CN112533621A - 强化病毒疗法的基于细胞的媒介 - Google Patents

强化病毒疗法的基于细胞的媒介 Download PDF

Info

Publication number
CN112533621A
CN112533621A CN201980051791.1A CN201980051791A CN112533621A CN 112533621 A CN112533621 A CN 112533621A CN 201980051791 A CN201980051791 A CN 201980051791A CN 112533621 A CN112533621 A CN 112533621A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
virus
subject
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980051791.1A
Other languages
English (en)
Inventor
D·德拉加诺夫
A·A·绍洛伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kalidi Biotherapy Co ltd
Original Assignee
Kalidi Biotherapy Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kalidi Biotherapy Co ltd filed Critical Kalidi Biotherapy Co ltd
Publication of CN112533621A publication Critical patent/CN112533621A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本文提供了载体细胞和病毒组合以及用于治疗癌症的方法。还提供了用于此类治疗的修饰的载体细胞，以及选择与用于此类治疗的对象相匹配的载体细胞的方法。

Description

强化病毒疗法的基于细胞的媒介
相关申请的交叉引用
要求Dobrin Draganov和Aladar A.Szalay于2018年6月4日提交的标题为“强化病毒疗法的基于细胞的媒介”的美国临时申请序列号62/680,570的优先权。该申请的主题以引用的形式整体并入。
技术领域
本文提供了载体细胞和病毒组合以及用于治疗癌症的方法，以及将其与对象匹配以进行治疗的方法。
背景技术
溶瘤病毒有望作为癌症治疗剂。溶瘤病毒被设计为在癌细胞中积累和复制。溶瘤病毒可裂解癌细胞，并且也可用于编码和递送抗癌剂。然而，溶瘤病毒的功效会受到循环中和抗体、先天和适应性免疫机制以及干扰病毒在癌性肿瘤/细胞中的递送和/或积累的其它清除机制的阻碍。需要用于实现溶瘤疗法的改进的递送方法。
发明简述
溶瘤疗法的挑战是被治疗对象的免疫系统具有消除病毒感染的功能。溶瘤病毒优先在肿瘤组织和其它免疫豁免环境中复制，但特别是如果其为全身施用的，则必须逃避、避免宿主的免疫(先天和适应性)应答或以其它方式受到保护，以使足够的病毒到达肿瘤和转移瘤。通过感染细胞并将其用作病毒的递送媒介(本文也称为载体细胞(carrier cell)或细胞媒介(vehicle))已解决了此问题。癌细胞、肿瘤细胞以及多种类型的干细胞和正常细胞可携带溶瘤病毒，以帮助保护它们免受循环中补体和抗体介导的中和作用。病毒必须能够在细胞中复制，同时能够逃脱宿主的免疫系统足够的时间以到达肿瘤或肿瘤细胞，并递送病毒。正是这些性质使细胞适合用作溶瘤或治疗性病毒的载体细胞。然而，通常，当施用细胞时，特别是全身甚至局部施用时都存在问题，包括但不限于：
-尽管优先归巢于肿瘤环境，但递送效率有限：大多数被感染的细胞被困在肺或其它器官中，仅一小部分成功进入肿瘤。肿瘤内注射仅部分改善递送，原因包括施用的载体细胞在肿瘤中的滞留性差或在循环中漏出。
-大多数癌症对于溶瘤病毒的对象特异性和癌症类型特异性的允许性有限(固有抗性)。
-仅当数量有限的病毒或感染的载体细胞定植在肿瘤中时，通过先天和适应性免疫(包括干扰素-γ(IFNγ)产生)有效控制和消除病毒。
-正确的肿瘤定植不仅需要递送，还需要病毒步骤的初步加强或关键扩增以克服固有的肿瘤细胞抗性以及先天和适应性免疫屏障。
-如果将现成的干细胞或癌细胞用作递送媒介，其存活和病毒扩增潜能将受到同种异体免疫应答的影响，包括例如失活和/或免疫排斥。
本文提供了解决这些问题的方法、细胞和策略，并提供了用于溶瘤疗法的改善的载体细胞和含病毒的细胞。所述细胞包括可用于将病毒递送至肿瘤的任何细胞，并且包括干细胞、肿瘤细胞、细胞系、原代细胞和培养的原代细胞。所述细胞包括干细胞，条件是在不允许胚胎干细胞或源自胚胎干细胞或细胞系的细胞的情况下，提及干细胞不包括此类细胞。因此，在一些实施方案中，所述细胞包括除胚胎干细胞和/或衍生自胚胎干细胞或细胞系的细胞以外的任何干细胞。所述细胞可为自体的或同种异体的。本文的方法使得有可能使用同种异体细胞，包括现成的同种异体干细胞和癌细胞系，不仅递送溶瘤病毒，还提供溶瘤病毒的强有力的瘤内扩增，从而克服现有的同种异体屏障。本文提供的细胞具有改善的用于将溶瘤病毒递送至肿瘤的性质。当考虑任何施用途径时，可通过全身施用来施用所述细胞。对所述细胞进行修饰和/或处理(敏化)以消除、减少或避免宿主免疫系统(包括补体)和宿主抗病毒免疫应答。还可对所述细胞进行修饰或工程化或选择以使特定的目标溶瘤病毒可在所述细胞中复制，从而将治疗量递送至肿瘤、转移瘤和/或肿瘤微环境。
在本文的发现中，本文显示：
基于细胞的递送媒介(干细胞或癌细胞)的高的固有病毒扩增能力不足以保证载体细胞对溶瘤病毒进行原位/体内肿瘤内扩增的能力。基于细胞的递送媒介的扩增潜能可被个体对象针对病毒或细胞，特别是同种异体载体细胞的免疫应答所限制或完全阻断。该问题可通过采用涉及以下一项或多项的替代和补充策略来克服：1)患者和基于同种异体细胞的递送媒介之间基于测定的匹配；2)敏化和保护基于细胞的递送媒介，以改善溶瘤病毒扩增和递送；和3)通过将特定遗传修饰导入基于细胞的递送媒介中，对先天和适应性免疫屏障的工程化抗性。
本文显示溶瘤疗法得到改善，并且通过增加或维持细胞中病毒扩增和/或可降低宿主免疫应答(例如补体或同种异体识别)和/或使细胞敏化或工程化以逃避同种异体识别或补体和/或其它此类应答以使细胞有足够时间将病毒递送至肿瘤并且使病毒复制的因素和处理和/或修饰解决了问题。I型和II型干扰素(IFN)在干细胞和某些肿瘤细胞中是强有力的抗病毒状态诱导剂。其干扰了这些细胞被感染并支持病毒扩增的能力。本文显示，阻断病毒感染的检测和抗病毒状态的诱导可通过使多种干细胞以及肿瘤细胞对病毒感染、扩增及传播敏化而增强它们作为溶瘤病毒载体的治疗潜能。可对细胞媒介进行敏化，例如处理或预处理和/或工程化，以在向宿主施用含病毒的细胞时增强病毒扩增和/或抑制抗病毒状态的诱导。用于实现该目的的靶包括例如抑制干扰素信号传导和/或抑制JAK-STAT信号传导途径，例如抑制JAK1/2。可对细胞进行处理或工程化以表达干扰素或干扰素信号传导途径的抑制剂。例如，可在施用前用JAK1/2抑制剂和/或干扰素抑制剂对细胞、肿瘤细胞和/或干细胞进行预处理。此类的示例是Ruxolintib、奥拉替尼(Oclactinib)和巴瑞克替尼(Baricitinib)。
人血清对干细胞载体可能具有多种有害作用，包括在感染病毒的载体细胞完成其病毒扩增和/或释放病毒颗粒前直接攻击和杀死该感染病毒的载体细胞，从而限制病毒传播至靶肿瘤细胞中。可对细胞进行预处理或工程化以抵御或逃避补体。靶包括补体活化的经典途径和旁路途径，例如补体蛋白C3或C5。抑制性抗体例如以商品名称
Figure BDA0002931076310000021
(Alexion)销售的抗-C5抗体以及C3裂解抑制剂例如坎普他汀(compstatin)以及其它此类补体活化抑制剂可用于保护细胞免受补体侵害。补体活化的多种抑制剂是本领域众所周知的。
可对细胞进行处理或工程化以抑制和/或消除引起同种异体识别和排斥的决定因素。这可增加同种异体干细胞或肿瘤细胞以现成的方式递送溶瘤病毒的治疗潜能，避免了同种异体识别和排斥。此类同种异体排斥决定因素包括被CD8 T细胞和CD4 T细胞识别的高度多态性和患者特异性的MHC I类和II类分子，以及由多种固有T细胞亚群(如NKT、iNKT和混合固有/适应性群例如γδ(gd)T细胞)识别的广谱的较少多态性的决定因素，包括但不限于MHC类MICA/MICB和CD1a、CD1b、CD1c、CD1d分子，以及多种其它与应激相关或应激感知分子，例如嗜乳脂蛋白和膜联蛋白A2。因此，可使细胞敏化/工程化以逃避或抑制同种异体识别/排斥靶。此类靶包括例如T细胞和NK细胞的同种异体排斥反应的决定因素(包括HLA-A、HLA-B、HLA-C)以及NKG2D，其为在NK细胞、CD8+细胞、CD4+细胞子集以及γ-δT细胞(gd T细胞或γδT细胞)上表达的活化受体。可通过泛HLA-A、HLA-B、HLA-C阻断例如泛HLA阻断抗体如Tü39(BioLegend)阻断对HLA决定因素的免疫应答。
多种非MHC标志物的参与(engagement)可增强同种异体和感染病毒的干细胞或肿瘤载体细胞的免疫学应答和排斥，这些标志物通常在感染病毒或转化的肿瘤细胞表面上上调，并充当免疫共刺激分子。此类标志物可直接调节载体细胞逃避免疫排斥的能力。例如，NKG2D分子(受体)识别多种MHC I类相关蛋白，例如人MICA和MICB，作为参与识别和排斥病毒感染和转化的肿瘤细胞的共刺激分子。如本文所示，它们在调节溶瘤病毒载体的免疫逃避潜能中发挥作用。NKG2D分子具有复杂的生物学，可使细胞敏化，以被NK和CD8 T细胞介导的先天和适应性细胞免疫靶向，或当从表面脱落并分泌时，还可用作强有力的免疫抑制剂。NKG2D可通过阻断其活化和/或抑制其配体(如MICA、MICB等)直接抑制。HLA阻断增强了细胞的免疫逃避；NKG2D参与损害了细胞的免疫逃避。
干细胞和肿瘤细胞使用多种免疫抑制和逃避策略，包括IDO表达和IL-10分泌。病毒在载体细胞中的扩增引起细胞活力和免疫抑制潜能的逐渐丧失。为克服该限制，对细胞进行处理或工程化以表达免疫抑制剂。例如，用高剂量的免疫抑制细胞因子IL-10处理细胞，以逆转病毒介导的免疫抑制性质的丧失，并提高感染病毒的载体细胞避免同种异体排斥/应答或早期免疫识别的能力。所述细胞可用免疫抑制因子敏化或工程化以分泌免疫抑制因子，所述免疫抑制因子如IL-10或PDL-1/PD-1途径的成员。例如，对细胞进行预处理或工程化以表达IL-10，其抑制针对细胞的免疫应答。
以上是可处理或修饰细胞载体(包括肿瘤细胞和干细胞，包括同种异体干细胞和肿瘤细胞)以改善或增加治疗有效量的病毒递送至靶肿瘤细胞，并且可对细胞载体进行处理/工程化以增加或维持病毒扩增的方法的实例。处理可在施用所述细胞前实现，或可通过共同施用所述物质实现。下表提供了靶、处理和修饰的示例。这些和其它内容在下面的描述和实例中进行了详细说明。
经敏化以改善病毒扩增和/或免疫调节的细胞媒介
Figure BDA0002931076310000022
Figure BDA0002931076310000031
Figure BDA0002931076310000041
经敏化以对病毒介导的杀伤具有抗性的细胞媒介
Figure BDA0002931076310000042
经工程化以改善病毒扩增和/或免疫调节的细胞媒介
Figure BDA0002931076310000043
Figure BDA0002931076310000051
Figure BDA0002931076310000061
本文提供了捕获对病毒和干细胞的免疫应答的患者特异性差异的方法，提供适当的对象-载体细胞匹配并允许有效使用现成的基于同种异体细胞的递送平台和/或开发用作病毒细胞载体的同种异体细胞，解决了上述问题。不需要细胞的长期存活和移植可促进同种异体干细胞用于溶瘤病毒递送的应用；因此，本文的方法可跨越无关紧要的MHC错配障碍而工作。对象和载体细胞可如本文所述进行处理和修饰并与对象匹配以有效递送病毒。因此，提供了自体干细胞方法的可行替代方式。
本文提供了用于改善溶瘤病毒向肿瘤细胞的递送的方法。细胞媒介已被用作载体(载体细胞)以递送病毒，帮助病毒逃避循环抗体和免疫机制并将病毒递送至癌性肿瘤/细胞。细胞媒介可增进病毒在肿瘤部位的扩增，从而提高其治疗功效并允许病毒克服固有的肿瘤细胞抗性以及先天和适应性免疫屏障。本文提供了具有改善的逃避治疗对象免疫应答的能力的载体细胞(细胞媒介)。提供了使载体细胞与对象匹配以最好地逃避免疫系统并使载体细胞与病毒匹配以及使载体细胞和病毒与待治疗的对象匹配的方法。特别地，提供了用包含溶瘤病毒的同种异体载体细胞治疗对象的方法。通过本文描述的方法使同种异体载体细胞与对象匹配。病毒和载体细胞通常在施用前进行共培养，但它们可分别施用，例如在不同的组合物中依次施用。同样，可施用与病毒共培养或感染病毒的载体细胞，并且可施用尚未与病毒共培养或感染病毒的额外载体细胞。
本文显示，溶瘤疗法通过增加或维持细胞中病毒扩增、和/或降低针对细胞的宿主免疫应答如补体和/或HLA应答以及其它此类应答以允许足够的时间将病毒递送至肿瘤的因子和处理和/或修饰细胞而得以改善并解决了问题。
还提供了使同种异体细胞与对象匹配以避免或减少宿主免疫应答的方法，所述宿主免疫应答在细胞可扩增病毒并将病毒递送至细胞前杀死或抑制细胞。所述方法还可帮助选择针对特定细胞类型的合适病毒。
本文提供了载体细胞，其包含溶瘤病毒，其中：所述病毒可在所述细胞中复制；所述细胞可施用于人类对象；所述细胞已被处理或修饰或两者皆有，以增强所述细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质，以施用于人类对象；以及任选地，所述细胞已被处理或修饰以增强所述病毒在所述细胞中的扩增。本发明提供了载体细胞，其已被处理或修饰或两者皆有，以增强所述细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质，以施用于人类对象；并且已被处理或修饰以增强病毒在细胞中的扩增。还提供了载体细胞，其允许溶瘤病毒扩增，并且在肿瘤中积累，和/或，提供了载体细胞，其在足以将病毒递送至对象中肿瘤的时间内未被所述对象的免疫系统识别。目的是使细胞存活足够长的时间，以扩增病毒并将病毒递送至肿瘤和转移瘤。最终，当细胞被病毒溶解时，细胞将消散。载体细胞是经处理或修饰的干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞。在其中载体细胞是干细胞的一些实施方案中，所述细胞不是胚胎或胎儿干细胞或不是衍生自胚胎细胞系。所述载体细胞可从对象中取出或获取并已被所述溶瘤病毒感染，或者其可为同种异体的。所述干细胞可是成体干细胞，或者在允许的情况下是胚胎干细胞或胎儿干细胞。示例性载体细胞可选自间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、多潜能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质干细胞、内皮干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼年干细胞、上皮干细胞、胚胎上皮干细胞和成纤维细胞干细胞。在一些实施方案中，所述载体细胞是间充质干细胞。间充质干细胞的示例是来自以下的间充质细胞：成年骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或液体间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton's Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质干细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳齿干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞，来自端突的干细胞和肌肉卫星细胞，或它们的混合物。
在一些实施方案中，所述载体细胞是脂肪基质细胞，例如脂肪基质间充质细胞。例如，所述细胞可是外膜外(supra adventitial)脂肪基质细胞(SA-ASC；CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-)，和/或周细胞(CD235a-/CD45-/CD34-/CD146+/CD31-)，例如外膜外脂肪基质细胞(CD34+SA-ASC)。在其它实施方案中，所述载体细胞可选自内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞和周细胞。在允许的情况下，所述载体细胞可是胚胎上皮细胞。
在其它实施方案中，所述载体细胞可为免疫细胞。免疫细胞可选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、靶向肿瘤特异性抗原的T细胞受体(TCR)转基因细胞和靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞。
在一些实施方案中，所述载体细胞是来自血液恶性肿瘤细胞系的经修饰或处理的细胞。通常，对恶性细胞进行处理，使其不能复制。
在所有实施方案中，所述载体细胞对于待治疗的对象可为同种异体的，或可为自体的。在同种异体的情况下，可对其进行处理或敏化或工程化以避免或不经受治疗对象的免疫应答，和/或与所述对象匹配以在足够长的时间内避免此类应答，以将病毒递送至肿瘤。
所述载体细胞可为来自细胞系的细胞，例如但不限于人白血病、T细胞白血病、髓单核细胞白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、红白血病、髓单核母细胞白血病、恶性非霍奇金NK淋巴瘤、骨髓瘤/浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和巨噬细胞细胞系。此类细胞系的示例是选自以下的一种：
白血病细胞系，其为KASUMI-1、HL-60、THP-1、K-562、RS4；11、MOLT-4、CCRF-CEM、JVM-13、31E9、ARH-77、MoB、JM1、NALM-1或ProPak-X.36；
T细胞白血病细胞系，其为HM-2、CEM-CM3、Jurkat/Jurkat克隆E6-1、J.CaM1.6、BCL2 Jurkat、BCL2 S87A Jurkat、BCL2 S70A Jurkat、Neo Jurkat、BCL2 AAA Jurkat、J.RT3-T3.5、J45.01、J.gamma1、J.gamma1.WT、JK28、P116、P116.cl39、A3、JX17、D1.1、I 9.2或I 2.1；
髓单核细胞白血病细胞系，其为MV-4-11；
淋巴瘤细胞系，其为HT、BC-3、CA46、Raji、Daudi、GA-10-Clone-4、HH或H9；
非霍奇金淋巴瘤细胞系，其为SU-DHL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-4、SU-DHL-5、SU-DHL-6、SU-DHL-8、SU-DHL-10、SU-DHL-16、NU-DUL-1、NCEB-1、EJ-1、BCP-1、TUR或U-937；
伯基特淋巴瘤细胞系，其为Ramos/RA 1、Ramos.2G6.4C10、P3HR-1、Daudi、ST486、Raji、CA46、来自伯基特淋巴瘤患者的人γ-疱疹病毒4/HHV-4颊癌、DG-75、GA-10、NAMALWA、HS-Sultan、Jiyoye、NC-37、20-B8、EB2、1G2、EB1、EB3、2B8、GA-10克隆20或HKB-11/肾脏-B细胞杂交体；
弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系，其为Toledo或Pfeiffer；
套细胞淋巴瘤细胞系，其为JeKo-1、JMP-1、PF-1、JVM-2、REC-1、Z-138、Mino或MAVER-1；
AML细胞系，其为AML-193、BDCM、KG-1、KG-1a、Kasumi-6或HL-60/S4；
CML细胞系，其为K562、K562-r、K562-s、LAMA84-r、LAMA84-s、AR230-r或AR230-s；
ALL细胞系，其为N6/ADR、RS4；11、NALM6克隆G5、Loucy、SUP-B15或CCRF-SB；
红白血病细胞系，其为IDH2-突变体-TF-1同基因细胞系；
髓单核母细胞白血病细胞系GDM-1；
恶性非霍奇金NK淋巴瘤细胞系，其为NK-92或NK-92MI；
骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系，其为U266B1/U266、HAA1、SA13、RPMI-8226、NCI-H929或MC/CAR；
多发性骨髓瘤细胞系，其为MM.1R、IM-9或MM.1S；以及
巨噬细胞细胞系，其为MD、SC或WBC264-9C。
所述载体细胞可为选自以下的经修饰的或处理的细胞：
间充质干细胞系，其为APCETH-201(APCETH)、APCETH-301(APCETH)、Cx601(TIGENIX)、TEMCELL、MSC-100-IV或Prochymal(MESOBLAST)；或
诱导多能干细胞(iPSC)，其为ToleraCyte(Fate Therapeutics)；或
成纤维细胞系，其为CCD-16Lu或WI-38；或
肿瘤相关成纤维细胞细胞系，其为Malme-3M、COLO 829、HT-144、Hs 895.T、hTERT或PF179T CAF；或
内皮细胞系，其为HUVEC、HUVEC/TERT 2或TIME；或
胚胎上皮细胞系，其为HEK-293、HEK-293STF、293T/17、293T/17SF或HEK-293.2sus；或
胚胎干细胞系，其为hESC BG01V；或
上皮细胞系，其为NuLi-1、ARPE-19、VK2/E6E7、Ect1/E6E7、RWPE-2、WPE-stem、End1/E6E7、WPMY-1、NL20、NL20-TA、WT9-7、WPE1-NB26、WPE-int、RWPE2-W99或BEAS-2B。
所述载体细胞可为是来自人血液恶性肿瘤细胞系的细胞系的经修饰或处理的细胞。所述载体细胞可为来自人肿瘤细胞系的经修饰或处理的细胞。细胞系包括但不限于选自以下的细胞系：NCI-60组、纤维肉瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、妇科癌、肉瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌、胚胎癌、睾丸畸胎瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、甲状腺癌或间皮瘤细胞系。
所述载体细胞可为来自GM-CSF全肿瘤细胞疫苗(GVAX)的经修饰或处理的细胞。可如本文所述对GVAX进行修饰或处理，以使其在足够的时间内不诱导抗病毒应答或其它免疫应答以将病毒递送至肿瘤。示例性的GVAX包括如本文所述各经修饰或处理的GVAX前列腺细胞；GVAX胰腺细胞；GVAX肺细胞；或GVAX肾细胞。
溶瘤病毒可为本领域技术人员已知的任何病毒。包括选自以下的溶瘤病毒：新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、痘病毒、柯萨奇病毒(CXV)和塞内卡谷病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)。在一些实施方案中，溶瘤病毒是痘苗病毒，例如但不限于天花疫苗。示例性痘苗病毒包括衍生自李斯特株、西储(Western Reserve，WR)株、哥本哈根(Copenhagen，Cop)株、伯尔尼(Bern)株、巴黎株、塔什干株、天坛(Tian Tan)株、惠氏(Wyeth)株(DRYVAX)、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、安卡拉株、CVA382株、大连(Dairen)I株、LC16m8株、LC16M0株、修饰的痘苗安卡拉(modified vaccinia Ankara，MVA)株、ACAM株、WR 65-16株、康诺特(Connaught)株、纽约市健康委员会(New York City Board of Health，NYCBH)株、EM-63株、NYVAC株、李斯特株LIVP、JX-594株、GL-ONC1株以及具有VGF和TK缺失的vvDD TK突变株(参见例如McCart等(2001)Cancer Res 61：8751-8757)。例如，痘苗病毒可为ACAM2000或ACAM1000。
所述病毒可为溶瘤腺病毒，例如ONYX-015、CG00070、Oncorin(H101)、ColoAd1、ONCOS-102或Delta24-RGD/DNX-2401。该病毒可为修饰的HSV-1病毒或麻疹病毒。
所述溶瘤病毒可被修饰以表达异源性基因产物和/或具有增加的致瘤性和/或具有降低的毒性(增加的减毒)。所述病毒可编码可检测标志物，用于在培养物中或在对象中进行检测。例如，所述标志物可为荧光蛋白，例如Turbo-Red或GFP。
可对所述载体细胞进行敏化或处理或工程化以(与未敏化、处理或工程化的病毒相比)实现增强或改善以下一种或多种：所述细胞中的病毒扩增、阻断所述对象或肿瘤微环境中抗病毒状态的诱导、免疫抑制/免疫逃避、针对同种异体失活/排斥决定因素的保护和/或针对补体的保护。提供了载体细胞，其经敏化或工程化以增强或改善病毒扩增；或经敏化或处理或工程化以阻断对象或肿瘤微环境中抗病毒状态的诱导；或通过用一种或多种细胞因子或生长因子预处理或处理而被处理、敏化或工程化以增强病毒扩增。例如，所述载体细胞可经处理以抑制干扰素-γ和/或干扰素-β或经修饰以表达干扰素-γ和/或干扰素-β的抑制剂。在一些实施方案中，可将试剂和细胞共施用至宿主而非用所述试剂处理细胞。
经敏化以增强病毒扩增的载体细胞的示例是通过预处理或处理以用IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、GM-CSF、RTK/mTOR激动剂、Wnt蛋白配体和GSK3抑制剂/拮抗剂中的一种或多种加载细胞而被敏化的那些细胞。经敏化以阻止抗病毒状态的诱导的载体细胞的示例是通过预处理或处理以用一种或多种小分子或蛋白质抑制剂加载细胞而被敏化的那些载体细胞，所述小分子或蛋白质抑制剂：干扰I型/II型IFN受体、干扰下游IFN信号传导、干扰IFNAR1/IFNAR2信号传导、干扰IFNGR1/IFNGR2信号传导、干扰STAT1/2信号传导、干扰Jak1信号传导、干扰Jak2信号传导、干扰IRF3信号传导、干扰IRF7信号传导、干扰IRF9信号传导、干扰TYK2信号传导、干扰TBK1信号传导或干扰针对细胞或对象中的溶瘤病毒实现免疫应答的其它信号传导途径。经敏化以阻断抗病毒状态的诱导的细胞的示例是通过预处理或处理以用一种或多种HDAC抑制剂加载细胞以干扰/解除IFN信号传导/反应性而被敏化的那些细胞。示例性的HDAC抑制剂包括但不限于选自伏立诺他、罗米地辛、西达本胺、帕比司他、贝利司他、丙戊酸、莫塞替诺特、艾贝司他、恩替诺特、SB939，resminostat、吉维诺特、quisinostat、HBI-8000，Ketvetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、萝卜硫素和曲古抑菌素的那些抑制剂。经敏化以阻断抗病毒状态的诱导或增强病毒扩增的载体细胞的示例是通过预处理或处理以用病毒感测和/或抗病毒防御途径的拮抗剂加载细胞而被敏化的那些载体细胞。病毒感测和/或防御途径包括由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)中的一种或多种诱导或调节的那些。影响一种或多种这些途径的拮抗剂包括例如K1、E3L和K3L痘苗病毒蛋白；NS1/NS2流感蛋白；丙型肝炎NS3-4A；沙粒病毒NP和Z蛋白；埃博拉病毒VP35；HSV US11，ICP34.5和ICP0；MCMV M45和博纳病病毒X蛋白中的一种或多种。
经敏化以抵御失活/排斥决定因素的载体细胞的示例是通过预处理或处理以用一种或多种病毒主要组织相容性复合物(MHC)拮抗剂加载细胞而被敏化的那些载体细胞。示例的MHC拮抗剂包括选自以下的一种或多种的那些：痘苗病毒的A40R MHCI拮抗剂；HIV的Nef和TAT；腺病毒的E3-19K；HSV 1和HSV2的ICP47；牛痘的CPXV012和CPXV203；水痘带状疱疹病毒(VZV)的ORF66；爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的EBNA1、BNLF2a、BGLF5和BILF1；人巨细胞病毒(hCMV)的US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10和US11/gp33；恒河猴CMV(RhCMV)的Rh178/VIHCE；人疱疹病毒(HHV)6或HHV7的U21；卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1和kK5/MIR2；小鼠肝炎病毒68(MHV-68)的mK3；α疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒2(BHV-1)和伪狂犬病病毒(PRV)的UL41/vhs；水痘病毒、BHV-1、马疱疹病毒1和4(EHV-1/4)和PRV的UL49.5以及鼠CMV(mCMV)的m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40。其它用于预处理或处理的拮抗剂是经处理以使细胞加载人MHC I类链相关基因MIC-A和MIC-B的拮抗剂或病毒来源的β2微球蛋白(B2M)拮抗剂。
经敏化以增强免疫抑制/免疫逃避的载体细胞的示例是通过预处理或处理以使细胞加载病毒来源的免疫抑制因子而被敏化的那些载体细胞。此类因子的示例是免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡的抑制剂；IL-1/NFKB/IRF3拮抗剂；IL-1和Toll样受体(TLR)拮抗剂；IL-1β拮抗剂；TNFα阻断剂；IFNα/β阻断剂和IFNγ阻断剂的一种或多种。
经敏化以增强免疫抑制/免疫逃避的载体细胞的示例是通过预处理或处理以使细胞加载抗原肽转运蛋白1/2(TAP-1和TAP-2)和tapasin的一种或多种的一种或多种小分子抑制剂而被敏化的那些载体细胞。
还可使载体细胞敏化以抵御补体。这可例如通过预处理或处理以使所述细胞加载补体蛋白的抗体或小分子或其它抑制剂来实现。可靶向的补体蛋白包括C3和C5。如上文和下文所述，并在本文中举例说明，存在许多已知的C3和C5的抑制剂，包括对于每种特异的拮抗剂抗体和小分子抑制剂。
通常用敏化或保护的物质对载体细胞进行预处理。可在病毒感染前、病毒感染之后、或施用于所述对象前或在储存前，进行预处理15分钟至48小时。
还可对载体细胞进行敏化或工程化以延长存活并改善局部免疫抑制以减少或限制病毒介导的杀伤。实现此目的的物质包括激动剂，例如STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)的一种或多种，其可被工程化以在适当时间表达的启动子的控制下而被细胞或病毒表达，或施用于对象表达，从而使载体细胞不被病毒很快杀死，而在将病毒递送至肿瘤前不被宿主的免疫系统杀死或抑制。
本文提供的载体细胞也可被工程化以改善病毒扩增和/或免疫调节。例如，这可通过以下一种或多种方式来实现：a)工程化以防止干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性；b)工程化以逃避T和NKT细胞的一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的适应性免疫应答；c)工程化以逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的先天免疫应答；d)工程化以表达人或病毒来源的免疫抑制因子以防止/抑制同种异体抗载体细胞或抗病毒免疫应答；e)工程化以表达癌症或干细胞衍生因子，其促进原本非允许性的载体细胞和/或肿瘤细胞的病毒感染；以及f)工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。
例如，对于a)，所述载体细胞可经工程化以通过短暂或永久抑制I型/II型IFN受体和/或下游信号传导而防止干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性，其中永久抑制可通过缺失被抑制的基因座来实现。抑制可通过抑制以下一种或多种来实现：I型/II型干扰素受体表达、IFNα/β受体表达、IFNγ受体表达、IFNAR1/IFNAR2受体表达、IFNGR1/IFNGR2受体表达、STAT1/2受体表达、Jak1/2受体表达、IRF3受体表达、IRF7受体表达、IRF9受体表达、TYK2激酶表达和TBK1激酶表达。在a)的另一实例中，所述载体细胞可经工程化以通过短暂或永久抑制胞质病毒DNA/RNA感测和抗病毒防御机制的元件而防止干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性。这可通过抑制STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和/或DAI(ZBP1)中的一种或多种来实现。在其它实施方案中，所述载体细胞可被a)工程化以通过短暂或永久表达由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)介导的病毒感测和抗病毒防御途径的拮抗剂而预防干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性。拮抗剂包括但不限于K1、E3L和K3L痘苗病毒蛋白；NS1/NS2流感蛋白；丙型肝炎NS3-4A；沙粒病毒NP和Z蛋白；埃博拉病毒VP35；HSV US11、ICP34.5和ICP0；MCMV M45和博纳病病毒X蛋白中的一种或多种。
例如，对于b)，所述载体细胞可经工程化以逃避T和NKT细胞的一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的适应性免疫应答。例如，这可通过以下一种或两种方法实现：(i)短暂或永久抑制以下一种或多种：MHC I类分子、MHC II类分子、MHC样分子以及MHC I类、MHC II类和MHC样分子的转录或表达的调节物；和/或(ii)短暂或永久表达病毒来源的B2M拮抗剂和/或病毒来源的MHC拮抗剂。一种或多种MHC I类分子的短暂或永久抑制可通过例如HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的永久或短暂抑制来实现；一种或多种MHC II类分子的短暂或永久抑制通过HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中的一种或多种的抑制来实现；一种或多种MHC样分子的短暂或永久抑制通过抑制CD1a/b/c/d来实现；MHC I类、MHC II类和MHC样分子的转录或表达的一种或多种调节物的短暂或永久抑制通过TAP1/2、Tapasin、β2微球蛋白、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP中的一种或多种的抑制来实现。
B2M和/或MHC的短暂或永久抑制可例如通过以下的短暂或永久表达来实现：选自hCMV的UL18的病毒来源的一种或多种B2M拮抗剂；以及一种或多种MHC拮抗剂，其选自以下的一种或多种：痘苗病毒的A40R MHCI拮抗剂；HIV的Nef和TAT；腺病毒的E3-19K；HSV 1和HSV2的ICP47；牛痘的CPXV012和CPXV203；水痘带状疱疹病毒(VZV)的ORF66；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的EBNA1、BNLF2a、BGLF5和BILF1；人巨细胞病毒(hCMV)的US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10和US11/gp33；恒河猴CMV(RhCMV)的Rh178/VIHCE；人疱疹病毒6或HHV7的U21；卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1和kK5/MIR2；小鼠肝炎病毒68(MHV-68)的mK3；α疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒2(BHV-1)和伪狂犬病病毒(PRV)的UL41/vhs；水痘带状疱疹病毒、BHV-1、马疱疹病毒1和4(EHV-1/4)和PRV的UL49.5以及鼠CMV(mCMV)的m4/gp34、m6/gp48、m27和m152/gp40。
例如，对于c)，所述载体细胞可经工程化以通过以下一种或两种逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的先天免疫应答：(i)短暂或永久抑制膜结合的MICA/B或膜结合的PVR或膜结合的连接蛋白-2，其中可通过缺失基因座来实现永久抑制；以及(ii)短暂或永久表达MIC-A和MIC-B的拮抗剂、NKG2D受体的拮抗剂、NCR的拮抗剂、NK抑制性受体(KIR)的配体或NK抑制性受体NKG2a/CD94的配体。例如，所述载体细胞可经工程化以通过以下一种或两种逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的先天免疫应答：(i)短暂或永久抑制NKG2D配体和/或DNAM-1配体；以及(ii)短暂或永久表达：MIC-A和MIC-B的拮抗剂kK5(来自卡波济氏肉瘤病毒(KHSV))；NKG2D受体牛痘OMCP的拮抗剂；靶向NKp30、NKp44、NKp46受体的NCR的拮抗剂血凝素(痘苗病毒和其它病毒的HA)；选自HLA-Bw4和HLA-C2的NK抑制性受体(KIR)的配体；以及NK抑制性受体(NKG2a/CD94)的配体，其选自单独的HLA-E和衍生物或与21M HLA-B配体组合以生成HLA-E结合肽并稳定HLA-E表面表达的HLA-E和衍生物。
例如，对于d)，所述载体细胞可经工程化以表达人或病毒来源的免疫抑制因子，以防止/抑制同种异体抗载体细胞或抗病毒免疫应答。这可例如通过使载体细胞工程化以表达人或病毒来源的免疫抑制因子以防止/抑制同种异体抗细胞媒介或抗病毒免疫应答而实现。人类来源的因子包括但不限于以下的一种或多种：IDO、精氨酸酶、TRAIL、iNOS、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、sMICA、sMICB、sHLA-G、HLA-E、PD-L1、FAS-L、B7-H4和靶向或消耗NK和/或NKT细胞和/或γδT细胞的单链抗体(scFv)。病毒来源的因子包括但不限于以下的一种或多种：鼠痘/痘苗病毒SPI-2/CrmA(免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡的抑制剂)、痘苗病毒编码的N1(IL-1/NFkB/IRF3拮抗剂)、HA(靶向NKp30、NKp44、NKp46的NCR拮抗剂)、IL-18结合蛋白、A40R、A46R、A52R、B15R/B16R、TNFα阻断剂(例如痘苗病毒CmrC/CmrE)、IFNα/β阻断剂(例如痘苗病毒B18R/B19R)、IFNγ阻断剂(例如痘苗病毒B8R)以及其它IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D拮抗剂。
例如，对于e)，所述载体细胞可经工程化以表达癌或干细胞衍生因子，所述因子促进病毒感染原本非允许性(不允许)的载体细胞和/或肿瘤细胞。例如，这可通过使载体细胞工程化以表达癌症或干细胞衍生因子来实现，所述因子促进病毒感染原本非允许性(不允许)的细胞媒介和/或肿瘤细胞，其中所述因子选自一种或多种促进病毒感染的生长因子和细胞因子。示例性因子包括但不限于以下一种或多种：癌相关抗原、癌胚抗原、癌基因/肿瘤抑制因子、分化抗原、GM-CSF、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、RTK/mTOR激动剂和Wnt蛋白配体。
例如，对于f)，所述载体细胞可经工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。例如，这可通过工程化载体细胞以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子来实现，其选自补体蛋白的蛋白质拮抗剂和/或抑制补体蛋白的抗体。例如，干扰补体和/或中和抗体的功能的因子包括但不限于补体因子(例如补体蛋白C1、C2、C3、C4、C5、MBL)的蛋白质拮抗剂、痘苗病毒补体控制蛋白(VCP)、痘苗病毒补体抑制剂(B5R)、scFv抗CD1q/CD1r/CD1s、抗C3抗体、抗C5抗体(例如依库丽单抗)、坎普他汀家族的肽类C3抑制剂(例如Cp40)、人可溶性膜(s/m)蛋白(例如s/mCR1(CD35)、s/mCR2(CD21)、s/mCD55、s/mCD59)、人H因子及衍生物以及眼镜蛇毒因子和具有补体抑制活性的衍生物。
还提供了经修饰的细胞媒介或载体细胞，其包含选自以下的一种或多种修饰：a)敏化所述细胞媒介以增强病毒扩增能力；b)敏化所述细胞媒介以阻断抗病毒应答的诱导和/或改善免疫逃避/免疫抑制；c)保护所述细胞媒介免于所述对象的同种异体失活和/或排斥；d)保护所述细胞媒介抵御补体；和/或e)使所述细胞媒介对病毒介导的杀伤具有抗性。
还提供了为以下目的而工程化的载体细胞：a)短暂或永久表达或抑制使所述细胞媒介对干扰素诱导的抗病毒应答无反应性的基因；b)短暂或永久表达或抑制基因以促进逃避T和NKT细胞的同种异体基因识别和/或γδT细胞；c)短暂或永久表达或抑制基因以促进逃避NK细胞的同种异体识别；d)短暂或永久表达免疫抑制因子；e)短暂或永久表达促进病毒与所述细胞媒介缔合的因子；以及f)短暂或永久表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。进一步的修饰可包括以下一种或多种：a)敏化所述细胞媒介以增强病毒扩增能力；b)敏化所述细胞媒介以阻断抗病毒应答的诱导和/或增强所述细胞媒介的免疫抑制/免疫逃避；c)保护所述细胞媒介免于所述对象的同种异体失活和/或排斥；d)保护所述细胞媒介抵御补体；和/或e)使所述细胞媒介对病毒介导的杀伤具有抗性。
本文提供的任何包含溶瘤病毒的载体细胞可用于治疗方法，所述方法包括将所述载体细胞施用于患有癌症的对象。还提供了细胞用于治疗癌症的用途。施用可为全身或局部施用，也可为肠胃外施用，例如静脉内施用。癌症包括实体瘤和血液恶性肿瘤，并且包括转移性癌症。所述载体细胞对于对象可为同种异体的或自体的。当是同种异体时，所述载体细胞可与对象匹配。特别地，可通过以下描述的方法进行匹配。因此，提供了治疗癌症的用途和方法，其中向对象施用包含溶瘤病毒的载体细胞，并且所述载体细胞匹配或已与所述对象匹配；并且载体细胞是：病毒可在其中复制的细胞；并且经处理或修饰或二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞；和/或经处理或修饰以增强所述病毒在所述细胞中扩增的细胞，从而所述细胞克服了对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至肿瘤。所述载体细胞包括本文所述的任何细胞。
治疗的对象包括动物，特别是哺乳动物，包括宠物、动物园动物和农场动物，以及人。非人类包括例如犬、猫、马、猪、牛、山羊和非人灵长类动物，例如黑猩猩、大猩猩、倭黑猩猩和狒狒。
载体细胞的治疗方法和用途包括将包含溶瘤病毒的载体细胞施用于患有癌症的对象，其中：所述载体细胞对于所述对象是同种异体的并且已与所述对象匹配；并且载体细胞是：病毒可在其中复制的细胞；并且经处理或修饰或二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞；和/或经处理或修饰以增强所述病毒在所述细胞中扩增的细胞，从而所述细胞克服了对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至肿瘤。
载体细胞的治疗方法和用途包括将包含溶瘤病毒的载体细胞施用于患有癌症的对象，其中所述载体细胞对于对象是同种异体的并且已与所述对象匹配。匹配可通过本文的方法实现。
还提供了载体细胞用于治疗癌症的用途，其中：所述载体细胞包含溶瘤病毒；所述载体细胞匹配或已与对象匹配；并且载体细胞是：病毒可在其中复制的细胞；经处理或修饰或二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞；和/或经处理或修饰以增强病毒在细胞中扩增的细胞，从而所述细胞克服了对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至肿瘤。提供了以下用途，其中：所述载体细胞包含溶瘤病毒；所述载体细胞匹配或已与所述对象匹配；并且所述载体细胞是本文所述的任何载体细胞。所述载体细胞可为自体的或同种异体的。当是同种异体的，它们可例如通过本文所述的匹配方法与所述对象匹配。
可通过本文提供的载体细胞、方法和用途治疗的癌症包括实体瘤、血液恶性肿瘤和转移性癌症。所述癌症包括但不限于选自如下的那些：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌(carcinoma)、肉瘤、骨髓瘤和神经母细胞瘤。其它癌症包括但不限于：胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、脑癌、中枢神经系统癌、腺癌、肝癌、皮肤癌、血液癌、胆道癌、骨癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、口腔癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。其它包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌、基底细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、唇癌、舌癌、口腔癌、胶质瘤和咽癌。
如本文所述，可对载体细胞进行处理或修饰以具有改善的病毒扩增性质和/或具有增强的免疫抑制或免疫豁免性质。可通过用促进载体细胞的病毒扩增和/或免疫抑制或免疫豁免性质的因子进行预处理来敏化载体细胞。可对载体细胞进行工程化以改善其病毒扩增潜能。
在所述方法和用途中，带有病毒的载体细胞可与未感染病毒的载体细胞一起施用或顺序施用或在其施用后施用，所述未感染病毒的载体细胞首先用IFN-γ预处理，并在施用包含病毒的载体细胞前或与包含病毒的载体细胞同时使用或施用。
本文提供的载体细胞、方法和用途可以以以下方式使用：与另一抗癌剂的组合疗法或与另一抗癌疗法例如放射疗法和/或外科手术一起治疗。其它抗癌剂或治疗的示例包括但不限于免疫共刺激激动剂、BiTE、CAR-T细胞和靶向肿瘤特异性抗原的TCR转基因T细胞、检查点抑制剂、化疗化合物/抗体和免疫抑制药物。其它抗癌剂包括但不限于免疫治疗和/或免疫抑制药物。其它抗癌剂或治疗包括但不限于选自以下的那些：B7家族(CD28、ICOS)；选自4-1BB、OX40、GITR、CD40、CD30和CD27的TNFR家族；LIGHT；LT-α；靶向以下一种或多种的检查点抑制剂：PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO1和IDO2、CTNNB1(β-连环蛋白)、SIRPα、VISTA、LIGHT、HVEM、LAG3、TIM3、TIGIT、半乳凝素-9、KIR、GITR、TIM1、TIM4、CEACAM1、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD112、CD137(4-1BB)、CD155、CD160、CD200、CD226、CD244(2B4)、CD272(BTLA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、ICOS、A2aR、A2bR、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4和OX40/OX-40L、MDR1、精氨酸酶1、iNOs、IL-10、TGF-β、pGE2、STAT3、VEGF、KSP、HER2、Ras、EZH2、NIPP1、PP1、TAK1和PLK1a；选自以下的化疗化合物和抗体：细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、免疫治疗剂；以及选自以下的免疫抑制药物：糖皮质激素(例如强的松、地塞米松、氢化可的松)、钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus))、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、甲氨蝶呤，来那度胺、咪硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、环磷酰胺、TNFα阻断抗体(例如英利昔单抗/Remicade、依那西普/Enbrel，阿达木单抗/Humira)和氟达拉滨。
如上所讨论的，为用于所述方法和用途，当为同种异体时，所述载体细胞可与待要被施用的对象或施用的对象匹配。还提供了匹配的方法。
所述载体细胞可与来自施用所述细胞的所述对象的免疫细胞匹配，以鉴定与所述对象的免疫细胞充分免疫相容的载体细胞以将病毒递送至所述对象。而且，所述载体细胞可与病毒匹配，其中测量所述细胞扩增病毒的能力。细胞/病毒组合也可与所述对象匹配。来自对象的免疫细胞包括例如外周血单个核细胞(PBMC)。匹配的方法可包括测试所述病毒在所述细胞中复制的能力和/或所述细胞促进病毒扩增的能力。所述方法和用途以及细胞包括其中通过共培养所述细胞和病毒并测量病毒扩增速率来测试所述病毒在所述细胞中复制的能力和/或所述细胞促进病毒扩增的能力的匹配的方法。病毒在细胞中复制的能力和/或细胞促进病毒扩增的能力可例如如下测量：a)使用为或约为0.01-10的感染复数(MOI)测量病毒扩增速率，并在等价测定条件下共培养1天至约1周或1周(24h-1周)的时间；以及b)针对感染的细胞载体的数量进行归一化，其中：在等价测定条件下测得的归一化的Pfu/细胞值可用于计算病毒扩增评分(VAS)，其用于对适合(或不适合)治疗的载体细胞+病毒组合进行排名；噬斑形成单位(pfu)/载体细胞为1-10被认为效力有限(作为特定病毒的细胞载体)；Pfu/细胞为10-100效力好；Pfu/细胞为100-1000效力非常好；Pfu/细胞超过1000效力极高；以及在所述细胞与所述对象的对象相容性筛选中，考虑表现出至少为10的pfu/细胞的载体细胞和病毒的组合用于测试。
按照这些方法：载体细胞/病毒组合通过以下方法与待治疗的对象匹配：a)评估患者特异性遗传多态性以鉴定MHC I/II单体型、KIR单体型和配体，以及非经典MHC单体型，包括HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、MICA/B中的一种或多种；b)将所述对象的遗传多态性谱与可用载体细胞的谱进行比较，以从载体细胞中鉴定与所述对象最相容的细胞；c)通过共培养所述细胞、病毒和免疫细胞来评估所述载体细胞和对象免疫细胞的相容性；以及d)评估病毒扩增水平。因此，匹配的方法可进一步包括：e)通过检测肿瘤细胞的媒介定向迁移和病毒扩增来测量载体细胞+活体肿瘤活组织检查+/-病毒，以鉴定用于施用的载体细胞/病毒，其中：对象肿瘤活组织检查+细胞媒介中的病毒扩增为比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增+等价条件下单独的细胞媒介中的病毒扩增的总和大5％或更多；或比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增大至少5％或更多。
匹配的方法可进一步包括通过培养对象衍生的PBMC+载体细胞+病毒来分析共培养物以评估对象对所述载体细胞介导的病毒疗法的允许性。所述方法、用途、细胞可包括：在对象来源的PMBC+载体细胞+病毒的共培养物中测量病毒扩增，其中匹配为：如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增超过不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的80％，则相容；如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增为不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的30-80％范围内，则中等相容；如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增为不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的10-30％范围内，则最低限度相容；如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增低于不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的10％，则不相容；以及％相容性可用于对每个个体患者和每个特定病毒从最不相容至最相容的载体细胞对载体细胞进行排名。
本文还提供了的载体细胞、方法(包括匹配方法)和用途，其中通过如下方法选择适于将溶瘤病毒递送至患有癌症的对象的细胞媒介(载体细胞)来实现载体细胞与对象之间的匹配，所述方法包括鉴定以下决定因素(a)-(f)中的一种或多种，作为所述细胞媒介(载体细胞)与所述对象之间匹配的指示：
a)所述细胞媒介和所述对象在以下遗传基因座的50％或更多处具有相同的等位基因：
(i)MHC I和/或MHC II单体型；
(ii)KIR单体型和/或KIR配体单体型；以及
(iii)HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c和/或CD1d单体型；
b)将所述细胞媒介在与所述对象的癌性细胞共培养物中温育导致以下一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的细胞至肿瘤迁移评分(CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的肿瘤至细胞迁移评分(TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的积累迁移评分(MRS)为至少20％；
c)将所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和所述对象的癌性细胞的共培养物中温育导致以下一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的加载病毒的细胞至肿瘤迁移评分(V-CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的加载病毒的肿瘤至细胞迁移评分(V-TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的加载病毒的积累迁移评分(V-MRS)为至少20％；
d)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学病毒扩增评分(IVAS)代表在从所述对象获得的免疫细胞存在的情况下的病毒扩增量，相对于除从所述对象获得的免疫细胞不存在外的等价条件下获得的病毒扩增量，为至少20％；
e)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学相容性评分(ICS)代表在所述细胞媒介存在的情况下的免疫应答，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件下的免疫应答，为≤200％，其中所述免疫应答由以下一种或多种的表达量决定：
(i)IFNγ；
(ii)与T细胞、γδT细胞、NK细胞和/或NKT细胞介导的细胞毒性相关的一或多种标志物；和/或
(iii)与T细胞、γδT细胞、NK细胞和/或NKT细胞活化物/效应子功能相关的一或多种标志物；
f)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养中温育时，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件，根据以下等式通过免疫抑制评分(ISS)≥0％测得的所述细胞媒介不增强抗病毒免疫应答和/或抑制抗病毒免疫应答：
ISS％＝[(IV+IC)-ICV]/(IV+IC)×100，其中：
IV＝病毒+从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中的标志物表达水平；
IC＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介的共培养物中的标志物表达水平；
ICV＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介+病毒的共培养物中的标志物表达水平；以及
所述标志物表达水平是e)的(i)、(ii)和(iii)中所示的一或多种标志物的表达水平；以及
如果满足a)-f)中的一项或多项，则确定所述细胞媒介与所述对象之间匹配，并且选择所述细胞媒介适合将溶瘤病毒递送至所述患有癌症的对象。
在a)-f)中的一项或多项前，所述方法可包括：当细胞媒介与所述病毒温育时，以pfu/细胞确定病毒扩增评分(VAS)；以及如果VAS分数为至少10，则使用决定因素(a)-(f)的一种或多种选择用于筛选的细胞媒介，并确定所述细胞媒介与所述对象之间是否匹配。
可通过包括以下的多路复用方法对用于一组可能的载体细胞的匹配方法进行多路复用，以基于溶瘤病毒对对象的有效性或向对象的递送对它们进行排序，其中排名1表示是最期望的、最高的排名，并且较大的数字代表较不期望的排名：
(i)测量组中每个细胞媒介的a)-f)中一或多项的值，并根据测量值对每个细胞媒介排名，其中：
对于a)，细胞媒介与所述对象之间的等位基因的相同性越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于b)，细胞媒介的CTMS、TCMS和/或MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于c)，细胞媒介的V-CTMS、V-TCMS和/或V-MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于d)，细胞媒介的IVAS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于e)，细胞媒介的ICS评分越低，所述细胞媒介的排名越高；以及
对于f)，细胞媒介的ISS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；和/或
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量a)-f)中两或多项的值获得积累排名，其为两或更多个排名的平均值，并根据其积累排名对所述组的细胞媒介进行排名。
多路复用方法可进一步包括：
(i)对于组中的每个细胞媒介，当将所述细胞媒介与所述病毒温育时，以pfu/细胞获得病毒扩增评分(VAS)；
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量VAS分数和a)-f)中一或多项的值，获得积累排名，其为两或更多个排名的平均值；以及
(iii)根据积累排名对所述组中的所述细胞媒介进行排名。
在匹配方法中，基于测量细胞共培养物中的标志物表达获得ICS评分和/或ISS评分。
所述ICS评分和/或所述ISS评分基于测量所述共培养物上清液中的标志物表达而获得；和/或通过包括以下的方法针对所述对象血清对病毒扩增的作用校正所述IVAS评分：(i)以共培养物体积的10-50重量％(或v/v)的量将所述对象的血清添加至d)的共培养物中；(ii)根据以下公式计算对象血清抗性评分(SSRS)：
Figure BDA0002931076310000141
以及
(iii)根据以下公式计算百分比SSRS校正的IVAS评分：
IVAS(校正SSRS的)＝IVAS×(1-SSRS)×100。
提供了选择适于将溶瘤病毒递送至患有癌症的对象的细胞媒介的方法(匹配方法)。所述方法包括鉴定以下决定因素(a)-(f)中的一或多种，作为所述细胞媒介与所述对象之间匹配的指示：
a)所述细胞媒介和所述对象在以下遗传基因座的50％或更多处具有相同的等位基因：
(i)MHC I和/或MHC II单体型；
(ii)KIR单体型和/或KIR配体单体型；以及
(iii)HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c和/或CD1d单体型；
b)将所述细胞媒介在与所述对象的癌性细胞共培养物中温育导致以下一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的细胞至肿瘤迁移评分(CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的肿瘤至细胞迁移评分(TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的积累迁移评分(MRS)为至少20％；
c)将所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和所述对象的癌性细胞的共培养物中温育导致以下一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的加载病毒的细胞至肿瘤迁移评分(V-CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的加载病毒的肿瘤至细胞迁移评分(V-TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的加载病毒的积累迁移评分(V-MRS)为至少20％；
d)当所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学病毒扩增评分(IVAS)代表在从所述对象获得的免疫细胞存在的情况下的病毒扩增量，相对于除从所述对象获得的免疫细胞不存在外的等价条件下获得的病毒扩增量，为至少20％；
e)当所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学相容性评分(ICS)代表所述细胞媒介存在的情况下的免疫应答，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件下的免疫应答，为≤200％，其中所述免疫应答由以下一种或多种的表达量决定：
(i)IFNγ；
(ii)与T细胞、γδT细胞、NK细胞和/或NKT细胞介导的细胞毒性相关的一或多种标志物；和/或
(iii)与T细胞、γδT细胞、NK细胞和/或NKT细胞活化物/效应子功能相关的一或多种标志物；
f)当所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件，根据以下等式通过免疫学抑制评分(ISS)≥0％测得的所述细胞媒介不增强抗病毒免疫应答和/或抑制抗病毒免疫应答：
ISS％＝[(IV+IC)-ICV]/(IV+IC)×100，其中：
IV＝病毒+从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中的标志物表达水平；
IC＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介的共培养物中的标志物表达水平；
ICV＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介+病毒的共培养物中的标志物表达水平；以及
所述标志物表达水平是e)的(i)、(ii)和(iii)中所示的一或多种标志物的表达水平；以及
如果满足a)-f)中的一或多项，则鉴定所述细胞媒介与所述对象之间匹配，并且选择所述细胞媒介适合将溶瘤病毒递送至所述患有癌症的对象。
如上，在a)-f)中的一项或多项前，匹配方法可进一步包括：当细胞媒介与病毒温育时，以pfu/细胞确定病毒扩增评分(VAS)；以及如果VAS分数为至少10，则使用决定因素(a)-(f)的一种或多种选择用于筛选的细胞媒介，并鉴定所述细胞媒介与所述对象之间是否匹配。还提供了上述的多路复用方法。
还提供了在药学上可接受的媒介中含有本文提供的任何载体细胞的药物组合物。所述药物组合物用于治疗癌症的用途以及如上所述和下文所述治疗癌症的方法中。所述组合物可全身、局部、肿瘤内、肝内、静脉内、直肠或皮下施用。所述载体细胞可通过本文所述的匹配方法与对象匹配。
在允许的情况下，下面提出的权利要求和优先权申请美国临时申请序列号62/680,570中的内容以引用的形式并入本节。
发明详述
大纲
A.定义
B.使用基于细胞的媒介(“细胞媒介”)选择用于病毒治疗的组分
(1)基于细胞的媒介
-细胞媒介的类型(自体或同种异体)
(2)病毒
-病毒类型
C.使细胞媒介和病毒与对象匹配的分析
(I)对象衍生的免疫细胞的选择
-细胞类型
-获得细胞的方法
(II)一般培养和标记方法
(III)将基于细胞的媒介(“细胞媒介”)与病毒匹配
(IV)将细胞媒介/病毒组合与对象匹配
1.单体型匹配
2.共培养细胞媒介、病毒和对象衍生的免疫细胞的条件和方法
3.测量被募集到肿瘤细胞的能力/效率以及使原本对病毒感染具有抗性的肿瘤细胞敏化。
4.对象/细胞媒介匹配的分析
a.病毒扩增的测量
b.共培养物免疫调节的测量
c.共培养物的上清液的免疫调节的测量
d.对象特异性细胞媒介的选择
D.具有改善的匹配能力的修饰的细胞媒介
(i)敏化以改善病毒扩增和/或免疫调节
1.类型
a.经敏化以增强病毒扩增能力的细胞媒介
b.经敏化以阻断抗病毒状态诱导的细胞媒介
c.抵御同种异体失活/排斥决定因素的细胞媒介
d.抵御补体的细胞媒介
2.制备方法
(ii)经敏化以对病毒介导的杀伤具有抗性
a.用I型和/或II型干扰素预处理的细胞媒介
b.用抗病毒状态的激动剂/诱导剂(STING、PKR、RIG-1、MDA-5等)预处理的细胞媒介
2.制备方法
(iii)经工程化以改善病毒扩增和/或免疫调节
1.类型
a.经工程化以对干扰素诱导的抗病毒状态无反应性
b.经工程化以逃避T细胞、γδ(gd)T细胞(适应性免疫应答)和NKT细胞的同种异体识别
c.经工程化以逃避NK细胞和γδ(gd)T细胞(先天免疫应答)的同种异体识别
d.经工程化以表达人类或病毒来源的免疫抑制因子
e.经工程化以表达促进病毒感染原本非允许性的肿瘤细胞的癌症或干细胞衍生因子
f.经工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子
2.制备方法
E.用于治疗的细胞媒介/病毒的施用方式
F.治疗方法和与治疗协同的监测
G.药物组合物、组合和试剂盒
H.与细胞媒介+病毒治疗一起施用的额外疗法
I.待治疗的癌症类型
J.实施例
K.权利要求
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，本文全文所指的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其它公开的材料均以引用的形式整体并入。如果本文的术语存在多种定义，以本节中的定义为准。提及URL或其它此类标识符或地址时，应当理解，此类标识符可改变并且互联网上的特定信息可出现并消失，但可通过搜索互联网来找到等价信息。对其的提及证明了此类信息的可用性和公开传播。
如本文所用，“病毒”是指在无宿主细胞的情况下不能生长或复制的大量感染性实体中的任何一种。病毒通常包含围绕遗传物质的RNA或DNA核心的蛋白质外壳，但无半透膜，并且仅在活细胞中能够生长和繁殖。病毒包括但不限于痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、乳头瘤病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、塞内卡谷病毒和塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)。
如本文所用，溶瘤病毒是指在肿瘤对象的肿瘤细胞中选择性复制的病毒。一些溶瘤病毒可在感染肿瘤细胞后杀死肿瘤细胞。例如，溶瘤病毒可通过裂解肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的细胞死亡而引起肿瘤细胞死亡。
如本文所用，术语“治疗性病毒”是指为治疗疾病或病症，例如肿瘤性疾病如癌症、肿瘤和/或转移瘤或炎症或伤口或它们的诊断和/或两者而施用的病毒。通常，本文的治疗性病毒是表现出抗肿瘤活性和最低限度毒性的一种病毒。
如本文所用，术语“痘苗病毒”或“VACV”或“VV”表示属于痘病毒家族的大的、复杂的包膜病毒。它有线性双链DNA基因组，长度约为190kbp，其编码约200种蛋白质。痘苗病毒株包括但不限于衍生自以下的毒株或以下毒株的修饰形式：西储(WR)、哥本哈根(Cop)、伯尔尼、巴黎、塔什干、天坛、李斯特、惠氏、IHD-J、IHD–W、布莱顿、安卡拉、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、CVA382、大连I、LIPV、LC16M8、LC16M0、LIVP、ACAM、WR 65-16、康诺特、JX-594、GL-ONC1、vvDD TK突变株、纽约市健康委员会(NYCBH)、EM-63和NYVAC痘苗病毒株。
如本文所用，病毒制剂研究所(the Institute of Viral Preparations)的李斯特株(LIVP)或LIVP病毒株是指在俄罗斯莫斯科的病毒制剂研究所对小牛皮肤进行适应而产生的减毒李斯特株(ATCC目录号VR-1549)的病毒株(Al'tshtein等(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699)。LIVP株可从例如俄罗斯莫斯科的病毒制剂研究所(参见例如Kutinova等(1995)Vaccine 13：487-493)；FSRI SRC VB载体的微生物保藏机构(Kozlova等(2010)Environ.Sci.Technol.44：5121-5126)获得；或可从莫斯科伊万诺夫斯基病毒学研究所获得(C0355 K0602；Agranovski等(2006)Atmospheric Environment 40：3924-3929)。这也是本领域技术人员众所周知的；因为它是USSR以及整个亚洲和印度用于疫苗接种的疫苗株。该毒株现在被研究者使用并且是众所周知的(参见例如Altshteyn等(1985)Dokl.Akad.Nauk USSR 285：696-699；Kutinova等(1994)Arch.Virol.134：1-9；Kutinova等(1995)Vaccine 13：487-493；Shchelkunov等(1993)Virus Research 28：273-283；Sroller等(1998)Archives Virology 143：1311-1320；Zinoviev等(1994)Gene 147：209-214；和Chkheidze等(1993)FEBS 336：340-342)。LIVP病毒株涵盖通过在细胞系中重复传代而繁殖LIVP而获得的任何病毒株或病毒制品。
如本文所用，术语“经修饰的病毒”是指与病毒的亲本株相比被改变的病毒。通常，经修饰的病毒在病毒基因组中具有一或多个截短、突变、插入或缺失。经修饰的病毒可具有经修饰的一或多个内源病毒基因和/或经修饰的一或多个基因间区域。示例性经修饰的病毒可具有插入病毒基因组中的一或多个异源核酸序列。经修饰的病毒可含有一或多个处于基因表达盒形式的异源核酸序列用于表达异源基因。
如本文所用，术语“载体细胞”，与“细胞媒介”、“载体媒介”、“基于细胞的递送媒介”和“基于细胞的媒介”可互换使用，是指，例如通过病毒与表面蛋白之间的化学或物理相互作用，或通过病毒感染细胞的细胞质或细胞核，可被病毒感染或已被病毒感染或另外与病毒缔合的任何细胞。
如本文所用，“敏化”或“敏化细胞”以改变细胞的性质，是指通常在使用前，通过用修饰细胞性质的物质进行处理(例如通过诱导基因的表达)来处理细胞。
如本文所用，特定细胞载体(本文也称为细胞媒介)与待用载体细胞和病毒治疗的患有癌症的对象之间的匹配意味着所述细胞载体与宿主的免疫系统充分相容以逃避对象的免疫系统以将病毒递送至对象的肿瘤中。本文提供了鉴定与待治疗对象匹配的匹配的载体细胞的测定。所述载体细胞还可与病毒匹配，其中匹配的病毒可在细胞中复制。如果病毒在细胞中扩增/复制并且细胞将病毒递送至对象中的肿瘤，则与病毒匹配的载体细胞是用于施用给对象的匹配物。本文还提供了选择载体细胞/病毒组合的测定。
如本文所用，病毒在载体细胞中的扩增意味着所述病毒在所述细胞中复制以维持所述病毒或增加所述细胞中所述病毒的量。
如本文所用，“宿主细胞”或“靶细胞”可互换使用，意味着可被病毒感染的细胞。
如本文所用，术语“组织”是指通常在生物体内起作用以执行特定功能的相似细胞的群、集合或聚集体。
如本文所用，术语“治疗性基因产物”或“治疗性多肽”或“治疗剂”是指由治疗性病毒表达的可减轻疾病或病症的症状或减轻疾病或病症的任何异源蛋白质。治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡、可被活化以抑制细胞生长或促进细胞死亡、或活化另一物质以抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。任选地，治疗剂可表现出或显出额外的性质，例如允许其用作如本文其它地方所述的成像剂的性质。示例性的治疗剂包括例如细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节物、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化疗化合物或它们的组合。
如本文所用，治疗剂是减轻疾病或病症的症状或减轻疾病或病症的物质。治疗剂、治疗化合物或治疗方案包括常规药物和药物疗法，包括本领域技术人员已知并在本文其它地方描述的用于治疗或预防(即降低患特定疾病或病症的风险)的疫苗。用于治疗赘生性疾病的治疗剂包括但不限于抑制细胞生长或促进细胞死亡、可被活化以抑制细胞生长或促进细胞死亡、或活化另一物质以抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。用于本文提供的方法中的治疗剂可为例如抗癌剂。示例性治疗剂包括例如治疗性微生物例如治疗性病毒和细菌、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、抗代谢物、信号传导调节物、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、放射疗法、化疗化合物或它们的组合。
如本文所用，肿瘤细胞或癌细胞是指由于生长和分裂不受调节或控制而异常分裂和再生的细胞，即易于不受控制生长的细胞。肿瘤细胞可为良性或恶性细胞。通常，肿瘤细胞是可传播至机体其它部位的恶性细胞，这一过程称为转移。
如本文所用，病毒制剂或病毒组合物是指在培养系统中体内或体外通过繁殖病毒株(例如痘苗病毒株，痘苗病毒克隆株或经修饰或重组的病毒株)而获得的病毒组合物。例如，痘苗病毒制剂是指通过病毒株在宿主细胞中繁殖、通常在使用本领域已知的标准方法从培养系统中纯化后获得的病毒组合物。病毒制剂通常由许多病毒颗粒或病毒粒子组成。如果期望，可使用噬斑测定确定样品或制剂中病毒颗粒的数量以计算每个样品单位体积的噬斑形成单位的数量(pfu/mL)，假定形成的每个噬斑代表一个感染性病毒颗粒。与其它病毒颗粒相比，制剂中的每个病毒颗粒或病毒粒子可具有相同的基因组序列(即制剂在序列上是同质的)或可具有不同的基因组序列(即制剂在序列上是异质的)。本领域技术人员应理解，在不存在克隆分离的情况下，病毒基因组中的异质性或多样性会随着病毒再生而发生，例如通过在病毒株自然选择过程中发生的同源重组事件(Plotkin&Orenstein(eds)“Recombinant Vaccinia Virus Vaccines”，Vaccines，第三版(1999年))。
如本文所用，噬斑形成单位(pfu)或感染单位(IU)是指感染的或活的病毒的数量。因此，它反映了制剂中活性病毒的量。pfu可使用病毒噬斑测定(噬斑形成测定)或终点稀释测定来确定，其为本领域技术人员已知的标准测定。
如本文所用，纳米粒子是指用于递送分子或物质的胶体粒子，其微观尺寸为1-1000纳米(nm)或约为1-1000纳米(nm)，例如1nm-100nm，并且在转运和性质方面表现为一个完整单位。纳米粒子包括尺寸均一的那些粒子。纳米粒子包括含有附着至外部的靶向分子的那些粒子。
如本文所用，“靶向分子”或“靶向配体”是指将定位导向特定细胞、组织或器官的任何分子信号。靶向配体的实例包括但不限于与细胞表面分子结合的蛋白质、多肽或它们的部分，包括但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质或其它此类部分。例如，靶向配体包括结合细胞表面受体的蛋白质或其部分，或针对在靶细胞上选择性表达的抗原的抗体。靶向配体包括但不限于生长因子、细胞因子、粘附分子、神经肽、蛋白激素和单链抗体(scFv)。
为本文的目的，提及“抗体”(例如针对免疫细胞群(例如待消耗或抑制以抑制免疫应答的T细胞、γδ(gd)T细胞、NK细胞、NKT细胞)上表达的抗原的抗体)包括全长抗体及其部分(包括抗体片段)。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体(diabody)、抗独特型(anti-Id)抗体或上述任一种的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类(例如IgG2a和IgG2b)的成员。
可使用本领域技术人员已知的标准方法来制备抗体，例如单克隆抗体(参见例如Kohler等，Nature 256：495-497(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；和WO02/46455)。例如，通过标准方法将动物免疫以产生分泌抗体的体细胞。然后将这些细胞从经免疫的动物中取出与骨髓瘤细胞融合。可产生抗体的体细胞，特别是B细胞，可用于与骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可衍生自已处理的(primed)动物的淋巴结、脾和外周血。已从淋巴细胞性肿瘤开发了专门的骨髓瘤细胞系用于产生杂交瘤的融合程序(Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Shulman等，Nature，276：269-282(1978)；Volk等，J.Virol.，42：220-227(1982))。这些细胞系具有三个有用的性质。首先是它们促进了从未融合的且同样无限自我繁殖的骨髓瘤细胞(具有使其无法在支持杂交瘤生长的选择性培养基中生长的酶缺陷)中选择融合的杂交瘤。第二是它们具有产生抗体的能力并且不能够产生内源性轻链免疫球蛋白链或重链免疫球蛋白链。第三个性质是它们可有效地与其它细胞融合。产生杂交瘤和单克隆抗体的其它方法是本领域技术人员众所周知的。产生针对任何多肽(例如免疫细胞群上的抗原标志物)的抗体是常规的。
示例性免疫细胞消耗抗体包括但不限于：
-抗无唾液酸GM1(Thermofisher Scientific)，其可在小鼠体内消耗NK细胞和在多种物种(包括人)中体外消耗NK细胞；
-抗NK1.1，其消耗小鼠中的NK细胞，并且还消耗NKT细胞；
-用于消耗NK细胞的OKM1(抗CD11b，人)和B73.1(抗CD16，人)抗体(Strassmann等，J.Immunol.，130(4)：1556-60(1983))；
-消耗NK细胞的DJ130c或3G8(抗CD16，人)抗体(Choi等，Immunology，124(2)：215-222(2008))；
-IMMU510或B1.1(抗TCRγδ)，其阻断γδ(gd)T细胞。同样，为受体阻断，将γδPBL与阻断抗体抗NKp30(克隆F252)、抗NKp44(克隆KS38)、抗NKp46(克隆KL247)、抗TCRγδ(Beckman Coulter，克隆IMMU510或B1)或抗Vδ1TCR(Fisher Scientific，克隆TCS1或TS8.2)温育(Correia等，Blood，118：992-1001(2011))；
-B1抗体阻断抗原介导的TCR活化；
-GL3和UC7-13D5抗体消耗γδ(gd)T细胞或在小鼠中使其体内内在化(Koenecke等，Eur.J.Immunol.，39(2)：372-9(2009))；
-抗CD1d克隆1B1消耗小鼠中的NKT细胞(Christaki等，J.Immunol.Res.，2015，文章ID 532717)；
-NKTT120消耗人中的iNKT细胞。NKTT120是靶向Vα24-Jα18基因重排不变TCR的人源化IgG1κ单克隆抗体，其具有快速且特异性消耗iNKT细胞的潜能(Field等，PLoS One，12,2.e0171067(2017))。
如本文所用，用于施用的递送媒介是指基于脂质的或基于其它聚合物的组合物，例如脂质体、胶束或反胶束，其与物质(例如本文提供的病毒)缔合以递送至宿主对象中。
如本文所用，病毒在特定组织中的积累是指病毒在施用至宿主后足以使病毒感染宿主的器官或组织的一段时间后，在宿主生物体的特定组织中的分布或定植。如本领域技术人员将认识到的，病毒感染的时间段将根据病毒、待感染的器官或组织、宿主的免疫能力以及病毒的剂量而变化。通常，可在感染病毒后约少于1天、约1天至约2天、3天、4天、5天、6天或7天、约1周至约2周、3周或4周、约1个月至约2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间的时间点确定积累。为本文的目的，在病毒的毒性为轻或可耐受并且至多不致命的程度，病毒优先在宿主的免疫豁免组织(例如发炎组织或肿瘤组织)中积累，但从其它组织和器官(例如非肿瘤组织)清除。
如本文所用，“优先积累”是指病毒在第一位置的积累水平高于第二位置的积累(即第一位置的病毒颗粒浓度或滴度高于第二位置的病毒颗粒病浓度)。因此，相对于正常组织或器官，优先积累在免疫豁免组织(避开免疫系统的组织)如发炎组织和肿瘤组织中的病毒是指在免疫豁免组织(例如肿瘤)中以比病毒在正常组织或器官中积累的水平更高的水平(即浓度或病毒滴度)积累的病毒。
如本文所用，活性是指本文提供的化合物或病毒的体外或体内活性。例如，体内活性是指在体内施用本文提供的化合物或病毒(或其组合物或其它混合物)后引起的生理反应。因此，活性涵盖此类化合物、组合物和混合物引起的治疗作用和药物活性。可在设计用于测试或使用此类活性的体外和/或体内系统中观察活性。
如本文所用，“抗肿瘤活性”或“抗致瘤性”是指体内或体外预防或抑制对象中肿瘤形成或生长的病毒株。抗肿瘤活性可通过评估指示抗肿瘤活性的一或多种参数来确定。
如本文所用，相对于抗肿瘤活性或抗致瘤性，“更高”或“改善”的活性是指病毒株能够以比参比病毒或对照病毒更大的程度或比不存在病毒治疗情况下更大的程度，体外或体内预防或抑制对象中肿瘤的形成或生长。可通过评估病毒(以及必要时对照病毒或参比病毒)对指示抗肿瘤活性的参数的作用来确定抗肿瘤活性是否是“更大”或“改善”的。应理解，当比较两种或更多种不同病毒的活性时，用于体外测定或体内施用的病毒(例如pfu)的量是相同或相似的，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内剂量方案))是相同或相似的。
如本文所用，关于病毒的“毒性”(在本文中也称为毒力或致病性)是指施用病毒后对宿主的有害或毒性作用。对于溶瘤病毒(例如痘苗病毒)，病毒的毒性与其在非肿瘤器官或组织中的积累(这可能影响宿主的存活或导致有害或毒性作用)有关。可通过评估指示毒性的一或多种参数来测量毒性。这些包括在非肿瘤组织中的积累以及对已施用病毒的对象的生存力或健康的影响，例如对体重的影响。
如本文所用，“降低的毒性”是指与未用病毒治疗的宿主相比或与用另一参比病毒或对照病毒施用的宿主相比，将病毒施用于宿主时的毒性或有害作用被减弱或减轻。毒性是否降低或减轻可通过评估病毒(以及如果必要，对照病毒或参比病毒)对指示毒性的参数的影响来确定。应理解，当比较两种或更多种不同病毒的活性时，用于体外测定或体内施用的病毒的量(例如pfu)相同或相似，并且体外测定或体内评估的条件(例如体内剂量方案)相同或相似。例如，当比较病毒和对照或参比病毒在体内施用时的作用时，对象是相同的物种、大小、性别并且在相同或相似的剂量方案下以相同或相似的量施用病毒。特别地，毒性降低的病毒可能意味着在将病毒施用于宿主(例如以治疗疾病)后，病毒不在宿主的非肿瘤性器官和组织中以导致对宿主的损害或伤害的程度积累，或比所治疗的疾病更大程度地、或者比对照或参比病毒更大程度地影响宿主的生存的程度积累。例如，毒性降低的病毒包括在治疗过程中不导致对象死亡的病毒。
如本文所用，“对照”或“标准”是指除未用测试参数处理外，与测试样品基本相同的样品，或者如果是血浆样品，其可来自不受感兴趣的条件影响的正常志愿者。对照也可为内部对照。例如，对照可为具有已知性质或活性的样品，例如病毒。
如本文所用，给药方案是指所施用药剂(例如载体细胞或病毒或其它物质)的量，以及在施用周期内的施用频率。给药方案是待治疗的疾病或病况的函数，因此可变化。
如本文所用，施用频率是指药剂在施用周期内施用的次数。例如，频率可为数天、数周或数月。例如，频率可在施用周期内施用一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次。频率可指施用周期内的连续数天。特定频率是所治疗的特定疾病或状况的函数。
如本文所用，“施用周期”是指在连续施用中重复的病毒施用给药方案的重复时间表。例如，示例性的施用周期是28天周期。
如本文所用，术语免疫豁免细胞和免疫豁免组织是指与免疫系统隔离的细胞和组织，例如实体瘤。通常，向对象施用病毒引起免疫应答，其将病毒从对象中清除。然而，免疫豁免位点被屏蔽或隔离免疫应答，允许病毒生存并通常复制。免疫豁免组织包括增生中的组织，例如肿瘤组织和涉及其它增生性病症的其它组织和细胞，涉及炎症反应的伤口和其它组织。
如本文所用，伤口或病变是指对活生物体中任何组织的任何损害。组织可为内部组织，例如胃粘膜或骨，或外部组织，例如皮肤。如此，伤口或病变可包括但不限于胃肠道溃疡、骨折、瘤形成以及皮肤割伤或磨损。伤口或病变可在软组织(例如脾脏)中，也可在硬组织(例如骨)中。伤口或病变可由任何因素引起，包括外伤、感染或外科手术干预。
如本文所用，肿瘤，也称为赘生物，是当细胞以异常高的速率增殖时导致的异常组织块。肿瘤可显示与正常组织的结构组织以及功能协调的部分或全部缺乏。肿瘤可为良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。如本文所用，肿瘤旨在涵盖造血肿瘤以及实体瘤。
恶性肿瘤可大致分为三大类型。癌(carcinoma)是起于上皮结构(例如乳房、前列腺、肺、结肠和胰腺)的恶性肿瘤。肉瘤是源自结缔组织或间充质细胞(例如肌肉、软骨、脂肪或骨骼)的恶性肿瘤。白血病和淋巴瘤是影响造血结构(与血细胞形成有关的结构)包括免疫系统成分的恶性肿瘤。其它恶性肿瘤包括但不限于神经系统肿瘤(例如神经纤维瘤)、生殖细胞肿瘤和母细胞性肿瘤(blastic tumor)。
如本文所用，切除的肿瘤是指其中肿瘤的大部分已被切除的肿瘤。切除可通过外科手术来实现(即外科手术切除的肿瘤)。切除可为部分切除或完全切除。
如本文所用，疾病或病症是指生物体中例如由感染或遗传缺陷引起的病理状况，并且其特征在于可识别的症状。如本文所述的示例性疾病是赘生性疾病，例如癌症。
如本文所用，参与疾病或疾病过程的细胞是指其存在有助于、加剧、引起或以其它方式参与疾病的病因学或疾病过程的细胞。抑制或杀死此类细胞可缓解疾病的症状或可缓解疾病。此类细胞的实例是肿瘤细胞。杀死或抑制肿瘤细胞的生长或增殖实现了肿瘤的治疗。其它实例是免疫效应细胞，其参与有助于多种疾病病理学的炎性反应。抑制或杀死免疫效应细胞可治疗具有炎性成分的疾病。
如本文所用，“杀死或抑制细胞的生长或增殖”是指细胞死亡或被消除。抑制生长或增殖意味着此类细胞的数量不增加，并且可减少。
如本文所用，“肿瘤细胞”是作为肿瘤部分的任何细胞。通常，与正常细胞相比，本文提供的载体细胞优先归巢于肿瘤细胞，并且本文提供的病毒优先感染对象中的肿瘤细胞。
如本文所用，“转移细胞”是具有转移潜能的细胞。转移细胞具有从对象的第一肿瘤转移的能力，并且可在对象的不同部位处定植组织以在该部位处形成第二肿瘤。
如本文所使，“致瘤细胞”是当被导入对象的合适部位时可形成肿瘤的细胞。细胞可为非转移性或转移性的。
如本文所用，“正常细胞”是不是衍生自肿瘤的细胞。
如本文所用，赘生性疾病是指涉及癌症的任何病症，包括肿瘤发展、生长、转移和进展。
如本文所用，癌症是由任何类型的恶性肿瘤(包括转移性癌症、淋巴性肿瘤和血液癌症)引起或以其为特征的疾病的术语。示例性癌症包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、癌、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径或下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、癌、中枢神经系统淋巴瘤、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、表皮样癌、食道癌、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌/眼内黑色素瘤、眼癌/视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胆结石肿瘤、胃部癌/胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤、巨细胞肿瘤、多形胶质母细胞瘤、胶质瘤、毛细胞肿瘤、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌/肝癌、霍奇金淋巴瘤、增生、增生性角膜神经肿瘤、原位癌、下咽癌、肠神经节瘤、胰岛细胞肿瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌/肾细胞癌、喉癌、平滑肌瘤、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性类癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、马凡体征肿瘤、髓样癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性皮肤癌、转移性鳞状颈癌、口腔癌、粘膜神经瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性病、鼻腔和鼻旁鼻窦癌、鼻咽癌、颈癌、神经组织癌症、神经母细胞瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮肿瘤、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞肿瘤、网状细胞肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、精原细胞瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、局部皮肤病变、滋养细胞肿瘤、尿道癌症、子宫/子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、
Figure BDA0002931076310000201
巨球蛋白血症或威尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)。通常在人类中诊断出的示例性癌症包括但不限于膀胱、脑、乳腺、骨髓、子宫颈、结肠/直肠、肾、肝、肺/支气管、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、甲状腺或子宫的癌症。通常在犬、猫和其它宠物中诊断出的示例性癌症包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、脑肿瘤、黑色素瘤、腺鳞癌、类癌性肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、威尔姆氏肿瘤、伯基特淋巴瘤、小胶质瘤、神经母细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔肿瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖鳞状细胞瘤、可传染性性病瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)肿瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤(例如粒细胞肉瘤)、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞肿瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤和囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。在啮齿动物如雪貂中诊断出的示例性癌症包括但不限于胰岛素瘤、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、胰岛细胞肿瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。影响农业牲畜的示例性瘤形成包括但不限于白血病、血管外皮细胞瘤和牛眼瘤(在牛中)；包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织瘤和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞癌(在猪中)；淋巴瘤和肺腺瘤病(在绵羊中)；肺肉瘤、淋巴瘤、劳氏肉瘤(Rous sarcoma)、网状内皮增生、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴样白血球组织增生(在禽类中)；视网膜母细胞瘤、肝瘤形成、淋巴肉瘤(淋巴母细胞淋巴瘤)、浆细胞样白血病和鳔肉瘤(在鱼中)、干酪性淋巴结炎(CLA)：由假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)细菌引起的绵羊和山羊的慢性、传染性接触传染病以及由南非羊肺炎(jaagsiekte)引起的绵羊的接触传染性肺肿瘤。
如本文所用，“转移”是指癌症从机体的一部分传播至另一部分。例如，在转移过程中，恶性细胞可从原发性肿瘤的部位传播，恶性细胞在该原发性肿瘤部位生长并移入淋巴管和血管，其将细胞运送至生物体中正常组织，细胞在该处继续增殖。已由转移传播的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”，“继发性肿瘤”或“转移”。
如本文所用，抗癌剂或化合物(可与“抗癌剂或抗肿瘤剂”互换使用)是指用于抗癌治疗的任何物质或化合物。这些包括单独使用或与其它化合物或治疗组合使用时可缓和、减少、减轻、预防或置于或维持与肿瘤性疾病、肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标志物的缓解的状态的任何物质，并且可用于本文提供的方法、组合和组合物中。抗癌剂包括抗转移剂。示例性的抗癌剂包括但不限于化疗化合物(例如毒素、烷基化剂、亚硝基脲、抗癌抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂)、细胞因子、生长因子、激素、光敏剂、放射性核素、信号传导调节剂、抗癌抗体、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸(例如反义RNA和siRNA)、血管生成抑制剂、放射疗法或它们的组合。示例性化疗化合物包括但不限于Ara-C、顺铂、卡铂、紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、喜树碱、伊立替康、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤。如本文所用，除非另有说明，否则提及抗癌剂或化疗剂包括抗癌剂或化疗剂的组合或多种抗癌剂或化疗剂。
如本文所用，对象包括任何生物体，包括对其进行诊断、筛选、监测或治疗的动物。动物包括哺乳动物，例如灵长类动物和家养动物。示例性的灵长类动物是人。患者是指患有疾病状况或待确定的疾病状况或待确定的疾病状况的风险的对象，例如哺乳动物、灵长类、人类或家畜对象。
如本文所用，患者是指表现出疾病或病症的症状的人类对象。
如本文所用，对具有状况、病症或疾病的对象的治疗是指其中状况、病症或疾病的症状得到减轻或以其它方式有益地改变的任何治疗方式。治疗涵盖本文所述和提供的病毒的任何药物用途。
如本文所用，对患有赘生性疾病(包括肿瘤或转移)的对象的治疗意味着其中患有赘生性疾病的症状得到减轻或以其它方式有益地改变的任何治疗方式。通常，对象的肿瘤或转移的治疗涵盖导致肿瘤生长减慢、肿瘤细胞裂解、肿瘤大小减小、防止新的肿瘤生长或预防原发性肿瘤的转移的任何治疗方式，包括抑制肿瘤血管形成、肿瘤细胞分裂、肿瘤细胞迁移或基底膜或细胞外基质的降解。
如本文所用，治疗作用意味着那些改变(通常改善或减轻)疾病或状况的症状或治愈疾病或状况的对于对象的治疗产生的作用。治疗有效量是指施用于对象后产生治疗效果的组合物、分子或化合物的量。
如本文所用，例如通过施用特定药物组合物，减轻或缓和特定病症的症状是指可归因于组合物的施用或与组合物的施用有关的任何减小，永久或暂时的、持久或短暂的。
如本文所用，功效意味着在施用病毒或病毒组合物后，所述病毒将对增殖或免疫豁免细胞(例如肿瘤细胞)定植并复制。在肿瘤细胞中的定值和复制指示该治疗是有效的治疗或将是有效的治疗。
如本文所用，用细胞载体/病毒的有效治疗是与不存在治疗相比可提高存活的治疗。例如，如果病毒稳定疾病、引起肿瘤消退、降低疾病严重性或减慢或减少肿瘤转移，则其为有效治疗。
如本文所用，用于治疗特定疾病的病毒或化合物的有效量或治疗有效量是减轻或以某种方式减少与疾病有关的症状的量。该量因人而异，并且取决于许多因素，包括但不限于年龄、体重、患者的总体身体状况和疾病的严重性。治疗有效量可作为单一剂量施用，或可根据方案以多个剂量施用，从而其为有效的。该量可治愈疾病，但通常为减轻疾病的症状而施用。可能需要重复施用以达到所需的症状减轻。
如本文所用，用于治疗赘生性疾病(包括肿瘤或转移)的病毒或化合物的有效量或治疗有效量是指减轻或以某种方式减少与赘生性疾病相关的症状(包括但不限于减慢肿瘤生长、肿瘤细胞裂解、减小肿瘤大小、防止新的肿瘤生长或预防原发性肿瘤的转移)的量。
如本文所用，“组合物”是指两种或更多种产物或化合物的任何混合物。它可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或它们的任何组合。
如本文所用，制剂是指含有至少一种活性药剂或治疗剂和一种或多种赋形剂的组合物。
如本文所用，共制剂是指含有两种或更多种活性药剂或治疗剂和一种或多种赋形剂的组合物。
如本文所用，组合是指两项或更多项条目之间或两项或多项条目之中的任何关联。组合可为两个或更多个分开的条目(例如两个组合物或两个集合)，可为它们的混合物(例如两项或更多项条目的单一混合物)，或它们的任何变化。组合的要素通常在功能上相关或有关。示例性组合包括但不限于两种或更多种药物组合物，含有两种或更多种活性成分(例如两种病毒、或一种病毒和一种抗癌剂例如化疗化合物、两种或更多种病毒、一种病毒和一种治疗剂、一种病毒和一种显像剂、一种病毒和多种治疗剂和/或显像剂，或其任何关联)的组合物。此类组合可包装成试剂盒。
如本文所用，直接施用是指施用未稀释的组合物。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，任选地包括使用该组合的说明和/或用于此类用途的其它反应和成分。
如本文所用，“制造品”是制造和销售的产品。如在本申请中通篇所使用的，该术语旨在涵盖含有单独的或与包装在相同或分开的包装物品中的第二疗法或治疗性能量源组合的载体细胞和痘苗病毒的物品。
如本文所用，装置(device)是指为特定任务而制造或改造的事物。本文的示例性装置是覆盖或涂覆或能够接触表皮或皮肤的表面的装置。此类装置的实例包括但不限于包裹、绷带、捆绑物、敷料、缝合线、贴剂、纱布或敷裹。
除非上下文另外明确指出，如本文所用的单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数指示物。
如本文所用，范围和量可表示为“约”或“大约”特定值或范围。“约”或“大约”还包括确切量。因此，“约5毫升”意味着“约5毫升”以及“5毫升”。通常，“约”包括预期在实验误差范围内的量。
如本文所用，“大约相同”是指在本领域技术人员认为相同或在可接受的误差范围内的量。例如，通常对于药物组合物，认为在至少1％、2％、3％、4％、5％或10％以内是相同的。此类量可根据对象对特定组成变化的耐受性而变化。
如本文所用，“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。
如本文所用，除非另有说明，否则任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写均应与它们的常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(参见(1972)Biochem.11：1726)一致。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另外指出，否则本文全文中所引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、网站和其它公开的材料均以引用的形式整体并入。如果本文术语存在多种定义，以本节中的定义为准。在提到URL或其它此类标识符或地址的地方，应理解此类标识符可改变并且互联网上的特定信息可出现并消失，但等价信息是已知的并且可例如通过搜索互联网和/或适当的数据库容易地访问。对其的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
如本文所用，“同种异体细胞”是因衍生自相同物种的遗传上不同的个体而相对于特定对象在遗传上不同的细胞。例如，同种异体干细胞是衍生自患者(或同卵双胞胎)以外的供体的干细胞。
如本文所用，“自体细胞”是从相同个体例如待治疗的对象(即患者)获得的细胞。例如，自体干细胞是衍生自患者的干细胞。
如本文所用，关于细胞媒介或载体细胞的术语“工程化”表示细胞的遗传修饰，使得它们表达可改善或增强细胞性能的蛋白质。例如，可将细胞工程化以改善病毒扩增和/或改善免疫调节。
如本文所用，“免疫调节”是指其中例如通过诱导、增强或抑制免疫应答将免疫应答修饰为期望的水平的任何过程。
如本文所用，“免疫抑制(immune suppression/immunosuppression)”是指免疫应答的抑制或降低。
如本文所用，“免疫豁免(immune privileged/immunoprivileged)”是指不引起免疫应答并且可逃避免疫系统的细胞或组织。免疫豁免细胞和组织是指诸如实体瘤和肿瘤微环境的细胞和组织，其由于肿瘤的免疫抑制性质而与免疫系统隔离。结果，溶瘤病毒优先在肿瘤微环境中的肿瘤中积累，因为它们被屏蔽了免疫系统。然而，免疫豁免组织和细胞被屏蔽或隔离于免疫应答，从而使病毒得以存活并通常复制。
如本文所用，溶瘤病毒是指在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。
如本文所用，“疾病或病症”是指生物体中由例如感染或遗传缺陷引起的病理学状况，并以可识别的症状为特征。
如本文所用，癌症是由任何类型的恶性肿瘤或血液恶性肿瘤(例如白血病)引起或表征的疾病的一般术语。
如本文所用，恶性肿瘤适用于肿瘤时是指具有转移能力但失去生长控制和位置控制的原发性肿瘤。
如本文所用，转移是指异常或赘生性细胞远离最初病态过程涉及部位的生长。
如本文所用，抗癌剂或化合物(可与“抗肿瘤剂或抗瘤剂”互换使用)是指用于抗癌治疗的任何物质或化合物。这些包括单独使用或与其它化合物组合使用时可缓和、减轻、改善、预防或置于或维持与赘生性疾病、肿瘤和癌症相关的临床症状或诊断标志物的缓解状态的任何物质，并且可用于本文提供的方法、组合和组合物中。
如本文所用，对病毒感染的“抗性”是指在暴露于病毒后未被病毒感染或感染程度很低的细胞。
如本文所用，关于病毒感染的“允许性”是指在暴露于病毒时容易被感染的细胞。
如本文所用，“单体型”是一起遗传的一组DNA变异或多态性，并且可指位于同一染色体上的一组等位基因或一组单核苷酸多态性(SNP)。
如本文所用，“匹配的单体型”表示供体的单体型与接受者或患者的单体型之间的免疫学相容性，使得供体的单体型与接受者或患者的免疫系统充分相容以逃避接受者的免疫系统。
如本文所用，“错配的单体型”表示供体的单体型与接受者或患者的单体型之间的免疫学不相容性，使得供体的单体型与接受者或患者的免疫系统不充分相容，并且供体细胞不能逃避接受者的免疫系统。“免疫受损错配”定义为在对象与载体细胞在遗传多态性位点上的错配，其与通过本文提供的匹配测定方法确定的％相容性的显著(例如10％或更多)降低相关。
如本文所用，免疫学相容是指与对象/宿主的免疫系统充分相容的细胞或病毒，以在足够的时间内逃避对象的免疫系统以将病毒递送至对象的肿瘤或癌性细胞。
如本文所用，“共培养物”是指其中生长两个或更多个不同细胞群的细胞培养物。
如本文所用，关于细胞，术语“加载”可指在细胞表面和细胞内部通过细胞和药剂之间的化学或物理相互作用的细胞和药剂例如病毒、小分子、治疗剂、抗体等的缔合。
如本文所用，脂肪来源的干细胞或ADSC是从供体的脂肪组织获得的间充质干细胞。
如本文所用，外周血单个核细胞或PBMC是具有圆形核的任何外周血细胞，例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。
如本文所用，“L14 VV”是TK插入的Turbo-FP635工程化的痘苗病毒LIVP株。
如本文所用，“WT1”，也称为“ACAM2000”，是痘苗病毒的野生型胸苷激酶(TK)阳性惠氏株。它是可从CDC获得的天花疫苗株。
如本文所用，病毒噬斑测定(VPA)是用于确定感染性病毒的量或病毒滴度(以每毫升或每个样品的噬斑形成单位(pfu)给出)的测定。
如本文所用，“已处理的”或“受保护的”细胞媒介或载体细胞是用药剂如细胞因子(例如干扰素(IFN)或同种异体失活/排斥决定因素的拮抗剂)预处理和/或加载以保护细胞免受免疫应答的细胞媒介或载体细胞。
如本文所用，治疗是指疾病或病症的症状的减轻。
如本文所用，预防是指预防性治疗以降低患病或病症的风险或降低其严重性。
如本文所用，对象是指可通过本文的方法和用途治疗的任何哺乳动物。哺乳动物包括人、其它灵长类动物(例如黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)、犬、猫、牛、猪、山羊和其它农场动物和宠物。患者是指人类对象。
为公开的清楚并且不以限制的方式，详细描述分为随后的小节。
B.使用基于细胞的媒介(“细胞媒介”或“载体细胞”)选择病毒治疗的成分
1.细胞媒介
溶瘤病毒(OV)相对于正常细胞具有优先感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中积累和杀死肿瘤细胞的能力。此能力可为病毒的自然特征(例如呼肠孤病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒)，也可通过对病毒进行遗传减毒使其规避对象中的抗病毒免疫和其它防御(例如水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒)或对肿瘤细胞的偏好可使用例如肿瘤特异性细胞表面分子、转录因子和组织特异性microRNA来选择或工程化入病毒(参见例如Cattaneo等，Nat.Natl.Acad.Sci.USA，87：3877-2404).Rev.Microbiol.，6(7)：529-540(2008)；Dorer等，Adv.Drug Deliv.Rev.，61(7-8)：554-571(2009)；Kelly等，Mol Ther.，17(3)：409-416(2009)和Naik等，Expert Opin.Biol.Ther.，9(9)：1163-1176(2009))。
溶瘤病毒的递送可通过直接肿瘤内注射来实现。尽管直接瘤内递送可使正常细胞对病毒的暴露最少，但通常例如由于无法到达肿瘤部位(例如脑瘤)或对处于大面积散布的数个小结节形式的肿瘤存在局限性。另一方面，全身递送具有病毒不仅到达原发性肿瘤位点，还到达散布的转移灶的潜能。
然而，无论何种递送方式，使用溶瘤病毒治疗的成功可能受到宿主免疫系统的损害，该系统迅速诱导免疫应答并中和病毒(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。例如，静脉内递送的病毒暴露于中和抗体、补体和多种免疫细胞，并被器官如肺、脾和肝隔离并随后清除(Roy andBell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。中和抗体(NAb)结合病毒，阻断其与细胞表面受体的附着并抑制病毒感染，从而限制了OV的治疗潜能(Jennings等(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。除先天免疫应答外，先前的暴露(导致适应性免疫性)可能是更特异性和强有力的，也限制了OV的治疗潜能。另外，物理屏障例如肿瘤的高组织间隙液压和细胞外基质，可阻止病毒颗粒向肿瘤细胞的有效递送(Roy and Bell(2013)OncolyticVirotherapy 2：47-56)。
多数个体暴露于许多病毒，包括麻疹病毒、腺病毒、痘苗病毒和呼肠孤病毒，并且因此表现出预先存在的抗病毒免疫力，这会削弱溶瘤病毒疗法的治疗潜能。例如，大多数年龄较大的对象已接种了天花疫苗，导致针对正痘病毒(包括痘苗病毒)的已有抗病毒免疫力。即使对象不具备针对特定OV的已有免疫力，病毒的初始剂量也导致稳健的抗病毒免疫应答，从而限制了通常是实现强有力的抗肿瘤应答所必需的重复剂量的有效性。规避此类情况的策略包括使用免疫抑制剂(例如环磷酰胺)，以及使用载体细胞(细胞媒介)绕过免疫系统并将OV递送至肿瘤部位。
使用免疫抑制药物(例如环磷酰胺、他克莫司、吗替麦考酚酯和甲泼尼龙琥珀酸钠)的短暂免疫抑制已成功用于器官移植，但在增强全身施用OV的肿瘤递送方面显示的成功有限(Guo等(2010)Gene Ther 17(12)：1465-1475；Guo等(2010)Gene Ther.17(12)：1465-1475)。免疫抑制药物的使用还可增加病毒的潜在毒性，此外，可减少免疫系统产生的原本有助于溶瘤的任何抗肿瘤应答(Thorne等(2010)Molecular Therapy 18(9)：1698-1705)。
使用载体细胞递送OV可模仿病毒进化为在宿主内传播的方式。例如，人类免疫缺陷病毒结合循环树突细胞(DC)和巨噬细胞，后两者可迁移至淋巴结并使病毒达到其靶：CD4+T细胞。此外，通过在细胞间传播而复制的病毒可成功逃避中和抗体。临床试验表明，即使存在中和抗体，溶瘤呼肠孤病毒静脉施用后结合循环细胞，保持其感染性并到达肿瘤细胞(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。使用基于细胞的媒介的优势包括将OV特异性递送至肿瘤细胞，增加其治疗潜能并防止脱靶毒性，以及使OV被屏蔽于预先存在的抗病毒免疫的能力。趋化因子和粘附分子(例如整联蛋白)在免疫系统内细胞向肿瘤的运输中发挥重要作用。癌细胞已示出分泌多种将载体细胞吸引至肿瘤的细胞因子和趋化因子。其它因素，例如缺氧，也可能有助于载体细胞的肿瘤归巢能力。
OV可通过特异性或非特异性相互作用加载至载体细胞的表面而与载体细胞相关联，或可被它们内在化。OV的内在化有时提供更好的保护以抵御循环NAb并允许病毒在细胞内复制，增加所递送病毒的数量。然而，病毒感染可在载体细胞到达靶部位之前杀死它们，防止OV的成功递送而发生溶瘤。另一方面，加载至载体细胞表面排除了病毒在到达肿瘤部位之前的扩增并且可减少被递送的病毒的量(Jennings等(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101；Willmon等(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676)。
载体细胞递送OV的功效取决于数个因素，包括：(1)成功的离体病毒加载；(2)病毒在肿瘤部位的体内积累；以及(3)在肿瘤部位的病毒扩增/产生(Guo等(2010)Gene Ther.17(12)：1465-1475)。理想的载体细胞不仅可屏蔽OV免受免疫系统的中和，而且还可将其特异性地递送至肿瘤并具备自身的抗肿瘤活性。载体细胞应安全施用、容易分离和/或制造、易于被病毒感染、允许病毒复制并在被破坏前在肿瘤部位释放病毒。不同的病毒以不同的速度复制，理想地，细胞运输和病毒复制的动力学应相容，以便在病毒复制时，载体细胞到达肿瘤部位。例如，VSV是快速复制病毒，如果在感染1-2小时后注射细胞，则可通过载体细胞实现成功递送。对于缓慢复制病毒(例如痘苗病毒)，在优化载体细胞的递送和感染时机方面具有更大的灵活性(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。选择相容病毒和载体细胞对还可确保病毒复制不对载体细胞的循环和效应子功能产生负面影响，也不阻碍其肿瘤运输。例如，一旦载体细胞被鉴定为“感染”，过早的病毒复制和/或表达可通过直接的细胞毒性或通过免疫系统的间接清除导致载体细胞的破坏(Willmon等(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676)。在病毒感染引起病毒抗原在载体细胞表面表达的情况下，可对病毒进行工程化，使其一旦到达肿瘤即复制，以减少或防止免疫介导的载体细胞破坏。例如，肿瘤特异性和低氧诱导的启动子可用于驱动肿瘤部位处的病毒复制(Royand Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。
除如上所述在动力学参数方面考虑病毒-载体细胞相容性外，载体细胞，像相关的溶瘤病毒一样，必须能够克服先天和适应性免疫屏障，同时促进肿瘤细胞/癌细胞中的病毒扩增。自体载体细胞(从待治疗的对象获得的细胞)的使用可使针对载体细胞的先天应答和免疫应答最小化，但对对象而言可能是繁重的、其可获得性是昂贵的并且限制性的。可包括多种易于分离的和/或可商购的细胞/细胞系的同种异体载体细胞为对象提供了容易获得性和非侵入性；然而，较大幅度的先天和/或适应性免疫应答可能损害其治疗功效和临床适用性。本文提供的方法允许筛选、鉴定和选择可以以对象特异性和/或癌症特异性方式加强病毒疗法的“匹配的”载体细胞。根据本文提供的方法，以鉴定在对象中促进病毒扩增和/或显示病毒治疗功效的能力未受到对象针对载体细胞和/或载体细胞/病毒组合的免疫应答显著损害的载体细胞的方式，筛选可用的潜在载体细胞候选物。然后，根据本文提供的治疗方法，如此鉴定的载体细胞可用于对象和/或癌症特异性载体细胞介导的病毒疗法。
选择本文提供的载体细胞的方法可用于筛选已用作OV递送的载体细胞的任何细胞类型。如本文所述，可基于筛选的载体细胞类型在待使用载体细胞介导的病毒肿瘤疗法治疗的特定对象中促进病毒扩增和/或逃避免疫攻击的能力对其进行排名；能力越高，“排名”越高。然后选择一种或多种排名“高”的载体细胞类型作为与待治疗的特定对象和/或特定癌症的匹配。本文还提供了使用如此选择的载体细胞类型的治疗方法。
多种细胞类型已被用作载体细胞，并且可在本文提供的方法中筛选这些细胞中的任何一种。在一些实例中，如本文所述，可修饰载体细胞以为感兴趣的对象提供更好的“匹配”。然后，筛选和/或修饰的载体细胞可用于本文提供的治疗方法。以下描述了用于递送OV的示例性载体细胞类型，其可包括例如干细胞/祖细胞、免疫细胞和癌症细胞/转化细胞。根据本文提供的方法筛选的载体细胞可为自体的(即来源于待治疗的对象)或同种异体的(即来源于不同于待治疗的对象的供体)。用于本文提供的方法、组合和组合物中的示例性载体细胞如下：
基于细胞的媒介的类型
干细胞、免疫细胞、癌细胞系
干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞/癌性细胞可用作溶瘤病毒(OV)(包括HSV-1、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒和腺病毒等)的递送媒介。分离用于本文提供的组合物和方法中的递送媒介并将其作为通过将分离的递送媒介/载体细胞与溶瘤病毒温育而形成的组合物施用；它们不是植物或动物的一部分。在实施方案中，可培养所述细胞以用作载体。
这些细胞表现出肿瘤归巢性质，其增强OV的治疗效果。这种肿瘤选择性是由于特征为低氧、炎症和大量化学吸引分子(例如细胞因子和趋化因子)的肿瘤微环境对这些细胞的吸引所致。
干细胞
干细胞具备固有的肿瘤归巢能力，使其作为溶瘤病毒疗法的载体细胞具有吸引力。这是由于肿瘤微环境富含多种生长因子、血管生成因子、细胞因子和趋化因子，其支持了肿瘤的不受控制的生长。TME的低氧性质也促进干细胞向肿瘤迁移。干细胞作为载体细胞也是有吸引力的，因为它们高度免疫抑制并表达较低水平的抗原加工和呈递所需的分子，延迟了免疫系统对它们所带有的病毒的识别(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。可用作OV的载体细胞的干细胞的实例包括内皮祖细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
内皮祖细胞已显示出归巢至肿瘤新血管系统部位并已成功用于在人胶质瘤小鼠模型中递送溶瘤麻疹病毒(Guo等(2008)Biochim Biophys Acta 1785(2)：217-231)。这些细胞在体内迅速分裂，但并非永生，并且必须从临床样本中反复分离新细胞(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。
神经干细胞(NSC)分化为神经系统的多种不同细胞，包括神经元和胶质细胞，其是第一个被研究作为将治疗剂递送至脑肿瘤的载体细胞的干细胞(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457)。由于低氧诱导性因子(HIF)介导的基质细胞衍生因子1(SDF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)在胶质瘤细胞中的表达，NSC对胶质母细胞瘤肿瘤表现出强烈的趋性(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。例如，已将NSC用于向胶质瘤递送IL-4、IL-12、IL-23、胞嘧啶脱氨酶、抗血管生成蛋白、血小板反应蛋白和OV如腺病毒。然而，NSC必须在外科手术过程中从胎儿的脑组织或成年大脑的脑周区域分离，这不利于它们用作载体细胞。
成人骨髓已被用作干细胞的替代来源，因为骨髓干细胞容易获得并且可源自患者自身以进行自体移植，从而排除免疫排斥(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4))：445-457)。在可用的多种骨髓干细胞中，间充质干细胞(MSC)作为载体细胞是有吸引力的，因为它们易于从患者分离并在体外扩增，它们支持OV的复制并保护其免受免疫系统的立即中和，它们可容易地进行工程化并且由于与肿瘤相关的炎性细胞因子表达，它们固有地体内归巢至肿瘤。MSC甚至可被用作独立的抗癌剂。例如，研究证明了表达IFN-β的MSC的肿瘤归巢能力和溶瘤作用(Nakashima等(2010)Cytokine Growth Factor Rev.21(2-3)：119-126)。
MSC在其细胞表面上表达低水平的I类MHC分子并且不表达II类MHC分子，从而允许同种异体移植。MSC还可抑制T细胞增殖和单核细胞分化为树突细胞(DC)，并可抑制CD4+T辅助细胞产生的干扰素-γ和肿瘤坏死因子的表达(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。MSC还能够通过蛋白酶的分泌降解细胞外基质，这可帮助克服溶瘤病毒递送的物理屏障(Ramirez等(2015)Oncolytic Virotherapy 4：149-155)。使用MSC的另一个优势是它们可在病毒感染后冷冻，并且在融化后保留活性病毒复制和抗肿瘤活性，从而允许储存(Royand Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。除骨髓外，MSC还可从脂肪组织、脐带血、外周血、肌肉、软骨和羊水中分离，其中脂肪组织是最有吸引力的来源，因为脂肪组织易于进入且丰富(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Nakashima等(2010)Cytokine Growth Factor Rev.21(2-3)：119-126)。
MSC已作为溶瘤腺病毒的载体用于治疗胰腺癌、脑癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和卵巢癌，以及作为麻疹病毒的载体用于治疗卵巢癌和肝细胞癌(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。例如，MSC已被用作溶瘤腺病毒ICOVIR-5的载体用于治疗患有晚期转移性神经母细胞瘤的儿童(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457；Ramirez等(2015)Oncolytic Virotherapy 4：149-155)。
然而，使用MSC的一个缺点是它们促进肿瘤生长的潜能，这已在乳腺癌、子宫内膜肿瘤和胶质瘤模型中得到证明。为克服此类潜在缺点，可对MSC进行工程化以确保其在OV递送时例如通过携带自杀基因而被破坏(Kerrigan等(2017)Cytotherapy 19(4)：445-457)。
可被利用作载体细胞的干细胞(自体或同种异体)的实例包括例如：成体干细胞；胚胎干细胞；胎儿干细胞；神经干细胞；间充质干细胞(例如从以下分离/衍生：成年骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或液间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton’s Jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质基质细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞、肌肉卫星细胞等)；神经干细胞；全能干细胞；多能干细胞；诱导多能干细胞；多潜能干细胞；寡能干细胞；单能干细胞；脂肪基质干细胞；内皮干细胞(例如内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞、周细胞)；成人外周血干细胞；成肌细胞；小幼年干细胞；皮肤成纤维细胞干细胞；组织/肿瘤相关成纤维细胞；上皮干细胞和胚胎上皮干细胞。在本文提供的组合物和方法的实施方案中，载体细胞不是胚胎干细胞、胎儿干细胞、脐带血来源的干细胞、羊水来源的干细胞或胎盘来源的干细胞中的一种或多种。
免疫细胞
通过运输至癌症部位来响应于从肿瘤释放的“危险信号”的免疫细胞已作为OV的载体细胞被广泛研究。这些免疫细胞包括例如T细胞，包括γδT细胞、靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞、靶向肿瘤特异性抗原的TCR转基因细胞；NKT细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、粒细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、髓来源的抑制细胞、淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞和细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。免疫细胞作为载体细胞是有吸引力的，因为它们可全身循环并可识别肿瘤(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy2：47-56)。使用免疫细胞作为OV的载体还可以以直接细胞毒性的形式或通过引发适应性抗肿瘤免疫应答来提供额外的抗肿瘤活性(Jennings等(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。
例如，肿瘤抗原特异性T细胞表现出直接的抗癌效应子功能，并且在将OV递送至肿瘤中已广泛研究了活化的T细胞。已显示用OV加载过继转移的T细胞可帮助对抗肿瘤微环境的免疫抑制性质，因为病毒感染的促炎性质可阻止T细胞的沉默和失活(Roy and Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。趋化因子如CCL3、CCL21和CXCL10(IP-10)的肿瘤内表达增强了过继T细胞的肿瘤特异性运输。还可对T细胞进行遗传工程化以表达趋化因子受体例如CXCR2，以帮助将其导向肿瘤(Guo等(2008)Biochim Biophys Acta 1785(2)：217-231)。研究证明，水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和逆转录病毒颗粒可附着在T细胞表面并被动或通过载体与肿瘤细胞之间的细胞突触而递送至肿瘤细胞(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。尽管使用T细胞作为OV的载体的优势，它仍然非常昂贵且难以针对患者的高度肿瘤特异性抗原培养T细胞群，从而限制了它们的用途(Willmon等(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676)。
淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)与IL-2结合治疗卵巢癌已显示出希望。测试了未成熟树突细胞(iDC)、LAK细胞以及它们的共培养物(LAKDC)作为呼肠孤病毒在卵巢癌治疗中的载体，结果表明，加载有呼肠孤病毒的LAKDC能够保护呼肠孤病毒抵御中和抗体，诱导促炎性细胞因子背景并产生先天和适应性抗肿瘤免疫应答(Jennings等(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。DC细胞也已成功用作呼肠孤病毒的载体，用于治疗黑色素瘤(Jennings等(2014)Int.J.Cancer 134：1091-1101)。
CIK细胞是可用作OV载体的另一类型的免疫细胞。肿瘤抗原特异性T细胞识别一种抗原，而CIK细胞识别NKG2D配体，这些配体通常在多种肿瘤细胞上被上调，从而使其更具通用性。CIK细胞也更易于从患者分离并离体扩增，可产生高滴度的病毒，并已成功用于将麻疹和痘苗病毒递送至肿瘤(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56；Willmon等(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676；Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。然而，使用CIK细胞的一个缺点是其产生需要体内使用细胞因子来扩增原代白细胞(Kim等(2015)Viruses 7：6200-6217)。
巨噬细胞代表了OV的又一潜在的载体细胞类别。由于肿瘤通常分泌单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞集落刺激因子和VEGF，单核细胞自然迁移至肿瘤部位，定位于低氧区域，并分化为肿瘤相关巨噬细胞，从而可以增强肿瘤生长抑制(Roy和Bell(2013)OncolyticVirotherapy 2：47-56)。结果，已对巨噬细胞的溶瘤腺病毒和麻疹病毒的递送进行了临床前研究。除讨论的其它类型的免疫细胞外，还研究了骨髓来源的抑制细胞作为递送溶瘤VSV的载体细胞。
癌细胞
为安全起见，在施用前通常用γ照射失活的癌细胞也已成功地用作OV的载体细胞。γ照射可预防致瘤性，但保存病毒产生。另一安全措施涉及工程化OV以表达自杀基因(例如胸苷激酶)以确保癌细胞不无限地保留在对象中(即被杀死并且不再永生)。或者，可使用通常由接受者的免疫系统清除的同种异体癌细胞(Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。
与正常细胞相比，癌细胞可易于大量获得且表现出更高水平的病毒感染性和扩增能力(Guo等(2010)Gene Ther.17(12)：1465-1475；Roy和Bell(2013)OncolyticVirotherapy 2：47-56)。此外，如转移性疾病所见，一些肿瘤细胞特异性迁移至某些器官。例如，骨髓瘤细胞表达高水平的趋化因子受体CXCR4，导致骨髓转移，并已被用于溶瘤麻疹病毒的递送(Roy和Bell(2013)Oncolytic Virotherapy 2：47-56)。已显示出多种转化的细胞系可在具有免疫能力的动物和免疫缺陷的动物中成功递送溶瘤细小病毒、麻疹病毒和水疱性口炎病毒。例如，已使用感染了VSV或腺病毒的癌细胞将病毒有效地递送至小鼠的肺转移中(Willmon等(2009)Molecular Therapy 17(10)：1667-1676；Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。然而，由于衍生自实体瘤的细胞的大尺寸，已显示其在静脉内施用后在小鼠的肺中积累。结果，造血/血液学来源的癌细胞可能是更好的替代，因为它们在体内分布更广并且可将OV递送至肺外的解剖学位置(Power和Bell(2007)Mol.Ther.15(4)：660-665)。
可用作载体细胞的同种异体人类血液恶性肿瘤细胞系的实例包括：白血病细胞(例如KASUMI-1、HL-60、THP-1、K-562、RS4；11、MOLT-4、CCRF-CEM、JVM-13、31E9、ARH-77、MoB、JM1、NALM-1、ProPak-X.36)；T细胞白血病细胞(例如HM-2、CEM-CM3、Jurkat/Jurkat克隆E6-1、J.CaM1.6、BCL2 Jurkat、BCL2 S87A Jurkat、BCL2 S70A Jurkat、Neo Jurkat、BCL2AAA Jurkat、J.RT3-T3.5、J45.01、J.γ1、J.γ1.WT、JK28、P116、P116.cl39、A3、JX17、D1.1、I 9.2、I 2.1)；髓单核细胞白血病细胞(例如MV-4-11)；淋巴瘤细胞(例如HT、BC-3、CA46、Raji、Daudi、GA-10-Clone-4、HH、H9)；非霍奇金淋巴瘤细胞(例如SU-DHL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-4、SU-DHL-5、SU-DHL-6、SU-DHL-8、SU-DHL-10、SU-DHL-16、NU-DUL-1、NCEB-1、EJ-1、BCP-1、TUR、U-937)；伯基特淋巴瘤细胞(例如Ramos/RA 1、Ramos.2G6.4C10、P3HR-1、Daudi、ST486、Raji、CA46、来自伯基特淋巴瘤患者的人γ疱疹病毒4/HHV-4颊肿瘤、DG-75、GA-10、NAMALWA、HS-Sultan、Jiyoye、NC-37、20-B8、EB2、1G2、EB1、EB3、2B8、GA-10克隆20、HKB-11/肾-B细胞Hybrid)；弥散性大B细胞淋巴瘤细胞(例如Toledo、Pfeiffer)；套细胞淋巴瘤细胞(例如JeKo-1、JMP-1、PF-1、JVM-2、REC-1、Z-138、Mino、MAVER-1)；AML细胞(例如AML-193、BDCM、KG-1、KG-1a、Kasumi-6、HL-60/S4)；CML细胞(例如K562、K562-r、K562-s、LAMA84-r、LAMA84-s、AR230-r、AR230-s)；ALL细胞(例如N6/ADR、RS4；11、NALM6克隆G5、Loucy、SUP-B15、CCRF-SB)；红白血病细胞(例如IDH2-mutant-TF-1同基因细胞系)；髓单核细胞白血病细胞(例如GDM-1)；恶性非霍奇金NK淋巴瘤细胞(例如NK-92、NK-92MI)；骨髓瘤/浆细胞瘤细胞(例如U266B1/U266、HAA1、SA13、RPMI8226、NCI-H929、MC/CAR)；多发性骨髓瘤细胞(例如MM.1R、IM-9、MM.1S)；和巨噬细胞细胞系(例如MD、SC、WBC264-9C)。
商业同种异体细胞系包括：间充质干细胞，例如APCETH-201、APCETH-301(APCETH)、Cx601(TIGENIX)、TEMCELL、MSC-100-IV、Prochymal(MESOBLAST)；诱导多能干细胞(iPSC)、例如ToleraCyte(Fate Therapeutics)；成纤维细胞，例如CCD-16Lu、WI-38；肿瘤相关成纤维细胞，例如Malme-3M、COLO 829、HT-144、Hs 895.T、hTERT PF179T CAF等；内皮细胞，例如HUVEC、HUVEC/TERT 2、TIME；胚胎上皮细胞，例如HEK-293、HEK-293STF、293T/17、293T/17SF、HEK-293.2sus；胚胎干细胞，例如hESC BG01V；和上皮细胞，例如NuLi-1、ARPE-19、VK2/E6E7、Ect1/E6E7、RWPE-2、WPE-stem、End1/E6E7、WPMY-1、NL20、NL20-TA、WT 9-7、WPE1-NB26、WPE-int、RWPE2-W99、BEAS-2B。在本文提供的组合物和方法的实施方案中，载体细胞不是胚胎来源的，例如胚胎上皮细胞、胚胎干细胞、胎儿细胞等。
自体或同种异体全肿瘤细胞疫苗包括分泌GM-CSF的全肿瘤细胞疫苗(GVAX)，例如来自Genesys/BioSante/Aduro Biotech的GVAX前列腺(基于PC3/LNCaP)；GVAX胰腺；GVAX肺；和GVAX肾细胞等。
同种异体人肿瘤细胞系包括例如NCI-60组(BT549、HS 578T、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D、SF268、SF295、SF539、SNB-19、SNB-75、U251、Colo205、HCC 2998、HCT-116、HCT-15、HT29、KM12、SW620、786-O、A498、ACHN、CAKI、RXF 393、SN12C、TK-10、UO-31、CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR、A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、LOX IMVI、M14、MALME-3M、MDA-MB-435、SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、NCI-ADR-RES、DU145、PC-3)。其它同种异体人肿瘤细胞系包括例如纤维肉瘤细胞系(HT-1080)；肝癌细胞系(Hih-7)；前列腺癌细胞系(LAPC4、LAPC9、VCaP、LuCaP、MDA PCa 2a/2b、C4、C4-2、PTEN-CaP8、PTEN-P8)；乳腺癌细胞系(HCC1599、HCC1937、HCC1143、MDA-MB-468、HCC38、HCC70、HCC1806、HCC1187、DU4475、BT-549、Hs 578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-157、MDA-MB-453、HCC1599、HCC1937、HCC1143、MDA-MB-468、HCC38、HCC70、HCC1806、HCC1187、DU4475、BT-549、Hs 578T、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-157、MDA-MB-453、BT-20、HCC1395、MDA-MB-361、EMT6、T-47D、HCC1954)；头颈癌细胞系(A-253、SCC-15、SCC-25、SCC-9、FaDu、Detroit 562)；肺癌细胞系(NCI-H2126、NCI-H1299、NCI-H1437、NCI-H1563、NCI-H1573、NCI-H1975、NCI-H661、Calu-3、NCI-H441)；胰腺癌细胞系(Capan-2、Panc10.05、CFPAC-1、HPAF-II、SW 1990、BxPC-3、AsPC-1、MIA PaCa-2、Hs 766T、Panc 05.04、PL45)；卵巢癌细胞系(PA-1、Caov-3、SW 626、SK-OV-3)；骨癌细胞系(HOS、A-673、SK-PN-DW、U-2OS、Saos-2)；结肠癌细胞系(SNU-C1、SK-CO-1、SW1116、SW948、T84、LS123、LoVo、SW837、SNU-C1、SW48、RKO、COLO 205、SW1417、LS411N、NCI-H508、HT-29、Caco-2、DLD-1)；胃癌细胞系(KATOIII、NCI-N87、SNU-16、SNU-5、AGS、SNU-1)；妇科癌细胞系(SK-LMS-1、HT-3、ME-180、Caov-3、SW626、MES-SA、SK-UT-1、KLE、AN3-CA、HeLa)；肉瘤细胞系(SW684、HT-1080、SW982、RD、GCT、SW872、SJSA-1、MES-SA/MX2、MES-SA、SK-ES-1、SU-CCS-1、A-673、VA-ES-BJ、Hs822.T、RD-ES、HS 132.T、Hs 737.T、Hs 863.T、Hs 127.T、Hs 324.T、Hs 821.T、Hs 706.T、Hs707(B).Ep、LL 86/LeSa、Hs 57.T、Hs 925.T、GCT、KHOS-312H、KHOS/NP R-970-5、SK-LMS-1、HOS)；黑色素瘤细胞系(SK-MEL-1、A375、G-361、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、CHL-1、Hs 695T、A2058、VMM18、A375.S2、Hs 294T、VMM39、A375-P、VMM917、VMM5A、VMM15、VMM425、VMM17、VMM1、A375-MA1、A375-MA2、SK-MEL-5、Hs 852.T、LM-MEL-57、A101D、LM-MEL-41、LM-MEL-42、MeWo、LM-MEL-53、MDA-MB-435S、C32、SK-MEL-28、SK-MEL-2、MP38、MP41、C32TG、NM2C5、LM-MEL-1a、A7/M2A7)；鳞状细胞癌细胞系(SiHa、NCI-H520、SCC-15、NCI-H226、HCC1806、SCC-25、FaDu、SW 954、NCI-H2170、SCC-4、SW 900、NCI-H2286、NCI-H2066、SCC-9、SCaBER、SW579、SK-MES-1、2A3、UPCI：SCC090、UPCI：SCC152、CAL 27、RPMI 2650、UPCI：SCC154、SW756、NCI-H1703、ME-180、SW962)；肝细胞癌细胞系(Hep G2、Hep 3B2.1-7/Hep 3B、C3A、Hep G2/2.2.1、SNU-449、SNU-398、SNU-475、SNU-387、SNU-182、SNU-423、PLC/PRF/5)；膀胱癌细胞系(5637、HT-1197、HT-1376、RT4、SW780、T-24、TCCSUP、UM-UC-3)；肾细胞癌细胞系(ACHN、786-O/786-0、769-P、A-498、Hs 891.T、Caki-2、Caki-1)；胚胎癌/睾丸畸胎瘤细胞系(NTERA-2cl.D1、NCCIT、Tera-2、Tera-1、Cates-1B)；胶质母细胞瘤细胞系(LN-229、U-87MG、T98G、LN-18、U-118MG、M059K、M059J、U-138MG、A-172)；星形细胞瘤细胞系(SW1088、CCF-STTG1、SW 1783、CHLA-03-AA)；脑癌细胞系(PFSK-1、Daoy)；甲状腺癌细胞系(TT、MDA-T68、MDA-T32、MDA-T120、MDA-T85、MDA-T41)和间皮瘤细胞系(NCI-H28、NCI-H226、NCI-H2452、NCI-H2052、MSTO-211H)。
2.病毒的选择
根据本文提供的方法选择和/或修饰的载体细胞可用于与鉴定为具有溶瘤性质的任何病毒进行病毒疗法。如本文所述，在本文提供的用于选择作为待治疗的特定对象和/或癌症类型的匹配的载体细胞的方法的一些实例中，还可基于其促进扩增用于治疗的溶瘤病毒的能力来选择载体细胞。根据本文提供的用于鉴定对象和/或癌症特异性匹配的方法选择的载体细胞-病毒组合可用于本文提供的治疗方法。可在本文提供的方法、组合和组合物中使用的示例性溶瘤病毒如下：
病毒类型
溶瘤病毒特征在于它们在很大程度上的肿瘤细胞特异性复制，导致肿瘤细胞裂解和有效的肿瘤消退。溶瘤病毒通过在包括转移性肿瘤细胞(例如循环肿瘤细胞)的肿瘤细胞中定植或积累并在其中复制来实现治疗。本文描述的发明可与任何抗癌疫苗或病毒使用。例如、溶瘤病毒可为任何天然存在或工程化的重组病毒，例如但不限于痘苗病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒、塞姆利基森林病毒、塞内卡谷病毒、新城疫病毒、仙台病毒、登革病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、逆转录病毒、慢病毒、α病毒、黄病毒、弹状病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、腮腺炎病毒、长臂猿白血病病毒、以及辛德毕斯病毒等。在许多情况下，肿瘤选择性是病毒(例如痘苗病毒和其它溶瘤病毒)的固有性质。通常，溶瘤病毒通过在肿瘤或肿瘤细胞中复制导致裂解来实现治疗。
在一些实施方案中，衍生自病原性病毒的减毒株用于制造活疫苗。痘苗病毒的非限制性实例包括但不限于李斯特(也称为Elstree)、纽约市健康委员会(NYCBH)、大连、池田(Ikeda)、LC16M8、西储(WR)、哥本哈根(Cop)、塔什干、天坛、惠氏、Dryvax、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、大连I、LIPV、LC16M0、LIVP、WR 65-16、EM63、伯尔尼、巴黎、CVA382、NYVAC、ACAM2000和康诺特毒株。病毒可为溶瘤病毒的克隆株。编码产生生色团的酶的核苷酸序列可被插入未经修饰的溶瘤病毒基因组中的非必需基因或区域中或将其替代，或可被插入未经修饰的溶瘤病毒基因组中的编码异源性基因产物的核酸中或将其替代。
在一些实施方案中，在本文公开的方法中利用的痘苗病毒是减毒的纽约市健康委员会(NYCBOH)株。在一些实施方案中，痘苗病毒的NYCBOH株可为ATCC VR-118或CJ-MVB-SPX。
在一些实施方案中，痘苗病毒选自Dryvax、ACAM1000、ACAM2000、李斯特、M63、LIVP、天坛、哥本哈根、西储或修饰的痘苗安卡拉(MVA)。在一些实施方案中，溶瘤病毒在这些株中的一种或多种中存在的任何基因中不存在缺陷。
在一些实施方案中，所述病毒或疫苗是具有复制能力的病毒。在一些实施方案中，所述病毒或疫苗是复制缺陷的。
在一些实施方案中，所述病毒或疫苗是非减毒的。
其它未经修饰的溶瘤病毒包括本领域技术人员已知的任何病毒，包括选自命名为GLV-1h68、JX-594、JX 954、ColoAd1、MV-CEA、MV-NIS、ONYX-015、B18R、H101、OncoVEX GMCSF、Reolysin、NTX-010、CCTG-102、Cavatak、Oncorine和TNFerade的病毒的那些。
用于本文提供的方法的溶瘤病毒包括本领域技术人员熟知的数种，包括例如水泡性口炎病毒，参见例如美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103和美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818和EP专利号1385466、1606411和1520175；单纯疱疹病毒，参见例如美国专利号7,897,146、7731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968和美国专利公开号2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894和20040009604；逆转录病毒，参见例如美国专利号6,689,871、6,635,472、6,639,139、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开号20110212530；和腺相关病毒，参见例如美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670。
新城疫病毒
新城疫病毒(NDV)是一种禽副粘病毒，具有负极性的单链RNA基因组，其可感染禽类并且通常对人为非致病性的，但可引起流感样症状(Tayeb等(2015)OncolyticVirotherapy 4：49-62；Cheng等(2016)J.Virol.90：5343-5352)。由于其细胞质复制、缺乏宿主基因组整合和重组以及高基因组稳定性，NDV和其它副粘病毒为其它溶瘤病毒(例如逆转录病毒或一些DNA病毒)提供了更安全且更具吸引力的替代方案(Matveeva等(2015)Molecular Therapy-Oncolytics 2，150017)。NDV已表现出肿瘤选择性，在肿瘤细胞中的复制是在正常细胞中的10,000倍，由于直接的细胞病变效应和免疫应答的诱导而导致溶瘤作用(Tayeb等，2015；Lam等(2011)Journal of Biomedicine and Biotechnology，文章ID718710)。尽管NDV的肿瘤选择性机制不完全清楚，但有缺陷的干扰素生产和肿瘤细胞对IFN信号传导的应答允许病毒复制和传播(Cheng等(2016)；Ginting等(2017)OncolyticVirotherapy 6：21-30)。副粘病毒对癌细胞的高亲和力也可归因于癌细胞表面上病毒受体(包括唾液酸)的过表达(Cheng等(2016)；Matveeva等(2015)；Tayeb等(2015))。
非工程化的NDV株根据其在鸡中的致病性分为弱毒性(无毒)、中毒性(中等)或强毒性(剧毒)，其中强毒性和中毒性株(而非弱毒性株)能够在多种人癌细胞系中复制(和裂解)(Cheng等(2016)；Matveeva等(2015))。NDV株也分为溶解或非溶解的，仅溶解株能够产生有活力的传染性后代(Ginting等(2017)；Matveeva等(2015))。另一方面，非裂解株的溶瘤作用主要源于其刺激导致抗肿瘤活性的免疫应答的能力(Ginting等(2017)OncolyticVirotherapy 6：21-30)。肿瘤治疗中普遍利用的中毒性裂解株包括PV701(MK107)、MTH-68/H和73-T，而普遍利用的弱毒性非裂解株包括HUJ、Ulster和Hitchner-B1(Tayeb等(2015)；Lam等(2011)；Beck等(2006)Mol.Ther.13(1)：221-228)。
1950年代初首次报道使用NDV作为溶瘤病毒，当将腺病毒和NDV直接注射入子宫癌时，导致部分坏死。然而，观察到肿瘤再生长，这可能归因于通过针对病毒的中和抗体的产生抑制了溶瘤活性(Lam等(2011)Journal of Biomedicine and Biotechnology，ArticleID 718710)。最近，NDV株PV701在1期试验中显示出有希望的抗结直肠癌活性(Laurie等(2006)Clin.Cancer Res.12(8)：2555-2562)，而NDV株73-T表现出对多种人癌细胞系(包括纤维肉瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤和宫颈癌)的体外溶瘤活性，以及在带有人神经母细胞瘤、纤维肉瘤异种移植物和数种癌异种移植物(包括结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌异种移植物)的小鼠中的治疗作用(Lam等2011)。NDV株MTH-68/H导致包括PC12、MCF7、HCT116、DU-145、HT-29、A431、HELA和PC3细胞在内的肿瘤细胞系的显著消退，并且当通过吸入施用时在晚期癌症患者中表现出有利的应答(Lam等(2011))。非裂解株Ulster针对结肠癌表现出细胞毒性作用，而裂解株Italien有效杀死人黑色素瘤(Lam等(2011))。当静脉内施用于患者时，弱毒性NDV株HUJ表现出针对多形性胶质母细胞瘤的溶瘤活性，而弱毒性株LaSota延长了结直肠癌患者的生存(Lam等(2011)；Freeman等(2006)Mol.Ther.13(1))：221-228)并能够感染和杀死非小细胞肺癌(A549)、胶质母细胞瘤(U87MG和T98G)、乳腺腺癌(MCF7和MDA-MB-453)和肝细胞癌(Huh7)细胞系(Ginting等(2017)Oncolytic Virotherapy 6：21-30)。
也评估遗传工程化的NDV株用于溶瘤疗法。例如，将流感NS1基因(IFN拮抗剂)导入NDV株Hitchner-B1的基因组中，在多种人类肿瘤细胞系和B16黑色素瘤小鼠模型中产生了增强的溶瘤作用(Tayeb等(2015))。通过将IL-2或GM-CSF基因导入病毒基因组，增强了NDV的抗肿瘤/免疫刺激作用(Lam等(2011))。
除使用游离病毒外，研究评价了NDV肿瘤溶解剂、NDV感染的基于细胞的媒介以及与其它非癌症物质的组合疗法用于癌症治疗的用途。在数项临床试验中，NDV肿瘤溶解剂表现出针对恶性黑色素瘤的溶瘤活性(Lam等(2011))。NDV感染的基于细胞的载体的用途也已成功证明。感染NDV的自体肿瘤细胞系已成功利用于针对结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌和胶质母细胞瘤(Lam等(2011))。感染NDV株MTH-68/H的衍生自骨髓、脂肪和脐带的MSC将病毒递送至共培养的A172和U87胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，导致胶质瘤细胞的剂量依赖性细胞死亡，胶质瘤干细胞的低水平凋亡和自我更新抑制，以及与用裸病毒直接感染相比更高的凋亡水平(Kazimirsky等(2016)Stem Cell Research&Therapy 7：149)。利用肿瘤内NDV注射与全身性CTLA-4抗体施用的组合疗法导致对先前建立的远端肿瘤的有效排斥(Matveeva等(2015))。
细小病毒
H-1细小病毒(H-1PV)是属于细小病毒科(Parvoviridae)的小型无包膜单链DNA病毒，其天然宿主是大鼠(Angelova等(2017)Front.Oncol 7:93；Angelova等(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:55)。H-1PV对人类是非致病性的，并且由于其有利的安全性、在人类中不存在预先存在的H-1PV免疫力以及其缺乏宿主细胞基因组整合而作为溶瘤病毒具有吸引力(Angelova等(2015))。H-1PV已表现出针对实体瘤(包括乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、胰腺癌和结直肠癌等的临床前模式)以及血液恶性肿瘤(包括淋巴瘤和白血病)二者的广泛抑癌潜能(Angelova等(2017))。H-1PV通过增加肿瘤相关抗原的呈递、树突细胞的成熟和促炎性细胞因子的释放来刺激抗肿瘤应答(Moehler等(2014)Frontiers in Oncology 4:92)。H-1PV还表现出肿瘤选择性，这被认为是由于细胞复制和转录因子的可用性、与NS1细小病毒蛋白相互作用的细胞蛋白的过表达、以及在肿瘤细胞而非正常细胞中NS1的功能性调节中涉及的代谢途径的活化(Angelova等(2015)Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:55)。由于H-1PV的无害性质，经常利用野生型毒株，无需通过遗传工程化进行减毒(Angelova等(2015))。
研究表明人胶质瘤细胞的溶瘤H-1PV感染导致有效的细胞杀伤，并且高级胶质瘤干细胞模型也允许裂解性H-1PV感染。当在肿瘤细胞照射后不久应用病毒时，已观察到增强的胶质瘤细胞杀伤，表明该方案可用于不可切除的复发性胶质母细胞瘤(Angelova等(2017))。脑内或全身性H-1PV注射导致具有原位RG-2肿瘤的有免疫能力的大鼠以及植入人U87胶质瘤的免疫缺陷动物中的胶质瘤消退而无毒副作用(Angelova等(2015))。Del H-1PV是具有较高感染性并在人转化细胞系中传播的适应性变体，在胰腺癌和宫颈癌异种移植物模型中表现出体内溶瘤作用(Geiss等(2017)Viruses 9，301)。H-1PV还表现出针对五种人骨肉瘤细胞系(CAL 72、H-OS、MG-63、SaOS-2、U-2OS)(Geiss等(2017)Viruses 9，301)和针对人黑素瘤细胞(SK29-Mel-1、SK29-Mel-1.22)(Moehler等(2014)Frontiers in Oncology4:92)的溶瘤活性。在另一研究中，带有宫颈癌异种移植物的裸大鼠在H-1PV处理后表现出剂量依赖性的肿瘤生长停滞和消退(Angelova等(2015))。H-1PV的肿瘤内和静脉内施用也表现出免疫受损小鼠的人乳腺癌异种移植物的显著生长抑制(Angelova等(2015))。在带有人胃癌或人伯基特淋巴瘤的小鼠中的瘤内H-1PV注射导致肿瘤消退和生长抑制(Angelova等(2015))。
溶瘤H-1PV(ParvOryx01)在复发性多形性胶质母细胞瘤患者中的一期I/IIa临床试验于2015年完成(临床试验NCT01301430)，并证实瘤内或静脉内注射后的有利的无进展生存、临床安全性和患者耐受性(Angelova等(2017)；Geiss等(2017)Viruses 9，301；Geletneky等(2017)Mol.Ther.25(12)：2620-2634)。该试验证明了H-1PV的以下能力：以剂量依赖性方式穿过血脑屏障并建立免疫原性抗肿瘤应答，其特征为白细胞(主要是CD8+和CD4+T淋巴细胞)浸润，并在局部处理的肿瘤中检测到免疫细胞活化的数种标志物，包括穿孔素、粒酶B、IFNγ、IL-2、CD25和CD40L(Geletneky等(2017)Mol.Ther.25(12)：2620-2634)。
H-1PV还被证明体外有效杀死高度侵袭性胰导管腺癌(PDAC)细胞，包括对吉西他滨具有抗性的细胞，并且在原位PDAC大鼠模型中瘤内注射H-1PV导致肿瘤消退和延长的动物存活(Angelova等(2017)；Angelova等(2015))。在免疫缺陷的裸大鼠PDAC模型中观察到相似的结果，包括选择性肿瘤靶向和无毒性(Angelova等(2015))。H-1PV与细胞抑制剂(顺铂，长春新碱)或靶向药物(舒尼替尼)的组合可协同诱导人黑色素瘤细胞中的凋亡(Moehler等(2014))。H-1PV和丙戊酸(HDAC抑制剂)的组合导致对宫颈和胰腺细胞的协同细胞毒性(Angelova等(2017))，而在两步方案中组合吉西他滨与H-1PV可显著改善吉西他滨的治疗效率(Angelova等(2015))。与其它病毒一样，H-1PV也可被工程化为表达抗癌分子。例如，研究表明表达Apoptin的细小病毒H1衍生的载体具有比野生型H-1PV更强的诱导凋亡的能力(Geiss等(2017))。
与其它溶瘤病毒一样，细小病毒的治疗潜能由于非特异性吸收而受限，这是由于识别它们的细胞表面受体的普遍表达以及由于重复施用后中和抗体的出现。然而，H-1PV与基于细胞的媒介组合使用时表现出成功的抗肿瘤作用，从而规避了这些潜在问题。在一项研究中，自体MH3924A大鼠肝癌细胞成功用于靶向递送H-1PV和抑制由相同细胞形成的转移(Raykov等(2004)Int.J.Cancer 109：742-749)。H-1PV感染后24小时，通过γ照射使肝癌细胞失活，这只能使子代病毒产量降低2倍或更少。与直接注射病毒相比，基于媒介细胞的疗法可导致改善的转移抑制并产生更少的中和抗体，从而支持使用载体细胞全身性递送溶瘤细小病毒(Raykov等(2004))。
麻疹病毒
麻疹病毒(MV)是一种带有负义基因组的包膜单链RNA病毒，其属于副粘病毒(Paramyxoviruses)家族(Aref等(2016)Viruses 8：294；Hutzen等(2015)OncolyticVirotherapy 4：109-118)。它的非节段基因组是稳定的，突变和回复其病原体形式的风险低，并且由于其在细胞质中的复制而在感染的细胞中不引起插入DNA诱变的风险(Aref等(2016)；Hutzen等(2015)。MV于1954年首次从名叫Edmonston的患者中分离，并通过多次体外传代后的减毒发展为已成功保护了全球10亿以上个体长达50年的具有出色安全性的活疫苗(Aref等(2016)病毒8：294；Hutzen等(2015)Oncolytic Virotherapy 4：109-118)。该毒株的衍生物称为MV-Edm，是溶瘤治疗研究中最常利用的MV毒株。然而，Schwarz/Moraten麻疹疫苗株比Edm衍生物更减毒且更具免疫原性，这使它们更安全且更具免疫调节性(Veinalde等(2017)Oncoimmunology 6(4)：e1285992)。野生型MV的溶瘤作用在1970年代有记载，其报道了急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤患者的改善(Aref等(2016))。
MV利用三种主要受体进入靶细胞：CD46、连接蛋白-4和信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)(Aref等(2016)；Hutzen等(2015))。SLAM在活化的B细胞和T细胞、未成熟的胸腺细胞、单核细胞和树突细胞上表达，是野生型毒株的主要受体，减毒和肿瘤选择性MV-Edm株主要靶向CD46受体，该受体是补体活化的调节剂，在许多肿瘤细胞中过表达(Aref等(2016)；Hutzen等(2015)；Jacobson等(2017)Oncotarget 8(38)：63096-63109；Msaouel等(2013)Expert Opin.Thel.Ther.13(4))。连接蛋白-4主要在呼吸道上皮中表达，被野生型和减毒MV株利用(Aref等(2016)；Msaouel等(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。与其它溶瘤病毒一样，肿瘤细胞的IFN抗病毒应答缺陷也促进了MV的肿瘤选择性(Aref等(2016)；Jacobson等(2017)Oncotarget 8(38)：63096-63109)。当前，数项临床试验研究了MV在治疗多种癌症中的潜能，包括多发性骨髓瘤(NCT02192775、NCT00450814)、头颈癌(NCT01846091)、间皮瘤(NCT01503177)和卵巢癌(NCT00408590、NCT02364713)。
MV已被遗传工程化以表达免疫刺激和免疫调节基因，例如包括编码IL-13、INF-β、GM-CSF和幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)嗜中性粒细胞活化蛋白(NAP)的那些基因(Aref等(2016)Hutzen等(2015)；Msaouel等(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。在黑色素瘤小鼠模型中，已证明利用溶瘤MV与抗CTLA4和抗PD-L1抗体的组合疗法是成功的(Aref等(2016)；Hutzen等(2015))。由于广泛的接种或先前的自然感染，大多数患者对MV具有事先免疫力，这阻碍了其治疗潜能。为避免此类情况，MV已在载体细胞如间充质基质细胞中被递送至肿瘤中，有效逃避了宿主中和抗体并在急性淋巴细胞白血病、肝细胞癌和卵巢癌的临床前模型中证明是有效的(Aref等(2016))。其它数种细胞载体已证明递送MV(包括U-937单核细胞细胞系、未成熟和成熟原代树突细胞、PMBC、活化的T细胞、原代CD14+细胞、多发性骨髓瘤MM1细胞系和血液过度生长内皮细胞(blood outgrowth endothelialcell))的有希望的结果(Msaouel等(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。当前，临床试验(NCT02068794)正在研究感染溶瘤MV的间充质干细胞在治疗复发性卵巢癌患者中的应用。克服预先存在的免疫力的另一策略涉及MV治疗与免疫抑制剂如环磷酰胺的组合(Hutzen等(2015))。
MV-CEA
MV-CEA，其经遗传工程化以表达肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)，导致癌细胞感染后释放CEA至患者的血流中，允许检测CEA水平，从而允许追踪体内病毒感染(Aref等(2016)；Hutzen等(2015))。MV-CEA的治疗潜能已在临床前得到证明，目前正在I期临床试验中研究用于治疗卵巢癌(NCT00408590)。
MV-NIS
MV-NIS是Edmonston疫苗谱系的另一可追踪溶瘤MV，工程化以表达碘化钠同向转运体(NIS)，由于NIS转基因位于MV基因组的血凝素(H)基因的下游而非MV-CEA构建体中核衣壳(N)基因的上游，因此NIS与MV-CEA相比显示出优异的病毒增殖(Aref等(2016)；Galanis等(2015)Cancer Res.75(1)：22-30)。放射性同位素如123I、124I、125I、131I和99mTc通过在感染MV-NIS的细胞上表达的NIS被转运，从而允许使用例如PET、SPECT/CT和γ照相机进行无创成像(Msaouel等(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(4))。NIS的表达还可通过促进发射β射线的放射性同位素(如I-131)进入肿瘤细胞进行放射病毒疗法，从而改善溶瘤MV的功效，并且在多发性骨髓瘤、多形性胶质母细胞瘤、头颈部癌、未分化甲状腺癌和前列腺癌模型中表现出有希望的临床前结果(Aref等(2016)；Hutzen等(2015)；Msaouel等(2013))。目前，一些I/II期临床试验正在研究MV-NIS在多发性骨髓瘤(NCT00450814、NCT02192775)、间皮瘤(NCT01503177)、头颈癌(NCT01846091)和卵巢癌中使用感染病毒的MSC(NCT02068794)的用途。
呼肠孤病毒
呼吸道肠道孤儿病毒，通常称为呼肠孤病毒，是呼肠孤病毒科的非包膜双链RNA病毒，其对人是非致病性的。野生型呼肠孤病毒在整个环境中普遍存在，导致普通人群中70％-100％的血清阳性(Gong等(2016)World J.Methodol.6(1)：25-42)。呼肠孤病毒有三种血清型，包括1型Lang、2型Jones、3型Abney和3型Dearing(T3D)。T3D是临床前和临床研究中最常用的天然溶瘤呼肠孤病毒血清型。
溶瘤呼肠孤病毒被认为具有肿瘤选择性，这是由于活化的Ras信号传导具有癌细胞的特征(Gong等(2016))；Zhao等(2016)Mol.Cancer Ther.15(5)：767-773)。Ras信号传导途径的活化通过抑制dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)的磷酸化来破坏细胞的抗病毒应答，PKR通常负责预防病毒蛋白合成(Zhao等(2016))。Ras活化还增强了病毒脱壳和拆卸能力，导致病毒子代生成和感染性增强，并通过增强的凋亡加速子代的释放(Zhao等(2016))。据估计，所有人肿瘤中大约30％显示出异常的Ras信号传导(Zhao等(2016))。例如，多数恶性胶质瘤具有活化的Ras信号传导途径，呼肠孤病毒在83％的体外恶性胶质瘤细胞中以及体内人恶性胶质瘤模型中，以及100％的离体胶质瘤标本中具有抗肿瘤活性(Gong等(2016)WorldJ.Methodol.6(1)：25-42)。此外，胰腺腺癌表现出很高的Ras突变发生率(大约90％)，并且呼肠孤病毒在100％的体外测试的胰腺细胞系中显示出强有力的细胞毒性并在100％的体内皮下肿瘤小鼠模型中诱导消退。(Gong等(2016))。
呼肠孤病毒已在临床上对广谱的恶性肿瘤(包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌(黑色素瘤)、神经癌、血液癌、前列腺癌、膀胱癌和头颈癌)表现出广泛的抗癌活性(Gong等(2016))。呼肠孤病毒疗法目前正在与放疗、化疗、免疫疗法和外科手术结合进行测试。呼肠孤病毒和放疗的结合已被证明对体外治疗头颈癌、结直肠癌和乳腺癌细胞系以及体内治疗结直肠癌和黑色素瘤模型有益(Gong等(2016))。呼肠孤病毒和吉西他滨的组合，以及呼肠孤病毒、紫杉醇和顺铂的组合已在小鼠肿瘤模型中被证明是成功的(Zhao等(2016))。在B16黑色素瘤小鼠模型中的临床前研究证明，溶瘤呼肠孤病毒和抗PD-1疗法的组合与单独的呼肠孤病毒相比具有改善的抗癌功效(Gong等(2016)；Zhao等(2016)；Kemp等(2015)Viruses 8，4)。
呼肠孤病毒证明的有希望的临床前结果已导致许多临床试验。由加拿大公司Oncolytics Biotech Inc.开发的
Figure BDA0002931076310000321
是临床开发中唯一的治疗性野生型呼肠孤病毒，并且已单独以及与其它治疗剂结合在许多恶性肿瘤中显示出抗癌活性。例如，
Figure BDA0002931076310000322
在复发性恶性胶质瘤治疗中的I期临床研究(NCT00528684)发现呼肠孤病毒被良好耐受，而I/II期试验发现
Figure BDA0002931076310000323
能够在对铂类化疗无应答的卵巢上皮癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者中杀死肿瘤细胞而不损害正常细胞(NCT00602277)。
Figure BDA0002931076310000324
的II期临床试验发现，它对治疗转移至肺部的骨和软组织肉瘤患者是安全有效的(NCT00503295)。
Figure BDA0002931076310000325
与FOLFIRI和贝伐单抗结合用于目前在转移性结直肠癌患者中积极进行的I期临床试验(NCT01274624)。
Figure BDA0002931076310000326
与化疗剂吉西他滨结合的II期临床试验已在晚期胰腺腺癌患者中进行(NCT00998322)，II期临床研究研究了
Figure BDA0002931076310000327
与多西他赛组合在转移性去势抗性前列腺癌中的治疗潜能(NCT01619813)，并且II期临床试验研究了
Figure BDA0002931076310000328
与紫杉醇组合治疗晚期/转移性乳腺癌患者(NCT01656538)。III期临床试验研究了
Figure BDA0002931076310000329
与紫杉醇和卡铂组合治疗铂难治性头颈癌的功效(NCT01166542)，而采用此结合疗法的II期临床研究是在非小细胞肺癌(NCT00861627)和转移性黑色素瘤(NCT00984464)患者中进行的。
Figure BDA00029310763100003210
与卡非佐米(carfilzomib)和地塞米松组合在复发或难治性多发性骨髓瘤患者中的I期临床试验正在进行中(NCT02101944)。
由于多数人群中存在中和抗体，全身施用呼肠孤病毒的治疗潜能有限，这可通过将呼肠孤病毒与免疫抑制剂(例如环孢菌素A或环磷酰胺)共同施用来克服(Gong等(2016))。在IV施用呼肠孤病毒前施用GM-CSF导致B16黑色素瘤肿瘤显著减少并延长了小鼠存活(Kemp等(2015)病毒8、4)。载体细胞还成功将病毒屏蔽于预先存在的免疫力。例如，淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)和DC被利用作卵巢癌模型中呼肠孤病毒的细胞载体，并成功保护病毒抵御中和抗体(Zhao等(2016))。包括NK细胞的PMBC已被证明不仅成功运输呼肠孤病毒，而且还被呼肠孤病毒刺激以杀死肿瘤靶(Zhao等(2016))。另一研究表明，在不存在人血清的情况下，DC和T细胞均为呼肠孤病毒的有效体外载体，但只有DC在存在中和血清的情况下成功地将病毒递送至黑色素瘤细胞(Ilett等(2011)Clin.Cancer Res.17(9)：2767-2776)。DC也能够在带有淋巴结B16tk黑色素瘤转移的小鼠中递送呼肠孤病毒，而单纯呼肠孤病毒完全无效(Ilett等(2009)Gene Ther.16(5)：689-699)。
水泡性口炎病毒(VSV)
水泡性口炎病毒(VSV)是弹状病毒科水泡病毒属成员。其基因组由具有负义极性的单链RNA组成，由11,161个核苷酸组成，并编码五个基因：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)(Bishnoi等(2018)Viruses 10(2)，90)。VSV通过昆虫载体传播，并且疾病限于其自然宿主，包括马、牛和猪，在人类中轻度和无症状感染(Bishnoi等(2018)Viruses 10(2)，90)。VSV是感染细胞凋亡的有力快速诱导剂，并已显示出可敏化化疗抗性肿瘤细胞。已显示VSV感染肿瘤脉管系统，导致流向肿瘤的血流损失、血液凝结和新脉管系统的溶解。该病毒还能够在低氧组织中复制并诱导细胞病变效应和细胞裂解。此外，WT VSV在多种组织培养细胞系中生长至高滴度，促进大规模病毒生产，其具有小且易于操作的基因组，并且其可在细胞质中复制而无宿主细胞转化风险(Bishnoi等)(2018)；Felt和Grdzelishvili(2017)Journal of General Virology 98：2895-2911)。这些因素加上它对人无致病性以及人通常无预先存在的对VSV的免疫力的事实，使其成为病毒肿瘤治疗的良好候选物。
尽管VSV可附着在普遍表达的细胞表面分子上，使其具有“泛嗜性”，但WT VSV对I型IFN应答敏感，从而基于缺陷或受抑制的肿瘤I型IFN信号传导而显示出肿瘤选择性(Felt和Grdzelishvili(2017))。然而，由于其对正常细胞的感染性，VSV可引起神经发病机制，但可通过修饰其基质蛋白和/或糖蛋白来减弱。例如，可缺失基质蛋白或可缺失基质蛋白第51位的甲硫氨酸残基或将其取代为精氨酸(Bishnoi等(2018)；Felt和Grdzelishvili(2017))。另一方法是用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)取代VSV的糖蛋白(rVSV-GP)(Bishnoi等(2018)；Felt和Grdzelishvili(2017))。还可对VSV进行遗传修饰以包括自杀基因(例如疱疹病毒胸苷激酶(TK))或表达免疫刺激性细胞因子(例如IL-4、IL-12、IFNβ)或共刺激物(例如粒细胞-巨噬细胞-菌落-刺激因子1(GM-CSF1)来增强溶瘤活性(Bishnoi等(2018)。编码NIS和IFNβ的VSV-IFNβ-碘化钠同向转运体(VSV-IFNβ-NIS)目前在美国的数个I期临床试验中测试(试验NCT02923466、NCT03120624和NCT03017820的详细信息请参见ClinicalTrials.gov)。
当在多种鼠类癌症模型中静脉内(IV)施用时，水泡性口炎病毒(VSV)是有效的溶瘤治疗剂。在一项研究中，VSV-GP在免疫缺陷小鼠模型中对皮下植入的G62人神经胶质母细胞瘤细胞的瘤内治疗以及对原位U87人胶质瘤细胞的静脉内治疗是成功的。肿瘤内注射VSV-GP针对颅内CT2A鼠胶质瘤细胞也是有效的(Muik等(2014)Cancer Res.74(13)：3567-3578)。已发现VSV-GP不引发可检测中和抗体反应，并且此类遗传修饰的溶瘤病毒对人补体不敏感，在整个实验过程中保持稳定(Muik等(2014))。在另一实例中，发现瘤内施用VSV-GP可有效感染并杀死小鼠模型中移植的人A375恶性黑色素瘤细胞以及鼠B16黑色素瘤细胞系(Kimpel等(2018)Viruses 10、108)。然而，溶瘤病毒的静脉注射不成功，即使在肿瘤内施用组中，由于I型IFN反应，肿瘤最终均生长(Kimpel等(2018))。在另一研究中，通过瘤内注射VSV-GP治疗具有A2780人卵巢癌细胞的皮下异种移植小鼠模型，并且尽管最初观察到无神经毒性的肿瘤缓解，缓解是暂时的，并且肿瘤复发。发现这是由于I型IFN应答，通过将VSV-GP与JAK1/2抑制剂鲁索替尼组合观察到抗病毒状态的逆转(Dold等(2016)MolecularTherapy-Oncolytics 3，16021)。然而，由于安全性考虑，对于野生型VSV的减毒变体，通常不可能在体内抑制I型IFN应答，这导致需要替代解决方案。
研究表明，产生抗病毒抗体的体液免疫限制了VSV的治疗潜能。已发现，与注射裸病毒粒子相比，对带有转移性肿瘤的动物重复施用载体细胞中的VSV导致高得多的治疗功效(Power等(2007)Molecular Therapy 15(1)：123-130)，证明载体细胞逃避循环抗体的能力。同基因CT26鼠结肠癌细胞容易被VSV感染，并在静脉内施用后迅速在肺肿瘤而不在周围正常肺组织中积累，在此保留直至释放病毒并在VSV递送以感染小鼠肺组织24h内经历裂解(Power等(2007))。使用异种基因A549细胞作为载体细胞也获得了全身性细胞介导的递送，说明使用免疫相容的同基因CT26细胞以及免疫不相容的异种基因A549细胞可实现细胞介导的VSV递送(Power等(2007))。L1210鼠白血病细胞也成功地将VSV递送至肺肿瘤以及位于小鼠后侧腹的皮下肿瘤(Power等(2007))。当将这些感染VSV的白血病细胞施用于无肿瘤的小鼠时，在正常组织中无可检测病毒复制，表明肿瘤选择性。
在另一研究中，缺乏基质蛋白的甲硫氨酸51及因此不能阻断编码IFN的mRNA的核输出的VSV-δ51被加载至OT-1CD8+T细胞，该细胞特别表达针对卵清蛋白抗原的SIINFEKL表位(由B16ova肿瘤表达)的转基因T细胞受体(Qiao等(2008)Gene Ther.15(8)：604-616)。此溶瘤病毒/基于细胞的媒介组合可用于针对具有免疫能力的C57B1/6小鼠肺中的B16ova肿瘤，并且当与单独使用病毒或T细胞相比，导致治疗效果显著提高。在OT-1细胞内无可检测VSV复制，但在将感染的T细胞与B16ova细胞共培养后，病毒被释放并有效感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞。将VSV加载至T细胞显示出体外增加T细胞活化并且体内增加T细胞向肿瘤的运输(Qiao等(2008))。
腺病毒
腺病毒(Ad)是具有线性基因组的非包膜ds-DNA病毒，由Wallace Rowe及同事于1953年首次发现，并于1956年对宫颈癌的治疗进行了测试(Choi等(2015)J.Control.Release 10(219)：181-191)。人Ad在环境中广泛存在，根据交叉易感性分为57个血清型(Ad1-Ad57)，根据毒力和组织趋性分为7个亚组(A-G)。腺病毒血清型5(Ad5)是用于溶瘤病毒疗法的最常用腺病毒。对人的感染是轻度的并导致类似感冒的症状(Yokoda等(2018)Biomedicines 6，33)，全身施用会导致肝脏趋性并可能导致肝毒性(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837)，但出于治疗目的，Ad被认为是安全的。Ad通过附着于柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)进入细胞，然后是细胞表面上的αvβ3和αvβ5整联蛋白与腺病毒五邻体基质上的Arg-Gly-Asp三肽基序(RGD)之间的相互作用(Jiang等(2015)Curr.Opin.Virol.13：33-39)。CAR在大多数正常细胞表面上表达，但表达在多种癌细胞类型之间高度变化。另一方面，RGD相关整联蛋白在癌细胞中高表达，但在正常细胞中的表达水平要低得多(Jiang等(2015))。结果，Ad通常通过RGD基序靶向癌细胞。
由于其在转化的细胞中的高转导效率、其缺乏向宿主基因组中的整合/缺乏插入诱变、其基因组稳定性、将大的治疗性基因插入其基因组的能力以及其通过遗传操纵(例如用癌症组织选择性启动子取代病毒启动子)的肿瘤选择性能力，Ad作为溶瘤病毒是具有吸引力的(Yokoda等(2018)Biomedicines 6，33；Choi等(2015)J.Control.Release 10(219)：181-191)。
具有肿瘤特异性启动子的溶瘤Ad的实例包括用于前列腺癌治疗的CV706，其腺病毒早期区1A(E1A)基因在前列腺特异性抗原启动子的控制下；以及OBP-301，其利用端粒酶逆转录酶(TERT)启动子调节E1A基因表达(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837)。诱导肿瘤选择性的另一方法是在Ad基因组的E1区导入突变，其中缺失基因与肿瘤细胞中常见的遗传突变(例如视网膜母细胞瘤(Rb)途径的异常或p53突变)在功能上互补(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837)。例如，溶瘤腺病毒ONYX-015和H101在E1B55K基因中具有缺失，使p53失活。这些突变体不能阻断正常凋亡防御途径，通过感染具有缺陷p53肿瘤抑制途径的肿瘤细胞而导致肿瘤选择性(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837；Uusi-Kerttula等(2015)Viruses 7：6009-6042)。E1AΔ24是溶瘤Ad，其在E1A基因中含有一个24-bp突变，在具有Rb途径突变的癌细胞中破坏Rb结合结构域并促进病毒复制。ICOVIR-5是溶瘤Ad，其组合了通过E2F启动子的E1A转录控制、E1A的Δ24突变以及腺病毒纤维中的RGD-4C插入(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837；Uusi-Kerttula等(2015)。Δ24-RGD或DNX-2401是溶瘤Ad，其中通过插入RGD基序修饰了Δ24骨架，其表现出增强的体外和体内溶瘤作用(Jiang等(2015))。
改善肿瘤选择性的替代策略涉及通过靶向细胞外基质(ECM)来克服实体瘤中的物理屏障。例如，VCN-01(表达透明质酸酶的溶瘤Ad)在鼠类癌症模型中显示出了希望。Ad也已被工程化为表达松弛素以破坏ECM(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837；Shaw和Suzuki(2015)Curr.Opin.Virol.21：9-15)。表达自杀基因(例如胞嘧啶脱氨酶(CD)和HSV-1胸苷激酶(TK))的Ad，如表达免疫刺激性细胞因子的Ad(例如表达GM-CSF的ONCOS-102)一样，显示出增强的体内抗肿瘤功效(Yamamoto等(2017)Cancer Sci.108：831-837；Shaw和Suzuki(2015)Curr.Opin.Virol.21：9-15)。表达抗CTLA4抗体的基于Δ24的溶瘤Ad在临床前研究中显示出了希望(Jiang等(2015))。
腺病毒H101
Figure BDA0002931076310000341
是2005年在中国批准的首个与化疗组合用于临床用途的溶瘤Ad，用于治疗晚期鼻咽癌患者。由于临床前研究显示出的希望，许多临床试验已研究了溶瘤腺病毒用于治疗多种癌症的用途。例如，正在进行的和过去的临床试验包括涉及以下的研究：转移性胰腺癌患者中的编码IL-12的Ad5(NCT03281382)；在胰腺腺癌、卵巢癌、胆道癌和结直肠癌患者中的表达TMX-CD40L和41BBL的免疫刺激性Ad5(LOAd703)(NCT03225989)；将LOAd703与吉西他滨和纳布紫杉醇(nab-paclitaxel)组合用于胰腺癌患者(NCT02705196)；编码人类PH20透明质酸酶的溶瘤腺病毒(VCN-01)与吉西他滨和
Figure BDA0002931076310000342
组合治疗晚期实体瘤包括胰腺腺癌(NCT02045602；NCT02045589)患者；
Figure BDA0002931076310000343
(OBP-301)，一种含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的具有肿瘤选择性的溶瘤腺病毒，用于肝细胞癌患者(NCT02293850)；E1B基因缺失的Ad5与经动脉化疗栓塞(TACE)组合用于肝细胞癌患者(NCT01869088)；CG0070(表达GM-CSF且含有癌症特异性E2F-1启动子来驱动E1A表达的溶瘤Ad)用于膀胱癌患者(NCT02365818；NCT01438112)；Enadenotucirev(Colo-Ad1)，一种Ad11p/Ad3嵌合B组溶瘤病毒，用于结肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌患者(NCT02053220)；和DNX-2401(Ad5E1AΔ24RGD)与替莫唑胺(NCT01956734)或IFNγ(NCT02197169)组合治疗胶质母细胞瘤患者。
与其它溶瘤病毒一样，由于中和抗体的发展以及由于其高血清阳性率，全身施用时Ad治疗功效低，据估计，一些人群中达90％对Ad具有现有免疫力(Uusi-Kerttula等(2015)Viruses 7：6009-6042)。此外，Ad的非特异性肝隔离导致肝毒性(Choi等(2015))。例如诸如PEG、带正电荷的精氨酸嫁接的生物可还原聚合物(ABP)、PAMAMG5等聚合物和其它纳米材料可用于掩盖病毒衣壳蛋白、减轻抗病毒免疫应答和非特异性肝积累以及增加肿瘤积累(Choi等(2015)。逃避免疫系统的其它方法包括使用载体媒介细胞来递送溶瘤Ad。例如，在基于原位胶质瘤干细胞(GSC)的异种移植小鼠模型中，T细胞用于在体外和体内递送Δ24-RGD Ad至胶质母细胞瘤细胞(Balvers等(2014)Viruses 6：3080-3096)。加载病毒的T细胞的全身施用导致肿瘤内病毒递送(Balvers等(2014))。研究用载体/媒介细胞递送Ad的临床试验包括使用加载有溶瘤Ad的神经干细胞治疗恶性胶质瘤(NCT03072134)；表达Her2的Ad感染的自体树突细胞用于转移性乳腺癌患者(NCT00197522)；以及感染ICOVIR5的自体间充质干细胞用于患有转移性和难治性实体瘤的儿童和成人(MSC)(NCT01844661)。
脊髓灰质炎病毒
脊髓灰质炎病毒(PV)属于细小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒(Enterovirus)属，具有正义单链RNA基因组。由于PV对于脊髓和运动神经元的趋性，PV感染导致严重的神经综合征脊髓灰质炎(Brown和Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PV在存在活跃抗病毒IFN应答的情况下保留了稳健的复制能力和细胞毒性，因此在临床应用中是有用的，允许数轮病毒复制以扩增免疫刺激病毒细胞毒性作用(Brown和Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PV也不整合至宿主细胞基因组中(Yla-Pelto等(2016)Viruses 8，57)。
PV宿主细胞进入是由Ig超家族细胞粘附分子CD155(也称为PV受体(PVR)和连接蛋白样分子5(Necl5，其在实体瘤例如胶质母细胞瘤中广泛过表达)介导的(Brown和Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85)。CD155在结直肠癌、肺腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中也表达，并在抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞和树突细胞中表达(Brown等(2014)Cancer 120(21)：3277-3286)。
PV的内部核糖体进入位点(IRES)负责驱动PV RNA基因组的翻译起始，并且与PV的神经致病性有关联。衍生自萨宾(Sabin)血清型的PV减毒活疫苗在IRES中携带关键的减毒点突变(Brown和Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85)。高度减毒的脊髓灰质炎/鼻病毒重组PVSRIPO(1型(萨宾)减毒活PV疫苗，其中同源PV IRES被人鼻病毒2(HRV2)的置换)与亲代PV相比无神经毒性/神经致病性，但保留对GBM细胞的癌细胞细胞毒性和特异性(Brown和Gromeier(2015)Curr.Opin.Virol.13：81-85；Brown和Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。PVSRIPO通过引发抗肿瘤免疫应答而非直接裂解大块肿瘤而导致肿瘤消退，并且已在治疗复发性胶质母细胞瘤(GBM)的临床试验中显示出希望(NCT01491893)(Brown和Gromeier(2015)Curr.Opin.13：81-85；Brown和Gromeier(2015)Discov.Med.19(106)：359-365)。目前，一项1b期临床试验正在研究PVSRIPO用于治疗儿童复发性恶性胶质瘤的用途(NCT03043391)，一项2期临床试验正在研究PVSRIPO单独或与化疗药物洛莫司汀组合用于患有复发性恶性胶质瘤的成年患者的用途(NCT02986178)。
单纯疱疹病毒
单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科，具有大的线性双链DNA基因组，包括许多对于病毒复制非必需的基因，使其成为遗传操作的理想候选物。其它优势包括感染多种细胞类型的能力、对阿昔洛韦和更昔洛韦等抗病毒药的敏感性以及其缺乏插入诱变(Sokolowski等(2015)Oncolytic Virotherapy4：207-219；Yin等。(2017)Front。Oncol。7：136)。HSV存在两种类型，HSV I型(HSV-1)和II型(HSV-2)，多数溶瘤HSV衍生自HSV-1。在人类中，HSV-1通过结合细胞表面的连接蛋白、糖蛋白和疱疹病毒进入介导物(HVEM)引起热病性疱疹并感染上皮细胞、神经元和免疫细胞(Kohlhapp和Kaufman(2016)Clin.Cancer Res22(5)：1048-1054)。
迄今为止已生成许多不同的溶瘤HSV-1病毒。例如，HSV-1已被工程化以表达抗HER-2抗体曲妥珠单抗，靶向过表达HER-2的肿瘤例如乳腺癌和卵巢癌、胃癌和胶质母细胞瘤。将编码曲妥珠单抗的基因插入HSV-1gD糖蛋白基因内的两个区域，产生两种溶瘤HSV：R-LM113和R-LM249。R-LM113和R-LM249表现出针对人乳腺癌和卵巢癌以及针对HER2+胶质母细胞瘤鼠模型的临床前活性。R-LM249已使用间充质基质细胞(MSC)作为载体细胞进行全身施用，针对鼠模型中卵巢癌和乳腺癌的肺和脑转移施加治疗作用(Campadelli-Fiume等(2016)Viruses 8，63)。另一溶瘤HSV-1，dlsptk HSV-1在独特的长3(UL23)基因(编码胸苷激酶(TK)的病毒同源物)中包含缺失，而hrR3 HSV-1突变体含有核糖核苷酸还原酶(RR，也称为ICP6，由基因UL39编码)大亚基的LacZ插入突变。结果，dlsptk和hrR3 HSV-1突变体分别仅在过表达TK和RR的癌细胞中复制(Sokolowski等(2015)Oncolytic Virotherapy 4：207-219)。
HF10是自发突变的溶瘤HSV-1，其缺少编码UL43、UL49.5、UL55、UL56和潜伏相关转录物的基因，并且过表达UL53和UL54。HF10在临床前研究中显示出有希望的结果，并证明了高肿瘤选择性、高病毒复制、强力抗肿瘤活性和有利的安全性(Eissa等(2017)Front.Oncol.7：149)。研究HF10的临床试验包括：针对难治性头颈癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤患者的I期研究(NCT01017185)，以及在不可切除胰腺癌患者中HF10与化疗(吉西他滨、纳布紫杉醇、TS-1)组合的I期研究(NCT03252808)。HF10也已与抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)结合使用，改善了IIIb、IIIc或IV期不可切除或转移性黑色素瘤患者的治疗功效(NCT03153085)。一项II期临床研究目前正在研究在可切除IIIb、IIIc和IV期黑色素瘤患者中HF10与抗PD-1抗体纳武单抗(Nivolumab)的组合(NCT03259425)以及在不可切除或转移性黑色素瘤患者中HF10与伊匹单抗的组合(NCT02272855)。与单独的任一治疗相比，紫杉醇与HF10组合疗法在腹膜结直肠癌模型中导致更优异的生存率，而与单独的HF10或厄洛替尼相比，用HF10和厄洛替尼组合治疗导致体外或体内针对胰腺异种移植物的活性提高(Eissa等(2017)Front.Oncol.7：149)。
Talimogene laherparepvec(
Figure BDA0002931076310000361
T-VEC)，以前称为OncoVEXGM-CSF，是FDA批准的用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤单纯疱疹病毒，它自HSV-1的JS1株生成并经遗传工程化以表达粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)(Aref等(2016)Viruses 8：294)。在T-VEC中，GM-CSF表达增强了抗肿瘤细胞毒性免疫应答，而被感染细胞蛋白34.5(ICP34.5)基因的两个拷贝缺失抑制了在正常组织中的复制，并且ICP47基因的缺失增加了MHC I类分子的表达，允许在感染细胞上的呈递抗原(Eissa等(2017))。T-VEC通过结合癌细胞表面的连接蛋白表现出肿瘤选择性，并通过利用破坏的致癌和抗病毒信号传导途径，特别是蛋白激酶R(PKR)和I型IFN途径，优先在肿瘤细胞中复制。在正常细胞中，病毒感染活化PKR，然后使真核起始因子2A蛋白(eIF-2A)磷酸化，使其失活，进而抑制细胞蛋白合成，阻断细胞增殖并阻止病毒复制。由于ICP34.5蛋白的表达(其活化了使eIF-2A去磷酸化的磷酸酶，从而恢复了感染细胞中的蛋白质合成)，野生型HSV逃避了抗病毒应答。因此，ICP34.5的缺失排除了T-VEC在正常细胞中的病毒复制。然而，癌细胞中的PKR-eIF-2A途径被破坏，允许细胞连续生长和不受抑制的病毒复制(Kohlhapp和Kaufman(2016)Clin.Cancer Res.22(5)：1048-1054；Yin等(2017)Front.Oncol.7：136)。GM-CSF的表达通过引起树突细胞积累、促进抗原呈递并引发T细胞应答来改善T-VEC的免疫原性(Kohlhapp和Kaufman(2016)Clin.Cancer Res.22(5)：1048-1054)。
T-VEC显示出在多种不同的癌细胞系(包括乳腺癌、结直肠腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和胶质母细胞瘤)中的优先复制。临床试验包括例如在以下中研究T-VEC：胰腺癌(NCT03086642、NCT00402025)、复发性乳腺癌(NCT02658812)、儿童晚期非CNS肿瘤(NCT02756845)、非黑色素瘤皮肤癌(NCT03458117)、非肌肉浸润性膀胱移行细胞癌(NCT03430687)和恶性黑色素瘤(NCT03064763)以及T-VEC与以下的组合：在转移性三阴性乳腺癌和转移性结直肠癌合并肝转移患者中与阿特珠单抗(atezolizumab)组合(NCT03256344)；在三阴性乳腺癌患者中与紫杉醇组合(NCT02779855)；在难治性淋巴瘤或晚期/难治性非黑色素瘤皮肤癌中与纳武单抗组合(NCT02978625)；在晚期头颈癌患者中与顺铂和放射疗法组合(NCT01161498)；以及在肝肿瘤(NCT02509507)、头颈癌(NCT02626000)、肉瘤(NCT03069378)和黑色素瘤(NCT02965716、NCT02263508)中与派姆单抗(pembrolizumab)组合。
除GM-CSF外，已将许多其它免疫刺激基因(包括编码IL-12、IL-15、IL-18、TNFα、IFNα/β和fms样酪氨酸激酶3配体的基因)插入溶瘤HSV中，导致治疗功效增加(Sokolowski等(2015)；Yin等(2017))。
另一溶瘤HSV-1，R3616在RL1(也称为γ134.5)基因(其编码ICP34.5)的两个拷贝中均包含缺失，靶向具有被破坏的PKR途径的癌细胞。NV1020(或R7020)是在UL55、UL56、ICP4、RL1和RL2基因中含有缺失的HSV-1突变体，导致神经毒性和癌症选择性降低。NV1020在头颈鳞状细胞癌、表皮样癌和前列腺腺癌的小鼠模型中显示出有希望的结果(Sokolowski等(2015))。此外，临床试验研究了NV1020在转移至肝脏的结直肠癌中的安全性和功效(NCT00149396和NCT00012155)。
G207(或MGH-1)是另一HSV-1突变体，在UL39神经毒力基因中具有LacZ失活插入和RL1(γ134.5)缺失。利用G207的临床研究包括：对患有进行性或复发性幕上脑肿瘤的儿童单独施用G207或与单一放射剂量一起施用G207的研究(NCT02457845)，在复发性脑癌(胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤患者中G207的安全性和功效的研究(NCT00028158)，以及在恶性胶质瘤患者中放疗后施用G207的功效的研究(NCT00157703)。
用G207生成G47Δ，其在编码ICP47的基因中包含进一步缺失。其它衍生自HSV-1的溶瘤病毒包括HSV1716，其在RL1中含有缺失，但具有完整UL39基因并在活跃分裂的细胞中选择性复制；以及KM100突变体，其在UL48和RL2基因中具有插入，导致丧失立即早期病毒基因的表达和癌细胞选择性(Sokolowski等(2015)；Yin等(2017)Front.Oncol.7：136)。
由于多数人群对HSV-1具备预先存在的免疫力，因此使用载体细胞递送溶瘤HSV可提高其治疗潜能。例如，人类腹膜间皮细胞(MC)被用作HF10的载体细胞，导致体外以及在卵巢癌小鼠异种移植模型中有效杀死卵巢癌细胞(Fujiwara等(2011)Cancer Gene Therapy18：77-86)。
也自HSV-2衍生溶瘤病毒。例如，FusOn-H2是HSV-2溶瘤病毒，缺失编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PK)结构域的ICP10基因N端区域。所述PK负责磷酸化GTPase活化蛋白Ras-FAP，其活化Ras/MEK/MAPK有丝分裂途径并诱导和稳定c-Fos，这是有效HSV-2复制所需的。正常细胞通常具有失活的Ras信号传导途径。因此，FusOn-H2通过仅在具有活化的Ras信号传导途径的肿瘤细胞中复制而表现出肿瘤选择性(Fu等(2006)Clin.Cancer Res.12(10)：3152-3157)。FusOn-H2已证明具有针对胰腺癌异种移植物的活性(Fu等(2006)Clin.CancerRes.12(10)：3152-3157)、与环磷酰胺组合具有针对Lewis肺癌异种移植物的活性以及具有针对同基因鼠乳腺肿瘤和神经母细胞瘤的活性(Li等(2007)Cancer Res.67：7850-7855)。
痘病毒
痘苗病毒
痘苗病毒的实例包括但不限于李斯特(也称为Elstree)、纽约市健康委员会(NYCBH)、大连、池田、LC16M8、西储(WR)、哥本哈根(Cop)、塔什干、天坛、惠氏、Dryvax、IHD-J、IHD-W、布莱顿、安卡拉、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、大连I、LIPV、LC16M0、LIVP、WR 65-16、EM63、伯尔尼、巴黎、CVA382、NYVAC、ACAM2000和康诺特毒株。痘苗病毒是溶瘤病毒，其具备多种特征，使其特别适合用于伤口和癌症基因疗法。例如，痘苗病毒是细胞质病毒，因此，它在其生命周期中不将其基因组插入宿主基因组。与许多其它需要宿主转录机制的病毒不同，痘苗病毒可使用病毒基因组中编码的酶在宿主细胞细胞质中支持其自身的基因表达。痘苗病毒也具有广泛的宿主和细胞类型范围。特别地，痘苗病毒可在免疫豁免细胞或免疫豁免组织(包括肿瘤和/或转移、还包括受伤组织和细胞)中积累。但与其它溶瘤病毒不同，痘苗病毒通常可通过对象免疫系统的活性而从施用病毒的对象中清除，因此其毒性比其它病毒(如腺病毒)低。因此，尽管该病毒通常可通过对象免疫系统的活性而从将施用病毒的对象中清除，其仍可在免疫豁免细胞和组织(如肿瘤)中积聚、存活和增殖，因为此类免疫豁免区域与宿主免疫系统隔离。
痘苗病毒也可通过插入异源基因被容易地修饰。这可导致病毒的减毒和/或允许递送治疗性蛋白质。例如，痘苗病毒基因组对外源基因具有大的携带能力，其中可插入多达25kb的外源DNA片段(痘苗基因组大小的大约12％)。数种痘苗病毒株的基因组已被完全测序，并鉴定出许多必需和非必需基因。由于不同毒株之间的高序列同源性，来自一种痘苗病毒株的基因组信息可用于设计和生成其它毒株的修饰病毒。最后，通过遗传工程生产修饰的痘苗毒株的技术已很成熟(Moss(1993)Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90；Broder和Earl，(1999)Mol.Biotechnol.13：223-245；Timiryasova等(2001)Biotechniques 31：534-540)。
已证明多种痘苗病毒表现出抗肿瘤活性。例如，在一项研究中，对带有非转移性结肠腺癌细胞的裸鼠全身注射痘苗病毒WR株，其通过痘苗病毒生长因子缺失和将增强的绿色荧光蛋白插入胸苷激酶基因座被修饰。尽管在修饰的病毒中缺少外源治疗性基因，但观察到该病毒具有抗肿瘤作用，包括一种完全应答(McCart等(2001)Cancer Res.1：8751-8757)。在另一研究中，在黑色素瘤患者的III期临床试验中，将痘苗病毒黑色素瘤肿瘤溶解剂(VMO)注射至黑色素瘤阳性淋巴结附近的部位。作为对照，向黑色素瘤患者施用纽约市健康委员会毒株痘苗病毒(VV)。用VMO治疗的黑色素瘤患者的生存率好于未治疗的患者，但与用VV对照治疗的患者相似(Kim等(2001)Surgical Oncol.10：53-59)。
痘苗病毒的LIVP株也已用于诊断和治疗肿瘤，以及用于治疗受伤和发炎组织和细胞(参见例如Lin等(2007)Surgery 142：976-983；Lin等(2008)J.Clin.Endocrinol.Metab.93：4403-7；Kelly等(2008)Hum.Gene Ther.19：774-782；Yu等(2009)Mol.Cancer Ther.8：141-151；Yu等(2009)Mol.Cancer 8:45；美国专利号7,588,767；美国专利号8,052,968；和美国公开号US 2004/0234455)。例如，当静脉内施用时，已证明LIVP株在体内多个位点积聚在内部肿瘤中，并已证明可有效治疗多种组织起源的人肿瘤，包括但不限于乳腺肿瘤、甲状腺肿瘤、胰腺肿瘤、胸膜间皮瘤的转移性肿瘤、鳞状细胞癌、肺癌和卵巢肿瘤。痘苗病毒的LIVP株(包括其减毒形式)表现出比痘苗病毒的WR株低的毒性，并导致经治疗的带瘤动物模型的存活增加和延长(参见例如美国公开号2011/0293527)。
痘苗病毒是细胞质病毒，因此其不在其生命周期内将其基因组插入宿主基因组。痘苗病毒具有大约180,000个碱基对长度的线性双链DNA基因组，其由单个连续多核苷酸链组成(Baroudy等(1982)Cell 28：315-324)。该结构是由于存在10,000个碱基对的反向末端重复序列(ITR)。ITR参与基因组复制。据信基因组复制涉及自身引导，导致形成高分子量连环体(从感染细胞中分离)，其随后裂解并修复以形成病毒基因组(参见例如Traktman，P.，第27章，Poxvirus DNA Replication，DNA Replication in Eukaryotic Cells的第775-798页，冷泉港实验室出版社(1996))。基因组含有大约250个基因。通常，非节段、非传染性基因组的排列应使位于中央的基因对于病毒复制至关重要(因此是保守的)，而位于靠近两个末端的基因实现更多的外围功能，例如宿主范围和毒力。痘苗病毒通过利用按一般原则排列为不重叠的集合的开放读框(ORF)来实践差别基因表达。
痘苗病毒具有用于癌症基因治疗和接种的多种特征，包括广泛宿主和细胞类型范围以及低毒性。例如，尽管大多数溶瘤病毒是天然病原体，痘苗病毒作为天花疫苗的广泛应用具有独特的历史，已在人类中建立了安全性记录。小于0.1％的病例发生与痘苗病毒施用相关的毒性，并且可通过免疫球蛋白施用有效解决。此外，痘苗病毒具备对外源基因的大的携带能力(多达25kb的外源性DNA片段(痘苗病毒基因组大小的大约12％)可插入痘苗病毒基因组)以及不同株之间的高序列同源性用于在其它毒株中设计和生成修饰病毒。通过遗传工程化生产修饰的痘苗毒株的技术已很成熟(Moss(1993)Curr.Opin.Genet.Dev.3：86-90；Broder和Earl(1999)Mol.Biotechnol.13：223-245；Timiryasova等(2001)Biotechniques 31：534-540)。痘苗病毒株已显示出特异性定殖实体瘤而不感染其它器官(参见例如Zhang等(2007)Cancer Res.67：10038-10046；Yu等(2004)Nat.Biotech.22：313-320；Heo等(2011)Mol.Ther.19：1170-1179；Liu等(2008)Mol.Ther.16：1637-1642；Park等(2008)Lancet Oncol.9：533-542)。
柯萨奇病毒
柯萨奇病毒(CV)属于肠病毒(Enterovirus)属和细小RNA病毒科，具有不整合至宿主细胞基因组的正义单链RNA基因组。根据CV在小鼠中的作用，可分为A组和B组，可在人类中引起轻度上呼吸道感染(Bradley等(2014)Oncolytic Virotherapy 3：47-55)。通常研究的用于溶瘤病毒疗法的柯萨奇病毒包括减毒柯萨奇病毒B3(CV-B3)、CV-B4、CV-A9和CV-A21(Yla-Pelto等(2016)Viruses 8，57)。CV-A21通过ICAM-1(或CD54)和DAF(或CD55)受体感染细胞，它们在肿瘤细胞(包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、胰腺癌和肺癌以及多发性骨髓瘤和恶性胶质瘤)中以非常高的水平表达。CV-A21显示出有希望的体外针对恶性骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、头颈癌和乳腺癌细胞系的临床前抗癌活性；以及在体内对带有人黑色素瘤异种移植物的小鼠的临床前抗癌活性；以及针对小鼠中原发性乳腺癌肿瘤及其转移的临床前抗癌活性(Yla-Pelto等(2016)；Bradley等(2014))。CV-A21的衍生物CV-A21-DAFv，也称为CAVATAKTM，是通过CV-A21在表达DAF的ICAM-1阴性横纹肌肉瘤(RD)细胞上连续传代而从野生型Kuykendall株产生的，并且与亲本株相比，发现具备增强的溶瘤性质。CAVATAKTM仅与DAF受体结合，这可有助于其对癌细胞的趋性增强(Yla-Pelto等(2016))。
还研究了CV-A21与盐酸多柔比星的组合，与单独针对人类乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌细胞系的治疗以及人乳腺癌异种移植小鼠模型相比，表现出增强的溶瘤效率(Yla-Pelto等(2016))。由于人群中相当一部分已发展出针对CV的中和抗体，CV-A21治疗已与免疫抑制剂(例如环磷酰胺)组合使用(Bradley等(2014))，并且是通过媒介细胞递送的良好候选物。
临床试验研究了CAVATAKTM在IIIc或IV期恶性黑色素瘤患者中的使用(NCT01636882；NCT00438009；NCT01227551)，以及CAVATAKTM单独或与低剂量丝裂霉素C组合在非肌肉浸润性膀胱癌患者中的使用(NCT02316171)。临床试验还研究了静脉内施用CV-A21在治疗实体瘤(包括黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌)中的作用(NCT00636558)。正在进行的临床试验包括研究CAVATAKTM单独或与派姆单抗组合用于治疗非小细胞肺癌(NCT02824965、NCT02043665)和膀胱癌(NCT02043665)患者；CAVATAKTM与伊匹单抗组合用于葡萄膜黑色素瘤和肝转移患者(NCT03408587)和晚期黑色素瘤患者(NCT02307149)；以及CAVATAKTM与派姆单抗组合用于晚期黑色素瘤患者(NCT02565992)。
塞内卡谷病毒
塞内卡谷病毒(SVV)是细小RNA病毒科塞内卡病毒(Senecavirus)属成员，具有正义单链RNA基因组并且对神经内分泌癌症(包括神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、Wilms肿瘤、胶质母细胞瘤和小细胞肺癌)具有选择性(Miles等(2017)J.Clin.Invest.127(8)：2957-2967；Qian等(2017)J.Virol.91(16)：e00823-17；Burke，MJ(2016))OncolyticVirotherapy 5：81-89)。研究已确定炭疽毒素受体1(ANTXR1)是SVV的受体，其与正常细胞相比经常在肿瘤细胞表面表达，但先前研究也表明在小儿胶质瘤模型中唾液酸可能是SVV受体的成分(Miles等(2017))。SVV分离株001(SVV-001)是强力溶瘤病毒，其可在静脉内施用后靶向并穿透实体瘤，并且由于其缺乏插入诱变以及对癌细胞的选择性趋性以及在人和动物中的非致病性而具有吸引力。另外，人类先前暴露少见，导致低的预先存在的免疫率(Burke，M.J.(2016)Oncolytic Virotherapy 5：81-89)。
SVV-001已显示出针对小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和尤文肉瘤细胞系的有希望的体外活性，以及在小儿GBM、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤的原位异种移植小鼠模型中的体内活性(Burke(2016))。NTX-010是
Figure BDA0002931076310000381
开发的溶瘤SVV-001，已被证明单独或与环磷酰胺组合用于治疗复发/难治性实体瘤的小儿患者是可行和可耐受的，但由于中和抗体的发展，其疗效有限(Burke等(2015)Pediatr.Blood Cancer 62(5)：743-750)。临床试验包括对患有具有神经内分泌特征的实体瘤的患者(NCT00314925)使用SV-001；对复发或难治性神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、Wilms肿瘤、视网膜母细胞瘤、腺皮质癌或类癌肿瘤患者使用NTX-010/SVV-001与环磷酰胺组合(NCT01048892)；以及对化疗后的小细胞肺癌患者使用NTX-010/SVV-001(NCT01017601)。
C.使细胞媒介和病毒与对象匹配的测定
为促进病毒疗法，根据其在体内表现出某些特性(例如促进病毒扩增从而增加肿瘤/癌症的感染以及随后的溶瘤潜能)；并克服先天(例如NK细胞介导的)和适应性(例如T细胞介导的)免疫屏障和/或混合的先天/适应性免疫屏障(例如γδT细胞介导的)的能力来选择用作病毒递送媒介的细胞。T细胞可通过其αβ和γδT细胞受体(TCR)的表面表达分为两个主要群。Gamma delta(γδ)T细胞是“非常规”T细胞的原型并且代表相对小的T细胞子集(有关概述请参见Wu等，Int.J.Biol.Sci.，10(2)：119-135(2014)；Moser和Eberl，Immunol.Reviews，215(1)：89-102(2007)，其内容以引用的形式并入本文。它们通过表达由γ和δ链组成的异二聚T细胞受体(TCR)定义。这使它们与更普遍的表达αβTCR的CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞区分开。与MHC限制性αβT细胞不同，多数γδT细胞以MHC非依赖方式被活化。γδT细胞可识别大小、组成和分子结构不同的多种结构上不同的配体，包括但不限于非肽抗原、MHC和非MHC细胞表面分子、可溶性蛋白、硫脂类等。γδT细胞可识别MHC分子，例如第1组(CD1a、b、c)和第2组(CD1d)CD1分子(适应性免疫)。然而，在Vγ9Vδ2T细胞(一种γδT细胞群)上表达的NKG2D(与NK细胞介导的免疫性相关)在γδT细胞的配体识别中也发挥作用(先天免疫)。NKG2D配体在大多数正常组织中不表达，但在许多肿瘤细胞类型中被上调，这是Vγ9Vδ2T细胞识别肿瘤细胞所需的。一些可溶性蛋白(例如细菌蛋白，包括不相关的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和毒素李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO))也参与γδT细胞的识别。γδT细胞还可识别热激蛋白(HSP)，其不需要抗原加工并且可在不存在任何抗原呈递细胞(APC)的情况下发生。非肽抗原(例如在真菌、细菌或原生动物感染期间出现的那些)可能是T细胞识别的重要靶。嗜乳脂蛋白(BTN3A1)已被鉴定为Vγ9Vδ2T细胞的磷酸化抗原呈递分子(APM)，其属于具有免疫调节功能的免疫球蛋白样分子家族。它在异戊二烯基焦磷酸的Vγ9Vδ2TCR识别中发挥重要作用并可作为细胞内磷酸化抗原水平的传感器。
尽管自体细胞可用作媒介，它们的可用性可能受限并且从对象获得细胞有时可能繁琐和/或昂贵。某些细胞媒介如间充质干细胞(MSC)即使在同种异体环境下也显示出促进病毒扩增并克服先天/适应性免疫屏障，部分原因是它们具有免疫抑制性质。例如，本文显示脂肪衍生干细胞(ADSC)可通过其促进强力病毒扩增并使肿瘤细胞对病毒感染敏化的组合性质甚至根除抗性肿瘤细胞。然而，使用“现成的”同种异体细胞系(包括同种异体间充质干细胞如ADSC)作为递送媒介的能力可能会因对象特异性差异而受限，该差异有时导致“不匹配”(病毒扩增不足；不足以逃避对象的免疫系统和/或不充分的免疫抑制，包括不充分的短暂或局部免疫抑制)，部分是由于抗细胞媒介细胞毒性IFNγ介导的应答。这些先天和/或适应性免疫应答可例如通过消除细胞媒介或诱导抗病毒状态而损害治疗功效。其它研究也显示，MHC错配的MSC有时不是免疫豁免的(Berglund等(2017)Stem Cell Research&Therapy，8：288)。因此，需要筛选与特定对象匹配的细胞媒介用于病毒疗法并允许使用“现成的”基于同种异体细胞的递送平台的测试。本文提供了鉴定用于对对象施用病毒疗法的对象特异性的特定“匹配”细胞媒介的测定。本文还提供了以一种或多种方式敏化和/或工程化以改善细胞递送的修饰的细胞媒介(参见例如下文D节)。可使用本文提供的测定来测试本文提供的任何细胞媒介包括修饰的细胞媒介(敏化和/或工程化的)与待通过基于细胞媒介递送施用病毒疗法的对象的匹配相容性。
概述
本文提供了测定(“匹配”测定)，其一种或组合可用于鉴定与对象“匹配”的细胞媒介，以将溶瘤病毒递送至对象。本文提供的测定测量对象对细胞媒介介导的病毒递送的特异性反应，从而鉴定细胞媒介是否适合于给对象特异性施用病毒，即是否与对象“匹配”。下文概述并随后在本文中更详细地阐明的测定A-F中的任一种或它们的任何组合可用于鉴定与感兴趣的对象匹配的细胞媒介。测定A-F的一种或多种可用于以其作为对象的匹配物的适合性来筛选感兴趣的单个细胞媒介，或可根据其作为对象的匹配物的期望性来筛选一种以上或多种/一组细胞媒介并对其进行排名，通常#1是最高排名，其后的数字(2、3、4等)表示较低的排名，但是可使用任何合适的排名系统来标识合适的匹配。如果仅执行测定A-F之一，排名可基于单个测定，或者可为基于一种以上测定中细胞媒介的性能的组合排名。下面提供了每种匹配测定A-F的概述：
A.单体型分析
(a)单体型概述
单体型是一起遗传的一套DNA变异或多态性，其可指位于同一染色体上的一组等位基因或一套单核苷酸多态性(SNP)。
主要组织相容性复合物(MHC)
6号染色体上的主要组织相容性复合物(MHC)包含人类白细胞抗原(HLA)基因，其编码一套对于用于适应性免疫系统的抗原呈递重要的细胞表面蛋白。MHC分子结合衍生自病原体的抗原并将其展示在细胞表面上以被适当的T细胞识别，从而介导免疫细胞之间以及与其它细胞之间的相互作用。MHC决定供体对器官移植的相容性，以及通过交叉反应免疫对自身免疫性疾病的易感性。
MHC基因家族分为三个亚组：I类、II类和III类。MHC I类分子与粗糙内质网中的肽结合，这些肽衍生自细胞内蛋白。它们存在于所有有核细胞中并与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面的CD8受体相互作用，介导细胞免疫。MHC I类包含三种α链基因：HLA-A、HLA-B和HLA-C。结合被吞噬蛋白的肽的MHC II类分子由抗原呈递细胞(APC)(包括巨噬细胞和树突细胞(DC))表达，并与辅助T细胞表面的CD4受体相互作用，介导适应性免疫。MHC II类包含三对α链和β链基因：HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，其中HLA-DR簇含有额外的可与DRα链配对的β链，从而产生四种类型的MHC II类分子。存在于单个染色体上的HLA等位基因的组合称为HLA单体型。HLA基因座是人类基因组中最多态的基因之一，其中I类的等位基因超过12,000个、II类的等位基因超过4,000个。因此，两个个体不太可能拥有相同的HLA单体型(Meyer等(2018)Immunogenetics 70：5-27)。
MHC I类
MHC I类包含HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。各个基因座用大写字母表示，例如HLA-A，并且等位基因用星号后面的数字表示，例如HLA-A*0201。由于MHC等位基因是共显性表达的且每个人携带3种MHC I类基因中每种的2个等位基因，因此存在六种可能的不同类型的MHCI类(Janeway CA Jr.等，“Immunobiology:The Immune System in Health and Disease”，第5版，New York:Garland Science，2001年。The major histocompatibility complexand its functions，可从ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/获得)。
MHC I类分子可在大多数细胞类型中表达并在被蛋白酶体降解并转运到内质网后结合衍生自细胞内蛋白质的肽，再将肽运输至细胞表面并将它们呈递给细胞毒性CD8 T细胞。这些肽是短的并且通常长8-11个氨基酸(Kaczmarek等(2017)Arch.Immunol.Ther.Exp.65：201-214；Reeves和James(2016)Immunology 150：16-24)。
MHC II类
MHC II类包含HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR同种型，每个含有高度多态的α和β链，DRα链除外。每个个体从其父母继承一对HLA-DP基因、一对HLA-DQ基因、一个HLA-DRA基因和一个或多个HLA-DRB基因，如此杂合子在其细胞上可具有8种不同的MHC II类分子。由不同染色体编码的α和β链的不同组合可产生更大数量的不同MHC II类分子(Janeway CA Jr.等，“Immunobiology:The Immune System in Health and Disease”，第5版，New York:Garland Science，2001年。The major histocompatibility complex and itsfunctions，可从ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/获得)。
MHC II类分子由抗原呈递细胞(包括DC细胞、B细胞和单核细胞/巨噬细胞)表达，并在其被溶酶体降解后结合至衍生自被吞噬的病原体的蛋白的肽，然后将其运输至细胞表面并将其呈递至辅助T细胞。这些肽比MHC I类分子呈递的肽更长，通常长为14-20个氨基酸残基(Kaczmarek等(2017)Arch.Immunol.Ther.Exp.65：201-214)。
MHC IB类(包括MIC、HLA-E)
除经典MHC I类和II类基因外，存在编码几乎不显示多态性的MHC I类-类型分子的基因，称为MHC IB类基因，其包括MIC基因家族成员HLA-G和HLA-E。五种MIC基因中仅两种(MICA和MICB)表达，特别是在上皮细胞和成纤维细胞中，并在先天免疫中发挥作用。由NK细胞和T细胞(例如γδT细胞)表达的MIC受体由NKG2D链(NK细胞受体NKG2家族的活化成员)和称为DAP10的信号传导蛋白组成。HLA-E复合物具有衍生自其它HLA I类分子的前导肽的特定肽子集，并且肽：HLA-E复合物结合NK细胞上的抑制性NKG2A受体，从而抑制NK细胞细胞毒活性(Janeway CA Jr.等，“Immunobiology:The Immune System in Health andDisease”，第5版，New York:Garland Science，2001年。The major histocompatibilitycomplex and its functions，可从ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/获得)。
CD1家族
CD1家族(其主要在抗原呈递细胞和胸腺细胞上表达并向CD4+T细胞、CD8+T细胞、双阴性T细胞、γδT细胞、iNKT细胞和NKT细胞呈递抗原)是位于MHC区域之外的MHC I类样基因家族。与MHC I类和II类分子不同，CD1分子能够结合并呈递脂质抗原。存在五种CD1蛋白，CD1a-e，其中CD1a-d在细胞表面展示脂质抗原。CD1a-c主要由抗原呈递细胞表达，将抗原呈递至介导适应性免疫的无性系多样性T细胞，而CD1d分子则由几种细胞类型(包括DC细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、角质形成细胞和胃肠道上皮细胞)表达并向NKT细胞呈递抗原(Kaczmarek等(2017)Arch.Immunol.Ther.Exp.65：201-214)。
KIR和KIR配体
NK细胞表达识别并结合MHC I类分子(KIR配体)的杀伤性Ig样受体(KIR)。在白细胞受体复合物的19号染色体上发现了17种KIR基因，并且大多数这些基因具有多个等位基因。KIR基因的命名基于胞外免疫球蛋白样结构域(2D或3D)、细胞质尾的长度(L＝长，S＝短)以及基因是否为假基因(P)。尽管大多数KIR是抑制性的，NK细胞也具备活化KIR。抑制性KIR与其配体的结合使NK细胞失活。在受感染的或赘生性细胞中，经典I类基因座的表达可能降低，降低了KIR分子的配体的可用性并活化NK介导的细胞裂解(Benson Jr.和Caligiuri(2014)Cancer Immunol Res.2(2)：99)-104)。
KIR分子高度多态性，并且KIR基因簇导致两种不同的单体型，称为A组和B组单体型。A组单体型由固定数目的基因组成并且仅具有抑制性KIR，而B组单体型具有可变的基因集并包括抑制性和活化KIR(Benson Jr.和Caligiuri(2014)Cancer Immunol Res.2(2)：99-104)。
尽管KIR分子及其配体(MHC I类分子)是独立遗传的，但特定KIR/HLA组合的遗传与病毒感染、自身免疫性和癌症的易感性或抗性相关。例如，抑制性KIR/HLA相互作用阻止了癌细胞的裂解，但KIR-配体错配导致接受同种异体供体NK细胞的患者的肿瘤细胞裂解增加(Benson Jr.和Caligiuri(2014)Cancer Immunol Res.2(2)：99-104)。
(b)单体型匹配分析
单体型匹配分析可如下进行：
i.从对象获取全血或DNA的替代来源(例如软组织样品、精液、唾液、皮肤细胞、发根等)。
ii.从全血或其它来源提取gDNA。
iii.在以下一个或多点基因座处分析对象特异性遗传多态性(例如使用下一代测序)：
a.经典MHC I/II单体型
b.KIR单体型和配体
c.非经典MHC单体型(例如HLA-E、CD1a/b/c/d、MIC-A/B)
iv.将如上文iii中所鉴定的对象的遗传多态性谱与细胞媒介或一种以上细胞媒介或一组细胞媒介的遗传多态性谱进行比较。与对象具有至少10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的匹配基因座的细胞媒介可鉴定为用于将病毒递送至对象的匹配物。在一些实例中，iii中指示的一个或多个基因座处细胞媒介的遗传多态性谱与对象的遗传多态性谱100％匹配。在其它实例中，在iii中指示的一个或多个基因座处细胞媒介的遗传多态性谱与对象的遗传多态性谱至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％匹配，或与对象的遗传多态性谱50％(或约50％)-99％(或约99％)匹配，被鉴定为对象的匹配细胞媒介。
v.当对一个以上细胞媒介进行单体型匹配分析时，具有最大匹配基因座数量(最好100％匹配)的细胞媒介被鉴定为最相容。
vi.在一些实施方案中，计算机模拟软件算法/程序可用于鉴定预测相容性的基因座并指导最相容匹配的鉴定。
B.募集/敏化抗性肿瘤细胞和/或促进病毒扩增的能力
在这个匹配测定中，进行迁移测定以测量细胞媒介募集/敏化肿瘤/癌症细胞用于病毒感染和/或促进病毒扩增的能力。可在涂覆有标准transwell、生物凝胶(水凝胶、基质胶)或细胞外基质(胶原/纤连蛋白)的表面系统中进行迁移测定，其中测定的各组分(例如实体瘤活组织检查和细胞媒介)根据系统类型被沉积在分开的腔室中(例如由半透膜隔开)或处于相邻位置。所述方法如下进行：
i.从对象获得肿瘤活组织检查，其可包括手术切片、细针吸出物、针芯活组织检查或源自组织处理(用胶原酶、分散酶、DNase等酶消化)的原发性肿瘤细胞/肿瘤类器官。在适当的涂覆有transwell/生物凝胶/细胞外基质的表面系统中培养固体活组织检查/类器官/肿瘤细胞。
ii.使用肿瘤活组织检查和一种或多种细胞媒介或一组细胞媒介进行迁移测定，每种类型的细胞媒介(如果筛选出一种以上)都用独特的可检测标志物(例如荧光标志物)标记。在实体肿瘤活组织检查、原发肿瘤细胞或肿瘤类器官中积累/向其迁移/在其周围聚集的标记细胞(对于每种类型的细胞媒介)的百分比是细胞媒介至肿瘤迁移评分(CTMS)，100％为最佳，0％为最差，至少为或约为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的CTMS评分被认为匹配。在一些实例中，细胞媒介的CTMS评分为至少20％被认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。在其它实例中，获得针对细胞媒介的CTMS评分为约20％至约60％被认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。
iii.标记肿瘤活组织检查或活组织检查来源的原发性肿瘤细胞/生物体(例如使用荧光标记)并使用标记的肿瘤活组织检查和以上步骤2的亚组(或如果未进行预筛选则整个组)的每个细胞媒介进行迁移测定。标记的肿瘤细胞或肿瘤相关基质细胞从实体瘤迁移出来并向细胞媒介迁移的百分比是肿瘤至细胞媒介迁移评分(TCMS)，100％为最佳，0％为最差，TCMS评分至少为或约为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的被认为匹配。在一些实例中，细胞媒介的TCMS评分为至少20％被认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。在其它实例中，获得细胞媒介的TCMS评分为约20％至约60％被认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。
iv.除在不同病毒存在的情况下进行迁移测定以测试某些病毒是否干扰肿瘤或载体细胞的迁移外，按照上述ii.和iii.制备样品。可将病毒直接添加至共培养物中或在与活组织检查标本共培养前预先加载至载体细胞。如上所述计算病毒校正CTMS(VCTMS)和TCMS(VTCMS)，反映病毒干扰细胞迁移和生存力的能力。
v.可如下所示为每个对象肿瘤活组织检查/细胞媒介/病毒组合计算累积平均迁移/募集评分(MRS)：
MRS(活组织检查、细胞媒介、病毒组合)＝[VCTMS(活组织检查、细胞媒介、病毒)+VTCMS(活组织检查、细胞媒介、病毒)]/2；或
MRS(活组织检查、细胞媒介组合)＝[CTMS(活组织检查、细胞媒介)+TCMS(活组织检查，细胞媒介)]/2。
细胞媒介的MRS评分至少为或约为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％可认为细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间匹配。在一些实例中，细胞媒介的MRS评分为至少20％认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。在其它实例中，获得细胞媒介的MRS评分为约20％至约60％被认为是细胞媒介与对象(或所治疗的肿瘤/癌症类型)之间的匹配。这个匹配测定鉴定了具有成功归巢肿瘤块或吸引/募集迁移的肿瘤细胞的潜能的细胞媒介/病毒相关细胞媒介，从而促进了病毒传播和感染。MRS评分可用于根据其不干扰特定细胞媒介正常迁移的能力对病毒进行排名，或替代地根据其对病毒介导的细胞迁移抑制的抗性对细胞媒介进行排名，从而可鉴定最佳的对象-病毒和载体媒介的特定组合。
可测量ii-v中所示的一种或多种评分，以鉴定良好匹配。
C.对象来源的免疫细胞促进病毒扩增的能力
此匹配测定在存在对象来源的免疫细胞的情况下测量细胞媒介介导的病毒扩增。测定如下进行：
i.获取对象来源的免疫细胞(例如全血、PBMC)
ii.将PMBC与细胞媒介和病毒共培养。添加顺序可为：
同时，或
首先温育细胞媒介+病毒(范围为15分钟或约15分钟至48小时或约48小时；在一些实施方案中，范围为或1小时约1小时至5小时或约5小时；在特定实施方案中，温育时间为2小时或约2小时)，然后添加至PBMC
将所得共培养物温育约24小时或约24小时至1周或约1周(在一些实施方案中，范围为15分钟或约15分钟至70小时或约70小时；在一些实施方案中，范围为20小时或约20小时至60小时或约60小时；在特定实施方案中，温育时间为48小时或约48小时)
iii.测量病毒扩增(例如通过荧光成像或病毒噬斑测定(VPA))，与除不存在PBMC外的等价条件的对照相比。
iv.如果在存在PBMC时病毒扩增低于不存在PBMC时获得的值的10％，认为细胞媒介与对象不相容或不匹配。如果在存在PBMC时病毒扩增为在不存在PBMC时获得的值的至少或约10％-30％，则认为足以匹配；如果在存在PBMC时病毒扩增为在不存在PBMC时获得的值的至少或约30％-80％，则认为中等匹配，如果在存在PBMC时病毒扩增为在不存在PBMC时获得的值的至少或约80％或更高，则认为良好匹配。
v.可使用以下公式为每个对象、细胞媒介、病毒组合计算免疫学病毒扩增评分(IVAS)：
IVAS＝(来自细胞媒介+PBMC共培养物的病毒的pfu(或荧光)/仅来自细胞媒介的病毒的pfu)。0.1或更大的比例可认为相容，具有如以上iv中所述的匹配程度(在不存在PBMC时获得的值为10％或更高，最高的比例为1.0)。
vi.可任选根据血清作用校正IVAS评分(对象/患者血清抗性筛查)。IVAS评分仅考虑细胞免疫性；如果对象的血清显著抑制病毒扩增，那么即使IVAS评分是可接受的(例如0.1或更高)，也可能不是良好匹配。可如下进行校正：
将对象的血清以共培养物体积的10％-50％的量添加至上述ii的共培养物中。
可使用以下公式计算患者(对象)血清抗性评分：
PSRS＝(无血清的pfu-有血清的pfu)/无血清的pfu(×100，将比例转换为百分比值)。血清抗性评分越高，血清对病毒扩增的干扰越大。
IVAS(PSRS校正的)＝IVAS×(1-PSRS)(×100，将比例转换为百分比值)。
D.测量与对象的免疫学相容性
在此匹配测定中，i.和ii.如上述C部分进行
iii.在共培养物中，测量以下一种或多种标志物(例如使用荧光标记的抗标志物抗体通过流式细胞术进行；具体标志物在详细概述中列出)
添加针对感兴趣的标志物的荧光标记抗体，在存在细胞媒介的情况下测量上调(如果有)(对照：仅PBMC；样品：PBMC+细胞媒介)
a.IFNγ
b.与T/NK/NKT细胞介导的细胞毒性相关的标志物
c.与活化剂/效应子功能标志物的T/NK/NKT细胞表达相关的标志物
iv.测量(通过流式细胞术)样品和对照的荧光。
v.计算免疫学相容性评分(ICS)：(样品荧光/对照荧光)的比例。如果测量了一种以上标志物，可将平均ICS评分计算为所测量的ICS评分的平均值，或可例如基于其已建立的与减少的病毒扩增的关联，对一些评分进行加权。
vi.比例为1-1.05或更小意味着细胞媒介对对象免疫应答没有影响，即良好匹配
比例为1.05-1.5表示中等程度相容的细胞媒介
比例为1.5-2表示足够相容的细胞媒介
比例大于2表示免疫学不相容的匹配
E.测量细胞媒介介导的抗病毒免疫性抑制
如上述D部分执行i.-iv.，除了对照：单独的PBMC和PBMC+细胞媒介，还包括以下样品：PBMC+病毒；PBMC+细胞媒介+病毒
v.计算一种或多种标志物的免疫学抑制评分(ISS)：
[(PBMC+病毒共培养物中的标志物水平+PBMC+细胞媒介共培养物中的标志物水平)-PBMC+病毒+细胞媒介共培养物中的标志物水平]/(PBMC+病毒共培养物中的标志物水平+PBMC+细胞媒介共培养物中的标志物水平)(×100，用于％免疫抑制)的比例。
vi.ISS％评分高于0％被认为是有利的，即表示细胞媒介抑制抗病毒免疫力并允许病毒感染肿瘤细胞的能力。如果测量了一个以上的标志物，则可将平均ISS评分计算为所测量ISS评分的平均值。
F.通过分析上清液测量细胞媒介的免疫调节作用
上述D和E节中描述的测量也可通过例如ELISA或Luminex测定用共培养物上清液进行。尽管无法鉴定特定的应答细胞群(因为未直接分析共培养物中的细胞/病毒)，上清液中测得的ISS和ICS评分也可提供有关相容性的信息；这些评分如上D和E节所述确定。
在本文提供的方法的一些实施方案中，可任选地在不存在对象特异性细胞的情况下，对一种或多种细胞媒介进行预筛选以确定细胞媒介促进病毒扩增的能力。对于选择的给定病毒疗法(例如痘苗病毒)，可筛选细胞媒介或一组可得的细胞媒介(自体/同种异体/原始/敏化/工程化)的促进病毒扩增的能力。确定在等价感染复数(0.001-1范围内的MOI)和共培养条件下，针对感染细胞数量归一化的每个细胞媒介类型的病毒扩增速率(pfu/细胞)(例如使用VPA-病毒噬斑测定)。每种使用的病毒类型的最佳读出时间点(例如1天或约1天至5天或约5天)。计算每个类型细胞媒介的pfu/细胞并用作细胞媒介的病毒扩增评分(VAS)。
在预筛选中，可根据A-F中总结并在此进一步描述的任何方法通过与对象匹配来选择产生至少为10pfu/细胞的细胞媒介用于进一步筛选(10-100是好，100-1000分是非常好，大于1000是优异)。可筛选亚组(或选择的一或多种细胞媒介)用于与对象最佳匹配。
在本文提供的方法中，可使用如上总结的测定A-F的一项或多项来鉴定细胞媒介与对象之间的匹配。在一些实施方案中，根据匹配测定A-F的一项或多项分析多于一种的细胞媒介或多个或一组细胞媒介。然后根据它们与对象的相容性对细胞媒介进行排名，范围从“最佳匹配”(例如排名1)至最差匹配(例如更大数字的排名)。对于每个细胞媒介，将根据进行的测定次数来计算累积排名：
累积排名＝排名(VAS)+排名(IVAS)+排名(ICS)+排名(ISS)+排名(MRS)/5(如果获得了所有这些评分；可获得少于5个的评分)。然后，将细胞媒介按照其作为匹配的适合性的顺序排名。对细胞媒介排名也可考虑单体型分析。
详细的匹配测定方法
a.在测定中进行测量的一般方法
以下是用于在本文提供的匹配测定中测量某些参数的一般方法：
病毒噬斑测定(VPA)
病毒噬斑测定(VPA)用于测量样品中的病毒滴度或病毒浓度。例如，VPA可用于量化在不同条件下以及患者来源的免疫细胞和基于细胞的递送媒介的不同组合下的病毒颗粒扩增。
含病毒样品存储在-80℃并进行三重冷冻(-80℃)/解冻(+37℃)循环，然后在冰水中超声处理3次，每次1分钟，间隔1分钟。将经超声处理的样品在痘苗病毒感染培养基(补充有2％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM)中连续稀释。在24孔板中一式两份进行噬斑测定。简而言之，每孔用于1mL D10培养基中的200,000个CV-1猴肾细胞铺板，过夜。吸出上清液并将含病毒样品的10倍系列稀释液以200μL/孔施加于CV-1单层。将板在37℃(培养箱)中温育1小时，每20分钟手动摇动。将1mL CMC培养基轻轻铺在细胞顶部并将板温育48小时。通过高压灭菌15g羧甲基纤维素钠盐(Sigma-Aldrich，C4888)制备CMC覆盖培养基并重悬于补充有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和5％FBS的1L DMEM中在室温搅拌过夜，在4℃短期储存。通过用结晶紫溶液(1.3％结晶紫(Sigma-Aldrich，C6158)、5％乙醇(纯乙醇，分子生物学级，VWR，71006-012)、30％甲醛(37％v/v甲醛，Fisher，目录号F79-9)和双蒸水)在室温敲打3h-5h将细胞固定，然后在自来水中清洗板并干燥过夜，之后计数噬斑。病毒排名以每个样品的噬斑形成单位(PFU)计算。
流式细胞术
流式细胞术可用于细胞计数、细胞分选和生物标志物/细胞表面抗原检测。例如，可使用门控参数进行流式细胞术以鉴定特定免疫细胞群，包括T细胞(例如但不限于CD3、CD4、CD8)、γδT细胞(例如CD3+NKp46+和CD3+NKp46-细胞群和其它群)、NK细胞(例如但不限于NKp46(CD335)、CD16、CD56)和NKT细胞(例如但不限于CD3、CD16、CD56，NKp46，aGalCer-CD1d四聚体)。例如，通过使用流式细胞术分析包括但不限于以下的不同活化/效应子功能参数来评价免疫应答：CD69、CD25、CD71、CD27(CD70L)、CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)、CD44、CD45RA、CD45RO、CD278(ICOS)、CD127(IL-7RA)、CD183(CXCR3)、CD197(CCR7)、CD39、CD73、CD314(NKG2D)、PD-1、CTLA-4、IFNα/β、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、GM-CSF、IL-17、IL-6、CD107a、CD107b、TGFβ、穿孔素、粒酶B、IL-1a/IL-1b、G-CSF、RANTES、EXOTAXIN、MIP-1b、MCP-1、EGF、HGF、VEGF、IL-1RA、IL-7、IP-10、IL-2R、MIG和IL-8等。例如，流式细胞术还用于检测遗传工程化的ADSC的eGFP表达，并测量被L14 VV(TK插入的Turbo-FP635工程化的痘苗病毒LIVP株)感染的细胞的百分比。
如果待检测的生物标志物/抗原在细胞表面(例如CD标志物)，使用表面染色。然而，如果待检测细胞内蛋白质例如细胞因子或转录因子，在抗体染色前需要额外的固定和透化步骤。
表面染色
例如，对于共培养物的流式细胞术分析，PBMC和干细胞的共培养物通过移液回收，转移至V型底平板，并用FACS缓冲液(含1％FBS的1×PBS)清洗。然后在补充有适当抗体混合物的FACS缓冲液中在4℃对细胞进行表面染色30分钟。例如，为检测T细胞或NKT细胞表面的CD3，使用抗人CD3-PerCP/Cy5.5抗体(BioLegend，目录号300328，1:50)；为检测NK细胞表面的CD335/NKp46，例如使用抗人CD335/NKp46-PE(BioLegend，目录号331908，1：50)；为检测T细胞、NK细胞和NKT细胞表面的CD69，例如使用抗人CD69-APC(BioLegend，目录号310910，1:50)。FACS缓冲液还可包含活力探针(ThermoFisher Scientific，LIVE/DEAD FixableViolet Dead Cell Stain Kit，405nm激发，目录号L34964，1:1000)。染色后，将细胞用FACS缓冲液清洗两次，于RT在1×PBS中的2％PFA中固定15分钟，再用FACS缓冲液清洗以去除PFA，然后在BD FACSAria II流式细胞仪上分析(BD Biosciences，San Jose，CA)。
例如，为通过检测免疫细胞表面的CD107a评估细胞毒性功能，将抗人CD107a-AlexaFluor488(BioLegend，目录号328610)在回收和表面染色之前5小时以1:20(10μl/孔)直接加入共培养物，然后一小时后以1:1000添加莫能星(Monensin)(BioLegend，目录号420701-BL，1000X)，在37℃再保温4小时。
细胞内染色
例如，为评价活化的NK、NKT和T细胞(包括γδT细胞)中的IFNγ产生，需要细胞内染色。刺激后1小时或回收和表面染色前4小时以1:1000添加布雷菲德菌素A溶液(BioLegend，目录号420601-BL，1000×)。如果待评估细胞的IFNγ产生和CD107a表面暴露，则将莫能星(BioLegend，目录号420701-BL，1000×)和布雷菲德菌素A一起添加。经过标准表面和活力染色后，使用eBioscience Intracellular Staining Buffer Set(ThermoFisher，目录号00-5523)处理细胞。简而言之，在用或不用抗CD107a-AlexaFluor488表面染色后，用1份固定/透化浓缩液(ThermoFisher，目录号00-5123)和3份固定/透化稀释液(ThermoFisher，目录号00-5223)将细胞固定30分钟，用200μl/孔在双蒸馏水中1:10稀释的透化缓冲液10×(ThermoFisher，目录号00-8333)清洗两次，并用抗人IFNγ-APC抗体(BioLegend，目录号502512，1:50)在室温在透化缓冲液中染色1小时。然后将细胞在透化缓冲液中清洗两次，在室温于1×PBS中的2％PFA中固定15分钟，再用FACS缓冲液清洗以去除PFA，并在BD FACSAria II流式细胞仪上分析(BD Biosciences，San Jose，CA)。
ELISPOT
酶联免疫斑点法(ELISPOT)是基于其对稀有抗原特异性和产生细胞因子的免疫细胞的灵敏、准确的鉴定和定量以及其检测PBMC群中单个阳性细胞的能力，被广泛用于监测细胞免疫应答的免疫测定。与流式细胞术一样，ELISPOT可用于基于以下分析免疫活化和免疫抑制：鉴定特定免疫细胞群(例如T细胞，包括γδT细胞(例如但不限于CD3、CD4、CD8)；NK细胞，包括γδT细胞(例如但不限于NKp46(CD335)、CD16、CD56)和NKT细胞(例如但不限于CD3、CD16、CD56、NKp46、aGalCer-CD1d四聚体)的一组标志物以及一组活化/效应子功能标志物，包括但不限于：CD69、CD25、CD71、CD27(CD70L)、CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)、CD44、CD45RA、CD45RO、CD278(ICOS)、CD127(IL-7RA)、CD183(CXCR3)、CD197(CCR7)、CD39、CD73、CD314(NKG2D)、PD-1、CTLA-4、IFNα/β、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、GM-CSF、IL-17、IL-6、CD107a、CD107b、TGFβ、穿孔素、粒酶B、IL-1a/IL-1b、G-CSF、RANTES、EXOTAXIN、MIP-1b、MCP-1、EGF、HGF、VEGF、IL-1RA、IL-7、IP-10、IL-2R、MIG和IL-8等。
ELISPOT测定与夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)非常相似。在典型方案中，首先通过在35％乙醇中温育30s，然后用200μl/孔磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗3次以去除乙醇，在96孔板上制备PVDF膜。然后将板用对目标分析物具有特异性的捕获抗体(在PBS中稀释至大约2-15μg/ml，100μl/孔)包被，并在4℃温育过夜。然后将孔倒空并用200μl/孔PBS清洗3次以去除未结合的捕获抗体，并例如使用100μl/孔的2％干脱脂乳或200μl/孔的于PBS中的1％BSA封闭膜，并在室温温育2小时以防止与膜的非特异性结合。然后将板用200μl/孔PBS清洗3次并风干，然后用于下一步或与干燥剂在4℃保存直至2周。将细胞(例如PBMC)稀释并吸取至孔中，通常每孔2×104-5×105个PBMC，添加适当的培养基并将板于加湿的37℃CO2恒温箱中放置特定时间(通常为24-72小时，例如IFNγ、IL-2和TNFα放置24小时；IL-4、IL-5和IL-10放置48小时)。活化的细胞分泌的细胞因子(例如IFNγ)结合PVDF膜上的固定化抗体。将孔用200μl/孔PBS清洗3次，然后用200μl/孔PBS/0.1％Tween-20清洗3次，以洗去细胞和未结合的分析物，并添加用PBS/1％BSA稀释至大约0.25-2μg/孔的对目标分析物具有特异性的生物素化检测抗体(100μl/孔)并在室温温育1h-2h或4℃过夜。然后将板用200μl/孔的PBS 0.1％Tween-20清洗3-4次以去除任何未结合的生物素化的抗体，并且将与酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))缀合的链霉亲和素(100μl/孔，在PBS-Tween-BSA中稀释至1:500-1:2000)添加至各孔并将板在室温温育1h-2h。或者，可将检测抗体直接缀合至酶。洗去未结合的酶(3×200μl/孔PBS/0.1％Tween-20和3×200μl/孔PBS)并添加沉淀底物溶液(例如对于HRP的AEC或对于AP的BCIP/NBT)。形成有色沉淀物，其对于HRP为红色，对于AP为黑蓝色，并且各有色斑点通常代表单个分泌细胞因子的细胞。通过用蒸馏水轻轻清洗终止反应，将板/膜在室温干燥，并且可手动地(例如使用解剖或立体显微镜)或使用自动ELISPOT读取器对斑点进行计数。如果在同一测定中测量多种细胞因子，使用荧光标记的抗细胞因子抗体且改良的测定称为FluoroSpot测定。
b.选择对象来源的免疫细胞
1.PBMC-可使用例如Ficoll-Paque离心分离。
2.全血-全肝素化血液包括除PBMC外的血细胞类型，例如中性粒细胞。
3.RBC裂解的全血-去除大量红细胞，并可获得更高浓度的淋巴细胞和髓细胞。如Ficoll-Paque PBMC分离过程一样，可在裂解后任选地进行清洗步骤以去除对象血清/血浆。
4.补充有自体对象血浆/血清的PBMC/RBC裂解的全血-高速离心后可从肝素化人血中分离对象血浆，高速离心对象的非肝素化和凝结的血液后可分离血清。然后可将RBC裂解后的全血细胞或PBMC与作为补充添加的10％-50％自体对象血清或血浆温育。在某些测定条件下，根据需要，血清/血浆中的补体可任选地进一步被热失活或药理学失活。
5.特定免疫细胞群、亚群以及它们的组合
c.将细胞媒介与病毒匹配
该分析可在与对象来源的免疫细胞培养之前进行。通过分析一种或多种待分析的细胞媒介和病毒的共培养物，可进行细胞媒介/病毒相容性筛选；当评估一种以上的细胞媒介/病毒组合时，所述方法在测定等价条件下进行。
对于每种共培养物，通过本领域技术人员已知方法，使用经工程化表达可检测地标记的蛋白质(例如荧光标记的蛋白质)的细胞媒介/病毒来测量细胞媒介促进病毒扩增的能力。可使用本领域技术人员已知的方法，例如：
1.病毒噬斑测定(VPA)
2.qPCR
3.荧光成像(可检测标记或经工程化以表达荧光蛋白)
4.ELISA(例如测量病毒编码的β-半乳糖苷酶)
5.生物发光(例如病毒经工程化表达报告基因荧光素酶)
6.荧光显微术(用于测量荧光强度的成像软件)/荧光板读取器，用于监控病毒感染的时间过程(例如跟随绿色通道上的细胞媒介(GFP)，红色通道上的病毒(TurboFP635))。
使用MOI(0.01-10)和在等价测定条件下约24小时-1周的共培养时间，测量每种分析的细胞媒介的病毒扩增速率。针对感染的细胞媒介的数量对测得的速率进行归一化：Pfu/细胞媒介为1-10可被认为效能有限(作为给定病毒的细胞媒介)；Pfu/细胞媒介为10-100被认为效能良好；Pfu/细胞媒介为100-1000被认为效能非常好；Pfu/细胞媒介超过1000被认为效能极高。可考虑使用表现出pfu/细胞媒介为至少10的细胞媒介和病毒的组合用于在使用衍生自对象的细胞的匹配测定中进行测试。或者，在等价测定条件下测得的归一化的pfu/细胞媒介值可用作病毒扩增评分(VAS)，其有助于将细胞媒介+病毒组合作为疗法的匹配(或非匹配)进行排名。
d.将细胞媒介/病毒组合与对象匹配
1.对象单体型数据可基于更近或更远的匹配来预测患者与特定细胞媒介的相容性。HLA基因座匹配(HLA-A、HLA-DP)和KIR单体型匹配通常表明对象对多种同种异体细胞媒介的广泛允许性，但不是结论性的。然而，可通过将对象匹配/相容性数据积累至数据库中并基于测定验证的相关性使用开发算法来预测相容性，来提高数据的预测价值。单体型方法可如下进行：
i.分离患者血液或其它DNA来源
ii.使用本领域已知的方法提取gDNA
iii.使用下一代测序或本领域已知的等价方法分析患者特异性遗传多态性的相关基因座
-经典MHC I/II单体型
-KIR单体型和配体
-非经典MHC单体型(例如HLA-E；CD1a、CD1b、CD1c、CD1d；MICA/B)
iv.将每个患者的遗传多态性谱与可获得的细胞媒介的谱进行比较。
-鉴定患者和细胞媒介之间的MHC错配
-鉴定患者和细胞媒介之间的KIR和KIR配体错配
-鉴定患者和细胞媒介之间非经典MHC基因座处的错配
-比较所有可获得的细胞媒介，以基于最小错配数量鉴定何种细胞媒介与患者最相容；或者如果仅使用单个细胞媒介，则查明错配百分比，以查看是否存在至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高的匹配。
-可使用计算机模拟软件算法/程序基于迭代积累测定数据来预测最相容的匹配并显示特定基因座的错配是不利的并导致细胞媒介无法扩增病毒。计算机模拟相容性预测算法可用新的对象和细胞媒介相容性筛选数据来迭代更新，并且可进行计算机模拟调整以预测多种溶瘤病毒(例如除痘苗病毒外的溶瘤病毒)的细胞媒介相容性。
2.测量募集/敏化原本抗性肿瘤细胞的能力：细胞媒介+活肿瘤活组织检查+/-病毒
可同时共培养对象来源的免疫细胞、细胞媒介和病毒，或可首先温育细胞媒介+病毒(例如15min-48h)，然后添加至对象来源的免疫细胞中。在例如24小时-1周(在一些实施例中为48小时)的温育时间后进行以下测量：
a.荧光成像以可视化和定量标记的细胞媒介的“肿瘤定向迁移”
b.荧光成像以可视化和定量未标记或标记的肿瘤活组织检查来源的癌症或基质细胞(例如癌症相关成纤维细胞，免疫细胞等)的细胞媒介定向迁移
c.荧光成像以可视化和量化细胞媒介增强的定植和对象肿瘤活组织检查的病毒扩增的协同作用，即对象肿瘤活组织检查+细胞媒介中的病毒扩增为：
-比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增+等价条件下单独的细胞媒介中的病毒扩增的总和大5％或更多；
-或比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增大至少5％或更多。
d.方法：
-从对象新鲜分离的活实体瘤活组织检查可分为等价大小/质量/体积的重复部分。
-可使用包被了标准Transwell、生物凝胶(水凝胶)或细胞外基质(胶原/纤连蛋白)的表面系统建立迁移测定，其中两种成分(实体肿瘤活组织检查和细胞媒介)分别沉积在单独的室中或位于相邻位置。
-将新鲜和活对象肿瘤活组织检查组织的等价重复部分与用荧光标志物(例如CFSE、GFP、RFP等)标记的细胞媒介共培养15min-1周。
-如果将肿瘤活组织检查与一种以上类型的细胞媒介共培养，可用不同的荧光标志物标记细胞媒介，从而使得可鉴定和量化何种类型的细胞媒介优先募集至对象的肿瘤活组织检查。
-实体肿瘤活组织检查中积累的荧光标记的细胞媒介细胞的％可用作细胞媒介募集效率的测量，其中100％募集最佳而0％募集最差，且此％可用作细胞媒介至肿瘤迁移评分(CTMS)。
-或者，可用非毒性示踪剂染料(例如CFSE、CYTO-ID绿/红(Enzo)，CellTracker(Thermofisher Scientific)或替代物)对新鲜肿瘤活组织检查进行荧光标记，以跟踪细胞媒介定向肿瘤或肿瘤相关基质细胞从实体肿瘤活组织检查中迁移出并向细胞媒介迁移。
-荧光标记的肿瘤或肿瘤相关基质细胞从肿瘤中迁移出并向细胞媒介迁移的％可用作细胞媒介的肿瘤/基质细胞募集效率的测量，其中100％募集最佳而0％募集最差，且此％可用作肿瘤至细胞媒介迁移评分(TCMS)。
-并行地，可用荧光标志物工程化的溶瘤病毒(例如TurboFP635)感染单独的肿瘤细胞活组织检查、肿瘤细胞活组织检查与细胞媒介或单独的细胞媒介的一些重复共培养物，以允许对肿瘤活组织检查中的病毒扩增程度和保留在肿瘤活组织检查外的荧光标记的细胞媒介的可视化和基于荧光强度的定量；
-可使用病毒工程化标志物的荧光强度以及通过标准VPA(病毒噬斑测定)评价肿瘤活组织检查+/-细胞媒介中或单独的细胞媒介中的病毒扩增程度。
-还可在存在不同病毒的情况下使用迁移测定来测试一些病毒是否显著干扰肿瘤或载体细胞的迁移。可将病毒直接添加至共培养物中或在与活组织检查标本共培养前预加载至载体细胞中。如上所述计算病毒校正CTMS(VCTMS)和TCMS(VTCMS)，反映了病毒干扰细胞迁移和活力的能力
-每个对象肿瘤活组织检查-细胞媒介-病毒组合的累积平均迁移/募集评分(MRS)可使用以下公式计算：
MRS(活组织检查、细胞媒介、病毒组合)＝[VCTMS(活组织检查、细胞媒介、病毒)+VTCMS(活组织检查、细胞媒介、病毒)]/2；或
MRS(活组织检查、细胞媒介组合)＝[CTMS(活组织检查、细胞媒介)+TCMS(活组织检查、细胞媒介)]/2
-随后可基于平均MRS评分对细胞媒介针对每个对象和病毒组合进行排名。
3.对于对象/细胞媒介匹配的共培养物的分析，即对象对细胞媒介介导的病毒疗法的允许性：对象来源的PBMC+细胞媒介+病毒
(a)病毒扩增的测量(参见本领域技术人员已知的和本文提供的测定)
-如果细胞媒介和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增超过在不存在PBMC的情况下感染同一细胞媒介时病毒扩增的80％，是相容的匹配；
-如果细胞媒介和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增在不存在PBMC的情况下感染同一细胞媒介时病毒扩增的30％-80％范围内，是中等相容的匹配；
-如果细胞媒介和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增在不存在PBMC的情况下感染同一细胞媒介时病毒扩增的10％-30％范围内，是足够相容的匹配；
-如果细胞媒介和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增低于不存在PBMC的情况下感染同一细胞媒介时病毒扩增的10％，是不相容的匹配。
-％相容性可用于对每个个体患者和每种特定病毒从最不相容至最相容细胞媒介对细胞媒介排名。
-％相容性还可使用以下公式计算为患者、细胞媒介和溶瘤病毒的每种组合的免疫学病毒扩增评分(IVAS)：
IVAS(％，患者、细胞媒介、病毒)＝(细胞媒介+对象PBMC共培养物的病毒的pfu/单独的细胞媒介的病毒的pfu)×100。
IVAS评分为例如10％或更高、20％或更高、30％或更高或在10％-30％或更高可被认为是足够供考虑的。
当筛选一种以上类型的细胞媒介时，此IVAS评分(百分比越高，相容性越高)可用于对每个患者和每种病毒从最不相容至最相容细胞媒介对细胞媒介进行排名。
-通过考虑对象血清中补体和中和抗体的作用(任选对象血清抗性筛查)，可任选地进一步校正IVAS评分：
-以0-100％抑制的数值范围评价在有或无PBMC的对象来源血清存在的情况下细胞媒介对病毒扩增的％抑制并使用下式计算患者血清抗性评分(PSRS)：
PSRS＝(无血清的pfu-有血清且无补体失活的pfu/无血清的pfu)×100。
-PSRS评分大于95％表明强血清介导的抑制作用，表明病毒仍不可能与对象相容，尽管表现出可接受的IVAS评分，因为后者(IVAS评分)仅考虑了对象的细胞免疫力。
-使用校正IVAS评分对细胞媒介相容性测试中使用的病毒进行评级：IVAS(PSRS校正的)＝IVAS×(100-PSRS)/100
-补体在抑制病毒扩增中的贡献可使用下式用存在有或无对象PBMC且有或无热或药理性血清失活的对象来源的血清的情况下细胞媒介对病毒扩增的％抑制(以0-100％的数值范围)来评价：
％补体抑制＝(有血清和补体失活的pfu-有血清且无补体失活的pfu/无血清的pfu)×100。
-此％补体抑制可用作对象/患者补体抗性评分(PCRS)并表示对象对多种溶瘤病毒具有更广泛的抗性，其不依赖于存在预先存在的暴露/与病毒特异性中和抗体相关的免疫力。
(b)测量免疫学相容性(免疫豁免/免疫抑制作用)
(i)-测量病毒/细胞媒介介导的干扰素(例如IFNγ)产生的上调(可接受的参数范围请参见以下第(I)节中的ICS评分描述)
IFNγELISPOT
流式细胞术
-使用的标记抗体是抗人IFNγ，例如抗人IFNγ-APC
(ii)-测量与T细胞相关的标志物的上调，包括γδT细胞、NK细胞和NKT细胞介导的细胞毒性粒酶B ELISPOT
流式细胞术
-使用的标记抗体是抗人CD107a/CD107b(例如抗人CD107a-AlexaFluor 488)
(iii)-测量与T细胞相关的其它标志物的上调，包括γδT细胞、NK细胞和NKT细胞介导的活化/效应子功能(可接受的参数范围请参见以下第(I)节中的ICS评分说明)
-荧光标记的抗体可用于测量免疫细胞上/中的多种活化/效应子功能标志物的表面或细胞内表达水平，例如：
活化/效应子功能标志物
CD69(例如抗人CD69-APC)
CD25
CD71
ICOS
CD314(NKG2D)
PD-1
CTLA-4
IFNα/β
IFNγ
TNFα
IL-2
IL-4
IL-5
IL-6
IL-8
IL-9
IL-10
IL-12
IL-13
IL-15
IL-17
IL-18
IL-21
IL-22
IL-23
IL-25
GM-CSF
CD107a
CD107b
TGFβ
穿孔素
粒酶B
CD27(CD70L)
CD154(CD40L)
CD137(4-1BB)
CD44
CD45RA
CD45RO
CD278(ICOS)
CD127(IL-7RA)
CD183(CXCR3)
CD197(CCR7)
CD39
CD73
IL-1a/IL-1b
G-CSF
RANTES
EXOTAXIN
MIP-1b
MCP-1
EGF
HGF
VEGF
IL-1RA
IL-7
IP-10
IL-2R
MIG
(iv)-标记的抗体(例如荧光抗体)可用于鉴定表达多种特征性标志物的特定免疫细胞群，例如：
T细胞/γδ T细胞：
CD3(例如抗人CD3-PerCP/Cy5.5)
CD69(例如抗人CD69-APC)
CD4
CD8
NK细胞/γδT细胞：
CD107a/CD107b(例如抗人CD107a-AlexaFluor 488)
CD335(例如抗人CD335或NKp46-PE)
CD16
CD56
NKT细胞：
CD335(例如抗人CD335或NKp46-PE)
CD3
CD16
CD56
aGalCer-CD1d四聚体
(v)可通过以下评分来确定来自共培养物的ELISPOT/流式细胞术数据的最佳匹配：
(I)免疫学相容性评分(ICS)
-当共培养物中相对于单独PBMC的活化/效应子功能参数(至少上述之一)的比率约为1-1.05或更低时，表明细胞媒介对免疫应答无影响或降低了应答，即其为免疫学相容的匹配。
-当比率在1.05-1.5范围时，中等免疫学相容的匹配。
-当比率在1.5-2范围时，最低限度的免疫学相容的匹配。
-当比率大于2时，免疫学不相容的匹配。
-活化/效应子参数可基于其与减少的病毒扩增之间建立的关联进行加权(例如IFNγ和CD107a因其对病毒扩增的影响而被认为是显著的)，并且随着来自其它活化/效应子参数的数据变得可获得而迭代更新显著性水平/权重(请参阅计算机模拟分析章节)。
-应答同种异体细胞媒介的免疫细胞群也可基于其与减少的病毒扩增之间建立的关联进行加权(例如NK、NKT和T细胞包括γδT细胞亚群被认为是显著的)，并且随着来自其它群/亚群的新关联数据变得可获得而迭代更新显著性水平/亚群权重(请参阅计算机模拟分析章节)。
-如下所示基于选定免疫细胞亚群的ICS比率的平均值以及每个患者-细胞媒介组合的活化/效应子参数(p1、p2、p3等)计算累积ICS评分：
NK细胞：ICS(NK)＝[ICS(p1)+ICS(p2)+ICS(p3)+…ICS(pn)]/n
T细胞：ICS(T)＝[ICS(p1)+ICS(p2)+ICS(p3)+…ICS(pn)]/n
NKT细胞：ICS(NKT)＝[ICS(p1)+ICS(p2)+ICS(p3)+…ICS(pn)]/n
其中“n”是所考虑的相关活化/效应子功能参数的总数(例如如果仅评价IFNγ和CD107a，则n＝2)。
-可使用以下公式计算每种患者-细胞媒介组合以及组合所有相关效应子群的积累平均ICS评分：
ICS[NK(1)+T(2)+NKT(3)+…E(n)]＝[ICS(NK，1)+ICS(T，2)+ICS(NKT，3)+…ICS(E，n)]/n，
其中“n”是所考虑的相关效应子免疫细胞群/亚群的总数(例如如果仅评价NK、T和NKT细胞，则n＝3；如果也考虑其它群例如gd(γδ)T细胞，则n＝4)。
(II)免疫学抑制评分(ISS)
-可评价患者和细胞媒介的每个组合以及每个免疫细胞亚型和效应子参数的细胞媒介介导的抗病毒免疫性抑制，以使用下式计算免疫学抑制评分(ISS；％抗病毒细胞免疫抑制)：
ISS＝(％PBMC+病毒共培养物中活化的效应子+％PBMC+细胞媒介共培养物中的活化效应子-％PBMC+病毒+细胞媒介共培养物中的活化效应子/％PBMC+病毒共培养物中的活化效应子+％PBMC+细胞媒介共培养物中活化的效应子)×100，
其中首先通过减去单独PBMC对照中的背景或％活化的效应子来将％活化的效应子归一化。
-ISS为0％或更高是有利的。尽管ISS为0％表示不存在免疫抑制，或负ISS值可表明细胞媒介刺激而非抑制抗病毒免疫力，但这些结论不是确定的，因为它们可能只反映了细胞媒介扩增病毒的能力，因此可预期后阶段增加而非抑制抗病毒免疫力。
-负％值是非结论性的。
-较高ISS值表明细胞媒介抑制抗病毒免疫力的能力更高，以及病毒传播至肿瘤细胞的能力更高。然而，总体重要性也取决于其它评分标准如IVAS和ICS，因为较高IVAS和较低ICS评分与更高的病毒扩增相关，并且可能使抑制抗病毒应答更具挑战性。
-如下所示基于每个应答免疫细胞亚群的ISS％抑制的平均值和每个患者-细胞媒介组合的关键活化/效应参数(p1、p2、p3等)计算累积ISS评分：
NK细胞：ISS(NK)＝[ISS(p1)+ISS(p2)+ISS(p3)+…ISS(pn)]/n
T细胞：ISS(T)＝[ISS(p1)+ISS(p2)+ISS(p3)+…ISS(pn)]/n
NKT细胞：ICS(NKT)＝[ISS(p1)+ISS(p2)+ISS(p3)+…ISS(pn)]/n，
其中“n”是所考虑的相关活化/效应功能参数的总数(例如如果仅评估IFNγ和CD107a，则n＝2)。
-每个患者-细胞媒介组合以及组合所有相关效应子群的积累平均ISS评分可使用下式计算：
ISS[NK(1)+T(2)+NKT(3)+…E(n)]＝[ISS(NK,1)+ISS(T,2)+ISS(NKT,3)+…ISS(E,n)]/n，
其中“n”是所考虑的相关效应子免疫细胞群/亚群的总数(例如如果仅评价NK、T和NKT细胞，则n＝3；如果也考虑其它群例如gd(γδ)T细胞，则n＝4)。
(c)通过分析共培养物上清液来测量免疫调节(免疫豁免/免疫抑制作用)
本领域已知的方法例如ELISA和Luminex测定可用于测量共培养上清液中以下活化物/效应子功能参数：
IFNα/β
IFN
TNFα
IL-2
IL-4
IL-5
IL-9
IL-10
IL-12
IL-13
IL-15
IL-18
IL-21
IL-22
IL-23
IL-25
GM-CSF
IL-17
IL-6
TGFβ
穿孔素
粒酶B
IL-1a/IL-1b
G-CSF
RANTES
EXOTAXIN
MIP-1b
MCP-1
EGF
HGF
VEGF
IL-1RA
IL-7
IP-10
IL-2R
MIG
IL-8
尽管这些测量(上清液)无法鉴定来源细胞，仍可以针对共培养物所述的方式测量累积ICS(和/或ISS)评分。
-对于细胞媒介诱导的活化/效应子免疫细胞的最低限度增加与效应子细胞因子/趋化因子产生的显著增加相关的患者，确认流式细胞术结果或对累积评分进行校正。这不仅解释了免疫效应子的频率，还解释了它们的活性大小。
(d)基于对象特异性相容性选择用于病毒治疗的细胞媒介
根据本文提供的方法选择与对象匹配的细胞媒介具备以下特征中的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个：
(1)在不存在对象来源的细胞的情况下最大病毒扩增(VAS评分)
(2)在存在对象来源的细胞的情况下最大病毒扩增(IVAS评分)；
(3)最低诱导抗细胞媒介免疫学应答(ICS评分)；
(4)抑制诱导抗病毒免疫学应答的最大能力(ISS评分)。
(5)向肿瘤迁移并募集肿瘤和/或肿瘤相关基质细胞的最大能力(当可获得此类细胞/肿瘤时；MRS评分)。
(6)在如本文提供的某些基因座处的最低单体型错配。
-当筛选出一个以上或一组细胞媒介以与对象匹配时，可基于单体型错配数量对细胞媒介选择进行排名，如果进行一种以上类型的匹配分析，可使用上述(1)-(5)中所示评分之一或上述(1)-(5)中所示两个或更多个评分的组合来获得累积排名。例如，可根据VAS、IVAS、ICS、ISS和MRS评分中的两个或更多个的最佳组合来对细胞媒介进行排名
累积RANK评分＝[RANK(VAS)+RANK(IVAS)+RANK(ICS)+RANK(ISS)+(任选的)RANK(MRS)]/5(如果获得全部5个评分；如果获得更少评分则2个、3个或4个)
当从这些测定收集到足够数量的匹配数据时，这些评分中的每个都可在计算机模拟分析中进行额外的加权因子。
(e)-计算机模拟分析可如下进行：
分析每个对象和细胞媒介的分型特征，例如，
经典MHC I/II单体型；
KIR单体型和配体；
非经典MHC单体型(HLA-E；CD1a、CD1b、CD1c、CD1d；MICA/B)。
从对象免疫细胞(PBMC/免疫细胞/血液)与特定病毒/细胞媒介对的每个共培养物测定中收集数据以建立数据库。
在数据库的每个测定中建立的匹配相容性评分(IVAS、ICS、ISS)与细胞媒介和对象单体型之间的匹配程度进行关联，以建立特定基因座处的一或多个错配与对一个或全部匹配相容性评分(IVAS、ICS、ISS)的显著性负面影响之间的负相关性。
当发现此类相关性具有统计学显著性时，其可用于“计算机模拟”预筛选并基于与对象的不期望匹配(与较差匹配相容性评分相关)而排除不合适的细胞媒介。
另外，为选择并用于治疗对象的细胞载体和病毒的每种组合建立的匹配相容性评分收集在数据库中并将其与在治疗的前48小时(例如24小时至3天的范围)内从治疗的对象的血液或肿瘤获得的病毒扩增数据进行关联，其可用作体内实际治疗功效的量度。
匹配相容性评分与体内实际治疗功效之间的相关性分析可用于通过对与体内治疗功效更密切相关/更可预测体内治疗功效的IVAS、ICS或ISS评分分配更高的加权因子来调整/改进用于选择最佳细胞媒介的累积RANK评分公式。。
D.具有改善的递送和/或匹配能力的修饰的细胞媒介
本文还提供了细胞媒介(载体细胞)，其性质被修饰以促进溶瘤病毒向对象的递送和/或提供与对象改善的匹配。本文提供的任何细胞媒介(例如干细胞、免疫细胞、癌症细胞)可被如此修饰。此类性质可包括但不限于：改善的细胞递送媒介中病毒扩增的促进、改善的逃避针对细胞媒介和/或病毒的免疫应答的能力和/或改善的免疫抑制。在实施方案中，免疫调节能力(例如逃避免疫应答、抑制免疫应答)可为局部和/或短暂的，以促进病毒在肿瘤或其它癌性细胞中的递送、积累和感染所需的程度存在。
在一些实施方案中，可使用本文提供的匹配测定(C章节)筛选本文提供的修饰的细胞媒介，以确定其作为将溶瘤病毒递送至特定对象和/或特定癌症/肿瘤类型的细胞媒介的适合性。在实施方案中，可通过本文提供的匹配测定筛选多个/一组修饰的细胞媒介，并按其匹配能力的顺序进行排名。在一些实例中，所述一组细胞媒介可包括未经修饰的细胞媒介。
如本文所述，本文提供的经修饰的细胞媒介可含有本节和本文其它部分所示的一种或多种修饰：
(i)用于改善病毒扩增和/或免疫调节的经敏化/保护的细胞媒介
本文提供了经修饰以改善病毒扩增和/或免疫调节以促进病毒递送和/或改善与正在用病毒疗法治疗的对象的匹配的细胞媒介。修饰可包括以下实施方案中的一种或多种：在实施方案中，可通过用以下一种或多种预处理/加载细胞媒介来将其敏化以增强其病毒扩增能力：IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、GM-CSF、生长因子、RTK/mTOR激动剂、wnt蛋白配体和GSK3抑制剂/拮抗剂(例如Tideglusib、丙戊酸)。在其它实施方案中，可通过例如用干扰IFN I型/II型受体和/或干扰包括但不限于以下的下游信号传导的小分子或蛋白抑制剂预处理/加载细胞媒介使细胞媒介敏化以阻断抗病毒状态的诱导：IFNAR1/IFNAR2信号传导、IFNGR1/IFNGR2信号传导、STAT1/2信号传导、Jak1信号传导(例如托法替尼、鲁索替尼、巴瑞替尼(Baricitinib))、Jak2信号传导(例如SAR302503、LY2784544、CYT387、NS-018、BMS-911543、AT9283)、IRF3信号传导、IRF7信号传导、IRF9信号传导、TYK2信号传导(例如BMS-986165)、TBK1信号传导(例如BX795、CYT387、AZ13102909)。
在一些实施方案中，可用HDAC抑制剂预处理/加载细胞媒介以干扰/解除IFN信号传导/响应性；此类抑制剂可包括但不限于伏立诺他、罗米地辛、西达本胺、帕比司他、贝利司他、丙戊酸、莫塞替诺特、艾贝司他、恩替诺特、SB939、Resminostat、吉维诺特、Quisinostat、HBI-8000、Ketvetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、萝卜硫素和/或曲古抑菌素。在其它实施方案中，可用由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)介导的病毒感测和/或抗病毒防御途径的拮抗剂预处理/加载细胞媒介；此类拮抗剂可包括但不限于K1、E3L、K3L蛋白(痘苗病毒)；NS1/NS2蛋白(流感)；NS3-4A(丙型肝炎)；NP和Z蛋白(沙粒病毒)；VP35(埃博拉病毒)；US11，ICP34.5，ICP0(HSV)；M45(MCMV)；和X蛋白(BDV：博纳病病毒)的一或多种。在实施方案中，可使细胞媒介抵御同种异体失活/排斥决定因素，例如通过用病毒来源的MHC拮抗剂预处理/加载细胞，例如A40R MHCI拮抗剂(痘苗病毒)、Nef和TAT(HIV)、E3-19K(腺病毒)、ICP47(HSV-1/2)、CPXV012和CPXV203(牛痘)、ORF66(VZV)、EBNA1、BNLF2a、BGLF5、BILF1(EBV)、US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10、US11/gp33(hCMV)、Rh178/VIHCE(RhCMV)、U21(HHV-6/7)、LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1、kK5/MIR2(KSHV)、mK3(MHV-68)、UL41/vhs(a-疱疹病毒、HSV、BHV-1、PRV)、UL49.5(水痘病毒、BHV-1、EHV-1/4、PRV)和m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40(mCMV)的一或多种。
在实施方案中，本文提供的修饰的细胞媒介可用病毒来源的B2M拮抗剂例如UL18(HCMV)预处理/加载。在其它实施方案中，细胞媒介可用MIC-A和MIC-B(NKG2D配体)的拮抗剂例如kK5(KHSV)预处理/加载。在一些实施方案中，细胞媒介可用一种或多种病毒来源的免疫抑制因子预处理/加载，包括但不限于：免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡抑制剂(例如鼠痘/痘苗病毒SP1-2/CrmA)、IL-1/NFκB/IRF3拮抗剂(例如痘苗病毒编码的N1)、IL-1和TLR拮抗剂(例如IL-18结合蛋白、A46R、A52R)、IL-1β拮抗剂(例如B15R/B16R)、TNFα阻断剂(例如痘苗病毒CmrC/CmrE)、IFNα/β阻断剂(例如痘苗病毒B18R/B19R)和IFNγ阻断剂(例如痘苗病毒B8R)。在实施方案中，细胞媒介可用TAP1/2和/或tapasin的小分子抑制剂预处理/加载。
在实施方案中，可通过例如用补体因子(例如C1、C2、C3、C4、C5、MBL)的小分子抑制剂预处理/加载细胞媒介来使本文提供的经修饰的细胞媒介抵御补体；此类抑制剂可包括但不限于以下一种或多种：VCP(痘苗病毒补体控制蛋白)、B5R(痘苗病毒补体抑制剂)、scFv抗CD1q/CD1r/CD1s、抗C3抗体、抗C5抗体(例如依库丽单抗)、坎普他汀家族的肽类C3抑制剂(例如Cp40)、人可溶性膜(s/m)蛋白(例如s/mCR1(CD35)、s/mCR2(CD21)、s/mCD55、s/mCD59)、人因子H及衍生物；和眼镜蛇毒因子及具有补体抑制活性的衍生物。
经敏化的细胞媒介可通过本领域已知的方法生成。例如，在细胞储存、病毒感染或施用于对象前，细胞媒介可用敏化剂例如蛋白质或小分子激动剂/拮抗剂通过温育10分钟至48小时或更多小时进行预处理，例如在细胞储存、病毒感染或施用于对象前保温约或至少10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟或约或至少1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时，10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时或48小时或更多小时。为增强蛋白质/脂质不溶性小分子在细胞中的加载，可使用lipofectamine或其它蛋白质转染试剂例如Xfect(Takara)、PiercePro-Ject(ThermoFisher)、Pro-DeliverIN(OZ Biosciences)、TurboFect(Fermentas)或替代物。
(ii)经敏化以对病毒介导的杀伤具有抗性(以延长生存并改善局部免疫抑制)
在一些实施方案中，本文提供的修饰的细胞媒介可用一种或多种使细胞媒介对病毒介导的杀伤具有抗性的物质预处理/加载。例如，在一些实施方案中，细胞媒介可用I型和/或II型干扰素预处理。在其它实施方案中，细胞媒介可用抗病毒状态的激动剂/诱导剂(例如STING、PKR、RIG-1、MDA-5)预处理。为生成此类“受保护的”细胞媒介，任何自体或同种异体细胞媒介可在无病毒感染情况下或在病毒感染前用I型干扰素(例如IFNα/β)和/或II型干扰素(例如IFNγ)和/或STING、PKR、RIG-I、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM-2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)途径的激动剂处理30分钟至至多48小时或更多小时，例如约或至少30分钟或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时或48小时或更多小时。
这些“受保护的”细胞媒介可作为单独的组合物与未如此保护并且包含病毒的经匹配/敏化/工程化的细胞媒介同时施用；受保护的细胞媒介可提供延长的存活和/或改善的局部免疫抑制。在一些实施方案中，受保护的细胞媒介可在施用未如此保护并且包含病毒的经匹配/敏化/工程化的细胞媒介之前或之后例如约或至少10小时、15小时、20小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时或48小时或1天、2天、3天、4天或5天的时间内施用。
(iii)工程化的细胞媒介用于改善病毒扩增和/或免疫调节
本文还提供了经修饰的细胞媒介，其被工程化以用于基因的短暂或永久表达或抑制以促进改善病毒扩增和/或免疫调节。细胞媒介可在以下一种或多种实施方案中被工程化。本文提供的任何细胞媒介可使用一种或多种实施方案的组合来修饰以敏化、保护和/或工程化本文提供的细胞媒介。
在一些实施方案中，细胞媒介可被工程化以对干扰素(IFN)诱导的抗病毒状态无反应性。例如，细胞媒介可被工程化以短暂或永久(例如切除基因基因座)抑制I型/II型IFN受体和/或下游信号传导，例如抑制以下的一种或多种：I型/II型干扰素受体表达；IFNα/β、IFNγ受体表达；IFNAR1/IFNAR2受体表达；IFNGR1/IFNGR2受体表达；STAT1/2受体表达；Jak1/2受体表达；IRF3受体表达；IRF7受体表达；IRF9受体表达；TYK2激酶表达和TBK1激酶表达。
在实施方案中，细胞媒介可被工程化以短暂或永久抑制胞质病毒DNA/RNA感测机制和抗病毒防御机制的元件，包括但不限于PKR、RIG-1、MDA-5、cGAS、STING、TBK1、IRF3、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)中的一种或多种。在其它实施方案中，细胞媒介可被工程化以短暂或永久表达由例如STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3、DAI(ZBP1)介导的病毒感测途径和抗病毒防御途径的拮抗剂；这些可包括但不限于以下的一种或多种：K1、E3L、K3L(痘苗病毒)；NS1/NS2(甲型流感)；NS3-4A(丙型肝炎)；NP、Z蛋白(沙粒病毒)；VP35(埃博拉病毒)；US11，ICP34.5，ICP0(HSV)；M45(MCMV)；和X蛋白(BDV：博纳病病毒)。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的细胞媒介可被工程化以逃避T细胞和NKT细胞中的一种或多种的同种异体识别以及γδT细胞的适应性免疫应答。例如，细胞媒介可被工程化以短暂或永久抑制以下一种或多种的表达：MHC I类分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)；MHCII类分子(HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)；MHC样分子(CD1a/b/c/d)；或MHC I类、MHC II类、MHC样分子的转录或表达的调节物(例如TAP1/2、Tapasin、β2微球蛋白、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP)。在其它实例中，细胞媒介可被工程化以短暂或永久表达以下的一种或多种：病毒来源的B2M拮抗剂(例如UL18(HCMV)；和/或病毒来源的MHC拮抗剂(例如以下的一种或多种：A40R MHCI(痘苗)；Nef、TAT(HIV)；E3-19K(腺病毒)；ICP47(HSV-1/2)；CPXV012、CPXV203(牛痘)；EBNA1、BNLF2a、BGLF5、BILF1(EBV)；ORF66(VZV)；US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10、US11/gp33(hCMV)；rh178/VIHCE(RhCMV)；U21(HHV-6/7)；LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1、kK5/MIR2(KHSV)；mK3(MHV-68)；UL41/vhs(α-疱疹病毒、HSV、BHV-1、PRV)；UL49.5(水痘病毒、BHV-1、EHV-1/4、PRV)；和m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40(mCMV))。
在实施方案中，细胞媒介可被工程化以逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的先天免疫应答。例如，细胞媒介可被工程化以短暂或永久抑制以下一种或多种的表达：膜结合MICA/B(NKG2D配体)；膜结合PVR(DNAM-1配体)；膜结合连接蛋白-2(DNAM-1配体)。在其它实例中，细胞媒介可被工程化以短暂或永久表达以下的一种或多种：MIC-A和MIC-B拮抗剂(NKG2D配体)(例如kK5(KHSV))；NKG2D受体的拮抗剂(例如牛痘OMCP)；NCR的拮抗剂-靶向NKp30、NKp44、NKp46受体(例如HA(血凝素-在痘苗和其它病毒中))；NK抑制性受体(KIR)的配体(例如HLA-Bw4、HLA-C2)；NK抑制性受体的配体(NKG2a/CD94)(例如单独的HLA-E及衍生物或与21M HLA-B配体组合以生成HLA-E结合肽并稳定HLA-E表面表达的HLA-E及衍生物)。
在某些实施方案中，细胞媒介可被工程化以表达人或病毒来源的免疫抑制因子(例如以防止/抑制同种异体抗细胞媒介或抗病毒免疫应答)。人来源的因子包括但不限于IDO、精氨酸酶、TRAIL、iNOS、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、sMICA、sMICB、sHLA-G、HLA-E、PD-L1、FAS-L、B7-H4和靶向或消耗NK和/或NKT和/或γδT细胞的单链抗体(scFv)。病毒来源的因子包括但不限于鼠痘/痘苗病毒SPI-2/CrmA(免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡抑制剂)；痘苗病毒编码的N1(IL-1/NFkB/IRF3拮抗剂)；HA(靶向NKp30、NKp44，NKp46的NCR拮抗剂)；IL-18结合蛋白；A40R；A46R；A52R；B15R/B16R；TNFα阻断剂(例如痘苗病毒CmrC/CmrE)；IFNα/β阻断剂(例如痘苗病毒B18R/B19R)；IFNγ阻断剂(例如痘苗病毒B8R)和其它IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D拮抗剂。
在一些实施方案中，细胞媒介可被工程化以表达癌症或干细胞衍生因子，其促进病毒感染原本不允许的细胞媒介和/或肿瘤细胞。例如，细胞媒介可被工程化以表达以下的一种或多种：癌症相关抗原(例如癌睾丸抗原(MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、NY-ESO-1、PRAME、CT83、SSX2、BAGE家族、CAGE家族)；癌胚抗原(AFP、CEA)；癌基因/肿瘤抑制基因(myc、Rb、Ras、p53、端粒酶)；分化抗原(MELAN、酪氨酸酶、TRP-1/2、gp100、CA-125、MUC-1、ETA)；GM-CSF；IL-10；TGFβ；VEGF；FGF-2；PDGF；HGF；IL-6；生长因子；RTK/mTOR激动剂和wnt蛋白配体。
在实施方案中，修饰的细胞媒介可被工程化以表达干扰补体和/或中和抗体功能的因子，包括但不限于以下的一种或多种：补体因子(例如C1、C2、C3、C4、C5、MBL)的蛋白质拮抗剂；痘苗病毒补体控制蛋白(VCP)；痘苗病毒补体抑制剂(B5R)；抗CD1q/CD1r/CD1s的scFv；抗C3抗体；抗C5抗体(例如依库丽单抗)；坎普他汀家族的肽类C3抑制剂(例如Cp40)；人可溶性膜(s/m)蛋白(例如s/mCR1(CD35)、s/mCR2(CD21)、s/mCD55、s/mCD59)；人因子H及衍生物；和眼镜蛇毒因子及具有补体抑制活性的衍生物。
本领域已知工程化细胞(例如用于制造本文提供的工程化细胞媒介)的许多方法。此类方法包括但不限于：
(a)CRISPR-CAS9靶向抑制(永久基因/基因座缺失)
细胞媒介可用DNA质粒转染，该质粒既表达CAS9蛋白也表达对目的基因而言特异的向导RNA(gRNA)。可使用供体DNA质粒修复基因组中gRNA-CAS9介导的切割，这会引起被靶向基因的特异性缺失以及基因编码蛋白的永久和完全丧失。可使用PCR(DNA水平)、Northern印迹/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定(例如蛋白质印迹或流式细胞术)来验证蛋白表达的丧失。
(b)CRISPR-CAS9靶向表达(永久基因/基因座插入)
此方法可用于将感兴趣的基因插入细胞媒介基因组的特定位置。细胞媒介可用DNA质粒转染，该质粒既表达CAS9蛋白也表达对特定插入位置而言特异的向导RNA(gRNA)。可使用供体DNA质粒修复基因组中gRNA-CAS9介导的切割，该质粒具有插入的感兴趣基因，其两侧是DNA切割/双链断裂的位置两侧的细胞媒介基因组序列，从而引起同源重组介导的(而非随机)感兴趣的基因在特定基因组位置的插入。可使用PCR(DNA水平)、Northern印迹/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定(例如蛋白质印迹或流式细胞术)来验证成功的插入和蛋白质表达。
(c)RNA干扰(逆转录病毒/慢病毒/转座子介导的shRNA/微RNA转导)(永久基因抑制)
可设计靶向感兴趣的特定基因/蛋白质的shRNA/微RNA并将其克隆至逆转录病毒/慢病毒/转座子载体中以稳定整合至细胞媒介基因组中。细胞媒介可用所述载体转导并且可使用所述载体编码的选择标志物选择成功转导的细胞。可使用例如Northern印迹和蛋白质测定来评价shRNA介导的感兴趣基因的抑制。
(d)慢病毒/γ-逆转录病毒介导的随机/多拷贝基因插入
可设计感兴趣的特定基因/蛋白质和/或克隆至逆转录病毒或慢病毒载体中以稳定随机整合至细胞媒介基因组中。细胞媒介可用所述病毒载体转导并且可使用所述载体编码的选择标志物选择成功转导的细胞。shRNA介导的感兴趣基因的抑制将使用Northern印迹和任何蛋白质分析(例如蛋白质印迹、流式细胞术等)进行评价。
(e)转座子介导的随机/多拷贝基因插入
可设计感兴趣的特定基因/蛋白质和/或克隆至哺乳动物转座子载体系统例如PiggyBac(SBI System Biosciences)或等价物中。细胞媒介可用所述转座子载体和和转座酶载体共转染，所述转座子载体具有感兴趣的基因(cDNA)，所述感兴趣的基因的两侧是反向末端重复(ITR)序列。转座酶可介导感兴趣的基因转移至TTAA染色体整合位点。任选地，可以使用载体编码的选择标志物来选择成功转导的细胞。可使用PCR(DNA水平)、Northern印迹/FISH(RNA水平)或任何蛋白质测定(例如蛋白质印迹或流式细胞术)来验证成功的插入和蛋白质表达。
(f)感兴趣蛋白表达的短暂基因抑制可例如通过RNA干扰来实现。siRNA/微RNA可通过本领域已知的任何已建立的方法学(例如：氯化钙转染；脂转染；Xfect；电穿孔；声孔效应(sonoporation)和细胞挤压(例如导入siRNA))转染至细胞媒介中。
(g)短暂基因表达可例如通过将感兴趣基因克隆至合适的哺乳动物质粒表达载体(其可用编码所需产物的质粒DNA转染至细胞媒介中)来实现。或者，可将编码感兴趣的基因/蛋白质的mRNA直接转染至细胞媒介中。可使用任何已建立的方法(例如：氯化钙转染；脂转染；Xfect；电穿孔；声孔效应和细胞挤压(例如导入siRNA))进行转染。
细胞媒介的示例性修饰
1.抑制抗病毒状态的诱导
未转化的干细胞和数种肿瘤细胞通常具有完整的抗病毒机制，该机制削弱了将其用作溶瘤病毒的细胞媒介/载体细胞的能力。I型和II型干扰素在干细胞以及一些肿瘤细胞中是强有力的抗病毒状态诱导剂，其可干扰这些细胞被感染并支持病毒扩增的能力。因此，在一些实施方案中，本文提供的和在本文提供的方法中使用的细胞媒介被加载或工程化以表达一种或多种阻断检测病毒感染和/或引发抗病毒状态/免疫应答的干扰素信号传导抑制剂。例如，干扰素信号传导Jak1/Jak2的小分子抑制剂鲁索替尼可成功用于通过使多种干细胞以及肿瘤细胞对病毒感染、扩增和传播敏化(使其对感染病毒、扩增和传播易感)而增强它们作为溶瘤病毒载体的治疗潜能(例如参见实施例6)。
2.保护细胞媒介抵御补体
人血清可对载体细胞具有有害作用，包括在病毒扩增起始和/或达到其峰值之前直接攻击和杀死感染病毒的载体细胞，或通过中和从载体细胞释放的裸露病毒颗粒，从而限制了病毒传播进入靶肿瘤细胞。因此，在一些实施方案中，本文提供的和在本文提供的方法中使用的细胞媒介被加载或工程化以表达一种或多种补体阻断因子。例如，坎普他汀，一种补体C3活化的肽类抑制剂，或中和性抗人C3a/C3a(desArg)/C3抗体，可用于增加载体细胞中的病毒载量并也获得增强的在靶肿瘤中的病毒扩增和传播(参见例如实施例7)。
3.逃避同种异体识别/排斥
如本文所证明的，干细胞载体(细胞媒介)由于其逃避同种异体识别并主动免疫抑制NK细胞、T细胞、gd(γδ)T细胞和/或同时表达NK(NKp46)和T细胞(CD3)标志物的“NKT”细胞群的能力，因此能够成功扩增和递送针对同种异体屏障的溶瘤痘苗病毒。然而，在“不相容/抗性”接受者的亚群中，干细胞载体有时无法逃避同种异体识别，其即使在不存在病毒的情况下也导致出现针对载体干细胞的快速有力的同种异体免疫应答。这些快速的同种异体应答可能与抗干细胞细胞毒性的发展以及干扰素(例如IFNγ)介导的抗病毒状态的诱导相关，从而由于载体细胞杀伤和抗病毒应答诱导的组合，导致痘苗病毒扩增能力被显著抑制。因此，在一些实施方案中，本文提供的和本文提供的方法中使用的细胞媒加载有抑制性因子或经工程化以抑制/消除/阻断同种异体排斥决定因素。此类同种异体排斥决定因素可包括但不限于被CD8和CD4 T细胞识别的高度多态性和患者特异性的MHC I类和II类分子，或被多种先天或混合的先天/适应性T细胞亚群(例如NKT、iNKT、γδ(gd)T细胞)识别的广谱的较少多态性的决定因素，包括MHC样MICA和CD1a、CD1b、CD1c、CD1d分子以及多种其它应激相关分子或应激感测分子，如嗜乳脂蛋白和膜联蛋白A2。
例如，消除/阻断同种异体MHC I分子可抑制针对载体干细胞和肿瘤细胞的同种异体免疫应答，特别是负责识别和应答同种异体MHC I错配的CD8 T细胞的应答。泛HLA阻断抗体(抗人HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体)(参见实施例8)可用于抑制多种先天和适应性免疫细胞群的同种异体抗载体细胞应答，其数量可例如通过使用CD69作为活化标志物以及以下的一套细胞类型特异性标志物的多参数流式细胞术分析来确定：γδT细胞(CD3+、γδTCR+)、iNKT/NKT 1型细胞(CD3+、Va24Ja18+)、普通NKT(CD3+CD56+细胞；排除γδ和iNKT)、经典CD4(CD3+CD4+；排除γδ和iNKT)、经典CD8T细胞(CD3+CD8+；排除γδ和iNKT)、普通NK细胞(CD3-CD56+)和NK亚群CD56highCD16-(产生细胞因子)和CD56lowCD16+(细胞毒性)。本文证明了短暂或永久阻断或消除同种异体排斥决定因素(如HLA(MHC I类))可用作生成基于干细胞或肿瘤细胞的载体(细胞媒介)的有效策略，所述载体具有增强的免疫逃避潜能以及通过阻断同种异体免疫应答的诱导和/或效应子细胞因子(如IFNγ，其可诱导抗病毒状态并阻断病毒有效载量的递送和传播)的分泌而更有效地递送溶瘤病毒的能力。
同种异体的感染病毒的干细胞或肿瘤载体细胞的免疫学应答和排斥可通过多种其它非MHC标志物的参与而增强，这些标志物通常在病毒感染或转化的肿瘤细胞表面上调并充当免疫共刺激分子。此类标志物可损害载体细胞(例如感染了病毒并用于递送病毒的肿瘤细胞或干细胞)逃避免疫学排斥的能力。例如，NKG2D分子识别MHC I类相关蛋白如人MIC A和MIC B，已知其作为参与病毒感染和转化的肿瘤细胞的识别和排斥的共刺激分子起作用。实施例9证明了使用例如NKG2D特异性抗体活化NKG2D信号传导途径提供了强有力的共刺激信号，其增强并有助于免疫识别和细胞免疫应答的活化。因此，在本文提供的并且在本文提供的方法中使用的细胞媒介的一些实施方案中，细胞媒介被加载抑制性因子或工程化以抑制/消除/阻断NKG2D信号传导途径的共刺激信号。例如，载体细胞可被工程化以短暂或永久抑制MIC A和/或MIC B的表达，或者可加载或被工程化以短暂或永久表达：卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)蛋白K5(亦称kK5或MIR2)，其靶向MICA/MICB的降解)；UL16(HCMV)，其结合MICB并防止配体在细胞表面表达(引起MICB的细胞内滞留)；HCMV US18和US20，其靶向MICA用于溶酶体降解(US20还下调MICA和MICB)；HCMV UL142，其通过在顺式高尔基体处滞留以下调MICA；人疱疹病毒7(HHV-7)U21蛋白，其抑制MICA和MICB的细胞表面表达；EBV蛋白LMP2A，其导致MICA的下调；腺病毒E3/19K蛋白，其防止MICA/B的细胞表面运输，抑制CD8 T细胞和NK细胞的识别；等。
4.分泌免疫抑制因子
已知干细胞和肿瘤细胞使用多种策略进行免疫抑制和逃避，包括IDO表达和IL-10分泌。然而，当它们用作病毒的载体细胞/细胞媒介时，载体细胞中的病毒扩增引起活力和免疫抑制潜能的逐渐丧失。因此，在本文提供的和在本文提供的方法中使用的细胞媒介的一些实施方案中，细胞媒介被加载免疫抑制分子或细胞因子或经工程化以短暂或永久表达免疫抑制分子或细胞因子(例如IL-10)以部分或完全逆转病毒介导的免疫抑制性质的丧失并改善感染病毒的载体细胞逃避同种异体应答和/或早期免疫识别的能力(参见例如实施例10)。
5.修饰细胞媒介；用于治疗的施用
如上文和本文其它部分所述，经修饰以逃避免疫识别和/或抑制抗病毒免疫应答和/或同种异体免疫应答的载体细胞/细胞媒介可通过使用本领域技术人员已知以及本文所述的方法用感兴趣的免疫应答修饰剂(例如鲁索替尼、C3活化的肽抑制剂、IL-10、MIC A/MIC B的抑制剂等)预处理/加载载体细胞或通过短暂或永久修饰载体细胞来表达/抑制感兴趣的免疫应答修饰剂的表达来获得。在实施方案中，加载/表达可为局部和/或短暂的，以促进病毒感染、病毒扩增、病毒向肿瘤或其它癌性细胞的递送以及病毒在肿瘤或其它癌症内传播所需的程度存在。在实施方案中，修饰是通过使用质粒或本领域技术人员已知的其它载体短暂表达来进行的。在实施方案中，对质粒进行工程化，使得被表达的外源基因的表达处于病毒启动子(例如许多病毒如腺病毒、痘苗病毒、CMV的立即早期、早期、中期、晚期启动子，RSV长末端重复启动子，腺病毒E1A启动子等)的控制下，从而减少或消除随后加载至载体细胞中的病毒的外源基因表达的关闭。
修饰的载体细胞可如本文所述加载病毒，并经肠胃外、全身、肿瘤内或如本文提供的其它途径施用。对于全身施用，载体细胞应以足够长的时间逃避免疫识别和/或抑制病毒或同种异体细胞免疫应答，以将病毒递送至靶肿瘤/癌症部位并促进其扩增和传播。对于肿瘤内施用，载体细胞应以足够长的时间逃避免疫识别和/或抑制病毒或同种异体细胞免疫应答以渗透至肿瘤深处。取决于载体细胞/病毒组合物，递送时间可为数小时(例如10-20小时，如10小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时)至数天的任何时间，例如24小时、30小时、36小时、40小时、48小时至3天、4天、5天或更多天。通常，一旦实现在靶递送部位(例如肿瘤)处的病毒递送和传播，则不期望持续的免疫抑制，因为它可防止肿瘤特异性免疫应答(针对肿瘤)起作用。
E.用于治疗的细胞媒介/病毒施用方式
可将本文提供的载体细胞/病毒施用于对象(包括患有肿瘤或具有赘生性细胞的对象)用于治疗。施用的载体细胞和病毒可为本文提供的载体细胞和病毒或使用本文提供的方法产生的任何其它载体细胞和病毒。在一些实例中，载体细胞是自体细胞(即衍生自患者)或同种异体细胞(即非衍生自患者)，其为干细胞、免疫细胞或癌细胞。载体细胞可被敏化，例如增强病毒扩增能力、阻断抗病毒状态的诱导、针对同种异体失活/排斥决定因素进行保护和针对补体进行保护，或载体细胞可被工程化以例如对干扰素诱导的抗病毒状态无反应性、逃避T细胞(包括γδT细胞、NK细胞和NKT细胞)的同种异体识别、表达人或病毒来源的免疫抑制因子、表达使低允许性肿瘤细胞对溶瘤病毒感染敏化的癌症或干细胞衍生因子以及表达干扰补体和中和抗体的功能的因子。在一些实例中，施用的病毒是含有以下特征的病毒：如减弱的致病性、低毒性、优先在肿瘤中积累、活化针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力和表达外源蛋白的能力，以及它们的组合。
a.施用经照射或未经照射的感染病毒的载体细胞
可在溶瘤病毒感染之前或之后照射载体细胞。为将转化的细胞用作用于溶瘤病毒疗法的细胞载体，必须防止未感染的细胞在施用后建立新的转移性生长。这可通过在病毒感染之前或之后，在施用前，对载体细胞进行γ照射来完成，这可消除致瘤性，但保留代谢活性并且不影响病毒产生/扩增和释放。例如，可在病毒感染之前至多24小时或在病毒感染之后至多24小时照射载体细胞。
辐射的量可由本领域技术人员根据多种因素中的任何来选择，包括载体细胞和病毒的性质。辐射量可足以使载体细胞失活并防止肿瘤发生，而不影响病毒感染、扩增和释放。例如，辐射量可为大约5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、100Gy、120Gy、150Gy、200Gy、250Gy、500Gy或更高。
b.施用途径
载体细胞/病毒组合可局部或全身地递送至或施用于对象。例如，施用模式包括但不限于全身、肠胃外、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、透皮、皮内、动脉内(例如肝动脉输注)、囊内灌注、胸膜内、关节内、表面(topical)、瘤内、病灶内、内镜、多次穿刺(例如与天花疫苗一起使用)、通过吸入、经皮、皮下、鼻内、气管内、口腔、腔内(例如通过导管施用于膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用于肠)、阴道、直肠、颅内、前列腺内、玻璃体内、耳、眼或表面施用。
本领域技术人员可选择与对象和载体细胞/病毒组合相容以及也可能导致载体细胞/病毒到达并进入靶细胞类型或组织(例如肿瘤和/或转移)的任何施用模式。本领域技术人员可根据多种因素中的任何来选择施用途径，所述因素包括疾病性质、靶细胞或组织的性质(例如肿瘤的种类)以及待施用的特定细胞媒介/病毒。可例如通过投射递送、以胶体分散系统对靶部位进行施用，或可通过注射入动脉来进行全身性施用。
c.装置
本领域已知的用于施用药物、药物组合物和疫苗的多种装置中的任一种均可用于施用载体细胞/病毒组合。示例性的装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器例如滴眼管。例如，可使用Qaudra-FuseTM多管注射针(RexMedical，Conshohocken，PA)。
通常，用于施用载体细胞/病毒组合的装置与载体细胞/病毒组合相容；例如，无针注射装置如高压注射装置可与不被高压注射破坏的载体细胞/病毒一起使用，但通常不与被高压注射破坏的载体细胞/病毒一起使用。本文还提供了用于给对象施用额外药剂或化合物的装置。可使用本领域已知的用于给对象施用药物的多种装置中的任一种。示例性的装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器例如滴眼管。通常，用于施用化合物的装置与期望的化合物施用方法相容。例如，可用皮下针和注射器施用待全身或皮下递送的化合物。
d.施用剂量
剂量方案可为多种方法和量中的任一种，并且可由本领域技术人员根据已知临床因素确定。如医学领域所知，任何一名患者的剂量可取决于许多因素，包括对象的种类、大小、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、待施用的特定细胞载体和病毒、施用的持续时间和途径、疾病的种类和阶段(例如肿瘤大小)以及同时施用的其它治疗或化合物(如化疗药物)。除上述因素外，如本领域技术人员可确定的，此类水平还可受到病毒的感染性和扩增潜能以及载体细胞和/或病毒的性质的影响。
在本发明的方法中，细胞载体和病毒的合适的最小剂量水平和剂量方案可为足以使载体细胞将病毒递送至靶部位并且使病毒在肿瘤或转移中存活、生长和复制的水平。通常，用任何合适的溶瘤病毒(包括基于本文提供的共培养筛选和分析方法选择的溶瘤病毒)0.1或更高的感染复数(MOI)离体感染100000-10亿个未经修饰的、敏化的、受保护的或遗传工程化的同种异体或自体载体细胞。选择产生pfu/细胞为至少10的细胞载体。例如，选择产生pfu/细胞为至少10或至少约10、至少100或至少约100、至少1000或至少约1000或更高的细胞载体。通常，在整个施用周期中，以至少1×105pfu或约1×105pfu或1×105pfu的量施用病毒至少一次。向65kg人施用病毒的示例性最低水平可包括至少约1×105噬斑形成单位(pfu)、至少约5×105pfu、至少约1×106pfu、至少约5×106pfu、至少约1×107pfu、至少约1×108pfu、至少约1×109pfu或至少约1×1010pfu。例如，在整个施用周期中，以至少或约或1×105pfu、1×106pfu、1×107pfu、1×108pfu、1×109pfu、1×1010pfu、1×1011pfu、1×1012pfu、1×1013pfu或1×1014pfu的量施用病毒至少一次。
e.方案
在剂量方案中，载体细胞和病毒的量以单次施用而施用或在整个施用周期内多次施用。因此，本文提供的方法可包括向对象单次施用细胞载体/病毒组合或向对象多次施用细胞载体/病毒组合。在一些实例中，单次施用足以在肿瘤中递送和建立病毒，其中病毒可在对象中增殖并且可引起或增强抗肿瘤应答；此类方法不需要额外施用载体细胞/病毒组合以在对象中引起或增强可导致例如以下的抗肿瘤应答：抑制肿瘤生长、抑制转移生长或形成、减少肿瘤大小、消除肿瘤或转移、抑制或防止赘生性疾病或新肿瘤形成的复发或其它癌症治疗作用。
在其它实例中，可在不同情况下施用细胞载体/病毒组合，时间间隔通常至少一天。例如，可将载体细胞/病毒组合施用两次、三次、四次、五次或六次或更多次，施用间隔一天或更长、两天或更长、一星期或更长或一个月或更长。在先前施用对于将病毒递送至肿瘤或转移无效时，分开施用可增加将病毒递送至肿瘤或转移的可能性。分开施用可增加肿瘤或转移上可发生病毒增殖的位置或可另外增加肿瘤中积累的病毒的滴度，这可增加抗原或其它化合物从肿瘤中释放的规模，从而引发或增强宿主的抗肿瘤免疫应答，并且还可以任选地增加基于病毒的肿瘤裂解或肿瘤细胞死亡的水平。分开施用病毒可进一步延长对象针对病毒抗原的免疫应答，从而可扩大宿主对病毒积累的肿瘤或转移的免疫应答，并可增加宿主出现抗肿瘤免疫应答的可能性。
当进行分开施用时，每次施用可为相对于其它施用剂量相同或不同的剂量。在一个实例中，所有施用剂量是相同的。在其它实例中，第一剂量可比一或多个后续剂量更大，例如比后续剂量大至少10倍、至少100倍或至少1000倍。在第一剂量大于一或多个后续剂量的分开施用方法的一个实例中，所有后续剂量相对于第一次施用可是相同或较小的量。
分开施用可包括任意数量的两次或更多次施用，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。本领域技术人员可根据本领域已知的用于监测治疗方法和本文提供的其它监测方法，容易地确定进行的施用次数或进行一次或多次额外施用的期望。因此，本文提供的方法包括向对象提供载体细胞/病毒组合的一次或多次施用的方法，其中可通过监测对象来确定施用次数，并基于监测的结果来确定是否提供一次或多次额外施用。可基于多种监测结果(包括但不限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的迹象、新转移的出现或转移的抑制、对象的抗病毒抗体滴度、对象的抗肿瘤抗体滴度、对象的整体健康、对象的体重、病毒仅在肿瘤和/或转移中存在以及正常组织或器官中病毒的存在)来决定是否提供一次或多次额外施用。
施用之间的时间可为多个时间中的任一个。施用之间的时间可为多种因素(包括关于施用次数所描述的监测步骤、对象出现免疫应答的时间、对象从正常组织清除病毒的时间或肿瘤或转移中病毒增殖的时间)中任一个的函数。在一个实例中，时间可为对象出现免疫应答的时间的函数；例如，时间可多于对象出现免疫应答的时间，如多约一周、多约十天、多约两周或多约一个月；在另一实例中，时间可少于对象出现免疫应答的时间，例如少约一周、少约十天、少约两周或少约一个月。在另一实例中，时间可为对象从正常组织清除病毒的时间的函数；例如，时间可多于对象从正常组织清除病毒的时间，如多约一天、多约两天、多约三天、多约五天或多约一周。在另一实例中，时间可为肿瘤或转移中病毒增殖的时间的函数，例如，时间可大于施用表达可检测标记的病毒后在肿瘤或转移中可检测信号出现的时间，例如约3天、约5天、约一周、约十天、约两周或约一个月。
例如，一定量的载体细胞/病毒组合在整个施用周期内施用两次、三次、四次、五次、六次或七次。可在周期的第一天、周期的第一天和第二天、周期的前三个连续天的每一天、周期的前四个连续天的每一天、周期的前五个连续天的每一天、周期的前六个连续天的每一天或周期的前七个连续天的每一天施用所述病毒量。通常，施用周期为7天、14天、21天或28天。取决于患者的反应性或预后，在数月或数年的过程中重复施用周期。
通常，载体细胞/病毒的适当的最大剂量水平或剂量方案是对宿主无毒的水平，不引起脾肿大3倍或更多倍的水平或在约1天后或约3天后或约7天后在正常组织或器官中不导致病毒定植或噬斑的水平。
F.治疗方法和与治疗相协调的监测
本文提供了通过将溶瘤病毒与本文提供的细胞媒介组合施用以促进病毒递送的治疗方法，以治疗患有增生性或炎性疾病或状况的对象。特别地，所述状况与免疫豁免细胞或组织相关。与免疫豁免细胞或组织相关的疾病或状况包括例如增生性病症或状况，包括治疗(例如抑制)癌性细胞、赘生物、肿瘤、转移、癌干细胞以及其它免疫豁免细胞或组织如伤口和受伤或发炎组织。在此类方法的特定实例中，本文提供的组合通过静脉内施用用于全身递送。在其它实例中，本文提供的组合通过肿瘤内注射施用。在实施方案中，对象患有癌症。本文提供的任何细胞媒介均可用于向有需要的对象提供病毒治疗，包括敏化的细胞媒介、受保护的细胞媒介、工程化的细胞媒介和匹配的细胞媒介，其可包括通过本文提供的匹配测定额外筛选的敏化/工程化的细胞媒介。
在本文提供的方法的一些实施方案中，对象除用细胞媒介和病毒的组合治疗外，还额外用含有受保护的细胞媒介的分开的组合物(例如用IFNγ预处理以提供延长的存活和/或局部免疫抑制)治疗。含有受保护的细胞媒介的分开的组合物可与细胞媒介/病毒组合同时施用，或可在施用所述组合之前或之后10小时-3天或更多天施用。在一些实施方案中，在施用所述组合之前或之后24小时施用受保护的细胞媒介。
本文提供的组合可通过单次注射、通过多次注射或连续施用。例如，可通过缓慢输注(包括使用静脉泵、注射器泵、静脉滴注或缓慢注射)来施用组合物。例如，组合物的连续施用可在数分钟至数小时(如1分钟-1小时或约1分钟-1小时，如20-60分钟)的过程中发生。
适用于本文所述的治疗和检测方法的癌症还包括转移的癌症。本领域技术人员理解转移是细胞从原发性肿瘤向非临近部位(通常经由血流或淋巴)的传播，其导致了继发性肿瘤生长的建立。设想用于治疗的癌症的实例包括但不限于黑色素瘤，包括脉络膜和皮肤黑色素瘤；膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、牙龈癌、舌癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胃肠淋巴瘤、脑癌或结肠癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、间皮瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤以及任何其它已转移或有转移风险的肿瘤或赘生物。
本文提供的方法的对象可为任何对象，如动物或植物对象，包括哺乳动物或禽类。例如，动物对象可为人或非人动物，包括但不限于家养动物和农场动物，例如猪、牛、山羊、绵羊、马、猫或犬。在特定的实例中，动物对象是人对象。
本文提供的方法可进一步包括监测对象、监测肿瘤和/或监测施用于对象的病毒的一个或多个步骤。本文提供的方法中可包括多种监测步骤的任何，包括但不限于监测肿瘤大小、监测抗(肿瘤抗原)抗体滴度、监测转移的存在和/或大小、监测对象的淋巴结、监测对象的体重或其它健康指标(包括血液或尿液标志物)、监测抗(病毒抗原)抗体滴度、监测可检测基因产物的病毒表达以及直接监测对象的肿瘤、组织或器官中的病毒滴度。
监视的目的可用于评估对象的健康状况或对象的治疗进展，或可用于确定是否批准进一步施用相同或不同的病毒，或用于确定何时或是否将化合物施用于对象(其中化合物可起到增加治疗方法功效的作用)，或化合物可起到降低施用于对象的病毒的致病性的作用。
可通过本领域已知的多种方法(包括外部评估方法或断层摄影或磁成像方法，如本文所述的检测方法)中的任何来监测肿瘤和/或转移大小。此外，本文提供的例如监测基因表达(例如病毒基因表达)的方法可用于监测肿瘤和/或转移大小。
在数个时间点监测大小可提供有关本文提供的治疗方法的功效的信息。此外，监测肿瘤或转移的大小的增加或降低，并且还可提供关于对象中额外肿瘤和/或转移的存在(即检测和/或诊断)的信息。在数个时间点监测肿瘤大小可提供有关对象中赘生性疾病发展的信息，包括对象中赘生性疾病的治疗(如本文提供的治疗)功效。
本文提供的方法还可包括监测对象的抗体效价，包括应答将病毒递送至对象的细胞媒介的施用而产生的抗体。例如，以本文提供的方法施用的病毒可引起对内源性病毒抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的病毒还可引起对病毒表达的外源基因的免疫应答。在本文提供的方法中施用的病毒还可引起对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对病毒抗原、病毒表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体效价可用于监测病毒毒性、监测治疗方法的效力或监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平的方法中。
在一个实例中，监测抗体效价可用于监测病毒毒性。在将病毒施用于对象后的一段时间内，针对病毒的抗体效价可变化，其中在某些特定时间点，抗(病毒抗原)抗体效价低可表明更高的毒性，而在其它时间点，高抗(病毒抗原)抗体效价可表明更高的毒性。本文提供的方法中使用的病毒可为免疫原性的，因此可在将病毒施用于对象后不久引发免疫应答。
通常，当对象的免疫系统可将病毒从所有正常器官或组织中清除时，对象的免疫系统可针对其快速出现强免疫应答的病毒可为具有低毒性的病毒。因此，在一些实例中，在向对象施用病毒后不久，针对病毒抗原的高抗体效价可表明病毒的低毒性。相反，非高免疫原性的病毒可感染宿主生物而不引发强免疫应答，这可能导致病毒对宿主的更高毒性。因此，在一些实例中，在将病毒施用于对象后不久，针对病毒抗原的高抗体效价可表明低病毒毒性。
在其它实例中，监测抗体效价可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体效价如抗-(肿瘤抗原)抗体效价可表明治疗方法如治疗赘生性疾病的治疗方法的功效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答。因此，通过监测抗(肿瘤抗原)抗体效价，可监测治疗方法引起或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答的功效。
本文提供的治疗方法还可包括向对象施用包含病毒的细胞媒介，所述病毒可在肿瘤中积累并且可引起或增强抗病毒或抗细胞媒介免疫应答。因此，可监测宿主针对在肿瘤或转移中积累的病毒或细胞媒介出现免疫应答的能力，其可表明对象也已出现抗肿瘤免疫应答，或可表明对象可能出现抗肿瘤免疫应答，或可表明对象能够出现抗肿瘤免疫应答。
本文提供的方法还可包括监测对象健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括赘生性疾病治疗方法。如本领域中已知的，监测对象健康可用于确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可包括向对象施用本文提供的细胞媒介和病毒的组合的步骤。当施用于对象时，监测对象健康可用于确定组合中病毒的致病性。如本领域中已知的，可监测用于监测疾病如赘生性疾病、传染性疾病或免疫相关疾病的多种健康诊断方法中的任一种。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、颜色、温度或其它可观察状态可指示对象的健康。此外，来自对象的样品中一种或多种组分的存在或不存在或水平可指示对象的健康。典型的样品可包括血液和尿液样品，其中一种或多种组分的存在或不存在或水平可通过进行例如血液组测试或尿液组诊断测试来确定。表明对象健康的示例性组分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容或反应性蛋白浓度。
G.药物组合物、组合和试剂盒
本文提供了包含本文提供的载体细胞和溶瘤病毒的药物组合物、组合和试剂盒。药物组合物可包括通过本文提供的方法鉴定的匹配的载体细胞和药物载体。匹配的载体细胞可包括通过本文提供的任何方法制备的敏化细胞、工程化细胞或已处理的细胞(例如用用IFNγ预处理的“受保护的”载体细胞)。药物组合物可包括本文提供的溶瘤病毒和药物载体。组合可包括例如：载体细胞和溶瘤病毒；匹配的载体细胞和溶瘤病毒；经敏化的载体细胞和溶瘤病毒；经工程化的载体细胞和溶瘤病毒；任何载体细胞，包括经敏化和工程化的细胞，溶瘤病毒和已处理的(受保护的)载体细胞；溶瘤病毒，已处理的(受保护的)载体细胞和如本文提供的经匹配或修饰的未受保护的载体细胞。组合可包括本文提供的任何载体细胞、溶瘤病毒和可检测化合物；任何载体细胞、溶瘤病毒和治疗化合物；任何载体细胞、溶瘤病毒和病毒表达调节化合物，或它们的任何组合。试剂盒可包括本文提供的一种或多种药物组合物或组合，以及一种或多种组分例如使用说明书、向对象施用药物组合物或组合的装置、向对象施用治疗性或诊断性化合物的装置或用于检测对象中病毒的装置。
药物组合物、组合或试剂盒中包含的载体细胞可包括本文提供的任何载体细胞。药物组合物、组合或试剂盒中包含的溶瘤病毒可包括本文提供的任何病毒。
1.药物组合物
本文提供的药物组合物包含载体细胞、已处理的(受保护的)载体细胞、经敏化的载体细胞、经工程化的载体细胞、溶瘤病毒或本文提供的任何载体细胞和溶瘤病毒，以及合适的药物载体。药学上可接受的载体包括充当病毒的媒介载体或介质的固体、半固体或液体材料。本文提供的药物组合物可以以多种形式配制，例如固体、半固体、水性、液体、粉末或冻干形式。本文提供的包含任何载体细胞(包括已处理的、经敏化的、经工程化的细胞)或溶瘤病毒的示例性药物组合物包括但不限于无菌注射溶液、无菌包装的粉剂、滴眼剂、片剂、丸剂、粉剂、锭剂、香囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(固体或在液体介质中)、油膏、软明胶和硬明胶胶囊以及栓剂。
合适的药物载体的实例是本领域已知的，包括但不限于水、缓冲剂、盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、多种类型的润湿剂、无菌溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、明胶、甘油、碳水化合物(如乳糖、蔗糖、右旋糖、直链淀粉或淀粉)、山梨糖醇、甘露醇、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素和粉末等。本文提供的药物组合物可包含其它添加剂，包括例如抗氧化剂、防腐剂、止痛剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、稀释剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张度剂、媒介、增粘剂、调味剂、甜味剂、乳剂如油/水乳剂、乳化剂和悬浮剂例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、藻酸钠、皂土、卡波姆、角叉菜胶、羧甲基纤维素、纤维素、胆固醇、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯聚醇9、油醇、聚维酮、单硬脂酸丙二醇酯、十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂醇、黄芪胶、黄原胶以及它们的衍生物、溶剂和混杂成分如但不限于结晶纤维素、微晶纤维素、柠檬酸、糊精、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等。此类载体和/或添加剂可通过常规方法配制并且可以以合适剂量施用于对象。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可保护组合物免于在体内降解。用于药物组合物中的其它合适制剂可在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy(2005，第二版，Gennaro&Gennaro，eds.，Lippencott Williams and Wilkins)中找到。
用于注射或粘膜递送的包含本文提供的载体细胞和/或溶瘤病毒的药物制剂通常包含在合适的用于注射或粘膜施用的缓冲液中提供的病毒的水性溶液或在合适的用于注射或粘膜施用的缓冲液中重建的病毒的冻干形式。此类制剂任选地可含有一种或多种本文所述或本领域已知的药学上可接受的载体和/或添加剂。用于口服施用的液体组合物通常包括水性溶液、合适的调味糖浆、水性或油悬浮剂，以及具有食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳剂，以及酏剂和类似药物媒介。
通过使用本领域已知的方法，可配制本文提供的药物组合物以提供本文所述的载体细胞和/或病毒的快速、持续或延迟释放。为制备固体组合物如片剂，将本文提供的载体细胞和/或病毒与药物载体混合以形成固体组合物。任选地，将片剂或丸剂包被或以其它方式混合以提供给予在对象中延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂含有内部剂量和外部剂量组分，后者处于在前者上的包膜形式中。两种组分可通过例如肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料用于此类肠溶层或包衣，包括例如多种聚合酸以及聚合酸与材料如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
用于吸入或吹入的组合物包含在药学上可接受的水性或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮剂以及粉末。这些液体或固体组合物任选地可含有如本文所述或本领域已知的合适的药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。此类组合物例如通过口服或鼻呼吸途径施用以产生局部或全身作用。通过使用惰性气体雾化药学上可接受的溶剂中的组合物。例如直接从雾化装置、附加的面罩帐篷或间歇性正压呼吸机吸入雾化溶液。溶液、混悬剂或粉剂组合物例如通过以适当方式(如使用吸入器)递送制剂的装置经口或经鼻施用。
可将本文提供的药物组合物配制成用于经由透皮递送装置(“贴剂”)透皮递送。此类透皮贴剂用于提供本文提供的病毒的连续或不连续输注。用于递送药剂的透皮贴剂的构建和使用根据本领域已知方法进行(参见例如美国专利号5,023,252)。构建此类贴剂以连续、脉动或按需递送本文提供的载体细胞和/或病毒。
可用于递送病毒的胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂(混合)、胶束、脂质体和脂复合物。示例性的胶体系统是脂质体。可使用器官特异性或细胞特异性脂质体以便仅递送至期望的组织。脂质体的靶向可由本领域技术人员通过应用通常已知的方法来进行。此靶向包括被动靶向(利用脂质体分布至含有窦状隙毛细管的器官中的网状内皮系统(RES)的细胞的自然趋势)或主动靶向(例如通过本领域技术人员已知的方法通过将脂质体与特定配体例如抗体、受体、糖、糖脂和蛋白质偶联)。单克隆抗体可用于经由特异细胞表面配体将脂质体靶向至特定组织，例如肿瘤组织。
2.组合
提供了以下组合：载体细胞和溶瘤病毒；经敏化的载体细胞和溶瘤病毒；经工程化的载体细胞和溶瘤病毒；或任何载体细胞包括经敏化和工程化的细胞，溶瘤病毒和已处理的(受保护的)载体细胞(例如用IFNγ预处理的载体细胞)，该组合任选地可包含根据本文提供的方法匹配和修饰的未受保护的载体细胞。组合可包含第三或第四物质，例如第二病毒或其它治疗剂或诊断剂。组合可包含本文提供的病毒与一种或多种额外的病毒，包括例如一种或多种额外的诊断病毒或治疗病毒。如本文所述，组合可含有含本文提供的病毒的药物组合物；或载体细胞(包括经敏化和工程化的细胞)和病毒；或载体细胞(包括经敏化和工程化的细胞)、病毒和已处理的细胞。组合也可包含用于根据本文提供的方法实现治疗或诊断的任何试剂，例如抗病毒剂或化疗剂。组合还可含有用于调节病毒编码的内源或异源基因的基因表达的化合物。
本文提供的组合可含有载体细胞、病毒和治疗化合物。用于本文提供的组合物的治疗化合物可为例如抗癌或化疗化合物。示例性治疗化合物包括例如细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、酶/pro E药物对、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化疗化合物、抗转移化合物或它们的任何组合。
本文提供的载体细胞和病毒可与抗癌化合物如铂配位络合物组合。示例性的铂配位络合物包括例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3 295和254-S。示例性的化疗剂还包括但不限于甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、Meglamine GLA、戊柔比星、卡莫司汀、聚苯丙生、MM1270、BAY 12-9566、RAS法呢基转移酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、洛美曲索/LY264618、Glamolec、CI-994、TNP-470、和美新/拓扑替康、PKC412、戊司泊达/PSC833、Novantrone/米托蒽醌、Metaret/苏拉明、BB-94/巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、IS1641、ODN 698、TA 2516/马立马司他、BB2516/马立马司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP 2202、FK 317、毕西巴尼/OK-432、戊柔比星/AD 32、锶89/氯化锶、Temodal/替莫唑胺、Yewtaxan/紫杉醇、紫杉醇/紫杉醇、Paxex/紫杉醇、Cyclopax/口服紫杉醇、希罗达/卡培他滨、Furtulon/去氧氟尿苷、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、Ergamisol/左旋咪唑、坎普/左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、Camptosar/伊立替康、拓优得/拉替曲定、克拉立平/克拉屈滨、Caelyx/脂质体多柔比星、Myocet/脂质体多柔比星、Doxil/脂质体多柔比星、Evacet/脂质体多柔比星、福达华/氟达拉滨、法玛新/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺、LU 103793/多拉司他汀、健择/吉西他滨、ZD 0473/AnorMED、YM 116、碘粒子(Iodine seeds)、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/右异环磷酰胺、Ifex/Mesnex/异环磷酰胺、卫萌/替尼泊苷、伯尔定/卡铂、Platinol/顺铂、凡毕士/Eposin/凡毕复/依托泊苷、ZD 9331、泰素帝/多西紫杉醇、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂如美法仑和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷HCl、放线菌素D、柔红霉素HCl、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基脲)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、干扰素α-2b、乙酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、氮芥(氮芥)、巯基嘌呤、美司钠、米托坦(o,p'-DDD)、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸丙卡巴肼、链脲菌素、柠檬酸他莫昔芬、硫代鸟嘌呤、噻替派、硫酸长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、促红细胞生成素、六甲基三聚氰胺(HMM)、白介素2、米托瓜酮(甲基-GAG；甲基乙二醛双胍腙；MGBG)、喷司他丁(2'脱氧助间型霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。可在本文其它地方找到用于本文提供的药物组合物和组合的额外的示例性治疗化合物(例如参见H章节的示例性细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、酶/前药对、抗代谢物、信号传导调节物、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂和化疗化合物)。
在一些实例中，所述组合可包含额外的治疗性化合物，如作为由病毒编码和表达的酶的底物的化合物，或本文提供的或本领域已知与病毒配合作用的其它治疗性化合物。例如，病毒可表达将前药转化为活性化疗药物以杀死癌细胞的酶。因此，本文提供的组合可含有治疗性化合物如前药。示例性的病毒/治疗性化合物组合可包含编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的病毒和前药更昔洛韦。用于提供的组合中的额外的示例性酶/前药对包括但不限于水痘带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷、β-内酰胺酶/头孢菌素-多柔比星、羧肽酶G2/4-[((2-氯乙基)(2-甲磺酰基氧乙基)氨基]苯甲酰基-L-谷氨酸、细胞色素P450/醋氨酚、辣根过氧化物酶/吲哚-3-乙酸、硝基还原酶/CB1954、兔羧酸酯酶/7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羰氧基喜树碱(CPT-11)、蘑菇酪氨酸酶/双-(2-氯乙基)氨基-4-羟基苯基氨基甲酮28、β半乳糖苷酶/1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚，β-葡萄糖醛酸酶/表柔比星-葡糖苷酸、胸苷磷酸化酶/5'-脱氧-5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/胞嘧啶阿拉伯糖苷、β-内酰胺酶和亚麻苦苷酶(linamerase)/亚麻苦苷。用于组合使用的额外的示例性前药也可在本文其它地方找到(参见例如H章节)。本文提供的组合中可包括本文提供的或本领域以其它方式已知的多种已知组合中的任一种。
在一些实例中，所述组合可包括可杀死或抑制病毒生长或毒性的化合物。此类化合物可用于减轻由病毒感染引起的一种或多种不良副作用(参见例如美国专利公开号US2009-016228-A1)。本文提供的组合可含有用于治疗感染的抗生素、抗真菌、抗寄生物或抗病毒化合物。在一些实例中，抗病毒化合物是抑制病毒生长或毒性的化疗剂。
可包括在与本文提供的载体细胞和病毒的组合中的示例性抗生素包括但不限于头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、氨基糖苷、万古霉素和抗假单胞菌β-内酰胺。可包括在与本文提供的载体细胞和病毒的组合中的示例性抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、氨苯砜、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、克霉唑、制霉菌素以及它们的组合。可包括在与本文提供的载体细胞和病毒的组合中的示例性抗病毒剂包括但不限于西多福韦、西多福韦的烷氧基烷基酯(CDV)、环状CDV和(S)-9-(3-羟基-2膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤、5-(二甲氧基甲基)-2'-脱氧尿苷、靛红-β-缩氨基硫脲、N-甲氨基甲硫咪啶(N-methanocarbathymidine)、溴夫定、7-deazaneplanocin A、ST-246、格列卫、2'-β-氟-2',3'-双脱氧腺苷、茚地那韦、奈非那韦、利托那韦、奈韦拉平、AZT、ddI、ddC以及它们的组合。通常，与抗病毒剂的组合包含已知对所述组合的病毒有效的抗病毒剂。例如，组合可包含痘苗病毒和抗病毒化合物，例如西多福韦、西多福韦的烷氧基烷基酯、更昔洛韦、阿昔洛韦、ST-246、格列卫及其衍生物。
在一些实例中，所述组合可包括可检测化合物。可检测化合物可包括例如配体、底物或其它化合物，它们可与病毒或载体细胞编码和表达的蛋白质或RNA相互作用和/或特异性结合，并可提供可检测信号，例如可通过体层摄影术、光谱、磁共振或其它已知技术检测的信号。在一些实例中，蛋白质或RNA是外源蛋白质或RNA。在一些实例中，由病毒或载体细胞表达的蛋白质或RNA修饰可检测化合物，其中修饰的化合物发射可检测信号。示例性可检测化合物可为或可包含成像剂，例如磁共振、超声或体层摄影成像剂，包括放射性核素。可检测化合物可包括本文其它地方提供的或本领域已知的多种化合物中的任何。可由病毒或载体细胞表达的示例性蛋白质以及用于检测的可检测化合物组合包括但不限于萤光素酶和萤光素，β-半乳糖苷酶和(4,7,10-三(乙酸)-1-(2-β-吡喃半乳糖基乙氧基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)钆(Egad)和本领域已知的其它组合。
在一些实例中，所述组合可包括调节病毒或载体细胞编码的一种或多种基因的表达的基因表达调节化合物。调节基因表达的化合物是本领域已知的，包括但不限于转录活化剂、诱导剂、转录抑制剂、RNA聚合酶抑制剂和RNA结合化合物如siRNA或核酶。本领域已知的多种基因表达调节化合物中的任何都可包括在本文提供的组合中。通常，本文提供的组合中包含在病毒中的基因表达调节化合物将是可与一种或多种对基因表达具有活性的化合物例如组合中病毒或载体细胞的转录因子或RNA结合、抑制或反应的化合物。示例性的病毒或载体细胞/表达调节剂组合可为编码嵌合转录因子复合物的病毒或载体细胞，所述嵌合转录因子复合物具有与酵母GAL4 DNA结合结构域融合的突变型人孕激素受体、单纯疱疹病毒蛋白VP16的活化结构域并且还含有在腺病毒主要晚期E1B TATA盒上游的一系列GAL4识别序列的合成启动子，其中该化合物可为RU486(参见例如Yu等(2002)Mol GenetGenomics 268：169-178)。本领域已知的多种其它病毒或载体细胞/表达调节剂组合也可包括在本文提供的组合中。
在一些实例中，所述组合可包含纳米粒子。纳米粒子可被设计为使得它们携带一种或多种本文提供的治疗剂。另外，可将纳米粒子设计为携带将纳米粒子靶向肿瘤细胞的分子。在一个非限制性实例中，纳米粒子可用放射性核素和任选地与肿瘤相关抗原免疫反应性的抗体包被。
在一些实例中，所述组合可包含一种或多种另外的治疗和/或诊断病毒或其它治疗和/或诊断微生物(例如治疗和/或诊断细菌)用于诊断或治疗。示例性的治疗和/或诊断病毒是本领域已知的，包括但不限于治疗和/或诊断痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒和呼肠孤病毒。上文描述了示例性溶瘤病毒。
3.试剂盒
本文提供的载体细胞、病毒、药物组合物或组合可包装成试剂盒。试剂盒可任选地包括一种或多种组分，例如使用说明书、装置和其它试剂以及组分例如用于实施方法的管、容器和注射器。示例性试剂盒可包含本文提供的载体细胞和病毒，或受保护的载体细胞、未受保护的载体细胞和病毒；并且可任选地包括使用说明书、用于在对象中检测载体细胞和/或病毒的装置、用于向对象施用载体细胞和病毒的装置或用于向对象施用另外的药剂或化合物的装置。
在一个实例中，试剂盒可包含说明书。说明书通常包括描述载体细胞和病毒以及任选地描述试剂盒中包括的用于施用载体细胞和病毒的其它组分以及施用方法(包括确定对象正常状态、合适剂量和合适施用方法的方法)的有形表达。说明书还可包括在治疗时间内监测对象的指导。
在另一个实例中，试剂盒可包含用于检测对象中的载体细胞和/或病毒的装置。用于检测对象中的载体细胞和/或病毒的装置可包括用于检测例如从荧光素酶发射的或从诸如绿色或红色荧光蛋白的荧光蛋白发荧光的光的弱光成像装置、核磁共振测量装置(例如MRI或NMR装置)、断层扫描仪(例如PET、CT、CAT、SPECT或其它相关扫描仪)、超声装置或其它可用于检测对象内载体细胞和/或病毒表达的蛋白质的装置。通常，试剂盒的装置将能够检测由试剂盒的载体细胞和/或病毒表达的一种或多种蛋白质。包含载体细胞、病毒和检测装置的多种试剂盒中的任何都可包括在本文提供的试剂盒中，例如表达萤光素酶的载体细胞或病毒和弱光成像仪或表达荧光蛋白如绿色或红色荧光蛋白的载体细胞或病毒以及弱光成像仪。
本文提供的试剂盒还可包括用于向对象施用载体细胞和病毒的装置。在本文提供的试剂盒中可包括本领域已知的用于施用药物、药物组合物和疫苗的多种装置中的任何。示例性的装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器例如眼滴管。例如，要例如通过静脉内注射全身性递送的载体细胞和病毒组合包括在具有皮下针和注射器的试剂盒中。通常，用于施用试剂盒的载体细胞和病毒的装置将与试剂盒的载体细胞和病毒相容；例如无针注射装置(例如高压注射装置)可包含在带有不被高压注射破坏的载体细胞和病毒的试剂盒中，但通常不包含在带有被高压注射破坏的载体细胞和病毒的试剂盒中。
本文提供的试剂盒还可包括用于向对象施用另外的药剂或化合物的装置。在本领域提供的试剂盒中可包括本领域已知的用于向对象施用药物的多种装置中的任何。示例性装置包括但不限于皮下针、静脉内针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器例如滴眼管。通常，施用试剂盒化合物的装置将与化合物的所需施用方法相容。例如，要全身或皮下递送的化合物可包括在具有皮下针和注射器的试剂盒中。
本文提供的试剂盒还可包括用于向对象施加能量的任何装置，例如电磁能。此类装置包括但不限于激光器、发光二极管、荧光灯、二向色灯和灯箱。试剂盒还可包括诸如内窥镜或光纤导管之类的用于使能量向对象内部暴露的装置。
H.与细胞媒介+病毒治疗一起施用的额外疗法
使用本文提供的含有溶瘤病毒和本文提供的用于将溶瘤病毒递送至需要病毒疗法的对象的细胞媒介的组合、组合物或试剂盒的病毒疗法可单独使用或与其它疗法或治疗进一步组合使用。本文提供的组合或组合物可进一步与其它治疗剂或药理剂或治疗(例如程序)一起、在其之前、间歇地或在其之后共同配制或共同施用。例如，此类药剂包括但不限于其它生物制剂、抗癌剂、小分子化合物、分散剂、麻醉剂、检查点抑制剂、血管收缩剂、外科手术、放射、化疗剂、生物药剂、多肽、抗体、肽、小分子、基因治疗载体、病毒和DNA以及它们的组合。此类药剂还可包括一种或多种减轻、减少或防止副作用的物质。在某些情况下，可将组合疗法与一种或多种在治疗之前去除原发性肿瘤或对对象进行免疫抑制的癌症治疗联合使用。例如，除本文提供的组合疗法外还可使用额外的化疗或放疗。此类额外的治疗可具有削弱对象的免疫系统的作用。在其它实例中，可能不需要外科手术去除和/或免疫系统削弱治疗。可在其中组合的示例性其它方法包括施用在不削弱免疫系统的情况下降低肿瘤或赘生性细胞的增殖速率的化合物(例如通过施用肿瘤抑制化合物或通过施用肿瘤细胞特异性化合物)或施用血管生成-抑制化合物。
一或多种第二药剂的制剂或一或多种治疗可立即施用，或可分为许多较小的剂量以间隔一定时间施用。所选择的药剂/治疗制剂可在治疗时间的过程中，例如在数小时、数天、数周或数月内以一种或多种剂量施用。在某些情况下，连续施用是有用的。可理解，确切的剂量和施用过程取决于适应症和患者的耐受性。通常，本文的第二药剂/治疗的给药方案是本领域技术人员已知的。
例如，本文提供的组合治疗可与以下(包括但不限于)的一种或多种进一步组合使用：免疫共刺激激动剂(例如B7家族(CD28、ICOS)；TNFR家族(4-1BB、OX40、GITR、CD40、CD30、CD27)；LIGHT(LTα)；BiTE；靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞和TCR转基因T细胞；检查点抑制剂(靶包括PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO1和IDO2、CTNNB1(β-连环蛋白)、SIRPα、VISTA、LIGHT、HVEM、LAG3、TIM3、TIGIT、半乳凝素9、KIR、GITR、TIM1、TIM4、CEACAM1、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD112、CD137(4-1BB)、CD155、CD160、CD200、CD226、CD244(2B4)、CD272(BTLA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、ICOS、A2aR、A2bR、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4和OX40/OX-40L、MDR1、精氨酸酶、iNOs、IL-10、TGF-β、pGE2、STAT3、VEGF、KSP、HER2、Ras、EZH2、NIPP1、PP1、TAK1和PLK1a))；以及化疗化合物和抗体。
除本文提供的病毒疗法外，用于施用的示例性化疗化合物和抗体可包括细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素和免疫治疗剂。
可在本文的组合疗法施用之后、同时或之前施用的示例性抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；Avicin；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；阿仑珠单抗；阿利维a酸(9-顺式维甲酸)；别嘌呤醇；六甲蜜胺；Alvocidibs；安巴腙；安波霉素；阿美蒽醌；氨磷汀；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他滨；氨茴霉素；Apaziquones；Argimesnas；三氧化二砷；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿扎胞苷；Azetepas；阿佐霉素；Banoxantrones；巴塔布林；巴马司他；BCG Live；贝那昔滨；苯达莫司汀；Benzodepas；贝沙罗汀；贝伐单抗；比卡鲁胺；比他舍平；比立考达；比生群；比生群；比那非二甲酸酯(Bisnafide Dimesylate)；比折来新；博来霉素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度钛；白消安；放线菌素；卡普睾酮；卡尼替尼(Canertinib)；卡培他滨；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡波醌；卡莫氟；卡莫司汀与聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布；西马多丁；苯丁酸氮芥；塞奥罗奈；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克兰氟脲；氯法拉滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷脂质体；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；达依泊汀α；柔红霉素脂质体；柔红霉素/道诺霉素；柔红霉素；地西他滨；Denileukin Diftitoxes；右尼古地平；地塞那铂(Dexonnaplatin)；右雷佐生；地扎胍宁；地吖醌；Dibrospidiums；地诺孕素；地那林；Disermolide；多西他赛；Dofequidars；去氧氟尿苷；多柔比星脂质体；盐酸多柔比星；盐酸多柔比星脂质体注射剂；多柔比星；屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依考莫司汀；依达曲沙；依地卡因(Edotecarin)；依氟鸟氨酸；依拉克达；依利奈法德；艾略特B溶液(Elliott's B Solutions)；依沙芦星；乙嘧替氟；恩洛铂；恩普氨酯；Enzastaurins；依匹哌啶；表柔比星；阿法依伯汀；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌莫司汀；依他硝唑；依托格鲁；磷酸依托泊苷；依托泊苷VP-16；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；依西美坦；依昔舒林；法倔唑；法扎拉滨；芬尼替尼(Fenretinides)；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟维司群；加柔比星；加洛他滨；吉西他滨；吉妥珠单抗/奥佐米星；吉罗酚；Gimatecans；吉美嘧啶；格洛沙腙；葡磷酰胺；醋酸戈舍瑞林；羟基脲；依博单抗(Ibritumomab)/Tiuxetans；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；伊洛马司他；甲磺酸伊马替尼；伊美克；英丙舒凡；Indisulams；双丙氧亚胺醌；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α；干扰素β；干扰素γ；干扰素；白介素2和其它白介素(包括重组白介素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；异丙铂；伊立替康；伊索拉定；伊沙贝比隆(Ixabepilone)；酮曲沙；L-阿拉诺新；兰瑞肽；拉帕替尼(Lapatinib)；来多蒽琼；来曲唑；醛氢叶酸；亮丙瑞林；Leuprorelins(亮丙瑞林)；左旋咪唑；来沙骨化醇；利阿唑；洛铂；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；Lonafarnibs；洛索蒽醌；勒托替康；马磷酰胺；甘露舒凡；马立马司他；马索罗酚；美坦辛；氮芥；氮芥/氮芥；醋酸甲地孕酮；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美法仑L-PAM；美诺立尔；美雄烷；巯嘌呤；6-巯基嘌呤；美司钠；美替辛德；甲氨蝶呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯氨啶；美妥替哌；米帕；米泼昔芬；米索硝唑；米丁度胺；Mitocarcins；丝裂红素；米托拉酮；米托洁林；米托胍腙；米托马星；丝裂霉素C；丝裂霉素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立宾；莫法罗汀；莫哌达醇；Mubritinibs；霉酚酸；苯丙酸诺龙；奈达铂；奈扎比(Nelzarabine)；奈莫柔比星；硝氨丙吖啶；诺考达唑；若莫单抗；诺加霉素；诺拉曲塞；Nortopixantrones；奥曲肽；奥普瑞白介素；奥马铂；Ortataxels；奥替拉西；奥沙利铂；奥昔舒仑；氧芬胂；紫杉醇；帕玛二磷酸；Patubilones；培加酶；培门冬酶；培非司亭；培得星；培利霉素；Pelitrexols；培美曲塞；溴新斯的明；喷司他丁；培洛霉素；培磷酰胺；哌立福辛；Picoplatins；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡罗蒽醌；Pixantrones；Plevitrexeds；普利米奇光辉霉素(PlicamycidMithramycins)；普卡霉素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆钠；卟菲尔钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；普罗帕脒；螺丙醇；嘌嘧替派；嘌呤霉素；吡唑霉素；奎纳克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔单抗；罗谷亚胺；罗喹美克；链黑霉素；Sabarubicins；沙芬戈；沙格司亭；沙铂；司铂；司莫司汀；辛曲秦；西左非兰；索布佐生；索拉非尼；Sparfosates；磷乙天冬氨酸；司帕霉素；锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；螺铂；角鲨胺；链黑霉素；链伐立星；链佐星；磺磷酰胺；磺氯苯脲；苹果酸舒尼替尼；6-硫鸟嘌呤(6-TG)；Tacedinalines；滑石粉；他利霉素；他莫司汀；他莫昔芬；Tariquidars；牛磺莫司汀；Tecogalans；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷/VM-26；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；硫米嘌呤；噻唑羧胺核苷；噻氯咪索；替洛隆；汀考达；噻莫西酸；替拉扎明；Topixantrones；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲贝替定(海鞘素743)；曲妥珠单抗；曲托龙；维甲酸/ATRA；曲西立滨；曲洛司坦；三甲曲沙；四硝酸三铂(Triplatin Tetranitrates)；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；乌苯美司；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；戊柔比星；伐司朴达；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春氟宁；长春米特；长春甘酯；长春西醇；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春曲醇；长春利定；伏氯唑；黄霉素A(胍甲环素)；折尼铂；亚苄维C[2-H]；净司他丁；唑来膦酸；佐柔比星；和Zosuquidars，例如：阿地白介素(例如
Figure BDA0002931076310000651
)；阿仑珠单抗(例如
Figure BDA0002931076310000652
)；阿利维A酸(例如
Figure BDA0002931076310000653
)；别嘌呤醇(例如
Figure BDA0002931076310000654
)；六甲蜜胺(例如
Figure BDA0002931076310000655
)；氨磷汀(例如
Figure BDA0002931076310000656
)；阿那曲唑(例如
Figure BDA0002931076310000657
)；三氧化二砷(例如
Figure BDA0002931076310000658
)；天冬酰胺酶(例如
Figure BDA0002931076310000659
)；BCG Live(例如
Figure BDA00029310763100006510
)；贝沙罗汀(例如
Figure BDA00029310763100006511
)；贝伐单抗
Figure BDA00029310763100006512
博来霉素(例如
Figure BDA00029310763100006513
)；静脉白消安(例如
Figure BDA00029310763100006514
)；白消安口服液(例如
Figure BDA00029310763100006515
)；卡普睾酮(例如
Figure BDA00029310763100006516
)；卡培他滨(例如
Figure BDA00029310763100006517
)；卡铂(例如
Figure BDA00029310763100006518
)；卡莫司汀(例如
Figure BDA00029310763100006519
)；卡莫司汀与聚苯丙生(例如
Figure BDA00029310763100006520
Wafer)；塞来昔布(例如
Figure BDA00029310763100006521
)；苯丁酸氮芥(例如
Figure BDA00029310763100006522
)；顺铂(例如
Figure BDA00029310763100006523
)；克拉屈滨(例如
Figure BDA00029310763100006524
)；环磷酰胺(例如
Figure BDA00029310763100006525
Figure BDA00029310763100006526
阿糖胞苷(例如
Figure BDA00029310763100006527
)；阿糖胞苷脂质体(例如
Figure BDA00029310763100006528
)；达卡巴嗪(例如DTIC-Dome)：放线菌素D(例如
Figure BDA00029310763100006529
)；达依泊汀α(例如
Figure BDA00029310763100006530
)；柔红霉素脂质体(例如
Figure BDA00029310763100006531
)；柔红霉素/道诺霉素(例如
Figure BDA00029310763100006532
)；DenileukinDiftitoxes(例如
Figure BDA00029310763100006533
)；右雷佐生(例如
Figure BDA00029310763100006534
)；多西紫杉醇(例如
Figure BDA00029310763100006535
)；多柔比星(例如
Figure BDA00029310763100006536
)；多柔比星脂质体，包括多柔比星HCL脂质体注射剂(例如
Figure BDA00029310763100006537
)；丙酸甲雄烷酮(例如
Figure BDA00029310763100006538
和
Figure BDA00029310763100006539
注射剂)；艾略特B溶液(例如Elliot’s B
Figure BDA00029310763100006540
)；表柔比星(例如
Figure BDA00029310763100006541
)；阿法依伯汀(例如
Figure BDA00029310763100006542
)；雌莫司汀(例如
Figure BDA00029310763100006543
)；磷酸依托泊苷(例如
Figure BDA00029310763100006544
)；依托泊苷VP-16(例如
Figure BDA00029310763100006545
)；依西美坦(例如
Figure BDA00029310763100006546
)；非格司亭(例如
Figure BDA00029310763100006547
)；氟尿苷(例如
Figure BDA00029310763100006548
)；氟达拉滨(例如
Figure BDA00029310763100006549
)；氟尿嘧啶，包括5-FU(例如
Figure BDA00029310763100006550
)；氟维司群(例如
Figure BDA00029310763100006551
)；吉西他滨(例如
Figure BDA00029310763100006552
)；吉妥珠单抗/奥佐米星(例如
Figure BDA00029310763100006553
)；醋酸戈舍瑞林(例如
Figure BDA00029310763100006554
)；羟基脲(例如
Figure BDA00029310763100006571
)；依博单抗/Tiuxetans(例如
Figure BDA00029310763100006555
)；伊达比星(例如
Figure BDA00029310763100006556
)；异环磷酰胺(例如
Figure BDA00029310763100006557
)；甲磺酸伊马替尼(例如
Figure BDA00029310763100006558
)；干扰素α-2a(例如
Figure BDA00029310763100006559
)；干扰素α-2b(例如INTRON
Figure BDA00029310763100006560
)；伊立替康(例如
Figure BDA00029310763100006561
)；来曲唑(例如
Figure BDA00029310763100006562
)；醛氢叶酸(例如
Figure BDA00029310763100006563
)；左旋咪唑(例如
Figure BDA00029310763100006564
)；洛莫司汀/CCNU(例如
Figure BDA00029310763100006565
)；氮芥/氮芥(例如
Figure BDA00029310763100006566
)；醋酸甲地孕酮(例如
Figure BDA00029310763100006567
)；美法仑/L-PAM(例如
Figure BDA00029310763100006568
)；巯基嘌呤，包括6-巯基嘌呤(6-MP；例如
Figure BDA00029310763100006569
)；美司钠(例如
Figure BDA00029310763100006570
)；甲氨蝶呤；甲氧沙林(例如
Figure BDA0002931076310000661
)；丝裂霉素C(例如
Figure BDA0002931076310000662
)；米托坦(例如
Figure BDA0002931076310000663
)；米托蒽醌(例如
Figure BDA0002931076310000664
)；苯丙酸诺龙(例如
Figure BDA0002931076310000665
)；若莫单抗(例如
Figure BDA0002931076310000666
)；奥普瑞白介素(例如
Figure BDA0002931076310000667
)；奥沙利铂(例如
Figure BDA0002931076310000668
)；紫杉醇(例如
Figure BDA0002931076310000669
)；帕玛二磷酸(例如
Figure BDA00029310763100006610
)；培加酶(例如
Figure BDA00029310763100006611
)；培门冬酶(例如
Figure BDA00029310763100006612
)；培非司亭(例如
Figure BDA00029310763100006613
)；喷司他丁(例如
Figure BDA00029310763100006614
)；哌泊溴烷(例如
Figure BDA00029310763100006615
)；普卡霉素/光辉霉素(例如
Figure BDA00029310763100006616
)；卟吩姆钠(例如
Figure BDA00029310763100006617
)；丙卡巴肼(例如
Figure BDA00029310763100006618
)；奎纳克林(例如
Figure BDA00029310763100006619
)；拉布立酶(例如
Figure BDA00029310763100006620
)；利妥昔单抗(例如
Figure BDA00029310763100006621
)；沙格司亭(例如
Figure BDA00029310763100006622
)；链佐星(例如
Figure BDA00029310763100006623
)；苹果酸舒尼替尼(例如
Figure BDA00029310763100006624
)；滑石粉(例如
Figure BDA00029310763100006625
)；他莫昔芬(例如
Figure BDA00029310763100006626
)；替莫唑胺(例如
Figure BDA00029310763100006627
)；替尼泊苷/VM-26s(例如
Figure BDA00029310763100006628
)；睾内酯(例如
Figure BDA00029310763100006629
)；硫鸟嘌呤，包括6-硫鸟嘌呤(6-TG)；塞替派(例如
Figure BDA00029310763100006630
)；托泊替康(例如
Figure BDA00029310763100006631
)；托瑞米芬(例如
Figure BDA00029310763100006632
)；托西莫单抗(例如
Figure BDA00029310763100006633
)；曲妥珠单抗(例如
Figure BDA00029310763100006634
)；维甲酸/ATRA(例如
Figure BDA00029310763100006635
)；尿嘧啶氮芥；戊柔比星(例如
Figure BDA00029310763100006636
)；长春碱(例如
Figure BDA00029310763100006637
)；长春新碱(例如
Figure BDA00029310763100006638
)；长春瑞滨(例如
Figure BDA00029310763100006639
)；和唑来膦酸(例如
Figure BDA00029310763100006640
)。
可在本文提供的细胞和病毒(用于病毒疗法的组合)的施用之后、同时或施用之前施用的示例性检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4剂、抗PD-1剂和其它，以下为其示例：
Figure BDA00029310763100006641
与本文提供的用于病毒疗法组合施用的额外治疗可包括一种或多种免疫抑制药物，例如糖皮质激素(例如强的松、地塞米松、氢化可的松)；钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司)；mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)；甲氨蝶呤；来那度胺；咪硫唑嘌呤；巯嘌呤；氟尿嘧啶；环磷酰胺；TNFα阻断抗体(例如英利昔单抗/类克、依那西普/恩利，阿达木单抗/修美乐)和氟达拉滨。
I.治疗的癌症类型
本文公开的方法可用于治疗任何类型的癌症或转移，包括实体瘤和血液恶性肿瘤。可通过本文公开的方法治疗的肿瘤包括但不限于膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、CNS癌、胶质瘤肿瘤、子宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌症、胃癌、上皮内瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌症例如淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳腺肿瘤、肥大细胞瘤、脑瘤、黑色素瘤、腺鳞状癌、类癌肺肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、伯基特淋巴瘤、小胶质瘤、神经母细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖鳞状细胞癌、可传染性性病瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、塞尔托利氏细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤、粒细胞肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞肿瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、眼瘤、包皮纤维肉瘤、溃疡鳞状细胞癌、包皮癌、结缔组织肿瘤、肥大细胞瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、肺腺瘤病、肺肉瘤、劳氏肉瘤、网状内皮增生、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血球组织增生、视网膜母细胞瘤、肝肿瘤、淋巴肉瘤、浆细胞样白血病、鳔肉瘤(鱼中)、干酪性淋巴结炎、肺癌、胰岛素瘤、淋巴瘤、肉瘤、唾液腺肿瘤、神经瘤、胰岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自转移性黑色素瘤；食道和胃腺癌；胆管癌(任何阶段)；胰腺癌(任何阶段)；胆囊癌(任何阶段)；高级粘液性阑尾癌(任何阶段)；高级胃肠神经内分泌癌(任何阶段)；间皮瘤(任何阶段)；软组织肉瘤；前列腺癌；肾细胞癌；肺小细胞癌；肺非小细胞癌；头颈鳞状细胞癌；结直肠癌；卵巢癌；肝细胞癌和胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑色素瘤。
实施例
包括以下实施例仅出于说明目的，并且不旨在限制主题的范围。
实施例1
细胞分离与培养
A.脂肪来源干细胞(ADSC)
I.脂肪基质血管部分的提取与制备
向对象施用局部麻醉，含0.5％利多卡因0.5％和1：400,000肾上腺素和8.4％HCO3，滴定至pH值为7.4(通常总体积为60cc中的5cc HCO3)。然后对象利用来自CellSurgical Network，Beverly Hills，CA，USA(CSN)的商标
Figure BDA0002931076310000671
装置下可获得的细胞获取和封闭系统收集和处理系统进行抽脂术，该系统包括脂肪处理单元(用于吸脂的气密注射器)和2.5mm-3mm套管。杆菌肽软膏和创可贴与压缩绷带一起固定在伤口上。
在本文提供的实施例中使用了衍生自supra advential脂肪基质细胞的扩增的脂肪干细胞。含有ADSC的基质血管部分(SVF)是根据以下方案在封闭系统中制备的：
a.用于获取和处理脂肪干细胞的封闭系统，例如CSN
Figure BDA0002931076310000673
(可从CSN获得)将脂肪的收集物提取至60cc TP-101注射器中(一次性使用无菌气密性脂肪加工注射器)
b.以2800rpm离心3分钟
c.通过TP-109封闭系统清除游离脂肪酸和碎片(局部/血液)
d.将25cc的浓缩脂肪转移至TP-102注射器(SVF处理注射器)
e.加入预热(38℃)的25cc Roche
Figure BDA0002931076310000672
Time Machine Accelerator(GMP级胶原酶)，其含有12.5Wunsch单位的酶(1Wunsch单位＝1000胶原降解单位(CDU))
f.在38℃温育30-45分钟
g.200g离心4分钟
h.除去除底部3cc-10cc外的上清液
i.加入50cc D5LR(乳酸林格氏液和5％葡萄糖)作为清洗液以去除胶原酶残留物并在200g离心4分钟
j.再重复2次，共3次洗涤
k.除去所有上清液，留3cc-10cc沉淀收集物，即基质血管部分
l.通过100微米过滤器将SVF转移至标记的20cc注射器中
m.收集SVF样品并鉴定其细胞数量、活力并确认无结块或碎片
n.将各细胞悬液的等分试样留作细胞分选、内毒素测试和无菌染色。确认内毒素单位水平(EU)小于或等于5EU/kg/hr以及阴性革兰氏染色结果后，释放SVF用于注射
o.将细胞重悬于20ml的Isolyte中。通过18号针将细胞悬液吸入注射器中用于注射；多达1亿个活细胞用于注射
p.然后将注射器放入标有对象姓名和病历号的密封标本袋中。
ii.细胞培养
如上所述，在获得知情书面同意(International Cell Surgical Society；IRB#ICSS-2016-024)后，作为IRB批准方案的一部分获得了非癌症供体基质血管部分(SVF)。将新鲜的SVF铺板以附着过夜，并在第二天清洗以去除未附着的细胞和碎片。每3-4天更换一次培养基，直至间充质干细胞(MSC)开始生长并达到80％融合。将细胞扩增至80％融合并使用TrypLETMExpress(Life Technologies，(1×)，无酚红，目录号12604021，3分钟，37℃恒温箱)每3-4天传代，最多10代。将脂肪来源干细胞(ADSC)扩增并维持在补充有L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中的5％人血小板提取物(Cook Regentec，Stemulate，PL-SP-100)中。从6个供体分离ADSC并分别标记为RM20、RM35、RM47、RM48、RM58和BH21。
iii.组成性表达eGFP(增强型绿色荧光蛋白)的脂肪来源干细胞的生成
第0代RM20脂肪来源干细胞工程化为在CMV启动子(UniProtKB-C5MKY7(C5MKY7_HCMV))控制下表达eGFP(Clontech，Palo Alto，CA)。含有eGFP的慢病毒载体(可从VectorBuilder Inc.，Santa Clara，CA获得的VectorBuilder)用于将eGFP导入ADSC中进行组成型表达。使用BioRAD S3细胞分选器在第1代和随后第2代分选了10,000个eGFP阳性细胞。通过使用Keyence多合一荧光显微镜BZ-X700系列的荧光显微术和流式细胞术确认eGFP表达。
B.癌细胞
在补充有10％胎牛血清(Omega Scientific，FB-02，USDA认证，热失活)、2mM L-谷氨酰胺(ThermoFisher Scientific，25030081，100x)和青霉素/链霉素(LifeTechnologies，15140122，100x)的RPMI 1640(K562)(Gibco，货号：21870092)或DMEM(B16，A549)(Gibco，货号：11960069)中繁殖B16 F10黑色素瘤、A549肺癌和K562细胞。
C.外周血单个核细胞(PBMC)
在获得知情书面同意后(International Cell Surgical Society；IRB#ICSS-2016-024)，作为IRB批准方案的一部分获得了PBMC。使用标准Ficoll协议(Ficoll-PaquePlus，GE Healthcare，目录号95021-205)分离PBMC。从8个供体分离PBMC并标记为BH62、RM20、RM47、RM48、RM52、RM53、SIBD01和SIBD02。
D.共培养物
共培养物可包含患者的免疫细胞(例如PBMC或全血)以及基于细胞的递送媒介/载体细胞(包括干细胞或肿瘤细胞)，并带有或不带有待测试的溶瘤病毒，例如痘苗病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒等。
分离患者的血液并将其处理以分离PBMC和血清后，将患者的PBMC与不同的带有或不带有溶瘤病毒的载体细胞共培养，以确定载体细胞相容性。待测试的共培养物(包括对照)包括例如：PBMC单独+/-病毒；载体细胞单独+/-病毒；PBMC+载体细胞+/-病毒；载体细胞单独+病毒+/-血清(10％-50％)+/-补体的热或药理学(眼镜蛇毒因子或等价物)失活(用于患者血清抗性筛查)；PBMC+载体细胞+病毒+/-血清(10％-50％)+/-补体的热或药理学(眼镜蛇毒因子或等价物)失活(用于患者血清抗性筛查)；肝素化全血代替上述PBMC(用于自然环境测试)。
然后使用多种测定和测试分析共培养物(包括细胞和/或上清液)以确定病毒扩增和感染以及免疫抑制/免疫刺激作用的水平，所述测定和测试包括但不限于：例如，表面和细胞内多参数流式细胞术或等价类似技术如飞行时间细胞术(CyTOF)；酶联免疫吸附测定(ELISA)；酶联免疫斑点(ELISPOT)测定；病毒噬斑测定(VPA)；定量PCR(qPCR)；生物发光测定；荧光显微术和细胞内染色。
例如，使用门控参数进行流式细胞术以鉴定包括T细胞(例如但不限于CD3、CD4、CD8)、NK细胞(例如但不限于NKp46，CD16、CD56))和NKT细胞(例如但不限于CD3、CD16、CD56、NKp46、aGalCer-CD1d四聚体)的特定免疫细胞群。通过分析多种活化/效应子功能参数来评价免疫应答，这些参数包括但不限于：CD69、CD25、CD71、CD27(CD70L)、CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)、CD44、CD45RA、CD45RO、CD278(ICOS)、CD127(IL-7RA)、CD183(CXCR3)、CD197(CCR7)、CD39、CD73、CD314(NKG2D)、PD-1、CTLA-4、IFNα/β、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、GM-CSF、IL-17、IL-6、CD107a、CD107b、TGFβ、穿孔素、粒酶B、IL-1a/IL-1b、G-CSF、RANTES、EXOTAXIN、MIP-1b、MCP-1、EGF、HGF、VEGF、IL-1RA、IL-7、IP-10、IL-2R、MIG和IL-8等。
例如，将PBMC与有或无痘苗病毒(50μl)的ADSC(50μl)在96孔平底板上并在总共200μl R10培养基(补充10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI 1640)中共培养(100μl)48小时。在一些实验中，将病毒(50μl)和ADSC(50μl)预混并在定轨振荡器上于37℃(培养箱)搅动1h，然后不清洗所有未结合的病毒，将(100μl混合物)添加至PBMC中。48小时温育期结束后，直接回收细胞进行染色和流式细胞术分析，或如需要，用K562细胞或莫能星/布雷菲德菌素A(50μl)与PMA/离子霉素(50μl)一起额外刺激4-5小时。
实施例2
来自对象的免疫细胞(外周血单个核细胞(PBMC))存在或不存在的情况下脂肪来源干细胞(ADSC)对病毒扩增和感染的影响
对于特定病毒，扩增病毒的载体细胞被鉴定为将病毒递送至对象进行病毒治疗的候选物。该实施例评价了来源于对象的免疫细胞对载体细胞促进病毒扩增和感染的能力的影响。PBMC用于此目的。载体细胞影响病毒感染和扩增的因素包括例如存在或不存在干扰素(IFN)和/或存在或不存在PBMC，通过测量存在的病毒量的适当测定进行评估。此类测定包括例如病毒噬斑测定(VPA)、qPCR(或测量存在的病毒DNA基因组量的任何其它测定)、ELISA(测定病毒编码的或工程化的报告蛋白或酶，例如但不限于β-半乳糖苷酶)和生物发光测定(测量病毒编码的发光报告蛋白，例如但不限于荧光素酶)。可使用例如流式细胞术和荧光显微镜术监测载体细胞、PBMC和肿瘤细胞的病毒感染。
A.病毒噬斑分析(VPA)
可存储实施例1中所述的共培养物，然后使用VPA进行分析，以对在不同条件下以及患者来源的免疫细胞和基于细胞的媒介的不同组合下的病毒颗粒扩增进行量化。
含病毒样品存储在-80℃，进行三次冷冻(-80℃)/融化(+37℃)循环，然后在冰冷的水中超声处理3次，每次1分钟，间隔1分钟。将经超声处理的样品在痘苗病毒感染培养基(补充有2％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM)中系列稀释。在24孔板中一式两份地进行噬斑测定。将CV-1猴肾细胞以每孔200,000个铺板于1mL D10培养基中，过夜。吸出上清液，并将含病毒样品的10倍连续稀释液以200μL/孔的浓度施加至CV-1单层。将板在37℃(培养箱)中温育1小时，每20分钟手动摇动一次。将1mL CMC培养基轻轻铺在细胞顶部，并将板温育48小时。通过室温下用结晶紫溶液(1.3％结晶紫(Sigma-Aldrich，C6158)、5％乙醇(纯乙醇，分子生物学级，VWR，71006-012)、30％甲醛(37％v/v甲醛，Fisher，目录号F79-9)和双蒸馏水)冲洗孔3-5h，然后在自来水中清洗板并干燥过夜固定细胞后，对噬斑进行计数。通过对15g羧甲基纤维素钠盐(Sigma-Aldrich，目录号C4888)进行高压灭菌并在室温下在1L补充有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和5％FBS的DMEM中搅拌过夜重悬，来制备CMC覆盖培养基，在4℃短期保存。
B.荧光显微术
使用荧光标记的细胞例如eGFP标记的ADSC(实施例1)和荧光标记的溶瘤病毒例如TurboFP635工程化的L14病毒(其为由StemVac GmbH，Bernried，Germany获得的TK插入的Turbo-FP635工程化的LIVP痘苗病毒株)监测病毒感染。使用Keyence多合一荧光显微镜BZ-X700系列荧光显微镜对病毒感染进行时程显微镜观察。例如，在GFP通道上跟踪经工程化以表达eGFP的ADSC(曝光1秒)，而在TRITC通道上监测TurboFP635工程化的LIVP病毒的病毒感染(曝光3秒)。收集4倍或10倍放大图像并用明场覆盖(相差，1/50秒曝光)。
C.在存在和不存在干扰素(IFN)的情况下，ADSC(脂肪来源干细胞)对痘苗病毒扩增的评估
使用L14痘苗病毒(VV)(TK插入的Turbo-FP635工程化LIVP株)评价了ADSC扩增痘苗病毒以及应答干扰素的保护性抗病毒作用的能力。从StemVac GmbH，Bernried，Germany获得痘苗病毒(L14VV)。在感染时或在感染前24小时添加(IFNβ/γ24小时)的IFNγ(Peprotech，目录号AF3000220UG，冻干20mg，从大约1000倍储液在补充有0.1％FBS的1×PBS中稀释至20μg/mL，在-80℃储存)或IFNβ(Peprotech，目录号AF30002B5UG，冻干5μg，从大约1000倍储液在补充有0.1％FBS的1×PBS中稀释至5μg/mL，在-80℃储存)剂量增加的情况下(0.08ng/mL、0.3ng/mL、1.3ng/mL、5ng/mL和20ng/mL)，用10,000pfu(噬斑形成单位)的L14 VV在12孔板中感染50,000个RM35 ADSC。感染后48小时进行荧光成像和噬斑测定。
表1中示出了噬斑测定分析的结果。感染后48小时的荧光成像和噬斑测定表明，I型和II型干扰素以剂量依赖性方式保护ADSC抵御痘苗病毒(VV)感染。这与这些细胞未转化并具有功能性抗病毒干扰素应答相一致。当同时(而非病毒暴露前24小时)添加干扰素时，对病毒感染的保护效率较低。
为评估I型和II型干扰素的组合是否增强抵御VV感染的保护作用，在感染10,000pfu的L14 VV之前，用剂量增加(0.02ng/mL、0.08ng/mL、0.3ng/mL、1.3ng/mL、5ng/mL、20ng/mL和80ng/mL)的IFNγ和IFNβ(单独或联合)对50,000个RM35 ADSC预处理24h。噬斑测定结果(表2)表明，I型和II型干扰素的组合未进一步增强保护。
然后确定了IFNγ诱导的抗病毒状态的稳定性。用100,000pfu的L14 VV在12孔板中感染100,000个RM20-eGFP ADSC(参见实施例1)并温育长达4天。ADSC未经处理((-)IFNγ对照)或用20ng/mL的IFNγ预处理24h。在病毒感染之前1天、2天或3天施用IFNγ。使用时程荧光图像分析将病毒感染的进程可视化，在感染后24h、48h、72h和96h拍摄图像。在不存在IFNγ((-)IFNγ对照)的情况下，被病毒感染的ADSC的荧光成像显示未感染的(eGFP+/绿色)ADSC、被感染的死亡ADSC(TurboFP635/红色)和被感染的活ADSC(黄色)，且从24h-96h感染和死亡的细胞数量增加，表明在不存在干扰素的情况下，病毒成功感染ADSC。暴露于IFNγ24小时后，感染病毒的ADSC的荧光成像显示无红色细胞或黄色细胞，表明用干扰素预处理防止了病毒感染。
如上所述，用病毒单独(无ADSC)对照和(-)IFNγ对照进行了噬斑分析。如表3所示，仅(-)IFNγ对照显示病毒扩增。ADSC对痘苗病毒感染高度允许性。噬斑分析的结果显示与无干扰素对照组相比，通过干扰素预处理消除了ADSC扩增病毒的能力。短暂暴露于IFNγ24小时后，干扰素治疗诱导的抗病毒状态持续稳定数天。因此，I型和II型干扰素应答在保护ADSC抵御病毒感染并潜在地提高其免疫抑制能力的同时，还具有损害其体内递送并扩增痘苗病毒的能力的作用。
表1.噬斑测定结果
IFNγ处理 平均pfu/样品 IFNβ处理 平均pfu/样品
(-)IFNγCTRL 3.40×10<sup>7</sup> (-)IFNβCTRL 1.90×10<sup>7</sup>
20ng/ml IFNγ 1.75×10<sup>5</sup> 20ng/ml IFNβ 4.10×10<sup>5</sup>
20ng/ml IFNγ24h 1.50×10<sup>3</sup> 20ng/ml IFNβ24h 4.40×10<sup>3</sup>
5ng/ml IFNγ 2.50×10<sup>5</sup> 5ng/ml IFNβ 1.80×10<sup>6</sup>
5ng/ml IFNγ24h 1.60×10<sup>3</sup> 5ng/ml IFNβ24h 4.20×10<sup>4</sup>
1.3ng/ml IFNγ 5.55×10<sup>5</sup> 1.3ng/ml IFNβ 5.90×10<sup>6</sup>
1.3ng/ml IFNγ24h 2.25×10<sup>3</sup> 1.3ng/ml IFNβ24h 5.40×10<sup>5</sup>
0.3ng/ml IFNγ 1.85×10<sup>6</sup> 0.3ng/ml IFNβ 3.40×10<sup>7</sup>
0.3ng/ml IFNγ24h 2.25×10<sup>3</sup> 0.3ng/ml IFNβ24h 2.10×10<sup>6</sup>
0.08ng/ml IFNγ 4.80×10<sup>6</sup> 0.08ng/ml IFNβ 4.00×10<sup>7</sup>
0.08ng/ml IFNγ24h 1.50×10<sup>4</sup> 0.08ng/ml IFNβ24h 4.10×10<sup>6</sup>
表2.IFNγ+IFNβ的噬斑测定结果
Figure BDA0002931076310000701
表3.IFNγ诱导的抗病毒状态的稳定性
处理 平均PFU/样品
病毒输入 3.80×10<sup>4</sup>
单独病毒 1.30×10<sup>4</sup>
(-)IFNγCTRL 4.10×10<sup>5</sup>
IFNγ-1天 1.02×10<sup>4</sup>
IFNγ-2天 5.20×10<sup>3</sup>
IFNγ-3天 9.55×10<sup>3</sup>
D.载体细胞/PBMC共培养物中的病毒扩增和感染
为评价在同种异体PBMC存在的情况下ADSC(载体细胞)对痘苗病毒(VV)的扩增潜能，用5,000或50,000L14 VV(单独的或在1×106个同种异体PBMC(来自指定为BH62的捐献者)存在的情况下)感染50,000个RM20-eGFP ADSC长达48小时。分别使用重叠荧光成像和病毒噬斑测定通过比较同种异体ADSC+PBMC的共培养物与单独培养的ADSC和单独培养的PBMC的结果评估痘苗病毒感染和扩增。
表4示出了结果。单独的ADSC对VV感染和扩增是允许性的，而单独的PBMC未显示VV感染或扩增。共培养物表明，在同种异体PBMC存在的情况下，ADSC可扩增痘苗病毒，并且在同种异体PBMC存在的情况下，总病毒输出相对于ADSC和PBMC分别感染时的总输出增加，表明ADSC使PBMC对痘苗病毒感染敏化。
表4.ADSC+PBMC共培养物中的病毒扩增和感染
Figure BDA0002931076310000702
Figure BDA0002931076310000711
实施例3
载体细胞+肿瘤细胞共培养物中的病毒扩增和感染
评价了在不同肿瘤/癌细胞类型存在的情况下溶瘤病毒的扩增和感染以确定特定载体细胞和溶瘤病毒组合对于肿瘤/癌细胞溶瘤是否有效。以此方式，可将肿瘤鉴定为对病毒感染有抗性或允许性，并且可评价载体细胞向肿瘤细胞的病毒递送的任何增强。还可评估其它因素，例如IFNγ预处理的作用、载体细胞剂量以及载体细胞的可溶性因子分泌。此实施例评价了示例性载体细胞类型ADSC对将示例性病毒(痘苗病毒)递送至示例性癌细胞系(B16黑色素瘤细胞)的能力的影响。
A.ADSC促进抗性和允许性肿瘤细胞系的溶瘤
例如，荧光显微镜检查、噬斑测定分析和流式细胞术可用于确定使用ADSC增强痘苗病毒向肿瘤/癌细胞的递送的效果。评价了ADSC将病毒更有效地递送至有抗性的B16 F10黑色素瘤细胞的用途。比较中包括高度允许病毒感染的A549细胞。
将1×106个B16细胞或A549细胞与2×105个eGFP标记的RM20供体的ADSC(参见实施例1)在12孔板中共培养并用1×105pfu L14 VV(MOI＝0.1至B16)感染并温育长达72h。无病毒对照包括单独的B16细胞、单独的A549细胞、单独的eGFP标记的ADSC或与eGFP ADSC共培养的B16细胞。温育24h、48h和72h后捕获荧光图像。单独培养的抗性B16细胞与单独培养的允许性A549细胞之间的比较显示，如荧光图像中红色细胞的存在所表明的，A549细胞中病毒感染水平显著更高。使用eGFP标记的ADSC(绿色)将它们可视化并与未标记的B16细胞(灰色)区分，观察到在融合环境中，ADSC倾向于聚集在一起并吸引未标记的黑色素瘤细胞。在不存在病毒的情况下，72h后观察到绿色干细胞簇。在存在病毒的情况下，此吸引导致形成被高度感染的黄色ADSC簇，周围被深红色的被感染的B16细胞包围。这些作用与抗性鼠B16黑色素瘤细胞单层的溶瘤显著改善有关。
这些结果表明，人ADSC通过增强L14痘苗病毒的扩增来促进抗性B16黑色素瘤细胞的溶瘤。用衍生自另一供体(RM35)的ADSC还观察到抗性B16细胞的改善的靶向。将1×106个B16细胞与200,000个RM35 ADSC共培养并用100,000pfu L14 VV感染长达4天。荧光成像分析表明，人RM35ADSC还可在体外促进抗性鼠B16黑色素瘤细胞的溶瘤。
如上所述在单独的B16细胞、单独的A549肺癌细胞、单独的B16+A549共培养物、单独的ADSC和B16+ADSC共培养物中进行痘苗病毒扩增的噬斑测定分析。结果总结在表5。A549肺癌细胞用作高度允许痘苗病毒的阳性对照，并显示出与单独的ADSC相似的病毒扩增水平。从B16+A549或B16+ADSC共培养物中回收的病毒滴度超过了分开感染的各个细胞的合并的病毒输出，表明高度允许性癌细胞和ADSC均可使抗性黑色素瘤细胞对痘苗病毒感染敏化。
表5.噬斑测定结果
培养物/条件 平均pfu/样品
输入病毒 9.50×10<sup>4</sup>
单独的B16细胞 5.55×10<sup>6</sup>
单独的A549细胞 6.10×10<sup>8</sup>
B16+A549共培养物 1.69×10<sup>9</sup>
单独的ADSC 8.55×10<sup>8</sup>
B16+ADSC共培养物 1.27×10<sup>9</sup>
B.IFNγ预处理对ADSC促进的抗性肿瘤细胞系溶瘤的影响
测试了ADSC的IFNγ预处理对病毒扩增的影响。用20ng/mL的IFNγ预处理200,000个RM20-eGFP细胞(0.2M)24h，然后与如上所述感染L14痘苗病毒的200,000个(0.2M)RM20ADSC、A549细胞或B16细胞共培养。在24h、48h和72h后捕获荧光图像。结果表明，IFNγ预处理仅在相对抗性的B16细胞存在的情况下保护ADSC不被病毒感染，而在高度允许性A549细胞存在的情况下则不能。由于保护ADSC抵御病毒，对ADSC的IFNγ预处理损害了B16单层的溶瘤，表明观察到的抗肿瘤潜能主要取决于ADSC对病毒的扩增。
C.载体细胞数量/剂量对B16细胞溶瘤的影响
评价了干细胞数量/剂量对B16单层溶瘤的影响。将1×106个B16细胞与200,000(0.2M)或20,000(0.02M)的RM20-eGFP ADSC共培养，并如上所述用L14 VV感染，并在24h、48h和72h捕获荧光图像。结果表明，数量不足的ADSC(2％或更少)导致B16单层的不完全溶瘤，证实了观察到的抗肿瘤潜能取决于ADSC对病毒的扩增。
D.载体细胞分泌的可溶性因子对抗性鼠B16肿瘤细胞和人K562癌细胞的溶瘤的影响
i.抗性肿瘤细胞的敏化
抗性肿瘤细胞的成功溶瘤不仅可归因于ADSC扩增病毒，还归因于肿瘤细胞对病毒感染的敏化。为确定敏化在抗性肿瘤细胞的溶瘤中所起的作用，通过添加来自ADSC的上清液而非ADSC细胞来评估ADSC分泌的可溶性因子的作用。如上所述，一式三份地将10,000个B16细胞在96孔平底板中以0.1的MOI用L14 VV感染96小时。加入来自人RM20 ADSC的上清液并使用TurboFP635荧光分析对B16细胞的病毒感染的影响并在感染后72小时通过噬斑测定进行定量。表6示出了噬斑测定结果。荧光图像和噬斑测定结果表明，添加来自ADSC上清液导致抗性B16细胞中的病毒扩增，表明ADSC使抗性B16肿瘤细胞对病毒感染敏化。
表6.噬斑测定结果
培养物/条件 平均pfu/样品
输入病毒 8.80×10<sup>4</sup>
单独的ADSC上清液 7.55×10<sup>4</sup>
单独的B16细胞 2.82×10<sup>7</sup>
B16细胞+ADSC上清液 5.23×10<sup>7</sup>
在类似实验中，将来自四个不同ADSC供体(RM20、RM35、BH21和RM58)的上清液添加至在96孔平底板中以0.1的MOI用L14 VV感染了96小时的B16(10,000)和K562(100,000)细胞中。荧光成像分析显示，来自不同ADSC供体的上清液对鼠B16细胞和抗性极强的人K562癌细胞提供相似的敏化作用。
ii.比较ADSC介导的B16细胞对两种不同痘苗病毒(L14 VV和WT1 VV)感染的敏化作用
WT1(ACAM2000)是痘苗病毒的野生型胸苷激酶(TK)阳性惠氏株，与L14 VV相比具有更高的扩增潜能和更强的逃避抗病毒免疫的能力。将ADSC介导的抗性B16细胞对L14 VV感染的敏化作用潜能与细胞对WT1 VV感染的敏化作用潜能进行了比较。将来自四个ADSC供体(RM20、RM35、BH21和RM58)的上清液添加至在96孔平底板中以0.1的MOI用L14 VV或WT1VV感染了96小时的10,000个B16细胞中。如先前所述对B16细胞中的L14和WT1痘苗病毒扩增进行噬斑测定分析。使用MTT测定确定细胞活力。MTT(四唑染料；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)测定是用于评估细胞代谢活性的众所周知的比色测定。NAD(P)H依赖性细胞氧化还原酶可在定义的条件下反映存在的活细胞数量。该测定评估了四唑染料MTT还原为紫色甲
Figure BDA0002931076310000725
染料。将MTT(ThermoFisher，目录号M-6494，1×PBS中5mg/mL储液，-20℃保存)以5μg/mL的终浓度添加至96孔平底板中的细胞(10μL-100μL细胞/孔)中并在37℃温育1h-2h(培养箱)。温育后，通过添加100μL异丙醇：1M HCl(24：1，补充有10％Triton X100，Sigma-Aldrich，X100-100ML)裂解细胞并剧烈吹打以溶解甲
Figure BDA0002931076310000721
在Tecan
Figure BDA0002931076310000722
200Pro上读取板并在1小时内通过从570nm处的OD值中减去650nm处的OD值来测量MTT信号。包括无MTT或空白/培养基孔的细胞作为对照以消除背景信号。
表7中示出的噬斑分析结果显示，在存在ADSC上清液的情况下，平均pfu/样品增加的总体趋势，表明ADSC上清液能够使B16细胞对L14和WT1 VV感染敏化。MTT分析结果(表8)显示单独的ADSC上清液对感染L14或WT1 VV的B16细胞的存活率无显著影响。
表7.L14 VV和WT1 VV感染的B16细胞的噬斑测定结果
Figure BDA0002931076310000723
表8.B16 MTT测定结果
Figure BDA0002931076310000724
Figure BDA0002931076310000731
iii.在存在ADSC上清液或ADSC的情况下K562细胞的病毒感染
在96孔平底板中将100,000个K562细胞用TurboFP635+(荧光标记的)L14 VV以0.1的MOI感染96小时并添加来自四个不同ADSC供体(RM20、RM35、BH21和RM58)的上清液。进行流式细胞术分析并记录感染L14 VV的K562细胞的百分比和中值荧光强度(MFI)。噬斑分析用于确定病毒滴度，MTT分析用于确定细胞活力。结果显示，感染的K562细胞(表9)、TurboFP635+MFI(表10)和病毒滴度(表11)的频率(百分比)略有增加，但如通过MTT测定所测量的，未显示对高抗性K562细胞的总体存活率的显著影响，证明ADSC上清液增强K562细胞感染。
结果表明，单独的ADSC上清液可使K562细胞对病毒感染敏化，但不导致明显溶瘤。将ADSC的作用与ADSC上清液的作用进行比较。100,000个K562细胞用L14 VV以0.1的MOI感染，将K562细胞(而非ADSC上清液)与5,000或20,000个RM20-eGFP ADSC一式三份共培养。荧光成像和流式细胞术分析显示，绿色荧光ADSC吸引了未标记的/灰色K562细胞并大大增加了感染的K562细胞的百分比。尽管高抗性K562细胞的感染性增强(表12)，ADSC最终未能根除或显著影响其总体存活率(表13)，这与K562细胞扩增痘苗病毒的最低能力(与ADSC增强感染的能力不同)相符。
结果表明，ADSC具有扩增病毒(大约10,000或5,000pfu/细胞)且将其传播至肿瘤细胞的独特性质。这可归因于较高的局部感染复数(MOI)以及某种形式的化学趋化。此作用至少部分归因于ADSC上清液中存在的未鉴定的可溶性因子的分泌。观察到的ADSC上清液对被感染的B16和K562细胞的频率和病毒扩增的增强作用相对小(约2倍)，表明成功治疗抗性肿瘤需要ADSC及其上清液的敏化作用和扩增性质，以及ADSC自身募集鼠和人肿瘤细胞并增强这些细胞感染的能力。
表9.感染的K562细胞的频率
Figure BDA0002931076310000732
表10.TurboFP635+感染的K562细胞的MFI
ADSC上清液供体 平均MFI
CTRL 8.30×10<sup>3</sup>
RM20 1.02×10<sup>4</sup>
RM35 1.11×10<sup>4</sup>
BH21 9.70×10<sup>3</sup>
RM58 1.26×10<sup>4</sup>
表11.噬斑测定结果
ADSC上清液供体 平均pfu/样品
CTRL 1.00×10<sup>4</sup>
RM20 1.50×10<sup>4</sup>
RM35 1.85×10<sup>4</sup>
BH21 1.55×10<sup>4</sup>
RM58 1.70×10<sup>4</sup>
表12.ADSC对L14VV感染K562细胞的影响
ADSC数量 TurboFP635+感染的K562平均细胞数
CTRL 119
5k 853
20k 1700
表13.ADSC对K562细胞根除的影响
Figure BDA0002931076310000733
Figure BDA0002931076310000741
实施例4
免疫参数分析以确定用于治疗对象的溶瘤病毒/载体细胞组合
如本文所述，最佳溶瘤病毒/基于细胞的递送媒介组合促进了待治疗对象中的病毒扩增和溶瘤，同时在将病毒递送至肿瘤期间防止了免疫活化并抑制了病毒诱导的免疫活化。先前实施例证明了如何评价载体细胞(例如ADSC)的病毒扩增潜能、使肿瘤/癌细胞对病毒感染敏化的能力以及促进病毒溶瘤作用(例如通过募集远距离肿瘤/癌细胞)的能力。
此实施例评估了对象特异性免疫限制，其可限制基于现成细胞的递送媒介将溶瘤病毒递送至肿瘤/癌细胞的治疗潜能。此类限制包括例如病毒诱导的和/或同种异体载体细胞诱导的免疫活化，例如IFNγ和细胞毒性反应。这些反应源于未适当匹配的对象/接受者的先天(NK、NKT)和适应性(T)免疫细胞。此实施例证明了当自体或同种异体施用时，通常满足用于病毒疗法良好递送媒介要求的载体细胞例如ADSC(即它们促进病毒扩增并证明了对病毒和/或载体细胞的先天和/或适应性免疫应答的逃避和/或抑制)有时在某些同种异体环境下可能不太有效。
为评价对象对载体细胞/溶瘤病毒的潜在免疫应答，将载体细胞(自体或同种异体的)、溶瘤病毒和对象来源免疫细胞(例如PBMC、PBMC+血浆/血清或有或无红细胞裂解的全血)共培养。使用例如酶联免疫斑点(ELISPOT)或流式细胞术分析(或等价方法例如CyTOF)基于识别不同免疫细胞群的一组标志物(例如包括：T细胞(例如但不限于CD3、CD4、CD8)、NK细胞(例如但不限于NKp46、CD16、CD56)和NKT细胞(例如但不限于CD3、CD16、CD56、NKp46、aGalCer-CD1d四聚体))以及一组活化/效应子功能标志物(包括但不限于：CD69、CD25、CD71、CD27(CD70L)、CD154(CD40L)、CD137(4-1BB)、CD44、CD45RA、CD45RO、CD278(ICOS)、CD127(IL-7RA)、CD183(CXCR3)、CD197(CCR7)、CD39、CD73、CD314(NKG2D)、PD-1、CTLA-4、IFNα/β、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、GM-CSF、IL-17、IL-6、CD107a、CD107b、TGFβ、穿孔素、粒酶B、IL-1a/IL-1b、G-CSF、RANTES、EXOTAXIN、MIP-1b、MCP-1、EGF、HGF、VEGF、IL-1RA、IL-7、IP-10、IL-2R、MIG和IL-8)评价溶瘤病毒/基于同种异体细胞的媒介组合的免疫诱导作用以及并行的基于同种异体/自体细胞的载体诱导的免疫抑制。
A.自体和同种异体环境中ADSC的免疫抑制性质
为评价ADSC克服免疫屏障的潜能，测试了它们在自体或同种异体人PBMC存在的情况下抑制NK细胞的能力。将250,000个新鲜分离的RM20 PBMC与10,000或100,000个自体(RM20)或同种异体(RM35)ADSC共培养48小时。将PBMC(100μL)与ADSC(50μL)在总计200μLR10培养基(补充有10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI 1640)中在96孔平底板上共培养48小时。在48h温育期结束时，根据需要，用NK细胞与250,000个K562细胞或PMA/离子霉素(50μL)与莫能星/布雷菲德菌素A(50μL)对共培养物进行额外的4h刺激。
对单独的PBMC、PBMC+10,000或+100,000个自体ADSC以及PBMC+10,000或+100,000个同种异体ADSC使用流式细胞术分析评价NK和T细胞的频率(百分比)以及NK细胞活化程度和NK细胞毒性活性。对于流式细胞术分析，通过移液回收PBMC和ADSC的共培养物并将转移至V型底板，在其中用FACS缓冲液(具有1％FBS的1×PBS)清洗并在补充有以下抗体混合物的FACS缓冲液中在4℃表面染色30分钟：抗人CD3-PerCP/Cy5.5(BioLegend，目录号300328，1：50)、抗人CD335或NKp46-PE(BioLegend，目录号331908，1：50)、抗人CD69-APC(BioLegend，目录号310910，1：50)。FACS缓冲液还含有活力探针(ThermoFisherScientific，LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit，405nm激发，目录号L34964，1：1000)。染色后，将细胞用FACS缓冲液清洗两次，在室温在1×PBS中的2％PFA中固定15分钟，再用FACS缓冲液清洗以去除PFA并在BD FACSAria II上进行分析。为评价细胞毒性功能，在回收和表面染色前5小时将抗人CD107a-AlexaFluor 488(BioLegend，目录号328610)以1：20(10μl/孔)直接添加至共培养物，1小时后以1：1000添加莫能星，在37℃额外温育4小时(BioLegend，目录号420701-BL，1000X)。
在自体和同种异体共培养物中确定NK细胞和T细胞的百分比并将与单独的PBMC对照进行比较。下表14中总结了结果。发现在自体和同种异体环境中，ADSC介导的免疫抑制不影响NK细胞和T细胞的频率。
表14.ADSC介导的免疫抑制作用对NK和T细胞频率的影响
Figure BDA0002931076310000742
Figure BDA0002931076310000751
使用门控活CD3-NKp46+NK细胞上CD69上调的NK活化流式细胞术分析(表15)显示，当用K562细胞或PMA/离子霉素刺激后，将PBMC与自体(RM20)或同种异体(RM35)ADSC共培养时，CD69被上调。使用CD107a表面暴露的NK细胞细胞毒性功能的流式细胞术分析(表15)显示，PBMC与自体和同种异体ADSC的共培养物中CD107a上调。
因此，PBMC与ADSC的共培养物显示出显著的抵御通过暴露于K562靶细胞刺激的NK细胞免疫应答的剂量依赖性免疫抑制作用。在自体和同种异体环境中观察到免疫抑制作用，证明ADSC可在自体和同种异体环境中抑制NK细胞。
表15.自体和同种异体培养物中的％CD69+和CD107a+NK细胞
Figure BDA0002931076310000752
B.同种异体干细胞抑制病毒诱导的T细胞、NK细胞和NKT细胞应答
同种异体干细胞克服免疫障碍的潜能与其抑制病毒诱导的T、NK和NKT样细胞应答的能力有关。在两种PBMC供体的新队列中测试了来自RM35供体的同种异体ADSC特异性抑制NK细胞、T细胞和NKT细胞介导的病毒诱导的应答的能力，以揭示可能的患者特异性限制。
将来自2个不同血液供体(RM47和RM48)的250,000个PBMC(100μL)与400、2,000、10,000或60,000个同种异体RM35 ADSC(50μL)在96孔平底板上在存在或不存在10,000pfu(50μL)的WT1VV(ACAM2000)的情况下于共200μL R10培养基(补充有10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素RPMI 1640)中共培养48h。进行门控活T、NK和NKT样细胞的流式细胞术分析以确定单独培养的PBMC(对照)、用WT1 VV培养的PBMC(无ADSC)、无病毒的PBMC+同种异体ADSC共培养物、以及具有WT1 VV的PBMC+同种异体ADSC共培养物中每种免疫细胞类型的CD69+活化细胞的百分比。
下表16中总结了结果。门控活T、NK和NKT样细胞的流式细胞术分析显示，与无ADSC培养的WT1 VV+PBMC相比，WT1 VV+PBMC+同种异体ADSC共培养物中CD69+活化的T细胞、NK细胞和NKT细胞的百分比均显著降低。这些结果证明，同种异体RM35 ADSC可抑制痘苗病毒诱导的先天和适应性免疫应答。
在48h共培养期结束时用250,000K562细胞刺激4h，以评价同种异体干细胞的免疫抑制潜能。相对于T细胞，NK细胞是主要应答群，病毒和低剂量干细胞的组合导致超过80％的NK细胞活化。较低剂量的干细胞不足以进行免疫抑制并且增加病毒诱导的免疫应答，这可能反映出病毒扩增显著增强。然而，较高剂量的ADSC以剂量依赖的方式提供了对较弱的痘苗病毒诱导的T细胞反应的有力抑制，表明干细胞介导的免疫抑制克服了增强的病毒扩增的免疫刺激作用。
仅在最高干细胞剂量下，抗病毒NK细胞应答的抑制才是明显的，并且在测试的两种同种异体血液供体中不一致。来自供体之一(RM48)的NK细胞直接应答同种异体ADSC。在48h PBMC/ADSC/VV共培养实验结束时，使用标准4h K562 NK刺激测定证明了抗病毒NK应答的不一致抑制与干细胞免疫豁免状态和免疫抑制能力的丧失有关。鉴定出NKp46+CD3+NKT样细胞群，其强烈应答病毒感染，活化标志物上调。此细胞群表现出应答痘苗病毒的快速选择性扩增的能力，与NKT细胞在控制病毒感染中已确立的作用一致。
表16.NK、T和NKT细胞应答
Figure BDA0002931076310000761
C.确定对同种异体干细胞的对象特异性应答
在更大的PBMC供体队列中评价并测试来自RM20供体的同种异体ADSC(实施例1)的免疫抑制和病毒扩增能力，以确定患者特异性限制。
将来自4个不同血液供体(SIBD01、SIBD02、RM52、RM53)的250,000个PBMC与5,000、10,000、20,000或40,000个同种异体RM20 ADSC在存在或不存在5,000pfu的WT1 VV的情况下共培养48h。如上所述进行流式细胞术分析以确定CD69+活化的NK细胞、T细胞和NKT细胞的百分比。无干细胞培养的PBMC用作对照。表17-19中示出的结果与之前的数据一致，显示当针对一组4种新同种异体PBMC供体进行测试时，相同的RM20 ADSC可以以对象特异性方式触发直接的NK、T和NKT细胞应答。在对同种异体干细胞和病毒的NK、T和NKT细胞应答中观察到高对象间变异性。两个血液供体显示出相反结果，SIBD01对同种异体ADSC的抗性最高，而SIBD02对同种异体ADSC是最允许性的。
表17.NK细胞对同种异体ADSC的应答
Figure BDA0002931076310000762
Figure BDA0002931076310000771
表18.T细胞对同种异体ADSC的应答
Figure BDA0002931076310000772
表19.NKT细胞对同种异体ADSC的应答
Figure BDA0002931076310000773
在48h共培养期结束时使用来自SIBD01和SIBD02血液供体的NK细胞，用250,000个K562细胞刺激4h以评价同种异体RM20 ADSC的NK细胞抑制程度。单独培养的PBMC用作对照。流式细胞术分析用于确定CD69+NK、T和NKT细胞的百分比，并且噬斑分析用于量化在抗性和允许性血液供体样品存在的情况下通过同种异体ADSC的病毒扩增。流式细胞术分析(表20)揭示了ADSC的免疫抑制性质在不利的同种异体环境中失效，而即使不存在病毒，干细胞也失去其免疫豁免状态并直接活化NK和T细胞。
这些免疫学差异对干细胞的病毒扩增潜能具有显著影响。如表21所示，对48h共培养物的噬斑测定分析证明RM20 ADSC仅在存在来自允许性SIBD02供体而非抗性SIBD01供体的同种异体PBMC存在的情况下可扩增WT1痘苗病毒。这证明了代表潜在MSC接受者的不适当匹配干细胞和血液供体可完全消除同种异体ADSC的病毒扩增潜能，从而揭示了可导致对ADSC的“允许性”或“抗性”的关键患者特异性差异。
表20.NK、T和NKT细胞应答
Figure BDA0002931076310000774
Figure BDA0002931076310000781
表21噬斑测试结果
Figure BDA0002931076310000782
进行了针对最高剂量(40,000)的同种异体ADSC的NK细胞、T细胞和NKT细胞应答(％CD69+细胞，对未经处理的PBMC对照归一化)的相关性分析。表22-24中示出的相关性分析结果表明，痘苗病毒诱导了显著协同的NK、NKT和T细胞应答。针对同种异体干细胞的NK和T细胞应答也有相似的相关性，但对病毒和同种异体ADSC的应答性是不一致的，并且可能彼此独立。
表22.抗WT1相关性分析
PBMC供体 NK T NKT
RM47 37.23 15.03 36.00
RM48 72.56 20.61 36.67
SIBD01 53.96 22.81 39.76
SIBD02 27.82 5.19 18.10
RM52 75.94 35.73 47.25
RM53 11.55 2.05 0.60
表23.抗ADSC相关性分析
PBMC供体 NK T NKT
RM47 1.23 0.29 14.40
RM48 16.16 1.38 0.33
SIBD01 37.82 8.26 27.51
SIBD02 3.89 1.80 32.15
RM52 5.19 2.55 -3.25
RM53 11.40 1.14 14.20
表24.抗ADSC+WT1相关性分析
Figure BDA0002931076310000783
Figure BDA0002931076310000791
因此，PBMC供体表现出对单独的病毒和同种异体干细胞或其组合的可变应答。这些对象特异性差异表明对象与载体细胞之间的适当匹配可改善治疗功效。
D.ADSC存活的对象特异性免疫屏障
鉴定了一对分别对同种RM20 ADSC具有显著抗性(SIBD01)和显著允许性(SIBD02)的血液供体后，这些供体用于进一步分析对ADSC的对象特异性抗性的潜在机制。在来自抗性(SIBD01；“抗性PBMC”)或允许性(SIBD02；“允许性PBMC”)血液供体的250,000个PBMC存在的情况下，将20,000eGFP标记的RM20 ADSC与20,000pfu L14 VV(MOI为1)共培养长达48h。ADSC在与PBMC共培养时感染病毒，或在37℃恒温箱中不断摇动预感染1h，然后将其加入PBMC中而不洗去任何未结合的病毒。
24h和48h后，捕获以下细胞培养物的荧光图像：单独的ADSC、ADSC+抗性PBMC和ADSC+允许性PBMC。在单独的ADSC和ADSC+允许性PBMC共培养物而非ADSC+抗性PBMC共培养物中观察到病毒感染。在允许性和抗性PBMC的情况下对同种异体ADSC的存活和扩增潜能的比较分析表明，在存在抗性同种异体PBMC且不存在病毒感染的情况下，抗性与干细胞的快速损失有关。与允许性接受者的PBMC共培养时，这些相同的干细胞保持完整。用L14 VV预感染ADSC未影响抗性PBMC的感染，表明在载体细胞中给予病毒的扩增“领先(head start)”不足以克服抗性PBMC的免疫学屏障。
为评估用L14 VV或WT1 VV预感染ADSC对病毒感染水平的影响，将2,500、5,000、10,000或20,000个ADSC与L14 VV或WT1 VV在37℃恒温箱中持续摇动预培养1小时，然后对上清液进行噬斑分析。表25中示出了结果。确定了当使用20,000个ADSC时，预感染足以使大约一半的病毒(L14 VV或WT1 VV)以较高MOI(较少干细胞)进入细胞，大多数病毒似乎保持游离且需要更长时间进行整合。
表25.温育1h后ADSC对VV的吸收
Figure BDA0002931076310000792
评估了ADSC预感染L14 VV或WT1 VV对ADSC/PBMC共培养物中病毒扩增的影响。如上所述，将2,500、5,000、10,000和20,000个ADSC与抗性和允许性PBMC共培养，同时用遗传减毒的L14痘苗病毒和野生型WT1(ACAM2000)痘苗病毒进行平行感染。ADSC在与PBMC共培养时感染病毒，或在37℃恒温箱中不断摇动预感染1h，然后将其加入PBMC中而不洗去任何未结合的病毒。痘苗病毒扩增的噬斑分析如上所述进行。结果(表26)显示，尽管潜在地增强干细胞感染并加速病毒扩增，但在存在同种异体PBMC的情况下，1h领先对ADSC的扩增潜能总体影响小。允许性SIBD02PBMC部分抑制了L14 VV而非WT1 VV的扩增。与基于李斯特的Turbo-FP635工程化L14病毒(如在大多数遗传减毒痘苗病毒株中一样，其TK基因座已失活/去除)相反，WT1/ACAM2000是被证明具有更高的扩增潜能和克服更强的同种异体屏障的能力的野生型TK阳性惠氏株痘苗病毒。这是由于可能更快的扩增周期和/或增强的逃避抗病毒免疫力的能力。然而，WT1病毒的这些优势不足以克服抗性接受者(SIBD01)中的免疫学屏障，并且仅通过在与同种异体PBMC共培养之前一小时开始病毒感染干细胞才可略微改善病毒扩增。因此，对于同种异体ADSC的患者特异性免疫学屏障可限制遗传减毒的和野生型痘苗病毒株的治疗潜能。
表26.噬斑测定结果
Figure BDA0002931076310000793
Figure BDA0002931076310000801
实施例5
分析对象特异性遗传多态性
此实施例提供了单体型分析以了解可导致对象排斥同种异体载体细胞的因素，以及可规避此问题的方法。某些对象特异性遗传多态性可能导致对象与同种异体载体细胞之间的“免疫学错配”。相关基因座包括但不限于例如经典MHC I/II单体型、KIR单体型/配体和非经典MHC单体型(例如HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和MICA/B)。
可使用例如下一代测序来进行对象特异性遗传多态性相关基因座的分析。然后将各对象的遗传多态性谱与各可用载体细胞类型的谱进行比较以鉴定对象与载体细胞之间的错配，包括鉴定出的MHC错配、KIR和KIR配体错配以及非经典MHC基因座处的错配、以及“免疫受损”错配。“免疫受损错配”是对象与载体细胞之间在遗传多态性基因座处的错配，其与通过本文提供的匹配测定方法确定的％相容性的显著降低(例如10％或更多)相关。
A.对同种异体ADSC的抗性与HLA错配相关
评估了对不同同种异体ADSC系的抗性或允许性。将来自抗性(SIBD01)和允许性(SIBD02)血液供体的250,000个PBMC与来自感染了5,000pfu的WT1 VV的四个不同供体(RM20、RM35、BH21和RM58)的40,000或5,000个同种异体ADSC共培养48小时。使用单独的ADSC作为对照，并如上所述进行噬斑测定。结果(表27)显示SIBD01和SIBD02血液供体分别证明了对四种同种异体ADSC系的广泛抗性和允许性。仅在来自允许性SIBD02血液供体的PBMC存在的情况下，四种同种异体ADSC系才扩增痘苗病毒。
表27.噬斑测定结果
Figure BDA0002931076310000802
HLA紧密匹配的细胞的排斥可由通过NK细胞抑制性(KIR、NKG2A/CD94)或刺激性(KIR、NKG2D)受体的信号传导的平衡或KIR单体型的差异来解释。HLA和KIR/MIC分型分析分别由通过ProImmune(Oxford，UK)和Scisco Genetics(Seattle，USA)的NGS进行。PBMC(SIBD01，SIBD02)和ADSC(RM20、RM35、BH21和RM58)供体的HLA等位基因中存在/不存在已知KIR配体A3/A11(HLA-A)、Bw4(HLA-B)和C1/C2(HLA-C)表位可从dorak.info/mhc/nkcell.html获得。来自前导序列的锚定氨基酸处的-21M/T(甲硫氨酸/苏氨酸)二态性(其预测HLA-E对HLA-B衍生的前导肽的强/弱结合和呈递，其通过NK细胞上的NKG2A/CD94受体提供抑制性信号传导)从ebi.ac.uk/ipd的免疫多态性数据库(IPD)获得。
对KIR单体型以及包括Bw4表位(HLA-B)和弱/强C1/C2表位(HLA-C)的已知KIR配体的存在进行了分析，包括对充当NK细胞上NKG2D活化受体的配体的寡聚MICA/B分子的分析。还分析了长(L)-抑制性和短(S)-活化性KIR受体的分布和拷贝数，以及存在的抑制性和活化性受体的总数。
结果表明，允许性/抗性与KIR单体型/KIR配体、-21M/T二态性和MICA/B寡态性之间不存在明显相关性。RM58干细胞显示出KIR配体C1/C2与抗性SIBD01和允许性SIBD02血液供体错配，表明单独的此错配不足以赋予抗性。允许性和抗性的更广泛决定因素主要与HLA-A和HLA-DP基因座处的部分匹配有关，广泛允许性供体具有最常见的HLA-A*02:01等位基因，抗性供体具有HLA-A*01:01等位基因。不一致的HLA-A*01:01情况可能与C2 KIR配体错配有关联(在先前的研究中，其与KIR抑制性信号传导不足和NK细胞介导的HLA单倍同一性iPSC排斥相关(Ichise等(2017)Stem Cell Reports 9：853-867)。因此，如HLA-A*01:01RM58 ADSC的不一致情况所见，单独的HLA分型数据不足以预测允许性与抗性。这些数据表明需要综合考虑多种基因座。
B.对同种异体ADSC的抗性与快速诱导抗干细胞细胞毒性和干扰素应答有关
相关流式细胞术用于分析对来自上述部分A的PBMC/ADSC/WT1共培养物的门控活NK、NKT和T细胞中同种异体ADSC和WT1 VV的CD107a和IFNγ应答。表28-30中示出的结果显示，即使在不存在病毒的情况下，所有测试的四种同种异体干细胞系在来自抗性而非允许性血液供体的NK和T细胞中诱导了强得多的CD107a和IFNγ应答。每种细胞类型的CD107a或IFNγ单阳性淋巴细胞的平均百分比基于一式三份孔进行分析并以各自背景(未经处理的PBMC对照)归一化。在允许性血液供体中，四种同种异体干细胞抑制自发的NK细胞介导的IFNγ反应使其低于背景(未经处理的PBMC对照)。
表28.抗WT1相关性(R：抗性；P：允许性)
PBMC供体 NK T NKT
R:SIBD01 0.0393 0.0099 0.200
P:SIBD02 0.0433 0.0011 0
表29.抗ADSC相关性(R：抗性；P：允许性)
PBMC供体 NK T NKT
R:RM20 0.0307 0.0507 0.1200
R:RM35 0.0700 0.0600 0
R:BH21 0.0640 0.0620 0.1933
R:RM58 0.1813 0.1890 0.2867
P:RM20 -0.2305 0.0093 0
P:RM35 -0.1693 0.0089 0
P:BH21 -0.2148 0.0051 0
P:RM58 -0.2140 0.0114 0
表30.抗ADSC+WT1相关性(R：抗性；P：允许性)
PBMC供体 NK T NKT
R:RM20 0.1147 0.0950 0
R:RM35 0.0963 0.0366 0
R:BH21 0.0263 0.1357 0.0323
R:RM58 0.1593 0.1857 0.1933
P:RM20 -0.2043 0.0205 1.7533
P:RM35 -0.1557 0.0059 0
P:BH21 -0.2180 0.0010 0
P:RM58 -0.2333 0.0024 0
流式细胞术分析还显示，用痘苗病毒或同种异体干细胞治疗未显著影响门控淋巴细胞群的频率。例外的是来自抗性SIBD01供体的CD3+NKp46+NKT样细胞。这些细胞应答单独的同种异体干细胞而扩展，并且在存在痘苗病毒感染的情况下进一步扩增(表31)。SIBD01供体对数种同种异体干细胞系的广泛抗性可能与CD3+NKp46+NKT样细胞(其为唯一应答病毒和同种异体干细胞而扩增数量的细胞群)的异常高频率相关。
表31.应答同种异体干细胞/病毒的NKT细胞百分比
Figure BDA0002931076310000811
Figure BDA0002931076310000821
C.NKT样细胞是IFNγ的最早产生者
为评估抗病毒和抗干细胞诱导的免疫应答，将2,000或10,000个RM20 ADSC与来自抗性SIBD01或允许性SIBD02血液供体的250,000PBMC和5,000pfu WT1 VV共培养。通过流式细胞术分析门控活NK细胞、NKT细胞和T细胞在6h和24h时间点的活化子(CD69表面染色；表32-34)和效应子(IFNγ的细胞内染色；表35-37)功能。显著背景免疫细胞活化在6h时是明显的，并在24h时间点消退。在6h，仅来自抗性供体的T细胞和NKT细胞表现出干细胞诱导的CD69上调，而非IFNγ应答。不管病毒存在或不存在，在24h，所有三个亚群均通过上调CD69活化标志物而应答同种异体干细胞。尽管NK细胞应答最强烈，仅NKT亚型表现出统计学上显著的干细胞诱导的IFNγ应答，表明NKT细胞可能是第一个针对同种异体干细胞产生效应子细胞因子应答的免疫细胞亚型。在任何时间点，来自允许供体的NK细胞、NKT细胞和T细胞均未应答干细胞而上调CD69或产生IFNγ。在24小时时间点，同种异体干细胞甚至能够通过的允许性供体NK细胞抑制IFNγ产生使其低于背景。
表32.百分比活化的NK细胞
Figure BDA0002931076310000822
表33.百分比活化的T细胞
Figure BDA0002931076310000823
表34.百分比活化的NKT细胞
Figure BDA0002931076310000824
表35.百分比IFNγ+NK细胞
Figure BDA0002931076310000825
表36.百分比IFNγ+T细胞
Figure BDA0002931076310000826
Figure BDA0002931076310000831
表37.百分比IFNγ+NKT细胞
Figure BDA0002931076310000832
D.IFNγ预处理ADSC对允许性和抗性PBMC免疫细胞应答的影响
为研究IFNγ分泌对体内可能发生的免疫细胞和同种异体干细胞之间相互作用的潜在有害影响，在存在或不存在痘苗病毒的情况下，在与PBMC共培养前用IFNγ对干细胞预处理。将抗性(SIBD01)和数种允许性(SIBD02、RM52、RM53)血液供体的PBMC与增加数量的未处理或用20ng/mL IFNγ预处理的同种异体RM20 ADSC(5,000、10,000、20,000或40,000)共培养48小时。如前所述对门控NK细胞、NKT细胞和T细胞进行流式细胞术分析。
确定了在存在和不存在WT1痘苗病毒的情况下，在允许性患者中IFNγ预处理增强而非抑制了NK和T细胞应答(表38-43)。数据还证明了RM20干细胞(p12)的稍后传代保留了一些T细胞免疫抑制能力，但失去了抑制NK细胞的能力。用NK特异性刺激细胞系K562刺激NK细胞诱导了T和NKT细胞应答的间接活化，这表明NK-NKT-T细胞交互作用(crosstalk)(表44-46)。
因此，尽管HLA或KIR匹配可在确定对载体细胞的允许性和抗性中发挥作用，载体细胞类型的最终治疗功效可能受其它对象特异性差异的影响，包括先天和适应性免疫细胞组成、活化状态和对病毒/同种异体细胞错配的敏感性。例如，发现无论部分HLA或KIR/KIR配体匹配程度如何，同种异体ADSC有效扩增病毒的能力与对测试的所有四种同种异体ADSC系中显著的抗干细胞IFNγ和细胞毒性NK和T细胞响应的缺乏相关。对来自显著抗性SIBD01接受者的PBMC的分析表明，即使在不存在病毒感染的情况下，未适当匹配的同种异体干细胞也诱导可检测的IFNγ应答。此应答似乎源于NK细胞和T细胞。尽管T细胞代表了早期的产生IFNγ细胞的大部分，但NK细胞显示出最高的比例细胞毒活性，表明先天和适应性免疫细胞群之间存在交互作用。
表38.在存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对NK细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000833
Figure BDA0002931076310000841
表39.在存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对T细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000842
表40.在存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对NKT细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000843
表41.在不存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对NK细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000851
表42.在不存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对T细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000852
表43.在不存在WT1 VV的情况下IFNγ预处理对NKT细胞活化的影响
Figure BDA0002931076310000853
表44.IFNγ预处理对T-NK-NKT交互作用的影响
Figure BDA0002931076310000854
Figure BDA0002931076310000861
表45.IFNγ预处理对T-NK-NKT交互作用的影响
Figure BDA0002931076310000862
表46.IFNγ预处理对T-NK-NKT交互作用的影响
Figure BDA0002931076310000863
实施例6
抑制IFN介导的抗病毒状态的诱导使干细胞和肿瘤细胞对病毒感染和扩增敏化
许多类型的肿瘤细胞表现出受损的干扰素信号传导，其使它们对溶瘤病毒疗法敏化。由多种细胞病毒传感器和干扰素介导的未转化的干细胞和某些类型的肿瘤细胞中完整抗病毒机制可能造成此类细胞用作用于溶瘤病毒递送的载体细胞的能力的屏障。例如，I型和II型干扰素在干细胞和一些类型的肿瘤细胞中是强有力的抗病毒状态诱导剂。这干扰了这些细胞对病毒感染的易感性，并降低了它们支持病毒扩增的能力。
本文证明了在干细胞和肿瘤载体细胞中阻断病毒感染的检测和/或阻断抗病毒状态的诱导可使载体细胞对病毒感染、扩增和传播敏化。使用鲁索替尼(抑制干扰素信号传导的JAK1/JAK2的小分子抑制剂)可阻断检测病毒感染。这改善了多种干细胞和肿瘤细胞作为溶瘤病毒载体的治疗潜能。
A.JAK1/2抑制增强干细胞载体的病毒感染和扩增潜能
为确定干扰干扰素信号传导并进而干扰抗病毒状态的诱导是否改善了干细胞作为溶瘤病毒载体的治疗潜能，在有或无干扰素信号抑制剂鲁索替尼时，在I型或II型干扰素存在的情况下，培养干细胞，并且评估了病毒感染、扩增和向肿瘤细胞的递送。用经工程化以表达TurboFP635荧光蛋白的L14溶瘤痘苗病毒以0.1的MOI感染RM35 ADSC(第5代)干细胞(以下称为ADSC-RM35干细胞；衍生自如上述实施例1中所述的supra advential脂肪基质细胞)2小时。洗去游离病毒后，立即将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中，并添加20ng/mL IFNβ(I型干扰素)或20ng/mL IFNγ(II型干扰素，有或无50nM鲁索替尼(LC Laboratories，目录号R-6688)并在37℃、5％CO2温育48小时。不用IFN培养的细胞用作对照。培养细胞48小时后，通过用于测量病毒编码的TurboFP635蛋白的荧光强度的时程荧光成像评价病毒感染和扩增。下表47中总结了结果，其示出了对照干细胞(无IFN)、对照干细胞+鲁索替尼；干细胞+IFNβ；干细胞+IFNβ+鲁索替尼；干细胞+IFNγ和干细胞+IFNγ+鲁索替尼的平均荧光强度密度。
由于未将IFN添加至对照细胞中，因此未诱导抗病毒状态，并且如通过TurboFP635荧光强度测量的，病毒感染和扩增的量与添加或未添加鲁索替尼的情况相同。与对照细胞相比，向细胞培养物中添加20ng/mL IFNβ或IFNγ分别导致荧光降低26.7％和17.8％。这表明病毒感染后，干细胞暴露于IFN降低了载体细胞支持病毒扩增的能力。这些培养条件模拟了感染的载体细胞暴露于I型和II型干扰素，其分别源于体内其它感染的载体细胞或对象的免疫细胞。
未转化的干细胞(和许多肿瘤细胞)可具有完整的固有病毒感测和防御机制，以抵抗痘苗病毒和其它溶瘤病毒。因此，在将它们用作载体细胞时为保持其高扩增潜能，防止诱导IFN-介导的抗病毒状态可能是有益的。如表47所示，向暴露于IFNβ或IFNγ的干细胞添加50nM鲁索替尼导致与未暴露于IFN的对照细胞大约相同的荧光量。这些结果证明，添加50nM鲁索替尼有效完全逆转了由I型和II型干扰素诱导的抗病毒状态，并使载体细胞敏化以支持病毒感染和扩增。
表47.鲁索替尼在病毒感染的干细胞中的干扰素阻断
Figure BDA0002931076310000871
B.JAK1/2抑制增强了肿瘤细胞的病毒感染和扩增潜能
为确定抑制IFN信号传导是否也使肿瘤细胞对痘苗病毒感染和扩增敏化，将200,000个PC3人前列腺癌细胞与以0.1的MOI预感染L14病毒2小时的20,000个ADSC-RM35干细胞共培养。将20ng/mL I型IFN+20ng/mL II型IFN(有或无5nM或50nM鲁索替尼)添加至共培养物中，并通过荧光成像监测病毒感染和传播的进程长达48小时。未添加IFN或鲁索替尼(Rux)的共培养物用作对照。下表48中总结了结果，其显示了以下的平均荧光强度密度(IntDen)：对照细胞(无IFN/无鲁索替尼)；共培养物+IFN I/II；共培养物+IFN I/II+5nM鲁索替尼；和共培养物+IFN I/II+50nM鲁索替尼。使用以下公式计算IFN抑制逆转百分比：
％干扰素抑制逆转＝[((IntDenRux+IFN-IntDenIFN)/(IntDen对照-IntDenIFN)]×100
结果显示，添加IFN后，肿瘤细胞被病毒感染以及肿瘤细胞对病毒的扩增显著降低。添加5nM鲁索替尼部分逆转了PC3细胞中抗病毒状态的诱导(40％)，并增加了病毒感染和扩增的水平，如增加的病毒编码的TurboFP635荧光信号所证明。添加50nM鲁索替尼在逆转PC3细胞中抗病毒状态的诱导方面非常有效(约91％逆转)，并将病毒感染和扩增的水平恢复至略低于对照细胞。
这些结果表明，对干细胞和肿瘤细胞的固有抗病毒防御机制(例如干扰素信号传导途径)的药理学和/或遗传干扰可用于改善/维持其病毒感染/扩增潜能。这使得载体细胞在体内病毒加载或暴露期间对干扰素的作用具有抗性，改善了其作为溶瘤病毒载体的潜能。因为干扰素介导抗病毒状态在受感染细胞和相邻未感染细胞之间的传播，在载体细胞中阻断抗病毒状态的诱导的额外益处是受抑制的I型干扰素产生可将抗病毒状态的初始传播最小化，从而促进病毒感染的体内传播。
表48.鲁索替尼在病毒感染的干细胞和PC3肿瘤细胞共培养物中的干扰素阻断
条件 平均荧光强度密度 ％IFN抑制的逆转
对照细胞((-)IFN/(-)鲁索替尼) 6.4 -
(+)20ng/mL IFNβ/γ(-)鲁索替尼 2.1 -
(+)20ng/mL IFNβ/γ(+)5nM鲁索替尼 3.8 40.2
(+)20ng/mL IFNβ/γ(+)50nM鲁索替尼 6.0 90.7
实施例7
补体阻断使干细胞和肿瘤细胞对病毒感染和扩增敏化
人血清对某些载体细胞可能具有有害作用，包括在病毒扩增前直接攻击并杀死被病毒感染的载体细胞或中和从载体细胞释放的裸露病毒颗粒，从而限制了病毒向靶肿瘤细胞的传播。为确定表达补体阻断因子的工程化载体细胞是否保护细胞并提高其治疗效力，评价了添加补体肽抑制剂坎普他汀或中和性抗人C3a/C3a(desArg)/C3抗体对载体细胞扩增和递送L14溶瘤痘苗病毒的能力的影响。
A.补体阻断对病毒感染的载体干细胞的影响
将经工程化以表达TurboFP635荧光蛋白的ADSC-RM35载体干细胞用L14痘苗病毒以0.1的MOI感染2小时。通过添加10％人血清(来自供体CBD2)并将L14痘苗病毒编码的TurboFP635荧光信号的积累与未暴露于血清的对照细胞比较来评估补体活性对病毒扩增和传播至未感染的90％载体细胞的影响。
72小时的时程荧光成像显示10％人血清未阻止病毒感染的载体干细胞扩增病毒。为评估阻断补体是否改善载体干细胞的病毒扩增和递送能力，在坎普他汀(其结合补体C3并通过C3转化酶抑制其蛋白水解切割)存在或中和性抗人C3a/C3a(desArg)/C3抗体存在的情况下，将感染病毒的干细胞与人血清温育。在20μM坎普他汀(目录号2585；TocrisBioscience，MN)、50ng/mL同种型对照(目录号400166；BioLegend，San Diego，CA)或50ng/mL抗C3抗体(目录号518104；BioLegend，San Diego，CA)存在的情况下，将ADSC-RM35干细胞用L14痘苗病毒以0.1的MOI感染2小时，并添加10％的人血清(来自供体CBD2)。病毒感染的干细胞与单独的10％人血清温育用作对照。72小时的荧光成像用于比较对照载体细胞(单独的10％人血清)；载体细胞+血清+坎普他汀；载体细胞+血清+同种型对照；和载体细胞+血清+抗C3抗体之间的病毒感染和扩增(通过平均荧光强度密度测量)。
下表49中总结了结果，显示了与对照细胞相比，添加20μM坎普他汀增加荧光信号，从而使载体干细胞中的病毒扩增量增加50％。与对照细胞相比，添加50ng/mL同种型对照未影响荧光信号的强度，而与对照细胞相比，添加50ng/mL抗C3抗体使荧光信号增加12.5％。这些结果表明，用肽抑制剂坎普他汀或抗C3中和抗体对补体的阻断进一步增加了病毒扩增。因此，阻断补体允许累积更高的病毒有效载荷。这可通过共同施用阻断补体的物质，例如用肽或小分子抑制剂预加载携带病毒的细胞和/或将细胞工程化以表达补体抑制剂或通过任何其它合适的方式来实现。
表49.补体阻断对暴露于10％人血清的干细胞中L14感染/扩增的影响
条件 平均荧光强度密度 ％荧光增加
对照细胞(仅10％血清) 0.06 -
10％血清+20μM坎普他汀 0.09 50
10％血清+50μg/mL同种型对照 0.057 -5
10％血清+50μg/mL抗-C3抗体 0.0675 12.5
接下来，针对来自三个不同供体的20％人血清评价了坎普他汀和/或抗C3抗体的补体阻断作用。将ADSC-RM35干细胞用L14痘苗病毒以0.1的MOI感染2小时，并在20μM坎普他汀、10μg/ml抗C3抗体或50μg/mL抗C3抗体存在的情况下，添加来自3个不同供体(CBD1、CBD2和CBD3)的20％人血清。与来自三个供体每一个的20％人血清(无补体阻断)温育的病毒感染的干细胞作为对照。温育后48小时的荧光成像用于比较不同细胞培养物之间的病毒感染和扩增(通过病毒表达的TurboFP635的平均荧光强度密度测量)。下表50中总结了结果，显示了与仅供体CBD1、CBD2和CBD3的对照细胞的血清相比，添加20μM坎普他汀将荧光强度分别提高了27.7％、8.1％和18.7％。与对照细胞相比，添加10μg/mL抗C3抗体使供体CBD1的荧光强度增加6.1％、使供体CBD3的荧光强度增加10.3％、并且使供体CBD2的荧光强度降低0.8％。与供体CBD1、CBD2和CBD3的对照细胞相比，添加50μg/mL抗C3抗体使荧光强度分别提高了20.9％、1.6％和10.3％。这些结果表明，小肽抑制剂坎普他汀(浓度20μM)或抗C3抗体(10μg/mL或50μg/mL)的补体阻断部分逆转了人血清对病毒感染的干细胞的负面影响，并且在多种人血液/血清供体中增强了痘苗病毒传播和扩增。
表50.补体阻断对暴露于3个不同供体的20％人血清的载体细胞中L14感染/扩增的影响
Figure BDA0002931076310000881
B.补体阻断对肿瘤细胞中病毒感染和扩增的影响
为显示阻断补体还增强了病毒向靶肿瘤细胞的传播，将干细胞用L14病毒感染并在存在20％人血清时，在有或无坎普他汀的情况下与肿瘤细胞共培养。20,000个RM35脂肪来源干细胞载体用L14痘苗病毒以1的MOI感染2小时，然后接种至300,000个PC3人前列腺癌细胞的过夜单层中。在存在来自供体CBD2的20％人血清时，添加或未添加20μM坎普他汀的情况下，使病毒感染从干细胞载体向肿瘤细胞的传播进行48小时。将在不存在血清或坎普他汀的情况下的感染病毒的干细胞和肿瘤细胞的共培养物用作对照。48小时后的荧光成像用于确定肿瘤细胞的感染程度，如通过平均荧光强度密度所测量，即来自L14痘苗病毒表达的TurboFP635的荧光信号。
下表51中总结了结果。如荧光强度密度从41.1降低至34.5所证实，添加20％人血清部分地减少了病毒从受感染的载体干细胞向肿瘤细胞的传播。添加20μM坎普他汀将荧光强度密度增加至36.4。因此，使用坎普他汀阻断补体可部分逆转补体介导的病毒传播抑制，并使荧光强度增加28.5％。这些结果表明，使载体细胞敏化以保护其抵御补体增强了病毒向靶PC3肿瘤细胞的传播和在其中的扩增。
总体而言，这些数据确认了阻断补体(例如通过使用经工程化以递送补体阻断剂例如肽抑制剂或补体中和/拮抗抗体的载体细胞)，保护载体细胞以及它们释放的裸病毒颗粒抵御人血清中的中和抗体和补体。这允许积累更高的病毒有效载荷，从而改善载体细胞将溶瘤病毒扩增、递送和传播至肿瘤细胞的能力。
表51.补体阻断对L14感染与感染病毒的载体干细胞和20％人血清共培养的PC3细胞的影响
条件 平均荧光强度密度
对照(无血清、无坎普他汀) 41.1
20％血清 34.5
20％血清+20μM坎普他汀 36.4
实施例8
使用HLA阻断评价同种异体决定因素及其抑制
实施例4证明了尽管存在同种异体屏障，干细胞载体仍可扩增和递送溶瘤痘苗病毒。这是由于它们具有逃避同种异体识别并主动免疫抑制NK细胞、T细胞和表达NK(NKp46)和T细胞(CD3)标志物的“NKT”细胞群的能力。在“不相容/抗性”接受者的亚群中，干细胞不能够逃避同种异体识别，这导致即使在病毒不存在的情况下，产生对载体干细胞的快速有效的同种异体NK、T和NKT细胞应答。这些快速同种异体应答在共培养的48小时内发展，并与抗干细胞细胞毒性应答和IFNγ介导的抗病毒状态的发展相关，抑制干细胞扩增痘苗病毒的能力。这些结果表明，缺乏有效干细胞特异性免疫抑制和免疫逃避能力的非干细胞载体(例如肿瘤细胞)可能受到类似或更强的同种异体限制，限制它们以患者特定方式扩增和递送溶瘤病毒的潜能。进而，这限制了它们的现成使用和有效性。
鉴定、抑制和消除负责同种异体识别和排斥的因子可用于增加同种异体干细胞或肿瘤细胞作为以现成方式递送溶瘤病毒的载体的治疗潜能。此类同种异体排斥决定因素包括被CD8和CD4 T细胞识别的高度多态性和患者特异性的MHC I类和II类分子，以及广泛的较少多态的决定因素，包括MHC样MICA和CD1a、CD1b、CD1c、CD1d分子，以及多种其它应激相关或应激感测分子，例如嗜乳脂蛋白和膜联蛋白A2，其被多种固有T细胞亚群(例如gd(γ)T、iNKT和NKT细胞等)识别。
阻断同种异体MHC I分子以评估其抑制针对载体干细胞和肿瘤细胞的同种异体免疫应答的能力，特别是负责识别和应答同种异体MHC I错配的CD8 T细胞的应答。
A.未感染和感染痘苗病毒的干细胞和肿瘤细胞的免疫细胞消耗
评估了与来自相容和不相容供体的PBMC共培养的未感染和感染痘苗病毒的载体干细胞和肿瘤细胞的免疫抑制性质和免疫细胞消耗潜能。将来自不相容/抗性(CBD1)和相容/允许性(CBD2)供体的300,000个PBMC与10,000个脂肪来源干细胞(RM35)或癌细胞(人前列腺PC3)(其为未感染的对照细胞)或用以MOI为10的ACAM2000痘苗病毒感染2小时的载体细胞共培养60小时。共培养60小时后，分析感染痘苗病毒(VV)的载体干细胞和肿瘤细胞与来自不相容/抗性(CBD1)和相容/允许性(CBD2)接受者的PBMC的共培养物中回收的不同免疫细胞亚型的数量。从单独的CBD1或CBD2PBMC以及与未感染的载体细胞共培养的CBD1或CBD2 PBMC中回收的不同免疫细胞亚型的数量用作对照。通过多参数流式细胞术分析，使用CD69作为活化标志物和如下所示的一组细胞类型特异性标志物鉴定出多种免疫细胞亚型：γδ(gd)T细胞(CD3+，γδTCR+)；iNKT/NKT 1型细胞(CD3+，Va24Ja18+)；普通NKT样细胞(CD3+CD56+；排除gd和iNKT)；经典CD4 T细胞(CD3+CD4+；排除gd和iNKT)；经典CD8 T细胞(CD3+CD8+；排除gd和iNKT)；普通NK细胞(CD3-CD56+)；以及NK亚群CD56highCD16-(产生细胞因子)和CD56lowCD16+(细胞毒性)。
下表52(干细胞)和表53(PC3细胞，人前列腺癌细胞)中总结了结果。表54以％抑制比较了未感染的干细胞和肿瘤细胞的免疫抑制和免疫细胞消耗性质。使用以下公式计算免疫细胞亚型的％抑制：
Figure BDA0002931076310000891
与单独的PBMC(对照)相比，来自不相容/抗性(CBD1)和相容/允许性(CBD2)供体的PBMC与未感染的RM35 ADSC的共培养物导致所有免疫亚型的减少/消耗。这确认了脂肪来源干细胞的强有力的免疫抑制潜力(见表52)。在将CBD1和CBD2 PBMC与PC3肿瘤细胞共培养时也观察到了此类作用，但程度小得多(见表53)，表明干细胞比肿瘤细胞相比具有更优异的免疫抑制性质(见表54))。然而，当将干细胞(表52)和肿瘤细胞(表53)用痘苗病毒预感染(RM35 ADSC(干细胞)+VV或PC3细胞(肿瘤细胞)+VV)并用作载体时，如所有免疫细胞亚型的数量的增加所证实，它们消耗免疫细胞的能力丧失。这些数据与载体细胞被扩增的病毒逐渐杀死并丧失其免疫抑制潜能相一致。
表52.来自感染和未感染的干细胞与来自不相容和相容接受者的PBMC的共培养物的免疫细胞亚型的数量
Figure BDA0002931076310000901
表53.来自感染和未感染的PC3细胞与来自不相容和相容接受者的PBMC的共培养物的免疫细胞亚型的数量
Figure BDA0002931076310000902
表54.来自未感染的干细胞或肿瘤细胞与来自不相容和相容供体的PBMC的共培养物的免疫细胞亚型的％抑制
Figure BDA0002931076310000903
B.应答同种异体载体细胞和痘苗病毒的免疫亚群
使用从PBMC+未感染的载体细胞共培养物和单独的PBMC中回收的各免疫亚群中的CD69+细胞部分，分析免疫活化，确定了应答同种异体干细胞或肿瘤细胞载体的主要免疫细胞群。表55中总结了结果，显示将未感染的干细胞或肿瘤细胞添加至不相容PBMC中后，所有亚型的免疫细胞(除应答干细胞的CD56highCD16-NK细胞)的数量均增加。观察到γδT、iNKT、NKT、普通NK和细胞毒性NK(CD56lowCD16+)细胞的数量变化最大。应答PC3细胞的普通NK和细胞毒性NK细胞数量的增加显著大于应答干细胞的，证实干细胞拥有优越的免疫抑制性质。当未感染的载体细胞与相容PBMC共培养时，免疫应答通常较小，一些情况下一些免疫亚型(例如γδT、iNKT、NKT和CD4 T细胞)的数量减少。这表明不相容同种异体共培养物中的免疫应答大于相容同种异体共培养物中的，证实在同种异体环境中供体-接受者相容性的重要性。
使用从PBMC+感染病毒的载体细胞的共培养物和PBMC+未感染的载体细胞的共培养物回收的各免疫亚群中CD69+细胞部分，分析免疫活化，确定了应答病毒的主要免疫细胞群。表56中总结了这些结果，显示应答病毒的主要免疫细胞亚型包括γδT、iNKT、普通NKT样(CD3+CD56+；除γδT和iNKT)、普通NK、细胞毒性NK(CD56lowCD16+)和产生细胞因子的NK(CD56highCD16-)细胞。在相容和不相容接受者中，相同免疫细胞群应答病毒。在具有干细胞和肿瘤细胞载体的相容接受者环境中，所有T亚群的应答强度均较弱或甚至为阴性(表明抗病毒应答的完全抑制)，证明了用任一类型的同种异体细胞载体，相容性都影响对病毒的应答。在NK细胞的情况下，发现这仅对产生细胞因子的NK细胞(CD56highCD16-)对干细胞载体递送的病毒的应答是正确的，但在相容(而非不相容)的接受者环境中被完全抑制。在两种接受者中，产生细胞因子的NK细胞(CD56highCD16-)对同种异体肿瘤载体细胞递送的病毒的应答同样强。在两种接受者中，对病毒的细胞毒性NK(CD56lowCD16+)细胞应答均非常高且相似。不相容接受者中用同种异体肿瘤细胞载体，对病毒的看似较低的应答反映了即使不存在病毒，这些NK细胞对单独的载体细胞的极高活化(参见表55)，并且也不表示此环境下的较低的抗病毒NK细胞应答。
实施例4证明了表达T细胞(CD3+)和NK细胞(NKp46+)标志物的固有T细胞群对应答溶瘤病毒的同种异体细胞载体的重要作用。表55和表56中总结的数据表明这些固有T细胞群包括γδT细胞、iNKT(I型NKT)细胞和CD56+CD3+NKT(II型NK)细胞。
表55.应答同种异体载体细胞的免疫细胞亚型
Figure BDA0002931076310000911
表56.应答痘苗病毒的免疫细胞亚型
Figure BDA0002931076310000912
C.不相容和相容PBMC对同种异体载体细胞的免疫应答
如表55和表56所示，与相容PBMC相比，与不相容PBMC的共培养物引起显著更高数量的固有免疫T细胞亚群(γδT细胞和CD3+CD56+NKT细胞)，并且针对感染病毒的载体的应答更强。确定了CD69+活化的免疫细胞亚群的数量在所有PBMC中的百分比，并与痘苗病毒感染的干细胞或肿瘤载体细胞共培养的不相容(CBD1)和相容(CBD2)PBMC进行了比较，结果总结于表57中。还计算了不相容和相容PBMC的CD69+活化的免疫细胞亚群的数量，以各特定亚群内的百分比表示，结果总结于表58中。表57示出了各PBMC亚群的CD69+活化的细胞占PBMC总数的分数(％)。表58示出了各PBMC亚群中CD69+活化的细胞占该特定亚群中细胞总数的分数。
不相容(CBD1)和相容(CBD2)PBMC之间的主要区别在于，以不相容PBMC观察到的固有免疫T细胞亚群(γδT细胞和CD3+CD56+NKT细胞)数量显著更高，并且它们针对感染病毒的载体的应答强得多。这可从不同亚型的增加的细胞总数(见表55和56)以及所有PBMC(见表57)或特定亚群(见表58)内CD69+活化的细胞的百分比明显看出。
结果还表明，通常，与肿瘤细胞相比，干细胞作为载体具有优异的免疫抑制/免疫逃避性质，肿瘤细胞刺激更有效活化除NK细胞外的所有固有和适应性免疫亚群(参见表57和58，RM35和PC3)。
表57.在存在感染的干细胞或肿瘤载体细胞的情况下，PBMC的％CD69+免疫亚群
Figure BDA0002931076310000921
表58.在存在感染的干细胞或肿瘤载体细胞的情况下，％CD69+免疫亚群
Figure BDA0002931076310000922
D.HLA阻断抑制对载体细胞的CD8 T细胞应答
如上所述，鉴定、抑制和/或消除负责同种异体识别和排斥的因子可用于增加用于以现成方式递送溶瘤病毒的同种异体干细胞或肿瘤细胞的治疗功效。同种异体排斥决定因素包括被CD8和CD4 T细胞识别的高度多态性和患者特异性的MHC I类和II类分子，以及广泛的较少多态性的决定因素，包括MHC样MICA和CD1a、CD1b、CD1c、CD1d分子，以及多种其它应激相关或应激感测分子，例如嗜乳脂蛋白和膜联蛋白A2，其被多种固有T细胞亚群(例如γδT、iNKT和NKT细胞等)识别。
评价了同种异体MHC I分子的消除/阻断，以评估其是否抑制针对载体干细胞和肿瘤细胞的同种异体免疫应答，特别是负责识别和应答同种异体MHC I错配的CD8 T细胞的应答。将来自不相容和相容供体的300,000个PBMC与用ACAM2000痘苗病毒MOI为10感染2小时的10,000个脂肪来源干细胞(RM35)或癌细胞(人前列腺PC3细胞)共培养60小时。将泛抗HLA阻断抗体(抗HLA抗体；Ultra-LEAFTM纯化的抗人HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体克隆W6/32，目录号311428，BioLegend，San Diego，CA)或同种型对照(Ultra-LEAFTM纯化的小鼠IgG2a，κ同种型对照抗体，克隆MOPC-173，目录号400264；BioLegend，San Diego，CA)添加至共培养物中，以评价HLA阻断对多种固有和适应性免疫细胞群、特别是CD8 T细胞的抗载体细胞应答活化的作用。在存在10μg/mL同种型对照或HLA阻断抗体的情况下，将PBMC与预感染的RM35、ADSC或PC3肿瘤细胞在37℃和5％CO2共培养60小时后，分析免疫活化。使用CD69作为活化标志物和一组细胞类型特异性标志物(包括CD8 T细胞的CD3+CD8+(除γδ和iNKT)和普通NK细胞的CD3-CD56+)通过多参数流式细胞术分析鉴定免疫细胞亚型。
下表59示出了用各与以下共培养的不相容(CBD1)和相容(CBD2)PBMC观察到的CD69+活化的CD8 T细胞和NK细胞的平均百分比：感染病毒的干细胞(RM35 ADSC)；感染病毒的干细胞+同种型对照；感染病毒的干细胞+HLA阻断抗体；感染病毒的肿瘤细胞(PC3)；感染病毒的肿瘤细胞+同种型对照；或病毒感染的肿瘤细胞+HLA阻断抗体。表60示出了有关由HLA阻断介导的CD8 T和NK细胞活化的抑制百分比的结果。使用以下公式计算％抑制：
％抑制＝(1-(具有抗HLA抗体的平均免疫细胞数/具有同种型对照的平均免疫细胞数))×100
如表59所示，同种异体的感染病毒的干细胞与不相容(CBD1)或相容(CBD2)PBMC的共培养物导致7％-12.5％的CD69+CD8 T细胞活化以及超过70％的CD69+NK细胞活化。添加同种型对照未抑制或显著影响免疫细胞应答。然而，在共培养物中添加抗HLA抗体减少了所有共培养物中免疫细胞的数量，对CD8 T细胞的活化有更大影响，尤其在与相容PBMC的共培养物中。例如，如表60所示，用泛HLA阻断抗体阻断HLA导致感染病毒的干细胞与不相容PBMC的共培养物中CD8 T细胞的58％抑制，以及感染病毒的干细胞与相容PBMC的共培养物中CD8 T细胞的86％抑制。通常，感染病毒的肿瘤细胞比感染病毒的干细胞引起更高的NK和CD8 T细胞数量。阻断HLA对PC3细胞产生了与干细胞相似的结果，感染病毒的PC3细胞和不相容PBMC的共培养物中CD8 T细胞活化的58％抑制，以及感染病毒的PC3细胞和相容PBMC的共培养物中CD8 T细胞活化的82％抑制。
这些结果证明了用泛HLA阻断抗体阻断HLA抑制了同种异体抗载体细胞CD8 T细胞应答，以及在一定程度上抑制了NK细胞应答，与不相容CBD1供体相比，阻断活性通常在相容CBD2供体中更有效，特别是在CD8 T细胞应答方面。这些数据与固有T细胞群的更多参与，以及除被经典CD8和CD4 T细胞识别的经典MHC I类和II类分子外，在不相容环境中被γδT和NKT细胞识别的额外的同种异体排斥决定因素以及清除它们的需要相一致。
因此，短暂和/或永久阻断或消除同种异体排斥决定因素，例如HLA(MHC I类)分子和其它，可用于生成具有增强的免疫逃避的基于干细胞或肿瘤细胞的载体。此类载体细胞可更有效地递送溶瘤病毒，而不诱导与细胞毒性T细胞和NK细胞的生成以及诱导抗病毒状态并阻止病毒有效载荷的递送和传播的效应子细胞因子(例如IFNγ)的分泌相关的同种异体应答。
表59.HLA阻断对与不相容和相容PBMC共培养的感染病毒的载体细胞的CD8 T细胞和NK细胞应答的影响
Figure BDA0002931076310000931
表60.HLA阻断介导的CD8 T细胞和NK细胞活化抑制％
Figure BDA0002931076310000932
实施例9
通过调节NKG2D信号传导逃避同种异体识别/排斥
除MHC I类和II类分子外，多种充当免疫共刺激分子的非MHC标志物的参与也增强了对感染病毒的干细胞和肿瘤载体细胞的免疫应答和同种异体排斥。这些非MHC标志物在感染病毒的细胞或转化的肿瘤细胞的表面上上调，并调节载体细胞逃避免疫排斥的能力。这些“应激诱导”的非MHC标志物包括MHC I类相关蛋白，例如人MICA和MICB，其为NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和CD8+T细胞表达的NKG2D受体的配体。因此，NKG2D受体可使表达应激诱导标志物/配体的细胞(例如溶瘤病毒载体)敏化，以通过固有和适应性细胞免疫进行靶向。
评估了NKG2D信号传导的活化对病毒感染的干细胞或肿瘤载体细胞逃避免疫系统的能力的影响。人NKG2D特异性抗体被用于评价NKG2D受体的参与对针对感染病毒的载体细胞的免疫应答的影响。该抗体作为有助于并增强免疫识别和活化细胞免疫应答的强有力的共刺激信号起作用。该NKG2D抗体是行为类似于NKG2D配体例如感染病毒的细胞和肿瘤细胞表达的配体的激动剂抗体。在该实施例中，其添加模拟了NKG2D轴的体内参与和活化。
将脂肪来源干细胞(ADSC-RM35)和肿瘤细胞(人前列腺PC3细胞)各用ACAM2000痘苗病毒以MOI为10预感染2小时。在50μg/ml人NKG2D特异性抗体(目录号MAB139-500，R&DSystems)或50μg/mL小鼠IgG1同种型对照(目录号MAB002，R&D Systems)存在的情况下，将来自不相容(CBD1)和相容(CBD2)供体的300,000个PBMC与10,000个感染病毒的RM35 ADSC或PC3肿瘤细胞在37℃和5％CO2共培养60小时。然后如上所述使用多参数流式细胞术分析，通过确定CD69+γδT细胞(CD3+，γδTCR+)、普通NK细胞(CD3-CD56+)、生成细胞因子的NK细胞亚群(CD56highCD16-)和细胞毒性NK细胞亚群(CD56lowCD16+)的百分比来评估免疫活化。
表61示出了不相容(CBD1)或相容(CBD2)PBMC与感染病毒的干细胞(“VV-ADSC”)的共培养物的结果，并且下表62中示出了其与感染病毒的PC3肿瘤细胞(“VV-PC3”)的共培养物的结果。表示出了在与同种型对照或NKG2D特异性抗体温育的各共培养物中观察到的CD69+活化的γδT细胞、普通NK细胞、CD56highCD16-(产生细胞因子的)NK细胞和CD56lowCD16+(细胞毒性)NK细胞的百分比。使用以下公式计算具有NKG2D活化的CD69+活化的免疫细胞亚群增加的百分比：
％增加＝((具有NKG2D特异性抗体的平均％免疫细胞亚型-具有同种型对照的平均％免疫细胞亚型)/(具有同种型对照的平均％免疫细胞亚型))×100
如表61所示，与同种型对照相比，在所有免疫细胞亚型的不相容(CBD1)和相容(CBD2)环境中，用NKG2D抗体温育增加了对感染病毒的干细胞载体的免疫活化/应答。γδT细胞和产生细胞因子的CD56highCD16-NK细胞的活化最显著，在不相容和相容环境中，γδT细胞分别增加16.5％和27.4％，在不相容和相容环境中，CD56highCD16-NK分别增加83.3％和51.5％。对高细胞毒性CD56lowCD16+NK亚群的影响最小，这可归因于NKG2D抗体阻断了细胞毒性NK细胞与细胞载体之间的接触。这些结果表明，NKG2D信号传导/参与参与了针对感染的载体细胞的免疫应答的调节。
表62中的结果显示，将NKG2D抗体和感染病毒的肿瘤细胞与不相容或相容PBMC的共培养物一起温育未增加相同免疫细胞亚群的活化。与干细胞载体相比，这些结果与针对肿瘤细胞载体的更强有力的免疫学应答以及它们逃避同种异体识别的能力降低相一致。针对干细胞和肿瘤细胞载体的相反免疫应答可归因于NKG2D途径在应答转化的/肿瘤细胞更加活跃。这是由于NKG2D配体(例如MIC-A/B)在肿瘤细胞上的组成性表达水平较高，使其更易于识别。与同种型对照相比，添加行为类似NKG2D配体的NKG2D抗体未增加针对肿瘤细胞载体的免疫活化，因为肿瘤细胞已显示出增加的NKG2D配体表达水平。
数据表明，NKG2D途径参与控制感染病毒的载体细胞的免疫逃避能力。因此，消除NKG2D配体如MIC-A/B和/或其它，可改善细胞载体的免疫逃避性质。这在表现出较高基础水平的应激诱导配体表达的肿瘤细胞载体的背景下尤其相关。在感染病毒的未转化干细胞中消除NKG2D配体也可改善其免疫逃避性质，因为随着病毒感染的进行，这些细胞还上调了应激诱导配体的表达。为此，可对载体细胞进行工程化以短暂或永久抑制膜结合MICA/B的表达。或者，可抑制NKG2D受体与其配体之间的相互作用。例如，可对载体细胞进行工程化以短暂或永久表达MIC-A和MIC-B的拮抗剂(例如kK5(KHSV))和/或NKG2D受体的拮抗剂(例如牛痘OMCP)。或者，可用拮抗剂或阻断抗体例如抗NKG2D单克隆抗体(参见例如Kim等(2010)Immunology 130：545-555)预处理细胞以防止其配体的结合，充当拮抗剂。
表61.NKG2D活化对感染病毒的干细胞与不相容和相容PBMC的共培养物中CD69+活化的免疫亚群的％的影响
Figure BDA0002931076310000941
表62.NKG2D活化对感染病毒的肿瘤细胞与不相容和相容PBMC的共培养物中CD69+活化的免疫亚群的％的影响
Figure BDA0002931076310000942
Figure BDA0002931076310000951
实施例10
经敏化/工程化以分泌免疫抑制因子的载体细胞
干细胞和肿瘤细胞使用多种免疫抑制和逃避策略，包括IDO表达和IL-10分泌。然而，病毒在载体细胞中的扩增引起细胞活力和免疫抑制潜能的逐渐丧失。为克服这一限制，评估了高剂量免疫抑制细胞因子IL-10逆转病毒介导的免疫抑制性质丧失和改善感染病毒的载体细胞逃避同种异体排斥/应答或早期免疫识别的能力的能力。
如上文实施例8中所述，在存在或不存在外源提供的重组人IL-10(哺乳动物表达，无载体)(目录号573202；BioLegend，San Diego，CA)的情况下，将未感染或感染痘苗病毒的载体细胞(RM35 ADSC-干细胞或PC3-肿瘤细胞)与不相容(CBD1)和相容(CBD2)PBMC共培养。简而言之，将来自不相容和相容供体的各300,000个PBMC与被ACAM2000痘苗病毒以MOI为10感染2小时的10,000个脂肪来源干细胞(RM35)或肿瘤细胞(人前列腺PC3细胞)共培养60小时。在存在或不存在10nM重组人IL-10的情况下，将PBMC与预感染的ADSC-RM35或PC3肿瘤细胞在37℃和5％CO2共培养60小时后，分析免疫活化。使用CD69作为活化标志物以及先前描述的一组细胞类型特异性标志物(参见实施例8)通过多参数流式细胞术分析鉴定并列举了多种免疫细胞亚型。下表63示出了从不相容或相容PBMC与以下的共培养物中回收的各CD69+活化的免疫细胞亚群的平均数量：未感染的干细胞；感染痘苗病毒的干细胞；或感染痘苗病毒的干细胞+IL-10。表64示出了未感染和感染痘苗病毒的PC3肿瘤细胞的共培养物的相同数据。表65以IL-10介导的免疫细胞亚型抑制百分比来描述结果，其使用如下公式计算：
％IL-10抑制＝(1-(感染病毒的载体细胞+IL10的平均免疫细胞数量/感染病毒的载体细胞的平均免疫细胞数量))×100
如表63和表64所示，与未感染的载体细胞相比，感染病毒的干细胞和肿瘤细胞载体引发了所有免疫细胞亚型中的免疫应答，不相容(CBD1)相对相容(CBD2)PBMC的共培养物中应答更强。病毒感染的肿瘤细胞引发了更多数量的所有免疫细胞亚型，这与干细胞拥有增强的免疫抑制和免疫逃避性质的事实一致。添加IL-10未阻止应答感染病毒的载体细胞的免疫活化，但显著抑制了在相容和不相容两种环境下以及与感染病毒的干细胞(表63)或肿瘤细胞(表64)的共培养物中测试的所有免疫亚型中CD69+活化的免疫细胞的数量。通常，IL-10介导的抑制的效力在感染病毒的干细胞与相容性PBMC的共培养物中最强(见表65)。这些结果与在不相容环境(CBD1 vs.CBD2)中针对载体细胞(肿瘤或干细胞)的更强有力的同种异体应答一致。数据表明，IL-10和其它免疫抑制因子在干细胞或肿瘤细胞载体中的工程化表达可维持和扩展载体细胞的免疫抑制性质，使其能够逃避免疫识别和同种异体排斥。反过来，在受到免疫系统攻击之前，这可通过改善病毒扩增、递送和传播到靶肿瘤细胞的能力来增强其治疗功效。
为此，可对载体细胞进行工程化以短暂或永久表达人或病毒来源的免疫抑制因子。例如，载体细胞可被工程化以表达人类来源的免疫抑制因子，例如但不限于IDO、精氨酸酶、TRAIL、iNOS、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、sMICA、sMICB、sHLA-G、HLA-E、PD-L1、FAS-L、B7-H4和靶向或消耗NK和/或NKT细胞的单链抗体(scFv)。载体细胞还可被工程化以表达病毒来源的免疫抑制因子，例如但不限于鼠痘/痘苗病毒SPI-2/CrmA(免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡抑制剂)；痘苗病毒编码的N1(IL-1/NFKB/IRF3拮抗剂)；HA(靶向NKp30、NKp44、NKp46的NCR拮抗剂)；IL-18结合蛋白；A40R；A46R；A52R；B15R/B16R；TNFα阻断剂(例如痘苗病毒CmrC/CmrE)；IFNα/β阻断剂(例如痘苗病毒B18R/B19R)；IFNγ阻断剂(例如痘苗病毒B8R)；和其它IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D拮抗剂。
表63.IL-10对未感染和病毒感染的干细胞与不相容和相容PBMC的共培养物中CD69+免疫细胞亚型平均数量的影响
Figure BDA0002931076310000952
Figure BDA0002931076310000961
表64.IL-10对肿瘤细胞与不相容和相容PBMC的共培养物中CD69+免疫细胞亚型平均数量的％影响
Figure BDA0002931076310000962
表65.对干细胞和肿瘤细胞与不相容和相容PBMC的共培养物中免疫细胞亚型的％IL-10介导抑制
Figure BDA0002931076310000963
由于修饰对于本领域技术人员是明显的，因此本发明旨在仅由所附权利要求书的范围来限制。

Claims (165)

1.一种载体细胞，其包含溶瘤病毒，其中：
所述病毒可在所述细胞中复制；
所述细胞可施用于人类对象；
所述细胞已被处理或修饰或两者皆有，以增强所述细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质，以施用于人类对象；和
任选地，所述细胞已被处理或修饰以增强所述病毒在所述细胞中的扩增。
2.权利要求1的细胞，其中：
所述细胞已被处理或修饰或两者皆有，以增强所述细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质，以施用于人类对象；和
所述细胞已被处理或修饰以增强所述病毒在所述细胞中的扩增。
3.权利要求1或2的细胞，其中所述细胞允许溶瘤病毒扩增，并且在肿瘤中积累和/或在足以将病毒递送至对象中肿瘤的时间内不被所述对象的免疫系统识别。
4.权利要求1-3中任一项的细胞，其选自经处理或修饰的干细胞、免疫细胞和肿瘤细胞。
5.权利要求1-4中任一项的细胞，其已从对象中取出或获取并已用所述溶瘤病毒感染。
6.权利要求1-5中任一项的细胞，其为干细胞。
7.权利要求6的细胞，其中所述干细胞不是胚胎细胞或胎儿细胞或衍生自胚胎细胞系。
8.权利要求6的细胞，其选自成体干细胞、胚胎干细胞和胎儿干细胞。
9.权利要求6的细胞，其选自间充质干细胞、神经干细胞、全能干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞、脂肪基质干细胞、内皮干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、成体外周血干细胞、成肌细胞干细胞、小幼年干细胞、上皮干细胞、胚胎上皮干细胞和成纤维细胞干细胞。
10.权利要求6-9中任一项的细胞，其为间充质干细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述间充质干细胞选自来自以下的间充质细胞：成年骨髓、脂肪组织、血液、牙髓、新生儿脐带、脐带血、胎盘、胎盘来源的粘附基质细胞、胎盘来源的蜕膜基质细胞、子宫内膜再生细胞、胎盘双能内皮/间充质祖细胞、羊膜或液体间充质干细胞、羊水来源的祖细胞、Wharton's jelly间充质干细胞、骨盆带干细胞、绒毛膜绒毛间充质干细胞、皮下白色脂肪间充质干细胞、周细胞、外膜网状干细胞、毛囊来源的干细胞、造血干细胞、骨膜来源的间充质干细胞、侧板间充质干细胞、脱落的乳齿干细胞、牙周韧带干细胞、牙囊祖细胞、来自端突的干细胞和肌肉卫星细胞。
12.权利要求1-9中任一项的细胞，其为脂肪基质细胞。
13.权利要求12的细胞，其为脂肪基质间充质细胞。
14.权利要求6-9中任一项的细胞，其为选自内皮祖细胞、胎盘内皮祖细胞、血管生成内皮细胞和周细胞的内皮细胞。
15.权利要求6-9中任一项的细胞，其为胚胎上皮细胞。
16.权利要求1-5中任一项的细胞，其为免疫细胞。
17.权利要求16的细胞，其中所述免疫细胞选自粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、靶向肿瘤特异性抗原的T细胞受体(TCR)转基因细胞和靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞。
18.权利要求1-5中任一项的细胞，其为来自血液恶性肿瘤细胞系的经修饰或处理的细胞。
19.权利要求1-5中任一项的细胞，其对于所述待治疗的对象是同种异体的。
20.权利要求1-5中任一项的细胞，其为脂肪来源的干细胞。
21.权利要求1-5中任一项的细胞，其为来自细胞系的细胞，其中所述细胞系选自人白血病细胞系、T细胞白血病细胞系、髓单核细胞白血病细胞系、淋巴瘤细胞系、非霍奇金淋巴瘤细胞系、伯基特淋巴瘤细胞系、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系、急性髓性白血病(AML)细胞系、慢性髓性白血病(CML)细胞系、急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞系、红白血病细胞系、髓单核母细胞白血病细胞系、恶性非霍奇金氏NK淋巴瘤细胞系、骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系、多发性骨髓瘤细胞系和巨噬细胞细胞系。
22.权利要求21的细胞，其中所述细胞系选自：
白血病细胞系，其为KASUMI-1、HL-60、THP-1、K-562、RS4；11、MOLT-4、CCRF-CEM、JVM-13、31E9、ARH-77、MoB、JM1、NALM-1或ProPak-X.36；
T细胞白血病细胞系，其为HM-2、CEM-CM3、Jurkat/Jurkat克隆E6-1、J.CaM1.6、BCL2Jurkat、BCL2 S87A Jurkat、BCL2 S70A Jurkat、Neo Jurkat、BCL2 AAA Jurkat、J.RT3-T3.5、J45.01、J.gamma1、J.gamma1.WT、JK28、P116、P116.cl39、A3、JX17、D1.1、I9.2或I2.1；
髓单核细胞白血病细胞系，其为MV-4-11；
淋巴瘤细胞系，其为HT、BC-3、CA46、Raji、Daudi、GA-10-Clone-4、HH或H9；
非霍奇金淋巴瘤细胞系，其为SU-DHL-1、SU-DHL-2、SU-DHL-4、SU-DHL-5、SU-DHL-6、SU-DHL-8、SU-DHL-10、SU-DHL-16、NU-DUL-1、NCEB-1、EJ-1、BCP-1、TUR或U-937；
伯基特淋巴瘤细胞系，其为Ramos/RA 1、Ramos.2G6.4C10、P3HR-1、Daudi、ST486、Raji、CA46、来自伯基特淋巴瘤患者的人γ-疱疹病毒4/HHV-4颊癌、DG-75、GA-10、NAMALWA、HS-Sultan、Jiyoye、NC-37、20-B8、EB2、1G2、EB1、EB3、2B8、GA-10克隆20或HKB-11/肾脏-B细胞杂交体；
弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系，其为Toledo或Pfeiffer；
套细胞淋巴瘤细胞系，其为JeKo-1、JMP-1、PF-1、JVM-2、REC-1、Z-138、Mino或MAVER-1；
AML细胞系，其为AML-193、BDCM、KG-1、KG-1a、Kasumi-6或HL-60/S4；
CML细胞系，其为K562、K562-r、K562-s、LAMA84-r、LAMA84-s、AR230-r或AR230-s；
ALL细胞系，其为N6/ADR、RS4；11、NALM6克隆G5、Loucy、SUP-B15或CCRF-SB；
红白血病细胞系，其为IDH2-突变体-TF-1同基因细胞系；
髓单核母细胞白血病细胞系，其为GDM-1；
恶性非霍奇金NK淋巴瘤细胞系，其为NK-92或NK-92MI；
骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系，其为U266B1/U266、HAA1、SA13、RPMI-8226、NCI-H929或MC/CAR；
多发性骨髓瘤细胞系，其为MM.1R、IM-9或MM.1S；以及
巨噬细胞细胞系，其为MD、SC或WBC264-9C。
23.权利要求1-5中任一项的细胞，其为选自以下的经修饰或处理的细胞：
间充质干细胞系，其为APCETH-201(APCETH)、APCETH-301(APCETH)、Cx601(TIGENIX)、TEMCELL、MSC-100-IV或Prochymal(MESOBLAST)；
诱导多能干细胞(iPSC)，其为ToleraCyte(Fate Therapeutics)；
成纤维细胞细胞系，其为CCD-16Lu或WI-38；
肿瘤相关成纤维细胞细胞系，其为Malme-3M、COLO 829、HT-144、Hs 895.T、hTERT或PF179T CAF；
内皮细胞系，其为HUVEC、HUVEC/TERT 2或TIME；
胚胎上皮细胞系，其为HEK-293、HEK-293STF、293T/17、293T/17SF或HEK-293.2sus；
胚胎干细胞系，其为hESC BG01V；以及
上皮细胞系，其为NuLi-1、ARPE-19、VK2/E6E7、Ect1/E6E7、RWPE-2、WPE-stem、End1/E6E7、WPMY-1、NL20、NL20-TA、WT9-7、WPE1-NB26、WPE-int、RWPE2-W99或BEAS-2B。
24.权利要求1-9中任一项的细胞，其为来自人血液恶性肿瘤细胞系的细胞系的经修饰或处理的细胞。
25.权利要求1-9中任一项的细胞，其为来自人肿瘤细胞系的经修饰或处理的细胞。
26.权利要求25的细胞，其中所述细胞系选自NCI-60组细胞系、纤维肉瘤细胞系、肝癌细胞系、前列腺癌细胞系、乳腺癌细胞系、头颈癌细胞系、肺癌细胞系、胰腺癌细胞系、卵巢癌细胞系、结肠癌细胞系、胃癌细胞系、妇科癌细胞系、肉瘤细胞系、黑色素瘤细胞系、鳞状细胞癌细胞系、肝细胞癌细胞系、膀胱癌细胞系、肾细胞癌细胞系、胚胎癌细胞系、睾丸畸胎瘤细胞系、胶质母细胞瘤细胞系、星形细胞瘤细胞系、甲状腺癌细胞系或间皮瘤细胞系。
27.权利要求1-9中任一项的细胞，其为来自GM-CSF全肿瘤细胞疫苗(GVAX)的经修饰或处理的细胞。
28.权利要求27的细胞，其中所述GVAX是GVAX前列腺细胞；GVAX胰腺细胞；GVAX肺细胞；或GVAX肾细胞。
29.权利要求1-28中任一项的细胞，其中所述溶瘤病毒选自新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、痘病毒、柯萨奇病毒(CXV)和塞内卡谷病毒(SVV)。
30.权利要求1-29中任一项的细胞，其中所述溶瘤病毒是痘苗病毒。
31.权利要求1-29中任一项的细胞，其中所述溶瘤病毒是为天花疫苗的痘苗病毒。
32.权利要求30或31的细胞，其中所述痘苗病毒选自李斯特株、西储(WR)株、哥本哈根(Cop)株、伯尔尼株、巴黎株、塔什干株、天坛株、惠氏株(DRYVAX)、IHD-J株、IHD-W株、布莱顿株、安卡拉株、CVA382株、大连I株、LC16m8株、LC16M0株、修饰的痘苗安卡拉(MVA)株、ACAM株、WR 65-16株、康诺特株、纽约市健康委员会(NYCBH)株、EM-63株、NYVAC株、李斯特株LIVP、JX-594株、GL-ONC1株以及缺失VGF和TK的vvDD TK突变株。
33.权利要求32的细胞，其中所述痘苗病毒是ACAM2000或ACAM1000。
34.权利要求1-33中任一项的细胞，其中所述病毒经修饰以表达异源基因产物和/或具有增加的致肿瘤性和/或具有降低的毒性(增加的减毒作用)。
35.权利要求1-34中任一项的细胞，其中所述溶瘤病毒编码可检测标志物。
36.权利要求35的细胞，其中所述标志物是荧光蛋白。
37.权利要求29的细胞，其中所述病毒是腺病毒，其为ONYX-015、CG00070、Oncorin(H101)、ColoAd1、ONCOS-102或Delta24-RGD/DNX-2401。
38.权利要求1-29和34-36中任一项的细胞，其中所述病毒是修饰的HSV-1病毒。
39.权利要求1-38中任一项的细胞，其中所述细胞已被敏化或处理以实现或增强或改善以下一种或多种：在所述细胞中的病毒扩增、阻断所述对象或肿瘤微环境中抗病毒状态的诱导、免疫抑制/免疫逃避、针对同种异体失活/排斥决定因素的保护和/或针对补体的保护。
40.权利要求39的细胞，其已被敏化以增强或改善病毒扩增。
41.权利要求39的细胞，其已被敏化或处理以阻断所述对象或肿瘤微环境中抗病毒状态的诱导。
42.权利要求39的细胞，其已通过用一种或多种细胞因子或生长因子预处理或处理而被敏化，以增强病毒扩增。
43.权利要求1-42中任一项的细胞，其经处理以抑制干扰素-γ和/或干扰素-β或经修饰以表达干扰素-γ和/或干扰素-β的抑制剂。
44.权利要求39-43中任一项的细胞，其已通过预处理或处理以使所述细胞加载IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、GM-CSF、RTK/mTOR激动剂、Wnt蛋白配体和GSK3抑制剂/拮抗剂中的一种或多种而被敏化，以增强病毒扩增。
45.权利要求1-44中任一项的细胞，其已通过预处理或处理以使所述细胞加载一种或多种小分子或蛋白质抑制剂而被敏化以阻断抗病毒状态的诱导，所述小分子或蛋白质抑制剂：干扰I型/II型IFN受体、干扰下游信号传导、干扰IFNAR1/IFNAR2信号传导、干扰IFNGR1/IFNGR2信号传导、干扰STAT1/2信号传导、干扰Jak1信号传导、干扰Jak2信号传导、干扰IRF3信号传导、干扰IRF7信号传导、干扰IRF9信号传导、干扰TYK2信号传导、干扰TBK1信号传导或干扰针对细胞或对象中的溶瘤病毒实现免疫应答的其它信号传导途径。
46.权利要求1-45中任一项的细胞，其已通过预处理或处理以使所述细胞加载一种或多种HDAC抑制剂以干扰/解除IFN信号传导/响应性而被敏化，以阻断抗病毒状态的诱导。
47.权利要求46的细胞，其中所述HDAC抑制剂选自伏立诺他、罗米地辛、西达本胺、帕比司他、贝利司他、丙戊酸、莫塞替诺特、艾贝司他、恩提诺特、SB939、瑞米司他、吉维诺特、quisinostat、HBI-8000，Ketvetrin、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、萝卜硫素和曲古抑菌素。
48.权利要求1-47中任一项的细胞，其已通过预处理或处理以使所述细胞加载病毒感测和/或抗病毒防御途径的拮抗剂而被敏化，以阻断抗病毒状态的诱导或增强病毒扩增。
49.权利要求48的细胞，其中所述病毒感测和/或防御途径由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)中的一种或多种介导。
50.权利要求49的细胞，其中所述拮抗剂选自K1、E3L和K3L痘苗病毒蛋白；NS1/NS2流感病毒蛋白；丙型肝炎病毒NS3-4A；沙粒病毒NP和Z蛋白；埃博拉病毒VP35；HSV US11，ICP34.5和ICP0；MCMV M45和博纳病病毒X蛋白中的一种或多种。
51.权利要求1-50中任一项的细胞，其已被敏化以抵御失活/排斥决定因素。
52.权利要求1-51中任一项的细胞，其中已通过预处理或处理以使所述细胞加载一种或多种病毒主要组织相容性复合物(MHC)拮抗剂，使所述细胞敏化以抵御失活/排斥决定因素。
53.权利要求52的细胞，其中所述MHC拮抗剂选自以下的一种或多种：痘苗病毒的A40RMHCI拮抗剂；HIV的Nef和TAT；腺病毒的E3-19K；HSV 1和HSV2的ICP47；牛痘的CPXV012和CPXV203；水痘带状疱疹病毒(VZV)的ORF66；爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的EBNA1、BNLF2a、BGLF5和BILF1；人巨细胞病毒(hCMV)的US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10和US11/gp33；恒河猴CMV(RhCMV)的Rh178/VIHCE；人疱疹病毒(HHV)6或HHV7的U21；卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1和kK5/MIR2；小鼠肝炎病毒68(MHV-68)的mK3；α疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒2(BHV-1)和伪狂犬病病毒(PRV)的UL41/vhs；水痘病毒、BHV-1、马疱疹病毒1和4(EHV-1/4)和PRV的UL49.5；以及鼠CMV(mCMV)的m4/gp34、m6/gp48、m27、m152/gp40。
54.权利要求51的细胞，其中已通过预处理或处理以使所述细胞加载人MHC I类链相关基因MIC-A和MIC-B的拮抗剂或病毒来源的β2微球蛋白(B2M)拮抗剂使所述细胞敏化以抵御失活/排斥决定因素。
55.权利要求39的细胞，其中已通过预处理或处理以使所述细胞加载病毒来源的免疫抑制因子使所述细胞敏化以增强免疫抑制/免疫逃避。
56.权利要求55的细胞，其中所述免疫抑制因子选自以下的一种或多种：免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡的抑制剂；IL-1/NFKB/IRF3拮抗剂；IL-1和Toll样受体(TLR)拮抗剂；IL-1β拮抗剂；TNFα阻断剂；IFNα/β阻断剂和IFNγ阻断剂。
57.权利要求39的细胞，其中已通过预处理或处理以使所述细胞加载抗原肽转运蛋白1/2(TAP-1和TAP-2)和tapasin中一种或多种的一种或多种小分子抑制剂使所述细胞敏化以增强免疫抑制/免疫逃避。
58.权利要求1-57中任一项的细胞，其中所述细胞已被敏化以抵御补体。
59.权利要求58的细胞，其已通过预处理或处理以使所述细胞加载补体蛋白的抗体或小分子或其它抑制剂而被敏化。
60.权利要求59的细胞，其中所述补体蛋白是C3或C5。
61.权利要求39-60中任一项的细胞，其中所述细胞在病毒感染前或施用于所述对象前或在储存前用所述敏化或保护的物质预处理15分钟至48小时。
62.权利要求1-61中任一项的细胞，其中所述细胞已被敏化以对病毒介导的杀伤具有延长的存活和改善的局部免疫抑制。
63.权利要求62的细胞，其用以下一种或多种的一或多种激动剂预处理：STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)。
64.权利要求1-63中任一项的细胞，其通过以下一种或多种被工程化以改善病毒扩增和/或免疫调节：
a)工程化以防止干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性；
b)工程化以逃避T和NKT细胞中一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种适应性免疫应答；
c)工程化以逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种先天性免疫应答；
d)工程化以表达人或病毒来源的免疫抑制因子以防止/抑制同种异体抗载体细胞或抗病毒免疫应答；
e)工程化以表达癌症或干细胞衍生的因子，其促进原本非允许性的载体细胞和/或肿瘤细胞的病毒感染；和
f)工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。
65.权利要求64的细胞，其a)经工程化以通过短暂或永久抑制I型/II型IFN受体和/或下游信号传导而对干扰素诱导的抗病毒状态无反应性，其中永久抑制可通过缺失被抑制的基因座来实现。
66.权利要求65的细胞，其中抑制是通过抑制以下一种或多种来实现的：I型/II型干扰素受体表达、IFNα/β受体表达、IFNγ受体表达、IFNAR1/IFNAR2受体表达、IFNGR1/IFNGR2受体表达、STAT1/2受体表达、Jak1/2受体表达、IRF3受体表达、IRF7受体表达、IRF9受体表达、TYK2激酶表达和TBK1激酶表达。
67.权利要求64的细胞，其a)经工程化以通过短暂或永久抑制胞质病毒DNA/RNA感测和抗病毒防御机制的元件而对干扰素诱导的抗病毒状态无反应性。
68.权利要求67的细胞，其中，通过抑制STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)中的一种或多种来实现抑制。
69.权利要求64的细胞，其a)经工程化以通过短暂或永久表达由STING、PKR、RIG-1、MDA-5、OAS-1/2/3、AIM2、MAVS、RIP-1/3和DAI(ZBP1)介导的病毒感测和抗病毒防御途径的拮抗剂而预防干扰素诱导的抗病毒状态或对其无反应性。
70.权利要求69的细胞，其中所述拮抗剂选自K1、E3L和K3L牛痘蛋白；NS1/NS2甲型流感蛋白；丙型肝炎NS3-4A；沙粒病毒NP和Z蛋白；埃博拉病毒VP35；HSV US11，ICP34.5和ICP0；MCMV M45和博纳病病毒X蛋白中的一种或多种。
71.权利要求64-70中任一项的细胞，其b)经工程化以逃避T和NKT细胞中一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种适应性免疫应答。
72.权利要求71的细胞，其中工程化以逃避T和NKT细胞中一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种适应性免疫应答通过以下一种或两种实现：
(i)短暂或永久抑制以下的一种或多种：MHC I类分子、MHC II类分子、MHC样分子以及MHC I类、MHC II类、MHC样分子的转录或表达的调节物；以及
(ii)短暂或永久表达病毒来源的B2M拮抗剂和/或病毒来源的MHC拮抗剂。
73.权利要求72的细胞，其中：
一种或多种MHC I类分子的短暂或永久抑制通过HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的永久或短暂抑制来实现；
一种或多种MHC II类分子的短暂或永久抑制通过HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中一种或多种的抑制来实现；
一种或多种MHC样分子的短暂或永久抑制通过抑制CD1a/b/c/d来实现；以及
MHC I类、MHC II类和MHC类分子的转录或表达的一种或多种调节物的短暂或永久抑制通过TAP1/2、Tapasin、Beta-2微球蛋白、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP中一种或多种的抑制来实现。
74.权利要求72或73的细胞，其中B2M和/或MHC的短暂或永久抑制通过以下一种或多种的短暂或永久表达来实现：
选自hCMV的UL18的病毒来源的B2M拮抗剂；以及
一种或多种MHC拮抗剂，其选自以下的一种或多种：牛痘的A40R MHCI拮抗剂；HIV的Nef和TAT；腺病毒的E3-19K；HSV 1和HSV2的ICP47；牛痘的CPXV012和CPXV203；水痘带状疱疹病毒(VZV)的ORF66；爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的EBNA1、BNLF2a、BGLF5和BILF1；人巨细胞病毒(hCMV)的US2/gp24、US3/gp23、US6/gp21、US10和US11/gp33；恒河猴CMV(RhCMV)的Rh178/VIHCE；人疱疹病毒6或HHV7的U21；卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的LANA1、ORF37/SOX、kK3/MIR1和kK5/MIR2；小鼠肝炎病毒68(MHV-68)的mK3；α疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒2(BHV-1)和伪狂犬病病毒(PRV)的UL41/vhs；水痘带状疱疹病毒、BHV-1、马疱疹病毒1和4(EHV-1/4)和PRV的UL49.5；以及鼠CMV(mCMV)的m4/gp34、m6/gp48、m27和m152/gp40。
75.权利要求64-74中任一项的细胞，其c)经工程化以通过以下的一种或两种来逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种先天性免疫应答：
(i)膜结合的MICA/B或膜结合的PVR或膜结合的连接蛋白-2的短暂或永久抑制，其中可通过缺失基因座来实现永久抑制；以及
(ii)MIC-A和MIC-B的拮抗剂、NKG2D受体的拮抗剂、NCR的拮抗剂、NK抑制性受体(KIR)的配体或NK抑制性受体NKG2a/CD94的配体的短暂或永久表达。
76.权利要求64-75中任一项的细胞，其为c)工程化以通过以下一种或两种来逃避NK细胞的同种异体识别：
(i)短暂或永久抑制NKG2D配体和/或DNAM-1配体；以及
(ii)短暂或永久表达：
MIC-A和MIC-B kK5的拮抗剂(来自卡波济氏肉瘤病毒(KHSV))；
NKG2D受体牛痘OMCP的拮抗剂；
靶向NKp30、NKp44、NKp46受体、血细胞凝集素(牛痘和其它病毒的HA)的NCR的拮抗剂；
选自HLA-Bw4和HLA-C2的NK抑制性受体(KIR)的配体；和/或
NK抑制性受体(NKG2a/CD94)的配体，其选自单独的HLA-E和衍生物或与21M HLA-B配体组合以生成HLA-E结合肽并稳定HLA-E表面表达的HLA-E和衍生物。
77.权利要求64-76中任一项的细胞，其d)经工程化以表达免疫抑制因子以防止/抑制同种异体抗载体细胞或抗病毒免疫应答。
78.权利要求64-77中任一项的细胞，其d)经工程化以表达免疫抑制因子以防止/抑制选自人或病毒来源的因子的同种异体抗细胞媒介或抗病毒免疫应答。
79.权利要求78的细胞，其中所述人类来源的因子选自以下的一种或多种：IDO、精氨酸酶、TRAIL、iNOS、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、sMICA、sMICB、sHLA-G、HLA-E、PD-L1、FAS-L、B7-H4和靶向或消耗NK和/或NKT细胞和/或γδT细胞的单链抗体(scFv)。
80.权利要求78的细胞，其中所述病毒来源的因子选自以下的一种或多种：鼠痘病毒/牛痘病毒SPI-2/CrmA(免疫FAS/TNF/粒酶B诱导的凋亡的抑制剂)、牛痘病毒编码的N1(IL-1/NFkB/IRF3拮抗剂)、HA(靶向NKp30、NKp44、NKp46的NCR拮抗剂)、IL-18结合蛋白、A40R、A46R、A52R、B15R/B16R、TNFα阻断剂、IFNα/β阻断剂，IFNγ阻断剂以及其它IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D拮抗剂。
81.权利要求64-80中任一项的细胞，其e)经工程化以表达癌症或干细胞衍生因子，所述因子促进病毒感染原本不允许的载体细胞和/或肿瘤细胞。
82.权利要求64-81中任一项的细胞，其e)经工程化以表达癌症或干细胞衍生因子，所述因子促进病毒感染原本不允许的细胞媒介和/或肿瘤细胞，其中所述因子选自一种或多种促进病毒感染的生长因子和细胞因子。
83.权利要求64-82中任一项的细胞，其e)经工程化以表达癌症或干细胞衍生因子，所述因子促进病毒感染原本不允许的载体细胞和/或肿瘤细胞，其中所述因子选自以下的一种或多种：癌症相关抗原、癌胚抗原、癌基因/肿瘤抑制物、分化抗原、GM-CSF、IL-10、TGFβ、VEGF、FGF-2、PDGF、HGF、IL-6、RTK/mTOR激动剂和Wnt蛋白配体。
84.权利要求64-83中任一项的细胞，其f)经工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。
85.权利要求64-84中任一项的细胞，其f)经工程化以表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子，其选自补体蛋白的蛋白质拮抗剂和/或抑制补体蛋白的抗体。
86.权利要求64-85中任一项的细胞，其f)经工程化以表达干扰补体和/或中和抗体功能的因子，其选自补体因子(C1、C2、C3、C4、C5、MBL)的蛋白质拮抗剂、痘苗病毒补体控制蛋白(VCP)、痘苗病毒补体抑制剂(B5R)、scFv抗-CD1q/CD1r/CD1s、抗-C3抗体、抗-C5抗体、坎普他汀家族的肽类C3抑制剂、人可溶性膜(s/m)蛋白、人H因子和衍生物，以及眼镜蛇毒因子和具有补体抑制活性的衍生物。
87.一种治疗癌症的方法，包括向患有癌症的对象施用权利要求1-86中任一项的细胞。
88.权利要求1-86中任一项的细胞在治疗患有癌症的对象中的用途。
89.权利要求87的方法或权利要求88的用途，其中所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
90.权利要求87-89中任一项的方法或用途，其中所述细胞对于所述对象是同种异体的。
91.权利要求87-89中任一项的方法或用途，其中所述细胞对于所述对象是自体的。
92.权利要求87-90中任一项的方法或用途，其中所述细胞已与所述对象匹配。
93.权利要求87-90中任一项的方法或用途，其包括通过匹配测定将所述细胞与将施用所述细胞的对象匹配。
94.一种治疗癌症的方法，包括向对象施用包含溶瘤病毒的载体细胞，其中：
所述载体细胞匹配所述对象或已与所述对象匹配；以及
载体细胞是：
所述病毒可在其中复制的细胞；以及
已被处理或修饰或经二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞，和/或已被处理或修饰以增强病毒在细胞中扩增的细胞，其中所述细胞克服了所述对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至所述肿瘤。
95.一种治疗癌症的方法，包括向对象施用包含溶瘤病毒的载体细胞，其中：
所述载体细胞匹配所述对象或已与所述对象匹配；以及
所述载体细胞包含权利要求1-86中任一项的细胞。
96.一种治疗癌症的方法，包括向对象施用包含溶瘤病毒的载体细胞，其中：
所述载体细胞对于所述对象是同种异体的并且已与所述对象匹配；以及
所述载体细胞是：
所述病毒可在其中复制的细胞；以及
已被处理或修饰或经二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞，和/或已被处理或修饰以增强病毒在细胞中扩增的细胞，其中所述细胞克服了所述对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至所述肿瘤。
97.一种治疗癌症的方法，包括向对象施用包含溶瘤病毒的载体细胞，其中所述所述载体细胞对于所述对象是同种异体的并且已与所述对象匹配。
98.载体细胞，其包含用于治疗癌症的溶瘤病毒，其中所述载体细胞已与所述对象匹配。
99.载体细胞用于治疗癌症的用途，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述载体细胞匹配所述对象或已与所述对象匹配；以及
载体细胞是：
所述病毒可在其中复制的细胞；以及
已被处理或修饰或经二者以增强细胞的免疫抑制性质或免疫豁免性质的细胞，和/或已被处理或修饰以增强病毒在细胞中扩增的细胞，其中所述细胞克服了所述对象的先天/适应性免疫屏障以将病毒递送至所述肿瘤。
100.载体细胞用于治疗癌症的用途，其中：
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述载体细胞匹配所述对象或已与所述对象匹配；以及
所述载体细胞包含权利要求1-86中任一项的细胞。
101.载体细胞用于治疗对象中的癌症的用途，其中：
所述载体细胞对于所述对象是同种异体的；
所述载体细胞包含溶瘤病毒；以及
所述载体细胞匹配所述对象。
102.载体细胞用于治疗对象中的癌症的用途，其中：
所述载体细胞对于所述对象是同种异体的；
所述载体细胞包含溶瘤病毒；
所述载体细胞匹配所述对象；以及
所述载体细胞包含权利要求1-86中任一项的细胞。
103.权利要求94-102中任一项的方法或用途，其中所述癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。
104.权利要求94-103中任一项的方法或用途，其中所述细胞被处理或修饰为具有改善的病毒扩增性质和/或具有增强的免疫抑制或免疫豁免性质。
105.权利要求94-104中任一项的方法或用途，其中通过用促进病毒扩增和/或增强载体细胞的免疫抑制或免疫豁免性质的因子预处理而使所述细胞敏化。
106.权利要求104或105所述的方法或用途，其中所述细胞经工程化以改善其病毒扩增潜能。
107.权利要求87-106中任一项的方法或用途，其中所述癌症包含实体瘤。
108.权利要求87-107中任一项的方法或用途，其中所述对象是人。
109.权利要求87-107中任一项的方法或用途，其中所述对象是非人动物。
110.权利要求87-107中任一项的方法或用途，其中所述对象是犬、猫、马、猪、牛或非人灵长类动物。
111.权利要求87-110中任一项的方法或用途，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌、肉瘤、骨髓瘤和神经母细胞瘤。
112.权利要求87-110中任一项的方法或用途，其中所述癌症选自胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、脑癌、中枢神经系统癌、腺癌、肝癌、皮肤癌、血液癌、胆道癌、骨癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、口腔癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。
113.权利要求87-112中任一项的方法或用途，其中所述癌症选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠癌、基底细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、唇癌、舌癌、口腔癌、胶质瘤和咽癌。
114.权利要求87-113中任一项的方法或用途，其中将不含病毒的载体细胞用IFN-γ预处理，并且在施用包含病毒的载体细胞前或与包含病毒的载体细胞同时施用或使用。
115.权利要求87-114中任一项的方法或用途，其中所述治疗进一步包括施用另一抗癌剂或用另一抗癌疗法进行治疗。
116.权利要求115的方法或用途，其中所述另外的抗癌剂或治疗包括免疫疗法。
117.权利要求115的方法或用途，其中所述另外的抗癌剂或治疗选自外科手术、免疫共刺激激动剂、BiTE、靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞和TCR转基因T细胞、检查点抑制剂、化疗化合物/抗体和免疫抑制药物中的一种或多种。
118.权利要求117所述的方法或用途，其中所述另外的抗癌剂或治疗是免疫抑制药物。
119.权利要求117的方法或用途，其中所述另外的抗癌剂或治疗选自以下的一种或多种：选自CD28和ICOS的B7家族；选自4-1BB、OX40、GITR、CD40、CD30和CD27的TNFR家族；LIGHT；LT-α；靶向以下一种或多种的检查点抑制剂：PD-1、PD-2、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、IDO1和IDO2、CTNNB1(β-连环蛋白)、SIRPα、VISTA、LIGHT、HVEM、LAG3、TIM3、TIGIT、半乳凝素-9、KIR、GITR、TIM1、TIM4、CEACAM1、CD27、CD40/CD40L、CD48、CD70、CD80、CD86、CD112、CD137(4-1BB)、CD155、CD160、CD200、CD226、CD244(2B4)、CD272(BTLA)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、ICOS、A2aR、A2bR、HHLA2、ILT-2、ILT-4、gp49B、PIR-B、HLA-G、ILT-2/4和OX40/OX-40L、MDR1、精氨酸酶1、iNOs、IL-10、TGF-β、pGE2、STAT3、VEGF、KSP、HER2、Ras、EZH2、NIPP1、PP1、TAK1和PLK1a；选自以下的化疗化合物和抗体：细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、免疫治疗剂；以及选自以下的免疫抑制药物：糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、甲氨蝶呤、来那度胺、咪硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶和环磷酰胺、TNFα阻断抗体和氟达拉滨。
120.权利要求1-119中任一项的细胞、方法或用途，其中所述载体细胞与待对其施用或对其施用的所述对象匹配。
121.权利要求1-120中任一项的细胞、方法或用途，其中所述载体细胞与来自施用所述细胞的所述对象的免疫细胞匹配，以鉴定与所述对象的免疫细胞充分免疫相容以将病毒递送至所述对象的载体细胞。
122.权利要求1-121中任一项的细胞、方法或用途，其中所述细胞与病毒匹配，其中测量所述细胞扩增病毒的能力。
123.权利要求120-122中任一项的细胞、方法或用途，其中所述细胞/病毒组合与所述对象匹配。
124.权利要求121-123中任一项的细胞、方法或用途，其中所述对象的免疫细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)。
125.权利要求1-124中任一项的细胞、方法或用途，其中测试所述载体以测试所述病毒在所述细胞中复制的能力和/或所述细胞促进病毒扩增的能力。
126.权利要求125的细胞、方法或用途，其中通过共培养所述细胞和病毒并测量病毒扩增速率来测试所述病毒在所述细胞中复制的能力和/或所述细胞促进病毒扩增的能力。
127.权利要求126的细胞、方法或用途，其中所述病毒在所述细胞中复制的能力和/或所述细胞促进病毒扩增的能力通过以下测量：
a)使用为或约为0.01-10的感染复数(MOI)，并在等价测定条件下共培养1天至约1周或1周(24h-1周)的时间测量病毒扩增速率；以及
b)针对感染的细胞载体的数量进行归一化，其中：
在等价测定条件下测得的噬斑形成单位(pfu)/细胞的归一化值可用于计算病毒扩增评分(VAS)，其用于对适合(或不适合)治疗的载体细胞+病毒组合进行排名；
噬斑形成单位/载体细胞为1-10被认为效力有限(作为特定病毒的细胞载体)；
Pfu/细胞为10-100是效力好；
Pfu/细胞为100-1000是效力非常好；
Pfu/细胞超过1000是效力极高；以及
在所述细胞与所述对象的对象相容性筛选中，考虑表现出pfu/细胞为至少10的载体细胞和病毒的组合用于测试。
128.权利要求1-127中任一项的细胞、方法或用途，其中所述载体细胞/病毒组合通过以下与待治疗的对象匹配：
a)评估患者特异性遗传多态性以鉴定MHC I/II单体型、KIR单体型和配体，以及非经典MHC单体型，包括HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、MICA/B中的一种或多种；
b)将所述对象的遗传多态性谱与可用载体细胞的谱进行比较，以从载体细胞中鉴定与所述对象最相容的细胞；
c)通过共同培养所述细胞、病毒和免疫细胞来评估所述载体细胞和对象免疫细胞的相容性；以及
d)评估病毒扩增水平。
129.权利要求128所述的细胞、方法或用途，进一步包括：
e)通过检测肿瘤细胞的媒介定向迁移和病毒扩增来测量载体细胞+活体肿瘤活组织检查+/-病毒，以鉴定用于施用的载体细胞/病毒，其中：
对象肿瘤活组织检查+细胞媒介中的病毒扩增：
比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增总和+同等条件下单独的细胞媒介中的病毒扩增总和大5％或更多；或
比等价条件下单独的肿瘤活组织检查中的病毒扩增大至少5％或更多。
130.权利要求128或129的细胞、方法或用途，进一步包括通过培养对象衍生的PBMC+载体细胞+病毒来分析共培养物以评估对象对所述载体细胞介导的病毒疗法的允许性。
131.权利要求128-130中任一项的细胞、方法或用途，包括：
在对象来源的PMBC+载体细胞+病毒的共培养物中测量病毒扩增，其中匹配：
如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增超过不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的80％，是相容的；
如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增在不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的30-80％范围内，是中等相容的；
如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增在不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的10-30％范围内，是最低相容的；
如果载体细胞和患者PBMC的共培养物中的病毒扩增低于不存在PBMC的情况下感染同一载体细胞时病毒扩增的10％，是不相容的；以及
％相容性可用于从对每个个体患者和每种特定病毒最不相容至最相容的载体细胞来对载体细胞进行排名。
132.权利要求1-131中任一项的细胞、方法或用途，其中通过选择适于将溶瘤病毒递送至患有癌症的对象的细胞媒介(载体细胞)进行载体细胞与对象之间的匹配通过包括鉴定以下决定因素(a)-(f)中的一种或多种作为所述细胞媒介(载体细胞)与所述对象之间的匹配的指示的方法实现：
a)所述细胞媒介和所述对象在组合的以下遗传基因座的50％或更多处具有相同等位基因：
(i)MHC I和/或MHC II单体型；
(ii)KIR单体型和/或KIR配体单体型；以及
(iii)HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c和/或CD1d单体型；
b)将所述细胞媒介在与所述对象的癌性细胞共培养物中温育导致以下的一或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的细胞至肿瘤迁移评分(CTMS)为20％或更高；
(ii)癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的肿瘤至细胞迁移评分(TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的积累迁移评分(MRS)为至少20％；
c)将所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和所述对象的癌性细胞的共培养物中温育导致以下的一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的加载病毒的细胞至肿瘤迁移评分(V-CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的加载病毒的肿瘤至细胞迁移评分(V-TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的积累的加载病毒的迁移评分(V-MRS)为至少20％；
d)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学病毒扩增评分(IVAS)为至少20％，所述IVAS代表在从所述对象获得的免疫细胞存在的情况下的病毒扩增量，相对于除从所述对象获得的免疫细胞不存在外的等价条件下获得的病毒扩增量；
e)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学相容性评分(ICS)为≤200％，所述ICS代表所述细胞媒介存在的情况下的免疫应答，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件下的免疫应答，其中所述免疫应答由以下一种或多种的表达量决定：
(i)IFNγ；
(ii)与T细胞、NK细胞和/或NKT细胞介导的细胞毒性相关的一种或多种标志物；和/或
(iii)与T细胞、NK细胞和/或NKT细胞活化剂/效应子功能相关的一种或多种标志物；
f)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件，根据以下等式通过免疫抑制评分(ISS)≥0％测得所述细胞媒介不增强抗病毒免疫应答和/或抑制抗病毒免疫应答：
ISS％＝[(IV+IC)-ICV]/(IV+IC)×100，其中：
IV＝病毒+从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中的标志物表达水平；
IC＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介的共培养物中的标志物表达水平；
ICV＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介+病毒的共培养物中的标志物表达水平；以及
所述标志物表达水平是e)的(i)、(ii)和(iii)中所示一种或多种标志物的表达水平；以及
如果满足a)-f)中的一项或多项，则确定所述细胞媒介与所述对象之间匹配，并且将所述细胞媒介选择为适合将溶瘤病毒递送至所述患有癌症的对象。
133.权利要求132所述的细胞、方法或用途，进一步包括在a)-f)中的一项或多项前：
当细胞媒介与病毒一起温育时，以pfu/细胞确定病毒扩增评分(VAS)；以及
如果VAS分数至少为10，则使用决定因素(a)-(f)的一种或多种选择用于筛选的细胞媒介并确定所述细胞媒介与所述对象之间是否匹配。
134.权利要求132或133的细胞、方法或用途，其中对所述方法进行多路复用以用于一组可能的载体细胞，以通过包括以下的多路复用方法基于溶瘤病毒的有效性或其至对象的递送对载体细胞进行排名，其中排名1表示最期望的、最高的排名，而较大的数字代表较不期望的排名：
(i)测量组中每个细胞媒介的a)-f)中一项或多项的值，并根据测量值对每个细胞媒介进行排名，其中：
对于a)，细胞媒介与所述对象之间的等位基因的相同性越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于b)，细胞媒介的CTMS、TCMS和/或MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于c)，细胞媒介的V-CTMS、V-TCMS和/或V-MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于d)，细胞媒介的IVAS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于e)，细胞媒介的ICS评分越低，所述细胞媒介的排名越高；以及
对于f)，细胞媒介的ISS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；和/或
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量a)-f)中两个或更多个的值获得积累排名，其为两个或更多个排名的平均值，并根据其积累排名对所述组的细胞媒介进行排名。
135.权利要求134的细胞、方法或用途，进一步包括：
(i)对于组中的每个细胞媒介，当将所述细胞媒介与所述病毒温育时，以pfu/细胞获得病毒扩增评分(VAS)；
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量VAS分数和a)-f)中一或多项的值，获得积累排名，其为两个或更多个排名的平均值；以及
(iii)根据所述组中所述细胞媒介的积累排名对其进行排名。
136.权利要求132-135中任一项的方法，其中所述ICS评分和/或所述ISS评分是基于测量所述细胞共培养物中的标志物表达而获得的。
137.权利要求132-135中任一项的方法，其中所述ICS评分和/或所述ISS评分是基于测量所述共培养物的上清液中的标志物表达而获得的。
138.权利要求132-137中任一项的方法，其中通过包括以下的方法针对所述对象的血清对病毒扩增的作用校正所述IVAS评分：
(i)以共培养物体积的10-50重量％(或v/v)的量将所述对象的血清添加至d)的共培养物中；
(ii)根据以下公式计算对象血清抗性评分(SSRS)：
Figure FDA0002931076300000111
以及
(iii)根据以下公式计算百分比SSRS校正的IVAS评分：
IVAS(SSRS校正的)＝IVAS×(1-SSRS)×100。
139.修饰的细胞媒介或载体细胞，其包含选自以下的一种或多种修饰：
a)敏化所述细胞媒介以增强病毒扩增能力；
b)敏化所述细胞媒介以阻断抗病毒应答的诱导；
c)使所述细胞媒介抵御所述对象的同种异体失活和/或排斥；
d)使所述细胞媒介抵御补体；和/或
e)使所述细胞媒介对病毒介导的杀伤具有抗性。
140.一种修饰的细胞媒介(载体细胞)，其被工程化为：
a)短暂或永久表达或抑制使所述细胞媒介对干扰素诱导的抗病毒应答无反应性的基因；
b)短暂或永久表达或抑制基因以促进逃避T和NKT细胞中一种或多种的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种适应性免疫应答；
c)短暂或永久表达或抑制基因以促进逃避NK细胞的同种异体识别和/或γδT细胞的一种或多种先天免疫应答；
d)短暂或永久表达免疫抑制因子；
e)短暂或永久表达促进病毒与所述细胞媒介缔合的因子；以及
f)短暂或永久表达干扰补体和/或中和抗体的功能的因子。
141.权利要求140的修饰的细胞媒介(载体细胞)，其中所述修饰进一步选自：
a)敏化所述细胞媒介以增强病毒扩增能力；
b)敏化所述细胞媒介以阻断抗病毒应答的诱导；
c)使所述细胞媒介抵御所述对象的同种异体失活和/或排斥；
d)使所述细胞媒介抵御补体；和/或
e)使所述细胞媒介对病毒介导的杀伤具有抗性。
142.一种选择适于将溶瘤病毒递送至患有癌症的对象的细胞媒介的方法，其包括鉴定以下决定因素(a)-(f)中的一种或多种，作为所述细胞媒介与所述对象之间的匹配的指示：
a)所述细胞媒介和所述对象在组合的以下遗传基因座的50％或更多处具有相同等位基因：
(i)MHC I和/或MHC II单体型；
(ii)KIR单体型和/或KIR配体单体型；以及
(iii)HLA-E、CD1a、CD1b、CD1c和/或CD1d单体型；
b)将所述细胞媒介在与所述对象的癌性细胞的共培养物中温育导致以下的一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的细胞至肿瘤迁移评分(CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的肿瘤至细胞迁移评分(TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的积累迁移评分(MRS)为至少20％；
c)将所述细胞媒介在与所述溶瘤病毒和所述对象的癌性细胞的共培养物中温育导致以下的一种或多种：
(i)所述细胞媒介细胞向所述癌性细胞迁移的加载病毒的细胞至肿瘤迁移评分(V-CTMS)为20％或更高；
(ii)所述癌性细胞向所述细胞媒介细胞迁移的加载病毒的肿瘤至细胞迁移评分(V-TCMS)为20％或更高；和/或
(iii)[(i)+(ii)]/2的加载病毒的积累迁移评分(V-MRS)为至少20％；
d)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学病毒扩增评分(IVAS)为至少20％，所述IVAS代表在从所述对象获得的免疫细胞存在的情况下的病毒扩增量，相对于除从所述对象获得的免疫细胞不存在外的等价条件下获得的病毒扩增量；
e)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，免疫学相容性评分(ICS)为≤200％，所述ICS代表所述细胞媒介存在的情况下的免疫应答，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件下的免疫应答，其中所述免疫应答由以下一种或多种的表达量决定：
(i)IFNγ；
(ii)与T细胞、NK细胞和/或NKT细胞介导的细胞毒性相关的一种或多种标志物；和/或
(iii)与T细胞、NK细胞和/或NKT细胞活化剂/效应子功能相关的一种或多种标志物；
f)当所述细胞媒介在与溶瘤病毒和从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中温育时，相对于除所述细胞媒介不存在外的等价条件，根据以下等式通过免疫抑制评分(ISS)≥0％测得的所述细胞媒介不增强抗病毒免疫应答和/或抑制抗病毒免疫应答：
ISS％＝[(IV+IC)-ICV]/(IV+IC)×100，其中：
IV＝病毒+从所述对象获得的免疫细胞的共培养物中的标志物表达水平；
IC＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介的共培养物中的标志物表达水平；
ICV＝从所述对象获得的免疫细胞+细胞媒介+病毒的共培养物中的标志物表达水平；以及
所述标志物表达水平是e)的(i)、(ii)和(iii)中所示的一种或多种标志物的表达水平；以及
如果满足a)-f)中的一或多项，则确定所述细胞媒介与所述对象之间匹配，并且将所述细胞媒介选择为适合将溶瘤病毒递送至所述患有癌症的对象。
143.权利要求142的方法，进一步包括，在a)-f)中的一或多项前：
当细胞媒介与病毒温育时，以pfu/细胞确定病毒扩增评分(VAS)；以及
如果VAS分数为至少10，则使用决定因素(a)-(f)的一种或多种选择用于筛选的细胞媒介，并确定所述细胞媒介与所述对象之间是否匹配。
144.一种多路复用方法，其包括将权利要求142或143的方法应用于一组细胞媒介，并根据其将溶瘤病毒递送至对象的期望对其进行排名，其中排名1表示最期望的、最高的排名，并且较大的数字代表较不期望的排名，该方法包括：
(i)测量组中每个细胞媒介的a)-f)中一种或多种的值，并根据测量值对每个细胞媒介进行排名，其中：
对于a)，细胞媒介与所述对象之间等位基因的相同性越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于b)，细胞媒介的CTMS、TCMS和/或MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于c)，细胞媒介的V-CTMS、V-TCMS和/或V-MRS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于d)，细胞媒介的IVAS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；
对于e)，细胞媒介的ICS评分越低，所述细胞媒介的排名越高；以及
对于f)，细胞媒介的ISS评分越高，所述细胞媒介的排名越高；和/或
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量a)-f)中两个或更多个的值获得积累排名，其为两个或更多个排名的平均值，并根据其积累排名对所述组的细胞媒介进行排名。
145.权利要求144的方法，进一步包括：
(i)对于组中的每个细胞媒介，当将所述细胞媒介与所述病毒温育时，以pfu/细胞获得病毒扩增评分(VAS)；
(ii)对于组中的每个细胞媒介，基于测量VAS评分和a)-f)中一或多项的值，获得积累排名，其为两个或更多个排名的平均值；以及
(iii)根据所述组的所述细胞媒介的积累排名对其进行排名。
146.权利要求142-145中任一项的方法，其中所述ICS评分和/或所述ISS评分是基于测量所述细胞共培养物中的标志物表达而获得的。
147.权利要求142-145中任一项的方法，其中所述ICS评分和/或所述ISS评分是基于测量所述共培养物的上清液中的标志物表达而获得的。
148.权利要求142-147中任一项的方法，其中通过包括以下的方法针对所述对象的血清对病毒扩增的作用校正所述IVAS评分：
(i)以共培养物体积的10-50重量％(或v/v)的量将所述对象的血清添加至d)的共培养物中；
(ii)根据以下公式计算对象血清抗性评分(SSRS)：
Figure FDA0002931076300000131
以及
(iii)根据以下公式计算百分比SSRS校正的IVAS评分：
IVAS(SSRS校正的)＝IVAS×(1-SSRS)×100。
149.一种用溶瘤病毒治疗患有癌症的对象的方法，其包括：
a)根据权利要求142-148中任一项的方法选择用于递送溶瘤病毒的载体细胞；以及
b)向所述对象施用所述细胞媒介和溶瘤病毒。
150.一种药物组合物，其包含药学上可接受的媒介中的权利要求1-86中任一项的细胞。
151.权利要求150所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
152.权利要求151的药物组合物，其中所述癌症包括实体瘤或血液恶性肿瘤。
153.权利要求1-152中任一项的细胞、方法、用途或药物组合物，其中全身、局部、肿瘤内、肝内、静脉内、直肠或皮下施用所述细胞。
154.权利要求97的方法，其中通过权利要求142-148中任一项的方法将所述载体细胞与所述对象匹配。
155.权利要求87-92中任一项的方法或用途，包括通过权利要求142-148中任一项的匹配测定将所述细胞与将施用所述细胞的对象匹配。
156.权利要求98的载体细胞，其中所述载体细胞通过权利要求142-148中任一项的方法与所述对象匹配。
157.一种使患有癌症的对象与用于将溶瘤病毒递送至所述对象的细胞媒介匹配的方法，包括：
通过在包含所述细胞媒介、所述溶瘤病毒和来自所述对象的细胞的共培养物中检测以下一种或多种，确定所述细胞媒介是否克服了所述对象中的免疫屏障：
(a)与除不存在所述细胞媒介外的等价条件相比，一种或多种T细胞活化标志物的水平降低；
(b)与除不存在所述细胞媒介外的等价条件相比，一种或多种NK细胞活化标志物的水平降低；以及
(c)与除不存在所述细胞媒介外的等价条件相比，一种或多种NKT细胞活化标志物的水平降低；
其中如果满足(a)、(b)和(c)中的一或多种，则所述细胞媒介与所述对象匹配。
158.一种使患有癌症的对象与用于将溶瘤病毒递送至所述对象的细胞媒介匹配的方法，包括：
(a)测量当所述病毒和所述细胞媒介与来自所述对象的细胞一起温育时获得的病毒扩增量；
(b)测量在除不存在来自所述对象的细胞外的等价条件下温育所述病毒和所述细胞媒介时所获得的病毒扩增量；以及
(c)比较在(a)和(b)中测得的量，其中如果(a)中测得的扩增量至少为(b)中测得的扩增量的20％，则所述细胞媒介与所述对象匹配。
159.权利要求157或158的方法，进一步包括将所述细胞媒介和所述对象中的至少10％等位基因鉴定为相同，所述等位基因位于一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)和/或杀伤细胞抑制性受体(KIR)遗传基因座处。
160.权利要求159所述的方法，其中在测量标志物的水平或病毒扩增量前鉴定相同的等位基因。
161.一种使患有癌症的对象与用于将溶瘤病毒递送至所述对象的细胞媒介匹配的方法，包括：
在所述细胞媒介和所述对象中的主要组织相容性复合物(MHC)和/或杀伤细胞抑制性受体(KIR)遗传基因座处鉴定相同的等位基因；以及
如果至少50％的等位基因是相同的，则选择所述细胞媒介作为所述对象的匹配。
162.一种使患有癌症的对象与用于将溶瘤病毒递送至所述对象的细胞媒介匹配的方法，包括：
通过在包含所述细胞媒介、所述溶瘤病毒和来自所述对象的细胞的共培养物中检测一种或多种免疫标志物的表达水平，其≤在除不存在所述细胞媒介外的等价条件下检测到的表达水平的200％，来确定所述细胞媒介是否克服了所述对象中的免疫屏障，其中所述标志物选自以下的一种或多种：
(1)T细胞活化的标志物；
(2)NK细胞活化的标志物；以及
(3)NKT细胞活化的标志物；
其中如果在共培养物中选自(1)、(2)和(3)中的至少一种标志物的表达水平≤在除不存在所述细胞媒介外的等价条件下检测到的表达水平的200％，则所述细胞媒介与所述对象匹配。
163.权利要求162的方法，其中进一步包括将主要组织相容性复合物(MHC)和/或杀伤细胞抑制性受体(KIR)遗传基因座处的等位基因的至少一个鉴定为在所述细胞媒介和所述对象中是相同的，其中如果所述基因座的至少一个是相同的且所述共培养物中的一种或多种免疫标志物的表达水平≤在除不存在所述细胞媒介外的等价条件下检测到的表达水平的200％，则所述细胞媒介与所述对象匹配。
164.权利要求163的方法，其中在检测所述一种或多种免疫标志物的表达水平前，鉴定相同的等位基因。
165.权利要求157-164中任一项的方法，其中所述细胞媒介选自权利要求1-86、120-135和139-141中任一项所述的细胞。
CN201980051791.1A 2018-06-04 2019-06-04 强化病毒疗法的基于细胞的媒介 Pending CN112533621A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862680570P 2018-06-04 2018-06-04
US62/680,570 2018-06-04
PCT/US2019/035464 WO2019236633A2 (en) 2018-06-04 2019-06-04 Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112533621A true CN112533621A (zh) 2021-03-19

Family

ID=67766240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980051791.1A Pending CN112533621A (zh) 2018-06-04 2019-06-04 强化病毒疗法的基于细胞的媒介

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230022205A1 (zh)
EP (1) EP3801584B1 (zh)
JP (2) JP7379385B2 (zh)
CN (1) CN112533621A (zh)
AU (1) AU2019282239A1 (zh)
CA (2) CA3177467A1 (zh)
EA (1) EA202000353A1 (zh)
ES (1) ES2966045T3 (zh)
WO (1) WO2019236633A2 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015335607B2 (en) 2014-10-24 2020-04-23 Calidi Biotherapeutics, Inc. Combination immunotherapy approach for treatment of cancer
WO2017027757A2 (en) 2015-08-11 2017-02-16 StemImmune, Incorporated Smallpox vaccine for cancer treatment
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
US11505782B2 (en) 2018-06-04 2022-11-22 Calidi Biotherapeutics, Inc. Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
CN108795867A (zh) * 2018-06-05 2018-11-13 华东理工大学 用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
AU2019377141A1 (en) 2018-11-06 2021-05-20 Calidi Biotherapeutics, Inc. Enhanced systems for cell-mediated oncolytic viral therapy
CN111097049A (zh) * 2020-01-15 2020-05-05 中国医学科学院基础医学研究所 IFN-α与HDACi在制备治疗肿瘤药物中的应用
WO2022012591A1 (zh) * 2020-07-15 2022-01-20 南京北恒生物科技有限公司 用于同种异体移植的工程化免疫细胞
CN112080521B (zh) * 2020-09-07 2022-05-31 山东农业大学 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法
EP4259784A1 (en) * 2020-12-14 2023-10-18 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Methods and compositions for depleting natural killer cells and uses thereof in cellular therapies
EP4340945A1 (en) * 2021-06-28 2024-03-27 Meridian Therapeutics, Inc. A vaccine composition for plasma cell disorders including multiple myeloma and methods to induce immunity using same
WO2024006268A2 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Meridian Therapeutics, Inc. A vaccine composition of cells expressing a lentiviral vector and methods of using

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160339066A1 (en) * 2014-01-02 2016-11-24 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5023252A (en) 1985-12-04 1991-06-11 Conrex Pharmaceutical Corporation Transdermal and trans-membrane delivery of drugs
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US7001765B2 (en) 1996-03-06 2006-02-21 Medigene Ag Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells
WO1999009139A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
CA2348382C (en) 1998-11-10 2013-09-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric parvovirus vectors and methods of making and administering the same
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US6723316B2 (en) 1999-12-22 2004-04-20 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Herpes simplex virus-1 Glycoprotein C mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth
ES2233600T5 (es) 2000-01-21 2009-06-22 Biovex Limited Cepas de virus del herpes.
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
IT1317108B1 (it) 2000-12-06 2003-05-26 Philogen Srl Processo per la selezione di frammenti anticorporali anti-angiogenesi,frammenti anticorpali anti-angiogenesi cosi' ottenuti e loro uso.
US20020096037A1 (en) 2001-01-25 2002-07-25 Richard Muller Color-coded melody text and method of teaching
US6653103B2 (en) 2001-03-30 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides
ATE500808T1 (de) 2001-05-11 2011-03-15 Wellstat Biologics Corp Onkolytische virustherapie
WO2003005964A2 (en) 2001-07-11 2003-01-23 University Of Miami Recombinant vsv for the treatment of tumor cells
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
WO2003082200A2 (en) 2002-03-27 2003-10-09 Baylor College Of Medicine Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US20050220818A1 (en) 2002-06-21 2005-10-06 Wellstat Biologics Corporation Administration of therapeutic viruses
WO2004022716A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
MXPA05010260A (es) 2003-03-27 2006-03-17 Ottawa Health Research Inst Virus de estomatitis vesicular mutantes y usos de los mismos.
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
DE602004018927D1 (de) 2003-06-18 2009-02-26 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
GB0326798D0 (en) 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
US20070003520A1 (en) 2003-11-17 2007-01-04 Brown Susanne M Mutant viruses
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
WO2005116224A2 (en) 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
WO2006002394A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
WO2006060314A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
AU2006252406B2 (en) 2005-06-01 2012-05-17 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
CN101495126B (zh) 2005-06-23 2016-01-06 休斯顿大学 Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
US20100086522A1 (en) * 2006-07-18 2010-04-08 Ottawa Health Research Institute Disparate suicide carrier cells for tumor targeting of promiscuous oncolytic viruses
EP2426142A3 (en) 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
WO2008140621A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
JP5442452B2 (ja) 2007-02-16 2014-03-12 ウイルツ・バイオロジクス・リミテッド 単純ヘルペスウイルスおよびウイルス複製法
JP4434242B2 (ja) 2007-07-11 2010-03-17 ソニー株式会社 送信装置、受信装置、誤り訂正システム、送信方法及び誤り訂正方法
US8313896B2 (en) 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
US8703120B2 (en) 2008-05-29 2014-04-22 The General Hospital Corporation Use of oncolytic herpes viruses for killing cancer stem cells
US8481297B2 (en) 2009-01-08 2013-07-09 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160339066A1 (en) * 2014-01-02 2016-11-24 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANICE KIM等: "Stem Cell-Based Cell Carrier for Targeted Oncolytic Virotherapy: Translational Opportunity and Open Questions", VIRUSES, vol. 7, no. 12, pages 1 - 2 *
Z S GUO等: "The combination of immunosuppression and carrier cells significantly enhances the efficacy of oncolytic poxvirus in the pre-immunized host", GENE THER, vol. 17, no. 12, pages 5 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019282239A1 (en) 2021-01-14
CA3100046A1 (en) 2019-12-12
JP7379385B2 (ja) 2023-11-14
JP2023116758A (ja) 2023-08-22
JP2021531737A (ja) 2021-11-25
EA202000353A1 (ru) 2022-01-14
WO2019236633A2 (en) 2019-12-12
KR20210022010A (ko) 2021-03-02
EP3801584A2 (en) 2021-04-14
CA3177467A1 (en) 2019-12-12
WO2019236633A3 (en) 2020-04-09
WO2019236633A9 (en) 2020-03-05
US20230022205A1 (en) 2023-01-26
EP3801584B1 (en) 2023-09-27
ES2966045T3 (es) 2024-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11505782B2 (en) Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
JP7329593B2 (ja) 細胞媒介性腫瘍溶解性ウイルス治療のための増強された系
JP7379385B2 (ja) ウイルス療法を増強するための細胞ベースの媒体
CN105188746B (zh) 新城疫病毒及其用途
US20210169956A1 (en) Increased activity of oncolytic newcastle disease virus
US20230210902A1 (en) Sars-cov-2-specific t cells
Bian et al. Selective gene transfer to tumor cells by recombinant Newcastle Disease Virus via a bispecific fusion protein
KR20210110838A (ko) M2 결함성 폭스바이러스
KR102662837B1 (ko) 바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클
AU2019252878B2 (en) Chimeric Notch receptors
KR20240060879A (ko) 바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클
CN114786696A (zh) 包含免疫调节转基因的溶瘤病毒及其用途
WO2022148736A1 (en) Vectorization of muc1 t cell engager
WO2021052811A1 (en) New oncolytic newcastle disease viruses and recombinant ndv strains

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination