KR20210110838A - M2 결함성 폭스바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양분해성 바이러스의 분야이다. 본 발명은 M2L 유전자좌에 의해 인코딩되는 기능 (즉, m2 기능)에 결함을 갖도록 조작된 새로운 폭스바이러스를 제공한다. 이러한 폭스바이러스는 CD80 및 CD86 보조-자극성 항원 중 적어도 하나 또는 둘 다에 대한 기능적 m2 결합 활성이 결여된다. 바람직하게, 상기 종양분해성 폭스바이러스는 M2L 유전자좌의 전부 또는 일부 결실을 갖는 백시니아 바이러스이다. 또한, 본 발명은 이러한 폭스바이러스를 포함하는 세포 및 조성물, 그리고 암과 같은 증식성 질환을 치료하고, 질환을 예방하기 위한 이들의 용도 (특히 수의학 분야에서의 백신접종)에 관한 것이다. 보다 명확하게, 본 발명은 바이러스 요법에 주로 사용되는 기존의 종양분해성 바이러스에 대한 대안을 제공한다. 구체적으로, m2 결함성 폭스바이러스는 면역 반응을 자극하거나 개선할 목적을 갖는 항-CTLA-4 항체와 같은 면역조절성 폴리펩티드의 발현에 유용하다.

Description

M2 결함성 폭스바이러스
본 발명은 종양분해성 바이러스의 분야이다. 본 발명은 M2L 유전자좌에 의해 인코딩되는 기능 (즉, m2 기능)에 결함을 갖도록 조작된 새로운 폭스바이러스를 제공한다. 이러한 폭스바이러스는 CD80 및 CD86 보조-자극성 항원 중 적어도 하나 또는 둘 다에 대한 기능적 m2 결합 활성이 결여된다. 바람직하게, 상기 종양분해성 폭스바이러스는 M2L 유전자좌의 전부 또는 일부 결실을 갖는 백시니아 바이러스이다. 또한, 본 발명은 이러한 폭스바이러스를 포함하는 세포 및 조성물, 그리고 암과 같은 증식성 질환을 치료하고, 질환을 예방하기 위한 이들의 용도 (특히 수의학 분야에서의 백신접종)에 관한 것이다. 보다 명확하게, 본 발명은 바이러스 요법에 주로 사용되는 기존의 종양분해성 바이러스에 대한 대안을 제공한다. 구체적으로, m2 결함성 폭스바이러스는 면역 반응을 자극하거나 개선할 목적을 갖는 항-CTLA-4 항체와 같은 면역조절성 폴리펩티드의 발현에 유용하다.
매년, 암은 전세계적으로 12백만 명의 대상체에서 진단된다. 선진국에서, 대략 5명 중 1명은 암으로 사망한다. 매우 많은 화학치료제가 존재하지만, 이들은 종종 특히 매우 초기 단계의 질환에서 확립하는 악성 및 전이성 종양을 대비하는데 효율적이지 않다.
종양분해성 바이러스 요법은 지난 20년 동안 암 세포를 파괴하도록 복제 적격한 바이러스를 기초로 하여 20여년 동안 개발되었다 (Russell et al., 2012, Nat. Biotechnol. 30(7): 658-70). 현재도 많은 전임상 및 임상 연구가 다양한 암 유형에서 다양한 치료 유전자를 갖춘 종양분해성 바이러스의 치료적 잠재력을 평가하도록 진행되고 있다.
치료 유전자는 보통 종양분해 표현형을 보유하도록 비-필수 유전자 내의 바이러스성 게놈에 삽입된다. J2R 유전자좌 (tk)에서의 삽입은 BUdR의 존재 시 재조합 바이러스의 식별도 용이하게 하기 때문에, 당해 기술분야에 널리 사용된다 (Mackett et al., 1984 J. Virol., 49: 857-64; Boyle et al., 1985, Gene 35, 169-177). 그러나, 다른 유전자좌도 예로 Hind F 단편 내, M2L 유전자좌 내 (Smith et al., 1993, Vaccine 11(1): 43-53　; Guo et al., 1990, J. Virol. 64: 2399-2406; Bloom et al., 1991, J. Virol. 65(3): 1530-42; Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54: 5552-5; McLaughlin et al., 1996, Cancer Res. 56: 2361-67) 및 A56R 유전자좌 (헤마글루티닌 (HA)을 인코딩함) 내에 제안되어 왔다.
폭스바이러스 및 특히 백시니아 바이러스 (VV)는 여러 유망한 종양분해 후보 (De Graaf et al., 2018, doi.org/10.1016/j.cytogfr.2018.03.006), 예컨대 JX594 (실라젠사/트랜스진사), GL-ONC1 (진럭스사), TG6002 (트랜스진사) 및 vvDD-CDSR (피츠버그 대학교)를 제공하여 왔다. 이러한 종양분해성 VV는 다양한 게놈 변형 및 다양한 치료 유전자의 발현을 갖는 상이한 VV 균주로부터 기원한다. 최근 들어 JX-594 (Wyeth 균주)가 바이러스성 J2R 유전자 (티미딘 키나제 (tk)를 인코딩함)의 결실에 의해 약화되고, GM-CSF를 추가로 갖추어, 간세포 암종에서 무작위 제 Ⅲ상 시험으로 임상 평가 중이다 (Parato et al., 2012, Molecular Therapy 20(4): 749-58). GL-ONC1는 부모 바이러스 리스터 균주 게놈의 F14.5L, J2R 및 A56R 유전자좌를 대신하여 3가지 발현 카세트를 각각 삽입함으로써 생성되었다. 동일한 선상에서, 비-독성 5-플루오로사이토신 (5-FC)을 세포독성 5-플루오로우라실 (5-FU)로 전환시키는 FCU1 효소를 인코딩하는 TG6002, J2R (tk) 및 I4L (I4L 유전자좌가 뉴클레오티드 환원효소 (rr-)를 인코딩함) 결함성 VV (코펜하겐 균주)는 일부 임상 시험으로 평가되고 있다. tk 및 rr 이중 결실은 높은 뉴클레오티드 풀을 제공하는 세포에서 바이러스의 복제를 제한하여, TG6002가 휴지기 세포에서 복제할 수 없도록 만든다 (Foloppe et al., 2008, Gene Ther. 15: 1361-71; 국제특허출원 WO 2009/065546). vvDD-CDSR은 최근 들어 난치성 피부 및 피하 종양에 걸린 환자에서 검정되고 있다. 이것은 tk (J2R 유전자좌) 및 백시니아 성장인자 (vgf)를 인코딩하는 유전자의 이중 결실에 의해 조작되고, 5-FU로 5-FC로 전환시키는 5-사이토신 탈아미나제 (CD) 및 생체내 촬영을 위한 소마토스타틴 수용체 (SR) 둘 다를 갖추고 있다.
처음에, 직접적 종양분해 (oncolysis)는 종양분해성 바이러스가 항-종양 효과를 발휘하는 단독 메커니즘인 것으로 생각되었다. 최근에야, 면역계가 바이러스 요법의 성공에서 결정적인 역할을 담당하는 것이 이해되었다 (Chaurasiya et al., 2018, Current Opinion in Immunology 51: 83-90). 그러나, 대다수 바이러스는 바이러스성 감염에 대항하도록 숙주에 의해 채용되는 많은 전략을 차단하려는 면역 회피 및 면역 조절에 관여하는 단백질 목록을 통한 자가-방어 메커니즘을 개발하여 왔다 (Smith and Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28(3): 149-85). 더우기, 종양 세포는 숙주의 면역계를 회피하도록 T 세포 소모의 메커니즘도 진화시켰고, 이는 억제성 수용체의 상향조절을 특징으로 하여, CTLA-4 (세포독성 T 림프구 관련 단백질 4; CD152로도 알려짐), 및 PD-1 (프로그램된 세포 사멸 단백질 1) 및 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2가 많이 보고되어 있다. 이러한 면역억제성 수용체는 상이한 수준의 T 세포 면역으로 작용하는 면역 체크포인트로서 작용한다. CTLA-4는 림프절에서 초기 단계의 T 세포 활성화를 억제하고, 바람직하지 않은 Treg도 역시 자극하는 한편 PD-1가 나중 단계에서 작용한다.
보다 구체적으로, T 세포의 활성화는 T 세포의 표면에 존재하는 CD28, CTLA-4 및 PDL-1와 같은 수용체와 함께 APC (항원 제시 세포)의 표면에 존재하는 CD80 (B7-1로도 명명됨) 및 CD86 (B7.2로도 명명됨)와 같은 보조-자극성 리간드의 상호작용이 관여한다. CD80은 이들 3가지 표면 수용체의 리간드인 반면, CD86은 CD28 및 CTLA-4에 결합한다. CD28 수용체는 휴지기 T 세포 상에 구성적으로 발현되고, 보조-자극성 CD80 및 CD86 리간드와 CD28의 라이게이션은 양성 자극성 신호를 T 세포에 전달하고, 이들이 증식하여 IL-2의 분비를 유도하며, Bcl-XL의 발현 증가를 통해 아폽토시스를 억제시킨다 (Chen, 2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 336-347). 대조적으로, CTLA-4 또는 PD-L1은 초기 T 세포 활성화 (CTLA-4)에 이어서 또는 나중 단계 (PD-L1)에서 T 세포의 음성 조절에서 역할을 담당한다. 구체적으로, CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드의 라이게이션 시, CTLA-4는 활성화된 T 세포 상에 시스 작용하여 CD80 및 CD86와 CD28의 상호작용에 의해 제공되는 보조-자극성 신호에 반대하고, IL-10 생산에 관여한다. 또한, CTLA-4는 면역억제성 조절 T 세포 (Treg)의 하위집합 상에 구성적으로 발현된다. 한편, T 조절 세포의 표면에서 PD-L1에 대한 CD80의 라이게이션은 이들 면역억제성 세포의 증식을 증가시키는 것으로 입증되었다 (Yi, 2011, J. Immunol. 186: 2739-2749). CTLA4는 1987년에 확인되었으며 (Brunet et al., 1987, Nature 328: 267-70), CTLA4 유전자에 의해 인코딩된다 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5). 완전한 CTLA-4 핵산 서열은 진뱅크 기탁번호 Ll 5006 하에 찾아볼 수 있다.
소모된 항-종양 T 세포를 복구하는 수단으로서 이러한 면역억제성 체크포인트를 차단하는데 관심이 증가하고 있다. 매우 많은 길항적 항체가 지난 십여년 동안 개발되어 왔고 (Kahn et al., 2015, J. Oncol. Doi: 10.1155/2015/847383), 다수가 FDA의 승인을 받았으며, 이들 중 첫 번째는 CTLA4 (예로, 이필리무맙 / 예르보이, 브리스톨-마이어스 스퀴브사) 및 PD-1 (머크사가 개발한 펨브롤리주맙 / 케이트루다 및 BMS사가 개발한 니볼루맙 / 옵티보)이었다. 통상적인 치료가 환자에게 항체 투여에 의존하는 반면, 이제는 바이러스 또는 플라스미드 벡터에 의한 벡터 접종 (vectorization)이 이들 항체를 종양 세포에 전달하는데 고려되고 있다 (예로, 국제특허출원 WO2016/008976 참조). 예를 들면, 항-PD-1을 갖춘 tk- 및 rr- VV가 MCA-205 마우스 모델에서 종양 성장의 조절을 유도하는 것으로 확인되었다 (Kleinpetter et al., 2016, OncoImmunology 5(10): e1220467).
그러나, 이러한 면역-상호작용하는 분자 및 바이러스 벡터의 복잡한 특성 및 연쇄반응을 촉발할 위험성으로 인해, 전임상 및 더욱 심화된 임상 연구는 시행이 어려울 수 있다.
따라서, 암성 환자에서 항-종양 적응성 면역 반응을 증진시키는, 체크포인트 유도된 길항제 항체와 같은 치료 폴리펩티드를 전달하기 위한 종양분해성 바이러스, 조성물 및 방법을 추가로 개발할 필요성이 여전히 있다.
국제특허출원 WO 97/20574 WO 99/03885 WO 00/037504 WO 01/23001 WO 03/053463 WO 2005/042728 WO 2006/085082 WO 2006/93924 WO 2006/108846 WO 2007/056847 WO 2007/113648 WO 2007/123737 WO 2007/147528 WO 2008/114021 WO 2008/129058 WO 2008/138533 WO 2009/53937 WO 2009/065546 WO 2009/065547 WO 2009/100521 WO 2010/130753 WO 2010/130756 WO 2011/066389 WO 2012/001075 WO 2012/122444 WO 2013/022764 WO 2013/079174 WO 2013/173223 WO 2013/181634 WO 2014/053571 WO 2016/008976 WO 2016/149201 WO 2016/196237 WO 2018/122088 유럽 특허 EP 17306012.0 EP 463　756 EP 1　162　982 미국 특허 US 5,250,534 US 6,469,012 US 6,686,152 US 6,984,720 US 7,108,844 US 7,109,003 US 7,456,009 US 7,700,569 US 8,017,114 US 8,143,379 US 8,217,149 US 8,491,895 US 2007-016108
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예기치 못하게도, 본 발명자들은 백시니아 바이러스 (VV)로 감염된 세포의 상청액이 보조-자극성 CD80 및 CD86 리간드와 상호작용하는 반면, 약화된 변형된 백시니아 바이러스 (MVA)로 감염된 세포의 상청액은 이러한 성질이 결여되는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 CD80 및 CD86 결합 성질을 VV M2L 유전자좌에 의해 인코딩되는 M2 단백질에 할당하였다. 본 발명 이전에, M2는 Nfκb 경로의 저해제로서 작용하는 세포질세망에 보유되고 (Hinthong et al., 2008, Virology 373(2): 248-62), 바이러스의 코팅 제거에 관여하는 단백질로서 보고되었다 (Baoming Liu et al., 2018, J. Virol. 92(7) e02152-17). VV에 추가하여, 본 발명자들은 많은 복제성 폭스바이러스에서 M2 오르토로그의 존재를 확인하였다.
본 발명은 CD80 및 CD86에 결합하고, 3가지 면역억제성 경로에 영향을 주는 M2 단백질의 성능을 설명하고 있으며, 각각 (i) 이것은 CD28과 CD80 및 CD86 상호작용을 차단하고, (ii) 이것은 PD-L1과 CD80의 상호작용을 촉진하고; (iii) 이것은CD80/CD86 양성 세포에 대한 역 신호전달을 촉발시킨다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명자들은 m2 기능에 대한 결함을 갖는 백시니아 바이러스를 생성하였다. 항-CTLA-4 항체와 같은 면역조절성 폴리펩티드를 갖출 때, 이의 발현은 CTLA-4 매개된 면역억제성 신호를 억제하며, m2 부재가 CD28 매개된 면역자극성 신호에 대한 T 세포 반응을 재유도하도록 하는 반면, M2 양성 백시니아 바이러스는 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 대한 m2 결합으로 인해 이러한 CD28 매개된 양성 신호에 음성적으로 간섭할 것으로 예상된다.
중요하게도 및 놀랍게도, 본원에 기술된 폭스바이러스는 감염된 세포에서 기능적 m2 단백질의 합성 부재로 인해 항원에 대한 면역 반응, 특히 림프구 매개된 반응을 자극하거나, 개선할 것으로 예상되는 반면, 통상적인 폭스바이러스 (M2L 양성)에서는 생산된 바이러스성 m2 단백질이 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하고, 이로써 CD28 매개된 양성 경로를 막을 것이다. 더우기, 본원에 기술된 폭스바이러스는 바이러스의 면역 회피에 관여하는 단백질을 결여하기 때믄에 숙주 면역계 의해 용납되는 성향을 증진시키며, 이 특징은 M2 양성 폭스바이러스를 능가하는 경쟁적 장점을 제공한다. 본 발명은 분열하는 세포를 살해하는 종양분해 및 면역자극 활성을 조합하는, 예로 암 관련된 면역 소모를 단절하고, 이로써 종양분해성 바이러스의 치료 성능을 개선하는 독특한 산물을 제안한다.
이러한 기술적 문제는 청구범위에 정의된 바와 같은 구현예의 제공에 의해 해결된다. 본 발명의 기타 추가의 양태, 특징 및 장점은 다음의 본 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 이들 구현예는 본 발명의 목적을 위해 주어진다.
본 발명은 M2L 유전자좌에 의해 인코딩되는 m2 단백질에 대한 결함을 갖도록 조작되었던 폭스바이러스, 특히 종양분해성 폭스바이러스 및 이러한 바이러스를 생성하고, 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, M2L 유전자좌에 의해 인코딩되는 m2 기능에 대한 결함을, 선택적으로 tk 인코딩 유전자좌 및/또는 rr 인코딩 유전자좌의 다른 기능적 불활성화(들)과 조합하여 갖는 폭스바이러스가 생성되고, 단리되었다. 또한, 항-CTLA4 항체를 발현하도록 조작된 m2 결함성 백시니아 바이러스도 고려된다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 변형된 폭스바이러스로서, 게놈이 고유의 (야생형) 맥락에서 기능적 m2 폭스바이러스성 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하고, 상기 m2 기능에 대한 결함을 갖도록 변형되며, 상기 기능적 M2 폭스바이러성 단백질은 CD80 또는 CD86 보조-자극성 리간드 둘 중 하나 또는 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드 둘 다에 결합할 수 있고, 상기 결함성 m2 기능은 상기 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합할 수 없는, 변형된 폭스바이러스가 제공된다.
일 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 바람직하게 아비폭스바이러스 (Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스 (Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus), 몰루스키폭스바이러스 (Molluscipoxvirus), 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스 (Parapoxvirus), 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus), 세르비드폭스바이러스 (Cervidpoxvirus) 및 야타폭스바이러스 (Yatapoxvirus) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코르도폭스비리내 (Chordopoxvirinae)로부터 생성되거나, 획득된다. 바람직한 구현예에서, 상기 변형된 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스의 구성원이고, 바람직하게 백시니아 바이러스 (VV), 소 폭스 (CPXV), 라쿤 폭스 (RCN), 토끼 폭스, 원숭이 폭스, 말 폭스, 들쥐 폭스, 스컹크 폭스, 배리올라 바이러스 (또는 천연두) 및 낙타 폭스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구체적으로 변형된 백시니아 바이러스를 선호한다.
일 구현예에서, 상기 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하지 못하는 무능력은 M2L 유전자좌 내의 유전적 병변으로부터 또는 m2 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 손상시키는 비정상적 상호작용으로부터 기원한다. 상기 유전적 병변(들)은 m2 코딩 서열 내에 또는 M2L 발현을 조절하는 조절요소에서 일부 또는 전부 결실 및/또는 하나 이상의 침묵하지 않는 (아미노산 잔기(들)의 변경으로 번역됨) 돌연변이(들)을 포함하고, 바람직하게 결함성 m2 단백질의 합성 또는 m2 합성의 결여를 유도한다. 바람직하게, 이러한 유전적 병변은 M2L 유전자좌의 일부 또는 전부 결실이다.
일 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 M2L 유전자좌가 아닌 영역, 구체적으로 J2R 유전자좌 (m2 및 tk 기능 둘 다에 대한 결함성 변형된 폭스바이러스를 생성함) 또는 I4L/F4L 유전자좌/유전자좌들 (m2 및 rr 기능 둘 다에 대한 결함성 변형된 폭스바이러스를 생성함)에서 추가로 변형된다. 바람직하게, 변형된 폭스바이러스는 J2R 및/또는 I4L/F4L 유전자좌들에서 추가로 변형되어, m2, tk 및 rr 기능에 대한 결함성 변형된 폭스바이러스를 생성한다.
일 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 종양분해성이다.
일부 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 재조합이다. 상기 변형된 폭스바이러스는 항원성 폴리펩티드, 뉴클레오시드/티드 풀을 조정하는 기능을 갖는 폴리펩티드 및 면역조절성 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 면역조절성 폴리펩티드는 바람직하게 사이토카인, 케모카인, 리간드 및 항체 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 변형된 폭스바이러스는 m2, tk 및 rr 활성에 대한 결함을 갖고, 항-PD-L1 항체를 인코딩한다.
또 다른 양태에 따르면, 변형된 폭스바이러스를 생산하는 방법으로서, (a) 생산자 세포주를 제조하는 단계, (b) 상기 제조된 생산자 세포주를 변형된 폭스바이러스로 형질감염 또는 감염시키는 단계, (c) 상기 형질감염 또는 감염된 생산자 세포주를 적합한 조건 하에 배양하여 상기 바이러스의 생산을 허용하는 단계, (d) 상기 생산된 바이러스를 상기 생산자 세포주의 배양액으로부터 회수하는 단계, 및 선택적으로 (e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 양태에 따르면, 변형된 폭스바이러스 및 약제학적으로 허용가능한 비히클의 유효량을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 바람직하게 대략 103개 내지 대략 1012개 pfu, 유리하게 대략 104개 내지 대략 1011개 pfu, 바람직하게 대략 105개 내지 대략 1010개 pfu, 더욱 바람직하게 대략 106개 내지 대략 109개 pfu의 변형된 폭스바이러스를 포함한다. 상기 조성물은 바람직하게 정맥내 또는 종양내 투여를 위해 제형화된다.
또 다른 양태에서, 상기 조성물은 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 증식성 질환, 뿐만 아니라 류마티스성 관절염 및 골다공증과 같은 파골세포 활성의 증가와 관련된 질환 및 재협착과 같은 심혈관 질환을 치료하거나, 예방하는데 사용된다. 상기 치료되거나 예방되는 암은 바람직하게 신장암, 전립샘암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간암, 위암, 담관 암종, 자궁내막암, 췌장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 변형된 폭스바이러스 및 조성물은 단독 요법으로서, 또는 바람직하게 수술, 방사선 요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소요법, 면역요법, 사이토카인 요법, 표적화된 암 요법, 유전자 요법, 광역학 요법 및 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 추가적인 요법과 조합하여 사용된다.
또 다른 양태에서, 상기 변형된 폭스바이러스 및 조성물은 면역 반응을 자극하거나, 개선하는데 사용된다.
도 1은 감염되지 않거나 (점선), 야생형 VV (다이아몬드) 또는 예르보이 (역삼각형)로 감염시킨 조류 DF1 세포로부터 수집된 상청액으로 수행된 CD80/CTLA4 (도 1a) 및 CD86/CTLA4 (도 1b) 경쟁 ELISA 검정법을 나타낸다. 고정화된 CTLA4-Fc에 대한 His-태그화 B7-Fc 단백질의 결합을 항-His 태그-HRP 컨쥬게이션된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 2는 MVA (MVA), 코펜하겐 균주의 백시니아 바이러스 (Cop VV), 웨스턴 리저브 균주 (WR VV), 웨스 균주 (Wyeth VV), 라쿤 폭스 (RCN), 토끼 폭스 (RPX), 소 폭스 (CPX), 가금 폭스 (FPV) 및 유사 소 폭스 (PCPV)로 감염시킨 HeLa 세포로부터 수집된 상청액 및 감염되지 않은 HeLa 세포의 상청액 (음성 대조군)으로 수행된 CD80/CTLA4 및 CD86/CTLA4 경쟁 ELISA를 나타낸다.
도 3은 직접적으로 수집되거나, 20배 농축된 (×20), 감염되지 않거나 (Sup. 세포) MVA (Sup.MVA) 또는 코펜하겐 백시니아 바이러스 (Sup.VV)로 감염시킨 CEF 세포의 상청액으로 비-환원 SDS-PAGE에서 수행되고, Fc 단편을 갖는 인간 CD86 (hCD86-Fc), Fc 단편을 갖는 인간 CD80 (hCD80-Fc) 및 Fc 단편을 갖는 인간 CTLA4 (hCTLA4-Fc)의 융합으로 탐색된 웨스턴 블럿을 나타낸다. 검출은 항-Fc 컨쥬게이션된 항체로 수행하였다.
도 4는 바이오틴화 CD80 및 바이오틴화 CD86의 이들의 동족 수용체 CD28/CD86, CD28/CD80, CTLA4/CD80 및 PDL1/CD80와 상호작용을 각각 테스트하는 경쟁 ELISA를 나타낸다. MVA (MVA) 및 코펜하겐 균주의 백시니아 바이러스 (VV)로 감염시킨 CEF 세포로부터 수집된 상청액을 감염되지 않은 CEF (CEF)의 상청액 (음성 대조군) 및 예르보이 항체 (10 μg/mL)와 비교한다. 모두 10 μg/mL에서 재조합 인간 PD1 (hPD1), 인간 CD80 (hCD80) 및 인간 CTLA4 (hCTLA4)의 반응성을 PDL1/CD80 상호작용과 경쟁하기 위한 양성 대조군으로서 사용한다. 결합된 바이오틴화 B7 단백질의 검출을 HRP 컨쥬게이션된 항체를 사용하여 수행하였다.
도 5a는 고정화된 CD86-Fc 융합을 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 "간섭 팩터 (IF)"를 확인하는데 사용된 실험적 접근법을 나타내고, 도 5b는 VV 감염된 CEF 세포에서 포획된 IF 서열을 제공한다.
도 6은 음성 대조군으로서 감염되지 않거나, 이중 결실된 (tk- rr-) 코펜하겐 백시니아 바이러스 (VVTG18277) 또는 삼중 결실된 (tk- rr- m2-) 코펜하겐 백시니아 바이러스 (COPTG19289)로 감염시킨 HeLa 또는 DF1 세포 (HeLa 또는 DF1)로부터 수집된 상청액으로 수행된 CD80/CTLA4 경쟁 ELISA를 나타낸다. 고정화된 CTLA4-Fc에 대한 His-태그화 CD80-Fc 단백질의 결합을 항-His 태그-HRP 컨쥬게이션된 항체를 사용하여 모니터링하였다.
도 7은 다양한 MOI (10-1개 내지 10-4개)에서 LOVO (도 7a) 및 HCT116 (도 7b) 세포의 감염 이후 4일째 tk- rr- m2- 백시니아 바이러스 (COPTG19289) 및 이의 tk- rr- 상대 바이러스의 종양분해 활성을 나타낸다. 모의 처리된 세포를 음성 대조군으로서 사용한다.
도 8은 B16F10 종양이 피하로 이식된 C57BL/6 마우스에서 루시퍼라제 발현을 나타낸다. VVTG18277 바이러스 및 COPTG19289 (107개 pfu)를 0일, 3일, 6일, 10일 및 14일째 종양내로 주사하고, 종양 시료를 종양 그램 당 루시퍼라제 활성 (RLU/g 종양)의 평가를 위해 1일, 2일, 6일, 9일, 13일 및 16일째 수집하였다. 3마리의 마우스가 각 시점에 포함되었다.
도 9는 CT26 종양이 피하로 이식된 Balb/c 마우스의 항-종양 활성을 나타낸다. 107개 pfu의 VVTG18277 (사각형), COPTG19289 (삼각형) 또는 모의군 (원형)을 D0, D3, D6, D10 및 D14에 종양내로 주사하였다 (10마리 마우스/실험군). 종양 성장을 매주 2회 추적하였다 (종양 부피가 2000 mm3에 도달할 때 마우스를 살상하였다)
도 10은 HT116 종양이 피하로 이식된 스위스 누드 마우스의 항-종양 활성을 나타낸다. 마우스 (10마리 마우스/실험군)는 105개 (도 10a) 또는 107개 (도 10b) pfu의 VVTG18277 (원형), COPTG19289 (사각형) 또는 모의군 (다이아몬드) 중 어느 하나를 종양이 100 내지 200 mm3에 도달할 때 D10에 단일 주사로 정맥내로 수여받았다. 종양 성장을 매주 2회 추적하였다.
도 11은 혼합 림프구 반응 (MLR)에 미치는 M2 결함성 폭스바이러스에 의해 감염된 세포의 상청액의 효과를 나타낸다. PBMC를 2명의 상이한 공여자로부터 정제하고, COPTG19289 (tk-, rr- 및 m2-), VVTG18058 (tk- rr-) 또는 MVAN33 (야생형)으로 감염된 CEF (MOI 0.05)로부터 획득된 상청액의 존재 시 배양하였다. 배양 상청액을 감염 후 48시간째 수확하고, 약 20배로 농축하였다. 이들 농축된 상청액을 희석되지 않거나, 10배 또는 100배 희석된 PBMC 배양액 (200 μL 중 20 μL)에 첨가하여 각각 2배, 0.2배 및 0.02배의 최종 "상청액 농도"를 수득하였다. PBMC의 배양 배지에 분비된 IL-2의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. IL-2 측정은 각 테스트된 시료에 대해 3벌씩 시행되었다. 측정을 주어진 시료의 3회 반복 IL 농도의 평균을 배지로 배양된 PBMC의 3회 반복 IL-2 농도의 평균으로 나누기하여 정규화하였다.
도 12는 인간화된 마우스 모델에서 M2 결함성 COPTG19289에 의해 제공된 종양 부피에 미치는 효과를 나타낸다. NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 면역결핍 마우스 (NCG)를 CD34+ 인간 줄기 세포로 인간화하고, 인간 결장직장 암종 세포 HCT-116를 이식하였다 (마우스의 일 측부에 5 × 106개 세포가 SC 주사됨: DO). 이식 후 12일째 (D12), 마우스는 COPTG19289 (TD) 또는 m2+ 상대 바이러스 VVTG18058 (DD) 둘 중 하나의 단일 Ⅳ 주사를 106개 pfu (도 12a) 또는 105개 pfu (도 12b)의 용량으로 수여받았다. 비히클 처리된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장을 세포 이식 이후 60일에 걸쳐 모니터링하였다. 각 실험군에 대한 mm3로의 평균 종양 성장을 세포 주사 후 일의 함수로서 나타낸다.
도 13은 상기 기술된 인간화된 NCG-CD34+ 마우스 모델에서 M2 결함성 COPTG19289에 의해 제공된 생존에 미치는 효과를 나타낸다. 종양 이식 후 12일째 (D12), 마우스는 COPTG19289 (TD) 또는 m2+ 상대 바이러스 VVTG18058 (DD) 둘 중 하나의 단일 Ⅳ 주사를 106개 pfu (도 13a) 또는 105개 pfu (도 13b)의 용량으로 수여받았다. 비히클 처리된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스 생존을 세포 이식 이후 90일에 걸쳐 모니터링하였다. 각 실험군에 대한 생존 (백분율)이 세포 주사 후 일의 함수로서 주어진다.
일반적인 정의
본 발명의 이해를 도와줄 많은 정의가 본원에 제공된다. 그러나, 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참고문헌으로 통합된다.
전체 출원에 걸쳐 사용되는 바, 용어 "a" 및 "an"은 달리 문맥상 명백하게 진술하지 않는 한, 이들이 참조된 구성요소 또는 단계 중 "적어도 하나", "적어도 제 1", "하나 이상" 또는 "다수"를 말하는 의미로 사용된다. 예를 들면, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함한 다수의 세포를 포함한다.
용어 "하나 이상"은 하나 또는 하나를 넘는 수 (예로, 2, 3, 4, 5 등)을 말한다.
용어 "및/또는"은 본원에 사용되는 어디서든 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 본원에 사용된 바 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게 10% 이내, 더욱 바람직하게 5% 이내를 의미한다.
본원에 사용된 바, 산물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, 용어 "포함하는" (및 "포함하다" 및 "포함하다" (단수형)와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖다" 및 "갖다" (단수형)와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는 (including)" (및 "포함하다" (단수형) 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태) 또는 "포함하는 (containing)" (및 "포함하다" (단수형) 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태)은 개방된 의미이고, 추가적인, 재인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부일 때 아미노산 서열을 "포함한다". "구성되는"는 임의의 필수적으로 중요한 다른 구성성분 또는 단계를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 재인용된 구성성분으로 구성되는 조성물은 미량의 오염물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. 아미노산 서열로 "구성되는" 폴리펩티드는 선택적으로 단지 일부 추가적이고 비-필수적인 아미노산 잔기를 갖는 이러한 아미노산 서열의 존재를 말한다. 그럼에도 불구하고, 폴리펩티드가 임의의 아미노산이 아닌 재인용된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 상세한 설명에서, 용어 "포함하는"은 (특히 특이적 서열을 언급할 때) 필요한 경우 "구성되는"으로 대체될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "핵산, "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 사용되고, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) (예로, cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스성 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머 및 임의의 이들의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) (예로, mRNA, 안티센스 RNA, siRNA) 또는 혼합된 폴리리보- 폴리데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나의 임의의 길이의 중합체를 정의한다. 이들은 단일가닥 또는 이중가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성, 변형된 또는 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
용어 "폴리펩티드"는 이의 크기 및 번역-후 구성성분 (예로, 글리코실화)의 존재 여부와 상관없이 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 9개의 아미노산 잔기의 중합체인 것으로 이해되어야 한다. 폴리펩티드에 포함되는 최대 아미노산 수에 관한 제한은 없다. 일반적인 표기로서, 용어는 짧은 중합체 (전형적으로 당해 기술분야에서 펩티드로서 명명됨) 및 더 긴 중합체 (전형적으로 당해 기술분야에서 폴리펩티드 또는 단백질로서 명명됨) 둘 다를 말한다. 이 용어는 특히 천연 폴리펩티드, 변형된 폴리펩티드 (유도체, 유사체, 변이체 또는 돌연변이체로도 지칭됨), 폴리펩티드 단편, 폴리펩티드 다량체 (예로, 이량체), 융합 폴리펩티드를 포괄한다. 이 용어는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 재조합 폴리펩티드도 말한다. 전형적으로, 이것은 인코딩 핵산의 mRNA 서열로의 전사 및 폴리뉴클레오티드 서열이 전달되는 세포의 리보좀 기구에 의한 이의 번역이 관여한다.
용어 "동일성 (identity)"은 2개의 폴리펩티드 또는 핵산 서열 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 상응성을 말한다. 2개 서열 간의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 일치하는 위치의 수 함수이고, 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려한다. 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율을 결정하도록, 예를 들면 단백질 서열 및 구조의 아틀라스 (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9)의 NCBI 또는 ALIGN에서 입수가능한 블라스트 프로그램 또는 니들만 운쉬의 알고리즘 (Needleman and Wunsh, J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970)과 같은 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘이 당해 기술분야에서 입수가능하다. 또한, 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 특수화된 데이타베이스 (예로, 진뱅크, 위스콘신 서열 분석 패키지, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램)에서 입수가능하다. 당업자라면 비교될 서열을 넘는 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예시적인 목적으로, "적어도 70%"는 70% 이상 (71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함함)을 의미하는 반면, "적어도 80% 동일성"은 80% 이상 (81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함함) 그리고 "적어도 90%"는 90% 이상 (91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 포함함)을 의미한다.
본원에 사용된 바, 용어 "단리된"은 이의 자연 환경으로부터 제거된 (즉, 자연에서 자연적으로 관련되거나 발견되는 적어도 하나의 다른 구성성분(들)로부터 분리됨) 구성성분 (예로, 폴리펩티드, 핵산 분자, 바이러스, 벡터 등)을 말한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열은 자연에서 이와 정상적으로 관련된 서열로부터 분리될 때 (예로, 게놈으로부터 분리됨) 단리되지만, 이종유래 서열과 관련될 수 있다.
용어 "로부터 획득된", "기원하는" 또는 "기원하다" 및 임의의 이들의 등가물은 구성성분 (예로, 폴리펩티드, 핵산 분자, 바이러스, 벡터 등)의 고유의 출처를 확인하는데 사용되지만, 예를 들면 화학적 합성 또는 재조합 수단에 의할 수 있는 구성성분이 만들어지는 방법을 제한하도록 의미하지는 않는다.
본원에 사용된 바, 용어 "숙주 세포"는 조직, 장기 또는 단리된 세포에서 특정한 구조물과 관련하여 임의의 제한 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 이러한 세포는 배양된 세포주, 일차 세포 및 분열하는 세포와 같은 독특한 유형의 세포 또는 상이한 유형의 세포의 일군일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 바람직하게 포유동물 (예로, 인간 또는 비-인간) 세포와 같은 진핵생물 세포, 뿐만 아니라 본원에 기술된 폭스바이러스를 생산할 수 있는 세포를 말한다. 또한, 이 용어는 폭스바이러스의 수여자일 수 있거나, 수여자이었던 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 포함한다.
용어 "대상체"는 일반적으로 본원에 기술된 임의의 폭스바이러스, 조성물 및 방법이 필요하거나, 유익할 수 있는 유기체를 말한다. 전형적으로, 유기체는 포유동물, 구체적으로 애완동물, 사육 동물, 스포츠 동물 및 유인원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물이다. 바람직하게, 대상체는 암과 같은 증식성 질환에 걸린 것으로서 진단되거나, 이에 걸릴 위험이 있는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 유기체를 언급할 때 상호교환적으로 사용될 수 있고, 수컷 및 암컷을 포괄한다. 치료될 대상체는 신생아, 유아, 청년, 중년 또는 노인일 수 있다.
용어 "치료" (및 "치료하는", "치료하다"와 같은 임의의 치료 형태)는 본원에 사용된 바, 궁극적으로 통상적인 치료 양식과 조합하여 예방 (예로, 치료될 병리학적 병태에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 예방적 척도) 및/또는 치료법 (예로, 치료될 병리학적 병태에 걸린 것으로서 진단된 대상체에서)를 포괄한다. 치료의 결과는 표적화된 병리학적 병태를 지연시키거나, 치유하거나, 개선하거나, 이의 진행을 통제하는 것이다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같이 폭스바이러스의 투여 이후에 대상체가 이의 임상 상태의 관찰가능한 개선을 나타내는 경우, 대상체는 암에 대해 성공적으로 치료된 것이다.
용어 "투여하는" (또는 "투여된"과 같은 임의의 투여 형태)는 본원에 사용된 바, 대상체에게 본원에 기술된 폭스바이러스와 같은 치료제의 전달을 말한다.
용어 "조합" 또는 "조합 (association)"은 본원에 사용된 바, 다양한 구성성분 (예로, 폭스바이러스 및 항암 요법에 효과적인 하나 이상의 물질)의 가능한 임의의 배열을 말한다. 이러한 배열은 상기 구성성분의 혼합물, 뿐만 아니라 동시적 또는 순차적 투여를 위한 별도의 조합을 포함한다. 본 발명은 동등한 몰 농도의 각 구성성분을 포함하는 조합, 뿐만 아니라 매우 상이한 농도를 갖는 조합을 포괄한다. 당업자라면 조합의 각 구성성분의 최적 농도를 결정할 수 있는 것으로 이해된다.
M2 결함성 폭스바이러스
일 양태에서, 본 발명은 변형된 폭스바이러스로서, 게놈이 고유의 (야생형) 맥락에서 기능적 m2 폭스바이러스성 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하고, 상기 m2 기능에 대한 결함을 갖도록 변형되며, 상기 기능적 M2 폭스바이러성 단백질은 CD80 또는 CD86 보조-자극성 리간드 둘 중 하나 또는 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드 둘 다에 결합할 수 있고, 상기 결함성 m2 기능은 상기 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합할 수 없는, 변형된 폭스바이러스를 제공한다.
본원에 사용된 바, 용어 "폭스바이러스" 또는 "폭스바이러스성"은 현재 동정되었거나, 이후 확인되고 있는, 하나 이상의 포유동물 세포 (예로, 인간 세포)에 대해 감염성이고, 게놈이 고유의 (즉, 야생형) 맥락에서 기능적인 소위 M2 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하는 임의의 폭스비리대 (Poxviridae) 바이러스를 말한다. 폭스바이러스 또는 본원에 언급된 임의의 다른 바이러스의 맥락에서 사용되는 용어 "바이러스"는 바이러스성 게놈, 뿐만 아니라 바이러스성 입자 (캡시드화 및/또는 외투화된 게놈)을 포괄한다.
폭스바이러스는 이중가닥 게놈을 포함하는 DNA 바이러스의 광범위한 과다. 대부분의 바이러스와 같이, 폭스바이러스는 바이러스성 감염과 대항하도록 숙주에 의해 채용되는 많은 전략을 차단하려는 면역 회피 및 면역 조절에 관여하는 단백질 목록을 통하는 자가-방어 메커니즘을 개발하여 왔다 (Smith and Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28(3): 149-85). 전형적으로, 폭스바이러스 게놈은 바이러스가 숙주 면역 반응을 조작하도록 하고, 이로써 바이러스 복제, 증식 및 전파를 용이하게 하는 20개 이상의 숙주 반응 개질인자를 인코딩한다. 이들은 성장인자, 항-아폽토시스 단백질, NFκB 경로 및 인터페론 신호전달의 저해제, 및 주요 조직적격성 복합체 (MHC)의 하향-조절인자를 포함한다.
일반적인 설명으로, 야생형 백시니아 바이러스 (VV) 게놈은 코딩 서열이 바이러스 생애 주기의 매우 초기 단계 동안 생산되는 m2로 불리는 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함한다. 이것은 세포질세망 (RE)에서 분비되거나, 정착하여 클리코실화되는 것 같다 (Hinthong et al., 2008, Virology 373: 248-262). 이것은 기능이 여전히 조사 중이긴 하지만, 코아 코팅 제거 및 바이러스성 DNA 복제에 관여하고 (Liu et al., 2018, J. Virol., doi/10.1128/JVI.02152-17), 시험관내 바이러스 복제에 반드시 필요하다 (Smith, 1993, Vaccine 11: 43-53). 또한, 세포성 NFκB 전사인자를 Erk1 인산화 억제를 통해 하향조절하는 이의 기능은 지금도 잘 확립되어 있으며 (Gedey et al., 2006, J. Virol. 80: 8676-85), 이로써 m2가 폭스바이러스 감염 동안 숙주의 항바이러스 반응에 관여함을 시시한다. VV "M2L" 유전자좌는 야생형 VV 게놈의 5' 3번째 부분에 존재하며, 구체적으로 코딩 서열은 코펜하게 (Cop) VV 게놈의 위치 27324번 및 위치 27986번 사이에 위치한다. Cop M2L 인코딩된 유전자 산물은 220개 아미노산의 단백질 (서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 또한 유니프로트 기탁번호 P21092 하에 기재되어 있음)이고, 8개의 Cys 잔기 및 N-말단 17개 아미노산 잔기 길이의 1개의 Cys 잔기도 갖는 신호 펩티드를 포함하는 203개 아미노산 잔기 길이의 성숙한 폴리펩티드로 구성된다.
고유의 맥락에서 폭스바이러스 게놈은 대략 200 kb의 이중가닥 DNA이고, M2L 유전자좌를 포함하여 서로 다른 기능을 갖는 거의 200개 단백질을 인코딩하는 잠재력을 갖는다. 게놈 서열 및 인코딩된 개방 판독틀 (ORF)는 잘 알려져 있다. 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 적어도 고유의 m2L 유전자좌에 의해 인코딩된 m2 기능에 대해 결함성을 갖도록 사람의 손으로 변형되었던 게놈을 포함하고, 추가로 본원에 기술된 변형과 같은 하나 이상의 추가적인 변형을 포함할 수 있다.
폭스바이러스성 게놈 내의 M2L 유전자좌의 존재의 확인
주어진 폭스바이러스가 고유의 맥락에서 기능적 m2 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하는지 여부를 결정하는 것은 본원에 주어진 정보 및 당해 기술분야의 일반 지식을 사용하는 당업자의 능력 범위에 속한다. 구체적인 검정 기술학의 선택이 중요하지 않고, 임의의 이들 통상적인 방법론을 후보 폭스바이러스가 기능적 m2 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하는지 여부의 결정에 적응시키는 것이 당업자의 능력에 속한다.
일 구현예에서, M2L 유전자좌는 주어진 폭스바이러스에서 본원에 주어진 정보를 사용하고, 폭스바이러스 게놈 서열을 스크리닝하도록 적절한 프로브 또는 프라이머를 설게하여 혼성화 또는 PCR 기법에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로 설명으로, 혼성화 검정법은 전형적으로 이러한 후보 폭스바이러스로 감염되거나 이를 포함하는 세포로부터 추출된 핵산으로 혼성화에 적합한 조건 하에 검출될 M2L 유전자좌에 대한, 본원에 기재된 공지의 뉴클레오티드 (nt) 서열 정보로부터 유래한 올리고뉴클레오티드 프로브를 기반으로 한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 M2L 서열에 상보적이 되도록 설계된 (즉, 적어도 80% 동일성) 단일가닥 RNA 또는 DNA의 짧은 단편 (보통 10개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이)이다. 프로브는 바람직하게 검출을 허용하도록 표지된다 (예로, 방사성, 형광 또는 효소로 표지된 프로브). 혼성화는 보통 특이적 하이브리드만이 형성되도록 하는 엄격한 조건 하에 수행된다.
또 다른 또는 대안의 구현예에서, 주어진 폭스바이러스의 게놈에서 M2L 유전자좌의 존재는 인코딩된 유전자 산물의 아미노산 서열을 기초로 하여 확인될 수 있다. 예를 들면, M2L 유전자좌의 존재는 게놈 서열의 번역 분석에 의해 그리고 Cop VV m2 (서열번호 1) 점액종 바이러스 gp-120 유사 단백질 (서열번호 2)과 같은 공지된 폭스바이러스 m2 단백질과 대비하여 입수가능한 데이타베이스에서 인코딩된 개방 판독틀 (ORF)을 블라스팅하여 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 바람직하게 적어도 70%, 더욱 바람직하게 적어도 80%, 절대적으로 선호하는 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 인코딩된 ORF의 존재를 검색함으로써 확인될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 폭스바이러스성 게놈에 의해 인코딩되는 ORF의 아미노산 서열은 입수가능한 데이타베이스와 대비하여 정렬될 수 있다. 후보 폭스바이러스는 도메인 데이타베이스 (예로, Gene3D, PANTHER, Pfam, PIRSF, PRINTS, ProDom, PROSITE, SMART, SUPERFAMILY 또는 TIGRFAM)로 검색 이후에 m2 VV 단백질의 결과 (유니프로트에서 기탁번호 P21092 하에 언급되고, 본원에 서열번호 1로서도 개시됨)와 동일한 결과를 제공하는 소위 m2 폴리펩티드 패밀리를 인코딩하는 경우 M2L 유전자좌를 포함하는 것으로서 고려된다. 따라서, 후보 폭스바이러스는 상기 인용된 데이타베이스를 사용한 블라스트 분석에 의뢰할 때 유니프로트 PFAM 모티브 번호 PF04887 또는 인터프로 모티브 번호 IPR006971 서명이 할당되는 폴리펩티드를 인코딩하는 경우에 M2L 유전자좌를 포함하는 것으로서 확인된다.
인코딩된 m2 단백질의 기능성
본원에 사용된 바 기능적 m2 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 CD80 및/또는 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하는 상기 단백질의 성능을 말한다. 폭스바이러스의 기능적 m2 폴리펩티드를 인코딩하는 능력은 일상적인 기법에 의해 평가될 수 있다. 단백질의 이의 표적에 결합하는 능력을 평가하는 표준 검정법은 예를 들면, 비아코아TM (BiacoreTM), 열량측정법, 형광측정법, 생체층 간섭측정법, 면역 블럿 (예로, 웨스턴 블럿), RIA, 유세포 측정법 및 ELISA를 포함하여 당해 기술분야에 공지되어 있다. 구체적인 검정 기술학의 선택이 중요하지 않고, 임의의 이들 통상적인 방법론을 후보 m2 단백질이 CD80 및/또는 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하는지 여부를 결정하는데 적응시키는 것이 당업자의 능력에 속한다.
예를 들면, 후보 폭스바이러스로 감염된 세포의 상청액은 플레이트에 고정되거나 (ELISA), 세포 표면에 전시된 (FACS) CD80 또는 CD86을 탐색하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 샌드위치 경쟁 ELISA 검정법 (실시예 섹션 참조)는 결과를 얻도록 태그화 재조합 단백질을 생성할 필요가 없는 점으로 인해 적절하다. 예를 들면, ELISA 플레이트가 테스트될 시료 (예로, 폭스바이러스로 감염된 세포의 상청액)를 첨가하기 이전에 관심있는 리간드 (예로, CD86 Fc)로 코팅될 수 있다. 시료가 M2 폴리펩티드를 포함하는 경우에, 이것은 코팅된 리간드에 결합할 것이다. 다음으로, 검출 리간드가 첨가되고, 이는 보통 예로 표지화 물질을 플레이트 판독기를 사용하여 측정될 수 있는 채색된 산물 (예로, HRP (호스래티쉬 퍼옥시다제)에 결합된 항-His 태그 항체에 의해 인식되는 His 태그를 갖는 CTLA4-Fc)로 전환하는 효소의 작용에 의해 검출되도록 표지된다. 시료 없음 또는 음성 대조군 시료와 비교하여 후보 시료의 존재 시 발색 검출의 감소는 시료가 코팅된 리간드에 대한 결합을 검출 리간드와 경쟁하는 M2 폴리펩티드를 포함하는 것을 나타낸다. 또한, 예로 코팅된 리간드로서 CTLA-4-Fc 및 검출 리간드로서 CD80-Fc-His 태그를 사용하여 역으로 진행할 수 있다.
"m2 기능에 대한 결함성"은 본원에 사용된 바, 시험관내 또는 생체내에서 CD80 및/또는 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하는 m2 단백질의 무능력을 의미하려고 의도된다. 이러한 무능력은 인코딩된 m2 단백질의 정상적인 결합 활성을 방해하는 고유의 M2L 유전자좌 내의 유전적 병변으로부터 기원할 수 있다. 따라서, 기능적 불활성화는 M2L 유전자좌에서 하나 이상의 돌연변이(들)로부터 유발될 수 있다. 이러한 돌연변이는 바람직하게 코딩 서열에서 또는 m2 단백질의 발현을 조절하는 조절요소에서 삽입, 결실 및 염기 변경으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 기능적 불활성화는 m2 단백질에 결합하거나, 상기 m2 단백질의 기능적 활성을 방해하는 하나 이상의 다른 유전자 산물과 m2 단백질의 비정상적 상호작용에 의해 발생할 수 있다.
일반적인 설명으로, 본 발명자들은 이에 따라 본원에서 이하 기술된 바와 같이 M2L 유전자좌 (기능적 m2 단백질 또는 이의 오르토로그를 인코딩함)를 매우 다양한 폭스바이러스에서, 보다 상세하게는 백시니아 바이러스의 7개 균주, 점액종 바이러스의 7개 균주, 원숭이 폭스의 4개 균주, 소 폭 바이러스의 다수 균주, 배리올라 바이러스의 8개 균주에서, 뿐만 아니라 말 폭스, 타테라폭스, 낙타 폭스, 라쿤 폭스, 스컹크 폭스, 요카폭스, 토끼 섬유종 바이러스, 무르만스크폭스, 엡테시폭스, 사슴 폭스, 타나폭스, 코티아 바이러스 및 들쥐 폭스를 포함하나, 이에 한정되지 않은 다양한 기타 폭스바이러스에서 확인하였다. 예시적인 목적으로, 말 폭스, 배리올라 바이러스, 원숭이 폭스, 낙타 폭스, 소 폭스의 인코딩된 M2 단백질 오르토로그는 기준 Cop m2 단백질 (서열번호 1로 예시된 바와 같음)과 90% 이상의 동일성을 나타내고, 점액종, 스컹크, 코티아 및 들쥐 폭스 바이러스의 단백질은 표 1에 도시된 바와 같이, CopVV m2 단백질과 각각 50%, 74%, 70% 및 72%의 서열 동일성을 보여준다. 표 1은 고유의 맥락에서 M2L 유전자좌를 포함하는 다양한 폭스바이러스의 게놈 서열에 대한 진뱅크 기탁번호의 개관 및 Cop m2 단백질 (유니프로트 기탁번호 P21092 및 서열번호 1)과 관련하여 이들의 m2 단백질의 아미노산 동일성의 표기를 제공한다.
Figure pct00001
명확하게, 본원에서 폭스바이러스성 M2L 유전자좌 및 인코딩된 m2 단백질을 지정하는데 사용된 유전자 명명법은 백시니아 바이러스의 명명법 (보다 상세하게는 코펜하겐 균주의 명명법)이다. 이것은 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 본원에 언급된 기능적으로 동등한 M2L 유전자 및 m2 단백질을 포함하는 다른 폭스바이러스에도 사용된다. 따라서, 유전자 및 각각의 유전자 산물 명명법은 폭스바이러스 과, 속 및 균주에 따라 상이할 수 있지만, 백시니아 바이러스 및 다른 폭스바이러스 간의 상응성은 일반적으로 문헌에서 입수가능하다. 예시적인 목적으로, VV M2L 유전자의 등가물은 점액종 바이러스에서 M154L, 소 폭스 게놈에서 CPXV040 또는 P2L, 원숭이 폭스 게놈에서 O2L, 토끼 폭스 게놈에서 RPXV023 및 배리올라 바이러스 게놈에서 O2L 또는 Q2L으로 명명된다.
그러나, 약화된 백시니아 바이러스 MVA (변형된 백시니아 바이러스 알카라) 및 유사 소 폭스 바이러스 (PCPV)와 같은 몇몇 폭스바이러스의 게놈은 약화 과정 동안 발생하였던 커다란 게놈 결실로 인해 고유의 맥락에서 M2L 유전자좌를 결여한다 (Antoine et al., 1998, Virology 244(2): 365-96). 본 발명의 맥락에서, 용어 "폭스바이러스"는 고유의 맥락에서, m2 폴리펩티드를 결여하거나, 기능적이지 않은 m2 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌 (또는 등가물)를 포괄하는 게놈 결실(들) 또는 돌연변이(들)을 갖는 유사 소 폭스 바이러스 (PCPV), MVA 및 NYVAC 바이러스와 같은 폭스바이러스를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 바람직하게 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 몰루스키폭스바이러스, 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 세르비드폭스바이러스 및 야타폭스바이러스 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코르도폭스비리내로부터 생성되거나, 획득된다. 이들 폭스바이러스의 게놈 서열은 당해 기술분야에서, 명확하게 진뱅크 또는 Refseq와 같은 특수화된 데이타베이스에서 입수가능하다.
바람직한 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스로부터 생성되거나, 획득된다. 임의의 오르토폭스가 사용될 수 있지만, 백시니아 바이러스 (VV), 소 폭스 (CPXV), 라쿤 폭스 (RCN), 토끼 폭스, 원숭이 폭스, 말 폭스, 들쥐 폭스, 스컹크 폭스, 배리올라 바이러스 (또는 천연두) 및 낙타 폭스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 구체적으로 백시니아 바이러스가 바람직하다. 임의의 백시니아 바이러스 균주는 이에 한정되지 않지만 웨스턴 리저브 (WR), 코펜하겐 (Cop), 리스터, LIVP, 웨스 타슈켄트, 티안탄, 브라이튼, 앙카라, LC16M8, LC16M0 균주 등을 포함하여 본 발명의 맥락에서 적절하고, 구체적으로 리스터, WR, 코펜하게 및 웨스 균주를 선호한다. 이들의 게놈 서열은 문헌 및 진뱅크 (예로, 기탁번호 AY678276 (리스터), M35027 (Cop), AF095689 1 (티안탄) 및 AY243312.1 (WR) 하에) 입수가능하다. 또한, 이들 바이러스는 바이러스 수집기관으로부터 획득될 수 있다 (예로, WR의 경우 ATCC VR-1354, 웨스의 경우 ATCC VR-1536 및 리스터의 경우 ATCC VR-1549).
또 다른 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 레포리폭스바이러스 속, 바람직하게 점액종 바이러스 (게놈 서열이 진뱅크 기탁번호 NP_051868.1 하에 개시됨)로부터 생성되거나, 획득된다. 점액종 바이러스의 M2L 오르토로그 유전자좌는 M154L 유전자좌로 명명되고, 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, Cop 인코딩된 m2 단백질 (서열번호 1)과 50%의 동일성을 제시하는 소위 gp 120 유사 단백질을 인코딩한다.
결함성 m2 기능
상기에 설명된 바와 같이, CD80 및/또는 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하지 못하는 m2 단백질의 무능력은 M2L 유전자좌 내의 유전적 병변으로부터 또는 m2 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 손상시키는 비정상적 상호작용으로부터 기원한다. 상세하게, "결함성 m2 기능"은 경쟁 ELISA 검정법과 같은 통상적인 검정법에 의해 측정된 바, 고유의 m2 단백질과 비교하여 (예로, m2 양성 폭스바이러스로 감염된 세포의 상청액에서 관찰되는 바와 같음) 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 심지어 전부 무능력으로 CD80 (예로, 인간) 및 CD86 (예로, 인간)에 결합하는 성능 감소를 말한다.
변형된 폭스바이러스는 통상적인 분자 기법을 사용하여 당업자에게 공지된 많은 방식으로 조작되어 m2 기능에 대한 결함을 갖을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 고유의 M2L 유전자좌에서 바이러스에 의한 m2 단백질의 발현을 억압하는 적어도 하나의 유전적 병변을 포함한다. 이러한 유전적 병변(들)은 m2 코딩 서열 내에 또는 M2L 발현을 조절하는 조절요소에서 일부 또는 전부 결실 및/또는 하나 이상의 침묵하지 않는 (아미노산 잔기(들)의 변경으로 번역됨) 돌연변이(들)을 포함한다. 바람직하게, 상기 유전적 병변(들)은 결함성 m2 단백질의 합성 (상기에 기술된 바와 같은 고유의 단백질의 활성을 보장할 수 없음) 또는 m2 합성의 결여 (단백질이 되지 못함)를 유도한다. 예를 들면, 상기 유전적 병변은 M2L 유전자좌의 일부 또는 전부 결실, 예로 m2 코딩 서열의 상류부터 m2 코딩 서열의 적어도 100개 코돈까지 확장되는 일부 결실이다. 대안적으로 또는 조합하여, M2L 유전자좌는 점 돌연변이 (예로, 코딩 서열 내에 종결 코돈의 도입), 판독틀 이동 돌연변이 (판독틀을 변경시킴), 삽입 돌연변이 (코딩 서열을 손상시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입에 의함) 또는 CD80 및/또는 CD86 결합 기능에 관여하거나 책임지는 하나 이상의 잔기의 결실 또는 치환 또는 임의의 이들의 조합에 의해 변형될 수 있다. 또한, 유전자 프로모터는 결실되거나, 돌연변이될 수 있고, 이로써 M2L 발현을 억제한다. 당업자라면 본 발명을 기초로 하여, 실시예 섹션에서 예시된 바와 같이 야생형 및 돌연변이된 m2 단백질을 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 능력에 대해 비교함으로써 특정한 변형이 m2를 불활성화하는지 여부를 바로 결정할 것이다.
다른 폭스바이러스 변형
일 구현예에서, 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 M2L 유전자좌가 아닌 영역에서 추가로 변형된다. 다양한 추가적인 변형이 본 발명의 맥락에서 고려될 수 있다.
본 발명에 의해 포괄되는 하나 이상의 추가적인 변형(들)은 예를 들면 종양분해 활성 (예로, 분열하는 세포에서 향상된 복제), 안전성 (예로, 종양 선택성) 및/또는 바이러스 유도된 면역에 이러한 변형이 없는 폭스바이러스와 비교하여 영향을 미친다. 바람직하게, 예시적인 변형은 DNA 대사. 숙주 감염성 또는 IFN 경로에 관여하는 바이러스성 유전자와 관련된다 (예로, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608 참조).
구체적으로, 손상될 적합한 유전자는 티미딘 키나제 (tk) 인코딩 유전자좌 (J2R; 진뱅크 기탁번호 AAA48082)이다. tk 효소는 데옥시리보뉴클레오티드의 합성에 관여한다. Tk는 낮은 뉴클레오티드 농도를 일반적으로 갖는 정상 세포에서 바이러스성 복제를 위해 필요한 반면, 높은 뉴클레오티드 농도를 포함하는 분열하는 세포에서는 필수불가결하다. 또한, tk 결함성 바이러스는 종양 세포에 대한 선택성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 변형된 폭스바이러스는 J2R 유전자좌에서 추가로 변형되어 (바이러스성 tk 단백질의 발현을 억제하는 변형을 선호함), m2 및 tk 기능 둘 다에 대해 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스 (m2- tk- 폭스바이러스)를 생성한다. 상기 J2R 유전자좌의 부분적 또는 완전한 결실, 뿐만 아니라 J2R 유전자좌에서 외래 핵산의 삽입이 tk 기능을 불활성화하도록 고려된다 이러한 변형된 m2- tk- 폭스바이러스는 바람직하게 종양분해성이다.
대안적으로 또는 이와 조합하여, 변형된 폭스바이러스는 I4L 및/또는 F4L 유전자좌/유전자좌들에서 추가로 변형될 수 있어 (바이러스성 리보뉴클레오티드 환원효소 (rr) 단백질의 발현을 억제하는 변형을 선호함), m2 및 rr 기능 둘 다에 대해 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스 (m2 및 rr 결함성 폭스바이러스)를 생성한다. 고유의 맥락에서, 이 효소는 DNA 생합성에서 중요한 단계인 데옥시리보뉴클레오티드로 리보뉴클레오티드의 환원을 촉매한다. 바이러스성 효소는 포유동물 효소와 소단위체 구조가 유사하여, I4L 및 F4L 유전자좌에 의해 각각 인코딩되는 R1 및 R2로 설계된 2가지 이종유래 소단위체로 구성된다. 다양한 폭스바이러스의 게놈에서 I4L 및 F4L 유전자의 서열은 공개된 데이타베이스 (예로, 국제특허출원 WO 2009/065546 참조)에서 입수가능하다. 본 발명의 맥락에서, 폭스바이러스는 I4L 유전자 (r1 큰 소단위체를 인코딩함) 및 F4L 유전자 (r2 작은 소단위체를 인코딩함) 또는 둘 다에서 변형되어, 예로 상기 I4L 및/또는 F4L 유전자좌의 부분적 또는 완전한 결실에 의해 rr 결함성 폭스바이러스를 제공할 수 있다. 바람직하게, 이러한 변형된 m2- rr- 폭스바이러스는 종양분해성이다.
또한, J2R 및 I4L/F4L 유전자좌에서 추가로 개질되는 변형된 폭스바이러스 (M2L, J2R 및 I4L 유전자좌; M2L, J2R 및 F4L 유전자좌 또는 M2L, J2R, I4L 및 F4L 유전자좌에서 변형을 갖는 삼중 결함성 바이러스)가 제공되고, m2, tk 및 rr 활성에 대해 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스 (m2-, tk-, rr- 폭스바이러스)를 생성한다. 바람직하게, 이러한 변형된 tk-, rr- 및 m2- 폭스바이러스는 종양분해성이다.
바람직한 구현예에서, 이러한 이중 및 삼중 결함성 폭스바이러스는 바람직하게 m2 결함성 폭스바이러스와 연결하여 상기에 기술된 바와 같이 오르토폭스바이러스 또는 레포리폭스바이러스로부터 기원한다. 구체적으로, MVA가 아닌 종양분해성 백시니아 바이러스가 바람직하고, 특히 리스터, WR, 코펜하겐, 웨스 균주를 선호한다. 구체적으로, tk 및 m2 활성에 대한 및 tk, rr 및 m2 활성에 대한 결함성 VV가, 특히 상기에 기술된 바와 같은 면역 반응 (예로, 항원 또는 이의 에피토프에 대한 림프구 매개성 반응)을 자극하거나 개선하는 용도 또는 증식성 질환을 치료하는 용도를 위해 바람직하다.
다른 적합한 추가적인 변형은 바이러스성 헤마글루티닌 (A56R), 세린 프로테아제 저해제 (B13R/B14R), 보체 4b 결합 단백질 (C3L), VGF 인코딩 유전자 및 인터페롤 조절 유전자(들) (B8R 또는 B18R)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스성 유전자 산물(들)의 발현을 억압하는 변형을 포함한다. 또 다른 적합한 변형은 DNA 복제의 신뢰도를 유지하고, 티미딜레이트 합성효소에 의한 TMP 생산의 전구체를 제공하는데 둘 다 관여하는 바이러스성 dUTPase (데옥시우리딘 트리포스파타제)의 발현을 억압하는 F2L 유전자좌의 불활성화를 포함한다 (국제특허출원 WO 2009/065547).
M2L의 경우, 본원에 사용된 유전자 명명법은 Cop VV 균주의 것이다. 또한, 본원에서 이것은 달리 표시되지 않는 한, 다른 폭스바이러스의 이종유래 유전자에 사용되고, 코펜하겐 및 다른 폭스바이러스 간의 상응성은 당업자에게 사용가능하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 종양분해성이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "종양분해성"은 분열하는 세포 (예로, 암 세포와 같은 증식성 세포)에서 시험관내 또는 생체내에서 상기 분열하는 세포의 성장을 지연시키고/거나 분해하는 반면 분열하지 않는 (예로, 정상 또는 건강한) 세포의 복제는 없거나 최소로 나타내는 선택적으로 복제하는 폭스바이러스의 성능을 말한다. "복제" (또는 "복제하다" 또는 "복제하는" 등과 같은 임의의 형태의 복제)는 핵산 수준에서, 바람직하게 감염성 바이러스성 입자의 수준에서 일어날 수 있는 바이러스의 복제를 의미한다. 용어 "감염성" (또는 "감염하다" 또는 "감염시키는" 등과 같은 임의의 형태의 감염성)은 숙주 세포 또는 대상체를 감염시키고, 이에 진입하는 바이러스의 능력을 의미한다. 전형적으로, 종양분해성 폭스바이러스는 본 발명의 맥락에서 이 용어가 바이러스 게놈 (예로, 게놈 DNA) 또는 이의 일부도 포괄할 수 있지만, 바이러스 입자 내에 패키징되는 (캡시드화 및/또는 외투화된 게놈) 바이러성 게놈을 포함한다.
재조합 m2 결함성 폭스바이러스
일 구현예에서, 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 재조합이다.
용어 "재조합"은 본원에 사용된 바, 폭스바이러스가 적어도 하나의 외래 핵산 (재조합 유전자, 트랜스 유전자 또는 핵산으로도 불림)을 발현하도록 조작된 것을 표시한다. 본 발명의 맥락에서, 폭스바이러스 게놈 내에 삽입되는 "외래 핵산"은 자연 발생 폭스바이러스 게놈에서는 발견되지 않거나, 발현되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 상기 외래 핵산은 재조합 폭스바이러스가 도입되는 대상체에게 동종유래 또는 이종유래일 수 있다. 보다 구체적으로, 이것은 인간 기원이거나 인간 기원이 아닐 수 있다 (예로, 박테리아, 효모 또는 폭스바이러스를 제외한 바이러스 기원). 유리하게, 상기 재조합 핵산은 폴리펩티드를 인코딩하거나, 병든 세포에 존재하는 상보적 세포성 핵산 (예로, DNA, RNA, miRNA)에 적어도 부분적으로 결합할 수 있는, 상기 질환에 관여하는 유전자를 억제하려는 핵산 서열이다. 이러한 재조합 핵산은 고유의 유전자 또는 이의 일부(들), 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 첨가에 의해 획득된 임의의 이들의 변이체일 수 있다.
일 구현에에서, 재조합 핵산은 대상체에게 적절하게 투여될 때 치료적 또는 예방적 이익이 있는 폴리펩티드 (즉, 치료적 이익이 있는 폴리펩티드)를 인코딩하여, 치료될 병리학적 병태의 경과 또는 증상에 미치는 유익한 효과를 생성한다. 치료적 이익이 있는 매우 많은 폴리펩티드가 고려될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스는 항원성 폴리펩티드 (예로, 종양 관련 또는 백신 항원), 뉴클레오시드/티드 풀을 조정하는 기능을 갖는 폴리펩티드 및 면역조절성 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 검출가능한 유전자 산물을 인코딩하는 재조합 변형된 폭스바이러스는 본 발명의 맥락에서도 역시 유용할 수 있다. 본원에 사용된 바 "조작된"은 바이러스성 게놈에서 적합한 유전자좌에 (예로, J2R 유전자좌를 대신하여), 숙주 세포 또는 유기체에서 외래 핵산의 발현을 허용하는 적절한 조절요소의 조절 하에 하나 이상의 외래 핵산의 삽입을 말한다.
면역조절성 폴리펩티드
일 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스는 적어도 하나의 면역조절성 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 용어 "면역조절성 폴리펩티드"는 직접적으로 또는 간접적으로 면역 반응을 조정하는데 관여할 수 있는 신호전달 경로의 구성요소를 표적하는 폴리펩티드를 말한다. 면역 반응을 "조정하는" 것은 면역계의 세포에서 또는 이러한 세포 (예로, T 세포)의 활성에서 임의의 변경을 말한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 수에서 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성에서 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 일어날 수 있는 임의의 기타 변화에 의해 발현될 수 있는 면역계의 자극 또는 억압을 포함한다. 바람직하게, 이러한 폴리펩티드는 적어도 부분적으로 억제 경로를 하향-조절하고/거나 적어도 부분적으로 자극 경로를 상향-조절할 수 있으며, 구체적으로 면역 경로는 항원 제시 세포 (APC) 또는 암 세포 및 효과기 T 세포 사이에 존재한다.
본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되기 위한 면역조절성 폴리펩티드는 항원 특이적 세포의 클론 선별, T 세포 활성화, 증식, 항원 및 염증 부위로의 이동, 직접적 효과기 기능의 실행 및 사이토카인 및 막 리간드를 통한 신호전달을 포함하는 T 세포 매개된 면역의 임의의 단계에서 작용할 수 있다. 이들 단계 각각은 반응을 미세하게 조정하는 자극성 및 억제성 신호를 상호 균형화하여 조절된다.
적합한 면역조절성 폴리펩티드 및 이를 사용하는 방법은 문헌에 기술되어 있다. 예시적인 면역조절성 폴리펩티드는 사이토카인, 케모카인, 리간드 및 항체 또는 임의의 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 하나 이상의 면역조절성 폴리펩티드 (예로, 사이토카인 및 항체; 사이토카인 및 리간드; 2개의 사이토카인; 2개의 면역 체크포인트 항체; 사이토카인, 리간드 및 항체; 항체 및 2개의 사이토카인 등)를 인코딩하는 변형된, 바람직하게 종양분해성 폭스바이러스를 포괄한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되는 면역조절성 폴리펩티드는 바람직하게 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-36, IFNa, IFNg 및 과립구 대식구 콜로니 자극인자 (GM-CSF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되는 면역조절성 폴리펩티드는 MIPIα, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21로 이루어진 군으로부터 선택되는 케모카인이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되는 면역조절성 폴리펩티드는 독립적으로 펩티드 (예로, 펩티드 리간드), 고유의 수용체의 가용성 도메인 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 맥락에서, 바람직하게 CD3, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA4, Tim- 3, BTLA, Lag-3 및 Tigit로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 적절하다.
용어 "특이적으로 결합하다"는 다른 단백질 및 생물제제의 이종유래 집단의 존재 시에도 특정한 표적 또는 에피토프에 대해 결합하는 특이도 및 친화도 성능을 말한다. 따라서, 지정된 검정법 조건 하에, 항체는 이의 표적에 우선적으로 결합하고, 테스트 시료 또는 대상체에 존재하는 다른 구성성분에 유의한 양으로 결합하지 않는다. 바람직하게, 이러한 항체는 1 × 10-6 M (예로, 적어도 0.5 × 10-6, 1 × 10-7, 1 × 10-8, 1 × 10-9, 1 × 10-10 M 등) 이하의 평형 해리 상수와 함께 이의 표적에 대한 높은 친화도 결합을 보여준다. 항체의 이의 표적에 대한 결합 능력을 평가하는 표준 검정법은, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블럿, RIA 및 유세포 측정법을 포함하여 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 맥락에서, "항체" ("Ab")는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 자연 발생 항체 및 사람에 의해 조작된 항체를 포괄하고, 합성, 단일클론, 다중클론 항체, 뿐만 아니라 전장의 항체 및 이들의 단편, 변이체 또는 융합을 단 이러한 단편, 변이체 또는 융합이 표적 단백질에 대한 결합 성질을 보유하면 포함한다. 이러한 항체는 임의의 기원, 인간 또는 비-인간 (예로, 설치류 또는 낙타류 항체) 또는 키메라일 수 있다. 비-인간 항체는 사람에서 이의 면역원성을 감소시키도록 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 항체는 임의의 널리 공지된 이소형 (예로, IgA, IgG 및 IgM) 및 임의의 IgG 하위클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)로부터 유래할 수 있다. 또한, 이것은 글리코실화되거나, 부분적으로 글리코실화되거나, 글리코실화되지 않을 수 있다. 달리 문맥상 표시되지 않는 한, 용어 "항체"는 임의의 전술한 항체의 항원-결합 단편도 포함하고, 단가 및 이가 단편 및 단일 사슬 항체를 포함한다. 또한, 용어 항체는 보모 항체와 동일한 결합 특이성을 나타내는 한 다중특이적 (예로, 이중특이적) 항체를 포함한다. 후보 항체의 결합 성질에 대해 스크리닝하는 것은 당업자의 능력에 속한다.
예시적인 목적으로, 전장의 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (H)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 3개의 CH1, CH2 및 CH3 도메인으로 (궁극적으로 CH1 및 CH2 사이의 힌지와 함께) 구성되는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 하나의 CL 도메인을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 구조틀 영역 (FR)로 명명된 4개의 보존된 영역과 함께 다음의 순서로 산재하는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 3개의 과다가변 영역을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역은 결합 특이성을 위한 결정기이다. 본원에 사용된 바, "인간화 항체"는 인간 항체 (즉, 인간에서 자연적으로 생산됨)와의 유사성을 증가시키도록 단백질 서열이 변형되었던 비-인간 (예로, 마우스, 낙타, 래트 등) 항체를 말한다. 인간화의 공정은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 전형적으로 FR 영역의 하나 이상의 잔기를 인간 면역글로불린 서열과 유사하게 치환함으로써 수행되는 반면, 가변 영역 (특히 CDR)의 많은 대부분의 잔기는 변형되지 않고, 비-인간 면역글로불린에 해당한다. "키메라 항체"는 한 종의 하나 이상의 요소(들) 및 또 다른 종의 하나 이상의 요소(들)을 포함하고, 예를 들면 인간 면역글로불린의 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함하는 비-인간 항체이다.
항원-결합 단편의 예시적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, ds-scFv 및 다이아체를 포함하여 당해 기술분야에 공지되어 있다. 구체적으로 유용한 항체 단편은, 궁극적으로 링커로 다함께 융합되어 단일 단백질 사슬을 만드는 Fv 단편의 2개 도메인, VH 및 VL을 포함하는 단일 사슬 항체 (scFv)이다.
일 구현에에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되는 항체는 T 세포의 표면에서 분자에, 바람직하게 T 세포 활성화의 조절에 관여하는 면역억제성 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 단일 사슬 항체이다. 결합 능력에 추가하여, 이러한 항체는 상기 면역억제성 수용체의 생물학적 활성을 추가로 억제할 수 있다.
구체적으로 바람직한 구현예는 변형된 바람직하게 종양분해성 폭스바이러스로서, PD-L1 또는 CTLA4에 특이적으로 결합하고, 바람직하게 이러한 수용체의 생물학적 활성을, 명확하게 보조-자극성 CD80 및/또는 CD86 리간드(들)와의 상호작용을 억제함으로써 억제하는 길항제 항체를 발현하는 폭스바이러스에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 변형된 폭스바이러스에 의해 발현되는 길항제 항체는 포유동물 CTLA-4 (예로, 인간 CTLA-4)에 특이적으로 결합하고, 면역억제성 신호를 전달하는 성능을 억제하는 (예로, CTLA-4의 CD80 및 CD86 리간드에 대한 결합을 차단함으로써) 항-CTLA-4 항체이다.
게놈에 M2L 유전자좌를 보유하는 통상적인 폭스바이러스를 사용하여, 발현된 항-CTLA-4 항체는 CTLA-4 매개된 면역억제성 신호를 억제하는데 작용할 것인 반면, 제자리 생산된 M2 단백질은 CD80 및 CD86 리간드와 상호작용하고, 이로써 CD28 매개된 보조-자극성 신호를 감소시키거나 억제할 것이다. 대조적으로, m2 기능이 결여된 항-CTLA-4 발현하는 본원에 기술된 변형된 (즉, m2 결함성) 폭스바이러스는 CTLA-4 매개된 면역억제성 신호를 억제하고, CD28 매개된 보조-자극성 신호를 향해 면역 반응을 재안내하는 둘 다를 할 수 있을 것이다.
많은 항-CTLA-4 항체는 당해 기술분야에서 입수가능하고 (예로, 특히 미국 특허 US 8,491,895, 국제특허출원 WO 2000/037504, WO 2007/113648, WO 2012/122444 및 WO 2016/196237 참조), 이들 중 일부는 지난 10여년간 FDA 승인을 받았거나, 임상 개발이 진행 중이다. 본 발명에 사용가능한 항-CTLA-4 항체의 대표적인 예시는, 예로 예르보이® (예로, 미국 특허 US 6,984,720; US 8,017,114 참조), MK-1308 (머크사), AGEN-1884 (아제누스사; 국제특허출원 WO 2016/196237) 및 트레멜리무맙 (아스트라제네카사; 미국 특허 US 7,109,003 및 US 8,143,379)와 같은 브리스톨 마이어 스퀴브사에 의해 시판되는 이필리무맙 그리고 단일 사슬 항-CTLA4 항체 (예로, 국제특허출원 WO 97/20574 및 WO 2007/123737 참조)이다.
바람직한 구현예는 (i) 항-CTRA-4 항체를 인코딩하는 m2 및 tk 기능 둘 다에 대한 결함을 갖는 (M2L 및 J2R 유전자좌 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스; (ii) 항-CTRA-4 항체를 인코딩하는 m2 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L 유전자좌 및 I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스; 및 (iii) 항-CTRA-4 항체를 인코딩하는 m2, tk 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L, J2R 및 I4L 및/또는 F4L 유전자좌에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙이다.
특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙이다.
본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의한 발현에 적합한 면역조절성 폴리펩티드의 또 다른 바람직한 예시는 PDL-1 (프로그램화된 사멸 리간드-1)에 특이적으로 결합하고, 이의 생물학적 활성을 억제하는 항체이다. PD-1/PD-L1 수용체/리간드 복합체의 형성은 CD8+ T 세포의 억제 및 이에 따른 면역 반응의 억제를 유도한다. PD-L1은 PD-1의 결합 시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향-조절하는 PD-1에 대한 2가지 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나이다 (나머지는 PD-L2임). 완전한 인간 PD-L1 서열은 진뱅크 기탁번호 Q9NZQ7 하에 찾을 수 있다.
길항제 항-PD-L1 항체는 당해 기술분야에서 머크사, 시그마 알드리치사 및 앱캠사와 같은 다양한 공급업체로부터 입수가능하고, 일부는 FDA 승인을 받았거나, 임상 개발이 진행 중이다. 본 발명에 사용가능한 항-PD-L1 항체의 대표적인 예시는, 예로 BMS-936559 (브리스톨 마이어 스퀴브사에 의해 개발 중으로 MDX-1105로도 알려짐; 국제특허출원 WO 2013/173223), 아테졸리주맙 (로슈사에 의해 개발 중으로 테센트리큐®로도 알려짐; 미국 특허 US 8,217,149); 듀르발루맙 (아스트라제네카사; 에비핀지TM (EVIFINZITM)로도 알려짐; 국제특허출원 WO 2011/066389), MPDL3280A (제넨테크/로슈사에 의해 개발 중임), 뿐만 아니라 아벨루맙 (상표명 바벤시오 하에 머크사 및 화이자사로부터 개발됨; 국제특허출원 WO 2013/079174), STI-1014 (소렌토사; 국제특허출원 WO 2013/181634) 및 CX-072 (사이토맥스사; 국제특허출원 WO 2016/149201)이다. 상응하는 뉴클레오티드 서열은 입수가능한 문헌에 개시된 정보를 기초로 하여 표준 기법에 따라 클로닝되거나 단리될 수 있다.
바람직한 구현예는 (i) 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2 및 tk 기능 둘 다에 대한 결함을 갖는 (M2L 및 J2R 유전자좌 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스; (ii) 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L 유전자좌 및 I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스; 및 (iii) 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2, tk 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L, J2R 및 I4L 및/또는 F4L 유전자좌에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된 (바람직하게 종양분해성) 폭스바이러스에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 듀르발루맙이다.
특정 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 아벨루맙이다.
다른 구현예는 (i) 항-CTRA-4 항체 및 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2 및 tk 기능 둘 다에 대한 결함을 갖는 (M2L 및 J2R 유전자좌 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된, 바람직하게 종양분해성 폭스바이러스; (ii) 항-CTRA-4 항체 및 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L 유전자좌 및 I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 둘 다에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된, 바람직하게 종양분해성 폭스바이러스; 및 (iii) 항-CTRA-4 항체 및 항-PD-L1 항체를 인코딩하는 m2, tk 및 rr 활성에 대한 결함을 갖는 (M2L, J2R 및 I4L 및/또는 F4L 유전자좌에서 돌연변이를 불활성화하여 생성됨) 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호하는 변형된, 바람직하게 종양분해성 폭스바이러스에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙이고, 항-PD-L1 항체는 아벨루맙이다.
항원성 폴리펩티드
용어 "항원성"은 항원성을 갖는 것으로서 정성분석된 폴리펩티드를 인코딩하는 본원에 기술된 재조합 폭스바이러스가 도입되었던 대상체에서 측정가능한 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력을 말한다. 상기 재조합 폭스바이러스에 의해 발현된 항원성 폴리펩티드에 대해 자극된 또는 유도된 면역 반응은 체액성 및/또는 세포성일 수 있다 (예로, 효과기 면역 세포의 활성화에 관여하는 항체, 사이토카인 및/또는 케모카인의 생산). 자극된 또는 유도된 면역 반응은 보통 투여받은 대상체에서 보호작용 효과에 기여한다. 매우 다양한 직접 또는 간접 생물학적 검정법이 생체내 (동물 또는 인간 대상체) 또는 시험관내에서 (예로, 생물학적 시료) 폴리펩티드의 항원성 특성을 평가하는데 사용가능하다. 예를 들면, 선천성 면역을 자극하는 특정한 항원의 능력은 예를 들면 NK/NKT 세포의 측정 (예로, 활성화의 ㅍ표시 및 수준), 뿐만 아니라 IFN 관련 사이토카인 및/또는 케모카인이 생산하는 연쇄반응, TLR (톨 유사 수용체)의 활성화 및 기타 선천성 면역의 마커에 의해 수행될 수 있다 (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5(1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968). 세포 매개된 면역 반응을 자극하는 특정한 항원의 능력은 일상적인 생체검정법을 사용한 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 유래한 것을 포함하는 활성화된 T 세포에 의해 생산된 사이토카인(들)의 정량화에 의해 (예로, ELISpot에 의해, 유세포 측정법의 다중매개변수에 의해, ICS (세포내 사이토카인 염색), 복합 기술 또는 ELISA를 사용한 사이토카인 프로파일 분석에 의해, T 세포의 증식 능력의 결정 (예로, [3H] 티미딘 혼입 검정법에 의해 T 세포 증식 검정법)에 의해, 민감화된 대상체에서 항원 특이적 T 림프구의 세포독성 성능을 검정함으로써, 또는 유세포 측정법 또는 상기에 기술된 바와 같은 적절한 동물 모델의 면역화에 의해 림프구 하위집단을 식별함으로써 T 세포의 특성화 및/또는 정량화) 수행될 수 있다.
용어 항원성 폴리펩티드는 고유의 항원, 뿐만 아니라 단편 (예로, 에피토프, 면역원성 도메인 등) 및 이들의 변이체를 포괄하는 것으로, 단 이러한 단편 또는 변이체가 면역 반응의 표적이 될 수 있으면 고려된다. 본원에 사용되는 바람직한 항원성 폴리펩티드는 종양 관련 항원이다. 특정한 병리학적 병태를 치료하는데 적절한 하나 이상의 항원성 폴리펩티드를 선택하는 것은 당업자의 능력에 속한다.
일 구현예에서, 재조합 변형된 폭스바이러스에 의해 인코딩된 항원성 폴리펩티드(들)은 암에 대한 마커와 관련되고/거나, 마커로서 작용하는 암 항원(들) (종양 관련 항원 또는 TAA로도 불림)이다. 암 항원은 다양한 카테고리의 폴리펩티드, 예로 건강한 세포에서 정상적으로 침묵하는 (예로, 발현되지 않음) 폴리펩티드, 낮은 수준으로만 또는 분화의 특정 단계에서 발현되는 폴리펩티드, 일시적으로 발현되는 배아 및 태아 항원과 같은 폴리펩티드, 뿐만 아니라 종양원 유전자 (예로, 활성화된 ras 종양원 유전자), 원시 종양원 유전자 (예로, ErbB 패밀리)과 같은 세포성 유전자의 돌연변이로부터 생성되는 폴리펩티드 또는 염색체 전위로부터 생성되는 단백질을 포괄한다.
수많은 종양 관련 항원이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 종양 항원은 특히 결장직장 관련 항원 (CRC), 암배아 항원 (CEA), 전립샘 특이 항원 (PSA), BAGE, GAGE 또는 MAGE 항원 패밀리, p53, 뮤신 항원 (예로, MUC1), HER2/neu, p21ras, hTERT, Hsp70, iNOS, 타이로신 키나제, 메조텔린, c-erbB-2, 알파 태아단백질, AM-1, 및 임의의 이들의 면역원성 에피토프 또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 종양 관련 항원은 암 세포에서 암발병기전의 과정 동안 출현하였던 신생 에피토프/항원을 포괄할 수 있으며, 상응하는 야생형 항원과 관련하여 아미노산 잔기(들)의 하나 이상의 돌연변이(들)을 포함한다. 전형적으로, 이것은 환자로부터 얻은 암 세포 또는 조직에서 발견되지만, 환자 또는 건강한 개인으로부터 얻은 정상 세포 또는 조직에서는 발견되지 않는다.
또한, 종양 관련 항원은 대상체 (특히 만성적으로 감염된 대상체)에서 악성 병태를 유발할 수 있는 병원성 유기체, 예컨대 RNA 및 DNA 종양 바이러스 (예로, 인간 파필로마 바이러스 (HPV), C형 간염 바이러스 (HCV), B형 간염 바이러스 (HBV), 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 등) 및 박테리아 (예로, 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pilori)에 의해 인코딩된 항원을 포괄할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 재조합 변형된 폭스바이러스에 의해 인코딩된 항원성 폴리펩티드(들)은 인간 또는 동물 대상체에게 전달될 때 감염성 질환에 대해 치료적으로 또는 예방적으로 보호작용을 하려는 백신 항원(들)이다. 수많은 백신 항원이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 백신 항원은 세포성 항원, 바이러스성, 박테리아성 또는 기생충 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포성 항원은 뮤신 1 (MUC1) 당단백질을 포함한다. 바이러스성 항원은 예를 들면 A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스, 면역결핍 바이러스 (예로, HIV), 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 배리셀라 조스터 바이러스, 파필로마 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 독감 바이러스, 파라-인플루엔자 바이러스, 콕사키 바이러스, 피코나 바이러스, 로타바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 리노바이러스, 루벨라 바이러스, 파포바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스 및 광견병 바이러스로부터 나온 항원을 포함한다. HIV 항원의 일부 비-제한적인 예는 gp120 gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef tat, nef를 포함한다. 인간 헤르페스 바이러스 항원의 일부 비-제한적인 예는 gH, gL gM gB gC gK gE 또는 gD, 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 매우 초기 단백질 예컨대 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36을 포함한다. 사이토메갈로바이러스 항원의 일부 비-제한적인 예는 gB를 포함한다. 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 항원의 일부 비-제한적인 예는 gp350를 포함한다. 배리셀라 조스터 바이러스 항원의 일부 비-제한적인 예는 gp1, 11, 111 및 IE63을 포함한다. C형 간염 바이러스 항원의 일부 비-제한적인 예는 env E1 또는 E2 단백질, 코아 단백질, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7을 포함한다. 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 항원의 일부 비-제한적인 예는 L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7을 포함한다. 기타 바이러스 병원체, 예컨대 호흡기 합포체 바이러스 (예로, F 및 G 단백질), 파라-인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 플래비바이러스 (예로, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기 매개성 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 및 독감 바이러스 세포 (예로, HA, NP, NA, 또는 M 단백질)로부터 유래한 항원도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 박테리아성 항원은 예를 들면 마이코박테리아 유발성 TB, 나병, 폐렴, 호기성 그램 음성 바실러스, 마이코플라즈마, 스태필로코커스, 스트렙토코커스, 살모넬라, 클라미디아, 나이세리아 등으로부터 나온 항원을 포함한다. 기생충 항원성 폴리펩티드는 예를 들면 말라리아, 리슈마니아증, 트리파노조마증, 톡소플라즈마증, 조충증 및 필라리아증으로부터 나온 항원을 포함한다.
뉴클레오시드 풀 조정인자
일 구현에에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스는 이의 게놈 내에 뉴클레오시드 풀 조정인자 기능을 갖는 하나 이상의 재조합 유전자(들)을 보유한다. 대표적인 예는 사이티딘 탈아미나제, 명확하게 효모 사이티딘 탈아미나제 (CDD1) 또는 인간 사이티딘 탈아미나제 (hCD) (국제특허출원 WO 2018/122088 참조); 대사 및 면역 경로에 작용하는 폴리펩티드 (예로, 아데노신 탈아미나제, 명확하게 인간 아데노신 탈아미나제 huADA1 또는 huADA2; 유럽 특허 EP 17306012.0 참조); 세포사멸 경로에 작용하는 폴리펩티드; 엔도뉴클레아제 (제한효소, CRISPR/Cas9) 및 표적 특이 RNA (예로, miRNA, shRNA, siRNA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
검출가능한 유전자 산물
전형적으로, 이러한 폴리펩티드는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능하고, 이에 따라 숙주 세포 또는 대상체 내의 재조합 폭스바이러스를 식별하도록 허용할 수 있다. 적합한 검출가능한 유전자 산물의 비-제한적인 예는 형광성 수단에 의해 검출가능한 mCherry, 에머랄드, 개똥벌레 루시퍼라제 및 녹색 형광성 단백질 (GFP 및 이의 증진된 버전 eGFP), 뿐만 아니라 열량측정 수단에 의해 검출가능한 베타-갈락토시다제를 포함한다.
재조합 유전자의 발현
상기에 인용된 바와 같이 치료적 이익이 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에서 접근가능한 서열 데이타 및 본원에 제공된 정보를 사용하여 표준 분자생물학 기법 (예로, PCR 증폭, cDNA 클로닝, 화학적 합성)에 의해 쉽게 획득될 수 있다. 예를 들면, 항체, 이들의 단편 및 유사체를 클로닝하는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다 (예로, Harlow and Lane, 1988, 항체 - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). 항체 인코딩하는 핵산 분자는 생산 하이브리도마 (예로, Cole et al. in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss pp77-96), 면역글로불린 유전자 라이브러리 또는 입수가능한 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 뉴클레오티드 서열이 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
또한, 재조합 핵산은 특정한 숙주 세포 또는 대상체에서 높은 수준의 발현을 제공하기 위해 최적화될 수 있다. 따라서, 유기체의 코돈 사용도 양상이 높은 무작위성을 갖지 않는 것으로 관찰되었으며, 코돈의 사용이 상이한 숙주 사이에 현저하게 상이할 수 있다. 예를 들면, 치료 유전자는 박테리아, 바이러스 또는 하등 진핵생물 기원이고, 따라서 고등 진핵생물 세포 (예로, 인간)에서의 효율적인 발현을 위해 부적절한 코돈 사용도 양상을 갖을 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 숙주 유기체에서 드물게 사용되는 코돈에 해당하는 하나 이상의 "고유의" (예로, 박테리아, 바이러스 또는 효모) 코돈을 동일한 아미노산을 인코딩하는 더욱 빈번하게 사용되는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 발현 증가가 부분적 치환으로 달성될 수 있기 때문에, 드물게 사용된 코돈에 해당하는 모든 고유의 코돈을 대체하는 것은 필요하지 않다.
코돈 사용도의 최적화에 추가하여, 숙주 세포 또는 대상체에서 발현은 재조합 핵산 서열(들)의 추가적인 변형을 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들면, 다양한 변형은 농축된 영역에 존재하는 드물고 비-최적 코돈의 군집화를 막고/거나, 음성적으로 발현 수준에 영향을 줄 것으로 예상된 "음성" 서열요소를 억압하거나 변형하도록 고려될 수 있다. 이러한 음성 서열요소는 매우 높은 (> 80%) 또는 매우 낮은 (< 30%) GC 함량을 갖는 영역; AT 농축 또는 GC 농축 서열 스트레치; 불안정한 직접 또는 역 반복서열 서열; RNA 이차 구조; 및/또는 내부 TATA 박스, 카이 부위, 리보좀 진입 부위 및/또는 스플라이싱 공여체/수여체 부위와 같은 내부 잠재조절요소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 재조합 핵산 분자(들) 각각은 숙주 세포 또는 대상체에서 발현에 적합한 조절요소에 작동가능하게 연결된다. 본원에 사용된 바, 용어 "조절요소" 또는 "조절 서열"은 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서 핵산(들) 또는 이의 유도체 (예로, mRNA)의 복제, 증식 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 운반을 포함하여 인코딩하는 핵산의 발현을 허용하거나, 이에 기여하거, 조정하는 임의의 요소를 말한다. 본원에 사용된 바, 용어 "작동가능하게 연결된"은 연결되는 요소가 이들의 의도한 목적으로 조화롭게 기능하도록 배열되는 것을 말한다. 예를 들면, 프로모터가 핵산 분자의 전사 개시부터 종결인자까지 전사에 효과를 발휘하는 경우에 프로모터는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 것을 의미한다.
당업자라면 조절 서열의 선택이 핵산 자체, 이것이 삽입되는 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 요인에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 맥락에서, 이것은 많은 유형의 숙주 세포에서 또는 특정 숙주 세포에 특이적인 (예로, 간 특이적 조절 서열) 핵산 분자의 전신 유도성 발현이거나, 특이적 사건 또는 외래성 요인 (예로, 온도, 영양 첨가물, 호르몬 등에 의함)에 반응하여 또는 바이러스 주기의 단계 (예로, 후기 또는 초기)에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이러스 생산을 최적화하고, 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적인 독성을 회피하기 위하여, 특이적 사건 또는 외래성 요인에 반응하여 생산 단계 동안 억압되는 프로모터를 사용할 수 있다.
구체적으로, 폭스바이러스 프로모터는 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의한 재조합 유전자의 발현에 적응된다. 대표적인 예는 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, p11, pB2R, pA35R 및 K1L 프로모터, 카크라바디 등에서 기술된 것과 합성 프로모터 (Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol. Methods 66: 135-8; 및 Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), 뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당업자라면 폭스바이러스성 게놈 내에 삽입된 핵산 분자(들)의 발현을 조절하는 조절요소가 적절한 전사의 개시, 조절 및/또는 종결 (예로, 폴리 A 전사 종결 서열), mRNA 운반 (예로, 핵 정착 신호 서열), 프로세싱 (예로, 스플라이싱 신호), 안정성 (예로, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역 (예로, 개시인자 Met, 삼분지 리더 서열, IRES 리보좀 결합 부위, 신호 펩티드 등)을 위한 추가적인 요소를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
적절할 때, 재조합 폴리펩티드가 추가적인 조절 요소를 포함하여 이의 발현, 이동 및 생물학적 활성을 용이하게 하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 신호 펩티드는 감염된 세포로부터의 분비를 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 신호 펩티드는 전형적으로 Met 개시인자 바로 직후에 단백질의 N-말단에 삽입된다. 신호 펩티드의 선택은 광범위하고, 당업자에게 접근가능하다. 또한, 감염된 세포의 적합한 막 (예로, 원형질막)에서 인코딩된 단백질의 고정을 용이하게 하도록 막통과 도메인의 첨가를 고려할 수 있다. 막통과 도메인은 전형적으로 종결 코돈 바로 직전에 또는 종결 코돈과 매우 근접하게 단백질의 C-말단에 삽입된다. 매우 다양한 막통과 도메인이 당해 기술분야에서 입수가능하다 (예로, 국제특허출원 WO 99/03885).
추가적인 예로서, 펩티드 태그 (전형적으로, 입수가능한 항혈청 또는 화합물에 의해 인식될 수 있는 짧은 펩티드 서열)도 인코딩된 유전자 산물의 이어지는 발현, 이동 또는 정제를 위해 첨가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, PK 태그, FLAG 옥타펩티드, MYC 태그, HIS 태그 (보통 4개 내지 10개 히스티딘 잔기의 스트레치) 및 e-태그 (미국 특허 US 6,686,152)를 포함하나 이에 한정되지 않는 매우 다양한 태그 펩티드가 사용될 수 있다, 태그 펩티드(들)은 독립적으로 단백질의 N-말단에 또는 대안적으로 이의 C-말단에, 또는 대안적으로 내부에 또는 여러 개의 태그가 채용될 때 임의의 이들 위치에 위치할 수 있다. 태그 펩티드는 항-태그 항체를 사용한 면역검출 검정법에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 예로서, 글리코실화는 변경되어 인코딩된 유전자 산물의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 변경은 글리코실화의 부위(들) 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이화함으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 양상은 항체의 ADCC 능력 및/또는 이들의 표적에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 맥락에서 추구될 수 있는 또 다른 접근법은 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 인코딩된 재조합 유전자 산물에 세포독성 제제 및/또는 표지화 제제와 같은 외부 제제의 커플링이다. 본원에 사용된 바, 용어 "세포독성 제제"는 독소 (예로, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이의 단편)과 같은 세포에 직접적으로 독성이 있는 (예로, 생식 또는 성장을 방해함) 화합물을 말한다. 본원에 사용된 바, "표지화 제제"는 검출가능한 화합물을 말한다. 표지화 제제는 자체적으로 검출가능하거나 (예로, 방사성 동이원소 표지 또는 형광성 표지), 효소적 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 커플링은 치료 폴리펩티드 및 외부 제제 사이의 유전적 융합에 의해 수행될 수 있다.
폭스바이러스 게놈에서 재조합 핵산(들)의 삽입 (적절한 조절요소가 장착됨)은 적절한 제한효소를 사용하거나, 바람직하게는 상동성 재조합에 의하는 통상적인 수단에 의해 이루어진다.
일 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스, 구체적으로 재조합 종양분해성 폭스바이러스를 생성하는 방법으로서, 삽입 부위의 상류 및 하류에 각각 존재하는 바이러스 서열과 5' 및 3'에서 연접하는 재조합 핵산을 (이의 조절요소와 함께) 포함하는 운반 플라스미드 및 바이러스 게놈 사이에 상동성 재조합에 의하는, 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 운반 플라스미드를 생성하는 단계 (예로, 통상적인 분자생물학 방법에 의함); 및 상기 운반 플라스미드를, 명확하게 운반 플라스미드에 존재하는 연접하는 서열을 포함하는 폭스바이러스 게놈 (예로, M2L 불활성화된 바이러스)과 함께 적합한 숙주 내에 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 운반 플라스미드는 형질감염에 의해 숙주세포 및 감염에 의해 바이러스 내에 도입된다.
각 연접하는 바이러스성 서열의 크기는 달라질 수 있다. 이것은 보통 적어도 100개 bp 및 많아야 1,500개 bp이고, 재조합 핵산의 각 측면 상에 대략 150개 내지 800개 bp, 유리하게 180개 내지 600개 bp, 바람직하게 200개 내지 550개 bp, 더욱 바람직하게 250개 내지 500개 bp를 선호한다.
재조합 핵산 분자(들)은 독립적으로 폭스바이러스성 게놈의 임의의 위치에 삽입될 수 있으며, 삽입은 당해 기술분야에 널리 공지된 일상적인 분자생물학에 의해 수행될 수 있다. 다양한 삽입 부위는 폭스바이러스 게놈의 비-필수적 바이러스성 유전자, 유전자간 영역 또는 비-코딩 부분에서 고려될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 맥락에서 J2R 유전자좌가 적절하다. 상기에 기술된 바와 같이, 폭스바이러스 게놈 내로 외래 핵산(들)의 삽입 시, 삽입 부위에서 바이러스성 유전자좌는 적어도 부분적으로 결실될 수 있고, 예로 전부 또는 일부 결실된 유전자좌에 의해 인코딩된 바이러스성 유전자 산물의 발현 억제 및 상기 바이러스 기능에 대한 결함성 바이러스를 생성한다.
특정 구현예에서, 변형된 폭스바이러스의 식별은 선별 및/또는 검출가능한 유전자의 사용에 의해 용이해질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 운반 플라스미드는 선별 마커를 추가로 포함하고, 구체적으로 선별 배지 (예로, 마이코페놀산, 크산틴 및 하이폭산틴의 존재)에서 성장을 허용하는 GPT 유전자 (구아닌 포스포리보실 전이효소를 인코딩함) 또는 GFP, e-GFP 또는 mCherry와 같은 검출가능한 유전자 산물을 인코딩하는 검출가능한 유전자를 선호한다. 또한, 상기 선별 또는 검출가능한 유전자에서 이중가닥 절단을 제공할 수 있는 엔도뉴클레아제의 사용도 고려될 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 단백질의 형태이거나, 발현 벡터에 의해 발현될 수 있다.
변형된 폭스바이러스를 생성하도록 하는 상동성 재조합은 바람직하게 적절한 숙주 세포 (예로, HeLa 또는 CEF 세포)에서 수행된다.
폭스바이러스의 생산
전형적으로, 본 발명의 변형된 폭스바이러스는 형질감염된 또는 감염된 숙주 세포를 감염성 폭스바이러스성 입자의 생산 및 회수를 허용하도록 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 통상적인 기법을 사용하여 적합한 숙주 세포주 내에서 생산된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발병은 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 방법은 (a) 생산자 세포주를 제조하는 단계, (b) 상기 제조된 생산자 세포주를 상기 변형된 폭스바이러스로 형질감염 또는 감염시키는 단계, (c) 상기 형질감염 또는 감염된 생산자 세포주를 상기 바이러스 (예로, 감염성 폭스바이러스성 입자)의 생산을 허용하도록 적합한 조건 하에 배양하는 단계, (d) 상기 생산된 바이러스를 상기 생산자 세포주의 배양액으로부터 회수하는 단계, 및 선택적으로 (e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 생산자 세포는 HeLa 세포 (예로, ATCC-CRM-CCL-2TM 또는 ATCC-CCL-2.2TM), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17) 및 BHK-21 (ATCC CCL-10)와 같은 햄스터 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 (예로, 인간 또는 비-인간) 세포 또는 국제특허출원 WO 2005/042728, WO 2006/108846, WO 2008/129058, WO 2010/130756, WO 2012/001075 등에 기술된 세포 중 하나와 같은 조류 세포, 뿐만 아니라 수정된 달걀로부터 얻은 닭 배아로부터 제조된 일차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)이다.
바람직하게, 생산자 세포는 필요한 경우 혈청 및/또는 적합한 성장인자(들)이 보충될 수 있거나 없는 적절한 배지 (예로, 바람직하게 동물- 또는 인간-유래한 산물이 없는 화학적으로 정의된 배지)에서 배양된다. 적절한 배지는 당업자라면 생산자 세포에 따라 용이하게 선택할 수 있다. 이러한 배지는 시판되어 입수가능하다. 바람직하게, 생산자 세포는 감염 이전에 +30℃ 내지 +38℃에 포함되는 온도 (더욱 바람직하게 대략 37℃)에서 1일 내지 8일 동안 배양된다. 필요한 경우, 1일 내지 8일의 여러 번의 계대가 총 세포 수를 증가시키기 위하여 이루어진다.
단계 (b)에서 생산자 세포는 생산자 세포의 생산적 감염을 허용하도록 적절한 감염 중복도 (MOI)를 사용하여 적절한 조건 하에서 변형된 폭스바이러스에 의해 감염된다. 예시적인 목적으로, 적절한 MOI는 10-3 내지 20의 범위이고, 구체적으로 0.01 내지 5, 더욱 바람직하게 0.03 내지 1를 포함하는 MOI를 선호한다. 감염 단계는 생산자 세포의 배양에 사용되는 배지와 동일하거나, 상이할 수 있는 배지에서 수행된다.
단계 (c)에서, 감염된 생산자 세포는 다음으로 자손 폭스바이러스 (예로, 감염성 바이러스 입자)가 생산될 때까지 당업자에게 널리 공지된 적절한 조건 하에 배양된다. 바람직하게, 감염된 생산자 세포의 배양도 생산자 세포의 배양에 사용되는 배지/배지들과 동일하거나, 상이할 수 있는 배지에서 및/또는 감염 단계를 위해 +32℃ 내지 +37℃의 온도에서 1일 내지 5일 동안 수행된다.
단계 (d)에서는, 단계 (c)에서 생산된 폭스바이러스는 배양 상청액 및/또는 생산자 세포로부터 수집된다. 생산자 세포로부터의 회수는 생산자 세포막을 파괴하여 바이러스를 유출시키는 단계를 요구할 수 있다. 생산자 세포막의 파괴는 이에 한정되지 않지만 냉동/해동, 저장성 분해, 초음파 파쇄, 미세유체화, 고전단 (또한 소위 고속) 균질화 또는 고압 균질화를 포함하는 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 유도될 수 있다.
다음으로 회수된 폭스바이러스는 용량으로 배분되기 이전에 적어도 부분적으로 정제되어, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 매우 많은 정제 단계 및 방법이 예로 정화, 효소적 처리 (예로, 엔도뉴클레아제, 프로테아제 등), 크로마토그래피 및 여과 단계를 포함하여 당해 기술분야에 사용가능하다. 적절한 방법은 당해 기술분야에 기술되어 있다 (예로, 국제특허출원 WO 2007/147528; WO 2008/138533, WO 2009/100521, WO 2010/130753, WO 2013/022764 참조).
일 구현예에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스로 감염된 세포를 제공한다.
조성물
본 발명은 또한 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 (활성 제제) 및 약제학적으로 허용가능한 비히클의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다.
"치료적 유효량"은 하나 이상의 유익한 결과를 생산하기에 충분한 변형된 폭스바이러스의 양에 상응한다. 이러한 치료적 유효량은 다양한 매개변수, 구체적으로 투여 방식, 질환 상태, 대상체의 연령 및 체중, 치료에 반응하는 대상체의 능력, 동시적인 치료의 종류, 치료 빈도 및/또는 예방 또는 요법의 필요성의 함수로서 달라질 수 있다. 예방적 용도와 관련될 때, 본 발명의 조성물은 특히 위험이 있는 대상체에서 증식성 질환 (예컨대 암)을 예방하거나, 이의 발병 및/또는 확립 및/또는 재발을 지연시키기에 충분한 용량으로 투여된다. "치료적" 용도를 위해, 상기 조성물은 질환을 치료할 목적으로, 증식성 질환 (예컨대 암)에 걸린 것으로서 진단된 대상체에게 궁극적으로는 하나 이상의 통상적인 치료 양식과 조합하여 투여된다. 구체적으로, 치료적 유효량은 기저선 상태와 비교하여 또는 치료되지 않는 경우에 예상된 상태와 비교하여 임상적 상태의 관찰가능한 개선, 예로 종양 수의 감소, 종양 크기의 감소, 전이의 수 또는 정도의 감소, 퇴행 길이의 증가, 상태의 안정화 (즉, 악화 없음), 질환 진행 또는 중증도의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 생존 연장, 표준 치료에 대한 더 나은 반응, 삶의 질의 향상, 사망율의 감소를 유도하는데 필요한 해당 양일 수 있다. 예를 들면, 연구실에서 일상적으로 사용되는 기법 (예로, 유세포 측정법, 조직학, 의학적 촬영)은 종양 감시를 수행하는데 사용될 수 있다.
또한, 치료적 유효량은 효과적인 비-특이적 (선천성) 및/또는 특이적 (적응성) 면역 반응의 발생을 유도하는데 필요한 양일 수 있다. 전형적으로, 면역 반응, 구체적으로 T 세포 반응의 발생은 적합한 동물 모델에서 또는 대상체로부터 수집한 생물학적 시료를 사용하여 시험관내에서 평가될 수 있다 (ELISA, 유세포 측정법, 조직학 등). 또한, 다양한 입수가능한 항체를 사용하여 치료받은 대상체에 존재하는 항-종양 반응에 관여하는 상이한 면역 세포 집단, 예컨대 세포독성 T 세포, 활성화된 세포독성 T 세포, 자연 킬러 세포 및 활성화된 자연 킬러 세포를 식별할 수 있다. 임상적 상태의 개선은 의사 또는 기타 의료진에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 관련이 있는 임상적 측정에 의해 용이하게 평가될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 비히클"은 포유동물, 구체적으로 인간 대상체의 투여에 적격한 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 아쥬반트, 분산 배지, 코팅, 항박테리아 및 항곰팡이 제제, 흡수제 등을 포함하려고 의도된다. 약제학적으로 허용가능한 비히클의 비-제한적인 예는 물, NaCl, 정상 식염수 용액, 락테이트화 링거, 당류 용액 (예로, 포도당, 트레할로스, 사카로스, 덱스트로스 등), 알코올, 오일, 젤라틴, 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로스 등을 포함하고, 뿐만 아니라 기타 수용성 생리학적으로 균형화된 염 용액도 사용될 수 있다 (예를 들면, 레밍턴의 최신 개정판: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins).
일 구현예에서, 상기 조성물은 변형된 폭스바이러스의 안정성을 냉동 (예로, -70℃ 내지 -10℃), 냉장 (예로, 4℃) 또는 상온 (예로, 20℃ 내지 25℃) 온도에서 제조 및 장기간 보관 조건 하에 (즉, 적어도 6개월, 바람직하게 적어도 2년 동안) 보장하도록 적절하게 제형화된다. 이러한 제형물은 일반적으로 수용성 용액과 같은 액체 담체를 포함한다.
유리하게, 조성물은 인간 용도를 위해 적합하게, 바람직하게 생리학적 또는 약간 염기성 pH (예로, 대략 pH 7 내지 대략 pH 9, 구체적으로 pH 7 내지 8을 선호하고, 더욱 바람직하게 pH 7.5에 근접함)에서 완충화된다. 적합한 완충액은 트리스 (트리스(히드록시메틸)메틸아민), 트리스-HCl (트리스(히드록시메틸)메틸아민-HCl), HEPES (4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), 포스페이트 완충액 (예로, PBS), ACES (N-(2-아세토아미도)-아미노에탄설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MOPSO (3-(N-몰포리노)-2-히드록시프로판설폰산), MOPS (3-(N-몰포리노)프로판설폰산), TES (2-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), DIPSO (3-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판-1-설폰산), MOBS (4-(N-몰포리노)부탄폰산), TAPSO (3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산), HEPPSO (4-(2-히드록시에틸)-피페라진-1-(2-히드록시)-프로판설폰산), POPSO (2-히드록시-3-[4-(2-히드록시-3-설포프로필)피페라진-1-일]프로판-1-설폰산), TEA (트리에탄올아민), EPPS (N-(2-히드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산), 및 트리신 (N-[트리스(히드록시메틸)-메틸]-글리신)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 완충액은 트리스-HCl, 트리스, 트리신, HEPES 및 Na2HPO4 및 KH2PO4의 혼합물 또는 Na2HPO4 및 NaH2PO4의 혼합물을 포함하는 포스페이트 완충액으로부터 선택된다. 상기 완충액 (구체적으로 상기에 언급된 완충액, 명확하게 트리스-HCl)은 바람직하게 10 mM 내지 50 mM의 농도로 존재한다.
또한, 제형물에 단가의 염을 포함하여 적절한 삼투압을 보장하는 것이 유리할 수 있다. 상기 단가의 염은 명확하게 NaCl 및 KCl로부터 선택될 수 있고, 바람직하게 상기 단가의 염은 NaCl이고, 바람직하게 10 mM 내지 500 mM의 농도이다.
또한, 상기 조성물은 낮은 보관 온도에서 변형된 폭스바이러스를 보호하는 동결보호제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 적합한 동결보호제는 바람직하게 0.5% 내지 20% (g 중량/L 부피, w/v로서 지칭됨)의 농도로 슈크로스 (또는 사카로스), 트레할로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소비톨 및 글리세롤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 슈크로스는 바람직하게 5% 내지 15% (w/v)의 농도로 존재한다.
변형된 폭스바이러스 조성물, 특히 이의 액체 조성물은 안정성을 개선하는 약제학적으로 허용가능한 킬레이팅제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 킬레이팅제는 명확하게 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 1,2-비스(o-아미노펜옥시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 에틸렌글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 디머캅토숙신산 (DMSA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA) 및 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산 (DMPS)으로부터 선택될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 킬레이팅제는 바람직하게 적어도 50 μM의 농도로 존재하고, 구체적으로 50 mM 내지 1000 μM의 농도를 선호한다. 바람직하게, 약제학적으로 허용가능한 킬레이팅제는 150 μM에 근접한 농도로 존재하는 EDTA이다.
추가적인 화합물이 변형된 폭스바이러스 조성물의 안정성을 증가시키도록 추가로 존재할 수 있다. 이러한 추가적인 화합물은 C2-C3 알코올 (바람직하게, 0.05% 내지 5% (부피/부피 또는 v/v)의 농도로), 소듐 글루타메이트 (바람직하게, 10 mM 이하의 농도로), 트윈 80 (폴리솔베이트 80으로도 알려짐)과 같은 비-이온성 표면활성제 (미국 특허 US 7,456,009, 미국 특허출원 US 2007-0161085)(0.1% 미만의 낮은 농도로)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. MgCl2 또는 CaCl2와 같은 이가의 염은 액체 상태에서 다양한 생물학적 산물의 안정화를 유도하는 것으로 밝혀져 왔다 (예로, Evans et al. 2004, J. Pharm. Sci. 93: 2458-75; 및 미국 특허 US 7,456,009 참조). 아미노산, 구체적으로 히스티딘, 아르기닌 및/또는 메티오닌은 액체 상태에서 다양한 바이러스의 안정화를 유도하는 것으로 밝혀져 왔다 (국제특허출원 WO 2016/087457 참조).
고분자량 중합체, 예컨대 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)의 존재는 구체적으로 진공 건조화 및 냉동 건조화가 관여하는 공정에 의해 획득되는 냉동 건조된 조성물에 적합하고, 이들 중합제의 존재는 냉동 건조화 동안 케이크의 형성을 돕는다 (예로, 국제특허출원 WO 03/053463; WO 2006/085082; WO 2007/056847; WO 2008/114021 및 WO 2014/053571 참조).
본 발명에 따르면, 상기 조성물의 제형물은 또한 적절한 배분 또는 생체내에서 방출 지연를 보장하도록 투여 방식에 적응될 수 있다. 생체분해성 및 생체적격성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다 (예로, J. R. Robinson in "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", 개정판, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; 국제특허출원 WO 01/23001; WO2006/93924; WO2009/53937 참조).
예시적인 목적으로, 사카로스 5% (w/v), 소듐 글루타메이트 10 mM 및 NaCl 50 mM을 포함하는 트리스 완충된 제형물 (트리스-HCl pH 8)은 -20℃ 내지 5℃에서 본원에 기술된 조성물의 보존에 적응되어 있다.
용량
바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 개별 용량으로 제형화되고, 각 용량은 사용된 정량화 기법에 의존하여 약 103개 내지 1012개 vp (바이러스 입자), iu (감염 단위) 또는 pfu (플라크 형성 단위)의 변형된 폭스바이러스를 포함한다. 시료에 존재하는 바이러스의 정량은 일상적인 적정 기법에 의해, 예로 허용되는 세포 (예로, HeLa 세포)의 감염에 이어서 플라크 수를 계수하여 플라크 형성 단위 (pfu) 역가를 획득함으로써, A260 흡광도 (vp 역가)를 측정함으로써, 또는 예로 항-바이러스 항체를 사용한 정량적 면역형광법 (iu 역가)에 의해 결정될 수 있다. 대상체 또는 일군의 대상체를 위한 적절한 용량을 적응하는데 필요한 계산의 조정은 적절한 상황에 비추어 의사라면 일상적으로 시행할 수 있다. 일반적인 설명으로서, 폭스바이러스 조성물에 적합한 개별 용량은 대략 103개 내지 대략 1012개 pfu, 유리하게 대략 104개 내지 대략 1011개 pfu, 바람직하게 대략 105개 내지 대략 1010개 pfu, 더욱 바람직하게 대략 106개 내지 대략 109개 pfu를 포함하고, 명확하게 대략 106개, 5 × 106개, 107개, 5 × 107개, 108개 또는 5 × 108개 pfu의 개별 용량이 구체적으로 바람직하다.
투여
임의의 통상적인 투여 경로는 경구, 국소 또는 점막 경로를 포함하여 본 발명의 맥락에서 적용가능하다. 비경구 경로는 주사 또는 주입으로서 투여를 의도하고, 전신뿐만 아니라 국소 경로를 포괄한다. 폭스바이러스 조성물을 투여하는데 사용될 수 있는 비경구 주사 유형은 정맥내 (정맥 내로), 혈관내 (혈관 내로), 동맥내 (간 동맥과 같은 동맥 내로), 피내 (진피 내로), 피하 (피부 아래), 근육내 (근육 내로), 복강내 (복강 내로) 및 종양내 (종양 내로 또는 이와 근접하여) 및 난절법을 포함한다. 투여는 단일 볼루스 투약의 형태일 수 있거나, 예를 들면 연속적 관류 펌프에 의할 수 있다. 점막 투여는 경구/영양관, 비강내, 기관내, 호흡기내, 질내 또는 직장내 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 국소 투여는 경피 수단 (예로, 패치 등)을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게, 변형된 폭스바이러스 조성물은 종양에서 또는 이와 근접하여 정맥내 또는 종양내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
투여는 당해 기술분야에서 입수가능한, 대상체에서 변형된 폭스바이러스의 전달을 용이하게 하거나 개선할 수 있는 (예로, 근육내 투여를 용이하게 하는 전기천공) 통상적인 주사기 및 바늘 (예로, 쿼드라퓨즈 주사 바늘) 또는 임의의 화합물 또는 장치를 사용할 수 있다. 대안은 바늘이 없는 주사 장치 (예로, 바이오인젝터 TM 장치)의 사용이다. 경피 패치도 고려될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 단일한 투여 또는 일련의 투여에 적합하다. 또한, 휴식 시간 이후에 반복되는 순차적인 투여 주기를 통해 진행하는 것이 가능하다. 각 투여 사이의 간격은 3일 내지 약 6개월 (예로, 24시간, 48시간, 72시간, 매주, 2주마다, 매월 또는 분기마다 등)일 수 있다. 또한 간격은 불규칙할 수 있다. 용량은 각 투여에 대해 상기 기술된 범위 내에서 달라질 수 있다. 바람직한 치료 일정은 폭스바이러스 조성물의 2회 내지 10회 매주 투여, 가능하게 이어지는 더 긴 간격 (예로, 3주)으로 2회 내지 15회 투여를 포함한다.
m2 결함성 폭스바이러스 및 본 발명의 조성물을 사용하는 방법
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 본원에 기술된 양식에 따라 증식성 질환을 치료하거나, 예방하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 조성물을 이를 필요로 하는 대상체 (바람직하게 암에 걸린 대상체)에게 이러한 질환 치료하거나 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법, 뿐만 아니라 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 기술된 방법 및 용도는 증식성 질환의 발생 또는 진행을 지연시키거나, 치유하거나, 개선하거나, 통제하는 것을 목표로 한다.
본원에 사용된 바, 용어 "증식성 질환"은 통제되지 않는 세포 성장 및 확산으로부터 유발되는, 암을 포함한 다양한 질환, 뿐만 아니라 파골세포 활성의 증가와 관련된 질환 (예로, 류마티스 관절염, 골다공증 등) 및 심혈관 질환 (예로, 혈관벽의 평활근 세포의 증식으로부터 유발되는 재협착)의 광범위한 군을 포함한다. 조절되지 않는 세포 분열 및 성장은 이웃하는 조직을 침입하는 악성 종양의 형성을 유발할 수 있고, 신체의 먼 부분으로 림프계 또는 혈류를 통해 전이도 될 수 있다. 용어 "암"은 "종양", "악성 종양", "신생물" 등 중 임의의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 임의의 유형의 조직, 장기 또는 세포, 임의의 전이 단계 (예로, 전-병변기 부터 제 Ⅳ기)를 포함하고, 고형 종양 및 혈액 종양, 뿐만 아니라 원발성 및 전이성 암을 포괄하도록 의미한다.
본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 대표적인 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병, 보다 구체적으로 골암, 위창자암, 간암, 췌장암, 위암, 결장직장암, 식도암, 구인두암, 후두암, 침샘 암종, 갑상샘암, 폐암, 두경부암, 피부암, 편평세포암, 흑색종, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막 암종, 질암, 난소암, 유방암, 전립샘암, 내분비계의 암, 연조직의 육종, 방광암, 신장암, 교모세포종 및 중추 신경계 (CNS)의 다양한 유형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 및 용도는 신장암 (예로, 투명세포 암종), 전립샘암 (예로, 호르몬 난치성 전립선 샘암종), 유방암 (예로, 전이성 유방암), 직장결장암, 폐암 (예로, 비-소세포 폐암), 간암 (예로, 간 암종), 위암, 담관 암종, 자궁내막암, 췌장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 것이다.
전형적으로, 본원에 기술된 조성물의 투여는 기저선 상태와 비교하여 또는 치료되지 않는 경우에 예상된 상태와 비교하여 임상적 상태의 관찰가능한 개선에 의해 입증될 수 있는 치료받은 대상체의 치료적 유익을 제공한다. 임상적 상태의 개선은 의사 또는 기타 의료진에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 관련이 있는 임상적 측정에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 치료적 유익은 일시적 (투여의 중단 이후 1개월 또는 2개월 동안) 또는 지속적 (수개월 또는 수년 동안)일 수 있다. 대상체 간에 상당히 달라질 수 있는 임상적 상태의 자연적 경과로서, 치료적 유익이 치료받은 각 대상체에서 유의한 수의 대상체로만 관찰되는 것을 요구하지는 않는다 (예로, 2개 실험군 사이의 통계적으로 유의한 차이가 당해 기술분야에 공지된, 터키 매개변수 테스트, 크루스칼-월리스 테스트, 만 및 휘트니에 따른 U 테스트, 스튜던트 t-테스트, 윌콕슨 테스트 등과 같은 임의의 통계적 테스트에 의해 결정될 수 있음).
예를 들면, 암에 걸린 대상체에서 치료적 유익은 예로 종양 수의 감소, 종양 크기의 감소, 전이의 수 또는 정도의 감소, 퇴행 길이의 증가, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화 없음), 질환 진행 또는 중증도의 속도 감소, 생존 연장, 표준 치료에 대한 더 나은 반응, 질환의 대리 마커의 개선, 삶의 질의 향상, 사망율의 감소및/또는 질환 재발의 예방 등에 의해 입증될 수 있다.
적절한 측정 예컨대 혈액 테스트, 생물학적 체액의 분석 및 생검, 뿐만 아니라 의학적 촬영 기법은 임상적 유익을 평가하는데 사용될 수 있다. 이들은 치료 이전에 (기저선) 및 치료 동안 및 치료의 중단 이후 다양한 시점에 수행될 수 있다. 이러한 측정은 일상적으로 의학 연구실 및 병원에서 평가되고, 많은 키트가 시판되어 입수가능하다 (예로, 면역검정법, 정량적 PCR 검정법).
바람직한 구현예는 암, 바람직하게 신장암, 결장직장암, 폐암 (예로, 비-소세포 폐암), 흑색종 및 난소암에 걸린 대상체를 치료하는데 사용되는, 변형된 폭스바이러스, 바람직하게 종양분해성 변형된 폭스바이러스, 바람직하게 종양분해성 백시니아 바이러스 (예로, 코펜하겐 균주)에 관한 것이고, 구체적으로 본원에 기술된 바와 같이 항-CTLA-4 항체를 인코딩하는 종양분해성 백시니아 바이러스를 선호한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 항-종양 적응성 면역 반응을 증진하기 위해 또는 항-종양 반응을 증진하거나 연장하기 위해 사용된다.
또 다른 양태에서, 변형된 폭스바이러스 또는 이의 조성물은 치료받은 대상체에서 면역 반응을 자극하거나 개선하기 위해 사용되거나, 투여된다. 따라서, 본 발명은 또한 면역 반응을 자극하거나 개선하는 방법으로서, 상기 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 양식에 따라 대상체의 면역을 자극하거나 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포괄한다. 상기 자극된 또는 개선된 면역 반응은 특이적 (즉, 에피토프/항원에게로 유도됨) 및/또는 비-특이적 (선천성), 체액성 및/또는 세포성, 명확하게 CD4+ 또는 CD8+ 매개된 T 세포 반응일 수 있다. 본원에 기술된 조성물의 면역 반응을 자극하거나 개선하는 능력은 당해 기술분야에서 표준이 되는 다양한 직접 또는 간접 검정법을 사용하여 시험관내 (예로, 대상체로부터 수집된 생물학적 시료를 사용함) 또는 생체내에서 평가될 수 있다 (예를 들면, Coligan et al., 1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; Wiley & Sons Inc, National Institute of Health 또는 후속 개정판 참조). 폴리펩티드의 항원 특성과 연결하여 상기에 인용된 것도 적절하다.
구체적으로, 통상적인 (m2 양성) 폭스바이러스와 비교하여, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물도 임의의 다음의 목적 또는 임의의 이들의 조합에 유용하다:
* 림프구 매개된 (특히 항원성 폴리펩티드에 대비한) 면역 반응을 자극하거나 개선하고/거나;
* APC 활성을 자극하거나 개선하고/거나;
* 항-종양 반응을 자극하거나 개선하고/거나;
* CD28 신호전달 경로를 자극하거나 개선하고/거나;
* 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 제공되는 치료 효능을 치료받은 대상체 또는 치료받은 대상체 군에서 개선하고/거나;
* 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스에 의해 제공되는 독성을 치료받은 대상체 또는 치료받은 대상체 군에서 감소시킴.
조합 요법
일 구현예에서, 본 발명의 변형된 폭스바이러스, 조성물 또는 방법은 단독 요법으로서 사용된다. 또 다른 구현예에서, 이들은 하나 이상의 추가적인 요법, 구체적으로 치료받은 대상체를 침범하는 암 유형에 적절한 표준 간호 요법(들)과 조합하여 사용되거나, 수행될 수 있다 상이한 암 유형에 대한 표준 간호 요법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 보통 암 네트워크 및 임상 관행 가이드라인에 개시된다. 이러한 하나 이상의 추가적인 요법(들)은 수술, 방사선 요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소요법, 면역요법, 사이토카인 요법, 표적화된 암 요법, 유전자 요법, 광역학 요법 및 이식 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 추가적인 항암 요법/요법들은 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물 이전에, 이후에, 이와 동시에 또는 이의 산재된 방식으로 표준 관행에 따라 대상체에게 투여된다. 2가지 이상의 요법의 동시적 투여는 상기 조성물 및 추가적인 항암 요법이 이들의 치료 효과를 발휘하는 기간이 겹치는 한, 제제가 동시에 또는 동일한 경로에 의해 투여되어야 함을 요구하지 않는다. 동시적 투여는 변형된 폭스바이러스 조성물을 다른 치료제와 동일한 날 (예로, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12시간) 내에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 의해 임의의 순서가 고려되지만, 변형된 폭스바이러스 조성물는 나머지 치료제 이전에 대상체에게 투여되는 것이 바람직하다.
상세한 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 수술과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 종양의 일부 또는 전부의 수술적 절제 이후에 (예로, 예를 들면 절제된 영역 내의 국소 적용에 의해) 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 당업자라면 적절한 방사선 요법 프로토콜 및 매개변수를 당업자에게 쉽게 자명해질 적절한 응용 및 변형을 사용하여 용이하게 공식화할 수 있다 (예를 들면, Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 제 2판. JB Lippincott Co. 참조). 명확하게 암에 사용될 수 있는 방사선 유형은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 전자빔, 선형 가속기로부터 또는 코발트 또는 세슘과 같은 방사선 광원으로부터 나온 고에너지 광자, 양성자 및 중성자를 포함한다. 방사성 동위원소의 용량 범위는 광범위하게 변화하고, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다. 연장된 기간 (3주 내지 6주) 동안 규칙적인 X-선 용량 또는 단일 고용량이 본 발명에 의해 고려된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다. 암의 치료에 현재 사용가능한 적합한 화학요법 제제의 대표적인 예는 알킬화 제제, 토포이소머라제 I 저해제, 토포이소머라제 Ⅱ 저해제, 백금 유도체, 타이로신 키나제 수용체의 저해제, 사이클로포스파미드 항-대사물, DNA 손상 제제, 항-유사분열제 및 항-바이러스제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가의 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 항-신생물 항체와 같은 면역치료제, 뿐만 아니라 siRNA 및 안티센스 폴리뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 아쥬반트와 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 아쥬반트의 대표적인 예는 TLR3 리간드 (Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88(10): 5242-55), TLR9 리간드 (예로, Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2: 1163-74; Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8(1): 60-6; 유럽 특허 EP 1　162　982; 미국 특허 US 7,700,569 및 US 7,108,844) 그리고 실데나필과 같은 PDE5 저해제 (미국 특허 US 5,250,534, US 6,469,012 및 유럽 특허 EP 463　756)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가적인 구현예에서, 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스 또는 조성물은 감작 조성물(들) 및 추가감작 조성물(들)의 순차적 투여를 포함하는 프라임 부스트 접근법에 따라 사용될 수 있다. 전형적으로, 감작 및 추가감작 조성물은 본원에 기술된 변형된 폭스바이러스인 적어도 하나를 공통으로 하여 적어도 하나의 항원성 도메인을 인코딩하는 상이한 벡터를 사용한다. 더우기, 감작 및 추가감작 조성물은 동일한 부위에 또는 대안의 부위에 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 상세한 설명 및 도면으로부터 및 청구항으로부터 자명해질 것이다. 다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하도록 도입된다. 그러나, 본 발명에 비추어, 당업자라면 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 구체적인 구현예가 변경될 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
재료 및 방법
단백질 및 바이러스
His 태그가 C-말단에 있거나 없는 재조합 Fc 융합 단백질 (인간 및 마우스)을 R & D 시스템사에 주문하였다. 인간 CD80-Fc 및 CD86-Fc를 연구실에서 바이오틴아미도헥사노일-6-아미노헥산산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (시그마사)를 사용하여 바이오틴화하였다.
다양한 백시니아 바이러스를 사용하였다:
* 야생형 백시니아 (코펜하겐, 웨스 및 웨스턴 리저브 균주);
* 티미딘 키나제 및 리보뉴클레오티드 환원효소 활성 둘 다에 대한 결함을 갖는 이중 결실된 백시니아 바이러스 (코펜하겐 균주) (tk-; rr-; 국제특허출원 WO 2009/065546에 기술됨);
* tk, rr- 및 m2 활성에 대한 결함을 갖는 삼중 결실된 백시니아 바이러스 (코펜하겐 균주). 삼중 결실된 바이러스를 이중 결실된 tk- rr-로부터 본원에 하기 기술된 바와 같이 M2L 유전자좌의 개방 판독틀 내의 특이적 상동성 재조합에 의해 생성하였다.
백시니아 바이러스 이외에도, 테스트된 모든 폭스바이러스가 달리 특정되지 않는 한, 야생형 균주이었다.
rr-, tk- 백시니아 바이러스에서 M2L의 결실
생체내 연구를 위해, 이중 (tk- rr-) 및 삼중 (tk- rr- m2-) 결실된 백시니아 바이러스를 J2R 유전자좌에서 p11K7.5 프로모터 하에 개똥벌레 루시퍼라제를 인코딩하도록 조작하였다.
VV 게놈 내로 도입된 M2L 유전자 결실은 m2 ORF 상류의 64개의 뉴클레오티드및 m2 ORF의 처음 169개의 코돈을 포함한다. 결실을 PUC18 기원점으로부터 나온 운반 플라스미드를 사용한 상동성 재조합에 의해 수행하였다. 이러한 운반 플라스미드는 백시니아 pH5R 프로모터의 조절 하에 선별 마커의 융합인 증진된 녹색 형광성 단백질/크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 (EGFP/GPT)를 인코딩하는 발현 카세트에 의해 분리된 왼쪽 (VV 게놈 기탁번호 M35027의 nt 26980번 내지 27479번) 및 오른쪽 (nt 28051번 내지 28550번) 팔을 포함하였다. 생성된 플라스미드를 루시퍼라제를 인코딩하는 백시니아 바이러스 (rr-; tk-/루시퍼라제)로 감염된 닭 배아 섬유모세포 (CEF) 내에 아막사 뉴클레오팩터를 사용한 전기천공법에 의해 형질감염시켰다. 재조합 바이러스를 EGFP/GPT 선별에 의해 단리하였다. M2L의 결실 및 EGFP/GPT 카세트의 삽입을 PCR 분석에 의해 검증하였다. EGFP/GPT 선별 카세트를 CEF 상에 재조합 바이러스를 선별 없이 통과시킴으로써 제거하였다. 일차 연구 스톡을 CEF 상에서 생산하였다. M2L 유전자의 결실을 PCR 및 시퀀싱에 의해 입증하였다.
바이러스를 CEF 상에서 MOI 0.05로의 감염 및 3일 배양 이후에 생산하였다. 감염 3일 이후, 감염된 세포 및 배양 상청액을 포함하는 조 수확물을 회수하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 정제 이전에, 이 현탁액을 바이러스성 입자를 방출시키기 위하여 균질화하였다. 다음으로 큰 세포성 잔재물을 깊이 여과에 의해 제거하였다. 정화된 바이러스성 현탁액을 후속으로 농축하고, 접선 유동 여과 및 크기 공섬유 미세여과를 사용하여 제형물 완충액으로 투과여과하였다. 마지막으로, 정제된 바이러스를 동일한 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 추가로 농축하고, 분량으로 나누어 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
B7 결합에 대한 ELISA 검정법
96-웰 플레이트 (면역 플레이트 Nunc Medisorp)를 코팅 완충액 (50 mM Na 카보네이트 pH 9.6) 중 100 μL의 0.5 μg/mL B7, CTLA4 또는 CD28 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 마이크로플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 200 μL의 차단 용액 (PBS; 0.05% 트윈 20; 5% 무지방 분유 (바이오래드사))으로 포화시켰다. 모든 항체 조제물 및 희석물을 차단 용액으로 만들었다. 100 μL의 시료를 각 웰이 3벌씩 그리고 일부 실험 (결합 곡선)의 경우 2배 일련 희석으로 첨가하였다. 다음으로 마이크로플레이트를 10,000배 희석된 100 μL의 항-플래그-HRP (시그마사)와 함께 배양하였다. 다음으로 마이크로플레이트를 100 μL/웰의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB, 시그마사)와 배양하고, 반응을 100 μL 2M H2SO4로 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 플레이트 판독기 (TECAN 인피니트 M200PRO)로 측정하여Te 흡광도 값을 분석 및 그래프 작성을 위해 소프트웨어 그래프패드프리즘으로 전환하였다.
경쟁 ELISA
실험적 조건 및 용액은 달리 특정되지 않으면, 상기 기술된 것과 동일하다. CTLA4/CD80, CD28/CD80 및 PDL1/CD80 경쟁 검정법을 위해, 100 μL의 CTLA4, CD28 및 PDL1을 0.25 (CTLA4) 또는 1 μg/mL (CD28 및 PD-L1)으로 코팅하였다. 시료를 첨가하고, 일정한 농도의 CD80 (CTLA4, CD28 및 PD-L150 각각의 경우 250 또는 500 ng/mL)를 포함하는 차단 용액으로 희석하였다 (2배 일련 희석). CD86/CTLA4 및 CD28/CD86 경쟁 검정법을 위해, 100 μL의 CD86 또는 CD28를 0.25 (CD86) 또는 2 μg/mL (CD28)로 코팅하였다, 시료를 첨가하고, 일정한 농도의 CTLA4 (100 ng/mL) 또는 CD86 (500 ng/mL)를 각각 포함하는 차단 용액으로 희석하였다 (2배 일련 희석). 1/2000에서 항-His 태그-HRP (퀴아젠사) 또는 1/1000에서 스트렙트아비딘 HRP (서던 바이오테크사) 둘 중 하나를 컨쥬게이션 시약으로서 사용하였다. 플레이트를 추가로 처리하고, 상기에 기술된 바와 같이 결과를 분석하였다.
웨스턴 블럿
25 μL의 시료를 5% β-머캅토에탄올 (BME)을 포함하거나 (환원 조건), 포함하지 않는 (비-환원 조건) 램리 완충액으로 제조하였다. 크리테리온 TGX 4 내지 15% 무-염색 젤 (바이오래드사) 상의 원심분리 이후에, 단백질을 PVDF 막 (트랜스블럿 터보 시스템)으로 트랜스퍼하였다. IBind 플렉스 웨스턴 시스템 (인비트로겐사)를 단백질/항체 배양 및 세척에 사용하였다. 블럿을 2.5 μg/mL CD80-Fc, CD86-Fc, CTLA4-Fc 또는 항-플래그-HRP로 1/1000에서 탐색하였다. CD80-Fc, CD86-Fc 및 CTLA4-Fc의 경우, 1/3000에서 HRP 항-인간 Fc (베틸사)를 컨쥬게이션 항체로서 사용하였다. 1× iBind 플렉스 용액을 차단하고, 항체를 희석하고, 세척하고, iBind 플렉스 카드를 적시는데 사용하였다, 면역 복합체를 에머샴 ECL 프라임 웨스턴 블럿팅 시약을 사용하여 검출하였다. 화학발광을 분자 영상화기 ChemiDOC XRS (바이오래드사)로 기록하였다.
친화 크로마토그래피
MVA 또는 백시니아 바이러스 코펜하겐으로 감염된 (MOI 0.05) CEF의 상청액을 감염 72시간 이후에 수집하였다, 상청액을 원심분리하고, 0.2 μm 필터 상에서 여과하여 대부분의 세포성 잔재물 및 백시니아 바이러스를 제거하였다. 다음으로 0.05% 트윈 20이 보충된 처리된 상청액을 비바스핀 20 30000 MWCO 컷오프 농축기 (사토리우스사)를 사용하여 ~20배 농축하였다. 스트렙트아비딘 자성 비드 (GE ㅎ헬스케어사)를 관련없는 단일클론 바이오틴화된 항체 (chCXⅡG6), CTLA4-Fc-Biot 또는 CD86-Fc-Biot 중 어느 하나로 코팅하였다. 4 mL의 농축된 상청액 (MVA 및 백시니아 바이러스 코펜하겐)을 24 μL의 chCXⅡG6-스트렙트아비딘 비드와 함께 배양하여 비-특이적 결합을 제거하였다. 이러한 제 1 배양물의 결과물을 2개의 동등한 부분으로 분리하고, CTLA4-Fc-Biot-스트렙트아비딘 비드 또는 CD86-Fc-Biot-스트렙트아비딘 비드 둘 중 하나와 배양하여 다음의 4가지 팔: MVA 상청액 + CTLA4 비드 (MVA A4); MVA 상청액 + CD86 비드 (MVA CD); 백시니아 바이러스 + CTLA4 비드 상청액 (VV A4) 및 백시니아 바이러스 + CD86 비드 (VV CD86)를 수득하였다. 비드를 PBS, 0.05% 트윈 20, 이어서 PBS로 철저하게 세척하고, 결합된 단백질을 50 μL 0.1 M 아세트산에 의해 2회 용리하고, 4 μL 2 M 트리스 염기의 첨가에 의해 바로 중화하였다. 다음으로 2개의 용리물을 MS 분석 이전에 풀로 만들었다.
소화를 위한 단백질 제조
10 μL 또는 20 μL의 시료를 증발시키고, 25 mM NH4HCO3 중 10 mM DTT의 10 μL에서 가용화 (57℃에서 1시간)에 의해 환원시켰다. 환원된 시스테인 잔기를 25 mM NH4HCO3 중 55 mM 이오도아세트아미드 10 μL로 암소에서 실온으로 30분 동안 알킬화하였다. 25 mM NH4HCO3에 신선하게 희석된 트립신 (12.5 ng/μL; 프로메가 V5111)을 시료에 1 : 100 (효소/단백질) 비율로 30 μL의 최종 부피로 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 트립신의 활성을 5 μl의 H2O/TFA 5%로 산성화에 의해 억제시켰다.
MS/MS 분석
시료를 쿼드로폴-오비트랩 하이브리드 질량 분광분석기 (Q-이그잭티브 플러스, 써모 사이언티픽사, 산호세, CA)와 결합된 나노UPLC-시스템 (나노액퀴티, 워터스사) 상에서 분석하였다. UPLC 시스템은 시미트리 C18 프리컬럼 (20 × 0.18 mm, 5 μm 입자 크기, 워터스사, 밀포드, USA) 및 액퀴티 UPLC® BEH130 C18 분리 컬럼 (75 μm × 200 mm, 1.7 μm 입자 크기, 워터스사)를 장착하였다. 용매 시스템이 물 중 0.1% 포름산 (용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용매 B)로 구성되엇다. 2 μL의 각 시료를 주입하였다. 펩티드를 5 μL/분으로 99% A 및 1% B를 사용하여 3분 동안 포집하였다. 용리를 60℃에서 400 nL/분의 유속으로 1% 내지 35% B의 선형 구배 79분을 사용하여 수행하였다. 오류를 최소화하기 위하여, 컬럼 세척 (20분 동안 50% ACN)을 용매 공시료 주사에 추가하여 포함시키고, 각 시료 이후에 이를 수행하였다.
Q-이그잭티브 플러스를 양이온 모드에서 250℃로 설정된 광원 온도 및 1.8 kV로의 분사 전압으로 작동하였다. 전체 스캔 MS 스펙트럼 (300 내지 1800 m/z)을 m/z 200에서 140,000의 해상도, 50 ms의 최대 주입 시간 및 3 × 106개 전하의 AGC 표적값에서 획득하고, 잠금-질량 옵션이 가능하였다 (445.12002 m/z). 전체 스캔 당 최대 10개의 최강 전구체가 2 m/z 윈도우를 사용하여 단리되고, 고에너지 충돌 해리 (HCD, 27eV의 정규화된 충돌 에너지)를 사용하여 단편화되었으며, 사전 단편화된 전구체의 역동적 배제를 60초로 설정하였다. MS/MS 스펙트럼을 m/z 200에서 17,500의 해상도, 100 ms의 최대 주입 시간 및 1 × 105의 AGC 표적값으로 획득하였다. 시스템을 X칼리버 소프트웨어 (v3.0.63; 써모피셔 사이언티픽사)에 의해 완전히 제어하였다.
MS/MS 데이타 해석
MS/MS 데이타를 마스코트 (버전 2.5.1, 매트릭스 사이언스사, 영국)를 사용하여 갈루스 갈루스 (Gallus gallus) 및 백시니아 바이러스 유니프로트 데이타베이스 유래한 조합된 표적-데코이 데이타베이스 (01-04-2018, 33939개의 표적 서열과 동일한 수의 역 데코이 서열을 포함함) 대비하여 검색하였다. 표적 단백질 hCTLA4, hCD86 및 hCXⅡG6, 및 표적-데코이를 수동으로 데이타베이스에 추가하였다. 데이타베이스는 공통의 오염 정보 (인간 케라틴 및 돼지 트립신)를 포함하고, 연구실 내 데이타베이스 생성 도구박스 (http://msda.u-strasbg.fr)를 사용하여 작성하였다. 다음의 매개변수가 적용되었으며, 생략된 트립신에 의한 절단 및 가변성 변형 (메티오닌의 산화 (+16 Da), 시스테인의 카바아미노메틸화 (+57 Da))가 고려되었다. 검색 윈도우를 전구체 이온에 대해 25 ppm 및 단편 이온에 대해 0.07 Da으로 설정하였다. 마스코트 결과 파일 (.dat)을 프롤린 소프트웨어 (http://proline.profiproteomics.fr/)로 수신하고, 단백질을 1과 동등한 순위, 조절된 e-값을 기초로 한 펩티드 스펙트럼 매칭에 대한 1% FDR, 단백질 당 적어도 1개의 특이적 펩티드, 단백질 세트 및 마스코트 변형된 Mudpit 점수 매김에 대한 1% FDR 상에서 입증하였다.
혼합 림프구 반응 (MLR)
림프구를 활성화하는 m2 바이러스의 성능을 MLR 검정법으로 평가하였다. CEF 세포를 COPTG19289, VVTG18058　또는 MVAN33 중 어느 하나로 감염시키고 (MOI 0.05), 배양 상청액을 감염 48시간 후 수확하였으며, 비바스핀 20 30000 MWCO 컷오프 농축기 (사토리우스)를 사용하여 ~20배로 농축하였다. 농축된 상청액을 첨가하여 (200 μL 중 20 μL) 희석하지 않거나 10배 및 100배로 희석하여 각각 2배, 0.2배 및 0.02배의 최종 "상청액 농도"를 수득하였다.
상이한 건강한 공여자로부터 얻은 혈액을 프랑스 혈액 기관 (EFS Grand Est, 67065 Strasbourg)에서 구입하였다. PBMC를 피콜-파크 방법 (피콜-파크 플러스, GE 헬스케어사)에 의해 정제하고, 20% FBS (소태아 혈청) 및 10% DMSO가 보충된RPMI 배지에서 약 1 × 107개 세포/mL로 재현탁하며, 사용 전까지 -150℃에 보관하였다. PBMC를 37℃에서 해동시키고, 10% FBS가 보충된 RMPI 배지에 재현탁하며, 300　g에서 5분 동안 원심분리하였다. 수집된 세포를 RMPI 배지 + 10%　FBS에 재현탁하고, 세포 농도를 3 × 106개 세포/mL로 조절하였다. 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC 100 μL를 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 3벌씩 혼합하였다. 상기에 기술된 20 μL의 감염된 세포 상청액을 각 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트를 5% CO2 대기에서 72시간 동안 37℃에서 배양하였다.
다음으로 MLR의 배양 상청액을 수확하고, 인간 인터루킨 2 (IL-2)를 인간 IL-2*-2ELISA 맥스TM　딜럭스 세트 키트 (바이오레전드사)를 사용한 ELISA에 의해 측정하였다. 측정을 주어진 시료의 3회 반복 IL 농도의 평균을 배지로 배양된 PBMC의 3회 반복 IL-2 농도의 평균으로 나누기하여 정규화하였다.
인간화 NCG-34+ 마우스에서 생체내 실험
마우스 인간화
NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 면역결핍 마우스 균주 (NCG)를 타코닉사로부터 공급받았다. 4주령 동물에게 부설판을 복강내로 처리하고 (화학절제), 다음날 CD34+ 인간 줄기 세포 (마우스 당 50,000개 세포)를 정맥내 (Ⅳ)로 주사하였다. 세포 주입 14주 이후, 이식 수준을 유세포 측정법에 의한 총 혈액 백혈구 중 인간 CD45+ 세포의 분석을 통해 모니터링하였다. 인간화 비율을 순화하는 hCD45/총 CD45 (mCD45 + hCD45)의 비율로서 정의하였다.
T 림프구 면역 표현형
혈액 (100 μL)을 종양 이식 2일 이전에 안구 후방동으로부터 수집하였다. 인간 CD45+, CD3+, CD3+ CD4+ 및 CD3+ CD8+ 림프구 집단을 hCD45 (참조번호 563879; BD), CD4 (참조번호 130-092-373; 밀테니사), CD3 (참조번호 130-109-462; 밀테니사) 및 CD8 (참조번호 130-096-561; 밀테니사)에게로 유도되는 항체, 뿐만 아니라 생/사 노란색 마커 (참조번호 L34968; 써모피셔사)를 사용한 유세포 측정법 (아튠 NxT, 라이프 테크놀로지사)에 의해 평가하였다. 간략하게, 혈액 시료를 다양한 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 다음으로, 적혈구 세포를 고수율 용해 완충액 (HYL250; 써모피셔 사이언티픽사)을 사용하여 실온 (RT)에서 15분 동안 용해시키고, 바로 이어서 유세포 측정법 분석 (아튠 NxT, 라이프 테크놀로지사)을 하였다.
종양분해성 바이러스로의 치료
인간 결장직장 암종 세포 HCT-116를 ATCC (CCL-247TM)로부터 구입하고, 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 맥코이 5A 배지에서 성장시키고, 트립신으로 37℃에서 10분 동안 탈착하였다. 세척 이후에, 세포를 멸균 PBS 중 5 × 107개 세포/mL로 재현탁하고, 100 μL의 세포 현탁액 (5 × 106개 세포)를 마우스의 한쪽 측면에 피하로 주사하였다. 평균 종양 크기가 거의 70 mm3에 도달할 때, 나우스를 인간화 비율 및 종양 크기를 기초로 하여 5가지 실험군 (5마리 마우스/실험군)으로 무작위화하였다:
* 실험군 1은 비히클을 수여받고,
* 실험군 2는 105개 pfu의 VVTG18058을 수여받고,
* 실험군 3은 106개 pfu의 VVTG18058을 수여받고,
* 실험군 4는 105개 pfu의 COPTG19289를 수여받고,
* 실험군 5는 106개 pfu의 COPTG19289를 수여받았다.
각 실험군의 경우, 100 μL의 바이러스 조제물의 단일 정맥내 (Ⅳ) 주사를 D0로서 정의된 무작위화한 날에 수행하였다. 마우스를 매일 예상되지 않은 통증의 징후에 대해 모니터링하였다. 체중 및 종양 부피를 매주 3회 모니터링하였다. 종양 직경을 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 부피 (mm3)를 다음의 공식에 따라 계산하였다: 부피 = 1/2 (길이 × 너비2). 종양 부피가 1500 mm3를 초과하거나, 체중 손실이 25%를 초과할 때 동물을 희생시켰다.
실시예 1: 백시니아 바이러스 m2 단백질의 B7 매개된 보조-자극성 경로를 간섭하는 능력의 확인 및 이의 결합 성질의 특성화
백시니아 바이러스 감염된 세포의 상청액은 CTLA4의 CD80 또는 CD86과의 상호작용을 억제한다
2가지 검정법이 상이한 바이러스 후보에 의해 제공되는 CD80/CTLA4 및 CD86/CTLA4 차단 활성을 정량적으로 모니터링하도록 설정되었다. 이들 검정법에서, 인간 CTLA4 (hCTLA4)를 ELISA 플레이트 상에 고정하고, 가용성 태그화된 hCD80 또는 hCD86를 첨가하였다. 이러한 설정에서, 고정된 또는 가용성 파트너에 결합하는 임의의 경쟁 분자는 신호의 감소를 유도할 것이다 (경쟁 검정법). 항-hCTLA4 항체 이필리무맙 (예르보이) 및 감염되지 않은 DF1 (사용가능한 닭 세포주; 예로, ATCC®로부터의 CRL-12208TM)의 상청액을 양성 및 음성 대조군으로서 각각 사용하였다. 놀랍게도, 예르보이가 코팅된 hCTLA-4와 상호작용하기 때문에, 백시니아 바이러스 (코펜하겐, 웨스 및 웨스턴 리저브 균주)에 의해 감염된 세포의 모든 상청액은 CD80/CTLA4 및 CD86/CTLA4 검정법 둘 다로 용량 반응 방식으로 경쟁하는 것으로 밝혀진 반면, 감염되지 않은 DF1 세포의 상청액은 전혀 효과가 없었다. 흥미롭게도, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)에 의해 감염된 DF1의 상청액은 hCTLA4/hCD80 및 hCTLA4/hCD86 상호작용의 억제를 생성하지 않았으며, 이러한 간섭 능력이 약화 과정 동안 6개의 게놈 단편을 상실한 (결실 I 내지 Ⅵ) 본 바이러스에서 보존되지 않음을 나타낸다 (데이타 미도시). 이들 결과는 VV 상청액의 일부가 CTLA-의 CD80 및 CD86와의 결합에 간섭하는 점을 시사한다.
세포 또는 배지 구성성분에 내포된 임의의 인공물을 배제하기 위하여, 상이한 기원으로부터의 상이한 세포주 (조류 일차 및 인간 종양 세포주)를 테스트하였고, FACS 경쟁 방법도 검정되었다.
경쟁 FACS 분석을 표면에 hCD80 및 hCD86을 자연적으로 전시하는 인간 세포주 (즉, KM-H2, 호지킨 림프종)을 사용하여 수행하였다. KM-H2 세포에 가용성 재조합 CTLA4-Fc의 결합을 형광크롬 컨쥬게이션된 항-Fc 항체를 사용하여 관찰하였다. CTLA4-Fc와 공동-배양될 때, 백시니아 바이러스 감염된 세포의 상청액은 음성 대조군으로서 행동하는 MVA 감염된 세포와 매우 대조적으로 KM-H2 세포에 대한 CTLA4-Fc 결합을 경쟁하였다 (데이타 미도시).
CD80 또는 CD86에 대한 CTLA4 결합을 간섭하는 능력을 평가하도록 경쟁 ELISA를 상이한 폭스바이러스로 감염된 HeLa 세포 (DF1 대신에)의 상청액을 사용하여 수행하였다. 백시니아 바이러스의 다양한 균주 (웨스, WR 및 코펜하겐), 뿐만 아니라 다른 오르토폭스 (예로, 라쿤 폭스, 토끼 폭스, 소 폭스, MVA), 조류 폭스 (가금 폭스) 파라폭스 바이러스 (유사 소 폭스바이러스)를 테스트하였다. 감염되지 않은 HeLa 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이러한 스크리닝 실험에서, HeLa 세포를 최적의 감염을 보장하도록 상이한 폭스바이러스로 높은 MOI (MOI 1)에서 감염시켰고, 생성된 상청액을 수집하여 CD80에 대한 CTLA4-Fc 결합을 억제하는 이들의 성능을 평가함으로써 테스트하였다 (OD 450 nm로서 표시됨). 도 2에 도시된 바와 같이, 백시니아 바이러스의 3가지 균주 또는 라쿤 폭스 (RCN), 토끼 폭스 (RPX) 및 소 폭스 (CPX)로 감염된 세포의 모든 상청액은 hCD80에 대한 hCTLA4의 결합을 간섭할 수 있었다. 이들 결과는 이들 폭스바이러스로의 감염 동안 분비되는 인자가 CTLA4-B7 경로를 간섭하는 것을 나타낸다. 이러한 억제 활성에 관여하는 새로운 미지의 인자는 "간섭 인자" (IF)로 불렸다. 또한, MVA 및 유사 소 폭스 (PCPV) 및 가금 폭스바이러스 (FPV)와 같은 일부 다른 폭스바이러스로 감염된 세포의 상청액은 감염되지 않은 HeLa 세포 (HeLa)와 같이 CTLA4/CD80-CD86 상호작용의 억제를 나타내지 않았다.
"간섭 인자"는 백시니아 바이러스 상청액에 존재하지만 MVA 상청액에는 존재하지 않는다
IF가 VV 감염된 상청액에 존재하는 분자와 상호작용하는 것을 이해하기 위하여, 감염되지 않거나 MVA 또는 백시니아 바이러스로 감염된 CEF (CEP로도 명명됨)의 상청액의 웨스턴 블럿을 상기에 기술된 ELISA 검정법의 3가지 구성성분 (즉, hCD80, hCD86 및 hCTLA4)으로 탐색하였다. CEF가 IF를 생산하거나 생산하지 않거는 백시니아 바이러스 및 MVA 둘 다에 각각 허용되기 때문에 선택되었다. 웨스턴 블럿을 탐색하는데 사용된 각 단백질은 특히 이들의 이량화 및 동일한 항-Fc 컨쥬게이션된 항체로의 검출을 허용하는 Fc 부분과의 융합이었다. 각 상청액을 이와 같이 또는 20배 농축하여 사용하였다 (×20). 도 3에 나타낸 블럿은 명백하게 약 200 kDa의 큰 분자가 백시니아 바이러스 감염된 상청액에만 존재하고, hCD80 및 hCD86 둘 다로는 강조되지만 hCTLA4는 아니었음을 입증한다 (적어도 이들 면역블럿 조건에서). 이러한 밴드는 농축되지 않은 상청액에서도 용이하게 검출되었다. hCD80-Fc 및 hCD86-Fc 둘 다와 반응성은 환원 조건에서 상실되었으며 (밴드가 검출되지 않음), 내부 및/또는 상호 이황화 결합이 IF 구조, 및 CD80와 CD86의 상호작용을 유지하는데 필요함을 나타낸다 (데이타 미도시). 매우 대조적으로, MVA 상청액에서는 밴드가 전혀 강조되지 않았다.
결합 성질의 특성화: 백시니아 바이러스 상청액에 존재하는 "간섭 인자"는 CTLA4 및 CD28에 대한 CD80 및 CD86의 결합을 억제하지만 PD-L1와 CD80의 결합을 강화한다
상기에 논의된 바와 같이 CD80 및 CD86은 적응성 T 세포 반응의 조절에 관여하는 중요한 보조-자극 항원이다. CD80 및 CD86 둘 다가 면역 반응의 견지에서 음성 (CTLA4 둘 다의 경우, 및 PD-L1 CD80 경우에만) 및 양성 (CD28) 결과를 갖는 여러 분자 상호작용에 관여하기 때문에, 이들 5가지 특이적 상호작용 각각에 미치는 If의 효과를 해석하도록 상이한 ELISA를 설정하였다. 비-재조합 백시니아 바이러스 (VV)로 감염된 CEF로부터 얻은 희석되지 않은 상청액을 이들 상이한 검정법으로 테스트하고, MVA 감염된 CEF의 상청액 및 항-hCTLA4 항체 예르보이 (10 μg/mL)와 비교하였다. 감염되지 않은 CEF 세포의 상청액을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, VV 상청액이 CTLA4와 CD80 및 CD86의 상호작용을 예르보이와 유사하게 (CD80에 대한 접근을 막는 CTLA-4 표적에 대한 에르보이의 결합 및 이에 따른 CTLA4/CD80 라이게이션으로 인해 예상되는 바와 같음) 억제하였다 (OD 450 nm 흡광도의 인상적인 감소에 의해 입증됨). 매우 대조적으로, MVA 감염된 CEF의 상청액은 효과가 없었다 (음성 CEF 대조군과 동일한 흡광도). 더우기, VV 상청액은 또한 CD28와 CD80 또는 CD86의 양성 상호작용을 없앨 수 있었다 (감염되지 않은 CEF 세포의 상청액으로 측정된 흡광도와 관련하여 OD 450 nm 흡광도의 강한 감소). 대조적으로, MVA 감염된 세포 상청액 및 예르보이 (CTLA4 수용체만을 표적하는 항체의 경우 예상된 바와 같음)는 효과가 없었다 (음성 대조군과 동일한 흡광도). 이들 결과는 VV 감염된 세포의 상청액에서 "IF"의 존재를 검증하는 한편, MVA 게놈은 이러한 인자를 생산하지 않는다.
놀랍게도, PD-L1/CD80 상호작용은 백시니아 바이러스 상청액의 존재에 의해 증가되었으며 (음성 대조군과 관련하여 OD 450 nm 흡광도의 강한 증가), PDL1 매개된 면역억제성 신호전달을 강화시킨다. 대조적으로, 예르보이 및 MVA 감염된 CEF 상청액은 PDL1/CD80에 영향이 전혀 없다 (감염되지 않은 대조군과 동일한 흡광도). 예상된 바와 같이, 재조합 hCD80, hCTLA4 및 hPD1가 이러한 상호작용을 없앴다. 이러한 결과는 CD80 상의 IF 및 CTLA4 결합 부위가 완벽하게 중첩하지 않는 것을 나타낸다. CD80/PD-L1 상호작용이 최근에 Treg 생존에 관여하였던 점을 주목해야 한다.
이들 결과는 폭스바이러스성 m2 폴리펩티드에 의해 나타나는 면역억제 성질의 개선을 강조하고 있다. 따라서, m2가 CD80/CD28, CD86/CD28를 차단함으로써 및 PDL1-CD80 경로를 강화함으로써 면역억제성 경로를 추진하는 한편, CTLA4-Fc는 면역억제성 PDL1-CD80 상호작용을 포함한 이들 3가지 경로를 억제한다.
간섭 인자인 것으로서 m2 폭스바이러스성 단백질의 확인
대략 200 kDa의 외관 분자량 및 IF가 MVA 감염된 상청액에 존재하지 않는 사실을 기초로 하여, 백시니아 코펜하겐 균주 및 MVA 사이에 상이한 37개 유전자를 임의의 자명한 증거가 없이 잠재적인 후보로 조사하였다. 약 200 kDa의 단백질을 확인할 수 없었다. 이들 37개 유전자 후보 중에서, 가장 큰 인코딩된 단백질이 200 kDa 이하로 관찰되는 147 kDa의 이론적인 질량을 갖는 DNA 의존성 RNA 중합효소 소단위체 rpo147 (J6R)이다. 일차 구조를 기초로 하여, IF와 결합할 수 있는 명백한 바이러스성 단백질 후보가 없었다.
따라서, IF를 확인하는 실험적 접근법을 친화 크로마토그래피 (도 5a 기획도 참조)를 사용하여 IF를 포획하도록 시도하였다. 백시니아 바이러스 감염된 CEF의 20배 농축된 상청액 (VV 감염됨)을 이러한 친화 크로마토그래피 상에 로딩하였다. MVA 감염된 세포의 20배 농축된 상청액 (MVA 감염됨)을 나란히 프로세싱하였다. VV 및 MVA 상청액을 고정화된 CTLA4 (음성 대조군) 또는 고정화된 CD86-Fc 융합에 산에 의해 용리되기 이전에 주입하였다. 친화 크로마토그래피 팔의 상이한 용리를 트립신 소화 이후에 MS/MS (질량 분광분석법)에 의해 분석하였다. 획득된 m/z 데이타를 닭 (갈루스 갈루스) 및 백시니아 바이러스 데이타뱅크를 검색하는데 사용하였다. 하나의 결과가 백시니아 바이러스 단백질인 M2L 유전자좌에 의해 인코딩된 m2 단백질의 75% (펩티드 신호를 포함함) 또는 82% (펩티드 신호가 없음)을 피복하는 CD86 코팅된 비드와 함께 배양된 백시니아 감염된 CEF의 상청액으로부터만 획득되었다 (도 5b, 검출된 펩티드에 의해 피복된 서열이 진하게 표시됨). 이러한 결과는 MVA 게놈에서 M2L 유전자좌의 부재 그리고 m2가 추정된 분비됨 단백질로 만드는 예측된 신호 펩티드를 갖는 사실과 전적으로 부합한다.
그러나, m2 단백질은 단지 25 kDa의 계산된 분자량을 작고, 환원 조건의 SDS-PAGE 상에서 35 kDa 단백질로서 전개되는 것으로 보고되었으며 (Hinthong et al. 2008), 이는 SDS-PAGE 상에서 관찰된 IF의 질량 200 kDa와는 매우 다르다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자의 지식으로, 환원 조건의 SDS-PAGE 상에서 m2 단백질의 행동은 보고되지 않았다. 따라서, 본 발명자는 IF가 VV m2 단백질을 소단위체 간 이황화 결합으로 내포하는 동종- 또는 이종 다량체 복합체로 SDS-PAGE 상에서 대략 200 kDa의 외관상 질량을 갖을 수 있음을 가설 세운다.
실시예 2: m2 결함성 폭스바이러스는 IF를 더 이상 생산하지 않는다
M2L 결실된 폭스바이러스의 제작
IF에서 m2 관여를 백시니아 바이러스 게놈에서 M2L 유전자를 결실시킴으로써 조사하였다. 상세하게, M2L 유전자좌를 루시퍼라제를 발현하는 이중 결실된 (DD) 백시니아 바이러스 (즉. tk - , rr- - , 국제특허출원 WO 2009/065546에 기재되고, VVTG18277로 명명됨)에서 파괴하여, 상기에 기술된 바와 같이 루시퍼라제를 발현하는 재조합 삼중 결실된 (TD) 바이러스 (즉, tk - rr - , m2 -) (COPTG19289)를 생성하였다. M2L 부분적 결실은 m2 ORF 상류의 64개 뉴클레오티드부터 처음 169개 코돈까지 연장되어 m2 단백질의 억압된 발현 (m2-)을 유도하였으며, 부모 바이러스와 비교하여 CEF 상에서 바이러스 복제에 미치는 유의한 영향은 없었다 (데이타 미도시).
M2L 결실된 바이러스는 IF를 더 이상 생산하지 않는다
DD 및 TD 바이러스로 인간 HeLa 및 조류 DF1 세포의 감염 시 획득된 상청액을 이전와 같이 경쟁 ELISA에 의해 연구하였다, 도 6에 나타낸 바와 같이, M2L 결실된 백시니아 바이러스 COPTG19289로 감염 시 수집된 상청액은 부모 DD 바이러스 (VVTG18277)가 음성 대조군과 비교하여 흡광도 측정에서 강한 감소를 나타낸 것과 달리, M2L 결실된 백시니아 바이러스 COPTG19289는 CTLA4/CD80 상호작용을 더 이상 억제할 수 없었다 (감염되지 않은 HeLa 또는 DF1 세포에서 측정된 흡광도와 동일한 흡광도에 의해 입증된 바와 같음).
더우기, 상기와 같이 웨스턴 블럿을 시행할 때, CD80-Fc 또는 CD86-Fc 프로브를 사용하여 검출된 200 kDa에서 이동하는 큰 복합체가 M2L 결실된 바이러스의 상청액으로는 검출되지 않았다 (데이타 미도시). 이들 결과는 m2가 적어도 IF의 일부인 것을 검증하였다.
실시예 3: m2 결함성 재조합 폭스바이러스
루시퍼라제를 발현하는 tk- rr- m2- 종양분해성 백시니아 바이러스의 제작은 상기에 설명된 바와 같다.
종양분해 활성
LOVO (ATCC® CCL-229TM) 및 HT116 (ATCC® CCL-247TM) 결장 암종 세포를 96-웰 플레이트에 8 ×105개 세포/웰의 세포 밀도로 접종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 감염 이전에 4시간 동안 배양하였다. 둘 다의 세포를 루시퍼라제를 발현하는 tk- rr- m2- COPTG19289 바이러스 또는 tk- rr- VVTG18277 바이러스 둘 중 하나로 세포 당 10-1개 내지 10-4개 입자의 MOI로 감염시켰다. 세포 생존능을 감염 96시간 후 (D4) 세포 계수기 (Vi-Cell, 벡크만 쿨터사)를 사용한 트립판 블루 배제에 의해 결정하였다. LOVO (도 7a) 및 HCT116 (도 7b)의 세포 생존%의 정량화는 m2 결함성 COPTG19289 바이러스에 의해 제공된 종양분해 효능이 LOVO 세포 및 HCT116 세포 둘 다에서 m2 양성 VVTG18277으로 획득된 효능과 비슷한 것을 입증하였다. 상세하게, LOVO 세포가 10-1 및 10-2개의 MOI로 VVTG18277 및 COPTG19289의 감염 시 용해되는 반면, 80% 세포 생존능은 낮은 10-3개의 MOI에서 관찰되지 않고, 10-4개의 MOI에서는 전부 보존되었다. 바이러스성 종양분해 활성은 세포 생존능 (0%)이 10-1, 10-2 및 10-3개의 MOI에서 검출될 수 없었으며, 50% 이하의 세포가 10-4개 MOI로 생존하기 때문에 HCT116 세포가 심지어 더 높았다. 모의 처리는 세포에 미치는 효과가 없었고, LOVO 및 HCT116 세포의 100% 생존능을 결정하는데 사용하였다.
이중 및 삼중 결실된 바이러스 사이의 이러한 구별 부재는 흑색종 B16F10 (ATCC® CCL-6475TM), 마우스 결장 암종 CT26WT (ATCC® CRL-2638TM) 및 마우스 결장 샘암종 MC38WT 세포 (케라패스트 및 셀로사우러스사로부터 입수가능함, CVCL_B288)를 포함하는 다른 종양 세포주에서 검증되었다. 백시니아 바이러스 둘 다는 10-1개 MOI로 이들 3가지 세포주에서 그리고 10-2개 MOI로 B16F10 및 MC38WT 세포에서 종양분해성인 한편, CT26WT에서 부분적으로 종양분해성이다.
결론적으로 재조합 m2 결함성 바이러스는 이들의 m2 양성 파트너와 비슷한 종양분해 활성을 나타내고, 이는 M2L 유전자좌의 손상이 종양 세포주에서 종양분해 활성에 해로운 영향을 주지 않는 사실을 지지하고 있다.
생체내 에서 트랜스 유전자 발현
tk- rr- m2- 종양분해성 백시니아 바이러스 (COPTG19289)로부터 생성된 루시퍼라제 발현을 피하 주사에 이어서 B16F10 종양이 이식된 C57BL/6 마우스에서 평가하였고, tk- rr- VVTG18277 바이러스로 획득된 발현과 비교하였다. 각 바이러스 (107개 pfu)를 0일, 3일, 6일, 10일 및 14일째 종양내로 주사하고, 종양 시료를 종양 그램 당 루시퍼라제 활성 (RLU/g 종양)의 평가를 위해 1일, 2일, 6일, 9일 13일및 16일째 수집하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 둘 다의 바이러스의 경우에 바이러스 주사 이후 1일째 (D1 및 D2) 루시퍼라제 활성이 검출되고, 이후에 감소하였다. 그러나, 루시퍼파제 발현은 VVTG18277의 감염 13일 이후에 배경 수준에 도달하였던 반면, 약하지만 지속적인 발현이 COPTG19289의 감염 시 측정되었고, 시간 경과 시 (D9, D13 및 D16) 유지되었다.
항-종양 활성
tk- rr- m2- 종양분해성 백시니아 바이러스 (COPTG19289)에 의해 제공된 항-종양 활성을 3가지 종양 모델, B16F10, CT26 및 HT116에서 각각 검정하였다.
제 1 설정에서, C57BL/6 마우스 (10마리 마우스/실험군)에게 B16F10 종양을 피하 주사에 의해 이식하였다. 종양이 25 내지 100 mm3의 부피에 도달할 때, 각 동물의 종양을 측정하였고, 마우스를 무작위화하고, 이에 종양내 경로에 의해 107개 pfu의 COPTG19289, VVTG18277 또는 모의 비히클 (음성 대조군)을 D0, D3, D6, D10 및 D14에 주사하였다. 동물 생존 및 종양 성장을 매주 2회 추적하였다 (종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달할 때 마우스를 희생시킴). 2가지 VV 처리된 실험군 사이에 극적인 차이는 없었다. 명확하게, 여러 동물이 둘 다의 실험군에서 지연된 종양 성장을 나타냈다. 대조적으로, 종양 성장은 모의 처리된 동물에서 24일 이후에 2000 mm3에 도달하여 매우 신속하고, D24에 마우스 모두가 치사하였다. 상세하게, 본 실험에서는 50% 생존을 D23에 tk- rr- VVTG18277로 처리된 마우스 그리고 D28에 tk- rr- m2- COPTG19289로 처리된 마우스의 경우에 획득하였다. 명백하게, 주사맞은 10마리 마우스 중 2마리가 몇 일 후에 치사한 것을 제외하고는 (데이타 미도시), 생존 곡선이 VV의 2가지 실험군 간에 일치하였다.
또한, 항-종양 활성을 피하 주사에 의해 CT26 종양이 이식된 Balb/c 마우스에서 검정하였다. 종양이 종양이 25 내지 100 mm3의 부피에 도달할 때, 종양을 개별적으로 측정하고, 마우스를 무작위화하고 (D0), tk- rr- m2- 종양분해성 백시니아 바이러스 (COPTG19289) 또는 tk- rr- VVTG18277 바이러스 또는 모의 비히클을 종양 내로 주사하였다 (10마리 마우스/실험군). 107개 pfu의 각 백시니아 바이러스 제조물 (또는 모의군)에 해당하는 50 μL를 종양 내에 D0, D3, D6, D10 및 D14에 주사하였다. 종양 성장을 매주 2회 추적하였으며, 종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달할 때 마우스를 희생시켰다. 도 9에 도시된 바와 같이, 모의 처리된 동물에서 종양 부피가 D28에 신속하게 증가하여 2000 mm3에 도달한 반면, VV 처리된 실험군에서 종양 성장은 지연되어 tk- rr- m2- 백시니아 바이러스에서 단지 종양 부피가 1000 mm3 미만이었다.
또한 항-종양 활성을 피하 주사에 의해 HT116 종양이 이식된 스위스 누드 마우스 (10마리 마우스/실험군)에서 검정하였다. 2가지 상이한 용량의 백시니아 바이러스를 종양 이식 이후 10일째 정맥내로 각각 105 및 107개 pfu 주사하였다. 종양 성장을 매주 2회 추적하였으며, 종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달할 때 마우스를 희생시켰다. 예상된 바와 같이, 모의 처리된 동물에서 종양 부피가 종양 이식 이후 45일째 2000 mm3 이상으로 신속하게 증가되는 반면, 종양 성장은 105개 pfu의 VV로 처리된 실험군에서 지연되었다. 명확하게, 종양 성장은 도 10에 도시된 바와 같이 107개 pfu의 백시니아 바이러스로 주사된 2가지 실험군에서 완전하게 억제되었다.
결론적으로, 백시니아 바이러스를 면역억제성 M2 단백질을 생산하지 못하도록 만드는 VV M2L 유전자좌의 변형은 종양분해 활성, 항-종양 효과 및 트랜스 유전자의 발현에 영향을 전혀 주지 못한다.
실시예 4: 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정법
COPTG19289 (tk-, rr- 및 m2-) 또는 VVTG18058 (tk- rr-) 또는 MVAN33로 감염된 CEF 세포로부터 획득된 상청액을 림프구를 활성화하는 이들의 능력에 대해 MLR로 평가하였다. 배양 상청액을 감염 (MOI 0.05) 48시간 후 수확하고, 약 20배 농축하였다.
PBMC를 건강한 공여자로부터 수집된 혈액으로부터 피콜-파크 플러스 (GE 헬스케어사)에 의해 정제하였다. 보다 상세하게, 2명의 공여자로부터 얻은 3 × 105개 PBMC를 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 농축된 상청액을 희석되지 않거나 10배 또는 100배 희석된 PBMC 배양액에 첨가하여 (200 μL 중 20 μL) 2배, 0.2배 및 0.02배의 최종 "상청액 농도"를 각각 수득하였고, 37℃, 5% CO2 대기에서 72시간 동안 배양하였다. RPMI 배지의 첨가를 음성 대조군으로서 사용하였다. IL-2 분비를 배양 상청액에서 림프구 활성화의 마커로서 ELISA (바이오레전드사로부터 나온 IL-2*-2ELISA 맥스TM　딜럭스 세트 키트)에 의해 정량화하였다. 측정을 주어진 시료의 3회 반복 IL 농도의 평균을 배지로 배양된 PBMC의 3회 반복 IL-2 농도의 평균으로 나누기하여 정규화하였다.
음성 대조군은 정규화된 림프구 활성화 상태 1이다. 도 11에 도시된 바와 같이, MVA 및 COPTG19289 (tk- rr- m2-; TD) 둘 다로 감염된 세포의 상청액의 존재 시 배양된 PBMC는 10배 내지 100배로 희석될 때 1에 근접한 값 또는 희석되지 않고 테스트될 때 1 초과에 도달하는 림프구 활성화를 유도하였다. 매우 대조적으로, VVTG18058 (tk- rr-; DD) 감염된 상청액은 테스트된 모든 희석물에서 림프구 활성화의 분명한 억제를 보여주었고, M2 인코딩 바이러스의 면역억제 활성을 검증하였다.
실시예 5: 인간화 NCG-CD34+ 마우스의 항-종양 활성
m2- COPTG19289 바이러스에 의해 제공된 항-종양 활성을 CD34+ 인간 줄기 세포로 인간화되고, 인간 결장직장 암종 세포 HCT-116이 이식된 (5 × 106개 세포, D0에 마우스의 한쪽 측면에 피하 주사됨) NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 면역결핍 마우스 균주 (ncg)에서 평가하였다. 이식 후 12일째 (D12), 마우스에게 COPTG19289 (tk- rr- m2-; TD) 또는 이의 m2+ 상대방 VVTG18058 (tk- rr-; DD)을 105개 pfu 또는 106개 pfu의 용량으로 단일 Ⅳ 주사를 수여하였다. 비히클 처리된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다 종양 성장 및 마우스 생존을 세포 이식 이후 적어도 60일에 걸쳐 모니터링하였다.
도 12a 및 도 12b에 도시된 바와 같이, 종양 부피가 비히클 처리된 마우스에서 매우 신속하게 증가하였다. 매우 대조적으로, 종양 성장이 m2- COPTG19289 (TD) 또는 m2+ VVTG18058 (DD)로 처리된 마우스에서 주사된 용량에 상관없이 명백하게 억제되었지만, 용량 의존성 독성 문제가 일부 동물의 경우에 출현하여 60일 기간에 걸친 종양 성장 모니터링을 방해하였다. 106 용량에서, 바이러스 둘 다는 대략 동일한 효능으로 종양 성장을 지연시켰지만, DD VVTG18058 바이러스와 비교하여 TD COPTG19289 바이러스에서 더 낮은 독성이 관찰되었다. 주목할만하게, 1마리의 TD 처리된 동물은 세포 이식 이후 55일째 종양이 없어지고, 종양이 없는 상태를 85일 이상에 걸쳐 유지하였다. 105 용량에서, TD COPTG19289 바이러스는 DD VVTG18058 바이러스에 대비한 항-종양 효과의 개선을 나타내었다 (도 12b). 보다 상세하게, 종양 성장이 DD 실험군에서 2마리/5마리에 대비하여 TD 실험군에서 5마리/5마리 동물에서 명백하게 억제되었다. 또한 독성 감소도 DD 실험군과 비교하여 TD 실험군에서 관찰되었다.
마우스 생존의 비교는 106개 pfu (도 13a) 또는 105개 pfu (도 13b)의 단일 Ⅳ 주사 이후에 m2+ VVTG18058 (DD)와 비교하여 m2- COPTG19289 (TD)에 의해 제공된 항-종양 효과의 개선을 검증하였다, 보다 상세하게는, 비히클 처리된 동물의 100%가 52일째 희생된 반면, 생존이 VVTG18058 (DD) 처리 및 더 나아가 COPTG19289 (TD) 처리에 의해 명백하게 연장되었다. 예를 들면, 50% 생존 (도 13a)이 음성 대조군의 경우 52일째, DD-106 pfu 처리된 실험군의 경우 54일째 및 TD-106 pfu 처리된 실험군의 경우 70일째 추정되었다.
더우기, 105개 pfu 용량에서, 50% 생존은 DD 및 TD의 경우 각각 52일 및 80일이었다.
이들 결과는 암과 같은 병리학을 치료하기 위하여 m2 결함성 폭스바이러스에 의해 제공된 치료적 이익의 개선을 설명하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Transgene SA <120> M2-defective poxvirus <130> B377256PCT-D39862 <150> EP 18306874.1 <151> 2018-12-28 <150> EP 19306022.5 <151> 2019-08-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 1 Met Val Tyr Lys Leu Val Leu Leu Phe Cys Ile Ala Ser Leu Gly Tyr 1 5 10 15 Ser Val Glu Tyr Lys Asn Thr Ile Cys Pro Pro Arg Gln Asp Tyr Arg 20 25 30 Tyr Trp Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Thr Ile Gly Val Asn Tyr Asp Ile 35 40 45 Asn Ser Thr Ile Ile Gly Glu Cys His Met Ser Glu Ser Tyr Ile Asp 50 55 60 Arg Asn Ala Asn Ile Val Leu Thr Gly Tyr Gly Leu Glu Ile Asn Met 65 70 75 80 Thr Ile Met Asp Thr Asp Gln Arg Phe Val Ala Ala Ala Glu Gly Val 85 90 95 Gly Lys Asp Asn Lys Leu Ser Val Leu Leu Phe Thr Thr Gln Arg Leu 100 105 110 Asp Lys Val His His Asn Ile Ser Val Thr Ile Thr Cys Met Glu Met 115 120 125 Asn Cys Gly Thr Thr Lys Tyr Asp Ser Asp Leu Pro Glu Ser Ile His 130 135 140 Lys Ser Ser Ser Cys Asp Ile Thr Ile Asn Gly Ser Cys Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Asn Leu Glu Thr Asp Pro Thr Lys Ile Asn Pro His Tyr Leu His 165 170 175 Pro Lys Asp Lys Tyr Leu Tyr His Asn Ser Glu Tyr Gly Met Arg Gly 180 185 190 Ser Tyr Gly Val Thr Phe Ile Asp Glu Leu Asn Gln Cys Leu Leu Asp 195 200 205 Ile Lys Glu Leu Ser Tyr Asp Ile Cys Tyr Arg Glu 210 215 220 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Myxoma virus <400> 2 Met Ala Arg Tyr Ile Ile Ile Val Leu Ala Cys Leu Val Ala Thr Ser 1 5 10 15 Thr Cys Ala Thr Tyr Pro Lys Lys Tyr Trp His Leu Ala Ala Glu Leu 20 25 30 Thr Ile Gly Leu Asn Arg Tyr Val Glu Thr Val Met Gly Glu Cys His 35 40 45 Met Lys Glu Arg Cys Asp His Lys Thr Ser Thr Leu Ile Leu Thr Gly 50 55 60 Tyr Gly Leu Met Ile Asn Ile Thr Ile Thr Asn Val Val Gln Arg Phe 65 70 75 80 Val Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly Asp Gly Asn Lys Leu Ser Ile Met 85 90 95 Leu Phe Thr Thr His Pro Leu Thr Lys Tyr Ser Asp Ile Tyr Leu Thr 100 105 110 Ile Thr Cys Leu Glu Pro Glu Gly Asp Val Gly Asn Tyr Gly Asn Gln 115 120 125 Leu Pro Asp Ser Leu His His Asn Lys Asp Val Ser Ile Thr Ile Leu 130 135 140 Gly Ser Cys Val Thr Cys Val Asn Leu Glu Thr Asn Pro Ile Lys Val 145 150 155 160 Asn Pro His Phe Thr His Pro Ile Ser Met Phe Val Tyr Asp Asn Lys 165 170 175 Glu Asp Val Arg Gly Ser Tyr Gly Val Thr Phe Glu Asp Glu Leu Asn 180 185 190 Val Cys Phe Leu Asp Ile Lys Lys Val Ser Tyr Asp Leu Cys Tyr Arg 195 200 205 Gln Thr Arg Tyr Leu Ile 210

Claims (28)

  1. 변형된 폭스바이러스로서, 게놈이 고유의 (야생형) 맥락에서 기능적 m2 폭스바이러스성 단백질을 인코딩하는 M2L 유전자좌를 포함하고, 상기 m2 기능에 대한 결함을 갖도록 변형되며, 상기 기능적 M2 폭스바이러성 단백질은 CD80 또는 CD86 보조-자극성 리간드 둘 중 하나 또는 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드 둘 다에 결합할 수 있고, 상기 결함성 m2 기능은 상기 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합할 수 없는, 변형된 폭스바이러스.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 바람직하게 아비폭스바이러스 (Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스 (Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus), 몰루스키폭스바이러스 (Molluscipoxvirus), 오르토폭스바이러스 (Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스 (Parapoxvirus), 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus), 세르비드폭스바이러스 (Cervidpoxvirus) 및 야타폭스바이러스 (Yatapoxvirus) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 코르도폭스비리내 (Chordopoxvirinae)로부터 생성되거나, 획득되는, 변형된 폭스바이러스.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스의 구성원이고, 바람직하게 백시니아 바이러스 (VV), 소 폭스 (CPXV), 라쿤 폭스 (RCN), 토끼 폭스, 원숭이 폭스, 말 폭스, 들쥐 폭스, 스컹크 폭스, 배리올라 바이러스 (또는 천연두) 및 낙타 폭스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 폭스바이러스.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이고, 바람직하게 웨스턴 리저브 (WR), 코펜하게 (Cop), 리스터, LIVP, 웨스, 타쉬켄트, 티안탄, 브라이튼, 앙카라, LC16M8, LC16M0 균주 등으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 구체적으로 WR, 코펜하게 및 웨스 균주를 선호하는, 변형된 폭스바이러스.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 레포리폭스바이러스 속의 구성원, 바람직하게 점액종 바이러스인, 변형된 폭스바이러스.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD80 및 CD86 보조-자극성 리간드에 결합하지 못하는 무능력은 상기 M2L 유전자좌 내의 유전적 병변으로부터 또는 상기 m2 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 손상시키는 비정상적 상호작용으로부터 기원하는, 변형된 폭스바이러스.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 유전적 병변(들)은 상기 m2 코딩 서열 내에 또는 상기 M2L 발현을 통제하는 조절요소에서 일부 또는 전부 결실 및/또는 하나 이상의 침묵하지 않는 돌연변이(들)을 포함하여, 바람직하게 결함성 m2 단백질의 합성 또는 m2 합성의 결여를 유도하는, 변형된 폭스바이러스.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 유전적 병변은 상기 M2L 유전자좌의 일부 또는 전부 결실인, 변형된 폭스바이러스.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 상기 M2L 유전자좌가 아닌 영역에서 추가로 변형되는, 변형된 폭스바이러스.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 J2R 유전자좌에서 추가로 변형되어, m2 및 tk 기능 둘 다에 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스를 생성하는, 변형된 폭스바이러스.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 I4L 및/또는 F4L 유전자좌/유전자좌들에서 추가로 변형되어, m2 및 rr 기능 둘 다에 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스를 생성하는, 변형된 폭스바이러스.
  12. 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 상기 J2R 및/또는 I4L/F4L 유전자좌들에서 추가로 변형되어 m2, tk 및 rr 활성에 결함을 갖는 변형된 폭스바이러스가 되는, 변형된 폭스바이러스.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 종양분해성인, 변형된 폭스바이러스.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 재조합인, 변형된 폭스바이러스.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 항원성 폴리펩티드, 뉴클레오시드/티드 풀을 조정하는 기능을 갖는 폴리펩티드 및 면역조절성 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 발현하도록 조작되는, 변형된 폭스바이러스.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 면역조절성 폴리펩티드는 사이토카인, 케모카인, 리간드 및 항체 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 폭스바이러스.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 항체는 바람직하게 CD3, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA4, Tim-3, BTLA, Lag-3 및 Tigit로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는, 변형된 폭스바이러스.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 PD-L1 또는 CTLA4에 특이적으로 결합하는 길항제 항체를 발현하는, 변형된 폭스바이러스.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 m2, tk 및 rr 활성에 대한 결함을 갖고, 항-CTLA-4 항체, 바람직하게 이필루무맙 또는 트레멜리무맙을 인코딩하는, 변형된 폭스바이러스.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스는 m2, tk 및 rr 활성에 대해 결함을 갖고, 항-PD-L1 항체, 바람직하게 아테졸리주맙, 듀르발루맙 또는 아벨루맙을 인코딩하는, 변형된 폭스바이러스.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스를 생산하는 방법으로서, (a) 생산자 세포주를 제조하는 단계, (b) 상기 제조된 생산자 세포주를 상기 변형된 폭스바이러스로 형질감염 또는 감염시키는 단계, (c) 상기 형질감염 또는 감염된 생산자 세포주를 적합한 조건 하에 배양하여 상기 바이러스의 생산을 허용하는 단계, (d) 상기 생산된 바이러스를 상기 생산자 세포주의 배양액으로부터 회수하는 단계, 및 선택적으로 (e) 상기 회수된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 변형된 폭스바이러스의 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 변형된 폭스바이러스의 대략 103개 내지 대략 1012개 pfu, 유리하게 대략 104개 내지 대략 1011개 pfu, 바람직하게 대략 105개 내지 대략 1010개 pfu, 더욱 바람직하게 대략 106개 내지 대략 109개 pfu, 명확하게는 106개, 5 × 106개, 107개, 5 × 107개, 108개 또는 5 × 108개 pfu의 개별 용량을 포함하는, 조성물.
  24. 제 22항 또는 제 23항에 있어서,
    정맥내 또는 종양내 투여를 위해 제형화되는, 조성물.
  25. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 증식성 질환, 뿐만 아니라 류마티스성 관절염 및 골다공증과 같은 파골세포 활성의 증가와 관련된 질환 및 재협착과 같은 심혈관 질환을 치료하거나, 예방하는데 사용되는, 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 암은 신장암, 전립샘암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간암, 위암, 담관 암종, 자궁내막암, 췌장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  27. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 반응을 자극하거나, 개선하고, 특히
    * 림프구 매개된 (특히 항원성 폴리펩티드에 대비한) 면역 반응을 자극하거나 개선하고/거나;
    * APC 활성을 자극하거나 개선하고/거나;
    * 항-종양 반응을 자극하거나 개선하고/거나;
    * CD28 신호전달 경로를 자극하거나 개선하고/거나;
    * 본원에 기술된 상기 변형된 폭스바이러스에 의해 제공되는 치료 효능을 치료받은 대상체 또는 치료받은 대상체 군에서 개선하고/거나;
    * 본원에 기술된 상기 변형된 폭스바이러스에 의해 제공된 독성을 치료받은 대상체 또는 치료받은 대상체 군에서 감소시키는데 사용되는, 조성물.
  28. 제 22항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
    단독 요법으로서, 또는 바람직하게 수술, 방사선 요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소요법, 면역요법, 사이토카인 요법, 표적화된 암 요법, 유전자 요법, 광역학 요법 및 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 추가적인 요법과 조합하여 사용되는, 조성물.
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