ES2317646T3 - Vectores aav mejorados para terapia genica. - Google Patents
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- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA GENERAR TITULOS ALTOS DE VECTORES DE AAV RECOMBINANTE LIBRES DE CONTAMINANTES, A LOS METODOS Y A LAS CONSTRUCCIONES GENETICAS PARA PRODUCIR VECTORES DE AAV RECOMBINANTE DE UN MODO ADECUADO Y EN GRANDES CANTIDADES, A LOS METODOS PARA LA ADMINISTRACION DE TODAS LAS PROTEINAS VIRICAS ESENCIALES NECESARIAS EN TRANS PARA LA PRODUCCION DE GRANDES CANTIDADES DE AAV RECOMBINANTE, VECTORES DE AAV RECOMBINANTE PARA SER UTILIZADOS EN TERAPIA GENICA, NUEVAS LINEAS CELULARES DE ACONDICIONAMIENTO EN LAS QUE NO SEA NECESARIA LA COTRANSFECCION DE LOS PLASMIDOS DEL VECTOR Y COLABORADOR, PLASMIDOS COLABORADORES Y CONSTRUCCIONES ESTRUCTURALES DE PLASMIDOS DEL VECTOR, Y UNA TECNICA DE ANALISIS PARA LA DETERMINACION DE LA PRODUCCION DEL VECTOR DE AAV. SE PRESENTAN TAMBIEN VECTORES AAV EN UN VEHICULO ACEPTABLE FARMACEUTICAMENTE, METODOS DE ADMINISTRACION DE UN TRANSGEN DE INTERES A UNA CELULA, COMPOSICIONES Y METODOS PARA LA ADMINISTRACION A UNA CELULA DE UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO DESEADO, Y MAMIFEROS TRANSGENICOS NO HUMANOS QUE EXPRESAN UN LOCUS DE INTEGRACION DE AAV EN EL CROMOSOMA 19 HUMANO.
Description
Vectores AAV mejorados para terapia génica.
El virus adeno-asociado (AAV) es
un parvovirus que tiene un genoma con un ADN de una hebra de
aproximadamente 4,6 kb. A diferencia de otros virus, AAV es
naturalmente defectivo, por lo que requiere la coinfección con un
virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus o virus del herpes) para
establecer una infección productiva. No se ha encontrado ninguna
enfermedad humana asociada con la infección por AAV (Blacklow et
al., 1968). El espectro de anfitriones de AAV es amplio; a
diferencia de otros retrovirus, AAV puede infectar células tanto
quiescentes como en división in vitro e in vivo
(Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; Podsakoff
et al., 1994; Russell et al., 1994) así como células
procedentes de diferentes especies y tipos de tejido in
vitro (Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al.,
1988). Cuando se produce la infección en ausencia de un virus
auxiliar, AAV de tipo salvaje puede integrarse en el genoma celular
como un provirus, hasta que es rescatado por superinfección con
adenovirus (Handa et al., 1977; Cheung et al., 1980;
Laughlin et al., 1986).
El genoma de AAV es relativamente simple y
contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF) flanqueados por
repeticiones terminales invertidas (ITR) cortas. Las ITR contienen,
entre otros, secuencias que actúan en cis requeridas para la
replicación, rescate, empaquetamiento e integración del virus. La
función de integración de las ITR permite que el genoma de AAV se
integre en un cromosoma celular después de la infección.
Las proteínas no estructurales o de replicación
(Rep) y las proteínas de las cápside (Cap) están codificadas por
los ORF 5' y 3', respectivamente. Cuatro proteínas relacionadas se
expresan a partir del gen rep; Rep78 y Rep68 se transcriben
a partir del promotor p5 mientras que un promotor en dirección 3',
p19, dirige la expresión de Rep52 y Rep40. Las proteínas Rep
grandes (Rep78/68) están implicadas directamente en la replicación
de AAV así como en la regulación de la expresión de los genes
virales (para una revisión, véase Muzyczka, 1992). El gen
cap se transcribe a partir de un tercer promotor viral, p40.
La cápside está compuesta por tres proteínas con secuencia
superpuesta; la más pequeña (VP-3) es la más
abundante. Debido a que las repeticiones terminales invertidas son
las únicas secuencias de AAV requeridas en cis para la
replicación, empaquetamiento e integración (Samulski et al.,
1989), la mayoría de los vectores AAV prescinden de los genes
virales que codifican las proteínas Rep y Cap y sólo contienen el
gen extraño insertado entre las repeticiones terminales.
El interés en AAV como un vector en la terapia
génica resulta de varias características únicas de su biología. La
transformación genética estable, ideal para muchos de los fines de
la terapia génica, puede conseguirse mediante la utilización de
dichos vectores AAV. Además, se sabe que el sitio de integración de
AAV es el cromosoma 19 de los seres humanos. Esta previsibilidad
elimina el peligro de eventos insercionales aleatorios en el genoma
celular que pueden activar o inactivar genes anfitriones o
interrumpir secuencias codificadoras, consecuencias que limitan la
utilización de vectores cuya integración es aleatoria, por ejemplo,
retrovirus. Como la proteína rep media la integración de AAV, se
piensa que la eliminación de esta proteína en la construcción de
vectores AAV resulta en patrones de integración alterados. Además,
AAV no se ha asociado a enfermedades humanas, lo que elimina muchas
de las preocupaciones que han surgido con vectores derivados de
virus en la terapia génica.
A pesar de los aspectos atractivos de los
vectores basados en AAV, el rápido progreso en su evaluación para
la terapia génica se ha visto dificultado por la incapacidad para
producir preparaciones madre virales recombinantes a gran escala y
con una titulación alta. El método convencional para la producción
de vectores AAV recombinantes (AAVr) es la cotransfección de un
plásmido que contiene el vector y un segundo plásmido auxiliar que
codifica las proteínas Rep y Cap de AAV en células 293 infectadas
con adenovirus (por ejemplo, Lebkowski et al., 1988;
Samulski et al., 1989; Muzyczka, N., 1992; Kaplitt et
al., 1994; Einerhand et al., 1995). Este método es
engorroso y resulta en un rendimiento bajo de AAVr, típicamente
10^{4}-10^{5} unidades infecciosas o
transductoras/ml. Las estrategias para mejorar este esquema han
incluido el incremento de la eficacia de la transfección haciendo
complejos de ADN plasmídico con partículas adenovirales mediante
polilisina (Mamounas et al., 1995), la administración de
secuencias del vector como parte de un adenovirus recombinante
(Thrasher et al., 1995) y la amplificación del número de
copias del virus auxiliar mediante la unión a un replicón SV40
(Chiorini et al., 1995).
El progreso en el desarrollo de AAV como un
vector en terapia génica ha estado limitado por la incapacidad para
producir una preparación madre de AAV recombinante con una
titulación alta utilizando los métodos descritos anteriormente.
Hasta ahora se ha pensado que las limitaciones derivan de la
producción inadecuada de las proteínas de AAV requeridas en
trans para la replicación y empaquetamiento del genoma de AAV
recombinante. Las estrategias basadas en trans para la
producción de vectores son las que modulan el nivel de proteínas
requeridas en trans para conseguir la producción de vectores
AAV. Los intentos de incrementar los niveles de estas proteínas han
incluido poner el gen rep de AAV bajo el control del promotor
LTR de VIH (Flotte, F.R. et al., Gene Therapy 2:
29-37, 1995) para incrementar los niveles de
proteína y el desarrollo de líneas celulares que expresan las
proteínas rep (Yang, Q. et al., J. Virol. 68:
4847-4856, 1994).
Las limitaciones en la producción de
preparaciones madre de vector AAV con titulación alta también
resultan del fracaso para incluir elementos de AAV requeridos en
cis en el diseño del vector AAV recombinante. Las
estrategias basadas en cis para incrementar la producción del
vector son las que proporcionan secuencias de ADN requeridas en
cis (en tándem) con el ADN recombinante que se va a
empaquetar en la partícula de vector AAV. Las funciones
trans y cis están relacionadas. Las proteínas
requeridas en trans son necesarias para conseguir la
producción del vector pero requieren las secuencias que actúan en
cis en el genoma de AAV recombinante con el fin de ser
funcionalmente activas. Por lo tanto, la producción del vector AAV
con un rendimiento alto requiere una estrategia coordinada de
mejoras basadas en trans y basadas en cis de manera
que pueda conseguirse el progreso en el desarrollo de AAV como un
vehículo estándar en terapia génica.
Así, existe una necesidad en la técnica de
métodos y composiciones que permitan la producción de preparaciones
de AAV recombinante (AAVr) con una titulación alta que no tengan
contaminación por AAV de tipo salvaje ni Adenovirus auxiliar.
La presente invención está dirigida a métodos
para generar vectores AAV recombinantes con una titulación alta y
sin contaminaciones.
La presente invención proporciona métodos y
construcciones genéticas para producir vectores AAV recombinantes de
manera conveniente y en grandes cantidades.
La presente invención proporciona además métodos
para la administración de todas las proteínas virales esenciales
requeridas en trans para obtener rendimientos altos de AAV
recombinante.
La presente invención proporciona vectores AAV
recombinantes para utilizarse en terapia génica, utilizando
estrategias basadas en trans y cis.
En la presente memoria se describe el
empaquetamiento en líneas celulares que obvia la necesidad de
cotransfección del vector y de los plásmidos auxiliares.
También se describen en la presente memoria
construcciones de núcleos de plásmidos auxiliares y vector plásmido
que se utilizan en estos métodos.
La presente invención proporciona un ensayo
informativo para determinar el rendimiento del vector AAV.
Además se proporcionan vectores AAV
recombinantes en un vehículo aceptable farmacéuticamente.
La presente descripción también proporciona
métodos para administrar un transgén de interés a una célula.
También se describen las composiciones y métodos
para administrar una secuencia de ADN que codifica una proteína
deseada a una célula.
Aún más, se describen mamíferos no humanos
transgénicos que expresan un locus de integración de AAV del
cromosoma 19 humano.
La Figura 1 muestra un diagrama de un plásmido
auxiliar replicativo que contiene los genes de adenovirus requeridos
para la producción del vector AAV.
La Figura 2 muestra un diagrama de un plásmido
auxiliar replicativo que contiene los genes rep y cap
de AAV requeridos para la producción del vector AAV.
La Figura 3 muestra un diagrama de un plásmido
auxiliar no replicativo que contiene los genes rep y
cap de AAV requeridos para la producción del vector AAV.
La Figura 4 muestra un diagrama de un plásmido
auxiliar replicativo que contiene los genes de adenovirus y los
genes rep y cap de AAV requeridos para la producción
del vector AAV.
La Figura 5 muestra un diagrama de fragmentos
subgenómicos de AAV para utilizarse en construcciones de vectores
plásmidos para la producción del vector AAV. Se hace referencia a
sitios de restricción en pIM45 que definen los extremos de los
fragmentos.
La Figura 6 muestra un diagrama del plásmido
informador pTRCAT.
La Figura 7 muestra un diagrama de plásmidos
auxiliares que contienen los genes rep y cap de AAV
utilizados en la producción del vector AAV.
La Figura 8 muestra un diagrama del plásmido
informador pTRlacZ.
La Figura 9 muestra un análisis por
transferencia Western de la expresión de la proteína rep a partir de
plásmidos auxiliares no replicativos AAV. Las proteínas rep (en kd)
se indican a la derecha.
La Figura 10 muestra un análisis por
transferencia Western de la expresión de la proteína cap a partir de
plásmidos auxiliares no replicativos AAV. Las proteínas cap (VP, en
kd) se indican a la derecha.
La Figura 11 muestra plásmidos auxiliares AAV
representados en forma lineal representando la línea delgada (sólo
se muestra una parte de ésta) el ADN plasmídico central, las barras
gruesas representan las regiones codificadoras de Rep y Cap y sus
regiones de control asociadas, las flechas por encima de las barras
representan las posiciones de los promotores endógenos de AAV, p5,
p19 y p40, y la "X" indica que el promotor p40 ha sido
inactivado por mutación.
La Figura 12 muestra la expresión de los genes
Rep y Cap a partir de plásmidos auxiliares AAV analizada por
transferencia Western utilizando anticuerpos primarios
anti-Rep (panel A) y anti-Cap (panel
B). Los carriles de cada panel corresponden a muestras obtenidas de
células transfectadas con los ADN auxiliares siguientes: carril 1
(simulado), carril 2 (pIM45), carril 3 (pIMRSV), carril 4
(p5rep\Delta-CMVcap), carril 5 (pRSV
rep\Delta-CMVcap), carril 6
(p5rep\Delta-p40cap), carril 7
(pRSVrep\Delta-p40cap), carril 8
(pIMRSV-am), carril 9 (AAVwt) MOI=10. Los estándares de peso
molecular (en kd) se representan en el lado izquierdo de cada panel;
cada una de las proteínas Rep y Cap de AAV se identifican a la
derecha.
La Figura 13 es un análisis del mecanismo de
regulación a la baja de los genes cap. Se muestra un análisis
por transferencia Western de muestras obtenidas de células 293
transfectadas con los ADN apropiados (10 \mug total) en ausencia
(-) o presencia (+) de adenovirus (Ad5ts149, MOI=20). El
panel A y el panel B muestran transferencias desarrolladas
utilizando anticuerpos primarios anti-Rep y
anti-Cap, respectivamente. Los carriles de cada
panel corresponden a lo siguiente: carril 1 (simulación de células
transfectadas), carril 2 (pIM45), carril 3 (pIMRSV), carril 4
(pIMRSV-am), carril 5 (pIMRSV-am y plásmido de ARNt
supresor), carril 6 (pIMRSV-am y pRSVRep), carril 7 (pRSVRep
solo; "Wt"=células infectadas con AAVwt (MOI=15)
en presencia de adenovirus (Adts149, MOI=20). Los marcadores
de peso molecular (en kd) se muestran a la izquierda y las proteínas
Rep y Cap de AAV se identifican a la
derecha.
derecha.
La Figura 14 es un análisis de ARN total
obtenido de las transfecciones descritas en la Figura 13. El panel A
muestra el Northern, el panel B es el gel teñido con etidio para
demostrar que se cargaron las mismas cantidades de ARN en cada
carril. Los carriles de cada panel corresponden a lo siguiente:
carril 1 (simulación de células transfectadas), carril 2 (pIM45),
carril 3 (pIMRSV), carril 4 (pIMRSV-am), carril 5
(pIMRSV-am y plásmido de ARNt supresor), carril 6
(pIMRSV-am y pRSVRep), carril 7 (pRSVRep solo;
"Wt"=células infectadas con AAVwt (MOI=15) en
presencia de adenovirus (Adts149, MOI=20). Las transfecciones
se llevaron a cabo en ausencia (-) o presencia (+) de adenovirus
(Ad5ts149, MOI=20). Los estándares de tamaño de ARN (en
kilobases) se muestran a la izquierda en el panel A, a la derecha en
el panel B; los ARNm de AAV se identifican a la derecha del panel
A.
La Figura 15 es un análisis de la replicación
del vector y de los niveles de contaminación de AAV wt. Se
transfectaron células 293 infectadas con adenovirus
(Ad5ts149) con 1,5 \mug de vector (pTRlacZ) y 15
\mug del ADN auxiliar indicado. El ADN viral replicado se analizó
por transferencia Southern; se ensayaron filtros en duplicado con la
sonda lacZ. Los paneles C y D muestran ADN Hirt primarios y
secundarios, respectivamente, ensayados con el fragmento de AAV.
Para los ADN primarios (paneles A y C), los carriles corresponden a
las muestras siguientes: carril 1 (transfección simulada), carril 2
(pIM45), carril 3 (pIMRSV), carril 4
(p5rep\Delta-CMVcap), carril 5
(RSVrep\Delta-CMVcap), carril 6
(p5rep\Delta-p40cap), carril 7
(RSVrep\Delta-p40cap), carril 8
(pIMRSV-am). Para los ADN secundarios (paneles B y D), los
carriles son los mismos excepto en que la muestra del carril 8 se
obtiene de células infectadas con AAVwt (MOI=0,001) y
adenovirus (Ad5ts149, MOI=20). Las posiciones de los
estándares de tamaño de ADN (en pares de kilobases) se representan a
la izquierda de cada panel; las bandas de hibridación
correspondientes a la forma replicativa dimérica (dRF) y la forma
replicativa monomérica (mRF) se identifican a la derecha.
En el caso de conflicto o inconsistencia entre
la presente descripción y cualquiera de las solicitudes de patente,
patentes y referencias bibliográficas citadas en esta
especificación, prevalecerá la presente descripción incluyendo las
definiciones.
Células 293 - línea celular embrionaria de riñón
humano que contiene y expresa partes del genoma del adenovirus
incluyendo la región adenoviral E1.
Células
293-MT-DBP - línea celular
embrionaria de riñón humano modificada para expresar partes del
genoma del adenovirus que complementan vectores de adenovirus
recombinantes a los que se ha delecionado E1 y E2A. Depositada el
28 de agosto, 1996 en la American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland y asignada ATCC
CRL-12181.
Células 2C4 - línea celular embrionaria de riñón
humano modificada para expresar partes del genoma del adenovirus
que complementan vectores de adenovirus recombinantes a los que se
ha delecionado E1 y E4. Depositada el 28 de agosto, 1996 en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland y asignada ATCC CRL-12182.
Células 3B1 - línea celular embrionaria de riñón
humano modificada para expresar partes del genoma del adenovirus
que complementan vectores de adenovirus recombinantes a los que se
ha delecionado E1 y E2A. Depositada el 28 de agosto, 1996 en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland y asignada ATCC CRL-12183.
Cfu - unidades formadoras de colonias. Para los
vectores de virus retrovirales y adenoasociados que contienen genes
de resistencia a antibióticos, el número de colonias de células
resistentes a antibiótico después de la infección. Se asume que una
colonia surge de una única célula infectada.
Plásmido de expresión - elementos genéticos
extracromosómicos que pueden propagarse autónomamente en células,
construidos de tal manera que los genes presentes en el plásmido
pueden expresarse en las células.
En cis - de la misma molécula de ADN.
En trans - de una molécula de ADN
diferente.
Mutagénesis insercional - la introducción de una
mutación en un gen diana por la inserción de ADN extraño, tal como
ADN viral, en el genoma de la célula anfitriona. El desarrollo de
una mutación en un gen celular como resultado de la introducción de
ADN extraño en una célula.
ITR - repetición terminal invertida, una
secuencia de ADN que se repite en cualquier extremo del virus de una
forma invertida.
Casete promotor-transgén - una
combinación de secuencias de ADN que contienen los elementos
necesarios para dirigir la producción de un producto génico y la
secuencia del ADN del gen mismo.
Transducción - la introducción de ADN extraño en
células de un organismo (in vivo).
Transfección - la introducción de ADN extraño en
células en cultivo (in vitro). La modificación genética de
células eucariotas por la introducción de ADN extraño utilizando
medios químicos. En la transfección transitoria, la expresión
ocurre a partir de ADN extraño no integrado y puede detectarse
durante unos pocos días después de la transfección.
Transgén - un gen que se ha incorporado
establemente en otro organismo.
Células quiescentes - células que no se dividen
activamente.
Recombinación - interacción física entre dos o
más moléculas de ADN, en este caso secuencias virales, que da lugar
al intercambio de secuencias de ADN entre las moléculas.
Titulación - el número de partículas de virus
producidas por ml. El sistema de ensayo para determinar el número
de partículas de virus producidas varía considerablemente
dependiendo del virus en cuestión. Generalmente, son esenciales
unas titulaciones altas para una terapia génica exitosa ya que
permiten la introducción del gen terapéutico contenido en el virus
en el mayor número posible de células.
Vector - un vehículo, habitualmente una entidad
biológica, tal como un virus, utilizado para la administración de
genes a un organismo. Un reactivo que facilita la introducción de
genes extraños en células.
Gen lacZ - gen bacteriano utilizado como
un marcador génico celular. Su expresión se detecta por una
coloración azul en presencia del sustrato X-gal.
Células empaquetadas - células que se han
transfectado con plásmidos que contienen los genes cap y
rep de AAV.
Un propósito de la investigación descrita en la
presente memoria fue determinar el o los componentes limitantes
requeridos para el empaquetamiento de AAVr. La comprensión del
proceso a un nivel básico resultaría beneficiosa para todos los
métodos de producción de AAVr. Mediante el incremento selectivo de
la expresión bien del gen rep o cap (o ambos), se
muestra que la producción de la proteína Cap es un factor limitante
en la producción de AAVr.
Como se ha discutido, las proteínas del
adenovirus se requieren para generar una infección de AAV
productiva. En ausencia de adenovirus auxiliares, AAV se integra en
el genoma celular, permaneciendo latente hasta que la célula se
infecta con adenovirus.
Los genes de adenovirus requeridos para la
función auxiliar incluyen, entre otros, E1A, E1B, E2A, ORF6 de E4 y
VA ARN (Muzycka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:
97-129, 1992). Los métodos estándar para generar
vectores AAV recombinantes se han basado en la infección con
adenovirus de la célula diana con el fin de proporcionar niveles
adecuados de las proteínas auxiliares necesarias. Para evitar la
generación no deseada de adenovirus de tipo salvaje que puede
ocurrir durante la producción del vector AAV, se utiliza un
adenovirus que contiene una deleción en una línea celular que
proporciona una proteína de adenovirus esencial en trans.
Alternativamente, puede utilizarse un mutante de replicación de
adenovirus sensible a la temperatura a una temperatura no
permisiva.
En una realización de la presente invención, se
proporciona un plásmido auxiliar que contiene los genes esenciales
del adenovirus auxiliar unidos por secuencias ITR de AAV que
permiten que el plásmido se replique. El plásmido auxiliar puede
contener los genes E1A, E1B, E2A, ORF6 de E4 y VA ARN. Cada uno de
estos genes puede tener también su propio promotor, mediante el
cual puede producirse la transcripción. Los promotores alternativos
que pueden utilizarse en el plásmido auxiliar incluyen, pero no
están limitados a, CMV, RSV, MMTV, E1A, EF1a, actina, citoqueratina
14, citoqueratina 18, PGK así como otros conocidos por los expertos
en la técnica.
Una alternativa para infectar una célula
anfitriona con adenovirus es proporcionar los genes de adenovirus
esenciales en un plásmido replicativo. Las secuencias ITR de AAV en
el plásmido funcionan como un origen de replicación bajo el control
de las proteínas rep de AAV para incrementar el número de copias del
plásmido. Un número incrementado de copias da lugar a unos niveles
incrementados de las proteínas codificadas por los genes del
plásmido. Así, el plásmido auxiliar de la presente invención
proporciona las proteínas de adenovirus requeridas para la
producción del vector AAV a la vez que elimina la posibilidad de
producción de adenovirus. Una ventaja adicional es que los niveles
de las proteínas de adenovirus no están limitados por la cantidad
de ADN plasmídico introducido, ya que la replicación del plásmido
incrementará el número de copias de los genes por encima de los
niveles introducidos.
En realizaciones adicionales, el origen de la
replicación puede incluir, pero no está limitado a, el origen de
replicación de SV40, el origen de replicación de
Epstein-Barr (EBV), así como otros conocidos por los
expertos en la técnica. Cuando, por ejemplo, un origen de
replicación requiere una proteína activadora -por ejemplo, origen
de SV40 que requiere antígeno T, origen EBV que requiere proteína
EBNA- la proteína activadora puede proporcionarse por transfección
estable de manera que se crea una fuente de línea celular o por
transfección transitoria con un plásmido que contiene el gen
apropiado.
Las técnicas estándar de ADN recombinante pueden
emplearse para construir los plásmidos auxiliares de la presente
invención (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel, F. et al., eds, Wiley and Sons, Nueva
York, 1995). Dichos métodos incluyen la utilización de sitios de
restricción compatibles en los extremos de los genes de adenovirus
y las secuencias ITR o secuencias de ADN conectoras que contienen
sitios de restricción, así como otros métodos conocidos por los
expertos en la técnica. Las referencias de la información de
secuencias de ADN de adenovirus se proporcionan en Roberts, R.J., en
Adenovirus DNA: The Viral Genome and Its Expression,
Oberfler, W., ed., Matinus Nihoff Publishing, Boston, 1986). Los
plásmidos que se emplean rutinariamente en biología molecular -por
ejemplo, pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA), pRep9
(Invitrogen, San Diego, CA) o pBS (Stratagene, La Jolla, CA)- pueden
utilizarse como base para el plásmido auxiliar en el que pueden
insertarse genes de adenovirus y la ITR de AAV. Los genes de
adenovirus pueden ponerse en el plásmido auxiliar en cualquier
orden posicional. Una realización particular de dicho plásmido
auxiliar replicativo según la invención se muestra en la Figura
1.
El plásmido auxiliar puede utilizarse en la
generación de AAV recombinante cuando se combina con una fuente de
las proteínas rep y cap de AAV, así como el genoma de AAV
recombinante. La transfección de células con el plásmido utilizando
técnicas muy conocidas en la técnica proporcionará los productos
génicos de adenovirus necesarios para el inicio de la expresión del
gen rep de AAV.
Con el fin de generar preparaciones madre de
vectores AAV recombinantes, los métodos estándar proporcionan los
productos génicos rep y cap de AAV en un plásmido que
se utiliza para cotransfectar una célula diana junto con el vector
plásmido AAV. Los niveles de las proteínas rep y cap producidas como
resultado de la transfección son apropiados para maximizar la
producción el vector AAV. Esto se debe a que las proteínas rep
activan la transcripción del gen cap, dando lugar a la
producción de las proteínas estructurales de AAV que están
implicadas en el empaquetamiento del genoma recombinante.
Los intentos de incrementar los niveles de estas
proteínas de AAV con el fin de aumentar la producción del vector
han sido problemáticos (Kotin, R.M., Human Gene Therapy 5:
793-81, 1994). Uno de los problemas parece ser la
toxicidad de la proteína rep para la célula a unos niveles
altos.
En este aspecto de la presente invención, se
proporcionan los genes rep y cap de AAV en un plásmido
auxiliar replicativo que contiene las secuencias ITR de AAV. Las
proteínas rep activan ITR como un origen de replicación, dando
lugar a la replicación del plásmido que resulta en un número
incrementado de copias. La ventaja de este método es que el nivel
de la proteína rep no depende simplemente de la eficacia de la
transfección con el plásmido sino que también es una función de la
replicación del plásmido después de la transfección. Un ejemplo de
un plásmido auxiliar replicativo que contiene los genes rep y
cap de AAV se proporciona en la Figura 2. En otras
realizaciones de este aspecto de la invención, el origen de
replicación puede incluir, pero no está limitado a, el origen de
replicación de SV40, el origen de replicación de
Epstein-Barr (EBV), así como otros conocidos por
los expertos en la técnica. Cuando, por ejemplo, un origen de
replicación requiere una proteína activadora -por ejemplo, el
origen de SV40 que requiere el antígeno T, el origen de EBV que
requiere la proteína EBNA- la proteína activadora puede
proporcionarse por transfección estable de manera que se crea una
fuente de línea celular o por transfección transitoria con un
plásmido que contiene el gen apropiado.
En otra realización más de la invención, los
genes rep y cap de AAV pueden proporcionarse en un
plásmido no replicativo que no contiene un origen de replicación.
Dicho plásmido no replicativo asegura además que el aparato de
replicación de la célula está dirigido a la replicación de los
genomas de AAV recombinantes con el fin de optimizar la producción
del virus. Además, debido a que algunos estudios han sugerido que
unos niveles altos de la proteína rep pueden ser tóxicos para la
célula (Muzyczka, N., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:
97-129, 1992) el hecho de proporcionar el gen
rep en un plásmido no replicativo puede disminuir esta
posibilidad. Los niveles de las proteínas de AAV que codifican
dichos plásmidos no replicativos pueden modularse mediante la
utilización de promotores particulares para dirigir la expresión de
estos genes. Dichos promotores incluyen, entre otros, promotores de
AAV así como promotores de fuentes exógenas, por ejemplo, CMV, RSV,
MMTV, E1A, EF1A, actina, citoqueratina 14, citoqueratina 18, PGK,
así como otros conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo
de un plásmido auxiliar AAV no replicativo se proporciona en la
Figura 3.
Los niveles de las proteínas rep y cap
producidos por estos plásmidos auxiliares pueden regularse
individualmente mediante la elección de un promotor para cada gen
que se ajusta de manera óptima al nivel de proteína deseado. La
modulación específica de un gen particular -por ejemplo, el gen
rep- también puede conseguirse con la utilización de un
promotor inducible. Dichos promotores inducibles incluyen, pero no
están limitados a, MMTV, metalotioneína, así como otros conocidos
por los expertos en la técnica.
Con el fin de evitar cualquier empaquetamiento
de secuencias genómicas de AAV que contienen los genes rep y
cap, puede modificarse un plásmido que contiene el fragmento
de ADN de rep y cap mediante la inclusión de un
fragmento "de relleno" en el genoma de AAV que da lugar a un
ADN con una longitud excesiva para un empaquetamiento óptimo. Así,
el fragmento auxiliar no se empaqueta en los viriones de AAV. Ésta
es una característica de seguridad que asegura que sólo se
empaqueta en viriones un genoma del vector de AAV recombinante que
no excede el tamaño óptimo para el empaquetamiento. Un fragmento
auxiliar de AAV que incorpora una secuencia de relleno excede la
longitud del genoma de tipo salvaje de 4,6 kb y las longitudes por
encima de 105% del tipo salvaje no se empaquetarán. El fragmento de
relleno puede obtenerse, por ejemplo, de fuentes no virales tales
como el gen de la \beta-galactosidasa.
Pueden emplearse técnicas estándar de ADN
recombinante para construir los plásmidos auxiliares de la presente
invención (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, Nueva
York 1995), incluyendo la utilización de sitios de restricción
compatibles en los extremos de los genes y secuencias ITR de AAV
(cuando se utilicen) o secuencias conectoras de ADN que contienen
sitios de restricción, así como otros métodos conocidos por los
expertos en la técnica. La referencia para la información de la
secuencia de ADN de AAV se proporciona en Srivastava, A., et al.,
J. Virol. 45: 555-564, 1983. Los plásmidos
empleados rutinariamente en biología molecular pueden utilizarse
como un núcleo -por ejemplo, pBR322 (New England Biolabs, Beverly,
MA), pRep9 (Invitrogen, San Diego, CA), pBS (Stratagene, La Jolla,
CA)- para la inserción de los genes de AAV y, en el caso de un
plásmido replicativo, la ITR de AAV.
La generación de una preparación madre de vector
AAV recombinante requiere proteínas de AAV y de adenovirus,
proporcionadas en trans, con el fin de facilitar la
activación transcripcional, replicación y empaquetamiento del
genoma de AAV recombinante. Los métodos estándar han utilizado la
administración basada en plásmidos de los genes de AAV en la célula
diana. La infección de la célula diana con adenovirus se utiliza
para proporcionar los genes de adenovirus. Este protocolo en varias
etapas requiere la coordinación de transfección e infección.
Además, la infección de la célula con adenovirus permite la
producción de adenovirus lo que no es deseable cuando se intenta
producir una preparación madre de vector AAV pura. Además, la
introducción de muchos genes virales que no son necesarios para la
generación del vector causa el desvío de la maquinaria
transcripcional y de replicación que podría dirigirse hacia una
producción más eficaz de las proteínas esenciales para la
producción de AAV. Aunque los vectores AAV se han producido
utilizando genes de adenovirus introducidos por infección, el
rendimiento alto de la producción del vector todavía es
problemático. Por lo tanto, una administración más eficaz de los
genes que codifican las proteínas requeridas en trans
mejoraría la producción del vector AAV.
La presente invención proporciona un método
sencillo para la administración de todas las proteínas virales
esenciales requeridas en trans para obtener unos rendimientos
altos de AAV. Se construye un plásmido híbrido que contiene los
genes de AAV y adenovirus que codifican las proteínas esenciales.
Las ventajas de este plásmido incluyen, entre otras, un único
evento de entrada en la célula que administra todos los genes que
codifican las proteínas que actúan en trans, suministro
coordinado de todos estos genes e impedimento de la producción de
adenovirus que resulta de la eliminación de genes de adenovirus
innecesarios. Dicho plásmido se muestra en la Figura 4. El plásmido
contiene genes esenciales de adenovirus-E1A, E1B,
E2A, ORF6 de E4 y VA ARN. El plásmido también contiene los genes
rep y cap de AAV, así como las secuencias ITR de AAV
que se requieren para replicar el plásmido. Los genes pueden
transcribirse utilizando sus propios promotores. Alternativamente,
los promotores pueden incluir, pero no están limitados a, CMV, RSV,
MMTV, E1A, EF1a, actina, citoqueratina 14, citoqueratina 18, PGK,
así como otros conocidos por los expertos en la técnica. Los genes
de adenovirus pueden insertarse en el plásmido en el orden mostrado
en la Figura 4 o pueden insertarse en varias organizaciones
posicionales diferentes que están dentro del alcance del experto en
la técnica.
Todos los genes esenciales requeridos en
trans también pueden proporcionarse en dos plásmidos para
facilitar la clonación. Así, los genes de AAV y adenovirus en el
plásmido auxiliar híbrido pueden estar contenidos en dos plásmidos,
en cualquier organización óptima para la clonación. En otras
palabras, los genes de AAV y adenovirus no tienen por qué estar en
plásmidos separados.
Pueden emplearse las técnicas estándar de ADN
recombinante para construir los plásmidos auxiliares de la presente
invención (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, Nueva
York 1995), incluyendo la utilización de sitios de restricción
compatibles en los extremos de los genes y las secuencias ITR o
secuencias conectoras de ADN que contienen sitios de restricción,
así como otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La
referencia para la información de la secuencia de ADN de adenovirus
y AAV se ha citado anteriormente. Los plásmidos utilizados
rutinariamente -por ejemplo, pBR322 (New England Biolabs, Beverly,
MA), pRep9 (Invitrogen, San Diego, CA), pBS (Stratagene, La Jolla,
CA)- pueden utilizarse para la inserción de los genes de adenovirus
y AAV y la ITR de AAV. Los genes de adenovirus pueden ponerse en el
plásmido auxiliar en cualquier orden posicional.
Los plásmidos auxiliares que proporcionan las
proteínas esenciales requeridas en trans se utilizan para
generar las preparaciones madre de vector AAV recombinante. Estos
plásmidos se introducen en la célula diana utilizando varios
métodos de transfección, incluyendo, entre otros, transfección con
fosfato de calcio, lipofección u otras técnicas conocidas por los
expertos en la técnica. La proporción de plásmidos auxiliares
respecto a la cantidad de vector plásmido que contiene el gen de
interés varía de 1:1-1:10. Este procedimiento
produce vectores AAV recombinantes; el vector plásmido contiene el
genoma de AAV recombinante flanqueado por las ITR de AAV.
Los vectores AAV recombinantes se producen
utilizando células 293 en 8 frascos giratorios (1x10^{9}
células/ml). Las células se transfectan tanto con el plásmido
auxiliar como con el vector plásmido AAV en una proporción
vector:auxiliar de 1:10. Los plásmidos pueden introducirse en la
célula diana utilizando varios métodos de transfección, incluyendo,
pero sin limitarse a, fosfato de calcio, lipofección u otras
técnicas conocidas por los expertos en la técnica (véase, por
ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel.,
F. et al., eds, Wiley and Sons, Nueva York 1995). En una
realización preferida, se utiliza la lipofección para la
transfección. La infección con adenovirus se inicia a una
multiplicidad de infección (MOI) de 20. La cepa de adenovirus puede
ser un virus de deleción, en cuyo caso, se integran genes
complementantes en la línea celular o un mutante sensible a la
temperatura (por ejemplo, ts149) que no puede replicarse a
una temperatura no permisiva (39ºC). Las células
transfectadas/infectadas se incuban durante 2 días a la temperatura
apropiada. Después de la incubación, las células se recogen y se
lisan mediante tres (3) ciclos de congelación y descongelación en
presencia de benzonasa (American International Chemical, Natick,
MA). Se añaden 1% desoxicolato y 0,25% tripsina al lisado, seguido
de incubación durante 30 minutos a 37ºC. El lisado celular (2
frascos giratorios/gradiente) puede aplicarse a un gradiente
escalonado de CsCl (1,5 g/ml-1,36 g/ml) en un rotor
SW28 y centrifugarse a 26K durante 6 horas a 4ºC. Se obtienen
fracciones y se purifican adicionalmente en dos gradientes de
equilibrio, utilizando un rotor NVT65 y se centrifugan a 60K durante
20 horas a 4ºC. Las fracciones de los gradientes de equilibro se
criban en un refractómetro y se juntan. El conjunto de las
fracciones se dializa en PBS con 1% sacarosa 3 veces durante 2 horas
a 4ºC.
La eficacia de un plásmido auxiliar como una
fuente de proteínas requeridas en trans se determina a partir
del rendimiento de la preparación madre de vector AAV. Para
determinar el rendimiento del virus, se utiliza un ensayo de
formación de placas de lisis de AAV para ensayar la producción de
progenie infecciosa. Los vectores AAV recombinantes se recuperan
después de la producción utilizando el protocolo de purificación
descrito anteriormente. El ensayo muestra si se produce progenie
infecciosa de AAV en el protocolo de producción.
El ensayo se lleva a cabo con células 293 que se
plaquean en el día uno a una densidad de 1x10^{5} células por
pocillo en 0,1 ml/pocillo en medio DME suplementado con 10% FBS,
penicilina/estreptomicina y glutamina. Después de aproximadamente
24 horas, las células se infectan con adenovirus a una MOI de 20 y
con AAV de tipo salvaje a una MOI de 2. Los virus se suspenden en
el mismo medio y se añaden 0,1 ml a cada pocillo para iniciar la
infección. Las muestras de vector AAV se añaden al pocillo
(25-100 microlitros de lisado o diluciones) y las
placas se incuban durante 24-30 horas a la
temperatura apropiada (37ºC para adenovirus de tipo salvaje; 39ºC
para un adenovirus mutante sensible a la temperatura). En el día
después de la infección, el medio se elimina cuidadosamente de las
células. Se añaden 0,2 ml de PBS frío que contiene 5 mM EDTA a cada
pocillo y la placa se pone en hielo.
Se prepara un aparato de filtración para
utilizarlo poniendo un filtro de nitrocelulosa humedecido
previamente con PBS en posición y añadiendo 5 ml de PBS en la parte
superior de la unidad de filtración. Las células de la placa se
resuspenden por pipeteo. Se añaden 0,05 ml de la suspensión celular
en el tampón PBS en la unidad de filtración y se mezcla por
rotación. Se aplica succión al aparato para depositar las células en
los filtros. Los filtros se secan al aire durante 10 minutos. Las
células se lisan directamente en los filtros utilizando una
disolución desnaturalizante seguida de una disolución neutralizante.
Los filtros se secan en papel durante 5 minutos después de cada
disolución y después se secan al aire durante 10 minutos. Los
filtros se lavan en 2x SSC, se secan al aire durante 10 minutos y
se cuecen en un horno con vacío durante 2 horas. La hibridación con
una sonda que detecta el gen de interés se lleva a cabo utilizando
los filtros preparados como se ha indicado anteriormente,
humedecidos en 2x SSC. Los filtros pueden prehibridarse utilizando
30-40 ml de Quick-Hyb® (Stratagene,
La Jolla, CA) incubando a 68ºC durante 2-4 horas en
un baño de agua giratorio. La sonda marcada se añade a la
disolución Quick-Hyb® y se incuba toda la noche a
68ºC. Los filtros se lavan al día siguiente (5 minutos en 2X SSC,
0,5% SDS a temperatura ambiente, 15 minutos en 2X SSC 0,1% SDS a
temperatura ambiente, seguido de 2 horas en 0,1X SSC, 0,5% SDS a
65ºC). El filtro se expone a una película toda la noche a -80ºC para
producir una autorradiografía.
El número de placas de lisis en el filtro se
cuenta en la autorradiografía. La titulación del material de partida
se determina multiplicando el número de placas de lisis por
cualquier dilución utilizada en la preparación de las muestras de
ensayo.
Cuando el vector AAV que se está produciendo
contiene un gen informador, pueden utilizarse métodos alternativos
para determinar la titulación del vector AAV. Por ejemplo, si se
utiliza el gen lacZ, las células infectadas pueden teñirse
para determinar la expresión del producto génico,
\beta-galactosidasa, utilizando
X-gal. La titulación se determina, por ejemplo,
contando las células teñidas de azul en un pocillo de la placa.
La presente invención también proporciona un
medio para incrementar la producción de vectores AAV recombinantes
mediante diseños de vector plásmido AAV que utilizan secuencias que
actúan en cis en el genoma de AAV requeridas para la
replicación y empaquetamiento eficaces. La invención también
proporciona vectores plásmidos diseñados para proporcionar dichas
secuencias que actúan en cis.
Los diseños actuales de vector plásmido sitúan
el gen de interés entre las secuencias ITR de AAV para crear un
genoma recombinante y no proporcionan otras secuencias de AAV. Las
secuencias ITR de AAV tienen funciones que actúan en cis que
facilitan la replicación y empaquetamiento del genoma recombinante
durante la producción del vector, así como la integración del
vector ADN en una célula después de su introducción por el vector
AAV. Así, las secuencias ITR se retienen en los diseños del vector
AAV recombinante. Sin embargo, la dificultad para conseguir una
producción con titulaciones altas de vectores AAV indica que las ITR
por sí mismas no son suficientes para proporcionar todas las
funciones que actúan en cis necesarias para producir una
preparación madre de vector con una titulación alta. Por lo tanto,
en la construcción del vector, se requieren otras secuencias de AAV
que actúan en cis además de las ITR con el fin de incrementar
la eficacia de la replicación y/o empaquetamiento del genoma de AAV
recombinante.
Se cree que los elementos que actúan en
cis en el genoma de AAV facilitan el rescate y la replicación
del genoma mediante interacciones con las proteínas rep de AAV. Se
sabe que las proteínas rep se unen a sitios en la ITR de AAV así
como a sitios en los promotores p5 y p19 de AAV (McCarty, D.M. et
al., J. Virol. 65: 2936-2945, 1991; McCarty,
D.M. et al., J. Virol. 68: 4988-4997, 1995).
También parece que los elementos de empaquetamiento que actúan en
cis se requieren en el genoma del vector AAV recombinante
para una producción máxima de partículas.
La presente invención proporciona un método para
mejorar la producción de vectores AAV utilizando construcciones de
núcleos de vectores que contienen secuencias de AAV además de las
secuencias ITR. El núcleo del vector AAV puede incluir fragmentos
genómicos de AAV que contienen sitios de unión rep o
secuencias de empaquetamiento críticas. Debido a que todavía no se
ha definido el número y localización precisa de todas las secuencias
de AAV que actúan en cis, es importante la construcción de
vectores plásmidos que contienen partes significativas del genoma
de AAV para incluir todas las secuencias que actúan en cis,
incluyendo las que todavía no se han definido. Aunque estas
construcciones de vectores plásmidos mejoran la producción de las
preparaciones madre de vectores AAV recombinantes, una utilidad
adicional de la invención es que pueden identificarse funcionalmente
secuencias que actúan en cis mediante la producción mejorada
del vector.
Las construcciones del vector que contienen
dichas secuencias que actúan en cis pueden prepararse
utilizando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Current
Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds,
Wiley and Sons, Nueva York 1995). La presencia de sitios de
restricción conocidos en el genoma de AAV puede utilizarse para
obtener fragmentos subgenómicos para la inserción en un vector AAV
recombinante. La longitud del fragmento se elige de manera que el
genoma recombinante no exceda la capacidad de empaquetamiento de la
partícula de AAV. Si es necesario, se añade una secuencia de ADN
"de relleno" a la construcción para mantener un tamaño
estándar del genoma de AAV para propósitos comparativos. Dicho
fragmento puede obtenerse a partir de fuentes no virales, por
ejemplo, lacZ u otros genes, que son conocidas y están
disponibles para los expertos en la técnica.
La presente invención proporciona una serie de
construcciones de vectores plásmidos que añaden fragmentos
subgenómicos de AAV a un vector plásmido que contiene un gen de
interés flanqueado por las ITR de AAV. Véase la Figura 5. El tamaño
de estos fragmentos varía de 1,7-2,1 kb. Debido a
que estos fragmentos contienen tanto regiones codificadoras como no
codificadoras del genoma de AAV, los efectos en el empaquetamiento
pueden deberse a elementos que actúan en trans así como en
cis. Las modificaciones adicionales de las construcciones
mostradas -por ejemplo, inserción de fragmentos de AAV más pequeños-
están en el alcance de la invención y pueden hacerlas fácilmente
los expertos en la técnica. Cuando se utilizan fragmentos
subgenómicos que son más pequeños que las regiones codificadoras
del genoma, los efectos observados en la producción del vector se
caracterizan como efectos que actúan en cis. Por ejemplo, los
métodos estándar de análisis de deleción son adecuados para refinar
los fragmentos subgenómicos hasta una longitud mínima que se
necesita para la producción óptima del vector. Los elementos que
actúan en cis de AAV definidos -por ejemplo, elementos que
responden a rep- se clonan específicamente en los vectores
plásmidos.
La presente invención proporciona un ensayo
informador eficaz para determinar el rendimiento del vector AAV para
utilizarlo en terapia génica. De esta manera, se identifican los
diseños más eficaces de la construcción por la producción de una
preparación madre con una titulación alta.
Para determinar la mejora en la eficacia de la
producción cuando se añaden secuencias de AAV se utilizan un
plásmido que contiene un gen informador y las secuencias ITR de AAV.
Este plásmido puede modificarse con la inserción de fragmentos
subgenómicos de AAV para crear construcciones adicionales, tal como
el plásmido pTR-CAT, mostrado en la Figura 6. Este
plásmido contiene un casete de expresión que comprende el gen de la
cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) bajo el control del promotor
CMV, un intrón híbrido y el sitio BGH poliA. El casete de expresión
se clonó en pUC-TR, un plásmido de alto número de
copias, obtenido por clonación de la región ITR de AAV en pUC19
(New England Biolabs, Beverly, MA). La inserción del casete de
expresión en pUC-TR creó pTR-CAT.
Pueden añadirse sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del
casete CAT mediante la inserción de conectores o mediante la
utilización de otras técnicas conocidas por los expertos en la
técnica. Pueden insertarse fragmentos subgenómicos de AAV en estos
sitios de restricción. Este plásmido informador contendrá los
fragmentos subgenómicos mostrados en la Figura 5 que pueden situarse
en el extremo 5' ó 3' del casete de expresión. De manera óptima,
puede ser necesario ensayar la inserción de los fragmentos en ambos
extremos con el fin de determinar cualquier efecto posicional que
pueda tener la colocación del inserto. El fragmento también puede
insertarse en ambos extremos del vector plásmido. Una o más copias
de un elemento definido que actúa en cis puede incrementar la
cantidad de vector producida.
El empaquetamiento de las nuevas construcciones
requiere que se proporcionen los genes rep y cap de
AAV (por ejemplo, utilizando pIM45, descrito en el EJEMPLO 1) así
como genes de adenovirus esenciales. Un plásmido que contiene los
genes de AAV se cotransfecta con la nueva construcción. Una
infección con adenovirus o un plásmido auxiliar de adenovirus de la
presente invención (Véase la Sección 1, más arriba) proporciona los
demás genes necesarios.
Para determinar la cantidad de progenie
infecciosa se utiliza un ensayo de formación de placas de lisis que
utiliza una sonda apropiada (véase la Sección 5, más arriba).
Alternativamente, puede ensayarse un producto de un gen informador
en el vector AAV directamente - por ejemplo, se utiliza un ensayo
enzimático CAT cuando está presente este gen informador, por
ejemplo, pTR-CAT (Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel., F. et al., eds., Wiley and Sons, Nueva
York, 1995).
Pueden utilizarse genes informadores
alternativos para ensayar las construcciones de vector plásmido
siempre que la construcción de plásmido final que contiene el gen
informador y los fragmentos de AAV que actúan en cis no
exceda la longitud de empaquetamiento para una partícula de AAV.
Pueden detectarse otros productos de genes informadores en las
partículas infecciosas de AAV utilizando un ensayo bioquímico
apropiado.
También se describen en la presente memoria
mamíferos transgénicos no humanos capaces de expresar el locus de
integración de AAV en el cromosoma 19 humano. Los ejemplos de
mamíferos transgénicos no humanos son vacas, ovejas, cabras, cerdos,
conejos, ratas y ratones transgénicos.
Los sistemas de modelos animales que elucidan
los papeles fisiológicos y comportamentales de polipéptidos se
producen creando animales transgénicos en los que la expresión de un
polipéptido de interés se altera o modifica utilizando varias
técnicas. Los ejemplos de dichas técnicas incluyen la inserción de
versiones normales o mutantes de ácidos nucleicos que codifican un
polipéptido de interés, por microinyección, infección retroviral u
otros medios muy conocidos por los expertos en la técnica, en
embriones fertilizados apropiados para producir un animal
transgénico. Véanse, por ejemplo, Carver, et al.,
Bio/Technology 11: 1263-1270, 1993; Carver
et al., Cytotechnology 9: 77-84, 1992; Clark
et al., Bio/Technology 7 : 487-492, 1989;
Simons et al., Bio/Technology 6
:179-183, 1988; Swanson et al.,
Bio/Technology 10 : 557-559, 1992; Velander
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
12003-12007, 1992; Hammer et al., Nature 315:
680-683, 1985; Krimpenfort et al.,
Bio/Technology 9 : 844-847, 1991; Ebert et
al., Bio/Technology 9: 835-838, 1991; Simons et
al., Nature 328: 530-532, 1987; Pittius et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5874-5878,
1988; Greenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8327-8331, 1991; Whitelaw et al., Transg.
Res. 1: 3-13, 1991; Gordon et al.,
Bio/Technology 5: 1183-1187, 1987; Grosveld
et al., Cell 51: 975-985, 1987; Brinster
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
478-482, 1991; Brinster et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85: 836-840, 1998; Brinster et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985;
Al-Shawi et al., Mol. Cell. Biol.
10(3): 1192-1198, 1990; Van Der Putten et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152,
1985; Thompson et al., Cell 56: 313-321,
1989; Gordon et al., Science 214: 1244-1246,
1981; y Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1986).
Puede utilizarse otra técnica, la recombinación
homóloga de versiones mutantes o normales de estos genes con el
locus del gen nativo en animales transgénicos, para alterar la
regulación de la expresión o la estructura del polipéptido de
interés (véanse, Capecchi et al., Science 244: 1288, 1989;
Zimmer et al., Nature 338: 150, 1989). Las técnicas de
recombinación homóloga son muy conocidas en la técnica. La
recombinación homóloga reemplaza el gen nativo (endógeno) por un
gen recombinante o mutado para producir un animal que no puede
expresar la proteína nativa (endógena) pero puede expresar, por
ejemplo, una proteína recombinante que resulta en la expresión, por
ejemplo, del locus de integración de AAV humano.
A diferencia de la recombinación homóloga, la
microinyección añade genes al genoma del anfitrión, sin eliminar
genes del anfitrión. La microinyección puede producir un animal
transgénico que es capaz de expresar tanto polipéptidos endógenos
como exógenos. Pueden unirse promotores inducibles a la región
codificadora de los ácidos nucleicos para proporcionar un medio
para regular la expresión del transgén. Pueden unirse elementos
reguladores específicos de tejido a la región codificadora para
permitir la expresión específica de tejido del transgén. Los
sistemas de modelos de animales transgénicos son útiles para el
cribado in vivo de composiciones de vectores para la
identificación y confirmación de la integración y expresión a largo
plazo de un transgén.
Se construyó una serie de plásmidos auxiliares
para determinar si el empaquetamiento de AAVr está limitado por los
niveles de expresión de los genes rep y/o cap (Figura
11). La expresión de las proteínas Rep y Cap se incrementó
reemplazando los promotores AAV endógenos, p5 y p40, por el promotor
RSV LTR y CMV IE, respectivamente. El plásmido auxiliar de partida,
pIM45 (McCarty et al., 1991), contiene una secuencia que
abarca el genoma de AAV de tipo salvaje pero excluye las
repeticiones terminales (nucleótidos 145-4493).
pIMRSV es una modificación de pIM45 en el que el RSV LTR reemplaza a
p5. Debido a que p40 está localizado en la región codificadora de
Rep, los genes rep y cap se separaron para permitir el
reemplazo de p40 por el promotor CMV IE (como en
p5rep\Delta-CMVcap). Esta estrategia generó un
vector con una repetición directa de 431 pb de secuencia después
del extremo 3' del promotor p40 y CMV. Para evitar la generación de
AAV de tipo salvaje por recombinación, el promotor p40 situado en la
ORF de rep de esta construcción se inactivó por mutagénesis
dirigida a sitio. Se construyó p5rep\Delta-p40cap
para expresar los genes rep y cap a partir de
promotores de AAV endógenos como en pIM45 pero para que se puedan
comparar más directamente con p5rep\Delta-CMVcap,
las regiones codificadoras de Rep y Cap se separaron.
RSVrep\Delta-CMVcap y
RSVrep\Delta-p40cap son derivados de
p5rep\Delta-CMVcap y
p5rep\Delta-p40cap, respectivamente en los que p5
se ha reemplazado por RSV LTR.
Las cantidades de las proteínas Rep y Cap
expresadas a partir de cada uno de los plásmidos auxiliares AAV se
estimaron por análisis de transferencia Western (Figura 12). Las
cuatro proteínas Rep producidas después de la transfección en
células 293 en presencia de una infección con Adts149 (MOI =
20) comigran con las proteínas correspondientes detectadas después
de la coinfección de las células 293 con AAV de tipo salvaje
(AAVwt) y Adts149. Para cada uno de los plásmidos
auxiliares, Rep78 y Rep52 son las proteínas principales producidas.
Rep68 y Rep40, que se traducen a partir de mensajeros sometidos a
corte y empalme, se observaron a un nivel menor. También se
detectaron como proteínas minoritarias en la infección con
AAVwt.
Cuando el promotor p5 se reemplazó por RSV LTR,
se observó un incremento en el nivel de Rep78. Este fue el caso de
los tres auxiliares, pIMRSV, RSVrep\Delta-CMVcap y
RSVrep\Delta-p40cap. No hubo ningún cambio en la
cantidad de Rep52, debido a que en todas las construcciones se
obtuvo a partir de un transcrito de p19.
Las tres proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3
se produjeron a partir de todos los plásmidos auxiliares en la
proporción 1:1:10 observada en una infección con AAV wt
(Figura 12). La síntesis de las tres proteínas de la cápside se
incrementó cuando se reemplazó p40 por el promotor CMV IE (Figura 12
carril 2 frente a carril 4). Sin embargo, la expresión del gen
rep a partir de RSV LTR tenía un efecto regulador a la baja
en la expresión de cap a partir de p40. Así, el nivel de la
proteína de la cápside se redujo para pIMRSV respecto al plásmido
parental que contiene p5 como el promotor que regula la expresión de
rep (pIM45; comparar los carriles 3 y 2). Un efecto similar,
aunque menos dramático, se observó con la expresión de la proteína
de la cápside a partir del promotor CMV IE (carril 5 frente a carril
4). En el último caso, también se vio una reducción correspondiente
del ARNm de cap por análisis Northern, lo que sugiere que la
sobreexpresión de Rep78 resulta en una regulación transcripcional a
la baja del promotor CMV. La síntesis de la proteína Cap también se
redujo respecto a pIM45 cuando los genes rep y cap se
expresaron a partir de unidades de transcripción distintas como en
p5rep\Delta-p40cap en el que la señal AAVpA separa
las ORF de rep y cap.
Debe indicarse que el nivel total de las
proteínas de AAV producido en las transfecciones transitorias fue
comparable al observado en una infección con AAV wt a una MOI
de 10. Mientras que Rep78, Rep52 y las proteínas de la cápside
aparecen a niveles similares a los observados en la infección con
AAV wt cuando se expresan a partir de los promotores de AAV
(p5, p19 y p40, respectivamente), la expresión a partir de los
promotores heterólogos, RSV LTR y CMV IE, incrementó la cantidad
por encima de la observada en la infección viral. Esto resulta
especialmente significativo cuando se considera que la eficacia de
la transfección varía de 20-50% mientras que la
infección a una MOI de 10 debería ocurrir con una eficacia mayor.
Esto sugiere que la concentración de cada producto génico viral por
célula transfectada es mayor en las transfecciones transitorias que
en la infección con AAV wt.
\newpage
Para analizar adicionalmente el mecanismo de
regulación a la baja de la expresión de las proteínas de la cápside
en los plásmidos auxiliares que contienen un casete RSV
LTR-gen rep, se obtuvo un derivado de pIMRSV
que contenía una mutación ámbar en la ORF de rep
(pIMRSV-am). Si la regulación a la baja se debía a una
alteración en cis (es decir, reemplazo de p5 por RSV LTR),
entonces debería persistir en el mutante ámbar. Por el contrario,
el efecto regulador a la baja debería mitigarse en el mutante si
fuera dependiente de la síntesis de la proteína Rep de longitud
completa.
Las transfecciones transitorias en células 293
se llevaron a cabo utilizando pIMRSV-am como un auxiliar en
presencia y ausencia de infección con adenovirus (Ad). Las proteínas
nucleares se aislaron y analizaron por transferencia Western
(Figura 13). Con pIM45 como auxiliar, Rep78 aparece a un nivel alto
en ausencia de Ad debido a la expresión de los genes E1A y E1B en
las células 293, de ahí la ausencia aparente de inducción con la
adición de Ad (la inducción de Rep78 con esta construcción se
observa en las células HeLa). La infección con Ad resulta en la
aparición de las proteínas Rep sometidas a corte y empalme, Rep68 y
Rep40, y en un incremento ligero del nivel de Rep52. Como se
esperaba, la expresión de Rep78 a partir del promotor RSV no
responde a la infección con Ad; aparece el mismo nivel alto en
presencia y ausencia de la coinfección con el virus auxiliar. En
las células transfectadas con pIMRSV-am, se observa una
pequeña cantidad de Rep78 de longitud completa, lo que indica que
la mutación es algo defectuosa. Cuando las células se cotransfectan
con pIMRSV-am y un ARNt supresor de ámbar, la producción de
Rep78 se restaura hasta el nivel observado con pIMRSV. La
cotransfección de pIMRSV-am con un plásmido que expresa Rep,
pRSVrep, proporciona un nivel alto de Rep78 en trans.
La expresión de las proteínas de la cápside se
analizó en paralelo (Figura 13). La síntesis de las proteínas de la
cápside se incrementa significativamente después de la infección con
Ad de células transfectadas con pIM45. Este incremento no se
observa con pIMRSV (carriles 5 y 6) pero ocurre con el mutante
pIMRSV-am. El fenotipo pIMRSV se restaura cuando
pIMRSV-am se cotransfecta con el ARNt supresor o cuando la
proteína Rep se suministra en trans por cotransfección con
pRSVrep.
Se llevó a cabo un análisis Northern en muestras
del mismo experimento para examinar este fenómeno a nivel del ARN
(Figura 14). Con pIM45, se observó un nivel relativamente bajo del
transcrito de p5 (4,2 kb) pero el transcrito de p19 (3,6 kb) fue
más predominante y mostró un incremento con la infección con Ad. No
se detectaron los transcritos sometidos a corte y empalme de p5 y
p19 (3,9 kb y 3,3 kb, respectivamente). El reemplazo de p5 por RSV
LTR resultó en un incremento del transcrito de 4,2 kb que contribuye
a los niveles más altos de Rep78 producida por esta construcción.
De manera interesante, la cantidad de este transcrito aumentó más
con la introducción de la mutación ámbar. Cuando se restaura la
síntesis de Rep por cotransfección de un ARNt supresor (carril 5) o
se suministra en trans por cotransfección con pRSVrep (carril
6), la síntesis del transcrito de 4,2 kb se reduce de nuevo. Estos
resultados sugieren que la transcripción a partir de RSV LTR está
regulada a la baja por Rep.
Con pIM45, la infección con Ad resulta en un
incremento significativo tanto del ARNm de p40 de longitud completa
(2,6 kb) como sometido a corte y empalme (2,3 kb), reflejando el
incremento en la síntesis de las proteínas de la cápside. La
predominancia de los transcritos de p40 respecto a los obtenidos a
partir de p5 y p19 es similar a la observada por Labow et
al. (1986) a partir de AAV wt en células KB infectadas
con adenovirus. En general, las proporciones de los dos ARNm de p40
están desplazadas a favor del transcrito sometido a corte y empalme
de 2,3 kb con la infección con Ad. A diferencia de pIM45, no se
observa ningún incremento en los niveles de los transcritos ni de
p19 ni de p40 con las construcciones pIMRSV después de la infección
con Ad. Notablemente, con pIMRSV-am, el incremento en la
síntesis de las proteínas de la cápside observado con la infección
con Ad en el análisis Western (Figura 13, carril 4) no se refleja en
un incremento en el nivel del ARNm de cap. El nivel del ARNm
de la cápside observado con pIMRSV-am es similar al del
plásmido parental, pIMRSV. Se observa el mismo nivel bajo en la
cotransfección de pIMRSV-am y el ARNt supresor y de
pIMRSV-am con el plásmido que expresa Rep, pRSVrep. El
análisis Northern sugiere que el nivel reducido de síntesis de las
proteínas de la cápside observado con pIMRSV podría explicarse a
nivel de ARN por un fracaso para activar la transcripción a partir
de p40 en respuesta a la infección con Ad. Además, estos resultados
sugieren que el incremento en la producción de las proteínas de la
cápside después de la infección con Ad con el mutante
pIMRSV-am es un efecto post-transcripcional y
que la mutación ha mitigado un efecto inhibidor de la traducción
mediado por Rep en la síntesis de la cápside.
Se compararon las series de plásmidos auxiliares
respecto a su capacidad para producir AAVr. Cada uno se transfectó
en células 293 infectadas con Ad junto con el plásmido vector
pTRlacZ y se determinó el rendimiento de AAVr en el lisado
crudo (Tabla 1) por el ensayo de titulación. El hecho de incrementar
la expresión de las proteínas de la cápside poniendo el gen
cap bajo el control del promotor CMV
(p5rep\Delta-CMVcap) incrementó el rendimiento de
AAVr aproximadamente 9 veces. Por el contrario, el reemplazo de p5
con RSV LTR con el fin de incrementar la expresión del gen
rep resultó en un rendimiento más bajo de AAVr. Cuando se
añadió RSV LTR a una construcción que contiene p40 (pIMRSV o
RSVrep\Delta-p40cap), las titulaciones de AAVr
disminuyeron 10-20 veces, mientras que
RSVrep\Delta-CMVcap auxiliar empaquetó AAVr 5
veces menos eficazmente que la construcción comparable que contiene
p5. Estos resultados se correlacionan con las diferencias en la
expresión de las proteínas de la cápside observadas en el análisis
Western. Como se ha descrito anteriormente, se observó una
disminución dramática en la producción de la proteína Cap como
resultado de la sobreproducción de Rep78 con las construcciones
p40-cap, mientras que se observó un efecto más sutil en la
expresión de la proteína Cap a partir del promotor CMV. Los
resultados de estos experimentos que comparan las diferentes
construcciones auxiliares sugieren que la síntesis de la proteína
Cap, aunque probablemente no de Rep, es un factor limitante en la
producción de AAVr. Las Tablas proporcionan los resultados de
experimentos que muestran la factibilidad de producir AAV
recombinante (AAVr) en ausencia de adenovirus si se proporcionan los
genes tempranos requeridos de adenovirus (E1A y E1B, E4, E2A, VA) en
plásmidos.
Tabla 1: Muestra una comparación del rendimiento
de AAVr a partir del esquema de producción convencional (293
condiciones estándar) en presencia de adenovirus con el obtenido en
ausencia de adenovirus. En los casos "ausencia de adenovirus",
se utilizaron varias líneas celulares diferentes. Cada línea celular
es un derivado de la línea celular 293 (que contiene el gen E1 de
adenovirus) que se ha sometido a ingeniería para contener también
el gen E4 de adenovirus. La línea celular VK2-20 se
obtuvo de Frank Graham, mientras que las demás líneas ORF 6 (2C4 y
3B1) se generaron en nuestro laboratorio. Debido a que las líneas
VK2-20 y ORF6 ya contienen los genes E1A, E1B y E4,
con el fin de producir AAVr, los genes E2A y VA deben suministrarse
por transfección con el plásmido E2A. E2VA 5'\rightarrow3' y E2VA
3'\rightarrow5' son dos clones de este plásmido (con el inserto
en orientaciones opuestas). (Las células también se transfectan con
el vector plásmido AAVr y el plásmido auxiliar para permitir la
producción de AAVr). La conclusión de este experimento es que es
factible producir AAVr en ausencia de adenovirus y que esta
estrategia tiene un rendimiento igual, sino mayor, que el método
convencional.
La Tabla 2 es un resumen de los resultados de la
producción a gran escala de AAVr utilizando pIM45 y
p5rep\Delta-CMVcap como ADN auxiliares.
Notablemente, el rendimiento de UI de AAVr/célula se incrementa casi
10 veces cuando se utiliza el auxiliar modificado. Este resultado
también se refleja en titulaciones altas (tanto en UI/ml como
partículas/ml) del material purificado. En la tabla se muestran las
UI/ml determinadas tanto en presencia como ausencia de adenovirus
(Adts149). Como han publicado otros (Ferrari et al.,
1996, Fisher et al., 1996), las titulaciones de AAVr son
aproximadamente 1.000 veces mayores en presencia de una infección
con Ad. La proporción partícula:UI de estas preparaciones es
20-120 (UI + Ad) ó 4-7 x 10^{4}
(UI-Ad). El primer valor está en el intervalo
publicado previamente (Samulski et al., 1989). Aunque el
procedimiento de purificación resulta en un nivel persistente
aunque variable de contaminación con Adts149 (de <10^{3}
UI/ml a 10^{7} UI/ml), las preparaciones madre no tienen AAV
wt contaminante (véase más adelante).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se llevaron a cabo análisis Hirt en las muestras
de las transfecciones transitorias a pequeña escala tales como las
descritas anteriormente para ensayar la replicación de los vectores
y para evaluar los niveles de contaminación de AAVwt. Todos
los ADN auxiliares apoyaron la replicación del vector TRlacZ
(Figura 15, panel A); sin embargo, en cada una de las
transfecciones en las que se utilizó el plásmido auxiliar que
contiene un casete RSV LTR-rep, el vector se replicaba a un
nivel disminuido (el gel teñido con bromuro de etidio indicó que se
habían cargado en cada carril unas cantidades iguales de ADN). Este
resultado también podría ayudar a explicar los rendimientos virales
reducidos obtenidos con los auxiliares que contienen RSV-rep.
Se observó un nivel bajo de replicación cuando se utilizó el
mutante ámbar, pIMRSV-am, como auxiliar, lo que confirma,
como se muestra en la Figura 13, panel A, que este mutante sintetiza
una pequeña cantidad de proteína Rep de longitud completa. Cuando
se ensayó la misma transferencia con un fragmento del genoma de
AAVwt, no se observó ninguna evidencia de ADN viral de
AAVwt replicativo (Figura 15, panel C). Sin embargo, si hubo
hibridación a un ADN de alto peso molecular en algunos carriles.
Esto podría representar una hibridación cruzada con secuencias
celulares que presentan alguna homología con la sonda de
AAVwt. Sin embargo, debido a que no apareció ninguna señal
en el carril del control negativo (simulado), una explicación
alternativa podría ser que la señal es una evidencia de integración
del ADN auxiliar en el genoma de las células 293. De manera
interesante, esta banda de alto peso molecular apareció sólo en las
células transfectadas con auxiliares que portaban el casete
p5-rep en lugar de RSV LTR-rep, lo que sugiere que la
sobreexpresión de rep podría inhibir la integración o,
alternativamente, que secuencias en p5 (es decir, el sitio de unión
de Rep o RSS) podrían requerirse en cis para la integración.
Un apoyo importante para la hipótesis de la integración es la
observación de que no aparece ninguna señal en las células
transfectadas con el mutante pIMRSV-am, lo que sugiere que
este fenómeno es dependiente de la síntesis de Rep. Los lisados
recogidos en paralelo de estas transfecciones se utilizaron para
infectar una segunda placa de células 293 en presencia de
Adts149 y se prepararon muestras Hirt. Si de hecho estuviera
presente una pequeña cantidad de AAV wt contaminante,
entonces el virus debería amplificarse después de la reinfección.
Los análisis Southern y de hibridación con una sonda AAVwt
(Figura 15, panel D) mostraron de nuevo que no había evidencia de
ADN viral de AAVwt replicativo. Cuando se ensayó una
transferencia duplicada con un fragmento lacZ (Figura 15,
panel B), no se observó ningún ADN del vector replicativo. Este
último resultado es una evidencia más de la ausencia de AAV
wt ya que la presencia de AAV wt (es decir, la
expresión del gen rep) habría permitido la replicación del
vector en estas condiciones.
Se sustituyeron los promotores de AAV en un
plásmido auxiliar estándar con promotores heterólogos más potentes
con el fin de incrementar independientemente la expresión de las
proteínas Rep y Cap requeridas para el empaquetamiento de AAVr.
Estos experimentos mostraron que el rendimiento de AAVr mejoró
aproximadamente 10 veces cuando se incrementó la expresión del gen
cap, lo que implica que el nivel de la proteína de la cápside
es un factor limitante para la producción de AAVr. Por el
contrario, la expresión del gen rep no es probablemente un
factor limitante ya que la sobreexpresión de rep no
incrementó el rendimiento de AAVr. Sin embargo, no es posible
llegar a una conclusión definitiva en este asunto ya que los
incrementos en la síntesis de la proteína Rep estuvieron siempre
acoplados a reducciones en la producción de la proteína de la
cápside. En el caso del plásmido
pRSVrep\Delta-CMVcap, sin embargo, la producción
de la proteína Cap disminuyó sólo ligeramente respecto a la
observada con p5rep\Delta-CMVcap (como máximo 2
veces aunque el nivel era todavía mayor que el conseguido con
pIM45) mientras que la expresión de Rep78 se incrementó
significativamente (aproximadamente 5 veces). En estas condiciones,
no hubo incremento en el rendimiento de AAVr sobre
p5rep\Delta-CMVcap; de hecho, la eficacia del
empaquetamiento se redujo ligeramente. Estas conclusiones están
reñidas con las hechas en un estudio previo (Flotte et al.
1995) en el que la utilización de una construcción que expresa
rep a partir de VIH LTR (pHIVrep-p40cap) dio
lugar a un incremento de 10 veces en el rendimiento de AAVr
comparado con una construcción en la que p5 controlaba la expresión
de
rep (pAAV/Ad).
rep (pAAV/Ad).
Otro factor relacionado que restringe la
producción del vector AAV por el protocolo estándar es la eficacia
de la transfección ya que el nivel global de la síntesis de las
proteínas Rep y Cap está limitado tanto por el número de células
que internalizan el ADN como por el número de moléculas de ADN
presente en cada célula. En un intento de incrementar la eficacia
de la transfección, se formó un complejo con ADN plasmídico y
adenovirus competentes para la replicación modificados con
polilisina, lo que resulta en un incremento en el empaquetamiento
de AAVr de 40-240 veces sobre el método estándar de
fosfato de calcio (Mamounas et al., 1995). Chiorini et
al. (1995) hicieron varias modificaciones al procedimiento
estándar de producción de AAVr ; en lugar de transfectar las
células 293 con fosfato de calcio, se electroporaron células COS con
eficacias de transfección mostradas de hasta el 90%. El plásmido
auxiliar utilizado para estos estudios también contenía un replicón
de SV40, lo que incrementó presumiblemente el número de copias de
los genes rep y cap en cada célula transfectada.
Mediante este método, se consiguió una eficacia de empaquetamiento
de más de 10^{3} partículas de AAVr/célula. Alternativamente, se
han construido líneas celulares de empaquetamiento con el fin de
evitar la etapa ineficaz de transfección. Cuando el vector ADN se
introdujo en una línea celular estable, se mostró una mejora de
cinco veces en el rendimiento de AAVr sobre la cotransfección, lo
que resulta en 10^{4} partículas/célula (Flotte et al.,
1995). Clark et al. (1995) han construido una línea celular
que contiene tanto el vector como los genes rep/cap de AAV
lo que permite la producción de AAVr por infección de adenovirus
sólo. Este sistema rinde 30 UI/célula (aproximadamente 400
partículas/célula), un valor que es comparable al conseguido con el
plásmido auxiliar mejorado descrito en la presente memoria. Dada la
experiencia de otros, es probable que el protocolo de
empaquetamiento empleado en estos estudios pueda mejorarse más, bien
replicando el plásmido auxiliar en la célula transfectada o
utilizando la nueva construcción auxiliar para generar una línea
celular de empaquetamiento.
\newpage
El efecto observado en la expresión de la
proteína Cap que resulta de reemplazar p5 por RSV LTR confirmó el
trabajo de otros respecto a la regulación génica de AAV. Además de
su función en la replicación, se sabe que las proteínas Rep de AAV
(principalmente Rep78/68; Kyostio et al., 1994; Horer et
al., 1995) actúan como reguladores transcripcionales. En
ausencia de una infección con adenovirus, las proteínas Rep reprimen
la transcripción a partir de los promotores de AAV (Tratschin et
al., 1986, Trempe y Carter, 1988, Beaton et al., 1989,
Kyostio et al., 1994) mientras que contrariamente activan la
transcripción a partir de esos promotores en respuesta a una
infección con adenovirus (Labow et al., 1986, Tratschin et
al., 1986). McCarty et al. (1991) han mostrado que la
activación mediada por Rep de los promotores p19 y p40 en presencia
de adenovirus es dependiente en cis de secuencias localizadas
antes del extremo 5' tanto de p5 como de p19. Es consistente con
este descubrimiento la falta de inducción de la transcripción de p40
después de la infección con adenovirus cuando p5 se delecionó y se
reemplazó por RSV LTR (como en el plásmido pIMRSV). De manera
similar, tampoco hubo un incremento en el nivel de ARN de p19 con
esta construcción. El hecho de no poder observar una inducción se
debió a la eliminación de las secuencias requeridas en cis
ya que se producía independientemente de la expresión del gen
rep; la activación transcripcional de p40 no se restauró
(Fig. 4) cuando la síntesis de la proteína Rep se evitó mediante una
mutación ámbar o cuando la proteína Rep se suministró en
trans. Respecto a pIM45, pIMRSV carece sólo de 84 bp antes
del extremo 5' de p5 (pb 191-275 de la secuencia de
AAV); esta deleción es más limitada que la mostrada por McCarty
et al. (1991) (pb 191-320) y así define más
la localización de la región reguladora potencial requerida para la
activación de Rep. Se sabe que la región entre pb 191 y 275 contiene
sitios de unión para el factor principal de la transcripción tardía
(USF; Chang et al., 1989), YY1 (Shi et al., 1991) y
Rep (McCarty et al., 1994; Kyostio et al., 1995) así
como la caja TATA de p5.
Aunque la transcripción a partir del promotor
p40 en el mutante pIMRSV-am no se activó por Rep en respuesta
a infección con adenovirus, se observó que la síntesis de la
proteína Cap se incrementaba. Este efecto puede atribuirse a la
actividad inhibidora de la traducción de Rep. En las células 293 en
ausencia de una infección con adenovirus, Trempe y Carter (1988)
han observado que el nivel del ARNm de p40 se reducía mientras que
la expresión de la proteína CAT se incrementaba en ausencia de Rep
comparado con un vector que contiene el gen rep. En las
células transfectadas con pIMRSVam, la síntesis de las
proteínas de la cápside se incrementa significativamente con la
infección con adenovirus. Este incremento, sin embargo, ocurre sin
ninguna alteración en el nivel basal del ARNm de p40, lo que indica
que es un efecto en la traducción. En comparación, la producción de
las proteínas de la cápside también se incrementa en células
transfectadas con pIM45, pero en este caso, hay un incremento
concomitante del nivel de los ARNm de p40 de 2,6 kb y de 2,3 kb. La
inducción aparente de la síntesis de las proteínas de la cápside
con pIMRSVam es un efecto trans de la mutación del
gen rep, ya que no ocurre en ninguno de los casos en los que
se expresan las proteínas Rep. Como Rep78 es la principal proteína
Rep producida por pIMRSV, es presumiblemente el principal mediador
del efecto inhibidor, sin embargo, no puede descartarse un papel
para Rep68. Estos resultados sugieren que aunque la infección con
adenovirus es capaz de incrementar significativamente la eficacia de
la traducción del ARNm de p40 (West et al., 1987; Janik
et al., 1989), este efecto puede contrarrestarse por las
proteínas Rep. No está claro si la inhibición de la traducción en
presencia de adenovirus ocurre como una función normal de Rep o si
es un artefacto de la sobreexpresión del gen rep en la
construcción pIMRSV. Alternativamente, la inhibición puede ocurrir
sólo cuando el nivel del ARNm de p40 es bajo y puede solucionarse
cuando la transcripción a partir de p40 se incremente normalmente
con la infección con adenovirus. La inducción de la transcripción a
partir de p40 se evitó en este caso mediante la eliminación de
secuencias antes del extremo 5' de p5.
Estos experimentos han proporcionado más
evidencias de la capacidad de las proteínas Rep para actuar como
represores de la expresión a partir de promotores heterólogos. Se
sabe que las proteínas Rep regulan a la baja la expresión de varios
genes heterólogos (Labow et al., 1987; Antoni et al.,
1991; Rittner et al., 1992; Oelze et al., 1994; Horer
et al., 1995). En los experimentos descritos en la presente
memoria, tanto la expresión del gen cap a partir del promotor
CMV IE como la del gen rep a partir de RSV LTR fueron
reguladas a la baja por Rep. Se ha mostrado previamente que Rep
reduce el nivel de expresión del gen cat a partir del
promotor CMV IE (Heilbronn et al., 1990); de manera similar a
los resultados obtenidos en la presente memoria, este efecto fue
pequeño (aproximadamente 2 veces). Tanto para el promotor CMV IE
como RSV LTR, la inhibición ocurrió a nivel del ARN, aunque debido a
que se ensayaron niveles basales de ARN por el análisis Northern,
el efecto podría ser a nivel de la transcripción o de la estabilidad
del ARNm. La regulación a la baja a nivel de ARN también se ha
demostrado en el caso de los promotores VIH LTR y HPV18 URR y se ha
atribuido principalmente a Rep 78/68 (Antoni et al., 1991;
Horer et al., 1995).
Se pretende que los ejemplos siguientes ilustren
la invención sin limitar el alcance de ésta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un experimento para determinar si un
plásmido auxiliar que proporciona los genes rep y cap
de AAV en un plásmido no replicativo y la utilización de promotores
heterólogos para la expresión génica incrementarían la titulación
del vector AAV por encima de las obtenidas a partir de controles en
los que los genes rep y cap se expresan a partir de
sus propios promotores. Los plásmidos auxiliares ensayados se
muestran en la Figura 7.
pIM45 contiene los genes rep y cap
de AAV bajo el control de los promotores nativos de AAV y el sitio
poliA de AAV en el extremo 3' (McCarty, D.M. et al., J.Virol.
65: 2936-2945, 1991).
pRSVrep-p40cap y
pRSVrep-CMVcap se construyeron delecionando la
región cap de pIM45 utilizando PCR para delecionar los
nucleótidos 2287-4049 en el genoma de AAV, lo que
resulta en la generación de pRep*30. Se clonó un fragmento de PCR
aislado de pRep*30, nucleótidos 275-4464, que
contiene extremos NheI y NotI, entre los sitios
NheI y NotI de pRep9 (Invitrogen, San Diego, CA) para
hacer pRSVrep. Un fragmento XbaI (relleno)-SfiI de
pRSVrep se clonó en pIM45 digerido con SmaI y SfiI
para hacer pRSVrep-p40cap. Este mismo fragmento
XbaI (relleno)-SfiI de pRSVrep se clonó en
pIM-CMVcap digerido con SmaI y SfiI
(véase más adelante) para hacer pRSVrep-CMVcap.
pIM-CMVcap se construyó
introduciendo 3 mutaciones puntuales en las posiciones 1823 (T:C),
1826 (A:C) y 1832 (G:A) en el genoma de AAV para inactivar el
promotor p40. pCMVcapB se generó insertando un fragmento de PCR que
contiene los nucleótidos 1850-4460 del genoma de AAV
y extremos BamHI en el sitio BamHI de pCMVB
(Clontech, Palo Alto, CA). Un fragmento SphI que contiene el
promotor CMV se aisló a partir de pCMVcapB y se insertó en el sitio
SphI en la posición 930 en pIM45 para hacer
pIM-CMVcap.
Los plásmidos auxiliares se transfectaron en
células 293 en una proporción 10:1 auxiliar/vector (16,5 \mug/ADN
total). El vector plásmido AAV utilizado fue pTR-lacZ, que
desarrolló el Dr. Nicholas Muzyczka, Universidad de Florida. El
plásmido se muestra en la Figura 8. El aislamiento y purificación
del vector AAV se realizó como se ha descrito en la Sección 4, más
arriba.
El rendimiento de AAV se tituló coinfectando las
células 293 con adenovirus auxiliar y el AAV. Esto redujo el tiempo
de infección, incrementando por lo tanto la sensibilidad del ensayo.
Para la titulación se plaquearon las células 293 en placas de 6
pocillos a 5x10^{5} células/ml (100 \mul/pocillo) en DMEM/10%
FBS (con penicilina/estreptomicina y glutamina) y se dejó que
crecieran durante un día a 37ºC. Las células se coinfectaron
entonces con virus Adts149 utilizando una MOI de 20 y con el
AAV a diluciones de 1:100, 1:200 y 1:400 etc. de la preparación
madre viral. Las diferentes diluciones se utilizaron con el fin de
averiguar la titulación.
Después de permitir que la infección progresara
durante dos días a 39ºC, el medio se aspiró, las células se
incubaron con 3,7% de formaldehído durante 5 minutos y se lavaron
con Disolución Salina Tamponada con Fosfato (PBS). Las células se
tiñeron entonces con X-Gal
(5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil-\beta-D-galactopiranósido)
a 37ºC durante 1-24 horas y se cribaron para
detectar la presencia de coloración azul en las células con el fin
de detectar la expresión del gen lacZ contenido en el vector
AAV. Se utilizó una conversión utilizando el programa de Análisis
de Titulación, que está basado en la determinación de la dilución
del punto final, para determinar la titulación en UI/ml.
Se realizó un análisis por transferencia Western
para determinar los niveles de la expresión de las proteínas rep y
cap utilizando los diferentes plásmidos auxiliares (y clones
específicos) mostrados en la Figura 7. La Figura 9 muestra un
análisis por transferencia Western de la expresión de la proteína
rep, mientras que la Figura 10 muestra un análisis por
transferencia Western de la expresión de la proteína cap. En el
análisis por transferencia Western se utilizaron técnicas estándar
(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et
al., eds., Wiley and Sons, Nueva York, 1995).
Los datos de la titulación se muestran en la
TABLA 3. La titulación de la preparación madre del vector se
proporciona en UI/ml. El experimento demuestra que los niveles
incrementados de la expresión de cap en particular, como se
pone de manifiesto por la transferencia Western, dan lugar a una
producción incrementada del vector AAV, pTRlacZ, como se
pone de manifiesto por las titulaciones mostradas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La línea celular 293, una línea celular
embrionaria de riñón humano transformada con adenovirus 5 (Graham
et al., 1977) se propagó en medio de Eagle modificado por
Dulbecco con glucosa alta (DME; Irvine Scientific) suplementado con
10% suero fetal bovino (FBS; Irvine Scientific, Santa Ana, CA), 20
mM glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) a 37ºC
y 5% de CO_{2}. El adenovirus tipo 5 mutante, ts149
(Ad5ts149; Ensinger y Ginsberg, 1972) utilizado como virus
auxiliar en estos estudios tiene una capacidad reducida para
replicar el ADN viral a una temperatura no permisiva (39ºC) debido
a una mutación sensible a la temperatura en la ADN polimerasa
codificada por la región temprana 2 del adenovirus (Stillman et
al., 1982). Ad5ts149 se creció en células 293 a la
temperatura permisiva (33ºC) y se purificó por centrifugación en
gradiente de CsCl.
El ADN plasmídico que codifica el vector AAV
recombinante, pTRlacZ, así como el plásmido auxiliar, pIM45
(McCarty et al., 1991) fueron proporcionados generosamente
por N. Muzyczka (Univ. de Florida). pTRlacZ consiste en el
gen LacZ de E. coli (citoplásmico) bajo el control
transcripcional del promotor CMV IE, insertado entre las
repeticiones terminales de AAV. El plásmido que codifica el ARNt
supresor ámbar, pSVtsSU+ (ámbar) (Capone et al.,
1985), se obtuvo de U.L. RajBhandary (MIT). pNTC3, un clon genómico
de AAV que contiene una mutación ámbar en la región codificadora de
rep (Chejanovsky y Carter, 1989) fue proporcionado
amablemente por R. Owens (NIH).
Utilizando pIM45 como plásmido de partida, los
promotores endógenos de AAV, p5 y p40, se reemplazaron por la
repetición terminal larga del Virus del Sarcoma de Rous (RSV LTR) y
el promotor CMV IE, respectivamente. Todas las manipulaciones se
realizaron según procedimientos estándar de clonación (Sambrook
et al., 1989). Todas las enzimas de restricción y las que
modifican el ADN se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA)
y se utilizaron según las especificaciones del fabricante. Los ADN
plasmídicos se purificaron utilizando kits obtenidos de Qiagen
(Chatsworth, CA).
El casete CMV IE-cap se construyó
amplificando en primer lugar un fragmento de ADN que consiste en
secuencias genómicas de AAV entre pb 1852 y 4440 (que codifican las
proteínas de la cápside y que incluyen el sitio de poliadenilación
de ARNm de AAV) mediante PCR (Saki et al, 1988) utilizando
polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA). Este fragmento
se insertó entre los sitios BamHI de pCMV\beta (Clontech,
Palo Alto, CA) para generar el plásmido pCMVcap.
Para obtener una secuencia mínima que codifique
Rep, las secuencias del gen rep entre el sitio BamHI
(pb 1045) y el sitio ApaI (pb 2283) se amplificaron por PCR y
se insertaron en el plásmido pIM45 digerido con BamHI y
ApaI. El resultado fue una deleción entre pb 2283 (justo en
3' respecto al codón de terminación de Rep) y el sitio ApaI
en pb 4049. Este plásmido, pIMrep\Delta, se utilizó para generar
una construcción en la que Rep78/68 se expresan a partir de RSV
LTR. Un fragmento de 2,4 kb del gen rep que se extiende de
pb 276 (justo en 5' respecto al codón de inicio del ARNm de
Rep78/68) hasta pb 4459 se amplificó por PCR a partir de
pIMrep\Delta y se insertó entre los sitios NheI y
NotI del vector de expresión pRep9 (Invitrogen, San Diego,
CA) para crear pRSVrep.
Debido a que las secuencias que codifican las
proteínas Rep y Cap se superponen en la región del intrón de AAV,
hay 431 pb en común entre los casetes de los genes rep y
cap (entre pb 1852 y 2283) de pIMrep\Delta y pCMVcap.
Antes de la inserción del fragmento CMV IE-cap en
pIMrep\Delta para crear p5rep\Delta-CMVcap, las
secuencias de p40 en pIMrep\Delta se mutaron para inactivar el
promotor. Esto se realizó para evitar la generación de AAV de tipo
salvaje como consecuencia de la recombinación entre las secuencias
compartidas. La mutagénesis se realizó por PCR de extensión
superpuesta (Higuchi et al., 1988). pIMrep\Delta se
utilizó como molde para la primera PCR utilizando el
cebador-1 flanqueante
(5'-GGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCC-3';
pb 1024-1050 del genoma de AAV) y el
cebador-1 mutagénico
(5'-GTTTGGGTTCACTGATGTCTGCGTCACTG-3';
pb 1821-1841 de AAV; los nucleótidos mutados están
subrayados). El resultado es la introducción de tres mutaciones de
pares de bases en la región de la caja TATA de p40 : desde
TATAAGTGAG hasta CATCAGTGAA. El cambio de G a A
crea un sitio BanII para permitir el cribado por análisis de
restricción. pIMrep\Delta también se utilizó como molde para la
segunda PCR utilizando el cebador-2 flanqueante
(5'-GTGTGGAATCTTTGCCCAGATGGGCCCGGTTT-GAGCTTC-3';
pb 2260-2283, 4049-4066 de AAV) y
el cebador-2 mutagénico
(5'-CAGTGACGCAGACATCAGTGAACCCAAACG-3';
pb 1821-1841 de AAV). Después de purificar en gel
los productos de PCR anteriores, se realizó una tercera PCR
hibridando los dos primeros productos y realizando una etapa de
amplificación final utilizando sólo los cebadores flanqueantes,
generando así un fragmento de ADN de 1285 pb. Este fragmento se
digirió con BamHI y ApaI y se clonó en los sitios
correspondientes del núcleo de pIMrep\Delta. El plásmido
resultante fue pIMrep\Delta/p40\Delta. El plásmido auxiliar
p5rep\Delta-CMVcap se construyó insertando un
fragmento SphI de pCMVcap que contiene el casete del
promotor CMV IE y el gen cap en el sitio único SphI de
pIMrep\Delta/p40\Delta. De manera similar, con el fin de
construir p5rep\Delta-p40 cap, un fragmento de PCR
con extremos SphI que se extiende de pb 1715 a 4461 de AAV
se generó a partir de pIM45 y se clonó en el sitio SphI de
pIMrep\Delta/p40\Delta.
Las regiones promotoras p5 en los plásmidos
pIM45, p5rep\Delta-CMVcap y
p5rep\Delta-p40cap se reemplazaron por el
promotor RSV LTR mediante escisión en primer lugar de pRSVrep con
XbaI. El sitio XbaI se hizo romo con ADN Polimerasa
I-fragmento de Klenow y el ADN se digirió con
SfiI para liberar un fragmento que contiene el promotor RSV
y el extremo 5' del gen rep. Este fragmento se clonó entonces
entre los sitios SmaI y SfiI del plásmido
parental.
Para introducir una mutación ámbar en pIMRSV, se
aisló un fragmento SfiI-BamHI que contiene la mutación
(en pb 1033 del genoma de AAV) a partir del plásmido pNTC3
(Chejanovsky y Carter, 1989) y se clonó en los sitios
correspondientes de pIMRSV.
Para los experimentos a pequeña escala, las
células 293 se sembraron a una densidad de 1 x 10^{6} células por
placa de 6 cm 48 horas antes de la transfección. Las células se
infectaron con Ad5ts149 en DME-10% FBS a una
multiplicidad de infección (MOI) de 20 durante 1 hora a 37ºC antes
de la transfección. Los procedimientos de transfección se
realizaron utilizando el kit ProFection de fosfato de calcio
(Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. En
general, para el empaquetamiento de AAVr, cada placa recibió una
mezcla de 1,5 \mug de ADN de vector (es decir, pTRlacZ) y
15 \mug de ADN auxiliar. Después de incubar a 37ºC durante 5
horas, la infección/transfección se terminó reemplazando el medio
por DME-10% FBS fresco; las placas se transfirieron
entonces a 39ºC (la temperatura no permisiva para
Ad5ts149).
Para el análisis del empaquetamiento de AAVr,
las células se recogieron a las 48 horas después de la transfección
por centrifugación a baja velocidad en una centrífuga clínica. El
sedimento de cada placa se resuspendió en 100 \mul de disolución
salina tamponada con fosfato (PBS) y se congeló-descongeló cuatro
veces para liberar AAVr. El adenovirus de inactivó con calor
incubando el lisado a 56ºC durante 30 minutos. El lisado se sometió
a una segunda centrifugación a baja velocidad para sedimentar los
restos celulares y se recogió el sobrenadante. La titulación de
AAVr se determinó en células 293 (+/- coinfección con
Ad5ts149; MOI=20) por dilución de punto final. Después de
teñir las células con X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galacto-piranósido)
durante 20-24 horas, se calcularon las titulaciones
utilizando un programa informático basado en el método de Karber
(Lynn, 1992).
\newpage
La replicación del vector ADN en las células
transfectadas se ensayó aislando el ADN extracromosómico 48 horas
después de la transfección según el método de fraccionamiento de
Hirt (Hirt, 1967). Los ADN se digirieron con DpnI (para
digerir el ADN introducido) antes de electroforesis en gel de
agarosa y análisis Southern. Las sondas lacZ y AAV de tipo
salvaje utilizadas fueron ambas oligonucleótidos de 50 mer,
5'-ACTGCTGCCAGGCGCT
GATGTGCCCGGCTTCTGACCATGCGGTCGCGTTC-3' y 5'-TCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGA
AATGCAAGTCCTCGGCCCAG-3' (nucleótidos 1501-1550 de AAV), respectivamente. Estos se marcaron con [\gamma-^{32}P]ATP utilizando la quinasa de polinucleótidos T4 según procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). El filtro se hibridó y se lavó como se describe a continuación para el análisis por transferencia Northern, excepto en que la prehibridación, hibridación y la etapa de lavado final fueron a 60ºC.
GATGTGCCCGGCTTCTGACCATGCGGTCGCGTTC-3' y 5'-TCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGA
AATGCAAGTCCTCGGCCCAG-3' (nucleótidos 1501-1550 de AAV), respectivamente. Estos se marcaron con [\gamma-^{32}P]ATP utilizando la quinasa de polinucleótidos T4 según procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). El filtro se hibridó y se lavó como se describe a continuación para el análisis por transferencia Northern, excepto en que la prehibridación, hibridación y la etapa de lavado final fueron a 60ºC.
Para el análisis de la expresión de las
proteínas Rep y Cap a partir de los diferentes plásmidos auxiliares,
las células 293 se transfectaron en primer lugar como se ha
descrito anteriormente. Se prepararon fracciones nucleares 48 horas
después de la transfección según el procedimiento descrito por
Mendelson et al. (1986). Los volúmenes de las muestras se
normalizaron según el contenido de ADN (por densidad óptica a 260
nm), se mezclaron con 15-20 \mul de tampón de
muestra (500 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% dodecil
sulfato sódico (SDS), 20 mM EDTA, 10%
\beta-mercaptoetanol, 10% glicerol y 0,2% azul de
bromofenol) y se hirvieron durante 5 minutos antes de la carga.
Después de electroforesis en geles de 10%
poliacrilamida/0,1% SDS, las proteínas se transfirieron del gel a
membranas de difluoruro de polivinilideno Hybond (Amersham,
Arlington Heights, IL). Antes de la tinción, los filtros se
bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en 5% de polvo de
leche disuelto en TBST (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl y 0,05%
Tween 20). Los anticuerpos primarios utilizados para los Westerns
de Rep y Cap fueron ambos anticuerpos monoclonales de ratón
(American Research Products, Belmont, MA) :
anti-proteína Rep de AAV, 303.9 (utilizado a una
dilución de 1:10 en TBST) y anti-VP1,
VP-2 y VP-3 de AAV, B1 (utilizado a
una dilución de 1:5 en TBST), respectivamente. Estos se incubaron en
el filtro durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación
vigorosa. Después de una etapa de lavado en TBST (3 x 15 minutos),
el filtro se incubó en el anticuerpo secundario, conjugado de IgG
de cabra anti-ratón (específico de Fab) con
peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a temperatura
ambiente. El filtro se lavó como antes y se reveló utilizando el kit
ECL (Amersham).
El ARN total se aisló a partir de células 293
transfectadas utilizando RNAzol B (Tel-Test, Inc.,
Friendswood, TX) según las instrucciones del fabricante. Antes de
la electroforesis, se combinaron 10 \mug de cada ARN con una
mezcla de desnaturalización (50% DMSO, 10% formaldehído, 20 mM MOPS
(ácido morfolinopropanosulfónico), pH 7,0, 10 mM acetato de sodio,
1 mM EDTA) y colorantes de carga (5% glicerol, 0,1 mM EDTA, 0,04%
azul de bromofenol, 0,04% xileno cianol) y se calentaron a 65ºC
durante 15 minutos. La electroforesis se hizo en un gel 1%
agarosa/0,65% formaldehído y se corrió en tampón de corrida MOPS (20
mM MOPS, pH 7,0, 10 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA). La
transferencia a una membrana de nilón GeneScreen
(NEN-DuPont, Boston, MA) se realizó por acción
capilar toda la noche en 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M citrato de
sodio; Sambrook et al., 1989).
Los filtros se prehibridaron durante
4-5 horas a 65ºC y después se hibridaron toda la
noche a 65ºC en tampón de hibridación (5 x SSC, 0,5% SDS, 5 x
disolución de Denhardt (Sambrook et al., 1989), 100 \mug/ml
de ADN de esperma de salmón desnaturalizado). La sonda fue un
fragmento HincII de 1,6 kb de pIM45 (pb 2397 a 3987 de AAV)
marcado con [\alpha-^{32}P]dATP
(actividad específica, 3.000 Ci/mmol); NEN DuPont, Boston, MA)
utilizando un kit de marcaje aleatorio de cebadores (Stratagene, La
Jolla, CA). El filtro se lavó durante 5 minutos a temperatura
ambiente en 2 x SSC, 0,5% SDS, 15 minutos a temperatura ambiente en
2 x SSC, 0,1% SDS y después durante 2 horas en 0,1 x SSC, 0,5% SDS
a 65ºC y se expuso a una película.
Antes de la transfección de las células 293 para
el crecimiento a gran escala de AAVr, las células se sembraron en
frascos giratorios de manera que pudieran alcanzar un
60-80% de confluencia en el día de la transfección
(la densidad final fue aproximadamente 1 x 10^{8} células/frasco).
La transfección se realizó en medio OptiMem
(Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD)
utilizando lípido #53:DOPE (Lee et al., 1996), 22 \mug de
vector ADN y 218 \mug de ADN auxiliar por frasco. Las células se
infectaron con Ad5ts149 a una MOI de 20 en el momento de la
transfección y se incubaron a 39ºC durante 48 horas antes de la
recogida.
En el momento de la recogida, las células se
desprendieron de los frascos mediante agitación suave. Las células
se sedimentaron por centrifugación en un rotor basculante Sorvall
RC-3B (2.500 rpm, 4ºC, 15 minutos) y se congelaron.
Para la purificación de AAVr, las células se resuspendieron en PBS
que contiene 2 mM MgCl_{2}, 0,7 mM CaCl_{2}, 10% glicerol y 0,1%
Tween.
Se añadió Benzonasa® (Nycomed Pharma A/S,
Copenague, Dinamarca) (10 \mul/l x 10^{8} células) y la
suspensión se incubó con agitación durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se añadió tripsina (Gibco-BRL Life
Technologies) a una concentración final de 0,25% y la suspensión se
incubó de nuevo con agitación durante 1 hora a temperatura
ambiente. Los restos celulares se recogieron por centrifugación
(3.000 rpm, 15 minutos, 4ºC en Sorvall RC-3B) y el
lisado se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El lisado se sometió a centrifugación en un
gradiente por etapas de CsCl (4 horas, 26K rpm, 4ºC, rotor SW28) en
el que las capas superior e inferior fueron 1,37 g/ml y 1,5 g/ml de
CsCl, respectivamente. La capa superior se recogió (entre la
intercapa de CsCl y la banda de Ad5ts149), se ajustó a 1,41
g/ml de CsCl y se centrifugó en un gradiente de equilibrio de CsCl
de 1,41 g/ml (16-20 horas, 4ºC, 35.000 rpm, rotor
NVT.65). Las fracciones se recogieron y se ensayaron en un
refractómetro; las fracciones con una densidad de
1,36-1,41 se juntaron y se dializaron frente a
PBS/1% sacarosa durante 6 horas a 4ºC. La sacarosa se añadió a una
concentración final de 5% y el virus purificado se almacenó en
alicuotas a -80ºC.
La preparación madre de AAVr purificado se
tituló para AAVr en presencia y ausencia de Ad5ts149
(MOI=20) por dilución de punto final como se ha descrito
anteriormente. La titulación de Ad5ts149 contaminante se
determinó de una manera similar excepto en que la tinción fue para
hexon utilizando conjugado anti-adenovirus
(hexon)/FITC (Chemicon, Temecula, CA). El nivel de AAV de tipo
salvaje contaminante se ensayó utilizando el ensayo de formación de
placas de lisis como se ha descrito (Einerhand, et al.,
1995).
La titulación de la partícula de AAV se
cuantificó utilizando un procedimiento modificado de Samulski et
al. (1989). La muestra de AAVr purificado se trató en primer
lugar con proteinasa K en 0,1% SDS a 37ºC durante 3 horas. Se
trataron diluciones apropiadas así como una curva de ADN estándar
(para virus TRlacZ, se utilizó ADN pTRlacZ como
estándar) con disolución de desnaturalización (0,5 M NaOH, 1,5 M
NaCl) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se aplicó un
volumen de 1 ml a una membrana GeneScreen Plus (Amersham)
utilizando un aparato de transferencia por ranuras (Schleicher y
Schuell, Keene, NH). Después de cargar, la ranura se lavó con 300
\mul de 0,5 M de acetato de amonio, pH 5,2. El filtro se secó y se
hibridó como se ha descrito anteriormente. La sonda (un fragmento
PvuII de pTRlacZ) se marcó utilizando el kit de
marcaje Prime-It Fluor (Stratagene, La Jolla, CA).
Después de una serie de lavados como se ha descrito anteriormente
(excepto en que el lavado final a 65ºC fue durante 10 minutos), el
filtro se reveló con el kit de detección Illuminator (Stratagene).
Las concentraciones de las partículas se estimaron comparando la
señal de la muestra con la de la curva estándar.
293-MT-DBP:
Construcción del Plásmido. El plásmido parental
pREP-7 (Invitrogen, San Diego, CA), contiene el
origen EBV de replicación y el gen EBNA para el mantenimiento
extracromosómico del plásmido y el gen de resistencia a higromicina
para la selección del ADN. Para construir pREP/MT/DBP, el promotor
RSV de pREP-7 se reemplazó por el promotor de la
metalotioneína (MT), que se induce con metales pesados. El gen E2A
que codifica la proteína de unión a ADN (DBP) se clonó después del
extremo 3' del promotor MT.
Generación de la Línea Celular 293/MT/DBP. Las
células 293 se transfectaron con pREP/MT/DPB clon 0.5 mediante
transfección con fosfato de calcio. Las células transfectadas se
seleccionaron durante 6 semanas con higromicina; las células
seleccionadas se expandieron por clonación y se juzgaron tomando
como base la expresión de DBP (mediante inmunofluorescencia)
después de la inducción y la capacidad de complementar los vectores
E1-/E2A.
Líneas Celulares 3B1 y 2C4: El plásmido parental
contiene un casete de expresión para los marcos de lectura abierto
6 y 6/7 (ORF) de E4 del adenovirus. El promotor utilizado para
dirigir la expresión es un promotor mutante de metalotioneína
humana que tiene un nivel bajo de actividad basal. (Makarov et
al., Nuc. Acids Res. 22(8): 1504-1505
(1994)).
Tanto la línea celular 3B1 como 2C4 se
obtuvieron a partir de células 293 que son células embrionarias de
riñón humano que han sido transformadas con la región E1 del
Adenovirus de Tipo 2. Tanto 3B1 como 2C4 tienen la capacidad de
complementar vectores de adenovirus recombinantes a los que se ha
delecionado E1 y E4. Las líneas celulares contienen un promotor
mutante de metalotioneína humana y señales de corte y empalme y de
poliadenilación de SV40 para dirigir la expresión de los marcos de
lectura abiertos 6 y 6/7 de E4 del adenovirus de tipo 2
(nucleótidos 34082-32913 del adenovirus). Para la
complementación de las funciones de E4, puede inducirse la
expresión de los ORF 6 y 6/7 mediante la adición de 100 \muM
Zn^{2+}, 2 \muM Cd^{2+}. Brevemente, las células 293 se
transfectaron con el plásmido parental. Las células se
cotransfectaron con pSV2Neo de manera que pudieran seleccionarse
clones individuales con G418.
Caracterización de un sitio preferido en el
cromosoma 19 humano para la integración de ADN de virus
adenoasociados por recombinación no homóloga. Se inyectó a
700-800 ratones CD-1 un fragmento de
ADN purificado (fragmento EcoRI-SacI de 0,7
kb de AAVS1; Kotin et al., EMBO J. 11:
5071-5078). 550-600 huevos
sobrevivieron y se escindieron. Se implantaron 19 ratones con
huevos inyectados y nacieron 148 crías.
Se aisló el ADN cromosómico a partir de las
colas de los ratones y se cribó por análisis Southern. Se
encontraron seis ratones positivos (#66, 73, 85, 93, 123, 147)
(Tabla 4).
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\vskip1.000000\baselineskip
Los F_{0} positivos se cruzaron con ratones
CD-1 wt y produjeron setenta y dos crías F1.
Se aisló el ADN cromosómico a partir de la progenie F1 y se cribó
utilizando PCR (fragmento de 250 pb producido por muestras positivas
en presencia de DMSO) (Tabla 5). Tomando como base los resultados
del cribado, se crió un total de 43 ratones
(Tabla 6).
(Tabla 6).
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\vskip1.000000\baselineskip
Brevemente, se cortaron muestras de cola y se
tripsinizaron como con las muestras previas. Se pusieron células
libres y grumos de células en placas de 6 pocillos (un pocillo/cola)
en 10% de suero de ternera en DMEM. Los análisis de las células 4
días después, indicaron que varias células adheridas tenían una
morfología semejante a los fibroblastos. En ese momento, los grumos
de células se eliminaron y se reemplazaron por medio fresco. Las
células de los cultivos primarios F1 se infectan con AAV (10 MOI)
(titulación de AAV 9 x 10E9/ml= 9 x 10E6/ul) (1 x 10^{6}
células/placa). 48 horas después de la infección, las células se
recogen y se someten a análisis Hirt.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Aunque la invención se ha descrito con
referencia a las realizaciones descritas, debe entenderse que pueden
hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la
invención. De acuerdo con esto, la invención sólo está limitada por
las reivindicaciones siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Antoni, B. A., A. B. Rabson, I. L.
Miller, J. P. Trempes, N. Chejanovsky y B. J.
Carter. 1991. Adeno-associated virus
Rep protein inhibits human immunodeficiency virus type 1 production
in human cells. J. Virol. 65:396404.
Beaton, A., P. Palumbo y K. I.
Berns. 1989. Expression from the
adeno-associated virus p5 and p19 promoters is
negatively regulated in trans by the rep protein. J. Virol.
63:4450-4454.
Berns, K. I. y R. M. Linden.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GENZYME CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES AAV MEJORADOS PARA TERAPIA GÉNICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: GENZYME CORPORATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One Mountain Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Framingham
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 01701
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0. Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/14423
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE CUMPLIMENTACIÓN: 06-SEP-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DUGAN, DEBORAH A
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37,315
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: GEN5-7.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (508) 872-8400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (508) 872-5415
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador oligonucleotídico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATTACCTC GGAGAAGCA GTGGATCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador oligonucleotídico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTTGGGTTC ACTGATGTCT GCGTCACTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido - región de la caja TATA de p40"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAAGTGAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido - mutación en la región de la caja TATA de p40"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCAGTGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador oligonucleotídico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTGGAATC TTTGCCCAGA TGGGCCCGGT TTGAGCTTC
\hfill
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador oligonucleotídico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTGACGCA GACATCAGTG AACCCAAACG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Sonda oligonucleotídica"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGCTGCCA GGCGCTGATG TGCCCGGCTT CTGACCATGC GGTCGCGTTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "Sonda oligonucleotídica"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG
\hfill
Claims (13)
1. Un método para producir virus adenoasociados
(AAV) recombinantes, comprendiendo dicho método las etapas de:
(1) cultivar una composición que comprende
células que se han transfectado transitoriamente con:
(a) un plásmido auxiliar AAV que comprende
ácidos nucleicos que codifican las proteínas rep y cap de AAV;
(b) un plásmido auxiliar adenoviral que
comprende genes auxiliares esenciales de adenovirus, seleccionándose
dichos genes auxiliares esenciales de adenovirus presentes en dicho
plásmido del grupo que consiste en E1A, E1B, E2A, E4, E4ORF6,
E4ORF6/7, VA ARN y combinaciones de estos; y
(c) un vector AAV que comprende una primera y
segunda repetición terminal invertidas (ITR) de AAV, en el que
dichas primera y segunda ITR de AAV flanquean un ADN que codifica un
polipéptido de interés, estando dicho ADN unido de manera operativa
a un ADN promotor;
en ausencia de partículas de adenovirus; y
(2) purificar el AAV recombinante producido a
partir de lo anterior.
2. El método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho plásmido auxiliar de virus
adenoasociado (AAV) comprende un gen rep de AAV y dicho gen rep de
AAV está bajo el control de un promotor heterólogo.
3. El método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho plásmido auxiliar de virus
adenoasociado (AAV) comprende un gen cap de AAV y dicho gen cap de
AAV está bajo el control de un promotor heterólogo.
4. El método según la reivindicación 3,
caracterizado porque dicho gen cap de virus adenoasociado
(AAV) está bajo el control de un promotor heterólogo expresado
constitutivamente.
5. El método según la reivindicación 4,
caracterizado porque dicho gen cap de virus adenoasociado
(AAV) está bajo el control de un promotor inmediato temprano de
citomegalovirus (CMV IE).
6. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho plásmido
auxiliar adenoviral comprende secuencias repetidas terminales
invertidas (ITR) de virus adenoasociado (AAV) flanqueando los genes
auxiliares de adenovirus y dichas secuencias ITR de AAV permiten que
el plásmido se replique.
7. Un método para producir virus adenoasociados
(AAV) recombinantes, comprendiendo dicho método las etapas de:
(1) cultivar una composición que comprende
células que se han transfectado con:
(a) un plásmido auxiliar AAV que comprende
ácidos nucleicos que codifican las proteínas rep y cap de AAV;
(b) un plásmido auxiliar adenoviral que
comprende genes auxiliares esenciales de adenovirus, seleccionados
del grupo que consiste en E1A, E1B, E2A, E4, E4ORF6, E4ORF6/7, VA
ARN y combinaciones de estos, en el que el plásmido auxiliar de
adenovirus comprende secuencias repetidas terminales invertidas
(ITR) de AAV flanqueando los genes auxiliares de adenovirus y dichas
secuencias ITR de AAV permiten que el plásmido se replique; y
(c) un vector AAV que comprende una primera y
segunda ITR de AAV, en el que dichas primera y segunda ITR de AAV
flanquean un ADN que codifica un polipéptido de interés, estando
dicho ADN unido de manera operativa a un ADN promotor;
en ausencia de partículas de adenovirus; y
(2) purificar el AAV recombinante producido a
partir de lo anterior.
8. Una composición para producir virus
adenoasociados (AAV) recombinantes, comprendiendo dicha
composición:
(a) un plásmido auxiliar AAV que comprende
ácidos nucleicos que codifican las proteínas rep y cap de AAV;
(b) un plásmido auxiliar adenoviral que consiste
en genes auxiliares de adenovirus, seleccionados del grupo que
consiste en E1A, E1B, E2A, E4, E4ORF6, E4ORF6/7, VA ARN y
combinaciones de estos; y
\newpage
(c) un vector AAV que comprende una primera y
segunda repetición terminal invertida (ITR) de AAV, en el que dichas
primera y segunda ITR de AAV flanquean un ADN que codifica un
polipéptido de interés, estando dicho ADN unido de manera operativa
a un ADN promotor;
en el que dicha composición no contiene
partículas de adenovirus.
9. La composición según la reivindicación 8,
caracterizada porque dicho plásmido auxiliar de virus
adenoasociado (AAV) comprende un gen rep de AAV y dicho gen rep de
AAV está bajo el control de un promotor heterólogo.
10. La composición según la reivindicación 8,
caracterizada porque dicho plásmido auxiliar de virus
adenoasociado (AAV) comprende un gen cap de AAV y dicho gen cap de
AAV está bajo el control de un promotor heterólogo.
11. La composición según la reivindicación 10,
caracterizada porque el gen cap de virus adenoasociado (AAV)
está bajo el control de un promotor heterólogo expresado
constitutivamente.
12. La composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho gen cap de virus adenoasociado
(AAV) está bajo el control de un promotor inmediato temprano de
citomegalovirus (CMV IE).
13. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, caracterizada porque dicho plásmido
auxiliar adenoviral comprende secuencias repetidas terminales
invertidas (ITR) de virus adenoasociado (AAV) flanqueando los genes
auxiliares de adenovirus y dichas secuencias ITR de AAV permiten que
el plásmido se replique.
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