BR112021004465A2

BR112021004465A2 - métodos para expansão de células car-t específicas de antígeno, composições e usos relacionados às mesmas

Info

Publication number: BR112021004465A2
Application number: BR112021004465-5A
Authority: BR
Inventors: Blake T. Aftab; Christina Pham; Rhine Shen; Michelle Wu
Original assignee: Atara Biotherapeutics, Inc.
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-05-25
Also published as: EP3849571A1; SG11202101468XA; EP3849571A4; KR20210061361A; IL281187A; MX2021002702A; WO2020055862A1; CN112969470A; AU2019338307A1; US20210301255A1; JP2021536260A; CA3111796A1

Abstract

São providos na presente invenção métodos para preparar e caracterizar preparados e culturas de célula CAR-T.

Description

"MÉTODOS PARA EXPANSÃO DE CÉLULAS CAR-T ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO, COMPOSIÇÕES E USOS RELACIONADOS ÀS MESMAS” PEDIDOS RELACIONADOS

[001] A O presente pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de patente provisória US números de série 62/729.089, depositado em 10 de setembro de 2018 e 62/896.707 depositado em 6 de setembro de 2019, que são incorporados por referência Na íntegra.

ANTECEDENTES

[002] Imunoterapia adotiva envolve a implantação ou infusão de células T específicas de doença e/ou criada, como células T citotóxicas específicas de antígeno e células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CAR0 em indivíduos com o objetivo de reconhecer, direcionar e destruir células associadas a doença. Imunoterapias adotivas se tornaram uma abordagem promissora para o tratamento de muitas doenças e distúrbios, incluindo câncer, distúrbios linfo proliferativos pós-transplante, doenças infecciosas (por exemplo, infecções virais) e doenças autoimunes.

[003] Por exemplo, foi mostrado que a exposição ao Vírus Epstein Barr onipresente (EBV, também conhecido como vírus de herpes humano 4) pode resultar em predisposição a ou de outro modo desempenhar um papel na patogênese de doenças autoimunes, incluindo esclerose múltipla (MS), doença autoimune sistêmica (SAD) e doença inflamatória do intestino (IBD). Tais patologias (isto é, MS, SADe IBD) se originam de resposta imune anormal contra o próprio tecido do corpo. MS é caracterizado pela degradação de mielina, uma bainha lipídica de proteção que circunda fibras de nervos, pelas próprias células imunes do corpo. SADs são um grupo de doenças de tecido conectivo com diversos sintomas que incluem artrite reumatóide (RA), lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e síndrome de Sjögren (SS). IBDs são um grupo de condições inflamatórias do cólon e intestino delgado que incluem doença de Crohn, doença celíaca e colite ulcerativa. Estudos recentes mostraram que indivíduos diagnosticados com MS mostram níveis mais altos de proteínas relacionadas a EBV em células B agregadas em tecido nervoso do que em indivíduos saudáveis.

[004] A associação entre infecção viral e a patogênese de múltiplas condições (por exemplo, canceres e doenças autoimunes) forneceu o ímpeto para vários grupos desenvolverem a produção de células T específicas de antígeno alogenéicas (vide, por exemplo, WO 2017/203368, incorporado pelo presente por referência) e autólogas (vide, por exemplo, Pender et al., Multiple Sclerosis Journal. 2014; 20(11):1541-1544) .

[005] Imuno-vigilância por células T desempenha um papel crítico na detecção e morte de uma gama ampla de células malignas (Gottschalk et al. 2005. Leuk Lymphoma. 46:1–10; Ochsenbein et al. 2002. Cancer Gene Ther. 9:1043–10). A sobrevivência e disseminação de células malignas foi associada à capacidade de tais células evadirem reconhecimento por CTLs (Bubenik et al. 2003. Oncol. Rep. 10:2005–2008; Rees et al. 1999. Cancer Immunol. Immunother. 48:374-381). Em particular, as funções de processamento e apresentação de antígeno permanecem intactas nas malignidades associadas a EBV como linfoma de Hodgkin e carcinoma de nasofaringe (Khanna et al. 1998. Cancer Res. 58: 310-314, Lee et al. 1998. Blood 92: 1020-1030). Estudos recentes sugeriram que imuno-vigilância (e subsequente resposta) pode ser subvertida por supressão mediada por célula T reguladora das células T específicas de EBV, levando à falha em tirar células malignas. Por exemplo, a supra regulação de receptores de controle imunológico inibidores, como PD-1 e Tim-3, correlaciona com a disfunção de célula T e foi observada tanto em células específicas de vírus de hepatite C (HCV) como células T CD8+ não específicas de HCV em pacientes com infecção crônica de HCV. A recuperação parcial da proliferação de células T e secreção de IFN-y pode ser obtida ex vivo por inibir a ligação de PD-1 e Tim-3 a seus ligantes respectivos (isto é, B7-H1, também conhecido como PD-L1 e Galectina-9). Adicionalmente, relatórios recentes demonstraram que a administração prolongada de terapia com interferon pode levar à “exaustão” de células T, um estado disfuncional caracterizado por potencial proliferativo diminuído, perda progressiva de função e expressão controlada de receptores de controle imunológico inibidores.

[006] Células de receptor de antígeno quimérico (CAR)-T são um tratamento aprovado pela FDA para leucemia linfoblástica aguda pediátrica e linfoma de células grandes difuso. A proliferação e persistência de células CAR-T in vivo é um fator importante na eficácia do tratamento. Para essa finalidade, descrevemos na presente invenção métodos para a geração e/ou produção de células T específicas de antígeno autólogos e alogenéicos (por exemplo, células T especificamente sensibilizadas para detectar, por exemplo, antígeno(s) associado(s) a EBV), e foram também criadas para expressar pelo menos um receptor de antígeno quimérico funcional dirigido contra um antígeno escolhido, associado à doença. A geração de CTLs específicos de antígeno que expressam também um ou mais CARs provê uma plataforma nova de imunoterapia adotiva para o tratamento de uma ampla gama de doenças. Além disso, células CAR-T que representam fenótipos de célula T de memória central (Tcm) e célula T de memória semelhante à célula tronco (Tscm) facilitam um potencial proliferativo e expansão in vivo controlada após infusão de célula CAR T (Kalos, 2018). Portanto, o enriquecimento de produtos de imunoterapia adotiva (por exemplo, células CAR-T) para fenótipos Tcm e Tscm usando métodos de estimulação e cultura aperfeiçoados é vantajoso para a potência in vivo, persistência e eficácia para esse modo de terapia. Tal aumento de respostas de célula T contra câncer e/ou antígenos associados a autoimune, através da transferência adotiva de células T específicas de antígeno criado (por exemplo, células T que expressam CAR, específicas de antígeno) pode oferecer alternativas atraentes para as estratégias de tratamento atuais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] São fornecidos na presente invenção métodos de gerar células T alogenéicas ou autólogas que expressam um receptor de células T que se liga especificamente a um antígeno (por exemplo, um antígeno de vírus como um peptídeo EBV) apresentado em um complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC) e um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga especificamente a um antígeno de célula alvo ou marcador de superfície de célula (por exemplo, um antígeno associado à célula de câncer como CD19). Em algumas modalidades, as células T específicas de antígeno são geradas por incubar uma amostra compreendendo células T (células respondedoras, por exemplo, uma amostra de PBMC ou células T isoladas a partir da mesma) com células apresentadoras de antígeno (APCs, isto é, células estimuladoras) apresentando um antígeno (por exemplo, peptídeo viral) em um MHC classe I (por exemplo, um MHC classe I codificado por um alelo HLA que está presente no sujeito), induzindo, desse modo, a proliferação de células T respondedoras específicas de antígeno. De preferência, as células T respondedoras específicas de antígeno são transduzidas com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR. São também providos na presente invenção métodos para induzir proliferação ex vivo de uma população de células T específicas de antígeno que expressam CAR, compreendendo cultivar uma população de células T isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno e transduzindo as células T específicas de antígeno resultantes com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um CAR. Em algumas modalidades as células T transduzidas são cultivadas com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno para induzir a proliferação de células CAR T específicas de antígeno. Em certas outras modalidades, as células T isoladas são transduzidas com um vetor viral de codificação de CAR antes do cultivo com APCs. Ainda em modalidades adicionais, as células T isoladas são cultivadas com APCs antes de e após transdução com um vetor viral de codificação de CAR.

[008] Em alguns aspectos, são providos na presente invenção métodos ex vivo para enriquecimento de células T de memória central. Em certas modalidades, tais métodos compreendem a obtenção de uma amostra de células a partir de um sujeito compreendendo células T CD3+ e colocar as células T CD3+ em contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno. Em modalidades preferidas, as células T CD3+ são isoladas da amostra antes de contato das células estimuladoras apresentadoras de antígeno por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, seleção positiva de células CD3+ a partir da amostra e/ou seleção negativa por depleção de células ou componente indesejáveis a partir da amostra). Por exemplo, e sem limitação, tais métodos incluem seleção com glóbulos anti-CD3 (por exemplo, glóbulos magnéticos), aderência plástica, elutriação, depleção de células NK (por exemplo, usando glóbulos anti-CD56) e/ou combinações dos mesmos. Em algumas dessas modalidades, as células T CD3+ são transduzidas com um vetor viral codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) antes e/ou após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno. Em algumas dessas modalidades, as células T específicas de antígeno, CD3+,que expressam CAR são cultivadas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[009] Em algumas modalidades, as células estimuladoras são feitas para apresentar pelo menos um antígeno de peptídeo de vírus por incubar as células estimuladoras pretendidas com vírus do tipo nativo/selvagem ou com um vetor viral que codifica para o antígeno de peptídeo viral. Em algumas dessas modalidades, os antígenos de peptídeo de vírus são derivados de tais tipos de vírus como herpes vírus (por exemplo, EBV e CMV), papilomavírus (por exemplo, HPV), adenovírus, poliomavírus (por exemplo, BKV, JCV e vírus de célula Merkel), retrovírus (por exemplo, HTLV-I, também incluindo lentivírus como HIV), picornavírus (por exemplo, vírus de Hepatite A), hepadnavírus (por exemplo, vírus de hepatite B), hepacivírus (por exemplo, vírus de Hepatite C), delta vírus (por exemplo, vírus de Hepatite D), hepevírus (por exemplo, vírus de Hepatite E), oncovírus e similares. Em certas modalidades preferidas, as células estimuladoras são feitas apresentar o peptídeo de EBV por incubar PBMCs com EBV do tipo nativo/selvagem. Em outras modalidades preferidas, as células estimuladoras são feitas apresentar o peptídeo EBV por incubar PBMCs com um vetor viral codificando para o peptídeo EBV, desse modo induzindo as células estimuladoras a apresentar o peptídeo EBV. Em algumas modalidades, o peptídeo EBV compreende um peptídeo LMP1 ou um fragmento do mesmo, um peptídeo LMP2A ou fragmento do mesmo e/ou um peptídeo EBNA’ ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o peptídeo EBV compreende uma sequência listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, o vetor viral é um adenovírus incompetente de replicação recombinante (por exemplo, AdE1-LMPpoly). Em algumas modalidades, as células estimuladoras podem ser células B, células T apresentadoras de antígeno, células dendríticas ou células apresentadoras de antígeno artificiais (por exemplo, uma linhagem de células expressando CD80, CD83, 41BB-L e/ou CD86, como células aK562). De preferência, as células estimuladoras apresentadoras de antígeno descritas na presente invenção apresentam também um antígeno de célula alvo ou marcador de superfície de célula para o CAR (como CD19). Em algumas modalidades, as células estimuladoras são irradiadas.

[010] Também são providos na presente invenção métodos para identificar um preparado terapêutico de células CAR-T como adequados para administração. Em algumas modalidades, uma amostra de um preparado terapêutico de células CAR-T é obtida e avaliada em relação a abundância de múltiplos tipos e subtipos de células T. Em algumas dessas modalidades, a quantidade de células CD3+, CD4+,

CD8+, CD62L+, e/ou CD45RO+ é avaliada .

[011] Em certos aspectos, são providos na presente invenção métodos para melhorar a capacidade proliferativa de células T, compreendendo executar os métodos revelados na presente invenção. Em alguns aspetos, são providos na presente invenção métodos para melhorar a viabilidade de células T que expressam CAR, compreendendo executar os métodos revelados na presente invenção. Em certos aspectos, são providas na presente invenção composições de célula T preparadas por qualquer um dos métodos revelados na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012] A figura 1 mostra um fluxograma delineando o procedimento e grupos experimentais comparando transdução de CAR de células EBV-T derivadas de PBMCs ou células T isoladas.

[013] A figura 2 mostra um fenótipo de memória central controlada em células T estimuladas por antígeno (EBV-CTLs).

[014] A figura 3 mostra curvas de crescimento de células EBV-T derivadas de PBMCs e células T isoladas, e transduzidas para expressar um CAR.

[015] A figura 4 mostra enriquecimento de células CAR+ viáveis derivadas de células T isoladas após seleção de blasticidina.

[016] A figura 5 mostra design de estudo para examinar o fenótipo de memória em células T após estimulação e transdução de CAR.

[017] A figura 6 mostra estratégia de gating de citometria de fluxo para identificar CD3, CD4, CD8, CD62L, e CD45RO em células CD19-CAR-T.

[018] A figura 7 mostra gráficos de pontos representativos para CD62L e CD45RO (gated em células CD3+) em células CD19-CAR-T após sem estimulação, BLCL, anti-CD3/CD28 solúvel e estimulação anti-CD3/CD28 ligada por glóbulo. PBMCs virgens foram avaliados também e serviram como referência para subconjuntos de memória gating; o retângulo vermelho mostra expressão de CD62l em células CD45RO+.

[019] A figura 8 mostra gráficos de pontos representativos para expressão de CD4 e CD8 (gated em CD3) em células CD19-CAR T.

[020] A figura 9 mostra células CAR T anti-CD19 específicas de EBV que exercem citotoxicidade potente e específica.

[021] A figura 10 mostra células CART T anti-CD19 específicas de EBV que induzem citotoxicidade específica de CD19.

[022] A figura 11 mostra citólise independente de HLA específica e potente tanto em células casadas-HLA (alvos BLCL) como descasadas-HLA (alvos BLCL e Raji), ao passo que EBV-CTLs podiam somente induzir citólise significativa em células alvo BLCL casadas.

[023] A figura 12 mostra células CAR T anti-CD19 convencionalmente geradas exibindo proliferação alo reativa intensificada em relação a células CAR T anti-CD19, específicas de EBV.

[024] A figura 13 mostra ensaios de diluição de CellTraceTM Violet após cultura conjunta com as linhagens de células indicadas. Em resumo, anti-CD19- CD28-CAR-EBV-CTLs induziram citólise de linhagens de células CD19+ (isto é, BLCL, Raji, e NALM/6; parte inferior-esquerda) enquanto alvos alogenéicos e autólogos sparing não tendo expressão de antígeno EBV e CD19 (isto é, K562 e PHA-blastos), com notavelmente menos alo reatividade em relação a células CAR T convencionais (parte inferior-direita, sombreada).

[025] A figura 14 mostra que o perfil de citosina de células CAR T anti-CD19 específicas de antígeno EBV e células CAR T anti-CD19 convencionalmente geradas apresentam respostas distintas.

DESCRIÇÃO DETALHADA Geral

[026] Os estudos revelados na presente invenção buscam determinar o impacto de vários estímulos de células CAR-T favoráveis a um processo de fabricação de alto rendimento, e/ou para enriquecer imunofenótipos de célula T de memória em um produto terapêutico final.

A estimulação baseada em glóbulo anti- CD3/CD28 é amplamente usada no campo como um método para expandir células T ex vivo ou in vitro antes da transdução com vetores de codificação de CAR.

Entretanto, são revelados na presente invenção processos de fabricação para células T estimuladas por antígeno (por exemplo, células T específicas de vírus) que expressam também um ou mais CARs.

Tais processos podem compreender uma etapa de enriquecimento de células-T inicial, em que células T CD3+ são enriquecidas/purificadas a partir de uma mistura mais heterogênea de células (por exemplo, a partir de sangue integral, de PBMCs e similares); estimuladas para reconhecer e responder a antígenos pré-selecionados (por exemplo, antígenos virais ou outros antígenos associados à doença/tumor etc.); e transduzidas com uma ou mais construções CAR.

Por exemplo, uma amostra de células obtidas a partir de um sujeito compreendendo células T CD3+ (por exemplo, PBMC) pode ser enriquecida para células T CD3+, e as células T CD3+ colocadas em contato com células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

De preferência, as células T CD3+ são isoladas a partir da amostra antes de fazer contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

Mais preferencialmente, as células T e as células estimuladoras apresentadoras de antígeno (por exemplo, BLCLs) são derivadas da mesma amostra e são desse modo casadas-HLA.

Tais métodos e técnicas de seleção de células incluem, em geral, seleção positiva de células CD3+ e/ou CD19+ a partir da amostra e/ou seleção negativa por depleção de células ou componentes indesejáveis a partir da amostra.

Por exemplo, e sem limitação, tais métodos compreendem a seleção com técnicas de separação de células vivas (por exemplo, separação de células ativada por fluorescência), glóbulos anti-CD3 e/ou anti-CD19 (por exemplo, glóbulos magnéticos), aderência plástica, depleção de células NK,

elutriação e/ou combinações dos mesmos. As células T CD3+ resultantes podem ser transduzidas com um vetor viral codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) antes e/ou após contato com células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[027] O estudo revelado na presente invenção provê também uma comparação dos subconjuntos de células T de memória efetora e central de células CAR-T anti-CD19 derivadas da estimulação de CTLs com culturas conjuntas de CD3/CD28 ou BLCL. Definições

[028] Para conveniência, certos termos empregados no relatório descritivo, exemplos e reivindicações apensas são coletados aqui.

[029] Os artigos “um” e “uma” são usados na presente invenção para se referir a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Como exemplo, “um elemento” significa um exemplo ou mais de um elemento.

[030] Como usado na presente invenção, o termo “administrar” significa fornecer um agente farmacêutico ou composição a um sujeito, e inclui, porém não é limitado a, administrar por um profissional médico e autoadministração. Tal agente pode conter, por exemplo, peptídeo descrito na presente invenção, uma célula apresentadora de antígeno fornecida na presente invenção e/ou um CTL fornecido na presente invenção.

[031] O termo “ligação” ou “interação” se refere a uma associação que pode ser uma associação estável, entre duas moléculas, por exemplo, entre um TCR e um peptídeo/MHC, devido, por exemplo, a interações eletrostáticas, hidrofóbicas, iônicas e/ou de ligação de hidrogênio sob condições fisiológicas.

[032] O termo “amostra biológica,” “amostra de tecido,” ou simplesmente “amostra” se refere, cada, a uma coleção de células obtidas a partir de um tecido de um sujeito. A fonte da amostra de tecido pode ser tecido sólido, como a partir de um órgão fresco, congelado e/ou preservado, amostra de tecido, biópsia, ou aspirado; sangue ou quaisquer constituintes de sangue, soro, sangue; fluidos corpóreos como fluido espinhal cerebral, fluido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial; ou células a partir de qualquer momento em gestação ou desenvolvimento do sujeito.

[033] Como usado na presente invenção, o termo “citocina” se refere a qualquer polipeptídio secretado que afete as funções de células e é uma molécula que modula interações entre células na resposta imune, inflamatória ou hematopoiética. Uma citocina inclui, porém não é limitada a, monocinas e linfocinas, independentemente de quais células as produzem. Por exemplo, uma monocina é em geral mencionada como sendo produzida e secretada por uma célula mononuclear, como um macrófago e/ou monócito. Muitas outras células entretanto produzem também monocinas, como células killer naturais, fibroblastos, basófilos, neutrófilos, células endoteliais, astrócitos do cérebro, células estromais de medula óssea, queratinócitos epidérmicos e B-linfócitos. Linfocinas são mencionadas em geral como sendo produzidas por células de linfócitos. Os exemplos de citocinas incluem, porém não são limitadas a, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-15 (IL-15), Fator de necrose de tumor-alfa (TNFα), e Fator de necrose de tumor beta (TNFβ).

[034] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a qualquer derivado de um anticorpo que tenha menos que o comprimento total. Em modalidades exemplificadoras, o fragmento de anticorpo retém pelo menos uma porção significativa da capacidade de ligação específica do anticorpo de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém não são limitados a, Fab, Fab′, F(ab′)2, scFv, Fv, diacorpo dsFv, Fc e fragmentos de Fd. O fragmento de anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser enzimática ou quimicamente produzido por fragmentação de um anticorpo intacto, pode ser produzido de modo recombinante a partir de um gene codificando a sequência de anticorpo parcial, ou pode ser total ou parcialmente sinteticamente produzido. O fragmento de anticorpo pode ser opcionalmente um fragmento de anticorpo de cadeia única. Alternativamente, o fragmento pode compreender múltiplas cadeias que são ligadas juntas, por exemplo, por ligações de dissulfeto. O fragmento também pode ser opcionalmente um complexo multimolecular. Um fragmento de anticorpo funcional compreenderá tipicamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos e mais tipicamente compreenderá pelo menos cerca de 200 aminoácidos.

[035] O termo “sítio de ligação de antígeno” se refere a uma região de um anticorpo que especificamente liga um epítopo em um antígeno.

[036] O termo “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” se refere a um fragmento Fv no qual o domínio de cadeia pesada e o domínio de cadeia leve são ligados. Um ou mais fragmentos scFv pode ser ligado a outros fragmentos de anticorpo (como o domínio constante de uma cadeia pesada ou uma cadeia leve) para formar construções de anticorpo tendo um ou mais sítios de reconhecimento de antígeno.

[037] O termo “fragmento Fab” se refere a um fragmento de um anticorpo compreendendo um sítio de ligação de antígeno gerado por clivagem do anticorpo com a enzima papaína, que corta na região de articulação N-terminalmente com a ligação de dissulfeto de inter-cadeia-H e gera dois fragmentos Fab a partir de uma molécula de anticorpo.

[038] O termo “fragmento F(ab’)2” se refere a um fragmento de um anticorpo contendo dois sítios de ligação de antígeno, gerado por clivagem da molécula de anticorpo com a enzima pepsina que corta na região de articulação C-terminalmente com a ligação de dissulfeto de inter-cadeia-H.

[039] O termo “fragmento Fc” se refere ao fragmento de um anticorpo compreendendo o domínio constante de sua cadeia pesada.

[040] O termo “fragmento Fv” se refere ao fragmento de um anticorpo compreendendo os domínios variáveis de sua cadeia pesada e cadeia leve.

[041] O termo “anticorpo criado” se refere a uma molécula recombinante que compreende pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo um sítio de ligação de antígeno derivado a partir do domínio variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo e pode compreender opcionalmente todos ou parte dos domínios variáveis e/ou constantes de um anticorpo a partir de quaisquer das classes Ig (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY).

[042] O termo “liga especificamente”, “ligação específica” ou “direcionamento”, como usado na presente invenção, ao se referir a um polipeptídio (incluindo anticorpos) ou receptor, se refere a uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína ou polipeptídio ou receptor em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. Desse modo, sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio no caso de um anticorpo), um ligante ou anticorpo especificado “liga especificamente” a seu “alvo” específico (por exemplo, um anticorpo liga especificamente a um antígeno endotelial) quando não liga em uma quantidade significativa a outras proteínas presentes na amostra ou a outras proteínas às quais o ligante ou anticorpo pode entrar em contato em um organismo. Em geral, uma primeira molécula que “liga especificamente” uma segunda molécula tem uma constante de afinidade (Ka) maior que cerca de 105 M–1 (e.g., 106 M–1, 107 M–1, 108 M–1, 109 M–1, 1010 M–1, 1011 M–1, e 1012 M–1 ou mais) com aquela segunda molécula. Por exemplo, no caso da capacidade de um TCR se ligar a um peptídeo apresentado em um MHC (por exemplo, MHC classe I ou MHC classe II); tipicamente, um TCR se liga especificamente a seu peptídeo/MHC com uma afinidade de pelo menos um KD de cerca de 10-4 M ou menos, e se liga ao partner de ligação/antígeno predeterminado com uma afinidade (como expresso por KD) que é pelo menos 10 vezes menos, pelo menos 100 vezes menos ou pelo menos 1000 vezes menos do que sua afinidade para ligação com um complexo MHC/peptídeo não relacionado e não específico (por exemplo, um compreendendo um peptídeo de BSA ou um peptídeo de caseína).

[043] O termo “epítopo” significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo ou TCR. Epítopos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas como aminoácidos ou cadeias secundárias de açúcar. Certos epítopos podem ser definidos por uma sequência específica de aminoácidos aos quais um anticorpo é capaz de se ligar.

[044] Como usado na presente invenção, a frase “farmaceuticamente aceitável” se refere àqueles agentes, compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, no escopo de decisão médica, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva ou outro problema de complicação, comensurável com uma razão razoável de benefício/risco.

[045] Como usado na presente invenção, a frase “veículo farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente ou material de encapsulação de solvente, envolvido em carregar ou transportar uma gente a partir de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada veículo deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não injuriosa para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açucares, como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, como carboxi metil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes; como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, como propileno glicol; (11) poliois, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água sem pirógeno; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool de etila; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[046] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico” são usados de modo intercambiável. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem executar qualquer função. Os exemplos não limitadores que se seguem são exemplos de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento de gene, locais (local) definidos a partir de análise de ligação, exons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência RNA de ribossomo, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações na estrutura de nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou após montagem do polímero. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado, como por conjugação com um componente de rotulação. Em todas as sequências de ácido nucleico fornecidas na presente invenção, U nucleotídeos são intercambiáveis com T nucleotídeos.

[047] Como usado na presente invenção, um terapêutico que “evita” uma condição se refere a um composto que, quando administrado a uma amostra estatística antes do início do distúrbio ou condição, reduz a ocorrência do distúrbio ou condição na amostra tratada em relação a uma amostra de controle não tratada, ou retarda o início ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condição em relação à amostra de controle não tratada.

[048] Como usado na presente invenção, “ligação específica” se refere à capacidade de um TCR se ligar a um peptídeo apresentado em um MHC (por exemplo, MHC classe I ou MHC classe II). Tipicamente, um TCR se liga específica a seu peptídeo/MHC com uma afinidade de pelo menos um KD de cerca de 10-4 M ou menos e se liga ao partner de ligação/antígeno predeterminado com uma afinidade (como expresso por KD) que é pelo menos 10 vezes menos, pelo menos 100 vezes menos ou pelo menos 1000 vezes menos do que sua afinidade para ligação com um complexo MHC/peptídeo não relacionado e não específico (por exemplo, um compreendendo um peptídeo de BSA ou um peptídeo de caseína).

[049] Como usado na presente invenção, o termo “sujeito” significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.

[050] Em certas modalidades, agentes da invenção podem ser usados individualmente ou conjuntamente administrados com outro tipo de agente terapêutico. Como usado na presente invenção, a frase “administração conjunta” ou “administrado conjuntamente” se refere a qualquer forma de administração de dois ou mais agentes terapêuticos diferentes (por exemplo, uma composição compreendendo um CAR T revelado na presente invenção e um inibidor de um controle imunológico) de modo que o segundo agente seja administrado enquanto o agente terapêutico anteriormente administrado ainda está eficaz no corpo (por exemplo, os dois agentes são simultaneamente eficazes no sujeito, que pode incluir efeitos sinergistas dos dois agentes). Por exemplo, os agentes terapêuticos diferentes podem ser administrados na mesma formulação ou em formulações separadas, concomitantemente ou sequencialmente. Em algumas modalidades preferidas, as células CAR T expressam (por exemplo, apresentam na superfície da célula ou secretam) agentes terapêuticos adicionais. Em certas modalidades, os agentes terapêuticos diferentes (por exemplo, células CAR T e moléculas de bloqueio de controle imunológico) podem ser administrados em cerca de uma hora, cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas ou cerca de uma semana um do outro. Desse modo, um sujeito que recebe tal tratamento pode se beneficiar de um efeito combinado de agentes terapêuticos diferentes.

[051] Como usado na presente invenção, o termo “tratamento” se refere à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado durante o curso de patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem diminuir a taxa de progresso, melhora ou diminuição do estado patológico e remissão ou prognóstico aperfeiçoado de uma doença, distúrbio ou condição específica. Um indivíduo é “tratado” com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma doença, distúrbio ou condição específica são diminuídos ou eliminados.

[052] O termo “vetor” se refere ao meio pelo qual um ácido nucleico pode ser propagado e/ou transferido entre organismos, células ou componentes celulares. Vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófago, pro-vírus, phagemids, transposons, e cromossomos artificiais e similares, que podem ou não ser capazes de replicar autonomamente ou integrar em um cromossomo de uma célula hospedeira. Enriquecimento de células T

[053]Até agora, métodos para a fabricação de células CAR-T conhecidas na técnica se basearam em um material de partida bruto e heterogêneo, como PBMC (vide Sun et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:5) ou isolados altamente purificados de tipos de célula T específicos, isto é, células T CD4+, CD8+ ou razões específicas das mesmas (vide Terakura et al. Blood (2011) 119:1 e Turtle et al. Sci Transl Med. (2016) 7;8 setembro). Entretanto, a invenção revelada aqui provê métodos ex vivo para enriquecer células T específicas de antígeno a serem usadas na fabricação de células CAR-T. Notavelmente, em algumas modalidades preferidas, tais métodos compreendem a obtenção de uma amostra de células (por exemplo, PBMC) de um sujeito compreendendo células CD3+ e fazendo contato das células CD3+ com células estimuladoras apresentadoras de antígeno. De preferência, as células T CD3+ são isoladas a partir das amostras antes de entrar em contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, seleção positiva de células CD3+ a partir da amostra e/ou seleção negativa por depleção de células ou componentes indesejáveis a partir da amostra). Por exemplo, e sem limitação, tais métodos incluem seleção usando separação de célula ativada por fluorescência (FACS), com glóbulos anti-CD3 (por exemplo, glóbulos magnéticos), aderência plástica, depleção de células NK usando anti-CD56, elutriação e/ou combinações dos mesmos. A sensibilização das células CD3+ selecionadas a antígenos predeterminados, como antígenos virais, pode promover um fenótipo de memória central na população de células T específicas de antígeno resultante. Tais células T podem ser transduzidas com um vetor viral codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) antes e/ou após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno. Em algumas dessas modalidades, as células T específicas de antígeno, CD3+,que expressam CAR são cultivadas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[054] A etapa de enriquecimento de CD3+ inicial revelada na presente invenção provê um material de partida que é significativamente menos heterogêneo do que uma amostra de PBMC ainda assim retém algum nível de heterogeneidade em relação a frações de célula T altamente purificadas. Sem desejar ser limitado por teoria, é postulado que usando uma etapa de enriquecimento de CD3+ inicial, o material de partida compreende uma mistura de células (incluindo pelo menos uma pluralidade de tipos de célula T efetora, células ajudantes T (células T CD4+ / células TH ), células T citotóxicas (células T CD8+ / CTLs), tipos de célula T de memória (isto é, células T de memória central (células TCM ), células T de memória efetora (células TEM ), células T de memória residente de tecido (TRM), e células T de memória virtual (células TVM )), células T reguladoras (células Treg ), células T assassinas naturais (células NKT ), células invariantes associadas à mucosa (células MAIT ), células T gama delta (células T γδ ), células T duplas-negativas (DNTs), células CD3+ B, ou qualquer combinação das mesmas) que podem funcionar de modo sinergista ou fornecer um meio vantajoso de promover viabilidade e proliferação aumentadas de células T específicas de antígeno após contato com APCs, eficiência de transdução aperfeiçoada de vetor que expressa CAR em tais células T específicas de antígeno e uma percentagem mais alta de células Tcm na composição terapêutica final. Em algumas modalidades, enriquecimento adicional é conduzido após estimulação de células T com antígeno. Por exemplo, depleção de NK (por exemplo, depleção de CD56) pode ser empregada antes de uma etapa de estimulação de antígeno subsequente (isto é, antes da reestimulação de células T específicas de antígeno, enriquecidas com antígeno). Estimulação e transdução

[055] A fabricação de células T expressando um receptor de células T que se liga especificamente a um peptídeo apresentado em um MHC classe I requer expansão de células T contra antígenos definidos. Em algumas modalidades as células T expressam também um CAR que se liga especificamente a um peptídeo associado à doença (por exemplo, um peptídeo associado a tumor, antígeno, ligante ou similar).

[056] O fornecimento de antígeno pode ser via infecção viral por vírus nativo,

ou via transdução usando vírus recombinante, de uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de doadores saudáveis ou células de linfoblastoide de célula B isolados (por exemplo, BLCLs CD19+) a partir dos mesmos.

Desse modo, as células infectadas ou transduzidas atuam como células apresentadoras de antígeno e são mencionadas como “estimuladores”. Em certas modalidades, as células estimuladoras também expressam um peptídeo (isto é, antígeno) na superfície de célula que é reconhecido pelo CAR.

As células estimuladoras podem expressar endogenamente tais peptídeos direcionados a CAR, ou ser criado para expressar tais peptídeos.

O vetor viral usado para transduzir estimuladores pode ser um vírus incompetente para replicação, recombinante (por exemplo, um adenovírus como AdE1-LMPpoly). Alternativamente, as células estimuladoras são infectadas com um vírus nativo/tipo selvagem.

Uma amostra ou cultura separada (por exemplo, PBMCs a partir do mesmo doador que não são usadas para transdução, uma amostra de PBMCs a partir de um doador saudável diferente ou células CD3+ isoladas a partir da mesma) compreende “respondedoras” e contém células T que se tornam o componente ativo de uma terapia, expressando um receptor de célula T que se liga especificamente a um antígeno de peptídeo apresentado em um MHC classe I.

As células T respondedoras podem ser isoladas a partir de PBMC por qualquer método adequado, dos quais muitos são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, células T “respondedora” podem ser isoladas a partir da amostra antes da apresentação à fração estimuladora por métodos conhecidos na técnica como glóbulos anti-CD3 (por exemplo, glóbulos magnéticos), aderência plástica, elutriação e/ou combinações dos mesmos.

De preferência, as células “estimuladoras” (por exemplo, PBMCs ou BLCLs) são obtidas a partir da mesma população de células (por exemplo, amostra de PBMC) como são as células “respondedoras” de modo que sejam identicamente casadas-HLA.

Por exemplo, uma amostra de PBMC a partir de um doador é dividida em uma fração de célula

“estimuladora” e uma fração de células “respondedoras”, onde as células estimuladoras podem ser enriquecidas para células CD3+; e células respondedoras são transduzidas ou infectadas de modo a apresentar antígenos específicos na superfície de célula. Opcionalmente, a fração de células estimuladoras pode ser enriquecida por métodos conhecidos na técnica antes da transdução/infecção, como por seleção para célula CD19+. Desse modo, as células apresentadoras de antígeno apresentarão o antígeno a células T (por exemplo, células enriquecidas CD3+), desse modo ativando e induzindo a proliferação de células T específicas de antígeno. Em algumas dessas modalidades, as células T respondedoras (por exemplo, células T isoladas) são transduzidas com um vetor de codificação de CAR antes da apresentação de antígeno pela fração estimuladora. Em certas modalidades, as células T respondedoras (por exemplo, células T isoladas) são transduzidas com um vetor de codificação de CAR após apresentação de antígeno pela fração estimuladora.

[057] Por conseguinte, são providos na presente invenção métodos de gerar células T alogenéicas ou autólogas que expressam um receptor de célula T que se liga especificamente a, por exemplo, um peptídeo EBV apresentado em um MHC classe I e expressam adicionalmente um receptor de antígeno quimérico (CAR) que se liga a um alvo selecionado (por exemplo, CD19). Em algumas modalidades, APCs são gerados através de infecção viral de células estimuladoras, por exemplo, por EBV nativo/tipo selvagem ou um vetor adenoviral, como AdE1-LMPpoly. O vetor AdE1-LMPpoly.codifica um poli epítopo de epítopos CTL definidos a partir de LMP1 e LMP2 fundidos com uma sequência EBNA1 com repetição Gly-Ala esgotada. O vetor AdE1-LMPpoly.é descrito, por exemplo, em Smith et al., Cancer Research 72:1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research 64:1483-9 (2004); e Smith et al., J. Immunol 117:4897-4906 (2006), cada um dos quais é pelo presente incorporado por referência. Em algumas modalidades, as células estimuladoras são misturadas com células T isoladas não infectadas (respondedoras) de modo a apresentar os poli epítopos EBV para as células T. Em algumas modalidades, células T específicas de vírus, isoladas apresentadas com poli epítopos EBV são ativadas e induzidas para proliferação.

[058] Células T podem ser classificadas em virgens ou um de três subtipos de experiência com antígeno principais: célula T de memória central, célula T de memória efetora e células T efetoras terminalmente diferenciadas. Células T de memória central (células Tcm) são comumente encontradas nos linfonodos e na circulação periférica. Esse subtipo expressa CD45RO, receptor de C-C quimiocina tipo 7 (CCR7) e L-selectina (CD62L). Células T de memória efetora (células TEM ) não têm receptores de localização-linfonodo e são desse modo encontrados principalmente nos tecidos e circulação periférica. Células TEM expressam CD450RO porém não têm expressão de CCR7 e L-selectina. Em certos aspectos, são providos na presente invenção métodos para identificar um preparado terapêutico de células CAR-T como adequados para administração a um receptor. Em algumas modalidades, uma amostra de um preparado terapêutico de células CAR-T é obtida e avaliada para subtipos de células T diferentes. De preferência, o preparado é compreendido predominantemente de células Tcm que expressam CAR e/ou células T CD4+.

[059] Em algumas modalidades, as células respondedoras e as células estimuladoras são individualmente derivadas de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). Em algumas dessas modalidades, as células respondedoras e as células estimuladoras são individualmente derivadas de PBMCs a partir do mesmo doador. Em outras modalidades, as células respondedoras e as células estimuladoras são individualmente derivadas de PBMCs a partir de doadores diferentes. Em algumas dessas modalidades, antes do contato com células estimuladoras, células respondedoras são isoladas e/ou purificadas de modo a consistirem essencialmente em células T. Em modalidades preferenciais, as células respondedoras são isoladas e/ou purificadas de modo a consistirem essencialmente em células CD3+. Mais preferencialmente, as células respondedoras consistem essencialmente em células T CD3+.

[060] Antes da apresentação a células respondedoras (por exemplo, células T), células estimuladoras podem ser infectadas com um vírus nativo, como EBV, apresentando, desse modo antígenos virais em sua superfície. Em algumas modalidades, as células estimuladoras são transduzidas com um vetor viral, de preferência um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um antígeno de herpes vírus. Em algumas dessas modalidades, o vetor adenoviral é incompetente para replicação. Mais preferencialmente, o vetor adenoviral compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais antígenos EBV. O um ou mais antígenos EBV pode compreender um peptídeo LMP1 ou fragmento do mesmo, um peptídeo LMP2A ou fragmento do mesmo e/ou um peptídeo EBNA1 ou fragmento do mesmo. Mais preferencialmente, o vetor adenoviral é AdE1-LMPpoly e codifica um poli epítopo de epítopos CTL definidos a partir de LMP1 e LMP2 fundidos em uma sequência EBNA1 com repetição de Gly- Ala esgotada. Em algumas modalidades, as células estimuladoras são incubadas com uma ou mais citocinas antes da cultura com (isto é, apresentação a) células respondedoras (por exemplo, células enriquecidas com CD3+ ou PBMC não infectadas). Tais células estimuladoras podem compreender células B (por exemplo, BLCLs), células T apresentadoras de antígeno, células apresentadoras de antígeno artificiais e/ou células aK562. Em modalidades preferidas, as células estimuladoras são BLCLs de apresentação de antígeno.

[061] Embora células T específicas de antígeno obtenham ativação e proliferação quando apresentadas com antígeno pela fração estimuladora, tais células estimuladoras não são desejáveis no produto de célula CAR-T colhido final.

Além disso, para minimizar o risco de quaisquer eventos de recombinação viral em células em proliferação levando à formação de vírus competente, as células estimuladoras são tratadas e/ou modificadas antes de cultivar com células T respondedoras de modo a inibir proliferação, por exemplo, por irradiação com raios gama ou exposição a um agente como mitomicina C.

Por exemplo, em tais condições de cultura, células respondedoras (por exemplo, células-T) são apresentadas com antígenos de peptídeo por células estimuladoras não proliferantes.

Em algumas dessas modalidades, a cultura é mantida de pelo menos 24 horas até pelo menos 28 dias antes da transdução com um vetor de codificação de CAR.

Em algumas modalidades, a cultura é mantida por pelo menos 24 horas, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 17 dias, ou pelo menos 28 dias antes da transdução com um vetor de codificação de CAR.

De preferência, a cultura é mantida por pelo menos 2 dias após apresentação de antígeno por células estimuladoras antes da transdução com um vetor de codificação de CAR.

Mais preferencialmente, a cultura é mantida por pelo menos 6 dias após apresentação de antígeno por células estimuladoras antes da transdução com um vetor de codificação de CAR.

Em modalidades adicionais, a cultura é mantida de pelo menos 24 horas a pelo menos 28 dias após transdução com um vetor de codificação de CAR.

Em certas modalidades, a cultura é mantida por pelo menos 24 horas, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 17 dias, ou pelo menos 28 dias após transdução com um vetor de codificação de CAR.

Em algumas modalidades, a cultura é semeada novamente e/ou estimulada novamente conforme necessário. Por exemplo, células T respondedoras são submetidas pelo menos a uma primeira etapa de estimulação (isto é, apresentada com antígeno em APCs) e podem ser semeadas novamente e/ou estimuladas novamente conforme necessário (isto é, uma segunda ou mais vezes). A cultura semeada novamente e/ou estimulada novamente é mantida por pelo menos 24 horas, pelo menos 3 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 17 dias, ou pelo menos 28 dias antes de/ou após transdução com um vetor de codificação de CAR. Em modalidades preferidas, uma cultura de células respondedoras é estimulada pelo menos uma vez antes da transdução com um vetor de codificação de CAR. Mais preferencialmente, a cultura de respondedora é estimulada múltiplas vezes, em que etapas de estimulação subsequentes são separadas por qualquer parte de 2 a 14 dias. Por exemplo, uma cultura sendo submetida a uma primeira estimulação pode ser submetida a uma segunda estimulação (por exemplo, nova estimulação) 11 dias após a primeira estimulação; opcionalmente, uma terceira estimulação (por exemplo, nova estimulação) é iniciada 7 dias após a segunda etapa de estimulação. Uma cultura sendo submetida a uma etapa de estimulação (por exemplo, nova estimulação) é mantida por pelo menos 1 a 10 dias antes da transdução com um vetor de codificação de CAR. De preferência, a cultura é mantida por pelo menos 2 dias antes da transdução com um vetor de codificação de CAR. Mais preferencialmente, a cultura é mantida por pelo menos 6 dias após apresentação de antígeno por células estimuladoras antes da transdução com um vetor de codificação de CAR. Opcionalmente, uma etapa de depleção de NK é empregada antes da estimulação. Por exemplo, células CD56+ podem ser esgotadas da cultura (por exemplo, com glóbulos anti-CD56) imediatamente antes da estimulação por APCs.

[062] Em certas modalidades, após pelo menos uma primeira apresentação de antígeno para obter ativação e proliferação, as células T específicas de antígeno podem ser congeladas e armazenadas antes de e/ou após transdução com um vetor de codificação de CAR, para serem descongeladas em uma data futura. Por exemplo, as células T que expressam CAR específicas de antígeno consideradas na presente invenção podem ser administradas a um sujeito necessitando das mesmas, ou congeladas para armazenagem em um banco de células ou repositório para serem descongeladas em uma data posterior. Em algumas dessas modalidades, a cultura descongelada é estimulada novamente pelo menos mais uma vez com antígeno (por exemplo, com células estimuladoras apresentadoras de antígeno, como BLCLs e similares como descrito na presente invenção) antes de e/ou após transdução como descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, a cultura descongelada é estimulada novamente e/ou semeada novamente conforme necessário, e a cultura estimulada novamente e/ou semeada novamente é mantida por pelo menos 24 horas, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 17 dias, ou pelo menos 28 dias antes de/ou após transdução com um vetor de codificação de CAR como descrito na presente invenção. De modo similar, em tais casos em que a cultura é estimulada novamente múltiplas vezes, etapas de estimulação subsequentes são separadas em qualquer parte de 2 a 14 dias, como descrito na presente invenção.

[063] A ativação e proliferação de células T específicas de antígeno também exigem uma quantidade suficiente de apresentação de antígeno por células estimuladoras. Por conseguinte, as culturas de estimulação consideradas na presente invenção (por exemplo, incluindo culturas de reestimulação) compreendem razões conhecidas de células respondedoras para células simuladoras. Por exemplo, a razão de células respondedoras para células simuladoras é de cerca de 0,1:1 a cerca de 20:1. Preferencialmente, a razão de células respondedoras para células simuladoras é de cerca de 0,2:1 a cerca de 5:1. Em algumas modalidades, a razão de células respondedoras para células simuladoras é de cerca de 20:1, cerca de 19:1, cerca de 18:1, cerca de 17:1, cerca de 16:1, cerca de 15:1, cerca de 14:1, cerca de 13:1, cerca de 12:1, cerca de 11:1, cerca de 10:1, cerca de 9:1, cerca de 8:1, cerca de 7:1, cerca de 6:1, cerca de 5:1, cerca de 4:1, cerca de 3:1, cerca de 2:1, cerca de 1:1, cerca de 0.9:1, cerca de 0.8:1, cerca de 0.7:1, cerca de 0.6:1, cerca de 0.5:1, cerca de 0.4:1, cerca de 0.3:1, cerca de 0.2:1, ou cerca de 0.1:1. Em algumas dessas modalidades, a razão de células respondedoras para células simuladoras é de cerca de 0,25:1, 0,43:1, ou 4:1. Além disso, em tais casos em que a cultura é estimulada novamente múltiplas vezes, cada estimulação pode compreender a mesma razão ou uma razão diferente de células respondedoras para células simuladoras. Por exemplo, e sem limitação, em modalidades preferidas, a estimulação inicial compreende uma razão de respondedora:estimuladora de cerca de 0,43:1. Uma estimulação subsequente (por exemplo, nova estimulação) pode compreender uma razão de respondedora:estimuladora de 0,25:1 e uma estimulação ainda adicional (por exemplo, nova estimulação) compreende uma razão de respondedora:estimuladora de 4:1.

[064] Um técnico no assunto reconheceria que a proliferação de células em cultura pode variar e é limitada por exigências de nutrientes e oxigênio e por acúmulo de produtos residuais como dióxido de carbono e ácido láctico. Como tal, um técnico no assunto seria capaz de determinar empiricamente cultura apropriada e (se necessário) programas de nova semeadura para obter as células T da invenção. Em algumas modalidades, a cultura é mantida até uma data de colheita predeterminada. A avaliação da cultura e determinação da presença ou ausência de um vírus ativo ocorre antes de e/ou no dia da colheita. Mais preferencialmente, as culturas e/ou preparados revelados na presente invenção são essencialmente isentos de vírus ativo no momento da colheita de CTL. Peptídeos antigênicos

[065] Em certos aspectos, são providos na presente invenção métodos de gerar células CAR-T alogenéicas ou autólogas que expressam TCRs que se ligam especificamente a peptídeos (por exemplo, antígenos) compreendendo epítopos de célula T apresentados no MHC classe I, e CARs que se ligam a um alvo selecionado, como um alvo de peptídeo associado à doença, para tratar distúrbios autoimunes e canceres (por exemplo, MS, SAD, IBD e/ou malignidades de célula-B CD19+, linfomas e leucemias). São consideradas na presente invenção células T adequadas para a produção de células CAR-T geradas por incubar uma amostra compreendendo células T (por exemplo, uma amostra de PBMC ou célulasCD3+ isoladas a partir da mesma) com células apresentadoras de antígeno (APCs) que apresentam um ou mais dos epítopos de célula T descritos na presente invenção (por exemplo, APCs que apresentam um peptídeo descrito na presente invenção compreendendo um epítopo EBV em um complexo de MHC classe I, como BLCs transduzidos de modo recombinante ou infectados-EBV).

[066] Em algumas dessas modalidades, os peptídeos compreendendo um epítopo de célula T, como descrito na presente invenção, compreendem epítopos a partir de vírus como, e sem limitação, herpes vírus (por exemplo, EBV e CMV), papilomavírus (por exemplo, HPV), adenovírus, poliomavírus (por exemplo, BKV, JCV, e vírus de célula Merkel), retrovírus (por exemplo, HTLV-I, também incluindo lentivírus como HIV), picornavírus ( por exemplo, vírus de Hepatite A), hepadnavírus (por exemplo, vírus de hepatite B), hepacivírus (por exemplo, vírus de hepatite C), delta vírus (por exemplo, vírus de hepatite D) e hepevírus (por exemplo, vírus de hepatite E) e similares. Em algumas modalidades, os epítopos são epítopos de célula T restritos a classe I HLA. Em outras modalidades, os epítopos são epítopos de célula T restritos a classe II HLA.

[067] Os peptídeos fornecidos na presente invenção podem compreender uma sequência de qualquer proteína viral de EBV (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de qualquer proteína EBV). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem não mais que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos da proteína viral EBV.

[068] Os peptídeos fornecidos na presente invenção podem compreender uma sequência de LMP1 (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de LMP1). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem não mais que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de LMP1. Uma sequência de aminoácido LMP1 exemplificadora é provida abaixo (SEQ ID NO: 1): 1mdldlergpp gprrpprgpp lssyialall llllallfwl yiimsnwtgg allvlyafal 61mlviiiliif ifrrdllcpl galcllllmi tlllialwnl hgqalylgiv lfifgcllvl 121giwvyfleil wrlgatiwql lafflaffld illliialyl qqnwwtllvd llwlllflai 181liwmyyhgqr hsdehhhdds lphpqqatdd ssnhsdsnsn egrhhllvsg agdapplcsq 241nlgapgggpd ngpqdpdntd dngpqdpdnt ddngphdplp qdpdntddng pqdpdntddn 301gphdplphnp sdsagndggp pnlteevenk ggdrgppsmt dggggdphlp tlllgtsgsg 361gddddphgpv qlsyyd

[069] Em algumas modalidades, os peptídeos providos na presente invenção compreendem uma sequência de LMP2A (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de LMP2A). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem não mais que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de LMP2A. Uma sequência de aminoácido LMP2A exemplificadora é provida abaixo (SEQ ID NO: 2): 1mgslemvpmg agppspggdp dgddggnnsq ypsasgsdgn tptppndeer esneeppppy 61edldwgngdr hsdyqplgnq dpslylglqh dgndglpppp ysprddssqh iyeeagrgsm 121npvclpviva pylfwlaaia ascftasvst vvtatglals llllaavass yaaaqrkllt 181pvtvltavvt ffaicltwri edppfnsllf allaaagglq giyvlvmlvl lilayrrrwr 241rltvcggimf lacvlvlivd avlqlspllg avtvvsmtll llafvlwlss pgglgtlgaa 301lltlaaalal laslilgtln lttmfllmll wtlvvllics scsscpltki llarlflyal 361allllasali aggsilqtnf kslsstefip nlfcmllliv agilfilail tewgsgnrty 421gpvfmclggl ltmvagavwl tvmtntllsa wiltagflif ligfalfgvi rccryccyyc 481ltleseerpp tpyrntv

[070] Em algumas modalidades, os peptídeos providos na presente invenção compreendem uma sequência de EBNA1 (por exemplo, uma sequência de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos contíguos de EBNA1). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem não mais que 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 aminoácidos contíguos de EBNA1. Uma sequência de aminoácido EBNA1 exemplificadora é provida abaixo (SEQ ID NO: 3): 1pffhpvgead yfeylqeggp dgepdvppga ieqgpaddpg egpstgprgq gdggrrkkgg 61 wfgkhrgqgg snpkfeniae glrvllarsh vertteegtw vagvfvyggs ktslynlrrg 121talaipqcrl tplsrlpfgm apgpgpqpgp lresivcyfm vflqthifae vlkdaikdlv 181mtkpaptcni kvtvcsfddg vdlppwfppm vegaaaegdd gddgdeggdg degeegqe

[071]De preferência, o peptídeo compreende a sequência de um epítopo listado na Tabela 1.

Tabela 1: Epítopos de proteína viral EBV exemplificadores Sequência de epítopos Restrição de HLA SEQ ID NO. CLGGLLTMV A*02 4 FLYALALLL A*02 5 YLQQNWWTL A*02, A*68, A*69 6 YLLEMLWRL A*02 7 ALLVLYSFA A*02 8

Sequência de epítopos Restrição de HLA SEQ ID NO. LLSAWILTA A*0203 9 LTAGFLIFL A*0206 10 SSCSSCPLSKI A*11 11 PYLFWLAA A*23, A*24, A*30 12 TYGPVFMCL A*24 13 VMSNTLLSAW A*25 14 CPLSKILL B*08 15 RRRWRRLTV B*27 16 IEDPPFNSL B*40 17 IALYLQQNW B*57, B*58 18 MSNTLLSAW B*58 19 VLKDAIKDL A*0203 20 RPQKRPSCI B*07 21 IPQCRLTPL B*07 22 YNLRRGTAL B*08 23 HPVGEADYFEY B*35 24 LSRLPFGMA B*57 25 FVYGGSKTSL Cw*03 26

[072] Em certas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência de qualquer proteína de poliomavírus, por exemplo, peptídeos compreendendo epítopos BKV, epítopos JCV, epítopos MCV e/ou epítopos que compreendem sequências homólogas entre epítopos BKV, JCV e/ou MCV que são CTLs reconhecidos quando apresentados em um HLA. Em certas modalidades, os epítopos descritos na presente invenção são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma infecção por poliomavírus (por exemplo, uma infecção viral por BKV, JCV ou MCV) e/ou câncer (por exemplo, um câncer associado a poliomavírus expressando um epítopo fornecido na presente invenção) e/ou para a geração de agentes farmacêuticos (por exemplo, CTLs e/ou APCs) que são úteis na prevenção e/ou tratamento de uma infecção de poliomavírus (por exemplo, uma infecção viral por BKV, JCV ou MCV) e/ou câncer (por exemplo, um câncer associado a poliomavírus que expressa um epítopo fornecido na presente invenção). Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo híbrido compreendendo aminoácidos a partir tanto de um epítopo BKV como um epítopo JCV homólogo e/ou variantes de aminoácidos encontrados em epítopos BKV ou JCV diferentes. Em algumas modalidades, as composições e métodos fornecidos na presente invenção compreendem ainda um epítopo MCV. Peptídeos exemplificadores compreendendo epítopos BKV, epítopos JCV, epítopos MCV e/ou epítopos que compreendem sequências homólogas entre epítopos BKV, JCV e/ou MCV (por exemplo, epítopos híbridos) podem ser encontrados em WO2018049165, pelo presente incorporado na íntegra.

[073] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência de qualquer proteína de citomegalovírus, por exemplo, peptídeos compreendendo epítopos que são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CTLs) e que são úteis na prevenção e/ou tratamento de infecção por CMV e/ou câncer (por exemplo, um câncer expressando um epítopo CMV). Peptídeos exemplificadores compreendendo epítopos CMV podem ser encontrados em cada de WO2017203370, WO2014059489, e WO2006056027, pelo presente incorporados na íntegra.

[074] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência de qualquer proteína de vírus de papiloma humano, por exemplo, peptídeos compreendendo epítopos HPV que são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (CTLs) e que são úteis na prevenção e/ou tratamento de infecção por HPV e/ou câncer (por exemplo, um câncer expressando um epítopo de HPV) e/ou lesões pré-cancerosas. Peptídeos exemplificadores compreendendo epítopos de HPV podem ser encontrados em PCT/US2019/014727, pelo presente incorporados na íntegra.

[075] Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem epítopos de dois ou mais vírus. Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem epítopos de três ou mais vírus. Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem epítopos de quatro ou mais vírus. Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem epítopos de cinco ou mais vírus. Por exemplo, em algumas modalidades os peptídeos compreendem sequências de pelo menos dois, três, quatro ou cinco de JCV, BKV, MCV, EBV, CMV e/ou HPV.

[076] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem dois ou mais dos epítopos de célula T (por exemplo, epítopos virais). Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 epítopos de célula T. Por exemplo, em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem dois ou mais dos epítopos de célula T conectados por ligadores (por exemplo, ligadores de polipeptídio). Em algumas modalidades, o polipeptídio ou proteína compreende ainda uma sequência de aminoácido intermediária entre pelo menos dois da pluralidade de epítopos. Em algumas modalidades, os aminoácidos intermediários ou sequências de aminoácidos são aminoácidos ou sequências de aminoácido de liberação de proteassoma. Exemplos não limitadores de sequências de aminoácido ou aminoácidos de liberação de proteassoma são ou compreendem AD, K ou R. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos ou aminoácidos intermediários são motivos de reconhecimento de TAP. Tipicamente, motivos de reconhecimento de TAP podem se conformar a seguinte fórmula: (R/N:I/Q:W/Y)n onde n é qualquer inteiro ≥ 1. Exemplos não limitadores de motivos de reconhecimento de TAP incluem RIW, RQW, NIW e NQY. Em algumas modalidades, os epítopos fornecidos na presente invenção são ligados ou unidos pela sequência de aminoácidos de liberação de proteassoma e, opcionalmente, o motivo de reconhecimento de TAP no terminal carboxila de cada epítopo.

[077] Em algumas modalidades, a sequência dos peptídeos compreende uma sequência de proteína viral exceto por 1 ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) modificações de sequência conservativa. Como usado na presente invenção, o termo “modificações de sequência conservativa” é destinada a se referir a modificações de aminoácido que não afetam significativamente ou alteram a alteração entre um receptor de célula T (TCR) e um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos apresentada em um MHC. Tais modificações conservativas incluem substituições de aminoácido, adições (por exemplo, adições de aminoácidos ao terminal N ou C do peptídeo) e deleções (por exemplo, deleções de aminoácidos a partir do terminal N ou C do peptídeo). Substituições de aminoácido conservativas são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia secundária similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias secundárias similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias secundárias básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias secundárias ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias secundárias polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias secundárias não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil alanina, metionina), cadeias secundárias beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias secundárias aromáticas (por exemplo, tirosina, fenil alanina, triptofano, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoácido dos peptídeos descritos na presente invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido a partir da mesma família de cadeia secundária e o peptídeo alterado pode ser testado para retenção de ligação de TCR usando métodos conhecidos na técnica. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo por técnicas padrão conhecidas na arte, como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR.

[078] Em algumas modalidades, os peptídeos fornecidos na presente invenção compreendem uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% or 100% idêntica a uma sequência de proteína (por exemplo, a sequência de um fragmento de uma proteína viral). Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácido para alinhamento ótimo e sequências não idênticas podem ser desconsideradas para fins de comparação). Os resíduos de aminoácidos em posições de aminoácido correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências.

[079] O peptídeo pode ser um peptídeo quimérico ou de fusão. Como usado na presente invenção, um “peptídeo quimérico” ou “peptídeo de fusão” compreende um peptídeo tendo uma sequência fornecida na presente invenção ligada a um peptídeo distinto tendo sequência à qual não é ligado por natureza. Por exemplo, o peptídeo distinto pode ser fundido ao terminal-N ou terminal-C do peptídeo fornecido na presente invenção diretamente, através de uma ligação de peptídeo ou indiretamente através de um ligador químico. Em algumas modalidades, o peptídeo fornecido na presente invenção é ligado a outro peptídeo compreendendo um epítopo distinto. Em algumas modalidades, o peptídeo fornecido na presente invenção é ligado a peptídeos compreendendo epítopos associados a outras doenças virais e/ou infecciosas. Um peptídeo quimérico ou de fusão provido na presente invenção pode ser produzido por técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, fragmentos de DNA codificando para as sequências de peptídeo diferentes são ligados juntos em alinhamento de acordo com técnicas convencionais, por exemplo por empregar terminais de extremidade cega ou extremidade escalonada para ligação, digestão de enzima de restrição para fornecer terminais apropriados, enchimento de extremidades coesas como apropriado, tratamento de fosfatase alcalina para evitar junção indesejável e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação de PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores de âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subsequentemente anelados e reamplificados para gerar uma sequência de gene quimérica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão são comercialmente disponíveis que já codificam uma fração de fusão.

[080] Os peptídeos fornecidos na presente invenção podem ser isolados a partir de células ou fontes de tecido por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de purificação de proteína padrão e podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante e/ou podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas de síntese de peptídeo padrão. Os peptídeos descritos na presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas por expressão de nucleotídeos codificando um(uns) peptídeo(s) da presente invenção. Alternativamente, tais peptídeos podem ser sintetizados por métodos químicos. Os métodos para expressão de peptídeos heterólogos em hospedeiros recombinantes, síntese química de peptídeos e tradução in vitro são bem conhecidos na técnicas e são descritos adicionalmente em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger e Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J.

Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; e Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, que são incorporados na presente invenção por referência.

[081] Em certos aspectos, são providas na presente invenção moléculas de ácido nucleico codificando os peptídeos descritos aqui. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um vetor. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um vetor viral, como um vetor de expressão baseado em adenovírus, que compreende as moléculas de ácido nucleico descritas na presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor provido na presente invenção codifica uma pluralidade de epítopos providos aqui (por exemplo, como um poli epítopo). Em algumas modalidades, o vetor provido na presente invenção codifica pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 epítopos providos na presente invenção (por exemplo, epítopos providos na Tabela 1).

[082] Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral (por exemplo, um adenovírus, como AdE1-LMPpoly). O vetor AdE1-LMPpoly.codifica um poli epítopo de epítopos CTL definidos a partir de LMP1 e LMP2 fundidos com uma sequência EBNA1 com repetição Gly-Ala esgotada. O vetor AdE1-LMPpoly.é descrito, por exemplo, em Smith et al., Cancer Research 72:1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research 64:1483-9 (2004); e Smith et al., J. Immunol 117:4897-4906 (2006), cada um dos quais é pelo presente incorporado por referência.

[083] Como usado na presente invenção, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um loop de DNA de fita dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação, vetores de epissoma de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissoma) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e desse modo ser replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes. Tais vetores são mencionados aqui como “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em algumas modalidades, são providos na presente invenção ácidos nucleicos operacionalmente ligados a uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, um promotor) em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, a célula transcreve o ácido nucleico provido na presente invenção e expressa desse modo um peptídeo descrito aqui. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada no genoma da célula ou pode ser extracromossômica.

[084] Em algumas modalidades, são providas na presente invenção células que contêm um ácido nucleico descrito aqui (por exemplo, um ácido nucleico codificando um peptídeo descrito aqui). A célula pode ser, por exemplo, procariótica, eucariótica, de mamífero, ave, murino e/ou humana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma APC (por exemplo, uma célula T apresentadora de antígeno, uma célula dendrítica, uma célula B ou uma célula aK562). Nos presentes métodos, um ácido nucleico descrito na presente invenção pode ser administrado à célula, por exemplo, como ácido nucléico sem veículo de fornecimento, em combinação com um reagente de fornecimento. Em algumas modalidades, qualquer método de fornecimento de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser usado nos métodos descritos na presente invenção. Reagentes de fornecimento adequados incluem, porém não são limitados a, por exemplo, o reagente lipofílico TKO Mirus Transit; lipofectina; lipofectamina;

cellfectin; policátions (por exemplo, poli lisina), atelocolágeno, nanoplexos e lipossomas. Em algumas modalidades dos métodos descritos na presente invenção, lipossomas são usados para fornecer um ácido nucleico a uma célula ou sujeito. Lipossomas adequados para uso nos métodos descritos na presente invenção podem ser formados a partir de lipídeos de formação de vesícula padrão, que incluem em geral fosfolipídios neutros ou negativamente carregados e um esterol, como colesterol. A seleção de lipídeos é guiada, em geral, pela consideração de fatores como o tamanho desejado de lipossoma e meia-vida dos lipossomas na corrente sanguínea. Uma variedade de métodos é conhecida para preparar lipossomas, por exemplo, como descrito em Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; e patente US Nos. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, e 5.019.369, cujas revelações na íntegra são pelo presente incorporadas por referência. Células CAR-T

[085] São providos na presente invenção métodos de tratar canceres e doenças autoimunes (por exemplo, MS, SAD, IBD) por administrar ao sujeito células CAR-T alogenéicas ou autólogas expressando um receptor de célula T que se liga especificamente a um antígeno (por exemplo, um antígeno de peptídeo de vírus) apresentado em uma molécula ou complexo de histocompatibilidade maior (MHC), e uma molécula de receptor de antígeno quimérico com a capacidade de ligar tanto especificamente um peptídeo alvo selecionado como transduzir sinais de ativação subsequentes através de motivos de ativação de imunorreceptor (ITAMs) presentes em suas caudas citoplásmicas.

[086] Em algumas modalidades, as células T específicas de antígeno usadas para gerar as células CAR-T da invenção são selecionadas a partir de uma biblioteca ou banco de células. De preferência, o MCH é um MHC classe I. Em certas modalidades, o MHC é um MHC classe II e tem um polipeptídio de cadeia α que é HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA or HLA-DRA. Em algumas dessas modalidades, o MHC classe II tem um polipeptídio de cadeia β que é HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB or HLA-DRB. Tais células T como descrito na presente invenção (por exemplo, células T específicas de antígeno e células T específicas de antígeno que expressam um CAR), são armazenadas em um banco ou biblioteca de células antes delas serem administradas ao sujeito.

[087] Em algumas modalidades, as células T usadas para gerar as células CAR-T da invenção são células-T polifuncionais, isto é, aquelas células T que são capazes de induzir múltiplas funções efetoras imunes, que fornecem uma resposta imune mais eficaz a um patógeno do que o fazem células que produzem, por exemplo, apenas um único efetor imune (por exemplo, um biomarcador único como citocina ou CD107a). Células T menos polifuncionais, monofuncionais, ou mesmo “esgotadas” podem dominar respostas imunes durante infecções crônicas, desse modo impactando negativamente a proteção contra complicações associadas ao vírus. De modo semelhante, as células CAR-T da invenção também são polifuncionais (por exemplo, apresentam, retêm ou têm polifuncionalidade aperfeiçoada). Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T usadas para gerar as células CAR-T da invenção são células T CD4+. Em algumas dessas modalidades, as células T são menos que 50% de células T CD4+. Ainda em modalidades adicionais, as células T são predominantemente células T CD4+. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T usadas para gerar as células CAR-T da invenção são células T CD8+. Em algumas dessas modalidades, as células T são menos que 50% de células T CD8+. Ainda em modalidades adicionais, as células T são predominantemente células T CD8+.

[088] São também fornecidos na presente invenção APCs que apresentam um peptídeo descrito na presente invenção (por exemplo, um peptídeo compreendendo um epítopo de célula T). Em algumas modalidades, os APCs são células B, células T apresentadoras de antígeno, células dendríticas ou células apresentadoras de antígeno artificiais (por exemplo, células aK562). Em certas modalidades preferidas, os APCs são derivados de células linfoblastoides, como BLCLs. BLCLs apresentadores de antígeno exemplificadores são descritos em O’Reily et al., Immunol Res 2007 38:237-250 e Koehne et al., Blood 2002 99: 1730- 1740, que são pelo presente incorporados por referência.

[089] Células dendríticas para uso no processo podem ser preparadas por tirar PBMCs a partir de uma amostra de paciente e aderir as mesmas a plástico. Em geral, a população de monócitos adere e todas as outras células podem ser lavadas. A população aderente é então diferenciada com IL-4 e GM-CSF para produzir células dendríticas derivadas de monócito. Essas células podem ser maturadas pela adição de IL-1β, IL-6, PGE-1 e TNF-α (que supra regula as moléculas coestimuladoras importantes na superfície da célula dendrítica) e são então transduzidas com um ou mais dos peptídeos providos na presente invenção.

[090] Em algumas modalidades, o APC é uma célula apresentadora de antígeno artificial, como uma célula aK562. Em algumas modalidades, as células apresentadoras de antígeno artificiais são criadas para expressar CD80, CD83, 41BB-L, and/or CD86. Células apresentadoras de antígeno artificiais exemplificadoras, incluindo células aK562, são descritas na pub. De patente U.S. No. 2003/0147869 que é incorporada pelo presente por referência.

[091] Em certos aspectos, são providos na presente invenção métodos de gerar APCs que apresentam um ou mais dos epítopos de célula T descritos na presente invenção compreendendo colocar um APC em contato com um peptídeo compreendendo um epítopo e/ou com um ácido nucleico codificando o epítopo. Em algumas modalidades, os APCs são irradiados. Uma célula que apresenta um peptídeo descrito na presente invenção pode ser produzido por técnicas padrão conhecidas na arte. Por exemplo, uma célula pode ser pulsada para encorajar absorção de peptídeo. Em algumas modalidades, as células são transfectadas com um ácido nucleico codificando um peptídeo fornecido na presente invenção. São providos na presente invenção métodos de produzir células apresentadoras de antígeno (APCs), compreendendo pulsar uma célula com os peptídeos descritos na presente invenção. Exemplos exemplificadoras de produzir células apresentadoras de antígeno podem ser encontrados em WO2013088114, incorporado pelo presente por referência na íntegra.

[092] Em algumas modalidades, são providas na presente invenção células T (por exemplo, células T CD4 e/ou células T CD8) que expressam um TCR (por exemplo, um αβ TCR ou um γδ TCR) que reconhece um peptídeo descrito na presente invenção apresentado em um MHC. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD8 (um CTL) que expressa um TCR que reconhece um peptídeo descrito na presente invenção apresentado em um MHC classe I. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD4 (uma célula T ajudante) que reconhece um peptídeo descrito na presente invenção apresentado em um MHC classe II.

[093] Em algumas modalidades, são providos na presente invenção métodos de gerar, ativar e/ou induzir proliferação de células CAR-T que reconhecem um ou mais dos epítopos EBV descritos na presente invenção e também expressam um receptor de antígeno quimérico (por exemplo, células antiCD19-CAR-T, específicas de EBV). Em algumas modalidades, uma cultura (ou amostra da mesma) compreendendo células T (isto é, células T isoladas) é incubada em cultura com um APC provido na presente invenção (por exemplo, um APC que apresenta um peptídeo compreendendo um epítopo EBV em um complexo de MHC classe I, como os PBMCs transduzidos de modo viral descritos na presente invenção). Em algumas modalidades, os APCs são autólogos ao sujeito a partir de quem as células T foram obtidas. Em algumas modalidades, os APCs não são autólogos ao sujeito de quem as células T foram obtidas. Em algumas modalidades, a amostra contendo células T são incubadas 2 ou mais vezes com APCs providos na presente invenção. Em algumas modalidades, as células T (e/ou células CAR-T) são incubadas com os APCs na presença de pelo menos um citocina. Em algumas modalidades, a citocina é IL-2, IL-4, IL-7 and/or IL-15. Similarmente, culturas de célula T e/ou célula CAR-T podem ser mantidas na presença pelo menos de uma citocina, como IL-2, IL-4, IL-7 and/or IL-15. Métodos exemplificadores para induzir proliferação de células T usando APCs são providos, por exemplo, na pub. de patente U.S. No. 2015/0017723 que é incorporada pelo presente por referência. Em modalidades preferidas, tais células T específicas de antígeno (por exemplo, específicas de EBV) são transduzidas com um vetor compreendendo sequência de ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende em geral um domínio extracelular (também mencionado como um ectodomínio), um domínio de transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular (também mencionado como um endodomínio).

[094] O domínio extracelular permite que o CAR, quando expresso na superfície de uma célula T, dirija atividade de célula T para aquelas células que expressam um alvo reconhecido pelo domínio extracelular. A inclusão de um domínio coestimulador, como o domínio coestimulador 4-1BB (CD137) em série com CD3ζ na região intracelular permite que a célula T receba sinais coestimuladores.

[095] Para fins de exemplificação, CARs de primeira geração representam um receptor artificial que, quando expresso por células T, podem redirecionar as mesmas para um antígeno associado à doença predeterminada (por exemplo, antígenos associados a tumor). Tais CARs compreendem tipicamente um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo específico de alvo (por exemplo, um antígeno de tumor) fundido com domínios de sinalização a partir de um receptor de célula T (TCR), como CD3ζ . Após ligação de antígeno, CARs desencadeiam fosforilação de motivos de ativação baseados em tirosina imunorreceptora (ITAMS) e iniciam a cascata de sinais necessária para citólise,

secreção e proliferação de citocina, desviando da via de processamento de antígeno endógeno e restrição de MHC. Designs de CAR de segunda geração incluem domínios de sinalização adicional para aumentar a ativação e co-estimulação, como CD28 e/ou 4-1BB. CARs de segunda geração são observados induzir mais secreção de IL-2,aumewntar proliferação e persistência de células T, mediar maior rejeição de tumor, e estender sobrevivência de células T. CARs de terceira geração são feitos por combinar múltiplos domínios de sinalização, como CD3ζ-CD28-OC40 or CD3ζ- CD28-41BB para aumentar a potência com produção mais intensa de citocina e capacidade de morte.

[096] O ectodomínio dos CARs revelados na presente invenção compreendem em geral um domínio de direcionamento, como um domínio de ligação-ligante ou um domínio de reconhecimento de antígeno que liga um antígeno alvo. Em certas modalidades, o domínio de direcionamento é a partir de cadeias únicas alfa e beta de receptor de célula-T nativa (TCR) como foi descrito na presente invenção. De preferência, tais domínios de direcionamento têm ectodomínio simples (por exemplo, um ectodomínio CD4 para reconhecer células infectadas por HIV). Alternativamente, tais domínios de reconhecimento de antígeno compreendem componentes de reconhecimento exótico tais como uma citocina ligada (que leva - pode levar ao reconhecimento de células contendo o receptor de citocina). Em geral, com relação aos métodos revelados na presente invenção, quase tudo que liga um alvo dado com alta afinidade pode ser usado como uma região de reconhecimento de antígeno. Desse modo, tais domínios de direcionamento são tipicamente derivados a partir de um anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento é um fragmento de anticorpo funcional ou derivado do mesmo (por exemplo, um scFv ou um Fab, ou qualquer fragmento de ligação de antígeno adequado de um anticorpo). Em modalidades preferidas, o ectodomínio compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas dessas modalidades, o scFv é a partir de um anticorpo monoclonal (mAb). Em modalidades preferidas, o domínio de ligação específico de antígeno (por exemplo, o scFv) é fundido com a transmembrana e/ou motivos de sinalização envolvidos em ativação de linfócito como revelado em Sadelain M., et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35–45, incorporado aqui por referência na íntegra. Também contém opcionalmente um peptídeo de sinal (SP) de modo que o CAR possa ser glicosilado e fixado na membrana de células da célula efetora imune. A afinidade/especificidade do scFv é acionada em grande parte por sequências específicas nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) na cadeia pesada (VH) e leve (VL). Cada sequência de VH VL terá três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3).

[097] Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento é derivado a partir de anticorpos naturais, como anticorpos monoclonais. Em alguns casos, o anticorpo é humano. Em alguns casos, o anticorpo foi submetido a uma alteração para tornar o mesmo menos imunogênico quando administrado a seres humanos. Por exemplo, a alteração pode compreender uma ou mais técnicas selecionadas de quimerização, humanização, enxerto-CDR, desumanização e mutação de aminoácidos de estrutura para corresponder com a sequência de germline humana mais próxima. Ainda em modalidades adicionais, o domínio de direcionamento é um domínio de direcionamento baseado em ligante, em que, por exemplo, o scFv revelado na presente invenção é substituído com um ligante para um marcador de tumor. Desse modo, um CAR que expressa um ligante para o receptor IL13 (IL13R) permitiria reorientação de células T para IL13R expresso em glioblastoma.

[098] São também revelados CARs biespecíficos que são capazes de ligar pelo menos a dois alvos moleculares (por exemplo, marcadores específicos de célula e antígenos de tumor). São também revelados CARs projetados para funcionar somente em combinação com outro CAR que liga um antígeno diferente, como um antígeno associado a câncer. Por exemplo, nessas modalidades, o endodomínio do primeiro CAR contém apenas um domínio de sinalização (SD) ou uma região de sinalização coestimuladora (CSR) porém não ambas. O segundo CAR fornece um sinal ausente se for ativado. Por exemplo, se o CAR revelado contiver um SD porém não um CSR, então a célula efetora imune contendo esse CAR é ativado apenas se outro CAR (ou célula-C) contendo um CSR liga seu antígeno respectivo. De modo semelhante, se o CAR revelado contiver um CSR, porém não um SD, então a célula efetora imune contendo esse CAR é ativada apenas se outro CAR (ou célula-T) contendo um SD liga seu antígeno respetivo.

[099] Antígenos exemplificadores incluem, porém não são limitados a, antígenos de tumor, isto é, proteínas que são produzidas por células de tumor que eliciam uma resposta imune, particularmente respostas imunes mediadas por célula- T. O domínio de ligação de antígeno adicional pode ser um anticorpo ou um ligante natural do antígeno de tumor. A seleção do domínio de ligação de antígeno adicional dependerá do tipo específico de câncer a ser tratado. Antígenos de tumor são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um antígeno associado a glioma, antígeno carcinoembriônico (CEA), EGFRvIII, IL-llRa, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA LX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, gonadotropina coriônica β-humana, alfafetoproteína (AFP), ALK, CD19, TIM3, ciclina Bl, AFP reativo de lectina, antígeno relacionado a Fos 1, ADRB3, tiroglobulina, EphA2, RAGE-1, RUl, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TESl, PAX5, SART3, CLL-1, fucosila GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, transcriptase inversa de telomerase humana, ácido polisiálico, PLAC1, RUl, RU2 (AS), esterase carboxila intestinal, lewisY, sLe, LY6K, HSP70, HSP27, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIBI, BORIS, prostase, antígeno específico de próstata (PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, LMP2, NCAM, p53, mutante p53, mutante Ras, gplOO, prostein, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-beta, survivina e telomerase, legumain, HPV E6,E7, proteína de esperma 17, SSEA-4,

tirosinase, TARP, WT1, antígeno de tumor de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-C1, MAGE-C2, Annexin-A2, MAD-CT- 1, MAD-CT-2, MelanA/MART 1, XAGE1, ELF2M, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, elastase de neutrófilo, pontos de ruptura de translocação de sarcoma , NY-BR-1, ephnnB2, CD20, CD22, CD24, CD30, TIM3, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, receptor de andrógeno, FAP, fator de crescimento de insulina (IGF)-I, IGFII, receptor IGF-I, GD2, o-acetil-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, receptor de folato (FRa), receptor de folato beta, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2, e mesotelina. Em certas modalidades preferidas, o antígeno de tumor é selecionado de receptor de folato (FRa), mesotelina, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, TIM3, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUCl, HER2, e qualquer combinação dos mesmos.

[0100] Exemplos não limitadores adicionais de antígenos de tumor incluem os que se seguem: Antígenos de diferenciação como tirosinase, TRP-1, TRP-2 e antígenos de múltiplas linhagens específicos de tumor como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pi 5; antígenos embriônicos superexpressos como CEA; oncogenes superexpressos e genes supressores de tumor mutado como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos de tumor únicos resultantes de translocações cromossômicas; como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; e antígenos virais, como os antígenos de vírus de Epstein Barr EBVA e os antígenos de papilomavírus humano (HPV) E6 e E7. Outros antígenos baseados em proteína, grandes incluem SCCA, GP73, FC-GP73, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm- 23H1, PSA, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA

27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1,

RCASl, SDCCAG1 6, TA-90\proteína de ligação Mac-2\proteína associada a ciclofilm C, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GPC3, MUC16, TAG-72, LMP1, EBMA-1, BARF-1, CS1, CD319, HER1, B7H6, L1CAM, IL6, e MET.

[0101] O domínio de transmembrana (TD) liga o ectodomínio (isto é, o domínio extracelular) ao endodomínio (isto é, o domínio intracelular) e reside na membrana de célula quando expresso por uma célula. O domínio de transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Onde a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína de transmembrana ou ligada por membrana. Por exemplo, a região de transmembrana pode ser derivada de (isto é, compreender pelo menos a(s) região(ões) de transmembrana de cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula-T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (e.g., CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, or CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, e PAG/Cbp. Alternativamente, o domínio de transmembrana pode ser sintético, em cujo caso compreenderá resíduos predominantemente hidrofóbicos como leucina e valina. Em algumas modalidades, um tripleto de fenil alanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana sintético. Um ligador oligo ou polipeptídio curto, como entre 2 e 10 aminoácidos em comprimento, pode formar a ligação entre o domínio de transmembrana e o domínio endoplásmico do CAR.

[0102] O endodomínio transmite um sinal de ativação para a célula efetora imune após reconhecimento de antígeno, ativando pelo menos uma das funções efetoras normais da célula efetora imune.

Em certas modalidades, a função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade de ajudante, incluindo a secreção de citocinas.

Em geral, o endodomínio pode conter um domínio de sinalização intracelular (ISD) e, opcionalmente, uma região de sinalização coestimuladora (CSR). O endodomínio pode compreender o ISD de um receptor de célula T (TRC) e correceptores opcionais.

Embora o domínio de sinalização intracelular inteiro possa ser empregado, não é necessário usar a cadeia inteira.

Até o ponto em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usado, tal porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta desde que transduza o sinal de função efetora.

Um “domínio de sinalização (SD)”, como um ISD, contém em geral sequências de sinalização citoplásmica que regulam a ativação primária do complexo de TCR que atua em um modo estimulador e são compreendidas de motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina imunorreceptora (ITAMs). Uma cascata de sinalização é ativada quando o ITAM é fosforilado.

O termo “região de sinalização coestimuladora (CSR)” se refere aos domínios de sinalização intracelular a partir dos receptores de proteína coestimuladora, como CD28, 41BB e ICOS, que são capazes de intensificar a ativação de célula-T por receptores de célula-T.

Em algumas modalidades, o endodomínio contém um SD ou um CSR, porém não ambos.

Nessas modalidades, uma célula efetora imune contendo o CAR revelado é ativado apenas se outro CAR (ou um receptor de célula-T) contendo o domínio ausente também ligar seu antígeno respectivo.

Os exemplos de sequências de sinalização citoplásmica contendo ITAM incluem aquelas derivadas de CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc gama RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB), e FcεRIγ (FCERIG).

[0103] Em modalidades específicas, o domínio de sinalização intracelular é derivado de CD3 zeta (CD3ζ) (TCR zeta, GenBank no.

De acessão BAG36664.1). A cadeia zeta CD3 de glicoproteína de superfície de célula-T (CD3ζ), também conhecida como cadeia zeta T3 de receptor de célula-T ou CD247 (Cluster de diferenciação 247), é uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene CD247. As caudas intracelulares das moléculas CD3 contêm um ITAM único que é essencial para a capacidade de sinalização do TCR.

A cauda intracelular da cadeia ζ (CD3ζ) contém 3 ITAMs.

Em algumas modalidades a cadeia ζ é uma cadeia ζ mutante.

Por exemplo, a cadeia ζ mutante compreende uma mutação, como uma mutação de ponto, em pelo menos um ITAM de modo a tornar o ITAM não funcional.

Em algumas dessas modalidades, o ITAM de membrana-proximal (ITAM1), o ITAM de membrana-distal (terceiro ITAM terminal-C, ITAM3) ou ambos são não funcionais.

Em modalidades adicionais, dois ITAMs de membrana proximal (ITAM1 e ITAM2) ou dois ITAMS de membrana-distal (ITAM2 e ITAM3) são não funcionais.

Ainda em modalidades adicionais, apenas ITAM2 é não funcional.

Em algumas modalidades, a cadeia ζ mutante compreende uma mutação de deleção (por exemplo, truncamento) de tal modo que pelo menos um ITAM esteja ausente.

Em algumas dessas modalidades, a cadeia ζ não tem o ITAM de membrana-proximal (ITAM1), o ITAM de membrana-distal (ITAM3) ou ambos.

Em outras modalidades, a cadeia ζ não tem os dois ITAMs de membrana-proximal (ITAM1 e ITAM2) ou os dois ITAMS de membrana-distal (ITAM2 e ITAM3). Em modalidades adicionais, a cadeia ζ não tem ITAM2. Os métodos para produzir CD3ζ mutante são conhecidos por aqueles versados na técnica (Bridgeman JS, et al., Clin Exp Immunol. 2014 Fec;175(2):258- 67 e WO2019/133969, que são pelo presente incorporados na presente invenção por referência). A remoção de pelo menos um ITAM a partir do CAR introduzido pode reduzir apoptose mediada por CD3ζ.

Alternativamente, a remoção de pelo menos um ITAM a partir do CAR introduzido pode reduzir seu tamanho sem perda de função.

[0104] Em algumas modalidades, o CAR compreende uma sequência de articulação. uma sequência de articulação é uma sequência curta de aminoácidos que facilita flexibilidade de anticorpo (vide, por exemplo, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)). A sequência de articulação pode ser posicionada entre a fração de reconhecimento de antígeno (por exemplo, anti-CD19, -CD20, - CD22, or -CLEC4 scFv) e o domínio de transmembrana. A sequência de articulação pode ser qualquer sequência adequada derivada ou obtida a partir de qualquer molécula adequada. Em algumas modalidades, por exemplo, a sequência de articulação é derivada de uma molécula CD8a ou uma molécula CD28.

[0105] Em modalidades preferidas, o CAR revelado é definido pela fórmula: SP–TD–HG–TM–CSR–SD; ou SP–TD–HG–TM–SD–CSR; Em que “SP” representa um peptídeo de sinal opcional, Em que “TD” representa um domínio de direcionamento, Em que “HG” representa um domínio de articulação opcional (domínio espaçador), Em que “TM” representa um domínio de transmembrana, Em que “CSR” representa uma ou mais regiões de sinalização coestimuladoras, Em que “SD” representa um domínio de sinalização e Em que “--” representa um ligador ou ligação de peptídeo.

[0106] Em algumas modalidades, o CAR contém um domínio de sinalização. Em outras modalidades, o CAR contém um ou mais domínios de sinalização (incluindo domínio de sinalização coestimulador). O um ou mais domínio de sinalização pode ser um polipeptídio selecionado de: CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, FcγRI-γ, FcγRIII-γ, FcεRIβ, FcεRIγ, DAP10, DAP12, CD32, CD79a, CD79b,

CD28, CD3C, CD4, b2c, CD137 (41BB), ICOS, CD27, CD28δ, CD80, NKp30, OX40, e mutantes dos mesmos. Por exemplo, o endodomínio do CAR pode ser projetado para compreender o domínio de sinalização de CD3ζ por si só ou combinado com qualquer (quaisquer) outro(s) domínio(s) citoplásmico(s) desejado(s) útil(úteis) no contexto do CAR da invenção. Alternativamente, o domínio citoplásmico do CAR pode compreender uma porção de cadeia de CD3ζ e uma região de sinalização coestimuladora. A região de sinalização coestimuladora se refere a uma porção do CAR que compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora. Uma molécula coestimuladora é uma molécula de superfície de célula diferente de um receptor de antígeno ou seus ligantes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos para um antígeno. Os exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, e um ligante que se liga especificamente com CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3, NKG2D e mutantes dos mesmos. Desse modo, embora o CAR seja exemplificado principalmente com CD28 como o elemento de sinalização coestimulador, outros elementos coestimuladores, e mutantes dos mesmos, podem ser usados individualmente ou em combinação com outros elementos de sinalização coestimuladores. por exemplo, em algumas dessas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador CAR preferido é o domínio mutante CD28 conhecido como “Mut06” como descrito em WO2019/010383.

[0107] Em algumas modalidades, o CAR tem mais de um domínio de transmembrana, que pode ser uma repetição do mesmo domínio de transmembrana, ou podem ser domínios de transmembrana diferentes.

[0108] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR de multicadeias, como descrito em WO2015/039523 que é incorporado por referência para esse ensinamento. Um CAR de multicadeias pode compreender domínios de sinalização e ligação de ligante extracelular separados em polipeptídios de transmembrana diferentes. Os domínios de sinalização podem ser projetados para montar em posição de juxtamembrana, que forma arquitetura flexível mais próxima a receptores naturais, que confere transdução ótima de sinal. Por exemplo, o CAR de multicadeias pode compreender uma parte de uma cadeia alfa FCERI e uma parte de uma cadeia beta FCERI de modo que as cadeias FCERI dimerizem espontaneamente juntas para formar um CAR.

[0109] Construções de CAR adicionais são descritas, por exemplo, em Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 de agosto de 2016;16(9):566-81, que é incorporado por referência na íntegra para o ensinamento desses modelos de CAR.

[0110] Em certas modalidades, o CAR pode ser, por exemplo (e sem limitação, um TRUCk, um CAR universal, um CAR de autodireção, um CAR blindado, um CAR de autodestruição, um CAR condicional, um CAR marcado, um TenCAR, um CAR dual ou um sCAR.

[0111] TRUCKs (células T redirecionadas para morte de citocina universal) expressam em conjunto um receptor de antígeno quimérico (CAR) e uma citocina antitumor. A expressão de citocina pode ser constitutiva ou induzida por ativação de célula T. Direcionada por especificidade de CAR, a produção localizada de citocinas pró-inflamatórias recruta células imunes endógenas para sítios de tumor e pode potenciar uma resposta antitumor.

[0112] Células T CAR alogenéicas, universais são criadas para não mais expressar receptor de célula T (TCR) endógenas e/ou moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC), desse modo evitando doença de enxerto- versus-hospedeiro (GVHD) ou rejeição, respectivamente.

[0113] CARs de autodireção expressam em conjunto um CAR e um receptor de quimiocina, que se liga a um ligante de tumor, aumentando desse modo localização de tumor.

[0114] Em certos aspectos revelados na presente invenção, a invenção emprega estratégias de bloqueio/inibição de controle imunológico. Terapias de controle imunológico se direcionam a reguladores principais do sistema imune que estimulam ou inibem a resposta imune. Tais controles imunes podem ser explorados no estado de doença (por exemplo, por tumores) para evadir ataques pelo sistema imune. Estudos de inibidor de controle observaram a atividade de terapia de inibidor de PD-1 (El-Khoueiry, Sangro et al., 2017) e o FDA aprovou Nivolumab para tratamento de segunda linha de HCC com uma taxa de resposta objetiva de 20%. Células CAR T criadas para serem resistentes à imunossupressão (CARs blindados) podem ser geneticamente modificadas para não mais expressarem várias moléculas de controle imunológico (por exemplo, antígeno associado a linfócito T citotóxico 4 (CTLA4) ou proteína de morte de célula programada 1 (PD-1)). Técnicas de “nocaute” e “knockdown” exemplificadoras incluem, porém não são limitadas a, interferência de RNA (RNAi) (por exemplo, asRNA, miRNA, shRNA, siRNA etc.) e interferência de CRISPR (CRISPRi) (por exemplo, CRISPR-Cas9). Em certas modalidades, células T CAR são criadas para expressar uma forma negativa-dominante de uma molécula de controle. Em algumas dessas modalidades, o domínio de ligação-ligante extracelular (isto é, ectodomínio) da molécula de controle imunológico é fundido com uma membrana de transmembrana para competir por ligação de ligante. Por exemplo, o domínio de ligação-ligante extracelular de PD-1 pode ser fundido com um domínio de transmembrana CD8, desse modo competindo para ligar PD-1 a partir da célula alvo. Em algumas modalidades, células T CAR são criadas para expressar um receptor de mudança de controle imunológico para explorar o ligante de controle imunológico inibidor presente em uma célula alvo. Em tais modalidades, o domínio de ligação-ligante extracelular da molécula de controle imunológico é fundido com um domínio de sinalização, estimulador e/ou coestimulador. Por exemplo, o domínio de ligação-ligante extracelular de PD-1 pode ser fundido com um domínio CD28, desse modo fornecendo co-estimulação CD28 enquanto bloqueia a sinalização de PD-1. Em modalidades adicionais, as células T CAR podem ser administradas com um aptâmero ou um anticorpo monoclonal que bloqueia sinalização de controle imunológico. Em algumas dessas modalidades, as células T CAR (por exemplo, terapia de célula CAR) são combinadas com um método de bloqueio de PD-1, como administração com aptâmeros antagonistas de PD-1/PD-L1 ou anticorpos anti-PD- 1/PD-L1. Em modalidades preferidas, as células T CAR e anticorpos de bloqueio de via de PD-1 são administrados conjuntamente. Em modalidades adicionais, as células T CAR são criadas para expressar ou expressar e secretar um anticorpo de bloqueio de controle imunológico, como anti-PD-1 ou anti-PD-L1, ou fragmentos dos mesmos. Ainda em modalidades adicionais, as células T CAR são administradas com um vetor (por exemplo, um vírus criado) que expressa uma molécula de bloqueio de controle imunológico descrita na presente invenção.

[0115] Um CAR de autodestruição pode ser projetado usando RNA fornecido por eletroporação para codificar o CAR. Alternativamente, apoptose induzível da célula T pode ser obtida com base em ligação de ganciclovir com timidina cinase em linfócitos modificados por gene ou o sistema mais recentemente descrito de ativação de caspase 9 humana por um dimerizador de molécula pequena.

[0116] Uma célula T CAR condicional é por default não responsiva, ou desligada, até a adição de uma molécula pequena para completar o “circuito” (por exemplo, via molecular), permitindo transdução total tanto do sinal 1 como do sinal 2, desse modo ativando a célula T CAR. Alternativamente, células T podem ser criadas para expressar um receptor específico de adaptador com afinidade para anticorpos secundários subsequentemente administrados dirigidos em antígeno alvo.

[0117] Células T CAR marcadas expressam um CAR mais um epítopo de tumor ao qual um agente de anticorpo monoclonal existente se liga. No cenário de efeitos adversos intoleráveis, a administração do anticorpo monoclonal limpa as células T CAR e alivia os sintomas sem efeitos off-tumor adicionais.

[0118] Uma célula T CAR tandem (TanCAR) expressa um CAR único consistindo em dois fragmentos variáveis de cadeia única ligados (scFvs) que têm afinidades diferentes fundidas com domínio(s) coestimulador(es) intracelular(es) e um domínio CD3ζ. A ativação de célula T TanCAR é obtida apenas quando células alvo expressam em conjunto ambos os alvos.

[0119] Uma célula T CAR dual expressa dois CARs separados com alvos de ligação de ligante diferentes. Como exemplo não limitador, um CAR pode incluir somente o domínio CD3ζ enquanto o outro CAR inclui somente o(s) domínio(s) coestimulador(es). Em algumas dessas modalidades, a célula T CAR dual é ativada quanto os dois alvos são expressos no tumor.

[0120] Um CAR de segurança (sCAR) consiste em um scFv extracelular fundido com um domínio inibidor intracelular. Células T sCAR expressando em conjunto um CAR padrão se tornam ativadas apenas ao encontrar células alvo que possuem o alvo CAR padrão, porém não tem o alvo sCAR.

[0121] São também revelados polinucleotídeos e vetores de polinucleotídeo codificando os CARs específicos de alvo revelados que permitem expressão dos CARs nas células efetoras imunes reveladas (por exemplo, células T).

[0122] Sequências de ácido nucleico que codificam os CARs revelados, e regiões das mesmas, podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, como, por exemplo por bibliotecas de triagem a partir de células expressando o gene, por derivar o gene a partir de um vetor conhecido como incluindo o mesmo, ou por isolar diretamente a partir de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, ao invés de clonado.

[0123] A expressão de ácidos nucleicos codificando CARs é tipicamente obtida por ligar operacionalmente um ácido nucleico codificando o polipeptídio de CAR para um promotor, e incorporando a construção em um vetor de expressão. Vetores de clonagem típicos contêm terminadores de translação e transcrição, sequências de iniciação e promotores úteis para regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada.

[0124] O ácido nucleico revelado pode ser clonado em diversos tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, porém não limitado a um plasmídeo, um phagemid, um derivado de fago, um vírus de animal e um cosmídeo. Vetores de interesse específico incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda e vetores de sequenciamento.

[0125] Além disso, o vetor de expressão pode ser provido para uma célula na forma de um vetor viral. Tecnologia de vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Vírus, que são úteis como vetores incluem, porém não são limitados a, retrovírus (por exemplo, gama retrovírus), adenovírus, vírus adeno- associados, herpes vírus, e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional pelo menos em um organismo, uma sequência de promotor, sítios de endonuclease de restrição convenientes e um ou mais marcadores selecionáveis. Em algumas modalidades, os vetores de polinucleotídeo são vetores lentivirais ou retrovirais. De preferência, os vetores de polinucleotídeo são vetores gama retrovirais.

[0126] Diversos sistemas de base viral foram desenvolvidos para transferência de genes para células de mamíferos. Por exemplo, retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de fornecimento de gene. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e acondicionado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na arte. O vírus recombinante pode ser então isolado e fornecido para células do sujeito in vivo ou ex vivo.

[0127] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência de promotor de citomegalovírus (CMV) prematuro imediata. Essa sequência de promotor é uma sequência de promotor constitutiva forte capaz de gerar altos níveis de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeos operativamente ligada à mesma. Outro exemplo de um promotor adequado é Fator de Crescimento de alongamento-1α (EF- 1α). Entretanto, outras sequências de promotor constitutivas também podem ser usadas, incluindo, porém não limitadas a promotor inicial de vírus símio 40 (SV40), promotor de MND (vírus de sarcoma mielo proliferativo), vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição de terminal longo (LTR) de vírus de imunodeficiência humana (HIV), promotor MoMuLV, um promotor de vírus de leucemia de ave, um promotor prematuro imediato de Epstein-Barr, um promotor de vírus de sarcoma Rous, bem como promotores de gene humano como, porém não limitado a, o promotor de actina, o promotor de miosina, o promotor de hemoglobina e o promotor de creatina cinase. O promotor pode ser alternativamente um promotor induzível. Os exemplos de promotores induzíveis incluem, porém não são limitados a um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticóide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[0128] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensificadores, regulam a frequência de iniciação de transcrição. Tipicamente, esses são localizados na região 30-110 bp a montante do sítio de início, embora diversos promotores tenham sido mostrados recentemente como contendo elementos funcionais a jusante do sítio de início também. O espaçamento entre elementos promotores é frequentemente flexível, de modo que a função de promotor seja preservada quando elementos são invertidos ou movidos um em relação ao outro.

[0129] Genes repórteres são usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente em ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídio cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é ensaiada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Genes repórter adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, transferase de acetil cloranfenicol, fosfatase alcalina secretada, ou o gene de proteína fluorescente verde. Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, a construção com a região de flanquear 5’ mínima mostrando o nível mais alto de expressão de gene repórter é identificada como o promotor. Tais regiões de promotor podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes em relação à capacidade de modular transcrição acionada por promotor.

[0130] Os métodos de introduzir e expressar genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser prontamente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, levedura ou inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meio físico, químico ou biológico.

[0131] Métodos físicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, micro injeção, eletroporação e similares. Os métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

[0132] Métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais, e especialmente vetores retrovirais, se tornaram o método mais amplamente usado para inserir genes em células de mamíferos, por exemplo, humanas.

[0133] Meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeiro incluem sistemas de dispersão coloidal, como complexos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, glóbulos, e sistemas baseados em lipídeo incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplificador para uso como um veículo de fornecimento in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

[0134] No caso em que um sistema de fornecimento não viral é utilizado, um veículo de fornecimento exemplificador é um lipossoma. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado na bicamada de lipídeo de um lipossoma, fixado em um lipossoma através de uma molécula de ligação que é associada tanto ao lipossoma como ao oligonucleotídeo, preso em um lipossoma, complexado com um lipossoma, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela ou de outro modo associado a um lipídeo. Composições associadas a lipídeo, lipídeo/DNA ou lipídeo/vetor de expressão não são limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, podem estar presentes em uma estrutura de bicamadas, como micelas ou com uma estrutura “em colapso”. Também podem ser simplesmente intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são de tamanho ou formato uniforme. Lipídeos são substâncias graxas que podem ser de lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, lipídeos incluem as gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois e aldeídos. Lipídeos adequados para uso podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, fosfatidil colina de dimiristila (“DMPC”) pode ser obtida a partir de Sigma, St. Louis, Mo.; fosfato de dicdetila (“DCP”) pode ser obtida a partir de K & K Laboratories (Plainview, N.Y.); colesterol (“Choi”) pode ser obtida a partir de Calbiochem-Behring; fosfatidil glicerol de dimiristila (“DMPG”) e outros lipídeos podem ser obtidos da Avanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.). Seleção

[0135] Para avaliar a expressão de um polipeptídio de CAR ou porções do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula (por exemplo, uma célula T específica de antígeno) pode conter também um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar identificação e seleção de células de expressão a partir da população de células que se procura ser transfectadas ou infectadas através de vetores virais. Em outras modalidades, o marcador selecionável pode ser carregado em um pedaço de DNA separado e usado em um procedimento de co-transfecção. Ambos os marcadores selecionáveis e genes repórteres podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir expressão nas células hospedeiras. Em algumas modalidades, o vetor de codificação de CAR compreende um vetor lentiviral. Em algumas modalidades preferidas, o vetor de codificação de CAR compreende um vetor gama retroviral. Mais preferencialmente, o vetor de codificação de CAR compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador ou tag físico selecionável que permite seleção apenas daquelas células que expressam o(s) CAR(s) codificado(s) pelo vetor. Marcadores selecionáveis úteis incluem, porém não são limitados a, genes de resistência a antibiótico, genes repórteres, ou expressão de um tag físico. Tags físicos podem incluir, porém não são limitados a peptídeos de superfície de célula truncada (por exemplo, um receptor de superfície de célula que não tem domínios de sinalização intracelular) e podem ser selecionados com um anticorpo apropriado, usando métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o vetor de codificação de CAR compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um gene de resistência a antibiótico como resistência a blasticidina bor. Em algumas dessas modalidades, as células T CAR (por exemplo, as células T CAR específicas de antígeno) são cultivadas na presença do marcador selecionável (por exemplo, blasticidina), desse modo permitindo a seleção e expansão de células T que expressam CAR descritas na presente invenção. Métodos terapêuticos

[0136] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos na presente invenção são dirigidos ao tratamento de um câncer e/ou um distúrbio autoimune em um sujeito por administrar ao sujeito células CAR-T autólogas ou alogenéícas como provido na presente invenção.

[0137] Os métodos da presente revelação se baseiam, em parte, nos princípios de restrição de célula T para antígenos alvo específicos. Por exemplo, e sem limitação, produtos e preparados compreendendo CTLs derivados de doador direcionados contra antígenos expressos por um vírus, como Vírus Epstein-Barr (EBV), podem ser eliciados em linhagens de células apresentadoras de antígeno direcionado (por exemplo, estimuladoras), incluindo linfoblastos B transformados por EBV (BLCLs). Com relação aos preparados de célula T CAR específica de antígeno- vírus revelados (por exemplo, anti-CD19-CD28-CAR-EBV-CTLs), as células alvo e/ou receptoras dos produtos CAR-T feitos pelos métodos providos na presente invenção, podem ser autólogas ou alogenéicas. No caso de alvos alogenéicos, a identidade de antígeno de leucócito humano (HLA) do doador deve ser conhecida e combinada com a identidade HLA do alvo (isto é, linhagens de células cultivadas e/ou receptoras).

[0138] Um preparado de células T CAR pode ter uma mistura de CTLs não específicos e específicos de antígeno. Desse modo, para quantificar CTLs alo reativos (por exemplo, CTLs específicos de antígeno com ou sem um CAR), uma reação contra alvos descasados-HLA é eliciada. De modo ideal, lise de célula deve ser mínima, ou abaixo de um limiar predeterminado. Além disso, o nível de CTLs expansíveis ou CTLs que expressam CAR pode ser quantificado por limitar ensaio de diluição e diluição de citotoxicidade contra alvos alogenéicos.

[0139] Células alvo para os ensaios revelados na presente invenção são tipicamente selecionados por seu fenótipo uniforme e disponibilidade em grandes quantidades. Em certas modalidades, as linhagens de células alvo são células apresentadoras de antígeno (APCs). Em algumas dessas modalidades, as linhagens de células alvo são células B, células T apresentadoras de antígeno, células dendríticas, ou células apresentadoras de antígeno artificiais (por exemplo, células aK562). Em certas modalidades, as linhagens de células alvo compreendem células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Em algumas dessas modalidades, as linhagens de células alvo são linfoblastos. Em certas modalidades preferidas, as linhagens de células alvo são transformadas de modo viral. Em modalidades preferidas, as linhagens de células alvo compreendem cada linfócitos de sangue periférico estimulados por fitoemaglutinina (PHA-blastos/PHAbs) e linhagens de células de lB-linfoblastoide transformadas por vírus de Epstein-Barr (BLCLs). Como exemplificado na presente invenção para a avaliação de CTLs específicos de antígeno que expressam CAR, BLCLs têm a vantagem de ser células maiores com alta viabilidade e a capacidade de reter desidrogenase de lactato significativa (LDH) e/ou grandes reservatórios de cromo intracelular (Cr), tornando os mesmos favoráveis para avaliação de citotoxicidade através de ensaios de liberação de LDH ou Cr. Entretanto, no caso de antígeno de EBV, BLCLs (como aqueles usados como APCs) são antígeno-positivo de EBV, que permite a apresentação cruzada específica de antígeno EBV para receptores de células T (TCRs) específicos para alelos HLA descasados. PHA-blastos têm a vantagem de serem EBV-antígeno- negativo e não podem apresentar de modo cruzado antígenos de EBV a TCRs. Ainda, PHA-blastos são células menores e em geral mais frágeis. Isso resulta em reservatórios menores e permeabilidade de repórter que provê finalmente probabilidade mais alta de resultados de citotoxicidade falso-positivos. Desse modo, BLCLs e PHA-blastos podem ser usados como pares alvo, derivados do mesmo doador. Em algumas dessas modalidades, as células alvo são derivadas do receptor em potencial de um preparado de célula T CAR alogenéica descrita na presente invenção, de modo a guiar seleção apropriada de um preparado de células T CAR a ser administrado.

[0140] Em certas modalidades, se o preparado induzir lise em uma pluralidade de linhagens de células alvo acima de um limiar predeterminado, o método compreende ainda quantificar no preparado a frequência de CTLs CAR-T expansíveis capazes de lisar uma linhagem de células alvo, em que a amostra é identificada como não sendo clinicamente alo reativa se contiver um nível dos CTLs CAR-T expansíveis que está em ou abaixo de um limiar predeterminado. Em certas modalidades, antes de quantificar a frequência de CTLs CAR-T expansíveis, citolíticos, o preparado induz mais de 15% de lise em cada da linhagem de células PHA-blasto alogenéica e da linhagem de célula alogenéica.

[0141] Em algumas modalidades, a quantificação da frequência de CTLs CAR-T expansíveis no preparado compreende avaliar função citolítica após um período de expansão de CTL CAR-T, por exemplo, por executar análise de diluição limitadora. Em modalidades adicionais, a avaliação de função citolítica compreende executar um método de detecção como liberação de cromo radioativo (por exemplo,

51Cr) ou liberação de desidrogenase de lactato (LDH).

[0142] Em algumas modalidades, linhagens de células alvo compreendem células alogenéicas. Em algumas dessas modalidades, células alvo carregam alelos de Antígeno de Leucócito humano (HLA) que não se casam com os alelos de HLA aos quais os CTLs CAR-T do preparado são restritos. Em outras dessas modalidades, as células alvo carregam alelos HLA que são um casamento parcial com os alelos HLA aos quais os CTLs CAR-T do preparado são restritos. Ainda em tais outras modalidades, as células alvo carregam alelos HLA que são um casamento com os alelos HLA aos quais os CTLs CAR-T do preparado são restritos. Em modalidades preferidas, os CTLs CAR-T são restritos aos alelos HLA das células alvo que codificam proteínas MHC da classe I.

[0143] Em outras modalidades, as linhagens de células alvo compreendem células autólogas. Em algumas dessas modalidades, o preparado de CTL CAR-T é identificado como adequado para uso contra células alvo por confirmar a capacidade do preparado de lisar duas ou mais linhagens de célula alvo autóloga em, acima, ou abaixo de limiares predeterminados.

[0144] Em certas modalidades, as células CAR-T autólogas ou alogenéicas compreendem células T de memória central (células Tcm ), por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80% das células são células Tcm. Em algumas modalidades, as células CAR-T autólogas ou alogenéicas compreendem uma razão de células T de memória central para células de memória efetora (Tcm:TEM) de pelo menos 1:1 a pelo menos 3:1, por exemplo, pelo menos 1:1, 1.4:1, 2.5:1, ou 3:1). Em algumas dessas modalidades, as células CAR-T autólogas ou alogenéicas são predominantemente células T CD4+. Em algumas modalidades, as células CAR-T autólogas ou alogenéicas compreendem pelo menos 80% de células CAR-T CD4+ e pelo menos 15% de células CAR-T CD8+). Em algumas modalidades as células CAR-T autólogas ou alogenéicas compreendem uma razão de células T CD4+ para células

T CD8+ de pelo menos 1:1 a pelo menos 3:1, por exemplo, pelo menos 1:1, 1,4:1, 2,5:1 ou 3:1. Em alguns dos métodos descritos na presente invenção, células T alogenéicas são selecionadas de um banco de células (por exemplo, um banco derivado de doador terceiro gerado previamente de células T específicas de epítopo).

[0145] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção podem ser usados para tratar qualquer doença autoimune. Os exemplos de doenças autoimunes incluem, por exemplo, nefrite glomerular, artrite, doença semelhante a cardiomiopatia dilatada, colite ulcerosa, síndrome de Sjogren, doença de Crohn, eritematodes sistêmica, artrite reumatóide crônica, artrite reumatóide juvenil, doença de Still, esclerose múltipla, psoríase, dermatite de contato alérgica, polimiosite, paquiderma, periarterite nodosa, febre reumática, vitiligo vulgaris, doença de Behcet, doença de Hashimoto, doença de Addison, dermatomiosite, miastenia gravis, síndrome de Reiter, doença de Graves, anemia perniciosa, doença de esterilidade, pênfigo, púrpura trombocitopênica autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite crônica ativa, doença de Addison, síndrome anti-fosfolipídeo, alergia atópica, gastrite atrófica autoimune, acloridria autoimune, doença celíaca, síndrome de Cushing, dermatomiosite, lúpus eritematoso discoide, síndrome de Goodpasture, tireoidite de Hashimoto, atrofia adrenal idiopática, trombocitopenia idiopática, diabetes dependente de insulina, síndrome de Lambert-Eaton, hepatite lupoide, linfopenia, doença de tecido conectivo misto, penfigoide, pênfigo vulgaris, anemia perniciosa, uveíte facogênica, poliarterite nodosa, auto síndromes poliglandulares, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, síndrome de Raynaud, policondrite recidivante, síndrome de Schmidt, esclerodermia limitada (ou síndrome de CREST), oftalmia simpática, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal, tirotoxicose, resistência a insulina tipo b, diabetes tipo 1, colite ulcerativa e granulomatose de Wegener.

[0146] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar MS. Em algumas modalidades, o MS é MS recorrente- remitente, MS progressivo secundário, MS progressivo primário ou MS progressivamente recorrente.

[0147] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar um SAD. Por exemplo, em certas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e/ou síndrome de Sjogren.

[0148] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar IBD. Por exemplo, em certas modalidades os métodos providos na presente invenção são usados para tratar doença de Crohn (doença de intestino regional, por exemplo, formas inativa e ativa), doença celíaca (por exemplo, formas inativa ou ativa) e/ou colite ulcerativa (por exemplo, formas inativa e ativa). Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar síndrome de intestino irritável, colite microscópica, enterite linfocítica- plasmocítica, doença celíaca, colite colagenosa, colite linfocítica, enterocolite eosinofílica, colite indeterminada, colite infecciosa (colite viral, bacteriana ou de protozoário, por exemplo, amebiana) (por exemplo, colite de clostridium dificile), colite pseudomembranosa (colite necrotizante), doença de intestino inflamatório isquêmico, doença de Behcet, sarcoidose, esclerodermia, displasia associada a IBD, lesões ou massas associadas à displasia, e/ou colangite esclerosante primária.

[0149] Em algumas modalidades, são providos na presente invenção métodos de tratar câncer em um sujeito por administrar ao sujeito um preparado de célula CAR-T terapêutico como descrito aqui.

[0150] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção podem ser usados para tratar qualquer câncer. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos e células CAR-T descritas na presente invenção podem ser usados para tratar qualquer tumor canceroso ou pré-canceroso.

Em algumas modalidades, o câncer inclui um tumor sólido.

Em algumas modalidades, canceres que podem ser tratados por métodos e composições providas na presente invenção incluem, porém não são limitadas a, células de câncer a partir da bexiga, sangue, osso, medula óssea, cérebro, mama, cólon, esôfago, gastrointestinal, gengiva, cabeça, rim, fígado, pulmão, nasofaringe, pescoço, ovário, próstata, pele, estômago, testículos, língua ou útero.

Além disso, o câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histológico, embora não seja limitado a esses: neoplasma, maligno; carcinoma; carcinoma, não diferenciado; carcinoma de célula do fuso e gigante; carcinoma de célula pequena; carcinoma papilar; carcinoma de célula escamosa; carcinoma linfo epitelial; carcinoma de célula basal; carcinoma pilomatrix; carcinoma de célula de transição; carcinoma de célula de transição papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; colangiocarcinoma e carcinoma hepatocelular combinada; adenocarcinoma trabecular; carcinoma cístico de adenoide; adenocarcinoma em pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, polipose adenomatosa familiar; carcinoma sólido; tumor de carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquíolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofobo; carcinoma acidfil; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de célula clara; carcinoma de célula granular; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometrióide; carcinoma de apêndice de pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de célula de anel de sinete; carcinoma de duto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença mamária de paget; carcinoma de célula acinar; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma com/metaplasia escamosa; timona maligno; tumor de estroma de ovário maligno; thecoma maligno; tumor de célula granulosa maligna; e roblastoma maligna; carcinoma de célula de sertoli; tumor de célula de leydig maligno; tumor de célula de lipídeo maligno; para ganglioma maligno; paraganglioma extra mamário maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de disseminação superficial; melanoma maligno em nevos pigmentado gigante; melanoma de célula epitelioide; nevos azul maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma de estroma; tumor misto maligno; tumor misto mulleriano; nefroblastoma; heptaoblastoma; carcinossarcoma; mesenquimoma maligno; tumor brenner maligno; tumor phyllodes maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma maligno; bócio ovariano maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma maligno; sarcoma de kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiossarcoma; osteosarcoma; condrossarcoma mesenquimal; tumor de célula gigante de osso; sarcoma de ewing; tumor odontogênico maligno; odontossarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodermal primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico de olfato; meningioma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma maligno; tumor de célula granular maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno linfócito pequeno; linfoma maligno de célula grande difusa; linfoma maligno folicular; fungoides de micose; outros linfomas não de Hodgkin especificados;

histiocitose maligno; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócito; doença imunoproliferativa de intestino delgado; leucemia; leucemia linfóide; leucemia de célula de plasma; eritroleucemia; leucemia de célula linfossarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócito; leucemia megacarioblasica; sarcoma de mieloide; e leucemia de célula pilosa. Em algumas dessas modalidades preferidas, as composições e métodos providos na presente invenção podem ser usados para tratar malignidades de célula B (por exemplo, malignidades CD19+) incluindo leucemia linfocítica crônica (CLL), ALL e muitos linfomas não de Hodgkin.

[0151] Em algumas modalidades, os métodos providos na presente invenção são usados para tratar câncer associado a EBV. Em algumas modalidades, o câncer associado a EBV é NPC associado a EBV. Em algumas modalidades, o câncer associado a EBV é distúrbio linfo proliferativo pós-transplante (PTLD), linfoma de célula T/NK, câncer gástrico EBV+ ou leiomiossarcoma EBV+.

[0152] Em algumas modalidades, o sujeito foi exposto a um vírus (por exemplo, EBV0 de modo que partículas de vírus são detectáveis no sangue do sujeito. Em algumas modalidades, o método compreende ainda medir a carga viral no sujeito (por exemplo, antes ou após a administração das células CAR-T específicas de peptídeo ao sujeito). A determinação de carga viral em um sujeito pode ser um bom marcador prognóstico para eficácia de imunoterapia. Em algumas modalidades, a seleção de células CAR-T compreende ainda determinar o número de cópias de DNA viral no sujeito (por exemplo, em uma amostra de sangue ou tecido). Em algumas modalidades, a carga viral é medidas duas ou mais vezes. Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas providas na presente invenção podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administração específico, sem ser tóxico para o paciente.

[0153] O nível de dosagem selecionada dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do agente particular empregado, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção ou metabolismo do composto específico sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com o composto específico empregado, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas artes médicas.

[0154] Em algumas modalidades, os métodos descritos na presente invenção incluem selecionar células T alogenéicas a partir de um banco de células (por exemplo, um banco derivado de doador terceiro gerado previamente de células T específicas de epítopo). Em algumas modalidades, as células T são selecionadas porque expressam um TCR restrito a um MHC classe I que é codificado por um alelo HLA que está presente no sujeito. Em algumas modalidades, as células T são selecionadas se as células T e sujeito compartilham pelo menos 2 (por exemplo, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6) alelos HLA e as células T são restritas através de um alelo HLA compartilhado. Em algumas modalidades, o método compreende testar o repertório de TCR das células T específicas de epítopo derivado de doador terceiro geradas previamente (isto é, células T alogenéicas) com citometria de fluxo. Em algumas modalidades, células T específicas de epítopo são detectadas usando um ensaio de tetrâmero, um ensaio de ELISA, um ensaio de western blot, um ensaio de microscopia fluorescente, um ensaio de degradação Edman e/ou um ensaio de espectrometria de massa (por exemplo, sequenciamento de proteína). Em algumas modalidades, o repertório de TCR é analisado usando uma sonda de ácido nucleico, um ensaio de amplificação de ácido nucleico e/ou um ensaio de sequenciamento.

[0155] Em algumas modalidades, são providas na presente invenção composições (por exemplo, composições terapêuticas) compreendendo células T e/ou APCs providas na presente invenção usadas para tratar e/ou evitar uma doença autoimune em um sujeito por administrar ao sujeito uma quantidade eficaz da composição. Em alguns aspectos, são providos na presente invenção métodos de tratar distúrbios autoimunes usando uma composição(por exemplo, uma composição farmacêutica, tais composições compreendendo CTLs alogenéicas). Em algumas modalidades, a composição inclui uma combinação de múltiplos CTLs (por exemplo, dois ou mais) providos na presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Comparação de transdução de CAR de CTLs EBV derivados de PBMCs e células T isoladas

[0156] PBMC congelado a partir de doadores saudáveis foram descongelados e recuperados em meio RPMI. As células foram divididas em duas frações: 1/3 das células (estimuladores) foram infectados com adenovírus AdE1- LMPpoly por uma hora a 37ºC. Os estimuladores foram então lavados duas vezes e suspensos novamente em meio de cultura de soro RPMI/AB e irradiado a 2500 cGy (2500 rads). Os 2/3 restantes de células (respondedoras) foram transferidos para meio de soro RPMI/AB e retidos a 37ºC até eles poderem ser misturados com os Estimuladores (por exemplo, BLCL derivado de PBMC) ou foram usados para isolar células T CD3+ que foram então cultivadas com o Estimulador PBMC (vide a figura 1). Ativação de PBMC

[0157] No dia 0, as culturas foram iniciadas em placas de cultura GRex de 6 poços (10 cm2) em a de 9x10 células de Estimulador de PBMC irradiadas a 2,1x107 células PBMC respondedoras e retornadas a 37ºC, incubação de cultura de tecido. Embora opcional, nos dias 9 e 10, as culturas de células foram esgotadas de CD56+, células NK (Assassinas naturais), antes da transdução.

Ativação de células T CD3+ isoladas

[0158] No dia 0, as células T foram isoladas (isto é, enriquecidas) de PBMC por meio conhecido na técnica (por exemplo, glóbulos magnéticos revestidos com FACS ou anti-CD3). Células T foram iniciadas em placas de cultura GRex de 6 poços (10 cm2) contendo meios compreendendo 20U/ml IL2, em uma razão de 1 célula T /4 células de Estimulador PBMC e retornadas a 37ºC, incubação de cultura de tecido. Nos dias 9 e 10, as culturas de célula foram transduzidas para expressar CARs (como acima, depleção de célula NK era opcional antes da transdução). A sensibilização do material de partida (por exemplo, após enriquecimento de CD3+) para antígenos virais, como EBV, resulta em um aumento na percentagem de células T de fenótipo de memória central na população resultante. (Vide a figura 2, lado esquerdo). Essas células T de memória central persistem vantajosamente ao longo do tempo enquanto marcadores de exaustão de célula T (PD1 e CTLA4) permanecem baios em células sensibilizadas de modo viral. (Figura 2 lado direito). Transdução de CAR

[0159] Nos dias 9 e 10 culturas de PBMC e célula T foram transduzidas com vírus recombinante codificando CAR anti-CD19 (e marcador de seleção de blasticidina). Em resumo, retronectina (0,5 mL, 10 μg/mL) foi adicionada a cada poço de uma placa tratada com cultura não de tecido de 24 poços para cada condição de estimulação e incubada 2 horas em temperatura ambiente. A retronectina foi então removida por aspiração, substituída com 0,5 mL de tampão de bloqueio para cada poço, e placas incubadas 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com tampão de lavagem. CAR anti-CD19 codificando vírus foi descongelado em temperatura ambiente e adicionado a placas. As placas foram envoltas em filme de parafina e centrifugadas a 2000xg durante 2 horas a 32ºC. O sobrenadante viral foi aspirado e 1 ml de suspensão de células preparada a partir de cada grupo de estimulação (0,5 x 106 células/mL suspenso novamente em meios

YH5) foi adicionado. As placas foram centrifugadas a 1000xg durante 15 minutos a 32ºC e incubadas a 37ºC, 5% CO2 durante a noite. As células para cada condição de estimulação foram então removidas e agrupadas para contagem. As células foram suspensas novamente em meios YH5 novo a 0,5 - 1,0 x106 células/mL.

[0160] No dia 11, cada condição de estimulação (isto é, células T isoladas ou de PBMC respondedora) foram retornadas à cultura com Estimulador PBMC irradiado. As amostras foram tiradas em cada dos dias 15, 23 e 27 para Separação de célula ativada por fluorescência (FACS) (por exemplo, para células CD33+, scFV+). A seleção de droga (blasticidina) foi induzida no dia 19. Resultados

[0161] EBV-CTLs derivados de células T isoladas demonstraram capacidade proliferativa e viabilidade melhorada. O material de partida enriquecido com CD3+ tem um rendimento maior que 10 vezes em relação a condições de transdução e expansão convencionais, demonstrando capacidade proliferativa e viabilidade significativamente melhorada. (Vide a figura 3). A eficiência de transdução de vetor CAR a jusante é dependente da capacidade proliferativa. Desse modo, capacidade proliferativa e viabilidade maior nas células T estimuladas por antígeno resulta em eficiência de transdução CAR a jusante aperfeiçoada. Quando comparado com transdução em uma cultura de PBMC bruta, CTLs EBV CAR+ derivados de uma etapa de enriquecimento de CD3+ inicial demonstram um aumento significativo de eficiência de transdução de CAR a jusante após estimulação de BLCL e também mostram maior viabilidade de célula em resposta à seleção de blasticidina. (Vide a figura 4) Exemplo 2: Avaliação do fenótipo de célula T de memória sobre anti-CD19- CAR-EBV-CTL após estimulação de BLCL

[0162] A estimulação baseada em glóbulo anti-CD3/CD28 padrão é amplamente usada no campo como um método para expandir células T in vitro antes da transdução com vetores de CAR. O seguinte experimento foi realizado para determinar o impacto de vários estímulos de célula CAR-T favoráveis a um processo de fabricação de alto rendimento sobre o fenótipo imune de célula T de memória para um produto terapêutico final. Design de estudo e procedimento

[0163] Células T específicas de antígeno-EBV, CD3+ isoladas foram estimuladas e expandidas em 4 condições de cultura diferentes durante 3 dias;

1. Não estimulado,

2. anti-CD3/CD28 solúvel,

3. Glóbulos magnéticos anti-CD3/CD28 e

4. Com células BLCL.

[0164] Após 3 dias de estimulação, cada cultura foi transduzida com um vetor viral codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) e retornada para incubação por 7 dias em cultura padrão (meio YH) para permitir expansão das células T transduzidas. As células foram então colhidas e fenótipos de células analisados por mancha de células e separação de células ativada por fluorescência (FACS) como delineado na figura 5). Linhagens de células e condições de cultura

[0165] Células T específicas de antígeno-EBV, CD3+ foram removidas de armazenagem de nitrogênio líquido, descongeladas e suspensas em meios YH em uma concentração de 2 x 106 células/mL com 100 IU/mL IL-2. A suspensão foi revestida em uma placa de 24 poço com 2 mLs da suspensão por poço e incubada durante a noite. Após essa recuperação durante a noite, as células foram contadas e divididas nos quatro grupos de tratamento diferentes como descrito na figura 5 (vide também a tabela 2) com 6 x 106 células por grupo, em uma concentração de 1 x 106 células/mL.

Tabela 2: Condições de estimulação para avaliar fenótipo de memória em células T após estimulação e transdução de CAR Número Condição de estimulação Lentivírus MOI 15 1 Não estimulado 28 2 Não estimulado 4-1BB 3 CD3/CD28 Dynabeads (1:1, glóbulo 28 para célula) 4 CD3/CD28 Dynabeads (1:1, glóbulo 4-1BB para célula) 5 CD3/CD28 ImmunoCult (25 µl/mL) 28 6 CD3/CD28 ImmunoCult (25 µl/mL) 4-1BB 7 BLCL 28 8 BLCL 4-1BB 9 BLCL Nenhum

[0166] A estimulação com anti-CD3/CD28 Dynabeads foi feita em uma razão de célula:glóbulo de 1:1. Um volume suficiente de glóbulos foi removido e lavado em DPBS antes de adição direta à suspensão de células. Por conseguinte, a cultura de estimulação foi revestida em 2mL de meios YH5 com 100 IU/mL, IL-2 por poço em uma placa de 24 poços, como acima, e incubada durante 3 dias.

[0167] A estimulação com anti-CD3/CD28 solúvel foi feita por adição direta de reagente CD3/CD28 ImmunoCultTM em uma concentração de 25µl por mL (isto é, 50 µl por poço da placa de 24 poço como acima) e incubada por 3 dias.

[0168] A estimulação com linhagem de células de linfoblastoide B transformada com EBV (BLCL) foi feita em uma razão de 1 célula T específica de antígeno EBV para quatro BLCL. Em resumo, células T específicas de antígeno-

EBV, CD3+ foram removidas de armazenagem de nitrogênio líquido, descongeladas, suspensas em meios YH, e deixadas recuperar. Na preparação para cultura de estimulação, EBV-BLCL foram irradiadas com uma dose total de 90Gy (9000rads) de radiação. Células T específicas de antígeno EBV-BLCL foram combinadas em meios YH5 com 100 IU/mL IL-2 na mesma placa de 24 poço como acima e incubadas durante 3 dias. Transdução de CAR

[0169] Na preparação de transdução, placas de 24 poço foram preparadas como a seguir: 0,5 mL de Retronectina (10µg/mL) foi adicionado a cada poço de uma placa tratada com cultura não tecido de 24 poço e incubado durante 2 horas em temperatura ambiente. Retronectina foi então removida e substituída com 0,5 mL de tampão de bloqueio e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. O tampão de bloqueio foi então removido e cada poço foi lavado com pelo menos 1 mL de tampão de lavagem. As placas foram mantidas com tampão de lavagem a 4ºC até o vetor lentiviral codificando o CAR (compreendendo um domínio de transdução de sinal CD28 ou 4-1BB) foi descongelado em temperatura ambiente e adicionado a cada poço das placas revestidas com Retronectina para obter um MOI (multiplicidade de infecção) ou 15 partículas virais/célula (vide a Tabela 2). As placas foram então envoltas em filme de parafina e centrifugadas a 2000xg por 2 horas a 32ºC, durante cujo tempo as células de cada grupo de estimulação foram contadas e suspensas novamente em meios YH5 em uma concentração de 0,5 x 106 células/mL. Após centrifugação, o sobrenadante viral foi aspirado de cada poço e substituído com 1 mL das suspensões de célula preparadas, incluindo poços de controle. As placas foram centrifugadas a 1000xg durante 15 minutos a 32ºC e então incubadas a 37ºC, 5% CO2 durante a noite. Tabela 3: Reagentes de FACS - anticorpos conjugados e corantes de viabilidade

Anticorpo/reagente clone Fabricante Anti-CD3 APC-Cy7 UCHT1 Biolegend CD19-Fc Biotina AcroBiosystems Estreptavidina PE eBioscience Anti-CD4 BV421 RPA-T4 BD Biosciences Anti-CD8 APC SK1 Biolegend Vivo/mortoBV510 Tonbo CD45RA PerCP-Cy5.5 HI100 Biolegend CD45RO PE-Cy7 UCHL1 Biolegend CD62L BB515 DREG-56 BD Biosciences

[0170] As células de cada grupo de estimulação forma agrupadas, contadas e suspensas novamente em uma concentração de 0.5-1.0x106 células/mL de meio YH novo antes de retornarem para incubação a 37ºC, 5% CO2 durante 2 dias. O agrupamento e suspensão de novo foi repetido a cada dois dias até o sétimo dia (colheita). Após colheita as células foram rotuladas (vide a tabela 3) e uma estratégia de gating de citometria de fluxo foi aplicada para identificar CD3, CD4, CD8, CD62L e CD45RO nas células T que expressam CAR (vide a figura 6). Em resumo, sinais de célula de interesse foram primeiramente identificados por tamanho e granularidade (isto é, dispersão para frente (FSC) vs. Dispersão lateral (SSC)). Células vivas foram então identificadas com base em mancha com um corante de viabilidade (por exemplo, Live/DeadTM BV510). Células únicas viáveis foram então gated com base em área-pulso vs. Altura-pulso (FSC-A vs. FSC-H). Células T CD3+ individuais e subpopulações subsequentes (por exemplo, células T de memória central, CD4+, CD8+) puderam ser então identificadas usando anticorpos rotulados de modo fluorescente.

Resultados Tabela 4: Frequência de CD62L+/CD45RO+ em células CD19-CAR-T Frequência de Estimulação CD62L+/CD45RO+ Frequência de CD62L-/CD45RO- cultura Domínio de sinais 4-1BBz CD28z 4-1BBz CD28z BLCL 61,2% 65,5% 21,9% 19,1% solúvel anti-CD3/CD28 36,3% 35,1% 31,8% 29,9% anti-CD3/CD28 ligado por glóbulo 35,1% 44,9% 45% 45,3% Não estimulado 25,2% 31,9%

[0171] A avaliação citométrica de fluxo indicou que células CD19-CAR-T transduzidas estimuladas com EBV-BLCLs mostraram percentagens mais altas de subconjuntos de célula T de memória central como avaliado por células CD62L+/CD45RO+ em comparação com CD3/CD28 solúvel ou estimulação de glóbulo (vide a figura 7). Células CD19-CAR-T estimuladas com CD3/CD28 ligada por glóbulo ou solúvel tiveram percentagens mais altas de subconjuntos de célula T de memória efetora como avaliado por células CD62L+/CD45RO+ em comparação com células estimuladas por BLCL (vide a Tabela 4). Tabela 5: Frequência de CD4 e CD8 em células CD19-CAR-T (gated em CD3) Estimulação Frequência de CD3+CD4+ Frequência de CD3+CD8+ 4-1BBz 28z 4-1BBz 28z BLCL 83,5 83,8 15,6 15,2 CD3/CD28 ImmunoCult 52,8 45,7 43,1 49,3

CD3/CD28 Dynabeads 29,5 22,3 56,5 53,0 Não estimulado 54,5 44,1

[0172] A expressão CD4 e CD8 foi avaliada também em células CD19-CAR- T. Da população de CD3+ de células CD19-CAR-T, houve uma percentagem mais alta de células CD4+ quando estimuladas com BLCLs em comparação com estimulação CD3/CD28 (vide a figura 8 e tabela 5).

[0173] Esses dados demonstram que a estimulação de culturas de células CAR-T com BLCLs expressando antígeno direcionado para CAR leva a um deslocamento para fenótipo de memória central predominante em comparação com resultados da estimulação de CD3/CD28 através de anticorpos solúveis ou ligados por glóbulo. Esse estudo suporta fortemente o potencial para qualidade melhorada de culturas de células CAR-T que utilizam estimulação de APC positivo-antígeno (como representado por BLCLs que apresentam antígeno) versus a qualidade esperada ao usar glóbulo anti-CD3/CD28 padrão ou outros modos acelulares de estimulação. Exemplo 3: anti-CD19-CAR-EBV-CTLs exercem citotoxicidade específica e potente

[0174] Similarmente ao acima, o vetor lentiviral que codifica o CAR (compreendendo um domínio de transdução de sinal CD28 ou 4-1BB) foi usado para transdução de células T específicas de antígeno, CD3+ estimuladas por EBV-BLCL.

[0175] Em resumo, células T específicas de vírus que expressam CAR foram preparadas do seguinte modo.

[0176] Dia 0, amostras de PBMC foram descongeladas, e células CD3+ foram enriquecidas (Por exemplo, por FACS vivo ou glóbulos magnéticos revestidos com anti-CD3). Essas células T CD3+ foram então estimuladas por cultura com BLCLs que apresentam antígeno-EBV como descrito na presente invenção.

[0177] 11 dias após estimulação (no dia 11), a cultura foi esgotada de células NK (por exemplo, usando glóbulos anti-CD56) e estimulada novamente com BLCLs que apresentam antígeno-EBV em uma razão de respondedora/estimulador de 1:4 durante 7 dias.

[0178] No dia 18, a cultura foi estimulada uma terceira vez, em uma razão de respondedora/estimulador de 4:1 durante 2 dias.

[0179] No dia 20 a transdução foi iniciada com um vetor viral que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) e retornada para incubação em cultura padrão (meio YH) para permitir a expansão das células T específicas de vírus, transduzidas. Opcionalmente, uma etapa de depleção de célula NK pode ser empregada imediatamente antes da transdução.

[0180] No dia 25, a expressão de CAR foi avaliada (por exemplo, por análise de FACS) e células T específicas de vírus, que expressam CAR (efetoras) puderam ser adicionadas a culturas alvo para ensaios de citotoxicidade. Opcionalmente, as células puderam ser congeladas no dia 25, a seguir descongeladas e testadas em relação à citotoxicidade no dia 28.

[0181] Citotoxicidade, mediada por liberação de LDH, pode ser observada após 4 horas em cultura em conjunto com células T EBV-CAR19-CAR ou EBV CTLs de controle nas razões E:T indicadas (vide as figuras 9 e 10). Células T EBV-CD19- CAR demonstram citotoxicidade específica de CD19, independente de HLA com baixa citotoxicidade-alo como observado por morte específica de células CD19+ (NALM6 e Raji) e BLCLs casadas e descasadas HLA EBV+/CD19+ (vide a figura 9, A e B; e figura 10). Em contraste, células K562, e blastos PHA casados e descasados HLA, todos os quais não têm antígeno CD19 e EBV, não são mortos (vide a figura 9, A e C; e a figura 10). Além disso, células T CAR anti-CD19 sensibilizadas com EBV eram citotóxicas para todas as linhagens de células CD19+ com menos citotoxicidade fora de alvo, isto é, menos citotoxicidade ou citotoxicidade não existente a células que não têm expressão tanto de CD19 como EBV. Quando observado durante três dias após adição de efetor (isto é, adição de célula T EBV- CTL ou EBV-CD19 CAR) citólise independente de HLA potente e específica foi observada em células direcionadas. A citólise foi induzida em células tanto casadas- HLA (alvos BLCL) como descasadas-HLA (alvos BLCL e Raji). Entretanto, EBV-CTL pode induzir somente citólise significativa em células alvo BLCL casadas (vide a figura 11).

[0182] Quando comparado com células T CAR produzidas convencionalmente (isto é, sem enriquecimento ou estimulação de antígeno das culturas T de partida), células T CAR específicas de antígeno (por exemplo, anti- CD19-CD28-CAR-EBV-CTLs) exibem citotoxicidade comparável, se não melhor (vide a figura 12). Entretanto, anti-CD19-CD28-CAR-EBV-CTLs) parecem ser menos alo reativos. A capacidade proliferativa de células T CD19-CAR específicas de EBV foi observada por ensaios de diluição de Violeta CellTraceTM após cultura em conjunto com as linhagens de células indicadas (vide a figura 13). Anti-CD19-CD28- CAR-EBV-CTLs retiveram a capacidade de matar linhagens de células B- linfoblastóide (BLCL) (figura 13, inferior-esquerda) porém pouparam alvos PHA- blasto autólogos e alogenéicos que não têm expressão de antígeno EBV e CD19 com notavelmente menos alo reatividade em relação a células T CAR convencionais (figura 13,inferior-direita, sombreada). O que é mais, em relação a células T CAR produzidas convencionalmente, Anti-CD19-CD28-CAR-EBV-CTLs exibem um perfil de citocina distinto que apresenta produção IFNy aumentada (vide a figura 14). Modalidades adicionais

[0183] Seguem algumas modalidades numeradas específicas da invenção reveladas na presente invenção. Essas modalidades são exemplificadoras e para fins de ilustração apenas. Será entendido que a invenção não é limitada às modalidades, porém abrange todas essas formas e combinações das mesmas como compreendidas no escopo da revelação acima.

[0184] Modalidade 1. Um método de gerar um preparado compreendendo células T específicas de antígeno que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR), compreendendo: i) preparar uma cultura de células CD3+, a cultura compreendendo células T e células estimuladoras apresentadoras de antígeno; ii) transduzir as células T da cultura com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CAR; iii) cultivar as células T transduzidas para permitir proliferação de células T específicas de antígeno, que expressam CAR; e iv) colher as células T específicas de antígeno, que expressam CAR.

[0185] Modalidade 2. Um método para induzir proliferação ex vivo de uma população de células T específicas de antígeno, que expressam CAR, compreendendo: i) preparar uma cultura de células CD3+, a cultura compreendendo células T e células estimuladoras apresentadoras de antígeno; ii) transduzir as células T com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um CAR; iii) cultivar a população de células T transduzidas para permitir proliferação de células T específicas de antígeno, que expressam CAR; e iv) colher as células T específicas de antígeno, que expressam CAR para processamento.

[0186] Modalidade 3. O método da modalidade 1 ou 2, compreendendo ainda cultivar as células T transduzidas da etapa iii) com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[0187] Modalidade 4. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, compreendendo ainda incubar a cultura das etapas i), ii), iii), ou qualquer combinação das mesmas, com uma ou mais citocinas.

[0188] Modalidade 5. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, compreendendo ainda incubar as células estimuladoras com uma ou mais citocinas antes da cultura com as células CD3+.

[0189] Modalidade 6. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que as células estimuladoras são células estimuladoras apresentadoras de antígeno irradiadas.

[0190] Modalidade 7. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que as células CD3+ compreendem uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de hemácias, plaquetas, monócitos e granulócitos.

[0191] Modalidade 8. O método de qualquer uma das modalidades 1-7, em que as células CD3+ compreendem uma amostra de PBMCs a partir da qual linfócitos CD3+ são positivamente selecionados.

[0192] Modalidade 9.O método da modalidade 8, em que as células CD3+ compreendem uma pluralidade de tipos de células incluindo qualquer um dos tipos de célula T efetora, células T ajudantes (células TH), células T citotóxicas (CTLs), tipos de célula T de memória, células T reguladoras (células Treg), células T assassinas naturais (células NKT), células invariantes associadas à mucosa (células MAIT), células gama delta T (células ?? T), células T duplo-negativo (DNTs), células CD3+ B, ou qualquer combinação das mesmas.

[0193] Modalidade 10. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que as células CD3+ e as células estimuladoras são individualmente derivadas do mesmo doador.

[0194] Modalidade 11. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que as células CD3+ são derivadas de um doador diferente das células estimuladoras.

[0195] Modalidade 12. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 11,

em que as células estimuladoras compreendem células linfoblastóides, células B, células-T apresentadoras de antígeno, células dendríticas, células apresentadoras de antígeno artificiais e/ou células K562.

[0196] Modalidade 13. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que as células estimuladoras compreendem células B linfoblastóide (BLCLs).

[0197] Modalidade 14. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que as células estimuladoras são positivamente selecionadas da amostra de doador.

[0198] Modalidade 15. O método da modalidade 14, em que as células positivamente selecionadas são células CD19+.

[0199] Modalidade 16. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que as células estimuladoras são infectadas com um vírus nativo e/ou do tipo selvagem compreendendo pelo menos um antígeno de peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T.

[0200] Modalidade 17. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que as células estimuladoras expressam um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um antígeno de peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T.

[0201] Modalidade 18. O método da modalidade 16 ou 17, em que o antígeno de peptídeo imunogênico é de um oncovírus.

[0202] Modalidade 19. O método de qualquer uma das modalidades 16 a 18, em que o antígeno de peptídeo imunogênico é de um herpes vírus, papilomavirus, adenovírus, poliomavírus ou retrovírus.

[0203] Modalidade 20. O método de qualquer uma das modalidades 16 a 19, em que o antígeno de peptídeo imunogênico é de vírus de Epstein-Bar (EBV), citomegalovírus (CMV), vírus de papiloma humano (HPV), vírus BK (BKV), vírus John-Cunningham (JCV), vírus de célula Merkel (MCV), vírus T-linfotrópico humano

(HTLV) ou vírus de imunodeficiência humana (HIV).

[0204] Modalidade 21. O método de qualquer uma das modalidades 16 a 18, em que o antígeno de peptídeo imunogênico é de um vírus conhecido como causando hepatite viral.

[0205] Modalidade 22. O método da modalidade 17, em que o vetor viral é incompetente para replicação.

[0206] Modalidade 23. O método de qualquer uma das modalidades 17 a 22, em que o vetor viral compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um ou mais antígenos de peptídeo imunogênico.

[0207] Modalidade 24. O método de qualquer uma das modalidades 17 a 23, em que o vetor viral é um vetor adenoviral.

[0208] Modalidade 25. O método da modalidade 24, em que o vetor viral compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um ou mais antígenos EBV.

[0209] Modalidade 26. O método da modalidade 24 ou 25, em que o vetor adenoviral é AdE1-LMPpoly.

[0210] Modalidade 27. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que as células estimuladoras apresentam mais de um antígeno de peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T.

[0211] Modalidade 28. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 27, em que as células estimuladoras expressam um ou mais antígenos EBV.

[0212] Modalidade 29. O método da modalidade 28, em que um ou mais antígenos EBV compreendem um peptídeo LMP1 ou fragmento do mesmo, um peptídeo LPM2A ou fragmento do mesmo e/ou um peptídeo EBNA1 ou fragmento do mesmo.

[0213] Modalidade 30. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que as células estimuladoras expressam endogenamente um antígeno ou ligante direcionado pelo CAR.

[0214] Modalidade 31. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que as células estimuladoras expressam um vetor compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um antígeno ou ligante direcionado pelo CAR.

[0215] Modalidade 32. O método da modalidade 30 ou 31, em que o antígeno CAR ou ligante é CD19.

[0216] Modalidade 33. O método de qualquer uma da modalidades 1-32, opcionalmente compreendendo congelar e armazenar a cultura de células CD3+ para transdução em uma data futura.

[0217] Modalidade 34. O método da modalidade 33, em que antes da transdução a cultura de células CD3+ é descongelada e cultivada novamente com células estimuladoras pelo menos uma vez.

[0218] Modalidade 35. O método de qualquer uma das modalidades 1-34, compreendendo manter as células CD3+ na cultura durante pelo menos 2 dias a pelo menos 28 dias antes da transdução.

[0219] Modalidade 36. O método da modalidade 35, compreendendo manter as células CD3+ na cultura durante pelo menos 2 dias antes da transdução.

[0220] Modalidade 37.O método da modalidade 35, compreendendo manter as células CD3+ na cultura durante pelo menos 9 dias antes da transdução.

[0221] Modalidade 38.O método da modalidade 35, compreendendo manter as células CD3+ na cultura durante pelo menos 20 dias antes da transdução.

[0222] Modalidade 39.O método da modalidade 35, compreendendo manter as células CD3+ na cultura durante pelo menos 28 dias antes da transdução.

[0223] Modalidade 40. O método de qualquer uma das modalidades 1-39, compreendendo manter as células T transduzidas na cultura durante pelo menos 2 dias a pelo menos 17 dias após transdução.

[0224] Modalidade 41. O método da modalidade 40, compreendendo manter as células T transduzidas na cultura durante pelo menos 2 dias após transdução.

[0225] Modalidade 42.O método da modalidade 40, compreendendo manter as células T transduzidas na cultura durante pelo menos 7 dias após transdução.

[0226] Modalidade 43.O método da modalidade 40, compreendendo manter as células T transduzidas na cultura durante pelo menos 17 dias após transdução.

[0227] Modalidade 44. O método de qualquer uma das modalidades 37 a 39, compreendendo ainda cultivar novamente as células CD3+ da cultura com células estimuladoras pelo menos uma vez.

[0228] Modalidade 45. O método de qualquer uma das modalidades 37 a 39, compreendendo ainda cultivar novamente as células CD3+ da cultura com células estimuladoras pelo menos duas vezes.

[0229] Modalidade 46. O método da modalidade 44 ou 45, em que a cultura de novo é iniciada pelo menos a cada 2 a 14 dias.

[0230]Modalidade 47. O método de qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que uma primeira nova cultura é iniciada 11 dias após a preparação da cultura.

[0231] Modalidade 48. O método de qualquer uma das modalidades 44 a 47, em que uma segunda nova cultura é iniciada 7 dias após a primeira nova cultura.

[0232] Modalidade 49. O método de qualquer uma das modalidades 1-48, em que o vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando o CAR é um vetor lentiviral.

[0233] Modalidade 50. O método da modalidade 49, em que o vetor viral codificando o CAR é um vetor gama retroviral.

[0234] Modalidade 51. O método da modalidade 49 ou 50, em que o vetor viral é incompetente para replicação.

[0235] Modalidade 52. O método da modalidade 51, em que a sequência de ácido nucleico codificando o CAR compreende um ou mais domínios de transdução de sinal.

[0236] Modalidade 53. O método da modalidade 52, em que um ou mais domínios de transdução de sinal compreende um domínio de sinalização CD28, um domínio de sinalização 4-1BB, e/ou um domínio de sinalização CD3, ou fragmentos dos mesmos.

[0237] Modalidade 54. O método da modalidade 53, em que o domínio de sinalização CD3 é CD3ζ.

[0238] Modalidade 55. O método de qualquer uma das modalidades 49 a 54, em que o vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR compreende ainda uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador selecionável.

[0239] Modalidade 56. O método da modalidade 55, em que o vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando o CAR compreende ainda uma sequência de ácido nucleico codificando resistência a antibiótico.

[0240] Modalidade 57. O método da modalidade 56, em que o antibiótico é blasticidina.

[0241] Modalidade 58. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 57, em que as células T que expressam CAR colhidas são células T CD3+.

[0242] Modalidade 59. O método da modalidade 58, opcionalmente compreendendo congelamento e armazenagem das células T que expressam CAR colhidas em um banco de células para preparar uma composição de imunoterapia adotiva em uma data posterior.

[0243] Modalidade 60. O método da modalidade 59, em que antes da preparação de uma composição de imunoterapia adotiva as células T que expressam CAR são descongeladas e cultivadas novamente com células estimuladoras pelo menos uma vez.

[0244] Modalidade 61. O método de qualquer uma das modalidades 58 a 60,

em que as células T que expressam CAR colhidas compreendem cada das células T de memória central (células Tcm ) e células de memória efetora (células TEM ).

[0245] Modalidade 62. O método de qualquer uma das modalidades 58 a 60, em que as células T que expressam CAR colhidas são predominantemente células Tcm.

[0246] Modalidade 63. O método da modalidade 61, em que a razão de células Tcm para células TEM é maior que 1:1.

[0247] Modalidade 64. O método da modalidade 63, em que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 1,4:1.

[0248] Modalidade 65.O método da modalidade 63, em que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 2,5:1.

[0249] Modalidade 66.O método da modalidade 63, em que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 3:1.

[0250] Modalidade 67. O método de qualquer uma das modalidades 58 a 60, em que as células T que expressam CAR colhidas compreendem cada de células T CD4+ e CD8+.

[0251] Modalidade 68. O método de qualquer uma das modalidades 58 a 60, em que as células T que expressam CAR colhidas são predominantemente células T CD4+.

[0252] Modalidade 69. O método da modalidade 68, em que a razão de células T CD4+ para células T CD8+ é maior que 1:1.

[0253] Modalidade 70. O método da modalidade 69, em que a razão de células T CD4+ para células T CD8+ é pelo menos 1,4:1.

[0254] Modalidade 71.O método da modalidade 69, em que a razão de células T CD4+ para células T CD8+ é pelo menos 2,5:1.

[0255] Modalidade 72.O método da modalidade 69, em que a razão de células T CD4+ para células T CD8+ é pelo menos 3:1.

[0256] Modalidade 73. O método de qualquer uma das modalidades 62 a 72, em que pelo menos 60% das células T que expressam CAR colhidas são células Tcm .

[0257] Modalidade 74. Um método ex vivo para enriquecer células T que expressam CAR, específicas de antígeno, compreendendo: (I) obter uma amostra de células a partir de um sujeito, a amostra compreendendo células T CD3+; (ii) isolar as células CD3+ a partir da amostra e colocar as células CD3+ em contato com células estimuladoras apresentadoras de antígeno, desse modo aumentando seletivamente a proliferação de células T CD3+ específicas de antígeno; (Iii) transduzir as células CD3+ com um vetor viral codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), para prover uma população de células-T CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno; e (Iv) opcionalmente cultivar a população de células T CD3+ que expressam CAR ex vivo em uma cultura com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno para seletivamente aumentar a proliferação de células T CD3+ que expressam CAR específicas de antígeno.

[0258] Modalidade 75. O método da modalidade 74, em que a amostra compreende células mononucleares de sangue periférico (PBMC).

[0259] Modalidade 76. O método da modalidade 74 ou 75, em que as células CD3+ isoladas e as células estimuladoras apresentadoras de antígeno são derivadas, individualmente do mesmo sujeito.

[0260] Modalidade 77. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 76, em que as células CD3+ isoladas são derivadas de um sujeito diferente das células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[0261] Modalidade 78. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 77, em que as células estimuladoras apresentadoras de antígeno compreendem células linfoblastóide, células B, células T apresentadoras de antígeno, células dendríticas, células apresentadoras de antígeno artificiais e/ou células K562.

[0262] Modalidade 79. O método de qualquer uma das modalidades 74 a....., em que as células estimuladoras apresentadoras de antígeno são BLCLs.

[0263] Modalidade 80.O método de qualquer uma das modalidades 74 a 79, em que as células estimuladoras apresentadoras de antígeno são CD19+.

[0264] Modalidade 81. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 80, em que as células estimuladoras apresentadoras de antígeno expressam um ou mais antígenos EBV.

[0265] Modalidade 82.O método da modalidade 81, em que um ou mais antígenos EBV compreendem um peptídeo LMP1 ou fragmento do mesmo, um peptídeo LPM2A ou fragmento do mesmo e/ou um peptídeo EBNA1 ou fragmento do mesmo.

[0266] Modalidade 83. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 82, compreendendo manter as células T CD3+ após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno durante pelo menos 3 dias a pelo menos 28 dias antes da transdução.

[0267] Modalidade 84. O método da modalidade 83, compreendendo manter as células T CD3+ após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno durante pelo menos 3 dias antes da transdução.

[0268] Modalidade 85.O método da modalidade 83, compreendendo manter as células T CD3+ após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno durante pelo menos 6 dias antes da transdução.

[0269] Modalidade 86.O método da modalidade 83, compreendendo manter as células T CD3+ após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno durante pelo menos 9 dias antes da transdução.

[0270] Modalidade 87.O método da modalidade 83, compreendendo manter as células T CD3+ após contato com as células estimuladoras apresentadoras de antígeno durante pelo menos 28 dias antes da transdução.

[0271] Modalidade 88. O método de qualquer uma das modalidades 83 a 87, compreendendo ainda contatar novamente as células T CD3+ isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno pelo menos uma vez.

[0272] Modalidade 89. O método de qualquer uma das modalidades 83 a 88, compreendendo ainda contatar novamente as células T CD3+ isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno pelo menos duas vezes.

[0273] Modalidade 90. O método da modalidade 88 ou 89, em que o contato novamente das células T CD3+ isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno é iniciado pelo menos a cada 2 a 14 dias.

[0274] Modalidade 91. O método de qualquer uma das modalidades 88 a 90, em que o primeiro novo contato das células T CD3+ isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno é iniciado após 11 dias.

[0275] Modalidade 92. O método de qualquer uma das modalidades 88 a 91, em que o segundo novo contato é iniciado 7 dias após o primeiro novo contato das células T CD3+ isoladas com células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[0276] Modalidade 93. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 92, em que a cultura que aumenta seletivamente a proliferação de células T CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno compreende as células estimuladoras apresentadoras de antígeno.

[0277] Modalidade 94. O método da modalidade 93, compreendendo manter as células T CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno na cultura que seletivamente aumenta a proliferação de células T que expressam CAR específicas de antígeno durante pelo menos 2 dias após transdução.

[0278] Modalidade 95.O método da modalidade 94, compreendendo manter as células T CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno na cultura que seletivamente aumenta a proliferação de células T que expressam CAR específicas de antígeno durante pelo menos 7 dias após transdução.

[0279] Modalidade 96.O método da modalidade 94, compreendendo manter as células T CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno na cultura que seletivamente aumenta a proliferação de células T que expressam CAR específicas de antígeno durante pelo menos 17 dias após transdução.

[0280] Modalidade 97. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 96, em que o vetor viral codificando o CAR é um vetor lentiviral.

[0281] Modalidade 98.O método da modalidade 97, em que o vetor viral codificando o CAR é um vetor gama retroviral.

[0282] Modalidade 99. O método de qualquer uma das modalidades 97 ou 98, em que o vetor viral codificando o CAR é incompetente para replicação.

[0283] Modalidade 100. O método da modalidade 99, em que a sequência de ácido nucleico codificando o CAR compreende um ou mais domínios de transdução de sinal.

[0284] Modalidade 101.O método da modalidade 100, em que um ou mais domínios de transdução de sinal compreende um domínio de sinalização CD28, um domínio de sinalização 4-1BB, e/ou um domínio de sinalização CD3, ou fragmentos dos mesmos.

[0285] Modalidade 102. O método da modalidade 101, em que o domínio de sinalização CD3 é CD3ζ. ou um fragmento do mesmo.

[0286] Modalidade 103. O método de qualquer uma das modalidades 97 a 102, em que o vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando o CAR, compreende ainda uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador selecionável.

[0287] Modalidade 104. O método de qualquer uma das modalidades 97 a 102, em que o vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando o CAR, compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica resistência a antibiótico.

[0288] Modalidade 105. O método de qualquer uma das modalidades 74 a 104, em que a cultura que aumenta seletivamente a proliferação de células T CD3+ que expressam CAR específicas de antígeno compreende ainda um antibiótico.

[0289] Modalidade 106.O método da modalidade 105, em que o antibiótico é blasticidina.

[0290] Modalidade 107. Um método para preparar uma composição de imunoterapia adotiva, compreendendo qualquer uma das modalidades 74 a 106, em que a composição compreende predominantemente células T de memória central (Tcm) CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno.

[0291] Modalidade 108. O método da modalidade 107, em que pelo menos 60% da composição de imunoterapia adotiva compreende Tcm CD3+ que expressa CAR, específica de antígeno.

[0292] Modalidade 109. O método de qualquer uma das modalidades 107 ou 108, em que Tcm CD3+ que expressam CAR, específicas de antígeno são predominantemente células T CD4+.

[0293] Modalidade 110. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o CAR compreende um domínio de direcionamento que liga CD19.

[0294] Modalidade 111. O método da modalidade 110, em que o CAR compreende um fragmento variável de cadeia única anti-CD19 (ScFv).

[0295] Modalidade 112. Um método para melhorar a capacidade proliferativa de células T, compreendendo executar o método de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0296] Modalidade 113. Um método para melhorar a eficiência de transdução de células T, compreendendo executar o método de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0297] Modalidade 114. Um método para melhorar a viabilidade de células T que expressam CAR, compreendendo executar o método de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0298] Modalidade 115. Uma composição de células T preparada pelo método de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0299] Modalidade 116. Um preparado de células T compreendendo células T específicas de antígeno que expressam um receptor de antígeno quimérico recombinante (CAR); em que pelo menos 60% das células T que expressam CAR são células Tcm.

[0300] Modalidade 117.O preparado de células da modalidade 116, em que as células Tcm que expressam CAR são predominantemente células T CD4+.

INCOPRORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[0301] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e números de acessão de sequência mencionados na presente invenção são pela presente incorporadas por referência na íntegra como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições da presente invenção, terá controle.

EQUIVALENTES

[0302] Os técnicos no assunto reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de gerar uma composição compreendendo células T citotóxicas que são específicas para ligação com um primeiro antígeno e que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ligação com um segundo antígeno, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: i) preparar uma cultura de células enriquecidas para células T CD3+, as células T CD3+ sendo estimuladas para reconhecer e se ligar ao primeiro antígeno através de um receptor de células-T ; ii) transduzir as células T CD3+ da cultura com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR que se liga ao segundo antígeno; iii) cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR para permitir proliferação de células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR; e iv) colher as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno que expressam CAR.

2. Método de preparar uma composição de imunoterapia adotiva compreendendo células T citotóxicas que são específicas para ligação com um primeiro antígeno e que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ligação com um segundo antígeno, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: i)preparar uma cultura de céçlulas enriquecias para células T CD3+, as células T CD3+ sendo estimuladas a reconhecer e ligar com o primeiro antígeno através de um receptor de células-T; ii) transduzir as células T CD3+ da cultura com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR que se liga ao segundo antígeno;

iii) cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR para permitir proliferação de células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR; e iv) colher as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR, desse modo fornecendo a composição de imunoterapia adotiva.

3. Método para induzir proliferação de uma população de células T citotóxicas que são específicas para ligação com um primeiro antígeno que expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ligação com um segundo antígeno, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: i) preparar uma cultura de células enriquecidas para células T CD3+, as células T CD3+ sendo estimuladas para reconhecer e se ligar ao primeiro antígeno através de um receptor de células-T; ii) transduzir as células T CD3+ da cultura com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um CAR que se liga ao segundo antígeno; e iii) cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR para permitir proliferação de células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda incubar a cultura das etapas i), ii), iii) ou qualquer combinação das mesmas, com uma ou mais citocinas.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura de células enriquecidas para células CD3+ compreende uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) esgotadas de hemácias, plaquetas, monócitos e granulócitos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura de células enriquecidas para células

CD3+ é preparada por um processo compreendendo seleção positiva de células CD3+ a partir de uma amostra de PBMCs.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de preparar uma cultura de células enriquecidas para células T CD3+ estimuladas para reconhecer e se ligar com o primeiro antígeno através de um receptor de células-T compreende cultivar em conjunto uma população de células respondedoras CD3+ com células estimuladoras que apresentam o primeiro antígeno em sua superfície de célula.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura em conjunto é iniciada em uma razão de células respondedoras:células estimuladoras de 1:4.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura preparada de células enriquecidas para células T CD3+ estimuladas para reconhecer e se ligar ao primeiro antígeno através de um receptor de células-T é opcionalmente cultivada novamente com células estimuladoras que apresentam o primeiro antígeno em sua superfície antes da transdução de CAR.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que uma primeira etapa de nova cultura é iniciada pelo menos 7 dias após a iniciação da etapa de cultura em conjunto.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que as células respondedoras e estimuladoras são derivadas do mesmo doador.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que as células estimuladoras são células estimuladoras apresentadoras de antígeno irradiadas por gama.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12,

CARACTERIZADO pelo fato de que as células estimuladoras compreendem células de linfoblastoide B (BLCLs).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que as células estimuladoras são infectadas com um vírus nativo e/ou do tipo selvagem compreendendo pelo menos um antígeno de peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que as células estimuladoras foram criadas para expressar pelo menos um antígeno de peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro antígeno é um antígeno viral.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral é um vírus Epstein-Bar (EBV), citomegalovírus (CMV), vírus de papiloma humano (HPV), vírus BK (BKV), vírus John-Cunningham (JCV), vírus de célula Merkel (MCV), vírus de T-linfotrópico humano (HTLV) ou antígeno de vírus de imunodeficiência humana (HIV).

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral compreende um peptídeo EBV LMP1 ou fragmento do mesmo, um peptídeo EBV LMP2A ou fragmento do mesmo, ou um peptídeo EBV EBNA1 ou fragmento do mesmo.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que as células estimuladoras expressam ainda o segundo antígeno.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de o segundo antígeno é um antígeno CD19, um antígeno CD20 ou um antígeno mesotelina.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de compreender opcionalmente congelar e armazenar a cultura de células enriquecida para células T CD3+ para transdução em uma data futura.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de compreender opcionalmente congelar e armazenar a cultura de células T citotóxicas específicas do primeiro antígeno, que expressam CAR para uso em uma data futura.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de compreender opcionalmente congelar e armazenar as células T citotóxicas específicas do primeiro antígeno, que expressam CAR, colhidas para administrar a um paciente necessitando em uma data futura.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de compreender manter a cultura de células enriquecidas para células T CD3+ durante pelo menos 2 dias até pelo menos 28 dias antes da transdução de CAR.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de compreender manter a cultura de células enriquecidas para células T CD3+ durante pelo menos 2 dias antes da transdução de CAR.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de compreender manter a cultura de células enriquecidas para células T CD3+ durante pelo menos 9 dias antes da transdução de CAR.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de compreender manter a cultura de células enriquecidas para células T CD3+ durante pelo menos 20 dias antes da transdução de CAR.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de compreender manter a cultura de células enriquecidas para células T CD3+ durante pelo menos 28 dias antes da transdução de CAR.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR durante pelo menos 2 dias a pelo menos 17 dias antes da etapa de colheita.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR durante pelo menos 2 dias antes da etapa de colheita.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR durante pelo menos 7 dias antes da etapa de colheita.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar as células T CD3+ transduzidas por CAR durante pelo menos 17 dias antes da etapa de colheita.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de compreender opcionalmente cultivar em conjunto as células T CD3+ transduzidas por CAR com células estimuladoras que expressam o primeiro antígeno pelo menos uma vez.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral compreendendo a sequência de ácidos nucleicos codificando o CAR é um vetor lentiviral ou retroviral.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral é incompetente para replicação.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35,

CARACTERIZADO pelo fato de que o CAR compreende um ou mais domínios de transdução de sinal.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais domínios de transdução de sinal compreende um domínio de sinalização CD28, um domínio de sinalização 4-1BB, um domínio de sinalização CD3 ou variantes ou fragmentos dos mesmos.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de sinalização de CD3 é CD3ζ.

39. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o CAR compreende um domínio de CD3ζ variante não tendo pelo menos uma região ITAM funcional.

40. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o CAR compreende um domínio Mut06.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor viral compreendendo a sequência de ácidos nucleicos codificando o CAR compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos codificando um marcador selecionável.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador selecionável confere resistência a antibiótico.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o antibiótico é blasticidina.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR, colhidas, compreendem cada de células T de memória central (células Tcm) e células T de memória efetora (células TEM ).

45. Método, de acordo com qualquer reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno que expressam CAR são predominantemente células Tcm.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão de células Tcm para células TEM é maior que 1:1.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 1,4:1.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 2,5:1.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão de células Tcm para células TEM é pelo menos 3:1.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno que expressam CAR colhidas compreendem cada de células T CD4+ e CD8+.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que as células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR colhidas são predominantemente células T CD4+.

52. Método ex vivo para gerar uma composição compreendendo células T citotóxicas que são específicas para ligação com um primeiro antígeno e que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ligação com um segundo antígeno, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: i) obter uma amostra de células a partir de um sujeito, a amostra de célula compreendendo células T CD3+;

ii) enriquecer a amostra de células para células T CD3+ para prover uma amostra enriquecida de células; iii) colocar a amostra enriquecida de células com células estimuladoras apresentadoras de antígeno que apresentam o primeiro antígeno em sua superfície de células para prover uma amostra de células, estimulada por primeiro antígeno; iv) transduzir a amostra de células, estimulada por primeiro antígeno com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um CAR que se liga ao segundo antígeno; V) cultivar as células transduzidas por CAR para permitir proliferação de células T citotóxicas específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR; e Vi) colher a composição celular específica de primeiro antígeno que expressa CAR.

53. Método ex vivo para gerar uma composição compreendendo células T citotóxicas que são específicas para ligação com um primeiro antígeno e que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ligação com um segundo antígeno, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: ii) obter uma amostra de células a partir de um sujeito, a amostra de célula compreendendo células T CD3+; ii) enriquecer a amostra de células para células T CD3+ para prover uma amostra enriquecida de células; iii) transduzir a amostra enriquecida de células com um vetor viral compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um CAR que se liga ao segundo antígeno; iv) colocar as células transduzidas por CAR em contato com células estimuladoras apresentadoras de antígeno que apresentam o primeiro antígeno em sua superfície de célula; e

V) colher a composição celular específica de primeiro antígeno que expressa CAR.

54. Método para melhorar a capacidade proliferativa de células T, CARACTERIZADO pelo fato de compreender executar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

55. Método para melhorar a eficiência de transdução de células T, CARACTERIZADO pelo fato de compreender executar o método de qualquer uma das reivindicações anteriores.

56. Método para melhorar a viabilidade de células T que expressam CAR, CARACTERIZADO pelo fato de compreender executar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

57. Método de tratar um distúrbio associado à expressão de um antígeno de peptídeo em um paciente necessitando do mesmo, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar ao paciente as células T citotóxicas, específicas de primeiro antígeno, que expressam CAR obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

58. Composição de célula T, CARACTERIZADA por ser preparada pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.