KR20210061361A - 항원-특이적 car-t 세포를 확장하기 위한 방법, 이와 관련된 조성물 및 용도 - Google Patents

항원-특이적 car-t 세포를 확장하기 위한 방법, 이와 관련된 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 CAR-T 세포 배양물 및 제제를 제조하고 특징화하는 방법을 제공한다.

Description

항원-특이적 CAR-T 세포를 확장하기 위한 방법, 이와 관련된 조성물 및 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 9월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/729,089호 및 2019년 9월 6일에 출원된 제62/896,707호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들은 그 전체가 참고로 원용된다.
배경
입양 면역요법은 질환-연관된 세포의 인식, 표적화 및 파괴를 목표로 하는 개인에게 질환-특이적 및/또는 조작된 T 세포, 예컨대, 항원-특이적 세포독성 T 세포 (CTL) 및 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 T 세포를 이식 또는 주입하는 것을 포함한다. 입양 면역요법은 암, 이식-후 림프증식성 장애, 감염성 질환 (예컨대, 바이러스 감염) 및 자가면역 질환을 포함하는 많은 질환 및 장애의 치료를 위한 유망한 접근법이 되었다.
예를 들어, 편재성 엡스타인 바 바이러스 (EBV, 인간 헤르페스바이러스 4로서 또한 알려짐)에 대한 노출은 다발성 경화증 (MS), 전신 자가면역 질환 (SAD) 및 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하는 자가면역 질환의 발병기전에 대한 소인 또는 다른 역할을 초래할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 병리 (즉, MS, SAD 및 IBD)는 자신의 신체 조직에 대한 비정상적인 면역 반응으로부터 발생한다. MS는 자신의 신체 면역 세포에 의한, 신경 섬유를 둘러싸고 있는 보호 지질 초(sheath)인 미엘린의 분해를 특징으로 한다. SAD는 류마티스성 관절염 (RA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 쇼그렌 증후군 (SS)을 포함하는 다양한 증상이 있는 결합 조직 질환의 그룹이다. IBD는 크론 질환, 셀리악 질환 및 궤양성 대장염을 포함하는 결장 및 소장의 염증성 병태의 그룹이다. 최근 연구는 MS로 진단받은 개인이 건강한 개인보다 신경 조직에 응집된 B 세포에서 더 높은 수준의 EBV 관련된 단백질을 나타냄을 보여준다.
바이러스 감염과 다중 병태 (예컨대, 암 및 자가면역 질환)의 발병기전 사이의 연관성은 여러 그룹이 동종이계 (예컨대, WO 2017/203368호 참고, 본원에 참고로 원용됨) 및 자가유래 (예컨대, Pender et al., Multiple Sclerosis Journal. 2014; 20(11):1541-1544 참고) 항원-특이적 T 세포의 생산을 발전시키는 추동력을 제공하였다.
T 세포에 의한 면역-감시는 광범위한 악성 세포의 검출 및 사멸에 중요한 역할을 한다 (Gottschalk et al. 2005. Leuk Lymphoma. 46:1-10; Ochsenbein et al. 2002. Cancer Gene Ther. 9:1043-10). 악성 세포의 생존 및 확산은 이러한 세포가 CTL에 의한 인식을 회피하는 능력과 연관이 있다 (Bubenik et al. 2003. Oncol. Rep. 10:2005-2008; Rees et al. 1999. Cancer Immunol. Immunother. 48:374-381). 특히, EBV-연관된 악성종양, 예컨대, 호지킨 림프종 및 비인두 암종에서 항원 처리 및 제시 기능은 온전히 남아있다 (Khanna et al. 1998. Cancer Res. 58: 310-314, Lee et al. 1998. Blood 92: 1020-1030). 최근 연구는 면역-감시 (및 후속 반응)가 EBV-특이적 T 세포의 조절 T 세포-매개된 억압에 의해 전복되어, 악성 세포를 제거하지 못할 수 있음을 시사하였다. 예를 들어, 억제성 면역 체크포인트 수용체, 예컨대, PD-1 및 Tim-3의 상향조절은 T 세포 기능장애와 관련이 있으며 만성 HCV 감염이 있는 환자의 C 형 간염 바이러스 (HCV)-특이적 및 HCV-비특이적 CD8+ T 세포 모두에서 관찰되었다. T 세포 증식 및 IFN-γ 분비의 부분적인 복원은 PD-1 및 Tim-3의 각각의 리간드 (즉, PD-L1 및 갈렉틴-9로서 또한 알려진 B7-H1)에 대한 결합을 억제함으로써 엑스 비보(ex vivo)에서 달성될 수 있다. 더욱이, 최근 보고서는 인터페론 요법의 장기간 투여가 감소된 증식 가능성, 기능의 점진적 손실 및 억제성 면역 체크포인트 수용체의 지속적인 발현을 특징으로 하는 기능장애 상태인 T 세포 "소모"를 야기할 수 있음을 입증하였다.
키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포는 소아 급성 림프모구성 백혈병 및 미만성 거대 세포 림프종에 대한 FDA-승인된 치료제이다. 인 비보(in vivo)에서 CAR-T 세포의 증식 및 지속성은 치료 효능의 중요한 인자이다. 이를 위해, 본원에서 본 발명자들은 자가유래 및 동종이계 항원-특이적 T 세포 (예컨대, 예를 들어, EBV-연관된 항원(들)을 검출하기 위해 특이적으로 민감화된 T 세포)의 생성 및/또는 생산 방법을 설명하고, 또한 선택된 질환-연관된 항원에 대해 지시된 하나 이상의 기능적 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작시켰다. 하나 이상의 CAR을 또한 발현하는 항원-특이적 CTL의 생성은 광범위한 질환의 치료를 위한 신규 입양 면역요법 플랫폼을 제공한다. 또한, 중앙 기억 T 세포 (Tcm) 및 줄기 세포-유사 기억 T 세포 (Tscm) 표현형을 제시하는 CAR-T 세포는 CAR T-세포 주입 후 증식 가능성 및 지속적인 인 비보 확장을 용이하게 한다 (Kalos, 2018). 따라서, 농축된 배양 및 자극 방법을 사용하여 Tcm 및 Tscm 표현형에 대한 입양 면역요법 생산물 (예컨대, CAR-T 세포)을 농축시키는 것은 이러한 요법의 모드에 대한 인 비보 효력, 지속성 및 효능에 유리하다. 조작된 항원-특이적 T 세포 (예컨대, 항원-특이적, CAR-발현 T 세포)의 입양 전달을 통한 암 및/또는 자가면역-연관된 항원에 대한 T 세포 반응의 이러한 증가는 현재 치료 전략에 대한 매력적인 대안을 제공할 수 있다.
발명의 요약
본원은 클래스 I 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 상에 제시된 항원 (예컨대, 바이러스 항원, 예컨대, EBV 펩티드)에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체 및 표적-세포 항원 또는 세포 표면 마커 (예컨대, 암 세포-연관된 항원, 예컨대, CD19)에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 동종이계 또는 자가유래 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항원-특이적 T 세포는 T 세포 (반응자 세포, 예컨대, PBMC 샘플 또는 이로부터 단리된 T 세포)를 포함하는 샘플을 클래스 I MHC (예컨대, 대상체에 존재하는 HLA 대립유전자에 의해 코딩된 클래스 I MHC) 상에 항원 (예컨대, 바이러스 펩티드)를 제시하는 항원 제시 세포 (APC, 즉, 자극자 세포)와 항온처리하여, 항원-특이적 반응자 T 세포의 증식을 유도시킴으로써 생성된다. 바람직하게, 항원-특이적 반응자 T 세포는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 본원은 단리된 T 세포 집단을 항원-제시 자극자 세포와 함께 배양하고 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 생성된 항원-특이적 T 세포를 형질도입하는 것을 포함하는, CAR-발현, 항원-특이적 T 세포 집단의 엑스 비보 증식을 유도하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 형질도입된 T 세포는 항원-특이적 CAR T 세포의 증식을 유도하기 위해 항원-제시 자극자 세포와 함께 배양된다. 다른 특정 실시양태에 있어서, 단리된 T 세포는 APC와 함께 배양하기 전에 CAR-코딩 바이러스 벡터로 형질도입된다. 추가 실시양태에 있어서, 단리된 T 세포는 CAR-코딩 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 전후에 APC와 함께 배양된다.
일부 양태에 있어서, 본원은 중앙 기억 T 세포를 농축시키기 위한 엑스 비보 방법을 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, 이러한 방법은 CD3+ T 세포를 포함하는 대상체로부터의 세포 샘플을 수득하고 상기 CD3+ T 세포를 항원-제시 자극자 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, CD3+ T 세포는 당업계에 알려진 방법 (예컨대, 샘플로부터 CD3+ 세포의 양성 선택 및/또는 샘플로부터 원하지 않은 세포 또는 구성요소의 고갈에 의한 음성 선택)에 의해 항원-제시 자극자 세포와 접촉하기 전에 샘플로부터 단리된다. 예를 들어, 제한없이, 이러한 방법은 항-CD3 비드 (예컨대, 자성 비드), 플라스틱 부착, 용출, NK 세포의 고갈 (예컨대, 항-CD56 비드 사용) 및/또는 이들의 조합을 이용한 선택을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CD3+ T 세포는 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 전 및/또는 접촉 후에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CAR-발현, CD3+, 항원-특이적 T 세포는 항원-제시 자극자 세포와 함께 배양된다.
일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 의도된 자극자 세포를 천연/야생형 바이러스 또는 바이러스 펩티드 항원을 코딩하는 바이러스 벡터와 함께 항온처리함으로써 하나 이상의 바이러스 펩티드 항원을 제시하도록 만들어진다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 펩티드 항원은 헤르페스바이러스 (예컨대, EBV 및 CMV), 파필로마바이러스 (예컨대, HPV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스 (예컨대, BKV, JCV 및 메르켈 세포 바이러스), 레트로바이러스(예컨대, HTLV-I, 또한 HIV와 같은 렌티바이러스를 포함함), 피코나바이러스 (예컨대, A 형 간염 바이러스), 헤파드나바이러스 (예컨대, B 형 간염 바이러스), 헤파시바이러스 (예컨대, C 형 간염 바이러스), 델타바이러스 (예컨대, D 형 간염 바이러스), 헤페바이러스 (예컨대, E 형 간염 바이러스) 및 종양바이러스 등과 같은 이러한 유형의 바이러스로부터 유래된다. 특정 바람직한 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 PBMC를 천연/야생형 EBV와 함께 항온처리함으로써 EBV 펩티드를 제시하도록 만들어진다. 다른 바람직한 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 PBMC를 EBV 펩티드를 코딩하는 바이러스 벡터와 함께 항온처리하여, EBV 펩티드를 제시하도록 자극자 세포를 유도함으로써 EBV 펩티드를 제시하도록 만들어진다. 일부 실시양태에 있어서, EBV 펩티드는 LMP1 펩티드 또는 이의 단편, LMP2A 펩티드 또는 이의 단편, 및/또는 EBNA1 펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, EBV 펩티드는 표 1에 나열된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 재조합 복제 무능한 아데노바이러스 (예컨대, AdE1-LMPpoly)이다. 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 B 세포, 항원-제시 T 세포, 수지상 세포 또는 인공 항원-제시 세포 (예컨대, CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현하는 세포주, 예컨대, aK562 세포)일 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 항원-제시 자극자 세포는 또한 CAR에 표적-세포 항원 또는 세포 표면 마커 (예컨대, CD19)를 제시한다. 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 조사된다.
또한 본원은 투여에 적합한 CAR-T 세포의 치료적 제제를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR-T 세포의 치료적 제제의 샘플을 수득하고 다중 T 세포 유형 및 아형의 풍부에 대해 평가한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CD3+, CD4+, CD8+, CD62L+, 및/또는 CD45RO+ 세포의 양을 평가한다.
특정 양태에 있어서, 본원은 본원에 개시된 방법을 수행하는 것을 포함하는, T 세포의 증식 성능을 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에 있어서, 본원은 본원에 개시된 방법을 수행하는 것을 포함하는, CAR-발현 T 세포의 생존력을 개선시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에 있어서, 본원은 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 T 세포 조성물을 제공한다.
도 1은 PBMC 또는 단리된 T 세포로부터 유래된 EBV-T 세포의 CAR 형질도입을 비교하는 절차 및 실험군을 요약한 흐름도를 도시한다.
도 2는 항원-자극된 T 세포 (EBV-CTL)에서 지속된 중앙 기억 표현형을 도시한다.
도 3은 PBMC 및 단리된 T 세포로부터 유래되고 CAR을 발현하도록 형질도입된 EBV-T 세포의 성장 곡선을 도시한다.
도 4는 블라스티시딘 선택 후 단리된 T 세포로부터 유래된 생존가능한 CAR+ 세포의 농축을 도시한다.
도 5는 자극 및 CAR 형질도입 후 T 세포에 대한 기억 표현형을 검토하기 위한 연구 설계를 도시한다.
도 6은 CD19-CAR-T 세포에서 CD3, CD4, CD8, CD62L 및 CD45RO를 식별하기 위한 대표적인 유세포 분석 게이팅 전략을 도시한다.
도 7은 무 자극, BLCL, 가용성 항-CD3/CD28 및 비드-결합된 항-CD3/CD28 자극 후 CD19-CAR-T 세포 상의 CD62L 및 CD45RO (CD3+ 세포에 게이팅됨)에 대한 대표적인 도트 플롯을 도시한다. 나이브 PBMC는 또한 평가되었고 기억 서브세트의 게이팅을 위한 참고로서 사용되었으며; 적색 직사각형은 CD45RO+ 세포에서 CD62L 발현을 묘사한다.
도 8은 CD19-CAR T 세포에서 CD4 및 CD8 발현 (CD3에 게이팅됨)에 대한 대표적인 도트 플롯을 도시한다.
도 9는 EBV-특이적, 항-CD19 CAR T 세포가 강력하고 특이적인 세포독성을 발휘함을 도시한다.
도 10은 EBV-특이적, 항-CD19 CAR T 세포가 CD19-특이적 세포독성을 유도함을 도시한다.
도 11은 HLA-매칭된 (BLCL 표적) 및 HLA-미스매칭된 (BLCL 및 Raji 표적) 세포 둘 모두에서 특이적이고 강력한 HLA-독립적 세포용해를 도시하나, EBV-CTL은 매칭된 BLCL 표적 세포에서만 유의한 세포용해를 유도할 수 있다.
도 12는 EBV-특이적, 항-CD19 CAR T 세포에 비해 향상된 동종반응성 증식을 나타내는 통상적으로 생성된 항-CD19 CAR T 세포를 도시한다.
도 13은 표시된 세포주와의 공동-배양시 CellTraceTM Violet 희석 검정을 도시한다. 간단히 말해서, 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL은 CD19+ 세포주 (즉, BLCL, Raji 및 NALM/6; 왼쪽-하단)의 세포용해를 유도하면서 CD19 및 EBV 항원 발현이 결여된자가유래 및 동종이계 표적 (즉, K562 및 PHA-모세포)은 모면하게 하였으며, 기존의 CAR T 세포에 비해 현저히 낮은 동종반응성 (오른쪽-하단, 음영 처리)을 나타냈다.
도 14는 EBV 항원-특이적 항-CD19 CAR T 세포 및 통상적으로 생성된 항-CD19 CAR T 세포의 사이토카인 프로파일이 뚜렷한 반응을 나타냄을 도시한다.
일반적인
본원에 개시된 연구는 고-수율 제조 공정으로 개량할 수 있고/있거나 최종 치료적 생산물에서 기억 T 세포 면역표현형을 농축시키기 위한 다양한 CAR-T 세포 자극의 영향을 결정하고자 한다. 표준 항-CD3/CD28 비드-기반 자극은 CAR-코딩 벡터로 형질도입하기 전에 엑스 비보 또는 인 비트로에서 T 세포를 확장하는 방법으로서 현장에서 널리 사용된다. 그러나, 본원은 하나 이상의 CAR을 또한 발현하는 항원-자극된 T 세포 (예컨대, 바이러스-특이적 T 세포)에 대한 제조 공정을 개시한다. 이러한 공정은 초기 T-세포 농축 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 CD3+ T 세포는 세포의 보다 비균질의 혼합물 (예컨대, 전혈 및 PBMC 등)으로부터 농축/정제되고; 미리-선택된 항원 (예컨대, 바이러스 항원 또는 기타 종양/질환-연관된 항원 등)을 인식하고 이에 반응하도록 자극되고; 하나 이상의 CAR 작제물로 형질도입된다. 예를 들어, CD3+ T 세포 (예컨대, PBMC)를 포함하는 대상체로부터 수득된 세포 샘플은 CD3+ T 세포가 농축될 수 있으며, 상기 CD3+ T 세포는 항원-제시 자극자 세포와 접촉하게 된다. 바람직하게, CD3+ T 세포는 항원-제시 자극자 세포와 접촉하기 전에 샘플로부터 단리된다. 보다 바람직하게, T 세포 및 항원-제시 자극자 세포 (예컨대, BLCL)는 동일한 샘플로부터 유래되어, HLA-매칭된다. 이러한 세포 선택 방법 및 기술은 일반적으로 샘플로부터 CD3+ 및/또는 CD19+ 세포의 양성 선택 및/또는 샘플로부터 원하지 않은 세포 또는 구성요소의 고갈에 의한 음성 선택을 포함한다. 예를 들어, 제한없이, 이러한 방법은 생세포 분류 기술 (예컨대, 형광 활성화 세포 분류), 항-CD3 및/또는 항-CD19 비드 (예컨대, 자성 비드), 플라스틱 부착, NK 세포의 고갈, 용출 및/또는 이들의 조합을 이용한 선택을 포함한다. 생성된 CD3+ T 세포는 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 전 및/또는 후에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다.
본원에 개시된 연구는 또한 CD3/CD28 또는 BLCL 공동-배양을 이용한 CTL의 자극으로부터 유래된 항-CD19 CAR-T 세포의 중앙 및 이펙터(effector) 기억 T 세포 서브세트의 비교를 제공한다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어는 여기에 수집된다.
관사 "단수형"은 하나 또는 하나 초과(즉, 하나 이상)의 관사의 문법적 대상을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "요소 (단수형)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는"은 대상체에 약학 약제 또는 조성물을 제공하는 것을 의미하며, 비제한적으로, 전문 의료진이 투여하는 것 및 자가-투여하는 것을 포함한다. 이러한 약제는 예를 들어, 본원에 기재된 펩티드, 본원에 제공된 항원 제시 세포 및/또는 본원에 제공된 CTL을 함유할 수 있다.
용어 "결합하는" 또는 "상호작용하는"은 생리학적 조건 하에서 예를 들어, 정전기, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 2 개의 분자 사이의, 예컨대, TCR 및 펩티드/MHC 사이의 안정된 회합(association)일 수 있는 회합을 지칭한다.
용어 "생물학적 샘플", "조직 샘플", 또는 간단하게는 "샘플" 각각은 대상체의 조직으로부터 수득된 세포의 집합체를 지칭한다. 조직 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기, 조직 샘플, 생검, 또는 흡입물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 혈청, 혈액; 체액, 예컨대, 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액; 또는 대상체의 임신 또는 발달 중 임의의 시점의 세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 세포의 기능에 영향을 미치고 면역, 염증 또는 조혈 반응에서 세포 사이의 상호작용을 조정하는 분자인 임의의 분비된 폴리펩티드를 지칭한다. 사이토카인은 이들을 생산하는 세포에 관계없이 모노카인 및 림포카인을 포함하나, 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노카인은 일반적으로 단핵 세포, 예컨대, 대식세포 및/또는 단핵구에 의해 생산되고 분비되는 것으로서 지칭된다. 그러나, 많은 다른 세포는 또한 모노카인, 예컨대, 자연 살해 세포, 섬유아세포, 호염구, 호중구, 내피 세포, 뇌 성상세포, 골수 기질 세포, 표피 케라티노사이트 및 B-림프구를 생산한다. 림포카인은 일반적으로 림프구 세포에 의해 생산되는 것으로서 지칭된다. 사이토카인의 예는 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-8 (IL-8), 인터류킨-15 (IL-15), 종양 괴사 인자-알파 (TNFα) 및 종양 괴사 인자 베타 (TNFβ)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체 단편"은 전장 미만인 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 예시적인 실시양태에 있어서, 항체 단편은 전장 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 유의한 부분을 보유한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디, Fc 및 Fd 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있거나, 부분적 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있거나, 전체 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 임의로 단일 쇄 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 단편은 예를 들어, 이황화 연결에 의해 함께 연결된 다중 쇄를 포함할 수 있다. 단편은 또한 임의로 다중분자 복합체일 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 약 50 개 이상의 아미노산을 포함할 것이고, 보다 전형적으로 약 200 개 이상의 아미노산을 포함할 것이다.
용어 "항원 결합 부위"는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 영역을 지칭한다.
용어 "단일 쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 중쇄 도메인 및 경쇄 도메인이 연결된 Fv 단편을 지칭한다. 하나 이상의 scFv 단편은 다른 항체 단편 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 불변 도메인)에 연결되어 하나 이상의 항원 인식 부위를 갖는 항체 작제물을 형성할 수 있다.
용어 "Fab 단편"은 효소 파파인을 이용한 항체의 절단에 의해 생성된 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 단편을 지칭하며, 이는 힌지 영역에서 N-말단에서 H-쇄-간 이황화 결합을 자르고, 하나의 항체 분자로부터 2 개의 Fab 단편을 생성한다.
용어 "F(ab')2 단편"은 힌지 영역에서 C-말단에서 H-쇄-간 이황화 결합을 자르는 효소 펩신을 이용한 항체 분자의 절단에 의해 생성된 2 개의 항원-결합 부위를 함유하는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "Fc 단편"은 중쇄의 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "Fv 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "조작된 항체"는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 항체 단편을 포함하는 재조합 분자를 지칭하며, Ig 클래스 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY) 중 임의의 것으로부터의 항체의 가변 및/또는 불변 도메인의 전체 또는 일부를 임의로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적 결합" 또는 "표적화"는 폴리펩티드 (항체 포함) 또는 수용체를 언급할 때 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 단백질 및 기타 생물의약품의 이종 집단에서 수용체의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예컨대, 항체의 경우 면역검정 조건) 하에서, 명시된 리간드 또는 항체는 샘플에 존재하는 다른 단백질, 또는 리간드 또는 항체가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 단백질에 유의한 양으로 결합하지 않는 경우 특정 "표적"에 "특이적으로 결합한다" (예컨대, 항체는 내피 항원에 특이적으로 결합함). 일반적으로, 제2 분자와 "특이적으로 결합"하는 제1 분자는 해당 제2 분자와 약 105 M-1보다 큰 (예컨대, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 및 1012 M-1 이상) 친화도 상수 (Ka)를 갖는다. 예를 들어, MHC (예컨대, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC) 상에 제시된 펩티드에 결합하는 TCR의 능력의 경우에서; 전형적으로, TCR은 적어도 약 10-4 M 이하의 KD의 친화도로 이의 펩티드/MHC에 특이적으로 결합하며, 비-특이적이고 관련되지 않은 펩티드/MHC 복합체 (예컨대, BSA 펩티드 또는 카제인 펩티드를 포함하는 것)에 대한 결합에 대한 이의 친화도보다 적어도 10 배 적은, 적어도 100 배 적은 또는 적어도 1000 배 적은 친화도 (KD에 의해 표현됨)로 소정의 항원/결합 파트너에 결합한다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 보통 분자, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 군체(grouping)로 이루어진다. 특정 에피토프는 항체가 결합할 수 있는 아미노산의 특정 서열에 의해 정의될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "약학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 그의 약제, 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여량 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "약학적으로-허용가능한 담체"는 신체의 하나의 장기 또는 부위로부터 신체의 다른 장기 또는 부위로 약제를 운반 또는 수송하는데 관련된 약학적으로-허용가능한 재료, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고형 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 재료를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 약학적으로-허용가능한 담체로서 제공할 수 있는 재료의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트(tragacanth); (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액(Ringer's solution); (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 약학 제형에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질.
용어 "폴리뉴클레오티드", 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태인, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들 (유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 전달될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 표지 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본원에 제공된 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오티드는 T 뉴클레오티드와 상호교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 병태를 "예방하는" 치료제는 장애 또는 병태의 발병 전에 통계적 샘플에 투여되었을 때, 처리되지 않은 대조군 샘플에 비해 처리된 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 감소시키거나, 처리되지 않은 대조군 샘플에 비해 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 MHC (예컨대, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC) 상에 제시된 펩티드에 결합하는 TCR의 능력을 지칭한다. 전형적으로, TCR은 적어도 약 10-4 M 이하의 KD의 친화도로 이의 펩티드/MHC에 특이적으로 결합하며, 비-특이적이고 관련되지 않은 펩티드/MHC 복합체 (예컨대, BSA 펩티드 또는 카제인 펩티드를 포함하는 것)에 대한 결합에 대한 이의 친화도에 비해 적어도 10 배 적은, 적어도 100 배 적은 또는 적어도 1000 배 적은 친화도 (KD에 의해 표현됨)로 소정의 항원/결합 파트너에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
특정 실시양태에 있어서, 본 발명의 약제는 단독으로 사용되거나 다른 유형의 치료제와 공동으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "공동 투여" 또는 "공동으로 투여된"은 제2 약제가 이전에 투여된 치료제가 신체에서 여전히 효과적인 동안 투여되도록 (예컨대, 2 개의 약제가 대상체에서 동시에 효과적이며, 이는 2 개의 약제의 상승작용 효과를 포함할 수 있도록) 2 개 이상의 상이한 치료제 (예컨대, 본원에 개시된 CAR T 및 면역 체크포인트의 억제제를 포함하는 조성물)의 임의의 형태의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 상이한 치료제는 동일한 제형으로 또는 별도의 제형으로 병용하여 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 추가 치료제를 발현 (예컨대, 세포 표면 상에 제시하거나 분비)한다. 특정 실시양태에 있어서, 상이한 치료제 (예컨대, CAR T 세포 및 면역 체크포인트-차단 분자)는 서로 약 1 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 72 시간, 또는 약 일주일 내에 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받은 대상체는 상이한 치료제의 조합된 효과로부터 이익을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리 과정 동안 치료되는 개인의 자연적인 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 진행 속도 감소, 병리학적 상태의 개량 또는 완화, 특정 질환, 장애 또는 병태의 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 특정 질환, 장애 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상이 경감되거나 제거되는 경우 개인은 성공적으로 "치료된다".
용어 "벡터"는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 구성요소 사이에서 전파되고/되거나 전달될 수 있는 수단을 지칭한다. 벡터는 자체적으로 복제 또는 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있거나 없는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존 및 인공 염색체 등을 포함한다.
T 세포 농축
지금까지, 당업계에 알려진 CAR-T 세포의 제조 방법은 미가공의 이질적인 출발 물질, 예컨대, PBMC (Sun et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3:5 참고) 또는 특이적 T 세포 유형, 즉, CD4+, CD8+ T 세포 또는 이들의 특이적 비로 고도로 정제된 단리물 (Terakura et al. Blood (2011) 119:1 and Turtle et al. Sci Transl Med. (2016) Sep 7;8 참고)에 의존해 왔다. 그러나, 본원에 개시된 본 발명은 CAR-T 세포의 제조에 사용되는 항원-특이적 T 세포를 농축시키기 위한 엑스 비보 방법을 제공한다. 특히, 일부 바람직한 실시양태에 있어서, 이러한 방법은 CD3+ 세포를 포함하는 대상체로부터 세포 샘플 (예컨대, PBMC)을 수득하고 상기 CD3+ 세포를 항원-제시 자극자 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게, CD3+ T 세포는 당업계에 알려진 방법 (예컨대, 샘플로부터 CD3+ 세포의 양성 선택 및/또는 샘플로부터 원하지 않은 세포 또는 구성요소의 고갈에 의한 음성 선택)에 의해 항원-제시 자극자 세포와 접촉시키기 전에 샘플로부터 단리된다. 예를 들어, 제한없이, 이러한 방법은 항-CD3 비드 (예컨대, 자성 비드), 플라스틱 부착, 항-CD56을 사용한 NK 세포의 고갈, 용출 및/또는 이들의 조합을 이용하는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용한 선택을 포함한다. 선택된 CD3+ 세포를 소정의 항원, 예컨대, 바이러스 항원에 민감화시키는 것은 생성된 항원-특이적 T 세포 집단에서 중앙 기억 표현형을 촉진할 수 있다. 이러한 T 세포는 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 전 및/또는 후에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CAR-발현, CD3+, 항원-특이적 T 세포는 항원-제시 자극자 세포와 함께 배양된다.
본원에 개시된 초기 CD3+ 농축 단계는 PBMC 샘플보다 유의하게 덜 비균질이나 고도로 정제된 T 세포 분획에 비해 일정 수준의 비균질성을 보유하는 출발 재료를 제공한다. 이론에 얽매이지 않고, 초기 CD3+ 농축 단계를 사용함으로써 출발 재료가 상승작용적으로 작용하거나 APC와의 접촉 후 항원-특이적 T 세포의 증가된 생존력 및 증식, 이러한 항원-특이적 T 세포에서 CAR-발현 벡터의 개선된 형질도입 효율 및 최종 치료적 조성물에서 더 높은 백분율의 TCM 세포를 촉진하는 유리한 환경을 제공할 수 있는 세포의 혼합물 (적어도 복수의 이펙터 T 세포 유형인, T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포/TH 세포), 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포/CTL), 기억 T 세포 유형 (즉, 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포), 조직 상주 기억 T 세포 (TRM) 및 가상 기억 T 세포 (TVM 세포)), 조절 T 세포 (Treg 세포), 자연 살해 T 세포 (NKT 세포), 점막 연관된 불변 세포 (MAIT 세포), 감마 델타 T 세포 (γδ T 세포), 이중-음성 T 세포 (DNT), CD3+ B 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함함)을 포함하는 것으로 가정된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원을 이용한 T 세포 자극 후에 추가 농축이 수행된다. 예를 들어, NK 고갈 (예컨대, CD56 고갈)은 후속 항원 자극 단계 이전에 (즉, 항원을 이용한 농축된, 항원-특이적 T 세포의 재-자극 이전에) 사용될 수 있다.
자극 및 형질도입
클래스 I MHC 상에 제시된 펩티드에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 제조는 정의된 항원에 대한 T 세포 확장이 필요하다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 또한 질환-연관된 펩티드 (예컨대, 종양-연관된 펩티드, 항원 또는 리간드 등)에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
항원 전달은 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 이로부터의 단리된 B 세포 림프모구 세포 (예컨대, CD19+ BLCL)의 샘플의, 천연 바이러스에 의한 바이러스 감염 또는 재조합 바이러스를 사용한 형질도입을 통해 이루어질 수 있다. 따라서 감염된 또는 형질도입된 세포는 항원-제시 세포로서 역할을 하며 "자극자"로서 지칭된다. 특정 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 또한 세포 표면 상에 CAR에 의해 인식되는 펩티드 (즉, 항원)를 발현한다. 자극자 세포는 이러한 CAR-표적화된 펩티드를 내인성으로 발현하거나 이러한 펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 자극자를 형질도입하는 데 사용되는 바이러스 벡터는 재조합, 복제 무능한 바이러스 (예컨대, AdE1-LMPpoly와 같은 아데노바이러스)일 수 있다. 대안적으로, 상기 자극자 세포는 야생형/천연 바이러스로 감염된다. 별도의 샘플 또는 배양물 (예컨대, 형질도입에 사용되지 않은 동일한 공여자로부터의 PBMC, 상이한 건강한 공여자로부터의 PBMC 샘플, 또는 이로부터 단리된 CD3+ 세포)은 "반응자"를 포함하고 클래스 I MHC 상에 제시된 펩티드 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현하는 요법의 활성 구성요소가 되는 T 세포를 함유한다. 반응자 T 세포는 임의의 적합한 방법에 의해 PBMC로부터 단리될 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, "반응자" T 세포는 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 항-CD3 비드 (예컨대, 자성 비드), 플라스틱 부착, 용출 및/또는 이들의 조합에 의해 자극자 분획에 제시되기 전에 샘플로부터 단리될 수 있다. 바람직하게, "자극자" 세포 (예컨대, PBMC 또는 BLCL)는 "반응자" 세포와 동일한 세포 집단 (예컨대, PBMC 샘플)으로부터 수득되어 이들은 동일하게 HLA-매칭된다. 예를 들어, 공여자로부터의 PBMC 샘플은 "자극자" 세포 분획 및 "반응자" 세포 분획으로 분할되며, 여기서 자극자 세포는 CD3+ 세포가 농축될 수 있고; 반응자 세포는 형질도입되거나 감염되어 세포 표면 상에 특정 항원을 제시한다. 임의로, 자극자 세포 분획은 형질도입/감염 이전에 당업계에 알려진 방법, 예컨대, CD19+ 세포에 대한 선택에 의해 농축될 수 있다. 따라서, 항원-제시 세포는 항원을 T 세포 (예컨대, CD3+-농축된 세포)에 제시하여, 항원-특이적 T 세포의 증식을 활성화 및 유도할 것이다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 반응자 T 세포 (예컨대, 단리된 T 세포)는 자극자 분획에 의한 항원의 제시 전에 CAR-코딩 벡터로 형질도입된다. 특정 실시양태에 있어서, 반응자 T 세포 (예컨대, 단리된 T 세포)는 자극자 분획에 의한 항원의 제시 후 CAR-코딩 벡터로 형질도입된다.
따라서, 본원은 예를 들어, 클래스 I MHC 상에 제시된 EBV 펩티드에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체를 발현하고 선택된 표적 (예컨대, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 추가로 발현하는 동종이계 또는 자가유래 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, APC는 예컨대, 야생형/천연 EBV 또는 아데노바이러스 벡터, 예컨대, AdE1-LMPpoly에 의한 자극자 세포의 바이러스 감염을 통해 생성된다. AdE1-LMPpoly 벡터는 Gly-Ala 반복-고갈된 EBNA1 서열에 융합된 LMP1 및 LMP2로부터 규정된 CTL 에피토프의 폴리에피토프를 코딩한다. AdE1-LMPpoly 벡터는 예를 들어, Smith et al., Cancer Research 72:1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research 64:1483-9 (2004); 및 Smith et al., J. Immunol 117:4897-4906 (2006)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 원용된다. 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 EBV 폴리에피토프를 상기 T 세포에 제시하기 위해 비-감염된, 단리된 T 세포 (반응자)와 혼합된다. 일부 실시양태에 있어서, EBV 폴리에피토프와 함께 제시된 단리된 바이러스-특이적 T 세포는 증식을 위해 활성화 및 유도된다.
T 세포는 나이브 또는 다음의 항원-경험이 있는 3 가지 주요 아형 중 하나로 구분될 수 있다: 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 및 말기 분화 이펙터 T 세포. 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포)는 보통 림프절 및 말초 순환에서 발견된다. 이 아형은 CD45RO, C-C 케모카인 수용체 유형 7 (CCR7) 및 L-셀렉틴 (CD62L)을 발현한다. 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포)는 림프절-귀소(homing) 수용체가 결여되었기 때문에 주로 말초 순환 및 조직에서 발견된다. TEM 세포는 CD45RO를 발현하나 CCR7 및 L-셀렉틴의 발현은 결여되었다. 특정 양태에 있어서, 본원은 수용자에 투여하기에 적합한 CAR-T 세포의 치료적 제제를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR-T 세포의 치료적 제제 샘플을 수득하고 상이한 T 세포 아형에 대해 평가하였다. 바람직하게, 제제는 주로 CAR-발현 Tcm 세포 및/또는 CD4+ T 세포로 이루어진다.
일부 실시양태에 있어서, 반응자 세포 및 자극자 세포는 각각 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 유래된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 반응자 세포 및 자극자 세포는 각각 동일한 공여자로부터의 PBMC로부터 유래된다. 다른 실시양태에 있어서, 반응자 세포 및 자극자 세포는 각각 상이한 공여자로부터의 PBMC로부터 유래된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포와 접촉하기 전에, 반응자 세포는 본질적으로 T 세포로 이루어지도록 단리 및/또는 정제된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 반응자 세포는 본질적으로 CD3+ 세포로 이루어지도록 단리 및/또는 정제된다. 보다 바람직하게, 반응자 세포는 본질적으로 CD3+ T 세포로 이루어진다.
반응자 세포 (예컨대, T 세포)에 제시하기 전에, 자극자 세포는 천연 바이러스, 예컨대, EBV에 감염되어, 표면 상에 바이러스 항원을 제시할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 바이러스 벡터, 바람직하게 헤르페스바이러스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 복제 무능하다. 보다 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 EBV 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 하나 이상의 EBV 항원은 LMP1 펩티드 또는 이의 단편, LMP2A 펩티드 또는 이의 단편, 및/또는 EBNA1 펩티드 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 AdE1-LMPpoly이고 Gly-Ala 반복-고갈된 EBNA1 서열에 융합된 LMP1 및 LMP2로부터 규정된 CTL 에피토프의 폴리에피토프를 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 반응자 세포 (예컨대, 비-감염된 PBMC 또는 CD3+ 농축된 세포)와 함께 배양 (즉, 이에 제시)하기 전에 하나 이상의 사이토카인과 함께 항온처리된다. 이러한 자극자 세포는 B 세포 (예컨대, BLCL), 항원-제시 T-세포, 수지상 세포, 인공 항원-제시 세포 및/또는 aK562 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 자극자 세포는 항원-제시 BLCL이다.
항원-특이적 T 세포는 자극자 분획에 의해 항원이 제시될 때 활성화 및 증식을 달성하지만, 이러한 자극자 세포는 최종 수확된 CAR-T 세포 생산물에서 바람직하지 않다. 더욱이, 컴피턴트 바이러스의 형성을 야기하는 증식 세포에서의 임의의 바이러스 재조합 사건의 위험을 최소화하기 위해, 자극자 세포는 반응자 T 세포와 함께 배양하기 전에 처리 및/또는 변형되어, 예컨대, 감마선을 이용한 조사 또는 약제, 예컨대, 미토마이신 C에 대한 노출에 의해 증식을 억제한다. 예를 들어, 이러한 배양 조건에서 반응자 세포 (예컨대, T-세포)는 비-증식 자극자 세포에 의한 펩티드 항원과 함께 제시된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전 적어도 24 시간 내지 적어도 28 일 유지된다. 일부 실시양태에 있어서, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전 24 시간 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 11 일 이상, 12 일 이상, 13 일 이상, 14 일 이상, 17 일 이상 또는 28 일 이상 동안 유지된다. 바람직하게, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전에 자극자 세포에 의한 항원 제시 후 2 일 이상 동안 유지된다. 가장 바람직하게, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전에 자극자 세포에 의한 항원 제시 후 6 일 이상 동안 유지된다. 추가 실시양태에 있어서, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 후 적어도 24 시간 내지 적어도 28 일 유지된다. 특정 실시양태에 있어서, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 후 24 시간 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 11 일 이상, 12 일 이상, 13 일 이상, 14 일 이상, 17 일 이상 또는 28 일 이상 동안 유지된다. 일부 실시양태에 있어서, 배양물은 필요에 따라 재-씨딩 및/또는 재-자극된다. 예를 들어, 반응자 T 세포는 적어도 제1 자극 단계 (즉, APC 상에 항원과 함께 제시됨)를 겪고 필요에 따라 재-씨딩 및/또는 재-자극될 수 있다 (즉, 제2 시점 이상). 상기 재-씨딩 및/또는 재-자극된 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전에/ 또는 후에 24 시간 이상, 3 일 이상, 9 일 이상, 11 일 이상, 14 일 이상, 17 일 이상 또는 28 일 이상 동안 유지된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 반응자 세포 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전에 1 회 이상 자극된다. 보다 바람직하게, 반응자 배양물은 다중 회 자극되며, 후속 자극 단계는 2 내지 14 일 어디에서든 분리된다. 예를 들어, 제1 자극을 겪은 배양물은 제1 자극 11 일 후에 제2 자극 (예컨대, 재-자극)을 겪을 수 있으며; 임의로, 제3 자극 (예컨대, 재-자극)은 제2 자극 단계 7 일 후에 개시된다. 자극 단계 (예컨대, 재-자극)를 겪은 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전 1 내지 10 일 이상 동안 유지된다. 바람직하게, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전 2 일 이상 동안 유지된다. 가장 바람직하게, 배양물은 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전에 자극자 세포에 의한 항원 제시 후 6 일 이상 동안 유지된다. 임의로, NK 고갈 단계는 자극 전에 사용된다. 예를 들어, CD56+ 세포는 APC에 의한 자극 직전에 (예컨대, 항-CD56 비드를 이용하여) 배양물로부터 고갈될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 활성화 및 증식을 달성하기 위한 항원의 적어도 제1 제시 후, 항원-특이적 T-세포는 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전 및/또는 후에 냉동 및 저장되어, 후일에 해동될 수 있다. 예를 들어, 본원에 고려되는 항원-특이적, CAR-발현 T 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있거나, 세포 은행 또는 저장소에 저장하기 위해 냉동되어, 추후에 해동될 수 있다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 해동된 배양물은 본원에 기재된 바와 같이 형질도입 전 및/또는 후에 항원으로 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 항원-제시 자극자 세포, 예컨대, BLCL 등으로) 1 회 이상 재-자극된다. 일부 실시양태에 있어서, 상기 해동된 배양물은 필요에 따라 재-자극 및/또는 재-씨딩되고, 상기 재-자극 및/또는 재-씨딩된 배양물은 본원에 기재된 CAR-코딩 벡터를 이용한 형질도입 전/또는 후에 24 시간 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 9 일 이상, 11 일 이상, 14 일 이상, 17 일 이상 또는 28 일 이상 동안 유지된다. 마찬가지로, 배양물이 다중 회 재-자극되는 이러한 경우에, 후속 자극 단계는 본원에 기재된 바와 같이 2 내지 14 일 어디에서든 분리된다.
항원-특이적 T 세포의 활성화 및 증식은 또한 자극자 세포에 의한 충분한 양의 항원-제시를 필요로 한다. 따라서, 본원에 고려되는 자극자 배양물 (예컨대, 재-자극 배양물 포함)은 반응자 세포 대 자극자 세포의 알려진 비를 포함한다. 예를 들어, 반응자 세포 대 자극자 세포의 비는 약 0.1:1 내지 약 20:1이다. 바람직하게, 반응자 세포 대 자극자 세포의 비는 약 0.2:1 내지 약 5:1이다. 일부 실시양태에 있어서, 반응자 세포 대 자극자 세포의 비는 약 20:1, 약 19:1, 약 18:1, 약 17:1, 약 16:1, 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 0.9:1, 약 0.8:1, 약 0.7:1, 약 0.6:1, 약 0.5:1, 약 0.4:1, 약 0.3:1, 약 0.2:1, 또는 약 0.1:1이다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 반응자 세포 대 자극자 세포의 비는 약 0.25:1, 0.43:1 또는 4:1이다. 더욱이, 배양물이 다중 회 재-자극되는 경우, 각각의 자극은 반응자 세포 대 자극자 세포의 동일한 비 또는 상이한 비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한없이, 바람직한 실시양태에 있어서, 초기 자극은 약 0.43:1의 반응자:자극자 비를 포함한다. 후속 자극 (예컨대, 재-자극)은 0.25:1의 반응자:자극자 비를 포함할 수 있고, 또 다른 자극 (예컨대, 재-자극)은 4:1의 반응자:자극자 비를 포함한다.
당업자는 배양물에서 세포 증식이 다양할 수 있고 영양분 및 산소에 대한 요구사항 및 노폐물, 예컨대, 이산화탄소 및 젖산의 축적에 의해 제한될 수 있음을 인식할 것이다. 이와 같이, 당업자는 본 발명의 T 세포를 달성하기 위해 적절한 배양 및 (필요하다면) 재-씨딩 일정을 경험적으로 결정할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 배양물은 소정의 수확 일까지 유지된다. 배양물의 평가 및 활성 바이러스의 존재 또는 부재의 결정은 수확 전 및/또는 수확 일에 발생한다. 가장 바람직하게, 본원에 개시된 배양물 및/또는 제제는 CTL 수확 시점에 활성 바이러스가 본질적으로 없다.
항원 펩티드
특정 양태에 있어서, 본원은 자가면역 장애 및 암 (예컨대, MS, SAD, IBD 및/또는 CD19+ B-세포 악성종양, 림프종 및 백혈병)을 치료하기 위해, 클래스 I MHC 상에 제시된 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 (예컨대, 항원)에 특이적으로 결합하는 TCR, 및 선택된 표적, 예컨대, 질환-연관된 펩티드 표적에 결합하는 CAR을 발현하는 동종이계 또는 자가유래 CAR-T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본원에서 T 세포를 포함하는 샘플 (예컨대, PBMC 샘플 또는 이로부터 단리된 CD3+ 세포)을 본원에 기재된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제시하는 항원-제시 세포 (APC) (예컨대, 클래스 I MHC 복합체 상에 EBV 에피토프를 포함하는 본원에 기재된 펩티드를 제시하는 APC, 예컨대, EBV-감염된 또는 재조합적으로 형질도입된 BLCL)와 항온처리함으로써 생성된 CAR-T 세포의 생산에 적합한 T 세포가 고려된다.
이러한 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드는 바이러스, 예컨대, 제한없이, 헤르페스바이러스 (예컨대, EBV 및 CMV), 파필로마바이러스 (예컨대, HPV), 아데노바이러스, 폴리오마바이러스 (예컨대, BKV, JCV 및 메르켈 세포 바이러스), 레트로바이러스 (예컨대, HTLV-I, 또한 HIV와 같은 렌티바이러스를 포함함), 피코나바이러스 (예컨대, A 형 간염 바이러스), 헤파드나바이러스 (예컨대, B 형 간염 바이러스), 헤파시바이러스 (예컨대, C 형 간염 바이러스), 델타바이러스 (예컨대, D 형 간염 바이러스) 및 헤페바이러스 (예컨대, E 형 간염 바이러스) 등으로부터의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 에피토프는 HLA 클래스 I-제한된 T 세포 에피토프이다. 다른 실시양태에 있어서, 에피토프는 HLA 클래스 II-제한된 T 세포 에피토프이다.
본원에 제공된 펩티드는 임의의 EBV 바이러스 단백질의 서열 (예컨대, 임의의 EBV 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 인접 아미노산의 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 EBV 바이러스 단백질의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 개 이하의 인접 아미노산을 포함한다.
본원에 제공된 펩티드는 LMP1의 서열 (예컨대, LMP1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 인접 아미노산의 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 LMP1의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 개 이하의 인접 아미노산을 포함한다. 예시적인 LMP1 아미노산 서열이 아래에 제공된다 (서열번호 1):
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 LMP2A의 서열 (예컨대, LMP2A의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 인접 아미노산의 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 LMP2A의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 개 이하의 인접 아미노산을 포함한다. 예시적인 LMP2A 아미노산 서열이 아래에 제공된다 (서열번호 2):
Figure pct00003
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 EBNA1의 서열 (예컨대, EBNA1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 인접 아미노산의 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 EBNA1의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 개 이하의 인접 아미노산을 포함한다. 예시적인 EBNA1 아미노산 서열이 아래에 제공된다 (서열번호 3):
Figure pct00004
Figure pct00005
바람직하게는, 펩티드는 표 1에 열거된 에피토프의 서열을 포함한다.
표 1: 예시적인 EBV 바이러스 단백질 에피토프
Figure pct00006
특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 임의의 폴리오마바이러스 단백질, 예컨대, BKV 에피토프, JCV 에피토프, MCV 에피토프 및/또는 HLA 상에 제시되는 경우 CTL로 인식되는 BKV, JCV 및/또는 MCV 에피토프 사이에 상동성인 서열을 포함하는 에피토프를 포함하는 펩티드의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 에피토프는 폴리오마바이러스 감염 (예컨대, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암 (예컨대, 본원에 제공된 에피토프를 발현하는 폴리오마바이러스 연관된 암)의 예방 및/또는 치료, 및/또는 폴리오마바이러스 감염 (예컨대, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암 (예컨대, 본원에 제공된 에피토프를 발현하는 폴리오마바이러스 연관된 암)의 예방 및/또는 치료에 유용한 약학 약제 (예컨대, CTL 및/또는 APC)의 생성에 유용하다. 일부 실시양태에 있어서, 에피토프는 BKV 에피토프 및 상동성 JCV 에피토프 둘 모두로부터의 아미노산 및/또는 상이한 BKV 또는 JCV 에피토프 내에서 발견되는 아미노산 변이체를 포함하는 하이브리드 에피토프이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 MCV 에피토프를 추가로 포함한다. BKV 에피토프, JCV 에피토프, MCV 에피토프 및/또는 BKV, JCV 및/또는 MCV 에피토프 사이에 상동인 서열을 포함하는 에피토프 (예컨대, 하이브리드 에피토프)를 포함하는 예시적인 펩티드는 그 전체가 본원에 원용되는 WO2018049165호에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 임의의 사이토메갈로바이러스 단백질, 예컨대, 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인식되고 CMV 감염 및/또는 암 (예컨대, CMV 에피토프를 발현하는 암)의 예방 및/또는 치료에 유용한 에피토프를 포함하는 펩티드의 서열을 포함한다. CMV 에피토프를 포함하는 예시적인 펩티드는 그 전체가 본원에 원용되는 각각의 WO2017203370호, WO2014059489호 및 WO2006056027호에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 임의의 인간 파필로마 바이러스 단백질, 예컨대, 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인식되고 HPV 감염 및/또는 암 (예컨대, HPV 에피토프를 발현하는 암) 및/또는 전암성 병변의 예방 및/또는 치료에 유용한 HPV 에피토프를 포함하는 펩티드의 서열을 포함한다. HPV 에피토프를 포함하는 예시적인 펩티드는 그 전체가 본원에 원용되는 PCT/US2019/014727호에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서 펩티드는 2 개 이상의 바이러스로부터의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서 펩티드는 3 개 이상의 바이러스로부터의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서 펩티드는 4 개 이상의 바이러스로부터의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서 펩티드는 5 개 이상의 바이러스로부터의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서 펩티드는 JCV, BKV, MCV, EBV, CMV 및/또는 HPV 중 2, 3, 4 또는 5 개 이상으로부터의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 2 개 이상의 T 세포 에피토프 (예컨대, 바이러스 에피토프)를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 링커 (예컨대, 폴리펩티드 링커)에 의해 연계된 2 개 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 폴리펩티드 또는 단백질은 복수의 에피토프 중 2 개 이상 사이에 개재 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 개재 아미노산 또는 아미노산 서열은 프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열이다. 프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 AD, K 또는 R이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 개재 아미노산 또는 아미노산 서열은 TAP 인식 모티프이다. 전형적으로, TAP 인식 모티프는 다음 식을 따를 수 있다: (R/N:I/Q:W/Y)n 여기서 n은 ≥ 1의 임의의 정수이다. TAP 인식 모티프의 비-제한적인 예는 RIW, RQW, NIW 및 NQY를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 에피토프는 프로테아좀 유리 아미노산 서열 및 임의로, 각각의 에피토프의 카복실 말단에서 TAP 인식 모티프에 의해 연결(link)되거나 접합(join)된다.
일부 실시양태에 있어서, 펩티드의 서열은 1 종 이상 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 종 이상)의 보존적 서열 변형을 제외한 바이러스 단백질 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 T 세포 수용체 (TCR) 및 MHC 상에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 사이의 상호작용에 유의한 영향을 미치지 않거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 (예컨대, 펩티드의 N 또는 C 말단에 대한 아미노산의 첨가) 및 결실 (예컨대, 펩티드의 N 또는 C 말단으로부터의 아미노산의 결실)을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있으며, 변경된 펩티드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 TCR 결합의 보유에 대해 테스트될 수 있다. 변형은 당업계에 알려진 표준 기술, 예컨대, 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 항체 내로 도입될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 단백질 서열 (예컨대, 바이러스 단백질의 단편의 서열)과 80%, 85%, 90%, 95% 이상 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 2 개의 아미노산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예컨대, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있으며, 비-동일 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 그 다음에, 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 채워질 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 2 개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
펩티드는 키메라 또는 융합 펩티드일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "키메라 펩티드" 또는 "융합 펩티드"는 자연에서는 연결되지 않는 서열을 갖는 별개의 펩티드에 연결된 본원에 제공된 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 별개의 펩티드는 펩티드 결합을 통해 직접적으로, 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 본원에 제공된 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 별개의 에피토프를 포함하는 다른 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 펩티드는 다른 바이러스 및/또는 감염 질환과 연관된 에피토프를 포함하는 펩티드에 연결된다. 본원에 제공된 키메라 또는 융합 펩티드는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 상이한 펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 종래의 기술에 따라, 예를 들어, 결찰(ligation)을 위한 블런트(blunt)-단부 또는 스태거(stagger)-단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화(digestion), 응집성 단부를 적절하게 채우기, 원하지 않은 접합을 회피하기 위한 적절한 알카라인 포스파타제 처리, 및 효소 결찰을 사용하는 것에 의해 인-프레임(in-frame)으로 함께 결찰된다. 다른 실시양태에 있어서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함한 종래의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재-증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2 개의 연속 유전자 단편 사이의 상보적 오버행(overhang)을 발생시키는 앵커(anchor) 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992 참고). 게다가, 융합 모이어티를 이미 코딩하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다.
본원에 제공된 펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있고/있거나 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드는 본 발명의 펩티드(들)를 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 이러한 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주에서 이종 펩티드의 발현, 펩티드의 화학적 합성 및 인 비트로 번역을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; 및 Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing에 추가로 기재되어 있고, 이들은 본원에 참고로 원용된다.
특정 양태에 있어서, 본원은 본원에 기재된 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산 분자는 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산 분자는 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 기반 발현 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 벡터는 본원에 제공된 복수의 에피토프 (예컨대, 폴리에피토프)를 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 벡터는 본원에 제공된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 이상의 에피토프 (예컨대, 표 1에 제공된 에피토프)를 코딩한다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터 (예컨대, AdE1-LMPpoly와 같은 아데노바이러스)이다. AdE1-LMPpoly 벡터는 Gly-Ala 반복-고갈된 EBNA1 서열에 융합된 LMP1 및 LMP2로부터의 정의된 CTL 에피토프의 폴리에피토프를 코딩한다. AdE1-LMPpoly 벡터는 예를 들어, Smith et al., Cancer Research 72:1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research 64:1483-9 (2004); 및 Smith et al., J. Immunol 117:4897-4906 (2006)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 원용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터 (예컨대, 박테리아 기원의 복제를 갖는 박테리아 벡터, 에피솜 포유동물 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 게다가, 특정 벡터는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "발현 벡터")로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원은 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열 (예컨대, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 본원에 제공된 핵산을 번역하여, 본원에 기재된 펩티드를 발현한다. 핵산 분자는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나 이는 염색체외일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원은 본원에 기재된 핵산 (예컨대, 본원에 기재된 펩티드를 코딩하는 핵산)을 함유하는 세포를 제공한다. 세포는 예를 들어, 원핵, 진핵, 포유동물, 새, 뮤린 및/또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 APC (예컨대, 항원-제시 T 세포, 수지상 세포, B 세포, 또는 aK562 세포)이다. 본 방법에서, 본원에 기재된 핵산은 예를 들어, 전달 비히클 없이, 전달 시약과 조합된 핵산으로서 세포에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 당업계에 알려진 임의의 핵산 전달 방법이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 적합한 전달 시약은 예컨대, Mirus Transit TKO 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 다양이온(polycation) (예컨대, 폴리리신), 아텔로콜라겐, 나노플렉스 및 리포좀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에 있어서, 리포좀은 세포 또는 대상체에 핵산을 전달하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 리포좀은 일반적으로 중성 또는 음성적으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포-형성 지질로부터 형성될 수 있다. 지질의 선택은 일반적으로 인자, 예컨대, 원하는 리포좀 크기 및 혈류에서 리포좀의 반감기의 고려에 의해 가이드된다. 리포좀을 제조하기 위한 다양한 방법이 예를 들어, Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호에 기재된 바와 같이 알려져 있으며, 이들의 전체 개시내용은 본원에 참고로 원용된다.
CAR-T 세포
본원은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자 상에 제시된 항원 (예컨대, 바이러스 펩티드 항원)에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체 및 선택된 표적 펩티드에 특이적으로 결합하고 세포질 꼬리에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프 (ITAM)를 통해 후속 활성화 신호를 전달하는 능력을 가진 키메라 항원 수용체 분자를 발현하는 동종이계 또는 자가유래 CAR-T 세포를 대상체에 투여함으로써 암 및 자가면역 질환 (예컨대, MS, SAD, IBD)을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 발명의 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 항원-특이적 T 세포는 세포 은행 또는 라이브러리로부터 선택된다. 바람직하게, MHC는 클래스 I MHC이다. 특정 실시양태에 있어서, MHC는 클래스 II MHC이며 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 또는 HLA-DRA인 α 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 클래스 II MHC는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 또는 HLA-DRB인 β 쇄 폴리펩티드를 갖는다. 본원에 기재된 바와 같은 이러한 T 세포 (예컨대, 항원-특이적 T 세포 및 CAR을 발현하는 항원-특이적 T 세포)는 대상체에 투여되기 전에 세포 라이브러리 또는 은행에 저장된다.
일부 실시양태에 있어서, 본 발명의 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 T 세포는 다기능적 T-세포, 즉, 예를 들어, 단일 면역 이펙터 (예컨대, 단일 바이오마커, 예컨대, 사이토카인 또는 CD107a)만 생산하는 세포보다 병원체에 대한 보다 효과적인 면역 반응을 제공하는 다중 면역 이펙터 기능을 유도할 수 있는 T 세포이다. 적은-다기능적, 단기능적 또는 심지어 "소모된" T 세포는 만성 감염 동안 면역 반응을 지배할 수 있으므로, 바이러스-연관된 합병증에 대한 보호에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 CAR-T 세포는 또한 다기능적이다 (예컨대, 향상된 다기능성을 나타내거나, 보유하거나 가짐). 일부 실시양태에 있어서, 본 발명의 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 T 세포의 50% 이상은 CD4+ T 세포이다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 상기 T 세포는 50% 미만의 CD4+ T 세포이다. 추가 실시양태에 있어서, 상기 T 세포는 주로 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 본 발명의 CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 T 세포의 50% 이상은 CD8+ T 세포이다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 상기 T 세포는 50% 미만의 CD8+ T 세포이다. 추가 실시양태에 있어서, 상기 T 세포는 주로 CD8+ T 세포이다.
본원은 또한 본원에 기재된 펩티드 (예컨대, T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드)를 제시하는 APC를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서 APC는 B 세포, 항원 제시 T-세포, 수지상 세포 또는 인공 항원-제시 세포 (예컨대, aK562 세포)이다. 특정 바람직한 실시양태에 있어서, APC는 림프모구 세포, 예컨대, BLCL로부터 유래된다. 예시적인 항원-제시 BLCL은 O'Reily et al., Immunol Res 2007 38:237-250 및 Koehne et al., Blood 2002 99: 1730-1740에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 원용된다.
공정에 사용하기 위한 수지상 세포는 환자 샘플로부터 PBMC를 채취하여 플라스틱에 부착시킴으로써 준비할 수 있다. 일반적으로, 단핵구 집단은 달라붙고 다른 모든 세포는 세척하여 제거될 수 있다. 그런 다음, 부착 집단은 IL-4 및 GM-CSF로 분화되어 단핵구 유래된 수지상 세포를 생산한다. 이러한 세포는 IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α (이는 수지상 세포의 표면 상의 중요한 공동-자극 분자를 상향조절함)의 첨가에 의해 성숙될 수 있으며 이어서, 본원에 제공된 펩티드 중 하나 이상으로 형질도입된다.
일부 실시양태에 있어서, APC는 인공 항원-제시 세포, 예컨대, aK562 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 인공 항원-제시 세포는 CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현하도록 조작된다. aK562 세포를 포함하는 예시적인 인공 항원-제시 세포는 미국 특허 공개공보 제2003/0147869호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 원용된다.
특정 양태에 있어서, 본원은 APC를 에피토프를 포함하는 펩티드 및/또는 상기 에피토프를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 T 세포 에피토프 중 하나 이상을 제시하는 APC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, APC는 조사된다. 본원에 기재된 펩티드를 제시하는 세포는 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 흡수를 조장하기 위해 세포를 펄스할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 본원에 제공된 펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질주입된다. 본원은 본원에 기재된 펩티드로 세포를 펄싱하는 것을 포함하는, 항원-제시 세포 (APC)를 생산하는 방법을 제공한다. 항원 제시 세포를 생산하는 예시적인 예는 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 WO2013088114호에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원은 MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드를 인식하는 TCR (예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)을 발현하는 T 세포 (예컨대, CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 클래스 I MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드를 인식하는 TCR을 발현하는 CD8 T 세포 (CTL)이다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 클래스 II MHC 상에 제시된 본원에 기재된 펩티드를 인식하는 CD4 T 세포 (헬퍼 T 세포)이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원은 본원에 기재된 EBV 에피토프 중 하나 이상을 인식하고 또한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-T 세포 (예컨대, EBV-특이적, 항 CD19-CAR-T 세포)의 생성, 활성화 및/또는 증식 유도 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포 (즉, 단리된 T 세포)를 포함하는 배양물 (또는 이의 샘플)은 본원에 제공된 APC (예컨대, 클래스 I MHC 복합체 상에 EBV 에피토프를 포함하는 펩티드를 제시하는 APC, 예컨대, 본원에 기재된 바이러스로 형질도입된 PBMC)와 함께 배양물에서 항온처리된다. 일부 실시양태에 있어서, APC는 T 세포가 수득된 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 실시양태에 있어서, APC는 T 세포가 수득된 대상체에 대해 자가유래가 아니다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포를 함유하는 샘플은 본원에 제공된 APC와 함께 2 회 이상 항온처리된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포 (및/또는 CAR-T 세포)는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 APC와 함께 항온처리된다. 일부 실시양태에 있어서, 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7 및/또는 IL-15이다. 유사하게, T 세포 및/또는 CAR-T 세포 배양물은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-4, IL-7 및/또는 IL-15의 존재 하에 유지될 수 있다. APC를 사용하여 T 세포의 증식을 유도하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2015/0017723에 제공되며, 이는 본원에 참고로 원용된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이러한 항원-특이적 (예컨대, EBV-특이적) T 세포는 일반적으로 세포 외 도메인 (엑토도메인으로서 또한 지칭됨), 막관통 도메인 및 세포 내 시그널링 도메인 (엔도도메인으로서 또한 지칭됨)을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질도입된다.
세포 외 도메인은 CAR이 T 세포의 표면 상에 발현될 때 T 세포 활성을 세포 외 도메인에 의해 인식되는 표적을 발현하는 세포로 지시할 수 있게 한다. 세포 내 영역에서 CD3ζ와 직렬로의 공동자극 도메인, 예컨대, 4-1BB (CD137) 공동자극 도메인의 봉입은 T 세포가 공동-자극 신호를 수신할 수 있게 한다.
예시를 위해, 제1 세대 CAR은 T 세포에 의해 발현될 때 소정의 질환-연관된 항원 (예컨대, 종양-연관된 항원)을 재표적화할 수 있는 인공 수용체를 나타낸다. 이러한 CAR은 전형적으로 T 세포 수용체 (TCR)로부터의 시그널링 도메인, 예컨대, CD3ζ에 융합된 표적-특이적 항체 (예컨대, 종양 항원)로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 항원 결합시, CAR은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAMS)의 인산화를 유발하고 내인성 항원-처리 경로 및 MHC 제한을 우회하여 세포용해, 사이토카인 분비 및 증식에 필요한 신호 캐스케이드를 개시한다. 제2 세대 CAR 설계는 활성화 및 공동-자극을 향상시키는 추가 시그널링 도메인, 예컨대, CD28 및/또는 4-1BB를 포함한다. 제2 세대 CAR은 더 많은 IL-2 분비를 유도하고, T 세포 증식 및 지속성을 증가시키고, 더 큰 종양 거부를 매개하고, T 세포 생존을 연장하는 것으로 관찰된다. 제3 세대 CAR은 다중 시그널링 도메인, 예컨대, CD3ζ-CD28-OC40 또는 CD3ζ-CD28-41BB를 조합하여, 더 강력한 사이토카인 생산 및 사멸 능력을 갖는 효력을 증대시킴으로써 만들어진다.
본원에 개시된 CAR의 엑토도메인은 일반적으로 표적화 도메인, 예컨대, 리간드-결합 도메인 또는 표적 항원에 결합하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 천연 T-세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 것이다. 바람직하게, 이러한 표적화 도메인은 단순한 엑토도메인 (예컨대, HIV 감염된 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인)을 갖는다. 대안적으로, 이러한 항원 인식 도메인은 외래 인식 구성요소, 예컨대, 연결된 사이토카인을 포함한다 (이는 사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식으로 이어질 수 있음). 일반적으로, 본원에 개시된 방법과 관련하여, 주어진 표적에 높은 친화도로 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 표적화 도메인은 전형적으로 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 표적화 도메인은 기능적 항체 단편 또는 이의 유도체 (예컨대, scFv 또는 Fab, 또는 항체의 임의의 적합한 항원-결합 단편)이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 엑토도메인은 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, scFv는 단클론 항체 (mAb)로부터의 것이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 항원-특이적 결합 도메인 (예컨대, scFv)은 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45에 개시된 림프구 활성화와 관련된 막관통 및/또는 시그널링 모티프에 융합된다. 이는 또한 CAR이 면역 이펙터 세포의 세포막에 글리코실화되고 고정될 수 있도록 신호 펩티드 (SP)를 임의로 함유한다. scFv의 친화도/특이성은 대부분 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)에서 상보성 결정 영역 (CDR) 내의 특이적 서열에 의해 구동된다. 각각의 VH 및 VL 서열은 3 개의 CDR (CDR1, CDR2, CDR3)을 가질 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 표적화 도메인은 천연 항체, 예컨대, 단클론 항체로부터 유래된다. 일부 경우에 있어서, 항체는 인간이다. 일부 경우에 있어서, 항체는 인간에 투여될 때 더 낮은 면역원성이 되도록 변경되었다. 예를 들어, 변경은 가장 가까운 인간 생식선 서열에 상응하는 프레임워크 아미노산의 키메라화, 인간화, CDR-그라프팅(grafting), 탈면역화 및 돌연변이로부터 선택된 하나 이상의 기술을 포함할 수 있다. 추가 실시양태에 있어서, 표적화 도메인은 리간드-기반 표적화 도메인이고, 여기서, 예를 들어, 본원에 개시된 scFv는 종양 마커에 대한 리간드로 교체된다. 따라서, IL13 수용체 (IL13R)에 대한 리간드를 발현하는 CAR은 교모세포종 상에 발현된 IL13R로 T 세포의 재지시(redirection)를 허용할 것이다.
또한 2 개 이상의 분자 표적 (예컨대, 세포-특이적 마커 및 종양 항원)에 결합할 수 있는 이중-특이적 CAR을 개시한다. 또한 상이한 항원, 예컨대, 암-연관된 항원에 결합하는 다른 CAR과 함께만 작동하도록 설계된 CAR을 개시한다. 예를 들어, 이러한 실시양태에 있어서, 제1 CAR의 엔도도메인은 시그널링 도메인 (SD) 또는 공동-자극 시그널링 영역 (CSR)만을 함유하나, 둘 모두를 포함하는 것은 아니다. 제2 CAR은 활성화된 경우 누락된 신호를 제공한다. 예를 들어, 개시된 CAR이 SD를 함유하나 CSR는 아닌 경우, 이 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 CSR을 함유하는 다른 CAR (또는 T-세포)이 각각의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다. 마찬가지로, 개시된 CAR이 CSR을 함유하나 SD는 아닌 경우, 이 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 SD를 함유하는 다른 CAR (또는 T-세포)이 각각의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다.
예시적인 항원은 종양 항원, 즉, 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 추가 항원 결합 도메인은 항체 또는 종양 항원의 자연적 리간드일 수 있다. 추가 항원 결합 도메인의 선택은 치료할 암의 특정 유형에 따라 달라질 것이다. 종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 신경교종-연관된 항원, 암배아 항원 (CEA), EGFRvIII, IL-11Ra, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA LX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, β-인간 융모성 성선자극호르몬, 알파태아단백질 (AFP), ALK, CD19, TIM3, 사이클린 Bl, 렉틴-반응성 AFP, Fos-관련된 항원 1, ADRB3, 티로글로불린, EphA2, RAGE-1, RU1, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TESl, PAX5, SART3, CLL-1, 푸코실 GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, 인간 텔로머라제 역전사효소, 플라이시알산(plysialic acid), PLAC1, RU1, RU2 (AS), 장 카복실 에스테라제, lewisY, sLe, LY6K, HSP70, HSP27, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIBI, BORIS, 프로스타제, 전립선-특이적 항원 (PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, LMP2, NCAM, p53, p53 돌연변이, Ras 돌연변이, gplOO, 프로스테인, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-베타, 서바이빈 및 텔로머라제, 레구마인, HPV E6, HPV E7, 정자 단백질 17, SSEA-4, 티로시나제, TARP, WT1, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-C1, MAGE-C2, 아넥신-A2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MelanA/MART 1, XAGE1, ELF2M, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, 호중구 엘라스타제, 육종 전좌 중단점, NY-BR-1, ephnnB2, CD20, CD22, CD24, CD30, TIM3, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, 안드로겐 수용체, FAP, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGFII, IGF-I 수용체, GD2, o-아세틸-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, 엽산 수용체 (FRa), 엽산 수용체 베타, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 및 메조텔린을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에 있어서, 종양 항원은 엽산 수용체 (FRa), 메조텔린, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, TIM3, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUCl, HER2 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
종양 항원의 추가 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예컨대, 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통 항원, 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pi 5; 과발현된 배아 항원, 예컨대, CEA; 및 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억압인자 유전자, 예컨대, p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌로 인한 고유한 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 거대 단백질-기반 항원은 SCCA, GP73, FC-GP73, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3
Figure pct00007
CA 27.29
Figure pct00008
BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68
Figure pct00009
P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733
Figure pct00010
EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCASl, SDCCAG1 6, TA-90
Figure pct00011
Mac-2 결합 단백질
Figure pct00012
사이클로필름(cyclophilm) C-연관된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GPC3, MUC16, TAG-72, LMP1, EBMA-1, BARF-1, CS1, CD319, HER1, B7H6, L1CAM, IL6 및 MET를 포함한다.
막관통 도메인 (TD)은 엑토도메인 (즉, 세포 외 도메인)을 엔도도메인 (즉, 세포 내 도메인)에 연계하고 세포에 의해 발현될 때 세포막 내에 존재한다. 막관통 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 막관통 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예컨대, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR 및 PAG/Cbp로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 이의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있음). 대안적으로 막관통 도메인은 합성될 수 있으며, 이 경우 주로 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 합성 막관통 도메인의 각각의 단부에서 발견될 것이다. 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예컨대, 2 내지 10 개의 아미노산 길이는 CAR의 막관통 도메인 및 내부원형질(endoplasmic) 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다.
엔도도메인은 항원 인식 후에 활성화 신호를 면역 이펙터 세포로 전송하여 상기 면역 이펙터 세포의 정상 이펙터 기능 중 하나 이상을 활성화시킨다. 특정 실시양태에 있어서, T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 일반적으로, 엔도도메인은 세포 내 시그널링 도메인 (ISD) 및 임의적으로 공동-자극 시그널링 영역 (CSR)을 함유할 수 있다. 엔도도메인은 T 세포 수용체 (TCR)의 ISD 및 임의로 공동-수용체를 포함할 수 있다. 전체 세포 내 시그널링 도메인을 사용할 수 있지만 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포 내 시그널링 도메인의 잘린 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 잘린 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. "시그널링 도메인 (SD)", 예컨대, ISD는 일반적으로 자극 방식으로 작용하고 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)로서 알려진 시그널링 모티프로 이루어지는 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 세포질 시그널링 서열을 함유한다. ITAM이 인산화될 때 시그널링 캐스케이드가 활성화된다. 용어 "공동-자극 시그널링 영역 (CSR)"은 T-세포 수용체에 의한 T-세포 활성화를 향상시킬 수 있는 공동자극 단백질 수용체로부터의 세포 내 시그널링 도메인, 예컨대, CD28, 41BB 및 ICOS를 지칭한다. 일부 실시양태에 있어서, 엔도도메인은 SD 또는 CSR을 함유하나, 둘 모두를포함하는 것은 아니다. 이러한 실시양태에 있어서, 개시된 CAR을 함유하는 면역 이펙터 세포는 누락된 도메인을 함유하는 다른 CAR (또는 T-세포 수용체)이 또한 각각의 항원에 결합하는 경우에만 활성화된다. ITAM-함유 세포질 시그널링 서열의 예는 CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc 감마 RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB) 및 FcεRIγ (FCERIG)로부터 유래된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3 제타 (CD3ζ) (TCR 제타, GenBank 수탁번호 BAG36664.1)로부터 유래된다. T-세포 수용체 T3 제타 쇄 또는 CD247 (분화 클러스터 247)로서 또한 알려진 T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 (CD3ζ) 쇄는 인간에서 CD247 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. CD3 분자의 세포 내 꼬리는 TCR의 시그널링 성능에 필수적인 단일 ITAM을 함유한다. ζ 쇄의 세포 내 꼬리 (CD3ζ)는 3 개의 ITAM을 함유한다. 일부 실시양태에 있어서, ζ 쇄는 돌연변이 ζ 쇄이다. 예를 들어, 돌연변이 ζ 쇄는 상기 ITAM을 비-기능적으로 만들기 위해 하나 이상의 ITAM에서 돌연변이, 예컨대, 점 돌연변이를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 막-근위 ITAM (ITAM1), 막-원위 ITAM (C-말단 제3 ITAM, ITAM3), 또는 둘 모두가 비-기능적이다. 추가 실시양태에 있어서, 2 개의 막-근위 ITAMS (ITAM1 및 ITAM2) 또는 2 개의 막-원위 ITAMS (ITAM2 및 ITAM3)는 비-기능적이다. 또 다른 실시양태에 있어서, ITAM2만이 비-기능적이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 ζ 쇄는 하나 이상의 ITAM이 누락되도록 결실 (예컨대, 절단) 돌연변이를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, ζ 쇄는 막-근위 ITAM (ITAM1), 막-원위 ITAM (ITAM3), 또는 둘 모두가 누락되어 있다. 다른 실시양태에 있어서, ζ 쇄는 2 개의 막-근위 ITAMS (ITAM1 및 ITAM2) 또는 2 개의 막-원위 ITAMS (ITAM2 및 ITAM3)가 누락되어 있다. 추가 실시양태에 있어서, ζ 쇄는 ITAM2가 누락되어 있다. 돌연변이 CD3ζ를 생산하는 방법은 당업자에게 알려져 있다 (Bridgeman JS, et al., Clin Exp Immunol. 2014 Feb;175(2):258-67 및 WO2019/133969호, 이는 본원에 참고로 원용됨). 도입된 CAR로부터 하나 이상의 ITAM을 제거하는 것은 CD3ζ-매개된 아폽토시스를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 도입된 CAR로부터 하나 이상의 ITAM을 제거하는 것은 기능 손실없이 크기를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, CAR은 힌지 서열을 포함한다. 힌지 서열은 항체 가요성을 용이하게 하는 짧은 아미노산 서열이다 (예컨대, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004) 참고). 힌지 서열은 항원 인식 모이어티 (예컨대, 항-CD19, -CD20, -CD22 또는 -CLEC4 scFv) 및 막관통 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자로부터 유래되거나 수득된 임의의 적합한 서열일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 힌지 서열은 CD8a 분자 또는 CD28 분자로부터 유래된다.
바람직한 실시양태에 있어서, 개시된 CAR은 다음 식에 의해 정의된다:
Figure pct00013
여기서 "SP"는 임의적 신호 펩티드를 나타내고,
여기서 "TD"는 표적화 도메인을 나타내고,
여기서 "HG"는 임의적 힌지 도메인 (스페이서 도메인)을 나타내고,
여기서 "TM"은 막관통 도메인을 나타내고,
여기서 "CSR"은 하나 이상의 공동-자극 시그널링 영역을 나타내고,
여기서 "SD"는 시그널링 도메인을 나타내고, 및
여기서 "-"는 펩티드 결합 또는 링커를 나타낸다.
일부 실시양태에 있어서, CAR은 하나의 시그널링 도메인을 함유한다. 다른 실시양태에 있어서, CAR은 하나 이상의 시그널링 도메인 (공동-자극 시그널링 도메인 포함)을 함유한다. 하나 이상의 시그널링 도메인은 다음으로부터 선택된 폴리펩티드일 수 있다: CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, FcγRI-γ, FcγRIII-γ, FcεRIβ, FcεRIγ, DAP10, DAP12, CD32, CD79a, CD79b, CD28, CD3C, CD4, b2c, CD137 (41BB), ICOS, CD27, CD28δ, CD80, NKp30, OX40 및 이들의 돌연변이체. 예를 들어, CAR의 엔도도메인은 그 자체로 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하도록 설계되거나 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다.
대안적으로, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 쇄 부분 및 공동자극 시그널링 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 시그널링 영역은 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3, NKG2D와 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이들의 돌연변이체를 포함한다. 따라서, CAR은 주로 공동-자극 시그널링 요소로서 CD28로 예시되지만, 다른 공동자극 요소 및 이의 돌연변이체는 단독으로 또는 다른 공동-자극 시그널링 요소와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 일부 실시양태에 있어서, 바람직한 CAR 공동-자극 시그널링 도메인은 WO2019/010383호에 기재된 바와 같이 "Mut06"으로서 알려진 CD28 돌연변이 도메인이다.
일부 실시양태에 있어서, CAR은 동일한 막관통 도메인의 반복일 수 있거나 상이한 막관통 도메인일 수 있는 하나 초과의 막관통 도메인을 갖는다.
일부 실시양태에 있어서, CAR은 WO2015/039523호에 기재된 바와 같은 다중-쇄 CAR이며, 이는 본 교시에 참고로 원용된다. 다중-쇄 CAR은 상이한 막관통 폴리펩티드에서 별도의 세포 외 리간드 결합 및 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 시그널링 도메인은 최적의 신호 전달을 부여하는 자연 수용체에 더 가까운 가요성 구조를 형성하는 막근접 위치에서 조립되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 다중-쇄 CAR은 FCERI 쇄가 자발적으로 함께 이량체화되어 CAR을 형성하도록 FCERI 알파 쇄의 일부 및 FCERI 베타 쇄의 일부를 포함할 수 있다.
추가 CAR 작제물은 예를 들어, Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81에 기재되어 있으며, 이는 이러한 CAR 모델의 교시를 위해 그 전체가 참고로 원용된다.
특정 실시양태에 있어서, CAR은 예를 들어 (및 제한없이), TRUCK, 범용 CAR, 자기-구동 CAR, 장갑(armored) CAR, 자기-파괴 CAR, 조건부 CAR, 마킹된 CAR, TenCAR, 이중 CAR 또는 sCAR일 수 있다.
TRUCK (범용 사이토카인 사멸을 위해 재지시된 T 세포)는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 항종양 사이토카인을 공동-발현한다. 사이토카인 발현은 구성적이거나 T 세포 활성화에 의해 유도될 수 있다. CAR 특이성에 의해 표적화된, 전-염증성 사이토카인의 국소 생산은 내인성 면역 세포를 종양 부위로 모집하고 항종양 반응을 강화시킬 수 있다.
범용 동종이계 CAR T 세포는 더 이상 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자를 발현하지 않도록 조작되어, 이식편-대-숙주 질환 (GVHD) 또는 거부 반응을 각각 예방한다.
자기-구동 CAR은 CAR 및 케모카인 수용체를 공동-발현하여, 이는 종양 리간드에 결합하여 종양 귀소를 향상시킨다.
본원에 개시된 특정 양태에 있어서, 본 발명은 면역 체크포인트 억제/차단 전략을 사용한다. 면역 체크포인트 요법은 면역 반응을 자극하거나 억제하는 면역 체계의 주요 조절인자를 표적화한다. 이러한 면역 체크포인트는 질환 상태 (예컨대, 종양)에서 악용되어 면역 체계에 의한 공격을 피할 수 있다. 체크포인트 억제제 연구는 PD-1 억제제 요법의 활성을 확인하였으며 (El-Khoueiry, Sangro et al., 2017) FDA는 20%의 객관적인 반응률로 HCC의 제2 라인 치료에 대해 니볼루맙을 승인하였다. 면역억압에 대해 저항하도록 조작된 CAR T 세포 (장갑 CAR)는 더 이상 다양한 면역 체크포인트 분자 (예컨대, 세포독성 T 림프구-연관된 항원 4 (CTLA4) 또는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1))를 발현하지 않도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예시적인 "녹다운" 및 "녹아웃" 기술은 RNA 간섭 (RNAi) (예컨대, asRNA, miRNA, shRNA, siRNA 등) 및 CRISPR 간섭 (CRISPRi) (예컨대, CRISPR-Cas9)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 체크포인트 분자의 우성-음성 형태를 발현하도록 조작된다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 면역 체크포인트 분자의 세포 외 리간드-결합 도메인 (즉, 엑토도메인)은 리간드 결합에 대해 경쟁하기 위해 막관통 막에 융합된다. 예를 들어, PD-1의 세포 외 리간드-결합 도메인은 CD8 막관통 도메인에 융합되어, 표적 세포로부터 PD-1 리간드에 대해 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 표적 세포에 존재하는 억제성 면역 체크포인트 리간드를 이용하기 위해 면역 체크포인트 스위치 수용체를 발현하도록 조작된다. 이러한 실시양태에 있어서, 면역 체크포인트 분자의 세포 외 리간드-결합 도메인은 시그널링, 자극 및/또는 공동-자극 도메인에 융합된다. 예를 들어, PD-1의 세포 외 리간드-결합 도메인은 CD28 도메인에 융합될 수 있어, PD-1 시그널링을 차단하면서 CD28 공동자극을 제공할 수 있다. 추가 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 면역 체크포인트 시그널링을 차단하는 압타머 또는 단클론 항체와 함께 투여될 수 있다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CAR T 세포 (예컨대, CAR T 세포 요법)는 PD-1 차단 방법, 예컨대, PD-1/PD-L1 길항 압타머 또는 항-PD-1/PD-L1 항체를 이용한 투여와 조합된다. 바람직한 실시양태에 있어서, CAR T 세포 및 PD-1 경로-차단 항체는 공동으로 투여된다. 추가 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 면역 체크포인트-차단 항체, 예컨대, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 또는 이의 단편을 발현 또는 발현 및 분비하도록 조작된다. 추가 실시양태에 있어서, CAR T 세포는 본원에 기재된 면역 체크포인트-차단 분자를 발현하는 벡터 (예컨대, 조작된 바이러스)와 함께 투여된다.
자기-파괴 CAR은 CAR을 코딩하기 위해 전기천공에 의해 전달된 RNA를 사용하여 설계될 수 있다. 대안적으로, T 세포의 유도성 아폽토시스는 유전자-변형된 림프구에서 티미딘 키나제에 대한 간시클로비르 결합 또는 소-분자 이량체화제에 의한 인간 카스파제 9의 보다 최근에 기재된 활성화 시스템에 기반하여 달성될 수 있다.
조건부 CAR T 세포는 "회로" (예컨대, 분자 경로)를 완성하기 위해 소분자가 첨가될 때까지 기본적으로 반응하지 않거나 스위치 오프('Off')되어, 신호 1 및 신호 2 둘 모두의 전체 전달을 가능하게 하여, CAR T 세포를 활성화시킨다. 대안적으로, T 세포는 표적 항원에 지시된 후속 투여된 이차 항체에 대한 친화도를 갖는 어댑터-특이적 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다
마킹된 CAR T 세포는 기존 단클론 항체 약제가 결합하는 CAR+ 종양 에피토프를 발현한다. 불내성 유해 효과의 설정에서, 단클론 항체의 투여는 CAR T 세포를 제거하고 추가적인 오프-종양 효과없이 증상을 해소시킨다.
탠덤 CAR (TanCAR) T 세포는 세포 내 공동-자극 도메인(들) 및 CD3ζ 도메인에 융합된 상이한 친화도을 갖는 2 개의 연결된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 단일 CAR을 발현한다. TanCAR T 세포 활성화는 표적 세포가 두 표적 모두를 공동-발현할 때만 달성된다.
이중 CAR T 세포는 상이한 리간드 결합 표적을 갖는 2 개의 별도의 CAR을 발현한다. 비-제한적인 예로서, 하나의 CAR은 CD3ζ 도메인만을 포함할 수 있는 반면 다른 CAR은 공동-자극 도메인(들)만을 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 이중 CAR T 세포는 두 표적 모두가 종양에서 발현될 때 활성화된다.
안전 CAR (sCAR)은 세포 내 억제 도메인에 융합된 세포 외 scFv로 이루어진다. 표준 CAR을 공동-발현하는 sCAR T 세포는 표준 CAR 표적을 보유하나 sCAR 표적을 보유하지 않은 표적 세포를 마주할 때만 활성화된다.
또한 본원은 개시된 면역 이펙터 세포 (예컨대, T 세포)에서 상기 CAR의 발현을 허용하는 개시된 표적-특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 벡터를 개시한다.
개시된 CAR 및 이의 영역을 코딩하는 핵산 서열은, 예컨대, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유래시키거나, 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 당업계에 알려진 재조합 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝되기 보다는 합성적으로 생산될 수 있다.
CAR을 코딩하는 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터에 혼입시킴으로써 달성된다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
개시된 핵산은 다수의 벡터 유형으로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 비제한적으로 포함하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스 (예컨대, 감마레트로바이러스), 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다. 일부 실시양태에 있어서, 폴리뉴클레오티드 벡터는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 벡터는 감마레트로바이러스 벡터이다.
포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자를 벡터에 삽입하고 당업계에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 단리하고 인 비보 또는 엑스 비보에서 대상체의 세포로 전달할 수 있다.
적합한 프로모터의 한 가지 예는 극초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 시미안 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, MND (골수증식성 육종 바이러스) 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 비제한적으로 포함하는 다른 구성적 프로모터 서열을 또한 사용할 수 있다. 프로모터는 대안적으로 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 프로모터 요소, 예컨대, 인핸서는 전사 개시 빈도를 조절한다. 다수의 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌지만, 이들은 전형적으로 시작 부위의 업스트림 30-110 bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번히 가요성이므로, 요소가 서로에 대해 반전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질주입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 발현되지 않는 유전자이며, 발현이 쉽게 검출가능한 일부 특성, 예컨대, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며 알려진 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 작제물은 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고 프로모터-구동된 전사를 조정하는 능력에 대한 약제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
유전자를 세포에 도입 및 발현시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입 및 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참고한다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히, 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예컨대, 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미쉘, 혼합 미쉘 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 인 비트로 및 인 비보 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀 (예컨대, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 다른 양태에 있어서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 연관된 연결 분자를 통해 리포좀에 접착되거나, 리포좀에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 미쉘과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 또는 다르게 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에, 미쉘로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액에 단순히 산재되어, 크기 또는 형태가 균일하지 않은 응집체를 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장-쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대, 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다. 사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, Mo.로부터 수득될 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)로부터 수득될 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득될 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.)로부터 수득될 수 있다.
선택
CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 (예컨대, 항원-특이적 T 세포)에 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질주입 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 선택가능한 마커는 별도의 DNA 조각에 운반될 수 있고 공동-형질주입 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열이 측면에 있을 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR-코딩 벡터는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에 있어서 CAR-코딩 벡터는 감마레트로바이러스 벡터를 포함한다. 가장 바람직하게, CAR-코딩 벡터는 상기 벡터에 의해 코딩된 CAR(들)을 발현하는 세포만의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 또는 물리적 태그를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 유용한 선택가능한 마커는 항생제-저항성 유전자, 리포터 유전자 또는 물리적 태그의 발현을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 물리적 태그는 절단된 세포 표면 펩티드 (예컨대, 세포 내 시그널링 도메인이 결여된 세포 표면 수용체)를 비제한적으로 포함할 수 있으며 당업계에 알려진 방법을 사용하여 적절한 항체로 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR-코딩 벡터는 항생제-저항성 유전자, 예컨대, 보르 블라스티시딘 저항성을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, CAR T 세포 (예컨대, 항원-특이적 CAR T 세포)는 선택가능한 마커 (예컨대, 블라스티시딘)의 존재 하에 배양되어, 본원에 기재된 CAR-발현 T 세포의 선택 및 확장을 허용한다.
치료 방법
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 바와 같이 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체에서 암 및/또는자가면역 장애를 치료하는 것에 관한 것이다.
본 개시내용의 방법은 부분적으로 특이적 표적 항원에 대한 T 세포 제한의 원리에 의존한다. 예를 들어, 제한없이, 바이러스, 예컨대, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)에 의해 발현된 항원에 대해 표적화된 공여자-유래된 CTL을 포함하는 생산물 및 제제는 EBV-형질전환된 B 림프모세포 (BLCL)를 포함하는 표적화된 항원-제시 (예컨대, 자극자) 세포주에서 이끌어낼 수 있다. 개시된 바이러스-항원-특이적 CAR T 세포 제제 (예컨대, 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL)와 관련하여, 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 CAR-T 생산물의 표적 세포 및/또는 수용자는 자가유래 또는 동종이계일 수 있다. 동종이계 표적의 경우, 공여자의 인간 백혈구 항원 (HLA) 아이덴티티(identity)가 알려지고 표적 (즉, 배양된 세포주 및/또는 수용자)의 HLA 아이덴티티와 매칭되어야 한다.
CAR T 세포의 제제는 항원-특이적 및 비-특이적 CTL의 혼합물을 가질 수 있다. 따라서, 동종반응성 CTL (예컨대, CAR이 있거나 없는 항원-특이적 CTL)을 정량화하기 위해 HLA-미스매칭된 표적에 대한 반응을 이끌어낸다. 이상적으로, 세포 용해는 최소이거나, 소정의 임계 미만이어야 한다. 추가로, 확장가능한 CTL 또는 CAR-발현 CTL의 수준은 제한 희석 검정 및 동종이계 표적에 대한 세포독성의 희석에 의해 정량화될 수 있다.
본원에 개시된 검정을 위한 표적 세포는 전형적으로 이들의 균일한 표현형 및 다량의 가용성을 위해 선택된다. 특정 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 항원-제시 세포 (APC)이다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 B 세포, 항원-제시 T-세포, 수지상 세포 또는 인공 항원-제시 세포 (예컨대, aK562 세포)이다. 특정 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 림프모세포이다. 특정 바람직한 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 바이러스로 형질전환된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 각각의 피토헤마글루티닌-자극된 말초 혈액 림프구 (PHA-모세포/PHAb) 및 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B-림포모구 세포주 (BLCL)를 포함한다. CAR-발현 항원-특이적 CTL의 평가를 위해 본원에 예시된 바와 같이, BLCL은 높은 생존력 및 유의한 락테이트 탈수소효소 (LDH) 및/또는 큰 세포 내 크롬 (Cr) 저장소를 보유하는 능력을 가진 더 큰 세포라는 장점을 가지고 있어, Cr 또는 LDH 방출 검정을 통한 세포독성 평가에 유리하다. 그러나, EBV 항원의 경우, BLCL (예컨대, APC로서 사용되는 것들)은 EBV 항원-양성이며, 이는 매칭되지 않는 HLA 대립유전자에 특이적인 T-세포 수용체 (TCR)에 대한 EBV 항원-특이적 교차-제시를 허용한다. PHA-모세포는 EBV-항원-음성이라는 장점이 있으며 EBV 항원을 TCR에 교차-제시할 수 없다. 그럼에도 불구하고, PHA-모세포는 더 작고 일반적으로 더 취약한 세포이다. 이는 궁극적으로 허위-양성 세포독성 결과의 더 높은 개연성을 제공하는 리포터의 더 작은 저장소 및 투과성을 초래한다. 따라서, BLCL 및 PHA-모세포는 동일한 공여자로부터 유래된 표적 쌍으로서 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 표적 세포는 투여될 CAR T 세포 제제의 적절한 선택을 가이드하기 위해 본원에 기재된 동종이계 CAR T 세포 제제의 잠재적 수용자로부터 유래된다.
특정 실시양태에 있어서, 제제가 소정의 임계를 초과하는 복수의 표적 세포주에서 용해를 유도하는 경우, 방법은 표적 세포주를 용해할 수 있는 확장가능한 CAR-T CTL의 빈도를 제제에서 정량화하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 샘플은 소정의 임계 이하인 확장가능한 CAR-T CTL의 수준을 함유하는 경우 임상적으로 동종반응성이 없는 것으로 식별된다. 특정 실시양태에 있어서, 세포용해의, 확장가능한 CAR-T CTL의 빈도를 정량화하기 전에, 제제는 동종이계 PHA-모세포 세포주 및 동종이계 세포주 각각에서 15% 초과의 용해를 유도한다.
일부 실시양태에 있어서, 제제에서 확장가능한 CAR-T CTL의 빈도를 정량화하는 것은 CAR-T CTL 확장 기간 후, 예컨대, 제한 희석 분석을 수행함으로써 세포용해 기능을 평가하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에 있어서, 세포용해 기능을 평가하는 것은 방사성 크롬 (예컨대, 51Cr) 방출 또는 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출과 같은 검출 방법을 수행하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 동종이계 세포를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 표적 세포는 제제의 CAR-T CTL이 제한되는 HLA 대립유전자와 매칭하지 않는 인간 백혈구 항원 (HLA) 대립유전자를 운반한다. 이러한 다른 실시양태에 있어서, 표적 세포는 제제의 CAR-T CTL이 제한되는 HLA 대립유전자와 부분적으로 매칭하는 HLA 대립유전자를 운반한다. 이러한 또 다른 실시양태에 있어서, 표적 세포는 제제의 CAR-T CTL이 제한되는 HLA 대립유전자와 매칭하는 HLA 대립유전자를 운반한다. 바람직한 실시양태에 있어서, CAR-T CTL은 MHC 클래스 I 단백질을 코딩하는 표적 세포의 HLA 대립유전자로 제한된다.
다른 실시양태에 있어서, 표적 세포주는 자가유래 세포를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서 CAR-T CTL 제제는 소정의 임계에서, 그 초과에서 또는 그 미만에서 2 개 이상의 자가유래 표적 세포주를 용해시키는 제제의 능력을 확인함으로써 표적 세포에 대해 사용하기에 적합한 것으로서 식별된다.
특정 실시양태에 있어서, 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포는 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포)를 포함하며, 예컨대, 세포의 60%, 70%, 80% 이상이 Tcm 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포는 1:1 이상 내지 3:1 이상, 예컨대, 1:1, 1.4:1, 2.5:1 또는 3:1 이상의 중앙 기억 T 세포 대 이펙터 기억 세포 (TCM:TEM)의 비를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에 있어서, 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포는 주로 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포는 80% 이상의 CD4+ CAR-T 세포 및 15% 이상의 CD8+ CAR-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 자가유래 또는 동종이계 CAR-T 세포는 1:1 이상 내지 3:1 이상, 예컨대, 1:1, 1.4:1, 2.5: 1 또는 3:1 이상의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비를 포함한다. 본원에 기재된 방법 중 일부에 있어서, 동종이계 T 세포는 세포 은행 (예컨대, 에피토프-특이적 T 세포의 사전-생성된 제3 자 공여자 유래 은행)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 임의의 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 자가면역 질환의 예는 예를 들어, 사구체 신염, 관절염, 확장성 심근병증-유사 질환, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 크론 질환, 전신 홍반, 만성 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 스틸 질환, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 접촉 피부염, 다발성근염, 피부비후증, 결절성 동맥주위염, 류마티스 열, 심상성 백반증, 베체트 질환, 하시모토 질환, 애디슨 질환, 피부근염, 중증근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스 질환, 악성 빈혈, 불임병, 천포창, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 자가면역 용혈 빈혈, 활성 만성 간염, 애디슨 질환, 항-인지질 증후군, 아토피 알레르기, 자가면역 위축성 위염, 무산증 자가면역, 셀리악 질환, 쿠싱 증후군, 피부근염, 원반모양 홍반 루푸스, 굿파스처 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 부신 위축증, 특발성 혈소판 감소증, 인슐린-의존성 당뇨병, 람베르트-이튼 증후군, 루포이드 간염, 림프구 감소증, 혼합된 결합 조직 질환, 유사천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 수정체 포도막염, 결절성 다발동맥염, 다선성 오토신드롬스(polyglandular autosyndromes), 원발성 담즙성 경변증, 원발성 경화성 담관염, 레이노 증후군, 재발성 다발연골염, 슈미츠 증후군, 제한된 피부경화증 (또는 크레스트 증후군), 교감성 안염, 전신 홍반성 루푸스, 타까야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염, 갑상선중독증, b 형 인슐린 저항성, I 형 당뇨병, 궤양성 대장염 및 베게너 육아종증을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 MS를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에 있어서, MS는 재발-관해형 MS, 이차 진행성 MS, 일차 진행성 MS 또는 점진적 재발성 MS이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 SAD를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스 및/또는 쇼그렌 증후군을 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 IBD를 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 특정 실시양태에 있어서 본원에 제공된 방법은 크론 질환 (국한성 장 질환, 예컨대, 비활성 및 활성 형태), 셀리악 질환 (예컨대, 비활성 및 활성 형태) 및/또는 궤양성 대장염 (예컨대, 비활성 및 활성 형태)을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 과민성 장 증후군, 현미경적 대장염, 림프구-형질세포성 장염, 만성 소화 장애증(coeliac disease), 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 호산성 전장염, 불확정 대장염, 감염성 대장염 (바이러스, 세균 또는 원충, 예컨대, 아메바성 대장염) (예컨대, 클로스트리디움 디피실 대장염(clostridium dificile colitis)), 가막성 대장염 (괴사성 대장염), 허혈 염증성 장 질환, 베체트 질환, 사르코이드증, 피부경화증, IBD-연관된 이형성증, 이형성증 연관된 종괴 또는 병변 및/또는 원발성 경화성 담관염을 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원은 본원에 기재된 바와 같은 치료적 CAR-T 세포 제제를 대상체에 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 임의의 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법 및 CAR-T 세포는 임의의 암성 또는 전-암성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장관, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁의 암세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음의 조직학적 유형일 수 있으나, 이들에 제한되지는 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추형 세포 암종; 소세포 암종; 유두모양 암종; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두모양 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 샘낭 암종; 샘종성 폴립에서의 선암종; 가족성 대장 폴립증 선암종; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두모양 선암종; 혐색소성 암종; 호산성세포 암종(acidophil carcinoma); 호산세포 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두모양 및 여포성 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지선암종; 귀지선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두모양 낭선암종; 유두모양 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질 암종; 소엽암종; 염증성 암종; 유방성 페이젯 질환(mammary paget's disease); 선방세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평상피화생(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 및 악성 로블라스토마(roblastoma); 세르톨리 세포 암종; 악성 레이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방-외 부신경절종; 크롬친화세포종; 글로만지오사르코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반에서의 악성 흑색종; 상피세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유상 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮐로(mullerian) 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종(malignant mesenchymoma); 악성 브레너 종양; 악성 엽상종; 활막육종; 악성 중피종; 이상종자세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치성 종양; 법랑모세포 치육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 법랑모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨 림프종; 파라육아종; 소 림프구성 악성 림프종; 미만성 대세포 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상 식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적혈성백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모양 세포 백혈병. 이러한 일부 바람직한 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), ALL 및 다수의 비호지킨 림프종을 포함하는 B-세포 악성종양 (예컨대, CD19+ 악성종양)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법은 EBV-연관된 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에 있어서, EBV-연관된 암은 EBV-연관된 NPC이다. 일부 실시양태에 있어서, EBV 연관된 암은 이식-후 림프증식성 장애 (PTLD), NK/T 세포 림프종, EBV+ 위암 또는 EBV+ 평활근육종이다.
일부 실시양태에 있어서, 대상체는 바이러스 입자가 대상체의 혈액에서 검출가능하도록 바이러스 (예컨대, EBV)에 노출되었다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 (예컨대, 대상체에 펩티드 특이적 CAR-T 세포를 투여하기 전 또는 후에) 대상체에서 바이러스 부하를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 대상체에서 바이러스 부하를 결정하는 것은 면역요법 유효성에 대한 양호한 예후 마커가 될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR-T 세포를 선택하는 것은 대상체 (예컨대, 조직 또는 혈액 샘플)에서 바이러스 DNA 카피의 수를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 부하는 2 회 이상 측정된다. 본원에 제공된 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료적 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양할 수 있다.
선택된 투여량 수준은 사용되는 특정 약제의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 또는 대사 속도, 치료의 지속기간, 사용되는 특정 화합물과 병용하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전 의학적 병력, 및 의료 분야에서 잘 알려진 유사한 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 세포 은행 (예컨대, 에피토프 특이적 T 세포의 사전-생성된 제3 자 공여자 유래 은행)으로부터 동종이계 T 세포를 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 대상체에 존재하는 HLA 대립유전자에 의해 코딩되는 클래스 I MHC로 제한된 TCR을 발현하기 때문에 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포 및 대상체가 2 개 이상 (예컨대, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상)의 HLA 대립유전자를 공유하고 T 세포가 공유된 HLA 대립유전자를 통해 제한되는 경우 T 세포가 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 유세포 분석을 사용하여 사전-생성된 제3-자-공여자-유래된 에피토프-특이적 T 세포 (즉, 동종이계 T 세포)의 TCR 레퍼토리를 테스트하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 에피토프-특이적 T 세포는 사량체 검정, ELISA 검정, 웨스턴 블롯 검정, 형광 현미경 검정, Edman 분해 검정 및/또는 질량 분석 검정 (예컨대, 단백질 시퀀싱)을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에 있어서, TCR 레퍼토리는 핵산 프로브, 핵산 증폭 검정 및/또는 시퀀싱 검정을 사용하여 분석된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원은 조성물의 유효량을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 본원에 제공된 T 세포 및/또는 APC를 포함하는 조성물 (예컨대, 치료적 조성물)을 제공한다. 일부 양태에 있어서, 본원은 조성물 (예컨대, 약학 조성물, 동종이계 CTL을 포함하는 이러한 조성물)을 사용하여 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 조성물은 본원에 제공된 다중 (예컨대, 2 개 이상의) CTL의 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1: PBMC 및 단리된 T 세포로부터 유래된 EBV CTL의 CAR 형질도입의 비교
건강한 공여자로부터의 냉동 PBMC를 해동하고 RPMI 배지로 회수하였다. 세포를 2 개의 분획으로 나누었으며; 세포의 1/3 (자극자)을 37℃에서 1 시간 동안 AdE1-LMPpoly 아데노바이러스로 감염시켰다. 그런 다음, 자극자를 2 회 세척하고 RPMI/AB 혈청 배양 배지에 재현탁하고 2500 cGy (2500 rads)에서 조사하였다. 세포의 나머지 2/3 (반응자)를 RPMI/AB 혈청 배지로 옮기고 자극자 (예컨대, PBMC-유래된 BLCL)와 혼합될 수 있을 때까지 37℃에서 유지하거나, 이어서 자극자 PBMC와 함께 배양되는 CD3+ T 세포를 단리하는 데 사용되었다 (도 1 참고).
PBMC 활성화
0 일차에, 9 × 106 개의 조사된 자극자 PBMC 세포에서 2.1 × 107 개의 반응자 PBMC 세포까지 6 개의 웰 (10 cm2) GRex 배양 플레이트에서 배양을 개시하였고, 37℃, 조직 배양 항온처리를 다시 시작하였다. 임의적이지만, 9 일 및 10 일차에, 형질도입 전에 세포 배양물에서 CD56+, NK (자연 살해) 세포의 고갈이 있었다.
단리된 CD3 + T 세포의 활성화
0 일차에, T 세포를 당업계에 알려진 수단 (예컨대, 생 FACS 또는 항-CD3-코팅된 자성 비드)에 의해 PBMC로부터 단리 (즉, 농축)시켰다. T 세포를 1 개의 T 세포/4 개의 자극자 PBMC 세포의 비로 20 U/ml IL2를 포함하는 배지를 함유하는 6 개의 웰 (10 cm2) GRex 배양 플레이트에서 개시하였고, 37℃로 조직 배양 항온처리를 다시 시작하였다. 9 일 및 10 일차에, 세포 배양물을 형질도입하여 CAR을 발현시켰다 (위와 같이, NK 세포 고갈은 형질도입 전에 임의적임). 시작 물질 (예컨대, CD3+ 농축 후)을 바이러스 항원, 예컨대, EBV에 대해 민감화시키는 것은 생성된 집단에서 중앙 기억 표현형 T 세포의 백분율의 증가를 초래한다. (도 2, 왼쪽 측 참고) 이러한 중앙 기억 T 세포는 시간이 지남에 따라 유리하게 지속되는 반면 T 세포 소모의 마커 (PD1 및 CTLA4)는 바이러스에-민감한 세포에서 낮게 유지된다. (도 2 오른쪽 측).
CAR 형질도입
9 일 및 10 일차에 단리된 T 세포 및 PBMC 배양물을 항-CD19 CAR (및 블라스티시딘 선택 마커)을 코딩하는 재조합 바이러스로 형질도입시켰다. 간단히 말해서, 각각의 자극 조건에 대해 24-웰 비-조직 배양 처리된 플레이트의 각각의 웰에 레트로넥틴 0.5 mL (10 μg/mL)을 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 레트로넥틴을 흡인에 의해 제거하고, 각각의 웰에 0.5 mL 차단 완충액으로 교체하고, 플레이트를 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. 항-CD19 CAR을 코딩하는 바이러스를 실온에서 해동하고, 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 파라핀 필름으로 싸서, 32℃에서 2 시간 동안 2000 × g에서 원심분리하였다. 바이러스 상청액을 흡인하고, 각각의 자극 군 (YH5 배지에 재현탁된 0.5 × 106 개의 세포/mL)으로부터 1 ml의 제조된 세포 현탁액을 첨가하였다. 플레이트를 32℃에서 15 분 동안 1000 × g에서 원심분리하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리하였다. 그런 다음, 각각의 자극 조건에 대한 세포를 제거하고 계수를 위해 풀링하였다. 세포를 0.5-1.0 × 106 개의 세포/mL로 신선한 YH5 배지에 재현탁하였다.
11 일차에, 각각의 자극 조건 (즉, 단리된 T 세포의 또는 반응자 PBMC의 자극 조건)으로 조사된 자극자 PBMC와의 배양을 다시 시작하였다. (예컨대, CD3+, scFV+ 세포에 대한) 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 위해 15 일, 23 일 및 27 일차 각각에서 샘플을 채취하였다. 약물 선택 (블라스티시딘)을 19 일 차에 유도하였다.
결과
단리된 T 세포로부터 유래된 EBV-CTL은 개선된 생존력 및 증식 성능을 입증하였다. CD3+ 농축된 시작 재료는 기존의 확장 및 형질도입 조건에 비해 10-배 초과의 수율을 가지며, 유의하게 개선된 생존력 및 증식 성능을 입증하였다 (도 3 참고). 다운스트림 CAR 벡터 형질도입의 효율은 증식 성능에 따라 달라진다. 따라서, 항원-자극된 T 세포에서 더 높은 생존력 및 증식 성능은 개선된 다운스트림 CAR 형질도입 효율을 초래한다. 미가공의 PBMC 배양물에서의 형질도입과 비교할 때, 초기 CD3+ 농축 단계로부터 유래된 CAR+ EBV CTL은 BLCL 자극 후 다운스트림 CAR 형질도입 효율의 유의한 향상을 입증하고 또한 블라스티시딘 선택에 대한 반응에서 더 높은 세포 생존력을 보여준다. (도 4 참고)
실시예 2: BLCL 자극 후 항-CD19-CAR-EBV-CTL에 대한 기억 T 세포 표현형의 평가
표준 항-CD3/CD28 비드-기반 자극은 CAR 벡터로 형질도입하기 전에 인 비트로에서 T 세포를 확장하는 방법으로서 현장에서 널리 사용된다. 다음 실험은 최종 치료적 생산물의 기억 T 세포 면역-표현형에 대한 고-수율 제조 공정으로 개량할 수 있는 다양한 CAR-T 세포 자극의 영향을 결정하기 위해 착수하였다.
연구 설계 및 절차
단리된 CD3+, EBV-항원 특이적 T 세포를 자극하고 3 일 동안 4 개의 상이한 배양 조건에서 확장시켰다;
1. 자극되지 않음,
2. 가용성 항-CD3/CD28,
3. 항-CD3/CD28 자성 비드, 및
4. BLCL 세포와 함께.
3 일의 자극 후, 각각의 배양물을 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입하고 형질도입된 T 세포의 확장을 허용하기 위해 표준 (YH 배지) 배양물에서 7 일 동안 항온처리를 다시 시작하였다. 그런 다음, 세포를 수확하고 세포 표현형을 도 5에 요약된 바와 같이 세포 염색 및 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 분석하였다.
세포주 및 배양 조건
CD3+, EBV-항원 특이적 T 세포를 액체 질소 저장소로부터 제거하고, 해동하고, 100 IU/mL IL-2와 함께 2 × 106 개의 세포/mL의 농도로 YH 배지에 현탁하였다. 현탁액을 웰당 2 mL의 현탁액과 함께 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 밤새 항온처리하였다. 이러한 밤새 회복 후, 세포를 계수하고, 1 × 106 개의 세포/mL의 농도에서 군당 6 × 106 개의 세포를 사용하여 도 5 (표 2를 또한 참고)에 기재된 바와 같이 4 개의 상이한 처리 군으로 나누었다.
표 2: 자극 및 CAR 형질도입 후 T 세포 상의 기억 표현형을 평가하기 위한 자극 조건
Figure pct00014
Figure pct00015
항-CD3/CD28 Dynabeads를 사용한 자극을 1:1의 세포:비드 비로 수행하였다. 충분한 부피의 비드를 제거하고 세포 현탁액에 직접 첨가하기 전에 DPBS에서 세척하였다. 따라서, 자극 배양물을 위와 같이 24 웰 플레이트에 웰당 100 IU/mL IL-2가 있는 2 mL YH5 배지에 플레이팅하고, 3 일 동안 항온처리하였다.
가용성 항-CD3/CD28을 사용한 자극은 mL당 25 μl (즉, 위와 같이 24-웰 플레이트의 웰당 50 μl)의 농도로 CD3/CD28 ImmunoCultTM 시약의 직접 첨가에 의해 수행하고, 3 일 동안 항온처리하였다.
EBV 형질전환된 림프모구 B 세포주 (BLCL)를 사용한 자극을 1 개의 EBV 항원-특이적 T 세포 대 4 개의 BLCL의 비로 수행하였다. 간단히 말해서, CD3+, EBV-항원 특이적 T 세포를 액체 질소 저장소로부터 제거하고, 해동하고, YH 배지에 현탁하고, 회수하도록 두었다. 자극 배양에 대비하여, EBV-BLCL을 총 90 Gy (9000 rads)의 방사선의 용량으로 조사하였다. EBV-BLCL 항원-특이적 T 세포를 위와 동일한 24-웰 플레이트에서 100 IU/mL IL-2와 함께 YH5 배지에서 조합하고, 3 일 동안 항온처리하였다.
CAR 형질도입
형질도입에 대비하여, 24-웰 플레이트를 다음과 같이 준비하였다: 0.5 mL의 레트로넥틴 (10 μg/mL)을 24-웰 비-조직 배양-처리된 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 레트로넥틴을 제거하고, 0.5 mL 차단 완충액으로 교체하고, 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그런 다음, 차단 완충액을 제거하고, 각각의 웰을 1 mL 이상의 세척 완충액으로 세척하였다. 플레이트는 사용 준비가 될 때까지 4℃에서 세척 완충액과 함께 보관되었다.
CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 (4-1BB 또는 CD28 신호 전달 도메인을 포함함)를 실온에서 해동하고, 레트로넥틴-코팅된 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여, MOI (감염의 다중도) 또는 15 개의 바이러스 입자/세포를 달성하였다 (표 2 참고). 그런 다음, 플레이트를 파라핀 필름에 싸서 32℃에서 2 시간 동안 2000 × g에서 원심분리하였으며, 이 시간 동안 각각의 자극 군으로부터의 세포를 계수하고 0.5 × 106 개의 세포/mL 농도로 YH5 배지에 재현탁하였다. 원심분리 후, 바이러스 상청액을 각각의 웰로부터 흡인하고 대조군 웰을 포함하여 1 mL의 제조된 세포 현탁액으로 교체하였다. 플레이트를 32℃에서 15 분 동안 1000 × g에서 원심분리한 다음, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리하였다.
표 3: FACS 시약 - 컨쥬게이트된 항체 및 생존력 염료
Figure pct00016
각각의 자극 군으로부터 세포를 풀링하고, 계수하고, 0.5-1.0 × 106 개의 세포/mL의 신선한 YH5 배지 농도로 재현탁한 후 2 일 동안 37℃, 5 % CO2에서 항온처리를 다시 시작하였다. 풀링 및 재현탁을 7 일째 (수확)까지 2 일마다 반복하였다. 일단 수확된 세포를 표지하고 (표 3 참고) CAR-발현 T 세포 상의 CD3, CD4, CD8, CD62L 및 CD45RO를 식별하기 위해 유세포 분석 게이팅 전략을 적용하였다 (도 6 참고). 간단히 말해, 관심 세포 신호를 먼저 크기 및 입도 (즉, 전방 산란 (FSC) 대 측면 산란 (SSC))에 의해 식별하였다. 그런 다음, 생존력 염료 (예컨대, Live/DeadTM BV510)를 사용한 염색에 기반하여 살아있는 세포를 식별하였다. 이어서, 펄스-면적 대 펄스-높이 (FSC-A 대 FSC-H)에 기반하여 생존가능한 단일 세포를 게이팅하였다. 그런 다음, 개별 CD3+ T 세포 및 후속 하위집단 (예컨대, CD4+, CD8+, 중앙 기억 T 세포)을 형광-표지된 항체를 사용하여 식별할 수 있다.
결과
표 4: CD19-CAR-T 세포 상의 CD62L + /CD45RO + 의 빈도
Figure pct00017
유세포 분석 평가는 EBV-BLCL로 자극된 형질도입된 CD19-CAR-T 세포가 가용성 CD3/CD28 또는 비드 자극에 비해 CD62L+/CD45RO+ 세포에 의해 평가된 바와 같이 더 높은 백분율의 중앙 기억 T 세포 서브세트를 나타냄을 표시하였다 (도 7 참고). 가용성 또는 비드-결합된 CD3/CD28로 자극된 CD19-CAR-T 세포는 BLCL 자극된 세포에 비해 CD62L-/CD45RO+ 세포에 의해 평가된 바와 같이 더 높은 백분율의 이펙터 기억 T 세포 서브세트를 가졌다 (표 4 참고).
표 5: CD19-CAR-T 세포 상의 CD4 및 CD8의 빈도 (CD3에 게이팅됨)
Figure pct00018
CD19-CAR-T 세포 상의 CD4 및 CD8 발현을 또한 평가하였다. CD19-CAR-T 세포의 CD3+ 집단 중에, CD3/CD28 자극에 비해 BLCL로 자극하였을 때 CD4+ 세포의 더 높은 백분율이 있었다 (도 8 및 표 5 참고).
이러한 데이터는 CAR-표적화된 항원을 발현하는 BLCL을 사용한 CAR-T 세포 배양물의 자극이 비드-결합된 또는 가용성 항체를 통한 CD3/CD28 자극으로부터의 결과와 비교할 때 우세한 중앙 기억 표현형으로의 변화를 야기한다는 것을 입증하였다. 이 연구는 표준 항-CD3/CD28 비드 또는 기타 무세포 자극 모드를 사용할 때 예상되는 품질에 비해 항원-양성 APC 자극 (항원-제시 BLCL에 의해 표현됨)을 활용하는 CAR-T 세포 배양물의 개선된 품질에 대한 잠재력을 강력하게 지지한다.
실시예 3: 항-CD19-CAR-EBV-CTL은 강력하고 특이적인 세포독성을 발휘한다
위와 유사하게, CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 (4-1BB 또는 CD28 신호 전달 도메인을 포함함)를 EBV-BLCL-자극된, CD3+, 항원-특이적 T 세포의 형질도입에 사용하였다.
간단히 말하면, CAR-발현, 바이러스-특이적 T 세포는 다음과 같은 방식으로 제조되었다.
● 0 일차, PBMC 샘플을 해동하고, CD3+ 세포를 (예컨대, 생 FACS 또는 항-CD3-코팅된 자성 비드에 의해) 농축하였다. 그런 다음, 이들 CD3+ T 세포를 본원에 기재된 바와 같이 EBV-항원-제시 BLCL과 함께 배양함으로써 자극시켰다.
● 자극 11 일-후 (11 일차), (예컨대, 항-CD56 비드 사용하여) 배양물에서 NK 세포를 고갈시켰고, 7 일 동안 1:4의 반응자/자극자 비로 신선한 EBV-항원-제시 BLCL를 이용하여 재-자극시켰다.
● 18 일차에, 배양물을 2 일 동안 4:1의 반응자/자극자 비로 제3 회차 자극시켰다.
● 20 일차에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입을 개시하고, 형질도입된 바이러스-특이적 T 세포의 확장을 허용하기 위해 표준 (YH 배지) 배양물에서 항온처리를 다시 시작하였다. 임의적으로, NK 세포 고갈 단계를 형질도입 직전에 사용할 수 있다.
● 25 일차까지, CAR-발현이 (예컨대, FACS 분석에 의해) 평가되었고, 세포독성 검정을 위해 CAR-발현, 바이러스-특이적 T 세포 (이펙터)를 표적 배양물에 첨가할 수 있었다. 임의적으로, 25 일차에 세포를 동결한 다음, 28 일차에 해동하고 세포독성을 테스트할 수 있었다.
LDH 방출에 의해 측정된 세포독성은 표시된 E:T 비로 EBV-CAR19-CAR T 세포 또는 대조군 EBV CTL과의 공동-배양물에서 4 시간 후에 관찰될 수 있었다 (도 9 및 10 참고). EBV-CD19-CAR T 세포는 CD19+ (NALM6 및 Raji) 세포 및 EBV+/CD19+ HLA-매칭된 및 미스매칭된 BLCL의 특이적 사멸에 의해 관찰된 바와 같이 낮은 동종이계-세포독성(allo-cytotoxicity)을 갖는 HLA-독립적, CD19-특이적 세포독성을 입증하였다 (도 9a 및 9b; 및 도 10 참고). 대조적으로, K562 세포, HLA-매칭된 및 미스매칭된 PHA 모세포 (이들 모두 EBV 및 CD19 항원이 결여됨)는 사멸되지 않았다 (도 9a 및 9c; 및 도 10 참고). 더욱이, EBV-민감화된, 항-CD19 CAR T 세포는 모든 CD19+ 세포주에 대해 낮은 표적-외 세포독성으로 세포독성적이었으며, 즉, CD19 및 EBV 발현 둘 모두가 결여된 세포에 대한 낮은 세포독성을 갖거나 세포독성이 비-존재하였다. 이펙터 첨가 (즉, EBV-CTL 또는 EBV-CD19 CAR T 세포 첨가) 후 3 일 동안 관찰하였을 때 표적 세포에서 특이적이고 강력한 HLA-독립적 세포용해가 관찰되었다. 세포용해는 HLA-매칭된 (BLCL 표적) 및 HLA-미스매칭된 (BLCL 및 Raji 표적) 세포 둘 모두에서 유도되었다. 그러나, EBV-CTL은 매칭된 BLCL 표적 세포에서만 유의한 세포용해를 유도할 수 있었다 (도 11 참고).
통상적으로 생산된 CAR T 세포 (즉, 시작 T 배양물의 농축 또는 항원 자극없이)와 비교할 때, 항원-특이적 CAR T 세포 (예컨대, 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL)는 더 우수하지는 않더라도 필적할 만한 세포독성을 나타낸다 (도 12 참고). 그러나, 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL은 낮은 동종반응성인 것으로 보인다. EBV-특이적 CD19-CAR T 세포의 증식 성능은 표시된 세포주와의 공동-배양시 CellTraceTM Violet 희석 검정에 의해 관찰되었다 (도 13 참고). 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL은 B-림프모구 세포주 (BLCL)를 사멸하는 능력을 보유하였으나 (도 13, 왼쪽-하단), CD19 및 EBV 항원 발현이 결여된 자가유래 및 동종이계 PHA-모세포 표적을 기존 CAR T 세포에 비해 현저히 낮은 동종반응성으로 모면하게 하였다 (도 13, 오른쪽-하단, 음영). 게다가, 통상적으로 생산된 CAR T-세포와 비교하여, 항-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL은 증가된 IFNγ 생산을 특성으로 하는 뚜렷한 사이토카인 프로파일을 나타낸다 (도 14 참고).
추가적인 실시양태
다음은 본원에 개시된 본 발명의 구체적인 번호가 매겨진 일부 실시양태이다. 이들 실시양태는 예시적이며 단지 설명을 위한 것이다. 본 발명은 실시양태에 제한되지 않고, 상기 개시내용의 범주 내에 있는 이러한 모든 형태 및 이들의 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다
실시양태 1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 항원-특이적 T 세포를 포함하는 제제를 생성하는 방법으로서,
i) CD3+ 세포의 배양물을 제조하는 단계이되, 배양물은 T 세포 및 항원-제시 자극자 세포를 포함하는, 단계;
ii) CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 배양물의 T 세포를 형질도입하는 단계;
iii) CAR-발현, 항원-특이적 T 세포의 증식을 허용하기 위해 형질도입된 T 세포를 배양하는 단계; 및
iv) CAR-발현, 항원-특이적 T 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
실시양태 2. CAR-발현, 항원-특이적 T 세포 집단의 엑스 비보 증식을 유도하는 방법으로서,
i) CD3+ 세포의 배양물을 제조하는 단계이되, 배양물은 T 세포 및 항원-제시 자극자 세포를 포함하는, 단계;
ii) CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 T 세포를 형질도입하는 단계;
iii) CAR-발현, 항원-특이적 T 세포의 증식을 허용하도록 형질도입된 T 세포 집단을 배양하는 단계; 및
iv) 가공을 위해 CAR-발현, 항원-특이적 T 세포를 수확하는 단계를 포함한다.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2의 방법으로서, 단계 iii)의 형질도입된 T 세포를 항원-제시 자극자 세포와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법이되, 단계 i), ii), iii) 또는 이들의 임의의 조합의 배양물을 하나 이상의 사이토카인과 항온처리하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법이되, CD3+ 세포와 배양하기 전에 자극자 세포를 하나 이상의 사이토카인과 항온처리하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 조사된 항원-제시 자극자 세포이다.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CD3+ 세포는 적혈구, 혈소판, 단핵구 및 과립구가 고갈된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플을 포함한다.
실시양태 8. 실시양태 1-7 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CD3+ 세포는 CD3+ 림프구가 양성 선택된 PBMC의 샘플을 포함한다.
실시양태 9. 실시양태 8의 방법이되, 여기서 CD3+ 세포는 이펙터 T 세포 유형, T 헬퍼 세포 (TH 세포), 세포독성 T 세포 (CTL), 기억 T 세포 유형, 조절 T 세포 (Treg 세포), 자연 살해 T 세포 (NKT 세포), 점막 연관된 불변 세포 (MAIT 세포), 감마 델타 T 세포 (γδ T 세포), 이중-음성 T 세포 (DNT), CD3+ B 세포 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나를 포함하는 복수의 세포 유형을 포함한다.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CD3+ 세포 및 자극자 세포는 각각 동일한 공여자로부터 유래된다.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CD3+ 세포는 자극자 세포와 상이한 공여자로부터 유래된다.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 림프모구 세포, B 세포, 항원-제시 T-세포, 수지상 세포, 인공 항원-제시 세포 및/또는 K562 세포를 포함한다.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 림프모구 B 세포 (BLCL)를 포함한다.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 공여자 샘플로부터 양성 선택된다.
실시양태 15. 실시양태 14의 방법이되, 여기서 양성 선택된 세포는 CD19+ 세포이다.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 면역원성 펩티드 항원을 포함하는 천연 및/또는 야생형 바이러스로 감염된다.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 면역원성 펩티드 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 발현한다.
실시양태 18. 실시양태 16 또는 17의 방법이되, 여기서 면역원성 펩티드 항원은 종양바이러스로부터 유래된 것이다.
실시양태 19. 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 면역원성 펩티드 항원은 헤르페스바이러스, 파필로마바이러스, 아데노바이러스, 폴리오마바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래된 것이다.
실시양태 20. 실시양태 16 내지 19 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 면역원성 펩티드 항원은 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 인간 파필로마 바이러스 (HPV), BK 바이러스 (BKV), 존-커닝햄 바이러스 (JCV), 메르켈 세포 바이러스 (MCV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래된 것이다.
실시양태 21. 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 면역원성 펩티드 항원은 바이러스성 간염을 유발하는 것으로 알려진 바이러스로부터 유래된 것이다.
실시양태 22. 실시양태 17의 방법이되, 여기서 바이러스 벡터는 복제 무능하다.
실시양태 23. 실시양태 17 내지 22 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 바이러스 벡터는 하나 이상의 면역원성 펩티드 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시양태 24. 실시양태 17 내지 23 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
실시양태 25. 실시양태 24의 방법이되, 여기서 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 EBV 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
실시양태 26. 실시양태 24 또는 25의 방법이되, 여기서 아데노바이러스 벡터는 AdE1-LMPpoly이다.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 초과의 면역원성 펩티드 항원을 제시한다.
실시양태 28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 하나 이상의 EBV 항원을 발현한다.
실시양태 29. 실시양태 28의 방법이되, 여기서 하나 이상의 EBV 항원은 LMP1 펩티드 또는 이의 단편, LMP2A 펩티드 또는 이의 단편, 및/또는 EBNA1 펩티드 또는 이의 단편을 포함한다.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 CAR에 의해 표적화된 항원 또는 리간드를 내인성으로 발현한다.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 자극자 세포는 CAR에 의해 표적화된 항원 또는 리간드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 발현한다.
실시양태 32. 실시양태 30 또는 31의 방법이되, 여기서 CAR 항원 또는 리간드는 CD19이다.
실시양태 33. 실시양태 1-32 중 어느 하나의 방법이되, 후일에 형질도입을 위해 CD3+ 세포의 배양물을 동결 및 저장하는 단계를 임의로 포함한다.
실시양태 34. 실시양태 33의 방법이되, 여기서 형질도입 전에 CD3+ 세포의 배양물은 해동되고 자극자 세포와 1 회 이상 재-배양된다.
실시양태 35. 실시양태 1-34 중 어느 하나의 방법이되, 형질도입 전 2 일 이상 내지 28 일 이상 동안 상기 배양물에서 CD3+ 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 36. 실시양태 35의 방법이되, 형질도입 전 2 일 이상 동안 상기 배양물에서 CD3+ 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 37. 실시양태 35의 방법이되, 형질도입 전 9 일 이상 동안 상기 배양물에서 CD3+ 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 38. 실시양태 35의 방법이되, 형질도입 전 20 일 이상 동안 상기 배양물에서 CD3+ 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 39. 실시양태 35의 방법이되, 형질도입 전 28 일 이상 동안 상기 배양물에서 CD3+ 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 40. 실시양태 1-39 중 어느 하나의 방법이되, 형질도입 후 2 일 이상 내지 17 일 이상 동안 상기 배양물에서 형질도입된 T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 41. 실시양태 40의 방법이되, 형질도입 후 2 일 이상 동안 상기 배양물에서 형질도입된 T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 42. 실시양태 40의 방법이되, 형질도입 후 7 일 이상 동안 상기 배양물에서 형질도입된 T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 43. 실시양태 40의 방법이되, 형질도입 후 17 일 이상 동안 상기 배양물에서 형질도입된 T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 44. 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 방법이되, 상기 배양물의 CD3+ 세포를 자극자 세포와 함께 1 회 이상 재-배양하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 45. 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 방법이되, 상기 배양물의 CD3+ 세포를 자극자 세포와 함께 2 회 이상 재-배양하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 46. 실시양태 44 또는 45의 방법이되, 여기서 재-배양은 2 내지 14 일 이상 마다 개시된다.
실시양태 47. 실시양태 44 내지 46 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제1 재-배양은 상기 배양물의 제조 후 11 일에 개시된다.
실시양태 48. 실시양태 44 내지 47 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제2 재-배양은 제1 재-배양 후 7 일에 개시된다.
실시양태 49. 실시양태 1-48 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
실시양태 50. 실시양태 49의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터이다.
실시양태 51. 실시양태 49 또는 50의 방법이되, 여기서 바이러스 벡터는 복제 무능하다.
실시양태 52. 실시양태 51의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함한다.
실시양태 53. 실시양태 52의 방법이되, 여기서 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD28 시그널링 도메인, 4-1BB 시그널링 도메인, 및/또는 CD3 시그널링 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
실시양태 54. 실시양태 53의 방법이되, 여기서 CD3 시그널링 도메인은 CD3ζ이다.
실시양태 55. 실시양태 49 내지 54 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
실시양태 56. 실시양태 55의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 항생제 저항성을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
실시양태 57. 실시양태 56의 방법이되, 여기서 항생제는 블라스티시딘이다.
실시양태 58. 실시양태 1 내지 57 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포는 CD3+ T 세포이다.
실시양태 59. 실시양태 58의 방법이되, 추후에 입양 면역요법 조성물을 제조하기 위해 수확된 CAR-발현 T 세포를 세포 은행에 동결 및 저장하는 단계를 임의로 포함한다.
실시양태 60. 실시양태 59의 방법이되, 여기서 입양 면역요법 조성물을 제조하기 전에 CAR-발현 T 세포는 해동되고 자극자 세포와 함께 1 회 이상 재-배양된다.
실시양태 61. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포는 각각의 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포) 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포)를 포함한다.
실시양태 62. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포는 주로 TCM 세포이다.
실시양태 63. 실시양태 61의 방법이되, 여기서 TCM 세포 대 TEM 세포의 비는 1:1 초과이다.
실시양태 64. 실시양태 63의 방법이되, 여기서 TCM 세포 대 TEM 세포의 비는 1.4:1 이상이다.
실시양태 65. 실시양태 63의 방법이되, 여기서 TCM 세포 대 TEM 세포의 비는 2.5:1 이상이다.
실시양태 66. 실시양태 63의 방법이되, 여기서 TCM 세포 대 TEM 세포의 비는 3:1 이상이다.
실시양태 67. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포는 각각의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
실시양태 68. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포는 주로 CD4+ T 세포이다.
실시양태 69. 실시양태 68의 방법이되, 여기서 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비는 1:1 초과이다.
실시양태 70. 실시양태 69의 방법이되, 여기서 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비는 1.4:1 이상이다.
실시양태 71. 실시양태 69의 방법이되, 여기서 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비는 2.5:1 이상이다.
실시양태 72. 실시양태 69의 방법이되, 여기서 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비는 3:1 이상이다.
실시양태 73. 실시양태 62 내지 72 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 수확된 CAR-발현 T 세포의 60% 이상은 TCM 세포이다.
실시양태 74. 항원-특이적, CAR-발현, T 세포를 농축시키기 위한 엑스 비보 방법으로서,
(i) 대상체로부터 세포의 샘플을 수득하는 단계이되, 샘플은 CD3+ T 세포를 포함하는, 단계;
(ii) 상기 샘플로부터 CD3+ 세포를 단리하고 상기 CD3+ 세포를 항원-제시 자극자 세포와 접촉시켜, 항원-특이적 CD3+ T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 단계;
(iii) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터로 CD3+ 세포를 형질도입하여, 항원-특이적, CAR-발현, CD3+ T-세포의 집단을 제공하는 단계; 및
(iv) 임의로, 항원-특이적, CAR-발현, CD3+ T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키기 위해 배양물에서 엑스 비보 CAR-발현, CD3+ T 세포의 집단을 항원-제시 자극자 세포와 배양하는 단계를 포함한다.
실시양태 75. 실시양태 74의 방법이되, 여기서 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다.
실시양태 76. 실시양태 74 또는 75의 방법이되, 여기서 단리된 CD3+ 세포 및 항원-제시 자극자 세포는 각각 동일한 대상체로부터 유래된다.
실시양태 77. 실시양태 74 내지 76 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 단리된 CD3+ 세포는 항원-제시 자극자 세포와 상이한 대상체로부터 유래된다.
실시양태 78. 실시양태 74 내지 77 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-제시 자극자 세포는 림프모구 세포, B 세포, 항원-제시 T-세포, 수지상 세포, 인공 항원-제시 세포 및/또는 K562 세포를 포함한다.
실시양태 79. 실시양태 74 내지 78 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-제시 자극자 세포는 BLCL이다.
실시양태 80. 실시양태 74 내지 79 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-제시 자극자 세포는 CD19+이다.
실시양태 81. 실시양태 74 내지 80 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-제시 자극자 세포는 하나 이상의 EBV 항원을 발현한다.
실시양태 82. 실시양태 81의 방법이되, 여기서 하나 이상의 EBV 항원은 LMP1 펩티드 또는 이의 단편, LMP2A 펩티드 또는 이의 단편, 및/또는 EBNA1 펩티드 또는 이의 단편을 포함한다.
실시양태 83. 실시양태 74 내지 82 중 어느 하나의 방법이되, 형질도입 전 3 일 이상 내지 28 일 이상 동안 상기 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 후 CD3+ T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 84. 실시양태 83의 방법이되, 형질도입 전 3 일 이상 동안 상기 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 후 CD3+ T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 85. 실시양태 83의 방법이되, 형질도입 전 6 일 이상 동안 상기 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 후 CD3+ T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 86. 실시양태 83의 방법이되, 형질도입 전 9 일 이상 동안 상기 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 후 CD3+ T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 87. 실시양태 83의 방법이되, 형질도입 전 28 일 이상 동안 상기 항원-제시 자극자 세포와의 접촉 후 CD3+ T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 88. 실시양태 83 내지 87 중 어느 하나의 방법이되, 상기 단리된 CD3+ T 세포를 항원-제시 자극자 세포와 1 회 이상 재-접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 89. 실시양태 83 내지 88 중 어느 하나의 방법이되, 상기 단리된 CD3+ T 세포를 항원-제시 자극자 세포와 2 회 이상 재-접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 90. 실시양태 88 또는 89의 방법이되, 여기서 상기 단리된 CD3+ T 세포를 항원-제시 자극자 세포와 재-접촉시키는 단계는 2 내지 14 일 이상 마다 개시된다.
실시양태 91. 실시양태 88 내지 90 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 상기 단리된 CD3+ T 세포와 항원-제시 자극자 세포의 제1 재-접촉시키는 단계는 11 일 후에 개시된다.
실시양태 92. 실시양태 88 내지 91 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 제2 재-접촉시키는 단계는 상기 단리된 CD3+ T 세포를 항원-제시 자극자 세포와의 제1 재-접촉 후 7 일에 개시된다.
실시양태 93. 실시양태 74 내지 92 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배양물은 항원-제시 자극자 세포를 포함한다.
실시양태 94. 실시양태 93의 방법이되, 형질도입 후 2 일 이상 동안 항원-특이적, CAR-발현 T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배양물에서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 95. 실시양태 94의 방법이되, 형질도입 후 7 일 이상 동안 항원-특이적, CAR-발현 T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배양물에서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 96. 실시양태 94의 방법이되, 형질도입 후 17 일 이상 동안 항원-특이적, CAR-발현 T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배양물에서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, T 세포를 유지하는 단계를 포함한다.
실시양태 97. 실시양태 74 내지 96 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
실시양태 98. 실시양태 97의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터이다.
실시양태 99. 실시양태 97 또는 98 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터는 복제 무능하다.
실시양태 100. 실시양태 99의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함한다.
실시양태 101. 실시양태 100의 방법이되, 여기서 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD28 시그널링 도메인, 4-1BB 시그널링 도메인, 및/또는 CD3 시그널링 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
실시양태 102. 실시양태 101의 방법이되, 여기서 CD3 시그널링 도메인은 CD3ζ 또는 이의 단편이다.
실시양태 103. 실시양태 97 내지 102 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
실시양태 104. 실시양태 97 내지 102 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터는 항생제 저항성을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
실시양태 105. 실시양태 74 내지 104 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, T 세포의 증식을 선택적으로 향상시키는 배양물은 항생제를 추가로 포함한다.
실시양태 106. 실시양태 105의 방법이되, 여기서 항생제는 블라스티시딘이다.
실시양태 107. 실시양태 74 내지 106 중 어느 하나를 포함하는 입양 면역요법 조성물의 제조 방법이되, 여기서 조성물은 주로 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, 중앙 기억 T 세포 (Tcm)를 포함한다.
실시양태 108. 실시양태 107의 방법이되, 여기서 입양 면역요법 조성물의 60% 이상은 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, Tcm을 포함한다.
실시양태 109. 실시양태 107 또는 108 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 항원-특이적, CAR-발현, CD3+, Tcm은 주로 CD4+ T 세포이다.
실시양태 110. 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 CAR은 CD19에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다.
실시양태 111. 실시양태 110의 방법이되, 여기서 CAR은 항-CD19 단일 쇄 가변 단편 (ScFv)을 포함한다.
실시양태 112. T 세포의 증식 성능을 개선시키는 방법으로서, 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법을 수행하는 것을 포함한다.
실시양태 113. T 세포의 형질도입 효율을 개선시키는 방법으로서, 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법을 수행하는 것을 포함한다.
실시양태 114. CAR-발현 T 세포의 생존력을 개선시키는 방법으로서, 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법을 수행하는 것을 포함한다.
실시양태 115. 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물.
실시양태 116. 재조합 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 항원-특이적 T 세포를 포함하는 T 세포 제제로서; 여기서 CAR-발현 T 세포의 60% 이상은 Tcm 세포이다.
실시양태 117. 실시양태 116의 T 세포 제제이되, 여기서 CAR-발현 Tcm 세포는 주로 CD4+ T 세포이다.
참조에 의한 통합
본원에 언급된 모든 공개물, 특허, 특허 출원 및 서열 수탁 번호는 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 원용되는 것으로 표시된 것처럼 그 전체가 참조로 원용된다. 상충되는 경우, 본원에서 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 제어될 것이다.
등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ATARA BIOTHERAPEUTICS, INC. <120> METHODS FOR EXPANDING ANTIGEN-SPECIFIC CAR-T CELLS, COMPOSITIONS AND USES RELATED THERETO <130> ABH-00425 <140> PCT/US2019/050404 <141> 2019-09-10 <150> 62/896,707 <151> 2019-09-06 <150> 62/729,089 <151> 2018-09-10 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 1 Met Asp Leu Asp Leu Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro 1 5 10 15 Arg Gly Pro Pro Leu Ser Ser Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Ile Met Ser Asn Trp Thr 35 40 45 Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Ala Leu Met Leu Val Ile 50 55 60 Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu 65 70 75 80 Gly Ala Leu Cys Leu Leu Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala 85 90 95 Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Ile Val Leu Phe 100 105 110 Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile Trp Val Tyr Phe Leu Glu 115 120 125 Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr 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Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg 165 170 175 Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val Leu Thr Ala Val Val Thr Phe Phe 180 185 190 Ala Ile Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu 195 200 205 Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val 210 215 220 Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg 225 230 235 240 Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val 245 250 255 Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala Val 260 265 270 Thr Val Val Ser Met Thr Leu Leu Leu Leu Ala Phe Val Leu Trp Leu 275 280 285 Ser Ser Pro Gly Gly Leu Gly Thr Leu Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu 290 295 300 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ile Leu Gly Thr Leu Asn 305 310 315 320 Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu 325 330 335 Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Thr Lys Ile Leu Leu 340 345 350 Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala 355 360 365 Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser 370 375 380 Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn Leu Phe Cys Met Leu Leu Leu Ile Val 385 390 395 400 Ala Gly Ile Leu Phe Ile Leu Ala Ile Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly 405 410 415 Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr 420 425 430 Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Thr Asn Thr Leu Leu 435 440 445 Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe 450 455 460 Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys 465 470 475 480 Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr 485 490 495 Val <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 3 Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu 20 25 30 Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg 35 40 45 Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys 50 55 60 His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Val Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Glu 85 90 95 Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr 100 105 110 Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys 115 120 125 Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro 130 135 140 Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met 145 150 155 160 Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile 165 170 175 Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Lys Val 180 185 190 Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro 195 200 205 Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly 210 215 220 Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln Glu 225 230 235 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 4 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 5 Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 6 Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 7 Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 8 Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 9 Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 10 Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 11 Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 12 Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 13 Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 14 Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 15 Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 16 Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 17 Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 18 Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 19 Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 20 Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 21 Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 22 Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 23 Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 24 His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 25 Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Human gammaherpesvirus 4 <400> 26 Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu 1 5 10

Claims (58)

  1. 제1 항원에 대한 결합에 특이적이고 제2 항원에 대한 결합에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포독성 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 제조하는 단계이되, 상기 CD3+ T 세포는 T-세포 수용체를 통해 상기 제1 항원을 인식하고 이에 결합하도록 자극되는, 단계;
    ii) 상기 제2 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 배양물의 CD3+ T 세포를 형질도입하는 단계;
    iii) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포의 증식을 허용하도록 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계; 및
    iv) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포를 수확하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1 항원에 대한 결합에 특이적이고 제2 항원에 대한 결합에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포독성 T 세포를 포함하는 입양 면역요법 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 제조하는 단계이되, 상기 CD3+ T 세포는 T-세포 수용체를 통해 상기 제1 항원을 인식하고 이에 결합하도록 자극되는, 단계;
    ii) 상기 제2 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 배양물의 CD3+ T 세포를 형질도입하는 단계;
    iii) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포의 증식을 허용하도록 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계; 및
    iv) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포를 수확하여, 상기 입양 면역요법 조성물을 제공하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1 항원에 대한 결합에 특이적이고 제2 항원에 대한 결합에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포독성 T 세포 집단의 증식을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 제조하는 단계이되, 상기 CD3+ T 세포는 T-세포 수용체를 통해 상기 제1 항원을 인식하고 이에 결합하도록 자극되는, 단계;
    ii) 상기 제2 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 배양물의 CD3+ T 세포를 형질도입하는 단계; 및
    iii) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포의 증식을 허용하도록 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 i), ii), iii) 또는 이들의 임의의 조합의 배양물을 하나 이상의 사이토카인과 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3+ 세포가 농축된 세포의 배양물이 적혈구, 혈소판, 단핵구 및 과립구가 고갈된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플을 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3+ 세포가 농축된 세포의 배양물이 PBMC의 샘플로부터 CD3+ 세포의 양성 선택을 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 수용체를 통해 상기 제1 항원을 인식하고 이에 결합하도록 자극된 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 제조하는 단계가, CD3+ 세포의 반응자 집단을 세포 표면 상에 상기 제1 항원을 제시하는 자극자 세포와 함께 공동-배양하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 공동-배양이 1:4의 반응자 세포:자극자 세포 비에서 개시되는 것인, 방법.
  9. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 수용체를 통해 상기 제1 항원을 인식하고 이에 결합하도록 자극된 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 상기 제조된 배양물이 CAR 형질도입 전에 표면 상에 상기 제1 항원을 제시하는 자극자 세포와 함께 임의로 재-배양되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    제1 재-배양 단계가 공동-배양 단계의 개시 후 7 일 이상에 개시되는 것인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응자 및 자극자 세포가 동일한 공여자로부터 유래되는 것인, 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극자 세포가 감마 조사된 항원-제시 자극자 세포인 것인, 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극자 세포가 림프모구 B 세포 (BLCL)를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극자 세포가 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 면역원성 펩티드 항원을 포함하는 천연 및/또는 야생형 바이러스로 감염되는 것인, 방법.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극자 세포가 T 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 면역원성 펩티드 항원을 발현하도록 조작되는 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원이 바이러스 항원인 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    바이러스 항원이 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 인간 파필로마 바이러스 (HPV), BK 바이러스 (BKV), 존-커닝햄 바이러스 (JCV), 메르켈 세포 바이러스 (MCV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 항원인 것인, 방법.
  18. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 항원이 EBV LMP1 펩티드 또는 이의 단편, EBV LMP2A 펩티드 또는 이의 단편, 또는 EBV EBNA1 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    자극자 세포가 상기 제2 항원을 추가로 발현하는 것인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원이 CD19 항원, CD20 항원 또는 메조텔린 항원인 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    후일에 형질도입을 위해 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 동결 및 저장하는 단계를 임의로 포함하는 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    후일에 사용하기 위해 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포의 배양물을 동결 및 저장하는 단계를 임의로 포함하는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    후일에 필요로 하는 환자에 투여하기 위해 수확된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포를 동결 및 저장하는 단계를 임의로 포함하는 것인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR 형질도입 전 2 일 이상 내지 28 일 이상 동안 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR 형질도입 전 2 일 이상 동안 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR 형질도입 전 9 일 이상 동안 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR 형질도입 전 20 일 이상 동안 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR 형질도입 전 28 일 이상 동안 CD3+ T 세포가 농축된 세포의 배양물을 유지하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확 단계 전 2 일 이상 내지 17 일 이상 동안 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확 단계 전 2 일 이상 동안 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확 단계 전 7 일 이상 동안 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확 단계 전 17 일 이상 동안 CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR-형질도입된 CD3+ T 세포를 상기 제1 항원을 발현하는 자극자 세포와 함께 1 회 이상 공동-배양하는 단계를 임의로 포함하는 것인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터인 것인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 벡터가 복제 무능한 것인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR이 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    하나 이상의 신호 전달 도메인이 CD28 시그널링 도메인, 4-1BB 시그널링 도메인, CD3 시그널링 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    CD3 시그널링 도메인이 CD3ζ인 것인, 방법.
  39. 제36항에 있어서,
    CAR이 하나 이상의 기능적 ITAM 영역이 결여된 변이체 CD3ζ 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  40. 제36항에 있어서,
    CAR이 Mut06 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    선택가능한 마커가 항생제 저항성을 부여하는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    항생제가 블라스티시딘인 것인, 방법.
  44. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    수확된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포가 각각의 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포) 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM 세포)를 포함하는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    수확된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포가 주로 TCM 세포인 것인, 방법.
  46. 제44항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCM 세포 대 TEM 세포의 비가 1:1 초과인 것인, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCM 세포 대 TEM 세포의 비가 1.4:1 이상인 것인, 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCM 세포 대 TEM 세포의 비가 2.5:1 이상인 것인, 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCM 세포 대 TEM 세포의 비가 3:1 이상인 것인, 방법.
  50. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    수확된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포가 각각의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    수확된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포가 주로 CD4+ T 세포인 것인, 방법.
  52. 제1 항원에 대한 결합에 특이적이고 제2 항원에 대한 결합에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포독성 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 엑스 비보 방법으로서, 상기 방법은
    i) 대상체로부터 세포 샘플을 수득하는 단계이되, 세포 샘플은 CD3+ T 세포를 포함하는, 단계;
    ii) CD3+ T 세포에 대해 상기 세포 샘플을 농축시켜 농축된 세포 샘플을 제공하는 단계;
    iii) 상기 농축된 세포 샘플을 세포 표면 상에 상기 제1 항원을 제시하는 항원-제시 자극자 세포와 접촉시켜 제1-항원-자극된 세포 샘플을 제공하는 단계;
    iv) 상기 제2 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 제1-항원-자극된 세포 샘플을 형질도입하는 단계;
    v) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포의 증식을 허용하도록 CAR-형질도입된 세포를 배양하는 단계; 및
    vi) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포 조성물을 수확하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  53. 제1 항원에 대한 결합에 특이적이고 제2 항원에 대한 결합에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포독성 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 엑스 비보 방법으로서, 상기 방법은
    i) 대상체로부터 세포 샘플을 수득하는 단계이되, 세포 샘플은 CD3+ T 세포를 포함하는, 단계;
    ii) CD3+ T 세포에 대해 상기 세포 샘플을 농축시켜 농축된 세포 샘플을 제공하는 단계;
    iii) 상기 제2 항원에 결합하는 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 상기 농축된 세포 샘플을 형질도입하는 단계;
    iv) CAR-형질도입된 세포를 세포 표면 상에 상기 제1 항원을 제시하는 항원 제시 자극자 세포와 접촉시키는 단계; 및
    v) CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포 조성물을 수확하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, T 세포의 증식 성능을 개선시키는 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, T 세포의 형질도입 효율을 개선시키는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, CAR-발현 T 세포의 생존력을 개선시키는 방법.
  57. 펩티드 항원의 발현과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 펩티드 항원의 발현과 연관된 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 CAR-발현, 제1-항원-특이적 세포독성 T 세포를 상기 환자에 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물.
KR1020217010391A 2018-09-10 2019-09-10 항원-특이적 car-t 세포를 확장하기 위한 방법, 이와 관련된 조성물 및 용도 KR20210061361A (ko)

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