KR20210022010A - 바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클 - Google Patents

바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클 Download PDF

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Abstract

본원에는 암의 치료를 위한 운반 세포 및 바이러스 조합 및 방법이 제공된다. 또한 이러한 치료를 위한 변형된 운반 세포 및 이러한 치료를 위해 대상체에 매칭되는 운반 세포를 선택하는 방법이 제공된다.

Description

바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클
관련 출원
우선권의 이익은 도브린 드라가노프 및 알라다르 에이. 스잘레이에 대해 2018년 6월 4일에 출원되고, "바이러스 치료법의 강화를 위한 세포-기반 비히클"이란 제목의 미국 가출원 일련 번호 62/680,570에 대해 주장된다. 본 출원의 주제는 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 분야
본원에는 암 치료를 위한 운반 세포(carrier cell) 및 바이러스 조합 및 방법, 및 치료를 위해 이것을 대상체에게 매칭하는 방법이 제공된다.
종양용해 바이러스(oncolytic virus)는 암 치료제로서의 가능성을 보여준다. 종양용해 바이러스는 암성 세포에서 축적하고 복제하도록 설계된다. 종양용해 바이러스는 암성 세포를 용해할 수 있고 또한 항암제를 암호화하고 전달하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 종양용해 바이러스의 효능은 순환하는 중화 항체, 선천성 및 적응성 면역 메커니즘, 및 암성 종양/세포에서 바이러스의 전달 및/또는 축적을 간섭하는 기타 정화 메커니즘에 의해 방해를 받을 수 있다.
종양용해 요법(oncolytic therapy)을 실시하기 위한 개선된 전달 방법에 대한 필요성이 있다.
종양용해 요법의 과제는 치료된 대상체의 면역체계가 바이러스 감염을 제거하기 위해 기능하는 것이다. 종양용해 바이러스는 종양 조직 및 다른 면역특권 환경에서 우선적으로 복제하지만, 특히 그것이 전신적으로 투여되는 경우에, 충분한 바이러스가 종양 및 전이에 도달하도록 그것은 숙주의 면역(선천성 및 적응성) 반응으로부터 벗어나거나, 탈피하거나, 또는 그렇지 않으면 보호되어야 한다. 이것은 세포를 감염시키고 그것을 바이러스에 대한 전달 비히클(또한 본원에서 운반 세포(carrier cell), 또는 세포 비히클로서 언급됨)로서 사용함으로써 해결되었다. 암 세포, 종양 세포, 뿐만 아니라 다양한 유형의 줄기 세포 및 정상 세포가 순환에서 보체 및 항체 매개 중화로부터 종양용해 바이러스를 보호하는 것을 돕기 위해 종양용해 바이러스를 운반할 수 있다. 바이러스는 세포에서 복제할 수 있어야 하고, 동시에 종양 또는 종양 세포에 도달하기까지 충분한 시간 동안 숙주의 면역체계를 벗어날 수 있어야 하고, 바이러스를 전달할 수 있어야 한다. 세포를 종양용해 또는 치료 바이러스를 위한 운반 세포로서 적합하게 하는 것은 바로 이들 특성이다. 그러나, 일반적으로, 세포가 특히 전신적으로 투여될 때, 그러나 국소적으로 투여될 때에도, 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한 문제들이 있다:
- 종양 환경으로의 우선적인 복귀에도 불구하고 제한된 전달 효율: 대부분의 감염된 세포는 폐 또는 다른 장기에서 포획되고 단지 적은 백분율만이 종양에 성공적으로 도달한다. 종양내 주사는 투여된 운반 세포의 종양에서의 불량한 보유, 또는 순환에서의 누출을 포함한 이유들로 단지 부분적으로 전달을 개선한다.
- 대부분의 암은 종양용해 바이러스에 대해 제한된 대상체- 및 암 유형-특이적 허용성을 가진다(내재성 내성).
- 제한된 수의 바이러스 또는 감염된 운반 세포만이 종양에 서식할 때 인터페론-감마(IFNγ) 생성을 포함한 선천성 및 적응성 면역에 의한 바이러스의 효율적인 제어 및 제거.
- 적절한 종양 서식은 전달뿐만 아니라, 선천성 및 적응성 면역 장벽뿐만 아니라 내재성 종양 세포 내성을 극복하기 위한 바이러스 단계의 초기 부스트 또는 중요한 증폭을 필요로 한다.
- 전달 비히클로서 사용되는 경우, 기성품 줄기 또는 암 세포의 생존 및 바이러스 증폭 잠재력은 예를 들어, 비활성화 및/또는 면역학적 거부반응을 포함한 동종 면역 반응에 의해 영향을 받을 것이다.
본원에는 이들 문제를 해결하기 위한 방법, 세포 및 전략이 제공되며 종양용해 요법을 위한 바이러스를 함유한 개선된 운반 세포 및 세포를 제공한다. 세포는 바이러스를 종양에 전달하기 위해 사용될 수 있는 임의의 것을 포함하며, 줄기 세포, 종양 세포, 세포주, 일차 세포, 및 배양된 일차 세포를 포함한다. 세포는 줄기 세포를 포함하며, 단, 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포 또는 세포주로부터 유래된 세포가 허용되지 않는 경우에, 줄기 세포에 대한 언급은 이러한 세포를 포함하지 않는다. 그러므로 일부 구현예에서, 세포는 배아 줄기 세포 및/또는 배아 줄기 세포 또는 세포주로부터 유래된 세포를 제외한 임의의 줄기 세포를 포함한다. 세포는 자가유래이거나 동종유래일 수 있다. 본원의 방법은 종양용해 바이러스를 전달할뿐만 아니라 강력한 종양내 증폭을 제공하고, 그로써 기존의 동종 장벽을 극복하기 위하여 기성품 동종 줄기 및 암 세포주를 포함한 동종 세포를 사용하는 것을 가능하게 한다. 본원에 제공된 세포는 종양용해 바이러스를 종양에 전달하기 위한 개선된 특성을 가진다. 임의의 투여 경로가 고려되지만, 세포는 전신적 투여를 통해 투여될 수 있다. 세포는 보체, 및 숙주 항바이러스 면역 반응을 포함한 숙주 면역 체계를 제거, 감소 또는 피하기 위하여 변형 및/또는 처리(감작)된다. 세포는 또한 관심 있는 특정 종양용해 바이러스가 세포에서 복제할 수 있도록, 그로써 치료적 양이 종양, 전이, 및/또는 종양 미세환경으로 전달되도록 변형되거나 조작되거나 선택된다.
본원의 발견 중에서, 다음이 제시된다:
세포-기반 전달 비히클(줄기 세포 또는 암 세포)의 높은 내재성 바이러스 증폭 능력은 제자리/생체내에서 운반 세포에 의한 종양용해 바이러스의 종양내 증폭 능력을 보증하기에는 충분하지 않다. 세포-기반 전달 비히클의 증폭 잠재력은 바이러스 또는 세포, 특히 동종 운반 세포에 대한 개별 대상체의 면역 반응에 의해 제한되거나 완전하게 차단될 수 있다. 이런 문제는 1) 환자와 동종 세포-기반 전달 비히클 사이의 검정-기반 매칭; 2) 개선된 종양용해 바이러스 증폭 및 전달을 위한 세포-기반 전달 비히클의 감작 및 보호; 및 3) 세포-기반 전달 비히클로의 특이적 유전자 변형의 도입에 의한 선천성 및 적응성 면역 장벽에 대한 조작된 내성 중 하나 이상을 포함하는 대체 및 보완 전략을 사용함으로써 극복될 수 있다.
본원에서는 인자 및 치료에 의해 및/또는 세포에서의 바이러스 증폭을 증가시키거나 유지시키는, 및/또는 숙주 면역 반응, 예컨대 보체 또는 동종 인식을 감소시킬 수 있는, 및/또는 세포가 바이러스를 종양에 전달하기에 충분한 및 바이러스가 복제하기에 충분한 시간을 허용하기 위하여 동종 인식 또는 보체, 및/또는 다른 그러한 반응을 피하기 위해 세포를 감작시키거나 조작하는 변형에 의해 종양용해 요법이 개선되고 문제들이 해결되는 것이 제시된다. 제1형 및 제2형 인터페론(IFN)은 줄기 세포에서, 및 일부 종양 세포에서 항바이러스 상태의 강력한 유도자이다. 이것은 이들 세포가 감염되고 바이러스 증폭을 지지하는 능력을 간섭한다. 본원에서는 바이러스 감염의 검출 및 항바이러스 상태의 유도를, 그것들을 바이러스 감염, 증폭 및 확산에 대해 감작시킴으로써 차단하는 것은 다양한 줄기 세포뿐만 아니라 종양 세포가 종양용해 바이러스의 운반체로서 기능하는 치료적 잠재력을 증대시킬 수 있는 것으로 나타난다. 세포 비히클은, 예를 들어, 바이러스 증폭을 향상시키기 위하여 및/또는 바이러스를 함유하는 세포의 숙주에의 투여시 항바이러스 상태의 유도를 억제하기 위하여 감작, 처리 또는 예비 처리, 및/또는 조작될 수 있다. 이것을 이루기 위한 표적(들)은, 예를 들어, 인터페론 신호전달을 억제하는 것 및/또는 JAK-STAT 신호전달 경로를 억제하는 것, 예컨대 JAK1/2를 억제하는 것을 포함한다. 세포는 인터페론 또는 인터페론 신호전달 경로의 억제제를 발현하기 위해 처리 또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포, 종양 세포 및/또는 줄기 세포는 JAK1/2 억제제, 및/또는 인터페론 억제제로, 투여 전에 사전 처리될 수 있다. 이러한 것의 예는 룩솔린팁(Ruxolintib), 오클락티닙(Oclactinib), 및 바리시티닙(Baricitinib)이다.
인간 혈청은 줄기 세포 운반체에 대해 바이러스 감염된 운반 세포를 그것들이 자신의 바이러스 증폭을 완료하거나 및/또는 바이러스 입자를 방출하기 전에 직접적으로 공격하고 사멸시킴으로써, 표적 종양 세포로의 바이러스 확산을 제한하는 것을 포함한, 수많은 유해 효과를 나타낼 수 있다. 세포는 보체에 대해 보호하거나 보체를 피하기 위해 사전 처리되거나 조작될 수 있다. 표적은 보체 활성화, 예컨대 보체 단백질 C3 또는 C5에 대한 고전적 및 대체 경로를 포함한다. 억제 항체, 예컨대 Soliris®(Alexion)이란 이름으로 판매되는 항-C5 항체, 및 C3 절단의 억제제, 예컨대 콤프스타틴(compstatin), 및 보체 활성화의 기타 그러한 억제제가 보체에 대해 세포를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 보체 활성화의 다양한 억제제는 기술분야에 잘 알려져 있다.
세포는 동종 인식 및 거부반응을 담당하는 결정 요인을 억제 및/또는 제거하기 위해 처리되거나 조작될 수 있다. 이것은 동종 인식 및 거부반응을 피하면서, 기성품 방식으로 종양용해 바이러스를 전달하는 동종 줄기 또는 종양 세포의 치료적 잠재력을 증대시킬 수 있다. 이러한 동종 거부반응 결정 요인은, 한정하는 것은 아니지만, MHC-유사 MICA/MICB 및 CD1a,b,c,d 분자, 뿐만 아니라 다양한 기타 스트레스-관련 또는 스트레스-감지 분자, 예컨대 부티로필린 및 아넥신 A2를 포함한, CD8 및 CD4 T 세포에 의해 인식되는 고도로 다형성이고 환자-특이적인 MHC 부류 I 및 부류 II 분자, 및 NKT, iNKT, 및 γδ(gd) T 세포와 같은 혼합 선천성/적응성 집단과 같은 다양한 선천성 T 세포 하위집단에 의해 인식된 덜 다형성인 결정 요인의 광범위한 스펙트럼을 포함한다. 그러므로, 세포는 동종 인식/거부반응 표적을 피하거나 억제하기 위해 감작되거나/조작될 수 있다. 이러한 표적으로는, 예를 들어, NK 세포, CD8+ 세포, CD4+ 세포의 하위세트, 및 감마-델타 T 세포(gd T 세포 또는 γδ T 세포) 상에서 발현된 활성화 수용체인 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 NKG2D를 포함한, T 및 NK 세포에 의한 동종 거부반응의 결정 요인을 들 수 있다. HLA 결정 요인에 대한 면역 반응은, 예를 들어, pan HLA-A,B,C 차단으로, 예컨대 pan-HLA 차단 항체, 예컨대 Tu39(BioLegend)로 차단될 수 있다.
동종 및 바이러스-감염된 줄기 또는 종양 운반 세포의 면역학적 반응 및 거부반응은 전형적으로 바이러스로 감염된 또는 형질전환된 종양 세포의 표면에서 상향조절되고, 면역 공동 자극 분자로서 작용하는 다양한 비-MHC 마커의 맞물림(engagement)에 의해 향상될 수 있다. 이러한 마커는 면역학적 거부반응을 피하는 운반 세포의 능력을 직접적으로 조절할 수 있다. 예를 들어, NKG2D 분자(수용체)는 바이러스-감염된 및 형질전환된 종양 세포의 인식 및 거부반응에 관여한 공동 자극 분자로서 기능하는 다양한 MHC 부류 I-관련 단백질, 예컨대 인간 MICA 및 MICB를 인식한다. 본원에서 제시된 것과 같이, 그것들은 종양용해 바이러스 운반체의 면역-회피 잠재력을 조절하는 데 역할을 한다. NKG2D 분자는 복잡한 생물학을 가지며 NK 및 CD8 T 세포에 의해 매개된 선천성 및 적응성 세포 면역에 의해 표적화될 세포를 감작시킬 수 있거나, 또는 표면으로부터 떨어지고 분비될 때 또한 강력한 면역 억제제로서 기능할 수 있다. NKG2D는 그것의 활성화를 차단함으로써, 및/또는 그것의 리간드, 예컨대 MICA, MICB 및 기타를 억제함으로써 억제될 수 있다. HLA 차단은 세포에 의한 면역 회피를 향상시키며; NKG2D 맞물림은 세포에 의한 면역 회피를 손상시킨다.
줄기 세포 및 종양 세포는 ID0 발현 및 IL-10 분비를 포함한, 면역 억제 및 회피에 대한 다양한 전략을 사용한다. 운반 세포에서의 바이러스 증폭은 세포 생존력 및 면역억제 잠재력의 점차적인 손실을 유발한다. 이런 한계를 극복하기 위하여, 세포는 면역억제제를 발현시키기 위해 처리되거나 조작된다. 예를 들어, 세포는 면역억제 특성의 바이러스-매개 손실을 반전시키고 동종 거부반응/반응 또는 초기 면역 인식을 피하는 바이러스-감염 운반 세포의 능력을 개선시키기 위해 고용량의 면역억제 사이토카인 IL-10으로 처리된다. 세포는 면역억제 인자, 예컨대 IL-10, 또는 PDL-1/PD-1 경로의 구성원으로 감작되거나 또는 그것을 분비하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포에 대한 면역 반응을 억제하는, IL-10을 발현시키기 위한 세포로의 사전 처리 또는 조작.
상기는 동종 줄기 및 종양 세포를 포함한, 종양 세포 및 줄기 세포를 포함한, 세포 운반체가 치료적 유효량의 바이러스의 표적 종양 세포에의 전달을 개선 또는 증가시키기 위해 처리되거나 변형될 수 있고, 또한 바이러스 증폭을 증가 또는 유지하기 위해 처리/조작될 수 있는 방법의 예이다. 치료는 세포의 투여 전에 실시되거나, 또는 작용제(들)의 공동 투여에 의해 실시될 수 있다. 다음의 표는 표적, 치료 및 변형의 예를 제공한다. 이들 및 기타는 하기 설명 및 실시예에서 설명된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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본원에는 바이러스 및 줄기 세포에 대한 면역 반응에서 환자-특이적 차이를 포착하여 적절한 대상체-운반 세포 매칭을 제공하고 기성품 동종 세포-기반 전달 플랫폼의 효과적인 사용 및/또는 상기 논의된 문제점을 해결하는 바이러스 세포 운반체로서 사용하기 위한 동종 세포의 개발을 허용하는 방법이 제공된다. 종양용해 바이러스 전달을 위한 동종 줄기 세포의 사용은 세포의 장기간 생존 및 생착(engraftment)에 대한 요구조건의 결핍에 의해 용이해지고; 따라서 본원의 방법은 유의하지 않은 MHC 미스매치 장벽을 가로질러 작동할 수 있다. 대상체 및 운반 세포는 본원에서 기술된 것과 같이 처리되고 변형될 수 있으며 바이러스의 효과적인 전달을 위해 대상체에 매칭될 수 있다. 그러므로, 자가유래 줄기 세포 접근법에 대한 실행 가능한 대안이 제공된다.
본원에는 종양용해 바이러스의 종양 세포에의 전달을 개선하기 위한 방법이 제공된다. 세포 비히클은 바이러스를 전달하기 위한 운반체(운반 세포)로서 사용되어 바이러스가 순환하는 항체 및 면역 메커니즘을 피하는 것을 돕고 바이러스를 암성 종양/세포에 전달하였다. 세포 비히클은 종양 부위에서 바이러스의 증폭을 부스팅할 수 있고, 그로써 그것의 치료 효능을 증가시키고 바이러스가 선천성 및 적응성 면역 장벽뿐만 아니라 내재성 종양 세포 내성을 극복하게 할 수 있다. 본원에는 치료된 대상체의 면역 반응을 피하는 개선된 능력을 가지는 운반 세포(세포 비히클)가 제공된다. 면역 체계를 가장 잘 피하기 위해 또한 운반 세포를 바이러스와 매칭시키기 위해, 그리고 운반 세포와 바이러스를 치료될 대상체와 매칭시키기 위해 운반 세포를 대상체에 매칭시키는 방법이 제공된다. 특히, 종양용해 바이러스를 포함하는 동종 운반 세포로 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 동종 운반 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 대상체에게 매칭된다. 바이러스 및 운반 세포는 일반적으로 투여 전에 공동 배양되지만, 이것들은 별도로, 예컨대 순차적으로, 상이한 조성물로 투여될 수 있다. 또한, 바이러스와 공동 배양된 또는 바이러스로 감염된 운반 세포가 투여될 수 있고, 바이러스와 공동 배양되지 않았거나 바이러스로 감염되지 않은 추가적인 운반 세포가 투여될 수 있다.
본원에는 인자 및 처리에 의해 및/또는 세포에서의 바이러스 증폭을 증가시키거나 유지하는, 및/또는 바이러스가 종양에 전달되기에 충분한 시간을 허용하기 위해 세포에 대한 숙주 면역 반응, 예컨대 보체 및/또는 HLA 반응 및 기타 그러한 반응을 감소시키는 세포의 변형에 의해 종양용해 요법이 개선되며 문제점이 해결되는 것이 제시된다.
또한 본원에는 세포가 바이러스를 증폭시키고 세포에 바이러스를 전달할 수 있기 전에 세포를 사멸하거나 억제하는 숙주 면역 반응을 피하거나 감소시키기 위하여 동종 세포를 대상체에게 매칭시키는 방법이 제공된다. 방법은 또한 특정 세포 유형에 대해 적절한 바이러스를 선택하는 것을 보조할 수 있다.
본원에는 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포가 제공되며, 여기서 바이러스는 세포에서 복제할 수 있고; 세포는 인간 대상체에 투여될 수 있으며; 세포는 인간 대상체에의 투여를 위해 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리되고 변형되었고; 선택적으로, 세포는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형되었다. 인간 대상체에의 투여를 위해 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리되고 변형되었고; 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형된 운반 세포가 제공된다. 또한 종양용해 바이러스 증폭이 허용되고, 종양에서 축적되는 운반 세포 및/또는 대상체의 종양에 바이러스를 전달하기에 충분한 시간 동안 종양 대상체의 면역 체계에 의해 인식되지 않는 운반 세포가 제공된다. 목표는 세포가 바이러를 증폭시키고 바이러스를 종양, 및 전이에 전달하기 위해 충분히 오래 생존하는 것이다. 궁극적으로 세포는 그것이 바이러스에 용해되기 때문에 수적으로 소멸할 것이다. 운반 세포는 처리된 또는 변형된 줄기 세포, 면역 세포, 및 종양 세포이다. 운반 세포가 줄기 세포인 일부 구현예에서, 세포는 배아 또는 태아 줄기 세포가 아니거나, 또는 배아 세포주로부터 유래되지 않는다. 운반 세포는 대상체로부터 제거되거나 수득될 수 있고 종양용해 바이러스로 감염될 수 있거나, 또는 그것들은 동종일 수 있다. 줄기 세포는 성인 줄기 세포일 수 있거나, 또는 허용되는 경우, 배아 줄기 세포 또는 태아 줄기 세포일 수 있다. 예시의 운반 세포는 중간엽, 신경, 전능성, 만능성, 유도 만능성, 다능성, 과능성(oligopotent), 단능성, 지방 기질, 내피, 골수, 제대혈, 성인 말초혈, 근모세포, 작은 소아, 상피, 배아 상피, 및 섬유 모세포 줄기 세포 중에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 운반 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 중간엽 줄기 세포의 예는 성인 골수, 지방 조직, 혈액, 치수, 신생아 탯줄, 제대혈, 태반, 태반-유래 부착 기질 세포, 태반-유래 탈락막 기질 세포, 자궁내막 재생 세포, 태반 양능성 내피/중간엽 전구 세포, 양막(amniotic membrane) 또는 양수 중간엽 줄기 세포, 양수 유래 전구체, 왓튼 젤리(Wharton's Jelly) 중간엽 줄기 세포, 골반 거들(pelvic girdle) 줄기 세포, 융모막 융모(Chorionic Villus) 중간엽 기질 세포, 피하 백색 지방 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 혈관외 망막 줄기 세포, 모낭-유래 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 골막-유래 중간엽 줄기 세포, 측판 중간엽 줄기 세포, 박리된 유치 줄기 세포, 치주 인대 줄기 세포, 치낭 전구 세포, 정단 유두(apical papilla)로부터의 줄기 세포, 또는 근육 위성 세포 또는 이것들의 혼합물로부터의 중간엽 세포이다.
일부 구현예에서, 운반 세포는 지방 기질 세포, 예컨대 지방 기질 중간엽 세포이다. 예를 들어, 세포는 외막 위-지방 기질 세포(SA-ASC; CD235a-/CD45-/CD34+/CD146-/CD31-), 및/또는 혈관 주위 세포(CD235a-/ CD45-/ CD34-/CD146+/ CD31-), 예컨대 외막 위-지방 기질 세포(CD34+ SA-ASC)일 수 있다. 다른 구현예에서, 운반 세포는 내피 전구 세포, 태반 내피 전구 세포, 혈관형성성 내피 세포, 및 혈관 주위 세포 중에서 선택될 수 있다. 허용되는 경우, 운반 세포는 배아 상피 세포일 수 있다.
다른 구현예에서, 운반 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포는 과립구, 비만 세포, 단핵 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 림프구, 종양-특이적 항원을 표적화하는 T-세포 수용체(TCR) 유전자도입 세포, 및 종양-특이적 항원을 표적화하는 CAR-T 세포 중에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 운반 세포는 혈액 악성 세포주로부터 변형된 또는 처리된 세포이다. 일반적으로, 악성 세포는 그것이 복제할 수 없도록 처리된다.
모든 구현예에서, 운반 세포는 치료될 대상체에 대해 동종일 수 있거나 자가유래일 수 있다. 동종인 경우, 그것들은 처리된 대상체의 면역 반응을 피하거나 그것에 적용되지 않도록 처리되거나 감작되거나 또는 조작될 수 있으며, 및/또는 바이러스를 종양에 전달하기에 충분한 시간 동안 그러한 반응을 피하기 위해 대상체에 매칭될 수 있다.
운반 세포는 세포주, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 인간 백혈병, T-세포 백혈병, 골수단핵세포성 백혈병, 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 적백혈병, 골수단핵모세포성 백혈병, 악성 비호지킨 NK 림프종, 골수종/형질세포종, 다발성 골수종 및 대식세포 세포주로부터의 세포일 수 있다. 이러한 세포주의 예는 다음 중에서 선택된 것이다:
KASUMI-1, HL-60, THP-1, K-562, RS4;11, MOLT-4, CCRF-CEM, JVM-13, 31E9, ARH-77, MoB, JM1, NALM-1, 또는 ProPak-X.36인 백혈병 세포주;
HM-2, CEM-CM3, Jurkat/Jurkat 클론 E6-1, J.CaM1.6, BCL2 Jurkat, BCL2 S87A Jurkat, BCL2 S70A Jurkat, Neo Jurkat, BCL2 AAA Jurkat, J.RT3-T3.5, J45.01, J.감마1, J.감마1.WT, JK28, P116, P116.cl39, A3, JX17, D1.1, I 9.2, 또는 I 2.1인 T 세포 백혈병 세포주;
MV-4-11인 골수단핵세포성 백혈병 세포주;
HT, BC-3, CA46, Raji, Daudi, GA-10-클론-4, HH, 또는 H9인 림프종 세포주;
SU-DHL-1, SU-DHL-2, SU-DHL-4, SU-DHL-5, SU-DHL-6, SU-DHL-8, SU-DHL-10, SU-DHL-16, NU-DUL-1, NCEB-1, EJ-1, BCP-1, TUR, 또는 U-937인 비호지킨 림프종 세포주;
Ramos/RA 1, Ramos.2G6.4C10, P3HR-1, Daudi, ST486, Raji, CA46, 버킷 림프종 환자로부터의 인간 감마-헤르페스 바이러스 4/HHV-4 볼 종양, DG-75, GA-10, NAMALWA, HS-Sultan, Jiyoye, NC-37, 20-B8, EB2, 1G2, EB1, EB3, 2B8, GA-10 클론 20, 또는 HKB-11/신장-B 세포 하이브리드인 버킷 림프종 세포주;
Toledo 또는 Pfeiffer인 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주;
JeKo-1, JMP-1, PF-1, JVM-2, REC-1, Z-138, Mino, 또는 MAVER-1인 맨틀 세포 림프종 세포주;
AML-193, BDCM, KG-1, KG-1a, Kasumi-6, 또는 HL-60/S4인 AML 세포주;
K562, K562-r, K562-s, LAMA84-r, LAMA84-s, AR230-r, 또는 AR230-s인 CML 세포주;
N6/ADR, RS4;11, NALM6 클론 G5, Loucy, SUP-B15, 또는 CCRF-SB인 ALL 세포주;
IDH2-돌연변이-TF-1 동질유전자형 세포주인 적백혈병 세포주;
GDM-1인 골수단핵모세포성 백혈병 세포주;
NK-92, 또는 NK-92MI인 악성 비호지킨 NK 림프종 세포주;
U266B1/U266, HAA1, SA13, RPMI-8226, NCI-H929, 또는 MC/CAR인 골수종/형질세포종 세포주;
MM.1R, IM-9, 또는 MM.1S인 다발성 골수종 세포주; 및
MD, SC, 또는 WBC264-9C인 대식세포 세포주.
운반 세포는 다음 중에서 선택된 변형된 또는 처리된 세포일 수 있다:
APCETH-201(APCETH), APCETH-301(APCETH), Cx601(TIGENIX), TEMCELL, MSC-100-IV, 또는 Prochymal(MESOBLAST)인 중간엽 줄기 세포주; 또는
ToleraCyte(Fate Therapeutics)인 유도 만능 줄기 세포(iPSC); 또는
CCD-16Lu 또는 WI-38인 섬유모세포 세포주; 또는
Malme-3M, COLO 829, HT-144, Hs 895.T, hTERT 또는 PF179T CAF인 종양-관련 섬유모세포 세포주; 또는
HUVEC, HUVEC/TERT 2 또는 TIME인 내피 세포주; 또는
HEK-293, HEK-293 STF, 293T/17, 293T/17 SF, 또는 HEK-293.2sus인 배아 상피 세포주; 또는
hESC BG01V인 배아 줄기 세포주; 또는
NuLi-1, ARPE-19, VK2/E6E7, Ect1/E6E7, RWPE-2, WPE-stem, End1/E6E7, WPMY-1, NL20, NL20-TA, WT 9-7, WPE1-NB26, WPE-int, RWPE2-W99, 또는 BEAS-2B인 상피 세포주.
운반 세포는 인간 혈액 악성 세포주인 세포주로부터의 변형된 또는 처리된 세포일 수 있다. 운반 세포는 인간 종양 세포주로부터의 변형된 또는 처리된 세포일 수 있다. 세포주는, 한정하는 것은 아니지만, NCI-60 패널, 섬유육종, 간암종, 전립선암, 유방암, 두경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 결장암(colon cancer), 위암(gastric cancer), 부인암(gynecological cancer), 육종(sarcoma), 흑색종(melanoma), 편평 세포 암종, 간세포 암종, 방광암, 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 배아성 암종(embryonal carcinoma), 고환 기형종(testicular teratoma), 교모세포종(glioblastoma), 성상세포종(glioblastoma), 갑상선 암종(thyroid carcinoma), 또는 중피종(mesothelioma) 세포주로부터 선택된 세포주를 포함한다.
운반 세포는 GM-CSF 전체 종양 세포 백신(GVAX)으로부터의 변형된 또는 처리된 세포일 수 있다. GVAX는 그것이 바이러스를 종양에 전달하기에 충분한 시간 동안 항-바이러스 반응 또는 다른 면역 반응을 포함하지 않도록 본원에서 기술된 것과 같이 변형되거나 처리될 수 있다. 예시의 GVAX로는 GVAX 전립선; GVAX 췌장; GVAX 폐; 또는 GVAX 신장 세포를 들 수 있고, 각각 본원에 기술된 것과 같이 변형되거나 처리된다.
종양용해 바이러스는 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있는 임의의 것일 수 있다. 뉴캐슬병 바이러스, 파보 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 폭스 바이러스, 콕사키 바이러스(CXV) 및 세네카 밸리 바이러스(SVV) 중에서 선택된 종양용해 바이러스가 포함된다. 일부 구현예에서, 종양용해 바이러스는 백시니아 바이러스, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 천연두 백신이다. 예시의 백시니아 바이러스로는 리스터(Lister) 스트레인, 웨스턴 리저브(Western Reserve)(WR) 스트레인, 코펜하겐(Cop) 스트레인, 베른(Bern) 스트레인, 파리 스트레인, 타슈켄트(Tashkent) 스트레인, 티안 탄(Tian Tan) 스트레인, 와이어스(Wyeth) 스트레인(DRYVAX), IHD-J 스트레인, IHD-W 스트레인, 브라이턴(Brighton) 스트레인, 앙카라(Ankara) 스트레인, CVA382 스트레인, 다이렌(Dairen) I 스트레인, LC16m8 스트레인, LC16M0 스트레인, 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 스트레인, ACAM 스트레인, WR 65-16 스트레인, 코노트(Connaught) 스트레인, 뉴욕시 보건 위생부(NYCBH) 스트레인, EM-63 스트레인, NYVAC 스트레인, 리스터 스트레인 LIVP, JX-594 스트레인, GL-ONC1 스트레인, 및 VGF 및 TK가 결실된 vvDD TK 돌연변이 스트레인(예컨대, McCart et al. (2001) Cancer Res. 61:8751-8757 참조)으로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 예를 들어, 백시니아 바이러스는 ACAM2000 또는 ACAM1000일 수 있다.
바이러스는 종양용해성 아데노바이러스, 예컨대, 예를 들어, ONYX-015, CG00070, 온코린(Oncorin)(H101), ColoAd1, ONCOS-102, 또는 델타24-RGD/DNX-2401일 수 있다. 바이러스는 변형된 HSV-1 바이러스, 또는 홍역 바이러스일 수 있다.
종양용해 바이러스는 이종성 유전자 생성물을 발현하기 위해 및/또는 증가된 종양원성을 가지도록 및/또는 감소된 독성(증가된 약독화)을 가지도록 변형될 수 있다. 바이러스는 배양에서 또는 대상체에서 검출하기 위한 검출 가능한 마커를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 마커는 형광 단백질, 예컨대 터보-레드(Turbo-Red) 또는 GFP일 수 있다.
운반 세포는 세포에서의 바이러스 증폭, 대상체에서 또는 종양 미세환경에서 항-바이러스 상태의 유도를 차단하는 것, 면역 억제/면역 회피, 동종 비활성화/거부반응 결정 요인에 대한 보호, 및/또는 보체에 대한 보호 중 하나 이상을 (감작되거나, 처리되거나 또는 조작되지 않은 바이러스에 비교하여) 이루기 위해, 향상시키기 위해 또는 개선하기 위해 감작되거나 처리되거나, 또는 조작될 수 있다. 바이러스 증폭을 향상시키거나 개선하기 위해 감작된 또는 조작된; 또는 대상체에서 또는 종양 미세환경에서 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 또는 처리된 또는 조작된; 또는 하나 이상의 사이토카인 또는 성장 인자로의 사전 처리 또는 처리에 의해 바이러스 증폭을 향상시키기 위해 처리된, 감작된 또는 조작된 운반 세포가 제공된다. 예를 들어, 운반 세포는 인터페론-γ 및/또는 인터페론-β를 억제하기 위해 처리되거나, 또는 그것의 억제제를 발현시키기 위해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 작용제로 처리하는 대신, 작용제와 세포가 숙주에 공동 투여될 수 있다.
바이러스 증폭을 향상시키기 위해 감작된 운반 세포의 예는 IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, GM-CSF, RTK/mTOR 작용물질, Wnt 단백질 리간드, 및 GSK3 억제제/길항물질 중 하나 이상으로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것들이다. 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 운반 세포의 예는 IFN 타입 I/타입 II 수용체를 간섭하는, 하류 IFN 신호전달을 간섭하는, IFNAR1/IFNAR2 신호전달을 간섭하는, IFNGR1/IFNGR2 신호전달을 간섭하는, STAT1/2 신호전달을 간섭하는, Jak1 신호전달을 간섭하는, Jak2 신호전달을 간섭하는, IRF3 신호전달을 간섭하는, IRF7 신호전달을 간섭하는, IRF9 신호전달을 간섭하는, TYK2 신호전달을 간섭하는, TBK1 신호전달을 간섭하는, 또는 세포 또는 대상체에서 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 이루게 하는 다른 신호전달 경로를 간섭하는 하나 이상의 소분자 또는 단백질 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것들이다. 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 세포의 예는 IFN 신호전달/반응성을 간섭/해제하기 위하여, 하나 이상의 HDAC 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것들이다. 예시의 HDAC 억제제로는, 한정하는 것은 아니지만, 보리노스타트(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 치다마이드(chidamide), 파노비노스타트(panobinostat), 벨리노스타트(belinostat), 발프로산, 모세티노스타트(mocetinostat), 아벡시노스타트(abexinostat), 엔티노스타트(entinostat), SB939, 레스미노스타트(resminostat), 기비노스타트(givinostat), 퀴시노스타트(quisinostat), HBI-8000, 케베트린(Kevetrin), CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 설포라판(sulforaphane), 또는 트리코스타틴(trichostatin) 중에서 선택된 것을 들 수 있다. 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 또는 바이러스 증폭을 향상시키기 위해 감작된 운반 세포의 예는 바이러스 감지 및/또는 항-바이러스 방어 경로의 길항물질로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것들이다. 바이러스 감지 및/또는 방어 경로(들)는 STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI(ZBP1) 중 하나 이상에 의해 유도되는 또는 조절되는 것들을 들 수 있다. 이들 경로 중 하나 이상에 영향을 미치는 길항물질로는, 예를 들어, K1, E3L, 및 K3L 백시니아 단백질; NS1/NS2 인플루엔자 단백질; C형 간염 NS3-4A; 아레나 바이러스 NP 및 Z 단백질; 에볼라 바이러스 VP35; HSV US11, ICP34.5 및 ICP0; MCMV M45; 및 보르나병 바이러스 X 단백질 중 하나 이상을 들 수 있다.
비활성화/거부반응 결정 요인에 대해 운반 세포를 보호하기 위해 감작된 운반 세포의 예는 하나 이상의 바이러스 주요 조직적합성(MHC) 길항물질로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것이다. 예시의 MHC 길항물질로는 백시니아로부터의 A40R MHCI 길항물질; HIV로부터의 Nef 및 TAT; 아데노바이러스로부터의 E3-19K; HSV 1 및 HSV2로부터의 ICP47; 우두로부터의 CPXV012 및 CPXV203; 수두 대상포진 바이러스(VZV)로부터의 ORF66; 엡스타인 바 바이러스(EBV)로부터의 EBNA1, BNLF2a, BGLF5, 및 BILF1; 인간 사이토메갈로 바이러스(hCMV)로부터의 US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, 및 US11/gp33; 레서스 CMV(RhCMV)로부터의 Rh178/VIHCE; 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV6) 또는 HHV7로부터의 U21; 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)로부터의 LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, 및 kK5/MIR2; 마우스 간염 바이러스-68(MHV-68)로부터의 mK3; 알파-헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 소 헤르페스 바이러스-2(BHV-1), 및 가성광견병 바이러스(PRV)로부터의 UL41/vhs; 바리셀로바이러스, BHV-1, 말 헤르페스 바이러스 1 및 4(EHV-1/4) 및 PRV로부터의 UL49.5; 및 쥐과 CMV(mCMV)로부터의 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40 중 하나 이상으로부터 선택된 것을 들 수 있다. 사전 처리 또는 처리를 위한 다른 길항물질은 인간 MHC 부류 I 사슬 관련 유전자 MIC-A 및 MIC-B의 길항물질로 또는 바이러스 기원의 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 길항물질로 세포를 로딩하기 위해 처리된 것이다.
면역 억제/면역 회피를 향상시키기 위해 감작된 운반 세포의 예는 바이러스 기원의 면역억제 인자로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것이다. 이러한 인자의 예는 면역 FAS/TNF/그랜자임 B-유도 세포자멸사의 억제제, IL-1/NFkB/IRF3 길항물질, IL-1 및 toll-유사 수용체(TLR) 길항물질, IL-1β 길항물질, TNFα 차단제, IFNα/β 차단제, 및 IFNγ 차단제 중 하나 이상이다.
면역 억제/면역 회피를 향상시키기 위해 감작된 운반 세포의 예는 항원 펩타이드 수송체-1/2(TAP-1 및 TAP-2) 및 타파신 중 하나 이상의 하나 이상의 소분자 억제제(들)로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것이다.
운반 세포는 또한 보체에 대해 보호하기 위해 감작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 항체 또는 소분자 또는 보체 단백질의 다른 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 이루어질 수 있다. 표적화될 수 있는 보체 단백질은 C3 및 C5를 포함한다. 상기에서 및 하기에서 기술되고 본원에서 예시되는 것과 같이, C3 및 C5의 각각에 대해 특이적인 길항물질 항체, 및 소분자 억제제를 포함한, 수많은 억제제가 공지되어 있다.
운반 세포는 일반적으로 감작시키는 또는 보호하는 작용제로 사전 처리된다. 사전 처리는 바이러스 감염 전에, 바이러스 감염 후에, 또는 대상체에게 투여되기 전에, 또는 보관 전에 15분 내지 48시간 동안 이루어질 수 있다.
운반 세포는 또한 연장된 생존 및 바이러스-매개 살해를 감소시키거나 제한하기 위한 개선된 국소 면역억제를 위해 감작되거나 조작될 수 있다. 이것을 이루기 위한 작용제는 예컨대 STING, PKR, RIG-I, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI(ZBP1) 중 하나 이상의 작용물질(들)을 들 수 있고, 이것들은 적절하게 발현을 배가시키는 프로모터의 제어 하에 세포 또는 바이러스에 의해, 또는 대상체에의 투여에 의해 발현에 대해 조작될 수 있어서, 운반 세포는 바이러스에 의해 너무 빨리 살해되지 않을뿐만 아니라, 바이러스가 종양에 전달되기 전에 숙주의 면역 체계에 의해 살해되거나 억제되지 않는다.
본원에 제공된 운반 세포는 또한 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위해 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 다음 중 하나 이상에 의해 이루어질 수 있다: a) 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 또는 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작됨; b) T 및 NKT 세포 중 하나 이상 및/또는 γδ T 세포의 적응성 면역 반응에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작됨; c) NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 선천성 면역 반응에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작됨; d) 동종 항-운반 세포 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위해 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현하기 위해 조작됨; e) 그렇지 않으면 비허용 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하기 위해 조작됨; 및 f) 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하기 위해 조작됨.
예를 들어 a)의 경우, 운반 세포는 IFN 타입 I/타입 II 수용체 및/또는 하류 신호전달의 일시적인 또는 영구적인 억제에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 또는 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작될 수 있고, 여기서 영구적인 억제는 억제되는 유전자좌를 결실함으로써 이루어질 수 있다. 억제는 타입 I/타입 II 인터페론 수용체 발현, IFNα/β 수용체 발현, IFNγ 수용체 발현, IFNAR1/IFNAR2 수용체 발현, IFNGR1/IFNGR2 수용체 발현, STAT1/2 수용체 발현, Jak1/2 수용체 발현, IRF3 수용체 발현, IRF7 수용체 발현, IRF9 수용체 발현, TYK2 키나제 발현, 및 TBK1 키나제 발현 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어질 수 있다. a)에 대한 다른 예에서 운반 세포는 세포질 바이러스 DNA/RNA-감지 및 항-바이러스 방어 기작의 요소의 일시적인 또는 영구적인 억제에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 또는 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작될 수 있다. 이것은 STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI(ZBP1) 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 운반 세포는 a) STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, DAI(ZBP1)에 의해 매개된 바이러스-감지 및 항-바이러스 방어 경로의 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 또는 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작될 수 있다. 길항물질로는, 한정하는 것은 아니지만, K1, E3L, 및 K3L 백시니아 단백질; NS1/NS2 인플루엔자 단백질; C형 간염 NS3-4A; 아레나 바이러스 NP 및 Z 단백질; 에볼라 바이러스 VP35; HSV US11, ICP34.5 및 ICP0; MCMV M45; 및 보르나병 바이러스 X 단백질 중 하나 이상을 들 수 있다.
예를 들어 b)의 경우 운반 세포는 T 및 NKT 세포 중 하나 이상 및/또는 γδ T 세포의 적응성 면역 반응에 의한 동종 인식을 회피하기 위하여 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어 (i) MHC 부류 I 분자, MHC 부류 II 분자, MHC-유사 분자, 및 MHC 부류 I, MHC 부류 II, 및 MHC-유사 분자의 전사 또는 발현의 조절자 중 하나 이상의 일시적인 또는 영구적인 억제; 및/또는 (ii) 바이러스 기원의 B2M 길항물질 및/또는 바이러스 기원의 MHC 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현 중 어느 하나에 의해 또는 둘 다에 의해 이루어질 수 있다. 하나 이상의 MHC 부류 I 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는, 예를 들어, HLA-A, B, 및/또는 C의 영구적인 또는 일시적인 억제에 의해 이루어질 수 있고; 하나 이상의 MHC 부류 II 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 HLA-DP, DQ 및 DR 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어지며; 하나 이상의 MHC-유사 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 CD1a/b/c/d의 억제에 의해 이루어지고; MHC 부류 I, MHC 부류 II, 및 MHC-유사 분자의 전사 또는 발현의 하나 이상의 조절자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 TAP1/2, 타파신, 베타-2 마이크로글로불린, CIITA, RFXANK, RFX5 및 RFXAP 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어진다.
B2M 및/또는 MHC의 일시적인 또는 영구적인 억제는, 예를 들어, hCMV로부터의 UL18로부터 선택된 바이러스 기원의 하나 이상의 B2M 길항물질, 및 백시니아로부터의 A40R MHCI 길항물질; HIV로부터의 Nef 및 TAT; 아데노바이러스로부터의 E3-19K; HSV 1 및 HSV2로부터의 ICP47; 우두로부터의 CPXV012 및 CPXV203; 수두 대상포진 바이러스(VZV)로부터의 ORF66; 엡스타인 바 바이러스(EBV)로부터의 EBNA1, BNLF2a, BGLF5, 및 BILF1; 인간 사이토메갈로 바이러스(hCMV)로부터의 US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, 및 US11/gp33; 레서스 CMV(RhCMV)로부터의 Rh178/VIHCE; 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV6) 또는 HHV7로부터의 U21; 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)로부터의 LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, 및 kK5/MIR2; 마우스 간염 바이러스-68(MHV-68)로부터의 mK3; 알파-헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 소 헤르페스 바이러스-2(BHV-1), 및 가성광견병 바이러스(PRV)로부터의 UL41/vhs; 수두 대상포진 바이러스, BHV-1, 말 헤르페스 바이러스 1 및 4(EHV-1/4) 및 PRV로부터의 UL49.5; 및 쥐과 CMV(mCMV)로부터의 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 MHC 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현 의해 이루어질 수 있다.
예를 들어 c)의 경우, 운반 세포는 (i) 막-결합 MICA/B 또는 막-결합 PVR, 또는 막-결합 넥틴(Nectin)-2의 일시적인 또는 영구적인 억제, 여기서 영구적인 억제는 유전자좌를 결실시킴으로써 이루어질 수 있는 것인 억제; 및 (ii)　MIC-A 및 MIC-B의 길항물질, NKG2D 수용체의 길항물질, NCR의 길항물질, NK 억제 수용체(KIR)에 대한 리간드, 및 NK 억제 수용체 NKG2a/CD94에 대한 리간드의 일시적인 또는 영구적인 발현 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해, NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 선천성 면역 반응에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 운반 세포는 (i) NKG2D 리간드 및/또는 DNAM-1 리간드의 일시적인 또는 영구적인 억제; 및 (ii) MIC-A 및 MIC-B, kK5(카포시 육종 바이러스(KHSV)로부터 유래함)의 길항물질; NKG2D 수용체 우두 OMCP의 길항물질; NKp30, NKp44, NKp46 수용체, 헤마글루티닌(백시니아 및 기타 바이러스로부터의 HA)을 표적화하는 NCR의 길항물질; HLA-Bw4 및 HLA-C2로부터 선택된 NK 억제 수용체(KIR)에 대한 리간드 및 HLA-E 및 유도체 단독 또는 HLA-E 결합 펩타이드를 생성하고 HLA-E 표면 발현을 안정화시키기 위해 21M HLA-B 리간드와 조합된 유도체로부터 선택된 NK 억제 수용체(NKG2a/CD94)에 대한 리간드의 일시적인 또는 영구적인 발현 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 선천성 면역 반응에 의한 동종 인식을 회피하도록 조작될 수 있다.
예를 들어 d)의 경우, 운반 세포는 동종 항-운반 세포 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위하여 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 운반 세포를 동종 항-세포 비히클 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위하여 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현하도록 운반 세포를 조작함으로써 이루어질 수 있다. 인간 기원의 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, IDO, 아르기나제, TRAIL, iNOS, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, sMICA, sMICB, sHLA-G, HLA-E, PD-L1, FAS-L, B7-H4, 및 NK 및/또는 NKT 세포, 및/또는 γδ T 세포를 표적으로 하거나 고갈시키는 단일 사슬 항체(scFv) 중 하나 이상을 들 수 있다. 바이러스 기원의 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, 엑트로멜리아(ectromelia)/백시니아 바이러스 SPI-2/CrmA(면역 FAS/TNF/그랜자임 B 유도 세포자멸사의 억제제), 백시니아 바이러스 암호화된 N1(IL-1/NFkB/IRF3 길항물질), HA(NKp30, NKp44, NKp46을 표적화하는 NCR 길항물질), IL-18 결합 단백질, A40R, A46R, A52R, B15R/B16R, TNFα 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 CmrC/CmrE), IFNα/β 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B18R/B19R), IFNγ 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B8R), 및 기타 IL-1/IL-1β/NFκB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D 길항물질 중 하나 이상을 들 수 있다.
예를 들어 e)의 경우, 운반 세포는 그렇지 않으면 비허용(불허용) 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 운반 세포를 그렇지 않으면 비허용(불허용) 세포 비히클 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작함으로써 이루어질 수 있고, 여기서 인자는 하나 이상의 성장 인자 및 바이러스 감염을 용이하게 하는 사이토카인 중에서 선택된다. 예시의 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, 암 관련 항원, 태아종양 항원, 종양 유전자/종양 억제자, 분화 항원, GM-CSF, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, RTK/mTOR 작용물질 및 Wnt 단백질 리간드 중 하나 이상을 들 수 있다.
예를 들어 f)의 경우, 운반 세포는 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 운반 세포를 보체 단백질의 단백질 길항물질 및/또는 보체 단백질을 억제하는 항체로부터 선택된 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, 보체 인자의 단백질 길항물질(예컨대, 보체 단백질 C1, C2, C3, C4, C5, MBL), 백시니아 바이러스 보체 제어 단백질(VCP), 백시니아 바이러스 보체 억제제(B5R), scFv 항-CD1q/CD1r/CD1s, 항-C3 항체, 항-C5 항체(예컨대, 에쿨리주맙), 콤프스타틴 패밀리(예컨대, Cp40)의 펩타이드 C3 억제제, 인간 가용성 막(s/m) 단백질(예컨대, s/mCR1(CD35), s/mCR2(CD21), s/mCD55, s/mCD59), 인간 인자 H 및 유도체, 및 코브라 독 인자 및 보체 억제 활성을 가진 유도체를 들 수 있다.
또한 a) 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위한 세포 비히클의 감작; b) 항-바이러스 반응의 유도를 차단하기 위한 및/또는 면역 회피/면역 억제를 개선하기 위한 세포 비히클의 감작; c) 대상체에 의한 동종 비활성화 및/또는 거부반응에 대한 세포 비히클의 보호; d) 보체에 대한 세포 비히클의 보호; 및/또는 e) 바이러스-매개 살해에 대해 세포 비히클을 내성으로 하는 것 중에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 세포 비히클 또는 운반 세포가 제공된다.
또한 a) 세포 비히클을 인터페론-유도 항바이러스 반응에 대해 비반응성이 되게 하는 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제; b) T 세포 및 NKT 세포, 및 γδ T 세포에 의한 동종 인식을 회피하는 것을 용이하게 하기 위한 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제; c) NK 세포에 의한 동종 인식을 회피하는 것을 용이하게 하기 위한 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제; d) 면역억제 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현; e) 세포 비히클과의 바이러스 회합을 용이하게 하는 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현; 및 f) 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작된 운반 세포가 제공된다. 추가의 변형은 a) 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위한 세포 비히클의 감작; b) 항-바이러스 반응의 유도를 차단하기 위한 및/또는 세포 비히클의 면역 회피/면역 억제를 개선하기 위한 세포 비히클의 감작; c) 대상체에 의한 동종 비활성화 및/또는 거부반응에 대한 세포 비히클의 보호; d) 보체에 대한 세포 비히클의 보호; 및/또는 e) 바이러스-매개 살해에 대해 세포 비히클을 내성으로 하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 종양용해 바이러스를 함유하는 임의의 운반 세포가 암을 가진 대상체에게 운반 세포를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 사용될 수 있다. 또한 암 치료를 위한 세포의 용도가 제공된다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있고, 비경구, 예컨대 정맥내일 수 있다. 암은 고형 암 및 혈액 악성 종양을 포함하며, 전이성 암을 포함한다. 운반 세포는 대상체에 대해 동종이거나 자가일 수 있다. 동종인 경우, 운반 세포는 대상체에 매칭될 수 있다. 특히, 매칭은 하기 기술되는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그러므로, 암을 치료하는 용도 및 방법이 제공되는데, 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포가 대상체에게 투여되고, 운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되었으며; 운반 세포는 바이러스가 복제할 수 있는 세포; 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 둘 다 향상시키기 위해 처리되었거나 변형된, 및/또는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 세포가 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포이다. 운반 세포는 본원에 기술된 임의의 것을 포함한다.
치료하기 위한 대상체는 동물, 특히 포유류, 이를테면 애완동물, 동물원 동물, 및 농장 동물, 및 인간을 포함한다. 비인간은, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 염소, 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지, 고릴라, 보노보, 및 개코 원숭이를 포함한다.
운반 세포의 치료 방법 및 용도는 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포가 암을 가진 대상체에게 투여되는 것을 포함하며, 운반 세포는 대상체에 대해 동종이며 대상체에게 매칭되었고; 운반 세포는 바이러스가 복제할 수 있는 세포; 및 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 둘 다 향상시키기 위해 처리되었거나 변형된, 및/또는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 세포가 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포이다.
운반 세포의 치료 방법 및 용도는 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포가 암을 가진 대상체에게 투여되는 것을 포함하며, 운반 세포는 대상체에 대해 동종이며 대상체에게 매칭되었다. 매칭은 본원의 방법에 의해 이루어질 수 있다.
또한 암의 치료를 위한 운반 세포의 용도가 제공되며, 운반 세포는 종양용해 바이러스를 포함하고; 운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되었으며; 운반 세포는 바이러스가 복제할 수 있는 세포; 및 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 둘 다 향상시키기 위해 처리되었거나 변형된, 및/또는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 세포가 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포이다. 운반 세포가 종양용해 바이러스를 포함하며; 운반 세포가 대상체에 매칭되거나 매칭되었고; 운반 세포가 본원에 기술된 임의의 것인 용도가 제공된다. 운반 세포는 자가이거나 동종일 수 있다. 동종인 경우, 그것은 대상체에, 예컨대 본원에 기술된 매칭 방법에 의해 매칭될 수 있다.
본원에 제공된 운반 세포, 방법, 및 용도에 의해 치료될 수 있는 암은 고형 종양, 혈액 악성종양, 및 전이성 암을 포함한다. 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종, 육종, 골수종, 및 및 신경모세포종으로부터 선택된 것을 들 수 있다. 다른 암으로, 한정하는 것은 아니지만, 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 뇌암, 중추신경계암, 선암종, 간암, 피부암, 혈액암, 담관암, 골암, 융모막 암종, 결장 및 직장암(colon and rectal cancer), 결합조직 암(connective tissue cancer), 소화기 암(cancer of the digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암(gastric cancer), 상피 내 신생물(intra-epithelial neoplasm), 신장암(kidney cancer), 후두암(larynx cancer), 구강암(oral cavity cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 호흡기 암, 위암(stomach cancer), 고환암, 갑상선암, 자궁암, 및 비뇨기암을 들 수 있다. 기타로는, 한정하는 것은 아니지만, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 결장암, 기저 세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 입술 암(cancer of the lip), 설암(cancer of the tongue), 구강암(cancer of the mouth), 신경교종, 및 인두암(cancer of the pharynx)을 들 수 있다.
본원에서 기술된 것과 같이, 운반 세포는 개선된 바이러스 증폭 특성을 갖기 위해 및/또는 향상된 면역억제 또는 면역 특권 특성을 갖기 위해 처리되거나 변형될 수 있다. 운반 세포는 운반 세포의 바이러스 증폭 및/또는 면역억제 또는 면역 특권 특성을 촉진하는 인자로의 사전처리에 의해 감작될 수 있다. 운반 세포는 그것의 바이러스 증폭 잠재력을 개선시키기 위해 조작될 수 있다.
방법 및 용도에서 바이러스를 가진 운반 세포는 바이러스로 감염되지 않고, IFN-감마로 먼저 사전 처리된 운반 세포와 함께 또는 순차적으로 또는 운반 세포의 투여 후에 투여될 수 있고, 바이러스를 포함하는 운반 세포의 투여 전에 또는 바이러스를 포함하는 운반 세포와 동시에 투여되거나 사용된다.
본원에 제공된 운반 세포, 방법 및 용도는 또 다른 항암제와의 병용 요법 또는 또 다른 항암 요법, 예컨대 방사선 요법 및/또는 수술과의 치료에 사용될 수 있다. 추가의 항암제 또는 치료의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 면역 공동자극 작용물질, BiTE, CAR-T 세포 및 종양-특이적 항원을 표적화하는 TCR 유전자도입 T 세포, 체크포인트 억제제, 화학요법 화합물/항체, 및 면역억제 약물을 들 수 있다. 추가의 항암제로는, 한정하는 것은 아니지만, 면역요법 및/또는 면역억제 약물을 들 수 있다. 추가의 항암제 또는 치료로는, 한정하는 것은 아니지만, B7 패밀리(CD28, ICOS); 4-1BB, OX40, GITR, CD40, CD30 및 CD27 중에서 선택된 TNFR 패밀리; LIGHT; LT-알파; PD-1, PD-2, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, IDO 1 및 2, CTNNB1(β-카테닌), SIRPα, VISTA, LIGHT, HVEM, LAG3, TIM3, TIGIT, 갈렉틴-9, KIR, GITR, TIM1, TIM4, CEACAM1, CD27, CD40/CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD112, CD137( 4-1BB), CD155, CD160, CD200, CD226, CD244(2B4), CD272(BTLA), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, ICOS, A2aR, A2bR, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT-2/4 및 OX40/OX-40L, MDR1, 아르기나제 1, iNOs, IL-10, TGF-β, pGE2, STAT3, VEGF, KSP, HER2, Ras, EZH2, NIPP1, PP1, TAK1 및 PLK1a 중 하나 이상을 표적으로 하는 체크포인트 억제제; 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 감광제, 독소, 항암 항생물질, 화학요법 화합물, 방사성 핵종, 혈관형성 억제제, 신호전달 조절제, 항대사산물, 항암 백신, 항암 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 유사분열 방지 올리고펩타이드, 항암 항체, 면역치료제 중에서 선택된 화학요법 화합물 및 항체; 및 글루코코르티코이드(예컨대, 프레드니손, 덱사메타손, 하이드로코르티손), 칼시뉴린 억제제(예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리무스), mTOR 억제제(예컨대, 시롤리무스, 에베롤리무스), 메토트렉세이트, 레날리도미드, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 사이클로포스파미드, TNFα 차단 항체(예컨대, 인플릭시맙(infliximab)/레미케이드(Remicade), 에타너셉트(etanercept)/Enbrel, 아달리무맙(adalimumab)/Humira), 및 플루다라빈으로부터 선택된 면역억제 약물로부터 선택된 것을 들 수 있다.
상기에서 논의된 것과 같이, 방법 및 용도에 사용하기 위하여, 운반 세포는 동종인 경우, 그것이 투여될 또는 그것이 투여되는 대상체에 매칭될 수 있다. 매칭 방법이 또한 제공된다.
운반 세포는 바이러스를 대상체에게 전달하기 위해 대상체로부터의 면역 세포에 충분히 면역학적으로 적합한 운반 세포를 확인하기 위해 세포가 투여되는 대상체로부터의 면역 세포에 매칭될 수 있다. 또한, 운반 세포는 바이러스와 매칭될 수 있는데, 여기서 세포의 바이러스를 증폭시키는 능력이 측정된다. 세포/바이러스 조합이 또한 대상체에 매칭될 수 있다. 대상체로부터의 면역 세포로는, 예를 들어, 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 들 수 있다. 매칭 방법은 바이러스의 세포에서 복제하는 능력 및/또는 세포의 바이러스 증폭을 촉진하는 능력을 테스트하는 단계를 포함할 수 있다. 방법 및 용도 및 세포는 바이러스의 세포에서 복제하는 능력 및/또는 세포의 바이러스 증폭을 촉진하는 능력이 세포와 바이러스를 공동 배양하고 바이러스 증폭 속도를 측정함으로써 테스트되는 매칭 방법을 포함한다. 바이러스의 세포에서 복제하는 능력 및/또는 세포의 바이러스 증폭을 촉진하는 능력은, 예를 들어 a) 0.01-10 또는 약 0.01-10의 감염 다중도(MOI)를 사용하여 바이러스 증폭 속도를 측정하고, 1일 내지 1주 또는 약 1주(24시간-1주) 동안 동등한 검정 조건 하에서 공동 배양하는 단계; 및 b) 감염된 세포 운반체의 수에 대해 표준화하는 단계에 의해 측정되며, 여기서 동등한 검정 조건 하에 측정된 세포당 표준화된 Pfu 값은 바이러스 증폭 점수(VAS)를 계산하기 위해 사용될 수 있으며, 운반 세포 + 바이러스 조합이 치료법에 적합한지(또는 아닌지) 순위를 매기기 위한 것이고; 1-10의 운반 세포당 플라크 형성 단위(pfu) 값은 제한된 효능(특정 바이러스에 대한 세포 운반체로서의)으로 여겨지며; 10-100의 세포당 Pfu가 양호한 효능이고; 100-1000의 세포당 Pfu가 매우 양호한 효능이며; 1000 이상의 세포당 Pfu는 극히 높은 효능이고; 적어도 10의 Pfu/세포를 보이는 운반 세포와 바이러스의 조합은 세포와 대상체의 대상체 적합성 스크린에서의 테스트를 위한 것으로 여겨진다.
이들 방법에 따르면: 운반 세포/바이러스 조합은 a) HLA-E, CD1a,b,c,d, MICA/B 중 하나 이상을 포함한, MHC I/II 하플로타입, KIR 하플로타입 및 리간드, 및 비고전적 MHC 하플로타입을 확인하기 위하여 환자-특이적 유전자 다형성을 평가하는 단계; b) 운반 세포 중에서 대상체와 가장 적합한 세포를 확인하기 위하여 대상체의 유전자 다형성 프로파일을 이용 가능한 운반 세포의 프로파일과 비교하는 단계; c) 세포, 바이러스 및 면역 세포를 공동 배양함으로써 운반 세포와 대상체 면역 세포의 적합성을 평가하는 단계; 및 d) 바이러스 증폭 수준을 평가하는 단계에 의해 치료될 대상체에 매칭된다. 그러므로 매칭 방법은 추가로 e) 투여용 운반 세포/바이러스를 확인하기 위하여, 종양 세포의 비히클-지향적 이동 및 바이러스 증폭을 검출함으로써 운반 세포 + 살아있는 종양 생검 +/- 바이러스를 측정하는 단계를 포함하며, 대상체 종양 생검 + 세포 비히클 중의 바이러스 증폭은 동등한 조건 하에서 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭 + 동등한 조건 하에서 세포 비히클 단독에서의 바이러스 증폭의 합보다 5% 이상 더 크거나; 또는 동등한 조건 하에서 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭보다 적어도 5% 이상 더 크다.
매칭 방법은 대상체-유래 PBMC + 운반 세포 + 바이러스를 배양함으로써 운반 세포-매개 바이러스 요법에 대한 대상체 허용성을 평가하기 위한 공동 배양을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법, 용도, 세포는 대상체-유래 PMBC + 운반 세포 + 바이러스의 공동 배양에서 바이러스 증폭을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 매치는 운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 80%를 초과한다면 적합하며; 운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 30-80% 범위에 있다면 중간 정도로 적합하고; 운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 10-30% 범위에 있다면 최소한으로 적합하며; 운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 10% 미만이라면 부적합하고; % 적합성은 각 개별 환자 및 각 특정 바이러스에 대한 최소 내지 가장 적합한 운반 세포로 운반 세포의 순위를 매기기 위해 사용될 수 있다.
또한 운반 세포, 매칭 방법을 포함한 방법, 및 용도가 제공되는데, 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클(운반 세포)을 선택함으로써 운반 세포와 대상체 사이의 매칭은 다음 결정요인 (a) 내지 (f) 중 하나 이상을 세포 비히클(운반 세포)과 대상체 사이의 매치의 지표로서 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해 이루어진다:
a) 세포 비히클 및 대상체는 50% 이상의 다음의 조합된 다음의 유전자 유전자좌에서 동일한 대립유전자를 가진다:
(i) MHC I 및/또는 MHC II 하플로타입;
(ii) KIR 하플로타입 및/또는 KIR 리간드 하플로타입; 및
(iii) HLA-E, CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 하플로타입;
b) 세포 비히클을 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
(i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 세포에서 종양으로의 이동 점수(CTMS);
(ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 종양에서 세포로의 이동 점수(TCMS); 및/또는
(iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 이동 점수(MRS);
c) 세포 비히클을 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
(i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 세포의 종양으로의 이동 점수(V-CTMS);
(ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 종양의 세포로의 이동 점수(V-TCMS); 및/또는
(iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 바이러스 로딩된 이동 점수(V-MRS);
d) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 대상체로부터 얻은 면역 세포의 부재를 제외하고 동등한 조건 하에서 얻어진 바이러스 증폭의 양에 비해 대상체로부터 얻은 면역 세포의 존재 하에 바이러스 증폭의 양을 나타내는 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)는 적어도 20%이다;
e) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서의 면역 반응에 비해 세포 비히클의 존재 하의 면역 반응을 나타내는 면역학적 적합성 점수(ICS)는 ≤ 200%이며, 여기서 면역 반응은 다음 중 하나 이상의 발현의 양에 의해 측정된다:
(i) IFNγ;
(ii) T 세포, γδ T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 하나 이상의 마커; 및/또는
(iii) T 세포, γδ T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포 활성자/이펙터 기능(들)과 관련된 하나 이상의 마커;
f) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건에 비해, 다음 식을 따라 ≥0%의 면역학적 억제 점수(ISS)에 의해 측정되는 바, 세포 비히클은 항-바이러스 면역 반응을 증대시키지 않거나 및/또는 항-바이러스 면역 반응을 억제한다:
ISS% = [(IV + IC) - ICV] /(IV + IC) x 100, 식에서:
IV = 바이러스 + 대상체로부터 얻은 면역 세포의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
IC = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이며;
ICV = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클 + 바이러스의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
마커 발현 수준은 e)의 (i), (ii) 및 (iii)에서 제시된 마커의 하나 이상의 발현 수준이며;
a) - f) 중 하나 이상이 만족되면, 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭을 확인하고 세포 비히클을 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클로서 선택한다.
a) - f) 중 하나 이상의 전에, 방법은 세포 비히클이 바이러스와 인큐베이션될 때 바이러스 증폭 점수(VAS)를 Pfu/세포로서 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 만약 VAS 점수가 적어도 10이면 그 세포 비히클을 결정요인 (a) - (f) 중 하나 이상을 사용하여 스크리닝하기 위해 선택하여 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭이 있는지를 확인한다.
매칭 방법은 가능한 운반 세포 패널에 대해 그것의 순위를 매기기 위하여 종양용해 바이러스의 대상체에 대한 유효성, 또는 전달을 토대로 다중화될 수 있으며, 다음을 포함하는 다중화 방법에 의해 1의 순위는 가장 바람직하고, 가장 높은 순위이며 숫자가 커질수록 덜 바람직한 순위를 나타낸다:
(i) 패널의 각 세포 비히클에 대해 a) - f) 중 하나 이상의 값(들)을 측정하고 측정된 값(들)에 따라 각 세포 비히클의 순위를 매기는 단계로서,
a)의 경우, 세포 비히클과 대상체 사이의 대립유전자의 동일성이 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
b)의 경우, 세포 비히클에 대한 CTMS, TCMS 및/또는 MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
c)의 경우, 세포 비히클에 대한 V-CTMS, V-TCMS 및/또는 V-MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
d)의 경우, 세포 비히클에 대한 IVAS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
e)의 경우, 세포 비히클에 대한 ICS 점수가 낮을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
f)의 경우, 세포 비히클에 대한 ISS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지는 단계; 및/또는
(ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, a) - f)의 둘 이상의 값(들)을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻고, 그것들의 누적 순위에 따라 패널의 세포 비히클의 순위를 매기는 단계.
다중화 방법은 추가로
(i) 패널의 각 세포 비히클에 대해, 세포 비히클이 바이러스와 함께 인큐베이션될 때 Pfu/세포로서 바이러스 증폭 점수(VAS)를 얻는 단계;
(ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, VAS 점수 및 a) - f) 중 하나 이상의 값을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻는 단계; 및
(iii) 패널의 세포 비히클을 그것들의 각각의 누적 순위에 따라 순위를 매기는 단계를 포함할 수 있다.
매칭 방법에서, ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 세포 공동 배양의 마커 발현 측정을 토대로 얻어진다.
ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 공동 배양(들)의 상층액에서 마커 발현의 측정을 토대로 얻어질 수 있고; 및/또는 IVAS 점수는 (i) d)의 공동 배양에 공동 배양 부피의 중량을 기준으로(또는 v/v) 10-50%의 양으로 대상체로부터의 혈청을 첨가하는 단계; (ii) 다음 식:
SSRS = pfu/혈청 없는 세포 - pfu/혈청을 포함한 세포
pfu/혈청 없는 세포
을 따라 대상체 혈청 저항 점수(SSRS)를 계산하는 단계; 및
(iii) 식: IVAS(교정된 SSRS) = IVAS x(1-SSRS) x 100을 따라 퍼센트 SSRS-교정된 IVAS 점수를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 바이러스 증폭에 대한 대상체 혈청의 영향에 대해 교정된다.
암을 가진 대상체에게 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 것으로서 세포 비히클을 선택하는 방법(매칭 방법)이 제공된다. 방법은 다음 결정요인 (a) 내지 (f) 중 하나 이상을 세포 비히클과 대상체 사이의 매치의 지표로서 확인하는 단계를 포함한다:
a) 세포 비히클 및 대상체는 50% 이상의 다음의 조합된 다음의 유전자 유전자좌에서 동일한 대립유전자를 가진다:
(i) MHC I 및/또는 MHC II 하플로타입;
(ii) KIR 하플로타입 및/또는 KIR 리간드 하플로타입; 및
(iii) HLA-E, CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 하플로타입;
b) 세포 비히클을 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
(i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 세포에서 종양으로의 이동 점수(CTMS);
(ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 종양에서 세포로의 이동 점수(TCMS); 및/또는
(iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 이동 점수(MRS);
c) 세포 비히클을 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
(i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 세포의 종양으로의 이동 점수(V-CTMS);
(ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 종양의 세포로의 이동 점수(V-TCMS); 및/또는
(iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 바이러스 로딩된 이동 점수(V-MRS);
d) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 대상체로부터 얻은 면역 세포의 부재를 제외하고 동등한 조건 하에서 얻어진 바이러스 증폭의 양에 비해 대상체로부터 얻은 면역 세포의 존재 하에 바이러스 증폭의 양을 나타내는 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)는 적어도 20%이다;
e) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서의 면역 반응에 비해 세포 비히클의 존재 하의 면역 반응을 나타내는 면역학적 적합성 점수(ICS)는 ≤ 200%이며, 여기서 면역 반응은 다음 중 하나 이상의 발현의 양에 의해 측정된다:
(i) IFNγ;
(ii) T 세포, γδ T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 하나 이상의 마커; 및/또는
(iii) T 세포, γδ T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포 활성자/이펙터 기능(들)과 관련된 하나 이상의 마커;
f) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건에 비해, 다음 식을 따라 ≥0%의 면역학적 억제 점수(ISS)에 의해 측정되는 바, 세포 비히클은 항-바이러스 면역 반응을 증대시키지 않거나 및/또는 항-바이러스 면역 반응을 억제한다:
ISS% = [(IV + IC) - ICV] /(IV + IC) x 100, 식에서:
IV = 바이러스 + 대상체로부터 얻은 면역 세포의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
IC = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이며;
ICV = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클 + 바이러스의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
마커 발현 수준은 e)의 (i), (ii) 및 (iii)에서 제시된 마커의 하나 이상의 발현 수준이며;
a) - f) 중 하나 이상이 만족되면, 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭을 확인하고 세포 비히클을 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클로서 선택한다.
상기와 같이, 매칭 방법은 a) - f) 중 하나 이상의 전에, 세포 비히클이 바이러스와 함께 인큐베이션될 때 Pfu/세포로서 바이러스 증폭 점수(VAS)를 측정하는 단계; 및 VAS 점수가 적어도 10이라면, 세포 비히클을 스크리닝을 위해 결정요인 (a) - (f) 중 하나 이상을 사용하여 선택하여 세포 비히클과 대상체 사이의 매치가 있는지를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 기술된 다중화 방법이 또한 제공된다.
또한 본원에서 제공된 임의의 운반 세포를 제약학적으로 허용되는 비히클에 함유하는 제약학적 조성물이 제공된다. 제약학적 조성물은 상기 및 하기에서 기술되는 것과 같이 암을 치료하기 위해, 그리고 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 조성물은 전신적으로, 국소적으로, 종양내로, 간내로, 정맥내로, 직장으로 또는 피하로 투여될 수 있다. 운반 세포는 본원에 기술된 매칭 방법에 의해 대상체에게 매칭될 수 있다.
허용되는 경우, 하기 및 우선권 출원 미국 가출원 일련 번호 제 62/680,570에 제시된 청구범위는 본 섹션에 참조로 포함된다.
개요
A. 정의
B. 세포-기반 비히클("세포 비히클")을 사용하는 바이러스 요법을 위한 구성요소의 선택
(1) 세포-기반 비히클
- 세포 비히클의 유형(자가유래 또는 동종)
(2) 바이러스
- 바이러스의 유형
C. 세포 비히클 및 바이러스를 대상체와 매칭하기 위한 검정
(I) 대상체-유래 면역 세포의 선택
- 세포의 유형
- 세포를 얻는 방법
(II) 일반적인 배양 및 표지화 방법
(III) 세포-기반 비히클("세포 비히클")을 바이러스와 매칭시키는 방법
(IV) 세포 비히클/바이러스 조합을 대상체와 매칭시키는 방법
1. 하플로타입 매칭
2. 세포 비히클, 바이러스 및 대상체-유래 면역 세포를 공동 배양하기 위한 조건 및 방법
3. 종양 세포에 충원되는 능력/효율의 측정 및 그렇지 않으면 바이러스 감염에 대해 내성인 종양 세포의 감작
4. 대상체/세포 비히클 매치의 분석
a. 바이러스 증폭의 측정
b. 공동 배양의 면역조절의 측정
c. 공동 배양의 상층액의 면역조절의 측정
d. 대상체-특이적 세포 비히클의 선택
D. 개선된 매칭 능력을 가진 변형된 세포 비히클
(i) 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위해 감작됨
1. 유형
a. 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위해 감작된 세포 비히클
b. 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 세포 비히클
c. 동종 비활성화/거부반응 결정요인에 대해 보호된 세포 비히클
d. 보체에 대해 보호된 세포 비히클
2. 제조 방법
(ii) 바이러스-매개 살해에 내한 내성을 위해 감작됨
a. 타입 I 및/또는 타입 II 인터페론으로 사전처리된 세포 비히클
b. 항-바이러스 상태의 작용물질/유도자(STING, PKR, RIG-I, MDA-5, 등)로 사전처리된 세포 비히클
2. 제조 방법
(iii) 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위해 조작됨
1. 유형
a. 인터페론-유도 항바이러스 상태에 대해 비반응성이 되도록 조작됨
b. T 세포, γδ(gd) T 세포(적응성 면역 반응) 및 NKT 세포에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작됨
c. NK 세포 및 γδ(gd) T 세포(선천성 면역 반응)에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작됨
d. 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현시키기 위해 조작됨
e. 그렇지 않으면 불허용 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현시키기 위해 조작됨
f. 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현시키기 위해 조작됨
2. 제조 방법
E. 치료법을 위한 세포 비히클/바이러스의 투여 방식
F. 치료 방법 및 치료와 연계된 모니터링
G. 제약학적 조성물, 조합 및 키트
H. 세포 비히클 + 바이러스 치료가 투여된 추가적인 치료법
I. 치료될 암의 유형
J. 실시예
K. 청구범위
A. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명(들)이 속하는 기술분야에 숙련된 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원의 전체 개시 전체에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 출판물, GenBank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 공개된 자료는, 다르게 주지되지 않는 한, 그 전문이 참조로 포함된다. 본원의 용어에 대해 복수의 정의가 있는 경우에, 본 섹션에서의 정의가 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소에 대한 언급이 있는 경우, 그러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷 상의 특정 정보는 입력되거나 유출될 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷 검색에 의해 발견될 수 있는 것이 이해된다. 그것에 대한 언급은 그러한 정보의 이용성 및 대중적인 파급을 증명한다.
본원에서 사용되는 바, "바이러스"는 숙주 세포 없이 성장할 수 없거나 복제할 수 없는 임의의 큰 그룹의 감염성 실체를 나타낸다. 바이러스는 전형적으로 유전자 물질의 RNA 또는 DNA 코어를 둘러싼 단백질 코트를 함유하지만, 반투과성 막이 없으며, 살아있는 세포에서만 성장 및 증식할 수 있다. 바이러스로는, 한정하는 것은 아니지만, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 랍도바이러스, 유두종바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 피코르나 바이러스, 샌드비스 바이러스, 유두종바이러스, 파보 바이러스, 레오바이러스, 콕사키 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 폴리오 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 및 셈리키 숲 바이러스를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 종양용해 바이러스는 종양을 가진 대상체의 종양 세포에서 선택적으로 복제하는 바이러스를 나타낸다. 일부 종양용해 바이러스는 종양 세포의 감염 후에 종양 세포를 살해할 수 있다. 예를 들어, 종양용해 바이러스는 종양 세포를 용해시키거나 종양 세포의 사멸을 유도함으로써 종양 세포의 사멸을 유발할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치료용 바이러스"는 질환 또는 장애, 예컨대 신생물 질환, 예컨대 암, 종양 및/또는 전이 또는 염증 또는 상처 또는 그것의 진단 및 또는 둘 다의 치료를 위해 투여되는 바이러스를 나타낸다. 일반적으로, 본원의 치료용 바이러스는 항-종양 활성 및 최소 독성을 나타내는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "백시니아 바이러스" 또는 "VACV" 또는 "VV"는 폭스 바이러스 패밀리에 속하는 크고, 복잡하고, 외피가 있는(enveloped) 바이러스를 나타낸다. 그것은 길이가 약 190 kbp이고, 약 200개의 단백질을 암호화하는 선형, 이중 가닥 DNA 게놈을 가진다. 백시니아 바이러스 스트레인으로는, 한정하는 것은 아니지만, 웨스턴 리저브(WR), 코펜하게(Cop), 베른, 파리, 타슈켄트, 티안 탄, 리스터, 와이어스, IHD-J, IHD-W, 브라이턴, 앙카라, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), CVA382, 다이렌 I, LIPV, LC16M8, LC16M0, LIVP, ACAM, WR 65-16, 코노트, JX-594, GL-ONC1, vvDD TK 돌연변이, 뉴욕시 보건 위생부(NYCBH), EM-63, 및 NYVAC 백시니아 바이러스 스트레인의 스트레인, 이것들로부터 유래된 또는 변형된 형태를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 준비 연구소(Institute of Viral Preparations, LIVP)의 리스터 스트레인 또는 LIVP 바이러스 스트레인은 러시아 모스크바 소재의 바이러스 준비 연구소에서 소가죽에 적응함으로써 제조된 약독화된 리스터 스트레인(ATCC Catalog No. VR-1549)인 바이러스 스트레인을 나타낸다(Al'tshtein et al. (1985) Dokl. Akad. Nauk USSR 285:696-699). LIVP 스트레인은, 예를 들어, 러시아 모스크바 소재의 바이러스 준비 연구소로부터(예컨대, Kutinova et al. (1995) Vaccine 13:487-493 참조); 마이크로오가니즘 콜렉션 오브 FSRI SRC VB 벡터로부터(Kozlova et al. (2010) Environ. Sci. Technol. 44:5121-5126) 얻을 수 있거나; 또는 모스크바 이바노프스키 바이러스 연구소로부터 얻을 수 있다(C0355 K0602; AgranOVki et al. (2006) Atmospheric Environment 40:3924-3929). 그것은 또한 그것이 USSR에서 및 아시아와 인도 전역에서 백신 접종에 사용된 백신 스트레인이었기 때문에, 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 스트레인은 이제 연구자들에 의해 사용되고 잘 알려져 있다(예컨대, Altshteyn et al. (1985) Dokl. Akad. Nauk USSR 285:696-699; Kutinova et al. (1994) Arch. Virol. 134:1-9; Kutinova et al. (1995) Vaccine 13:487-493; Shchelkunov et al. (1993) Virus Research 28:273-283; Sroller et al. (1998) Archives Virology 143:1311-1320; Zinoviev et al., (1994) Gene 147:209-214; 및 Chkheidze et al. (1993) FEBS 336:340-342 참조). LIVP 바이러스 스트레인은 세포주에서의 반복 계대를 통한 LIVP의 증식에 의해 얻어지는 임의의 바이러스 스트레인 또는 바이러스 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "변형된 바이러스"는 바이러스의 모 스트레인에 비교하여 변경된 바이러스를 나타낸다. 전형적으로 변형된 바이러스는 바이러스 게놈에 하나 이상의 절단, 돌연변이, 삽입 또는 결실을 가진다. 변형된 바이러스는 변형된 하나 이상의 내인성 바이러스 유전자 및/또는 변형된 하나 이상의 유전자내 영역을 가질 수 있다. 예시의 변형된 바이러스는 바이러스 게놈에 삽입된 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 가질 수 있다. 변형된 바이러스는 이종성 유전자의 발현을 위해 유전자 발현 카세트 형태로 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포 비히클", "운반체 비히클", 세포-기반 전달 비히클" 및 "세포-기반 비히클"과 상호교환적으로 사용된 용어 "운반 세포"는 바이러스일 수 있거나 바이러스로 감염된 또는 그렇지 않으면 바이러스와 관련된, 예컨대 바이러스와 표면 단백질 사이의 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해, 또는 세포의 세포질 또는 핵의 바이러스로의 감염에 의해 감염되거나 관련된 임의의 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 세포의 특성을 변경시키기 위해 "감작된" 또는 "세포를 감작시키는 것"은, 일반적으로 사용 전에, 세포의 특성을 변형시키기 위한 작용제로의 처리에 의해, 예컨대 유전자 발현을 유도함으로써 세포를 처리하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 특정 세포 운반체(또한 본원에서 세포 비히클로서 언급됨)와 운반 세포 및 바이러스로 치료될 암을 가진 대상체 사이의 매치는 세포 운반체가 바이러스를 대상체의 종양에 전달하기 위해 대상체의 면역 체계를 회피하기 위해 숙주의 면역 체계와 충분히 적합한 것을 의미한다. 치료될 대상체에 매칭된 매칭된 운반 세포를 확인하기 위한 검정이 본원에 제공된다. 운반 세포는 또한 바이러스에 매칭될 수 있고, 이때 매칭된 바이러스는 세포에서 복제할 수 있다. 바이러스와 매칭된 운반 세포는 만약 바이러스가 세포에서 증폭/복제하고 세포가 바이러스를 대상체의 종양에 전달한다면 대상체에 투여하기 위한 매치이다. 운반 세포/바이러스 조합을 선택하기 위한 검정이 또한 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바, 운반 세포에서 바이러스의 증폭은 세포에서 바이러스를 유지하거나 바이러스의 양을 증가시키기 위하여 세포에서 바이러스가 복제하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "숙주 세포" 또는 "표적 세포"는 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "조직"은 유기체 내에서 특정 기능을 수행하기 위해 일반적으로 작용하는 유사한 세포의 그룹, 집합 또는 응집체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어, "치료 유전자 생성물" 또는 "치료 폴리펩타이드" 또는 "치료제"는 질환 또는 장애의 증상을 개선하거나 질환 또는 장애를 개선하는 치료용 바이러스에 의해 발현된 임의의 이종성 단백질을 나타낸다. 치료제는, 한정하는 것은 아니지만, 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하는, 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 활성화될 수 있는, 또는 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 또 다른 작용제를 활성화하는 모이어티를 포함한다. 선택적으로, 치료제는 추가적인 특성, 예컨대, 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이, 영상화제로서의 그것의 용도를 허용하는 특성을 나타내거나 표시할 수 있다. 예시의 치료제로는, 예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 감광제, 방사성 핵종, 독소, 항-대사산물, 신호전달 조절제, 항암 항생물질, 항암 항체, 혈관형성 억제제, 화학요법 화합물 또는 이것들의 조합을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 치료제는 질환 또는 장애의 증상을 개선하거나 질환 또는 장애를 개선하는 작용제이다. 치료제, 치료 화합물, 또는 치료 양생법은 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있고 본원의 다른 곳에서 기술된, 치료 또는 예방을 위한 백신(즉, 특정 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는)을 포함한, 종래의 약물 및 약물 요법을 포함한다. 신생물 질환의 치료를 위한 치료제는, 한정하는 것은 아니지만, 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하는, 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 활성화될 수 있는, 또는 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 또 다른 작용제를 활성화하는 모이어티를 포함한다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 치료제는, 예를 들어, 항암제일 수 있다. 예시의 치료제로는, 예를 들어, 치료용 미생물, 예컨대 치료용 바이러스 및 박테리아, 사이토카인, 성장 인자, 감광제, 방사성 핵종, 독소, 항대사산물, 신호전달 조절제, 항암 항생물질, 항암 항체, 혈관형성 억제제, 방사선 요법, 화학요법 화합물 또는 이것들의 조합을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 종양 세포 또는 암 세포는 성장 및 분할이 조절되지 않거나 제어되지 않기 때문에 비정상적으로 분할하고 재생하는 세포, 즉 제어되지 않은 성장을 하기 쉬운 세포를 나타낸다. 종양 세포는 양성 또는 악성 세포일 수 있다. 전형적으로, 종양 세포는 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있는 악성 세포이며, 그 과정은 전이로서 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 제제 또는 바이러스 조성물은 생체내에서 또는 배양 시스템의 시험관내에서 바이러스 스트레인, 예를 들어 백시니아 바이러스 스트레인, 백시니아 바이러스 클론성 스트레인 또는 변형된 또는 재조합 바이러스 스트레인의 증식에 의해 얻어진 바이러스 조성물을 나타낸다. 예를 들어, 백시니아 바이러스 제제는 전형적으로 기술분야에 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 배양 시스템으로부터의 정제시에, 숙주 세포에서 바이러스 스트레인의 증식에 의해 얻어진 바이러스 조성물을 나타낸다. 바이러스 제제는 일반적으로 많은 바이러스 입자 또는 비리온으로 구성된다. 필요하다면, 샘플 또는 제제 중의 바이러스 입자의 수는 샘플 단위 부피당 플라크 형성 단위의 수(pfu/mL)를 계산하기 위한 플라크 검정을 사용하여 측정될 수 있고, 이때 형성된 각각의 플라크는 하나의 감염성 바이러스 입자를 나타낸다고 가정한다. 제제의 각각의 바이러스 입자 또는 비리온은 다른 바이러스 입자와 비교하여 동일한 게놈 서열을 가질 수 있거나(즉, 제제는 서열이 동질성임) 또는 상이한 게놈 서열을 가질 수 있다(즉, 제제는 서열이 이질적임). 기술분야의 숙련된 사람들에게는, 클론성 분리의 부재시에, 바이러스 게놈의 이질성 또는 다양성이 바이러스가 재생됨에 따라, 예컨대 바이러스 스트레인의 자연적인 선택 과정에서 일어나는 상동성 재조합 사건에 의해 일어날 수 있는 것으로 이해된다(Plotkin & Orenstein(eds) "Recombinant Vaccinia Virus Vaccines" in Vaccines, 3rd edition (1999)).
본원에서 사용되는 바, 플라크 형성 단위(pfu) 또는 감염 단위(IU)는 감염성 또는 살아있는 바이러스의 수를 나타낸다. 그것은 따라서 제제 중의 활성 바이러스의 양을 반영한다. pfu는 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 표준 검정인 바이러스 플라크 검정(플라크 형성 검정) 또는 종점 희석 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 나노입자는 1 또는 약 1 내지 1000 나노미터(nm), 예컨대 1 내지 100 nm의 미시적 크기이고 수송 및 특성의 관점에서 전체 유닛으로서 작동하는 분자 또는 작용제의 전달을 위한 콜로이드성 입자를 나타낸다. 나노입자는 크기가 균일한 것을 포함한다. 나노입자는 외부에 부착된 표적화 분자를 함유하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "표적화 분자" 또는 "표적화 리간드"는 특정 세포, 조직 또는 장기로의 국지화를 지시하는 임의의 분자 신호를 나타낸다. 표적화 리간드의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 세포 표면 분자에 결합하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 그것의 일부분, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 기타 그러한 모이어티를 들 수 있다. 예를 들어, 표적화 리간드는 표적 세포 상에서 선택적으로 발현된 항원에 대해 지시된 세포 표면 수용체 또는 항체에 결합하는 단백질 또는 그것의 일부분을 포함한다. 표적화 리간드로는, 한정하는 것은 아니지만 성장 인자, 사이토카인, 부착 분자, 신경펩타이드, 단백질 호르몬 및 단일 사슬 항체(scFv)를 들 수 있다.
본원의 목적에 대해, "항체"(예컨대, 예를 들어 면역 반응의 억제를 위해 고갈되거나 억제될 T 세포, γδ(gd) T 세포, NK 세포, NKT 세포와 같은 면역 세포 집단 상에서 발현된 항원에 대해 지시된 항체)의 열거는 전장 항체 및 항체 단편을 포함한 그것의 일부분을 포함한다. 항체 단편으로는, 한정하는 것은 아니지만, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화 결합 Fv(dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일 사슬 Fvs(scFv), 단일 사슬 Fab(scFab), 디아바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편을 들 수 있다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 인간 항체, 비인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 인트라바디를 포함한다. 본원에 제공된 항체는 임의의 면역글로불린 타입(예컨대, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류(예컨대, IgG2a 및 IgG2b)의 구성원을 포함한다.
항체, 예컨대 단클론성 항체는 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예컨대, Kohler et al., Nature 256:495-497(1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976); 및 WO 02/46455 참조). 예를 들어, 동물은 항체-분비 체세포성 세포를 생성하기 위해 표준 방법에 의해 면역화된다. 그런 후 이들 세포는 골수종 세포에의 융합을 위해 면역화된 동물로부터 제거된다. 항체, 특히 B 세포를 생성하는 체세포성 세포는 골수종 세포주와의 융합에 사용될 수 있다. 이러한 체세포성 세포는 프라이밍된 동물의 림프절, 비장 및 말초혈로부터 유래될 수 있다. 특수화된 골수종 세포주가 하이브리도마-생성 융합 과정에 사용하기 위하여 림프구성 종양으로부터 개발되었다(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976); Shulman et al., Nature, 276:269-282(1978); Volk et al., J. Virol., 42:220-227(1982)). 이들 세포주는 3가지 유용한 특성을 가진다. 첫 번째는 그것을 하이브리도마의 성장을 지지하는 선택 배지에서 성장할 수 없게 만드는 효소 결핍을 가짐으로써 그것이 융합되지 않고 유사하게 무한하게 자체 증식하는 골수종 세포로부터 융합된 하이브리도마의 선택을 용이하게 한다는 것이다. 두 번째는 그것이 항체를 생성하는 능력을 가지며 내인성 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린을 생성할 수 없다는 것이다. 세 번째 특성은 그것이 다른 세포와 효율적으로 융합한다는 것이다. 하이브리도마 및 단클론성 항체를 제조하는 다른 방법이 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 임의의 폴리펩타이드, 예컨대 면역 세포 집단 상의 항원성 마커에 대해 항체를 생성하는 것은 일상적이다.
예시의 면역 세포 고갈 항체로는, 한정하는 것은 아니지만:
- 마우스에서 생체내에서 및 인간을 포함한 다양한 종에서, 시험관내에서 NK 세포를 고갈시키는 항-아시알로 GM1(Thermofisher Scientific);
- 마우스에서 NK 세포를 고갈시키고, 또한 NKT 세포를 고갈시키는 항-NK1.1;
- NK 세포를 고갈시키기 위한 OKM1(항-CD11b, 인간) 및 B73.1(항-CD16, 인간) 항체(Strassmann et al., J. Immunol., 130(4):1556-60(1983));
- NK 세포를 고갈시키기 위한 DJ130c 또는 3G8(항-CD16, 인간) 항체(Choi et al., Immunology, 124(2): 215-222(2008));
- γδ(gd) T 세포를 차단하는 IMMU510 또는 B1.1(항-TCRγδ). 또한, 수용체 차단을 위해, γδ PBL은 차단 항체 항-NKp30(클론 F252), 항-NKp44(클론 KS38), 항-NKp46(클론 KL247), 항-TCRγδ(Beckman Coulter, 클론 IMMU510 또는 B1.1), 또는 항-Vδ1 TCR(Fisher Scientific, 클론 TCS1 또는 TS8.2)과 함께 인큐베이션되었다(Correia et al., Blood, 118:992-1001(2011));
- B1 항체는 TCR의 항원-매개 활성화를 차단한다;
- GL3 및 UC7-13D5 항체는 γδ(gd) T 세포를 고갈시키거나 또는 그것을 마우스에서 생체내에서 내재화한다(Koenecke et al., Eur. J. Immunol., 39(2):372-9(2009));
- 항-CD1d, 클론 1B1는 마우스에서 NKT 세포를 고갈시킨다(Christaki et al., J. Immunol. Res., 2015, Article ID 532717);
- NKTT120은 인간에서 iNKT 세포를 고갈시킨다. NKTT120은 신속하고 특이적으로 iNKT 세포를 고갈시키는 잠재력을 가진 Vα24-Jα18 유전자 재배열된 불변 TCR에 대해 표적화된 인간화된 IgG1κ 단클론성 항체이다(Field et al., PLoS One, 12,2.e0171067(2017)).
본원에서 사용되는 바, 투여용 전달 비히클은 숙주 대상체에의 전달을 위해 작용제, 예컨대 본원에서 제공된 바이러스와 회합하는 지질-기반 또는 다른 중합체-기반 조성물, 예컨대 리포좀, 미셸 또는 역미셸을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 특정 조직에서 바이러스의 축적은 바이러스가 숙주의 장기 또는 조직을 감염시키기에 충분히 긴, 바이러스를 숙주에게 투여한 후 일정 시간 후에 숙주 유기체의 특정 조직에서 바이러스의 분포 또는 콜로니화를 나타낸다. 기술분야의 숙련된 사람이 인식하게 되는 것과 같이, 바이러스의 감염을 위한 시간은 바이러스, 감염된 장기(들) 또는 조직(들), 숙주의 면역능력, 및 바이러스의 투여량에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 축적은 바이러스로의 감염 후 약 1일 미만, 약 1일 내지 약 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 약 1주 내지 약 2, 3, 또는 4주, 약 1개월 내지 약 2, 3, 4, 5, 6개월 또는 그 이상의 시점에 측정될 수 있다. 본원의 목적에 대해, 바이러스는 우선적으로 숙주의 면역특권 조직, 예컨대 염증이 생긴 조직 또는 종양 조직에서 축적되지만, 다른 조직 및 장기, 예컨대 비종양 조직으로부터 바이러스의 독성이 약해지거나 허용적이고 최대한 치명적이지 않을 정도로 정화된다.
본원에서 사용되는 바, "우선적 축적"은 제2 위치에서의 축적보다 더 높은 수준으로 제1 위치에서의 바이러스의 축적을 나타낸다(즉, 제1 위치에서의 바이러스 입자의 농도, 또는 역가는 제2 위치에서의 바이러스 입자의 농도보다 높다). 그러므로, 정상 조직 또는 장기에 비해 면역특권 조직(면역 체계로부터 보호되는 조직), 예컨대 염증이 생긴 조직, 및 종양 조직에서 우선적으로 축적하는 바이러스는 면역특권 조직, 예컨대 종양에서, 정상 조직 또는 장기에서 축적하는 바이러스보다 더 높은 수준(즉, 농도 또는 바이러스 역가)으로 축적하는 바이러스를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 활성은 본원에 제공된 화합물 또는 바이러스의 시험관내 또는 생체내 활성을 나타낸다. 예를 들어, 생체내 활성은 본원에 제공된 화합물 또는 바이러스(또는 조성물 또는 그것의 다른 혼합물)의 생체내 투여 후에 결과로 나타나는 생리적 반응을 나타낸다. 그러므로, 활성은 그러한 화합물, 조성물 및 혼합물의 결과적인 치료 효과 및 제약학적 활성을 포함한다. 활성은 그러한 활성을 테스트하거나 사용하기 위해 설계된 시험관내 및/또는 생체내 시스템에서 관찰될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항종양 활성" 또는 "항종양원성"은 시험관내에서 또는 대상체에서 생체내에서 종양의 형성 또는 성장을 방지 또는 억제하는 바이러스 스트레인을 나타낸다. 항종양 활성은 항종양 활성을 가리키는 파라미터 또는 파라미터들을 평가함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 항종양 활성 또는 항-종양원성과 관련하여 "더 큰" 또는 "개선된" 활성은 바이러스 스트레인이 참조 또는 대조군 바이러스보다 더 큰 정도로 또는 바이러스로의 치료가 없을 때보다 더 큰 정도로 시험관내에서 또는 대상체에서 생체내에서 종양의 형성 또는 성장을 방지하거나 억제할 수 있는 것을 의미한다. 항종양 활성이 "더 큰" 또는 "개선된" 것인지는 항종양 활성을 가리키는 파라미터에 미치는 바이러스 및, 필요하다면, 대조군 또는 참조 바이러스의 영향을 평가함으로써 측정될 수 있다. 둘 이상의 상이한 바이러스의 활성을 비교할 때, 시험관내 검정에 사용된 또는 생체에 투여된 바이러스의 양(예컨대, pfu)은 동일하거나 유사하고, 시험관내 검정 또는 생체내 평가의 조건(예컨대, 생체내 투여 양생법)은 동일하거나 유사한 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스와 관련하여 "독성"(또한 본원에서 병독성 또는 병원성으로 언급됨)은 바이러스의 투여시 숙주에 대한 유해한 또는 독성 영향을 나타낸다. 종양용해 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스의 경우, 바이러스의 독성은 비종양성 장기 또는 조직에서의 그것의 축적과 관련되며, 그것은 숙주의 생존에 영향을 미치거나 유해한 또는 독성 효과를 초래할 수 있다. 독성은 독성을 가리키는 하나 이상의 파라미터를 평가함으로써 측정될 수 있다. 이것들은 비종양성 조직에서의 축적 및 그것이 투여되는 대상체의 생존성 또는 건강에 미치는 영향, 예컨대 체중에 미치는 영향을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "감소된 독성"은 숙주에 대한 바이러스의 투여시 독성 또는 유해한 영향이 바이러스로 치료되지 않은 숙주와 비교하여 또는 또 다른 참조 또는 대조군 바이러스로 투여된 숙주와 비교하여 약해지거나 감소된 것을 의미한다. 독성이 감소되거나 줄어들었는지의 여부는 독성을 가리키는 파라미터에 미치는 바이러스 및, 필요하다면, 대조군 또는 참조 바이러스의 영향을 평가함으로써 측정될 수 있다. 둘 이상의 상이한 바이러스의 활성을 비교할 때, 시험관내 검정에 사용된 또는 생체에 투여된 바이러스의 양(예컨대, pfu)은 동일하거나 유사하고, 시험관내 검정 또는 생체내 평가의 조건(예컨대, 생체내 투여 양생법)은 동일하거나 유사한 것으로 이해된다. 예를 들어, 바이러스 및 대조군 또는 참조 바이러스의 생체내 투여시 영향을 비교할 때 대상체는 동일한 종, 크기, 성별 이고 바이러스는 동일한 또는 유사한 투여 양생법 하에서 동일하거나 유사한 양으로 투여된다. 특히, 감소된 독성을 가진 바이러스는, 예컨대 질환의 치료를 위해 바이러스를 숙주에 투여할 때, 바이러스가 숙주의 비종양성 장기 및 조직에 숙주에 대한 손상 또는 유해를 초래할 정도로, 또는 치료되는 질환보다 큰 정도로 또는 대조군 또는 참조 바이러스 용량보다 큰 정도로 숙주의 생존에 영향을 미치는 정도로 축적되지 않는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 감소된 독성을 가진 바이러스는 치료 과정 동안 대상체의 사망을 초래하지 않는 바이러스를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "대조군" 또는 "표준"은 테스트 파라미터로 처리되지 않는 경우를 제외하고 테스트 샘플에 대해 실질적으로 동일한 샘플을 나타내거나, 또는 만약 혈장 샘플이라면, 그것은 관심 있는 질병에 영향을 받지 않은 정상 지원자로부터 유래될 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다. 예를 들어, 대조군은 알려진 특성 또는 활성을 가지는 샘플, 예컨대 바이러스일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 투약 레지멘(dosing regimen)은 투여된 작용제, 예를 들어, 운반 세포 또는 바이러스 또는 다른 작용제의 양, 및 투여 사이클 과정 동안 투여의 빈도를 나타낸다. 투약 레지멘은 처리될 질환 또는 질병의 함수이며, 따라서 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 투여 빈도는 투여 사이클 동안 투여되는 작용제의 횟수를 나타낸다. 예를 들어, 빈도는 일, 주 또는 개월일 수 있다. 예를 들어, 빈도는 투여 사이클 중에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 7회일 수 있다. 빈도는 투여 사이클 동안 연속일을 나타낼 수 있다. 특정 빈도는 치료된 특정 질환 또는 질병의 함수이다.
본원에서 사용되는 바, "투여 사이클"은 연속적인 투여에 걸쳐 반복되는 바이러스 투여의 투약 레지멘의 반복된 스케줄을 나타낸다. 예를 들어, 예시의 투여 사이클은 28일 사이클이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 면역특권 세포 및 면역특권 조직은 면역 체계로부터 격리되는 세포 및 조직, 예컨대 고형 종양을 나타낸다. 일반적으로, 바이러스의 대상체에의 투여는 대상체로부터 바이러스를 제거하는 면역 반응을 불러일으킨다. 그러나, 면역특권 부위는 면역 반응으로부터 가려지거나 격리되어, 바이러스가 생존하고, 일반적으로 복제하는 것을 허용한다. 면역특권 조직은 증식하는 조직, 예컨대 종양 조직 및 기타 증식성 장애, 상처에 관여하는 기타 조직 및 세포 및 염증성 반응에 관여하는 기타 조직을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 상처 또는 병변은 살아있는 유기체에서 임의의 조직에 대한 임의의 손상을 나타낸다. 조직은 내부 조직, 예컨대 위 내벽(stomach lining) 또는 뼈, 또는 외부 조직, 예컨대 피부일 수 있다. 그로써, 상처 또는 병변은, 한정하는 것은 아니지만, 위장관 궤양, 부서진 뼈, 신생물, 및 절단된 또는 마모된 피부를 포함할 수 있다. 상처 또는 병변은 연조직, 예컨대 비장에, 또는 경조직, 예컨대 뼈에 있을 수 있다. 상처 또는 병변은 외상적 상해, 감염 또는 수술적 개입을 포함한, 임의의 요인에 의해 유발될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 신생물로도 알려져 있는 종양은 세포가 비정상적으로 높은 속도로 증식할 때 유발되는 조직의 비정상적인 덩어리이다. 종양은 구조적 조직화 및 정상 조직과의 기능 조정의 부분적 또는 전체적인 결핍을 보일 수 있다. 종양은 양성(암성이 아님), 또는 악성(암성)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 종양은 고형 종양뿐만 아니라 조혈 종양을 포함하는 것으로 의도된다.
악성 종양은 3개의 주요 유형으로 광범위하게 분류될 수 있다. 암종은 상피 구조(예컨대, 유방, 전립선, 폐, 결장, 및 췌장)로부터 발생하는 악성 종양이다. 육종은 결합 조직, 또는 중간엽 세포, 예컨대 근육, 연골, 지방 또는 뼈로부터 기원하는 악성 종양이다. 백혈병 및 림프종은 면역 체계의 구성요소를 포함한, 조혈 구조(혈액 세포의 형성에 속해있는 구조)에 영향을 미치는 악성 종양이다. 다른 악성 종양으로는, 한정하는 것은 아니지만, 신경계의 종양(예컨대, 신경섬유종), 생식 세포 종양, 및 모세포성 종양(blastic tumor)을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 절제된 종양은 종양의 상당 부분이 삭제된 종양을 나타낸다. 삭제는 수술에 의해 이루어질 수 있다(즉, 수술로 절제된 종양). 절제는 부분적이거나 완전할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 질환 또는 장애는, 예를 들어, 감염 또는 유전자 결합으로부터 유발되며, 확인 가능한 증상을 특징으로 하는 유기체의 병리적 상태를 나타낸다. 본원에서 기술되는 예시의 질환은 신생물 질환, 예컨대 암이다.
본원에서 사용되는 바, 질환 또는 질환 과정에 관여하는 세포는 그것의 존재가 원인에 기여하거나, 원인을 악화시키거나, 또는 그렇지 않으면 질환 또는 질환 과정의 병인학에 관여하는 세포를 나타낸다. 그러한 세포의 억제 또는 살해는 질환의 증상을 개선할 수 있거나 질환을 개선할 수 있다. 그러한 세포의 예는 종양 세포이다. 종양 세포의 성장 또는 증식을 살해 또는 억제하는 것은 종양 치료에 영향을 미친다. 다른 예는 면역 이펙터 세포로, 그것은 다양한 질환의 발병에 기여하는 염증 반응에 참여한다. 면역 이펙터 세포를 억제 또는 살해하는 것은 염증 구성요소를 가지는 질환을 치료할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포의 성장 또는 증식을 살해 또는 억제하는 것"은 세포가 죽거나 제거되는 것을 의미한다. 성장 또는 증식을 억제하는 것은 그러한 세포의 수가 증가하지 않고, 감소할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "종양 세포"는 종양의 일부인 임의의 세포이다. 전형적으로, 본원에 제공된 운반 세포는 우선적으로 종양 세포로 복귀하고 본원에 제공된 바이러스는 정상 세포와 비교하여 대상체의 종양 세포를 우선적으로 감염시킨다.
본원에서 사용되는 바, "전이 세포"는 전이에 대한 잠재력을 가진 세포이다. 전이 세포는 대상체의 제1 종양으로부터 전이하는 능력을 가지며 대상체의 상이한 부위에서 그 부위에서 제2 종양을 형성하기 위해 조직을 콜로니화할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "종양원성 세포"는 대상체의 적합한 부위로 도입될 때, 종양을 형성할 수 있는 세포이다. 세포는 비전이성이거나 전이성일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "정상 세포"는 종양으로부터 유래되지 않는 세포이다.
본원에서 사용되는 바, 신생물 질환은 종양 발생, 성장, 전이 및 진행을 ㅍ포함한, 암을 포함하는 임의의 장애를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 암은 전이성 암, 림프 종양, 및 혈액 암을 포함한, 임의의 유형의 악성 종양에 의해 유발된 또는 그것을 특징으로 하는 질환에 대한 용어이다. 예시의 암으로, 한정하는 것은 아니지만, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 선암종, 선종, 부신암, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌암, 암종, 소뇌 성상세포종, 소뇌 성상세포종/악성 신경교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 상부 원시 신경 외배엽 종양, 시각 경로 또는 시상 하부 신경교종, 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 유암종 종양, 암종, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직형성 작은 원형 세포 종양, 자궁내막 암, 뇌실막세포종. 유표피암 암종, 식도암, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 성선외 생식 세포 종양, 간외 담관암, 안암/안내 흑색종, 안암/망막모세포종, 담낭암, 담석 종양, 위장/위암, 위장 유암종 종양, 위장 기질 종양, 거대 세포 종양, 교모세포종 다형성, 신경교종, 털세포 종양, 두경부암, 심장암, 간세포/간 암, 호지킨 림프종, 과형성, 과형성 각막 신경 종양, 제자리 암종, 하인두암, 장의 신경절신경종, 섬 세포 종양, 카포시 육종, 신장/신장 세포 암, 후두암, 평활근종 종양, 입술 및 구강 암, 지방육종, 간암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 림프종, 거대글로불린혈증, 악성 유암종, 뼈의 악성 섬유성 조직구종, 악성 고칼슘혈증, 악성 흑색종, 마파노이드 습관성 종양, 수질 암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 피부 암종, 전이성 편평 경부암, 구강암, 점막 신경종, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수형성이상 증후군, 골수종, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 경부암, 신경 조직암, 신경모세포종, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 난소 상피 종양, 난소 생식 세포 종양, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아세포종, 송과체모세포종, 뇌하수체 선종, 흉막폐 모세포종, 진성 적혈구증가증, 원발성 뇌 종양, 전립선암, 직장암, 신장 세포 종양, 세망 세포 육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘 암, 정상피종, 세자리(Sezary) 증후군, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부 암종, 위암, 상부 원시 신경 외배엽 종양, 고환암, 후두암, 흉선종, 갑상선암, 국소 피부 병변, 영양막 종양, 요도암, 자궁/자궁내막 암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 빌림스 종양을 들 수 있다. 인간에서 흔히 진단되는 예시의 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 방광, 뇌, 유방, 골수, 자궁 경부, 결장/직장, 신장, 간, 폐/기관지, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 갑상선, 또는 자궁의 암을 들 수 있다. 개, 고양이, 및 다른 애완동물에서 흔히 진단되는 예시의 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 림프육종, 골육종, 유선 종양, 비만세포종, 뇌 종양, 흑색종, 선편평세포 암종, 유암종 폐 종양, 기관지샘 종양, 소기관지 선암종, 섬유종, 점액 연골종, 폐 육종, 신경육종, 골종, 유두종, 망막모세포종, 유잉 육종, 빌름스 종양, 버킷 림프종, 미세신경교종, 신경모세포종, 파골세포종, 구강 신생물, 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종, 생식기 편평 세포 암종, 전파성 성 종양, 고환 종양, 정상피종, 세르톨리 세포 종양, 혈관주위세포종, 조직구종, 녹색종(예컨대, 과립구성 육종), 각막 유두종, 각막 편평 세포 암종, 혈관육종, 흉막 중피종, 기저 세포 종양, 흉선종, 위 종양, 부신 선 암종, 경구 유두종증, 혈관내피종 및 낭생종, 여포성 림프종, 장 림프육종, 섬유육종 및 폐 편평 세포 암종을 들 수 있다. 설치류, 예컨대 페럿에서 진단되는 예시의 암으로는, 한정하는 것은 아니지만, 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌장 섬 세포 종양, 위 MALT 림프종 및 위 선암종을 들 수 있다. 농업용 가축에 영향을 미치는 예시의 신생물로는, 한정하는 것은 아니지만, 백혈병, 혈관주위세포종 및 소 눈의 신생물(소에서); 포피 섬유육종, 궤양성 편평 세포 암종, 포피 암종, 결합 조직 신생물 및 비만세포종(말에서); 간세포 암종(돼지에서); 림프종 및 폐 선종증(양에서); 폐 육종, 림프종, 라우스 육종, 망상 내피증, 섬유육종, 신모세포종, B-세포 림프종 및 림프성 백혈병(조류 종에서); 망막모세포종, 간 신생물, 림프육종(림프모세포성 림프종), 형질세포성 백혈병 및 수영 방광 육종(어류에서), 기회성 림프절염(CLA): 박테리아 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스에 의해 유발된 양 및 염소의 만성, 감염성, 전염성 질환, 및 양 폐 선암종(jaagsiekte)에 의해 유발된 양의 전염성 폐 종양을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "전이"는 신체의 한 부분으로부터 다른 부분으로의 암의 확산을 나타낸다. 예를 들어, 전이 과정에서, 악성 세포는 악성 세포가 발생하는 원발성 종양의 부위로부터 확산되어 림프관 및 혈관으로 이동할 수 있고, 그것들은 세포를 유기체의 다른 곳에 있는 정상 조직으로 수송하여 그곳에서 세포가 계속해서 증식된다. 전이에 의해 확산된 세포에 의해 형성된 종양은 "전이성 종양", "이차 종양" 또는 "전이"로 불린다.
본원에서 사용되는 바, 항암제 또는 항암 화합물("항종양 또는 항신생물제"와 상호교환적으로 사용됨)은 항암 치료에 사용된 임의의 작용제 또는 화합물을 나타낸다. 이것들은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료와 함께 사용될 때, 신생물 질환, 종양 및 암과 관련된 임상 증상 또는 진단 마커를 완화, 감소, 개선, 방지, 또는 대체시킬 수 있거나 또는 임상 증상의 관해 상태를 유지할 수 있고, 본원에 제공된 방법, 조합 및 조성물에 사용될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 항암제는 항전이제를 포함한다. 예시의 항암제로는, 한정하는 것은 아니지만, 화학요법 화합물(예컨대, 독소, 알킬화제, 니트로소우레아, 항암 항생물질, 항대사산물, 유사분열 방지제, 토포아이소머라제 억제제), 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 감광제, 방사성 핵종, 신호전달 조절제, 항암 항체, 항암 올리고펩타이드, 항암 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스 RNA 및 siRNA), 혈관형성 억제제, 방사선 요법, 또는 이것들의 조합을 들 수 있다. 예시의 화학요법 화합물로는, 한정하는 것은 아니지만, Ara-C, 시스플라틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 독소루비신, 겜시타빈, 캄프토테신, 이리노테칸, 사이클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 빈크리스틴, 5-플루오로우라실, 및 메토트렉세이트를 들 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 항암 또는 화학치료제에 대한 언급은 다르게 표시되지 않는 한 항암 또는 화학치료제의 조합 또는 다수의 항암 또는 화학치료제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 대상체는 그것에 대해 진단, 스크리닝, 모니터링 또는 치료가 고려되는 동물을 포함한, 임의의 유기체를 포함한다. 동물로는 영장류 및 가축 동물과 같은 포유류를 들 수 있다. 예시의 영장류는 인간이다. 환자는 질환 상태로 영향을 받았거나 질환 상태가 측정될 또는 질환 상태의 위험이 측정될 대상체, 예컨대 포유류, 영장류, 인간, 또는 가축 대상체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 환자는 질환 또는 장애의 증상을 나타내는 인간 대상체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 질병, 장애 또는 질환을 가진 대상체의 치료는 질병, 장애 또는 질환의 증상이 개선되거나 또는 그렇지 않으면 유익하게 변경되는 임의의 치료 방식을 의미한다. 치료는 본원에서 기술되고 제공된 바이러스의 임의의 제약학적 용도를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 종양 또는 전이를 포함한, 신생물 질환을 가진 대상체의 치료는 신생물 질환을 가진 증상이 개선되거나 또는 그렇지 않으면 유익하게 변경되는 임의의 치료 방식을 의미한다. 전형적으로, 대상체에서 종양 또는 전이의 치료는 종양의 혈관신생의 억제, 종양 세포 분할, 종양 세포 이동 또는 기저막 또는 세포외 기질의 분해를 포함한, 종양 성장의 둔화, 종양 세포의 용해, 종양의 크기의 감소, 새로운 종양 성장의 방지, 또는 원발성 종양의 전이의 방지를 초래하는 임의의 치료 방식을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 치료 효과는 질환 또는 질병의 증상을 변경시키는, 전형적으로 개선하거나 완화시키는 또는 질환 또는 질병을 치유하는 대상체의 치료로부터 유발되는 효과를 의미한다. 치료적 유효량은 대상체에게 투여 후 치료 효과를 초래하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 예컨대 특정 제약학적 조성물의 투여에 의한 특정 장애의 증상의 개선 또는 완화는 영구적이거나 일시적이거나, 지속적이거나 일시적이든간에, 조성물의 투여에 기인할 수 있는 또는 조성물의 투여와 관련될 수 있는 임의의 감소를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 효능은 바이러스 또는 바이러스 조성물의 투여시, 바이러스가 증식하는 또는 면역특권 세포, 예컨대 종양 세포를 콜로니화하고, 복제할 것을 의미한다. 종양 세포에서의 콜로니화 및 복제는 치료가 효과적인 치료이거나 효과적인 치료가 될 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 세포 운반체/바이러스로의 효과적인 치료는 그것을 사용한 치료가 없을 때와 비교하여 생존을 증가시킬 수 있는 것이다. 예를 들어, 바이러스는 만약 그것이 질환을 안정화시키거나, 종양 퇴행을 유발하거나, 질환의 중증도를 감소시키거나 또는 종양의 전이화를 둔화 또는 감소시킨다면 효과적인 치료이다.
본원에서 사용되는 바, 특정 질환을 치료하기 위한 바이러스 또는 화합물의 유효량, 또는 치료적 유효량은 그 질환과 관련된 증상을 개선하기 위한, 또는 일부 방식으로 감소시키기 위한 양이다. 그 양은 개인별로 달라질 것이고, 한정하는 것은 아니지만, 연령, 체중, 환자의 전체적인 신체 조건 및 질환의 중증도를 포함한 많은 인자에 따라 좌우될 것이다. 치료적 유효량은 단일 투여량으로서 투여되거나 또는 양생법에 따라 다중 투여량으로 투여될 수 있음으로써 효과적이다. 양은 질환을 치유할 수 있지만, 전형적으로, 질환의 증상을 개선하기 위하여 투여된다. 원하는 증상의 개선을 이루기 위하여 반복 투여가 필요할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 종양 또는 전이를 포함한, 신생물 질환을 치료하기 위한 바이러스 또는 화합물의 유효량, 또는 치료적 유효량은, 한정하는 것은 아니지만, 종양 성장의 둔화, 종양 세포의 용해, 종양 크기의 감소, 새로운 종양 성장의 방지, 또는 원발성 종양의 전이의 방지를 포함한, 신생물 질환과 관련된 증상을 개선, 또는 일부 방식에서는 감소시키기 위한 양이다.
본원에서 사용되는 바, "조성물"은 둘 이상의 생성물 또는 화합물의 임의의 혼합물을 나타낸다. 그것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성, 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 제형은 적어도 하나의 활성 제약학적 작용제 또는 치료제 및 하나 이상의 부형제를 함유하는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 공동 제형은 둘 이상의 활성 또는 제약학적 작용제 또는 치료제 및 하나 이상의 부형제를 함유하는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 조합은 둘 이상의 대상 사이의 또는 중의 임의의 연합을 나타낸다. 조합은 둘 이상의 별도 대상, 예컨대 두 조성물 또는 두 집합일 수 있고, 이것들의 혼합물, 예컨대 둘 이상의 대상, 또는 이것들의 임의의 변화의 단일 혼합물일 수 있다. 조합의 요소는 일반적으로 기능적으로 회합되거나 관련된다. 예시의 조합으로는, 한정하는 것은 아니지만, 둘 이상의 제약학적 조성물, 둘 이상의 활성 성분, 예컨대 2개의 바이러스, 또는 바이러스와 항암제, 예컨대 화학치료 화합물, 둘 이상의 바이러스, 바이러스와 치료제, 바이러스와 영상화제, 바이러스와 복수의 치료제 및/또는 영상화제, 또는 이것들의 임의의 회합을 함유하는 조성물을 들 수 있다. 이러한 조합은 키트로서 포장될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 직접 투여는 희석 없는 조성물의 투여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 키트는 선택적으로, 조합의 사용을 위한 설명서 및/또는 그러한 사용을 위한 다른 반응 및 구성요소를 포함한 포장된 조합이다.
본원에서 사용되는 바, "제조 물품"은 제조되고 판매되는 제품이다. 본 출원 전체에서 사용되는 바, 용어는 운반 세포 및 단독 또는 이차 치료법 또는 동일한 또는 별도의 포장 물품에 함유된 치료 에너지 공급원과 조합된 백시니아 바이러스를 함유하는 물품을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 장치는 특정 과업을 위해 만들어진 또는 적응된 것을 나타낸다. 본원에서 예시의 장치는 표피 또는 피부의 표면을 덮는 또는 감싸는 또는 접촉할 수 있는 장치이다. 이러한 장치의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 랩, 붕대, 바인딩, 드레스, 봉합, 패치, 거즈 또는 드레싱을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 단수를 나타내는 단어 형태는 맥락이 분명하게 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 범위 및 양은 "약" 또는 "대락" 특정 값 또는 범위로서 표시될 수 있다. "약" 또는 "대락"은 또한 정확한 양을 포함한다. 그러므로, "약 5 밀리리터"는 "약 5 밀리리터"와 또한 "5 밀리리터"를 의미한다. 일반적으로 "약"은 실험 오차 내에 있을 것으로 예상할 수 있는 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "거의 동일한"은 기술분야의 숙련된 사람이 동일하거나 허용되는 오차 범위 내에 있을 것으로 간주할 수 있을 양 내에 있음을 의미한다. 예를 들어, 전형적으로, 제약학적 조성물의 경우, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 내에 있는 것은 거의 동일한 것으로 간주된다. 이러한 양은 대상체에 의한 특정 조성물의 변화에 대한 허용도에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "선택적인" 또는 "선택적으로"는 계속해서 기술된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 것과, 그 기술이 상기 사건 또는 상황이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 임의의 보호기, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는, 다르게 표시되지 않는 한, 그것들의 통상적인 용법, 인식된 약어, 또는 생화학적 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회를 따른다((1972) Biochem. 11:1726 참조).
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명(들)이 속하는 기술분야에 숙련된 사람에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원의 전체 개시 전체에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 출판물, 웹사이트 및 기타 공개된 자료는, 그 전문이 참조로 포함된다. 본원의 용어에 대해 복수의 정의가 있는 경우에, 본 섹션에서의 정의가 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소에 대한 언급이 있는 경우, 그러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷 상의 특정 정보는 들어오거나 나갈 수 있지만, 동등한 정보가 알려져 있고 인터넷 검색에 의해 및/또는 적절한 데이터베이스에 의해 쉽게 접근될 수 있는 것이 이해된다. 그것에 대한 언급은 그러한 정보의 이용성 및 대중적인 파급을 증명한다.
본원에서 사용되는 바, "동종 세포"는 그것이 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터 유래되기 때문에 특정 대상체와 관련하여 유전적으로 상이한 세포이다. 예를 들어, 동종 줄기 세포는 환자(또는 동일한 쌍둥이) 이외의 도너로부터 유래된 줄기 세포이다.
본원에서 사용되는 바, "자가 세포"는 동일한 개체, 예를 들어 치료될 대상체(즉, 환자)로부터 얻어진 세포이다. 예를 들어, 자가 줄기 세포는 환자로부터 유래된 줄기 세포이다.
본원에서 사용되는 바, 세포 비히클 또는 운반 세포와 관련하여, 용어 "조작된"은 세포의 유전자 변형을 나타내어서, 그것은 세포의 성능을 개선 또는 향상시킬 수 있는 단백질을 발현한다. 예를 들어, 세포는 개선된 바이러스 증폭 및/또는 개선된 면역조절을 위해 조작될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역조절"은 면역 반응이, 예를 들어 면역 반응을 유도, 향상 또는 억제함으로써 원하는 수준으로 변형된 임의의 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "'면역 억제" 또는 "면역억제"는 면역 반응의 억제 또는 감소를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "면역 특권이 있는" 또는 "면역특권"은 면역 반응을 유도하지 않고 면역 체계를 회피할 수 있는 세포 또는 조직을 나타낸다. 면역특권 세포 및 조직은 종양의 면역억제 특성에 의해 면역 체계로부터 격리되는 세포 및 조직, 예컨대 고형 종양 및 종양 미세환경을 나타낸다. 그 결과로서, 종양용해 바이러스는 종양 미세환경의 종양에서 우선적으로 축적되는데, 왜냐하면 그것이 면역 체계로부터 가려지기 때문이다. 그러나 면역특권 조직 및 세포는 면역 반응으로부터 가려지거나 격리되어서, 바이러스가 생존하고 일반적으로 복제하는 것이 허용된다.
본원에서 사용되는 바, 종양용해 바이러스는 종양 세포에서 선택적으로 복제하는 바이러스를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "질환 또는 장애"는, 예컨대, 감염 또는 유전자 결함으로부터 유발되고, 확인 가능한 증상을 특징으로 하는 유기체의 병리적 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 암은 임의의 유형의 악성 종양 또는 혈액 악성종양, 예컨대 백혈병에 의해 유발되고 그것을 특징으로 하는 질환에 대한 일반적인 용어이다.
본원에서 사용되는 바, 종양에 적용되는 것과 같이, 악성은 성장 제어 및 위치 제어가 상실된, 전이 능력을 가진 원발성 종양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 전이는 병적인 과정에 의해 주로 포함된 부위로부터 떨어져서 비정상적인 또는 신생물 세포가 성장하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 항암제 또는 항암 화합물("항-종양 또는 항-신생물제"와 상호교환적으로 사용됨)은 항암 치료에 사용된 임의의 작용제 또는 화합물을 나타낸다. 이것들은 단독으로 또는 다른 화합물과 함께 사용될 때, 신생물 질환, 종양 및 암과 관련된 임상 증상 또는 진단 마커를 완화, 감소, 개선, 방지, 또는 대체시킬 수 있거나 또는 임상 증상의 관해 상태를 유지할 수 있고, 본원에 제공된 방법, 조합 및 조성물에 사용될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 감염과 관련하여 "내성"은 바이러스에 노출시 바이러스로 감염되지 않은, 또는 매우 낮은 정도로 바이러스로 감염된 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 감염과 관련하여 "허용되는"은 바이러스에 노출시 쉽게 감염되는 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "하플로타입"은 함께 유전된 DNA 변이 또는 다형성 세트이며, 동일한 염색체 상에 위치한 대립유전자 그룹 또는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 세트를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "매칭된 하플로타입"은 도너의 하플로타입이 수령체 또는 환자의 면역 체계와 충분히 적합하여 수령체의 면역 체계를 회피할 수 있도록 하는, 도너의 하플로타입과 수령체 또는 환자의 하플로타입 사이의 면역학적 적합성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "미스매칭된 하플로타입"은 도너의 하플로타입이 수령체 또는 환자의 면역 체계와 충분히 적합하지 못하고 도너 세포가 수령체의 면역 체계를 회피할 수 없게 하는, 도너의 하플로타입과 수령체 또는 환자의 하플로타입 사이의 면역학적 부적합성을 나타낸다. "면역손상 미스매치"는 본원에 제공된 매칭 검정 방법에 의해 측정되는 바 % 적합성의 상당한(예컨대, 10% 이상) 감소와 관련된, 유전자 다형성 유전자좌에서의 대상체와 운반 세포 사이의 미스매치로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, 면역학적으로 적합한은 바이러스를 대상체의 종양 또는 암성 세포에 전달하기에 충분한 시간 동안 대상체의 면역 체계를 회피하기 위해, 대상체/숙주의 면역 체계와 충분히 적합한 세포 또는 바이러스를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "공동 배양"은 세포의 둘 이상의 상이한 집단이 성장하는 세포 배양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 세포와 관련하여, 용어 "로딩"은 세포와 세포 표면 또는 세포 내부의 작용제 사이의 화학적 또는 물리적 상호작용을 통한, 세포와 작용제, 예컨대 바이러스, 소분자, 치료제, 항체 등과의 회합을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 지방-유래 줄기 세포 또는 ADSC는 도너의 지방 조직으로부터 얻어진 중간엽 줄기 세포이다
본원에서 사용되는 바, 말초혈 단핵 세포 또는 PBMC는 둥근 핵을 가진 임의의 말초혈 세포, 예를 들어, 림프구, 단핵 세포 또는 대식세포이다.
본원에서 사용되는 바, "L14 VV"는 백시니아 바이러스의 TK-삽입된 터보-FP635 조작된 LIVP 스트레인이다.
본원에서 사용되는 바, "ACAM2000"으로도 불리는 "WT1"은 백시니아 바이러스의 야생형 티미딘 키나제(TK)-양성 와이어스 스트레인이다. 그것은 CDC로부터 입수 가능한 천연두 백신 스트레인이다.
본원에서 사용되는 바, 바이러스 플라크 검정(VPA)은 감염성 바이러스의 양 또는 바이러스 역가를 측정하기 위해 사용된 검정이며, ml당 또는 샘플당 플라크 형성 단위(pfu)로서 제시된다.
본원에서 사용되는 바, "프라이밍된" 또는 "보호된" 세포 비히클 또는 운반 세포는 면역 반응으로부터 세포를 보호하기 위해 작용제, 예컨대 사이토카인, 예를 들어 인터페론(IFN), 또는 동종 비활성화/거부반응 결정요인의 길항물질로 사전 처리된 및/또는 로딩된 것이다.
본원에서 사용되는 바, 치료는 질환 또는 장애의 증상의 개선을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 방지는 질환 또는 질병에 걸릴 위험을 감소시키기 위한 또는 그것의 중증도를 감소시키기 위한 예방적 치료를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 대상체는 본원의 방법 및 용도에 의해 치료될 수 있는 임의의 포유류를 나타낸다. 포유류는 인간, 다른 영장류, 예컨대 침팬지, 보노보, 및 고릴라, 개, 고양이, 소, 돼지, 염소 및 다른 농장 동물 및 애완동물을 포함한다. 환자는 인간 대상체를 나타낸다.
개시의 명료함을 위해, 그리고 제한 없이, 상세한 설명은 하기의 하위섹션들로 나누어진다.
B. 세포-기반 비히클("세포 비히클" 또는 "운반 세포")을 사용하는 바이러스 요법을 위한 구성요소의 선택
1. 세포 비히클
종양용해 바이러스(OV)는 정상 세포에 비해 종양 세포를 우선적으로 감염시키고, 그 안에 축적되고 사멸시키는 능력을 가진다. 이런 능력은 바이러스의 자연적인 특징일 수 있거나(예컨대, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 유행성 이하선염 바이러스), 또는 바이러스는 그것이 대상체의 항바이러스 면역 및 다른 방어를 피하도록 유전자적으로 약독화될 수 있거나(예컨대, 수포성 구내염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스) 또는 종양 세포에 대한 선호도가 선택되거나, 또는 예컨대 종양-특이적 세포 표면 분자, 전사 인자 및 조직-특이적 마이크로RNA를 사용하여 바이러스에 조작될 수 있다(예컨대, Cattaneo et al., Nat. Rev. Microbiol., 6(7):529-540(2008); Dorer et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 61(7-8):554-571(2009); Kelly et al., Mol. Ther., 17(3):409-416(2009) 및 Naik et al., Expert Opin. Biol. Ther., 9(9):1163-1176(2009) 참조).
종양용해 바이러스의 전달은 직접적인 종양내 주사를 통해 이루어질 수 있다. 직접적인 종양내 전달은 정상 세포의 바이러스에 대한 노출을 최소화할 수 있는 한편, 자주, 예컨대 종양 부위의 비접근성(예컨대, 뇌 종양) 또는 여러 작은 결절 형태로 있는 종양의 경우 큰 면적에 걸친 확산으로 인해 한계가 있다. 다른 한편으로, 전신적 전달은 바이러스가 원발성 종양 부위뿐만 아니라, 파종성 전이에도 도달하는 잠재력을 가진다.
그러나, 전달 방식에도 불구하고, 종양용해 바이러스를 사용하는 치료의 성공은 면역 반응을 신속하게 유도하여 바이러스를 중화시키는 숙주의 면역 체계에 의해 손상될 수 있다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457; Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 예를 들어, 정맥내로 전달된 바이러스는 중화 항체, 보체 및 다양한 면역 세포에 노출되고, 격리되며 계속해서 폐, 비장 및 간과 같은 장기에 의해 제거된다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 중화 항체(NAb)는 바이러스에 결합하여 세포 표면 수용체에 바이러스가 부착하는 것을 차단하고 바이러스 감염을 억제함으로써, OV의 치료 잠재력을 제한한다(Jennings et al. (2014) Int. J. Cancer 134:1091-1101). 선천성 면역 반응 외에, 적응성 면역을 초래하는 이전의 노출은 보다 특이적이고 강력할 수 있으며 또한 OV의 치료 잠재력을 제한한다. 추가적으로, 물리적 장벽, 예컨대 세포외 기질 및 종양의 높은 간질액 압력이 종양 세포로의 바이러스 입자의 효율적인 전달을 방해할 수 있다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56).
대부분의 개체는 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 및 레오바이러스를 포함한 많은 바이러스에 노출되었고, 그 결과로서 종양용해 바이러스 요법의 치료 잠재력을 감소시킬 수 있는 기존의 항바이러스 면역을 나타낸다. 예를 들어, 대부분의 고령 대상체는 천연두에 대해 백신접종되었고, 그 결과 백시니아 바이러스를 포함한, 오르토폭스 바이러스에 대한 기존의 항바이러스 면역을 초래한다. 대상체가 특정 OV에 대한 기존의 면역을 이미 갖고 있지 않더라도, 초기 용량의 바이러스는 왕성한 항바이러스 면역 반응을 초래하여 반복된 용량의 유효성을 제한하고, 이것은 자주 강력한 항종양 반응을 이루기 위해 필요하다. 이것을 피하기 위한 전략은 면역 억제제, 예컨대 사이클로포스파미드의 사용, 및 면역 체계를 우회하고 OV를 종양 부위로 전달하기 위한 운반 세포(세포 비히클)의 사용을 포함한다.
사이클로포스파미드, 타크롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 및 메틸프레드니솔론 소디움 석시네이트와 같은 면역억제 약물을 사용한 일시적인 면역억제가 장기 이식에 성공적으로 사용되어 왔지만, 전신적으로 투여된 OV의 종양 전달을 향상시키는 데에는 제한된 성공을 나타냈다(Guo et al. (2010) Gene Ther. 17(12):1465-1475; Guo et al. (2010) Gene Ther. 17(12):1465-1475). 면역억제 약물의 사용은 또한 바이러스의 잠재적 독성을 증가시킬 수 있고, 더불어, 그렇지 않으면 종양용해를 보조할 수 있을 면역 체계에 의해 시작된 임의의 항종양 반응을 감소시킬 수 있다(Thorne et al. (2010) Molecular Therapy 18(9): 1698-1705).
OV의 전달을 위한 운반 세포의 사용은 바이러스가 숙주 내에서 확산하기 위해 진화했던 방식을 모방할 수 있다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스는 순환하는 수지상 세포(DC) 및 대식세포에 결합하여, 림프절로 이동하여 그것의 표적: CD4+ T 세포에 도달할 수 있게 된다. 추가적으로, 세포로부터 세포로 확산됨으로써 복제하는 바이러스는 성공적으로 중화 항체를 회피할 수 있다. 임상 실험은 종양용해 레오바이러스가 정맥내 투여될 때, 순환하는 세포에 결합하여 그것의 감염성을 유지한 채 중화 항체의 존재 하에서도 종양 세포에 도달하는 것을 보여주었다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 세포-기반 비히클을 사용하는 장점으로 OV의 치료 잠재력을 증가시키고 표적 외 독성을 방지하는 OV의 종양 세포로의 특이적 전달, 및 기존의 항바이러스 면역으로부터 OV를 숨기는 능력을 들 수 있다. 케모카인 및 인테그린과 같은 부착 분자가 면역 체계 내에서 및 종양으로의 세포의 이동에 중요한 역할을 한다. 암 세포는 운반 세포를 종양으로 끌어들이는 다양한 사이토카인 및 케모카인을 분비하는 것으로 나타났다. 다른 인자, 예컨대 하이폭시아 또한 운반 세포의 종양 복귀 능력에 기여할 수 있다.
OV는 특이적 또는 비특이적 상호작용을 통해 운반 세포의 표면 위로 로딩됨으로써 운반 세포와 회합되거나, 또는 그것에 의해 내재화될 수 있다. OV의 내재화는 때때로 순환하는 NAb에 대해 더 나은 보호를 제공하며 세포 내에서 바이러스 복제를 허용하여 전달된 바이러스의 양을 증가시킨다. 그러나, 바이러스 감염은 그것이 그것의 표적 부위(들)에 도달하기 전에 운반 세포를 사멸시켜서, 종양용해를 위한 OV의 성공적인 전달을 방해할 수 있다. 다른 한편으로, 운반 세포 표면 위로의 로딩은 종양 부위에 도착하기 전 바이러스 증폭을 불가능하게 하고 전달되는 바이러스의 양을 감소시킬 수 있다(Jennings et al. (2014) Int. J. Cancer 134:1091-1101; Willmon et al. (2009) Molecular Therapy 17(10):1667-1676).
OV의 전달을 위한 운반 세포의 유효성은 (1) 바이러스의 성공적인 생체외 로딩; (2) 종양 부위에서의 바이러스의 생체내 축적; 및 (3) 종양 부위에서의 바이러스 증폭/생성을 포함한, 여러 인자에 좌우된다(Guo et al. (2010) Gene Ther. 17(12):1465-1475). 이상적인 운반 세포는 면역 체계에 의한 중화로부터 OV를 숨길뿐만 아니라, 그것을 종양에 특이적으로 전달하고 그 자체의 항종양 활성을 가진다. 운반 세포는 투여하기에 안전하고, 분리 및/또는 제조하기 쉬우며, 방이러스에 의해 감염되기 쉽고, 바이러스가 복제할 수 있게 하며, 파괴되기 전에 종양 부위에서 바이러스를 방출해야 한다. 상이한 바이러스는 상이한 속도로 복제하며, 이상적으로는 바이러스가 복제하는 동안 운반 세포가 종양 부위에 도착하도록 세포 이동 및 바이러스 복제의 동력학이 양립하여야 한다. 예를 들어, VSV는 신속하게 복제하는 바이러스이고, 운반 세포를 통한 성공적인 전달은 세포가 감염 후 1-2시간 후에 주사되는 경우에 이루어질 수 있다. 백시니아 바이러스와 같이 더 느리게 복제하는 바이러스로는, 운반 세포의 감염 및 전달을 위한 타이밍을 최적화하는 데 더 많은 유연성이 있다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 적합한 바이러스 및 운반 세포 쌍을 선택하는 것이 또한 바이러스 복제가 운반 세포의 순환 및 이펙터 기능에 부정적으로 영향을 미치지 않거나, 그것의 종양 이동을 방해하지 않는 것을 보장할 수 있다. 예를 들어, 조숙한 바이러스 복제 및/또는 발현은, 운반 세포가 "감염된" 것으로 확인된 후에는, 직접적인 세포독성을 통해, 또는 면역 체계에 의한 간접적인 정화를 통해 운반 세포의 파괴를 초래할 수 있다(Willmon et al. (2009) Molecular Therapy 17(10):1667-1676). 바이러스 감염이 운반 세포의 표면에서 바이러스 항원의 발현을 유도하는 경우에, 당업자는 운반 세포의 면역-매개 파괴를 감소하거나 방지하기 위하여 그것이 종양에 도달한 후에 복제하도록 바이러스를 조작할 수 있다. 예를 들어, 종양-특이적 및 저산소증-유도 프로모터가 종양 부위에서 바이러스 복제를 구동하기 위해 사용될 수 있다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56).
상기 논의된 것과 같이, 동역학 파라미터와 관련하여 바이러스-운반 세포 적합성을 고려하는 것 외에, 회합된 종양용해 바이러스와 같은 운반 세포는 종양 세포/암 세포에서 바이러스 증폭을 촉진하면서 선천성 및 적응성 면역 장벽을 극복할 수 있어야 한다. 자가 운반 세포(치료될 대상체로부터 얻어진 세포)의 사용은 운반 세포에 대해 지시된 선천성 및 면역 반응을 최소화할 수 있지만, 대상체에게 부담이 될 수 있고, 값비싸며 그것의 이용성을 제한할 수 있다. 다양한 쉽게 분리 가능한 및/또는 상업적으로 입수 가능한 세포/세포주를 포함할 수 있는 동종 운반 세포는 용이한 이용성 및 대상체에 대한 비침습성을 제공한다; 그러나, 더 큰 크기의 선천성 및/또는 적응성 면역 반응이 그것의 치료 효능 및 임상 적용성을 손상시킬 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체-특이적 및/또는 암-특이적 방식으로 바이러스 요법을 강화시킬 수 있는 "매칭된" 운반 세포의 스크리닝, 확인 및 선택을 가능하게 한다. 본원에 제공된 방법에 따르면, 이용 가능한 잠재적 운반 세포 후보가 그것의 바이러스의 증폭을 촉진하는 및/또는 대상체에서 바이러스의 치료 효능을 보이는 능력이 운반 세포 및/또는 운반 세포/바이러스 조합에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 유의하게 손상되지 않는 운반 세포를 확인하는 방식으로 스크리닝된다. 그렇게 확인된 운반 세포는 그런 후 본원에 제공된 치료 방법에 따라 대상체 및/또는 암 특이적 운반 세포-매개 바이러스 요법에 대해 사용될 수 있다.
본원에 제공된 운반 세포를 선택하는 방법은 OV의 전달을 위한 운반 세포로서 사용된 임의의 세포 유형을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 것과 같이, 스크리닝된 운반 세포 유형은 운반 세포-매개 바이러스 종양 요법을 사용하여 치료되는 특정 대상체에서 바이러스 증폭을 촉진하거나 및/또는 면역 공격을 회피하는 능력을 토대로 순위가 매겨질 수 있다; 능력이 높을수록, "순위"가 높다. 그런 후 "높은" 것으로 순위가 매겨진 하나 이상의 운반 세포 유형이 치료될 특정 대상체 및/또는 특정 암에 대한 매치로서 선택된다. 그렇게 선택된 운반 세포 유형을 사용하는 치료 방법이 또한 본원에 제공된다.
다양한 세포 유형이 운반 세포로서 사용되어 왔고, 이들 중 어느 것이든지 본원에 제공된 방법으로 스크리닝될 수 있다. 본원에서 논의된 것과 같이 일부 예에서, 운반 세포는 관심 있는 대상체에 대해 더 나은 "매치"를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 그런 후 스크리닝된 및/또는 변형된 운반 세포는 본원에 제공된 치료 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 줄기/전구 세포, 면역 세포 및 암/형질전환된 세포를 포함하는, OV의 전달을 위한 예시의 운반 세포 유형이 하기에 기술된다. 본원에 제공된 방법에 따라 스크리닝된 운반 세포는 자가, 즉, 치료될 대상체로부터 유래되거나, 동종, 즉, 치료될 대상체 이외의 도너로부터 유래될 수 있다. 본원에 제공된 방법, 조합 및 조성물에 사용하기 위한 예시의 운반 세포는 다음과 같다:
세포-기반 비히클의 유형
줄기 세포, 면역 세포, 암 세포주
줄기 세포, 면역 세포 및 종양/암성 세포는 다른 것들 중에서도 HSV-1, 파보 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 백시니아 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 아데노바이러스를 포함한, 종양용해 바이러스(OV)에 대한 전달 비히클로서 이용될 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법에서 사용된 전달 비히클은 분리되고 분리된 전달 비히클/운반 세포를 종양용해 바이러스와 함께 인큐베이션함으로써 형성된 조성물로서 투여된다; 이것은 식물 또는 동물의 일부가 아니다. 구현예에서, 세포는 운반체로서 사용하기 위해 배양될 수 있다.
이들 세포는 OV의 치료 효과를 향상시키는 종양-복귀 특성을 입증한다. 이런 종양 선택성은 저산소증, 염증 및 화학유인 분자, 예컨대 사이토카인 및 케모카인의 풍부함을 특징으로 하는, 이들 세포의 종양 미세환경으로의 이끌림에 기인한다.
줄기 세포
줄기 세포는 그것을 종양용해 바이러스 요법에 대한 운반 세포로서 매력적으로 만드는 고유한 종양-복귀 능력을 가진다. 이것은 종양의 제어되지 않은 성장을 지지하는 다양한 성장 인자, 혈관형성 인자, 사이토카인 및 케모카인이 풍부한 종양 미세환경에 기인한다. TME의 저산소 본성이 또한 줄기 세포의 종양을 향한 이동을 촉진한다. 줄기 세포 또한 그것이 고도로 면역억제성이고 항원 프로세싱 및 제공에 필요한 분자의 낮은 수준을 발현하여 그것이 은닉하고 있는 바이러스의 면역 체계에 의한 인식을 지연시키기 때문에 운반 세포로서 매력적이다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217). OV에 대한 운반 세포로서 사용될 수 있는 줄기 세포의 예로는 내피 전구 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 들 수 있다.
내피 전구 세포는 인간 신경교종의 쥐과 모델에서 종양 신생혈관 부위로 복귀하여 종양용해 홍역 바이러스를 전달하기 위해 성공적으로 이용된 것으로 나타났다(Guo et al. (2008) Biochim Biophys Acta 1785(2):217-231). 이들 세포는 생체내에서 신속하게 분할하지만, 불멸은 아니며, 새로운 세포는 임상 샘플로부터 반복적으로 분리되어야 한다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217).
뉴런 및 신경교 세포를 포함한 신경계의 다양한 상이한 세포로 분화하는 신경 줄기 세포(NSC)는 뇌 종양으로 치료제를 전달하기 위한 운반 세포로서 조사된 첫 번째 줄기 세포였다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457). NSC는 신경교종 세포에서 기질 세포-유래 인자-1(SDF-1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 유로키나제 플라스미노겐 활성자(uPA)의 저산소증-유도 인자(HIF)-매개 발현으로 인해 교모세포종 종양을 향한 강력한 향성을 나타낸다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217). NSC는 IL-4, IL-12, IL-23, 시토신 탈아미노효소, 혈관형성 방지 단백질 트롬보스폰신 및 아데노바이러스와 같은 OV의, 예를 들어 신경교종으로의 전달에 이용되어 왔다. 그러나, NSC는 태아의 뇌 조직으로부터 또는 수술 중에 성인 뇌의 실질주변 구역으로부터 분리되어야 하고, 이것은 운반 세포로서의 그것의 유용성에 대해 단점이다.
성인 인간 골수는 골수 줄기 세포가 쉽게 획득될 수 있고 자가 이식에 대해 환자 자신으로부터 공급될 수 있어서 면역 거부 반응의 여지가 없기 때문에, 줄기 세포에 대한 대체 공급원으로서 이용되어 왔다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457). 이용 가능한 다양한 골수 줄기 세포 중에서, 중간엽 줄기 세포(MSC)가 그것이 환자로부터 쉽게 분리되며 시험관내에서 팽창되고, OV의 복제 및 면역 체계에 의한 즉각적인 중화로부터의 보호를 지지하며, 쉽게 조작될 수 있고 염증성 사이토카인의 종양-관련 발현으로 인해 생체내에서 종양으로 본질적으로 복귀하기 때문에 운반 세포로서 매력적이다. MSC는 심지어 독립된 항암제로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 연구는 IFN-β를 발현하는 MSC의 종양 복귀 능력 및 종양용해 효과를 입증하였다(Nakashima et al. (2010) Cytokine Growth Factor Rev. 21(2-3):119-126).
MSC는 그것의 세포 표면에서 저수준의 MHC 부류 I 분자를 발현하며 MHC 부류 II 분자를 발현하지 않아서, 동종 이식을 가능하게 한다. MSC는 또한 T-세포 증식 및 수지상 세포(DC)로의 단핵 세포의 분화를 억제할 수 있고, CD4+ T-헬퍼 세포에 의해 생성된 인터페론-감마 및 종양 괴사 인자의 발현을 억제할 수 있다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217). MSC는 또한 종양용해 바이러스 전달에 대한 물리적 장벽을 극복하는 것을 도울 수 있는 프로테아제의 분비를 통해 세포외 기질을 분해할 수 있다(Ramirez et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:149-155). MSC 사용의 다른 장점은 그것이 바이러스 감염 후에 냉동될 수 있고, 해동시 활성 바이러스 복제 및 항종양 활성을 보유하여서 그것의 보관을 가능하게 한다는 것이다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 골수 외에, MSC는 또한 지방 조직, 제대혈, 말초혈, 근육, 연골 및 양수로부터 분리될 수 있고, 이중 지방 조직이 접근성 및 지방 조직의 풍부함으로 인해 가장 매력적인 공급원이다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457; Nakashima et al. (2010) Cytokine Growth Factor Rev. 21(2-3):119-126).
MSC는 췌장암, 뇌암, 신장 세포 암종, 교모세포종, 및 난소암의 치료를 위한 종양용해 아데노바이러스의 운반체로서, 및 난소암 및 간세포 암종의 치료를 위한 홍역 바이러스의 운반체로서 작용하였다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217). 예를 들어, MSC는 진행성 소아 전이성 신경모세포종의 치료를 위한 종양용해 아데노바이러스 ICOVIR-5의 운반체로서 이용되어 왔다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457; Ramirez et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:149-155).
그러나, MSC 사용의 한 가지 단점은 종양 성장을 촉진하는 그것의 잠재력인데, 이것은 유방암, 자궁내막 종양 및 신경교종의 모델에서 입증되었다. 이런 잠재적 단점을 극복하기 위하여, MSC는 예를 들어, 자살 유전자를 운반함으로써 OV의 전달시 그것의 파괴를 보장하도록 조작될 수 있다(Kerrigan et al. (2017) Cytotherapy 19(4):445-457).
운반 세포로서 이용될 수 있는 줄기 세포(자가 또는 동종)의 예는 다음을 들 수 있다: 예를 들어, 성인 줄기 세포; 배아 줄기 세포; 태아 줄기 세포; 신경 줄기 세포; 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 성인 골수, 지방 조직, 혈액, 치수, 신생아 탯줄, 제대혈, 태반, 태반-유래 부착 기질 세포, 태반-유래 탈락막 기질 세포, 자궁내막 재생 세포, 태반 양능성 내피/중간엽 전구 세포, 양막 또는 양수 중간엽 줄기 세포, 양수 유래 전구, 왓튼 젤리 중간엽 줄기 세포, 골반 거들 줄기 세포, 융모막 융모 중간엽 기질 세포, 피하 백색 지방 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 혈관외 망막 줄기 세포, 모낭-유래 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 골막-유래 중간엽 줄기 세포, 측판 중간엽 줄기 세포, 박리된 유치 줄기 세포, 치주 인대 줄기 세포, 치낭 전구 세포, 정단 유두로부터의 줄기 세포, 근육 위성 세포 등으로부터 분리됨/유래됨); 신경 줄기 세포; 전능성 줄기 세포; 만능성 줄기 세포; 유도된 만능성 줄기 세포; 다능성 줄기 세포; 과능성 줄기 세포; 단능성 줄기 세포; 지방 기질 줄기 세포; 내피 줄기 세포(예를 들어, 내피 전구 세포, 태반 내피 전구 세포, 혈관형성성 내피 세포, 혈관 주위 세포); 성인 말초혈 줄기 세포; 근모세포; 작은 소아 줄기 세포; 피부 섬유모세포 줄기 세포; 조직/종양-관련 섬유모세포; 상피 줄기 세포; 및 배아 상피 줄기 세포. 본원에 제공된 조성물 및 방법의 구현예에서, 운반 세포는 배아 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 제대혈 유래 줄기 세포, 양수 유래 줄기 세포 또는 태반 유래 줄기 세포 중 하나 이상이 아니다.
면역 세포
암 부위로의 이동에 의해 종양으로부터 방출된 "위험 신호"에 대해 반응하는 면역 세포는 OV에 대한 운반 세포로서 집중적으로 조사되어 왔다. 이들 면역 세포로는 γδ T 세포, 종양-특이적 항원을 표적화하는 CAR-T 세포, 종양-특이적 항원을 표적화하는 TCR 유전자도입 세포를 포함한 T 세포; NKT 세포, 림프구, 단핵 세포, 대식세포, 비만 세포, 과립구, 수지상 세포(DC), 자연 살해(NK) 세포, 골수-유래 억제자 세포, 림포카인-활성화된 살해(LAK) 세포, 및 사이토카인-유도 살해(CIK) 세포를 예로 들 수 있다. 면역 세포는 그것이 전신적으로 순환하고 종양을 인식할 수 있기 때문에 운반 세포로서 매력적이다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). OV에 대한 운반체로서의 면역 세포의 사용은 또한 직접 세포독성의 형태로, 또는 적응성 항종양 면역 반응을 프라이밍함으로써 추가적인 항종양 활성을 제공할 수 있다(Jennings et al. (2014) Int. J. Cancer 134:1091-1101).
종양 항원-특이적 T 세포는, 예를 들어, 직접적인 항암 이펙터 기능을 나타내며, 활성화된 T 세포는 OV의 종양으로의 전달에서 광범위하게 조사되었다. OV로 입양 전달된 T 세포를 로딩하는 것은, 바이러스 감염의 전염증성 본성이 T 세포의 침묵 및 비활성화를 방지할 수 있기 때문에, 종양 미세환경의 면역억제 본성과 대항하는 것을 도울 수 있는 것으로 나타났다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). CCL3, CCL21 및 CXCL10(IP-10)과 같은 케모카인의 종양내 발현은 입양 T 세포의 종양-특이적 이동을 향상시킨다. T 세포는 또한 그것을 종양에 대해 지시하는 것을 돕기 위하여, CXCR2와 같은 케모카인 수용체를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다(Guo et al. (2008) Biochim Biophys Acta 1785(2):217-231). 연구는 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 및 레트로바이러스 입자가 T 세포의 표면에 부착할 수 있고 종양 세포에 수동적으로 또는 운반체와 종양 세포 사이의 세포 시냅스를 통해 전달될 수 있음을 입증하였다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). T 세포를 OV를 위한 운반체로서 사용하는 장점에도 불구하고, 그것은 여전히 매우 값비싸며 환자로부터의 고도의 종양-특이적 항원에 대해 T-세포 집단을 유발하기가 어려워서, 그것의 사용을 제한한다(Willmon et al. (2009) Molecular Therapy 17(10):1667-1676).
림포카인-활성화 살해 세포(LAK 세포)는 난소암의 치료에서 IL-2와 조합하여 유망한 것으로 나타났다. 미성숙 수지상 세포(iDC), LAK 세포 및 이것들의 공동 배양(LAKDC)은 난소암의 치료에서 레오바이러스에 대한 운반체로서 테스트되었고, 레오바이러스-로딩된 LAKDC가 중화 항체로부터 레오바이러스를 보호할 수 있었고, 전염증성 사이토카인 환경을 유도하여 선천성 및 적응성 항종양 면역 반응을 생성하는 것으로 나타났다(Jennings et al. (2014) Int. J. Cancer 134:1091-1101). DC 세포는 또한 흑색종의 치료를 위해 레오바이러스의 운반체로서 성공적으로 사용되었다(Jennings et al. (2014) Int. J. Cancer 134:1091-1101).
CIK 세포는 OV에 대한 운반체로서 사용될 수 있는 또 다른 유형의 면역 세포이다. 종양 항원-특이적 T 세포가 한 항원을 인식하는 반면, CIK 세포는 종종 다양한 종양 세포에서 상향조절되는 NKG2D 리간드를 인식하여 그것을 보다 다용도로 만든다. CIK 세포는 또한 환자로부터 분리하고 생체외로 팽창되는 것이 더 쉽고, 고역가의 바이러스를 생성할 수 있으며, 홍역 및 백시니아 바이러스를 종양에 전달하기 위해 성공적으로 사용되었다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56; Willmon et al. (2009) Molecular Therapy 17(10):1667-1676; Power and Bell(2007) Mol. Ther. 15(4):660-665). 그러나, CIK 세포를 사용하는 한 가지 단점은 그것의 생성이 생체내에서 사이토카인을 사용하는 원발성 백혈구의 팽창을 필요로 한다는 것이다(Kim et al. (2015) Viruses 7:6200-6217).
대식세포는 OV에 대한 운반 세포의 또 다른 잠재적 부류를 나타낸다. 종양이 자주 단핵세포 화학주성 단백질-1, 대식세포 콜로니 자극 인자 및 VEGF를 분비하기 때문에, 단핵 세포가 자연적으로 종양 부위로 이동하여 저산소 영역에 국지화하며, 종양-관련 대식세포로 분화하고, 이것은 종양 성장 억제를 향상시킬 수 있다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virtherapy 2:47-56). 그 결과로서, 대식세포는 종양용해 아데노바이러스 및 홍역 바이러스의 전달을 위해 전임상적으로 조사되었다. 논의된 다른 유형의 면역 세포 외에, 골수-유래 억제자 세포가 또한 종양용해 VSV의 전달을 위한 운반 세포로서 조사되었다.
암 세포
안전을 위해 투여 전에 자주 γ-조사로 비활성화되는 암 세포 또한 OV를 위한 운반 세포로서 성공적으로 사용되어 왔다. γ-조사는 종양원성을 방지할 수 있지만, 바이러스 생성은 보존한다. 또 다른 안전 척도는 암 세포가 대상체에서 무한하게 유지되지 않는 것(즉, 사멸되고 더 이상 불멸이 아님)을 보장하기 위해 자살 유전자, 예컨대 티미딘 키나제를 발현하기 위해 OV를 조작하는 것을 포함한다. 대안으로, 전형적으로 수령체의 면역 체계에 의해 정화되는 동종 암 세포가 사용될 수 있다(Power and Bell(2007) Mol. Ther. 15(4):660-665).
암 세포는 대량으로 쉽게 얻어질 수 있고 정상 세포보다 고수준의 바이러스 감염성 및 증폭을 나타낸다(Guo et al. (2010) Gene Ther. 17(12):1465-1475; Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 추가적으로, 일부 종양 세포는, 전이성 질환에서 볼 수 있는 것과 같이, 특정 장기로 특이적으로 이동한다. 예를 들어, 골수종 세포는 고수준의 케모카인 수용체 CXCR4를 발현하여, 골수 전이를 초래하고, 종양용해 홍역 바이러스의 전달에 이용되었다(Roy and Bell(2013) Oncolytic Virotherapy 2:47-56). 다양한 형질전환된 세포주가 면역-결핍 동물뿐만 아니라 면역-경합에서 종양용해 파보 바이러스, 홍역 바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스를 성공적으로 전달하는 것으로 나타났다. 예를 들어, VSV 또는 아데노바이러스로 감염된 암종 세포는 마우스에서 바이러스를 폐 전이로 효과적으로 전달하기 위해 사용되었다(Willmon et al. (2009) Molecular Therapy 17(10):1667-1676; Power and Bell(2007) Mol. Ther. 15(4):660-665). 그러나, 고형 종양으로부터 유래된 세포는 그것의 큰 직경으로 인해 정맥내 투여 후에 마우스의 폐에서 축적되는 것으로 나타났다. 그 결과로서, 조혈/혈액 기원의 암 세포가, 그것이 신체에서 광범위하게 분포하고 OV를 폐 외부의 해부학적 위치로 전달할 수 있기 때문에 더 나은 대안이 될 수 있다(Power and Bell(2007) Mol. Ther. 15(4):660-665).
운반 세포로서 사용될 수 있는 동종 인간 혈액 악성 세포주의 예로는 다음을 들 수 있다: 백혈병 세포(예컨대, 예를 들어, KASUMI-1, HL-60, THP-1, K-562, RS4;11, MOLT-4, CCRF-CEM, JVM-13, 31E9, ARH-77, MoB, JM1, NALM-1, ProPak-X.36); T 세포 백혈병 세포(예컨대, 예를 들어, HM-2, CEM-CM3, Jurkat/Jurkat 클론 E6-1, J.CaM1.6, BCL2 Jurkat, BCL2 S87A Jurkat, BCL2 S70A Jurkat, Neo Jurkat, BCL2 AAA Jurkat, J.RT3-T3.5, J45.01, J.감마1, J.감마1.WT, JK28, P116, P116.cl39, A3, JX17, D1.1, I 9.2, I 2.1); 골수단핵세포성 백혈병 세포(예를 들어, MV-4-11); 림프종 세포(예를 들어, HT, BC-3, CA46, Raji, Daudi, GA-10-클론-4, HH, H9); 비호지킨 림프종 세포(예컨대, 예를 들어, SU-DHL-1, SU-DHL-2, SU-DHL-4, SU-DHL-5, SU-DHL-6, SU-DHL-8, SU-DHL-10, SU-DHL-16, NU-DUL-1, NCEB-1, EJ-1, BCP-1, TUR, U-937); 버킷 림프종 세포(예를 들어, Ramos/RA 1, Ramos.2G6.4C10, P3HR-1, Daudi, ST486, Raji, CA46, 인간 감마헤르페스 바이러스 4/버킷 림프종 환자로부터의 HHV-4 볼 종양, DG-75, GA-10, NAMALWA, HS-Sultan, Jiyoye, NC-37, 20-B8, EB2, 1G2, EB1, EB3, 2B8, GA-10 클론 20, HKB-11/신장-B 세포 하이브리드); 미만성 거대 B 세포 림프종 세포(예를 들어, Toledo, Pfeiffer); 맨틀 세포 림프종 세포(예를 들어, JeKo-1, JMP-1, PF-1, JVM-2, REC-1, Z-138, Mino, MAVER-1); AML 세포(예를 들어, AML-193, BDCM, KG-1, KG-1a, Kasumi-6, HL-60/S4); CML 세포(예를 들어, K562, K562-r, K562-s, LAMA84-r, LAMA84-s, AR230-r, AR230-s); ALL 세포(예를 들어, N6/ADR, RS4;11, NALM6 클론 G5, Loucy, SUP-B15, CCRF-SB); 적백혈병 세포(예를 들어, IDH2-mutant-TF-1 동질유전자형 세포주); 골수단핵모세포성 백혈병 세포(예를 들어, GDM-1); 악성 비호지킨 NK 림프종 세포(예를 들어, NK-92, NK-92MI); 골수종/형질세포종 세포(예를 들어, U266B1/U266, HAA1, SA13, RPMI8226, NCI-H929, MC/CAR); 다발성 골수종 세포(예를 들어, MM.1R, IM-9, MM.1S); 및 대식세포 세포주(예를 들어, MD, SC, WBC264-9C).
상업적 동종 세포주로 다음을 들 수 있다: 중간엽 줄기 세포, 예컨대, 예를 들어, APCETH-201, APCETH-301(APCETH), Cx601(TIGENIX), TEMCELL, MSC-100-IV, Prochymal(MESOBLAST); 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC), 예컨대, 예를 들어, ToleraCyte(Fate Therapeutics); 섬유모세포 세포, 예를 들어, CCD-16Lu, WI-38; 종양-관련 섬유모세포, 예를 들어, Malme-3M, COLO 829, HT-144, Hs 895.T, hTERT PF179T CAF, 등; 내피 세포, 예를 들어, HUVEC, HUVEC/TERT 2, TIME; 배아 상피 세포, 예를 들어, HEK-293, HEK-293 STF, 293T/17, 293T/17 SF, HEK-293.2sus; 배아 줄기 세포, 예를 들어, hESC BG01V; 및 상피 세포, 예를 들어, NuLi-1, ARPE-19, VK2/E6E7, Ect1/E6E7, RWPE-2, WPE-stem, End1/E6E7, WPMY-1, NL20, NL20-TA, WT 9-7, WPE1-NB26, WPE-int, RWPE2-W99, BEAS-2B. 본원에 제공된 조성물 및 방법의 구현예에서, 운반 세포는 배아 기원의 것, 예컨대, 배아 상피 세포, 배아 줄기 세포, 태아 세포, 등이 아니다.
자가 또는 동종 전체 종양 세포 백신은 Cell Genesys/BioSante/Aduro Biotech로부터의 GM-CSF 분비 전체 종양 세포 백신(GVAX), 예컨대, 예를 들어, GVAX 전립선(PC3/LNCaP-based); GVAX 췌장; GVAX 폐; 및 GVAX 신장 세포, 등을 들 수 있다.
동종 인간 종양 세포주로는, 예를 들어, NCI-60 패널(BT549, HS 578T, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, T-47D, SF268, SF295, SF539, SNB-19, SNB-75, U251, Colo205, HCC 2998, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12, SW620, 786-O, A498, ACHN, CAKI, RXF 393, SN12C, TK-10, UO-31, CCRF-CEM, HL-60, K562, MOLT-4, RPMI-8226, SR, A549, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, LOX IMVI, M14, MALME-3M, MDA-MB-435, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257, UACC-62, IGROV1, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3, NCI-ADR-RES, DU145, PC-3)을 들 수 있다. 다른 동종 인간 종양 세포주로는, 예를 들어, 섬유육종 세포주(HT-1080); 간암종 세포주(Hih-7); 전립선암 세포주(LAPC4, LAPC9, VCaP, LuCaP, MDA PCa 2a/2b, C4, C4-2, PTEN-CaP8, PTEN-P8); 유방암 세포주(HCC1599, HCC1937, HCC1143, MDA-MB-468, HCC38, HCC70, HCC1806, HCC1187, DU4475, BT-549, Hs 578T, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-157, MDA-MB-453, HCC1599, HCC1937, HCC1143, MDA-MB-468, HCC38, HCC70, HCC1806, HCC1187, DU4475, BT-549, Hs 578T, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-157, MDA-MB-453, BT-20, HCC1395, MDA-MB-361, EMT6, T-47D, HCC1954); 두경부암 세포주(A-253, SCC-15, SCC-25, SCC-9, FaDu, Detroit 562); 폐암 세포주(NCI-H2126, NCI-H1299, NCI-H1437, NCI-H1563, NCI-H1573, NCI-H1975, NCI-H661, Calu-3, NCI-H441); 췌장암 세포주(Capan-2, Panc 10.05, CFPAC-1, HPAF-II, SW 1990, BxPC-3, AsPC-1, MIA PaCa-2, Hs 766T, Panc 05.04, PL45); 난소암 세포주(PA-1, Caov-3, SW 626, SK-OV-3); 골암 세포주(HOS, A-673, SK-PN-DW, U-2 OS, Saos-2); 결장암 세포주(SNU-C1, SK-CO-1, SW1116, SW948, T84, LS123, LoVo, SW837, SNU-C1, SW48, RKO, COLO 205, SW1417, LS411N, NCI-H508, HT-29, Caco-2, DLD-1); 위암 세포주(KATOIII, NCI-N87, SNU-16, SNU-5, AGS, SNU-1); 부인암 세포주(SK-LMS-1, HT-3, ME-180, Caov-3, SW626, MES-SA, SK-UT-1, KLE, AN3-CA, HeLa); 육종 세포주(SW684, HT-1080, SW982, RD, GCT, SW872, SJSA-1, MES-SA/MX2, MES-SA, SK-ES-1, SU-CCS-1, A-673, VA-ES-BJ, Hs 822.T, RD-ES, HS 132.T, Hs 737.T, Hs 863.T, Hs 127.T, Hs 324.T, Hs 821.T, Hs 706.T, Hs 707(B).Ep, LL 86/LeSa, Hs 57.T, Hs 925.T, GCT, KHOS-312H, KHOS/NP R-970-5, SK-LMS-1, HOS); 흑색종 세포주(SK-MEL-1, A375, G-361, SK-MEL-3, SH-4, SK-MEL-24, RPMI-7951, CHL-1, Hs 695T, A2058, VMM18, A375.S2, Hs 294T, VMM39, A375-P, VMM917, VMM5A, VMM15, VMM425, VMM17, VMM1, A375-MA1, A375-MA2, SK-MEL-5, Hs 852.T, LM-MEL-57, A101D, LM-MEL-41, LM-MEL-42, MeWo, LM-MEL-53, MDA-MB-435S, C32, SK-MEL-28, SK-MEL-2, MP38, MP41, C32TG, NM2C5, LM-MEL-1a, A7/M2A7); 편평 세포 암종 세포주(SiHa, NCI-H520, SCC-15, NCI-H226, HCC1806, SCC-25, FaDu, SW 954, NCI-H2170, SCC-4, SW 900, NCI-H2286, NCI-H2066, SCC-9, SCaBER, SW579, SK-MES-1, 2A3, UPCI:SCC090, UPCI:SCC152, CAL 27, RPMI 2650, UPCI:SCC154, SW756, NCI-H1703, ME-180, SW962); 간세포 암종 세포주(Hep G2, Hep 3B2.1-7/Hep 3B, C3A, Hep G2/2.2.1, SNU-449, SNU-398, SNU-475, SNU-387, SNU-182, SNU-423, PLC/PRF/5); 방광암 세포주(5637, HT-1197, HT-1376, RT4, SW780, T-24, TCCSUP, UM-UC-3); 신장 세포 암종 세포주(ACHN, 786-O/786-0, 769-P, A-498, Hs 891.T, Caki-2, Caki-1); 배아성 암종/고환 기형종 세포주(NTERA-2 cl.D1, NCCIT, Tera-2, Tera-1, Cates-1B); 교모세포종 세포주(LN-229, U-87 MG, T98G, LN-18, U-118 MG, M059K, M059J, U-138 MG, A-172); 성상세포종 세포주(SW 1088, CCF-STTG1, SW 1783, CHLA-03-AA); 뇌암 세포주(PFSK-1, Daoy); 갑상성 암종 세포주(TT, MDA-T68, MDA-T32, MDA-T120, MDA-T85, MDA-T41) 및 중피종 세포주(NCI-H28, NCI-H226, NCI-H2452, NCI-H2052, MSTO-211H)를 들 수 있다.
2. 바이러스의 선택
본원에 제공된 방법에 따라 선택된 및/또는 변형된 운반 세포는 종양용해 특성을 가지는 것으로서 확인된 임의의 바이러스로의 바이러스 요법에 사용될 수 있다. 본원에서 논의된 것과 같이, 특정 대상체 및/또는 치료될 암 유형에 대한 매치인 운반 세포의 선택을 위해 본원에 제공된 방법의 일부 예에서, 운반 세포는 또한 치료를 위해 사용될 종양용해 바이러스의 증폭을 촉진하는 그것의 능력을 토대로 선택될 수 있다. 대상체 및/또는 암-특이적 매치를 확인하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 선택된 운반 세포-바이러스 조합은 본원에 제공된 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법, 조합 및 조성물에 사용될 수 있는 예시의 종양용해 바이러스는 다음과 같다:
바이러스의 유형
종양용해 바이러스는 그것의 주로 종양 세포 특이적 복제를 특징으로 하여 종양 세포 용해 및 효율적인 종양 퇴행을 초래한다. 종양용해 바이러스는 순환하는 종양 세포와 같은 전이성 종양 세포를 포함한 종양 세포의 콜로니화 또는 축적, 및 그 안에서의 복제에 의해 치료를 이룬다. 본원에 기술된 발명은 임의의 항암 백신 또는 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양용해 바이러스는 임의의 자연적으로 발생하는 또는 조작된 재조합 바이러스, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 다른 것들 중에서도 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 콕사키 바이러스, 셈리키 숲 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스 뎅기 바이러스, 피코르나 바이러스, 폴리오 바이러스, 파보 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 플라비 바이러스, 랍도바이러스, 유두종바이러스, 인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 및 샌드비스 바이러스일 수 있다. 많은 경우에, 종양 선택성은 바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스 및 다른 종양용해 바이러스의 고유한 특성이다. 일반적으로 종양용해 바이러스는 종양 또는 종양 세포에서 복제하여 용해를 초래함으로써 치료를 이룬다.
일부 구현예에서, 병원성 바이러스로부터 유래된 약독화된 스트레인이 살아있는 백신의 제조에 사용된다. 백시니아 바이러스의 비제한적인 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 리스터(엘스트리(Elstree)로도 알려져 있음), 뉴욕시 보건 위생부(NYCBH), 다이렌, Ikeda, LC16M8, 웨스턴 리저브(WR), 코펜하겐(Cop), 타슈켄트, 티안 탄, 와이어스, 드라이박스(Dryvax), IHD-J, IHD-W, 브라이턴, 앙카라, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 다이렌 I, LIPV, LC16M0, LIVP, WR 65-16, EM63, 베른, 파리, CVA382, NYVAC, ACAM2000 및 코노트 스트레인을 들 수 있다. 바이러스는 종양용해 바이러스의 클론성 스트레인일 수 있다. 발색단 생성 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 비변형 종양용해 바이러스의 게놈의 비필수 유전자 또는 영역에, 또는 그것 대신 삽입될 수 있거나, 또는 비변형 종양용해 바이러스의 게놈의 이종성 유전자 생성물을 암호화하는 핵산에 또는 그것 대신 삽입된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 이용된 백시니아 바이러스는 약독화된 뉴욕시 보건 위생부(NYCBOH) 스트레인이다. 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스의 NYCBOH 스트레인은 ATCC VR-118 또는 CJ-MVB-SPX일 수 있다.
일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 드라이박스, ACAM1000, ACAM2000, 리스터, EM63, LIVP, 티안 탄, 코펜하겐, 웨스턴 리저브, 또는 변형된 백시니아 앙카라(MVA)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종양용해 바이러스는 이들 스트레인 중 하나 이상에 존재하는 임의의 유전자가 결핍되지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스 또는 백신은 복제 경합 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 백신은 복제가 결핍된 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스 또는 백신은 약독화되지 않는다.
다른 비변형된 종양용해 바이러스는 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있는 임의의 것을 포함하며, 이를테면 GLV-1h68, JX-594, JX-954, ColoAd1, MV-CEA, MV-NIS, ONYX-015, B18R, H101, OncoVEX GM-CSF, Reolysin, NTX-010, CCTG-102, Cavatak, 온코린, 및 TNFerade로 표시된 바이러스로부터 선택된 것들이다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 종양용해 바이러스는 기술분야의 숙련된 사람에게 잘 알려져 있는 것을 포함하며, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(예컨대, 미국 특허 제 7,731,974호, 제 7,153,510호, 제 6,653,103호 및 미국 특허 공개 번호 2010/0178684호, 2010/0172877호, 2010/0113567호, 2007/0098743호, 20050260601호, 20050220818호 및 유럽 특허 제 1385466호, 제 1606411호 및 제 1520175호 참조); 단순 헤르페스 바이러스(예컨대, 미국 특허 제 7,897,146호, 제 7,731,952호, 제 7,550,296호, 제 7,537,924호, 제 6,723,316호, 제 6,428,968호 및 미국 특허 공개 번호 2011/0177032호, 2011/0158948호, 2010/0092515호, 2009/0274728호, 2009/0285860호, 2009/0215147호, 2009/0010889호, 2007/0110720호, 2006/0039894호 및 20040009604호; 레트로바이러스(예컨대, 미국 특허 제 6,689,871호, 제 6,635,472호, 제 6,639,139호, 제 5,851,529호, 제 5,716,826호, 제 5,716,613호 및 미국 특허 공개 번호 20110212530호 참조); 및 아데노 관련 바이러스(예컨대, 미국 특허 제 8,007,780호, 제 7,968,340호, 제 7,943,374호, 제 7,906,111호, 제 7,927,585호, 제 7,811,814호, 제 7,662,627호, 제 7,241,447호, 제 7,238,526호, 제 7,172,893호, 제 7,033,826호, 제 7,001,765호, 제 6,897,045호, 및 제 6,632,670호 참조)를 들 수 있다.
뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus)
뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 가금류를 감염시키고 일반적으로 인간에게는 비병원성이지만, 독감-유사 증상을 유발할 수 있는 음의 극성의 단일 가닥 RNA 게놈을 가진 조류 파라믹소바이러스이다(Tayeb et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:49-62; Cheng et al. (2016) J. Virol. 90:5343-5352). 그것의 세포질 복제, 숙주 게놈 통합 및 재조합의 결핍 및 높은 게놈 안정성으로 인해, NDV 및 다른 파라믹소바이러스는 다른 종양용해 바이러스, 예컨대 레트로바이러스 또는 일부 DNA 바이러스에 대한 더 안전하고 더 매력적인 대안을 제공한다(Matveeva et al. (2015) Molecular Therapy - Oncolytics 2, 150017). NDV는 정상 세포보다 종양 세포에서의 복제가 10,000배 더 큰 복제를 가진 종양 선택성을 입증하여 직접적인 세포병변 효과 및 면역 반응의 유도로 인한 종양용해를 초래하는 것으로 나타났다(Tayeb et al. (2015; Lam et al. (2011) Journal of Biomedicine and Biotechnology, Article ID 718710). NDV의 종양 선택성의 메커니즘이 완전하게 밝혀지진 않았지만, 결함 인터페론 생성 및 종양 세포에서의 IFN 신호전달에 대한 반응이 바이러스가 복제하고 확산되는 것을 가능하게 한다(Cheng et al. (2016); Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30). 암 세포를 향한 파라믹소바이러스의 높은 친화도는 또한 시알산을 포함한, 암 세포 표면 상의 바이러스 수용체의 과다발현으로 인한 것일 수 있다(Cheng et al. (2016); Matveeva et al. (2015); Tayeb et al. (2015)).
비조작 NDV 스트레인은 닭에서의 그것의 병원성을 기준으로 약독형(무독성), 중간독성(중간), 또는 강독성(병독성)으로 분류되며, 강독성과 중간독성 스트레인이 다중 인간 암 세포주에서 복제(및 용해)할 수 있지만, 약독형 스트레인은 그렇지 못하다(Cheng et al. (2016); Matveeva et al. (2015)). NDV 스트레인은 또한 용해성 또는 비용해성으로 범주화되며, 용해성 스트레인만이 생존 가능하고 감염성인 자손을 생산할 수 있다(Ginting et al. (2017); Matveeva et al. (2015)). 다른 한편으로, 비용해성 스트레인의 종양용해 효과는 주로 항종양 활성을 초래하는 면역 반응을 자극하는 그것의 능력으로부터 비롯된다(Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30). 종양요법에 일반적으로 이용되는 중간 용해성 스트레인으로는 PV701(MK107), MTH-68/H 및 73-T를 들 수 있고, 일반적으로 이용되는 약독형 비용해성 스트레인으로는 HUJ, Ulster 및 Hitchner-B1을 들 수 있다(Tayeb et al. (2015); Lam et al. (2011); Beck et al. (2006) Mol. Ther. 13(1):221-228).
NDV의 종양용해 바이러스로서의 용도는 1950년대 초반에 처음 보고되었는데, 그때에는 아데노바이러스 및 NDV가 직접 자궁 암종에 주사되었고, 부분적인 괴사를 초래하였다. 그러나, 바이러스에 대한 중화 항체의 생성에 의한 종양용해 활성의 억제의 가능성으로 인해 종양 재성장이 관찰되었다(Lam et al. (2011) Journal of Biomedicine and Biotechnology, Article ID 718710). 보다 최근에, NDV 스트레인 PV701은 1상 시험에서 대장암에 대한 유망한 활성을 나타냈고(Laurie et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(8):2555-2562), 한편 NDV 스트레인 73-T가 섬유육종, 골육종, 신경모세포종 및 경부 암종을 포함한 다양한 인간 암 세포주에 대한 시험관내 종양용해 활성뿐만 아니라, 인간 신경모세포종, 섬유육종 이종이식 및 결장, 폐, 유방 및 전립선암 이종이식을 포함한 여러 암종 이종이식을 보유하는 마우스에서 생체내 치료 효과를 입증하였다 (Lam et al. (2011)). NDV 스트레인 MTH-68/H는 PC12, MCF7, HCT116, DU-145, HT-29, A431, HELA, 및 PC3 세포를 포함한, 종양 세포주의 유의한 퇴행을 초래하였고, 흡입에 의해 투여되었을 때 진행성 암을 가진 환자에서 바람직한 반응을 입증하였다(Lam et al. (2011)). 비용해성 스트레인 Ulster는 결장 암종에 대해 세포독성 효과를 입증한 한편, 용해성 스트레인 Italien은 인간 흑색종을 효과적으로 사멸시켰다(Lam et al. (2011)). 약독형 NDV 스트레인 HUJ는 환자에게 정맥내로 투여되었을 때 재발하는 신경교모세포종 다형성에 대해 종양형성 활성을 입증한 한편, 약독형 스트레인 LaSota는 대장암 환자에서 생존을 연장시켰으며(Lam et al. (2011); Freeman et al. (2006) Mol. Ther. 13(1):221-228) 비-소세포 폐 암종(A549), 교모세포종(U87MG 및 T98G), 유선 선암종(MCF7 및 MDA-MB-453) 및 간세포 암종(Huh7) 세포주를 감염시키고 사멸시킬 수 있었다(Ginting et al. (2017) Oncolytic Virotherapy 6:21-30).
유전자 조작된 NDV 스트레인은 또한 종양용해 요법에 대해 평가되었다. 예를 들어, 인플루엔자 NS1 유전자, IFN 길항물질이 NDV 스트레인 Hitchner-B1의 게놈에 도입되어 다양한 인간 종양 세포주 및 B16 흑색종의 마우스 모델에서 향상된 종양용해 효과를 초래하였다(Tayeb et al. (2015)). NDV의 항종양/면역자극 효과는 IL-2 또는 GM-CSF 유전자의 바이러스 게놈으로의 도입에 의해 증대되었다(Lam et al. (2011)).
유리 바이러스의 사용에 더불어, 연구는 NDV 종양용해물, NDV-감염된 세포-기반 비히클, 및 암 요법을 위한 다른 비암 작용제와의 병용 요법의 사용을 평가하였다. 여러 임상 시험에서, NDV 종양용해물은 악성 흑색종에 대한 종양용해 활성을 입증하였다(Lam et al. (2011)). NDV-감염된 세포-기반 운반체의 사용 또한 성공적으로 입증되었다. NDV로 감염된 자가 종양 세포주는 대장, 유방, 난소, 신장, 두경부암 및 교모세포종에 대해 성공적으로 사용되었다(Lam et al. (2011)). NDV 스트레인 MTH-68/H로 감염된 골수, 지방 및 제대로부터 유래된 MSC는 바이러스를 공동 배양된 A172 및 U87 신경교종 세포 및 신경교종 줄기 세포에 전달하여, 신경교종 세포에서 용량-의존성 세포 사멸, 신경교종 줄기 세포에서 저수준의 세포자멸사 및 자체-재생의 억제, 및 네이키드 바이러스로의 직접 감염보다 높은 수준의 세포자멸사를 초래하였다(Kazimirsky et al. (2016) Stem Cell Research & Therapy 7:149). 전신성 CTLA-4 항체 투여와 함께 종양내 NDV 주사를 사용하는 병용 요법은 사전에 확립된 원거리 종양의 효율적인 거부반응을 초래하였다(Matveeva et al. (2015)).
파보 바이러스(Parvovirus)
H-1 파보 바이러스(H-1PV)는 천연 숙주가 래트인, 파르보비리다에(Parvoviridae) 과에 속하는 작은, 외피가 없는 단일 가닥의 DNA 바이러스이다(Angelova et al. (2017) Front. Oncol. 7:93; Angelova et al. (2015) Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:55). H-1PV는 인간에 대해 비병원성이며, 그것의 유리한 안전한 프로파일, 인간에서의 기존의 H-1PV 면역의 부재 및 그것의 숙주 세포 게놈 통합의 결여로 인해 종양용해 바이러스로서 매력적이다(Angelova et al. (2015)). H-1PV는 유방, 위, 경부, 뇌, 췌장 및 대장암의 전임상 모드를 포함하는 고형 종양뿐만 아니라, 림프종 및 백혈병을 포함한 혈액 악성 전부에 대한 광범위한 종양억제 잠재력을 증명하였다(Angelova et al. (2017)). H-1PV는 종양-관련 항원의 증가된 제시, 수지상 세포의 성숙 및 전염증성 사이토카인의 방출을 통해 항-종양 반응을 자극한다(Moehler et al. (2014) Frontiers in Oncology 4:92). H-1PV는 또한 세포 복제 및전사 인자의 이용성, NS1 파보바이러스 단백질과 상호작용하는 세포 단백질의 과다발현, 및 정상 세포가 아닌 종양 세포에서 NS1의 기능적 조절에 관여하는 대사 경로의 활성화로 인한 것이라 여겨지는 종양 선택성을 나타낸다(Angelova et al. (2015) Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:55). H-1PV의 무해한 본성으로 인해, 야생형 스트레인이 자주 이용되어, 유전자 조작에 의한 약독화 필요성이 없게 한다(Angelova et al. (2015)).
연구는 인간 신경교종 세포의 종양용해 H-1PV 감염이 효율적인 세포 살해를 초래하였고, 고급 신경교종 줄기 세포 모델이 또한 용해성 H-1PV 감염에 허용적인 것을 나타냈다. 신경교종 세포의 향상된 살해가 바이러스가 종양 세포 조사 직후 적용되었을 때 관찰되었고, 이것은 이 프로토콜이 비절제성 재발성 교모세포종에 유용할 수 있음을 나타낸다(Angelova et al. (2017)). 뇌내 또는 전신성 H-1PV 주사는 정위의 RG-2 종양을 가진 면역경합 래트뿐만 아니라, 인간 U87 신경교종으로 이식된 면역결핍 동물에서 독성 부작용 없이 신경교종의 퇴행으로 이어졌다(Angelova et al. (2015)). 인간 형질전환된 세포주에서 더 높은 감염성 및 확산을 가진 피트니스 변이체인 Del H-1PV는 췌장암 및 자궁경부 암종 이종이식 모델에서 생체내 종양용해 효과를 입증하였다(Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301). H-1PV는 또한 5개의 인간 골육종 세포주(CAL 72, H-OS, MG-63, SaOS-2, U-2OS)의 패널에 대해(Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301) 및 인간 흑색종 세포(SK29-Mel-1, SK29-Mel-1.22)에 대해(Moehler et al. (2014) Frontiers in Oncology 4:92) 종양용해 활성을 입증하였다. 다른 연구에서, 자궁경부 암종 이종이식을 보유하는 누드 래트는 H-1PV로의 치료 후에 용량-의존성 종양 성장 억제 및 퇴행을 입증하였다(Angelova et al. (2015)). H-1PV의 종양내 및 정맥내 투여는 또한 면역손상된 마우스에서 인간 유방 암종 이종이식에서 유의한 성장 억제를 입증하였다(Angelova et al. (2015)). 인간 위 암종 또는 인간 버킷 림프종-보유 마우스에서 종양내 H-1PV 주사는 종양 퇴행 및 성장 억제를 초래하였다(Angelova et al. (2015)).
재발 교모세포종 다형성 환자에서 종양용해 H-1PV(ParvOryx01)의 제1 상 I/IIa 임상 시험은 2015년에 완료되었고(임상 시험 NCT01301430), 유리한 진행이 없는 생존, 임상적 안전성 및 종양내 또는 정맥내 주사에 대한 환자 내약성을 입증하였다(Angelova et al. (2017); Geiss et al. (2017) Viruses 9, 301; Geletneky et al. (2017) Mol. Ther. 25(12):2620-2634). 이 시험은 H-1PV의 용량-의존성 방식으로 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 능력 및 대부분 CD8+ 및 CD4+ T 림프구에 의해 백혈구 침윤, 및 퍼포린, 그랜자임 B, IFNγ, IL-2, CD25 및 CD40L을 포함한 여러 면역 세포 활성화 마커의 국소적으로 치료된 종양에서의 검출을 특징으로 하는 면역원성 항종양 반응을 확립하는 능력을 입증하였다(Geletneky et al. (2017) Mol. Ther. 25(12):2620-2634).
H-1PV는 또한 겜시타빈에 내성인 것들을 포함한, 시험관내에서 매우 공격적인 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 효율적인 살해를 입증하였고, H-1PV의 종양내 주사는 PDAC의 정위 래트 모델에서 종양 퇴행 및 연장된 동물 생존을 초래하였다(Angelova et al. (2017); Angelova et al. (2015)). 선택적 종양 표적화 및 독성의 부재를 포함하는 유사한 결과가 면역결핍 누드 래트 PDAV 모델에서 관찰되었다(Angelova et al. (2015)). H-1PV 및 세포정지(시스플라틴, 빈크리스틴) 또는 표적화된(수니티닙(sunitinib)) 약물의 조합은 인간 흑색종 세포에서 세포자멸사의 상조적 유도를 초래한다(Moehler et al. (2014)). H-1PV 및 발프로산, HDAC 억제제의 조합은 경부 및 훼장 세포를 향한 상조적 세포독성을 초래한 한편(Angelova et al. (2017)), 겜시타빈의 치료 효율은 H-1PV와 2단계 프로토콜로 조합되었을 때 상당히 개선되었다(Angelova et al. (2015)). 다른 바이러스와 같이, H-1PV는 또한 항암 분자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 연구 결과 아폽틴을 발현하는 파보 바이러스-H1-유래 벡터가 야생형 H-1PV보다 세포자멸사를 유도하는 능력이 더 큰 것으로 나타났다(Geiss et al. (2017)).
다른 종양용해 바이러스와 같이, 파보 바이러스의 치료 잠재력은 그것을 인식하는 세포 표면 수용체의 편재성 발현으로 인해, 및 반복된 투여 후 중화 항체의 발생으로 인한 비특이적 흡수에 의해 제한된다. 그러나, H-1PV는 이들 잠재적 문제를 피하는 세포-기반 비히클과 조합될 때 성공적인 항종양 효과를 입증하였다. 한 연구에서, 자가 MH3924A 래트 간종양 세포가 H-1PV의 표적화된 전달 및 동일한 세포에 의해 형성된 전이의 억제에 성공적으로 사용되었다(Raykov et al. (2004) Int. J. Cancer 109:742-749). 간종양 세포는 H-1PV로의 감염 후 24시간 후에 γ-방사선에 의해 비활성화되었고, 이것만으로 자손 바이러스 수율이 2배 이하로 감소되었다. 직접 바이러스 주사와 비교하여, 비히클 세포-기반 치료법은 개선된 전이 억제 및 더 적은 수의 중화 항체의 생성을 초래하며, 이것은 종양용해 파보 바이러스를 전신적으로 전달하기 위한 운반 세포의 용도를 지지한다(Raykov et al. (2004)).
홍역 바이러스(Measles Virus)
홍역 바이러스(MV)는 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses) 과에 속하는 음-센스 게놈을 가진 외피가 있는, 단일 가닥 RNA 바이러스이다(Aref et al. (2016) Viruses 8:294; Hutzen et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:109-118). 그것의 비-분할 게놈은 안정적이며, 돌연변이 및 그것의 병원성 형태로 반전될 위험이 적고, 세포질에서의 복제로 인해 감염됨 세포에서 삽입 DNA 돌연변이의 위험이 없다(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015)). MV는 1954년에 에드몬스턴이라 불리는 환자로부터 처음 분리되었고, 우수헌 안전성 프로파일을 가진 생백신으로 개발되어, 다중 시험관내 계대 후 약독화에 의해 50년 동안 십억명 이상의 개체를 성공적으로 보호하였다(Aref et al. (2016) Viruses 8:294; Hutzen et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:109-118). MV-Edm으로 표시된 이 스트레인의 유도체가 종양용해 요법 연구에서 가장 일반적으로 사용된 MV 스트레인이다. 그러나, Schwarz/Moraten 홍역 백신 스트레인이 Edm 유도체보다 더 약독화되고 면역원성이어서, 그것을 보다 안전하고 보다 면역조절성으로 만든다(Veinalde et al. (2017) Oncoimmunology 6(4):e1285992). 야생형 MV의 종양용해 효과는 1970년대에 기록되었는데, 급성 림프모세포성 백혈병, 버킷 림프종 및 호지킨 림프종을 가진 환자에서 개선이 보고되었다(Aref et al. (2016)).
MV는 표적 세포에 들어가기 위하여 3개의 주요 수용체를 이용한다: CD46, 넥틴-4 및 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM)(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015)). 활성화된 B 및 T 세포, 미성숙 흉선세포, 단핵 세포 및 수지상 세포 상에 발현되는 SLAM이 야생형 스트레인에 대한 주요 수용체인 반면, 약독화된 및 종양-선택적 MV-Edm 스트레인은 주로 많은 종양 세포에서 과다발현되는 보체 활성화 조절자인 CD46 수용체를 표적으로 한다(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015); Jacobson et al. (2017) Oncotarget 8(38):63096-63109; Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4)). 호흡기 상피에서 우선적으로 발현되는 넥틴-4는 야생형 및 약독화된 MV 스트레인 둘 다에 의해 이용된다(Aref et al. (2016); Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4)). 다른 종양용해 바이러스와 같이, 종양 세포의 IFN 항바이러스 반응의 결핍은 MV의 종양-선택성을 용이하게 한다(Aref et al. (2016); Jacobson et al. (2017) Oncotarget 8(38):63096-63109). 현재 다발성 골수종(NCT02192775, NCT00450814), 두경부암(NCT01846091), 중피종(NCT01503177), 및 난소암(NCT00408590, NCT02364713)을 포함하여, 여러 암의 치료에서 MV의 잠재력을 조사하는 여러 임상 시험이 있다.
MV는 IL-13, INF-베타, GM-CSF 및 헬리코박터 파일로리 호중구-활성화 단백질(NAP)을 암호화하는 것을 포함한, 면역-자극 및 면역조절 유전자를 발현하기 위해 유전자 조작되었다(예를 들어(Aref et al. (2016), Hutzen et al. (2015); Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4)). 항-CTLA4 및 항-PD-L1 항체와 함께 종양용해 MV를 이용하는 병용 요법이 흑색종 마우스 모델에서 성공적으로 증명되었다(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015)). 광범위한 백신 접종 또는 이전의 자연 감염으로 인해, 대부분의 환자가 MV에 대한 사전 면역을 가지며 이것이 치료 잠재력을 방해한다. 이것을 피하기 위하여, MV는 운반 세포, 예컨대 중간엽 기질 세포에 담겨 종양에 전달되어, 숙주 중화 항체를 효과적으로 피하고 급성 림프모세포성 백혈병, 간세포 암종 및 난소 암종의 전임상 모델에서 효과적인 것으로 증명되었다(Aref et al. (2016)). U-937 단핵세포성 세포주, 미성숙 및 성숙 일차 수지상 세포, PMBC, 활성화된 T 세포, 일차 CD14+ 세포, 다발성 골수종 MM1 세포주 및 혈액 파생물 내피 세포를 포함한, 여러 다른 세포 운반체가 MV의 전달을 위해 유망한 결과를 입증하였다(Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4)). 현재, 임상 시험(NCT02068794)은 재발성 난소암을 가진 환자의 치료에서 종양용해 MV 감염된 중간엽 줄기 세포의 사용을 연구중이다. 기존의 면역을 극복하기 위한 또 다른 전략은 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제와 MV 치료법의 조합을 포함한다(Hutzen et al. (2015)).
MV-CEA
종양 마커 암종배아 항원(CEA)을 발현하기 위해 유전자 조작된 MV-CEA는 암세포의 감염 후에 환자의 혈류로 CEA의 방출을 초래하여 CEA 수준의 검출을 가능하게 함으로써 생체내 바이러스 감염의 추적이 가능해진다(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015)). MV-CEA의 치료 잠재력은 전임상적으로 입증되었고, 현재 난소암 (NCT00408590)의 치료를 위해 1상 임상 시험으로 조사되고 있다.
MV-NIS
요오드화 나트륨 동반수송체(NIS)를 발현하도록 조작된 MV-NIS는 에드몬스턴 백신 계통의 또 다른 추적 가능한 종양용해 MV로, MV-CEA 구성물에서와 같이 뉴클레오캡시드(N) 유전자의 상류 대신, MV 게놈의 헤마클루티닌(H) 유전자의 하류에 NIS 도입유전자의 배치로 인해 MV-CEA와 비교하여 월등한 바이러스 증식을 나타낸다(Aref et al. (2016); Galanis et al. (2015) Cancer Res. 75(1):22-30). 123I, 124I, 125I, 131I 및 99mTc와 같은 방사성 동위원소가 MV-NIS 감염된 세포 상에 발현되는 NIS를 통해 수송됨으로써, 예를 들어, PET, SPECT/CT, 및 γ 카메라를 사용하는 비침습성 영상화가 가능해진다(Msaouel et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(4)). NIS의 발현은 또한 방사성바이러스 요법을 위해 베타-방출 방사성 동위원소, 예컨대 I-131의 종양 세포에의 유입을 용이하게 함으로써 종양용해 MV의 효능을 개선시킬 수 있고, 다발성 골수종, 교모세포종 다형성, 두경부암, 역형성 갑상선암 및 전립선암 모델에서 전임상적으로 유망한 결과를 입증하였다(Aref et al. (2016); Hutzen et al. (2015); Msaouel et al. (2013)). 여러 1상/2상 임상 시험이 현재 다발성 골수종(NCT00450814, NCT02192775), 중피종(NCT01503177), 두경부암(NCT01846091)에서 MV-NIS를 사용하여, 그리고 바이러스-감염된 MSC를 사용하여 난소암(NCT02068794)에서 조사되고 있다.
레오바이러스(Reovirus)
일반적으로 레오바이러스로 알려져 있는, 호흡기 장 고아 바이러스는 인간에 대해 비병원성인 레오비리다에(Reoviridae) 과의 외피가 없는 이중 가닥 RNA 바이러스이다. 야생형 레오바이러스는 환경 전반에 걸쳐 편재하여서, 일반 인구에서 70-100% 혈청양성을 초래한다(Gong et al. (2016) World J. Methodol. 6(1):25-42). 레오바이러스에는 3가지 혈청형이 있는데, 타입 1 Lang, 타입 2 Jones, 타입 3 Abney 및 타입 3 Dearing(T3D)이다. T3D는 전임상 및 임상 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 자연적으로 발생하는 종양용해 레오바이러스 혈청형이다.
종양용해 레오바이러스는 암 세포의 특징인 활성화된 Ras 신호전달로 인해 종양-선택적인 것으로 여겨진다(Gong et al. (2016)); Zhao et al. (2016) Mol. Cancer Ther. 15(5):767-773). Ras 신호전달 경로의 활성화는 일반적으로 바이러스 단백질 합성을 방지하는 것을 담당하는 단백질인 dsRNA-의존성 단백질 키나제(PKR)의 인산화를 억제함으로써 세포의 항바이러스 반응을 파괴한다(Zhao et al. (2016)). Ras 활성화는 또한 바이러스 코팅 제거 및 분해를 향상시켜서, 향상된 바이러스 자손 생성 및 감염성을 초래하며, 향상된 세포자멸사를 통해 자손의 방출을 가속화한다(Zhao et al. (2016)). 모든 인간 종양의 대략 30%가 일탈된 Ras 신호전달을 나타내는 것으로 추정된다(Zhao et al. (2016)). 예를 들어, 대부분의 악성 신경교종은 활성화된 Ras 신호전달 경로를 가지며, 레오바이러스는 시험관내에서 악성 신경교종 세포의 83%에서뿐만 아니라, 생체내에서 인간 악성 신경교종 모델에서, 및 생체외에서 100%의 신경교종 시편에서 항종양 활성이 입증되었다(Gong et al. (2016) World J. Methodol. 6(1):25-42). 추가적으로, 췌장 선암종은 매우 높은 Ras 돌연변이 발생률을 보이며(대략 90%), 레오바이러스는 시험관내에서 테스트된 췌장 세포주의 100%에서 강력한 세포독성을 나타냈고 생체내에서 피하 종양 마우스 모델의 100%에서 퇴행을 유도하였다(Gong et al. (2016)).
레오바이러스는 결장, 유방, 난소, 폐, 피부(흑색종), 신경, 혈액, 전립선, 방광, 및 두경부 암을 포함한 악성종양 스펙트럼에 걸쳐 전임상적으로 광범위한 항암 활성을 입증하였다(Gong et al. (2016)). 레오바이러스 요법은 현재 방사선요법, 화학요법, 면역요법, 및 수술과의 조합이 테스트되고 있다. 레오바이러스와 방사선요법의 조합은 시험관내에서 두경부, 대장 및 유방암 세포주의 치료에서, 뿐만 아니라 생체내에서 대장암 및 흑색종 모델에서 유익한 것으로 증명된다(Gong et al. (2016)). 레오바이러스와 겜시타빈, 뿐만 아니라 레오바이러스, 파클리탁셀 및 시스플라틴의 조합이 마우스 종양 모델에서 성공적인 것으로 증명되었다(Zhao et al. (2016)). B16 흑색종 마우스 모델에서의 전임상 연구는 종양용해 레오바이러스와 항-PD-1 요법의 조합이 레오바이러스 단독과 비교하여 개선된 항암 효능을 입증한 것을 보여주었다(Gong et al. (2016); Zhao et al. (2016); Kemp et al. (2015) Viruses 8, 4).
레오바이러스에 의해 입증된 유망한 전임상 결과는 많은 임상 시험으로 이어졌다. 캐나다 회사 Oncolytics Biotech Inc.에 의해 개발된 Reolysin®은 임상 개발된 유일한 치료용 야생형 레오바이러스이고, 많은 악성종양에서 단독으로, 및 다른 치료법과 함께 항암 활성을 입증하였다. 예를 들어, 재발성 악성 신경교종(NCT00528684)의 치료에서 Reolysin®의 1상 임상 연구는 레오바이러스가 잘 허용된 것으로 나타난 한편, 1/2상 시험은 Reolysin®이 백금 화학요법(NCT00602277)에 반응하지 않은 난소 상피암, 원발성 복막암, 또는 난관암을 가진 환자에서 정상 세포를 손상시키지 않으면서 종양 세포를 사멸할 수 있는 것으로 나타났다. Reolysin®의 2상 임상 시험은 폐에 전이된 뼈 및 연조직 육종(NCT00503295)을 가진 환자의 치료에서 그것이 안전하고 효과적인 것으로 나타났다. FOLFIRI 및 베바시주맙과 조합된 Reolysin®의 1상 임상 시험은 현재 전이성 대장암(NCT01274624)을 가진 환자에서 활성이다. 화학요법제 겜시타빈과 조합된 Reolysin®의 2상 임상 시험이 진행성 췌장 선암종(NCT00998322)을 가진 환자에서 수행되었고, 2상 임상 연구는 전이성 거세 저항성 전립선암(NCT01619813)에서 도세탁셀과 조합된 Reolysin®의 치료 잠재력을 조사하였으며, 2상 임상 시험이 진행성/전이성 유방암(NCT01656538)을 가진 환자에서 파클리탁셀과 Reolysin®의 조합을 조사하였다. 3상 임상 시험이 백금-내성 두경부암(NCT01166542)에서의 파클리탁셀 및 카르보플라틴과 조합된 Reolysin®의 효능을 조사한 한편, 이 병용 요법을 사용하는 2상 임상 연구가 비-소세포 폐암(NCT00861627) 및 전이성 흑색종(NCT00984464)을 가진 환자에서 수행되었다. 재발된 또는 난치성 다발성 골수종을 가진 환자에서 카르필조밉(carfilzomib) 및 덱사메타손과 조합된 Reolysin®의 1상 임상 시험이 진행중이다(NCT02101944).
대부분의 인구에서 중화 항체의 존재로 인해, 레오바이러스의 전신적 투여는 치료 잠재력을 제한하였고, 이것은 레오바이러스와 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린 A 또는 사이클로포스파미드의 공동 투여로 극복될 수 있다(Gong et al. (2016)). 레오바이러스의 정맥내 투여 전에 GM-CSF의 투여는 마우스에서 B16 흑색종 종양의 상당한 감소 및 연장된 생존을 초래하였다(Kemp et al. (2015) Viruses 8, 4). 운반 세포는 또한 기존 면역으로부터 바이러스를 차폐하는 데 성공적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, 림포카인-활성화 살해 세포(LAKs) 및 DC는 난소암의 모델에서 레오바이러스를 위한 세포 운반체로서 사용되었고, 바이러스를 중화 항체로부터 성공적으로 보호하였다(Zhao et al. (2016)). NK 세포를 포함한 PMBC는 성공적으로 레오바이러스를 수송할뿐만 아니라 또한 종양 표적을 사멸시키기 위해 레오바이러스에 의해 자극된 것으로 나타났다(Zhao et al. (2016)). 또 다른 연구는 DC 및 T 세포가 둘 다 인간 혈청의 부재시에 시험관내에서 레오바이러스의 효과적인 운반체였지만, DC만이 중화 혈청의 존재 하에 바이러스를 흑색종 세포로 성공적으로 전달한 것을 보여주었다(Ilett et al. (2011) Clin. Cancer Res. 17(9):2767-2776). DC는 또한 림프절 B16tk 흑색종 전이를 보유한 마우스에서 레오바이러스를 전달할 수 있었던 반면, 순수한 레오바이러스는 완전히 비효과적이었다(Ilett et al. (2009) Gene Ther. 16(5):689-699).
수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 과 내의 베시큘로바이러스(Vesiculovirus) 속의 구성원이다. 음-센스 극성을 가진 단일 가닥 RNA로 구성된 그것의 게놈은 11,161개의 뉴클레오타이드로 이루어지며 5개의 유전자: 뉴클레오캡시드 단백질(N), 인단백질(P), 기질 단백질(M), 당단백질(G), 및 큰 중합효소 단백질(L)을 암호화한다(Bishnoi et al. (2018) Viruses 10(2), 90). VSV는 곤충 벡터에 의해 전파되며 질환은 말, 소 및 돼지를 포함한 자연 숙주에 한정되고, 인간에서는 경미한 및 무증상 감염이 된다(Bishnoi et al. (2018) Viruses 10(2), 90). VSV는 감염된 세포에서 세포자멸사의 강력하고 신속한 유도자이고, 화학요법-내성 종양 세포를 감작시키는 것으로 나타났다. VSV는 종양 혈관구조를 감염시켜서, 종양에 대한 혈류의 손실, 혈액 응고 및 신생혈관의 용해를 초래하는 것으로 나타났다. 이 바이러스는 또한 복제할 수 있고 저산소 조직에서 세포병변 효과및 세포 용해를 유도할 수 있다. 더불어, 야생형 VSV는 다양한 조직 배양 세포주에서 고역가로 성장하여, 대규모 바이러스 생성을 용이하게 하고, 작고 용이한 게놈을 조작을 가지며, 숙주 세포 형질전환의 위험 없이 세포질에서 복제한다(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili(2017) Journal of General Virology 98:2895-2911). 이들 인자는 그것이 인간에 대해 비병원성이고 일반적으로 VSV에 대한 기존의 인간 면역이 없다는 사실과 함께, 그것을 바이러스 용해요법에 대한 양호한 후보로 만든다.
비록 VSV가 편재하게 발현된 세포-표면 분자에 부착할 수 있어서 그것을 "범친화적"으로 만들 수 있어도, 야생형 VSV는 타입 I IFN 반응에 민감하며 그로써 종양의 결핍성 또는 억제된 타입 I IFN 신호전달을 토대로 종양선택성을 나타낸다(Felt and Grdzelishvili(2017)). 그러나, 그것의 정상 세포의 감염성으로 인해, VSV는 신경병원성을 유발할 수 있지만, 그것의 기질 단백질 및/또는 당단백질을 변형시킴으로써 약독화될 수 있다. 예를 들어, 기질 단백질은 결실될 수 있거나 기질 단백질의 위치 51에서 메티오닌 잔기가 결실되거나 아르기닌으로 대체될 수 있다(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili(2017)). 또 다른 접근법은 VSV의 당단백질을 림프루성 맥락수막염 바이러스(LCMV)(rVSV-GP)의 당단백질로 교체한다(Bishnoi et al. (2018); Felt and Grdzelishvili(2017)). VSV는 또한 종양용해 활성을 향상시키기 위하여 자살 유전자, 예컨대 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(TK)를 포함하도록, 또는 IL-4, IL-12, IFNβ와 같은 면역-자극 사이토카인, 또는 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자 1(GM-CSF1)과 같은 공동자극제를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다(Bishnoi et al. (2018)). NIS 및 IFNβ를 암호화하는 VSV-IFNβ-요오드화 나트륨 동반수송체(VSV-IFNβ-NIS)는 현재 미국에서 여러 1상 임상 시험으로 테스트되고 있다(시험 NCT02923466, NCT03120624 및 NCT03017820에 대한 상세한 내용은 ClinicalTrials.gov 참조).
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 다양한 쥐과 암 모델에서 정맥내로(IV) 투여될 때 효과적인 종양용해 치료제이다. 한 연구에서, VSV-GP는 면역 결핍 마우스 모델에서 피하 이식된 G62 인간 신경교모세포종 세포의 종양내 치료에서뿐만 아니라, 정위 U87 인간 신경교모세포종 세포의 정맥내 치료에서 성공적이었다. VSV-GP의 종양내 주사는 또한 두개내 CT2A 쥐과 신경교종 세포에 대해 효과적이었다(Muik et al. (2014) Cancer Res. 74(13):3567-3578). VSV-GP는 검출 가능한 중화 항체 반응을 유도하지 않았고, 이 유전자 변형된 종양용해 바이러스는 인간 보체에 대해 민감하지 않아서, 긴 실험 기간 동안 안정하게 유지된 것으로 나타났다(Muik et al. (2014)). 다른 예에서, VSV-GP의 종양내 투여는 마우스 모델에서 이식된 인간 A375 악성 흑색종 세포뿐만 아니라 쥐과 B16 흑색종 세포주를 효과적으로 감염시키고 사멸시키는 것으로 나타났다(Kimpel et al. (2018) Viruses 10, 108). 그러나, 종양용해 바이러스의 정맥내 주사는 성공적이지 않았고, 종양내 투여된 그룹에서도, 종양은 모두 결국 타입 I IFN 반응으로 인해 성장하였다(Kimpel et al. (2018)). 또 다른 연구에서, A2780 인간 난소암 세포를 가진 피하 이종이식 마우스 모델은 VSV-GP의 종양내 주사로 처리되었고, 비록 신경독성이 없는 종양 관해가 초기에 관찰되었지만, 관해는 일시적이었고 종양이 재발되었다. 이것은 VSV-GP를 JAK1/2 억제제 룩소리티닙(Ruxolitinib)과 조합함으로써 항바이러스 상태의 반전이 관찰된, 타입 I IFN 반응으로 인한 것으로 나타났다(Dold et al. (2016) Molecular Therapy - Oncolytics 3, 16021). 그러나, 타입 I IFN 반응의 억제는 자주 안전성 문제로 인해 생체내에서 야생형 VSV의 약독화된 변이체에 대해서는 가능하지 않아 대체 해결책에 대한 필요성이 유발된다.
연구 결과, 항바이러스 항체를 유발시키는 체액성 면역은 VSV의 치료 잠재력을 제한하는 것으로 나타났다. 전이성 종양을 함유한 동물에 운반 세포 중의 VSV의 반복된 투여는 네이키드 버전의 주사와 비교하여 훨씬 더 높은 치료 효능을 초래한 것으로 나타났고(Power et al. (2007) Molecular Therapy 15(1):123-130), 이것은 순환하는 항체를 회피하는 운반 세포의 능력을 입증한다. 동계 CT26 쥐과 결장 암종 세포가 VSV로 쉽게 감염되었고, 정맥 내 투여 후에, 주변의 정상 폐 조직에서가 아닌 폐 종양에서 쉽게 축적되었으며, 마우스에서 폐 종양을 감염시키기 위해 VSV가 전달될 때 24시간 내에 바이러스를 방출하고 용해가 진행될 때까지 유지되었다(Power et al. (2007)). 전신성 세포-매개 전달이 또한 운반 세포로서 이종이식 A549 세포를 사용하여 얻어졌고, 이것은 VSV의 세포-매개 전달이 면역학적으로 부적합한 이종이식 A549 세포뿐만 아니라 면역학적으로 적합한 동계 CT26 세포를 사용하여 이루어질 수 있음을 예시한다 (Power et al. (2007)). L1210 쥐과 백혈병 세포가 또한 VSV를 폐 종양뿐만 아니라, 마우스의 뒷 옆구리에 위치한 피하 종양에 성공적으로 전달하였다(Power et al. (2007)). 이들 VSV 감염된 백혈병 세포가 종양이 없는 마우스에 투여되었을 때, 정상 조직에서는 검출 가능한 바이러스 복제가 없었고, 이것은 종양 선택성을 가리킨다.
또 다른 연구에서, 기질 단백질의 메티오닌 51이 없고 따라서 IFN-암호화 mRNA의 핵 유출을 차단할 수 없는 VSV-δ51이, B16ova 종양에 의해 발현된 오브알부민 항원의 SIINFEKL 에피토프에 대해 특이적인 유전자도입 T 세포 수용체를 발현하는 OT-I CD8+ T 세포 위로 로딩되었다(Qiao et al. (2008) Gene Ther. 15(8):604-616). 이 종양용해 바이러스/세포-기반 비히클 조합은 면역-경합 C57B1/6 마우스의 폐의 B16ova 종양에 대해 사용되었고, 바이러스 또는 T 세포 단독의 사용과 비교할 때 치료 효능의 유의한 증가를 초래하였다. OT-1 세포 내에서는 VSV의 검출 가능한 복제가 없었지만, 바이러스는 방출되었고 효과적으로 감염시켰으며, 감염된 T 세포와 B16ova 세포의 공동 배양 후에 그 안에서 복제되었고, 종양 세포를 사멸시켰다. VSV의 T 세포 위로의 로딩은 시험관내에서 T-세포 활성화를 증가시키고 생체내에서 T 세포의 종양으로의 이동을 증가시키는 것으로 나타났다(Qiao et al. (2008)).
아데노바이러스 (Adenovirus)
아데노바이러스(Ad)는 1953년에 Wallace Rowe와 동료들에 의해 처음 발견된 선형 게놈을 가진 외피가 없는 ds-DNA 바이러스이며, 1956년이라는 초기에 자궁경부암의 치료를 위해 테스트되었다(Choi et al. (2015) J. Control. Release 10(219):181-191). 인간 Ad는 환경 전반에 걸쳐 있고 교차-민감성을 토대로 57개의 혈청형(Ad1-Ad57), 및 병독성 및 조직 향성을 토대로 7개의 하위그룹(A-G)으로 분류된다. 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)는 종양용해 바이러스 요법을 위해 가장 일반적으로 사용되는 아데노바이러스이다. 인간에서의 감염은 경미하고 감기-유사 증상을 초래하며(Yokoda et al. (2018) Biomedicines 6, 33) 전신성 투여는 간 향성을 초래하고 간독성으로 이어질 수 있지만(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837), Ad는 치료 목적에 대해서는 안전한 것으로 여겨진다. Ad는 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체(CAR)에 부착하고, 이어서 세포 표면 상의 αvβ3 및 αvβ5 인테그린과 아데노바이러스 펜톤 염기에서의 Arg-Gly-Asp 삼펩타이드 모티프(RGD) 사이의 상호작용에 의해 세포에 들어간다(Jiang et al. (2015) Curr. Opin. Virol. 13:33-39). CAR은 대부분의 정상 세포 표면에서 발현되지만, 발현은 암세포 유형에 따라 고도로 가변적이다. 다른 한편으로, RGD-관련 인테그린은 암 세포에 의해 고도로 발현되지만, 정상 세포에서 훨씬 더 낮은 수준으로 발현된다(Jiang et al. (2015)). 그 결과로서, Ad는 자주 RGD 모티프를 통해 암 세포에 대해 표적화된다.
Ad는 형질전환된 세포에서의 높은 변환 효율, 숙주 게놈으로의 통합의 결핍/삽입 돌연변이생성의 결핍, 게놈 안정성, 그것의 게놈으로 큰 치료 유전자를 삽입하는 능력, 및 유전자 조, 예컨대 암 조직-선택적 프로모터로의 바이러스 프로모터의 치환작을 통한 종양 선택성에 대한 능력으로 인해 종양용해 바이러스로서 매력적이다(Yokoda et al. (2018) Biomedicines 6, 33; Choi et al. (2015) J. Control. Release 10(219):181-191).
종양-특이적 프로모터를 가진 종양용해 Ad의 예로는 전립선 특이적 항원 프로모터의 제어 하에 아데노바이러스 초기 영역 1A(E1A) 유전자, 및 EIA 유전자 발현의 조절을 위해 텔로머라제 역 전사효소(TERT) 프로모터를 사용하는 OBP-301을 포함한, 전립선암 치료를 위한 CV706을 들 수 있다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837). 종양 선택성을 유도하기 위한 다른 방법은 Ad 게놈의 E1 영역에 돌연변이를 유도하는 것으로, 여기서 누락된 유전자는 종양 세포에서 일반적으로 발견되는 유전자 돌연변이, 예컨대 망막모세포종(Rb) 경로의 비정상 또는 p53 돌연변이에 의해 기능적으로 보완된다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837). 예를 들어, 종양용해 Ad ONYX-015 및 H101은 E1B55K 유전자가 결실되어서 p53을 비활성화한다. 이들 돌연변이는 정상적인 세포자멸성 방어 경로를 차단할 수 없어서, 결핍성 p53 종양 억제자 경로로 신생물 세포의 감염을 통해 종양 선택성을 초래한다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Uusi-Kerttula et al. (2015) Viruses 7:6009-6042). E1A△24는 E1A 유전자에 24-bp 돌연변이를 함유한 종양용해 Ad로, Rb 경로 돌연변이를 가진 암 세포에서 Rb-결합 도메인을 파괴하고 바이러스 복제를 촉진한다. ICOVIR-5는 E2F 프로모터에 의한 E1A 전사 제어, E1A의 △24 돌연변이 및 아데노바이러스 섬유로의 RGD-4C 삽입을 조합한 종양용해 Ad이다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Uusi-Kerttula et al. (2015)). 델타-24-RGD, 또는 DNX-2401은 △24 골격이 RGD 모티프의 삽입에 의해 변형된 종양용해 Ad로, 시험관내에서 및 생체내에서 향상된 종양용해 효과를 입증하였다(Jiang et al. (2015)).
종양 선택성을 개선하기 위한 대체 전략은 세포외 기질(ECM)을 표적화함으로써 고형 종양의 물리적 장벽을 극복하는 것을 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다제를 발현하는 종양 용해 Ad인 VCN-01은 쥐과 암 모델에서 유망한 것으로 나타났다. Ad는 또한 ECM을 파괴하기 위해 릴랙신(relaxin)을 발현하도록 조작되었다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Shaw and Suzuki(2015) Curr. Opin. Virol. 21:9-15). 자살 유전자, 예컨대 시토신 탈아미노효소(CD) 및 HSV-1 티미딘 키나제(TK)를 발현하는 Ad는 GM-CSF를 발현하는 면역조절 사이토카인, 예컨대 ONCOS-102를 발현하는 Ad를 가지기 때문에 생체내에서 향상된 항종양 효능을 나타냈다(Yamamoto et al. (2017) Cancer Sci. 108:831-837; Shaw and Suzuki(2015) Curr. Opin. Virol. 21:9-15). 항-CTLA4 항체를 발현하는 △24-기반 종양용해 Ad는 전임상 연구에서 유망한 것으로 나타났다(Jiang et al. (2015)).
아데노바이러스 H101(Oncorine®)은 2005년에 진행성 비인두암을 가진 환자를 치료하기 위해, 화학요법과 함께 중국에서 임상 사용하도록 승인된 첫 번째 종양용해 Ad였다. 전임상 연구에서 나타난 유망함으로 인해, 많은 임상 시험이 광범위한 암의 치료를 위해 종양용해 아데노바이러스의 사용을 조사하였다. 예를 들어, 진행중인 및 과거의 임상 시험은 전이성 췌장암(NCT03281382) 환자에서 IL-12를 암호화하는 Ad5; 췌장 선암종, 난소암, 담즙 암종 및 대장암(NCT03225989) 환자에서 TMX-CD40L 및 41BBL을 발현하는 면역조절 Ad5(LOAd703); 췌장암(NCT02705196) 환자에서 겜시타빈 및 nab-파클리탁셀과 조합된 LOAd703; 췌장 선암종(NCT02045602; NCT02045589)을 포함한, 진행성 고형 종양 환자에서 겜시타빈 및 Abraxane®과 조합된 인간 PH20 히알루로니다제(VCN-01)를 암호화하는 종양용해 아데노바이러스; 간세포 암종(NCT02293850) 환자에서 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 프로모터를 함유하는, 종양 선택성을 가진 종양용해 Ad인 Telomelysin®(OBP-301); 간세포 암종(NCT01869088) 환자에서 경동맥 화학색전술(TACE)과 조합된 E1B 유전자 결실된 Ad5; 방광암(NCT02365818; NCT01438112) 환자에서, GM-CSF를 발현하고 E1A의 발현을 구동하기 위하여 암-특이적 E2F-1프로모터를 함유하는 종양용해 Ad인 CG0070; 결장암, 비-소세포 폐암, 방광암 및 신장 세포 암종(NCT02053220) 환자에서 Ad11p/Ad3 키메라 그룹 B 종양용해 바이러스인 Enadenotucirev(Colo-Ad1); 및 교모세포종 환자에서 테모졸로미드(Temozolomide)(NCT01956734)와 조합된 또는 IFNγ(NCT02197169)와 조합된 DNX-2401(Ad5 E1A△24RGD)을 포함하는 연구들을 포함한다.
다른 종양용해 바이러스와 같이, Ad는 중화 항체의 발생으로 인해 전신적으로 투여될 때 낮은 치료 효능을 경험하며, 그것의 높은 혈청 유병률로 인해 일부 인구의 90% 정도로 많은 인구가 Ad에 대한 사전 면역을 가지는 것으로 추정된다(Uusi-Kerttula et al. (2015) Viruses 7:6009-6042). 추가적으로, Ad의 비특이적인 간 격리는 간독성을 초래한다(Choi et al. (2015)). 중합체, 예컨대 PEG, 양전하의 아르기닌-이식된 생체환원성 중합체(ABP), PAMAMG5, 및 기타 나노물질이 바이러스 캡시드 단백질을 차폐하여 항바이러스 면역 반응 및 비특이적 간 축적을 경감시키고 종양 축적을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Choi et al. (2015)). 면역 체계를 회피하기 위한 다른 접근법은 종양용해 Ad를 전달하기 위한 운반체 비히클 세포의 사용을 포함한다. 예를 들어, T-세포가 정위 신경교종 줄기 세포(GSC)-기반 이종이식 쥐과 모델에서 시험관내에서 및 생체내에서 델타24-RGD Ad를 교모세포종 세포에 전달하기 위해 사용되었다(Balvers et al. (2014) Viruses 6:3080-3096). 바이러스-로딩된 T-세포의 전신적 투여는 종양내 바이러스 전달을 초래하였다(Balvers et al. (2014)). 운반체/비히클 세포로 Ad의 전달을 조사하는 임상 시험은 악성 신경교종(NCT03072134)의 치료를 위해 종양용해 Ad로 로딩된 신경 줄기 세포; 전이성 유방암(NCT00197522) 환자에서 Her2를 발현하는 Ad로 감염된 자가 수지상 세포; 전이성 및 난치성 고형 종양(NCT01844661)을 가진 아동 및 성인에서 ICOVIR5로 감염된 자가 중간엽 줄기 세포(MSC)의 사용을 포함한다.
폴리오 바이러스(Poliovirus)
폴리오 바이러스(PV)는 피코르나 비리다에(Picornaviridae ) 과의 엔테로바이러스(Enterovirus) 속에 속하며 양-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 가진다. PV 감염은 척수 및 운동 신경에 대한 PV의 향성으로 인해 중증의 신경학적 증후군 소아마비를 초래한다(Brown and Gromeier(2015) Discov. Med. 19(106):359-365). PV는 면역-자극 바이러스 세포독성 효과를 증폭시키기 위해 여러 회기의 바이러스 복제를 가능하게 하는, 활성 항바이러스 IFN 반응의 존재 하의 왕성한 복제 능력 및 세포독성의 보유로 인해 임상 적용에서 유용하다(Brown and Gromeier(2015) Discov. Med. 19(106):359-365). PV는 또한 숙주 세포 게놈에 통합하지 못한다(Yla-Pelto et al. (2016) Viruses 8, 57).
PV 숙주 세포 유입은 PV 수용체(PVR)로도 알려져 있는 Ig-수퍼패밀리 세포 부착 분자 CD155 및 고형 신생물, 예컨대 교모세포종에서 광범위하게 과다발현되는 넥틴-유사 분자 5(Necl5)에 의해 매개된다(Brown and Gromeier(2015) Curr. Opin. Virol. 13:81-85). CD155는 또한 대장 암종, 폐 선암종, 유방암 및 흑색종에서 발현되고, 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제공 세포(APC)에서 발현된다(Brown et al. (2014) Cancer 120(21):3277-3286).
PV의 내부 리보좀 진입 부위(IRES)는 PV RNA 게놈의 번역 개시 구동을 담당하며, PV의 신경병원성에 연루된다. Sabin 혈청형으로부터 유래된 생-약독화된 PV 백신은 IRES의 중요한 약독화 점 돌연변이를 운반한다(Brown and Gromeier(2015) Curr. Opin. Virol. 13:81-85). 동족 PV IRES가 인간 리노바이러스 2(HRV2)의 그것으로 대체된 타입 1(Sabin) 생-약독화된 PV 백신인 고도로 약독화된 폴리오-/리노바이러스 재조합 PVSRIPO는 모 PV와 비교하여 신경병독성/신경병원성을 나타내지 않지만, 암 세포 세포독성 및 GBM 세포를 향한 특이성을 보유하고 있다(Brown and Gromeier(2015) Curr. Opin. Virol. 13:81-85; Brown and Gromeier(2015) Discov. Med. 19(106):359-365). PVSRIPO는 부피가 큰 종양의 직접적인 용해보다는 항종양 면역 반응을 유도함으로써 종양 퇴행을 유발하고, 재발성 교모세포종(GBM)(NCT01491893)의 치료를 위한 임상 시험에서 유망한 것으로 나타났다(Brown and Gromeier(2015) Curr. Opin. Virol. 13:81-85; Brown and Gromeier(2015) Discov. Med. 19(106):359-365). 현재, 1b상 임상 시험이 아동에서의 재발성 악성 신경교종(NCT03043391)의 치료를 위해 PVSRIPO의 사용을 조사 중이며 2상 임상 시험이 재발성 악성 신경교종(NCT02986178)을 가진 성인 환자에서 PVSRIPO 단독, 또는 화학요법 약물 로무스틴과 조합된 PVSRIPO의 사용을 조사 중이다.
단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex Virus)
단순 헤르페스 바이러스(HSV)는 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 과에 속해 있고, 유전자 조작에 이상적인 후보로 만드는, 바이러스 복제에 필수적이지 않은 많은 유전자를 포함한, 큰 선형 이중 가닥의 DNA 게놈을 가진다. 다른 장점으로는 광범위한 세포 유형을 감염시키는 능력, 아시클로비르 및 간시클로비르와 같은 항바이러스에 대한 민감성, 및 삽입 돌연변이생성의 결핍을 들 수 있다(Sokolowski et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:207-219; Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136). HSV에는 2가지 유형, HSV 유형 I(HSV-1) 및 유형 II(HSV-2)가 있으며, 대부분의 종양용해 HSV는 HSV-1로부터 유래된다. 인간에서, HSV-1은 발열 물집 질환을 유발하고 세포 표면 상의 넥틴, 당단백질, 및 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM)에 결합함으로써 상피 세포, 뉴런, 및 면역 세포를 감염시킨다(Kohlhapp and Kaufman(2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054).
많은 상이한 종양용해 HSV-1 바이러스가 현재까지 생성되었다. 예를 들어, HSV-1은 HER-2를 과다발현하는 종양, 예컨대 유방 및 난소암, 위 암종 및 교모세포종을 표적화하는 항-HER-2 항체 트라스투주맙(trastuzumab)을 발현하도록 조작되었다. 트라스투주맙을 암호화하는 유전자는 HSV-1 gD 당단백질 유전자 내에서 2개 영역에 삽입되어 2개의 종양용해 HSV, R-LM113 및 R-LM249를 생성한다. R-LM113 및 R-LM249는 인간 유방 및 난소암에 대해, 그리고 HER2+ 교모세포종의 쥐과 모델에 대해 전임상 활성을 입증하였다. R-LM249는 운반 세포로서 중간엽 기질 세포(MSC)를 사용하여 전신적으로 투여되어 쥐과 모델에서 폐암 및 난소 및 유방암의 뇌 전이에 대해 치료 효과를 나타냈다(Campadelli-Fiume et al. (2016) Viruses 8, 63). 다른 종양용해 HSV-1인, dlsptk HSV-1은 티미딘 키나제(TK)의 바이러스 상동체를 암호화하는 특유한 긴 23(UL23) 유전자에서의 결실을 함유하는 한편, hrR3 HSV-1 돌연변이는 유전자 UL39에 의해 암호화된, ICP6으로서 알려져 있는 리보뉴클레오타이드 환원효소(RR)의 큰 하위유닛의 LacZ 삽입 돌연변이를 함유한다. 그 결과로서, dlsptk 및 hrR3 HSV-1 돌연변이는 암 세포에서만 복제하여 각각 TK 및 RR을 과다발현할 수 있다(Sokolowski et al. (2015) Oncolytic Virotherapy 4:207-219).
HF10은 UL43, UL49.5, UL55, UL56 및 잠복기-관련 전사물을 암호화하는 유전자가 결핍되고, UL53 및 UL54를 과다발현하는 자발적으로 돌연변이된 종양용해 HSV-1이다. HF10은 전임상 연구에서 유망한 결과를 나타냈고 높은 종양 선택성, 높은 바이러스 복제, 강력한 항종양 활성 및 유리한 안전성 프로파일을 입증하였다(Eissa et al. (2017) Front. Oncol. 7:149). HF10을 조사하는 임상 시험으로는: 난치성 두경부암, 피부의 편평 세포 암종, 유방 암종 및 악성 흑색종(NCT01017185)을 가진 환자에서의 1상 연구 및 비절제성 췌장암(NCT03252808) 환자에서 화학요법(겜시타빈, Nab-파클리탁셀, TS-1)과 조합된 HF10의 1상 연구를 들 수 있다. HF10은 또한 항-CTLA-4 항체 이필리무맙(ipilimumab)과 조합되어 3b, 3c 또는 4기 비절제성 또는 전이성 흑색종(NCT03153085)을 가진 환자에서 개선된 치료 효능을 초래하였다. 2상 임상 연구는 현재 비절제성 3b, 3c 및 4기 흑색종(NCT03259425)을 가진 환자에서 HF10과 항-PD-1 항체 니볼루맙(Nibolumab)과의 조합 및 비절제성 또는 전이성 흑색종(NCT02272855)을 가진 환자에서 HF10과 이필리무맙과의 조합을 조사 중에 있다. 파클리탁셀 및 HF10 병용 요법은 어느 하나의 단독 치료와 비교하여 복막 대장암 모델에서 월등한 생존율을 초래한 한편, HF10과 에를로티닙(erlotinib)과의 병용 치료는 HF10 단독 또는 에를로티닙 단독보다 시험관내에서 및 생체내에서 췌장 이종이식에 대한 개선된 활성을 초래하였다(Eissa et al. (2017) Front. Oncol. 7:149).
이전에 OncoVEXGM-CSF로서 알려져 있는, 탈리모겐 라허파렙벡(Talimogene laherparepvec)(Imlygic®, T-VEC)은 HSV-1의 JS1 스트레인으로부터 생성되고 과립구 대식세포 자극 인자(GM-CSF)를 발현하도록 유전자 조작된, 진행성 흑색종의 치료를 위한 FDA-승인 종양용해 단순 헤르페스 바이러스이다(Aref et al. (2016) Viruses 8:294). T-VEC에서, GM-CSF 발현은 항종양 세포독성 면역 반응을 향상시키는 한편, 감염된 세포 단백질 34.5(ICP34.5) 유전자의 두 복사물의 결실은 정상 조직에서의 복제를 억제하고, ICP47 유전자의 결실은 MHC 부류 I 분자의 발현을 증가시켜서, 감염된 세포 상에서 항원 제공을 가능하게 한다(Eissa et al. (2017)). T-VEC은 암 세포 표면 상의 넥틴에 결합함으로써 종양 선택성을 나타내고 파괴된 종양발생 및 항바이러스 신호전달 경로, 특히 단백질 키나제 R(PKR) 및 타입 I IFN 경로를 이용함으로써 종양 세포에서 우선적으로 복제한다. 정상 세포에서, PKR은 바이러스 감염에 의해 활성화된 후, 진핵세포 개시 인자-2A 단백질(eIF-2A)를 인산화하여 그것을 비활성화하고, 결국 세포 단백질 합성을 억제하며, 세포 증식을 차단하고 바이러스 복제를 방지한다. 야생형 HSV는 eIF-2A를 탈인산화시키는 포스파타제를 활성화하는 ICP34.5 단백질의 발현으로 인해 항바이러스 반응을 회피하여, 감염된 세포에서 단백질 합성을 복원시킨다. 그러므로, ICP34.5의 결실은 정상 세포에서 T-VEC의 바이러스 복제를 불가능하게 한다. 그러나, 암 세포에서 PKR-eIF-2A 경로는 파괴되어, 연속적인 세포 성장 및 억제되지 않은 바이러스 복제를 하게 한다(Kohlhapp and Kaufman(2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054; Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136). GM-CSF의 발현은 수지상 세포 축적을 유발하고, 항원 제공을 촉진하며 T-세포 반응을 프라이밍함으로써 T-VEC의 면역원성을 개선시킨다(Kohlhapp and Kaufman(2016) Clin. Cancer Res. 22(5):1048-1054).
T-VEC은 유방암, 대장 선암종, 흑색종, 전립선암, 및 교모세포종을 포함한, 다양한 상이한 암 세포주에서 우선적으로 복제되는 것으로 나타났다. 임상 시험은, 예를 들어, 췌장암(NCT03086642, NCT00402025), 재발성 유방암(NCT02658812), 아동에서의 진행성 비-CNS 종양(NCT02756845), 비-흑색종 피부암(NCT03458117), 비-근육 침습성 방광 이행 세포 암종(NCT03430687), 및 악성 흑색종(NCT03064763)에서 T-VEC, 뿐만 아니라 전이성 삼중 음성 유방암 및 간 전이(NCT03256344)를 가진 전이성 대장 암 환자에서 아테졸리주맙(atezolizumab)과 조합된 T-VEC, 삼중 음성 유방암(NCT02779855)을 가진 환자에서 파클리탁셀과 조합된 T-VEC, 난치성 림프종 또는 진행성/난치성 비흑색종 피부암(NCT02978625)을 가진 환자에서 니볼루맙과 조합된 T-VEC, 진행성 두경부암(NCT01161498)을 가진 환자에서 시스플라틴 및 방사선요법과 조합된 T-VEC, 및 간 종양(NCT02509507), 두경부 암종(NCT02626000), 육종(NCT03069378) 및 흑색종(NCT02965716, NCT02263508)을 가진 환자에서 펨브롤리주맙(pembrolizumab)과 조합된 T-VEC를 조사하는 것을 포함한다.
GM-CSF에 더불어, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNα/β 및 fms-유사 티로신 키나제 3 리간드를 암호화하는 것을 포함한, 수많은 다른 면역 자극 유전자가 종양용해 HSV에 삽입되어 증가된 치료 효능을 초래한다(Sokolowski et al. (2015); Yin et al. (2017)).
또 다른 종양용해 HSV-1인 R3616은 PKR 경로가 파괴된 암 세포를 표적화하는 ICP34.5를 암호화하는 RL1(γ134.5로도 알려져 있음)의 두 복사물의 결실을 함유한다. NV1020(또는 R7020)은 UL55, UL56, ICP4, RL1 및 RL2 유전자에 결실을 함유하여 감소된 신경병독성 및 암 선택성을 초래하는 HSV-1 돌연변이이다. NV1020은 두경부 편평 세포 암종, 유표피암 암종 및 전립선 선암종의 쥐과 모델에서 유망한 결과를 나타냈다(Sokolowski et al. (2015)). 추가적으로, 임상 시험은 간으로 전이된 대장암(NCT00149396 및 NCT00012155)에서 NV1020의 안전성 및 효능을 조사하였다.
G207(또는 MGH-1)은 UL39 신경병독성 유전자에서 RL1(γ134.5) 결실 및 LacZ 비활성화 삽입을 가진 또 다른 HSV-1 돌연변이이다. G207을 활용한 임상 연구는 진행성 또는 재발성 상원 뇌 종양(NCT02457845)을 가진 아동에서 G207 단독 투여 또는 단일 방사선 용량과 조합된 G207 투여의 조사, 재발성 뇌암(신경교종, 성상세포종, 교모세포종)(NCT00028158)을 가진 환자에서 G207의 안전성 및 효능의 조사, 및 악성 신경교종(NCT00157703)을 가진 환자에서 G207 투여와 이어지는 방사선 요법의 효과의 조사를 포함한다.
G207은 ICP47을 암호화하는 유전자에서 추가의 결실을 함유하는 G47△를 생성하기 위해 사용되었다. 다른 HSV-1 유래 종양용해 바이러스로 RL1에 결실을 함유하지만 온전한 UL39 유전자를 가지며 능동적으로 분할하는 세포에서 복제하는 HSV1716, 및 UL48과 RL2 유전자에 삽입을 가져서 즉시 초기 바이러스 유전자의 발현 및 암 세포 선택성의 상실을 초래한 KM100 돌연변이를 들 수 있다(Sokolowski et al. (2015); Yin et al. (2017) Front. Oncol. 7:136).
인구의 대부분이 HSV-1에 대한 기존의 면역을 갖고 있기 때문에, 종양용해 HSV를 전달하기 위한 운반 세포의 사용은 그것의 치료 잠재력을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 복막 중피 세포(MC)가 HF10을 위한 운반 세포로서 사용되어 시험관내에서 난소암 세포뿐만 아니라, 난소암의 마우스 이종이식 모델에서 효율적인 살해로 이어졌다(Fujiwara et al. (2011) Cancer Gene Therapy 18:77-86).
종양용해 바이러스는 또한 HSV-2로부터 유래되었다. 예를 들어, FusOn-H2는 세린/트레오닌 단백질 키나제(PK) 도메인을 암호화하는 ICP10 유전자의 N-말단 영역이 결실된 HSV-2 종양용해 바이러스이다. 이 PK는 Ras/MEK/MAPK 유사분열 경로를 활성화시키고 c-Fos를 유도하며 안정화시키고, 효율적인 HSV-2 복제에 필요한 GTPase-활성화 단백질 Ras-FAP를 인산화를 담당한다. 정상 세포는 보통 비활성화된 Ras 신호전달 경로를 가진다. 그러므로, FusOn-H2는 활성화된 Ras 신호전달 경로를 가진 종양 세포에서만 복제함으로써 종양 선택성을 나타낸다(Fu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(10):3152-3157). FusOn-H2는 췌장암 이종이식에 대해(Fu et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(10):3152-3157), 사이클로포스파미드와 함께 루이스 폐 암종 이종이식에 대해, 그리고 동계 쥐과 유방 종양 및 신경모세포종에 대해(Li et al. (2007) Cancer Res. 67:7850-7855) 활성을 입증하였다.
폭스 바이러스 (Poxvirus)
백시니아 바이러스 (Vaccinia Virus)
백시니아 바이러스의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 리스터(엘스트리로도 알려져 있음), 뉴욕시 보건 위생부(NYCBH), 다이렌, Ikeda, LC16M8, 웨스턴 리저브(WR), 코펜하겐(Cop), 타슈켄트, 티안 탄, 와이어스, 드라이박스, IHD-J, IHD-W, 브라이턴, 앙카라, 변형된 백시니아 앙카라(MVA), 다이렌 I, LIPV, LC16M0, LIVP, WR 65-16, EM63, 베른, 파리, CVA382, NYVAC, ACAM2000 및 코노트 스트레인을 들 수 있다. 백시니아 바이러스는 그것을 상처 및 암 유전자 요법에 사용하기에 특히 적합하게 만드는 다양한 특징을 가지는 종양용해 바이러스이다. 예를 들어, 백시니아는 세포질 바이러스이고, 따라서 그것은 라이프 사이클 중에 숙주 게놈에 그것의 게놈을 삽입하지 않는다. 숙주의 전사 기작을 필요로 하는 많은 다른 바이러스와 달리, 백시니아 바이러스는 바이러스 게놈에 암호화된 효소를 사용하여 숙주 세포 세포질에서 그 자체의 유전자 발현을 지지할 수 있다. 백시니아 바이러스는 또한 광범위한 숙주 및 세포 유형 범위를 가진다. 특히, 백시니아 바이러스는 종양 및/또는 전이를 포함한, 또한 상처입은 조직 및 세포를 포함한, 면역특권 세포 또는 면역특권 조직에서 축적될 수 있다. 그러나, 다른 종양용해 바이러스와 달리, 백시니아 바이러스는 전형적으로 바이러스가 투여되는 대상체로부터 대상체의 면역 체계의 활성에 의해 정화될 수 있고, 따라서 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스보다 독성이 적다. 그러므로, 바이러스가 전형적으로 바이러스가 투여되는 대상체로부터 대상체의 면역 체계의 활성에 의해 정화될 수 있는 한편, 바이러스는 그럼에도 불구하고 종양과 같은 면역특권 세포 및 조직에서 축적되고, 생존하고 증식할 수 있는데, 그러한 면역특권 구역이 숙주의 면역 체계로부터 분리되기 때문이다.
백시니아 바이러스는 또한 이종성 유전자의 삽입에 의해 쉽게 변형될 수 있다. 이것은 바이러스의 약독화를 초래하거나 및/또는 치료 단백질의 전달을 허용한다. 예를 들어, 백시니아 바이러스 게놈은 외래 유전자에 대해 큰 운반 용량을 가지는데, 최대 25 kb의 외인성 DNA 단편(백시니아 게놈 크기의 대략 12%)이 삽입될 수 있다. 여러 백시니아 스트레인의 게놈이 완전히 서열분석되어 있고, 많은 필수 및 비필수 유전자가 확인되었다. 상이한 스트레인들 중에서 높은 서열 상동성으로 인해, 한 백시니아 스트레인으로부터의 게놈 정보는 다른 스트레인에서 변형된 바이러스를 설계하고 생성하기 위해 사용될 수 있다. 마지막으로, 유전자 조작에 의한 변형된 백시니아 스트레인의 제조 기법은 잘 확립되어 있다(Moss(1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3:86-90; Broder and Earl, (1999) Mol. Biotechnol. 13:223-245; Timiryasova et al. (2001) Biotechniques 31:534-540).
다양한 백시니아 바이러스가 항종양 활성을 나타내는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 한 연구에서, 비전이성 결장 선암종 세포를 함유한 누드 마우스가 백시니아 성장 인자 결실 및 티미딘 키나제 유전자좌에 삽입된 향상된 녹색 형광 단백질을 가짐으로써 변형된 백시니아 바이러스의 WR 스트레인으로 전신 주사되었다. 바이러스는 변형된 바이러스에 외인성 치료 유전자의 결핍에도 불구하고, 하나의 완전한 반응을 포함한 항종양 효과를 가지는 것으로 관찰되었다(McCart et al. (2001) Cancer Res. 1:8751-8757). 다른 연구에서, 백시니아 흑색종 종양용해물(VMO)이 흑색종 환자의 3상 임상 시험에서 흑색종 양성 림프절 주위의 부위에 주사되었다. 대조군으로서, 뉴욕시 보건 위생부 스트레인 백시니아 바이러스(VV)가 흑색종 환자에게 투여되었다. VMO로 치료된 흑색종 환자는 미치료 환자에 대한 것보다 나은 생존율을 보였지만, VV 대조군으로 치료된 환자와 유사하였다(Kim et al. (2001) Surgical Oncol. 10:53-59).
백시니아 바이러스의 LIVP 스트레인이 또한 종양의 진단 및 치료에, 및 상처입은 및 염증이 있는 조직 및 세포의 치료에 사용되었다(예컨대, Lin et al. (2007) Surgery 142:976-983; Lin et al. (2008) J. Clin. Endocrinol. Metab. 93:4403-7; Kelly et al. (2008) Hum. Gene Ther. 19:774-782; Yu et al. (2009) Mol. Cancer Ther. 8:141-151; Yu et al. (2009) Mol. Cancer 8:45; 미국 특허 제 7,588,767호; 미국 특허 제 8,052,968호; 및 미국 공개 번호 U.S. 2004/0234455호 참조). 예를 들어, 정맥내로 투여되었을 때, LIVP 스트레인은 생체내에서 다양한 유전자좌에서 내부 종양에 축적되는 것이 입증되었고, 한정하는 것은 아니지만, 유방 종양, 갑상선 종양, 췌장 종양, 흉막 중피종의 전이성 종양, 편평 세포 암종, 폐 암종 및 난소 종양을 포함한 다양한 조직 기원의 인간 종양을 효과적으로 치료하는 것이 입증되었다. 약독화된 형태를 포함한, 백시니아의 LIVP 스트레인은 백시니아 바이러스의 WR 스트레인보다 적은 독성을 나타내서, 치료된 종양-함유 동물 모델의 증가되고 더 길어진 생존을 초래한다(예컨대, 미국 공개 번호 U.S. 2011/0293527호 참조).
백시니아는 세포질 바이러스이고, 따라서 그것은 라이프 사이클 동안 숙주 게놈에 그것의 게놈을 삽입하지 않는다. 백시니아 바이러스는 단일한 연속 폴리뉴클레오타이드 사슬로 구성된 대략 180,000 염기쌍 길이의 선형, 이중 가닥 DNA 게놈을 가진다(Baroudy et al. (1982) Cell 28:315-324). 구조는 10,000 염기쌍의 반전된 말단 반복부(ITR)의 존재로 인한 것이다. ITR은 게놈 복제에 관여한다. 게놈 복제는 자체 프라이밍을 포함하여, 계속해서 절단되고 바이러스 게놈을 만들기 위해 수복되는 고분자량 콘가테머(concatemer)(감염된 세포로부터 분리됨)의 형성으로 이어지는 것으로 여겨진다(예컨대, Traktman, P., Chapter 27, Poxvirus DNA Replication, pp. 775-798, in DNA Replication in Eukaryotic Cells, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996) 참조). 게놈은 대략 250개의 유전자를 함유한다. 일반적으로, 분절화되지 않은, 비감염성 게놈이, 중심에 위치한 유전자가 바이러스 복제에 필수적인(그러므로 보존됨) 한편, 2개의 말단에 가까운 유전자가 숙주 범위 및 병독성과 같은 보다 말초적인 기능을 이루게 되도록 배열된다. 백시니아 바이러스는, 일반적인 원리로 종복되지 않는 세트로 배열된 오픈 리딩 프레임(ORF)를 활용함으로써 차등 유전자 발현을 실시한다.
백시니아 바이러스는 광범위한 숙주 및 세포 유형 범위, 및 낮은 독성을 포함한, 암 유전자 요법 및 백신 접종에 사용하기 위한 다양한 특징을 갖고 있다. 예를 들어, 대부분의 종양용해 바이러스가 자연적인 병원체인 한편, 백시니아 바이러스는 인간에서 확립된 안전 실적을 초래한 천연두 백신으로서 광범위하게 적용된 특유한 이력을 가진다. 백시니아 투여와 관련된 독성은 사례의 0.1% 미만으로 일어나며, 면역글로불린 투여로 효과적으로 해결될 수 있다. 더불어, 백시니아 바이러스는 외래 유전자에 대한 큰 운반 용량(백시니아 게놈 크기의 대략 12%인 최대 25 kb의 외인성 DNA 단편이 백시니아 게놈에 삽입될 수 있음) 및 다른 스트레인에서 변형된 바이러스를 설계하고 생성하기 위하여 상이한 스트레인 중에서 높은 서열 상동성을 가지고 있다. 유전자 조작에 의해 변형된 백시니아 스트레인을 제조하는 기법은 잘 확립되어 있다(Moss(1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 86-90; Broder and Earl(1999) Mol. Biotechnol. 13: 223-245; Timiryasova et al. (2001) Biotechniques 31: 534-540). 백시니아 바이러스 스트레인은 고형 종양을 특이적으로 콜로니화하는 한편, 다른 장기는 감염시키지 않는 것으로 나타났다(예컨대, Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67:10038-10046; Yu et al. (2004) Nat. Biotech. 22:313-320; Heo et al. (2011) Mol. Ther. 19:1170-1179; Liu et al. (2008) Mol. Ther. 16:1637-1642; Park et al. (2008) Lancet Oncol. 9:533-542 참조).
콕사키 바이러스 (Coxsackie Virus)
콕사키 바이러스(CV)는 엔테로바이러스 속 및 피코르나 비리다에 과에 속하며 숙주 세포 게놈에 통합하지 않는 양-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 가진다. CV는 마우스에서의 영향을 토대로 그룹 A 및 B로 분류되며, 인간에서 경미한 상부 호흡기 감염을 유발할 수 있다(Bradley et al. (2014) Oncolytic Virotherapy 3:47-55). 종양용해 바이러스 요법을 위해 일반적으로 조사된 콕사키 바이러스로는 약독화된 콕사키 바이러스 B3(CV-B3), CV-B4, CV-A9 및 CV-A21을 들 수 있다(Yla-Pelto et al. (2016) Viruses 8, 57). CV-A21은 흑색종, 유방, 결장, 자궁내막, 두경부, 췌장 및 폐암을 포함한 종양 세포에서뿐만 아니라, 다발성 골수종 및 악성 신경교종에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 ICAM-1(또는 CD54) 및 DAF(또는 CD55) 수용체를 통해 세포를 감염시킨다. CV-A21은 시험관에서 악성 골수종, 흑색종, 전립선, 폐, 두경부, 및 유방암 세포주에 대해, 그리고 생체내에서 인간 흑색종 이종이식을 함유한 마우스에서, 그리고 마우스에서 원발성 유방암 종양뿐만 아니라 그것의 전이에 대해서 유망한 전임상 항암 활성을 나타냈다(Yla-Pelto et al. (2016); Bradley et al. (2014)). CAVATAKTM로도 알려져 있는 CV-A21의 유도체인 CV-A21-DAFv는 야생형 Kuykendall 스트레인으로부터 DAF-발현, ICAM-1-음성 횡문근육종(RD) 세포 상에서 CV-A21의 연속적인 계대에 의해 생성되었고 모 스트레인과 비교하여 향상된 종양용해 특성을 가진 것으로 나타났다. CAVATAKTM는 DAF 수용체에만 결합하여 암 세포를 향한 그것의 향상된 향성에 기여할 수 있다(Yla-Pelto et al. (2016)).
CV-A21은 또한 독소루비신 염산염과의 조합으로 연구되었고, 인간 유방암, 대장암 및 췌장암 세포주에 대해서뿐만 아니라, 인간 유방암의 이종이식 마우스 모델에서 어느 하나의 단독 치료와 비교하여 향상된 종양용해 효율을 나타냈다(Yla-Pelto et al. (2016)). 인구의 상당 부분이 CV에 대해 이미 발생된 중화 항체를 가지고 있기 때문에, CV-A21 요법은 사이클로포스파미드와 같은 면역억제제와 조합되었고(Bradley et al. (2014)) 비히클 세포를 통한 전달에 대해 양호한 후보이다.
임상 시험으로 3c 또는 4기 악성 흑색종(NCT01636882; NCT00438009; NCT01227551)을 가진 환자에서 CAVATAKTM의 사용이 조사되었고, 단독 또는 저용량의 미토마이신 C와 조합된 CAVATAKTM가 비근육 침습성 방광암(NCT02316171)을 가진 환자에서 조사되었다. 임상 시험은 또한 흑색종, 유방암 및 전립선암(NCT00636558)을 포함한 고형 종양의 치료에서 CV-A21의 정맥내 투여의 영향을 연구하였다. 진행 중인 임상 시험으로는 비-소세포 폐암(NCT02824965, NCT02043665) 및 방광암(NCT02043665)을 가진 환자의 치료를 위한 CAVATAKTM 단독 또는 펨브롤리주맙과의 조합의 조사; 포도막 흑색종 및 간 전이(NCT03408587)를 가진 환자 및 진행성 흑색종(NCT02307149)을 가진 환자에서 이필리무맙과 조합된 CAVATAKTM의 조사; 및 진행성 흑색종(NCT02565992)을 가진 환자에서 펨브롤리주맙과 조합된 CAVATAKTM의 조사를 들 수 있다.
세네카 밸리 바이러스 (Seneca Valley Virus)
세네카 밸리 바이러스(SVV)는 양-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 가지며 신경모세포종, 횡문근육종, 수모세포종, 빌름스 종양, 교모세포종 및 소세포 폐암을 포함한 신경내분비 암에 대해 선택적인 피코르나비리다에 과 내의 세네카바이러스(Senecavirus) 속의 구성원이다(Miles et al. (2017) J. Clin. Invest. 127(8):2957-2967; Qian et al. (2017) J. Virol. 91(16):e00823-17; Burke, M. J. (2016) Oncolytic Virotherapy 5:81-89). 연구는 SVV에 대한 수용체로서 안트락스 독소 수용체 1(ANTXR1)을 확인하였는데, 그것은 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 표면에서 자주 발현되지만, 이전 연구는 또한 시알산이 소아 신경교종 모델에서 SVV 수용체의 구성요소일 수 있음을 나타냈다(Miles et al. (2017)). SVV 분리물 001(SVV-001)은 정맥내 투여 후에 고형 종양을 표적으로 하여 관통할 수 있는 강력한 종양용해 바이러스이며 그것의 암 세포에 대한 선택적 향성 및 인간 및 동물에서의 비병원성뿐만 아니라 그것의 삽입 돌연변이생성의 결핍으로 인해 매력적이다. 추가적으로, 인간에서의 이전의 노출은 드물어서, 기존의 면역률은 낮다(Burke, M. J. (2016) Oncolytic Virotherapy 5:81-89).
SVV-001은 소세포 폐암, 부신 피질 암종, 신경모세포종, 횡문근육종, 및 유잉 육종 세포주에 대한 유망한 시험관내 활성, 및 소아 GBM, 수모세포종, 망막모세포종, 횡문근육종 및 신경모세포종의 정위 이종이식 마우스 모델에서 생체내 활성을 나타냈다(Burke(2016)). Neotropix®에 의해 개발된 종양용해 SVV-001인 NTX-010은 재발된/난치성 고형 종양 단독 또는 사이클로포스파미드와 조합된 종양을 가진 소아 환자의 치료를 위해 실현 가능하며 허용적인 것으로 증명되었지만, 중화 항체의 발생으로 인해 그것의 치료 효능이 제한되었다(Burke et al. (2015) Pediatr. Blood Cancer 62(5):743-750). 임상 시험으로는 신경내분비 특징(NCT00314925)을 가진 고형 종양을 가진 환자에서 SV-001을 사용한 연구, 재발된 또는 난치성 신경모세포종, 횡문근육종, 빌름스 종양, 망막모세포종, 부신피질 암종 또는 유암종 종양(NCT01048892)을 가진 환자에서 사이클로포스파미드와 조합된 NTX-010/SVV-001을 사용한 연구, 및 화학요법 후 소세포 폐암(NCT01017601)을 가진 환자에서 NTX-010/SVV-001을 사용한 연구를 들 수 있다.
C. 세포 비히클 및 바이러스를 대상체와 매칭하기 위한 검정
바이러스 요법을 용이하게 하기 위하여, 바이러스 전달 비히클로서 작용하는 세포는 생체내에서 특정 특징, 예컨대 바이러스의 증폭을 촉진함으로써 종양/암의 감염 및 종양용해에 대한 후속적인 잠재력을 증가시키고; 선천성(예컨대, NK 세포 매개) 및 적응성(예컨대, T 세포 매개) 면역 장벽, 및/또는 혼합된 선천성/적응성 면역 장벽(예컨대, γδ T 세포 매개)을 극복하는 능력을 토대로 선택된다. T 세포는 αβ 및 γδ T 세포 수용체(TCR)의 표면 발현에 의해 구별되는 2개의 주요 집단으로 세분화된다. 감마 델타(γδ) T 세포는 '비인습적인' T 세포의 프로토타입이며 T 세포의 상대적으로 작은 하위세트를 나타낸다(개요를 위해, Wu et al., Int. J. Biol. Sci., 10(2):119-135(2014); Moser and Eberl, Immunol. Reviews, 215(1):89-102(2007)를 참조함(이것의 내용은 본원에 참조로 포함됨)). 이것들은 γ 및 δ 사슬로 구성된 헤테로다이머 T-세포 수용체(TCR)의 발현에 의해 규정된다. 이것은 αβ TCR을 발현하는 보다 우세한 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 CD8+ 세포독성 T 세포로부터 그것들을 떨어뜨려 놓는다. 대부분의 γδ T 세포는 MHC-제한된 αβ T 세포와 대조적으로, MHC-의존적 방식으로 활성화된다. γδ T 세포는 한정하는 것은 아니지만, 비-펩타이드 항원, MHC 및 비-MHC 세포 표면 분자, 가용성 단백질, 설파타이드 등을 포함한, 크기, 조성 및 분자 구조가 다른 다양한 구조적으로 상이한 리간드를 인식할 수 있다. γδ T 세포는 그룹 1(CD1a, b, c) 및 그룹 2(CD1d) CD1 분자(적응성 면역)와 같은 MHC 분자를 인식할 수 있다. 그러나, Vγ9Vδ2 T 세포(γδ T 세포 집단) 상에서 발현되는 NKG2D(NK 세포-매개 면역과 관련됨)가 또한 γδ T 세포(선천성 면역)에 의한 리간드 인식에서 역할을 한다. NKG2D 리간드는 대부분의 정상 조직에서는 발현되지 않지만, 많은 종양-세포 유형에 의해 상향조절되고, 이것은 Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 종양 세포-인식에 필요하다. 일부 가용성 단백질, 예를 들어, 미관련 스타필로코쿠스 내독소 A(SEA) 및 독소 리스테리올리신 O(LLO)를 포함한 박테리아 단백질이 또한 γδ T 세포에 의한 인식에 관여한다. γδ T 세포는 또한 항원 프로세싱을 필요로 하지 않으며 임의의 항원 제공 세포(APC)의 부재 하에서 일어날 수 있는 열 충격 단백질(HSP)을 인식할 수 있다. 비-펩타이드 항원, 예컨대 진균, 박테리아, 또는 원생동물로의 감염 중에 발생하는 것들은 T-세포 인식에 대한 중요한 표적일 수 있다. 면역조절 기능을 가지는 면역글로불린-유사 분자 패밀리에 속하는 부티로필린(BTN3A1)이 Vγ9Vδ2 T 세포에 대한 인산화된 항원-제공 분자(APM)로서 확인되었다. 그것은 프레닐 피로포스페이트의 Vγ9Vδ2 TCR 인식에 중요한 역할을 하며 인산화된 항원의 세포내 수준에 대한 센서로서 작용할 수 있다.
자가 세포가 비히클로서 사용될 수 있는 한편, 그것의 이용성은 제한되고 대상체로부터 세포를 얻는 것은 때때로 부담스럽고 및/또는 값비싸다. 특정 세포 비히클, 예컨대 중간엽 줄기 세포(MSC)는 부분적으로는 그것의 면역억제 특성으로 인해 동종 환경에서도 바이러스 증폭을 촉진하고 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 본원에서 지방-유래 줄기 세포(ADSC)가 강력한 바이러스 증폭을 용이하게 하고 바이러스 감염에 대해 종양 세포를 감작시키는 그것의 조합된 특성을 통해 내성 종양 세포조차 제거할 수 있는 것으로 나타난다. 그러나 ADSC와 같은 동종 중간엽 줄기 세포를 포함한 "기성품" 동종 세포주를 전달 비히클로서 사용하는 능력은 부분적으로 항-세포 비히클 세포독성 IFNγ-매개 반응으로 인해, 때때로 "미스매치"(불충분한 바이러스 증폭; 대상체의 면역 체계의 불충분한 회피 및/또는 일시적인 또는 국소적인 면역억제를 포함한 불충분한 면역억제)로 이어지는 대상체-특이적 차이에 의해 제한될 수 있다. 이들 선천성 및/또는 적응성 면역 반응은, 예컨대, 세포 비히클을 제거함으로써 또는 항-바이러스 상태를 유도함으로써 치료 효능을 손상시킬 수 있다. 다른 연구 또한 MHC-미스매치된 MSC가 때때로 면역 특권이 없는 것을 보여주었다(Berglund et al. (2017) Stem Cell Research & Therapy, 8:288). 따라서, 바이러스 요법을 위해 특정 대상체와 매칭되고 "기성품" 동종 세포-기반 전달 플랫폼의 사용을 허용하는 세포 비히클에 대해 스크리닝하는 테스트가 필요하다. 본원에는 바이러스 요법을 대상체에게 투여하기 위하여 대상체-특이적 특정 "매칭된" 세포 비히클을 확인하는 검정이 제공된다. 또한 본원에는 개선된 세포 전달을 위해 하나 이상의 방법으로 감작된 및/또는 조작된 변형된 세포 비히클이 제공된다(예컨대, 하기 섹션 D 참조). 변형된 세포 비히클(감작된 및/또는 조작된)을 포함한 본원에 제공된 임의의 세포 비히클은 세포 비히클-기반 전달을 통해 바이러스 요법이 투여될 대상체와의 매칭 적합성에 대해 본원에 제공된 검정을 사용하여 테스트될 수 있다.
개요
본원에는 검정("매칭" 검정)이 제공되어, 한 검정 또는 검정의 조합이 세포 비히클을 종양용해 바이러스를 대상체에 전달하기 위해 대상체와 "매칭된" 것으로서 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 검정은 바이러스의 세포 비히클-매개 전달에 대한 대상체-특이적 반응을 측정함으로써, 세포 비히클이 특정 대상체에게 바이러스를 투여하기에 적합한지, 즉, 그것이 대상체에 "매칭"되는지를 확인한다. 하기에서 요약되고 본원에서 보다 상체하게 설명되는 검정 A-F 중 어느 하나, 또는 그것들의 임의의 조합이 관심 있는 대상체와 매칭된 세포 비히클을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 검정 A-F 중 하나 이상이 관심 있는 단일 세포 비히클을 대상체에 대한 매치로서의 그것의 적합성에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 하나 이상 또는 다수/패널의 세포 비히클이 스크리닝되고 대상체에 대한 매치로서의 바람직성에 따라 순위가 매겨질 수 있으며, 일반적으로 #1이 최고 순위이고 후속 번호(2, 3, 4, ... 등)는 더 낮은 순위를 나타내지만, 임의의 적합한 순위 매김 시스템이 적합한 매치(들)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 순위 매김은 검정 A-F 중 하나만 수행되는 경우 단일 검정을 토대로 할 수 있거나, 또는 하나 이상의 검정으로 세포 비히클의 수행을 토대로 조합된 순위 매김일 수 있다. 매칭 검정 A-F의 각각의 개요가 하기에 제공된다:
A. 하플로타입 분석
(a) 하플로타입의 개요
하플로타입은 함께 유전되는 DNA 변이 또는 다형성의 세트이며, 동일한 염색체 상에 위치한 대립유전자의 그룹 또는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 세트를 나타낼 수 있다.
주요 조직적합성 복합체(MHC)
염색체 6 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC)는 적응성 면역 체계를 위한 항원 제공에 필수적인 세포 표면 단백질 세트를 암호화하는 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자를 포함한다. MHC 분자는 병원체로부터 유래된 항원에 결합하여 적절한 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 그것을 나타냄으로써, 서로와 및 다른 세포와의 면역 세포의 상호작용을 매개한다. MHC는 장기 이식에 대한 도너의 적합성뿐만 아니라, 교차-반응 면역화를 통해 자가면역 질환에 대한 개체의 민감성을 결정한다.
MHC 유전자 패밀리는 3개의 하위그룹으로 나누어진다: 부류 I, 부류 II, 및 부류 III. MHC 부류 I 분자는 세포내 단백질로부터 유래된 거친 소포체의 펩타이드에 결합한다. 이것은 모든 핵화된 세포 상에서 발견되며 세포독성 T 림프구(CTL)의 표면 상의 CD8 수용체와 상호작용하여 세포 면역을 매개한다. MHC 부류 I은 3개의 α-사슬 유전자: HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함한다. 식균작용이 일어난 단백질로부터의 펩타이드에 결합하는 단백질 MHC 부류 II 분자는 대식세포 및 수지상 세포(DC)를 포함한 항원 제공 세포(APC)에 의해 발현되며, 헬퍼 T 세포의 표면 상의 CD4 수용체와 상호작용하여 적응성 면역을 매개한다. MHC 부류 II는 α- 및 β-사슬 유전자의 3개의 쌍: HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR을 포함하며, 가외의 β-사슬을 함유하는 HLA-DR 클러스터는 DRα 사슬과 쌍을 형성하여 MHC 부류 II 분자의 4개의 쌍을 형성한다. 단일 염색체 상에 존재하는 HLA 대립유전자의 조합이 HLA 하플로타입으로 불린다. HLA 유전자좌는 인간 게놈의 대부분의 다형 중에 있고, 부류 I의 경우 12,000개 이상의 대립유전자가 있으며 부류 II의 경우 4,000개 이상의 대립유전자가 있다. 그러므로 두 개체가 동일한 HLA 하플로타입을 가질 가능성은 거의 없다(Meyer et al. (2018) Immunogenetics 70:5-27).
MHC 부류 I
MHC 부류 I은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자를 포함한다. 개별적인 유전자좌는 대문자에 의해, 예를 들어, HLA-A로 표시되고, 대립유전자는 별표에 이어 숫자로, 예를 들어 HLA-A*0201로 표시된다. MHC 대립유전자가 공동으로 우세하게 발현되고 각 사람은 3개의 MHC 부류 I 유전자 각각의 2개의 대립유전자를 운반하기 때문에, 6개의 가능한 상이한 유형의 MHC 부류 I이 있다(Janeway CA Jr., et al., "Immunobiology: The Immune System in Health and Disease." 5th edition. New York: Garland Science; 2001. The major histocompatibility complex and its functions. Available from ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/).
MHC 부류 I 분자는 대부분의 세포 유형에 의해 발현되고 세포내 단백질로부터 유래된 펩타이드에 결합하며, 그것이 프로테아좀에 의해 분해되고 소포체로 전위된 후에는, 펩타이드를 세포 표면으로 이동시키고, 그것을 세포독성 CD8 T 세포에 제공한다. 이들 펩타이드는 짧고 전형적으로 8-11개의 아미노산 길이이다(Kaczmarek et al. (2017) Arch. Immunol. Ther. Exp. 65:201-214; Reeves and James(2016) Immunology 150:16-24).
MHC 부류 II
MHC 부류 II는 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR 아이소타입을 포함하며, DR 알파 사슬을 제외하고, 각각 고도로 다형성인 알파 및 베타 사슬을 함유한다. 모든 개체는 부모로부터 한 쌍의 HLA-DP 유전자, 한 쌍의 HLA-DQ 유전자, 하나의 HLA-DRA 유전자 및 하나 이상의 HLA-DRB 유전자를 유전받아서, 이형접합체는 그것의 세포 상에 8개의 상이한 MHC 부류 II 분자를 가질 수 있다. 상이한 염색체에 의해 암호화된 α 및 β 사슬의 상이한 조합은 훨씬 더 큰 수의 상이한 MHC 부류 II 분자를 유발할 수 있다(Janeway CA Jr., et al., "Immunobiology: The Immune System in Health and Disease." 5th edition. New York: Garland Science; 2001. The major histocompatibility complex and its functions. Available from ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/).
MHC 부류 II 분자는 DC, B 세포 및 단핵 세포/대식세포를 포함한 항원 제공 세포에 의해 발현되며, 식균된 병원체로부터 그것이 리소좀에 의해 분해된 후 유래된 단백질로부터의 펩타이드에 결합하여, 세포 표면으로 그것을 이동시키고, 그것을 헬퍼 T 세포에 제공한다. 이들 펩타이드는 MHC 부류 I 분자에 의해 제공된 펩타이드보다 더 길고, 보통 14-20개 아미노산 잔기 길이이다(Kaczmarek et al. (2017) Arch. Immunol. Ther. Exp. 65:201-214).
MHC 부류 IB(MIC, HLA-E를 포함함)
고전적 MHC 부류 I 및 부류 II 유전자에 더불어, MIC 유전자 패밀리, HLA-G 및 HLA-E의 구성원을 포함하며, MHC 부류 IB 유전자로서 알려져 있고, 다형성을 거의 보이지 않는 MHC 부류 I-형 분자를 암호화하는 유전자가 있다. 5개의 MIC 유전자 중 단지 2개, MICA 및 MICB만이 특히 상피 세포 및 섬유모세포에서 발현되며, 선천성 면역에서 역할을 한다. NK 세포 및 T 세포, 예컨대 γδ T 세포에 의해 발현되는 MIC 수용체는 NKG2D 사슬(NK 세포 수용체의 NKG2 패밀리의 활성화 구성원) 및 DAP10으로 불리는 신호전달 단백질로 구성된다. HLA-E는 다른 HLA 부류 I 분자의 리더 펩타이드로부터 유래된 펩타이드의 특정 하위세트와 복합체를 형성하고, 펩타이드:HLA-E 복합체는 NK 세포 상의 억제 NKG2A 수용체에 결합하여 NK 세포 세포독성 활성의 억제를 초래한다(Janeway CA Jr., et al., "Immunobiology: The Immune System in Health and Disease." 5th edition. New York: Garland Science; 2001. The major histocompatibility complex and its functions. Available from ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27156/).
CD1 패밀리
주로 항원 제공 세포 및 흉선세포 상에서 발현되고 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, iNKT 세포 및 NKT 세포에 항원을 제공하는 CD1 패밀리는 MHC 영역 밖에 있는 MHC 부류 I-유사 유전자의 패밀리이다. MHC 부류 I 및 부류 II 분자와 달리, CD1 분자는 지질 항원에 결합하고 그것을 제공할 수 있다. 5개의 CD1 단백질, CD1a-e가 있으며, CD1a-d가 세포 표면 상에 지질 항원을 나타낸다. 대부분 항원 제공 세포에 의해 발현되는 CD1a-c가 적응성 면역을 매개하는 클론적으로 다양한 T 세포에 항원을 제공하는 한편, CD1d 분자는 DC, B 세포, 단핵 세포, 대식세포, 케라틴 생성세포 및 위장 상피 세포를 포함하는 여러 세포 유형에 의해 발현되고, NKT 세포에 항원을 제공한다(Kaczmarek et al. (2017) Arch. Immunol. Ther. Exp. 65:201-214).
KIRs 및 KIR 리간드
NK 세포는 MHC 부류 I 분자(KIR 리간드)를 인식하고 그것에 결합하는 살해 Ig-유사 수용체(KIR)를 발현한다. 백혈구 수용체 복합체의 염색체 19 상에서 발견되는 17개의 KIR 유전자가 있고, 대부분의 이들 유전자는 다중 대립유전자를 가지고 있다. KIR 유전자의 명명법은 세포외 면역글로불린-유사 도메인의 수(2D 또는 3D), 세포질 꼬리의 길이(L = 길고, S = 짧음) 및, 유전자가 위유전자인지(P)를 토대로 한다. 대부분의 KIR이 억제성인 반면, NK 세포는 또한 활성화 KIR을 가지고 있다. 억제 KIR의 그것의 리간드에 대한 결합은 NK 세포를 비활성화한다. 감염된 또는 신생물 세포에서, 고전적 부류 I 유전자좌의 발현은 감소할 수 있어서, KIR 분자에 대한 리간드의 이용률이 감소되고 NK-매개 세포 용해가 활성화된다(Benson Jr. and Caligiuri(2014) Cancer Immunol Res. 2(2):99-104).
KIR 분자는 고도로 다형성이고 KIR 유전자 클러스터는 그룹 A 및 그룹 B 하플로타입으로 알려져 있는, 2개의 뚜렷한 하플로타입으로 이어진다. 그룹 A 하플로타입은 고정된 수의 유전자로 이루어지며 억제 KIR만을 포함하는 한편, 그룹 B 하플로타입은 유전자의 가변적인 세트를 가지며 억제 및 활성화 KIR 둘 다를 포함한다(Benson Jr. and Caligiuri(2014) Cancer Immunol Res. 2(2):99-104).
KIR 분자 및 이것의 리간드(MHC 부류 I 분자)가 유전적으로 독립적인 한편, 특정 KIR/HLA 조합의 유전은 바이러스 감염, 자가면역 및 암에 대한 민감성 또는 내성과 결부되었다. 예를 들어, 억제 KIR/HLA 상호작용은 암 세포의 용해를 방지하지만, KIR-리간드 미스매치는 동종 도너 NK 세포를 받은 환자에서 증가된 종양 세포 용해로 이어진다(Benson Jr. and Caligiuri(2014) Cancer Immunol Res. 2(2):99-104).
(b) 하플로타입 매칭 분석
하플로타입 매칭 분석은 다음과 같이 수행될 수 있다:
i. 대상체로부터의 DNA의 전혈 또는 대체 공급원(예컨대, 연조직 샘플, 정액, 타액, 피부 세포, 모근, 등)을 얻음.
ii. gDNA를 전혈 또는 다른 공급원으로부터 추출함.
iii. 다음 유전자좌 중 하나 이상에서 대상체-특이적 유전자 다형성을 분석함(예컨대, 차세대 서열분석을 하용함):
a. 고전적 MHC I/II 하플로타입
b. KIR 하플로타입 및 리간드
c. 비-고전적 MHC 하플로타입(예컨대, HLA-E, CD1a/b/c/d; MIC-A/B)
iv. 상기 iii에서 확인된 대상체의 유전자 다형성 프로파일을 세포 비히클 또는 하나 이상의 세포 비히클 또는 세포 비히클의 패널의 유전자 다형성 프로파일과 비교한다. 대상체와 적어도 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 매칭 유전자좌를 가진 세포 비히클이 대상체에 바이러스를 전달하기 위한 매치로서 확인될 수 있다. 일부 예에서, iii에서 나타낸 유전자좌의 하나 이상에서 세포 비히클의 유전자 다형성 프로파일은 대상체의 유전자 다형성 프로파일과 100% 매칭된다. 다른 예에서, iii에서 나타낸 유전자좌의 하나 이상에서 세포 비히클의 유전자 다형성 프로파일은 대상체의 유전자 다형성 프로파일과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 매칭되거나, 또는 대상체의 유전자 다형성 프로파일과 50% 또는 약 50% 내지 99% 또는 약 99%의 매치가, 대상체에 대한 매칭 세포 비히클로서 확인된다.
v. 하나 이상의 세포 비히클이 하플로타입 매칭에 대해 분석될 때, 최대 수의 매칭 유전자좌를 가진 세포 비히클이 가장 적합한 것으로서 확인되며, 100% 매치가 최상이다.
vi. 일부 구현예에서, 인실리코 소프트웨어 알고리즘/프로그램이 적합성을 예측하고 가장 적합한 매치의 확인을 안내하는 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
B. 내성 종양 세포를 충원/감작시키거나 및/또는 바이러스 증폭을 촉진하는 능력
이 매칭 검정에서, 세포 비히클(들)의 종양/암 세포를 바이러스 감염에 대해 충원/감작시키거나 및/또는 바이러스 증폭을 촉진하는 능력을 측정하기 위해 이동 검정이 수행된다. 이동 검정은 표준 트랜스웰, 바이오겔(하이드로겔, 매트리겔) 또는 세포외 기질(콜라겐/피브로넥틴)-코팅된 표면 시스템에서 설정될 수 있고, 검정의 각각의 구성요소(예컨대, 고형 종양 생검 및 세포 비히클)은 시스템의 유형에 따라 별도의 챔버(예컨대, 반투과성 막에 의해 분리됨)에 또는 인접한 위치에서 침착된다. 방법은 다음과 같이 수행된다:
i. 대상체로부터 종양 생검을 얻는 단계로, 생검은 수술 섹션, 미세 바늘 흡인물, 바늘 코어 생검 또는 조직 프로세싱(콜라게나제, 디스파제, DNase 등으로의 효소적 소화) 후 파생된 원발성 종양 세포/종양 유사장기를 포함할 수 있다. 고형 생검/유사장기/종양 세포를 적절한 트랜스웰/바이오겔/세포외 기질-코팅된 표면 시스템에서 배양하는 단계.
ii. 종양 생검 및 하나 이상의 세포 비히클, 또는 세포 비히클의 패널을 사용하여 이동 검정을 수행하는 단계로, 각 유형의 세포 비히클(하나 이상이 스크리닝되는 경우)은 특유한 검출 가능한 마커(예컨대, 형광 마커)로 표지된다. 고형 종양 생검, 원발성 종양 세포, 또는 종양 유사장기에 축적되는/향해서 이동하는/주변에 클러스터링되는 표지된 세포(각 유형의 세포 비히클에 대한)의 퍼센트는 세포 비히클-대-종양 이동 점수(CTMS)이고, 100%가 최상이며 0%가 최악이고, 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 CTMS 점수가 매치로 여겨진다. 일부 예에서, 세포 비히클에 대해 적어도 20%의 CTMS 점수가 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로 간주된다. 다른 예에서, 세포 비히클에 대해 약 20% 내지 약 60%의 CTMS 점수를 얻는 것이 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로 간주된다.
iii. 종양 생검 또는 생검-유래 원발성 종양 세포/유사장기의 표지화(예컨대, 형광 마커를 사용함) 및 표지된 종양 생검 및 상기 단계 2의 하위 패널의 각각의 세포 비히클, 또는 사전 스크리닝이 수행되지 않은 경우 전체 패널의 각각을 사용하여 이동 검정을 수행하는 단계. 고형 종양의 외부로 나와 세포 비히클을 향해 이동하는 표지된 종양 세포, 또는 종양-관련 기질 세포의 퍼센트가 종양-대-세포 비히클 이동 점수(TCMS)이며, 100%가 최상이고 0%가 최악이며, 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 TCMS 점수가 매치로 간주된다. 일부 예에서, 세포 비히클에 대해 적어도 20%의 TCMS 점수가 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로 간주된다. 다른 예에서, 세포 비히클에 대해 약 20% 내지 약 60%의 TCMS 점수를 얻는 것이 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로 간주된다.
iv. 상기 ii 및 iii에서와 같이 샘플을 준비하며, 단 이동 검정을 일부 바이러스가 종양 또는 운반 세포의 이동을 간섭하는지를 테스트하기 위하여 상이한 바이러스의 존재 하에 수행한다. 바이러스는 생검 시편과 공동 배양 전에 공동 배양에 직접 첨가되거나 운반 세포에 사전 로딩될 수 있다. 바이러스-교정된 CTMS(VCTMS) 및 TCMS(VTCMS)를 상기와 같이 계산하고, 바이러스의 세포 이동 및 생존을 간섭하는 능력을 반영한다.
v. 누적 평균 이동/충원 점수(MRS)가 다음과 같이 각 대상체 종양 생검/세포 비히클/바이러스 조합에 대해 계산될 수 있다:
MRS(생검, 세포 비히클, 바이러스 조합) = [VCTMS(생검, 세포 비히클, 바이러스) + VTCMS(생검, 세포 비히클, 바이러스)]/2; 또는
MRS(생검, 세포 비히클 조합) = [CTMS(생검, 세포 비히클) + TCMS(생검, 세포 비히클)]/2.
세포 비히클에 대한 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 MRS 점수가 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로서 간주될 수 있다. 일부 예에서, 세포 비히클에 대해 적어도 20%의 MRS 점수가 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로서 간주된다. 다른 예에서, 세포 비히클에 대해 약 20% 내지 약 60%의 MRS 점수를 얻는 것이 세포 비히클과 대상체(또는 종양/치료되는 암의 유형) 사이의 매치로 간주된다. 이런 매칭 검정은 종양 덩어리를 향해 성공적으로 복귀시키거나 이동하는 종양 세포를 유인/충원함으로써, 바이러스 확산 및 감염을 용이하게 하는 잠재력을 가진 세포 비히클/바이러스-관련 세포 비히클을 확인시켜준다. MRS 점수는 특정 세포 비히클의 적절한 이동을 간섭하지 않는 능력을 토대로 바이러스의 순위를 매기거나, 또는 대안으로 세포 이동의 바이러스-매개 억제에 대한 내성을 토대로 세포 비히클의 순위를 매기는 데 사용됨으로써 바이러스 및 운반체 비히클의 최적의 대상체-특이적 조합의 확인이 허용된다.
양호한 매치를 확인하기 위해 ii - v에 제시된 점수 세트 중 하나 이상이 측정될 수 있다.
C. 대상체-유래 면역 세포의 바이러스 증폭을 촉진시키는 능력
이 매칭 검정은 대상체-유래 면역 세포의 존재 하에 세포 비히클-매개 바이러스 증폭을 측정한다. 검정은 다음과 같이 수행된다:
i. 대상체-유래 면역 세포(예컨대, 전혈, PBMC)를 얻는다.
ii. PMBC를 세포 비히클 및 바이러스와 공동 배양한다. 첨가 순서는:
동시이거나, 또는
세포 비히클 + 바이러스를 먼저 인큐베이션하고(15분 또는 약 15분 내지 48시간 또는 약 48시간의 범위; 일부 구현예에서 범위는 1시간 또는 약 1시간 내지 5시간 내지 약 5시간임; 특정 구현예에서 인큐베이션 시간은 2시간 또는 약 2시간임) 그런 후 PBMC에 첨가한다.
그 결과의 공동 배양을 24시간 또는 약 24시간 내지 1주 또는 약 1주 동안 인큐베이션한다(구현예에서, 15분 또는 약 15분 내지 70시간 또는 약 70시간의 범위; 일부 구현예에서 범위는 20시간 또는 약 20시간 내지 60시간 내지 약 60시간임; 특정 구현예에서 인큐베이션 시간은 48시간 또는 약 48시간임).
iii. 바이러스 증폭을 측정하고(예컨대, 형광 영상화 또는 바이러스 플라크 검정(VPA)에 의해), PBMC의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서 대조군과 비교한다.
iv. PBMC의 존재 하에 바이러스 증폭이 PBMC의 부재 하에 얻어진 값의 10% 아래에 있다면, 세포 비히클은 대상체와 적합하지 않거나 매치가 아닌 것으로 간주된다. PBMC의 존재 하에 바이러스 증폭이 PBMC의 부재 하에 얻어진 값의 적어도 또는 약 10%-30%라면 매치가 적당한 것으로 간주될 수 있고, PBMC의 존재 하에 바이러스 증폭이 PBMC의 부재 하에 얻어진 값의 적어도 또는 약 30%-80%라면 매치는 중간 정도인 것으로 간주될 수 있으며, PBMC의 존재 하에 바이러스 증폭이 PBMC의 부재 하에 얻어진 값의 적어도 또는 약 80% 이상이면 매치는 양호한 것으로 간주될 수 있다.
v. 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)는 다음 식을 사용하여 각 대상체, 세포 비히클, 바이러스 조합에 대해 계산될 수 있다:
IVAS =(세포 비히클로부터의 바이러스 + PBMC 공동 배양의 pfu(또는 형광) / 세포 비히클 단독으로부터의 바이러스의 pfu). 0.1 이상의 비율이 적합한 것으로 간주될 수 있고, 매칭도는 상기 iv.에서 기술된 것과 같다(PBMC의 부재 하에 얻어진 값의 10% 이상이며, 1.0의 비율이 가장 높음).
vi. IVAS 점수는 선택적으로 혈청 효과에 대해 교정될 수 있다(대상체/환자 혈청 저항 스크린). IVAS 점수는 세포 면역만 고려한다; 만약 대상체의 혈청이 바이러스 증폭을 상당히 억제한다면, IVAS 점수가 허용적이라도(예컨대, 0.1 이상), 그럼에도 불구하고 양호한 매치가 아닐 수 있다. 교정은 다음과 같이 수행될 수 있다:
대상체로부터의 혈청을 상기 ii.의 공동 배양에 공동 배양 부피의 10-50%의 양으로 첨가한다.
환자(대상체) 혈청 저항 점수는 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
PSRS =(혈청이 없는 pfu - 혈청이 있는 pfu) / 혈청이 없는 pfu(x 100, 비율을 퍼센트 값으로 전환하기 위함). 혈청 저항 점수가 높을수록, 혈청이 바이러스 증폭을 더 많이 간섭한다.
IVAS(교정된 PSRS) = IVAS x(1-PSRS)(x100, 비율을 퍼센트 값으로 전환하기 위함).
D. 대상체와의 면역학적 적합성의 측정
이 매칭 검정에서, i. 및 ii.는 상기 파트 C.에서와 같이 수행된다.
iii. 공동 배양에서, 하기 마커 중 하나 이상을 측정한다(예컨대, 마커에 대해 형광 표지된 항체를 사용하는 유동 세포분석에 의해; 특정 마커는 상세한 개요에서 열거됨).
관심 있는 마커(들)에 대한 형광 표지된 항체를 첨가하고, 세포 비히클의 존재 하에 상향조절(있다면)을 측정한다(대조군: PBMC 단독; 샘플: PBMC + 세포 비히클)
a. IFNγ
b. T/NK/NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 마커
c. 활성자/이펙터 기능 마커의 T/NK/NKT 세포 발현과 관련된 마커
iv. 샘플 및 대조군의 형광을 (유동 세포분석에 의해) 측정한다.
v. 면역학적 적합성 점수(ICS)를 계산한다: (샘플의 형광 / 대조군의 형광)의 비율. 하나 이상의 마커가 측정되면, 평균 ICS 점수는 측정된 ICS 점수의 평균으로서 계산될 수 있거나, 일부 점수는 예컨대 감소된 바이러스 증폭과의 확립된 관련성을 토대로 가중치가 부여될 수 있다.
vi. 1 - 1.05 이하의 비율은 세포 비히클이 대상체의 면역 반응에 영향을 미치지 않는다, 즉 양호한 매치인 것을 의미한다.
1.05 - 1.5의 비율은 중간 정도로 적합한 세포 비히클을 나타낸다.
1.5 - 2의 비율은 적당하게 적합한 세포 비히클을 나타낸다.
2보다 큰 비율은 면역학적으로 부적합한 매치를 나타낸다.
E. 항-바이러스 면역의 세포 비히클-매개 억제의 측정
i. - iv.를 상기 파트 D.에서와 같이 수행하며, 단 대조군: PBMC 단독 및 PBMC + 세포 비히클에 더불어, 또한 다음 샘플을 포함한다: PBMC + 바이러스; PBMC + 세포 비히클 + 바이러스
v. 하나 이상의 마커에 대한 면역학적 억제 점수(ISS)를 계산한다:
[(PBMC + 바이러스 공동 배양의 마커 수준 + PBMC + 세포 비히클 공동 배양의 마커 수준) - PBMC + 바이러스 + 세포 비히클 공동 배양의 마커 수준] /(PBMC + 바이러스 공동 배양의 마커 수준 + PBMC + 세포 비히클 공동 배양의 마커 수준)(x 100, % 면역억제에 대해)의 비율.
vi. 0%보다 높은 ISS % 점수가 유리한 것으로 간주되는데, 즉, 항-바이러스 면역을 억제하는 세포 비히클의 능력을 나타내며 바이러스가 종양 세포를 감염시키는 것을 허용한다. 하나 이상의 마커가 측정되면, 평균 ISS 점수는 측정된 ISS 점수의 평균으로서 계산될 수 있다.
F. 상층액을 분석함으로써 세포 비히클의 면역조절 효과를 측정
섹션 D. 및 E.에서 기술된 측정이 또한 예컨대 ELISA 또는 Luminex 검정에 의해 공동 배양의 상층액으로 수행될 수 있다. 비록 특정 반응 세포 집단이 확인될 수 없지만(공동 배양 중의 세포/바이러스가 직접 분석되지 않기 때문임), 상층액에서 측정된 ISS 및 ICS 점수가 또한 적합성과 관련된 정보일 수 있다; 이들 점수는 상기 섹션 D. 및 E.에서 기술된 것과 같이 측정된다.
본원에 제공된 일부 구현예에서 세포 비히클 또는 비히클은, 선택적으로, 대상체-특이적 세포의 부재 하에 바이러스 증폭을 촉진하는 세포 비히클의 능력을 측정하기 위하여 사전 스크리닝이 적용될 수 있다. 선택된(예컨대, 백시니아 바이러스) 제공된 바이러스 요법의 경우, 세포 비히클(들) 또는 이용 가능한 세포 비히클의 패널(자가 / 동종 / 원래의 / 감작된 / 조작된)이 바이러스 증폭을 촉진하는 그것들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 동등한 감염 다중도(0.001 내지 1의 범위의 MOI) 및 공동 배양 조건 하에서, 감염된 세포의 수에 대해 표준화된 각 유형의 세포 비히클에 대해 바이러스 증폭 속도(pfu/세포)가 측정된다(예컨대, VPA - 바이러스 플라크 검정을 사용함). 각 유형의 바이러스에 대한 최적의 판독 시점이 사용되었다(예컨대, 1일 또는 약 1일 내지 5일 또는 약 5일). 각 유형의 세포 비히클에 대한 pfu/세포가 계산되고 세포 비히클의 바이러스 증폭 점수(VAS)로서 사용된다.
사전 스크리닝에서, 적어도 10의 pfu/세포를 유발하는 세포 비히클이 A-F에서 요약되고 본원에서 한층 더 기술되는 임의의 방법에 따라 대상체에 매칭됨으로써 추가로 스크리닝되기 위해 선택될 수 있다(10-100이 양호하며, 100-1000이 매우 양호하고, 1000 이상은 우수함). 하위패널(또는 선택된 세포 비히클 또는 비히클들)이 대상체와의 최적의 매칭을 위해 스크리닝될 수 있다.
본원에 제공된 방법에서, 세포 비히클과 대상체 사이의 매치는 상기에서 요약된 검정 A-F 중 하나 이상을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 비히클, 또는 다수의 세포 비히클 또는 세포 비히클의 패널이 매칭 검정 A-F 중 하나 이상에 따라 분석된다. 그런 후 세포 비히클은, "최상 매치"(예컨대, 순위 1)로부터 최악 매치(예컨대, 더 높은 수의 순위)의 범위로, 대상체와의 적합성에 따라 순위가 매겨진다. 각 세포 비히클에 대해, 수행된 검중 수에 따라 누적 순위가 계산된다:
누적 순위 = 순위(VAS) + 순위(IVAS) + 순위(ICS) + 순위(ISS) + 순위(MRS) / 5(모든 이들 점수가 얻어지는 경우; 당업자는 5개 미만의 점수를 얻을 수도 있음). 그런 후 세포 비히클은 매치로서의 적합성 순서로 순위가 매겨진다. 하플로타입 분석 또한 세포 비히클의 순위를 매기는 데 고려될 수 있다.
매칭 검정에 대한 상세한 방법
a. 검정에서 수행된 측정에 대한 일반적 방법
다음은 본원에서 제공된 매칭 검정의 특정 파라미터를 측정하기 위해 사용된 일반적인 방법이다:
바이러스 플라크 검정(VPA)
바이러스 플라크 검정(VPA)은 샘플 중의 바이러스의 역가, 또는 바이러스의 농도를 측정하기 위해 사용된다. 예를 들어, VPA는 상이한 조건 하에 환자-유래 면역 세포 및 세포-기반 전달 비히클의 상이한 조합으로 바이러스 입자 증폭을 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
바이러스 함유 샘플은 -80℃에서 보관되고 3회 냉동(-80℃)/해동(+37℃) 사이클이 적용된 후 빙냉수에서 1분 간격으로 3회 1분 간격으로 초음파처리된다. 초음파처리된 샘플은 백시니아 바이러스 감염 배지(2% FBS, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)로 연속적으로 희석된다. 플라크 검정은 24-웰 플레이트에서 이중 웰로 수행된다. 간단히 설명하며, 200,000개의 CV-1 원숭이 신장 세포가 웰당 1 mL의 D10 배지에 밤새 유지된다. 상층액이 흡인되고 바이러스-함유 샘플의 10배 연속 희석이 200 μL/웰 CV-1 단층에 적용된다. 플레이트는 1시간 동안 37℃(인큐베이터)에서 20분마다 수동으로 흔들어주면서 인큐베이션된다. 1 mL CMC 배지가 세포의 상부에 부드럽게 층이 형성되고 플레이트는 48시간 동안 인큐베이션된다. CMC 오버레이 배지는 15 g의 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 염(Sigma-Aldrich, C4888)을 오토클레이빙하고 실온에서 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 및 5% FBS가 첨가된 1 L의 DMEM 에서 밤새 교반하면서 재현탁하고, 4℃에서 단기간 보관함으로써 제조한다. 웰을 크리스탈 바이올렛 용액(1.3% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich, C6158), 5% 에탄올(순수 에탄올, 분자생물학 등급, VWR, 71006-012), 30% 포름알데하이드(37 % v/v 포름알데하이드, Fisher, cat # F79-9), 및 이중 증류수)으로 3 내지 5시간 동안 실온에서 토핑함으로써 세포를 고정시킨 후, 플레이트를 수돗물에 세척하고 밤새 건조시킨 후에 플라크가 계수된다. 바이러스 역가는 샘플당 플라크 형성 단위(PFU)로 계산된다.
유동 세포분석 (FLOW CYTOMETRY)
유동 세포분석은 세포 계수, 세포 분류 및 바이오마커/세포 표면 항원 검출에 이용될 수 있다. 예를 들어, 유동 세포분석은 T 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD4, CD8), γδ T 세포(예컨대, 세포의 CD3+NKp46+ 및 CD3+NKp46- 집단 및 기타), NK 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, NKp46(CD335), CD16, CD56) 및 NKT 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD16, CD56, NKp46, aGalCer-CD1d 테트라머)를 포함한 특정 면역 세포 집단을 확인하기 위한 게이팅 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응은 한정하는 것은 아니지만: 다른 것들 중에서도 CD69, CD25, CD71, CD27(CD70L), CD154(CD40L), CD137(4-1BB), CD44, CD45RA, CD45RO, CD278(ICOS), CD127(IL-7RA), CD183(CXCR3), CD197(CCR7), CD39, CD73, CD314(NKG2D), PD-1, CTLA-4, IFNα/β, IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, IL-17, IL-6, CD107a, CD107b, TGFβ, 퍼포린, 그랜자임 B, IL-1a/IL-1b, G-CSF, RANTES, EXOTAXIN, MIP-1b, MCP-1, EGF, HGF, VEGF, IL-1RA, IL-7, IP-10, IL-2R, MIG 및 IL-8을 포함한 다양한 활성화/이펙터 기능 파라미터를 유동 세포분석을 사용하여 분석함으로써 평가된다. 유동 세포분석은 또한 예를 들어, 유전자 조작된 ADSC에 의해 eGFP 발현을 검출하기 위해, L14 VV(백시니아 바이러스의 TK-삽입된 터보-FP635 조작된 LIVP 스트레인)로 감염된 세포의 백분율을 측정하기 위해 사용된다.
만약 검출하고자 하는 바이오마커/항원이 세포 표면에 있다면, 예컨대 CD 마커라면, 표면 염색이 사용된다. 그러나, 만약 사이토카인 또는 전사 인자와 같은 세포내 단백질을 검출하고자 한다면, 추가적인 고정 및 투과화 단계가 항체 염색 전에 필요하다.
표면 염색
예를 들어, 공동 배양의 유동 세포분석 분석을 위해서, PBMC와 줄기 세포의 공동 배양이 피펫팅에 의해 회수되고 V-자형 바닥 플레이트에 전달되며, FACS 완충액으로 세척된다(1% FBS를 포함한 PBS로 1회). 그런 후 세포는 30분 동안 적절한 항체 칵테일이 첨가된 FACS 완충액에서 4℃에서 표면 염색된다. 예를 들어, T 세포 또는 NKT 세포의 표면 상의 CD3의 검출을 위해, 항-인간 CD3-PerCP/Cy5.5(BioLegend, cat# 300328, 1:50)가 사용되고; NK 세포 표면 상의 CD335/NKp46 검출을 위해, 예를 들어, 항-인간 CD335/NKp46-PE(BioLegend, cat# 331908, 1:50)가 사용되며; T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 표면 상의 CD69 검출을 위해, 예를 들어, 항-인간 CD69-APC(BioLegend, cat# 310910, 1:50)가 사용된다. FACS 완충액은 또한 가변성 프로브(ThermoFisher Scientific, LIVE/DEAD 고정 가능한 바이올렛 죽은 세포 염색 키트, 405 nm 여기용, cat# L34964, 1:1000에서)를 함유할 수 있다. 염색 후에, 세포는 FACS 완충액으로 2회 세척되고, 1x PBS 중의 2 % PFA에 15분 동안 실온에서 고정되고, 다시 FACS 완충액으로 세척되어 PFA가 제거된 후, BD FACSAria II 유동 세포분석기(BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 분석된다.
예를 들어, 면역 세포의 표면 상의 CD107a 검출에 의해 세포독성 기능의 평가를 위해, 항-인간 CD107a-AlexaFluor 488(BioLegend, cat. # 328610)이 회수 및 표면 염색 전 5시간 전에 1:20(10 μl /웰)의 공동 배양에 직접 첨가된 후, 1;1000의 모넨신(Monensin)(BioLegend, cat. # 420701-BL, 1000X)이 첨가되고 1시간 후에 추가로 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다.
세포내 염색
γδ T 세포를 포함한 활성화된 NK, NKT 및 T 세포에서 IFNγ 생성을 평가하기 위하여, 예를 들어, 세포내 염색이 필요하다. 회수 및 표면 염색을 위해 브레펠딘(Brefeldin) A 용액(BioLegend, cat. # 420601-BL, 1000X)이 자극 후 1시간 후에, 또는 4시간 전에 1:1000로 첨가된다. 만약 세포가 IFNγ 생성 및 CD107a 표면 노출 둘 다에 대해 평가되어야 한다면, 모넨신(BioLegend, cat. # 420701-BL, 1000X) 및 브레펠딘 A가 함께 첨가된다. 표준 표면 및 생존 염색 후에, 세포는 eBioscience 세포내 염색 완충액 세트(ThermoFisher, cat. # 00-5523)를 사용하여 프로세싱된다. 간단히 설명하면, 항-CD107a-AlexaFluor 488이 있거나 또는 없이 표면 염색 후에, 세포는 30분 동안 1부의 고정/투과화 농축물(ThermoFisher, cat. # 00-5123) 및 3부의 고정/투과화 희석제(ThermoFisher, cat. # 00-5223)로 고정되고, 이중 증류수에 1:10으로 희석된 200 μl/웰 투과화 완충액 10x(ThermoFisher, cat. # 00-8333)로 2회 세척되고, 투과화 완충액 중의 항-인간 IFNγ-APC 항체(BioLegend, cat. # 502512, 1:50)로 1시간 동안 실온에서 염색된다. 그런 후 세포는 투과화 완충액으로 2회 세척되고, 1x PBS 중의 2% PFA에 15분 동안 실온에서 고정되고, 다시 FACS 완충액으로 세척되어 PFA가 제거되고, BD FACSAria II 유동 세포분석기(BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 분석된다.
ELISPOT
효소-결합 면역스팟(ELISPOT)은 희귀한 항원-특이적 및 사이토카인-생성 면역 세포의 민감하고 정확한 확인 및 정량화, 및 PBMC 집단 내에서 단일 양성 세포를 검출하는 그것의 능력을 토대로 한, 세포 면역 반응을 모니터링하기 위해 광범위하게 이용되는 면역검정이다. 유동 세포분석과 같이, ELISPOT은 γδ T 세포를 포함한 T 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD4, CD8), γδ T 세포를 포함한 NK 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, NKp46(CD335), CD16, CD56) 및 NKT 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD16, CD56, NKp46, aGalCer-CD1d 테트라머)와 같은 특정 면역 세포 집단을 확인하는 마커의 패널, 뿐만 아니라 한정하는 것은 아니지만: 다른 것들 중에서도 CD69, CD25, CD71, CD27(CD70L), CD154(CD40L), CD137(4-1BB), CD44, CD45RA, CD45RO, CD278(ICOS), CD127(IL-7RA), CD183(CXCR3), CD197(CCR7), CD39, CD73, CD314(NKG2D), PD-1, CTLA-4, IFNα/β, IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, IL-17, IL-6, CD107a, CD107b, TGFβ, 퍼포린, 그랜자임 B, IL-1a/IL-1b, G-CSF, RANTES, EXOTAXIN, MIP-1b, MCP-1, EGF, HGF, VEGF, IL-1RA, IL-7, IP-10, IL-2R, MIG 및 IL-8을 포함한, 활성화/이펙터 기능 마커의 패널을 토대로, 면역 활성화 및 면역억제를 분석하기 위해 사용될 수 있다.
ELISPOT 검정은 샌드위치 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)와 매우 유사한 기법이다. 전형적인 프로토콜에서, 먼저, 35% 에탄올에서 30초 동안 인큐베이션된 후, 200 μl/웰 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척되어 에탄올이 제거됨으로써 PVDF 막이 96-웰 플레이트에서 제조된다. 그런 후 플레이트는 관심 있는 분석물에 특이적인 포획 항체(대략 2-15 μg/ml로 PBS에 희석됨, 100 μl/웰)로 코팅되고, 밤새 4℃에서 인큐베이션된다. 그런 후 웰은 비워지고 200 μl/웰 PBS로 3회 세척되어 미결합 포획 항체가 제거된 후, 막은, 예를 들어, 100 μl/웰의 PBS 중의 2% 건조한 탈지유 또는 200 μl/웰의 PBS 중의 1% BSA을 사용하여 차단되고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션되어 막에 대한 비특이적 결합이 방지된다. 그런 후 플레이트는 200 μl/웰 PBS로 3회 세척되고 공기 건조된 후, 다음 단계에서 사용되거나 4℃에서 건조제와 함께 최대 2주 동안 보관된다. 세포, 예를 들어, PBMC는 희석되고, 웰에, 전형적으로 웰당 2 x 104 내지 5 x 105개의 PBMC로 피펫팅되고, 적절한 배양 배지가 첨가되고 플레이트는 가습된 37℃ CO2 인큐베이터에 특정 시간 동안, 보통 24-72시간 동안, 예를 들어 IFNγ, IL-2 및 TNFα의 경우 24시간, IL-4, IL-5 및 IL-10의 경우 48시간 동안 넣어진다. 사이토카인, 예컨대 활성화된 세포에 의해 분비된 IFNγ는 PVDF 막 상에 고정된 항체에 결합한다. 웰은 200 μl/웰의 PBS로 3회 세척된 후, 200 μl/웰의 PBS/0.1% Tween-20으로 3회 세척되어 세포 및 미결합 분석물이 제거되고, 관심 있는 분석물에 특이적이고, PBS/1% BSA에 대략 0.25-2 μg/웰(100 μl/웰)로 희석된 비오티닐화된 검출 항체가 첨가되고 1-2시간 동안 실온에서, 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션된다. 그런 후 플레이트는 200 μl/웰의 PBS 0.1% Tween-20으로 3-4회 세척되어 임의의 미결합 비오티닐화 항체가 제거되고, 효소, 예컨대 양고추냉에 과산화효소(HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(AP)에 콘쥬게이션된 스트렙트아비딘(100 μl/웰, PBS-Tween-BSA에 1:500-1:2000으로 희석됨)이 각 웰에 첨가되고 플레이트는 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션된다. 대안으로, 검출 항체는 효소에 직접 콘쥬게이션될 수 있다. 미결합 효소는 세척되고(3 x 200 μl/웰의 PBS/0.1% Tween-20 및 3 x 200 μl/웰의 PBS) 기질 침전 용액(예컨대, HRP의 경우 AEC 또는 AP의 경우 BCIP/NBT)이 첨가된다. 착색된 침전이 형성되는데, HRP의 경우 적색이거나, AP의 경우 검푸른색이며, 각각의 착색된 반점은 전형적으로 개별적인 사이토카인-분비 세포를 나타낸다. 반응은 증류수로 부드럽게 세척함으로써 중단되고, 플레이트/막은 실온에서 건조되고, 반점은 수동으로 (예컨대, 해부 또는 실체현미경 사용) 또는 자동 ELISPOT 판독기로 계수될 수 있다. 만약 다중 사이토카인이 동일한 검정으로 측정되어야 한다면, 형광-표지된 항-사이토카인 항체가 사용되고 변형된 검정은 FluoroSpot 검정으로서 알려져 있다.
b. 대상체-유래 면역 세포의 선택
1. PBMC - 예컨대, 피콜-파크 원심분리를 사용하여 분리될 수 있다.
2. 전혈 - 헤파린처리된 전혈은 PBMC 이외의 혈액 세포 유형, 예컨대, 호중구를 포함한다.
3. RBC 용해가 있는 전혈 - 다수의 적혈구를 제거하고 고농도의 림프구 및 골수 세포를 이룰 수 있다. 이 용해 후에 세척 단계는 선택적으로, 피콜-파크 PBMC 분리 중에서와 같이, 대상체 혈청/혈장을 제거하기 위해 수행될 수 있다.
4. 자가 대상체 혈장/혈청이 보충된, RBC 용해가 있는 PBMC/전혈 - 대상체 혈장은 헤파린처리된 인간 혈액으로부터 고속 원심분리 후에 분리될 수 있고, 혈청은 대상체로부터의 헤파린처리되지 않고 응고된 혈액의 고속 원심분리 후에 분리될 수 있다. 그런 후 RBC 용해 후의 PBMC 또는 전혈 세포는 보충물로서 첨가된 10% 내지 50% 자가 대상체 혈청 또는 혈장과 함께 인큐베이션될 수 있다. 검정의 일부 조건에서 혈청/혈장 중의 보체는 선택적으로, 필요에 따라 열적으로 또는 약물학적으로 추가로 비활성화될 수 있다.
5. 특정 면역 세포 집단, 그것의 하위 집단 및 조합.
c. 세포 비히클과 바이러스와의 매칭
이 분석은 대상체-유래 면역 세포와의 배양 전에 수행될 수 있다. 세포 비히클/바이러스 적합성 스크리닝은 하나 이상의 세포 비히클과 분석될 바이러스의 공동 배양의 분석에 의해 수행된다; 하나 이상의 세포 비히클/바이러스 조합이 평가될 때, 방법은 동등한 검정 조건 하에서 수행된다.
공동 배양의 각각에 대해, 바이러스 증폭을 촉진하는 세포 비히클의 능력은 검출 가능하게 표지된 단백질, 예컨대, 형광 표지된 단백질을 발현하도록 조작된 세포 비히클/바이러스를 사용하는, 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있는 방법에 의해 측정된다. 예를 들어 다음을 포함하는 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있는 방법이 사용될 수 있다:
1. 바이러스 플라크 검정(VPA)
2. qPCR
3. 형광 영상화(검출 가능한 표지 또는 형광 단백질을 발현하도록 조작됨)
4. ELISA(예컨대, 바이러스-암호화된 β-갈락토시다제를 측정함)
5. 생물발광(예컨대, 리포터 유전자 루시페라제를 발현하도록 조작된 바이러스)
6. 형광 현미경(형광 세기를 측정하기 위한 영상화 소프트웨어)/바이러스 감염의 시간 과정을 모니터링하기 위한 형광 플레이트 판독기(예컨대, 녹색 채널(GFP) 상의 세포 비히클, 적색 채널(TurboFP635) 상의 바이러스 추적).
바이러스 증폭 속도는 분석된 각 세포 비히클에 대해, 동등한 검정 조건 하에서 MOI(0.01-10) 및 약 24시간-1주의 공동 배양 주기를 사용하여 측정된다. 측정된 속도는 감염된 세포 비히클의 수에 대해 표준화된다: 1-10의 세포 비히클당 Pfu는 제한된 효능으로 간주될 수 있고(주어진 바이러스에 대한 세포 비히클로서); 10-100의 세포 비히클당 Pfu는 양호한 효능으로 간주될 수 있으며; 100-1000의 세포 비히클당 Pfu는 매우 양호한 효능으로 간주될 수 있고; 1000 이상의 세포 비히클당 Pfu는 극히 높은 효능으로 간주될 수 있다.
적어도 10의 pfu/세포 비히클을 나타내는 세포 비히클과 바이러스의 조합은 대상체로부터 유래된 세포를 사용하는 매칭 검정에서 테스트되는 것으로 여겨질 수 있다. 대안으로, 동등한 검정 조건 하에서 측정된 세포 비히클당 표준화된 pfu 값은 치료법에 대한 매치로서(또는 매치가 아닌) 세포 비히클 + 바이러스 조합의 순위를 매기는 것에 기여하는 바이러스 증폭 점수(VAS)로서 사용될 수 있다.
d. 세포 비히클/바이러스 조합과 대상체와의 매칭
1. 대상체 하플로타입 데이터는 더 가깝거나 더 먼 매칭을 토대로 특정 세포 비히클과의 환자의 적합성을 예측할 수 있다. HLA 유전자좌 매칭(HLA-A, HLA-DP) 및 KIR 하플로타입 매칭은 자주 다중 동종 세포 비히클을 향한 대상체의 광범위한 허용성을 시사하지만, 결정적인 것은 아니다. 그러나 데이터의 예측 값은 대상체 매칭/적합성 데이터를 데이터베이스에 축적하고 검정-검증된 상관관계를 토대로 적합성을 예측하기 위해 개발된 알고리즘을 사용함으로써 증대될 수 있다. 하플로타입 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다:
i. 환자 혈액 또는 다른 DNA 공급원을 분리한다.
ii. 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 DNA를 추출한다.
iii. 차세대 서열분석 또는 기술분야에 공지된 동등한 방법을 사용하여 환자-특이적 유전자 다형성의 관련된 유전자를 분석한다.
- 고전적 MHC I/II 하플로타입
- KIR 하플로타입 및 리간드
- 비고전적 MHC 하플로타입(예컨대, HLA-E; CD1a,b,c,d; MICA/B)
iv. 각 환자의 유전자 다형성 프로파일을 이용 가능한 세포 비히클(들)의 프로파일과 비교한다.
- 환자와 세포 비히클 사이의 MHC 미스매치를 확인한다.
- 환자와 세포 비히클 사이의 KIR 및 KIR 리간드 미스매치를 확인한다.
- 환자와 세포 비히클 사이의 비고전적 MHC 유전자좌에서의 미스매치를 확인한다.
- 어떤 세포 비히클이 환자에 가장 적합한지 확인하기 위하여 모든 이용 가능한 세포 비히클을 미스매치의 최소 수를 토대로 비교하거나; 또는 단일 세포 비히클만이 사용된 경우에, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상의 매치가 있는지 알아보기 위하여 퍼센트 미스매치를 확인한다.
- 검정 데이터를 반복적으로 축적하고 특정 유전자좌에서의 미스매치는 유리하지 않으며 세포 비히클이 바이러스를 증폭시키지 못하는 실패를 초래하는 것을 보여주는 것을 토대로 인실리코(in silico) 소프트웨어 알고리즘/프로그램이 가장 적합한 매치를 예측하기 위해 사용될 수 있다. 인실리코 적합성 예측 알고리즘은 새로운 대상체 및 세포 비히클 적합성 스크리닝 데이터로 반복적으로 업데이트될 수 있고, 다양한 종양용해 바이러스(예컨대, 백시니아 바이러스 이외의 바이러스)에 대한 세포 비히클 적합성을 예측하기 위해 인실리코에서 조정될 수 있다.
2. 그렇지 않으면 내성인 종양 세포: 세포 비히클 + 살아있는 종양 생검 +/- 바이러스를 충원/감작시키는 능력의 측정
대상체-유래 면역 세포, 세포 비히클 및 바이러스는 동시에 공동 배양되거나, 또는 세포 비히클 + 바이러스가 먼저 인큐베이션(예컨대, 15분 내지 48시간)된 후, 대상체-유래 면역 세포에 첨가될 수 있다. 예컨대 24시간 내지 1주의 인큐베이션 시간 후에(일부 구현예에서, 48시간), 다음의 측정이 수행된다:
a. 표지된 세포 비히클의 "종양-지향 이동"을 가시화하고 정량화하기 위한 형광 영상화
b. 비표지된 또는 표지된 종양-생검-유래 암 또는 기질 세포(예컨대, 암 관련 섬유모세포, 면역 세포, 등)의 세포 비히클-지향 이동을 가시화하고 정량화하기 위한 형광 영상화
c. 대상체 종양 생검의 세포 비히클-향상된 콜로니화 및 바이러스 증폭의 상조적 효과, 즉, 대상체 종양 생검 + 세포 비히클에서의 바이러스 증폭이
- 동등한 조건 하에서의 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭 + 동등한 조건 하에서 세포 비히클 단독에서의 바이러스 증폭의 합보다 5% 이상 큰지;
- 또는 동등한 조건 하에서 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭보다 적어도 5% 이상 더 큰지를 가시화하고 정량화하기 위한 형광 영상화
d. 방법:
- 대상체로부터 새롭게 분리된 살아있는 고형 종양 생검은 동등한 크기/질량/부피의 복제 조각으로 나누어질 수 있다.
- 이동 검정은 표준 트랜스웰, 바이오겔(하이드로겔), 또는 세포외 기질(콜라겐/피브로넥틴)-코팅된 표면 시스템을 사용하여 설정될 수 있고, 2개의 구성요소(고형 종양 생검 및 세포 비히클)가 각각 별도의 챔버에 또는 인접한 위치에서 침착될 것이다.
- 새롭고 살아있는 대상체 종양 생검의 동등한 복제 조각은 CFSE, GFP, RFP, 등과 같은 형광 마커로 표지된 세포 비히클과 함께 15분 내지 1주의 기간 동안 공동 배양된다.
- 만약 종양 생검이 하나 이상의 유형의 세포 비히클과 공동 배양된다면, 세포 비히클은 어떤 유형의 세포 비히클이 대상체의 종양 생검에 대해 우선적으로 충원되는지 확인 및 정량화를 가능하게 하기 위하여 상이한 형광 마커로 표지될 수 있다.
- 고형 종양 생검에 축적되는 형광 표지된 세포 비히클 세포의 %는 세포 비히클 충원의 효능의 척도로서 사용될 수 있으며, 100% 충원은 최상이고 0% 충원은 최악이며, 이런 %는 세포 비히클-대-종양 이동 점수(CTMS)로서 사용될 수 있다.
- 대안으로, 새로운 종양 생검은 고형 종양 생검을 벗어나 세포 비히클로 향하는 종양 또는 종양 관련 기질 세포의 세포 비히클-지향 이동을 추적하기 위하여, CFSE, CYTO-ID Green/Red(Enzo), CellTracker(Thermofisher Scientific) 또는 대체물과 같은 무독성 추적 염료로 형광 표지될 수 있다.
- 종양을 벗어나 세포 비히클로 향해 이동하는 형광 표지된 종양 또는 종양 관련 기질 세포의 %는 세포 비히클에 의한 종양/기질 세포 충원의 효능의 척도로서 사용될 수 있으며, 100% 충원이 최상이고 0% 충원이 최악이며, 이런 %는 종양-대-세포 비히클 이동 점수(TCMS)로서 사용될 수 있다.
- 병행하여, 종양 세포 생검 단독, 세포 비히클을 포함한 종양 세포 생검, 또는 세포 비히클 단독의 복제 공동 배양의 일부는 종양 생검을 벗어나 유지되는 형광 표지된 세포 비히클에 대비하여 종양 생검에서의 바이러스 증폭 정도의 시각화 및 형광 세기-기반 정량화를 가능하게 하기 위해 형광 마커-조작된 종양용해 바이러스(예컨대 TurboFP635)로 감염될 수 있다;
- 종양 생검 +/- 세포 비히클 또는 세포 비히클 단독에서의 바이러스 증폭 정도는 표준 VPA(바이러스 플라크 검정)에 의해서뿐만 아니라 바이러스-조작된 마커의 형광 세기를 사용하여 평가될 수 있다.
- 또한 일부 바이러스가 종양 또는 운반 세포의 이동을 유의하게 간섭하는지를 테스트하기 위하여 상이한 바이러스의 존재 하에 이동 검정을 사용할 수 있다. 바이러스는 공동 배양에 직접 첨가되거나 그것과 생검 시편과의 공동 배양 전에 운반 세포에 사전 로딩될 수 있다. 바이러스-교정된 CTMS(VCTMS) 및 TCMS(VTCMS)는 상기와 같이 계산되고, 세포 이동 및 생존을 간섭하는 바이러스의 능력을 반영한다.
- 각각의 대상체 종양 생검-세포 비히클-바이러스 조합에 대한 누적 평균 이동/충원 점수(MRS)는 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
MRS(생검, 세포 비히클, 바이러스 조합) = [VCTMS(생검, 세포 비히클, 바이러스) + VTCMS(생검, 세포 비히클, 바이러스)]/2; 또는
MRS(생검, 세포 비히클 조합) = [CTMS(생검, 세포 비히클) + TCMS(생검, 세포 비히클)]/2.
- 세포 비히클은 후속하여 평균 MRS 점수를 토대로 각각의 대상체 및 바이러스 조합에 대해 순위가 매겨질 수 있다.
3. 대상체/세포 비히클 매치에 대한 공동 배양의 분석, 즉 세포 비히클-매개 바이러스 요법: 대상체-유래 PBMC + 세포 비히클 + 바이러스에 대한 대상체 허용성
(a) - 바이러스 증폭의 측정(기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있고 본원에 제공된 검정 참조)
- 세포 비히클과 환자 PBMC의 공동 배양 중의 바이러스 증폭이 동일한 세포 비히클이 PBMC의 부재 하에 감염될 때의 바이러스 증폭의 80%를 초과하면 적합한 매치임.
- 세포 비히클과 환자 PBMC의 공동 배양 중의 바이러스 증폭이 동일한 세포 비히클이 PBMC의 부재 하에 감염될 때의 바이러스 증폭의 30-80%의 범위이면 중간 정도로 적합한 매치임.
- 세포 비히클과 환자 PBMC의 공동 배양 중의 바이러스 증폭이 동일한 세포 비히클이 PBMC의 부재 하에 감염될 때의 바이러스 증폭의 10-30%의 범위이면 적당히 적합한 매치임.
- 세포 비히클과 환자 PBMC의 공동 배양 중의 바이러스 증폭이 동일한 세포 비히클이 PBMC의 부재 하에 감염될 때의 바이러스 증폭의 10% 미만이면 부적합한 매치임.
- % 적합성은 각 개별 환자에 대해 및 각 특정 바이러스에 대해 최소 내지 최대 적합한 세포 비히클까지 세포 비히클의 순위를 매기는 데 사용될 수 있다.
- % 적합성은 또한 다음 식을 사용하여 환자, 세포 비히클 및 종양용해 바이러스의 각 조합에 대한 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)로서 계산될 수 있다:
IVAS(%, 환자, 세포 비히클, 바이러스) = (세포 비히클 + 대상체 PBMC 공동 배양으로부터의 바이러스의 pfu/세포 비히클 단독으로부터의 바이러스의 pfu) x 100.
예컨대, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상 또는 10%-30% 이상의 IVAS 점수가 고려하기에 적당한 것으로 간주될 수 있다.
하나 이상의 유형의 세포 비히클이 스크리닝되는 경우, 이런 IVAS 점수(%가 높을수록, 적합성이 더 높음)는 각 환자에 대해 및 각 바이러스에 대해 최소 내지 최대 적합한 세포 비히클까지 세포 비히클의 순위를 매기는 데 사용될 수 있다.
- IVAS 점수는 선택적으로 대상체의 혈청에서 보체 및 중화 항체의 효과를 고려함으로써 추가로 교정될 수 있다(선택적 대상체 혈청 저항 스크리닝):
- PBMC가 있거나 없는 대상체 유래 혈청의 존재 하에 세포 비히클에 의한 바이러스 증폭의 %억제를 0 내지 100% 억제의 범위로 평가하고 환자 혈청 저항 점수(PSRS)를 다음 식을 사용하여 계산한다:
PSRS = (혈청이 없을 때의 pfu - 혈청이 있으며 보체 비활성화가 없을 때의 pfu/혈청이 없을 때의 pfu) x 100.
- 95% 이상의 PSRS 점수는 강력한 혈청-매개 억제를 나타낼 것이며, 허용적인 IVAS 점수를 입증하였음에도 불구하고 후자(IVAS 점수)가 대상체의 세포 면역만을 고려하기 때문에 바이러스가 대상체와 적합하지 않을 것임을 시사한다.
- 교정된 IVAS 점수: IVAS(PSRS-교정) = IVAS x(100 - PSRS)/100을 사용하여 세포 비히클 적합성 테스트에서 사용한 바이러스를 평가한다.
- 바이러스 증폭의 억제에 대한 보체의 기여는 대상체 PBMC가 있거나 없는 및 열적 또는 약물학적 혈청 비활성화가 있거나 없는 대상체-유래 혈청의 존재 하에 세포 비히클에 의한 바이러스 증폭의 % 억제를 사용하여 다음 식을 사용하여 0 내지 100%의 범위로 평가될 수 있다:
% 보체 억제 = (혈청이 있고 보체 비활성화가 있을 때의 pfu - 혈청이 있고 보체 비활성화가 없을 때의 pfu/혈청이 없을 때의 pfu) x 100.
- 이런 % 보체 억제는 대상체/환자 보체 저항 점수(PCRS)로서 사용될 수 있고 기존의 노출/바이러스-특이적 중화 항체와 관련된 면역의 존재와 무관한 다중 종양용해 바이러스에 대한 더 광범위한 내성을 가지는 대상체를 나타낼 것이다.
(b) - 면역학적 적합성(면역 특권/ 면역억제 효과)의 측정
(i) - 바이러스/세포 비히클-매개 인터페론(예컨대, IFNγ) 생성의 상향 조절을 측정한다(허용적인 파라미터 범위에 대해 하기 섹션 (I)에서의 ICS 점수 설명 참조함).
IFNγ ELISPOT
유동 세포분석
- 사용된 표지된 항체는 항-인간 IFNγ, 예컨대, 항-인간 IFNγ-APC이다
(ii) - γδ T 세포를 포함한 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 마커의 상향 조절을 측정한다
그랜자임 B ELISPOT
유동 세포분석
- 사용된 표지된 항체는 항-인간 CD107a / CD107b(예컨대, 항-인간 CD107a-AlexaFluor 488)이다
(iii) - γδ T 세포를 포함한 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포-매개 활성화/이펙터 기능과 관련된 기타 마커의 상향 조절을 측정한다(허용적인 파라미터 범위에 대해 하기 섹션 (I)에서의 ICS 점수 설명 참조함).
- 형광-표지된 항체는 면역 세포 상에서/에서 다양한 활성화/이펙터 기능 마커, 예컨대 다음의 표면 수준 또는 세포내 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다:
활성자/이펙터 기능 마커
CD69(예컨대, 항-인간 CD69-APC)
CD25
CD71
ICOS
CD314(NKG2D)
PD-1
CTLA-4
IFNα/β
IFNγ
TNFα
IL-2
IL-4
IL-5
IL-6
IL-8
IL-9
IL-10
IL-12
IL-13
IL-15
IL-17
IL-18
IL-21
IL-22
IL-23
IL-25
GM-CSF
CD107a
CD107b
TGFβ
퍼포린
그랜자임 B
CD27(CD70L)
CD154(CD40L)
CD137(4-1BB)
CD44
CD45RA
CD45RO
CD278(ICOS)
CD127(IL-7RA)
CD183(CXCR3)
CD197(CCR7)
CD39
CD73
IL-1a/IL-1b
G-CSF
RANTES
EXOTAXIN
MIP-1b
MCP-1
EGF
HGF
VEGF
IL-1RA
IL-7
IP-10
IL-2R
MIG
(iv) - 표지된 항체(예컨대, 형광)는 다양한 특징적인 마커, 예컨대 다음을 발현하는 특정 면역 세포 집단을 확인하기 위해 사용될 수 있다:
T-세포 / γδ T 세포:
CD3(예컨대, 항-인간 CD3-PerCP/Cy5.5)
CD69(예컨대, 항-인간 CD69-APC)
CD4
CD8
NK 세포 / γδ T 세포:
CD107a/ CD107b(예컨대, 항-인간 CD107a-AlexaFluor 488)
CD335(예컨대, 항-인간 CD335 또는 NKp46-PE)
CD16
CD56
NKT 세포:
CD335(예컨대, 항-인간 CD335 또는 NKp46-PE)
CD3
CD16
CD56
aGalCer-CD1d 테트라머
(v) - 최상의 매치에 대한 공동 배양으로부터의 ELISPOT/유동 세포분석 데이터의 분석은 다음의 점수에 의해 측정될 수 있다:
(I) 면역학적 적합성 점수(ICS)
- PBMC 단독과 관련하여 공동 배양 중의 활성화/이펙터 기능 파라미터(상기 중 적어도 하나)의 비율이 약 1 - 1.05 이하인 경우, 세포 비히클이 면역 반응에 영향을 미치지 않거나, 반응을 감소시킨다, 즉 그것은 면역학적으로 적합한 매치인 것을 나타낸다.
- 중간 정도로 면역학적으로 적합한 매치는 비율이 1.05 내지 1.5의 범위 내에 있을 때이다.
- 최소한으로 면역학적으로 적합한 매치는 비율이 1.5 내지 2의 범위 내에 있을 때이다.
- 면역학적으로 부적합한 매치는 비율이 2보다 클 때이다.
- 활성화/이펙터 파라미터는 감소된 바이러스 증폭과의 확립된 연관성을 토대로 가중치가 부여될 수 있는데, 예컨대, IFNγ 및 CD107a는 바이러스 증폭에 대한 그것의 영향이 상당한 것으로 여겨지며, 다른 활성화/이펙터 파라미터로부터의 데이터가 이용 가능해짐에 따라 유의성 수준/가중치는 반복적으로 업데이트된다(인실리코 분석 섹션 참조).
- 동종 세포 비히클에 반응하는 면역 세포 집단은 또한 감소된 바이러스 증폭과의 확립된 연관성을 토대로 가중치가 부여될 수 있는데, 예컨대, γδ T 세포 하위집단을 포함한 NK, NKT 및 T 세포가 유의한 것으로 여겨지면, 다른 집단/하위집단과의 연관성의 새로운 데이터가 이용 가능해짐에 따라 유의성 수준/가중치 하위집단이 반복적으로 업데이트된다(인실리코 분석 섹션 참조).
- 각 환자-세포 비히클 조합에 대해, 선택된 면역 세포 하위집단 및 활성화/이펙터 파라미터(p1,2,3, 등)의 ICS 비율의 평균을 토대로 누적 ICS 점수를 다음과 같이 계산한다:
NK 세포: ICS(NK) = [ICS(p1) + ICS(p2) + ICS(p3) + .. ICS(pn)] / n
T 세포: ICS(T) = [ICS(p1) + ICS(p2) + ICS(p3) + .. ICS(pn)] / n
NKT 세포: ICS(NKT) = [ICS(p1) + ICS(p2) + ICS(p3) + .. ICS(pn)] / n
여기서 "n"은 고려되는 관련된 활성화/이펙터 기능 파라미터의 총 수이다(예컨대, IFNγ 및 CD107a만이 평가된다면 n=2임).
- 각 환자-세포 비히클 조합에 대한 평균 ICS 점수를 누적하고 모든 관련된 이펙터 집단을 조합하여 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
ICS[NK(1) + T(2) + NKT(3) + ... E(n)] = [ICS(NK,1) + ICS(T,2) + ICS(NKT,3) + ... ICS(E,n)] / n,
여기서 "n"은 고려되는 관련된 이펙터 면역 세포 집단/하위집단의 총 수이다(예컨대, NK, T, 및 NKT 세포만이 평가되면 n=3이고, 다른 집단, 예컨대, gd(γδ) T 세포가 또한 고려되면 n=4인 식임).
(II) 면역학적 억제 점수(ISS)
- 항-바이러스 면역의 세포 비히클-매개 억제가 환자와 세포 비히클의 각 조합에 대해 각각의 면역 세포 하위유형 및 이펙터 파라미터에 대해 면역학적 억제 점수(ISS; 항-바이러스 세포 면역의 % 억제)를 계산하기 위하여 다음 식을 사용하여 평가될 수 있다:
ISS =(PBMC+바이러스 공동 배양 중의 % 활성화된 이펙터 + PBMC+세포 비히클 공동 배양 중의 % 활성화된 이펙터 - PBMC+바이러스+세포 비히클 공동 배양 중의 % 활성화된 이펙터 / PBMC+바이러스 공동 배양 중의 % 활성화된 이펙터 + PBMC+세포 비히클 공동 배양 중의 % 활성화된 이펙터) x 100,
여기서 % 활성화된 이펙터는 바탕값을 뺌으로서 첫 번째로 표준화되거나 PBMC 단독 대조군 중의 % 활성화된 이펙터이다.
- 0% 이상의 ISS가 유리하다. 비록 0%의 ISS가 면역억제의 부재를 나타내거나, 세포 비히클이 항바이러스 면역을 억제하기보다는 자극하는 것을 가리키는 마이너스 ISS 값을 나타내더라도, 이러한 결론은 그것이 바이러스를 증폭하는 세포 비히클의 능력을 단순히 반영하고, 그로써 항바이러스 면역을 억제하기보다는 하류에서 증대되는 것으로 기대될 수 있기 때문에 결정적이지 않다.
- 마이너스 % 값은 결정적이지 않다.
- 더 높은 ISS 값은 항-바이러스 면역을 억제하는 세포 비히클의 더 큰 능력 및 바이러스의 종양 세포로 확산되는 개선된 능력을 나타낸다. 그러나, 전체적인 유의성은 또한, 더 높은 IVAS 및 더 낮은 ICS 점수가 더 높은 바이러스 증폭과 상관이 있고 항-바이러스 반응의 억제를 더 도전적인 것으로 만들 것이기 때문에, IVAS 및 ICS와 같은 다른 채점 기준에 좌우된다.
- 각각의 환자-세포 비히클 조합에 대해 모든 반응하는 면역 세포 하위집단 및 핵심 활성화/이펙터 파라미터(p1,2,3, 등)에 대한 ISS % 억제의 평균을 토대로, 다음과 같이 누적 ISS 점수를 계산한다:
NK 세포: ISS(NK) = [ISS(p1) + ISS(p2) + ISS(p3) + ... ISS(pn)] / n
T 세포: ISS(T) = [ISS(p1) + ISS(p2) + ISS(p3) + ... ISS(pn)] / n
NKT 세포: ICS(NKT) = [ISS(p1) + ISS(p2) + ISS(p3) + ... ISS(pn)] / n,
여기서 "n"은 고려되는 관련된 활성화/이펙터 기능 파라미터의 총 수이다(예컨대, IFNγ 및 CD107a만이 평가된다면 n=2임).
- 각각의 환자-세포 비히클 조합에 대한 평균 ISS 점수를 누적하고 모든 관련된 이펙터 집단을 조합하는 것은 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
ISS[NK(1) + T(2) + NKT(3) + ... E(n)] = [ISS(NK,1) + ISS(T,2) + ISS(NKT,3) + ... ISS(E,n)] / n,
여기서 "n"은 고려되는 관련된 이펙터 면역 세포 집단/하위집단의 총 수이다(예컨대, NK, T, 및 NKT 세포만이 평가되면 n=3이고, 다른 집단, 예컨대, gd(γδ) T 세포가 또한 고려되면 n=4인 식임).
(c) - 공동 배양의 상층액을 분석함으로써 면역조절(면역 특권/면역억제 효과)의 측정
기술분야에 알려져 있는 방법, 예컨대, ELISA 및 Luminex 검정이 공동 배양의 상층액에서 다음의 활성자/이펙터 기능 파라미터를 측정하기 위해 사용될 수 있다:
IFNα/β
IFNγ
TNFα,
IL-2
IL-4
IL-5
IL-9
IL-10
IL-12
IL-13
IL-15
IL-18
IL-21
IL-22
IL-23
IL-25
GM-CSF
IL-17
IL-6
TGFβ
퍼포린
그랜자임 B
IL-1a/IL-1b
G-CSF
RANTES
EXOTAXIN
MIP-1b
MCP-1
EGF
HGF
VEGF
IL-1RA
IL-7
IP-10
IL-2R
MIG
IL-8
이들 측정(상층액)은 원래 세포를 확인할 수 없는 한편, 당업자는 공동 배양에 대해 기술된 방식으로 누적 ICS(및/또는 ISS) 점수를 여전히 측정할 수 있다.
- 유동 세포분석 결과를 확인하거나 세포 비히클-유도 활성화된/이펙터 면역 세포의 최소 증가가 이펙터 사이토카인/케모카인의 생성의 상당한 증가와 결부된 경우에 환자에 대한 누적 점수에 대해 교정할 수 있다. 이것은 면역 이펙터의 빈도뿐만 아니라 그것의 활성의 크기도 설명해준다.
(d) - 대상체-특이적 적합성을 토대로 한 바이러스 요법에 대한 세포 비히클의 선택
본원에 제공된 방법에 따라 대상체와 매칭되는 것으로서 선택된 세포 비히클은 다음 특징 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 가진다:
(1) 대상체-유래 세포의 부재 하의 최대 바이러스 증폭(VAS 점수)
(2) 대상체-유래 세포의 존재 하의 최대 바이러스 증폭(IVAS 점수);
(3) 항-세포 비히클 면역학적 반응의 최소 유도(ICS 점수);
(4) 항-바이러스 면역학적 반응의 유도를 억제하는 최대 능력(ISS 점수).
(5) 종양을 향해 이동하고 종양 및/또는 종양-관련 기질 세포를 충원하는 최대 능력(이러한 세포/종양이 평가될 수 있는 경우; MRS 점수).
(6) 본원에 제공된 특정 유전자좌에서의 최소 하플로타입 미스매치.
- 세포 비히클의 하나 이상 또는 패널이 대상체와의 매칭에 대해 스크리닝될 때, 세포 비히클 선택은 하플로타입 미스매치의 수를 토대로 순위가 매겨질 수 있고, 상기 (1)-(5)에 제시된 점수 중 하나, 또는 하나 이상의 유형의 매칭 검정이 수행되는 경우 상기 (1)-(5)에 제시된 점수의 임의의 둘 이상의 조합이 누적 순위를 얻기 위해 사용될 수 있다. 세포 비히클은, 예를 들어, VAS, IVAS, ICS, ISS 및 MRS 점수 중 둘 이상의 최상 조합에 따라 순위가 매겨질 수 있다.
누적 순위 점수 = [순위(VAS) + 순위(IVAS) + 순위(ICS) + 순위(ISS) +(선택적) 순위(MRS)] / 5(5개 전부의 점수가 얻어지는 경우; 더 적은 수의 점수가 얻어지는 경우에는 2, 3 또는 4)
각각의 이들 점수는 충분한 양의 매칭 데이터가 이들 분석으로부터 모아질 때 인실리코 분석에서 추가적인 가중 인자가 적용될 수 있다.
(e) - 인실리코 분석은 다음과 같이 수행될 수 있다:
각각의 대상체 및 세포 비히클은 그것의 유형별 특징, 예컨대,
고전적 MHC I/II 하플로타입;
KIR 하플로타입 및 리간드;
비고전적 MHC 하플로타입(HLA-E; CD1a,b,c,d; MICA/B)에 대해 분석된다.
데이터는 데이터뱅크를 확립하기 위해 특정 바이러스/세포 비히클 쌍을 가진 대상체 면역 세포(PBMC/면역 세포/혈액)의 각각의 공동 배양 검정으로부터 수집된다.
데이터뱅크의 각 검정에서 확립된 매칭 적합성 점수(IVAS, ICS, ISS)는 특정 유전자좌/유전자좌들에서의 미스매치/미스매치들과 하나 또는 모든 매칭 적합성 점수(IVAS, ICS, ISS)에 미치는 유의한 부정적 영향 사이의 부정적 상관관계를 확립하기 위한 세포 비히클과 대상체의 하플로타입 사이의 매칭 정도와 상관이 있다.
이러한 상관관계는, 통계학적으로 유의한 것으로 나타났을 때, "인실리코" 사전 스크리닝하기 위해, 그리고 대상체와와 바람직하지 못한 미스매치의 존재(좋지 못한 매칭 적합성 점수와 관련됨)를 토대로 부절적한 세포 비히클을 배제하기 위해 사용될 수 있다.
추가적으로, 선택되고 대상체를 치료하기 위해 사용된 세포 비히클과 바이러스의 모든 조합에 대해 확립된 매칭 적합성 점수가 데이터베이스에 수집되고, 치료의 처음 48시간 이내(예컨대, 24시간 내지 3일의 범위)에, 치료된 대상체의 혈액 또는 종양으로부터 얻어진 바이러스 증폭 데이터와 추가로 상관관계가 있고, 이것은 생체내에서 실제 치료 효능의 척도로서 사용될 수 있다.
매칭 적합성 점수와 생체내의 실제 치료 효능 사이의 상관 분석이 더 높은 가중 인자를 생체내에서 치료 효능과 보다 밀접하게 관련된/그것을 나타내는 IVAS, ICS, 또는 ISS 점수에 할당함으로써 최적의 세포 비히클을 선택하기 위해 사용된 누적 순위 점수 공식을 조정/개선하기 위해 사용될 수 있다.
D. 개선된 전달 및/또는 매칭 용량을 가지는 변형된 세포 비히클
또한 본원에는 그것의 특성이 종양용해 바이러스의 대상체로의 전달을 용이하게 하기 위한 및/또는 대상체와의 개선된 매칭을 제공하기 위하여 변형되는 세포 비히클(운반 세포)이 제공된다. 본원에 제공된 임의의 세포 비히클(예컨대, 줄기 세포, 면역 세포, 암 세포)은 그렇게 변형될 수 있다. 이러한 특성으로는, 한정하는 것은 아니지만, 세포 전달 비히클에서의 바이러스 증폭의 개선된 용이함, 세포 비히클 및/또는 바이러스에 대해 지시된 면역 반응을 회피하는 개선된 능력 및/또는 개선된 면역억제를 들 수 있다. 구현예에서, 면역조절 능력(예컨대, 면역 반응을 회피함, 면역 반응을 억제함)은 국소적이거나 및/또는 일시적일 수 있고, 종양 또는 다른 암성 세포에서 바이러스의 전달, 축적 및 감염을 용이하게 하기 위해 필요한 정도로 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 세포 비히클은 종양용해 바이러스를 특정 대상체 및/또는 특정 암/종양 유형에 전달하기 위한 세포 비히클로서의 적합성을 확인하기 위해 본원에 제공된(섹션 C) 매칭 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 구현예에서, 변형된 세포 비히클의 다수/패널은 본원에 제공된 매칭 검정에 의해 스크리닝될 수 있고 그것의 매칭 능력의 순서로 순위가 매겨질 수 있다. 일부 예에서, 세포 비히클의 패널은 비변형 세포 비히클을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 변형된 세포 비히클은 하기에서 기술되는 바와 같은, 이 섹션 및 본원의 다른 곳에서 제시된 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다:
(i) 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위해 감작된/보호된 세포 비히클
본원에는 바이러스 전달을 용이하게 하기 위해 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절 및/또는 바이러스 요법으로 치료되는 대상체와의 개선된 매칭을 위해 변형된 세포 비히클이 제공된다. 변형은 다음 구현예 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 구현예에서, 세포 비히클은 IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, GM-CSF, 성장 인자, RTK/mTOR 작용물질, wnt 단백질 리간드 및 GSK3 억제제/길항물질(예컨대, 타이드글루십(Tideglusib), 발프로산) 중 하나 이상으로 세포 비히클을 사전처리/로딩함으로써 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위해 감작될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 비히클은 예를 들어, IFN 타입 I/타입 II 수용체를 간섭하는 및/또는, 한정하는 것은 아니지만, IFNAR1/IFNAR2 신호전달, IFNGR1/IFNGR2 신호전달, STAT1/2 신호전달, Jak1 신호전달(예컨대, 토파시티닙(Tofacitinib), 룩소리티닙, 바리시티닙), Jak2 신호전달(예컨대, SAR302503, LY2784544, CYT387, NS-018, BMS-911543, AT9283), IRF3 신호전달, IRF7 신호전달, IRF9 신호전달, TYK2 신호전달(예컨대, BMS-986165), TBK1 신호전달(예컨대, BX795, CYT387, AZ13102909)을 포함한 하류 신호전달을 간섭하는 소분자 또는 단백질 억제제로 세포 비히클을 사전처리/로딩함으로써 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 비히클은 IFN 신호전달/반응성을 간섭/해제하기 위해 HDAC 억제제로 사전처리/로딩될 수 있다; 이러한 억제제로는, 한정하는 것은 아니지만, 보리노스타트, 로미뎁신, 치다마이드, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, SB939, 레스미노스타트, 기비노스타트, 퀴시노스타트, HBI-8000, 케베트린, CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 설포라판 및/또는 트리코스타틴을 들 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 비히클은 STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, DAI(ZBP1)에 의해 매개된 바이러스 감지 및/또는 항-바이러스 방어 경로의 길항물질로 사전처리/로딩될 수 있다; 이러한 길항물질로는, 한정하는 것은 아니지만, K1, E3L, K3L 단백질(백시니아), NS1/NS2 단백질(인플루엔자), NS3-4A(C형 간염), NP 및 Z 단백질(아레나 바이러스), VP35(에볼라 바이러스), US11, ICP34.5, ICP0(HSV), M45(MCMV) 및 X 단백질(BDV: 보르나병 바이러스) 중 하나 이상을 들 수 있다. 구현예에서, 세포 비히클은 동종 비활성화/거부반응 결정요인에 대해, 예컨대 세포를 바이러스 기원의 MHC 길항물질, 예컨대, A40R MHCI 길항물질(백시니아), Nef 및 TAT(HIV), E3-19K(아데노바이러스), ICP47(HSV-1/2), CPXV012 및 CPXV203(우두), ORF66(VZV), EBNA1, BNLF2a, BGLF5, BILF1(EBV), US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, US11/gp33(hCMV), Rh178/VIHCE(RhCMV), U21(HHV-6/7), LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, kK5/MIR2(KSHV), mK3(MHV-68), UL41/vhs(a-헤르페스 바이러스, HSV, BHV-1, PRV), UL49.5(바리셀로바이러스, BHV-1, EHV-1/4, PRV) 및 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40(mCMV) 중 하나 이상으로 사전처리/로딩함으로써 보호될 수 있다.
구현예에서, 본원에 제공된 변형된 세포 비히클은 바이러스 기원의 B2M 길항물질, 예컨대, UL18(HCMV)로 사전처리/로딩될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 비히클은 MIC-A 및 MIC-B(NKG2D 리간드)의 길항물질, 예컨대, kK5(KHSV)로 사전처리/로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 비히클은, 한정하는 것은 아니지만, 면역 FAS/TNF/그랜자임 B-유도 세포자멸사(예컨대, 엑트로멜리아/백시니아 바이러스 SP1-2/CrmA)의 억제제, IL-1/NFkB/IRF3 길항물질(예컨대, 백시니아 바이러스-암호화된 N1), IL-1 및 TLR 길항물질(예컨대, IL-18 결합 단백질, A46R, A52R), IL-1β 길항물질(예컨대, B15R/B16R), TNFα 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 CmrC/CmrE), IFNα/β 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B18R/B19R) 및 IFNγ 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B8R)를 포함한, 바이러스 기원의 하나 이상의 면역억제 인자로 사전처리/로딩될 수 있다. 구현예에서, 세포 비히클은 TAP1/2 및/또는 타파신의 소분자 억제제로 사전처리/로딩될 수 있다.
구현예에서, 본원에 제공된 변형된 세포 비히클은, 예컨대, 보체 인자(예컨대, C1, C2, C3, C4, C5, MBL)의 소분자 억제제로 세포 비히클을 사전처리/로딩함으로써 보체에 대해 보호될 수 있다; 이러한 억제제로는, 한정하는 것은 아니지만, VCP(백시니아 바이러스 보체 제어 단백질), B5R(백시니아 바이러스 보체 억제제), scFv 항-CD1q/CD1r/CD1s, 항-C3, 항-C5(예컨대, 에쿨리주맙), 콤프스타틴 패밀리(예컨대, Cp40)의 펩타이드 C3 억제제, 인간 가용성 막(s/m) 단백질(예컨대, s/mCR1(CD35), s/mCR2(CD21), s/mCD55, s/mCD59), 인간 인자 H 및 유도체, 코브라 독 인자 및 보체 억제 활성을 가진 유도체 중 하나 이상을 들 수 있다.
감작된 세포 비히클은 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 세포 비히클은 감작제, 예컨대, 단백질 또는 소분자 작용물질/길항물질로, 세포 뱅킹, 바이러스 감염 또는 대상체에의 투여 전 10분 내지 48시간 이상, 예컨대, 약 또는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60분 동안 또는 세포 뱅킹, 바이러스 감염 또는 대상체에의 투여 전 약 또는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48시간 또는 그 이상의 시간 동안 인큐베이션함으로써 사전처리될 수 있다. 단백질/지질 불용성 소분자의 세포에의 로딩을 향상시키기 위하여, 리포펙타민 또는 대체 단백질 트랜스펙션 시약, 예컨대, 예를 들어, Xfect(Takara), Pierce Pro-Ject(ThermoFisher), Pro-DeliverIN(OZ Biosciences), TurboFect(Fermentas), 또는 대체물이 사용될 수 있다.
(ii) 바이러스-매개 살해에 대한 내성을 위해 감작됨(연장된 생존 및 개선된 국소 면역억제를 위함)
본원에 제공된 변형된 세포 비히클은, 일부 구현예에서, 세포 비히클을 바이러스-매개 살해에 대해 내성으로 만드는 하나 이상의 작용제로 사전처리/로딩될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 비히클은 타입 I 및/또는 타입 II 인터페론으로 사전처리될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 비히클은 작용물질/항-바이러스 상태의 유도자(예컨대, STING, PKR, RIG-I, MDA-5)로 사전처리될 수 있다. 이러한 "보호된" 세포 비히클을 생성하기 위하여, 임의의 자가 또는 동종 세포 비히클이 인터페론 타입 I(예컨대, IFNα/β) 및/또는 타입 II(예컨대, IFNγ) 및/또는 STING, PKR, RIG-I, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM-2, MAVS, RIP-1/3, DAI(ZBP1) 경로의 작용물질로 30분 내지 최대 48시간 또는 그 이상의 시간, 예컨대, 바이러스 감염 없이 또는 바이러스 감염 전 약 또는 적어도 30분 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48시간 이상의 시간 동안 처리될 수 있다.
이들 "보호된" 세포 비히클은 그렇게 보호되지 않고 바이러스를 포함하는 매칭된/감작된/조작된 세포 비히클과 동시에 별도의 조성물로서 투여될 수 있다; 보호된 세포 비히클은 연장된 생존 및/또는 개선된 국소 면역억제를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 세포 비히클은, 예를 들어, 그렇게 보호되지 않고 바이러스를 포함하는 매칭된/감작된/조작된 세포 비히클을 투여하기 전 또는 투여한 후 약 또는 적어도 10, 15, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48시간 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일 내에 투여될 수 있다.
(iii) 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위한 조작된 세포 비히클
또한 본원에는 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 용이하게 하기 위한 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제를 위해 조작된 변형된 세포 비히클이 제공된다. 세포 비히클은 다음 구현예 중 하나 이상에서 조작될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 세포 비히클은 본원에 제공된 세포 비히클을 감작, 보호 및/또는 조작하기 위한 구체예 중 하나 또는 조합을 사용하여 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 비히클은 인터페론(IFN)-유도 항바이러스 상태에 대해 비반응성이 되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포 비히클은 타입 I/타입 II 인터페론 수용체 발현; IFN α/β, IFNγ 수용체 발현; IFNAR1/IFNAR2 수용체 발현; IFNGR1/IFNGR2 수용체 발현; STAT1/2 수용체 발현; Jak1/2 수용체 발현; IRF3 수용체 발현; IRF7 수용체 발현; IRF9 수용체 발현; TYK2 키나제 발현 및 TBK1 키나제 발현 중 하나 이상의 억제와 같이, IFN 타입 I/타입 II 수용체 및/또는 하류 신호전달의 일시적인 또는 영구적인(예컨대 유전자 유전자좌를 잘라냄) 억제를 위해 조작될 수 있다.
구현예에서, 세포 비히클은 한정하는 것은 아니지만, PKR, RIG-I, MDA-5, cGAS, STING, TBK1, IRF3, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3 및 DAI(ZBP1) 중 하나 이상을 포함한, 세포질 바이러스 DNA/RNA-감지 및 항-바이러스 방어 기작의 요소의 일시적인 또는 영구적인 억제를 위해 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 비히클은 예컨대, STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, DAI(ZBP1)에 의해 매개되는 바이러스-감지 및 항-바이러스 방어 경로의 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있고; 이들 길항물질로는, 한정하는 것은 아니지만, K1, E3L, K3L(백시니아); NS1/NS2(인플루엔자 A); NS3-4A(C형 간염); NP, Z 단백질(아레나 바이러스); VP35(에볼라 바이러스); US11, ICP34.5, ICP0(HSV); M45(MCMV); 및 X 단백질(BDV: 보르나병 바이러스) 중 하나 이상을 들 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 세포 비히클은 T 및 NKT 세포 중 하나 이상에 의한 동종 인식, 및 γδ T 세포의 적응성 면역 반응(들)을 피하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포 비히클은 MHC 부류 I 분자(HLA-A, B, C); MHC 부류 II 분자(HLA-DP, DQ, DR); MHC-유사 분자(CD1a/b/c/d) 중 하나 이상의 발현; MHC 부류 I, MHC 부류 II, MHC-유사 분자(예컨대, TAP1/2, 타파신, 베타-2 마이크로글로불린, CIITA, RFXANK, RFX5 및 RFXAP)의 전사 또는 발현의 조절자의 일시적인 또는 영구적인 억제를 위해 조작될 수 있다. 다른 예에서, 세포 비히클은 바이러스 기원(예컨대, UL18(HCMV))의 B2M 길항물질; 및/또는 바이러스 기원의 MHC 길항물질(예컨대, A40R MHCI(백시니아); Nef, TAT(HIV); E3-19K(아데노바이러스); ICP47(HSV-1/2); CPXV012, CPXV203(우두); EBNA1, BNLF2a, BGLF5, BILF1(EBV); ORF66(VZV); US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, US11/gp33(hCMV); rh178/VIHCE(RhCMV); U21(HHV-6/7); LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, kK5/MIR2(KHSV); mK3(MHV-68); UL41/vhs(a-헤르페스 바이러스, HSV, BHV-1, PRV); UL49.5(바리셀로바이러스, BHV-1, EHV-1/4, PRV); 및 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40(mCMV) 중 하나 이상)의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있다.
구현예에서, 세포 비히클은 NK 세포에 의한 동종 인식 및/또는 γδ T 세포의 선천성 면역 반응(들)을 피하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포 비히클은 막-결합 MICA/B(NKG2D 리간드); 막-결합 PVR(DNAM-1 리간드); 막-결합 넥틴-2(DNAM-1 리간드) 중 하나 이상의 발현의 일시적인 또는 영구적인 억제를 위해 조작될 수 있다. 다른 예에서, 세포 비히클은 다음 중 하나 이상의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있다:
MIC-A 및 MIC-B(NKG2D 리간드)의 길항물질(예컨대, kK5(KHSV); NKG2D 수용체의 길항물질(예컨대, 우두 OMCP); NCR - 표적화 NKp30, NKp44, NKp46 수용체의 길항물질(예컨대, HA(백시니아 및 다른 바이러스에서의 헤마글루티닌)); NK 억제 수용체(KIR)에 대한 리간드(예컨대, HLA-Bw4; HLA-C2); NK 억제 수용체에 대한 리간드(NKG2a/CD94)(예컨대, HLA-E 및 유도체 단독 또는 HLA-E 결합 펩타이드를 생성하고 HLA-E 표면 발현을 안정화시키기 위해 21M HLA-B 리간드와 조합된 유도체).
특정 구현예에서, 세포 비히클은 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현하기 위해(예컨대, 동종 항-세포 비히클 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위해) 조작될 수 있다. 인간 기원의 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, IDO, 아르기나제, TRAIL, iNOS, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, sMICA, sMICB, sHLA-G, HLA-E, PD-L1, FAS-L, B7-H4 및 NK 및/또는 NKT 및/또는 γδ T 세포를 표적으로 하거나 고갈시키는 단일 사슬 항체(scFv)를 들 수 있다. 바이러스 기원의 인자로는, 한정하는 것은 아니지만, 엑트로멜리아/백시니아 바이러스 SPI-2/CrmA(면역 FAS/TNF/그랜자임 B 유도 세포자멸사의 억제제); 백시니아 바이러스 암호화된 N1(IL-1/NFkB/IRF3 길항물질); HA(NKp30, NKp44, NKp46을 표적화하는 NCR 길항물질); IL-18 결합 단백질; A40R; A46R; A52R; B15R/B16R; TNFα 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 CmrC/CmrE); IFN α/β 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B18R/B19R); IFNγ 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B8R) 및 기타 IL-1/IL-1β/NFKB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D 길항물질을 들 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 비히클은 그렇지 않으면 불허용 세포 비히클 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포 비히클은 암 관련 항원(예컨대, 암 고환 항원(MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, NY-ESO-1, PRAME, CT83, SSX2, BAGE 패밀리, CAGE 패밀리); 태아종양 항원(AFP, CEA); 종양 유전자/종양 억제자(myc, Rb, Ras, p53, 텔로머라제); 분화 항원(MELAN, 티로시나제, TRP-1/2, gp100, CA-125, MUC-1, ETA); GM-CSF; IL-10; TGFβ; VEGF; FGF-2; PDGF; HGF; IL-6; 성장 인자; RTK/mTOR 작용물질 및 wnt 단백질 리간드 중 하나 이상을 발현하도록 조작될 수 있다.
구현예에서, 변형된 세포 비히클은 한정하는 것은 아니지만, 보체 인자(C1, C2, C3, C4, C5, MBL)의 단백질 길항물질; 백시니아 바이러스 보체 제어 단백질(VCP); 백시니아 바이러스 보체 억제제(B5R); scFv 항-CD1q/CD1r/CD1s; 항-C3; 항-C5(예컨대, 에쿨리주맙); 콤프스타틴 패밀리(예컨대, Cp40)의 펩타이드 C3 억제제; 인간 가용성 막(s/m) 단백질(예컨대, s/mCR1(CD35), s/mCR2(CD21), s/mCD55, s/mCD59); 인간 인자 H 및 유도체 및 코브라 독 인자 및 보체 억제 활성을 가진 유도체 중 하나 이상을 포함한, 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작될 수 있다.
세포를 조작하는, 예컨대 본원에 제공된 조작된 세포 비히클을 제조하기 위한 많은 방법이 기술분야에 알려져 있다. 이러한 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 다음을 들 수 있다:
(a) CRISPR-CAS9 표적화된 억제(영구적인 유전자/유전자좌 결실)
세포 비히클은 관심 있는 유전자에 특이적인 CAS9 단백질 가이드 RNA(gRNA)를 둘 다 발현하는 DNA 플라스미드로 트랜스펙션될 수 있다. 게놈에서의 gRNA-CAS9-매개 절단은 도너 DNA 플라스미드를 사용하여 수복될 수 있고, 이것은 표적화된 유전자의 특정 결실 및 유전자-암호화된 단백질의 영구적인 및 전체 상실을 유발한다. 단백질 발현의 상실은 PCR(DNA 수준), 노던 블롯/FISH(RNA 수준), 또는 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 유동 세포분석과 같은 임의의 단백질 검정을 사용하여 확인될 수 있다.
(b) CRISPR-CAS9 표적화된 발현(영구적인 유전자/유전자좌 삽입)
이 방법은 세포 비히클 게놈의 특정 위치에 관심 있는 유전자를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 세포 비히클은 특정 삽입 위치에 특이적인 CAS9 단백질 가이드 RNA(gRNA)를 둘 다 발현하는 DNA 플라스미드로 트랜스펙션될 수 있다. 게놈에서의 gRNA-CAS9-매개 절단은 도너 DNA 플라스미드를 사용하여 수복될 수 있고, 이것은 DNA 절단/이중 가닥 절단의 위치의 양측에 있는 세포 비히클 게놈의 서열이 측면에 있음으로써, 무작위이기보다는 특정 게놈 위치에 관심 있는 유전자의 상동성 재조합-매개 삽입을 유발하는 관심 있는 삽입된 유전자를 가진다. 성공적인 삽입 및 단백질 발현은 PCR(DNA 수준), 노던 블롯/FISH(RNA 수준), 또는 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 유동 세포분석과 같은 임의의 단백질 검정을 사용하여 확인될 수 있다.
(c) RNA 간섭(shRNA/마이크로RNA의 레트로바이러스/렌티바이러스/트랜스포존-매개 변환)(영구적인 유전자 억제)
관심 있는 특정 유전자/단백질을 표적화하는 shRNA/마이크로RNA는 세포 비히클 게놈으로의 안정적인 통합을 위해 설계되고 레트로바이러스/렌티바이러스/트랜스포존 벡터에 클로닝될 수 있다. 세포 비히클은 벡터로 형질전환되고 성공적으로 형질도입된 세포는 벡터 암호화된 선택 마커를 사용하여 선택될 수 있다. 관심 있는 유전자의 shRNA-매개 억제는 예컨대, 노던 블롯 및 단백질 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
(d) 렌티바이러스/γ-레트로바이러스-매개 무작위/다중 복사물 유전자 삽입
관심 있는 특정 유전자/단백질은 세포 비히클 게놈으로의 안정적인 무작위 통합을 위해 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 설계 및/또는 클로닝될 수 있다. 세포 비히클은 바이러스 벡터로 형질전환되고 성공적으로 형질도입된 세포는 벡터 암호화된 선택 마커를 사용하여 선택될 수 있다. 관심 있는 유전자의 shRNA-매개 억제는 노던 블롯 및 임의의 단백질 검정, 예컨대 웨스턴 블롯, 유동 세포분석 등을 사용하여 평가될 것이다.
(e) 트랜스포존(Transposon)-매개 무작위/다중 복사물 유전자 삽입
관심 있는 특정 유전자/단백질은 PiggyBac(SBI System Biosciences) 또는 동등물과 같은 포유류 트랜스포존 벡터 시스템에 설계 및/또는 클로닝될 수 있다. 세포 비히클은 반전된 말단 반복부(ITR) 서열 및 트랜스포존 벡터가 측면에 있는 관심 있는 유전자(cDNA)를 가진 트랜스포존 벡터로 공동 트랜스펙션될 수 있다. 트랜스포존 효소는 TTAA 염색체 통합 부위로의 관심 있는 유전자의 전달을 매개할 수 있다. 성공적으로 형질도입된 세포는 선택적으로 벡터 암호화된 선택 마커를 사용하여 선택될 수 있다. 성공적인 삽입 및 단백질 발현은 PCR(DNA 수준), 노던 블롯/FISH(RNA 수준), 또는 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 유동 세포분석과 같은 임의의 단백질 검정을 사용하여 확인될 수 있다.
(f) 관심 있는 단백질의 발현의 일시적인 유전자 억제는, 예컨대, RNA 간섭을 통해 이루어질 수 있다. siRNA/마이크로RNA는 기술분야에 알려져 있는 임의의 확립된 방법론, 예컨대 염화 칼슘 트랜스펙션; 리포펙션; Xfect; 전기천공; 소노포레이션 및 세포 압착(예컨대, siRNA를 도입하기 위함)에 의해 세포 비히클에 트랜스펙션될 수 있다.
(g) 일시적인 유전자 발현은, 예컨대, 원하는 생성물을 암호화하는 플라스미드 DNA로 세포 비히클에 트랜스펙션될 수 있는 적절한 포유류 플라스미드 발현 벡터에 관심 있는 유전자의 클로닝에 의해 이루어질 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자/단백질을 암호화하는 mRNA는 세포 비히클에 직접 트랜스펙션될 수 있다. 트랜스펙션은 확립된 방법론, 예컨대 염화 칼슘 트랜스펙션; 리포펙션; Xfect; 전기천공; 소노포레이션 및 세포 압착(예컨대, siRNA를 도입하기 위함) 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다.
세포 비히클의 예시적인 변형
1. 항바이러스 상태의 유도를 억제한다
형질전환되지 않은 줄기 세포 및 여러 종양 세포는 자주 종양용해 바이러스에 대한 세포 비히클/운반 세포로서 그것을 사용하는 능력을 손상시키는 온전한 항바이러스 메커니즘을 가진다. 타입 I 및 타입 II 인터페론은 일부 종양 세포에서뿐만 아니라 줄기 세포에서 항바이러스 상태의 강력한 유도자이며, 이들 세포가 감염되고 바이러스 증폭을 지지하는 능력을 간섭할 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본원에서 제공되고 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포 비히클은 바이러스 감염의 검출 및/또는 항바이러스 상태/면역 반응의 개시를 차단하는 인터페론 신호전달의 하나 이상의 억제제로 로딩되거나 그것을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, Jak1/Jak2의 인터페론 신호전달 소분자 억제제인 룩소리티닙이 종양용해 바이러스의 운반체로서 기능하기 위해 종양 세포뿐만 아니라 다양한 줄기 세포의 치료 잠재력을 증대시키기 위해 그것을 바이러스 감염, 증폭 및 확산에 대해 감작시킴으로써(그것을 민감하게 함으로써) 성공적으로 사용될 수 있다(예컨대, 실시예 6 참조).
2. 보체에 대해 세포 비히클을 보호한다
인간 혈청은 바이러스 증폭이 개시되거나 및/또는 그것의 정점에 도달하기 전에 바이러스-감염된 운반 세포를 직접적으로 공격하여 살해함으로써, 또는 운반 세포로부터 방출된 네이키드 바이러스 입자를 중화함으로써 바이러스의 표적 종양 세포로의 확산을 제한하는 것을 포함하여, 운반 세포에 유해 효과를 나타낼 수 있다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본원에 제공되고 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포 비히클은 하나 이상의 보체 차단 인자로 로딩되거나 그것을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 보체 C3 활성화의 펩타이드 억제제인 콤프스타틴, 또는 중화 항-인간 C3a/C3a(desArg)/C3 항체는 운반 세포에서 바이러스 페이로드를 증가시키고 또한 표적 종양에서 향상된 바이러스 증폭 및 확산을 얻기 위해 사용될 수 있다(예컨대, 실시예 7 참조).
3. 동종 인식/거부반응을 회피한다
본원에서 입증된 것과 같이, 줄기 세포 운반체(세포 비히클)는 동종 인식을 회피하고 NK 세포, T 세포, gd(γδ) T 세포 및/또는 NK(NKp46) 및 T 세포(CD3) 마커를 둘 다 발현하는 "NKT" 세포의 집단을 능동적으로 면역억제하는 능력으로 인해 동종 장벽에 반해 종양용해성 백시니아 바이러스를 성공적으로 증폭시키고 전달할 수 있다. 그러나, "부적합/내성" 수령체의 하위세트에서, 줄기 세포 운반체는 때때로 동종 인식을 피할 수 없어서, 바이러스가 없을 때에도 운반 줄기 세포에 대해 신속하고 강력한 동종 면역 반응을 초래할 수 있다. 이들 신속한 동종 반응은 항-줄기 세포 세포독성의 발생 및 인터페론(예컨대, IFNγ)-매개 항바이러스 상태의 유도와 관련될 수 있고, 운반 세포 살해 및 항바이러스 반응의 유도의 조합으로 인해 백시니아 바이러스를 증폭시키는 상당히 억제된 능력을 초래한다. 그러므로, 일부 구현예에서, 본원에 제공되고 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포 비히클은 억제 인자로 로딩되거나 동종 거부반응 결정요인의 억제/제거/차단을 위해 조작된다. 이러한 동종 거부반응 결정요인으로는, 한정하는 것은 아니지만, CD8 및 CD4 T 세포에 의해 인식된 고도로 다형성이고 환자-특이적인 MHC 부류 I 및 부류 II 분자, 뿐만 아니라 다양한 선천성 또는 혼합 선천상/적응성 T 세포 하위집단, 예컨대 다른 것들 중에서도 γδ T, iNKT, 및 NKT 세포에 의해 인식되고, MHC-유사 MICA 및 CD1a,b,c,d 분자, 뿐만 아니라 다른 스트레스-관련 또는 스트레스-감지 분자, 예컨대 부티로필린 및 아넥신 A2를 포함하는 광범위한 스펙트럼의 다형성이 적은 결정요인을 들 수 있다.
예를 들어, 동종 MHC I 분자의 제거/차단은 운반체 줄기 및 종양 세포, 특히 동종 MHC I 미스매치를 인식하고 반응하는 것을 담당하는 CD8 T 세포의 그것들에 대한 동종 면역 반응을 억제할 수 있다. pan-HLA 차단 항체(항-인간 HLA-A,B,C 항체(실시예 8 참조)는 다양한 선천성 및 적응성 면역 세포 집단의 동종 항-운반 세포 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 그것의 수는, 예를 들어 활성화 마커로서 CD69를 사용하고 다음과 같은 세포 유형 특이적 마커의 세트를 사용하는 다중 파라미터 유동 세포분석에 의해 확인될 수 있다: γδ T 세포(CD3+, γδ TCR+), iNKT/NKT 타입 1 세포(CD3+, Va24Ja18+), 일반적인 NKT(CD3+CD56+ 세포; γδ 및 iNKT 배제), 고전적 CD4(CD3+CD4+; γδ 및 iNKT 배제), 고전적 CD8 T 세포(CD3+CD8+; γδ 및 iNKT 배제), 일반적인 NK 세포(CD3-CD56+), 및 NK 하위집단 CD56highCD16-(사이토카인 생성) 및 CD56lowCD16+(세포독성). 본원에서 HLA(MHC 부류 I) 및 기타와 같은 동종 거부반응 결정요인의 일시적인 또는 영구적인 차단 또는 제거는 동종 면역 반응 및/또는 항바이러스 상태를 유도할 수 있고 바이러스 페이로드의 전달 및 확산을 차단할 수 있는 IFNγ와 같은 이펙터 사이토카인의 분비의 유도를 차단함으로써 향상된 면역 회피 잠재력 및 종양용해 바이러스를 보다 효과적으로 전달하는 능력을 가지는 줄기- 또는 종양 세포-기반 운반체(세포 비히클)를 생성하기 위한 효과적인 전략으로서 사용될 수 있는 것으로 입증된다.
동종 및 바이러스-감염된 줄기 또는 종양 운반 세포의 면역학적 반응 및 거부반응은 전형적으로 바이러스 감염된 또는 형질전환된 종양 세포의 표면에서 상향 조절되고 면역 동시자극 분자로서 작용하는 다양한 다른 비-MHC 마커의 맞물림에 의해 향상될 수 있다. 이러한 마커는 면역학적 거부반응을 회피하는 운반 세포(예컨대, 바이러스로 감염되고 바이러스의 전달에 사용된 종양 세포 또는 줄기 세포)의 능력을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, NKG2D 분자는 바이러스-감염되고 형질전환된 종양 세포의 인식 및 거부반응에 관여하는 동시 자극 분자로서 기능하는 것으로 알려져 있는 MHC 부류 I-관련 단백질, 예컨대 인간 MIC A 및 MIC B를 인식한다. 실시예 9는 예컨대, NKG2D-특이적 항체를 사용하는 NKG2D 신호전달 경로의 활성화가 세포성 면역 반응의 면역 인식 및 활성화를 향상시키고 기여하는 강력한 동시 자극 신호를 제공하는 것을 입증한다. 그러므로, 본원에 제공되고 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포 비히클의 일부 구현예에서, 세포 비히클은 억제 인자로 로딩되거나 NKG2D 신호전달 경로의 동시 자극 신호의 억제/제거/차단을 위해 조작된다. 예를 들어, 운반 세포는 MIC A 및/또는 MIC B의 발현의 일시적인 또는 영구적인 억제를 위해 조작될 수 있거나, 또는 MICA/MICB의 분해를 표적으로 하는 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스(KSHV) 단백질 K5(또한 kK5 또는 MIR2로도 불림), MICB에 결합하여 세포 표면 상에서의 리간드의 발현을 방지하는 UL16(HCMV)(MICB의 세포내 보유를 유발함), 리소좀성 분해를 위해 MICA를 표적으로 하는 HCMV US18 및 US20(US20은 또한 MICA 및 MICB를 하향조절함), 시스-골지체에서의 보유에 의해 MICA를 하향조절하는 HCMV UL142, MICA 및 MICB의 세포 표면 발현을 억제하는 인간 헤르페스 바이러스-7(HHV-7) U21 단백질, MICA의 하향조절로 이어지는 EBV 단백질 LMP2A, MICB의 세포 표면 수송을 방지하여 CD8 T 세포 및 NK 세포에 의한 인식 억제하는 아데노바이러스 E3/19K 단백질, 등으로 로딩되거나 이것들의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있다.
4. 면역억제 인자를 분비한다
줄기 세포 및 종양 세포는 IDO 발현 및 IL-10 분비를 포함한 면역 억제 및 회피를 위한 다양한 전략을 사용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 그것들이 바이러스를 위한 운반 세포/세포 비히클로서 사용되는 때에는, 운반 세포에서의 바이러스 증폭은 생존력 및 면역억제 잠재력의 점진적인 상실을 유발한다. 그러므로, 본원에 제공되고 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포 비히클의 일부 구현예에서, 세포 비히클은 면역억제 특성의 바이러스-매개 상실을 부분적으로 또는 완전하게 반전시키고 바이러스 감염된 운반 세포의 동종 반응 및/또는 초기 면역 인식을 회피하는 능력을 개선시키기 위하여 면역억제 분자 또는 사이토카인, 예컨대, IL-10으로 로딩되거나 그것을 일시적으로 또는 영구적으로 발현하기 위해 조작된다(예컨대, 실시예 10 참조).
5. 세포 비히클의 변형; 치료법을 위한 투여
상기 및 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이, 면역 인식을 회피하고 및/또는 항바이러스 및/또는 동종 면역 반응을 억제하도록 변형된 운반 세포/세포 비히클은 관심 있는 면역 반응 변형제(예컨대, C3 활성화의 펩타이드 억제제인 룩소리티닙, MIC A/MIC B의 억제제인 IL-10, 등)로 운반 세포를 사전처리/로딩함으로써, 또는 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있고 본원에서 기술된 방법을 사용하여 관심 있는 면역 반응 변형제의 발현/발현의 억제를 위해 운반 세포의 일시적인 또는 영구적인 변형에 의해 얻어질 수 있다. 구현예에서, 로드/발현은 국소적이거나 및/또는 일시적일 수 있어서, 바이러스에 의한 감염, 바이러스의 증폭, 바이러스의 종양 또는 다른 암성 세포로의 전달, 및 종양 또는 다른 암 내에서 바이러스의 확산을 용이하게 하기 위해 필요한 정도로 존재한다. 구현예에서, 변형은 시굴분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있는 것과 같이 플라스미드 또는 다른 벡터를 사용하는 일시적인 변형에 의한 것이다. 구현예에서, 플라스미드는 발현되는 외인성 유전자의 발현이 바이러스 프로모터(예컨대, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, CMV와 같은 많은 바이러스의 초기 즉시, 즉시, 중간, 후기 프로모터, RSV 긴 말단 반복 프로모터, 아데노바이러스 E1A 프로모너, 등)의 제어 하에 있음으로써, 계속해서 운반 세포에 로딩되는 바이러스에 의해 외인성 유전자 발현의 셧다운이 감소 또는 제거되도록 조작된다.
변형된 운반 세포는 본원에 기술된 바이러스로 로딩될 수 있고 비경구로, 전신적으로, 종양내로 또는 본원에 제공된 다른 경로로 투여될 수 있다. 전신성 투여를 위해서는, 운반 세포는 면역 인식을 회피하거나 및/또는 종양/암 부위를 표적으로 하고 그것의 증폭 및 확산을 용이하게 하기 위해 바이러스를 전달하기에 충분히 긴 바이러스 또는 동종 세포성 면역 반응을 억제해야 한다. 종양내 투여를 위해서는, 운반 세포는 면역 인식을 회피하거나 및/또는 종양 깊숙히 침투하기에 충분히 긴 바이러스 또는 동종 세포성 면역 반응을 억제해야 한다. 전달을 위한 시간은 운반 세포/바이러스 조성에 따라 수시간, 예컨대, 10-20시간, 예컨대 10, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20시간 내지 수일, 예컨대, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 내지 3, 4, 5일 또는 그 이상의 시간 까지 임의의 시간일 수 있다. 일반적으로, 표적 전달 부위(예컨대, 종양)에서의 바이러스 전달 및 확산이 이루어진 후에는 그것이 종양-특이적 면역 반응(종양에 대해 지시됨)이 효과를 나타내는 것을 방해할 수 있기 때문에지속적인 면역억제는 바람직하지 않다.
E. 치료법을 위한 세포 비히클/바이러스의 투여 방식
본원에 제공된 운반 세포/바이러스는 종양을 가진 또는 신생물 세포를 가진 대상체를 포함한 대상체에 치료를 위해 투여될 수 있다. 투여된 운반 세포 및 바이러스는 본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스 또는 본원에 제공된 방법을 사용하여 생성된 임의의 다른 운반 세포 및 바이러스일 수 있다. 일부 예에서, 운반 세포는 줄기 세포, 면역 세포, 또는 암 세포인 자가 세포(즉, 환자로부터 유래됨) 또는 동종 세포(즉, 환자로부터 유래되지 않음)이다. 운반 세포는 예를 들어, 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위해, 항바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해, 동종 비활성화/거부반응 결정요인에 대해 보호하기 위해, 및 보체에 대해 보호하기 위해 감작될 수 있거나, 또는 운반 세포는 예를 들어, 인터페론-유도 항바이러스 상태에 대해 비반응성이 되게 하기 위해, γδ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 T 세포에 의한 동종 인식을 회피하기 위해, 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현시키기 위해, 빈약하게 허용적인 종양 세포를 종양용해 바이러스 감염에 대해 감작시키는 암- 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현시키기 위해, 보체 및 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 일부 예에서, 투여된 바이러스는 약독화된 병원성, 저독성, 종양에서의 우선적인 축적, 종양 세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 능력, 높은 면역원성, 복제 경합력 및 외인성 단백질을 발현하는 능력, 및 이것들의 조합과 같은 특징을 함유하는 바이러스이다.
a. 조사된 또는 비조사된 바이러스-감염 운반 세포의 투여
운반 세포는 종양용해 바이러스로의 감염 전에, 또는 후에 조사될 수 있다. 형질전환된 세포를 종양용해 바이러스요법을 위한 세포 운반체로서 사용하기 위하여, 비감염 세포는 투여 후에 새로운 전이성 성장을 확립하지 않아야 한다. 이것은 바이러스 감염 전 또는 후, 투여 전에 운반 세포의 γ-조사에 의해 이루어질 수 있으며, 이것은 종양원성은 제거하지만, 대사 활성은 보존하며 바이러스 생성/증폭 및 방출에는 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 운반 세포는 바이러스 감염 전 최대 24시간 전에, 또는 바이러스 감염 후 최대 24시간 후에 조사될 수 있다.
방사선의 양은 기술 분야에 숙련된 사람에 의해 운반 세포 및 바이러스의 본질을 포함한 다양한 인자 중 임의의 것에 따라 선택될 수 있다. 방사선 양은 바이러스 감염, 증폭 및 방출에 영향을 주지 않으면서 운반 세포를 비활성화하고 종양원성을 방지하기에 충분할 수 있다. 예를 들어, 방사선 양은 약 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy 50 Gy, 100 Gy, 120 Gy, 150 Gy, 200 Gy, 250 Gy, 500 Gy 또는 그 이상일 수 있다.
b. 투여 경로
운반 세포/바이러스 조합은 대상체에게 국소적으로 또는 전신적으로 전달 또는 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여 방식은, 한정하는 것은 아니지만 전신성, 비경구, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 경피, 피내, 동맥내(예컨대, 간동맥 주입), 혈관내 관류, 흉막내, 관절내, 국소적, 종양내, 병변내, 내시경, 다중천공(예컨대, 천연두 백신을 사용할 때처럼), 흡입에 의해, 경피, 피하, 비강내, 기관지내, 구강, 공동내(예컨대, 카테터를 통한 방광에의 투여, 좌제 또는 관장제에 의한 장에의 투여), 질, 직장, 두개내, 전립선내, 유리체내, 귀, 눈 또는 국소 투여를 포함한다.
기술 분야의 숙련된 사람은 대상체 및 운반 세포/바이러스 조합과 적합하고, 또한 표적 세포-유형 또는 조직, 예컨대 운반 세포/바이러스가 종양 및/또는 전이에 도달하여 그 안으로 들어가는 것을 초래할 가능성이 있는 임의의 투여 방식을 선택할 수 있다. 투여 경로는 질환의 본질, 표적 세포 또는 조직의 특성(예컨대, 종양의 종류), 및 투여될 특정 세포 비히클/바이러스를 포함한 다양한 인자 중 임의의 것에 따라 기술분야에 숙련된 사람에 의해 선택될 수 있다. 표적 부위로의 투여는 예를 들어, 탄도 전달(ballistic delivery)에 의해, 콜로이드성 분산 시스템으로써 수행될 수 있거나, 전신 투여는 동맥에의 주사에 의해 수행될 수 있다.
c. 장치(device)
약물, 제약학적 조성물 및 백신을 투여하기 위해 기술분야에 알려져 있는 다양한 장치 중 임의의 것이 운반 세포/바이러스 조합을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예시의 장치로는, 한정하는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘 없는 주사 장치, 흡입기 및 액체 분산기, 예컨대 점안기를 들 수 있다. 예를 들어, Qaudra-FuseTM 다구 주사 바늘(multi-pronged injection needle)(Rex Medical, Conshohocken, PA)이 사용될 수 있다.
전형적으로, 운반 세포/바이러스 조합을 투여하기 위한 장치는 운반 세포/바이러스 조합과 적합할 것이다; 예를 들어, 고압 주사 장치와 같은 바늘 없는 주사 장치는 고압 주사에 손상되지 않는 운반 세포/바이러스와 사용될 수 있지만, 전형적으로 고압 주사에 의해 손상되는 운반 세포/바이러스와는 사용되지 않는다. 또한 본원에는 추가의 작용제 또는 화합물을 대상체에게 투여하기 위한 장치가 제공된다. 약물을 대상체에게 투여하기 위한 기술 분야에 알려져 있는 다양한 장치 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예시의 장치로는, 한정하는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘 없는 주사 장치, 흡입기 및 액체 분산기, 예컨대 점안기를 들 수 있다. 전형적으로 화합물을 투여하기 위한 장치는 화합물의 바람직한 투여 방법과 적합할 것이다. 예를 들어, 전신적으로 또는 피하로 전달될 화합물은 피하 주사바늘 및 주사기로 투여될 수 있다.
d. 투여의 투여량
투여량 요법은 다양한 방법 및 양 중 임의의 것일 수 있고, 공지된 임상적 인자에 따라 기술분야의 숙련된 사람에 의해 측정될 수 있다. 의학 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 대상체의 종, 크기, 신체 표면적, 연령, 성별, 면역능력, 및 일반적인 건강 상태, 투여될 특정 세포 운반체 및바이러스, 투여 기간 및 경로, 질환의 종류 및 단계, 예를 들어, 종양 크기, 및 다른 치료 또는 화합물, 에컨대 화학요법 약물이 동시에 투여되고 있는지를 포함한 많은 인자에 따라 좌우될 수 있다. 상기 인자에 더불어, 이러한 수준은 기술분야에 숙련된 사람에 의해 측정될 수 있는 바, 바이러스의 감염성 및 증폭 잠재력, 및 운반 세포 및/또는 바이러스의 본질에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 방법에서, 세포 운반체 및 바이러스의 적절한 최소 투여량 수준 및 투여량 요법은 운반 세포가 바이러스를 표적 부위에 전달하고 바이러스가 종양 또는 전이에서 생존, 성장 및 복제하기에 충분한 수준일 수 있다. 일반적으로, 100,000 내지 십억개의 미변형, 감자된, 보호된 또는 유전자 조작된 동종 또는 자가 운반 세포가 생체외에서 공동 배양 스크린 및 본원에 제공된 분석 방법을 토대로 선택된 종양용해 바이러스를 포함한 임의의 적합한 종양용해 바이러스로, 0.1 이상의 감염 다중도(MOI)로 감염된다. 적어도 10의 pfu/세포를 생성하는 세포 운반체가 선택된다. 예를 들어, 적어도 또는 적어도 약 10, 적어도 또는 적어도 약 100, 적어도 또는 적어도 약 1,000 또는 그 이상의 pfu/세포를 생성하는 세포 운반체가 선택된다. 일반적으로, 바이러스는 투여 주기에 걸쳐 적어도 1회 적어도 또는 약 또는 1 x 105 pfu인 양으로 투여된다. 바이러스를 65 kg 인간에게 투여하기 위한 예시의 최소 수준은 적어도 약 1 x 105 플라크 형성 단위(pfu), 적어도 약 5 x 105 pfu, 적어도 약 1 x 106 pfu, 적어도 약 5 x 106 pfu, 적어도 약 1 x 107 pfu, 적어도 약 1 x 108 pfu, 적어도 약 1 x 109 pfu, 또는 적어도 약 1 x 1010 pfu를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 투여 주기에 걸쳐 적어도 1회 적어도 또는 약 또는 1 x 105 pfu, 1 x 106 pfu, 1 x 107 pfu, 1 x 108 pfu, 1 x 109 pfu, 1 x 1010 pfu, 1 x 1011 pfu, 1 x 1012 pfu, 1 x 1013 pfu, 또는 1 x 1014 pfu인 양으로 투여된다.
e. 레지멘(regimen)
투약 레지멘에서, 운반 세포 및 바이러스의 일정량이 투여 주기에 걸쳐 단일 투여 또는 여러 번 투여될 수 있다. 그러므로, 본원에 제공된 방법은 대상체에 대한 세포 운반체/바이러스 조합의 단일 투여 또는 대상체에 대한 세포 운반체/바이러스 조합의 다중 투여를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 단일 투여는 바이러스를 종양에 전달하고 종양에서 바이러스를 확립하기에 충분하며, 이때 바이러스는 대상체에서 증식할 수 있고 항종양 반응을 유발하거나 향상시킬 수 있고; 이러한 방법은 대상체에서 항종양 반응을 유발하거나 향상시키기 위하여 운반 세포/바이러스 조합의 추가적인 투여를 필요로 하지 않으며, 예를 들어, 종양 성장의 억제, 전이 성장 또는 형성의 억제, 종양 크기의 감소, 종양 또는 전이의 제거, 신생물 질환의 재발 또는 새로운 종양 형성의 억제 또는 방지, 또는 다른 암 치료 효과를 초래할 수 있다.
다른 예에서, 세포 운반체/바이러스 조합은 상이한 시기에, 전형적으로 적어도 1일의 간격으로 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 운반 세포/바이러스 조합은 투여 사이에 1일 이상, 2일 이상, 1주 이상, 또는 1개월 이상의 시간을 두고 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 이상 투여될 수 있다. 별도의 투여는 바이러스를 종양 또는 전이에 전달할 가능성을 증가시킬 수 있고, 이때 이전의 투여는 바이러스를 종양 또는 전이로 전달하는 데 비효과적이었다. 별도의 투여는 종양 또는 전이에 대한 위치를 증가시킬 수 있으며, 이때 바이러스 증식이 종양에서 일어나거나 또는 그렇지 않으면 종양에 축적된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있고, 이것은 숙주의 항종양 면역 반응을 발생시키거나 향상시키는 데 있어 종양으로부터 항원 또는 다른 화합물의 방출 규모를 증가시킬 수 있으며, 또한 선택적으로, 바이러스-기반 종양 용해 또는 종양 세포 사멸의 수준을 증가시킬 수 있다. 바이러스의 별도의 투여는 바이러스 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 추가로 연장시킬 수 있으며, 이것은 바이러스가 축적되어 있는 종양 또는 전이에 대한 숙주의 면역 반응을 연장시킬 수 있고, 숙주가 항-종양 면역 반응을 시작할 가능성을 증가시킬 수 있다.
별도의 투여가 수행되는 경우, 각각의 투여는 다른 투여의 투여량과 비교하여 동일하거나 상이한 투여량일 수 있다. 한 예에서, 모든 투여 투여량은 동일하다. 다른 예에서, 제1 투여량은 하나 이상의 후속되는 투여량보다 큰 투여량, 예를 들어, 후속되는 투여량보다 적어도 10배 크거나, 적어도 100배 크거나, 또는 적어도 1000배 크다. 제1 투여량이 하나 이상의 후속되는 투여량보다 큰 별도의 투여 방법의 한 예에서, 모든 후속 투여량은 제1 투여에 비해 동일하거나, 더 적은 양이다.
별도의 투여는 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여를 포함한, 2회 이상의 투여 중 임의의 수를 포함할 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람은 치료 방법을 모니터링하기 위한 기술분야에 알려져 있는 방법 및 본원에 제공된 다른 모니터링 방법에 따라 하나 이상의 추가적인 투여를 수행하기 위한 투여 횟수 또는 바람직성을 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 대상체에게 운반 세포/바이러스 조합의 1회 이상의 투여를 제공하는 방법을 포함하며, 투여 횟수는 대상체를 모니터링함으로써, 및 모니터링의 결과를 토대로 하여, 1회 이상의 추가 투여를 제공할 것인지 아닌지를 결정함으로써 측정될 수 있다. 1회 이상의 추가 투여를 제공할 것인지 아닌지를 결정하는 것은, 한정하는 것은 아니지만, 종양 성장 또는 종양 성장의 억제의 표시, 새로운 전이 또는 전이의 억제의 출현, 대상체의 항-바이러스 항체 역가, 대상체의 항-종양 항체 역가, 대상체의 전체적인 건강, 대상체의 체중, 종양 및/또는 전이에서의 바이러스 단독의 존재, 및 정상 조직 또는 장기에서 바이러스의 존재를 포함한, 다양한 모니터링 결과를 토대로 할 수 있다.
투여 사이의 기간은 다양한 기간 중 임의의 기간일 수 있다. 투여 사이의 기간은 투여 횟수와 관련하여 기술된 것과 같이, 모니터링 단계, 대상체가 면역 반응을 시작하기 위한 기간, 대상체가 정상 조직으로부터 바이러스를 정화하기 위한 기간, 또는 종양 또는 전이에서 바이러스 증식을 위한 기간을 포함한 다양한 인자 중 임의의 인자의 함수일 수 있다. 한 예에서, 기간은 대상체가 면역 반응을 시작하기 위한 기간의 함수일 수 있다; 예를 들어, 기간은 대상체가 면역 반응을 시작하기 위한 기간보다, 예컨대 약 1주 이상, 약 10일 이상, 약 2주 이상, 또는 약 1개월 이상 많을 수 있고; 다른 예에서, 기간은 대상체가 면역 반응을 시작하기 위한 기간보다, 예컨대 약 1주 미만, 약 10일 미만, 약 2주 미만, 또는 약 1개월 미만 더 적을 수 있다. 또 다른 예에서, 기간은 대상체가 정상 조직으로부터 바이러스를 정화하기 위한 기간의 함수일 수 있다; 예를 들어, 기간은 대상체가 정상 조직으로부터 바이러스를 정화하기 위한 기간보다, 예컨대 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 5일 이상, 또는 약 1주 이상 더 많을 수 있다. 또 다른 예에서, 기간은 종양 또는 전이에서 바이러스 증식을 위한 기간의 함수일 수 있다; 예를 들어, 기간은 검출 가능한 마커를 발현하는 바이러스의 투여 후 종양 또는 전이에서 검출 가능한 신호가 발생하기 위한 시간의 양보다, 예컨대 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 10일, 약 2주, 또는 약 1개월 더 많을 수 있다.
예를 들어, 일정량의 운반 세포/바이러스 조합은 투여 기간에 걸쳐 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 7회 투여된다. 바이러스의 양은 주기의 제1일에, 주기의 제1일 및 제2일에, 주기의 처음 3일의 연속적인 각각의 날에, 주기의 처음 4일의 연속적인 각각의 날에, 주기의 처음 5일의 연속적인 각각의 날에, 주기의 처음 6일의 연속적인 각각의 날에, 또는 주기의 처음 7일의 연속적인 각각의 날에 투여될 수 있다. 일반적으로, 투여 주기는 7일, 14일, 21일 또는 28일이다. 환자의 반응성 또는 예후에 따라, 투여 주기는 수개월 또는 수년의 과정에 걸쳐 반복된다.
일반적으로, 운반 세포/바이러스의 적절한 최대 투여 수준 또는 투여 양생법은 숙주에게 독성이지 않으며, 3회 이상 비장비대증을 유발하지 않는 수준, 약 1일 후에 또는 약 3일 후에 또는 약 7일 후에 정상 조직 또는 장기에서 바이러스 콜로니 또는 플라크를 초래하지 않는 수준이다.
F. 치료 방법 및 치료와 연계된 모니터링
본원에는 바이러스의 전달을 용이하게 하기 위해, 증식성 또는 염증성 질환 또는 질병을 가진 대상체를 치료하기 위해 본원에 제공된 세포 비히클과 함께 종양용해 바이러스를 투여함에 의한 치료 방법이 제공된다. 특히, 질병은 면역특권 세포 또는 조직과 결부된다. 면역특권 세포 또는 조직과 결부된 질환 또는 질병으로는, 예를 들어, 암성 세포, 신생물, 종양, 전이, 암 줄기 세포, 및 다른 면역특권 세포 또는 조직, 예컨대 상처 및 상처를 입었거나 염증이 있는 조직의 치료(예컨대 억제)를 포함한, 증식성 장애 또는 질병을 들 수 있다. 이러한 방법의 특정 예에서, 본원에 제공된 조합은 전신성 전달을 위한 정맥내 투여에 의해 투여된다. 다른 예에서, 본원에 제공된 조합은 종양내 주사에 의해 투여된다. 구현예에서, 대상체는 암을 가진다. 본원에 제공된 임의의 세포 비히클, 이를테면 감작된 세포 비히클, 보호된 세포 비히클, 조작된 세포 비히클 및 추가적으로 본원에 제공된 매칭 검정에 의해 스크리닝되는 감작된/조작된 세포 비히클을 포함할 수 있는 매칭된 세포 비히클이 그것을 필요로 하는 대상체에게 바이러스 요법을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 세포 비히클과 바이러스의 조합으로 치료되는 것 외에, 연장된 생존 및/또는 국소 면역억제를 제공하기 위하여, 보호된 세포 비히클, 예컨대 IFNγ로 사전 처리된 세포 비히클을 함유하는 별도의 조성물로 추가적으로 치료된다. 보호된 세포 비히클을 함유하는 별도의 조성물이 세포 비히클/바이러스 조합과 동시에 투여되거나 또는 조합을 투여하기 전 또는 후에 10시간 내지 3일 이상 사이에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 보호된 세포 비히클이 조합을 투여하기 전 24시간 전, 또는 투여한 후 24시간 후에 투여된다.
본원에 제공된 조합은 단일 주사에 의해, 다중 주사에 의해, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 정맥내 펌프, 주사기 펌프, 정맥내 드립 또는 느린 주사를 사용하는 것을 포함하는 느린 주입에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물의 연속 투여는 수분 내지 수시간의 과정에 걸쳐, 예컨대 1분 내지 1시간, 또는 약 1분 내지 약 1시간, 예컨대 20 내지 60분에 걸쳐 일어날 수 있다.
본원에 기술된 치료 및 검출 방법을 잘 따르는 암은 또한 전이하는 암을 포함한다. 기술분야의 사람들에게는 전이가 보통 혈류 또는 림프관을 통해 원발성 종양으로부터 비인접 부위로 세포가 확산되어 이차 종양 성장의 확립을 초래하는 것으로 이해된다. 치료가 고려되는 암의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 맥락막 및 피부 흑색종을 포함한 흑색종; 방광, 비소세포 폐, 소세포 폐, 폐, 머리, 목, 유방, 췌장, 잇몸, 혀, 전립선, 신장, 뼈, 고환, 난소, 자궁경부, 위장 림프종, 뇌, 또는 결장 암; 간암종; 망막모세포종; 중피종; 성상세포종; 신경교모세포종; 신경모세포종' 및 전이된 또는 전이의 위험이 있는 임의의 다른 종양 또는 신생물을 들 수 있다.
본원에 제공된 방법의 대상체는 포유류 또는 조류 종을 포함한 임의의 대상체, 예컨대 동물 또는 식물 대상체일 수 있다. 예를 들어, 동물 대상체는, 한정하는 것은 아니지만, 인간 또는 가축 및 농장 동물, 예컨대 돼지, 소, 염소, 양, 말, 고양이, 또는 개를 포함한 비인간 동물일 수 있다. 특정 예에서, 동물 대상체는 인간 대상체이다.
본원에 제공된 방법은 대상체를 모니터링하거나, 종양을 모니터링하거나, 및/또는 대상체에게 투여된 바이러스를 모니터링하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법에는, 한정하는 것은 아니지만, 종양 크기의 모니터링 단계, 항(종양 항원) 항체 역가의 모니터링 단계, 전이의 존재 및/또는 크기의 모니터링 단계, 대상체의 림프절의 모니터링 단계, 대상체의 체중 또는 혈액 또는 소변 마커를 포함한 기타 건강 지표의 모니터링 단계, 항-(바이러스 항원) 항체 역가의 모니터링 단계, 검출 가능한 유전자 생성물의 바이러스 발현의 모니터링 단계, 및 대상체의 종양, 조직 또는 장기에서 바이러스 역가의 직접적인 모니터링 단계를 포함한, 다양한 모니터링 단계 중 임의의 단계가 포함될 수 있다.
모니터링의 목적은 대상체의 건강 상태 또는 대상체의 치료적 치료의 진행을 평가하기 위한 것이거나, 또는 동일한 또는 상이한 바이러스의 추가의 투여가 보장되는지 아닌지를 결정하기 위한 것이거나, 또는 화합물이 치료 방법의 효능을 증가시키기 위해 작용할 수 있는, 또는 화합물이 대상체에게 투여된 바이러스의 병원성을 감소시키기 위해 작용할 수 있는 대상체에게 화합물을 투여하는 시기 또는 투여 여부를 결정하기 위한 것일 수 있다.
종양 및/또는 전이 크기는 외부 평가 방법 또는 단층촬영 또는 자기 영상화 방법, 예컨대 본원에 기술된 검출 방법을 포함한, 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 더불어, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 유전자 발현(예컨대, 바이러스 유전자 발현)을 모니터링하는 단계가 종양 및/또는 전이 크기를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
여러 시점에 걸쳐 크기를 모니터링하는 것은 본원에 제공된 치료 방법의 효능과 관련된 정보를 제공할 수 있다. 더불어, 종양 또는 전이의 크기의 증가 또는 감소를 모니터링하는 것은 또한 대상체에서 추가적인 종양 및/또는 전이의 존재와 관련된 정보(즉, 검출 및/또는 진단)를 제공할 수 있다. 여러 시점에 걸쳐 종양 크기를 모니터링하는 것은 대상체에서 신생물 질환의 치료 효능, 예컨대 본원에 제공된 치료 효능을 포함한, 대상체에서 신생물 질환의 발달과 관련된 정보를 제공할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 바이러스를 전달하는 대상체에 대한 세포 비히클의 투여에 대한 반응으로 생성된 항체를 포함한, 대상체에서 항체 역가를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에서 투여된 바이러스는 내인성 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 본원에 제공된 방법으로 투여된 바이러스는 또한 바이러스에 의해 발현된 외인성 유전자에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 본원에 제공된 방법으로 투여된 바이러스는 또한 종양 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바이러스 항원, 바이러스 발현된 외인성 유전자 생성물, 또는 종양 항원에 대한 항체 역가를 모니터링하는 단계는 바이러스의 독성을 모니터링하거나, 치료 방법의 효능을 모니터링하거나, 또는 생성 및/또는 수득을 위해 유전자 생성물 또는 항체의 수준을 모니터링하는 방법에 사용될 수 있다.
한 예에서, 항체 역가를 모니터링하는 단계는 바이러스의 독성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스에 대한 항체 역가는 바이러스의 대상체에의 투여 후 기간 동안 달라질 수 있고, 이때 일부 특정 시점에서, 낮은 항-(바이러스 항원) 항체 역가는 더 높은 독성을 나타낼 수 있는 한편, 다른 시점에서 높은 항-(바이러스 항원) 항체 역가는 더 낮은 독성을 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 사용된 바이러스는 면역원성일 수 있고, 따라서 바이러스를 대상체에게 투여한 직후에 면역 반응을 유도할 수 있다.
일반적으로, 대상체의 면역 체계가 그것에 대해 강력한 면역 반응을 빠르게 시작할 수 있는 바이러스는 대상체의 면역 체계가 모든 정상 장기 또는 조직으로부터 바이러스를 제거할 수 있을 때 낮은 독성을 가지는 바이러스일 수 있다. 그러므로, 일부 예에서, 바이러스를 대상체에게 투여한 직후 바이러스 항원에 대한 고항체 역가는 바이러스의 저독성을 나타낼 수 있다. 대조적으로, 고도로 면역원성이 아닌 바이러스는 강한 면역 반응을 유도하지 않으면서 숙주 유기체를 감염시킬 수 있고, 그것은 바이러스의 숙주에 대한 더 높은 독성을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 바이러스를 대상체에게 투여한 직후 바이러스 항원에 대한 고항체 역가는 바이러스의 저독성을 나타낼 수 있다.
다른 예에서, 항체 역가를 모니터링하는 것은 치료 방법의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에서, 항체 역가, 예컨대 항-(종양 항원) 항체 역가는 신생물 질환을 치료하기 위한 치료 방법과 같은 치료 방법의 효능을 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 치료 방법은 종양 및/또는 전이에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, 항-(종양 항원) 항체 역가를 모니터링함으로써, 종양 및/또는 전이에 대해 면역 반응을 유발 또는 향상시키는 데 있어 치료 방법의 효능을 모니터링하는 것이 가능하다.
본원에 제공된 치료 방법은 또한 대상체에게 종양에 축적될 수 있고 항-바이러스 또는 항-세포 비히클 면역 반응을 유발 또는 향상시킬 수 있는 바이러스를 함유한 세포 비히클을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 숙주가 종양 또는 전이에서 축적된 바이러스 또는 세포 비히클에 대한 면역 반응을 시작하는 능력을 모니터링하는 것이 가능하며, 그것은 대상체가 항-종양 면역 반응을 시작했음을 나타낼 수 있거나, 또는 대상체가 항-종양 면역 반응을 시작할 가능성이 있음을 나타낼 수 있거나, 또는 항-종양 면역 반응을 시작할 수 있음을 나타낼 수 있다.
본원에 제공된 방법은 또한 대상체의 건강을 모니터링하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법의 일부는 신생물 질환 치료 방법을 포함한, 치료 방법이다. 대상체의 건강을 모니터링하는 것은, 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 치료 방법의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 본원에 제공된 세포 비히클, 및 바이러스의 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체의 건강을 모니터링하는 것은 대상체에게 투여되었을 때 그 조합에서 바이러스의 병원성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 신생물 질환, 감염성 질환, 또는 면역-관련 질환과 같은 질환을 모니터링하기 위한 다양한 건장 진단 방법 중 임의의 방법이, 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 체중, 혈압, 맥박, 호흡, 혈색, 체온 또는 기타 관찰 가능한 상태는 대상체의 건강을 나타낼 수 있다. 더불어, 대상체로부터의 샘플 중의 하나 이상의 구성요소의 존재 또는 부재 또는 수준은 대상체의 건강을 나타낼 수 있다. 전형적인 샘플로는 혈액 및 소변 샘플을 들 수 있고, 하나 이상의 구성요소의 존재 또는 부재 또는 수준은 예를 들어, 혈액 패널 또는 소변 패널 진단 테스트를 수행함으로써 측정될 수 있다. 대상체의 건강을 나타내는 예시의 구성요소는, 한정하는 것은 아니지만, 백혈구 수, 적혈구 용적, 또는 반응성 단백질 농도를 들 수 있다.
G. 제약학적 조성물, 조합 및 키트
본원에는 본원에 제공된 운반 세포 및 종양용해 바이러스를 함유한 제약학적 조성물, 조합 및 키트가 제공된다. 제약학적 조성물은 본원에 제공된 방법에 의해 확인된 매칭된 운반 세포 및 제약학적 담체를 포함할 수 있다. 매칭된 운반 세포는 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 제조된 감작된 세포, 조작된 세포 또는 프라이밍된 세포(예컨대, IFNγ로 사전 처리된 "보호된" 운반 세포)를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 본원에 제공된 종양용해 바이러스 및 제약학적 담체를 포함할 수 있다. 조합은, 예를 들어, 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 매칭된 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 감작된 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 조작된 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 감작된 및 조작된 세포, 종양용해 바이러스 및 프라이밍된(보호된) 운반 세포를 포함한 임의의 운반 세포; 종양용해 바이러스, 프라이밍된(보호된) 운반 세포 및 본원에 제공된 바와 같이 매칭되거나 변형된 비보호된 운반 세포를 포함할 수 있다. 조합은 본원에 제공된 운반 세포, 종양용해 바이러스 및 검출 가능한 화합물; 임의의 운반 세포, 종양용해 바이러스 및 치료 화합물; 임의의 운반 세포, 종양용해 바이러스 및 바이러스 발현 조절 화합물, 또는 이것들의 임의의 조합 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 제공된 하나 이상의 제약학적 조성물 또는 조합, 및 하나 이상의 구성요소, 예컨대 사용 설명서, 제약학적 조성물 또는 조합을 대상체에게 투여하기 위한 장치, 치료 또는 진단 화합물을 대상체에게 투여하기 위한 장치 또는 대상체의 바이러스를 검출하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
제약학적 조성물, 조합 또는 키트에 함유된 운반 세포는 본원에 제공된 임의의 운반 세포를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물, 조합 또는 키트에 함유된 종양용해 바이러스는 본원에 제공된 임의의 바이러스를 포함할 수 있다.
1. 제약학적 조성물
본원에는 본원에 제공된 운반 세포, 프라이밍된(보호된) 운반 세포, 감작된 운반 세포, 조작된 운반 세포, 종양용해 바이러스, 또는 임의의 운반 세포 및 종양용해 바이러스, 및 적합한 제약학적 담체를 함유하는 제약학적 조성물이 제공된다. 제약학적으로 허용되는 담체로는 비히클 운반체 또는 바이러스를 위한 배지로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질을 들 수 있다. 본원에 제공된 제약학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 고체, 반고체, 수성, 액체, 분말 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 운반 세포(프라이밍된, 감작된, 조작된 세포를 포함함) 또는 종양용해 바이러스를 함유하는 예시의 제약학적 조성물로는, 한정하는 것은 아니지만, 멸균 주사용 용액, 멸균 포장된 분말, 점안액, 정제, 환, 분말, 당의정, 사셰(sachets), 카세(cachets), 엘릭시르, 현탁액, 에멀션, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질 중의), 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 및 좌제를 들 수 있다.
적합한 제약학적 담체의 예는 기술분야에 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, 다른 것들 중에서도 물, 완충액, 식염수 용액, 인산염 완충 식염수 용액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식용유, 벤질 알코올, 젤라틴, 글리세린, 탄수화물, 예컨대 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 아밀로스 또는 전분, 소르비톨, 만니톨, 스테아르산 마그네슘, 탈트, 규산, 점성 파라핀, 향수 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 다이글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로스, 및 분말을 들 수 있다. 본원에 제공된 제약학적 조성물은, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 항산화제, 보존제, 진통제, 결합제, 붕해제, 착색제, 희석제, 부형제, 증량제, 글리단트, 가용화제, 안정화제, 등장화제, 비히클, 점도 작용제, 풍미제, 감미제, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 유화 및 현탁화제, 예컨대 아카시아, 아가, 알긴산, 알긴산 나트륨, 벤토나이트, 카보머, 카라기난, 카르복시메틸셀룰로스, 셀룰로스, 콜레스테롤, 젤라틴, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 옥토시놀 9, 올레일 알코올, 포비돈, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 라우릴 황산 나트륨, 소르비탄 에스테르, 스테아릴 알코올, 트라가칸트, 크산탄 검, 및 이것의 유도체, 용매, 및 기타 성분, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 결정성 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 시트르산, 덱스트린, 액상 글루코스, 락트산, 락토스, 염화 마그네슘, 메타인산 칼륨, 전분을 포함한 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 담체 및/또는 첨가제는 종래 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 지질, 뉴클레아제 억제제, 중합체, 및 킬레이트화제와 같은 안정화제가 조성물을 신체 내에서의 분해로부터 보존할 수 있다. 제약학적 조성물에 사용하기에 적합한 다른 제형은, 예를 들어, 문헌에서 찾을 수 있다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2005, Twenty-first edition, Gennaro & Gennaro, eds., Lippencott Williams and Wilkins).
주사 또는 점막 전달을 위해 본원에 제공된 운반 세포 및/또는 종양용해 바이러스를 포함하는 제약학적 제형은 전형적으로 주사 또는 점막 투여를 위한 적합한 완충액으로 제공된 바이러스의 수용액 또는 주사 또는 점막 투여를 위한 적합한 완충액에서의 재구성을 위한 바이러스의 동결건조 형태를 포함한다. 이러한 제형은 선택적으로 본원에 기술된 또는 기술분야에 공지되어 있는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조성물은 일반적으로 수용액, 적합하게 풍미가 첨가된 시럽, 수성 또는 유성 현탁액, 및 옥수수유, 면실유, 참기름, 코코넛 오일, 또는 땅콩 오일과 같은 식용유로 풍미가 첨가된 에멀션, 뿐만 아니라 엘릭시르 및 유사한 제약학적 비히클을 포함한다.
본원에 제공된 제약학적 조성물은 기술분야에 알려져 있는 과정을 사용함으로써 본원에 기술된 운반 세포 및/또는 바이러스의 빠르고, 지속성 또는 지연된 방출을 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 정제와 같은 고형 조성물을 제조하기 위하여, 본원에 제공된 운반 세포 및/또는 바이러스는 고형 조성물을 형성하기 위해 제약학적 담체와 혼합된다. 선택적으로, 정제 또는 환은 대상체에서 연장된 작용의 장점을 제공하는 투약 형태를 제공하기 위해 코팅되거나 또는 그렇지 않으면 합성된다. 예를 들어, 정제 또는 환은 내부 투약 및 외부 투약 구성요소를 함유하는데, 후자는 전자 위의 외피 형태이다. 2개의 구성요소는, 예를 들어, 위에서 붕해에 저항하고 내부 구성요소가 십이지장으로 온전하게 통과하거나 방출이 지연되도록 하는 장 층(enteric layer)에 의해 분리될 수 있다. 이러한 장 층 또는 코팅에 대해, 예를 들어, 중합체 산 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알코올, 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한 다양한 물질이 사용된다.
흡입 또는 주입용 조성물은 제약학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 이것들의 혼합물 중의 용액 또는 현탁액, 및 분말을 포함한다. 이들 액체 또는 고체 조성물은 선택적으로 본원에 기술된 또는 기술분야에 알려져 있는 적합한 제약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 예를 들어, 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 제약학적으로 허용되는 용매 중의 조성물은 비활성 가스의 사용에 의해 분무된다. 분무된 용액은, 예를 들어, 분무 장치로부터 직접, 부착된 페이스 마스크 텐트로부터, 또는 간헐적 양압 호흡기로부터 흡입된다. 용액, 현탁액, 또는 분말 조성물은, 예를 들어, 흡입기의 사용과 같은 적절한 방식으로 제형을 전달하는 장치로부터, 예를 들어, 경구로 또는 비강으로 투여된다.
본원에 제공된 제약학적 조성물은 경피 전달 장치("패치")를 통한 경피 전달을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 경피 패치는 본원에 제공된 바이러스의 연속 또는 비연속 주입을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 제약학적 작용제의 전달을 위한 경피 패치의 구성 및 사용은 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 수행된다(예를 들어, 미국 특허 제 5,023,252호 참조). 이러한 패치는 본원에 제공된 운반 세포 및/또는 바이러스의 연속성, 박동성, 또는 주문형 전달을 위해 구성된다.
바이러스의 전달을 위해 사용될 수 있는 콜로이드성 분산 시스템으로 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 수-중-유 에멀션(혼합)을 포함한 지질-기반 시스템, 미셸, 리포솜 및 리포플렉스를 들 수 있다. 예시의 콜로이드성 시스템은 리포솜이다. 장기-특이적 또는 세포-특이적 리포솜이 원하는 조직으로만 전달을 이루기 위해 사용될 수 있다. 리포솜의 표적화는 기술분야에 숙련된 사람에 의해 일반적으로 알려져 있는 방법을 적용함으로써 수행될 수 있다. 이런 표적화는 수동 표적화(리포솜이 사인파 모양의 모세혈관을 함유하는 장기의 망상내피계(RES)의 세포로 분포되는 자연스러운 경향을 이용함) 또는 능동 표적화(예를 들어, 리포솜을 특정 리간드, 예를 들어, 항체, 수용체, 당, 당지질 및 단백질에, 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 방법에 의해 결합시킴에 의함)를 포함한다. 단클론성 항체는 리포솜을 특정 조직, 예를 들어, 종양 조직에, 특정 세포-표면 리간드를 통해 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다.
2. 조합 (combination)
운반 세포 및 종양용해 바이러스; 감작된 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 조작된 운반 세포 및 종양용해 바이러스; 또는 감작된 및 조작된 세포를 포함한 임의의 운반 세포, 종양용해 바이러스 및 프라이밍된(보호된) 운반 세포(예컨대, IFNγ로 사전처리된 운반 세포)의 조합이 제공되며, 이런 조합은 본원에 제공된 방법에 따라 매칭된 또는 변형된 비보호 운반 세포를 선택적으로 포함할 수 있다. 조합은 제3 또는 제4 작용제, 예컨대 제2 바이러스 또는 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 조합은 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 진단 또는 치료 바이러스를 포함한 하나 이상의 추가적인 바이러스와 함께 본원에 제공된 바이러스를 포함할 수 있다. 조합은 본원에 제공된 바이러스; 또는 운반 세포(감작된 및 조작된 세포를 포함함) 및 바이러스; 또는 운반 세포(감작된 및 조작된 세포를 포함함), 바이러스 및 본원에 기술된 프라이밍된 세포를 함유하는 제약학적 조성물을 함유할 수 있다. 조합은 또한 본원에 제공된 방법에 따라 치료 또는 진단을 이루기 위한 임의의 시약, 예를 들어, 항바이러스 또는 화학요법제를 포함할 수 있다. 조합은 또한 바이러스에 의해 암호화된 내인성 또는 이종성 유전자로부터의 유전자 발현의 조절을 위해 사용된 화합물을 함유할 수 있다.
본원에 제공된 조합은 운반 세포, 바이러스 및 치료 화합물을 함유할 수 있다. 본원에 제공된 조성물에 대한 치료 화합물은, 예를 들어, 항암 또는 화학요법 화합물일 수 있다. 예시의 치료 화합물로는, 예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 감광제, 방사성핵종, 독소, siRNA 분자, 효소/프로 E 약물 쌍, 항-대사산물, 신호전달 조절제, 항암 항생물질, 항암 항체, 혈관형성 억제제, 화학요법 화합물, 항전이 화합물 또는 이것들 중 임의의 것들의 조합을 들 수 있다.
본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스는 항암 화합물, 예컨대 백금 배위 착체와 조합될 수 있다. 예시의 백금 배위 착체로는, 예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, DWA2114R, NK121, IS3　295, 및 254-S를 들 수 있다. 예시의 화학요법제로는 또한, 한정하는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 비-당 함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카르바진, 탁솔, 프라길린, 메글라민 GLA, 발루비신, 카르무스틴, 폴리페프로산, MM1270, BAY 12-9566, RAS 파르네실 트란스퍼라제 억제제, 파르네실 트란스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, 로메트렉솔/LY264618, 글라몰렉(Glamolec), CI-994, TNP-470, 하이캄틴(Hycamtin)/토포테칸, PKC412, 발스포다르(Valspodar)/PSC833, 노반트론(Novantrone)/미톡산트론, 메타레르(Metaret)/수라민(suramin), BB-94/바티마스타트(batimastat), E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, IS1641, ODN 698, TA 2516/마리마스타트(marimastat), BB2516/마리마스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날(Lemonal) DP 2202, FK 317, 피시바닐(picibanil)/OK-432, 발루비신/AD 32, 스트론튬-89/매타스트론(Metastron), 테모달(Temodal)/테모졸로미드(temozolomide), 예우탁산(Yewtaxan)/파클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 파섹스(Paxex)/파클리탁셀, 사이클로팍스/경구용 파클리탁셀, 젤로다(Xeloda)/카페시타빈, 푸르툴론(Furtulon)/독시플루리딘(doxifluridine), 경구용 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌(flavopiridol), CP-358(774)/EGFR, CP-609(754)/RAS 종양유전자 억제제, BMS-182751/경구용 백금, UFT(테가푸르(Tegafur)/우라실), 에르가미솔(Ergamisol)/레바미솔(levamisole), 캄프토/레바미솔, 에닐루라실(Eniluracil)/776C85/5FU 향상제, 캄프토사르(Camptosar)/이리노테칸, 토무덱스(Tomudex)/랄티트렉세드(raltitrexed), 레우스타틴(Leustatin)/클라드리빈(cladribine), 카엘릭스(Caelyx)/리포솜 독소루비신, 미오세트(Myocet)/리포솜 독소루비신, 독실(Doxil)/리포솜 독소루비신, 에바세트(Evacet)/리포솜 독소루비신, 플루다라(Fludara)/플루다라빈, 파모루비신(Pharmorubicin)/에피루비신(epirubicin), DepoCyt, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈이미드, LU 103793/돌라스타틴, 겜자르(Gemzar)/겜시타빈, ZD 0473/AnorMED, YM 116, 요오드 시드, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포스파미드, Ifex/Mesnex/이포스파미드, 부몬(Vumon)/테니포시드, 파라플라틴(Paraplatin)/카르보플라틴, 플라티놀( Platinol)/시스플라틴, VePesid/에포신(Eposin)/에토포포스(Etopophos)/에토포시드, ZD 9331, 탁소티어(Taxotere)/도세탁셀, 구아닌 아라비노시드의 전구약물, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 멜팔란 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 클로람부실, 시타라빈 HCl, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에토포시드(VP16-213), 플록수리딘, 플루오로우라실(5-FU), 플루타미드, 하이드록시우레아(하이드록시카르바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트(LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴(CCNU), 메클로르에타민 HCl(질소 무스타드), 머캡토퓨린, 메스나, 미토탄(o,p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오티드, 플리카마이신, 프로카르바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 설페이트, 암사크린(m-AMSA), 아자시티딘, 에리트로포이에틴, 헥사메틸멜라민(HMM), 인터류킨 2, 미토구아존(메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐하이드라존; MGBG), 펜토스타틴(2'데옥시코포르마이신), 세무스틴(메틸-CCNU), 테니포시드(VM-26) 및 빈데신 설페이트를 들 수 있다. 본원에 제공된 제약학적 조성물 및 조합에 사용하기 위한 추가적인 예시의 치료 화합물은 본원의 다른 곳에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 예시의 사이토카인, 성장 인자, 감광제, 방사성 핵종, 독소, siRNA 분자, 효소/전구약물 쌍, 항-대사산물, 신호전달 조절제, 항암 항생물질, 항암 항체, 혈관형성 억제제, 및 화학요법 화합물에 대한 섹션 H 참조).
일부 예에서, 조합은 예를 들어, 바이러스에 의해 암호화되고 발현된 효소에 대한 기질인 화합물과 같은 추가적인 치료 화합물, 또는 본원에 제공된 또는 바이러스와 협력하여 작용하는 것으로 기술분야에 알려져 있는 다른 치료 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 전구약물을 암세포를 살해하기 위한 활성 화학요법 약물로 전환시키는 효소를 발현할 수 있다. 그러므로, 본원에 제공된 조합은 치료 화합물, 예컨대 전구약물을 함유할 수 있다. 예시의 바이러스/치료 화합물 조합은 전구약물 간시클로비르와 함께 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제를 암호화하는 바이러스를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 조합에 사용하기 위한 추가적인 예시의 효소/전구약물 쌍으로는, 한정하는 것은 아니지만, 수두 대상포진 티미딘 키나제/간시클로비르, 시토신 탈아미노효소/5-플루오로우라실, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제/6-메틸퓨린 데옥시리보사이드, 베타 락타마제/세팔로스포린-독소루비신, 카르복시펩티다제 G2/4-[(2-클로로에틸)(2-메실옥시에틸)아미노]벤조일-L-글루탐산, 시토크롬 P450/아세트아미노펜, 양고추냉이 과산화효소/인돌-3-아세트산, 니트로환원효소/CB1954, 토끼 카르복실에스테라제/7-에틸-10-[4-(1-피페리디노)-1-피페리디노]카르보닐옥시캄프토테신(CPT-11), 버섯 티로시나제/비스-(2-클로로에틸)아미노-4-하이드록시페닐아미노메타논 28, 베타 갈락토시다제/1-클로로메틸-5-하이드록시-1,2-다이하이드로-3H-벤즈[e]인돌, 베타 글루쿠로니다제/에피루비신-글루쿠로나이드, 티미딘 포스포릴라제/5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 데옥시시티딘 키나제/시토신 아라비노시드, 베타-락타마제 및 리나머라제/리나마린을 들 수 있다. 조합에 사용하기 위한 추가적인 예시의 전구약물은 또한 본원의 다른 곳에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 섹션 H 참조). 본원에 제공된 또는 그렇지 않으면 기술분야에 알려져 있는 다양한 임의의 공지 조합이 본원에 제공된 조합에 포함될 수 있다.
일부 예에서, 조합은 바이러스 성장 또는 독성을 사멸 또는 억제할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 바이러스 감염으로부터 유발될 수 있는 하나 이상의 해로운 부작용을 완화하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 공개 번호 US 2009-016228-A1 참조). 본원에 제공된 조합은 감염 치료를 위한 항생물질, 항진균, 항기생충 또는 항바이러스 화합물을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 항바이러스 화합물은 바이러스 성장 또는 독성을 억제하는 화학요법제이다.
본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스와의 조합에 포함될 수 있는 예시의 항생물질로는, 한정하는 것은 아니지만, 세프타지딤(ceftazidime), 세페핌(cefepime), 이미페넴(imipenem), 아미노글리코시드, 반코마이신 및 항녹농균 β-락탐을 들 수 있다. 본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스와의 조합에 포함될 수 있는 예시의 항진균제로는, 한정하는 것은 아니지만, 암포테리신 B, 다프손(dapsone), 플루코나졸(fluconazole), 플루시토신(flucytosine), 그리세오풀빈(griseofulvin), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 미코나졸(miconazole), 클로트리마졸(clotrimazole), 니스타틴(nystatin), 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스와의 조합에 포함될 수 있는 예시의 항바이러스제로는, 한정하는 것은 아니지만, 시도포비르(cidofovir), 시도포비르(CDV)의 알콕시알킬 에스테르, 고리형 CDV, 및 (S)-9-(3-하이드록시-2포스포닐메톡시프로필)아데닌, 5-(다이메톡시메틸)-2'-데옥시우리딘, 이사틴-베타-티오세미카르바존, N-메타노카르바티미딘, 브리부딘, 7-데아자네플라노신 A, ST-246, Gleevec, 2'-베타-플루오로-2',3'-다이데옥시아데노신, 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir), 리토나비르(ritonavir), 네비라핀(nevirapine), AZT, ddi, ddC, 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 전형적으로, 항바이러스제와의 조합은 조합의 바이러스에 대해 효과적인 것으로 알려져 있는 항바이러스제를 함유한다. 예를 들어, 조합은 항바이러스 화합물, 예컨대 시도포비르, 시도포비르의 알콕시알킬 에스테르, 간시클로비르, 아시클로비르, ST-246, Gleevec, 및 이것들의 유도체와 함께 백시니아 바이러스를 함유할 수 있다.
일부 예에서, 조합은 검출 가능한 화합물을 포함할 수 있다. 검출 가능한 화합물로는, 예를 들어, 리간드, 기질 또는 바이러스 또는 운반 세포에 의해 암호화되고 발현된 단백질 또는 RNA와 상호작용하거나 및/또는 특이적으로 결합하고, 검출 가능한 신호, 예컨대 단층촬영, 분광, 자기 공명, 또는 다른 알려져 있는 기법에 의해 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 다른 화합물을 들 수 있다.
일부 예에서, 단백질 또는 RNA는 외인성 단백질 또는 RNA이다. 일부 예에서, 바이러스 또는 운반 세포에 의해 발현된 단백질 또는 RNA는 변형된 화합물이 검출 가능한 신호를 방출하는 검출 가능한 화합물을 변형시킨다. 예시의 검출 가능한 화합물은 방사성 핵종을 포함한, 자기 공명, 초음파 또는 단층촬영 영상화제와 같은 영상화제이거나, 그것을 함유할 수 있다. 검출 가능한 화합물은 본원의 다른 곳에서 제공되거나 그렇지 않으면 기술분야에서 알려져 있는 다양한 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 바이러스 또는 운반 세포에 의해 발현될 수 있는 예시의 단백질 및 검출에 사용된 검출 가능한 화합물 조합으로는, 한정하는 것은 아니지만 루시페라제 및 루시페린, β 갈락토시다제 및 (4,7,10-트라이(아세트산)-l-(2-β-갈락토피라노실에톡시)-l,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸)가돌리늄(Egad), 및 기술분야에 알려져 있는 다른 조합을 들 수 있다.
일부 예에서, 조합은 바이러스 또는 운반 세포에 의해 암호화된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 유전자 발현 조절 화합물을 포함할 수 있다. 유전자 발현을 조절하는 화합물은 기술분야에 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, 전사 활성자, 유도자, 전사 억제자, RNA 중합효소 억제제 및 siRNA 또는 리보자임과 같은 RNA 결합 화합물을 예로 들 수 있다. 기술분야에 알려져 있는 다양한 유전자 발현 조절 화합물 중 임의의 것이 본원에 제공된 조합에 포함될 수 있다. 전형적으로, 본원에 제공된 조합에 바이러스와 함께 포함된 유전자 발현 조절 화합물은 전사 인자 또는 바이러스의 RNA 또는 조합의 운반 세포와 같은 유전자 발현에서 활성인 하나 이상의 화합물에 결합하거나, 그것을 억제하거나 또는 그것과 반응할 수 있는 화합물일 것이다. 예시의 바이러스 또는 운반 세포/발현 조절자 조합은 단순 헤르페스 바이러스 단백질 VP16의 효모 GAL4 DNA-결합 도메인 활성화 도메인에 융합된 돌연변이 인간 프로게스테론 수용체를 가진 키메라 전사 인자 복합체를 암호화하고 또한 아데노바이러스 주요 후기 E1B TATA 박스의 상류에 일련의 GAL4 인식 서열을 함유하고 있는 합성 프로모터를 함유한 바이러스 또는 운반 세포일 수 있으며, 여기서 화합물은 RU486일 수 있다(예컨대, Yu et al. (2002) Mol Genet Genomics 268:169-178 참조). 기술분야에 알려져 있는 다양한 다른 바이러스 또는 운반 세포/발현 조절자 조합이 또한 본원에 제공된 조합에 포함될 수 있다.
일부 예에서, 조합은 나노입자를 함유할 수 있다. 나노입자는 그것이 본원에 제공된 하나 이상의 치료제를 운반하도록 설계될 수 있다. 추가적으로, 나노입자는 나노입자를 종양 세포로 표적화하는 분자를 운반하도록 설계될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 나노입자는 방사성 핵종 및, 선택적으로, 종양-관련 항원과 면역반응하는 항체로 코팅될 수 있다.
일부 예에서, 조합은 진단 또는 치료를 위한 하나 이상의 추가적인 치료 및/또는 진단 바이러스 또는 다른 치료 및/또는 진단 미생물(예컨대, 치료 및/또는 진단 박테리아)을 함유할 수 있다. 예시의 치료 및/또는 진단 바이러스는 기술분야에 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, 치료 및/또는 진단 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 및 레오바이러스를 예로 들 수 있다. 예시의 종양용해 바이러스가 상기 본원에서 기술된다.
3. 키트
본원에 제공된 운반 세포, 바이러스, 제약학적 조성물 또는 조합은 키트로서 포장될 수 있다. 키트는 선택적으로 사용 설명서, 장치 및 추가 시약, 및 구성요소, 예컨대 방법의 실시를 위한 튜브, 용기 및 주사기와 같은 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있다. 예시의 키트는 본원에 제공된 운반 세포 및 바이러스, 또는 보호된 운반 세포, 비보호된 운반 세포 및 바이러스를 포함할 수 있고; 선택적으로 사용 설명서, 대상체에서 운반 세포 및/또는 바이러스를 검출하기 위한 장치, 대상체에 운반 세포 및 바이러스를 투여하기 위한 장치, 또는 대상체에 추가의 작용제 또는 화합물을 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
한 예에서, 키트는 설명서를 함유할 수 있다. 설명서는 전형적으로 운반 세포 및 바이러스를 기술하는 유형의 표현을 포함하며, 선택적으로, 키트에 포함된 다른 구성요소, 및 운반 세포 및 바이러스를 투여하기 위하여, 대상체의 적절한 상태를 측정하기 위한 방법, 적절한 투여량, 및 적절한 투여 방법을 포함한 투여 방법을 포함한다. 설명서는 또한 치료 기간 동안 대상체를 모니터링하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 키트는 대상체에서 운반 세포 및/또는 바이러스를 검출하기 위한 장치를 함유할 수 있다. 대상체에서 운반 세포 및/또는 바이러스를 검출하기 위한 장치는 예를 들어 루시페라제로부터 방출된, 또는 형광 단백질, 예컨대 녹색 또는 적색 형광 단백질로부터 형광된 빛을 검출하기 위한 저조도 영상화 장치, MRI 또는 NMR 장치와 같은 자기 공명 측정 장치, 단층촬영 스캐너, 예컨대 PET, CT, CAT, SPECT 또는 다른 관련 스캐너, 초음파 장치, 또는 대상체 내에서 운반 세포 및/또는 바이러스에 의해 발현된 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있는 다른 장치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 키트의 장치는 키트의 운반 세포 및/또는 바이러스에 의해 발현된 하나 이상의 단백질을 검출할 수 있을 것이다. 운반 세포, 바이러스 및 검출 장치, 예를 들어, 운반 세포 또는 바이러스 발현 루시페라제 및 저조도 영상화기 또는 운반 세포 또는 바이러스 발현 형광 단백질, 예컨대 녹색 또는 적색 형광 단백질, 및 저조도 영상화기를 함유한 다양한 키트 중 임의의 것이 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다.
본원에 제공된 키트는 또한 대상체에 운반 세포 및 바이러스를 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약물, 제약학적 조성물 및 백신을 투여하기 위한 기술분야에 알려져 있는 다양한 장치 중 임의의 것이 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시의 장치로는, 한정하는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘 없는 주사 장치, 흡입기 및 액체 분산기, 예컨대 점안기를 들 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주사에 의해 전신적으로 전달될 운반 세포 및 바이러스 조합은 피하 주사바늘 및 주사기를 포함한 키트에 포함될 수 있다. 전형적으로, 키트의 운반 세포 및 바이러스를 투여하기 위한 장치는 키트의 운반 세포 및 바이러스와 적합할 것이다; 예를 들어, 고압 주사 장치와 같은 바늘 없는 주사 장치가 고압 주사에 의해 손상되지 않는 운반 세포 및 바이러스를 가진 키트에 포함될 수 있지만, 전형적으로 고압 주사에 의해 손상되는 운반 세포 및 바이러스를 가진 키트에 포함되지 않는다.
본원에 제공된 키트는 또한 대상체에 추가적인 작용제 또는 화합물을 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 대상체에 약물을 투여하기 위한 기술분야에 알려져 있는 다양한 장치 중 임의의 것이 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시의 장치로는, 한정하는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘 없는 주사 장치, 흡입기 및 액체 분산기, 예컨대 점안기를 들 수 있다. 전형적으로 키트의 화합물을 투여하기 위한 장치는 화합물의 바람직한 투여 방법과 적합할 것이다. 예를 들어, 전신적으로 또는 피하로 전달될 화합물은 피하 주사바늘 및 주사기를 가진 키트에 포함될 수 있다.
본원에 제공된 키트는 또한 대상체에 에너지, 예컨대 전자기 에너지를 적용하기 위한 임의의 장치를 포함할 수 있다. 이러한 장치로는, 한정하는 것은 아니지만, 레이저, 발광 다이오드, 형광 램프, 이색성 램프, 및 라이트 박스를 들 수 있다. 키트는 또한 대상체에 대한 에너지의 내부 노출을 이루기 위한 장치, 예컨대 내시경 및 광섬유 카테터를 포함할 수 있다.
H. 세포 비히클 + 바이러스 치료와 함께 투여된 추가적인 치료법
바이러스 요법을 필요로 하는 대상체에게 종양용해 바이러스를 전달하기 위해 본원에 제공된 종양용해 바이러스 및 세포 비히클을 함유하는 본원에 제공된 조합, 조성물 또는 키트를 사용하는 바이러스 요법은 단독으로 또는 다른 치료법 또는 치료와의 추가의 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 제공된 조합 또는 조성물은 추가로 다른 치료제 또는 약물학적 작용제 또는 치료, 예컨대 수술과 함께, 그 전에, 그것과 간헐적으로, 또는 그것에 후속하여 공동 제형화되거나 또는 공동 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 작용제로는, 한정하는 것은 아니지만, 다른 생체의약품, 항암제, 소분자 화합물, 분산제, 마취제, 체크포인트 억제제, 혈관수축제, 수술, 방사선, 화학요법제, 생물학적 작용제, 폴리펩타이드, 항체, 펩타이드, 소분자, 유전자 요법 벡터, 바이러스 및 DNA 및 이것들의 조합을 들 수 있다. 이러한 작용제는 또한 부작용을 개선, 감소 또는 방지하기 위한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 병용 요법은 원발성 종양을 제거하거나 또는 치료 전에 대상체를 면역억제하는 하나 이상의 암 치료와 함게 사용될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 화학요법 또는 방사선 요법은 본원에 제공된 병용 요법에 더불어 사용될 수 있다. 이러한 추가적인 치료법은 대상체의 면역 체계를 약화시키는 효과를 가질 수 있다. 다른 예에서, 수술적 제거 및/또는 면역 체계 약화 요법이 필요하지 않을 수 있다. 본원에서 조합될 수 있는 예시의 다른 방법은 면역 체계를 약화시키지 않으면서 종양 또는 신생물 세포의 증식 속도를 감소시키는(예컨대, 종양 억제자 화합물을 투여함으로써 또는 종양 세포-특이적 화합물을 투여함으로써) 화합물을 투여하는 단계 또는 혈관형성-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
제2 작용제 또는 작용제들 또는 치료 또는 치료들의 제제가 한 번에 투여될 수 있거나, 또는 간격을 두고 투여될 여러 번의 작은 용량으로 나누어질 수 있다. 선택된 작용제/치료 제제는 치료 과정에 걸쳐, 예를 들어 수시간, 수일, 수주, 또는 수개월에 걸쳐 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 연속적인 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여 과정은 적응증 및 환자의 내약성에 따라 좌우되는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본원의 제2 작용제/치료를 위한 투약 레지멘은 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있다.
예를 들어, 본원에 제공된 병용 요법은 한정하는 것은 아니지만 다음 중 하나 이상과의 추가의 조합으로 사용될 수 있다: 면역 동시 자극 작용물질( 예컨대, B7 패밀리(CD28, ICOS); TNFR 패밀리(4-1BB, OX40, GITR, CD40, CD30, CD27); LIGHT, LTα); BiTE; 종양-특이적 항원을 표적화하는 CAR-T 세포 및 TCR 유전자도입 T 세포; 체크포인트 억제제(표적은 PD-1, PD-2, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, IDO 1 및 2, CTNNB1(β-카테닌), SIRPα, VISTA, LIGHT, HVEM, LAG3, TIM3, TIGIT, 갈렉틴-9, KIR, GITR, TIM1, TIM4, CEACAM1, CD27, CD40/CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD112, CD137(4-1BB), CD155, CD160, CD200, CD226, CD244(2B4), CD272(BTLA), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, ICOS, A2aR, A2bR, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT-2/4 및 OX40/OX-40L, MDR1, 아르기나제1, iNOs, IL-10, TGF-β, pGE2, STAT3, VEGF, KSP, HER2, Ras, EZH2, NIPP1, PP1, TAK1 및 PLK1a를 포함함); 및 화학요법 화합물 및 항체.
본원에 제공된 바이러스 요법 외에 투여를 위한 예시의 화학요법 화합물 및 항체로 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 감광제, 독소, 항암 항생물질, 화학요법 화합물, 방사성 핵종, 혈관형성 억제제, 신호전달 조절제, 항대사산물, 항암 백신, 항암 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 유사분열 방지 올리고펩타이드, 항암 항체, 항암 항생물질 및 면역치료제를 들 수 있다.
본원의 병용 요법의 투여 후에, 동시에 또는 전에 투여될 수 있는 예시의 항암제로는, 한정하는 것은 아니지만 다음을 들 수 있다: 아시비신; 아비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인(9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀴온; 아르기메스나; 아르센 삼산화물; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파스; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 생; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다; 비산트렌; 비산트렌; 비스나피드 다이메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르보퀴온; 카르모푸르; 프롤리페프로산을 포함한 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핀골; 셀레콕십; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 사이클로포스파미드; 리포솜성 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 아르베포에틴 알파; 리포솜성 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀴온; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포솜성 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포솜 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리오트 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타닌다졸; 에토글루시드; 에토포시드 인산염; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑스메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록스우리딘; 플루다라빈; 플로오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 칼로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트 하이드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이마티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀴온; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2s 및 기타 인터류킨(재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린(류크로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 무스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란실-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메코프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스페르; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카미시드 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 푸미테파; 푸로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핀골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌(6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈리소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티라미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나식; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘(엑테이나스시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA: 트라이시리빈; 트릴로스탄; 트라이메트렉세이트; 트라이플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 빈에피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A(구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신; 및 조수퀴다르, 예를 들어:
알데스류킨(예컨대 PROLEUKIN®); 알렘투주맙(예컨대 CAMPATH®); 알리트레티노인(예컨대 PANRETIN®); 알로퓨리놀(예컨대 ZYLOPRIM®); 알트레타민(예컨대 HEXALEN®); 아미포스틴(예컨대 ETHYOL®); 아나스트로졸(예컨대 ARIMIDEX®); 아르센 삼산화물(예컨대 TRISENOX®); 아스파라기나제(예컨대 ELSPAR®); BCG 생(예컨대 TICE® BCG); 벡사로텐(예컨대 TARGRETIN®); 베바시주맙(AVASTIN®); 블레오마이신(예컨대 BLENOXANE®); 정맥내 부술판(예컨대 BUSULFEX®); 경구용 부술판(예컨대 MYLERAN®); 칼루스테론(예컨대 METHOSARB®); 카페시타빈(예컨대 XELODA®); 카르보플라틴(예컨대 PARAPLATIN®); 카르무스틴(예컨대 BCNU®, BiCNU®); 폴리페로산을 포함한 카르무스틴(예컨대 GLIADEL® Wafer); 셀레콕십(예컨대 CELEBREX®); 클로람부실(예컨대 LEUKERAN®); 시스플라틴(예컨대 PLATINOL®); 클라드리빈(예컨대 LEUSTATIN®, 2-CdA®); 사이클로포스파미드(예컨대 CYTOXAN®, NEOSAR®); 시타라빈(예컨대 CYTOSAR-U®); 리포솜성 시타라빈(예컨대 DepoCyt®); 다카르바진(예컨대 DTIC-Dome): 닥티노마이신(예컨대 COSMEGEN®); 다르베포에틴 알파(예컨대 ARANESP®); 리포솜성 다우노루비신(예컨대 DANUOXOME®); 다우노루비신/다우노마이신(예컨대 CERUBIDINE®); 데니류킨 디프티톡스(예컨대 ONTAK®); 덱스라족산(예컨대 ZINECARD®); 도세탁셀(예컨대 TAXOTERE®); 독소루비신(예컨대 ADRIAMYCIN®, RUBEX®); 리포솜성 독소루비신, 이를테면 독소루비신 HCL 리포솜 주사액(예컨대 DOXIL®); 드로모스타놀론 프로피오네이트(예컨대 DROMOSTANOLONE® 및 MASTERONE® 주사액); 엘리오트 B 용액(예컨대 엘리오트 B 용액®); 에피루비신(예컨대 ELLENCE®); 에포에틴 알파(예컨대 EPOGEN®); 에스트라무스틴(예컨대 EMCYT®); 에토포시드 인산염(예컨대 ETOPOPHOS®); 에토포시드 VP-16(예컨대 VEPESID®); 엑세메스탄(예컨대 AROMASIN®); 필그라스팀(예컨대 NEUPOGEN®); 플록스우리딘(예컨대 FUDR®); 플루다라빈(예컨대 FLUDARA®); 플루오로우라실, 이를테면 5-FU(예컨대 ADRUCIL®); 풀베스트란트(예컨대 FASLODEX®); 겜시타빈(예컨대 GEMZAR®); 겜투주맙/오조가미신(예컨대 MYLOTARG®); 고세렐린 아세테이트(예컨대 ZOLADEX®); 하이드록시우레아(예컨대 HYDREA®); 이브리투모맙/티욱세탄(예컨대 ZEVALIN®); 이다루비신(예컨대 IDAMYCIN®); 이포스파미드(예컨대 IFEX®); 이마티닙 메실레이트(예컨대 GLEEVEC®); 인터페론 알파-2a(예컨대 ROFERON-A®); 인터페론 알파-2b(예컨대 INTRON A®); 이리노테칸(예컨대 CAMPTOSAR®); 레트로졸(예컨대 FEMARA®); 류코보린(예컨대 WELLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); 레바미솔(예컨대 ERGAMISOL®); 로무스틴/CCNU(예컨대 CeeBU®); 메클로레타민/질소 머스타드(예컨대 MUSTARGEN®); 메게스트롤 아세테이트(예컨대 MEGACE®); 멜팔란/L-PAM(예컨대 ALKERAN®); 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린을 포함함(6-MP; 예컨대 퓨린THOL®); 메스나(예컨대 MESNEX®); 메토트렉세이트; 메톡살렌(예컨대 UVADEX®); 미토마이신 C(예컨대 MUTAMYCIN®, MITOZYTREX®); 미토탄(예컨대 LYSODREN®); 미톡산트론(예컨대 NOVANTRONE®); 난드롤론 펜프로피오네이트(예컨대 DURABOLIN-50®); 노페투모맙(예컨대 VERLUMA®); 오프렐베킨(예컨대 NEUMEGA®); 옥살리플라틴(예컨대 ELOXATIN®); 파클리탁셀(예컨대 PAXENE®, TAXOL®); 파미드로네이트(예컨대 AREDIA®); 페가데마제(예컨대 ADAGEN®); 페가스파르가제(예컨대 ONCASPAR®); 페그필그라스팀(예컨대 NEULASTA®); 펜토스타틴(예컨대 NIPENT®); 피포브로만(예컨대 VERCYTE®); 플리카마이신/미트라마이신(예컨대 MITHRACIN®); 포르피머 나트륨(예컨대 PHOTOFRIN®); 프로카르바진(예컨대 MATULANE®); 퀴나크린(예컨대 ATABRINE®); 라스부리카제(예컨대 ELITEK®); 리툭시맙(예컨대 RITUXAN®); 사르그라모스팀(예컨대 PROKINE®); 스트렙토조신(예컨대 ZANOSAR®); 수니티닙 말레에이트(예컨대 SUTENT®); 탈크(예컨대 SCLEROSOL®); 타목시펜(예컨대 NOLVADEX®); 테모졸로미드(예컨대 TEMODAR®); 테니포시드/VM-26(예컨대 VUMON®); 테스토락톤(예컨대 TESLAC®); 티오구아닌, 이를테면 6-티오구아닌(6-TG); 티오테파(예컨대 THIOPLEX®); 토포테칸(예컨대 HYCAMTIN®); 토레미펜(예컨대 FARESTON®); 토시투모맙(예컨대 BEXXAR®); 트라스투주맙(예컨대 HERCEPTIN®); 트레티노인/ATRA(예컨대 VESANOID®); 우라실 머스타드; 발루비신(예컨대 VALSTAR®); 빈블라스틴(예컨대 VELBAN®); 빈크리스틴(예컨대 ONCOVIN®); 비노렐빈(예컨대 NAVELBINE®); 및 졸레드로네이트(예컨대 ZOMETA®).
본원에 제공된 세포 및 바이러스(바이러스 요법을 위한 조합)의 투여 후에, 동시에 또는 전에 투여될 수 있는 예시의 체크포인트 억제제로는, 한정하는 것은 아니지만, 항-CTLA4 작용제, 항-PD-1 작용제 및 기타를 들 수 있고, 그것의 예는 다음과 같다:
Figure pct00008
본원에 제공된 바이러스 요법을 위한 조합과 투여된 추가적인 치료로는 하나 이상의 면역억제 약물, 예를 들어, 글루코코르티코이드(예컨대, 프레드니손, 덱사메타손, 하이드로코르티손); 칼시뉴린 억제제(예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리무스); mTOR 억제제(예컨대, 시롤리무스, 에베롤리무스); 메토트렉세이트; 레날리도미드; 아자티오프린; 머캅토퓨린; 플루오로우라실; 사이클로포스파미드; TNFα 차단 항체(예컨대, 인플릭시맙/레미케이드, 에타너셉트/Enbrel, 아달리무맙/Humira) 및 플루다라빈을 들 수 있다.
I. 치료될 암의 유형
본원에 개시된 방법은 고형 종양 및 혈액 악성종양을 포함한 임의의 유형의 암 또는 전이를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 종양으로는, 한정하는 것은 아니지만 방광 종양(bladder tumor), 유방 종양(breast tumor), 전립선 종양(prostate tumor), 암종(carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 담관암(biliary tract cancer), 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), CNS 암, 신경교종 종양(glioma tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 융모막 암종(choriocarcinom), 결장 및 직장 암(colon and rectum cancer), 결합 조직 암(connective tissue cancer), 소화기 암(cancer of the digestive system), 자궁내막 암(endometrial cancer), 식도암(esophageal cancer), 안암(eye cancer), 두경부암(cancer of the head and neck), 위암(gastric cancer), 상피내 신생물(intra-epithelial neoplasm), 신장암(kidney cancer), 후두암(larynx cancer), 백혈병(leukemia), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma), 흑색종(melanoma), 골수종(myeloma), 신경모세포종(neuroblastoma), 구강암(oral cavity cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 직장암(rectal cancer), 신장암(renal cancer), 호흡기 암(cancer of the respiratory system), 육종(sarcoma), 피부암(skin cancer), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 및 비뇨기계 암(cancer of the urinary system), 예컨대 림프육종(lymphosarcoma), 골육종(osteosarcoma), 유방 종양(mammary tumors), 비만세포종(mastocytoma), 뇌 종양(brain tumor), 흑색종(melanoma), 선편평세포 암종(adenosquamous carcinoma), 유암종 폐 종양(carcinoid lung tumor), 기관지샘 종양(bronchial gland tumor), 소기관지 선암종(bronchiolar adenocarcinoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancers), 섬유종(fibroma), 점액 연골종(myxochondroma), 폐 육종(pulmonary sarcoma), 신경육종(neurosarcoma), 골종(osteoma), 유두종(papilloma), 망막모세포종(retinoblastoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 미세신경교종(microglioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 파골세포종(osteoclastoma), 구강 신생물(oral neoplasia), 섬유육종(fibrosarcoma), 골육종(osteosarcoma) 및 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 생식기 편평 세포 암종(genital squamous cell carcinoma), 전파성 생식기 종양(transmissible venereal tumor), 고환 종양(testicular tumor), 정상피종(seminoma), 세르톨리 세포 종양(Sertoli cell tumor), 혈관주위세포종(hemangiopericytoma), 조직구종(histiocytoma), 녹색종(chloroma), 과립구성 육종(granulocytic sarcoma), 각막 유두종(corneal papilloma), 각막 편평 세포 암종(corneal squamous cell carcinoma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 흉막 중피종(pleural mesothelioma), 기저 세포 종양(basal cell tumor), 흉선종(thymoma), 위 종양(stomach tumor), 부신 선 암종(adrenal gland carcinoma), 구강 유두종증(oral papillomatosis), 혈관내피종(hemangioendothelioma), 낭선종(cystadenoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 장의 림프육종(intestinal lymphosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 및 폐 편평 세포 암종(pulmonary squamous cell carcinoma), 백혈병(leukemia), 혈관주위세포종(hemangiopericytoma), 눈의 신생물(ocular neoplasia), 포피 섬유육종(preputial fibrosarcoma), 궤양성 편평 세포 암종(ulcerative squamous cell carcinoma), 포피 암종(preputial carcinoma), 결합 조직 신생물(connective tissue neoplasia), 비만세포종(mastocytoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 림프종(lymphoma), 폐 선종증(pulmonary adenomatosis), 폐 육종(pulmonary sarcoma), 라우스 육종(Rous sarcoma), 망상내피증(reticulo-endotheliosis), 섬유육종(fibrosarcoma), 신모세포종(nephroblastoma), B-세포 림프종(B-cell lymphoma), 림프성 백혈병(lymphoid leukosis), 망막모세포종(retinoblastoma), 간 신생물(hepatic neoplasia), 림프육종(lymphosarcoma), 형질세포양 백혈병(plasmacytoid leukemia), 부레 육종(swimbladder sarcoma, 어류에서), 기회성 림프절염(caseous lumphadenitis), 폐 암종(lung carcinoma), 인슐린종(insulinoma), 림프종(lymphoma), 육종(sarcoma), 침샘 종양(salivary gland tumors), 신경종(neuroma), 췌장 섬 세포 종양(pancreatic islet cell tumor), 위 MALT 림프종(gastric MALT lymphoma) 및 위 선암종(gastric adenocarcinoma)을 들 수 있다.
일부 구현예에서, 종양은 전이성 흑색종(metastatic melanoma); 식도 및 위 선암종(esophageal and gastric adenocarcinoma); 담관암종(cholangiocarcinoma, 모든 단계); 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma, 모든 단계); 담낭암(gallbladder cancer, 모든 단계); 고급 점액성 충수암(high-grade mucinous appendix cancer, 모든 단계); 고급 위장 신경내분비 암(high-grade gastrointestinal neuroendocrine cancer, 모든 단계); 중피종(mesothelioma, 모든 단계); 연조직 육종(soft tissue sarcoma); 전립선암(prostate cancer); 신장 세포 암종(renal cell carcinoma); 폐 소세포 암종(lung small cell carcinoma); 폐 비-소세포 암종(lung non-small cell carcinoma); 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma); 대장암(colorectal cancer); 난소 암종(ovarian carcinoma); 간세포 암종(hepatocellular carcinoma); 및 교모세포종(glioblastoma)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 종양은 교모세포종(glioblastoma), 유방 암종(breast carcinoma), 폐 암종(lung carcinoma), 전립선 암종(prostate carcinoma), 결장 암종(colon carcinoma), 난소 암종(ovarian carcinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 중추신경계 종양(central nervous system tumor), 및 흑색종(melanoma)으로부터 선택된다.
J. 실시예
다음의 실시예는 예시의 목적으로만 포함되며 주제의 범주를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
세포 분리 및 배양
A. 지방-유래 줄기 세포(ADSC)
i. 지방 기질 혈관 분획의 회수 및 제조
1:400,000 에피네프린 및 7.4의 pH로 적정된 8.4% HCO3(일반적으로, 총 부피 60 cc 중의 5cc의 HCO3)을 포함한 0.5% 리도카인 0.5%를 함유한 국소 마취제를 대상체에게 투여한다. 그런 후 대상체를 Cell Surgical Network(Beverly Hills, CA, USA(CSN))사로부터의 상표명 Time-Machine® 장치 하에 입수 가능하고, 지방 가공 유닛(지방흡인을 위한 밀폐형 주사기) 및 2.5 - 3 mm 캐뉼라를 포함하는 세포 수득 및 폐쇄 시스템 수득 및 가공 시스템을 이용하여 지방흡인 과정을 진행한다. 바시트라신 연고 및 밴드 에이드를 압박 붕대와 함께 상처 위에 고정시킨다.
상부 외막 지방 기질 세포로부터 유래된 확장된 지방 줄기 세포를 본원에 제공된 실시예에 사용하였다. ADSC를 함유한 기질 혈관 분획(SVF)을 다음 프로토콜에 따라 폐쇄 시스템에서 제조한다:
a. 지방 줄기 세포를 수득하고 가공하기 위한 폐쇄 시스템, 예컨대 CSN TimeMachine®(CSN으로부터 입수 가능함)은 지방 수득물을 60cc TP-101 주사기(단일 사용 멸균 밀폐 지방 가공 주사기)로 추출한다.
b. 2800 rpm에서 3분 동안 원심분리한다.
c. 유리 지방산 및 파편(국소/혈액)을 TP-109 폐쇄 시스템을 통해 제거한다.
d. 25cc의 응축된 지방을 TP-102 주사기(SVF 가공 주사기)로 옮긴다.
e. 12.5 Wunsch 유닛의 효소(1 Wunsch 유닛 = 1000 콜라겐 분해 유닛(CDU))를 함유한 사전 가온한(38℃) 25cc의 Roche T-MAX® 타임 머신 가속화기(GMP급 콜라게나제)를 첨가한다.
f. 38℃에서 30 - 45분 동안 인큐베이션한다.
g. 200g에서 4분 동안 원심분리한다.
h. 바닥의 3 - 10 cc를 제외하고 상층액을 제거한다.
i. 50cc의 D5LR(락테이트 첨가된 링거액 및 5% 덱스트로스)을 콜라게나제 잔류물을 제거하기 위한 세척 용액으로서 첨가하고 200g에서 4분 동안 원심분리한다.
j. 총 3회 세척을 2회 더 반복한다.
k. 3 - 10 cc의 펠릿 콜렉션을 남겨두고 모든 상층액을 제거한다 - 이것은 기질 혈관 분획임.
l. SVF를 100-마이크론 필터를 통해 표지된 20cc 주사기로 옮긴다.
m. SVF 샘플을 수집하고 세포 수, 생존율에 대해 확인하고 군집이나 파편이 없는지를 확인한다.
n. 각 세포 현탁액의 분취액을 세포 분류, 내독소 테스트 및 멸균 염색을 위해 확보한다. 5 EU/kg/시간 이하의 내독소 단위 수준(EU) 및 음성 그램 염색 결과를 확인한 후 SVF를 주사용으로 방출한다.
o. 세포를 20 ml의 분리물에 재현탁한다. 세포 현탁액을 18-게이지 주사용 바늘을 통해 주사기 안으로 뽑아낸다; 최대 1억개의 생존 세포를 주사에 사용한다.
p. 그런 후 주사기를 밀봉 시편 백에 넣고 대상체 이름과 의료 기록 번호로 표지한다.
ii. 세포 배양
비-암 도너 기질 혈관 분획(SVF)을 상기에서 기술한 것과 같이, 고지된 서면 동의(국제 세포 수술 협회; IRB# ICSS-2016-024) 후에 IRB-승인 프로토콜의 일부로서 얻었다. 새로운 SVF를 플레이팅하여 밤새 부착시키고 다음날 세척하여 미부착 세포 및 파편을 제거하였다. 배지를 중간엽 줄기 세포(MSC)가 성장하기 시작하여 80%의 합류에 도달할 때까지 3-4일마다 교환하였다. 세포를 80% 합류로 팽창시키고 3-4일마다 TrypLETM Express(Life Technologies(1x), 페놀 레드 없음, Cat# 12604021, 3분, 37℃ 인큐베이터)를 사용하여 최대 10 계대까지 계대시켰다. 지방-유래 줄기 세포(ADSC)를 팽창시켜서 L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 중의 5% 인간 혈소판 추출물(Cook Regentec, Stemmulate, PL-SP-100)에 유지하였다. ADSC를 6명의 도너로부터 분리하고 RM20, RM35, RM47, RM48, RM58 및 BH21로 표지하였다.
iii. eGFP(향상된 녹색 형광 단백질)를 본질적으로 발현하는 지방-유래 줄기 세포의 생성
계대 0에서의 RM20 지방-유래 줄기 세포를 CMV 프로모터(UniProtKB - C5MKY7(C5MKY7_HCMV))의 제어 하에 eGFP(Clontech, Palo Alto, CA)를 발현하도록 조작하였다. eGFP를 함유한 렌티바이러스 벡터(VectorBuilder Inc.(Santa Clara, CA)로부터 입수 가능한 벡터 빌더)를 사용하여 eGFP를 본질적 발현을 위해 ADSC에 도입하였다. 10,000개의 eGFP-양성 세포를 계대 1 및 계속해서 계대 2에서 BioRAD S3 세포 분류기를 사용하여 분류하였다. eGFP 발현을 유세포 분석 및 Keyence 올인원 형광 현미경 BZ-X700 시리즈를 사용한 형광 현미경에 의해 확인하였다.
B. 암 세포
B16 F10 흑색종, A549 폐 암종 및 K562 세포를 10% 소 태아 혈청(Omega Scientific, FB-02, USDA 인증, 열 비활성화됨), 2 mM L-글루타민(ThermoFisher Scientific, 25030081, 100x) 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, 15140122, 100x)이 첨가된 DMEM(B16, A549)(Gibco, Cat. #: 11960069) 또는 RPMI 1640(K562)(Gibco, Cat. #: 21870092)에서 증식시켰다.
C. 말초혈 단핵 세포(PBMC)
PBMC를 IRB-승인 프로토콜의 일부로서 고지된 서면 동의(국제 세포 수술 협회; IRB# ICSS-2016-024) 후에 얻었다. PBMC를 표준 피콜 프로토콜(Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare, cat. # 95021-205)을 사용하여 분리하였다. PBMC를 8명의 도너로부터 분리하였고 BH62, RM20, RM47, RM48, RM52, RM53, SIBD01 및 SIBD02로 표지하였다.
D. 공동 배양
공동 배양은 테스트할 종양용해 바이러스, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 백시니아 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 아데노바이러스의 유무에 관계 없이 PBMC 또는 전혈과 같은 환자의 면역 세포를 줄기 세포 또는 종양 세포를 포함하는 세포-기반 전달 비히클/운반 세포와 함께 포함할 수 있다.
환자의 혈액을 분리하고 그것에서 PBMC 및 혈청을 분리하기 위해 가공한 후, 환자의 PBMC를 상이한 운반 세포와 함께, 종양용해 바이러스가 있거나 없이 공동 배양하여 운반 세포 적합성을 측정하였다. 대조군을 포함한, 테스트할 공동 배양은, 예를 들어: PBMC 단독 +/- 바이러스; 운반 세포 단독 +/- 바이러스; PBMC + 운반 세포 +/- 바이러스; 운반 세포 단독 + 바이러스 +/- 혈청(10-50%) +/- 보체의 열 또는 약물학적(코브라 독 인자 또는 동등물) 비활성화(환자 혈청 저항 스크리닝을 위한 것임); PBMC + 운반 세포 + 바이러스 +/- 혈청(10-50%) +/- 보체의 열 또는 약물학적(코브라 독 인자 또는 동등물) 비활성화(환자 혈청 저항 스크리닝을 위한 것임); 및 상기와 같은 PBMC 대신 헤파린 처리된 전혈(천연 환경 테스트를 위한 것임)을 포함하였다.
그런 후 공동 배양(세포 및/또는 상층액을 포함함)을 다양한 검정 및 테스트를 사용하여 바이러스 증폭 및 감염의 수준뿐만 아니라, 면역억제/면역자극 효과를 측정하였다. 이에 한정하는 것은 아니나: 표면 및 세포 내 다중파라미터 유세포 분석 또는 CyTOF (Cytometry by Time of Flight), 예를 들어; 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA); 효소-결합 면역반점(ELISPOT) 검정; 바이러스 플라크 검정(VPA); 정량적 PCR(qPCR); 생물발광 검정; 형광 현미경; 및 세포내 염색과 같은 동등한 분석을 포함한다.
유세포 분석은, 예를 들어, 게이팅 파라미터를 사용하여 T 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD4, CD8), NK 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, NKp46, CD16, CD56) 및 NKT 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD16, CD56, NKp46, aGalCer-CD1d 테트라머)를 포함한 특정 면역 세포 집단을 확인한다. 면역 반응을, 한정하는 것은 아니나: 다른 것들 중에서도 CD69, CD25, CD71, CD27(CD70L), CD154(CD40L), CD137(4-1BB), CD44, CD45RA, CD45RO, CD278(ICOS), CD127(IL-7RA), CD183(CXCR3), CD197(CCR7), CD39, CD73, CD314(NKG2D), PD-1, CTLA-4, IFNα/β, IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, IL-17, IL-6, CD107a, CD107b, TGFβ, 퍼포린, 그랜자임 B, IL-1a/IL-1b, G-CSF, RANTES, EXOTAXIN, MIP-1b, MCP-1, EGF, HGF, VEGF, IL-1RA, IL-7, IP-10, IL-2R, MIG 및 IL-8을 포함한 다양한 활성화/이펙터 기능 파라미터를 분석함으로써 평가한다.
예를 들어, PBMC를 ADSC(50 μl)와 함께 백시니아 바이러스(50 μl)가 있거나 없이 48시간 동안 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 및 총 200 μl R10 배지(10% FBS, L-글루타민 및 Pen/Strep이 첨가된 RPMI 1640)에서 공동 배양하였다(100 μl). 일부 실험에서, 바이러스(50 μl) 및 ADSC(50 μl)를 사전 혼합하고 궤도 진동기에서 37℃(인큐베이터)에서 1시간 동안 교반한 후, 100 μl의 혼합물을 어떠한 미결합 바이러스의 추가적인 세척 없이 PBMC에 첨가한다. 48시간의 인큐베이션 기간이 끝났을 때, 세포를 염색 및 유세포 분석을 위해 직접 회수하거나, 또는 필요에 따라, 추가적으로 4-5시간 K562 세포 또는 모넨신/브레펠딘 A(50 μl)를 포함한 PMA/이오노마이신(50 μl)으로 자극한 후 회수하였다.
실시예 2
대상체로부터의 면역 세포(말초혈 단핵 세포(PBMC))의 존재 및 부재 하에 바이러스 증폭 및 감염에 미치는 지방 유래 줄기 세포(ADSC)의 영향
특정 바이러스에 대해, 바이러스를 증폭시키는 운반 세포를 바이러스 요법을 위해 바이러스의 대상체에의 전달을 위한 후보로서 확인하였다. 이 실시예는 대상체로부터 유래된 면역 세포가 바이러스 증폭 및 감염을 용이하게 하는 운반 세포의 능력에 미치는 영향을 평가한다. 예를 들어, 인터페론(IFN)의 존재 또는 부재 및/또는 PBMC의 존재 또는 부재를 포함하여, 운반 세포에 의해 바이러스 감염 및 증폭에 영향을 미치는 인자를 존재하는 바이러스의 양을 측정하는 적절한 검정을 사용하여 평가한다. 이러한 검정으로는, 예를 들어, 바이러스 플라크 검정(VPA), qPCR(또는 존재하는 바이러스 DNA의 양을 측정하는 임의의 대체 검정), ELISA(바이러스-암호화된 또는 조작된 리포터 단백질 또는 효소, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, β-갈락토시다제를 측정하기 위한 것임), 및 생물발광 검정(한정하는 것은 아니지만, 루시페라제와 같은 바이러스-암호화된 발광 리포터 단백질을 측정하기 위한 것임)을 들 수 있다. 운반 세포, PBMC 및 종양 세포의 바이러스 감염은, 예를 들어, 유세포 분석 및 형광 현미경을 사용하여 모니터링될 수 있다.
A. 바이러스 플라크 검정(VPA)
실시예 1에서 기술한 것과 같은 공동 배양을 보관하고 환자-유래 면역 세포 및 세포-기반 전달 비히클의 상이한 조합을 포함한 상이한 조건 하에 바이러스 입자 증폭을 정량화하기 위해 VPA를 사용하여 분석할 수 있다.
바이러스-함유 샘플을 -80℃에서 보관하고 3배 동결(-80℃)/해동(+37℃) 사이클을 적용한 후 빙냉수에서 1분 간격으로, 1분 간격의 초음파 처리를 3회 적용하였다. 초음파 처리된 샘플을 백시니아 바이러스 감염 배지(2% FBS, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM)에서 연속적으로 희석한다. 플라크 검정을 24-웰 플레이트에서 이중 웰로 수행한다. 200,000개의 CV-1 원숭이 신장 세포를 웰당 1 mL D10 배지에 밤새 플레이팅한다. 상층액을 흡인하고 바이러스-함유 샘플의 10배 연속 희석을 CV-1 단층에 200 μL/웰로 적용한다. 플레이트를 1시간 동안 37℃(인큐베이터)에서 20분마다 최소한으로 진동하면서 인큐베이션한다. 1 mL CMC 배지가 세포 상부에 부드럽게 층이 형성되고 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션한다. 웰을 크리스탈 바이올렛 용액(1.3% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich, C6158), 5% 에탄올(순수 에탄올, 분자생물학 등급, VWR, 71006-012), 30% 포름알데하이드(37 % v/v 포름알데하이드, Fisher, cat # F79-9), 및 이중 증류수)으로 3 내지 5시간 동안 실온에서 토핑함으로써 세포를 고정시킨 후, 플레이트를 수돗물에 세척하고 밤새 건조시킨 후에 플라크를 계수한다. CMC 오버레이 배지를 15 g의 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 염(Sigma-Aldrich, cat. # C4888)을 오토클레이빙하고 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 및 5% FBS가 첨가된 1 L DMEM에서 밤새 실온에서 교반하면서 재현탁하고, 4℃에서 단기 보관함으로써 제조한다.
B. 형광 현미경
형광 표지된 세포, 예컨대 eGFP-표지된 ADSC(실시예 1), 및 형광 표지된 종양용해 바이러스, 예컨대, StemVac GmbH(Bernried, Germany)로부터 얻은 백시니아의 TK-삽입 Turbo-FP635 조작된 LIVP 스트레인인 TurboFP635-조작된 L14 바이러스를 사용하여 바이러스 감염을 모니터링한다. 바이러스 감염의 시간 경과 현미경 관찰을 형광 현미경을 사용하여, Keyence 올인원 형광 현미경 BZ-X700 시리즈 상에서 수행한다. 예를 들어, eGFP를 발현하도록 조작된 ADSC를 GFP 채널을 따르게 하는 한편(1초 노출), TurboFP635-조작된 LIVP 바이러스로의 바이러스 감염을 TRITC 채널 상에서 모니터링한다(3초 노출). 4x 또는 10x 배율의 이미지를 수집하고 명시야(상 대조, 1/50초 노출)와 오버레이한다.
C. 인터페론(IFN)의 존재 및 부재 하에 ADSC(지방-유래 줄기 세포)에 의한 백시니아 바이러스 증폭의 평가
백시니아 바이러스를 증폭시키고 인터페론의 보호성 항-바이러스 효과에 반응하는 ADSC의 능력을 L14 백시니아 바이러스(VV)(TK-삽입된 Turbo-FP635 조작된 LIVP 스트레인)를 사용하여 평가하였다. 백시니아 바이러스(L14 VV)를 StemVac GmbH(Bernried, Germany)로부터 얻었다. 50,000개의 RM35 ADSC를 12-웰 플레이트에서 10,000 pfu(플라크 형성 단위)의 L14 VV로, 감염과 동시에 첨가되거나, 또는 24시간 전에(IFNβ/γ 24시간) 증가하는 용량(0.08 ng/mL, 0.3 ng/mL, 1.3 ng/mL, 5 ng/mL 및 20 ng/mL)의 IFNγ(Peprotech, cat. # AF3000220UG, 20 mg 동결건조되고, 0.1% FBS가 첨가된 1x PBS 중의 대략 1000X 스톡으로부터 20 μg/mL로 희석되고, -80℃에서 보관됨) 또는 IFNγ(Peprotech, cat# AF30002B5UG, 5 μg 동결건조되고, 0.1% FBS가 첨가된 1x PBS 중의 대략 1000X 스톡으로부터 5 μg/mL로 희석되고, -80℃에서 보관됨)의 존재 하에 감염시켰다. 형광 영상화 및 플라크 검정을 감염 후 48시간째에 수행하였다.
플라크 검정 분석의 결과를 표 1에 제시한다. 감염 후 48시간째의 형광 영상화 및 플라크 검정은 타입 I 및 타입 II 인터페론이 백시니아 바이러스(VV) 감염에 대해 ADSC를 용량-의존성 방식으로 보호하는 것을 보여준다. 이것은 이들 세포가 형질전환되지 않고 기능성 항-바이러스 인터페론 반응을 가지는 것과 일치한다. 바이러스 감염으로부터의 보호는 바이러스 노출되기 24시간 전에 인터페을 첨가한 경우 보다 바이러스 노출과 동시에 첨가되었을 때 덜 효율적이었다.
타입 I 및 II 인터페론 결과의 조합이 VV 감염에 대해 증가된 보호를 초래하였는지를 평가하기 위하여, 50,000개의 RM35 ADSC를 24시간 동안 증가하는 용량(0.02, 0.08, 0.3, 1.3, 5, 20 및 80 ng/mL)의 IFNγ 및 IFNβ 단독으로 또는 조합으로, 10,000 pfu의 L14 VV로의 감염 전에 사전처리하였다. 플라크 검정 결과(표 2)는 타입 I 및 II 인터페론의 조합이 보호를 추가로 향상시키지 않는 것을 보여준다.
그런 후 IFNγ-유도 항-바이러스 상태의 안정성을 측정하였다. 100,000개의 RM20-eGFP ADSC(실시예 1 참조)를 12-웰 플레이트에서 with 100,000 pfu의 L14 VV로 감염시키고 최대 4일 동안 인큐베이션하였다. ADSC는 미처리((-) IFNγ 대조군)이거나, 또는 20 ng/mL의 IFNγ로 24시간 동안 사전처리하였다. IFNγ를 바이러스 감염 전 1, 2, 또는 3일 전에 투여하였다. 시간 경과 형광 이미지 분석을 사용하여 바이러스 감염의 진행을 시각화하였고, 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간째의 영상을 택하였다. IFNγ((-) IFNγ 대조군)의 부재 하에 바이러스로 감염된 ADSC의 형광 영상화는 미감염(eGFP+/녹색) ADSC, 죽은 감염된 ADSC(TurboFP635/적색), 및 살아있는 감염된 ADSC(황색)을 보여주는데, 24-96시간으로부터 죽은 감염된 세포의 수가 증가하며, 인터페론의 부재 하에 바이러스가 ADSC에 대해 성공적인 감염을 보임을 입증한다. IFNγ에 대한 24시간 노출 후 바이러스로 감염된 ADSC의 형광 영상화는 적색 또는 황색 세포가 없는 것으로 나타났으며, 인터페론의 사전처리가 바이러스 감염을 방지하는 것을 나타낸다.
플라크 분석을 상기에서 기술한 것과 같이, 바이러스 단독(ADSC 없음) 대조군 및 (-)IFNγ 대조군으로 수행하였다. 표 3에서 나타낸 것과 같이, (-)IFNγ 대조군만이 바이러스 증폭을 보였다. ADSC는 백시니아 바이러스 감염에 고도로 허용적이었다. 플라크 분석의 결과는 ADSC의 바이러스 증폭 능력이 인터페론이 없는 대조군 그룹과 비교하여, 인터페론 사전처리에 의해 폐지되었음을 나타낸다. 인터페론 치료에 의해 유도된 항-바이러스 상태는 안정적이었고, IFNγ에 대한 일시적인 24시간 노출 후 수일 동안 지속되었다. 그러므로, 타입 I 및 타입 II 인터페론 반응은, 바이러스 감염에 대해 ADSC를 보호하고 그것의 면역억제 능력을 강력하게 개선하는 한편, 백시니아 바이러스를 생체내에서 전달하고 증폭시키는 그것의 능력을 또한 손상시키는 효과를 가진다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
D. 운반 세포/PBMC 공동 배양에서의 바이러스 증폭 및 감염
동종 PBMC의 존재 하에 ADSC(운반 세포)에 의한 백시니아 바이러스(VV)의 증폭 잠재력을 평가하기 위하여, 50,000개의 RM20-eGFP ADSC를 5,000 또는 50,000개의 L14 VV 단독으로, 또는 1 x 106개의 동종 PBMC(BH62로 표시된 혈액 도너로부터 유래함)의 존재 하에 최대 48시간 동안 감염시켰다. 오버레이 형광 영상화 및 바이러스 플라크 검정을 사용하여, 각각, 동종 ADSC + PBMC의 공동 배양으로부터의 결과를 단독 배양된 ADSC 및 단독 배양된 PBMC와 비교함으로써 백시니아 바이러스 감염 및 증폭을 평가하였다.
그 결과를 표 4에 나타낸다. ADSC 단독은 VV 감염 및 증폭에 대해 허용적인 반면, PBMC 단독은 VV 감염 또는 증폭을 보이지 않는다. 공동 배양은 ADSC가 동종 PBMC의 존재 하에 백시니아 바이러스를 증폭시킬 수 있고, 동종 PBMC의 존재 하에, 전체 바이러스 방출 (Output)은 별도로 감염되었을 때의 ADSC 및 PBMC의 조합된 방출에 비해 증가한 것을 입증하였고, 이것은 ADSC가 백시니아 바이러스 감염에 대해 PBMC를 감작시킨 것을 나타낸다.
Figure pct00012
실시예 3
운반 세포 + 종양 Cell 공동 배양에서의 바이러스 증폭 및 감염
상이한 종양/암 세포 유형의 존재 하에 종양용해 바이러스의 증폭 및 감염을 평가하여 특정 운반 세포 및 종양용해 바이러스 조합이 종양/암 세포 종양용해에 효과적인지를 측정한다. 이런 방식으로, 종양을 바이러스 감염에 대해 내성이거나 허용적인 것으로서 확인할 수 있고, 운반 세포에 의한 종양 세포로의 바이러스 전달의 임의의 향상이 평가될 수 있다. 다른 인자, 예컨대 IFNγ 사전처리의 역할, 운반 세포 용량 및 운반 세포에 의한 가용성 인자의 분비를 또한 평가할 수 있다. 이 실시예는 예시의 바이러스, 백시니아 바이러스를 예시의 암 세포주, B16 흑색종 세포에 전달하는 능력에 미치는 예시의 운반 세포 유형, ADSC의 영향을 평가한다.
A. 내성 및 허용적 종양 세포주의 ADSC-촉진된 종양용해
예를 들어, 형광 현미경, 플라크 검정 분석 및 유세포 분석을 사용하여 백시니아 바이러스의 종양/암 세포에의 전달을 향상시키기 위하여 ADSC를 사용하는 효과를 측정하였다. 바이러스를 내성 B16 F10 흑색종 세포에 보다 효과적으로 전달하기 위한 ADSC의 사용을 평가하였다. 바이러스 감염에 대해 고도로 허용적인 A549 세포를 비교에 포함하였다.
1 x 106개의 B16 세포 또는 A549 세포를 RM20 도너로부터의 2 x 105개의 eGFP-표지된 ADSC(실시예 1 참조)와 함께 12-웰 플레이트에서 공동 배양하고 1x105 pfu의 L14 VV(B16에 대한 MOI=0.1)로 감염시키고 72시간 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 대조군에는 B16 세포 단독, A549 세포 단독, eGFP-표지된 ADSC 단독, 또는 eGFP ADSC와 공동 배양된 B16 세포가 포함되지 않았다. 형광 이미지를 24시간, 48시간 및 72시간 인큐베이션 기간 후에 캡쳐하였다. 단독 배양된 내성 B16 세포와 단독 배양된 허용적 A549 세포 사이의 비교는 형광 이미지에서 적색 세포의 존재에 의해 나타는 바, A549 세포에서의 극적으로 더 높은 바이러스 감염 수준을 보였다. 시각화하고 미표지된 B16 세포(회색)과 구별하기 위해 eGFP-표지된 ADSC(녹색)을 사용하여, 융합 환경(confluent environments)에서 ADSC가 함께 클러스터를 형성하고 미표지된 흑색종 세포를 유인하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 바이러스의 부재 하에, 녹색 줄기 세포 클러스터를 72시간 후에 관찰하였다. 바이러스의 존재 하에, 이런 유인은 집중적으로 적색의 감염된 B16 세포에 의해 둘러싸인 고도로 감염된 황색 ADSC 클러스터의 형성을 초래하였다. 이들 효과는 내성 쥐과 B16 흑색종 세포의 단층의 종양용해를 극적으로 개선하는 것과 관련이 있었다.
이들 결과는 인간 ADSC가 L14 백시니아 바이러스의 증대된 증폭을 통해 내성 B16 흑색종 세포의 종양용해를 촉진하는 것을 나타냈다. 내성 B16 세포의 개선된 표적화가 또한 다른 도너(RM35)로부터 유래된 ADSC로 관찰되었다. 1 x 106개의 B16 세포를 200,000개의 RM35 ADSC와 함께 공동 배양하였고 100,000 pfu의 L14 VV로 최대 4일 동안 감염시켰다. 형광 영상화 분석은 인간 RM35 ADSC가 또한 시험관 내에서 내성 쥐과 B16 흑색종 세포의 종양용해를 촉진하였음을 나타냈다.
백시니아 바이러스 증폭의 플라크 검정 분석을 상기에서 기술한 것과 같이 B16 세포 단독, A549 폐 암종 세포 단독, B16 + A549 공동 배양, ADSC 단독, 및 B16 + ADSC 공동 배양에 대해 수행하였다. 결과를 표 5에 요약한다. A549 폐 암종 세포를 고도로 백시니아 바이러스 허용적인 양성 대조군으로서 사용하였고 ADSC 단독과 유사한 바이러스 증폭 수준을 나타냈다. B16 + A549 또는 B16 + ADSC 공동 배양으로부터 회수된 바이러스 역가는 별도로 감염된 개별 세포로부터의 조합된 바이러스 방출을 초과하였고, 고도로 허용적인 암 세포 및 ADSC는 둘 다 백시니아 바이러스로의 감염에 대해 내성인 흑색종 세포를 감작할 수 있음을 보여주었다.
Figure pct00013
B. 내성 종양 세포주의 ADSC-촉진된 종양용해에 미치는 IFNγ 사전처리의 영향
바이러스 증폭에 미치는 IFNγ 사전처리의 영향을 테스트하였다. 200,000개의 RM20-eGFP 세포(0.2 M)를 20 ng/mL의 IFNγ로 24시간 동안 사전처리한 후, 200,000(0.2 M)개의 RM20 ADSC, A549 세포 또는 B16 세포와 공동 배양하고, 상기 기술한 것과 같이 L14 백시니아 바이러스로 감염시켰다. 형광 이미지를 24시간, 48시간 및 72시간 인큐베이션 기간 후에 캡쳐하였다. 결과는 IFNγ 사전처리가 상대적으로 내성인 B16 세포의 존재 하에서만 바이러스 감염으로부터 ADSC를 보호하지만, 고도로 허용적인 A549 세포의 존재하에서는 그렇지 않은 것을 보여주었다. 바이러스로부터 ADSC의 보호로 인해, ADSC의 IFNγ 사전처리는 B16 단층의 종양용해를 손상시켰고, 이것은 관찰된 항종양 잠재력이 ADSC에 의한 바이러스의 증폭에 주로 의존하는 것을 나타낸다.
C. B16 세포의 종양용해에 미치는 운반 세포 수/용량의 영향
B16 단층의 종양용해에 미치는 줄기 세포 수/용량의 영향을 평가하였다. 1 x 106개의 B16 세포를 200,000(0.2 M)개 또는 20,000(0.02 M)개의 RM20-eGFP ADSC와 함께 공동 배양하고, 상기 기술된 것과 같이 L14 VV로 감염시키고, 형광 이미지를 24시간, 48시간 및 72시간째에 캡쳐하였다. 결과는 ADSC의 불충분한 수(2% 이하)가 B16 단층의 불완전한 종양용해로 이어지는 것을 보여주며, 이것은 관찰된 항종양 잠재력이 ADSC에 의한 바이러스의 증폭에 좌우되는 것을 확인시켜준다.
D. 내성 쥐과 B16 종양 세포 및 인간 K562 암 세포의 종양용해에 미치는 운반 세포에 의해 분비된 가용성 인자의 영향
i. 내성 종양 세포의 감작
내성 종양 세포의 성공적인 종양용해는 ADSC에 의한 바이러스 증폭뿐만 아니라, 바이러스 감염에 대한 종양 세포의 감작에 기인할 수 있다. 감작이 내성 종양 세포의 종양용해에서 담당하는 역할을 측정하기 위하여, ADSC에 의해 분비된 가용성 인자의 영향을 ADSC 세포 대신 ADSC로부터의 상층액을 첨가함으로써 평가하였다. 10,000개의 B16 세포를 상기에서 기술한 것과 같이 96시간 동안 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 L14 VV로 0.1의 MOI로 삼중으로 감염시켰다. 인간 RM20 ADSC로부터의 상층액을 첨가하고 B16 세포의 바이러스 감염에 미치는 효과를 TurboFP635 형광을 사용하여 분석하고 감염 후 72시간째에 플라크 검정에 의해 정량화하였다. 플라크 검정 결과를 표 6에 나타낸다. 형광 이미지 및 플라크 검정 결과는 ADSC로부터의 상층액의 첨가가 내성 B16 세포에서 바이러스 증폭을 초래한 것을 나타내며, 이것은 ADSC가 바이러스 감염에 대해 내성 B16 종양 세포를 감작시킨 것을 나타낸다.
Figure pct00014
유사한 실험에서, 상이한 4개의 ADSC 도너(RM20, RM35, BH21 및 RM58)로부터의 상층액을 L14 VV로 0.1의 MOI에서 감염된 B16(10,000개) 및 K562(100,000개) 세포에 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 96시간 동안 첨가하였다. 형광 영상화 분석은 상이한 ADSC 도너 유래의 상층액이 쥐과 B16 세포(murine B16 cells) 및 극히 내성인 인간 K562 암 세포의 유사한 감작을 제공했음을 나타냈다.
ii. 2개의 상이한 백시니아 바이러스 스트레인 감염에 대한 ADSC-매개 B16 세포의 감작 비교: L14 VV 및 WT1 VV
WT1(ACAM2000)은 L14 VV보다 더 높은 증폭 잠재력 및 더 큰 항-바이러스 면역 회피 능력을 가진 백시니아 바이러스의 야생형 티미딘 키나제(TK)-양성 와이어스(Wyeth) 스트레인이다. L14 VV에 의한 감염에 대한 내성 B16 세포의 ADSC-매개 감작 잠재력을 WT1 VV에 의한 감염에 대한 세포의 감작 잠재력과 비교하였다. 4개의 ADSC 도너(RM20, RM35, BH21 및 RM58)로부터의 상층액을 L14 VV 또는 WT1 VV 중 어느 하나로 0.1의 MOI에서 96시간 동안 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 감염된 10,000개의 B16 세포에 첨가하였다. B16 세포에서 L14 및 WT1 백시니아 바이러스 증폭의 플라크 검정 분석을 이전에 기술한 것과 같이 수행하였다. 세포 생존율을 MTT 검정을 사용하여 측정하였다. MTT(테트라졸륨 염료; 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드) 검정은 세포 대사 활성을 평가하기 위한 잘 알려져 있는 비색 검정이다. NAD(P)H-의존성 세포 산화환원 효소는, 정의된 조건 하에서, 존재하는 생존 세포의 수를 반영한다. 검정은 테트라졸륨 염료 MTT의 퍼플 포르마잔 염료로의 환원을 평가한다. MTT(ThermoFisher, cat. # M-6494, 1x PBS 중의 5 mg/mL 스톡, -20℃에서 유지됨)를 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 세포(10 μL 내지 100 μL 세포/웰)에 5 μg/mL의 최종 농도로 첨가하고, 1-2시간 동안 37℃(인큐베이터)에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 100 μL의 아이소프로판올:1M HCl(24:1, 10% Triton X100이 첨가됨, Sigma-Aldrich, X100-100ML)을 첨가하고 포르마잔을 용해시키기 위해 격렬하게 피펫팅함으로써 용해시켰다. 플레이트를 Tecan Infinite® 200 Pro 상에서 판독하고 MTT 신호를 1시간 이내에 650 nm에서의 OD 값을 570 nm에서의 OD 값으로부터 뺌으로써 측정하였다. MTT가 없는 세포 또는 블랭크/배지 웰을 바탕값 신호를 제거하기 위한 대조군으로서 포함시켰다.
표 7에 나타낸 플라크 분석의 결과는 ADSC 상층액의 존재 하에 증가하는 평균 pfu/샘플의 전체적인 경향을 보여주며, 이것은 ADSC 상층액이 L14 및 WT1 VV 감염에 대해 B16 세포를 감작시킬 수 있음을 나타낸다. MTT 검정 결과(표 8)는 L14 또는 WT1 VV로 감염된 B16 세포의 생존에 미치는 ADSC 상층액 단독의 중요한 영향의 부재를 보여준다.
Figure pct00015
Figure pct00016
iii. ADSC 상층액 또는 ADSC의 존재 하에 K562 세포의 바이러스 감염
100,000개의 K562 세포를 TurboFP635+(형광 표지됨) L14 VV로 0.1의 MOI에서 96시간 동안 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 감염시키고 4개의 상이한 ADSC 도너(RM20, RM35, BH21 및 RM58)로부터의 상층액을 첨가하였다. 유세포 분석을 수행하고 L14 VV로 감염된 K562 세포의 백분율 및 중간 형광 세기(MFI)를 기록하였다. 플라크 분석을 사용하여 바이러스 역가를 측정하고, MTT 검정을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 결과는 감염된 세포(표 9), TurboFP635+ MFI(표 10), 및 바이러스 역가(표 11)의 경미한 증가를 보였지만, 고도로 내성인 K562 세포의 전체 생존에 미치는 중요한 영향을 보이지 않았고, 이것은 K562 세포의 ADSC 상층액-강화된 감염을 입증한다.
결과는 ADSC 상층액 단독이 바이러스 감염에 대해 K562 세포를 감작할 수 있지만, 상당한 종양용해를 초래하지 않는 것을 보여준다. ADSC의 영향을 ADSC 상층액의 영향과 비교하였다. 100,000개의 K562 세포를 L14 VV로 0.1의 MOI로 감염시켰지만, ADSC 상층액 대신, K562 세포를 5,000 또는 20,000개의 RM20-eGFP ADSC와 삼중으로 공동 배양하였다. 형광 영상화 및 유세포 분석은 녹색 형광 ADSC가 미표지된/회색 K562 세포를 유인하고 감염된 K562 세포의 백분율을 극적으로 증가시키는 것을 보여준다. 고도로 내성인 K562 세포(표 12)의 강화된 감염성에도 불구하고, ADSC는 결국 그것의 전체 생존을 근절하거나 상당히 영향을 나타내지 못하였고(표 13), 이것은 감염을 강화시키는 ADSC의 능력과는 별개로 백시니아 바이러스를 증폭시키는 K562 세포의 최소한의 능력과 일치한다.
결과는 ADSC가 바이러스를 증폭시키고(대략 10,000배 또는 5,000 pfu/세포) 그것을 종양 세포로 확산시키는 두 가지의 특유한 특성을 가지는 것을 나타낸다. 이것은 일부 형태의 화학적 유인뿐만 아니라 더 높은 국소 감염 다중도(MOI)로 인한 것일 수 있다. 이 효과는 적어도 부분적으로는 ADSC의 상층액에 존재하는 미확인 가용성 인자의 분비로 인한 것이다. 감염된 B16 및 K562 세포의 빈도 및 바이러스 증폭에 미치는 ADSC 상층액의 관찰된 강화 효과는 상대적으로 작았고(대략 2배), 이것은 내성 종양의 성공적인 치료법이 ADSC 및 그것의 상층액의 감작 및 증폭 특성뿐만 아니라, ADSC 자체가 쥐과 및 인간 종양 세포를 모집(recruit)하고 이들 세포의 감염을 강화시키는 능력을 필요로 하는 것을 나타낸다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 4
대상체를 치료하기 위하여 종양용해 바이러스/운반 세포 조합을 확인하기 위한 면역 파라미터의 분석
본원에서 기술된 것과 같이, 최적의 종양용해 바이러스/세포-기반 전달 비히클 조합은 치료될 대상체에서 바이러스 증폭 및 종양용해를 용이하게 하는 한편, 바이러스를 종양에 전달하는 중에 면역 활성화를 방지하고 바이러스-유도 면역 활성화를 억제한다. 이전의 실시예는 운반 세포, 예컨대 ADSC를 그것의 바이러스 증폭 잠재력, 종양/암 세포를 바이러스에 의한 감염에 대해 감작시키는 능력, 및 바이러스에 의한 종양용해를 용이하게 하는(예컨대, 원격 종양/암 세포를 모집함으로써) 능력에 대해 평가하는 방법을 입증한다.
이 실시예는 종양용해 바이러스를 종양/암 세포에 전달하기 위한 기성품 세포-기반 전달 비히클의 치료 잠재력을 제한할 수 있는 대상체-특이적 면역 제한을 평가한다. 이러한 제한으로는, 예를 들어, 바이러스-유도 및/또는 동종 운반 세포-유도 면역 활성화, 예컨대, 예를 들어, IFNγ 및 세포독성 반응을 들 수 있다. 이들 반응은 부적절하게 매칭된 대상체/수령체의 선천성(NK, NKT) 및 적응성(T) 면역 세포로부터 기원한다. 이 실시예는 운반 세포가 ADSC와 같이 자가로 또는 동종으로 투여될 때 일반적으로 바이러스 치료법에 대해 양호한 전달 비히클의 요구조건을 충족하고(즉, 그것은 바이러스 증폭을 촉진하고 바이러스 및/또는 운반 세포에 대한 선천성 및/또는 적응성 면역 반응의 회피 및/또는 억제를 입증함), 그럼에도 불구하고 때때로 특정 동종 환경에서 덜 효율적인 것을 입증한다.
운반 세포/종양용해 바이러스에 대한 대상체의 잠재적 면역 반응을 평가하기 위하여, 운반 세포(자가 또는 동종), 종양용해 바이러스 및 대상체-유래 면역 세포(예컨대, PBMC, PBMC + 혈장/혈청, 또는 적혈구 용해가 있거나 없는 전혈)를 공동 배양한다. 종양용해 바이러스/동종 세포-기반 전달 비히클 조합의 면역 유도 효과, 및 병행 동종/자가 세포-기반 운반체-유도 면역억제를, 예컨대, 효소-결합 면역반점(ELISPOT) 또는 유세포 분석(또는 예를 들어 CyTOF와 같은 동등물)을 사용하여, T 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD4, CD8), NK 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, NKp46, CD16, CD56) 및 NKT 세포(예컨대, 한정하는 것은 아니지만, CD3, CD16, CD56, NKp46, aGalCer-CD1d 테트라머)를 포함하는 상이한 면역 세포 집단을 확인하는 마커의 패널, 뿐만 아니라 한정하는 것은 아니지만: 예를 들어, CD69, CD25, CD71, CD27(CD70L), CD154(CD40L), CD137(4-1BB), CD44, CD45RA, CD45RO, CD278(ICOS), CD127(IL-7RA), CD183(CXCR3), CD197(CCR7), CD39, CD73, CD314(NKG2D), PD-1, CTLA-4, IFNα/β, IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, GM-CSF, IL-17, IL-6, CD107a, CD107b, TGFβ, 퍼포린, 그랜자임 B, IL-1a/IL-1b, G-CSF, RANTES, EXOTAXIN, MIP-1b, MCP-1, EGF, HGF, VEGF, IL-1RA, IL-7, IP-10, IL-2R, MIG 및 IL-8을 포함한 활성화/이펙터 기능 마커의 패널을 토대로 평가한다.
A. 자가 및 동종 환경에서 ADSC의 면역억제 특성
면역 장벽을 극복하는 ADSC의 잠재력을 평가하기 위하여, 자가 또는 동종 인간 PBMC의 존재 하에 NK 세포를 억제하는 그것의 능력을 테스트하였다. 250,000개의 새롭게 분리한 RM20 PBMC를 48시간 동안 10,000 또는 100,000개의 자가(RM20) 또는 동종(RM35) ADSC와 함께 공동배양하였다. PBMC를 ADSC(50 μL)와 48시간 동안 96-웰 편평 바닥 플레이트 상에서 및 총 200 μL의 R10 배지(10% FBS, L-글루타민 및 Pen/Strep이 첨가된 RPMI 1640)에서 공동 배양하였다(100 μL). 48시간 인큐베이션 기간이 끝났을 때, 공동 배양을 250,000개의 K562 세포 또는, 필요에 따라 모넨신/브레펠딘 A(50 μL)를 포함한 PMA/이오노마이신(50 μL)으로의 NK 세포의 추가적인 4시간 자극을 적용하였다.
NK 및 T 세포의 빈도(백분율), 및 NK 세포 활성화 및 NK 세포독성 활성의 전도를 PBMC 단독, PBMC + 10,000개 또는 + 100,000개의 자가 ADSC, 및 PBMC + 10,000개 또는 + 100,000개의 동종 ADSC에 대한 유세포 분석을 사용하여 평가하였다. 유세포 분석을 위해, PBMC 및 ADSC의 공동 배양을 피펫팅함으로써 회수하고 V-자형 바닥 플레이트에 옮겼고, 플레이트에서 FACS 완충액(1% FBS를 포함한 1x PBS)으로 세척하고 4℃에서 30분 동안 다음의 항체 칵테일이 첨가된 FACS 완충액에서 표면 염색하였다: 항-인간 CD3-PerCP/Cy5.5(BioLegend, cat. # 300328, 1:50), 항-인간 CD335 또는 NKp46-PE(BioLegend, cat. # 331908, 1:50), 항-인간 CD69-APC(BioLegend, cat. # 310910, 1:50). FACS 완충액은 또한 생존 프로브(ThermoFisher Scientific, LIVE/DEAD 고정 가능한 바이올렛 죽은 세포 염색 키트, 405 nm 여기에 대해, cat. # L34964, 1:1000)를 함유하였다. 염색 후에, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 1x PBS 중의 2% PFA로 15분 동안 실온에서 고정시키고, 다시 FACS 완충액으로 세척하여 PFA를 제거하고 BD FACSAria II 상에서 분석하였다. 세포독성 기능을 평가하기 위하여, 항-인간 CD107a-AlexaFluor 488(BioLegend, cat. # 328610)을 직접 공동 배양에 회수 및 표면 염색 전 5시간 전에 1:20(10 μl/웰)으로 첨가하고, 이어서 모넨신을 1시간 후에 1:1000으로 첨가하고, 추가로 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다(BioLegend, cat. # 420701-BL, 1000X).
NK 및 T 세포의 백분율을 자가 및 동종 공동 배양에서 측정하고 PBMC 단독 대조군에 비교하였다. 결과를 하기 표 14에 요약한다. 자가 및 동종 환경에서, ADSC-매개 면역억제는 NK 및 T 세포의 빈도에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
Figure pct00022
게이팅된 살아있는 CD3-NKp46+ NK 세포에 대한 CD69 상향조절을 사용한 NK 활성화의 유세포 분석(표 15)은 PBMC가 자가(RM20) 또는 동종(RM35) ADSC와 공동 배양된 후 K562 세포 또는 PMA/이오노마이신으로 자극된 후에 CD69가 상향조절된 것을 보여준다. CD107a 표면 노출(표 15)을 사용한 NK 세포 세포독성 기능의 유세포분석은 PBMC와 자가 및 동종 ADSC와의 공동 배양에서 CD107a의 상향조절을 보여준다. 그러므로, ADSC와의 PBMC 공동 배양은 K562 표적 세포에 대한 노출에 의해 자극된 NK 세포의 면역 반응에 대해 상당한 용량-의존성 면역억제 효과를 입증한다. 면역억제 효과를 자가 및 동종 환경에서 관찰하였고, 이것은 ADSC가 자가 및 동종 환경에서 NK 세포를 억제할 수 있음을 입증한다.
Figure pct00023
B. 바이러스-유도 T, NK 및 NKT 세포 반응의 동종 줄기 세포 억제
면역 장벽을 극복하는 동종 줄기 세포의 잠재력은 바이러스-유도 T, NK 및 NKT-유사 세포 반응을 억제하는 그것의 능력과 상관이 있다. NK, T 및 NKT 세포에 의해 매개된 바이러스-유도 반응을 특이적으로 억제하는 RM35 도너로부터의 동종 ADSC의 능력을 2개의 PBMC 도너의 새로운 집단에서 테스트하였고, 가능한 환자-특이적 제한을 밝혔다.
상이한 2개의 혈액 도너(RM47 및 RM48)로부터의 250,000개의 PBMC(100 μL)를 400; 2,000; 10,000 또는 60,000개의 동종 RM35 ADSC(50 μL)와 48시간 동안 96 웰 편평 바닥 플레이트 상에서, 총 200 μL의 R10 배지(10% FBS, L-글루타민 및 Pen/Strep이 첨가된 RPMI 1640)에서, 10,000 pfu(50 μL)의 WT1 VV(ACAM2000)의 존재 또는 부재 하에 공동 배양하였다. 게이팅된 살아있는 T, NK, 및 NKT-유사 세포의 유세포 분석을 수행하여 단독 배양된 PBMC(대조군), WT1 VV와 배양된 PBMC(ADSC 없음), 바이러스 없는 PBMC + 동종 ADSC 공동 배양, 및 WT1 VV가 포함된 PBMC + 동종 ADSC 공동 배양에서 각각의 면역 세포 유형으로부터 CD69+ 활성화된 세포의 백분율을 측정하였다.
결과를 하기 표 16에 요약한다. 게이팅된 살아있는 T, NK, 및 NKT-유사 세포의 유세포 분석은 CD69+ 활성화된 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 백분율이 모두, ADSC 없이 배양된 WT1 VV + PBMC와 비교하여 WT1 VV + PBMC + 동종 ADSC 공동 배양에서 극적으로 감소하였음을 보여준다. 이들 결과는 동종 RM35 ADSC가 백시니아 바이러스-유도 선천성 및 적응성 면역 반응을 억제할 수 있음을 입증한다.
48시간 공동 배양 기간이 끝났을 때 250,000개의 K562 세포로의 4시간 자극을 사용하여 동종 줄기 세포의 면역억제 잠재력을 평가하였다. T 세포에 비해, NK 세포는 주요 반응 집단이었고, 바이러스와 저용량의 줄기 세포의 조합이 NK 세포의 80% 이상의 활성화를 초래하였다. 더 낮은 용량의 줄기 세포는 면역억제 및 증가된 바이러스-유도 면역 반응에는 불충분하였는데, 상당히 증대된 바이러스 증폭을 반영할 가능성이 있다. 그러나, 더 높은 용량의 ADSC는 용량-의존성 양식으로 더 약한 백시니아 바이러스-유도 T 세포 반응의 강력한 억제를 제공하였고, 이것은 줄기 세포-매개 면역억제가 증대된 바이러스 증폭의 면역 자극 효과를 극복하는 것을 나타낸다.
항-바이러스 NK 세포 반응의 억제는 줄기 세포의 가장 높은 용량에서만 분명하였고, 2개의 테스트된 동종 혈액 도너에서 일치하지 않았다. 혈액 도너 중 하나(RM48)로부터의 NK 세포는 동종 ADSC에 직접 반응하였다. 48시간 PBMC/ADSC/VV 공동 배양 실험이 끝났을 때, 표준 4시간 K562 NK 자극 검정을 사용하여, 항-바이러스 NK 반응의 일관되지 않은 억제가 줄기 세포의 면역-특권 상태(immune-privleged staus) 및 면역억제 능력 (immunosuppressive abilities)의 상실과 상관이 있는 것을 입증하였다. 세포의 NKp46+CD3+ NKT-유사 집단은 활성화 마커가 상향조절과 함께 바이러스 감염에 대해 격렬하게 반응한 것으로 확인되었다. 이 세포 집단은 백시니아 바이러스에 대한 반응으로 신속하고 선택적인 팽창에 대한 능력을 나타냈고, 이것은 바이러스 감염의 대조군에서 NKT 세포의 이미 확립된 역할과 일치한다.
Figure pct00024
C. 동종 줄기 세포에 대한 대상체-특이적 반응의 측정
RM20 도너(실시예 1)로부터 유래된 동종 ADSC의 면역억제 및 바이러스 증폭 능력을 환자-특이적 제한을 측정하기 위해 PBMC 도너의 더 큰 집단(cohort)에서 평가하고 테스트하였다.
4개의 상이한 혈액 도너(SIBD01, SIBD02, RM52, RM53)로부터의 각각의 250,000개의 PBMC를 5,000; 10,000; 20,000; 또는 40,000개의 동종 RM20 ADSC와 48시간 동안, 5,000 pfu의 WT1 VV의 존재 또는 부재 하에 공동 배양하였다. 유세포 분석을 상기와 같이 수행하여 CD69+ 활성화된 NK, T 및 NKT 세포의 백분율을 측정하였다. 줄기 세포 없이 배양된 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 표 17 내지19에 나타낸 결과는, 동일한 RM20 ADSC가 4개의 새로운 동종 PBMC 도너의 패널에 대해 테스트되었을 때, 대상체-특이적 방식으로 직접적인 NK, T, 및 NKT 세포 반응을 촉발할 수 있음을 보여주는 이전의 데이터와 일치하였다. 고역가-대상체 생존율을 동종 줄기 세포 및 바이러스 둘 다에 대한 NK, T 및 NKT 세포 반응에서 관찰하였다. 혈액 도너 중 2개는 대조적인 결과를 보였는데, SIBD01이 가장 내성을 보였고 SIBD02가 동종 ADSC에 대해 가장 허용적이었다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
48시간 공동 배양 기간이 끝났을 때 250,000개의 K562 세포로의 4시간 자극을 사용하여 SIBD01 및 SIBD02 혈액 도너로부터의 NK 세포를 사용하여, 동종 RM20 ADSC에 의한 NK 세포 억제의 정도를 평가하였다. 단독으로 배양한 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 유세포 분석을 사용하여 CD69+ NK, T 및 NKT 세포의 백분율을 측정하였고, 플라크 분석을 사용하여 허용적 혈액 도너 샘플 대비 내성 혈액 도너 샘플의 존재 하에 동종 ADSC에 의해 바이러스 증폭을 정량화하였다. 유세포 분석(표 20)은 ADSC의 면역억제 특성이 불리한 동종 환경에서 실패한 것으로 드러났고, 이때 줄기 세포는 그것의 면역 특권 상태를 상실하고, 바이러스의 부재 하에서도 NK 및 T 세포를 직접 활성화한다. 이들 면역학적 차이는 줄기 세포의 바이러스 증폭 잠재력에 상당한 영향을 미친다. 표 21에서 나타낸 것과 같이, 48시간 공동 배양의 플라크 검정 분석은 RM20 ADSC가 내성 SIBD01 도너가 아닌 허용적 SIBD02 도너로부터의 동종 PBMC의 존재 하에서만 WT1 백시니아 바이러스를 증폭시킬 수 있음을 입증하였다. 이것은 잠재적인 MSC-수령체를 나타내는 부적절하게 매칭된 줄기 세포 및 혈액 도너가 동종 ADSC의 바이러스 증폭 잠재력을 폐지할 수 있고, 그러므로 ADSC에 대한 "허용성" 또는 "내성"으로 이어질 수 있는 중요한 환자-특이적 차이를 나타내는 것을 입증한다.
Figure pct00028
Figure pct00029
동종 ADSC의 최고 용량(40,000)에 대한 NK, T, 및 NKT 세포 반응(% CD69+ 세포, 미처리된 PBMC 대조군에 대해 표준화됨)의 상관 분석을 수행하였다. 표 22 내지 24에 나타낸 상관 분석의 결과는 백시니아 바이러스가 상당히 연계된 NK, NKT 및 T 세포 반응을 유도하는 것을 보여준다. 유사한 상관이 동종 줄기 세포에 대한 NK 및 T 세포 반응에 대해 분명하지만, 동종 ADSC에 대비하여 바이러스에 대한 반응성은 불일치하고 서로와 독립적일 가능성이 있다.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
그러므로, PBMC 도너는 동종 줄기 세포 및 바이러스 단독 또는 조합에서 가변적인 반응을 입증한다. 이들 대상체-특이적 차이는 대상체와 운반 세포 사이의 적절한 매칭이 치료 효능을 개선할 수 있음을 나타낸다.
D. ADSC의 생존에 대한 대상체-특이적 면역학적 장벽
동종 RM20 ADSC에 대해 각각 유의하게 내성(SIBD01) 및 유의하게 허용적인(SIBD02) 한 쌍의 혈액 도너를 확인하여, 이들 도너를 사용하여 ADSC에 대한 대상체-특이적 내성의 기저 메커니즘을 추가로 분석하였다. 20,000개의 eGFP-표지된 RM20 ADSC를 내성(SIBD01; "내성 PBMC") 또는 허용적(SIBD02; "허용적 PBMC") 혈액 도너로부터의 20,000 pfu의 L14 VV(1의 MOI)와 함께 최대 48시간 동안 250,000개의 PBMC의 존재 하에 공동 배양하였다. ADSC를 PBMC와 함께 공동 배양할 때 바이러스로 감염시키거나, 또는 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 일정하게 흔들어주면서 사전 감염시킨 후 임의의 미결합 바이러스를 세척하지 않고 PBMC에 첨가하였다.
24시간 및 48시간 후, 다음과 같은 세포 배양의 형광 이미지를 캡쳐하였다: ADSC 단독, ADSC + 내성 PBMC 및 ADSC + 허용적 PBMC.
바이러스 감염은 ADSC 단독 및 ADSC + 허용적 PBMC 공동 배양에서 관찰했지만, ADSC + 내성 PBMC 공동 배양에서는 관찰하지 못하였다. 내성 PBMC 대비 허용적 PBMC의 경우에 동종 ADSC의 생존 및 증폭 잠재력의 비교 분석은 내성이, 내성 동종 PBMC의 존재 하 및 바이러스 감염의 부재 하에 줄기 세포의 신속한 상실과 관련되었음을 나타냈다. 이들 동일한 줄기 세포는 허용적 수령체 유래의 PBMC와 공동 배양되었을 때 온전하게 유지되었다. ADSC의 L14 VV로의 사전 감염은 내성 PBMC에서 감염에 영향을 미치지 않았고, 이것은 운반 세포에서 바이러스에 증폭 "헤드 스타트(head start)"를 제공하는 것이 내성 PBMC의 면역학적 장벽을 극복하기에 충분하지 않은 것을 나타낸다.
ADSC를 L14 VV 또는 WT1 VV로 사전 감염시키는 것이 바이러스 감염 수준에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 2,500; 5,000; 10,000 또는 20,000개의 ADSC를 L14 VV 또는 WT1 VV로, 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 일정하게 흔들어주면서 사전 인큐베이션하였고, 플라크 분석을 상층액에 대해 수행하였다. 그 결과를 표 25에 나타내었다. 사전 감염은 20,000개의 ADSC가 사용되었을 때 세포 안으로 대략 절반의 바이러스(L14 VV 또는 WT1 VV)가 들어가기에 충분하였고, 더 높은 MOI에서(더 적은 줄기 세포), 대부분의 바이러스는 자유롭게 유지되는 것으로 나타났고 통합하기 위해 더 긴 시간을 필요로 하는 것으로 측정되었다.
Figure pct00033
ADSC/PBMC 공동 배양에서 L14 VV 또는 WT1 VV룰 사용한 ADSC의 사전 감염이 바이러스 증폭에 미치는 영향을 평가하였다. 2,500; 5,000; 10,000 및 20,000개의 ADSC를 상기 기술된 것과 같이 내성 및 허용적 PBMC와 함께 공동 배양하였고, 유전적으로 약독화된 L14 백시니아 바이러스 및 야생형 WT1(ACAM2000) 백시니아 바이러스로 병행 감염시켰다. ADSC를 PBMC와의 공동 배양시에 바이러스로 감염시키거나, 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 일정하게 흔들어주면서 사전 감염시킨 후 임의의 미결합 바이러스를 세척하지 않고 PBMC에 첨가하였다. 백시니아 바이러스 증폭의 플라크 분석을 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다. 결과(표 26)는, 줄기 세포를 잠재적으로 향상시키고 바이러스 증폭을 가속화했음에도 불구하고, 1시간 헤드 스타트는 동종 PBMC의 존재 하에 ADSC의 증폭 잠재력에 대해 전체적으로 작은 영향을 미쳤음을 보여준다. 허용적 SIBD02 PBMC는 L14 VV의 증폭을 부분적으로 억제하였지만, WT1 VV는 억제하지 못하였다. 비활성화된/제거된 TK 유전자좌를 가진 리스터-기반 Turbo-FP635-조작된 L14 바이러스와 대조적으로, 대부분의 유전적으로 약독화된 백시니아 바이러스 스트레인에서처럼, WT1/ACAM2000은 더 높은 증폭 잠재력 및 더 강력한 동종 장벽을 극복하는 능력이 입증된 야생형 TK-양성 와이어스 스트레인 백시니아 바이러스이다. 이것은 가능한 더 빠른 증폭 사이클 및/또는 항-바이러스 면역을 회피하는 증대된 능력에 기인한다. 그럼에도 불구하고 WT1 바이러스의 이러한 장점은 내성 수령체(SIBD01)에서 면역학적 장벽을 극복하기에 불충분하였고, 바이러스 증폭은 동종 PBMC와의 공동 배양 1시간 전에 줄기 세포의 바이러스 감염을 시작함으로써 단지 미미하게 개선되었다. 그러므로, 동종 ADSC에 대한 환자-특이적 면역학적 장벽은 유전적으로 약독화된 및 야생형 백시니아 바이러스 스트레인의 치료 잠재력을 제한할 수 있다.
Figure pct00034
실시예 5
대상체-특이적 유전자 다형성의 분석
이 실시예는 대상체에 의한 동종 운반 세포의 거부반응에 기여할 수 있는 인자, 및 이런 문제를 피할 수 있는 방법의 이해를 얻기 위하여 하플로타입 분석( haplotype analysis)을 제공한다. 특정 대상체-특이적 유전자 다형성은 대상체와 동종 운반 세포 사이의 "면역학적 미스매치(immunological mismatch)"를 초래할 수 있다. 관련 유전자좌로는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 고전적 MHC I/II 하플로타입, KIR 하플로타입/리간드 및 비고전적 MHC 하플로타입(예컨대, HLA-E, CD1a,b,c,d 및 MICA/B)을 들 수 있다.
대상체-특이적 유전자 다형성의 관련 유전자좌의 분석을, 예를 들어 차세대 서열분석(next generation sequencing)을 사용하여 수행할 수 있다. 그런 후 각 대상체의 유전자 다형성 프로파일을 이용 가능한 운반 세포 유형의 각각의 프로파일과 비교하여 MHC 미스매치, KIR 및 KIR 리간드 미스매치 및 비고전적 MHC 유전자좌에서의 미스매치, 및 확인된 "면역손상" 미스매치를 포함한, 대상체와 운반 세포 사이의 미스매치를 확인한다. "면역손상 미스매치"는 본원에 제공된 매칭 검정 방법에 의해 측정된 바 % 적합성의 현저한(예컨대, 10% 이상) 감소와 관련된 유전자 다형성 유전자좌에서의 대상체와 운반 세포 사이의 미스매치이다.
A. 동종 ADSC에 대한 내성은 HLA 미스매치와 관련된다
상이한 동종 ADSC 주(lines)의 내성 또는 허용성을 평가하였다. 내성(SIBD01) 및 허용적(SIBD02) 혈액 도너로부터의 250,000개의 PBMC를 5,000 pfu의 WT1 VV로 감염된 4개의 상이한 도너(RM20, RM35, BH21 및 RM58)로부터의 40,000 또는 5,000개의 동종 ADSC와 48시간 동안 공동 배양하였다. ADSC 단독을 대조군으로서 사용하였고, 플라크 검정을 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다. 결과(표 27)는 SIBD01 및 SIBD02 혈액 도너가 각각 4개의 동종 ADSC 주에 대해 광범위한 내성 및 허용성을 입증한 것을 보여준다. 4개의 동종 ADSC 주는 허용적 SIBD02 혈액 도너 유래의 PBMC 존재 하에서만 백시니아 바이러스를 증폭시켰다.
Figure pct00035
밀접하게 HLA-매칭된 세포의 거부반응을 KIR 하플로타입의 차이에 의해 또는 NK 세포 억제(KIR, NKG2A/CD94) 또는 자극(KIR, NKG2D) 수용체를 통한 신호전달의 균형으로 설명할 수 있다. HLA 및 KIR/MIC 유형 분석을 각각 ProImmune(Oxford, UK) 및 Scisco Genetics(Seattle, USA)에 의해 NGS를 통해 실시하였다. PBMC(SIBD01, SIBD02) 및 ADSC(RM20, RM35, BH21 및 RM58) 도너에서의 HLA 대립유전자의 알려져 있는 KIR 리간드 A3/A11(HLA-A), Bw4(HLA-B) 및 C1/C2(HLA-C) 에피토프의 존재/부재를 dorak.info/mhc/nkcell.html로부터 얻었다. NK 세포에 대한 NKG2A/CD94 수용체를 통해 억제 신호전달을 제공하는, HLA-E에 의해 HLA-B-유래 리더 펩타이드의 강력한/약한 결합 및 제시(presentation)을 예측하는 리더 서열로부터의 앵커 아미노산에서의 -21M/T(메티오닌/트레오닌) 이형성을 ebi.ac.uk/ipd의 면역 다형성 데이터베이스(IPD)로부터 얻었다. NK 세포에 미치는 NKG2D 활성화 수용체로서 작용하는 과형성 MICA/B 분자의 분석을 포함하여, Bw4 에피토프(HLA-B) 및 약한/강한 C1/C2 에피토프(HLA-C)를 포함한 공지의 KIR 리간드의 존재뿐만 아니라 KIR 하플로타입의 분석을 수행하였다. 존재하는 억제 및 활성화 수용체의 총 수와 함께, 긴(L)-억제 및 짧은(S)-활성화 KIR 수용체의 분포 및 카피 수를 또한 분석하였다.
결과는 허용성/내성과 KIR 하플로타입/KIR 리간드, -21M/T 이형성, 및 MICA/B 과형성 사이에 명확한 상관 관계가 없음을 보여준다. RM58 줄기 세포는 내성 SIBD01와 및 허용적 SIBD02 혈액 도너와의 KIR 리간드 C1/C2 미스매치를 보였고, 이는 이러한 미스매치만으로는 내성을 부여하기에는 불충분함을 나타낸다. 내성에 대비하여 허용성의 더 광범위한 결정요인은 대부분 HLA-A 및 HLA-DP 유전자좌에서의 부분적인 매칭, 가장 공통적인 HLA-A*02:01 대립유전자를 가지는 광범위하게 허용적인 도너, 및 HLA-A*01:01 대립유전자를 가지는 내성 도너와 상관이 있었다. HLA-A*01:01 미스매치 사례는 이전의 연구에서, HLA-반일치(Haploidentical) iPSC의 불충분한 KIR 억제 신호전달 및 NK 세포-매개 거부반응과 관련이 있었던 C2 KIR 리간드 미스매치에 연결될 수 있을 것이다(Ichise et al. (2017) Stem Cell Reports 9:853-867). 그러므로, HLA-A*01:01 RM58 ADSC의 미스매치 사례에서 볼 수 있듯이, HLA 유형 데이터(HLA typing data)만으로는 내성에 대비하여 허용성을 예측하기에는 불충분하다. 이들 데이터는 다양한 유전자좌의 조합된 고려가 필요한 것을 나타낸다.
B. 동종 ADSC에 대한 내성은 항-줄기 세포 세포독성 및 인터페론 반응의 신속한 유도와 관련된다
상관 유세포 분석을 사용하여 상기 파트 A.의 PBMC/ADSC/WT1 공동 배양으로부터의 게이팅된 살아있는 NK, NKT 및 T 세포에서 WT1 VV 및 동종 ADSC에 대한 CD107a 및 IFNγ 반응을 분석하였다. 표 28 내지 30에 나타낸 결과는 전부 4개의 테스트된 동종 줄기 세포주가, 내성이지만 허용적이지 않은 혈액 도너로부터의 NK 및 T 세포에서, 바이러스의 부재 하에서도 훨씬 더 강력한 CD107a 및 IFNγ 반응을 유도한 것을 보여준다. 각 세포 유형의 CD107a 및 IFNγ 단일 양성 림프구의 평균 백분율을 삼중 웰을 토대로 분석하였고 각각의 바탕값(미처리 PBMC 대조군)에 대해 표준화하였다. 허용적 혈액 도너에서, 4개의 동종 줄기 세포는 바탕값(미처리 PBMC 대조군) 아래의 자발적인 NK 세포-매개 IFNγ 반응을 억제하였다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
유세포 분석은 또한 백시니아 바이러스 또는 동종 줄기 세포로의 처리가 게이팅된 림프구 집단의 빈도에 유의하게 영향을 미치지 않은 것을 보여준다. 예외는 내성 SIBD01 혈액 도너 유래의 CD3+NKp46+ NKT-유사 세포였다. 이들 세포는 동종 줄기 세포 단독에 반응하고 백시니아 바이러스 감염의 존재 하에 더욱 확장되었다(표 31). 여러 동종 줄기 세포주에 대한 SIBD01 도너의 광범위한 내성은 비정상적으로 높은 빈도의 CD3+NKp46+ NKT-유사 세포와 관련이 있을 수 있고, 위 세포는 바이러스 및 동종 줄기 세포에 반응하여 수적으로 확장된(expanded in numbers) 유일한 세포 집단이다.
Figure pct00039
C. NKT-유사 세포는 IFNγ의 가장 초기의 생산자이다
항-바이러스 및 항-줄기 세포 유도 면역 반응을 평가하기 위하여, 2,000 또는 10,000개의 RM20 ADSC를 내성 SIBD01 또는 허용적 SIBD02 혈액 도너로부터의 250,000개의 PBMC 및 5,000 pfu의 WT1 VV와 공동 배양하였다. 게이팅된 살아있는 NK, NKT 및 T 세포를 6시간 및 24시간 시점에 활성자(CD69 표면 얼룩; 표 32 내지 34) 및 이펙터(IFNγ에 대한 세포내 얼룩; 표 35 내지 37) 기능에 대한 유세포 분석에 의해 분석하였다. 유의한 바탕 면역 세포 활성화가 6시간 시점에 분명하였고 24시간 시점에는 가라앉았다. 6시간 째에, 내성 도너 유래의 T 세포 및 NKT 세포만이 줄기 세포-유도 CD69 상향조절을 입증하였지만 IFNγ 반응은 없었다. 24시간 째에, 바이러스의 존재 유무에 관계없이, 모든 3개의 하위세트가 CD69 활성화 마커의 상향조절에 의해 동종 줄기 세포에 반응하였다. NK 세포 반응이 가장 격렬한 한편, NKT 하위세트만이 통계학적으로 유의한 줄기 세포-유도 IFNγ 반응을 나타냈고, 이것은 NKT 세포가 동종 줄기 세포에 대한 이펙터 사이토카인 반응을 시작하는 첫 번째 면역 세포 하위유형이었음을 나타낸다. 허용적 도너로부터의 NK, NKT 및 T 세포는 어떠한 시점에서도 줄기 세포에 대한 반응으로 CD69를 상향조절하거나 IFNγ를 생성하지 못하였다. 24시간 시점에, 동종 줄기 세포는 바탕값 아래의 허용적 도너 NK 세포에 의해 IFNγ 생성을 억제할 수 있었다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
D. 내성 PBMC 대비 허용적 PBMC에서 면역 세포 반응에 미치는 ADSC의 IFNγ 사전처리의 영향
생체 내에서 일어날 수 있는 면역 세포와 동종 줄기 세포 사이의 상호작용에 미치는 IFNγ 분비의 잠재적 유해 영향을 연구하기 위하여, 백시니아 바이러스의 존재 또는 부재 하에 PBMC와의 공동 배양 전에 줄기 세포를 IFNγ로 사전처리하였다. 내성(SIBD01) 및 여러 허용적(SIBD02, RM52, RM53) 혈액 도너 유래의 PBMC는 처리하지 않았거나 20 ng/mL IFNγ로 48시간 동안 사전처리된 동종의 RM20 ADSC를 증가하는 수(5,000; 10,000; 20,000 또는 40,000개)로 공동 배양하였다. 게이팅된 NK, NKT, 및 T 세포의 유세포 분석을 이전에 기술된 것과 같이 수행하였다.
IFNγ 사전처리는 WT1 백시니아 바이러스의 존재 하에, 그러나 또한 부재 하에서도 허용적 환자에서 NK 및 T 세포 반응을 억제하기보다는 향상시킨 것으로 측정되었다(표 38 내지 43). 데이터는 또한 RM20 줄기 세포(p12)의 후기 계대가 약간의 T 세포 면역억제 능력을 보유하지만, NK 세포를 억제하는 능력을 상실한 것을 입증한다. NK 세포의 NK-특이적 자극제 세포주인 K562로의 자극은 T 및 NK 세포 반응의 간접적인 활성화를 유도하고, 이것은 NK-NKT-T 세포 교차 대화(crosstalk)를 나타낸다(표 44 내지 46).
그러므로, HLA 또는 KIR 매칭이 운반 세포에 대한 내성/허용성(permissiveness vs. resistance)을 결정하는 데 역할을 할 수 있는 한편, 운반 세포 유형의 궁극적인 치료 효능은 선천성 및 적응성 면역 세포 조성, 활성화 상태 및 바이러스/동종 세포 미스매치에 대한 민감성을 포함한 다른 대상체-특이적 차이에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 부분적인 HLA 또는 KIR/KIR 리간드 매치 정도에 상관없이, 동종 ADSC의 바이러스를 효율적으로 증폭시키는 능력은 테스트된 4개의 동종 ADSC 주 모두에서 유의한 항-줄기 세포 IFNγ 및 세포독성 NK 및 T 세포 반응의 부재와 관련이 있었던 것으로 나타났다. 상당히 내성인 SIBD01 수령체로부터의 PBMC의 분석은 부적절하게 매칭된 동종 줄기 세포가 바이러스 감염의 부재 하에서도 검출 가능한 IFNγ 반응을 유도한 것을 보여준다. 이런 반응은 NK 세포 및 T 세포로부터 기원하는 것으로 나타난다. T 세포는 대용량의 초기 IFNγ-생성 세포를 나타낸 한편, NK 세포는 가장 높은 비율(the highest proportional)의 세포독성 활성을 입증하며, 이것은 선천성 및 적응성 면역 세포 집단 사이의 교차 대화(crosstalk)의 존재를 나타낸다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
실시예 6
IFN-매개 항-바이러스 상태의 유도를 억제하는 것은 바이러스 감염 및 증폭에 대해 줄기 및 종양 세포를 감작시킨다
많은 유형의 종양 세포는 종양용해 바이러스 요법에 대해 민감하게 만드는 손상된 인터페론 신호전달을 나타낸다. 다양한 세포 바이러스 센서 및 인터페론에 의해 매개되는, 형질전환되지 않은 줄기 세포 및 특정 유형의 종양 세포에서 온전한 항-바이러스 메커니즘은 종양용해 바이러스의 전달을 위해 운반 세포로 기능하는 세포의 능력에 대한 장벽을 생성할 수 있다. 예를 들어, 타입 I 및 II 인터페론은 줄기 세포 및 일부 유형의 종양 세포에서 항-바이러스 상태의 강력한 유도자이다. 이것은 바이러스 감염에 대한 이들 세포의 민감성을 간섭하고, 바이러스 증폭을 지지하는 능력을 감소시킨다.
바이러스 감염의 검출의 차단 및/또는 줄기 및 종양 운반 세포에서 항-바이러스 상태의 유도를 차단하는 것이 바이러스 감염, 증폭 및 확산에 대해 운반 세포를 감작시킬 수 있다는 것이 본원에서 입증된다. 인터페론 신호전달을 억제하는 JAK1/JAK2의 소분자 억제제인 룩소리티닙을 사용하여 바이러스 감염 검출을 차단했다. 이것은 종양용해 바이러스의 운반체로서 다양한 줄기 및 종양 세포의 치료적 잠재력을 개선시킨다.
A. JAK1/2 억제는 줄기 세포 운반체의 바이러스 감염 및 증폭 잠재력을 향상시킨다
인터페론 신호를 방해하여 항 바이러스 상태의 유도가 종양 용해성 바이러스 운반체로서 줄기 세포의 치료 잠재력을 향상시키는지 여부를 확인하기 위해, 줄기세포를 타입 I 또는 타입 II 인터페론의 존재 하, 인터페론 신호 전달 억제제인 룩소리티닙 첨가 또는 무첨가 및 바이러스 감염의 존재 또는 부존재 상태에서 바이러스 감염, 증폭 및 종양 세포로의 전달을 평가하였다. RM35 ADSC(계대 5) 줄기 세포(이하 ADSC-RM35 줄기 세포로서 언급함; 상기 실시예 1에서 기술한 것과 같이 상부 외막 지방 기질 세포로부터 유래됨)를 TurboFP635 형광 단백질을 발현하도록 조작된 L14 종양용해 백시니아 바이러스로 0.1의 MOI에서 2시간 동안 감염시켰다. 유리 바이러스를 세척한 후에, 세포를 즉시 웰당 10,000개 세포의 밀도로 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 50 nM 룩소리티닙(LC Laboratories, Cat. No. R-6688)이 있거나 없이 20 ng/mL IFNβ(타입 I 인터페론) 또는 20 ng/mL IFNγ(타입 II 인터페론)를 첨가하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. IFN이 없는 세포 배양을 대조군으로서 사용하였다. 세포를 배양한지 48시간 후에, 바이러스 감염 및 증폭을 시간 경과 형광 영상화에 의해 평가하였고, 그것을 사용하여 바이러스에 의해 암호화된 TurboFP635 단백질의 형광 밀도를 측정하였다. 결과를 하기 표 47에 나타내며, 그것은 대조군 줄기 세포(IFN 없음); 대조군 줄기 세포 + 룩소리티닙; 줄기 세포 + IFNβ; 줄기 세포 + IFNβ + 룩소리티닙; 줄기 세포 + IFNγ; 및 줄기 세포 + IFNγ + 룩소리티닙에 대한 평균 형광 세기 밀도를 보여준다.
IFN이 대조군 세포에 첨가되지 않았기 때문에, 항-바이러스 상태의 유도는 없었고, TurboFP635 형광의 세기에 의해 측정한 바이러스 감염 및 증폭의 양은 룩소리티닙의 첨가가 있거나 없을 때 동일하였다. 대조군 세포와 비교하여, 20 ng/mL의 IFNβ 또는 IFNγ의 세포 배양에의 첨가는 형광이 각각 26.7% 및 17.8%의 감소를 나타내게 하였다. 이것은 바이러스 감염 후 줄기 세포가 IFN에 노출되면 바이러스의 증폭을 지지하는 운반 세포의 능력이 감소함을 나타낸다. 이들 배양 조건은 감염된 운반 세포가 타입 I 및 타입 II 인터페론에 노출되는 것을 모방하며, 이는 각각 다른 감염된 운반 세포 또는 생체 내에서 대상체의 면역 세포에서 발생할 수 있다.
형질전환되지 않은 줄기 세포(및 많은 종양 세포)는 백시니아 바이러스 및 다른 종양용해 바이러스에 대한 온전한 고유의 바이러스 감지 및 방어 메커니즘을 가질 수 있다. 그러므로, 그것이 운반 세포로서 사용될 때 높은 증폭 잠재력을 유지하기 위하여, IFN-매개 항-바이러스 상태의 유도를 방지하는 것이 유리할 수 있다. 표 47에서 나타낸 것과 같이, IFNβ 또는 IFNγ에 노출된 줄기 세포에 50 nM 룩소리티닙의 첨가는 IFN에 노출되지 않은 대조군 세포와 대략 동일한 양의 형광을 초래한다. 이들 결과는 50 nM 룩소리티닙의 첨가가 타입 I 및 타입 II 인터페론에 의한 항-바이러스 상태의 유도를 효과적으로 및 완전하게 반전시키며, 바이러스 감염 및 증폭을 지지하기 위해 운반 세포를 감작시키는 것을 입증한다.
Figure pct00055
B. JAK1/2 억제는 종양 세포의 바이러스 감염 및 증폭 잠재력을 향상시킨다
IFN 신호전달의 억제가 백시니아 바이러스 감염 및 증폭에 대해 종양 세포를 감작시키는지의 여부를 측정하기 위하여, 200,000개의 PC3 인간 전립선암 세포를 L14 바이러스로 0.1의 MOI에서 2시간 동안 사전감염된 20,000개의 ADSC-RM35 줄기 세포와 공동 배양하였다. 5 nM 또는 50 nM 룩소리티닙의 첨가 또는 무첨가, 20 ng/mL의 IFN 타입 I + 20 ng/mL IFN 타입 II를 공동 배양에 첨가하고, 바이러스 감염 및 확산의 진행을 형광 영상화에 의해 최대 48시간 동안 모니터링하였다. IFN 또는 룩소리티닙(Rux)을 첨가하지 않은 공동 배양을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 하기 표 48에 요약하는데, 대조군 세포(IFN 없음/룩소리티닙 없음); 공동 배양 + IFN I/II; 공동 배양 + IFN I/II + 5 nM 룩소리티닙; 및 공동 배양 + IFN I/II + 50 nM 룩소리티닙에 대한 평균 형광 세기 밀도(IntDen)를 보여준다. IFN 억제의 퍼센트 반전을 다음 식을 사용하여 계산하였다:
IFN 억제의 % 반전 = [(IntDen Rux+IFN - IntDen IFN ) /(IntDen 대조군 - IntDen IFN )] x 100.
결과는, IFN의 첨가시, 바이러스가 종양 세포를 감염시키는 것, 뿐만 아니라 종양 세포에 의한 바이러스의 증폭이 상당히 감소된 것을 보여준다. 5 nM 룩소리티닙의 첨가는 증가된 바이러스-유도 TurboFP635 형광 신호에 의해 증명되는 바, PC3 세포에서 항-바이러스 상태의 유도를 부분적으로 반전시켰고(40%), 바이러스 감염 및 증폭의 수준을 증가시켰다. 50 nM 룩소리티닙의 첨가는 PC3 세포에서 항-바이러스 상태의 유도의 반전에서 고도로 효과적이었고(약 91% 반전), 바이러스 감염 및 증폭 수준을 대조군 세포보다 약간 적게 복원하였다.
이들 결과는 줄기 및 종양 세포의 고유한 항-바이러스 방어 메커니즘, 예컨대 인터페론 신호전달 경로의 약물학적 및/또는 유전적 간섭을 그것의 바이러스 감염/증폭 잠재력을 개선/유지하기 위해 사용할 수 있음을 입증한다. 이것은 생체 내에서 바이러스 로딩 또는 노출 중에 인터페론의 영향에 대해 운반 세포가 내성을 갖 게하여, 종양용해 바이러스에 대한 운반체로서의 그것의 잠재력을 개선시킨다. 인터페론은 감염된 세포와 이웃한 미감염 세포 사이의 항-바이러스 상태의 확산을 매개하기 때문에, 운반 세포에서 항-바이러스 상태 유도 차단의 추가적인 이익은 타입 I 인터페론 생성 억제가 항-바이러스 상태의 초기 확산을 최소화하고 그로써 생체 내에서 바이러스 감염의 확산을 용이하게 한다는 것이다.
Figure pct00056
실시예 7
보체 차단은 바이러스 감염 및 증폭에 대해 줄기 세포 및 종양 세포를 감작시킨다
인간 혈청은 바이러스 증폭 전에 바이러스-감염된 운반 세포를 직접적으로 공격하여 살해하거나, 또는 운반 세포로부터 방출된 네이키드 바이러스 입자를 중화함으로써 표적 종양 세포로의 바이러스의 확산을 제한하는 것을 포함하여, 일부 운반 세포에 해로운 영향을 나타낼 수 있다. 보체-차단 인자를 발현하도록 운반 세포를 조작하는 것이 세포를 보호하고 그것의 치료 효능을 개선시키는지의 여부를 측정하기 위하여, 보체 펩타이드 억제제인 콤프스타틴(Compstatin), 또는 중화 항-인간 C3a/C3a(desArg)/C3 항체를 첨가하는 것이 운반 세포가 L14 종양용해 백시니아 바이러스를 증폭시키고 전달하는 능력에 미치는 영향을 평가하였다.
A. 바이러스-감염된 운반 줄기 세포에 미치는 보체 차단의 영향
TurboFP635 형광 단백질을 발현하도록 조작된 L14 백시니아 바이러스로 ADSC-RM35 운반 줄기 세포를 0.1의 MOI에서 2시간 동안 감염시켰다. 바이러스의 증폭 및 미감염 운반 세포 90%로의 바이러스 확산에 대한 보체 활성의 영향은 10% 인간 혈청(도너 CBD2로부터)을 첨가하고, L14 백시니아 바이러스-암호화된 TurboFP635 형광 신호의 축적을 혈청에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교하였다.
72시간에 걸친 시간 경과 형광 영상화는 10% 인간 혈청이 바이러스-감염된 운반 줄기 세포가 바이러스를 증폭시키는 것을 방지하지 못하였음을 보여준다.
보체의 차단이 운반 줄기 세포의 바이러스 증폭 및 전달 용량을 개선하는지의 여부를 평가하기 위하여, 바이러스-감염된 줄기 세포를, 보체 C3에 결합하여 그것의 단백질 가수분해 절단을 C3 전환효소에 의해 억제하는 콤프스타틴의 존재 하 또는 중화 항-인간 C3a/C3a(desArg)/C3 항체의 존재 하에 인간 혈청과 함께 인큐베이션하였다. ADSC-RM35 줄기 세포를 L14 백시니아 바이러스로 0.1의 MOI에서 2시간 동안 감염시키고, 10% 인간 혈청(도너 CBD2로부터)을 20 μM 콤프스타틴(Cat. No. 2585; Tocris Bioscience, MN), 50 ng/mL 아이소타입 대조군(Cat. No. 400166; BioLegend, San Diego, CA), 또는 50 ng/mL 항-C3 항체(Cat. No. 518104; BioLegend, San Diego, CA)의 존재 하에 첨가하였다. 10% 인간 혈청 단독과 함께 인큐베이션한 바이러스-감염된 줄기 세포를 대조군으로서 사용하였다. 72시간째의 형광 영상화를 사용하여 대조군 운반 세포(10% 인간 혈청 단독); 운반 세포 + 혈청 + 콤프스타틴; 운반 세포 + 혈청 + 아이소타입 대조군; 및 운반 세포 + 혈청 + 항-C3 항체 사이의 바이러스 감염 및 증폭을 비교하였다(평균 형광 세기 밀도에 의해 측정됨).
하기 표 49에 나타낸 결과는 20 μM 콤프스타틴의 첨가가 형광 신호를 증가시키고, 따라서 운반 줄기 세포에서 바이러스 증폭의 양이 대조군 세포와 비교하여 50% 증가한 것을 보여준다. 50 ng/mL 아이소타입의 첨가는 대조군 세포와 비교하여 형광 신호의 세기에 영향을 미치지 않은 한편, 50 ng/mL 항-C3 항체의 첨가는 대조군 세포와 비교하여 형광 신호를 12.5% 증가시킨다. 이들 결과는 펩타이드 억제제 콤프스타틴 또는 항-C3 중화 항체의 보체 차단이 바이러스 증폭을 추가로 증가시킨 것을 나타낸다. 그러므로, 보체 차단은 더 높은 바이러스 페이로드(payloads)의 축적을 허용한다. 이것은 보체를 차단하는 작용제의 공동 투여, 예컨대 바이러스-운반 세포를 펩타이드 또는 소분자 억제제로 사전 로딩하거나 및/또는 보체의 억제제를 발현하도록 조작함에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방식에 의해 이루어질 수 있다.
Figure pct00057
다음으로 콤프스타틴 및/또는 항-C3 항체에 의한 보체 차단의 영향을 3개의 상이한 도너 유래의 20% 인간 혈청에 대해 평가하였다. ADSC-RM35 줄기 세포를 L14 백시니아 바이러스로 0.1의 MOI에서 2시간 동안 감염시키고, 3개의 상이한 도너(CBD1, CBD2 및 CBD3)로부터의 20% 인간 혈청을 20 μM 콤프스타틴, 10 μg/mL 항-C3 항체, 또는 50 μg/mL 항-C3 항체의 존재 하에 첨가하였다. 3개의 도너(보체 차단 없음) 각각으로부터의 20% 인간 혈청과 함께 인큐베이션한 바이러스-감염된 줄기 세포를 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 후 48시간 째의 형광 영상화를 사용하여 상이한 세포 배양 사이의 바이러스 감염 및 증폭을 비교하였다(바이러스-발현된 TurboFP635의 평균 형광 세기 밀도에 의해 측정됨). 하기 표 50에 요약한 결과는 20 μM 콤프스타틴의 첨가가 도너 CBD1, CBD2 및 CBD3에 대해 혈청 단독 대조군 세포와 비교하여 형광 세기를 각각 27.7%, 8.1% 및 18.7% 증가시킨 것을 보여준다. 대조군 세포와 비교하여, 10 μg/mL 항-C3 항체의 첨가는 형광 세기를 도너 CBD1의 경우 6.1% 및 도너 CBD3의 경우 10.3% 증가시키고, 도너 CBD2의 경우 0.8% 감소시킨다. 50 μg/mL 항-C3 항체의 첨가는 도너 CBD1, CBD2 및 CBD3에 대해 대조군 세포와 비교하여 형광 세기를 각각 20.9%, 1.6% 및 10.3% 증가시킨다. 이들 결과는 작은 펩타이드 억제제 콤프스타틴(20 μM의 농도) 또는 항-C3 항체(at 10 μg/mL 또는 50 μg/mL)에 의한 보체 차단이 바이러스-감염된 줄기 세포에 대한 인간 혈청의 부정적 영향을 부분적으로 반전시켰고, 다중 인간 혈액/혈청 도너에서 백시니아 바이러스 확산 및 증폭을 향상시킨 것을 나타낸다.
Figure pct00058
B. 종양 세포에서 바이러스 감염 및 증폭에 미치는 보체 차단의 영향
보체의 차단이 바이러스의 표적 종양 세포로의 확산을 향상시키는지를 보여주기 위하여, 줄기 세포를 L14 바이러스로 감염시키고 콤프스타틴의 첨가 또는 무첨가 상태에서 20% 인간 혈청의 존재 하에 종양 세포와 공동 배양하였다. 20,000개의 RM35 지방-유래 줄기 세포 운반체를 L14 백시니아 바이러스로 1의 MOI에서 2시간 동안 감염시킨 후, 300,000개의 PC3 인간 전립선암 세포의 단층에 밤새 시딩하였다. 줄기 세포 운반체로부터 종양 세포로의 바이러스 감염의 확산은 20 μM 콤프스타틴의 첨가 또는 무첨가 및 도너 CBD2로부터의 20% 인간 혈청의 존재 하에 48시간 동안 진행되는 것이 가능하였다. 혈청 또는 콤프스타틴의 부재 하에서 바이러스-감염된 줄기 세포 및 종양 세포의 공동 배양을 대조군으로서 사용하였다. L14 백시니아 바이러스에 의해 발현된 TurboFP635로부터의 평균 형광 세기 밀도, 즉, 형광 신호에 의해 측정되는 바, 48시간 후의 형광 영상화를 사용하여 종양 세포의 감염 정도를 측정하였다.
결과를 하기 표 51에 요약한다. 20% 인간 혈청의 첨가는 41.1로부터 34.5로 형광 세기 밀도의 감소에 의해 증명되는 바, 감염된 운반 줄기 세포로부터 종양 세포로의 바이러스의 확산을 부분적으로 감소시켰다. 20 μM 콤프스타틴의 첨가는 형광 세기 밀도를 36.4로 증가시켰다. 그러므로, 콤프스타틴을 사용한 보체 차단은 보체-매개 바이러스 확산 억제를 부분적으로 반전시키고, 형광 세기를 28.5% 증가시킨다. 이들 결과는 보체에 대한 보호를 위해 운반 세포를 감작시키는 것이 표적 PC3 종양 세포에서 바이러스 확산 및 증폭을 향상시키는 것을 나타낸다.
전체적으로, 이들 데이터는 보체 차단제, 예컨대 펩타이드 억제제 또는 보체 중화/길항 항체를 전달하도록 조작된 운반 세포를 사용함으로써 보체를 차단하는 것이, 운반 세포 및 그것이 방출하는 네이키드 바이러스 입자를 인간 혈청에 있는 보체 및 중화항체로부터 보호하는 것임을 확인한다. 이것은 더 높은 바이러스 페이로드의 축적을 가능하게 함으로써, 운반 세포가 종양용해 바이러스를 증폭시키고, 종양 세포로 전달하고 확산시키는 능력을 개선시킨다.
Figure pct00059
실시예 8
동종 거부반응 결정요인 및 HLA-차단을 이용한 억제의 평가
실시예 4는 줄기 세포 운반체가 동종 장벽에도 불구하고 종양용해 백시니아 바이러스를 증폭시키고 전달할 수 있음을 입증한다. 이것은 동종 인식(allogeneic recognition)을 회피하고 NK 세포, T 세포, 및 NK(NKp46) 및 T 세포(CD3) 마커를 발현하는 "NKT" 세포의 집단을 능동적으로 면역억제하는 능력으로부터 유발된다. "부적합한/내성" 수령체의 하위세트에서, 줄기 세포는 동종 인식을 피할 수 없었고, 그것은 바이러스의 부재 하에서도 운반 줄기 세포에 대해 신속하고 강력한 동종 NK, T, 및 NKT 세포 반응의 시작을 초래하였다. 이들 신속한 동종 반응(allogeneic responses)은 공동 배양의 48시간 이내에 발생하였고, 항-줄기 세포 세포독성 반응 및 IFNγ-매개 항-바이러스 상태의 발생과 관련이 있으며, 백시니아 바이러스를 증폭하는 줄기 세포의 능력을 억제한다. 이러한 결과는 강력한 줄기 세포 특이적 면역억제 및 면역-회피 능력이 없는 비-줄기 세포 운반체, 예컨대 종양 세포가 유사 또는 더 강력한 동종 제한을 받아 종양용해 바이러스 증폭 및 전달 잠재력을 환자-특이적 방식으로 제한하는 것을 나타낸다. 이것은 결국 그것의 기성품 사용 및 유효성을 제한한다.
동종 인식 및 거부반응을 담당하는 인자의 확인, 억제 및 제거는 기성품 방식으로 종양용해 바이러스의 전달을 위한 운반 세포로서의 동종 줄기 또는 종양 세포의 치료적 잠재력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동종 거부반응 결정요인으로는 CD8 및 CD4 T 세포에 의해 인식된 고도로 다형성이고 환자-특이적인 MHC Class I 및 Class II 분자, 뿐만 아니라 다양한 선천성 T 세포 하위집단, 예컨대 다른 것들 중에서도 감마 델타(gamma delta, gd) T, iNKT, 및 NKT 세포에 의해 인식되는 MHC-유사 MICA 및 CD1a,b,c,d 분자, 뿐만 아니라 다른 스트레스-관련 또는 스트레스-감지 분자, 예컨대 부티로필린(butyrophilins) 및 아넥신 A2(Annexin A2)를 포함하는 광범위한 스펙트럼의 다형성이 적은 결정요인을 들 수 있다.
동종 MHC I 분자의 차단은 운반 줄기 및 종양 세포에 대한 그것의 동종 면역 반응, 특히 동종 MHC I 미스매치를 인식하고 그것에 반응하는 것을 담당하는 CD8 T 세포의 반응을 억제하는 능력에 대해 평가하였다.
A. 비감염 및 백시니아 바이러스-감염된 줄기 세포 및 종양 세포에 의한 면역 세포 고갈
적합 및 부적합 (incompatible/resistant) 도너로부터의 PBMC와 공동 배양된 백시니아 바이러스 비감염 및 감염된 운반 줄기 및 종양 세포의 면역억제 특성 및 면역 세포 고갈 잠재력을 평가하였다. 부적합/내성(incompatible/resistant)(CBD1) 및 적합/허용적(compatible/permissive)(CBD2) 도너로부터의 300,000개의 PBMC를 비감염된 대조군 세포이거나 ACAM2000 백시니아 바이러스로 10의 MOI에서 2시간 동안 감염된 운반 세포인 10,000개의 지방-유래 줄기 세포(RM35) 또는 암 세포(인간 전립선 PC3)와 60시간 동안 공동 배양하였다. 60시간의 공동 배양 후에, 백시니아 바이러스(VV) 감염된 운반 줄기 세포 및 종양 세포와 부적합/내성(CBD1) 및 적합/허용적(CBD2) 수령체로부터의 PBMC와의 공동 배양으로부터 회수한 상이한 면역 세포 하위유형의 수를 분석하였다. CBD1 또는 CBD2 PBMC 단독 및 미감염 운반 세포와 공동 배양된 CBD1 또는 CBD2 PBMC로부터 회수된 상이한 면역 세포 하위유형의 수를 대조군으로서 사용하였다. 다양한 면역 세포 하위유형을 활성화 마커로서 CD69 및 다음과 같은 세포 유형 특이적 마커의 세트를 사용하여 다중-파라미터 유세포 분석에 의해 확인하였다: γδ(gd) T 세포(CD3+, γδ TCR+); iNKT/NKT 타입 1 세포(CD3+, Va24Ja18+); 일반적인 NKT-유사 세포(CD3+CD56+; gd 및 iNKT 배제됨); 고전적 CD4 T 세포(CD3+CD4+; gd 및 iNKT 배제됨); 고전적 CD8 T 세포(CD3+CD8+; gd 및 iNKT 배제됨); 일반적인 NK 세포(CD3-CD56+); 및 NK 하위집단 CD56highCD16-(사이토카인 생성) 및 CD56lowCD16+(세포독성).
결과를 하기 표 52(줄기 세포의 경우) 및 표 53(PC3 세포, 인간 전립선암 세포의 경우)에 나타낸다. 표 54는 억제% 의 관점에서 종양 세포 대비 미감염 줄기 세포의 면역억제 및 면역 세포 고갈 특성을 비교한다. 면역 세포 하위 유형의 억제%를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
% 억제 =(1-( 운반 세포+PBMC 공동 배양으로부터의 평균 면역세포수)) x 100
PBMC 단독으로부터의 평균 면역세포수
부적합/내성(incompatible/resistant)(CBD1) 및 적합/허용적(compatible/permissive)(CBD2) 도너 유래의 PBMC와 미감염 RM35 ADSC의 공동 배양은 PBMC 단독(대조군)과 비교하여 모든 면역 하위유형의 감소/고갈을 초래한다. 이것은 지방-유래 줄기 세포의 강력한 면역억제 잠재력을 확인시켜준다(표 52 참조). CBD1 및 CBD2와 PC3 종양 세포(표 53 참조)의 공동배양시, 또한 이런한 효과가 관찰되었지만, 훨씬 더 적은 정도였고, 종양 세포와 비교하여 줄기 세포의 월등한 면역억제 특성을 나타냈다(표 54 참조). 그러나 줄기 세포(표 52) 및 종양 세포(표 53)가 백시니아 바이러스(RM35 ADSC(줄기 세포) + VV, 또는 PC3 세포(종양 세포) + VV)로 사전 감염되었고 운반체로서 사용된 경우, 모든 면역 세포 하위유형의 수의 증가함에 따라 면역 세포를 고갈시키는 능력이 상실되었다. 이러한 데이터는 증폭 바이러스에 의해 점진적으로 사멸되고 면약 억제 잠재력을 잃는 운반 세포와 일치한다.
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
B. 동종 운반 세포 및 백시니아 바이러스에 대한 면역 하위세트 반응
PBMC 단독 대비 PBMC + 미감염 운반 세포 공동 배양으로부터 회수된 각각의 면역 하위집단에서 CD69+ 세포의 분획을 사용하여, 면역 활성화의 분석은 동종 줄기 또는 종양 세포 운반체에 대한 면역 세포 반응의 주요 집단을 확인하였다. 표 55에 요약한 결과는, 부적합 PBMC에 미감염 줄기 세포 또는 종양 세포를 첨가했을 때, 모든 하위유형의 면역 세포의 수가 증가하는 것을 보인다(줄기 세포에 반응하는 CD56highCD16- NK 세포는 예외임). 가장 큰 수의 변화는 γδ T, iNKT, NKT, 일반적인 NK 및 세포독성 NK(CD56lowCD16+) 세포에서 관찰되었다. 일반적인 NK 및 세포독성 NK 세포 수의 증가는 줄기 세포에 대한 것보다 PC3 세포에 대한 반응에서 상당히 더 컸고, 이것은 줄기 세포가 월등한 면역억제 특성을 가지는 것을 확인시켜준다. 미감염 운반 세포를 적합한 PBMC와 공동 배양했을 때, 면역 반응은 일반적으로 더 작았고, 일부 하위유형의 수는 일부 경우에 감소하였다(예컨대, γδ T, iNKT, NKT 및 CD4 T 세포). 이것은 부적합 동종 공동 배양에서의 면역 반응이 적합한 동종 공동 배양에서보다 더 컸음을 나타내며, 동종 환경에서 도너-수령체 적합성의 중요성을 확인시켜준다.
PBMC + 미감염 운반 세포 공동 배양에 대비하여 PBMC + 바이러스-감염된 운반 세포 공동 배양으로부터 회수된 각각의 면역 하위집단에서 CD69+ 세포의 분획을 사용하여, 면역 활성화의 분석은 바이러스에 반응하는 면역 세포의 주요 집단을 확인하였다. 이들 결과는 표 56에 요약하며, 바이러스에 반응하는 주요 면역 세포 하위유형은 γδ T, iNKT, 일반적인 NKT-유사(CD3+CD56+; γδ T 및 iNKT 배제됨), 일반적인 NK, 세포독성 NK(CD56lowCD16+) 및 사이토카인-생성 NK(CD56highCD16-) 세포를 포함하였다. 면역 세포의 동일한 집단이 적합 및 부적합 수령체 둘 다에서 바이러스에 반응하였다. 모든 T 하위집단의 크기는 줄기 세포 및 종양 세포 운반체 둘 다와의 적합한 수령체 환경에서 더 약하거나 또는 심지어 음성(항-바이러스 반응의 완전한 억제를 나타냄)이었고, 이것은 적합성이 동종 세포 운반체의 어느 한 유형을 가진 바이러스에 대한 반응에 영향을 미치는 것을 입증한다. NK 세포의 경우에, 이것은 줄기 세포 운반체에 의해 전달된 바이러스의 사이토카인-생성 NK 세포(CD56highCD16-)의 반응에 대해서만 사실인 것으로 나타났는데, 그것은 부적합한 수령체 환경에서가 아닌 적합한 수령체 환경에서 완전하게 억제되었다. 동종 종양 운반 세포에 의해 전달된 바이러스에 대한 사이토카인-생성 NK 세포의 반응은 두 수령체에서 동등하게 강력하였다. 바이러스에 대한 세포독성 NK(CD56lowCD16+) 반응은 매우 높았고 두 수령체에서 유사하였다. 부적합 수령체에서 동종 종양 세포 운반체로의 바이러스에 대한 외견상 더 낮은 반응은 바이러스의 부재하에서도 운반 세포 단독에 대한 NK 세포의 매우 높은 활성화를 반영하며(표 55 참조), 이런 환경에서 더 낮은 항-바이러스 NK 세포 반응을 나타내는 것은 아니다.
실시예 4는 종양용해 바이러스의 동종 세포 운반체에 대한 반응으로 T 세포(CD3+) 및 NK 세포(NKp46+) 마커를 발현하는 선천성 T 세포 집단에 대한 중요한 역할을 입증한다. 표 55 및 56에 요약한 데이터는 이들 선천성 T 세포 집단이 γδ T 세포, iNKT(NKT 타입 I) 세포 및 CD56+CD3+ NKT(NKT 타입 II) 세포를 포함한 것을 나타낸다.
Figure pct00063
Figure pct00064
C. 적합 PBMC 대비 부적합 PBMC에서 동종 운반 세포에 대한 면역 반응
표 55 및 56에서 나타낸 것과 같이, 부적합 PBMC와 공동 배양은 적합한 PBMC와 비교하여 상당히 더 높은 수의 선천성 면역 T 세포 하위집단(γδ T 세포 및 CD3+CD56+ NKT 세포)을 유도할뿐만 아니라, 바이러스-감염된 운반체에 대해 더 강력한 반응을 유도한다. 모든 PBMC의 백분율로서 CD69+ 활성화된 면역 세포 하위집단의 수를 측정하였고, 백시니아 바이러스-감염된 줄기 또는 종양 운반 세포와 공동 배양한 부적합(CBD1) 및 적합(CBD2) PBMC와 비교하였고, 그 결과를 표 57에 요약한다. 각각의 특정 하위집단 내에서의 백분율로서, CD69+ 활성화된 면역 세포 하위집단의 수를 또한 적합한 PBMC 대비 부적합 PBMC에 대해 계산하였고, 그 결과를 표 58에 요약한다. 표 57은 PBMC의 총 수의 분율(%)로서 각각의 PBMC 하위집단의 CD69+ 활성화된 세포를 보여준다. 표 58은 그 특정 하위집단 내에서 세포의 총 수의 분율로서 각각의 PBMC 하위집단의 CD69+ 활성화된 세포를 보여준다.
부적합(CBD1) 및 적합(CBD2) PBMC 사이의 중요한 차이는 부적합 PBMC에서 관찰된 선천성 면역 T 세포 하위집단(γδ T 세포 및 CD3+CD56+ NKT 세포)의 수가 상당히 많았고 바이러스-감염된 운반체에 대해 훨씬 더 강력한 반응을 보였다. 이것은 상이한 하위유형의 세포의 증가된 총 수(표 55 및 56 참조), 뿐만 아니라 모든 PBMC에서(표 57 참조), 또는 특정 하위집단 내에서(표 58 참조) CD69+ 활성화된 세포의 백분율로부터 분명하다.
결과는 또한, 일반적으로, 줄기 세포가 종양 세포에 비해 운반체로서 월등한 면역억제/면역 회피 특성을 보여주며, 이때 후자가 NK 세포를 제외한 모든 선천성 및 적응성 면역 하위집단의 보다 강력한 활성화를 자극한다(표 57 및 58, RM35 대비 PC3 참조).
Figure pct00065
Figure pct00066
D. HLA 차단은 운반 세포에 대한 CD8 T 세포 반응을 억제한다
상기에서 논의된 것과 같이, 동종 인식 및 거부반응을 담당하는 인자의 확인, 억제 및/또는 제거는 기성품 방식으로 종양용해 바이러스의 전달을 위한 동종 줄기 또는 종양 세포의 치료 효능을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 동종 거부반응 결정요인으로는 CD8 및 CD4 T 세포에 의해 인식된 고도로 다형성이고 환자-특이적인 MHC Class I 및 Class II 분자, 뿐만 아니라 다양한 선천성 T 세포 하위집단, 예컨대 다른 것들 중에서도 γδ T, iNKT, 및 NKT 세포에 의해 인식되는 MHC-유사 MICA 및 CD1a,b,c,d 분자, 뿐만 아니라 다른 스트레스-관련 또는 스트레스-감지 분자, 예컨대 부티로필린 및 아넥신 A2를 포함하는 광범위한 스펙트럼의 다형성이 적은 결정요인을 들 수 있다.
동종 MHC I 분자의 제거/차단을 평가하여 그것이 줄기 및 종양 세포에 대한 동종 면역 반응, 특히 동종 MHC I 미스매치의 인식 및 반응을 담당하는 CD8 T 세포의 반응을 억제하는지의 여부를 평가하였다. 부적합 및 적합 도너로부터의 각각의 300,000개의 PBMC를 ACAM2000 백시니아 바이러스로 10의 MOI로 2시간 동안 감염된 10,000개의 지방-유래 줄기 세포(RM35) 또는 암 세포(인간 전립선 PC3 세포)와 60시간 동안 공동 배양하였다. 범(pan) 항-HLA 차단 항체(항-HLA 항체; Ultra-LEAFTM 정제된 항-인간 HLA-A,B,C 항체 클론 W6/32, Cat. No. 311428, BioLegend, San Diego, CA) 또는 아이소타입 대조군(Ultra-LEAFTM 정제된 마우스 IgG2a, κ 아이소타입 Ctrl 항체, 클론 MOPC-173, Cat. No. 400264; BioLegend, San Diego, CA)를 공동 배양에 첨가하여, 다양한 선천성 및 적응성 면역 세포 집단, 특히 CD8 T 세포에 의한 항-운반 세포의 활성화에 미치는 HLA 차단의 영향을 평가하였다. 면역 활성화는, PBMC를 사전 감염된 RM35 ADSC 또는 PC3 종양 세포와 함께 60시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 10 μg/mL의 아이소타입 대조군 또는 HLA 차단 항체의 존재 하에 공동 배양한 후에 분석하였다. 면역 세포 하위유형을 활성화 마커로서 CD69 및 CD8 T 세포의 경우 CD3+CD8+(γδ 및 iNKT 배제됨), 및 일반적인 NK 세포의 경우 CD3-CD56+를 포함한, 세포 유형 특이적 마커 세트를 사용하는 다중 파라미터 유세포 분석에 의해 확인하였다.
하기 표 59는 각각 바이러스-감염된 줄기 세포(RM35 ADSC); 바이러스-감염된 줄기 세포 + 아이소타입 대조군; 바이러스-감염된 줄기 세포 + HLA-차단 항체; 바이러스-감염된 종양 세포(PC3); 바이러스-감염된 종양 세포 + 아이소타입 대조군; 또는 바이러스-감염된 종양 세포 + HLA-차단 항체와 공동 배양된 부적합(CBD1) 및 적합(CBD2) PBMC로 관찰된 CD69+ 활성화된 CD8 T 세포 및 NK 세포의 평균 백분율을 보여준다. 표 60은 HLA 차단에 의해 매개된, CD8 T 및 NK 세포 활성화의 억제의 백분율의 관점에서의 결과를 보여준다. 억제% 를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
% 억제 =(1 -(항-HLA 항체를 가진 평균 면역 세포 수 / 아이소타입 대조군을 가진 평균 면역 세포 수)) x 100.
표 59에서 알 수 있는 것과 같이, 동종 바이러스-감염된 줄기 세포와 부적합(CBD1) 또는 적합(CBD2) PBMC의 공동 배양은 7-12.5% CD69+ CD8 T 세포 활성화, 및 70% 이상의 CD69+ NK 세포 활성화를 초래하였다. 아이소타입 대조군의 첨가는 면역 세포 반응을 억제하거나 상당한 영향을 미치지 못하였다. 그러나, 공동 배양에항-HLA 항체를 첨가한 것은 모든 공동 배양에서 면역 세포의 수를 감소시켰고, 이때 특히 적합 PBMC와의 공동 배양에서 CD8 T 세포의 활성화에 더 큰 영향을 미쳤다. 예를 들어, 표 60에 알 수 있는 것과 같이, 범-HLA 차단 항체로의 HLA의 차단은 부적합 PBMC와 바이러스-감염된 줄기 세포 공동 배양에서 CD8 T 세포를 58% 억제하고 적합 PBMC와 바이러스-감염된 줄기 세포 공동 배양에서 CD8 T 세포를 86% 억제하였다. 일반적으로, 바이러스-감염된 종양 세포는 바이러스-감염된 줄기 세포보다 더 높은 수의 NK 및 CD8 T 세포를 유도하였다. HLA의 차단은 PC3 세포에 대해 줄기 세포와 유사한 결과를 유발하였고, 이때 바이러스-감염된 PC3 세포 및 부적한 PBMC의 공동 배양에서 CD8 T 세포 활성화는 58% 억제되고, 바이러스-감염된 PC3 세포 및 적합 PBMC의 공동 배양에서 CD8 T 세포 활성화는 82% 억제되었다.
이들 결과는 HLA를 범-HLA 차단 항체로 차단하는 것이 동종 항-운반 세포 CD8 T 세포 억제 및 NK 세포 반응을 어느 정도로 억제하며, 이때 일반적으로 차단 활성은 특히 CD8 T 세포 반응과 관련하여 부적합 CBD1 도너에서보다 적합 CBD2 도너에서 더 효과적인 것을 입증한다. 이들 데이터는 고전적 CD8 및 CD4 T 세포에 의해 인식된 고전적 MHC Class I 및 Class II 분자외에도 선천성 T 세포 집단의 더 큰 관여와 부적합한 환경에서 γδ T 및 NKT 세포에 의해 인식된 추가적인 동종 거부반응 결정요인을 제거할 필요성과 일치한다.
그러므로, 동종 거부반응 결정요인, 예컨대 HLA(MHC Class I) 분자 및 기타의 일시적인 및/또는 영구적인 차단 또는 제거는 면역 회피가 향상된 줄기 또는 종양 세포-기반 운반체를 생성할 수 있습니다. 이러한 운반 세포는 세포독성 T 및 NK 세포의 생성과 관련된 동종 반응을 유도하지 않고 항-바이러스 상태를 유도하고 전달을 차단하는 IFNγ와 같은, 바이러스 페이로드의 전달 및 확산을 차단하는 이펙터 사이토카인의 분비를 유도하지 않고 종양용해 바이러스를 보다 효과적으로 전달할 수 있다.
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Figure pct00068
실시예 9
NKG2D 신호전달의 조절에 의한 동종 인식/거부반응 회피
MHC Class I 및 Class II 분자 외에, 바이러스-감염된 줄기 및 종양 운반 세포에 대한 면역 반응, 및 동종 거부반응은 면역 공동자극 분자로서 작용하는 다양한 비-MHC 마커의 참여로 향상된다. 이들 비-MHC 마커는 바이러스로 감염된 세포 또는 형질전환된 종양 세포의 표면에서 상향조절되고, 면역 거부반응을 회피하는 운반 세포의 능력을 조절한다. 이러한 "스트레스-유도(stress-induced)" 비-MHC 마커로는 MHC Class I-관련 단백질, 예컨대 NK 세포, NKT 세포, γδ T 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 발현되는 NKG2D에 대한 리간드인 인간 MICA 및 MICB를 들 수 있다. 그러므로, NKG2D 수용체는 선천성 및 적응성 세포 면역에 의한 표적화를 위해, 스트레스-유도 마커/리간드를 발현하는 세포, 예컨대 종양용해 바이러스를 감작시킬 수 있다.
NKG2D 신호전달의 활성화는 면역 체계를 회피하는 바이러스-감염된 줄기 또는 종양 운반 세포가 면역계를 회피하는 능력에 미치는 영향에 대해 평가하였다. 인간 NKG2D-특이적 항체를 사용하여 바이러스-감염된 운반 세포에 대한 면역 반응에 미치는 NKG2D 수용체의 참여 효과를 평가하였다. 이 항체는 면역 인식 및 세포 면역 반응의 활성화에 기여하며 향상시키는 강력한 공동 자극 신호로서 기능한다. 이 NKG2D 항체는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포에 의해 발현되는 것과 같이 리간드처럼 행동하는 작용제 항체입니다. 이 실시예에서는 NKG2D 축의 생체 내 결합(engagement) 및 활성화를 시뮬레이션한다.
지방-유래 줄기 세포(ADSC-RM35s) 및 종양 세포(인간 전립선 PC3 세포)를 각각 ACAM2000 백시니아 바이러스로 10의 MOI에서 2시간 동안 사전감염시켰다. 부적합(CBD1) 및 적합(CBD2) 도너로부터의 300,000개의 PBMC를 60시간 동안, 37℃ 및 5% CO2에서 10,000개의 바이러스-감염된 RM35 ADSC 또는 PC3 종양 세포와, 50 μg/mL의 인간 NKG2D-특이적 항체(Cat. No. MAB139-500, R&D Systems) 또는 50 μg/mL의 마우스 IgG1 아이소타입 대조군(Cat. No. MAB002, R&D Systems)의 존재 하에 공동 배양하였다. 그런 후 면역 활성화를, 상기에서 기술된 것과 같이, CD69+ γδ T 세포(CD3+, γδ TCR+), 일반적인 NK 세포(CD3-CD56+), 사이토카인-생성 NK 세포 하위집단(CD56highCD16-) 및 세포독성 NK 세포 하위집단(CD56lowCD16+)의 백분율을 다중-파라미터 유세포 분석에 의해 측정함으로써 평가하였다.
부적합(CBD1) 또는 적합(CBD2) PBMC와 바이러스-감염된 줄기 세포("VV-ADSC")와의 공동 배양에 대한 결과를 하기 표 61에 나타내며, 바이러스-감염된 PC3 종양 세포("VV-PC3")와의 공동 배양에 대한 결과를 하기 표 62에 나타낸다. 표는 아이소타입 대조군 또는 NKG2D-특이적 항체와 인큐베이션된 각각의 공동 배양에서 관찰된 CD69+ 활성화된 γδ T 세포, 일반적인 NK 세포, CD56highCD16-(사이토카인-생성) NK 세포, 및 CD56lowCD16+(세포독성) NK 세포의 백분율을 보여준다. NKG2D 활성화를 보인 CD69+ 활성화된 면역 세포 하위집단의 퍼센트 증가를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
% 증가 =((NKG2D-특이적 항체를 가진 평균 % 면역 세포 하위유형 - 아이소타입 대조군을 가진 평균 % 면역 세포 하위유형) /(아이소타입 대조군을 가진 평균 % 면역 세포 하위유형)) x 100.
표 61에서 알 수 있는 것과 같이, NKG2D 항체와의 인큐베이션은 아이소타입 대조군과 비교하여, 모든 면역 세포 하위유형에 대해 부적합 (CBD1) 및 적합(CBD2) 환경에서 바이러스-감염된 줄기 세포 운반체에 대한 면역 활성화/반응을 증가시켰다. γδ T 세포 및 사이토카인-생성 CD56highCD16- NK 세포의 활성화가 가장 중요하였는데, 부적합 및 적합 환경에서 γδ T 세포에 각각 16.5% 및 27.4% 증가가 있었고, 부적합 및 적합 환경에서 CD56highCD16- NK 세포에 각각 83.3% 및 51.5%의 증가가 있었다. 고도로 세포독성인 CD56lowCD16+ NK 하위 집단에 미치는 영향은 최소였고, 이것은 세포독성 NK 세포와 세포 운반체 사이의 NKG2D 항체 차단 접촉에 기인할 수 있다. 이들 결과는 NKG2D 신호전달/참여가 감염된 운반 세포에 대한 면역 반응의 조절에 관여하는 것을 나타낸다.
표 62의 결과는 NKG2D 항체와 바이러스-감염된 종양 세포 및 부적합 또는 적합 PBMC와의 공동 배양이 동일한 면역 세포 하위집단의 활성화를 증가시키지 못했음을 보여준다. 이들 결과는 줄기 세포 운반체 대비, 종양 세포 운반체에 대한 보다 강력한 면역학적 반응, 및 동종 인식을 피하는 능력의 감소와 일치한다. 줄기 및 종양 세포 운반체에 대한 대조적인 면역 반응은 형질전환된/종양 세포에 대한 반응에서 이미 더 활성인 NKG2D 경로에 기인할 수 있다. 이는 종양 세포에서 NKG2D 리간드, 예컨대 MIC-A/B의 더 높은 수준의 구성적 발현으로 인해 쉽게 인식할 수 있기 때문이다. NKG2D 리간드처럼 행동하는 NKG2D 항체의 첨가는 종양 세포가 이미 증가된 수준의 NKG2D 리간드 발현을 나타내기 때문에 아이소타입 대조군과 비교하여 종양 세포 운반체에 대한 면역 활성화를 증가시키지 못하였다.
데이터는 NKG2D 경로가 바이러스-감염된 운반 세포의 면역-회피 능력을 제어하는 데 관여하는 것을 나타낸다. 그러므로, NKG2D 리간드, 예컨대 MIC-A/B 및/또는 기타를 제거하면 세포 운반체의 면역-회피 특성을 개선시킬 수 있다. 이것은 특히 더 높은 기본 수준의 스트레스-유도 리간드 발현을 나타내는 종양 세포 운반체의 맥락에서 관련된다. 바이러스-감염된 형질전환되지 않은 줄기 세포에서의 NKG2D 리간드의 제거 또한, 이들 세포가 또한 바이러스 감염이 진행됨에 따라 스트레스-유도 리간드의 발현을 상향조절하기 때문에, 그것의 면역-회피 특성을 개선시킬 수 있다. 이것을 이루기 위하여, 운반 세포는 막-결합 MICA/B의 발현의 일시적인 또는 영구적인 억제를 위해 조작될 수 있다. 대안으로, NKG2D 수용체와 그것의 리간드 사이의 상호작용이 억제될 수 있다. 예를 들어, 운반 세포는 MIC-A 및 MIC-B의 길항물질(예컨대, kK5(KHSV)), 및/또는 NKG2D 수용체의 길항물질(예컨대, 우두 OMCP)의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있다. 대안으로, 세포는 길항물질로서 작용하는 그것의 리간드(들)에 의한 결합을 방지하기 위하여 길항물질 또는 차단 항체, 예컨대 항-NKG2D 단클론성 항체로 사전처리될 수 있다(예컨대, Kim et al. (2010) Immunology 130:545-555 참조).
Figure pct00069
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실시예 10
면역억제 인자를 분비하기 위하여 감작된/조작된 운반 세포
줄기 세포 및 종양 세포는 IDO 발현 및 IL-10 분비를 포함하여, 면역 억제 및 회피를 위한 다양한 전략을 사용한다. 그러나, 운반 세포에서의 바이러스 증폭은 세포 생존 및 면역억제 잠재력의 점진적인 상실을 유발한다. 이런 제한을 극복하기 위해, 바이러스에 의한 면역 억제 특성의 손실을 반전시키고 바이러스에 감염된 운반 세포의 능력을 항상시켜 동종 거부반응/반응 또는 초기 면역 인식을 회피하는 고용량의 면역억제 사이토카인 IL-10의 능력을 평가하였다.
미감염 또는 백시니아 바이러스-감염된 운반 세포(RM35 ADSC - 줄기 세포, 또는 PC3 - 종양 세포)를 상기 실시예 8에서 기술한 것과 같이, 부적합(CBD1) 및 적합(CBD2) PBMC와, 내재적으로 제공된 재조합 인간 IL-10(포유류 발현됨, 운반체-유리)(cat. # 573202; BioLegend, San Diego, CA)의 존재 또는 부재 하에 공동 배양하였다. 간단히 설명하면, 부적합 및 적합 도너 유래 각각 300,000개의 PBMC를 ACAM2000 백시니아 바이러스로 10의 MOI에서 2시간 동안 감염된 10,000개의 지방-유래 줄기 세포(RM35) 또는 종양 세포(인간 전립선 PC3 세포)와 60시간 동안 공동 배양하였다. 면역 활성화를, PBMC와 사전 감염된 ADSC-RM35 또는 PC3 종양 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10 nM 재조합 인간 IL-10의 존재 또는 부재 하에 60시간 동안 공동 배양한 후에 분석하였다. 다양한 면역 세포 하위유형을 확인하였고 활성화 마커로서 CD69, 및 앞서 기술된 세포 유형 특이적 마커(실시예 8 참조) 세트를 사용하는 다중 파라미터 유세포 분석에 의해 열거하였다. 하기 표 63은 부적합 또는 적합 PBMC와 미감염 줄기 세포; 백시니아 바이러스-감염된 줄기 세포; 또는 백시니아 바이러스-감염된 줄기 세포 + IL-10의 각각과의 공동 배양으로부터 회수된 CD69+ 활성화된 면역 세포 하위집단의 각각에 대한 평균 수를 보여준다. 표 64는 미감염 및 백시니아 바이러스-감염된 PC3 종양 세포와의 공동 배양에 대한 동일한 데이터를 나타낸다. 표 65는 다음 식을 사용하여 계산한, 면역 세포 하위유형의 퍼센트 IL-10-매개 억제의 관점으로 결과를 나타낸다:
% IL-10 억제 =(1 -(바이러스-감염된 운반 세포 + IL-10을 가진 평균 면역 세포 수 / 바이러스-감염된 운반 세포를 가진 평균 면역 세포 수)) x 100.
표 63 및 64에서 알 수 있는 것과 같이, 바이러스-감염된 줄기 및 종양 세포 운반체는 미감염 운반 세포와 비교하여 모든 면역 세포 하위유형에 걸쳐 면역 반응을 유도하며, 적합(CBD2) PBMC 대비 부적합(CBD1) PBMC와 공동 배양에서 더 큰 반응이 있다. 바이러스-감염된 종양 세포는 모든 면역 세포 하위유형의 더 큰 수를 유도하였고, 이것은 줄기 세포가 향상된 면역억제 및 면역 회피 특성을 가진다는 사실과 일치한다. IL-10의 첨가는 바이러스-감염된 운반 세포에 대한 반응으로 면역 활성화를 방지하지 못했지만, 적합 및 부적합 환경 둘 다에서 테스트된 모든 면역 하위유형, 및 바이러스-감염된 줄기 세포와의 공동 배양에서(표 63) 또는 종양 세포에서(표 64) CD69+ 활성화된 면역 세포의 수를 상당히 억제하였다. 일반적으로, IL-10-매개 억제 효능은 적합 PBMC와 바이러스-감염된 줄기 세포 공동 배양에서 가장 높았다(표 65 참조). 이들 결과는 부적합 환경에서 운반 세포(종양 또는 줄기 세포)에 대한 보다 강력한 동종 반응과 일치한다(CBD2에 대비하여 CBD1). 데이터는 줄기 또는 종양 세포 운반체에서 IL-10 및 면역억제 인자의 조작된 발현이 운반 세포의 면역억제 특성을 유지하고 확장시킬 수 있어서, 그것이 면역 인식 및 동종 거부반응을 피할 수 있게 하는 것을 나타낸다. 이것은 결국 면역 체계에 의해 공격을 받기 전에 바이러스를 증폭하고, 표적 종양 세포로 전달하고, 확산시키는 그것의 능력을 개선함으로써 그것의 치료 효능을 향상시킨다.
이것을 이루기 위하여, 운반 세포는 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현을 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 운반 세포는 예컨대, 인간 기원의 면역억제 인자, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, IDO, 아르기나제(Arginase), TRAIL, iNOS, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, sMICA, sMICB, sHLA-G, HLA-E, PD-L1, FAS-L, B7-H4, 및 NK 및/또는 NKT 세포를 표적으로 하거나 고갈시키는 단일 사슬 항체(scFv)를 발현하도록 조작될 수 있다. 운반 세포는 또한 바이러스 기원의 면역억제 인자, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 엑트로멜리아(ectromelia)/백시니아 바이러스 SPI-2/CrmA(면역 FAS/TNF/그랜자임 B 유도된 세포자멸사의 억제제); 백시니아 바이러스 암호화된 N1(IL-1/NFκB/길항물질); HA(NKp30, NKp44, NKp46을 표적화하는 NCR 길항물질); IL-18 결합 단백질; A40R; A46R; A52R; B15R/B16R; TNFα 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 CmrC/CmrE); IFN α/β 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B18R/B19R); IFNγ 차단제(예컨대, 백시니아 바이러스 B8R); 및 기타 IL-1/IL-1β/NFκB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D 길항물질을 발현하도록 조작될 수 있다.
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변형이 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백해질 것이기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.

Claims (165)

  1. 종양용해(oncolytic) 바이러스를 포함하는 운반 세포로서,
    바이러스는 세포에서 복제할 수 있고;
    세포는 인간 대상체에 투여될 수 있으며;
    세포는 인간 대상체에의 투여를 위해 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권(immunoprivileged) 특성을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리 및 변형되었고; 그리고
    선택적으로, 세포는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형된, 운반 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    세포는 인간 대상체에의 투여를 위해 세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리 및 변형되었고; 그리고
    세포는 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위하여 처리되었거나 변형된 것인 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포는 종양용해 바이러스 증폭이 허용되고, 종양에 축적되고/거나 대상체에서 바이러스를 종양에 전달하기에 충분한 시간 동안 대상체의 면역 체계에 의해 인식되지 않는 것인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 또는 변형된 줄기 세포, 면역 세포, 및 종양 세포 중에서 선택되는 것인 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 제거되었거나 수득되었고 종양용해 바이러스로 감염된 것인 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포인 것인 세포.
  7. 제6항에 있어서, 줄기 세포는 배아 세포 또는 태아 세포가 아니거나 배아 세포주로부터 유래되지 않은 것인 세포.
  8. 제6항에 있어서, 성인, 배아 및 태아 줄기 세포 중에서 선택된 것인 세포.
  9. 제6항에 있어서, 중간엽, 신경, 전능성, 만능성, 유도 만능성, 다능성, 과능성, 단능성, 지방 기질, 내피, 골수, 제대혈, 성인 말초혈, 근모세포(myoblast), 작은 소아(small juvenile), 상피, 배아 상피, 및 섬유 모세포 줄기 세포 중에서 선택되는 것인 세포.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포인 것인 세포.
  11. 제10항에 있어서, 중간엽 줄기 세포는 성인 골수에서 유래된 중간엽 세포, 지방 조직, 혈액, 치수 (dental pulp), 신생아 탯줄, 제대혈, 태반, 태반-유래 부착 기질 세포, 태반-유래 탈락막 기질 세포, 자궁내막 재생 세포, 태반 양능성 내피/중간엽 전구 세포, 양막 또는 양수 중간엽 줄기 세포, 양수 유래 전구체, 왓튼 젤리 중간엽 줄기 세포(Wharton's Jelly mesenchymal stem cells), 골반 거들 줄기 세포, 융모막 융모 중간엽 기질 세포, 피하 백색 지방 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 혈관외 망막 줄기 세포, 모낭-유래 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 골막-유래 중간엽 줄기 세포, 측판 중간엽 줄기 세포, 박리된 유치 줄기 세포(exfoliated deciduous teeth stem cells), 치주 인대 줄기 세포, 치낭 전구 세포, 정단 유두(apical papilla)로부터의 줄기 세포, 및 근육 위성 세포 중에서 선택되는 것인 세포.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 기질 세포인 것인 세포.
  13. 제12항에 있어서, 지방 기질 중간엽 세포인 것인 세포.
  14. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 전구 세포, 태반 내피 전구 세포, 혈관형성성 내피 세포(Angiogenic Endothelial Cells), 및 혈관 주위 세포 (pericytes) 중에서 선택된 내피 세포인 것인 세포.
  15. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배아 상피 세포인 것인 세포.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포인 것인 세포.
  17. 제16항에 있어서, 면역 세포는 과립구, 비만 세포, 단핵 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 림프구, 종양-특이적 항원을 표적화하는 T-세포 수용체(TCR) 유전자도입 세포, 및 종양-특이적 항원을 표적화하는 CAR-T 세포 중에서 선택되는 것인 세포.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 악성 세포주로부터 변형되거나 처리된 세포인 것인 세포.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 대상체에 대해 동종(allogeneic)인 것인 세포.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 유래된 줄기 세포인 것인 세포.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주로부터의 세포이며, 세포주는 인간 백혈병, T-세포 백혈병, 골수단핵세포성 백혈병(myelomonocytic leukemia), 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프모세포성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 적백혈병(erythroleukemia), 골수단핵모세포성 백혈병(myelomonoblastic leukemia), 악성 비호지킨 NK 림프종, 골수종/형질세포종(plasmacytoma), 다발성 골수종 및 대식세포 세포주 중에서 선택되는 것인 세포.
  22. 제21항에 있어서, 세포주는:
    KASUMI-1, HL-60, THP-1, K-562, RS4;11, MOLT-4, CCRF-CEM, JVM-13, 31E9, ARH-77, MoB, JM1, NALM-1, 또는 ProPak-X.36인 백혈병 세포주;
    HM-2, CEM-CM3, Jurkat/Jurkat 클론 E6-1, J.CaM1.6, BCL2 Jurkat, BCL2 S87A Jurkat, BCL2 S70A Jurkat, Neo Jurkat, BCL2 AAA Jurkat, J.RT3-T3.5, J45.01, J.감마1, J.감마1.WT, JK28, P116, P116.cl39, A3, JX17, D1.1, I 9.2, 또는 I 2.1인 T 세포 백혈병 세포주;
    MV-4-11인 골수단핵세포성 백혈병 세포주;
    HT, BC-3, CA46, Raji, Daudi, GA-10-Clone-4, HH, 또는 H9인 림프종 세포주;
    SU-DHL-1, SU-DHL-2, SU-DHL-4, SU-DHL-5, SU-DHL-6, SU-DHL-8, SU-DHL-10, SU-DHL-16, NU-DUL-1, NCEB-1, EJ-1, BCP-1, TUR, 또는 U-937인 비호지킨 림프종 세포주;
    Ramos/RA 1, Ramos.2G6.4C10, P3HR-1, Daudi, ST486, Raji, CA46, 버킷 림프종 환자로부터의 인간 감마-헤르페스 바이러스 4/HHV-4 볼 종양, DG-75, GA-10, NAMALWA, HS-Sultan, Jiyoye, NC-37, 20-B8, EB2, 1G2, EB1, EB3, 2B8, GA-10 클론 20, 또는 HKB-11/신장-B 세포 하이브리드인 버킷 림프종 세포주;
    Toledo 또는 Pfeiffer인 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주;
    JeKo-1, JMP-1, PF-1, JVM-2, REC-1, Z-138, Mino, 또는 MAVER-1인 맨틀 세포 림프종 세포주;
    AML-193, BDCM, KG-1, KG-1a, Kasumi-6, 또는 HL-60/S4인 AML 세포주;
    K562, K562-r, K562-s, LAMA84-r, LAMA84-s, AR230-r, 또는 AR230-s인 CML 세포주;
    N6/ADR, RS4;11, NALM6 clone G5, Loucy, SUP-B15, 또는 CCRF-SB인 ALL 세포주;
    IDH2-mutant-TF-1 동질유전자형 세포주인 적백혈병 세포주;
    GDM-1인 골수단핵모세포성 백혈병 세포주;
    NK-92, 또는 NK-92MI인 악성 비호지킨 NK 림프종 세포주;
    U266B1/U266, HAA1, SA13, RPMI-8226, NCI-H929, 또는 MC/CAR인 골수종/형질세포종 세포주;
    MM.1R, IM-9, 또는 MM.1S인 다발성 골수종 세포주; 및
    MD, SC, 또는 WBC264-9C인 대식세포 세포주
    중에서 선택되는 것인 세포.
  23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    APCETH-201(APCETH), APCETH-301(APCETH), Cx601(TIGENIX), TEMCELL, MSC-100-IV, 또는 Prochymal(MESOBLAST)인 중간엽 줄기 세포주;
    ToleraCyte(Fate Therapeutics)인 유도 만능 줄기 세포(iPSC);
    CCD-16Lu 또는 WI-38인 섬유모세포 세포주;
    Malme-3M, COLO 829, HT-144, Hs 895.T, hTERT 또는 PF179T CAF인 종양-관련 섬유모세포 세포주;
    HUVEC, HUVEC/TERT 2 또는 TIME인 내피 세포주;
    HEK-293, HEK-293 STF, 293T/17, 293T/17 SF, 또는 HEK-293.2sus인 배아 상피 세포주;
    hESC BG01V인 배아 줄기 세포주; 및
    NuLi-1, ARPE-19, VK2/E6E7, Ect1/E6E7, RWPE-2, WPE-stem, End1/E6E7, WPMY-1, NL20, NL20-TA, WT 9-7, WPE1-NB26, WPE-int, RWPE2-W99, 또는 BEAS-2B인 상피 세포주
    중에서 선택된 변형된 또는 처리된 세포인 것인 세포.
  24. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈액 악성 세포주인 세포주로부터 변형된 또는 처리된 세포인 것인 세포.
  25. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 종양 세포주로부터 변형된 또는 처리된 세포인 것인 세포.
  26. 제25항에 있어서, 세포주는 NCI-60 패널, 섬유육종, 간암종, 전립선암, 유방암, 두경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 결장암, 위암, 부인암, 육종, 흑색종, 편평 세포 암종, 간세포 암종, 방광암, 신장 세포 암종, 배아성 암종, 고환 기형종, 교모세포종, 성상세포종, 갑상성 암종 또는 중피종 세포주로부터 선택되는 것인 세포.
  27. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, GM-CSF 전체 종양 세포백신(GVAX)으로부터 변형된 또는 처리된 세포인 것인 세포.
  28. 제27항에 있어서, GVAX는 GVAX 전립선; GVAX 췌장; GVAX 폐; 또는 GVAX 신장 세포인 것인 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 파보 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 폭스 바이러스, 콕사키 바이러스(CXV) 및 세네카 밸리 바이러스(SVV) 중에서 선택되는 것인 세포.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해 바이러스는 백시니아 바이러스인 것인 세포.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해 바이러스는 천연두 백신인 백시니아 바이러스인 것인 세포.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 백시니아 바이러스는 리스터 스트레인, 웨스턴 리저브(WR) 스트레인, 코펜하겐(Cop) 스트레인, 베른 스트레인, 파리 스트레인, 타슈켄트 스트레인, 티안 탄 스트레인, 와이어스 스트레인(DRYVAX), IHD-J 스트레인, IHD-W 스트레인, 브라이턴 스트레인, 앙카라 스트레인, CVA382 스트레인, 다이렌 I 스트레인, LC16m8 스트레인, LC16M0 스트레인, 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 스트레인, ACAM 스트레인, WR 65-16 스트레인, 코노트 스트레인, 뉴욕시 보건 위생부(NYCBH) 스트레인, EM-63 스트레인, NYVAC 스트레인, 리스터 스트레인 LIVP, JX-594 스트레인, GL-ONC1 스트레인, 및 VGF 및 TK가 결실된 vvDD TK 돌연변이 스트레인 중에서 선택되는 것인 세포.
  33. 제32항에 있어서, 백시니아 바이러스는 ACAM2000 또는 ACAM1000인 것인 세포.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 이종성 유전자 생성물을 발현하고/하거나 증가된 종양원성을 가지고/가지거나 감소된 독성(증가된 약독화)을 가지도록 변형되는 것인 세포.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해 바이러스는 검출 가능한 마커를 암호화하는 것인 세포.
  36. 제35항에 있어서, 마커는 형광 단백질인 것인 세포.
  37. 제29항에 있어서, 바이러스는 ONYX-015, CG00070, 온코린(H101), ColoAd1, ONCOS-102, 또는 델타4-RGD/DNX-2401인 아데노바이러스인 것인 세포.
  38. 제1항 내지 제29항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 변형된 HSV-1 바이러스인 것인 세포.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 세포에서의 바이러스 증폭, 대상체에서 또는 종양 미세환경에서 항-바이러스 상태의 유도를 차단하는 것, 면역 억제/면역 회피(immune evasion), 동종 비활성화(allogeneic inactivation)/거부반응 결정 요인에 대한 보호, 및/또는 보체에 대한 보호 중 하나 이상을 이루기 위해 또는 향상시키기 위해 또는 개선하기 위해 감작되거나 처리된 것인 세포.
  40. 제39항에 있어서, 바이러스 증폭을 향상시키거나 개선하기 위하여 감작된 것인 세포.
  41. 제39항에 있어서, 대상체에서 또는 종양 미세환경에서 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작되거나 처리된 것인 세포.
  42. 제39항에 있어서, 사이토카인 또는 성장 인자 중 하나 이상의 사전 처리 또는 처리에 의하여 바이러스 증폭을 향상시키기 위해 감작된 것인 세포.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-γ 및/또는 인터페론-β를 억제하기 위해 처리되거나, 또는 그것의 억제제를 발현시키기 위해 변형되는 것인 세포.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, GM-CSF, RTK/mTOR 작용물질, Wnt 단백질 리간드, 및 GSK3 억제제/길항물질 중 하나 이상을 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 바이러스 증폭을 향상시키기 위해 감작된 것인 세포.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, IFN 타입 I/타입 II 수용체를 간섭하는, 하류 IFN 신호전달을 간섭하는, IFNAR1/IFNAR2 신호전달을 간섭하는, IFNGR1/IFNGR2 신호전달을 간섭하는, STAT1/2 신호전달을 간섭하는, Jak1 신호전달을 간섭하는, Jak2 신호전달을 간섭하는, IRF3 신호전달을 간섭하는, IRF7 신호전달을 간섭하는, IRF9 신호전달을 간섭하는, TYK2 신호전달을 간섭하는, TBK1 신호전달을 간섭하는, 또는 세포 또는 대상체에서 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 이루게 하는 다른 신호전달 경로를 간섭하는 하나 이상의 소분자 또는 단백질 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 것인 세포.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, IFN 신호전달/반응성을 간섭/제거(deregulating) 하기 위하여 하나 이상의 HDAC 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 감작된 것인 세포.
  47. 제46항에 있어서, HDAC 억제제는 보리노스타트, 로미뎁신, 치다마이드, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 발프로산, 모세티노스타트, 아벡시노스타트, 엔티노스타트, SB939, 레스미노스타트, 기비노스타트, 퀴시노스타트, HBI-8000, 케베트린, CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ME-344, 설포라판 및 트리코스타틴 중에서 선택되는 것인 세포.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 감지(sensing) 및/또는 항-바이러스 방어 경로의 길항물질로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 항-바이러스 상태의 유도를 차단하기 위해 또는 바이러스 증폭을 향상시키기 위해 감작된 것인 세포.
  49. 제48항에 있어서, 바이러스 감지 및/또는 방어 경로(들)는 STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI (ZBP1) 중 하나 이상에 의해 매개되는 것인 세포.
  50. 제49항에 있어서, 길항물질은 K1, E3L, 및 K3L 백시니아 단백질; NS1/NS2 인플루엔자 단백질; C형 간염 NS3-4A; 아레나 바이러스 NP 및 Z 단백질; 에볼라 바이러스 VP35; HSV US11, ICP34.5 및 ICP0; MCMV M45; 및 보르나병 바이러스 X 단백질 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 세포.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 비활성화/거부반응 결정요인에 대해 보호하기 위해 감작된 것인 세포.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하나 이상의 바이러스 주요 조직적합성 복합체(MHC) 길항물질로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 비활성화/거부반응 결정요인에 대해 보호하기 위해 감작된 것인 세포.
  53. 제52항에 있어서, MHC 길항물질은 백시니아로부터의 A40R MHCI 길항물질; HIV로부터의 Nef 및 TAT; 아데노바이러스로부터의 E3-19K; HSV 1 및 HSV2로부터의 ICP47; 우두로부터의 CPXV012 및 CPXV203; 수두 대상포진 바이러스(VZV)로부터의 ORF66; 엡스타인 바 바이러스(EBV)로부터의 EBNA1, BNLF2a, BGLF5, 및 BILF1; 인간 사이토메갈로 바이러스(hCMV)로부터의 US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, 및 US11/gp33; 레서스 CMV(RhCMV)로부터의 Rh178/VIHCE; 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV6) 또는 HHV7로부터의 U21; 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)로부터의 LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, 및 kK5/MIR2; 마우스 간염 바이러스-68(MHV-68)로부터의 mK3; 알파-헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 소 헤르페스 바이러스-2(BHV-1), 및 가성광견병 바이러스(PRV)로부터의 UL41/vhs; 바리셀로바이러스, BHV-1, 말 헤르페스 바이러스 1 및 4(EHV-1/4) 및 PRV로부터의 UL49.5; 및 쥐과 CMV(mCMV)로부터의 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 세포.
  54. 제51항에 있어서, 세포는 인간 MHC 부류 I 사슬 관련 유전자 MIC-A 및 MIC-B의 길항물질로 또는 바이러스 기원의 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 길항물질로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 비활성화/거부반응 결정요인에 대해 보호하기 위해 감작된 것인 세포.
  55. 제39항에 있어서, 세포는 바이러스 기원의 면역억제 인자로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 면역 억제/면역 회피를 향상시키기 위해 감작된 것인 세포.
  56. 제55항에 있어서, 면역억제 인자는 면역 FAS/TNF/그랜자임 B-유도 세포자멸사의 억제제, IL-1/NFkB/IRF3 길항물질; IL-1 및 toll-유사 수용체(TLR) 길항물질; IL-1β 길항물질, TNFα 차단제, IFNα/β 차단제, 및 IFNγ 차단제 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 세포.
  57. 제39항에 있어서, 세포는 항원 펩타이드 수송체-1/2(TAP-1 및 TAP-2) 및 타파신 중 하나 이상의 소분자 억제제(들) 하나 이상으로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 면역 억제/면역 회피를 향상시키기 위해 감작된 것인 세포.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 보체에 대한 보호를 위해 감작된 것인 세포.
  59. 제58항에 있어서, 항체 또는 소분자 또는 보체 단백질의 다른 억제제로 세포를 로딩하기 위한 사전 처리 또는 처리에 의해 감작된 것인 세포.
  60. 제59항에 있어서, 보체 단백질은 C3 또는 C5인 것인 세포.
  61. 제39항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 바이러스 감염 전, 또는 대상체에게 투여되기 전, 또는 보관 전에 15분 내지 48시간 동안 감작시키거나 보호하는 작용제로 사전처리되는 것인 세포.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 바이러스-매개 살해에 비해 연장된 생존 및 개선된 국소 면역억제를 위해 감작된 것인 세포.
  63. 제62항에 있어서, STING, PKR, RIG-I, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI (ZBP1) 중 하나 이상의 작용물질(들)로 사전처리되는 것인 세포.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 바이러스 증폭 및/또는 면역조절을 위해 다음 중 하나 이상에 의해 조작되는 것인 세포:
    a) 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 또는 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작함;
    b) T 및 NKT 세포 중 하나 이상 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 적응성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작함;
    c) NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 선천성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작함;
    d) 동종 항-운반 세포 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위해 인간 또는 바이러스 기원의 면역억제 인자를 발현하도록 조작함;
    e) 그렇지 않으면 비허용 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작함; 및
    f) 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작함.
  65. 제64항에 있어서, a) 타입 I/타입 II IFN 수용체 및/또는 하류 신호전달의 일시적인 또는 영구적인 억제에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태에 대해 비반응성이 되도록 조작되고, 여기서 영구적인 억제는 억제되는 유전자좌를 결실함으로써 이루어질 수 있는 것인 세포.
  66. 제65항에 있어서, 억제는 타입 I/타입 II 인터페론 수용체 발현, IFNα/β 수용체 발현, IFNγ 수용체 발현, IFNAR1/IFNAR2 수용체 발현, IFNGR1/IFNGR2 수용체 발현, STAT1/2 수용체 발현, Jak1/2 수용체 발현, IRF3 수용체 발현, IRF7 수용체 발현, IRF9 수용체 발현, TYK2 키나제 발현, 및 TBK1 키나제 발현 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어지는 것인 세포.
  67. 제64항에 있어서, a) 세포질 바이러스 DNA/RNA-감지 및 항-바이러스 방어 기작의 요소의 일시적인 또는 영구적인 억제에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태에 대해 비반응성이 되도록 조작되는 것인 세포.
  68. 제67항에 있어서, 억제는 STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI (ZBP1) 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어지는 것인 세포.
  69. 제64항에 있어서, a) STING, PKR, RIG-1, MDA-5, OAS-1/2/3, AIM2, MAVS, RIP-1/3, 및 DAI(ZBP1)에 의해 매개된 바이러스-감지 및 항-바이러스 방어 경로의 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현에 의해 인터페론-유도 항바이러스 상태를 방지하거나 그것에 대해 비반응성이 되도록 조작되는 것인 세포.
  70. 제69항에 있어서, 길항물질(들)은 K1, E3L, 및 K3L 백시니아 단백질; NS1/NS2 인플루엔자 A 단백질; C형 간염 NS3-4A; 아레나 바이러스 NP 및 Z 단백질; 에볼라 바이러스 VP35; HSV US11, ICP34.5 및 ICP0; MCMV M45; 및 보르나병 바이러스 X 단백질 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 세포.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, b) T 및 NKT 세포 중 하나 이상 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 적응성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하기 위하여 조작되는 것인 세포.
  72. 제71항에 있어서, T 및 NKT 세포 중 하나 이상 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 적응성(adaptive) 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하기 위하여 조작하는 것은:
    (i) MHC 부류 I 분자, MHC 부류 II 분자, MHC-유사 분자, 및 MHC 부류 I, MHC 부류 II, 및 MHC-유사 분자의 전사 또는 발현의 조절자 중 하나 이상의 일시적인 또는 영구적인 억제; 및
    (ii) 바이러스 기원의 B2M 길항물질 및/또는 바이러스 기원의 MHC 길항물질의 일시적인 또는 영구적인 발현
    중 어느 하나에 의해 또는 둘 다에 의해 이루어지는 것인 세포.
  73. 제72항에 있어서,
    하나 이상의 MHC 부류 I 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 HLA-A, B, 및/또는 C의 일시적인 또는 영구적인 억제에 의해 이루어지고;
    하나 이상의 MHC 부류 II 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 HLA-DP, DQ 및 DR 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어지며;
    하나 이상의 MHC-유사 분자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 CD1a/b/c/d의 억제에 의해 이루어지고; 그리고
    MHC 부류 I, MHC 부류 II, 및 MHC-유사 분자의 전사 또는 발현의 하나 이상의 조절자의 일시적인 또는 영구적인 억제는 TAP1/2, 타파신, 베타-2 마이크로글로불린, CIITA, RFXANK, RFX5 및 RFXAP 중 하나 이상의 억제에 의해 이루어지는 것인 세포.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, B2M, 및/또는 MHC의 일시적인 또는 영구적인 억제는 다음 중 하나 이상의 일시적인 또는 영구적인 발현에 의해 이루어지는 것인 세포:
    hCMV로부터의 UL18로부터 선택된 바이러스 기원의 B2M 길항물질; 및
    백시니아로부터의 A40R MHCI 길항물질; HIV로부터의 Nef 및 TAT; 아데노바이러스로부터의 E3-19K; HSV 1 및 HSV2로부터의 ICP47; 우두(Cowpox)로부터의 CPXV012 및 CPXV203; 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus, VZV)로부터의 ORF66; 엡스타인 바 바이러스(EBV)로부터의 EBNA1, BNLF2a, BGLF5, 및 BILF1; 인간 사이토메갈로 바이러스(hCMV)로부터의 US2/gp24, US3/gp23, US6/gp21, US10, 및 US11/gp33; 레서스 CMV(RhCMV)로부터의 Rh178/VIHCE; 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV6) 또는 HHV7로부터의 U21; 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)로부터의 LANA1, ORF37/SOX, kK3/MIR1, 및 kK5/MIR2; 마우스 간염 바이러스-68(MHV-68)로부터의 mK3; 알파-헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 소 헤르페스 바이러스-2(BHV-1), 및 가성광견병 바이러스(pseudorabies virus, PRV)로부터의 UL41/vhs; 수두 대상포진 바이러스, BHV-1, 말 헤르페스 바이러스 1 및 4(EHV-1/4) 및 PRV로부터의 UL49.5; 및 쥐과 CMV(mCMV)로부터의 m4/gp34, m6/gp48, m27, m152/gp40 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 MHC 길항물질.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) (i) 막-결합 MICA/B 또는 막-결합 PVR, 또는 막-결합 넥틴(Nectin)-2의 일시적인 또는 영구적인 억제, 여기서 영구적인 억제는 유전자좌를 결실시킴으로써 이루어질 수 있는 것인 억제; 및
    (ii)　MIC-A 및 MIC-B의 길항물질, NKG2D 수용체의 길항물질, NCR의 길항물질, NK 억제 수용체(KIR)에 대한 리간드, 또는 NK 억제 수용체 NKG2a/CD94에 대한 리간드의 일시적인 또는 영구적인 발현
    중 어느 하나 또는 둘 다에 의해, NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 선천성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하기 위해 조작되는 것인 세포.
  76. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, c) 다음 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해 NK 세포에 의한 동종 인식을 피하기 위해 조작되는 것인 세포:
    (i) NKG2D 리간드 및/또는 DNAM-1 리간드의 일시적인 또는 영구적인 억제; 및
    (ii) MIC-A 및 MIC-B kK5(카포시 육종 바이러스(KHSV)로부터 유래함)의 길항물질;
    NKG2D 수용체 우두 OMCP의 길항물질;
    NKp30, NKp44, NKp46 수용체, 헤마글루티닌(백시니아 및 기타 바이러스로부터의 HA)을 표적화하는 NCR의 길항물질;
    HLA-Bw4 및 HLA-C2로부터 선택된 NK 억제 수용체(KIR)에 대한 리간드; 및/또는
    HLA-E 및 유도체 단독 또는 HLA-E 결합 펩타이드를 생성하고 HLA-E 표면 발현을 안정화시키기 위해 21M HLA-B 리간드와 조합된 유도체로부터 선택된 NK 억제 수용체(NKG2a/CD94)에 대한 리간드
    의 일시적인 또는 영구적인 발현.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, d) 동종 항-운반 세포 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위하여 면역억제 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, d) 인간 또는 바이러스 기원의 인자로부터 선택된 동종 항-세포 비히클 또는 항-바이러스 면역 반응을 방지/억제하기 위한 면역억제 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  79. 제78항에 있어서, 인간 기원의 인자는 IDO, 아르기나제, TRAIL, iNOS, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, sMICA, sMICB, sHLA-G, HLA-E, PD-L1, FAS-L, B7-H4, 및 NK 및/또는 NKT 세포, 및/또는 γδ T 세포를 표적으로 하거나 고갈시키는 단일 사슬 항체(scFv) 중 하나 이상 중에서 선택되는 것인 세포.
  80. 제78항에 있어서, 바이러스 기원의 인자는 엑트로멜리아/백시니아 바이러스 SPI-2/CrmA(면역 FAS/TNF/그랜자임 B 유도 세포자멸사의 억제제), 백시니아 바이러스 암호화된 N1(IL-1/NFkB/IRF3 길항물질), HA(NKp30, NKp44, NKp46을 표적화하는 NCR 길항물질), IL-18 결합 단백질, A40R, A46R, A52R, B15R/B16R, TNFα 차단제, IFNα/β 차단제, IFNγ 차단제, 및 기타 IL-1/IL-1β/NFκB/IRF3/NCR/MHCI/TLR/NKG2D 길항물질 중 하나 이상 중에서 선택되는 것인 세포.
  81. 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, e) 그렇지 않으면 비허용 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  82. 제64항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, e) 그렇지 않으면 비허용 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작되며, 여기서 인자는 하나 이상의 성장 인자 및 바이러스 감염을 용이하게 하는 사이토카인 중에서 선택되는 것인 세포.
  83. 제64항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, e) 그렇지 않으면 비허용 운반 세포 및/또는 종양 세포의 바이러스 감염을 용이하게 하는 암 또는 줄기 세포-유래 인자를 발현하도록 조작되며, 여기서 인자는 암 관련 항원, 태아종양 항원, 종양 유전자/종양 억제자, 분화 항원, GM-CSF, IL-10, TGFβ, VEGF, FGF-2, PDGF, HGF, IL-6, RTK/mTOR 작용물질 및 Wnt 단백질 리간드 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 세포.
  84. 제64항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, f) 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  85. 제64항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, f) 보체 단백질의 단백질 길항물질 및/또는 보체 단백질을 억제하는 항체로부터 선택된 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  86. 제64항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, f) 보체 인자의 단백질 길항물질(C1, C2, C3, C4, C5, MBL), 백시니아 바이러스 보체 제어 단백질(VCP), 백시니아 바이러스 보체 억제제(B5R), scFv 항-CD1q/CD1r/CD1s, 항-C3 항체, 항-C5 항체, 콤프스타틴 패밀리의 펩타이드 C3 억제제, 인간 가용성 막(s/m) 단백질, 인간 인자 H 및 유도체, 및 코브라 독 인자 및 보체 억제 활성을 가진 유도체 중에서 선택된 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자를 발현하도록 조작되는 것인 세포.
  87. 암의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 암을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  88. 암을 가진 대상체의 치료를 위한 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포의 용도.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체에 대해 동종인 것인 방법 또는 용도.
  91. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체에 대해 자가(autologous)인 것인 방법 또는 용도.
  92. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체에 매칭된 것인 방법 또는 용도.
  93. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 매칭 검정에 의해 세포가 투여될 대상체에 세포를 매칭시키는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  94. 암의 치료 방법으로서, 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되어 있고; 그리고
    운반 세포는:
    바이러스가 복제할 수 있는 세포; 및
    세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리 및 변형되었고/되었거나, 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포인, 방법.
  95. 암의 치료 방법으로서, 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되어 있고; 그리고
    운반 세포는 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 방법.
  96. 암의 치료 방법으로서, 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    운반 세포는 대상체에 대해 동종이고 대상체에게 매칭되어 있으며; 그리고
    운반 세포는:
    바이러스가 복제할 수 있는 세포; 및
    세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리 및 변형되었고/되었거나, 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포인, 방법.
  97. 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법으로서, 운반 세포는 대상체에 대해 동종이고 대상체에게 매칭되어 있는, 방법.
  98. 암의 치료를 위해 사용하기 위한, 종양용해 바이러스를 포함하는 운반 세포로서, 운반 세포는 대상체에 매칭되어 있는, 운반 세포.
  99. 암의 치료를 위한 운반 세포의 용도로서,
    운반 세포는 종양용해 바이러스를 포함하고;
    운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되어 있으며; 그리고
    운반 세포는:
    바이러스가 복제할 수 있는 세포; 및
    세포의 면역억제 특성 또는 면역특권 특성을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형되었거나 또는 처리 및 변형되었고/되었거나, 세포에서 바이러스의 증폭을 향상시키기 위해 처리되었거나 변형됨으로써, 바이러스를 종양에 전달하기 위해 대상체의 선천성/적응성 면역 장벽을 극복하는 세포인, 용도.
  100. 암의 치료를 위한 운반 세포의 용도로서,
    운반 세포는 종양용해 바이러스를 포함하고;
    운반 세포는 대상체에 매칭되거나 매칭되어 있으며; 그리고
    운반 세포는 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 용도.
  101. 대상체에서 암의 치료를 위한 운반 세포의 용도로서,
    운반 세포는 대상체에 대해 동종이고;
    운반 세포는 종양용해 바이러스를 포함하며; 그리고
    운반 세포는 대상체에 매칭되는, 용도.
  102. 대상체에서 암의 치료를 위한 운반 세포의 용도로서,
    운반 세포는 대상체에 대해 동종이고;
    운반 세포는 종양용해 바이러스를 포함하며;
    운반 세포는 대상체에 매칭되고; 그리고
    운반 세포는 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는, 용도.
  103. 제94항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양인 것인 방법 또는 용도.
  104. 제94항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 개선된 바이러스 증폭 특성을 가지고/가지거나 향상된 면역억제 또는 면역 특권 특성을 가지도록 처리되거나 변형되는 것인 방법 또는 용도.
  105. 제94항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 바이러스 증폭을 촉진하고/하거나나 운반 세포의 면역억제 또는 면역 특권 특성을 향상시키는 인자로의 사전처리에 의해 감작되는 것인 방법 또는 용도.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 세포는 그것의 바이러스 증폭 잠재력을 개선하기 위해 조작되는 것인 방법 또는 용도.
  107. 제87항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 고형 종양을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  108. 제87항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인 것인 방법 또는 용도.
  109. 제87항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 비인간 동물인 것인 방법 또는 용도.
  110. 제87항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 개, 고양이, 말, 돼지, 소 또는 비인간 영장류인 것인 방법 또는 용도.
  111. 제87항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종, 육종, 골수종, 및 신경모세포종으로부터 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  112. 제87항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 뇌암, 중추신경계암, 선암종(adenocarcinomas), 간암, 피부암, 혈액암(hematological cancers), 담관암(biliary tract cancer), 골암(bone cancer), 융모막 암종(choriocarcinoma), 결장 및 직장암(colon and rectal cancers), 결합조직 암(connective tissue cancer), 소화기 암(cancer of the digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암(eye cancer), 두경부암(head and neck cancer), 위암(gastric cancer), 상피 내 신생물(intra-epithelial neoplasm), 신장암(kidney cancer), 후두암(larynx cancer), 구강암(oral cavity cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 호흡기 암(cancer of the respiratory system), 위암(stomach cancer), 고환암, 갑상선암, 자궁암 및 비뇨기암(urinary system cancers) 중에서 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  113. 제87항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 결장암(colon cancer), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 입술 암(cancer of the lip), 설암(cancer of the tongue), 구강암(cancer of the mouth), 신경교종(gliomas), 및 인두암(cancer of the pharynx) 중에서 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  114. 제87항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 없는 운반 세포는 IFN-감마로 사전처리되고, 바이러스를 포함하는 운반 세포의 투여 전에, 또는 바이러스를 포함하는 운반 세포와 동시에 투여되거나 사용되는 것인 방법 또는 용도.
  115. 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 다른 항암제의 투여 또는 다른 항암 요법으로의 치료를 추가로 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  116. 제115항에 있어서, 추가의 항암제 또는 치료는 면역요법을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  117. 제115항에 있어서, 추가의 항암제 또는 치료는 수술, 면역 동시자극 작용물질, BiTEs, CAR-T 세포 및 종양-특이적 항원을 표적화하는 TCR 유전자도입 T 세포, 체크포인트 억제제, 화학요법 화합물/항체, 및 면역억제 약물 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  118. 제117항에 있어서, 추가의 항암제 또는 치료는 면역억제 약물인 것인 방법 또는 용도.
  119. 제117항에 있어서, 추가의 항암제 또는 치료는 CD28 및 ICOS 중에서 선택된 B7 패밀리; 4-1BB, OX40, GITR, CD40, CD30 및 CD27 중에서 선택된 TNFR 패밀리; LIGHT; LT-알파; PD-1, PD-2, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, IDO 1 및 2, CTNNB1(β-카테닌), SIRPα, VISTA, LIGHT, HVEM, LAG3, TIM3, TIGIT, 갈렉틴-9, KIR, GITR, TIM1, TIM4, CEACAM1, CD27, CD40/CD40L, CD48, CD70, CD80, CD86, CD112, CD137( 4-1BB), CD155, CD160, CD200, CD226, CD244(2B4), CD272(BTLA), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, ICOS, A2aR, A2bR, HHLA2, ILT-2, ILT-4, gp49B, PIR-B, HLA-G, ILT-2/4 및 OX40/OX-40L, MDR1, 아르기나제 1, iNOs, IL-10, TGF-β, pGE2, STAT3, VEGF, KSP, HER2, Ras, EZH2, NIPP1, PP1, TAK1 및 PLK1a 중 하나 이상을 표적으로 하는 체크포인트 억제제; 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 감광제, 독소, 항암 항생물질, 화학요법 화합물, 방사성 핵종, 혈관형성 억제제, 신호전달 조절제, 항대사산물, 항암 백신, 항암 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 유사분열 방지 올리고펩타이드, 항암 항체, 면역치료제 중에서 선택된 화학요법 화합물 및 항체; 및 글루코코르티코이드, 칼시뉴린 억제제, mTOR 억제제, 메토트렉세이트, 레날리도미드, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 및 사이클로포스파미드, TNFα 차단 항체, 및 플루다라빈으로부터 선택된 면역억제 약물 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법 또는 용도.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 세포는 그것이 투여될 또는 그것이 투여되는 대상체에 매칭되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  121. 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 대상체에게 전달하기 위해 대상체로부터의 면역 세포와 충분히 면역학적으로 적합한 운반 세포를 확인하기 위하여, 운반 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터의 면역 세포와 매칭되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 바이러스와 매칭되고, 세포의 바이러스 증폭 능력이 측정되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 세포/바이러스 조합은 대상체에게 매칭되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 면역 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체는 세포에서 바이러스의 복제 능력 및/또는 바이러스 증폭을 촉진하는 세포의 능력을 테스트하기 위해 테스트되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  126. 제125항에 있어서, 세포에서 바이러스의 복제 능력 및/또는 바이러스 증폭을 촉진하는 세포의 능력은 세포와 바이러스를 공동 배양하고 바이러스 증폭 속도를 측정함으로써 테스트되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  127. 제126항에 있어서, 세포에서 바이러스의 복제 능력 및/또는 바이러스 증폭을 촉진하는 세포의 능력은 다음:
    a) 0.01-10 또는 약 0.01-10의 감염 다중도(MOI)를 사용하여 바이러스 증폭 속도를 측정하고, 1일 내지 1주 또는 약 1주(24시간-1주) 동안 동등한 검정 조건 하에서 공동 배양하는 단계; 및
    b) 감염된 세포 운반체의 수에 대해 표준화하는 단계에 의해 측정되며, 여기서:
    동등한 검정 조건 하에 측정된 세포당 표준화된 플라크 형성 단위(pfu) 값은 운반 세포 + 바이러스 조합이 치료법에 적합한지(또는 아닌지) 순위를 매기기 위한 바이러스 증폭 점수(VAS)를 계산하기 위해 사용될 수 있고;,
    1-10의 운반 세포당 플라크 형성 단위는 제한된 효능(특정 바이러스에 대한 세포 운반체로서)으로 여겨지며;
    10-100의 세포당 Pfu는 양호한 효능이고;
    100-1000의 세포당 Pfu는 매우 양호한 효능이며;
    1000 초과의 세포당 Pfu는 극히 높은 효능이고; 그리고
    적어도 10의 pfu/세포를 보이는 운반 세포와 바이러스의 조합은 세포와 대상체의 대상체 적합성 스크린에서의 테스트에 대한 것으로 간주되는
    것인 세포, 방법 또는 용도.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 세포/바이러스 조합은:
    a) HLA-E, CD1a,b,c,d, MICA/B 중 하나 이상을 포함한, MHC I/II 하플로타입, KIR 하플로타입 및 리간드, 및 비고전적 MHC 하플로타입을 확인하기 위하여 환자-특이적 유전자 다형성을 평가하는 단계;
    b) 운반 세포 중에서 대상체와 가장 적합한 세포를 확인하기 위하여 대상체의 유전자 다형성 프로파일을 이용 가능한 운반 세포의 프로파일과 비교하는 단계;
    c) 세포, 바이러스 및 면역 세포를 공동 배양함으로써 운반 세포와 대상체 면역 세포의 적합성을 평가하는 단계; 및
    d) 바이러스 증폭 수준을 평가하는 단계
    에 의해 치료될 대상체에 매칭되는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  129. 제128항에 있어서,
    e) 투여용 운반 세포/바이러스를 확인하기 위하여, 종양 세포 및 바이러스 증폭의 비히클-지향적 이동을 검출함으로써 운반 세포 + 살아있는 종양 생검 +/- 바이러스를 측정하는 단계를 추가로 포함하며,
    대상체 종양 생검 + 세포 비히클 중의 바이러스 증폭은:
    동등한 조건 하에서 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭 + 동등한 조건 하에서 세포 비히클 단독에서의 바이러스 증폭의 합보다 5% 이상 더 크거나; 또는
    동등한 조건 하에서 종양 생검 단독에서의 바이러스 증폭보다 적어도 5% 이상 더 큰 것인 세포, 방법 또는 용도.
  130. 제128항 또는 제129항에 있어서, 대상체-유래 PBMC + 운반 세포 + 바이러스를 배양함으로써 운반 세포-매개 바이러스 요법에 대한 대상체 허용성을 평가하기 위한 공동 배양을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체-유래 PMBC + 운반 세포 + 바이러스의 공동 배양에서 바이러스 증폭을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 매치는:
    운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 80%를 초과한다면 적합(compatible)하고;
    운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 30-80% 범위에 있다면 중간 정도로 적합하며;
    운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 10-30% 범위에 있다면 최소한으로 적합하고;
    운반 세포와 환자 PBMC의 공동 배양에서의 바이러스 증폭이 동일한 운반 세포가 PBMC의 부재하에 감염될 때 바이러스 증폭의 10% 미만이라면 부적합(incompatible)하며; 그리고
    % 적합성(% compatibility)은 각 개별 환자 및 각 특정 바이러스에 대한 최소 내지 가장 적합한 운반 세포로 운반 세포의 순위를 매기기 위해 사용될 수 있는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클(운반 세포)을 선택함에 의한 운반 세포와 대상체 사이의 매칭은 다음 결정요인 (a) 내지 (f) 중 하나 이상을 세포 비히클(운반 세포)과 대상체 사이의 매치의 지표로서 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해 이루어지는 것인 세포, 방법 또는 용도:
    a) 세포 비히클 및 대상체는 50% 이상의 다음의 조합된유전자좌에서 동일한 대립유전자를 가진다:
    (i) MHC I 및/또는 MHC II 하플로타입;
    (ii) KIR 하플로타입 및/또는 KIR 리간드 하플로타입; 및
    (iii) HLA-E, CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 하플로타입;
    b) 세포 비히클을 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
    (i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 세포에서 종양으로의 이동 점수(CTMS);
    (ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 종양에서 세포로의 이동 점수(TCMS); 및/또는
    (iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 이동 점수(MRS);
    c) 세포 비히클을 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
    (i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 세포의 종양으로의 이동 점수(V-CTMS);
    (ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 종양의 세포로의 이동 점수(V-TCMS); 및/또는
    (iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 바이러스 로딩된 이동 점수(V-MRS);
    d) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 대상체로부터 얻은 면역 세포의 부재를 제외하고 동등한 조건 하에서 얻어진 바이러스 증폭의 양에 비해 대상체로부터 얻은 면역 세포의 존재 하에 바이러스 증폭의 양을 나타내는 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)는 적어도 20%이다;
    e) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서의 면역 반응에 비해 세포 비히클의 존재 하의 면역 반응을 나타내는 면역학적 적합성 점수(ICS)는 ≤ 200%이며, 여기서 면역 반응은 다음 중 하나 이상의 발현의 양에 의해 측정된다:
    (i) IFNγ;
    (ii) T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 하나 이상의 마커; 및/또는
    (iii) T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포 활성자/이펙터 기능(들)과 관련된 하나 이상의 마커;
    f) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건에 비해, 세포 비히클은 항-바이러스 면역 반응을 증대시키지 않고/않거나 항-바이러스 면역 반응을 억제하며, 다음 식을 따라 ≥0%의 면역학적 억제 점수(ISS)에 의해 측정된다:
    ISS% = [(IV + IC) - ICV] /(IV + IC) x 100, 식에서:
    IV = 바이러스 + 대상체로부터 얻은 면역 세포의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
    IC = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이며;
    ICV = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클 + 바이러스의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고; 그리고
    마커 발현 수준은 e)의 (i), (ii) 및 (iii)에서 제시된 마커의 하나 이상의 발현 수준이며;
    a) - f) 중 하나 이상이 만족되면, 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭을 확인하고 세포 비히클을 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클로서 선택한다.
  133. 제132항에 있어서, a) - f) 중 하나 이상의 전에,
    세포 비히클이 바이러스와 인큐베이션될 때 바이러스 증폭 점수(VAS)를 pfu/세포로서 측정하는 단계를 추가로 포함하며;
    만약 VAS 점수가 적어도 10이면 그 세포 비히클을 결정요인 (a) - (f) 중 하나 이상을 사용하여 스크리닝하기 위해 선택하여 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭이 있는지를 확인하는 단계를 포함하는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 방법은 가능한 운반 세포 패널에 대해 그것의 순위를 매기기 위하여 종양용해 바이러스의 대상체에 대한 유효성, 또는 전달을 토대로 다중화되며, 다음을 포함하는 다중화 방법에 의해 1의 순위는 가장 바람직하고, 가장 높은 순위이며 숫자가 커질수록 덜 바람직한 순위를 나타내는 것인 세포, 방법 또는 용도:
    (i) 패널의 각 세포 비히클에 대해 a) - f) 중 하나 이상의 값(들)을 측정하고 측정된 값(들)에 따라 각 세포 비히클의 순위를 매기는 단계로서,
    a)의 경우, 세포 비히클과 대상체 사이의 대립유전자의 동일성이 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
    b)의 경우, 세포 비히클에 대한 CTMS, TCMS 및/또는 MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
    c)의 경우, 세포 비히클에 대한 V-CTMS, V-TCMS 및/또는 V-MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
    d)의 경우, 세포 비히클에 대한 IVAS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
    e)의 경우, 세포 비히클에 대한 ICS 점수가 낮을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
    f)의 경우, 세포 비히클에 대한 ISS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지는 단계; 및/또는
    (ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, a) - f)의 둘 이상의 값(들)을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻고, 그것들의 누적 순위에 따라 패널의 세포 비히클의 순위를 매기는 단계.
  135. 제134항에 있어서,
    (i) 패널의 각 세포 비히클에 대해, 세포 비히클이 바이러스와 함께 인큐베이션될 때 pfu/세포로서 바이러스 증폭 점수(VAS)를 얻는 단계;
    (ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, VAS 점수 및 a) - f) 중 하나 이상의 값을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻는 단계; 및
    (iii) 패널의 세포 비히클을 그것들의 각각의 누적 순위에 따라 순위를 매기는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 세포, 방법 또는 용도.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 세포 공동 배양에서의 마커 발현 측정을 토대로 얻어지는 것인 방법.
  137. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 공동 배양(들)의 상층액에서 마커 발현의 측정을 토대로 얻어지는 것인 방법.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, IVAS 점수는
    (i) d)의 공동 배양에 공동 배양 부피의 중량을 기준으로(또는 v/v) 10-50%의 양으로 대상체로부터의 혈청을 첨가하는 단계;
    (ii) 다음 식:
    SSRS = pfu/혈청 없는 세포 - pfu/혈청을 포함한 세포
    pfu/혈청 없는 세포
    을 따라 대상체 혈청 저항 점수(SSRS)를 계산하는 단계; 및
    (iii) 식: IVAS(교정된 SSRS) = IVAS x(1-SSRS) x 100을 따라 퍼센트 SSRS-교정된 IVAS 점수를 계산하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 바이러스 증폭에 대한 대상체 혈청의 영향에 대해 교정되는 것인 방법.
  139. 변형된 세포 비히클 또는 운반 세포로서,
    a) 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위한 세포 비히클의 감작;
    b) 항-바이러스 반응의 유도를 차단하기 위한 세포 비히클의 감작;
    c) 대상체에 의한 동종 비활성화 및/또는 거부반응에 대한 세포 비히클의 보호;
    d) 보체에 대한 세포 비히클의 보호; 및/또는
    e) 바이러스-매개 살해에 대해 세포 비히클을 내성으로 만드는 것
    중에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 세포 비히클 또는 운반 세포.
  140. 변형된 세포 비히클(운반 세포)로서,
    a) 세포 비히클을 인터페론-유도 항바이러스 반응에 대해 비반응성이 되게 하는 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제;
    b) T 및 NKT 세포 중 하나 이상, 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 적응성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하는 것을 용이하게 하기 위한 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제;
    c) NK 세포 및/또는 γδ T 세포의 하나 이상의 선천성 면역 반응(들)에 의한 동종 인식을 회피하는 것을 용이하게 하기 위한 유전자의 일시적인 또는 영구적인 발현 또는 억제;
    d) 면역억제 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현;
    e) 세포 비히클과의 바이러스 회합을 용이하게 하는 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현; 및
    f) 보체 및/또는 중화 항체의 기능을 간섭하는 인자의 일시적인 또는 영구적인 발현
    을 위해 조작된 변형된 세포 비히클(운반 세포).
  141. 제140항에 있어서, 변형은:
    a) 바이러스 증폭 능력을 향상시키기 위한 세포 비히클의 감작;
    b) 항-바이러스 반응의 유도를 차단하기 위한 세포 비히클의 감작;
    c) 대상체에 의한 동종 비활성화 및/또는 거부반응에 대한 세포 비히클의 보호;
    d) 보체에 대한 세포 비히클의 보호; 및/또는
    e) 바이러스-매개 살해에 대해 세포 비히클을 내성으로 하는 것
    으로부터 추가로 선택되는 것인 변형된 세포 비히클(운반 세포).
  142. 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 것으로서 세포 비히클을 선택하는 방법으로서, 다음 결정요인 (a) - (f) 중 하나 이상을 세포 비히클과 대상체 사이의 매치의 지표로서 확인하는 단계를 포함하는, 방법:
    a) 세포 비히클 및 대상체는 50% 이상의 다음의 조합된 유전자좌에서 동일한 대립유전자를 가진다:
    (i) MHC I 및/또는 MHC II 하플로타입;
    (ii) KIR 하플로타입 및/또는 KIR 리간드 하플로타입; 및
    (iii) HLA-E, CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d 하플로타입;
    b) 세포 비히클을 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
    (i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 세포에서 종양으로의 이동 점수(CTMS);
    (ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 종양에서 세포로의 이동 점수(TCMS); 및/또는
    (iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 이동 점수(MRS);
    c) 세포 비히클을 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 암성 세포와 공동 배양으로 인큐베이션하는 것은 다음 중 하나 이상을 초래한다:
    (i) 암성 세포를 향해 이동하는 세포 비히클 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 세포의 종양으로의 이동 점수(V-CTMS);
    (ii) 세포 비히클 세포를 향해 이동하는 암성 세포의 20% 이상의 바이러스 로딩된 종양의 세포로의 이동 점수(V-TCMS); 및/또는
    (iii) 적어도 20%의 [(i) +(ii)]/2의 누적 바이러스 로딩된 이동 점수(V-MRS);
    d) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 대상체로부터 얻은 면역 세포의 부재를 제외하고 동등한 조건 하에서 얻어진 바이러스 증폭의 양에 비해 대상체로부터 얻은 면역 세포의 존재 하에 바이러스 증폭의 양을 나타내는 면역학적 바이러스 증폭 점수(IVAS)는 적어도 20%이다;
    e) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서의 면역 반응에 비해 세포 비히클의 존재 하의 면역 반응을 나타내는 면역학적 적합성 점수(ICS)는 ≤ 200%이며, 여기서 면역 반응은 다음 중 하나 이상의 발현의 양에 의해 측정된다:
    (i) IFNγ;
    (ii) T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포-매개 세포독성과 관련된 하나 이상의 마커; 및/또는
    (iii) T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포 활성자/이펙터 기능(들)과 관련된 하나 이상의 마커;
    f) 세포 비히클이 종양용해 바이러스 및 대상체로부터 얻은 면역 세포와 공동 배양으로 인큐베이션될 때, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건에 비해, 세포 비히클은 항-바이러스 면역 반응을 증대시키지 않고/않거나항-바이러스 면역 반응을 억제하며, 다음 식을 따라 ≥0%의 면역학적 억제 점수(ISS)에 의해 측정된다:
    ISS% = [(IV + IC) - ICV] /(IV + IC) x 100, 식에서:
    IV = 바이러스 + 대상체로부터 얻은 면역 세포의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
    IC = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이며;
    ICV = 대상체로부터 얻은 면역 세포 + 세포 비히클 + 바이러스의 공동 배양 중의 마커 발현 수준이고;
    마커 발현 수준은 e)의 (i), (ii) 및 (iii)에서 제시된 마커의 하나 이상의 발현 수준이며;
    a) - f) 중 하나 이상이 만족되면, 세포 비히클과 대상체 사이의 매칭을 확인하고 세포 비히클을 암을 가진 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기에 적합한 세포 비히클로서 선택한다.
  143. 제142항에 있어서, a) - f) 중 하나 이상의 전에:
    세포 비히클이 바이러스와 함께 인큐베이션될 때 Pfu/세포로서 바이러스 증폭 점수(VAS)를 측정하는 단계; 및
    VAS 점수가 적어도 10이라면, 세포 비히클을 스크리닝을 위해 (a) - (f) 중 하나 이상을 사용하여 선택하여 세포 비히클과 대상체 사이의 매치가 있는지를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  144. 다중화 방법으로서, 세포 비히클의 패널에 적용된 제142항 또는 제143항의 방법 및 그것을 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기 위한 바람직성(desirability)에 따라 순위를 매기는 단계를 포함하며, 순위 1은 가장 바람직하고, 가장 높은 순위이며 숫자가 커질수록 덜 바람직한 순위를 나타내며, 방법은:
    (i) 패널의 각 세포 비히클에 대해 a) - f) 중 하나 이상의 값(들)을 측정하고 측정된 값(들)에 따라 각 세포 비히클의 순위를 매기는 단계로서,
    a)의 경우, 세포 비히클과 대상체 사이의 대립유전자의 동일성이 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
    b)의 경우, 세포 비히클에 대한 CTMS, TCMS 및/또는 MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
    c)의 경우, 세포 비히클에 대한 V-CTMS, V-TCMS 및/또는 V-MRS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고;
    d)의 경우, 세포 비히클에 대한 IVAS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지며;
    e)의 경우, 세포 비히클에 대한 ICS 점수가 낮을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지고; 및
    f)의 경우, 세포 비히클에 대한 ISS 점수가 높을수록, 세포 비히클의 순위는 더 높아지는 단계; 및/또는
    (ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, a) - f)의 둘 이상의 값(들)을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻고, 그것들의 누적 순위에 따라 패널의 세포 비히클의 순위를 매기는 단계를 포함하는 방법.
  145. 제144항에 있어서,
    (i) 패널의 각 세포 비히클에 대해, 세포 비히클이 바이러스와 함께 인큐베이션될 때 pfu/세포로서 바이러스 증폭 점수(VAS)를 얻는 단계;
    (ii) 패널의 각 세포 비히클에 대해, VAS 점수 및 a) - f) 중 하나 이상의 값을 측정한 것을 토대로 둘 이상의 순위의 평균인 누적 순위를 얻는 단계; 및
    (iii) 패널의 세포 비히클을 그것들의 누적 순위에 따라 순위를 매기는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  146. 제142항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 세포 공동 배양의 마커 발현 측정을 토대로 얻어지는 것인 방법.
  147. 제142항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, ICS 점수 및/또는 ISS 점수는 공동 배양(들)의 상층액에서의 마커 발현의 측정을 토대로 얻어지는 것인 방법.
  148. 제142항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, IVAS 점수는:
    (i) d)의 공동 배양에 공동 배양 부피의 중량(또는 v/v)을 기준으로 10-50%의 양으로 대상체로부터의 혈청을 첨가하는 단계;
    (ii) 다음 식:
    SSRS = pfu/혈청 없는 세포 - pfu/혈청을 포함한 세포
    pfu/혈청 없는 세포
    을 따라 대상체 혈청 저항 점수(SSRS)를 계산하는 단계; 및
    (iii) 식: IVAS(교정된 SSRS) = IVAS x(1-SSRS) x 100을 따라 퍼센트 SSRS-교정된 IVAS 점수를 계산하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 바이러스 증폭에 대한 대상체 혈청의 영향에 대해 교정되는 것인 방법.
  149. 종양용해 바이러스로 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서,
    a) 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항의 방법에 따라 종양용해 바이러스의 전달을 위한 운반 세포를 선택하는 단계; 및
    b) 세포 비히클 및 종양용해 바이러스를 대상체에 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  150. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 제약학적으로 허용되는 비히클에 포함하는 제약학적 조성물.
  151. 제150항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 것인 제약학적 조성물.
  152. 제151항에 있어서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양을 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  153. 제1항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 전신적으로, 국소적으로, 종양내로, 간내로, 정맥내로, 직장으로 또는 피하로 투여되는 것인 세포, 방법, 용도 또는 제약학적 조성물.
  154. 제97항에 있어서, 운반 세포는 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항의 방법에 의해 대상체에 매칭되는 것인 방법.
  155. 제87항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항의 매칭 검정에 의해 투여될 대상체에 세포를 매칭시키는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  156. 제98항에 있어서, 운반 세포는 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항의 방법에 의해 대상체에 매칭되는 것인 운반 세포.
  157. 암을 가진 대상체를 그 대상체에 종양용해 바이러스를 전달하기 위한 세포 비히클과 매칭시키는 방법으로서,
    세포 비히클, 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 세포를 포함하는 공동 배양에서 다음:
    (a) 세포 비히클이 존재하지 않는 것을 제외하지 않으면 동등한 조건에 비교하여 T 세포 활성화에 대한 하나 이상의 마커의 감소된 수준;
    (b) 세포 비히클이 존재하지 않는 것을 제외하지 않으면 동등한 조건에 비교하여 NK 세포 활성화에 대한 하나 이상의 마커의 감소된 수준; 및
    (c) 세포 비히클이 존재하지 않는 것을 제외하지 않으면 동등한 조건에 비교하여 NKT 세포 활성화에 대한 하나 이상의 마커의 감소된 수준
    중 하나 이상을 검출함으로써 세포 비히클이 대상체에서 면역 장벽을 극복하는지를 측정하는 단계를 포함하고,
    만약 (a), (b) 및 (c) 중 하나 이상이 만족되면, 세포 비히클이 대상체에 매칭된 것인, 방법.
  158. 암을 가진 대상체를 종양용해 바이러스를 대상체에게 전달하기 위한 세포 비히클과 매칭시키는 방법으로서,
    (a) 바이러스 및 세포 비히클이 대상체로부터의 세포와 함께 인큐베이션될 때 얻어진 바이러스 증폭의 양을 측정하는 단계;
    (b) 대상체로부터의 세포의 부재를 제외하고, 바이러스 및 세포 비히클이 동등한 조건 하에서 인큐베이션될 때 얻어진 바이러스 증폭의 양을 측정하는 단계; 및
    (c) (a)와 (b)에서 측정된 양을 비교하고, 만약 (a)에서 측정된 증폭의 양이 (b)에서 측정된 증폭의 양의 적어도 20%라면, 세포 비히클이 대상체에 매칭되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 세포 비히클과 대상체에서 대립유전자의 적어도 10%가 동일한지를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 대립유전자는 하나 이상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 및/또는 살해 세포 억제 수용체(KIR) 유전자좌에 있는 것인 방법.
  160. 제159항에 있어서, 동일한 대립유전자를 확인하는 단계는 마커의 수준 또는 바이러스 증폭의 양을 측정하기 전에 수행되는 것인 방법.
  161. 암을 가진 대상체를 종양용해 바이러스를 대상체에게 전달하기 위한 세포 비히클과 매칭시키는 방법으로서,
    세포 비히클 및 대상체에서 주요 조직적합성 복합체(MHC) 및/또는 살해 세포 억제 수용체(KIR) 유전자좌에서 동일한 대립유전자를 확인하는 단계; 및
    대립유전자의 적어도 50%가 동일하면, 세포 비히클을 대상체에 대한 매치로서 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  162. 암을 가진 대상체를 종양용해 바이러스를 대상체에게 전달하기 위한 세포 비히클과 매칭시키는 방법으로서,
    세포 비히클, 종양용해 바이러스 및 대상체로부터의 세포를 포함하는 공동 배양에서, 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서 검출된 발현 수준의 ≤200%인 하나 이상의 면역학적 마커의 발현 수준을 검출함으로써 세포 비히클이 대상체의 면역 장벽을 극복하는지를 측정하는 단계를 포함하며, 마커는:
    (1) T 세포 활성화에 대한 마커;
    (2) NK 세포 활성화에 대한 마커; 및
    (3) NKT 세포 활성화에 대한 마커
    중 하나 이상으로부터 선택되고,
    만약 공동 배양에서 (1), (2) 및 (3) 중에서 선택된 적어도 한 마커의 발현 수준이 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서 검출된 발현 수준의 ≤200%이면 세포 비히클은 대상체에 대한 매치인 것인, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 및/또는 살해 세포 억제 수용체(KIR) 유전자좌에서 적어도 하나의 대립유전자가 세포 비히클 및 대상체에서 동일한지를 확인하는 단계를 추가로 포함하며, 만약 적어도 하나의 유전자좌가 동일하고 공동 배양에서 하나 이상의 면역학적 마커의 발현 수준이 세포 비히클의 부재를 제외한 동등한 조건 하에서 검출된 발현 수준의 ≤200%이면 세포 비히클은 대상체에 대한 매치인 것인 방법.
  164. 제163항에 있어서, 동일한 대립유전자(들)를 확인하는 단계는 하나 이상의 면역학적 마커의 발현 수준을 검출하는 단계 전에 수행되는 것인 방법.
  165. 제157항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 비히클은 제1항 내지 제86항, 제120항 내지 제135항 및 제139항 내지 제141항 중 어느 한 항에 제시된 세포 중에서 선택되는 것인 방법.
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