KR20210049806A - Nef-함유 T 세포 및 이의 생산 방법 - Google Patents
Nef-함유 T 세포 및 이의 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210049806A KR20210049806A KR1020217005328A KR20217005328A KR20210049806A KR 20210049806 A KR20210049806 A KR 20210049806A KR 1020217005328 A KR1020217005328 A KR 1020217005328A KR 20217005328 A KR20217005328 A KR 20217005328A KR 20210049806 A KR20210049806 A KR 20210049806A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- nef
- tcr
- mutant
- domain
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 375
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 626
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 587
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 claims abstract description 339
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 268
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 231
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 231
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 212
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 169
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 168
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 144
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 130
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims abstract description 88
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 339
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 303
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 167
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 164
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 164
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 164
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 124
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 124
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 97
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 95
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 86
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 75
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 69
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 claims description 68
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 57
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 56
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 55
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 55
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 54
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 51
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 51
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 34
- -1 Lewis Y Proteins 0.000 claims description 29
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 claims description 25
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 claims description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 23
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 23
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 12
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 12
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 11
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 11
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 claims description 9
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 7
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 6
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 claims description 6
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000884275 Homo sapiens Endosialin Proteins 0.000 claims description 6
- 101000608769 Homo sapiens Galectin-8 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100029215 Signaling lymphocytic activation molecule Human genes 0.000 claims description 6
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 6
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 5
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000971538 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021458 Killer cell lectin-like receptor subfamily F member 1 Human genes 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 5
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims description 5
- 101710164680 Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 claims description 5
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 claims description 4
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 claims description 4
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000633780 Homo sapiens Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 claims description 4
- 101000809875 Homo sapiens TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000648507 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 4
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 claims description 4
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038717 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 claims description 4
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100040079 A-kinase anchor protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710109924 A-kinase anchor protein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000017918 ADRB3 Human genes 0.000 claims description 3
- 108060003355 ADRB3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026402 Adhesion G protein-coupled receptor E2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025218 B-cell differentiation antigen CD72 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027522 Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710188619 C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 claims description 3
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029390 CMRF35-like molecule 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 claims description 3
- 101710178046 Chorismate synthase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035167 Coiled-coil domain-containing protein 54 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010060385 Cyclin B1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710152695 Cysteine synthase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027417 Cytochrome P450 1B1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 claims description 3
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010055196 EphA2 Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030340 Ephrin type-A receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023721 Ephrin-B2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044090 Ephrin-B2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031507 Fc receptor-like protein 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 101150032879 Fcrl5 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010449 Folate receptor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108050001930 Folate receptor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003817 Fos-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000123 Fos-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036939 G-protein coupled receptor 20 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021197 G-protein coupled receptor family C group 5 member D Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032340 G2/mitotic-specific cyclin-B1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000044445 Galectin-8 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039554 Galectin-8 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710088083 Glomulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010007712 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100034459 Hepatitis A virus cellular receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000718211 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934359 Homo sapiens B-cell differentiation antigen CD72 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000936083 Homo sapiens Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000740785 Homo sapiens Bone marrow stromal antigen 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000912622 Homo sapiens C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 claims description 3
- 101000990055 Homo sapiens CMRF35-like molecule 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000882898 Homo sapiens Claudin-6 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000737052 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 54 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000725164 Homo sapiens Cytochrome P450 1B1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000954709 Homo sapiens Doublecortin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001071355 Homo sapiens G-protein coupled receptor 20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001040713 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member D Proteins 0.000 claims description 3
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000985516 Homo sapiens Hermansky-Pudlak syndrome 5 protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000840267 Homo sapiens Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101000614481 Homo sapiens Kidney-associated antigen 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000984197 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 3
- 101001065550 Homo sapiens Lymphocyte antigen 6K Proteins 0.000 claims description 3
- 101001018034 Homo sapiens Lymphocyte antigen 75 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101001051490 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule L1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 101000873418 Homo sapiens P-selectin glycoprotein ligand 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000613490 Homo sapiens Paired box protein Pax-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000601724 Homo sapiens Paired box protein Pax-5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000589399 Homo sapiens Pannexin-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000691463 Homo sapiens Placenta-specific protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001064779 Homo sapiens Plexin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101001136981 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-9 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000633782 Homo sapiens SLAM family member 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000665137 Homo sapiens Scm-like with four MBT domains protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000824971 Homo sapiens Sperm surface protein Sp17 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000873927 Homo sapiens Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000714168 Homo sapiens Testisin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000772267 Homo sapiens Thyrotropin receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101000894428 Homo sapiens Transcriptional repressor CTCFL Proteins 0.000 claims description 3
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 claims description 3
- 101000808105 Homo sapiens Uroplakin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000814512 Homo sapiens X antigen family member 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029616 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004553 Interleukin-11 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017521 Interleukin-11 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034872 Kallikrein-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 claims description 3
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025586 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 3
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100032129 Lymphocyte antigen 6K Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033486 Lymphocyte antigen 75 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 108700012912 MYCN Proteins 0.000 claims description 3
- 101150022024 MYCN gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 claims description 3
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024964 Neural cell adhesion molecule L1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034925 P-selectin glycoprotein ligand 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040891 Paired box protein Pax-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037504 Paired box protein Pax-5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032364 Pannexin-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100026181 Placenta-specific protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031889 Plexin domain-containing protein 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023832 Prolyl endopeptidase FAP Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035764 Proteasome subunit beta type-9 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032831 Protein ITPRID2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029214 SLAM family member 8 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 3
- 101900170934 Simian immunodeficiency virus Protein Nef Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 3
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims description 3
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010032166 TARP Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036494 Testisin Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021393 Transcriptional repressor CTCFL Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038851 Uroplakin-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039490 X antigen family member 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 108010024383 kallikrein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims description 3
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 2
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024965 Caspase recruitment domain-containing protein 11 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000585551 Equus caballus Pregnancy-associated glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims description 2
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000761179 Homo sapiens Caspase recruitment domain-containing protein 11 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000900690 Homo sapiens GRB2-related adapter protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000824104 Homo sapiens High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 claims description 2
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001047640 Homo sapiens Linker for activation of T-cells family member 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101001090688 Homo sapiens Lymphocyte cytosolic protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001124867 Homo sapiens Peroxiredoxin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000692259 Homo sapiens Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 claims description 2
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000679857 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024032 Linker for activation of T-cells family member 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034709 Lymphocyte cytosolic protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710165202 T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000011408 Tripartite Motif Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023649 Tripartite Motif Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024586 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 14 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022156 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 claims description 2
- 101001038499 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) Lysine acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 claims 6
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 claims 6
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 claims 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 claims 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims 1
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims 1
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims 1
- 101100341510 Mus musculus Itgal gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100034937 Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims 1
- 102100039094 Tyrosinase Human genes 0.000 claims 1
- 108040000983 polyphosphate:AMP phosphotransferase activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 abstract description 39
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000004605 Persistent Truncus Arteriosus Diseases 0.000 description 77
- 208000037258 Truncus arteriosus Diseases 0.000 description 77
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 76
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 37
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 32
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 24
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 23
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 23
- 102220003351 rs387906411 Human genes 0.000 description 18
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 13
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 12
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 12
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 11
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 11
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 11
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 10
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 5
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000760643 Homo sapiens Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 3
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 3
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 102000006271 p21-Activated Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010058266 p21-Activated Kinases Proteins 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 101000721757 Homo sapiens Olfactory receptor 51E2 Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108090001145 Nuclear Receptor Coactivator 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100022883 Nuclear receptor coactivator 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100025128 Olfactory receptor 51E2 Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 2
- 101710181056 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100026194 C-type lectin domain family 2 member B Human genes 0.000 description 1
- 102100026197 C-type lectin domain family 2 member D Human genes 0.000 description 1
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 1
- 210000000195 CD3e-positive T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000010451 Folate receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108050001931 Folate receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000912618 Homo sapiens C-type lectin domain family 2 member B Proteins 0.000 description 1
- 101000912615 Homo sapiens C-type lectin domain family 2 member D Proteins 0.000 description 1
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101100334515 Homo sapiens FCGR3A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334524 Homo sapiens FCGR3B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150018199 KLRC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022700 NKG2-F type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010083312 T-Cell Antigen Receptor-CD3 Complex Proteins 0.000 description 1
- 108700042076 T-Cell Receptor alpha Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700042077 T-Cell Receptor beta Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011961 computed axial tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 210000001978 pro-t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464416—Receptors for cytokines
- A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464424—CD20
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70517—CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
- A61K2239/11—Antigen recognition domain
- A61K2239/13—Antibody-based
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법, 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포 및 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 상기 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 T 세포 수용체 (TCR)의 하향-조정을 초래하고, 변형된 T 세포는 또한 기능적 외인성 수용체, 예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 키메라 TCR), T 세포 항원 커플러 (TAC), TAC-유사 키메라 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다. 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질을 또한 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 7월 26일에 출원된 국제특허 출원 번호 PCT/CN2018/097235의 우선권 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 다음 제출의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형식 (CRF) (파일명: 761422001741SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2019년 7월 25일, 크기: 126KB).
본 출원의 분야
본 출원은 하향-조정된 내인성 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는 변형된 T 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 출원은 또한 외인성 수용체, 예컨대, 조작된 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 발현하는 하향-조정된 내인성 TCR을 갖는 변형된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 변형된 T 세포, 약학 조성물, 키트 및 이의 치료 방법을 추가로 제공한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포 요법은 표적 종양 항원을 특이적으로 인식하는 조작된 수용체를 운반하는 유전적으로 변형된 T 세포를 이용하여 T 세포를 종양 부위로 유도한다. 이는 혈액 암 및 다발성 골수종 (MM) 치료에 유망한 결과를 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 개인차로 인하여 자가유래 CAR-T 또는 TCR-T 요법 (환자 자신의 T 세포 사용)은 제조 및 표준화에 유의한 과제를 제시하며 제조 및 치료 비용이 매우 높다. 또한, 암 환자는 보통 감소된 림프구 수, 낮은 면역 활성 및 생체 외에서 확장하기 어려운 낮은 면역 기능을 갖는다.
보편적 동종이계 CAR-T 또는 TCR-T 요법은 건강한 공여자로부터 유래된 T 세포를 이용하는 이상적인 모델로서 간주된다. 그러나, 주요 과제는 조직비적합성으로 인해 치료 동안에 어떻게 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)을 효과적으로 제거하는가이다. TCR은 항원 제시에 대한 반응에서 T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 수용체이다. 인간의 T 세포의 95%는 알파 (α) 쇄 및 베타 (β) 쇄로 이루어진 TCR을 가지고 있다. TCRα 및 TCRβ 쇄는 조합하여 이종이량체를 형성하고 CD3 서브유닛과 연관되어 세포 표면에 존재하는 TCR 복합체를 형성한다. GvHD는 공여자의 T 세포가 TCR을 통해 비-자기 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자를 인식하고 숙주 (이식 수용자) 조직을 항원적으로 이물질로서 인식하여 공격할 때 발생한다. 공여자 T 세포로부터 내인성 TCR을 제거하여 GvHD를 예방하기 위해, 사람들은 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자 녹아웃 (KO)을 위한 유전자 편집 기술, 예컨대, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 및 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (CRISPR)-CRISPR 연관 (Cas) (CRISPR/Cas)를 사용하여, 동종이계 CAR-T 또는 TCR-T 생산을 위한 TCR-음성 T 세포를 농축시킨다. 그러나, TCR 결실은 손상된 CD3 다운스트림 신호 전달 경로를 야기시키고 T 세포 확장에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 언급된 모든 공개물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시 내용은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다.
본 출원은 내인성 TCR을 하향-조정하는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 외인성 수용체, 예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), T 세포 항원 커플러 (TAC), TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)을 발현하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 변형된 T 세포, 약학 조성물, 키트 및 이의 치료 방법을 또한 제공한다.
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 T 세포 수용체 (TCR)의 하향-조정을 초래한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계. 일부 실시양태에 있어서, 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 약 50% 이상으로 하향-조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
일부 실시양태에서 본원에 기재된 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 Nef 상동 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef, 예컨대, 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다.
일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 예를 들어, 전구체 T 세포는 조작된 TCR-T 세포 (예컨대, cTCR-T 세포), TAC-T 세포, TAC-유사-T 세포 또는 CAR-T 세포일 수 있으며, 이는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현함으로써 추가로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 예를 들어, 전구체 T 세포가 조작되지 않은 경우, 방법은 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있으며, 예를 들어, 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대, P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는 연결 서열을 통해 연계되며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 제1 및/또는 제2 핵산을 보유하는 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 에피솜 벡터 발현 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 제1 및/또는 제2 핵산을 운반하는 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대, 피기백 벡터 또는 슬리핑 뷰티 벡터이다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 이식편-대-숙주 질환 (GvHD) 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 일부 실시양태에 있어서, 방법은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef를 발현하는 변형된 T 세포로부터 TCR-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef를 발현하는 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화시키는 단계를 추가로 포함한다.
기능적 외인성 수용체를 포함하는 전구체 T 세포를 사용하거나 기능적 외인성 수용체를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 cTCR의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
기능적 외인성 수용체를 포함하는 전구체 T 세포를 사용하거나 기능적 외인성 수용체를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 TAC의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다.
기능적 외인성 수용체를 포함하는 전구체 T 세포를 사용하거나 기능적 외인성 수용체를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 TAC-유사 키메라 수용체의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
기능적 외인성 수용체를 포함하는 전구체 T 세포를 사용하거나 기능적 외인성 수용체를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 예컨대, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 항원-결합 단편은 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, 단일 쇄 Fv 항체 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원-결합 단편은 sdAb 또는 scFv이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가, 예컨대, 다중특이적 또는 다중에피토프이다. 일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 메조텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터루킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이, hTERT, 육종 전위 파열점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 및 IGLL1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ 또는 DAP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137 (4-1BB)의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 (예컨대, 인간)의 질환 (예컨대, 암)을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있는 비-자연 발생 Nef 단백질 (돌연변이 Nef 단백질 또는 비-자연 발생 돌연변이 Nef 단백질로서 또한 지칭됨)을 제공한다. 다른 양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질은 돌연변이 SIV Nef 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질은 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다.
본원에 기재된 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 방법에 유용한 키트 및 제조 물품을 추가로 제공한다.
도 1a-1b는 SIV Nef 발현이 T 세포 활성화를 유의하게 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 1a는 SIV Nef-LNGFR (M071)을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 Jurkat 세포주를 형질도입한 후, LNGFR+ 세포 비율이 66.1%였고, 자기-활성화 세포 분류 (MACS)가 LNGFR+ 세포를 94.3%로 추가 농축한 것을 도시한다. 도 1b는 T 세포 활성화 마커 CD69가 PHA로 자극된 LNGFR+ Jurkat 세포에서 유의하게 감소되었으나 PMA/ION으로 자극된 LNGFR+ Jurkat 세포에서는 영향을 받지 않음을 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 표시한다. "TCRα KO"는 CRISPR/Cas 방법에 의한 TCRα 녹-아웃 Jurkat 세포주를 표시한다. "벡터"는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 표시한다. "M071"은 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하고 MACS에 의해 농축된 LNGFR+ Jurkat 세포 집단을 나타낸다.
도 2는 SIV Nef 발현이 TCR/CD3 복합체의 세포 표면 발현을 억제함으로써 TCR-매개 시그널링 경로에 영향을 미친다는 것을 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 표시한다. "TCRα KO"는 CRISPR/Cas 방법에 의한 TCRα 녹-아웃 Jurkat 세포주를 표시한다. "벡터"는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 표시한다. "M071"은 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하고 MACS에 의해 농축된 LNGFR+ Jurkat 세포 집단을 나타낸다.
도 3은 HIV1 Nef 및 HIV2 Nef 발현이 TCR/CD3 복합체의 세포 표면 발현을 억제함으로써 TCR-매개 시그널링 경로에 영향을 미친다는 것을 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 표시한다. "TCRα KO"는 CRISPR/Cas 방법에 의한 TCRα 녹-아웃 Jurkat 세포주를 표시한다. "벡터"는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 표시한다. "M071"은 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하고 MACS에 의해 농축된 LNGFR+ Jurkat 세포 집단을 나타낸다. "HIV1 Nef"는 HIV1 Nef-T2A-Puro를 발현하는 Jurkat 세포를 나타낸다. "HIV2 Nef"는 HIV2 Nef-T2A-Puro를 발현하는 Jurkat 세포를 나타낸다.
도 4a-4d는 SIV Nef-발현 TCR-음성 T 세포에 대한 세포 분류 전략 및 표적 세포 세포용해 효과을 도시한다. 도 4a는 3 일 후 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입된 HEK 293T 세포에 대한 BCMA CAR 및 LNGFR 발현의 FACS 결과를 도시한다. 도 4b는 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR-P2A-LNGFR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입되고 MACSelect LNGFR MicroBeads로 분류된 LNGFR+ T 세포에 대한 TCRαβ 양성 및 음성 비율을 도시한다. 도 4c는 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입된 MACS 농축 CD3ε 음성 T 세포에서의 TCRαβ, CD3ε 및 LNGFR 발현 비율을 도시한다. 도 4d는 RPMI-8226 (BCMA+) 및 K562 (BCMA-) 세포주에 대한 CAR+/CD3ε- T 세포의 특이적 및 비-특이적 세포용해 효과를 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 일차 T 세포를 표시한다. "NC"는 음성 대조군으로서 일차 T 세포와 함께 항온처리되지 않은 Luc-표지된 세포를 나타낸다. "PC"는 양성 대조군으로서 모든 Luc-표지된 세포를 용해하는 Triton X-100을 나타낸다. "MACS CD3ε neg"는 MACS 농축 CD3ε-음성 T 세포 집단을 나타낸다. "TCRαβ-"는 CD3ε 분류 후 TCRαβ 음성 T 세포를 나타낸다. "TCRαβ+"는 CD3ε 분류 후 TCRαβ 양성 T 세포를 나타낸다.
도 5a-5c는 SIV Nef+CAR 올-인-원 렌티바이러스 벡터, 예컨대, BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef (M072), BCMA CAR-P2A-SIV Nef (M086), BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef (M090), 및 SIV Nef-P2A-BCMA CAR (M091), SIV Nef-IRES-BCMA CAR (M126), BCMA CAR-IRES-SIV Nef (M159), BCMA CAR-PGK-SIV Nef (M160), 및 SIV Nef-PGK-BCMA CAR (M161)를 이용하여 형질주입된 T 세포에서 BCMA CAR (CAR pos), TCRαβ (TCRαβ neg) 및 CD3ε (CD3ε neg)의 발현 비율을 보여준다. SIV Nef-P2A-LNGFR (M071)은 비-CAR 코딩 대조군으로서 사용되었다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다. "CAR pos"는 CAR 양성 T 세포를 나타낸다. "TCRαβ neg"는 TCRαβ 음성 T 세포를 나타낸다. "CD3ε neg"는 CD3ε 음성 T 세포를 나타낸다.
도 6a-6d는 T 세포에 대한 TCRαβ, CDε, CD28 및 CD4 발현에 대한 Nef 서브타입 및 돌연변이체의 효과를 보여준다.
도 7은 SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR (M167) T 세포 (89.7%), SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR (M168) T 세포 (93.3%), SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR (M169) T 세포 (92.1%), SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR (M170) T 세포 (93.6%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 (M171) T 세포 (93.5%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 (M172) T 세포 (87.9%) 및 SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR (M173) T 세포 (94.0%)에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 8a-8b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 및 대조군으로서 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)와 함께, 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포의 CAR-매개 특이적 종양 세포독성을 도시한다. M167: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR T 세포. M168: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR T 세포. M169: SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR T 세포. M170: SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T 세포. M171: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T 세포. M172: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T 세포. M173: SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR T 세포.
도 9a-9b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 TCR-매개 비-특이적 세포독성을 도시한다. MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포는 TCR-매개 비-특이적 종양 세포 사멸 활성이 거의 또는 전혀 없었다. M167: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR T 세포. M168: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR T 세포. M169: SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR T 세포. M170: SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T 세포. M171: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T 세포. M172: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T 세포. M173: SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR T 세포.
도 10a는 BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116 전달 플라스미드 (PLLV-M133 플라스미드)를 이용하여 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 10b는 PLLV-M133 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 CAR-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 11a는 M572로서 지칭되는 SIV Nef M116-IRES-CD20 키메라 TCR (항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-CD3ε)로 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 11b는 PLLV-M572 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 CD20 키메라 TCR-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 12a는 PLLV-M574로서 지칭되는 SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC (항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-huUCHT1.Y177T-GGGGS-CD4 서열)로 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 12b는 M574 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 항-CD20 TAC-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 13a-13c는 야생형 SIV Nef (M071)와 비교하여 TCRαβ (도 13a), CD4 (도 13b) 및 CD28 (도 13c)의 발현에 대한 다양한 SIV Nef 아미노산 잔기 돌연변이의 조절 효과를 도시한다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT)는 음성 대조군으로서 제공되었다. M116 (SIV Nef M116, 실시예 6 참고)으로 형질도입된 Jurkat 세포는 양성 대조군으로서 제공되었다.
도 2는 SIV Nef 발현이 TCR/CD3 복합체의 세포 표면 발현을 억제함으로써 TCR-매개 시그널링 경로에 영향을 미친다는 것을 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 표시한다. "TCRα KO"는 CRISPR/Cas 방법에 의한 TCRα 녹-아웃 Jurkat 세포주를 표시한다. "벡터"는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 표시한다. "M071"은 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하고 MACS에 의해 농축된 LNGFR+ Jurkat 세포 집단을 나타낸다.
도 3은 HIV1 Nef 및 HIV2 Nef 발현이 TCR/CD3 복합체의 세포 표면 발현을 억제함으로써 TCR-매개 시그널링 경로에 영향을 미친다는 것을 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 표시한다. "TCRα KO"는 CRISPR/Cas 방법에 의한 TCRα 녹-아웃 Jurkat 세포주를 표시한다. "벡터"는 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 표시한다. "M071"은 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하고 MACS에 의해 농축된 LNGFR+ Jurkat 세포 집단을 나타낸다. "HIV1 Nef"는 HIV1 Nef-T2A-Puro를 발현하는 Jurkat 세포를 나타낸다. "HIV2 Nef"는 HIV2 Nef-T2A-Puro를 발현하는 Jurkat 세포를 나타낸다.
도 4a-4d는 SIV Nef-발현 TCR-음성 T 세포에 대한 세포 분류 전략 및 표적 세포 세포용해 효과을 도시한다. 도 4a는 3 일 후 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입된 HEK 293T 세포에 대한 BCMA CAR 및 LNGFR 발현의 FACS 결과를 도시한다. 도 4b는 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR-P2A-LNGFR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입되고 MACSelect LNGFR MicroBeads로 분류된 LNGFR+ T 세포에 대한 TCRαβ 양성 및 음성 비율을 도시한다. 도 4c는 SIV Nef-P2A-LNGFR 및 BCMA CAR 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질주입된 MACS 농축 CD3ε 음성 T 세포에서의 TCRαβ, CD3ε 및 LNGFR 발현 비율을 도시한다. 도 4d는 RPMI-8226 (BCMA+) 및 K562 (BCMA-) 세포주에 대한 CAR+/CD3ε- T 세포의 특이적 및 비-특이적 세포용해 효과를 도시한다. "UnT"는 형질도입되지 않은 일차 T 세포를 표시한다. "NC"는 음성 대조군으로서 일차 T 세포와 함께 항온처리되지 않은 Luc-표지된 세포를 나타낸다. "PC"는 양성 대조군으로서 모든 Luc-표지된 세포를 용해하는 Triton X-100을 나타낸다. "MACS CD3ε neg"는 MACS 농축 CD3ε-음성 T 세포 집단을 나타낸다. "TCRαβ-"는 CD3ε 분류 후 TCRαβ 음성 T 세포를 나타낸다. "TCRαβ+"는 CD3ε 분류 후 TCRαβ 양성 T 세포를 나타낸다.
도 5a-5c는 SIV Nef+CAR 올-인-원 렌티바이러스 벡터, 예컨대, BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef (M072), BCMA CAR-P2A-SIV Nef (M086), BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef (M090), 및 SIV Nef-P2A-BCMA CAR (M091), SIV Nef-IRES-BCMA CAR (M126), BCMA CAR-IRES-SIV Nef (M159), BCMA CAR-PGK-SIV Nef (M160), 및 SIV Nef-PGK-BCMA CAR (M161)를 이용하여 형질주입된 T 세포에서 BCMA CAR (CAR pos), TCRαβ (TCRαβ neg) 및 CD3ε (CD3ε neg)의 발현 비율을 보여준다. SIV Nef-P2A-LNGFR (M071)은 비-CAR 코딩 대조군으로서 사용되었다. "UnT"는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 나타낸다. "CAR pos"는 CAR 양성 T 세포를 나타낸다. "TCRαβ neg"는 TCRαβ 음성 T 세포를 나타낸다. "CD3ε neg"는 CD3ε 음성 T 세포를 나타낸다.
도 6a-6d는 T 세포에 대한 TCRαβ, CDε, CD28 및 CD4 발현에 대한 Nef 서브타입 및 돌연변이체의 효과를 보여준다.
도 7은 SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR (M167) T 세포 (89.7%), SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR (M168) T 세포 (93.3%), SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR (M169) T 세포 (92.1%), SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR (M170) T 세포 (93.6%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 (M171) T 세포 (93.5%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 (M172) T 세포 (87.9%) 및 SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR (M173) T 세포 (94.0%)에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 8a-8b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 및 대조군으로서 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)와 함께, 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포의 CAR-매개 특이적 종양 세포독성을 도시한다. M167: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR T 세포. M168: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR T 세포. M169: SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR T 세포. M170: SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T 세포. M171: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T 세포. M172: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T 세포. M173: SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR T 세포.
도 9a-9b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물을 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 TCR-매개 비-특이적 세포독성을 도시한다. MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포는 TCR-매개 비-특이적 종양 세포 사멸 활성이 거의 또는 전혀 없었다. M167: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR T 세포. M168: SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR T 세포. M169: SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR T 세포. M170: SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T 세포. M171: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T 세포. M172: SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T 세포. M173: SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR T 세포.
도 10a는 BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116 전달 플라스미드 (PLLV-M133 플라스미드)를 이용하여 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 10b는 PLLV-M133 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 CAR-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 11a는 M572로서 지칭되는 SIV Nef M116-IRES-CD20 키메라 TCR (항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-CD3ε)로 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 11b는 PLLV-M572 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 CD20 키메라 TCR-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 12a는 PLLV-M574로서 지칭되는 SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC (항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-huUCHT1.Y177T-GGGGS-CD4 서열)로 형질도입된 T 세포에 대한 MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율을 도시한다. 도 12b는 M574 플라스미드를 이용하여 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 항-CD20 TAC-매개 특이적 종양 세포독성 (왼쪽 패널) 및 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성 (오른쪽 패널)을 도시한다. 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 대조군으로서 제공되었다.
도 13a-13c는 야생형 SIV Nef (M071)와 비교하여 TCRαβ (도 13a), CD4 (도 13b) 및 CD28 (도 13c)의 발현에 대한 다양한 SIV Nef 아미노산 잔기 돌연변이의 조절 효과를 도시한다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT)는 음성 대조군으로서 제공되었다. M116 (SIV Nef M116, 실시예 6 참고)으로 형질도입된 Jurkat 세포는 양성 대조군으로서 제공되었다.
본 출원은 치료, 예컨대, 암 면역요법 중에 조직비적합성 개체에서 감소된 GvHD 반응을 이끌어낼 수 있는 변형된 T 세포 (예컨대, TCR-T 세포 (예컨대, cTCR-T 세포), TAC-T 세포, TAC-유사-T 세포 또는 CAR-T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다. 간단히 말해서, 전구체 T 세포 (즉, 변형될 초기 T 세포)는 Nef (음성 조절 인자) 단백질을 발현하도록 변형되며, 이는 내인성 TCR (이하 "TCR-결핍 T 세포" 또는 "GvHD-최소화 T 세포"로서 지칭됨)을 하향-조정할 수 있으며, 예컨대, 내인성 TCRα 또는 TCRβ의 세포 표면 발현을 하향-조절하여, 내인성 TCR-매개 신호 전달을 억제할 수 있다. 이어서, 이러한 Nef-함유 TCR-결핍 T 세포는 외인성 수용체, 예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 본 출원은 또한 Nef를 코딩하는 벡터 및 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 벡터로 전구체 T 세포를 공동-형질도입시킴으로써, 또는 Nef 및 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 둘 모두를 코딩하는 "올-인-원" 벡터로 전구체 T 세포를 형질도입시킴으로써 GvHD-최소화된 변형된 T 세포 (예컨대, TCR-T 세포 (예컨대, cTCR-T 세포), TAC-T 세포, TAC-유사-T 세포 또는 CAR-T 세포)를 생산하는 1-단계 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법으로부터 유래된 변형된 T 세포는 TCR의 세포 표면 발현을 효과적으로 하향-조절할 수 있는 반면, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 발현 및 기능을 보존한다. 본 발명은 동종이계 이식 동안 GvHD의 발생을 효과적으로 최소화하거나 제거하고, 보편적인 동종이계 CAR-T, TCR-T (예컨대, cTCR-T), TAC-T 또는 TAC-유사-T 요법에 대한 편리하고 효과적이며 저-비용 전략을 제공한다.
따라서, 본 출원의 일 양태는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포를 생산하는 방법, 및 이러한 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포를 제공한다. 다른 양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 임의로 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 제공한다. 다른 양태에 있어서, 본원에 기재된 변형된 T 세포를 제조하는 데 유용한 비-자연 발생 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 제공한다. 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 핵산 및 임의로 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터)를 제공한다.
I. 정의
용어 "항체"는 단일클론 항체 (전장 4-쇄 항체 또는 면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 중-쇄 단독 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디 및 단일-쇄 분자)뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, Fab, F(ab')2 및 Fv)를 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 고려되는 항체는 단일-도메인 항체, 예컨대, 중쇄 단독 항체를 포함한다.
용어 "중-쇄 단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만 4-쇄 항체에서 보통 발견되는 경쇄가 없는 기능적 항체를 지칭한다. 낙타류 동물 (예컨대, 낙타, 라마 또는 알파카)은 HCAb를 생산하는 것으로 알려져 있다.
용어 "단일-도메인 항체" 또는 "sdAb"는 3 개의 상보적 결정 영역 (CDR)을 갖는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb 단독은 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 쌍을 이루지 않고 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 단일-도메인 항체는 낙타류 HCAb로부터 조작되고, 이들의 중쇄 가변 도메인은 본원에서 "VHH"로서 지칭된다. 일부 VHH는 또한 나노바디로서 알려져 있다. 낙타류 sdAb는 알려진 가장 작은 항원-결합 항체 단편 중 하나이다 (예컨대, Hamers-Casterman 등, Nature 363:446-8 (1993); Greenberg 등, Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh 등, Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013) 참고). 기본 VHH는 다음의 N-말단에서 C-말단까지의 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하며, 여기서 CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 (동일한 부류의 다른 항체에 비해) 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원 결합 부위를 함유한다. 낙타류 종으로부터의 중-쇄 단독 항체는 "VHH"로서 지칭되는 단일 중쇄 가변 영역을 갖는다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체간에 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 스팬을 가로질러 균등하게 분산되지 않는다. 대신, 이는 경-쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 둘 모두 초가변 영역 (HVR)이라 칭하는 3 개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역 (FR)이라 칭한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 영역을 포함하며, 주로 베타-시트 구성을 채택하고, 3 개의 HVR에 의해 연계되어, 루프 연계를 형성하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 쇄의 HVR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat 등, Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) 참고). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대, 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 또는 "전체 항체"는 항체 단편과 반대로 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전장 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것들을 포함한다. 전장 중-쇄 단독 항체는 중쇄 (예컨대, VHH) 및 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예컨대, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편 (또는 항원-결합 단편)의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 등, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995] 참고); 단일-쇄 항체 분자; 단일-도메인 항체 (예컨대, VHH) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라 칭하는 2 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 용이하게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는 것의 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 생산하였다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이며, 즉, 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2 개의 디설파이드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원을 가교할 수 있는 단일 큰 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에 소수의 추가 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 알려져 있다.
Fc 단편은 디설파이드에 의해 함께 유지되는 H 쇄 둘 모두의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 또한 인식되는 영역인 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 빽빽한, 비-공유 회합으로 하나의 중-쇄 및 하나의 경-쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2 개의 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6 개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3 개의 루프)가 생성된다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
"sFv" 또는 "scFv"로서 또한 약칭되는 "단일-쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄에 연계된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다.
본원에 기재된 항체의 "기능적 단편"은 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역, 또는 변형된 FcR 결합 능력을 보유하거나 갖는 항체의 Fc 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다" 또는 "이에 특이적"이다는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대, 표적과 항원 결합 단백질 (예컨대, 항원-결합 도메인, 리간드, 조작된 TCR, CAR 또는 키메라 수용체) 사이의 결합을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함하는 이종 분자 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합성, 더 용이하게 및/또는 더 긴 기간으로 이 표적에 결합하는 항원 결합 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 관련되지 않은 표적에 대한 항원 결합 단백질의 결합 정도는, 예컨대, 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항원 결합 단백질의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에 있어서, 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 또는 0.1 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 항원 결합 단백질은 상이한 종으로부터의 단백질 간에 보존된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 이를 필요로 하지 않는다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 sdAb, scFv)의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 자연 항체는 단일특이적이다. 본원에 사용된 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것 또는 sdAb)이 2 개 이상의 항원-결합 부위를 가지며, 이들 중 2 개 이상이 상이한 항원에 결합함을 나타낸다. 본원에 사용된 "이중특이적"은 항원 결합 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것)이 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 가짐을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "단일특이적" CAR은 각각이 동일한 항원에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항원 결합 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것 또는 sdAb, scFv)을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "가"는 항원 결합 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것 또는 sdAb, scFv)에서 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 자연 항체 또는 전장 항체는 2 개의 결합 부위를 가지며 2가이다. 이와 같이, 용어 "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질 (예컨대, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것 또는 sdAb, scFv)에 각각 2 개의 결합 부위, 3 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위, 5 개의 결합 부위 및 6 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중-쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230로부터 이의 카복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항체에 사용하기 위한 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예컨대, 항체, 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것, 예컨대, CAR)와 이의 결합 파트너 (예컨대, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예컨대, 항체 및 항원, 또는 본원에 기재된 외인성 수용체 중 임의의 것 및 항원, 예컨대, CAR 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 알려진 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원과 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 출원의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특이적인 실례가 되는 및 예시적인 실시양태는 다음에 설명된다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)" 및 "상동성"은, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하고, 임의의 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™ (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 효과기 세포, 예컨대, T 세포에 하나 이상의 항원 특이성을 접목하는데 사용될 수 있는 유전적으로 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 CAR은 "인공 T-세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "키메라 면역 수용체"로서 또한 알려져 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 하나 이상의 항원 (예컨대, 종양 항원)에 특이적인 세포 외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. "CAR-T"는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR)을 발현하는 T 세포를 지칭한다. "BCMA CAR"은 BCMA에 특이적인 세포 외 결합 도메인을 갖는 CAR을 지칭한다. "바이-에피토프 CAR"은 2 개의 상이한 에피토프에 특이적인 세포 외 결합 도메인을 갖는 CAR을 지칭한다.
본원에 기재된 (예컨대, Nef 단백질, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)을 코딩하는) "단리된" 핵산 분자는 이것이 생산된 환경에 일반적으로 연관되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생산 환경과 연관된 모든 구성요소와 연관성이 없다. 본원의 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정과 다른 형태이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 세포에 자연적으로 존재하는 본원의 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 핵산과 구별된다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 분비 리더의 경우에 인접해 있고, 판독 시기에서 인접해 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하지 않아야 한다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 문구는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 이에 연결되는 다른 핵산을 증폭시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "형질주입된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질주입된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질주입, 형질전환 또는 형질도입된 것이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한되지 않는다: 질환으로부터 초래되는 하나 이상의 증상을 완화시키는 것, 질환 정도를 약화시키는 것, 질환을 안정화시키는 것(예컨대, 질환의 악화를 예방하거나 지연시키는 것), 질환의 확산 (예컨대, 전이)을 예방하거나 지연시키는 것, 질환의 회귀을 예방하거나 지연시키는 것, 질환의 진행을 지연시키거나 늦추는 것, 질환 상태를 개량시키는 것, 질환의 (부분적 또는 전체) 관해를 제공하는 것, 질환을 치료하는 데 필요한 1종 이상의 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 질환의 진행을 지연시키는 것, 삶의 질을 증가시키는 것 및/또는 생존을 연장시키는 것. 또한 "치료"에 암의 병리학적 결과의 감소가 포함된다. 본 출원의 방법은 이러한 치료 양태 중 어느 하나 이상을 상정한다.
본원에 사용된 바와 같이, "개체" 또는 "대상체"는 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 비제한적으로 포함하는 포유류를 지칭한다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 명시된 장애, 병태 또는 질환을 치료하는, 예컨대, 이의 증상 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병) 중 하나 이상을 개량시키고/시키거나, 경감시키고/시키거나 줄이고/줄이거나 지연시키는 데 충분한 약제, 예컨대, 본원에 기재된 변형된 T 세포 또는 이의 약학 조성물의 양을 지칭한다. 암에 관해, 유효량은 종양이 수축되게 하고/하거나 (예컨대, 종양 성장을 억압하기 위해) 종양의 성장률을 감소시키거나 다른 원치않는 세포 증식을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 유효량은 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에 있어서, 유효량은 회귀를 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 1 회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 약제 (예컨대, 변형된 T 세포) 또는 조성물의 유효량은: (i) 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; (ii) 종양 크기를 감소시키고/시키거나; (iii) 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 일정한 정도로 억제하고, 지체시키며, 늦추고, 바람직하게는 중단시키고/시키거나; (iv) 종양 전이를 억제하고/하거나(즉, 일정한 정도로 늦추고 바람직하게는 중단시키고/시키거나); (v) 종양 성장을 억제하고/하거나; (vi) 종양의 발생 및/또는 회귀를 예방하거나 지연시키고/시키거나; (vii) 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 덜어줄 수 있다. 감염성 질환, 예컨대, 바이러스 감염의 경우, 본원에 기재된 변형된 T 세포 또는 이의 조성물의 치료적 유효량은 병원균에 의해 감염된 세포의 수를 감소시키고/시키거나; 병원균-유래 항원의 생산 또는 방출을 감소시키고/시키거나; 감염되지 않은 세포로의 병원균의 확산을 억제하고/하거나 (즉, 일정한 정도로 늦추고 바람직하게는 중단시키고/시키거나); 감염과 연관된 하나 이상의 증상을 일정한 정도로 덜어줄 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장하는 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환의 발달을 "지연시키는 것"은 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애, 또는 방사선 질병)의 발달을 연기시키고/시키거나, 방해하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 지체시키고/시키거나, 안정화시키고/시키거나, 미루는 것을 의미한다. 이 지연은 치료 중인 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의한 지연은 개체가 질환을 발달시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 암의 발달을 "지연시키는" 방법은, 방법을 사용하지 않을 때와 비교하여, 주어진 시간 프레임에서 질환 발달의 가능성을 감소시키고/시키거나 주어진 시간 프레임에서 질환 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계학적으로 유의한 수의 개체를 이용하는 임상 연구에 기반한다. 암 발달은 컴퓨터 축 단층촬영술(CAT 스캔), 자기 공명 이미징 (MRI), 복부 초음파, 응고 테스트, 동맥조영법 또는 생검을 비제한적으로 포함하는 표준 방법을 이용하여 검출가능할 수 있다. 발달은 또한 초기에 검출가능하지 않을 수 있고, 발생, 회귀 및 발병을 포함하는 암 진행을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가유래"는 나중에 개체에 재-도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 이식편을 지칭한다. "동종이계 T 세포"는 수용자와 매칭하는 조직 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형을 갖는 공여자로부터의 T 세포를 지칭한다. 전형적으로, 매칭은 HLA 유전자의 3 개 이상의 유전자좌에서 가변성을 기준으로 수행되며, 이러한 유전자좌에서 완벽한 매칭이 선호된다. 일부 경우에 있어서 동종이계 이식 공여자가 관련이 있을 수 있고 (보통 밀접하게 HLA 매칭된 형제자매), 동계 (환자의 일란성 "동일한" 쌍둥이) 또는 비관련 (관련이 없고 매우 밀접한 HLA 매칭 정도를 갖는 것으로 발견된 공여자) 일 수 있다. HLA 유전자는 2 개의 카테고리 (유형 I 및 유형 II)로 나뉜다. 일반적으로, 유형-I 유전자 (즉, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C)의 미스매치는 이식 거부 위험을 증가시킨다. HLA 유형 II 유전자 (즉, HLA-DR 또는 HLA-DQB1)의 미스매치는 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)의 위험을 증가시킨다.
본원에 사용된 "환자"는 질환 (예컨대, 암, 바이러스 감염, GvHD)을 앓고 있는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "공여자 대상체" 또는 "공여자"는 본원에서 추가 생체 외 조작을 위해 세포가 수득되는 대상체를 지칭한다. 공여자 대상체는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 집단으로 치료될 환자 (즉, 자가유래 공여자) 일 수 있거나, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 집단의 생성시 상이한 개체 또는 환자를 치료하는 데 사용될 것인 혈액 샘플 (예컨대, 림프구 샘플)을 기증하는 개체 (즉, 동종이계 공여자)일 수 있다. 본 방법에 의해 제조된 세포를 받은 대상체는 "수용자" 또는 "수용자 대상체"로서 지칭될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 세포의 표면에서 쌍을 이루는 αβ 또는 γδ 쇄로 구성된 이종이량체 수용체를 지칭한다. 각각의 α, β, γ 및 δ 쇄는 2 개의 Ig-유사 도메인으로 구성된다: 상보성 결정 영역 (CDR)을 통해 항원 인식을 부여하는 가변 도메인 (V), 다음에 연계 펩티드 및 막관통 (TM) 영역에 의해 세포막에 고정되는 불변 도메인 (C). TM 영역은 CD3 시그널링 장치의 변치 않는 서브유닛과 연관된다. 각각의 V 도메인은 3 개의 CDR을 갖는다. 이들 CDR은 주요 조직적합성 복합체 (pMHC)에 의해 코딩된 단백질에 결합된 항원성 펩티드 사이의 복합체와 상호작용한다 (Davis 및 Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis 등 (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).
용어 "TCR-연관 시그널링 분자"는 TCR-CD3 복합체의 일부인 세포질 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 분자를 지칭한다. TCR-연관 시그널링 분자는 CD3γε, CD3δε 및 ζζ (CD3ζ 또는 CD3ζζ로서 또한 알려짐)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "자극"은 세포 표면 모이어티의 결찰에 의해 유도된 일차 반응을 지칭한다. 예를 들어, 수용체의 맥락에서 이러한 자극은 수용체의 결찰 및 후속 신호 전달 이벤트를 수반한다. T 세포의 자극과 관련하여, 이러한 자극은 일 실시양태에서 신호 전달 이벤트, 예컨대, TCR/CD3 복합체 결합을 후속적으로 유도하는 T 세포 표면 모이어티의 결찰을 지칭한다. 또한, 자극 이벤트는 세포를 활성화하고 분자의 발현 또는 분비, 예컨대, TGF-β의 하향조절을 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 따라서, 직접 신호 전달 이벤트가 부재한 경우에도 세포 표면 모이어티의 결찰은 세포골격 구조의 재조직 또는 세포 표면 모이어티의 합체를 초래할 수 있으며, 이들 각각은 후속 세포 반응을 향상, 변형 또는 변경하는 역할을 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "활성화"는 눈에 띄는 생화학적 또는 형태학적 변화를 유도하기에 충분한 세포 표면 모이어티 결찰 후 세포의 상태를 지칭한다. T 세포의 맥락에서, 이러한 활성화는 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. T 세포의 활성화는 또한 사이토카인 생산 및 조절 또는 세포용해 효과기 기능의 수행을 유도할 수 있다. 다른 세포의 맥락에서, 이 용어는 특정 물리-화학적 과정의 상향 또는 하향 조절을 유추한다. 용어 "활성화된 T 세포"는 현재 세포 분열, 사이토카인 생산, reg. 또는 cytol. 효과기 기능의 수행을 겪고 있는 T 세포 및/또는 최근에 "활성화" 과정을 겪은 T 세포를 나타낸다.
용어 T 세포에서 분자 (예컨대, 내인성 TCR 또는 CD4)의 "하향-조정"은 분자의 세포 표면 발현을 하향-조절하고/하거나 신호 전달 (예컨대, TCR, CD3, CD28-매개 신호 전달), T 세포 활성화 및 T 세포 증식을 방해하는 것을 지칭한다. 즉, 내재화, 스트리핑, 캡핑 또는 세포 표면 상의 수용체를 변화시킨 다른 형태의 재배열을 통한 표적 수용체의 하향 조정이 또한 포괄될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기능적 외인성 수용체"는 본원에 기재된 T 세포 또는 Nef-발현 T 세포에 도입된 후 생물학적 활성을 보유하는 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), T 세포 항원 커플러 (TAC) 또는 TAC-유사 키메라 수용체)를 지칭한다. 생물학적 활성은 분자 (예컨대, 암 항원 또는 ACTR에 대한 항체)에 특이적으로 결합하는 외인성 수용체의 능력, 다운스트림 신호, 예컨대, 세포 증식 유도, 사이토카인 생산, 및/또는 조절 또는 세포용해 효과기 기능의 수행을 적절하게 전달하는 외인성 수용체의 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 본 출원의 실시양태는 실시양태로 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원의 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체에 대한 변형을 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 값 또는 매개변수가 "아님"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "이외의"를 의미하고 설명한다. 예를 들어, 방법이 X 형의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 이 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "단수형"은 문맥 상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
II. Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포
본 발명은 Nef를 포함하는 변형된 T 세포 및 이러한 변형된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 추가로 발현한다. 따라서, 본 출원은 Nef 단백질 (예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 중 어느 하나 및 임의로 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 어느 하나를 공동-발현하는 변형된 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서 본원에 기재된 Nef 단백질은 돌연변이 Nef, 예컨대, 본원에 기재된 돌연변이 Nef 단백질 중 임의의 것, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 Nef 단백질은 발현시 변형된 T 세포에서 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 하향-조정을 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 세포 표면 발현은 Nef 단백질에 의해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 CD3ζ를 하향-조정 (예컨대, 발현을 하향-조절)하지 않거나, CD3ζ를 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형되지 않은 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌, 예컨대, TCRα 또는 TCRβ를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas, TALEN, shRNA 및 ZFN으로부터 선택된 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 유전자 편집 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 유전자 편집 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산은 상이한 벡터 상에 있다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 야생형 Nef 단백질과 비교하여 변형된 T 세포에서 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 하향-조정 효과 (예컨대, 세포 표면 발현의 하향-조절)를 감소시킨다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이하로 감소된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 변형된 T 세포는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)의 발현은 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절)하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체, 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR))이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 T 세포 항원 커플러 (TAC) 또는 TAC-유사 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 (또는 이의 일부) (또는 임의의 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 cTCR의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, cTCR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 cTCR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 TCR 공동-수용체의 세포 외 도메인 (또는 이의 일부) (또는 임의의 TCR 공동-수용체의 세포 외 도메인)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 TAC의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 N-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인의 C-말단에 있다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 (또는 이의 일부) (또는 임의의 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 TAC-유사 키메라 수용체의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드, 예컨대, CD8α로부터 유래된 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC-유사 키메라 수용체를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다). 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 sdAb (예컨대, 항-BCMA sdAb)이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 함께 연결된 2 개 이상의 sdAb를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 scFv (예컨대, 항-CD19 scFv, 항-CD20 scFv 또는 CD19xCD20 scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 리간드로부터 유래된 하나 이상의 도메인 또는 수용체의 세포 외 도메인을 포함하며, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 APRIL 또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체 (FcγR)이다. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 메조텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터루킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스 Y, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이, hTERT, 육종 전위 파열점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 및 IGLL1, 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-CD19 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이상 중 어느 하나의) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 항-CD20 scFv에 직접 또는 간접적으로 (예컨대, 링커를 통해) 융합된 항-CD19 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조절하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 세포 표면 발현은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD3ζ를 하향-조정하지 않거나 (예컨대, 발현을 하향-조절하지 않거나), CD3ζ를 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)의 발현은 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)를 발현하는 변형된 T 세포는 변형되지 않은 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌, 예컨대, TCRα 또는 TCRβ를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas, TALEN 및 ZFN으로부터 선택된 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 유전자 편집 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 유전자 편집 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산은 상이한 벡터 상에 있다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질은 돌연변이 SIV Nef 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 야생형 Nef 단백질과 비교하여 변형된 T 세포에서 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 하향-조정 효과 (예컨대, 세포 표면 발현의 하향조절)를 감소시킨다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 감소된다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 표 11에 기재된 아미노산 돌연변이 부위 중 임의의 것에서 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 SIV Nef는 표 11에 기재된 것과 동일한 군에 속하는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 돌연변이 부위 중 임의의 것에서 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 표 11에 기재된 오직 하나의 아미노산 돌연변이 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 표 11에 기재된 바과 동일한 그룹에 속하는 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 연속적인 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있으며, 여기서 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위는 표 11에 기재된 바와 동일한 그룹 (예컨대, 그룹 3의 aa 185-187 및 aa 188-190에서의 돌연변이)에 속한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에서 모든 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 모두 돌연변이시키는 것)이고, 여기서 아미노산 돌연변이 부위는 표 11에 기재된 바과 동일한 그룹 (예컨대, 그룹 3의 aa 185-187 및 aa 188-190의 모든 잔기를 Ala로 돌연변이시키는 것)에 속한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 제1 아미노산 돌연변이 부위로부터 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것) 및 제2 아미노산 돌연변이 부위로부터 다른 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이고, 여기서 2 개의 아미노산 돌연변이 부위는 표 11에 기재된 바와 동일한 그룹에 속한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 인접하며, 즉, 2 개 이상의 돌연변이 부위가 서로 가까이 있다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 8-10 및 aa 11-13에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 비-인접하며, 즉, 돌연변이 부위가 서로 가까이 있지 않다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 8-10 및 aa 44-46에 있다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ) 세포 표면 발현을 하향-조절하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 중 임의의 것, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상 중 임의의 것 이하의) 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13 (예컨대, aa 8-13), aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67 (예컨대, aa 44-67), aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112 (예컨대, aa 107-112), aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196 (예컨대, aa 164-196), aa 203-205, aa 206-208 (예컨대, aa 203-208), aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223 (예컨대, aa 212-223), 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개 중 임의의 것 이하의 아미노산 돌연변이 부위이다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 8-10 및 aa 44-46에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 오직 하나의 아미노산 돌연변이 부위 내에 (예컨대, aa 8-10 내에서만) 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 인접하며, 즉, 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위가 서로 옆에 있다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 8-10 및 aa 11-13에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 비-인접하며, 즉, 아미노산 돌연변이 부위가 서로 가까이 있지 않다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 8-10 및 aa 44-46에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내의 모든 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, 모두 Ala로 돌연변이시키는 것)이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 제1 아미노산 돌연변이 부위로부터 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이고, 제2 아미노산 돌연변이 부위로부터 다른 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ) 및 CD4 세포 표면 발현을 하향-조절하는 돌연변이 SIV Nef이며, 여기서 돌연변이 SIV Nef에 의한 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 또는 TCRβ) 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것과 (보다 적게 또는 더 많이) 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 상이하며, 돌연변이 SIV Nef에 의한 CD4 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상)으로 적다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고, CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 SIV Nef는 TCRαβ 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 중 임의의 것, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상 중 임의의 것 이하의) 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67 (예컨대, aa 44-67), aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169 (예컨대, aa 164-169), aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181 (예컨대, aa 176-181), aa 185-187, aa 188-190 (예컨대, aa 185-190), aa 194-196, aa 203-205, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개 중 임의의 것 이하의 아미노산 돌연변이 부위이다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 44-46에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 오직 하나의 아미노산 돌연변이 부위 내에 (예컨대, aa 2-4 내에서만) 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 인접하며, 즉, 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위가 서로 옆에 있다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 62-64 및 aa 65-67에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 비-인접하며, 즉, 아미노산 돌연변이 부위가 서로 가까이 있지 않다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 44-46에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내의 모든 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, 모두 Ala로 돌연변이시키는 것)이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 제1 아미노산 돌연변이 부위로부터 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이고, 제2 아미노산 돌연변이 부위로부터 다른 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ) 및 CD28 세포 표면 발현을 하향-조절하는 돌연변이 SIV Nef이며, 여기서 돌연변이 SIV Nef에 의한 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 또는 TCRβ) 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것과 (보다 적게 또는 더 많이) 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 상이하며, 돌연변이 SIV Nef에 의한 CD28 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상)으로 적다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고, CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 SIV Nef는 TCRαβ 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 중 임의의 것, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상 중 임의의 것 이하의) 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67 (예컨대, aa 56-67), aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190 (예컨대, aa 164-190), aa 194-196, aa 203-205, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개 중 임의의 것 이하의 아미노산 돌연변이 부위이다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 56-58에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 오직 하나의 아미노산 돌연변이 부위 내에 (예컨대, aa 2-4 내에서만) 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 인접하며, 즉, 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위가 서로 옆에 있다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 62-64 및 aa 65-67에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 비-인접하며, 즉, 아미노산 돌연변이 부위가 서로 가까이 있지 않다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 62-64에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내의 모든 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, 모두 Ala로 돌연변이시키는 것)이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 제1 아미노산 돌연변이 부위로부터 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이고, 제2 아미노산 돌연변이 부위로부터 다른 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ), CD4 및 CD28 세포 표면 발현을 하향-조절하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ), CD4 및 CD28 세포 표면 발현을 하향-조절하는 돌연변이 SIV Nef이며, 여기서 돌연변이 SIV Nef에 의한 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 또는 TCRβ) 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것과 (보다 적게 또는 더 많이) 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 상이하며, 돌연변이 SIV Nef에 의한 CD4 및 CD28 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 SIV Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상)으로 적다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 중 임의의 것, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상 중 임의의 것 이하의) 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67 (예컨대, aa 56-67), aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169 (예컨대, aa 164-169), aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181 (예컨대, aa 176-181), aa 185-187, aa 188-190 (예컨대, aa 185-190), aa 194-196, aa 203-205, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개 중 임의의 것 이하의 아미노산 돌연변이 부위이다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 56-58에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 오직 하나의 아미노산 돌연변이 부위 내에 (예컨대, aa 2-4 내에서만) 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 Ala로 돌연변이시키는 것, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 개의 아미노산 잔기 중 임의의 것을 Ala로 돌연변이시키는 것)는 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 인접하며, 즉, 2 개 이상의 아미노산 돌연변이 부위가 서로 옆에 있다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 62-64 및 aa 65-67에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 비-인접하며, 즉, 아미노산 돌연변이 부위가 서로 가까이 있지 않다 (예컨대, 돌연변이된 잔기는 aa 2-4 및 aa 65-67에 있다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 부위 내의 모든 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, 모두 Ala로 돌연변이시키는 것)이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 제1 아미노산 돌연변이 부위로부터 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이고, 제2 아미노산 돌연변이 부위로부터 다른 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것 (예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 TCRαβ 세포 표면 발현을 야생형 SIV Nef보다 더 많이 (예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상 더 많이) 하향-조절하나, 야생형 SIV Nef와 비교하여 CD4 및 CD28 세포 표면 발현의 더 적은 (예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상 적게) 하향-조절을 갖는 돌연변이 SIV Nef이다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 아미노산 잔기 178-179aa에서 하나의 2 개의 아미노산 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환, 예컨대, 하나 또는 둘 모두의 aa를 Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 SIV Nef는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 거대세포바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터 (CMV IE), 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터, 유비퀴틴-C (UBQ-C) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 (CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 (MC1) 프로모터, 베타 액틴 (β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND)" 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연계된다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대, 에피솜 발현 벡터, 향상된 에피솜 벡터 (EEV), 피기백 트랜스포사제 벡터 또는 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래되는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 GvHD 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR))이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 TAC 또는 TAC-유사 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 CAR (예컨대, 항-항원 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR)이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 1가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다가 및 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터) 상에 있고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형되지 않은 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌, 예컨대, TCRα 또는 TCRβ를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 유전자 편집 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef, 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외), 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, 야생형 Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA , CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 세포 항원 커플러 (TAC)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외), 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산). 일부 실시양태에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 하에 전사된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES 또는 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)를 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 거대세포바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터 (CMV IE), 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터, 유비퀴틴-C (UBQ-C) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 (CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 (MC1) 프로모터, 베타 액틴 (β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND)" 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A를 코딩하는 핵산 서열이다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대, 에피솜 발현 벡터, 향상된 에피솜 벡터 (EEV), 피기백 트랜스포사제 벡터 또는 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템이다. 본원에 기재된 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 바이러스 벡터)을 도입함으로써 수득된 T 세포를 추가로 제공한다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 수득된 T 세포를 추가로 제공한다.
벡터
본 출원은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 어느 하나를 클로닝하고 발현하기 위한 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Sambrook 등 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 많은 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종유래 핵산은 벡터에 삽입되고 당업계에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 단리하여 생체 외 또는 엑스 비보에서 조작된 포유동물 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져있다. 일부 실시양태에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 많은 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져있다. 일부 실시양태에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시양태에 있어서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 코딩 서열을 운반하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 운반하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 프로토콜과 함께 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 포유동물 세포 (예컨대, 일차 인간 T 세포)를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 트랜스진의 장기적이고 안정적인 통합 및 자손 세포에서의 증식을 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 갖고, 증식하지 않는 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템 또는 피기백 트랜스포존 시스템이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 예를 들어, 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA) 및 폴리 락트산 (PLA), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 및 덴드리머를 포함하는 중합체-기반 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 양이온성-지질 기반 비-바이러스 벡터, 예컨대, 양이온성 리포솜, 지질 나노에멀젼 및 고체 지질 나노입자 (SLN)이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 펩티드-기반 유전자 비-바이러스 벡터, 예컨대, 폴리-L-리신이다. 게놈 편집에 적합한 알려진 비-바이러스 벡터 중 임의의 것은 Nef-코딩 핵산 및/또는 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))-코딩 핵산을 조작된 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)로 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Yin H. 등 Nature Rev. Genetics (2014) 15:521-555; Aronovich EL 등 "The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy." Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; 및 Zhao S. 등 "PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing." Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5(1): 120-125를 참고하며, 이는 본원에 참고로 원용된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산 중 어느 하나 이상은 전기천공법, 초음파천공법, 광천공법, 마그네토펙션(magnetofection), 하이드로포레이션(hydroporation)을 비제한적으로 포함하는 물리적 방법에 의해 조작된 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)에 도입된다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산 중 어느 하나를 포함한다. 핵산은 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 사용하는 것을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 알려진 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터로 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서 유전자 발현을 위해 다양한 프로모터가 탐색되었으며, 당업계에 알려진 프로모터 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예컨대, 유도성 프로모터로서 대략 카테고리화될 수 있다.
프로모터
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종유래 유전자 (트랜스진으로서 또한 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 허용한다. 본원에 고려되는 예시적인 프로모터는 거대세포바이러스 즉시-초기 프로모터 (CMV), 인간 연장 인자-1 알파 (hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터 (UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터 (PGK), 시미안 바이러스 40 초기 프로모터 (SV40), CMV 초기 인핸서와 커플링된 닭 β-액틴 프로모터 (CAGG), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 (MC1) 프로모터, 베타 액틴 (β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND)" 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 트랜스진 발현을 구동하는 이러한 구성적 프로모터의 효율은 수많은 연구에서 널리 비교되었다. 예를 들어, Michael C. Milone 등은 일차 인간 T 세포에서 CAR 발현을 구동하기 위한 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율을 비교하여, hEF1α 프로모터가 최고 수준의 트랜스진 발현을 유도할뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 내렸다 (Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산은 hEF1α 프로모터 또는 PGK 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1a 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터 거대세포바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터 (CMV), 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 프로모터 (PGK), 유비퀴틴-C 프로모터 (UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터 (CAG), 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 프로모터 (MC1), 베타 액틴 프로모터 (β-ACT), 시미안 바이러스 40 프로모터 (SV40), 및 골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND) 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 카테고리에 속한다. 유도성 프로모터는 하나 이상의 조건, 예컨대, 물리적 조건, 조작된 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)의 미세환경, 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리학적 상태, 인듀서 (즉, 유도제) 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 유도 조건은 조작된 포유동물 세포 및/또는 약학 조성물을 받는 대상체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 유도 조건은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 인듀서, 조사 (예컨대, 이온화 방사선, 광), 온도 (예컨대, 열), 산화환원 상태, 종양 환경 및 조작된 포유동물 세포의 활성화 상태. 일부 실시양태에 있어서, 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 또는 NFκB 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 또한 벡터 (예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 통해 형질주입된 숙주 세포 집단으로부터 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 발현하는 세포를 선택하기 위한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열이 측면에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유할 수 있다.
연결 서열
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 하나 초과의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))을 코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 여기서 제1 핵산은 연결 서열을 통해 제2 핵산에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)이다. IRES는 캡-독립적 방식으로 번역 개시를 허용하는 RNA 요소이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다 (예컨대, 핵산 서열이다). 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 서열번호 34의 핵산 서열을 포함하는 IRES이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 서열번호 35의 핵산 서열을 포함하는 PGK이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 P2A 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 T2A 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 아래의 "V. 기능적 외인성 수용체" 하에서 "펩티드 링커" 섹션에 기재된 바와 같은 펩티드 링커, 예컨대, 가요성 링커를 코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에 있어서, 가요성 연결 서열은 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다). 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 선택가능한 마커, 예컨대, LNGFR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 본원에 기재된 연결 서열의 하나 이상의 유형, 예컨대, 자가-절단 2A 펩티드 (예컨대, P2A)에 이어 Gly-Ser 가요성 링커 (예컨대, (GGGS)3) 또는 자가-절단 2A 펩티드 (예컨대, P2A)에 이어 선택가능한 마커 (예컨대, LNGFR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR을 하향-조정한다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절한다). 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포에서 발현시 Nef 단백질은 CD3ζ, CD4, CD28 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않거나 (예컨대, 발현을 하향-조절하지 않거나), CD3ζ, CD4, CD28 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다.
일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산 예컨대. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK), 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다). 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 프로모터 (예컨대, PGK), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 가요성 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되며, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 T 세포 항원 커플러 (TAC)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 제공한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α); 다음을 포함하는 기능적 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외), 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열); 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열); 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
III. 변형된 T 세포의 생산 방법
본 발명의 일 양태는 상기 기재된 변형된 T 세포 중 어느 하나를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 일반적으로 Nef (예컨대, 돌연변이 Nef)를 코딩하는 제2 핵산 및 임의로 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 천연 또는 조작된 T 세포 (본원에서 "전구체 T 세포"로서 지칭됨)에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되고, 면역계의 세포, 예컨대, 선천성 또는 적응성 면역의 세포이다. 일부 양태에서, 세포는 인간 세포이다.
일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 세포주, 예컨대, T 세포주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서 세포는 이종발생 공급원, 예를 들어, 마우스, 랫트, 비-인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8- 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 자연 살해 T (NKT) 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 조작된 T 세포, 예컨대, 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 중 임의의 것 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))이다. 일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 발현시 및 표적 세포, 예컨대, BCMA+ 종양 세포에 결합시 IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 실시양태에 있어서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 발현시 및 표적 세포에 결합시 항원-특이적 표적 세포를 용해한다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 줄기 세포, 예컨대, 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS 또는 배아 줄기 세포로부터 분화된다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 본원에 기재된 핵산 중 어느 하나 또는 벡터 중 어느 하나 (예컨대, 비-바이러스 벡터 및 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터)를 형질주입시킴으로써 T 세포에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 세포막에 단백질을 삽입하고 세포를 미세유체 시스템, 예컨대, CELL SQUEEZE®을 통과시킴으로써 T 세포에 도입된다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20140287509 참고).
벡터 (예컨대, 바이러스 벡터) 또는 단리된 핵산을 포유동물 세포에 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 본원에 기재된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 T 세포로 전달될 수 있다.
벡터 (예컨대, 바이러스 벡터)를 T 세포에 도입하는 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입 및 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York를 참고한다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터)는 전기천공법에 의해 세포에 도입된다.
벡터를 T 세포로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터는 포유동물, 예컨대, 인간 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
벡터 (예컨대, 바이러스 벡터)를 T 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 생체 외 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예컨대, 인공막 소포)이다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 임의의 것으로 코딩되는 RNA 분자는 통상적인 방법 (예컨대, 생체 외 전사)에 의해 제조될 수 있으며, 그런 다음 알려진 방법, 예컨대, mRNA 전기천공법을 통해 T 세포에 도입된다. 예컨대, Rabinovich 등, Human Gene Therapy 17:1027-1035를 참고한다.
일부 실시양태에 있어서, 형질도입되거나 형질주입된 T 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후 엑스 비보에서 증식된다. 일부 실시양태에 있어서, 형질도입되거나 형질주입된 T 세포는 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 12 일 또는 14 일 중 임의의 것 이상 동안 증식하도록 배양된다. 일부 실시양태에 있어서, 형질도입되거나 형질주입된 T 세포는 조작된 포유동물 세포를 선택하기 위해 추가로 평가되거나 스크리닝된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질주입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고, 쉽게 검출가능한 특성, 예컨대, 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예컨대, Ui-Tei 등 FEBS Letters 479: 79-82 (2000)). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며 알려진 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득할 수 있다.
Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 조작된 T 세포에서 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산의 존재를 확인하는 다른 방법은 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블롯, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대, 면역학적 방법 (예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯), 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자성-활성화 세포 분류 (MACS)에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다 (또한 실시예 섹션을 참고한다).
따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 방법. 일부 실시양태에 있어서, 전구체 T 세포는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 T 세포에 순차적으로 도입된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리 또는 농축시킨 다음, 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 T 세포에 동시에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 Nef 발현시 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다른 벡터 상에서 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되며, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산.
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터 (예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열)을 통해 연계된다.
따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 발현시 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ를 하향-조정하며, 예컨대, 내인성 TCR, MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 세포 표면 발현을 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형되지 않은 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌, 예컨대, TCRα 또는 TCRβ를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas, TALEN 및 ZFN으로부터 선택된 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 유전자좌는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체 (예컨대, HIV F2 Nef, HIVC2 Nef 및 HIV H2N2 Nef)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나, 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 야생형 Nef 단백질과 비교하여 변형된 T 세포에서 발현시 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 하향-조정 효과 (예컨대, 세포 표면 발현의 하향조절)를 감소시키며, 예컨대, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조정 효과를 감소시킨다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 발현시 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD3ζ, CD4, CD28, 및/또는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않거나 (예컨대, 발현을 하향조절하지 않거나), CD3ζ, CD4, CD28, 및/또는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다 (예컨대, 발현을 하향-조절한다).
일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 거대세포바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터 (CMV IE), 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터, 유비퀴틴-C (UBQ-C) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 (CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 (MC1) 프로모터, 베타 액틴 (β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND)" 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다.
일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 IRES이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A를 코딩하는 핵산 서열이다.
일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대, 에피솜 발현 벡터, 향상된 에피솜 벡터 (EEV), 피기백 트랜스포사제 벡터 또는 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR)이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 TAC, TAC-유사 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 비-TCR 수용체, 예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR)이다.
일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 CAR이다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 sdAb (예컨대, 항-BCMA sdAb) 또는 scFv이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 함께 연결된 2 개 이상의 sdAb를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 함께 연결된 2 개 이상의 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 리간드 또는 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하고, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 APRIL 또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체 (FcγR)이다. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 1가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 이중특이적) 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 2가) 및 다중특이적 (예컨대, 이중특이적)이다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19, CD20이다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, DAP12 또는 CD3γ로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포 외 리간드 결합 도메인 (예컨대, BCMA, APRIL/BAFF 리간드 또는 Fc 수용체의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb), CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인.
일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다; (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다.
일부 실시양태에 있어서, Nef (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)를 발현하는 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래되는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 GvHD 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3ε-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 TCRα-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포의 유효량, 또는 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 인간이다.
일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 CAR이다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리되거나 농축시킨 다음, CAR을 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 T 세포에 동시에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 다른 벡터 상의 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절한다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리 또는 농축시킨 다음, cTCR을 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 T 세포에 동시에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 다른 벡터 상의 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, cTCR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 cTCR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리 또는 농축시킨 다음, TAC를 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 T 세포에 동시에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 다른 벡터 상의 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다 (예컨대, 모두 CD4). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리 또는 농축시킨 다음, TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동시에 T 세포에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 다른 벡터 상의 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC-유사 키메라 수용체를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 T 세포, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열을 통해 연계된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 CAR이다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항- BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다: Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계, 이어서 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef-양성 및/또는 내인성 TCR/CD3ε-음성 변형된 T 세포를 단리 또는 농축시킨 다음, CAR을 코딩하는 제2 핵산을 농축된 변형된 T 세포에 도입한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동시에 T 세포에 도입된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 하나의 벡터 상에서 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 다른 벡터 상의 제2 핵산을 전구체 T 세포에 동시에 도입하는 단계: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열)을 통해 연계된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, 제1 연결 서열 IRES, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인, P2A를 코딩하는 제1 연결 서열, 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 함께 연결된 2 개 이상의 항-BCMA sdAb를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 1가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 이중특이적) 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 2가) 및 다중특이적 (예컨대, 이중특이적)이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되며, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열을 통해 연계된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하고 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, cTCR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 cTCR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되며, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되며, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열을 통해 연계된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터 (예컨대, EF1-α 및 PGK)에 작동가능하게 연결되고, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제1 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제2 프로모터 (예컨대, PGK) 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 제2 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 프로모터 (예컨대, PGK), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터 (예컨대, EF1-α)에 작동가능하게 연결되며, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열, 예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열을 통해 연계된다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열) 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨. 일부 실시양태에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지의 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다: 프로모터 (예컨대, EF1-α), 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨, 제1 연결 서열 (예컨대, IRES, 자가-절단 2A 펩티드, 예컨대, P2A 또는 T2A를 코딩하는 핵산 서열), 임의적인 제2 연결 서열 (예컨대, 가요성 링커, 예컨대, (GGGS)3 링커를 코딩하는 핵산 서열), 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC-유사 키메라 수용체를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포의 유효량, 또는 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 인간이다.
T 세포 공급원, 세포 제조 및 배양
T 세포 (예컨대, 전구체 T 세포)의 확장 및 유전적 변형 이전에, T 세포의 공급원은 개체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하는 많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술, 예컨대, FICOLL™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유닛으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 생산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 실시양태에 있어서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 실시양태에 있어서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 모두 2가 양이온이 아닌 경우 많은 것이 부족할 수 있다. 다시 말해, 놀랍게도, 칼슘이 부재한 초기 활성화 단계는 과장된 활성화를 야기한다. 당업자는 세척 단계가 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대, 제조사의 지침에 따라 반-자동화된 "유동형" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써 수행될 수 있음을 용이하게 인식할 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대, 예를 들어, Ca2+가 없는, Mg2+가 없는 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액을 포함하거나 포함하지 않는 다른 식염수에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 구성요소를 제거할 수 있고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 제대혈 은행, 말초 혈액 은행으로부터 제공되거나 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC), 다분화성 및 다능성 줄기 세포, 또는 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서 T 세포는 이종발생 공급원, 예를 들어, 마우스, 랫트, 비-인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 인간 세포이다. 일부 양태에 있어서, T 세포는 일차 세포, 예컨대, 대상체로부터 직접 단리되고/되거나 대상체로부터 단리되고 동결된 것들이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브세트, 예컨대, 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이들의 서브집단, 예컨대, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확장, 재순환, 국소화 및/또는 지속 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들을 포함한다. 치료할 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가유래일 수 있다. 일부 경우에 있어서, T 세포는 하나 이상의 의도된 수용자와 관련하여 동종이계이다. 일부 경우에 있어서, T 세포는 이식에 적합하며, 예컨대, 수용자에게 GvHD를 유도하지 않는다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브-타입 및 서브집단 중에는 나이브 T (TN) 세포, 효과기 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이의 서브-타입, 예컨대, 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중앙 기억 T (TCM), 효과기 기억 T (TEM) 또는 말기 분화 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-연관 불변 T (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용출에 의해 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특이적 서브집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합된 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와의 항온처리에 의해 원하는 T 세포의 양성 선택을 위한 충분한 기간 동안 단리된다. 일부 실시양태에 있어서, 기간은 약 30 분이다. 추가 실시양태에 있어서, 기간은 30 분 내지 36 시간 이상 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 실시양태에 있어서, 기간은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 시간 이상이다. 일부 실시양태에 있어서, 기간은 10 내지 24 시간이다. 일부 실시양태에 있어서, 항온처리 시간은 24 시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해, 더 긴 항온처리 시간, 예컨대, 24 시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 더 긴 항온처리 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 임의의 상황, 예컨대, 종양 조직 또는 면역-손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL) 단리하는 것에서 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 항온처리 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단축하거나 연장함으로써 및/또는 (본원에 추가로 기재된 바와 같이) T 세포에 대한 비드의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 서브집단은 배양 개시 또는 과정 동안의 다른 시점 동안 또는 이에 대해 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 서브집단은 배양 개시 또는 다른 원하는 시점 동안 또는 이에 대해 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 선택의 다중 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 활성화 및 확장 과정에서 선택 절차를 수행하고 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 선택의 추가 라운드의 대상이 될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지시된 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역접착 또는 유세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축시키거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시양태에 있어서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예컨대, 입자, 예컨대, 비드)의 농도는 달라질 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에 있어서, 20 억 개의 세포/mL의 농도가 사용된다. 일 실시양태에 있어서, 10 억 개의 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가 실시양태에 있어서, 1 억개 초과의 세포/mL가 사용된다. 추가 실시양태에 있어서, 1 천만, 1 천 5백만, 2 천만, 2 천 5 백만, 3 천만, 3 천 5 백만, 4 천만, 4 천 5 백만 또는 5 천만 개의 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에 있어서, 7 천 5 백만, 8 천만, 8 천 5 백만, 9 천만, 9 천 5 백만 또는 1 억 개의 세포/mL로부터의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에 있어서, 1 억 2 천 5 백만 또는 1 억 5 천만 개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하는 것은 일반적으로 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
일부 실시양태에 있어서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예컨대, 입자, 예컨대, 비드)의 혼합물을 유의하게 희석함으로써, 입자와 세포 간의 상호작용을 최소화한다. 이는 입자에 결합할 원하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 실시양태에 있어서, 사용된 세포의 농도는 5x106 개/mL이다. 일부 실시양태에 있어서, 사용된 농도는 약 1x105 개/mL 내지 1x106 개/mL, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 세포는 2-10 ℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 로테이터에서 항온처리될 수 있다.
자극을 위해 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구를 제거하고 세포 집단에서 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 알려져 있고 본 내용에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% Dextran 40 및 5% Dextrose, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% Dextrose 5%, 0.45% NaCl, 10% Dextran 40 및 5% Dextrose, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하며, 이어서 세포는 분당 1°의 속도로 -80 ℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다. -20 ℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결뿐만 아니라 제어된 동결의 다른 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고 활성화 전에 실온에서 1 시간 동안 그대로 있도록 허용된다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시기 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집술 생산물의 수집이 본 출원에서 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있으며, T 세포 요법, 예컨대, 본원에 기재된 것들로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 수의 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법의 나중의 사용을 위해 원하는 세포, 예컨대, T 세포를 단리하고 동결한다. 일 실시양태에 있어서 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 실시양태에 있어서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 질환이 발병할 위험이 있지만 아직 질환이 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되며, 관심 세포는 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 특정 실시양태에 있어서, T 세포는 확장되고, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 실시양태에 있어서, 세포는 약제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억압제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK206, 항체 또는 다른 면역절제제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 방사선조사를 사용한 치료를 비제한적으로 포함하는, 임의의 수의 관련 치료 양상 이전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도 시그널링에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)를 억제한다 (Liu 등, Cell 66:807-815, 1991; Henderson 등, Immun 73:316-321, 1991; Bierer 등, Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가 실시양태에 있어서, 세포는 환자를 위해 단리되고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 예컨대, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예컨대, 전에, 동시에 또는 이후에) 나중에 사용하기 위해 동결된다. 다른 실시양태에 있어서, B-세포 절제 요법, 예컨대, CD20과 반응하는 약제, 예컨대, 리툭산(Rituxan) 이후의 치료를 위해 세포는 이전에 단리되고, 나중에 사용하기 위해 동결될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 치료 직후 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 정상적으로 치료에서 회복되는 기간 동안 치료 직후, 수득된 T 세포의 품질이 최적이거나 엑스 비보에서 확장 능력이 개선될 수 있음을 관찰하였다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 엑스 비보 조종 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체 내 확장을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 이 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정 실시양태에 있어서, 가동화 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 가동화) 및 컨디셔닝 양생법은 특정 세포 유형의 재집단, 재순환, 재생 및/또는 확장이 특히 치료 후 정의된 시간 윈도우 동안에 선호되는 대상체의 병태를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 기타 면역계 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
일부 실시양태에 있어서, 세포는 유전자 조작 이전에 또는 이와 연계하여 항온처리 및/또는 배양된다. 항온처리 단계는 배양, 재배, 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 항온처리된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고/하거나, 항원 노출을 모방하고/하거나, 유전자 조작, 예컨대, 유전자 조작된 항원 수용체의 도입을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것들을 포함한다. 조건은 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 약제, 예컨대, 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화하도록 설계된 기타 약제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
Nef (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, 또는 ACTR))를 포함하는 T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에 관계없이, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개공보 번호 20060121005에 기재된 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 약제 및 T 세포 표면의 공동-자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 예컨대, 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예컨대, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자를 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함하며, 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법으로 사용될 수 있다 (Berg 등, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 등, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 등, J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 (예컨대, 생성된 세포 집단이 확장될 개시 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 개 이상의 PBMC 영양 세포를 함유하도록) 배양-개시 조성물 영양 세포, 예컨대, 비-분열 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 첨가함으로써; 및 (예컨대, T 세포의 수를 확장하기에 충분한 시간 동안) 배양물을 항온처리함으로써 확장된다. 일부 양태에 있어서, 비-분열 영양 세포는 감마-조사된 PBMC 영양 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, PBMC는 세포 분열을 예방하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 양태에 있어서, 영양 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포에 대한 일차 자극성 신호 및 공동-자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 약제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 약제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형성) 또는 별개의 표면 (즉, "트랜스" 형성)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 약제는 표면 및 용액 중 다른 약제에 커플링될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, 공동-자극성 신호를 제공하는 약제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 약제는 용액 중에 있거나 표면에 커플링된다. 특정 실시양태에 있어서, 약제 둘 모두는 용액 중에 있을 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 약제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서 표면, 예컨대, Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 약제에 결합할 것인 다른 결합제에 가교될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포의 활성화 및 확장에 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대하여 예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20040101519 및 20060034810을 참고한다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포는 약제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포는 후속적으로 분리된 다음, 세포가 배양된다. 대안적인 실시양태에 있어서, 배양 전에, 약제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가 실시양태에 있어서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대, 자성력의 인가에 의해 집중되어 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 유발하여, 세포 자극을 유도한다.
예로서, 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포와 접촉하도록 허용함으로써 세포 표면 단백질을 결찰시킬 수 있다. 일 실시양태에 있어서 세포 (예를 들어, 104 내지 109 개의 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비율의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 바람직하게는 PBS (2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)에서 조합된다. 다시 말해, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 드물고 샘플의 0.01% 만 포함할 수 있거나 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 번호는 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도 증가를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에 있어서, 약 20 억 개의 세포/mL의 농도가 사용된다. 다른 실시양태에 있어서, 1 억개 초과의 세포/mL가 사용된다. 추가 실시양태에 있어서, 1 천만, 1 천 5 백만, 2 천만, 2 천 5 백만, 3 천만, 3 천 5 백만, 4 천만, 4 천 5 백만 또는 5 천만 개의 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에 있어서, 7 천 5 백만, 8 천만, 8 천 5 백만, 9 천만, 9천 5 백만 또는 1 억 개의 세포/mL로부터의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시양태에 있어서, 1 억 2 천 5 백만 또는 1 억 5 천만 개의 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 야기할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대, CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고 특정 실시양태에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하는 것은 일반적으로 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
일부 실시양태에 있어서, 혼합물은 수 시간 (약 3 시간) 내지 약 14 일 동안 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 혼합물은 21 일 동안 배양될 수 있다. 발명의 일 실시양태에 있어서 비드 및 T 세포는 약 8 일 동안 함께 배양된다. 다른 실시양태에 있어서, 비드 및 T 세포는 2-3 일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60 일 이상이 될 수 있도록 여러 주기의 자극이 또한 요구될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 알려진 세포 성장을 위한 기타 첨가제를 포함하여 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-Vivo 15 (Lonza))를 포함한다. 세포 성장을 위한 기타 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하나. 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 옵티마이저를 포함하며, 아미노산, 소듐 피루베이트 및 비타민이 첨가되며, 헐청이 없거나 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체에 주입될 세포 배양물이 아닌 실험 배양물에만 포함된다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 대기 (예컨대, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 다른 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집술 말초 혈액 단핵 세포 생산물은 세포독성 또는 억압인자 T 세포 집단 (TC, CD8)보다 더 많은 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 가진다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 엑스 비보 확장은 약 8-9 일 이전에는 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포 집단을 생산하는 반면, 약 8-9 일 후에는 T 세포 집단이 점점 더 많은 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리된 경우 이 서브세트를 더 큰 정도로 확장하는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형 마커는 유의하게 달라지지만, 대부분 세포 확장 과정의 진행 동안 재현가능하게 달라진다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T 세포 생산물을 특이적 목적에 맞게 맞출 수 있는 능력을 가능하게 한다.
일부 실시양태에 있어서, 방법은 변형된 세포 또는 조작될 세포의 표면 상의 하나 이상의 마커의 발현을 사정하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에 있어서, 방법은 예를 들어, 친화도-기반 검출 방법, 예컨대, 유세포분석에 의해 TCR 또는 CD3ε의 표면 발현을 사정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에 있어서, 방법이 항원 또는 다른 마커의 표면 발현을 나타내는 경우, 항원 또는 다른 마커를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 파괴되거나 그렇지 않으면 발현이 저해된다.
내인성 유전자좌의 유전자-편집
일부 실시양태에 있어서, T 세포의 내인성 유전자좌, 예컨대, 내인성 TCR 유전자좌 (예컨대, TCRα, TCRβ)는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체, 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))을 발현하도록 T 세포를 변형하기 전에 또는 이와 동시에 유전자-편집 방법에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 유전자좌의 변형은 유전자의 파괴, 예컨대, 녹-아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임이동 돌연변이, 예컨대, 이중대립유전자 프레임이동 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 예컨대, 하나 이상의 엑손 또는 이의 일부 및/또는 녹-익을 가져옴으로써 수행된다. 일부 실시양태에 있어서, 이러한 유전자좌 변형은 DNA-표적화 분자, 예컨대, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산, 또는 이를 함유하는 복합체, 화합물 또는 조성물을 사용하여 수행되며, 이는 유전자에 특이적으로 결합하거나 이에 혼성화한다. 일부 실시양태에 있어서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예컨대, 징크 핑거 단백질 (ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성화제-유사 단백질 (TAL) 또는 TAL 효과기 (TALE) DNA-결합 도메인, 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체 (CRISPR) DNA-결합 도메인 또는 메가뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 내인성 유전자좌 (예컨대, TCR)의 변형은 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (RGEN)를 통한 파괴, 또는 다른 RNA-가이드 효과기 분자에 의한 저해의 다른 형태로 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 저해는 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-연관 (Cas) 단백질을 사용하여 수행된다. Sander 및 Joung, Nature Biotechnology, 32 (4): 347-355를 참고한다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예컨대, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복체" 및 tracrRNA-처리된 부분적 직접 반복체를 포괄함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 또한 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는 CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 것에 관여하는 전사체 및 기타 요소를 총괄적으로 지칭한다.
일부 실시양태에 있어서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열-특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자 (가이드) RNA, 및 뉴클레아제 기능성 (예컨대, 2 개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9)을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 유형 I, 유형 II 또는 유형 III CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예컨대, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 유래된다.
일부 실시양태에 있어서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합 포함)가 세포에 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에 있는 표적 부위는 상보적인 염기 쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예컨대, 유전자로 표적화한다. 일부 실시양태에 있어서, 표적 부위는 프로토 스페이서 근접 모티프 (PAM) 서열, 예컨대, 전형적으로 NGG 또는 NAG의 바로 5' 위치에 기반하여 선택된다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20 개 뉴클레오티드를 변형함으로써 원하는 서열에 표적화된다. 일부 실시양태에 있어서, gRNA는 서열번호 23의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, CRISPR 시스템은 표적 부위에서 DSB를 유도한다. 다른 실시양태에 있어서, "닉카제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹하기 위해 사용된다. 일부 양태에 있어서, 쌍을 이룬 닉카제는 예컨대, 특이성을 개선하기 위해 사용되며, 각각은 동시에 닉의 도입시, 5' 오버행이 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 실시양태에 있어서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 이종유래 효과기 도메인, 예컨대, 전사 저해자 또는 활성인자에 융합된다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포의 내인성 유전자좌 (예컨대, 내인성 TCR)는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 발현하도록 T 세포를 변형시키기 전에 CRISPR/Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포의 내인성 유전자좌 (예컨대, 내인성 TCR)는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 것과 동시에 CRISPR/Cas 시스템에 의해 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, CRISPR/Cas 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산(들)은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, CRISPR/Cas 시스템을 코딩하는 핵산(들) 및 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 핵산(들)은 상이한 벡터 상에 있다.
변형된 T 세포의 단리 및 농축
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3ε/γ/δ-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 TCRα/β-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD4+ 및/또는 CD28+ T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포의 단리 또는 농축은 본원에 기재된 방법의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 단리 방법은 하나 이상의 특이적 분자, 예컨대, 표면 마커, 예컨대, 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산의 세포에서의 부재 또는 존재에 기반하여 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 선택 마커는 Nef (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef), 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)), CD4, CD28, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD69, TCRα, TCRβ 또는 MHC이다. 일부 실시양태에 있어서, 이러한 마커에 기반한 임의의 알려진 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 분리는 친화도- 또는 면역친화도-기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양태에서 단리는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기반하여, 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 항온처리에 이어서, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 분리에 의한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함한다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 보유되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 보유되는 음성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두는 추가 사용을 위해 보유된다. 일부 양태에 있어서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있으므로, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커를 기반으로 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요가 없다. 예를 들어, 특정 유형의 세포, 예컨대, 마커를 발현하는 것들의 양성 선택 또는 이에 대한 농축은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 특정 유형의 세포, 예컨대, 마커를 발현하는 것들의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하지만, 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 예에서, 다중 라운드의 분리 단계가 수행되며, 여기서 한 단계로부터의 양성 또는 음성으로 선택된 분획은 다른 분리 단계, 예컨대, 후속 양성 또는 음성 선택을 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대, 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온처리함으로써 동시에 다중 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다중 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온처리함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에 있어서, T 세포의 특이적인 서브집단, 예컨대, 양성 또는 하나 이상의 표면 마커의 높은 수준을 발현하는 세포, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합 자성 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 세포 확장기)를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 실시양태에 있어서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성으로 선택된 세포에서 상대적으로 더 높은 수준 (마커고)으로 발현 또는 발현된 (마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 항온처리함으로써 달성된다.
일부 양태에 있어서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 작은, 자화가능한 또는 자성 반응 물질, 예컨대, 자성 반응 입자 또는 마이크로입자, 예컨대, 상자성 비드 (예컨대, Dynalbead 또는 MACS 비드)와 함께 항온처리된다. 자성 반응 물질, 예컨대, 입자는 일반적으로 분리하는 것이 바람직한, 예컨대, 음성 또는 양성으로 선택하는 것이 바람직한 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하는 분자, 예컨대, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예컨대, 항체에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 실시양태에 있어서, 자성 입자 또는 비드는 특이적 결합 구성원, 예컨대, 항체 또는 다른 결합 파트너에 결합된 자성 반응 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용되는 잘-알려진 자성 반응 물질이 많이 있다. 적합한 자성 입자는 본원에 참고로 원용되는 Molday, 미국 특허 번호 4,452,773 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기재된 것들을 포함한다. 콜로이드 크기 입자, 예컨대, Owen 미국 특허 번호 4,795,698, 및 Liberti 등, 미국 특허 번호 5,200,084에 기재된 것들은 다른 예이다.
항온처리는 일반적으로 항체 또는 결합 파트너, 또는 자성 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대, 이차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포에 존재하는 경우 세표 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일부 실시양태에 있어서, 샘플은 자기장에 배치되고, 자성 반응 입자 또는 자화가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려 표지되지 않은 세포로부터 분리된다. 양성 선택의 경우, 자석에 끌리는 세포는 보유되며; 음성 선택의 경우, 끌리지 않는 세포 (표지되지 않은 세포)는 보유된다. 일부 양태에 있어서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 보유되고 추가로 처리되거나 추가 분리 단계를 거친다.
특정 실시양태에 있어서, 자성 반응 입자는 일차 항체 또는 다른 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙트아비딘으로 코팅된다. 특정 실시양태에 있어서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 일차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 실시양태에 있어서, 비드가 아닌 세포는 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 다음, 세포-유형 특이적 이차 항체- 또는 다른 결합 파트너 (예컨대, 스트렙트아비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 실시양태에 있어서, 스트렙트아비딘-코팅된 자성 입자는 비오틴화된 일차 또는 이차 항체와 함께 사용된다.
일부 실시양태에 있어서, 자성 반응 입자는 후속적으로 항온처리, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 남아 있고; 일부 양태에서, 입자는 환자에 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남아 있다. 일부 실시양태에 있어서, 자화가능한 또는 자성 반응 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화가능한 입자를 제거하는 방법은 알려져 있으며, 예컨대, 경쟁하는 비-표지 항체, 자화가능한 입자 또는 절단가능한 링커에 접합된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 자화가능한 입자는 생분해성이다.
일부 실시양태에 있어서, 친화도-기반 선택은 자성-활성화 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.)를 통해 이루어진다. 자성 활성화 세포 분류 (MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착된 세포의 고-순도 선택을 가능하게 한다. 특정 실시양태에 있어서, MACS는 외부 자기장의 인가 후에 비-표적 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 모드에서 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종이 용리되는 동안 제자리에 고정된다. 그런 다음, 이 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 갇혀 용리되는 것이 예방된 종은 용리 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로든 해방된다. 특정 실시양태에 있어서, 비-표적 세포는 표지되고 이종 세포 집단으로부터 고갈된다.
특정 실시양태에 있어서, 단리 또는 분리는 단리, 세포 제조, 분리, 처리, 항온처리, 배양 및/또는 단계의 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 양태에 있어서, 시스템은 예를 들어, 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 이러한 단계 각각을 수행하는 데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 국제 특허 출원, 공개공보 번호 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기재된 시스템이다.
일부 실시양태에 있어서, 시스템 또는 장치는 통합된 시스템 또는 자체-함유된 시스템에서 및/또는 자동화 또는 프로그래밍가능한 방식으로 단리, 처리, 조작 및 제형 단계 중 하나 이상, 예컨대, 모두를 수행한다. 일부 양태에 있어서, 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함하며, 이는 사용자가 처리, 단리, 조작 및 제형화 단계의 결과를 프로그래밍, 제어, 사정 및/또는 이의 다양한 양태를 조정하도록 허용한다.
일부 양태에 있어서, 분리 및/또는 다른 단계는 예를 들어, 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상-규모 수준에서 세포의 자동 분리를 위해 CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성요소는 통합된 마이크로컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브를 포함할 수 있다. 일부 양태에서의 통합된 컴퓨터는 기기의 모든 구성요소를 제어하고 시스템이 표준화된 순서로 반복되는 절차를 수행하도록 지시한다. 일부 양태에서의 자성 분리 유닛은 이동가능한 영구 자석 및 선택 컬럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜브 세트 전체의 유량을 제어하고, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 버퍼의 제어된 흐름 및 세포의 계속적인 현탁액을 보장한다.
일부 양태에서의 CliniMACS 시스템은 멸균, 비-발열성 용액 중 공급되는 항체-커플링된 자화가능한 입자를 사용한다. 일부 실시양태에 있어서, 자성 입자로 세포를 표지한 후 세포를 세척하여 과잉 입자를 제거한다. 그런 다음, 세포 제조 백을 튜브 세트에 연계하고, 이를 버퍼 및 세포 수집 백을 함유하는 백에 차례로 연계한다. 튜브 세트는 사전-컬럼 및 분리 컬럼을 포함하여 사전-조립된 멸균 튜브로 이루어지며, 일회용이다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동으로 세포 샘플을 분리 컬럼에 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 보유되는 반면, 표지되지 않은 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 컬럼에 보유되지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 컬럼에 보유된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 컬럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 실시양태에 있어서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 일부 양태에서의 CliniMACS Prodigy 시스템에는 원심분리에 의한 세포의 자동 세척 및 분별을 허용하는 세포 처리 유니티가 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 공급원 세포 생산물의 거시적 층을 파악함으로써 최적의 세포 분획 종점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 자동으로 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 분리된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 배양 프로토콜, 예컨대, 세포 분화 및 확장, 항원 로딩 및 장기 세포 배양을 수행하는 통합된 세포 재배 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 배지 보충을 허용할 수 있으며 통합된 현미경을 사용하여 세포를 모니터링할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 세포 집단은 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포가 유체 스트림으로 운반되는 유세포분석을 통해 수집 및 농축 (또는 고갈)된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 세포 집단은 분취 규모 (FACS)-분류를 통해 수집 및 농축 (또는 고갈)된다. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 미세전자기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 농축 (또는 고갈)된다 (예컨대, WO 2010/033140, Cho 등 (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin 등 (2008) J Biophoton. 1 (5):355-376 참고. 둘 모두의 경우에서, 세포는 다중 마커로 표지되어 고순도에서 잘-정의된 T 세포 서브세트의 단리를 허용할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게하기 위해, 하나 이상의 검출가능한 마커로 표지된다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기반한 세포의 분리는 예컨대, 유세포-분석 검출 시스템과 조합하여, 분취 규모 (FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템 (MEMS) 칩을 포함하는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 유체 스트림에서 수행된다. 이러한 방법은 동시에 다중 마커에 기반한 양성 및 음성 선택을 허용한다.
또한 단리 및 농축 방법에 대해 "실시예" 섹션을 참고한다.
IV. Nef 단백질
본원에 기재된 방법은 Nef 단백질의 발현을 포함한다. 또한 본원에 기재된 변형된 T 세포를 제조하는 데 특히 유용한 비-자연 발생 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 제공한다.
야생형 Nef (음성 조절 인자)는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1 및 HIV-2) 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함하는 영장류 렌티바이러스에 의해 코딩된 작은 27-35 kDa 미리스토일화된 단백질이다. Nef는 주로 세포질에 국한되지만 또한 부분적으로 플라즈마 막 (PM)에 동원된다. 이는 또한 숙주의 세포 기작을 조종하여 병원균의 감염, 생존 또는 복제를 허용할 수 있는 독성 인자로서 기능을 한다.
Nef는 모든 영장류 렌티바이러스에서 고도로 보존된다. HIV-2 및 SIV Nef 단백질은 HIV-1 Nef보다 더 긴 10-60 개의 아미노산이다. N-말단에서 C-말단까지, Nef 단백질은 다음 도메인을 포함한다: 미리스토일화 부위 (CD4 하향조절, MHC I 하향조절에 관여됨, 및 Nef 및 비리온 혼입의 내부 플라즈마 막 표적화 및 이에 따른 감염성에 필요한 시그널링 분자와의 연관성), N-말단 α-나선 (MHC I 하향조절 및 단백질 키나제 동원에 관여됨), 티로신-기반 AP 동원 (HIV-2/SIV Nef), CD4 결합 부위 (WL 잔기, CD4 하향조절에 관여됨, HIV-1 Nef에 대해 특성화됨), 산성 클러스터 (MHC I 하향조절, 숙주 PACS1 및 PACS2와의 상호작용에 관여됨), 프롤린-기반 반복체 (MHC I 하향조절 및 SH3 결합에 관여됨), PAK (p21 활성화된 키나제) 결합 도메인 (시그널링 분자와의 연관성 및 CD4 하향조절에 관여됨), COP I 동원 도메인 (CD4 하향조절에 관여됨), 디-류신 기반 AP 동원 도메인 (CD4 하향조절에 관련됨, HIV-1 Nef), V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인 (CD4 하향조절에 관여됨 및 시그널링 분자와의 연관성).
CD4는 55 kDa의 I 형 통합 세포 표면 당단백질이다. 이는 MHC 부류 II-제한 세포, 예컨대, 헬퍼/인듀서 T-림프구 및 대식세포/단핵구 계통의 세포 상의 T 세포 수용체의 구성요소이다. 이는 HIV 및 SIV의 주요 세포 수용체로서 역할을 한다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 일차 HIV-1 서브타입 C 인디언 단리물로부터 수득되거나 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 전장 단백질 (HIV F2-Nef)을 코딩하는 인디언 단리물의 F2 대립 유전자로부터 발현된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체 및 PAK 결합 도메인 (HIV C2-Nef)의 인-프레임 결실을 갖는 인디언 단리물인 C2 대립 유전자로부터 발현된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위 (HIV D2-Nef)의 인-프레임 결실을 갖는 인디언 단리물인 D2 대립 유전자로부터 발현된다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이 Nef, 예컨대, Nef 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 본 출원은 비-자연 발생 돌연변이 Nef 단백질, 예컨대, T 세포에서 발현될 때 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 또는 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체))를 하향조절하지 않는 비-자연 발생 돌연변이 Nef 단백질을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 야생형 Nef와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 비-자연 발생 돌연변이 Nef 단백질을 제공하며, 여기서 비-자연 발생 돌연변이 Nef는 T 세포에서 발현될 때 야생형 Nef와 비교하여 외인성 수용체를 전혀 또는 덜 하향조절하지 않는다. Nef 단백질은 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 모티프에서 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 디-류신 기반 AP 동원 도메인에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 디-류신 기반 AP 동원 도메인 및 PAK 결합 도메인에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 디-류신 기반 AP 동원 도메인, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 디-류신 기반 AP 동원 도메인, COP I 동원 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 디-류신 기반 AP 동원 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 부분적 또는 전체 도메인을 결실하는 절두를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef 단백질은 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 전술한 도메인/모티프 중 임의의 것이 아닌 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 SIV Nef (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 중 임의의 것 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이시키는 것, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 중 임의의 것 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이시키는 것, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것) 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)에서 본원에 기재된 Nef 단백질 (야생형 또는 돌연변이, 예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)의 발현은 내인성 TCR을 하향-조정한다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR 하향-조정은 내인성 TCR, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현의 하향-조절, 및/또는 (예컨대, 필수 TCR 근위 기작, 예컨대, Lck 및 LAT의 플라즈마 막으로의 수송을 통제하는 소포 수송 경로를 조정하고/하거나 TCR 근위 시그널링 기작의 시-공간 협응에 필수적인 TCR-유도 액틴 리모델링 이벤트를 방해함으로써) TCR-매개 신호 전달, 예컨대, T 세포 활성화 또는 T 세포 증식을 방해하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 T 세포에서 내인성 TCR, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 TCR을 하향-조정하는 (예컨대, 발현을 하향-조절하는) 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-14 및 18-22 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향-조절하고, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)에서 본원에 기재된 Nef 단백질 (야생형 또는 돌연변이, 예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)의 발현은 내인성 CD3ζ 발현 또는 CD3ζ-매개 신호 전달을 변경하지 않거나, 내인성 CD3ζ 발현을 하향조절하고/하거나 CD3ζ-매개 신호 전달을 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-14 및 18-22 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. Nef 발현이 내인성 TCR을 하향-조정하는 반면 동일한 세포에 도입된 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체), 예컨대, 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체)의 신호 전달에 대한 영향을 거의 또는 전혀 이끌어내지 않기 때문에, CD3ζ-매개 신호 전달에 영향을 주지 않거나 최소한으로 영향을 미치는 Nef의 능력은 본 발명에서 중요하다. Nef 발현은 또한 동일한 세포에 도입된 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체), 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체)의 발현에 대한 영향을 거의 또는 전혀 이끌어내지 않는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)에서 본원에 기재된 Nef 단백질 (야생형 또는 돌연변이, 예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)의 발현은 동일한 T 세포에서 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체) 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체)를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포에서 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체) 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체)는 외인성 수용체가 Nef 발현없이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현되는 경우와 비교하여 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현이 하향-조절된다). 일부 실시양태에 있어서, 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체) 또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체)의 세포 표면 발현 및/또는 신호 전달은 변형된 T 세포가 본원에 기재된 Nef 단백질을 발현하는 경우 영향을 받지 않거나, 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조절된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-14 및 18-22 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)에서 본원에 기재된 Nef 단백질 (야생형 또는 돌연변이, 예컨대, 비-자연 발생 돌연변이)의 발현은 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28을 하향-조정하며, 예컨대, 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 (예컨대, 내포작용 및 분해를 통해) 하향조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질을 발현하는 T 세포에서의 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절된다.
일부 실시양태에 있어서, T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포)에서 (예컨대, CD4 또는 CD28 하향조절에 관여하는 돌연변이된 도메인/모티프를 갖는) 본원에 기재된 돌연변이 (예컨대, 비-자연 발생 돌연변이) Nef 단백질의 발현은 내인성 TCR (및/또는 MHC I)을 하향-조정하면서, 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현되는 경우와 비교하여 내인성 CD4 또는 CD28에 대한 감소된 하향-조정 효과 (약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적은 하향-조정)를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 내인성 CD4/CD28에 대한 하향-조정 효과는 CD4/CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 내인성 CD4를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 내인성 CD28을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 내인성 CD4 (및/또는 CD28)의 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현되는 경우와 비교하여, 돌연변이 Nef가 T 세포에서 발현되는 경우 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 감소된다. 일부 실시양태에 있어서, T 세포에서 돌연변이 Nef의 발현은 내인성 TCR (및/또는 MHC I)의 세포 표면 발현을 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 것과 비교하여 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절하는 반면, 내인성 CD4 (및/또는 CD28)의 세포 표면 발현의 하향-조절은 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현되는 경우와 비교하여 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 감소된다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하 (예컨대, 약 2% 또는 1% 중 임의의 것 이하)로 하향-조절하거나 (또는 내인성 TCR (예컨대, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (3%와 동등 포함; 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 더 많이 하향-조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 (예컨대, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상) 적게 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef 단백질은 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 더 적은 CD4 및/또는 CD28 하향-조절 효과를 갖는 돌연변이 Nef는 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다.
일부 실시양태에 있어서, 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 전술한 도메인/모티프 중 임의의 것 내에 있지 않은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 다음 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질을 제공한다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질을 제공한다.
또한 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 (예컨대, 단리된 핵산)을 제공한다. 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터, 박테리아 발현 벡터)를 추가로 제공한다. 이들 벡터는 본원에 기재된 벡터 중 임의의 것에 배치될 수 있다.
V. 기능적 외인성 수용체
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 추가로 발현한다. 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 핵산은 이전에 전구체 T 세포에 존재할 수 있거나 Nef 단백질을 코딩하는 핵산과 함께 (예컨대, 동시에) 전구체 T 세포에 도입될 수 있다. 기능적 외인성 수용체는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA)을 함께 특이적으로 인식하는 야생형 TCR로부터 유래된 Vα 및 Vβ를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 조작된 TCR, 예컨대, 전통적인 조작된 TCR (예컨대, BCMA 또는 BCMA/MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 조작된 TCR, "항-BCMA TCR"로서 지칭됨)이며, 여기서 Vα, Vβ 또는 둘 모두는 야생형 TCR에 관하여 하나 이상의 CDR에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 전통적인 조작된 TCR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "전통적인 TCR-T"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이며; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 키메라 TCR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "cTCR-T"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-프리셉터 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 막관통을 포함하는 막관통; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다 (예컨대, 모두 CD4). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD8 (예컨대, CD8α) 또는 CD28). TAC를 발현하는 T 세포는 본원에서 "TAC-T"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다 (예컨대, CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 (예컨대, CD3ε) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε); 여기서, 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 둘 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 둘 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1 (예컨대, TCRα) 및 제2 (예컨대, CD3ε) TCR 서브유닛은 상이하다. TAC-유사 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 본원에서 "TAC-유사-T"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체는 비-TCR 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 비-TCR 수용체는 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다: (a) 항원 (예컨대, 본원에 기재된 항원 중 임의의 것, 예컨대, BCMA, CD20, CD19)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, 수용체 도메인 또는 항체-기반 결합 도메인, 예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR (이하 "항-항원 CAR" 또는 "항체-기반 CAR", 예컨대, "항-BCMA CAR"로서 지칭됨)의 세포 외 리간드 결합 도메인은 항원-결합 단편, 예컨대, sdAb (예컨대, 항-BCMA sdAb) 또는 scFv (예컨대, 항-CD20 scFv, 항-CD19 scFv)를 포함하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR (이하 "리간드/수용체-기반 CAR"로서 또한 지칭됨)의 세포 외 리간드 결합 도메인은 리간드 또는 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 APRIL 또는 BAFF (BCMA의 리간드)로부터 유래된다. CAR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "CAR-T"로서 지칭된다. APRIL 또는 BAFF를 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR은 이하 "BCMA-리간드 CAR"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체 (예컨대, FcγR)의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. Fc 결합 도메인 (예컨대, FcγR)을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR은 또한 이하 "항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)"로서 지칭된다. ACTR을 발현하는 T 세포는 본원에서 "ACTR-T"로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc-함유 단백질이 ACTR-T 세포에 투여되거나 ACTR-T 세포에서 공동-발현되는 경우, Fc-함유 단백질은 본원에 기재된 항원에 대한 ACTR-발현 T 세포의 결합 특이성을 부여한다. 일부 실시양태에 있어서, Fc-함유 단백질은 Fc-함유 항체 (예컨대, 전장 항체, 예컨대, 항-BCMA 전장 항체) 또는 Fc-융합 단백질, 예컨대, 항원-결합 단편-Fc 융합 단백질 (예컨대, 항-BCMA sdAb-Fc 융합 단백질, 또는 항-BCMA HCAb), Fc-수용체/리간드 융합 단백질 (예컨대, APRIL-Fc 융합 단백질), 면역글로불린 G (IgG)의 Fc 영역에 융합된 TCR의 가변 영역을 포함하는 Fc-융합 단백질 ("TCR-Fc 융합 단백질", 예컨대, 항-BCMA TCR-Fc 융합 단백질)이다. ACTR/Fc-함유 단백질 시스템은 이하 "항-항원 ACTR", 예컨대, "항-BCMA ACTR"로서 지칭된다.
또한 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체, 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 (예컨대, 단리된 핵산)을 제공한다. 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터)를 추가로 제공한다.
항원
본원에 기재된 기능적 외인성 수용체의 세포 외 리간드 결합 도메인 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 표적 세포 상의 임의의 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 세포 표면 분자이다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 특별한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용한다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단일 종양 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단일 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 2 개 이상의 종양 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 B 세포 악성도, 예컨대, B 세포 림프종 또는 다발성 골수종 (MM)과 연관된다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응에 대한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 많은 단백질을 발현한다. 세포 외 리간드 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 항원은 단일 질환 세포 상의 항원 또는 각각 질환에 기여하는 상이한 세포 상에 발현되는 항원일 수 있다. 세포 외 리간드 결합 도메인에 의해 특이적으로 인식되는 항원은 질환에 직접적으로 또는 간접적으로 관여될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 발명의 표적 항원의 선택은 치료할 암의 특정 유형에 따라 달라질 것이다. 예시적인 종양 항원은 예를 들어, 신경교종-연관 항원, BCMA (B-세포 성숙 항원), 암성배아성 항원 (CEA), β-인간 융모성 생식선자극호르몬, 알파태아단백질 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2 (AS), 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체, 및 메조텔린을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원 성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 많은 단백질을 발현한다. 이러한 분자는 조직-특이적 항원, 예컨대, 흑색종의 MART-1, 티로시나제 및 gp100, 및 전립선 암의 전립선 산 포스파타제 (PAP) 및 전립선-특이적 항원 (PSA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환-관련 분자 그룹, 예컨대, 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2에 속한다. 또 다른 표적 항원 그룹은 종양성-태아 항원, 예컨대, 암성배아성 항원 (CEA)이다. B-세포 림프종에서 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B-세포 분화 항원, 예컨대, CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-연관 항원 (TAA)이다. TSA는 종양 세포에 고유하며 신체의 다른 세포에서 발생하지 않는다. TAA 연관된 항원은 종양 세포에 고유하지 않으며, 대신 항원에 대한 면역학적 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서 또한 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 태아 발달 동안에, 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없는 경우 정상 세포 상에 발현되는 항원일 수 있거나, 이들은 정상 세포 상에 일반적으로 극히 낮은 수준으로 존재하나 종양 세포 상에 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 분화 항원, 예컨대, MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다중계통 항원, 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아성 항원, 예컨대, CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억압인자 유전자, 예컨대, p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전좌로 인한 고유한 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰, 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결합 단백질\사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 B 세포 상에 발현된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
일부 실시양태에 있어서, 항원은 병원균 항원, 예컨대, 진균, 바이러스 또는 박테리아 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 진균 항원은 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 칸디다(Candida)로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 바이러스 항원은 단순 포진 바이러스 (HSV), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 메타뉴모바이러스 (hMPV), 리노바이러스, 파라인플루엔자 (PIV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 거대세포바이러스 (CMV), JC 바이러스 (존 커닝햄 바이러스), BK 바이러스, HIV, 지카 바이러스, 인간 코로나바이러스, 노로바이러스, 뇌염 바이러스 또는 에볼라로부터 유래된다.
일부 실시양태에 있어서, 세포 표면 항원은 리간드 또는 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 리간드 또는 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 리간드 또는 수용체는 본원에 기재된 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 BCMA에 결합할 수 있는 APRIL 또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체 (FcγR)이다. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 다음을 포함하는 CAR을 추가로 발현한다: (a) 항원 (예컨대, 본원에 기재된 항원 중 임의의 것, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 4-쇄 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타류 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 sdAb (예컨대, 항-BCMA sdAb)이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 함께 연결된 2 개 이상의 sdAb를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 scFv (예컨대, 항-CD19 scFv, 항-CD20 scFv 또는 CD19xCD20 이중특이적 scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 비-항체 결합 단백질, 예컨대, 폴리펩티드 리간드 또는 항원에 결합하는 조작된 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 리간드 또는 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하며, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 BCMA에 결합할 수 있는 APRIL 또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체 (FcγR)이다. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 1가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 이중특이적) 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가 (예컨대, 2가) 및 다중특이적 (예컨대, 이중특이적)이다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 DAP12, CD3ζ 또는 CD3γ로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 세포 외 리간드 결합 도메인 (예컨대, BCMA, APRIL/BAFF 리간드, 또는 Fc 수용체의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb), CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인, 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 "항-BCMA CAR"이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, 제1 항-BCMA sdAb 및 제2 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 항-BCMA sdAb 및 제2 항-BCMA sdAb는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 항-BCMA sdAb 및 제2 항-BCMA sdAb는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 항-BCMA sdAb 및 제2 항-BCMA sdAb는 동일한 BCMA 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 항-BCMA sdAb 및 제2 항-BCMA sdAb는 상이한 BCMA 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-BCMA CAR은 서열번호 59-61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 항-CD19 CAR이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD19 CAR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 항-CD19 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD19 CAR은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 항-CD20 CAR이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 CAR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 항-CD20 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 scFv는 항-CD20 항체, 예컨대, 리툭시맙 (예컨대, Rituxan®, MabThera®) 또는 Leu-16으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 CAR은 서열번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 항-CD19/항-CD20 이중특이적 CAR (본원에서 CD19xCD20 CAR로서 또한 지칭됨)이다. 일부 실시양태에 있어서, CD19xCD20 CAR의 세포 외 리간드 결합 도메인은 항-CD20 scFv 및/또는 항-CD19 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CD19xCD20 CAR은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 "BCMA-리간드 CAR"이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, APRIL 또는 BAFF로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 APRIL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 BAFF 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 APRIL 도메인 및 BAFF 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR은 항체 커플링된 TCR (ACTR)이다. ACTR을 보유하는 조작된 T 세포는 Fc-함유 단백질 (예컨대, 단일클론 항체, 예컨대, 항-BCMA 항체)에 결합하여 종양 세포에 대한 브릿지로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α 신호 펩티드, Fc 결합 도메인 (예컨대, Fc 수용체, 예컨대, FcγR)을 포함하는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PCT/CN2017/096938 및 PCT/CN2016/094408 (이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 원용됨)에 기재된 CAR을 포함하여 당업계에 공지되거나 본 발명자들에 의해 개발된 임의의 CAR을 사용하여 본원에 기재된 CAR을 작제할 수 있다. CAR의 예시적인 구조는 PCT/CN2017/096938의 도 15a-15d에 도시된다.
다가 및/또는 다중특이적 CAR
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 다가 CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 본원에 기재된 항원 중 임의의 것을 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 단일-도메인 항체 (예컨대, 항-BCMA sdAb, BCMA VHH)를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 낙타류 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 4-쇄 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 scFv (예컨대, 항-CD20 scFv, 항-CD19 scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 인간 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 중 하나 이상은 폴리펩티드 리간드 또는 항원에 특이적으로 결합하는 다른 비-항체 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에 있어서, 다가 CAR은 단일특이적이고, 즉, 다가 CAR은 단일 항원을 표적화하고 단일 항원에 대한 2 개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 다가 CAR은 다중특이적이고, 즉, 다가 CAR은 하나 초과의 항원을 표적화하고, 다가 CAR은 하나 이상의 항원에 대한 2 개 이상의 결합 부위를 포함한다. 동일한 항원에 특이적인 결합 모이어티는 항원의 동일한 에피토프 (즉, "모노-에피토프 CAR")에 결합하거나 항원의 상이한 에피토프 (즉, "다중-에피토프 CAR", 예컨대, 바이-에피토프 CAR 또는 트리-에피토프 CAR)에 결합할 수 있다. 동일한 항원에 특이적인 결합 부위는 동일하거나 상이한 sdAb를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 다가 (예컨대, 2가, 3가 또는 더 높은 수의 원자가) CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)에 특이적으로 결합하는 복수의 (예컨대, 약 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나 이상의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 다가 (예컨대, 2가, 3가 또는 더 높은 수의 원자가) CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)에 특이적으로 결합하는 복수의 (예컨대, 약 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나 이상의) sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 다가 (예컨대, 2가, 3가 또는 더 높은 수의 원자가) CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv), 및 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 결합 모이어티는 sdAb이고 제2 결합 모이어티는 인간 항체 (예컨대, scFv)로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 결합 모이어티는 둘 모두 sdAb 또는 scFv이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 결합 모이어티는 sdAb이고 제2 결합 모이어티는 폴리펩티드 리간드 또는 수용체 (예컨대, APRIL, BAFF, Fc 수용체)이다. 일부 실시양태에 있어서, 다가 CAR은 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 다가 CAR은 항원 상의 3 개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 2가 CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA)의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb 및 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA)의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 2가 CAR이다: (a) 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 scFv 및 항원 (예컨대, 종양 항원, 예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인 (본원에서 CD19xCD20 CAR로서 또한 지칭됨). 일부 실시양태에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 2가 및 이중특이적 CAR이다: (a) CD19에 특이적으로 결합하는 제1 scFv 및 CD20에 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 예컨대, 일부 실시양태에 있어서, 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR은 다음을 포함하는 2가 CAR이다: (a) BCMA의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 sdAb ("항-BCMA sdAb1" 또는 "항-BCMA VHH1") 및 BCMA의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 sdAb ("항-BCMA sdAb2" 또는 "항-BCMA VHH2")를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 항-BCMA sdAb1 및 항-BCMA sdAb2는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 항-BCMA sdAb1 및 항-BCMA sdAb2는 상이하다.
세포 외 리간드 결합 도메인
본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 세포 외 리간드 결합 도메인은 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티, 예컨대, sdAb를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 4-쇄 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타류 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 인간 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 sdAb (예컨대, 항-BCMA sdAb)이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 scFv (예컨대, 항-CD19 scFv, 항-CD20 scFv 또는 CD19xCD20 scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 비-항체 결합 단백질, 예컨대, 폴리펩티드 리간드 또는 항원에 결합하는 조작된 단백질이다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 결합 모이어티는 리간드 또는 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함하며, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드 또는 수용체는 NKG2A, NKG2C, NKG2F, NKG2D, BCMA, APRIL, BAFF, IL-3, IL-13, LLT1, AICL, DNAM-1 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 리간드는 BCMA에 결합할 수 있는 APRIL 또는 BAFF로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 수용체는 Fc 결합 도메인, 예컨대, Fc 수용체의 세포 외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체 (FcγR)이다. 일부 실시양태에 있어서, FcγR은 CD16A (FcγRIIIa), CD16B (FcγRIIIb), CD64A, CD64B, CD64C, CD32A 및 CD32B로 이루어진 군으로부터 선택된다. 결합 모이어티는 펩티드 결합을 통해 또는 펩티드 링커를 통해 직접적으로 서로 융합될 수 있다.
단일-도메인 항체 (sdAb)
일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 하나 이상의 sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함한다. sdAb는 상이한 기원의 동일한 것, 동일한 또는 상이한 크기일 수 있다. 예시적인 sdAb는 중-쇄 단독 항체 (예컨대, VHH 또는 VNAR)로부터의 중쇄 가변 도메인, 자연적으로 경쇄가 없는 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 (예컨대, VH 또는 VL), 인간화 중-쇄 단독 항체, 인간 중쇄 세그먼트를 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 랫트에 의해 생산된 인간 sdAb, 및 항체로부터 유래된 것 이외의 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. PCT/CN2017/096938 및 PCT/CN2016/094408 (이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 원용됨)에 기재된 sdAb를 포함하여 당업계에 공지되거나 본 발명자들에 의해 개발된 임의의 sdAb를 사용하여 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))을 작제할 수 있다. CAR의 예시적인 구조는 PCT/CN2017/096938의 도 15a-15d에 도시된다. sdAb는 마우스, 랫트, 인간, 낙타, 라마, 램프리, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 고려되는 단일-도메인 항체는 또한 카멜리대(Camelidae) 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 sdAb 분자를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, sdAb는 경쇄가 없는 중쇄 항체 (본원에서 "중쇄 단독 항체"로서 또한 지칭됨)로서 알려진 자연 발생 단일-도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어, WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, C. 등 (1993) Nature 363:446-448에 개시된다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 4 쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH로서 알려져있다. 이러한 VHH 분자는 카멜리대 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠나, 단봉 낙타, 알파카 및 구아나코에서 형성된 항체로부터 유래될 수 있다. 카멜리대 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자를 생산할 수 있으며, 이러한 VHH는 본 출원의 범주 내에 있다.
낙타류로부터의 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10 배 작다. 이들은 단일 폴리펩티드이며 극한의 pH 및 온도 조건에 견디며 매우 안정적일 수 있다. 더욱이, 이들은 통상적인 4-쇄 항체의 경우가 아닌 프로테아제의 작용에 저항할 수 있다. 또한, VHH의 생체 외 발현은 고 수율, 적절하게 폴딩된 기능적 VHH를 생산한다. 또한, 낙타류에서 생성된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통해 또는 낙타류 이외의 포유류의 면역화를 통해 생체 외에서 생성된 항체에 의해 인식된 것 이외의 에피토프를 인식할 수 있다 (예컨대, WO9749805 참고). 이와 같이, 하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다중특이적 또는 다가 CAR은 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 또는 다가 CAR보다 표적과 더 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHH는 '비정상적인' 에피토프, 예컨대, 공동 또는 홈에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 VHH를 포함하는 CAR의 친화도는 통상적인 다중특이적 폴리펩티드보다 치료적 치료에 더 적합할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, sdAb는 연골 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, sdAb는 상어의 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체 (NAR)로서 알려진 면역글로불린 이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR ("IgNAR")의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909에 기재된다.
일부 실시양태에 있어서, sdAb는 재조합, CDR-접목된, 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 생체 외 생성 (예컨대, 파지 디스플레이에 의해 선택)된다. 일부 실시양태에 있어서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역에서 특이적 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 통상적인 4-쇄 항체로부터의 (자연 발생) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 아미노산 잔기 중 하나 이상으로 대체 또는 치환하는 것을 지칭한다. 이는 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어, 본원에서 추가 설명에 근거하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같이 VH-VL 인터페이스를 형성하고/하거나 이에 존재하는 아미노산 위치 및/또는 소위 카멜리대 홀마크 잔기에 삽입된다 (예를 들어, WO 94/04678, Davies 및 Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies 및 Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957-969, 1996; 그리고 Riechmann 및 Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999 참고).
일부 실시양태에 있어서, sdAb는 인간 중쇄 세그먼트를 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 랫트에 의해 생산된 인간 sdAb이다. 예컨대, US20090307787A1, U.S. Pat. No. 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1 및 WO2004049794를 참고한다. 일부 실시양태에 있어서, sdAb는 친화도가 성숙된 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연 발생 VHH 도메인은 낙타류 VHH 서열의 (나이브 또는 면역) 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 이러한 방법은 그 자체로 알려진 하나 이상의 스크리닝 기술을 사용하여 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 하나 이상의 부분, 단편, 항원 결정기 또는 에피토프를 사용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 라이브러리 및 기술은 예를 들어, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 대안적으로, (나이브 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리, 예컨대, 기술, 예컨대, 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링에 의해 (나이브 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 수득된 VHH 라이브러리가 예를 들어, WO 00/43507에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, sdAb는 통상적인 4-쇄 항체로부터 생성된다. 예를 들어, EP 0 368 684, Ward 등 (Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6), Holt 등, Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; 및 WO 06/003388을 참고한다.
펩티드 링커
본원에 기재된 다중특이적 또는 다가 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에서 다양한 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, 리간드/수용체 도메인)는 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, 리간드/수용체 도메인)는 임의의 펩티드 링커없이 서로 직접적으로 융합된다. 상이한 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, 리간드/수용체 도메인)를 연계하는 펩티드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 상이한 도메인은 또한 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다.
기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 각각의 펩티드 링커는 sdAb 및/또는 다양한 도메인 (예컨대, 리간드/수용체 도메인)의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각각의 펩티드 링커는 독립적으로 선택되고 최적화될 수 있다. 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에서 사용되는 펩티드 링커(들)의 길이, 가요성의 정도 및/또는 기타 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도, 특이성 또는 결합성을 비제한적으로 포함하는 특성에 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 2 개의 근접 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 하기위해 더 긴 펩티드 링커를 선택할 수 있다. 예를 들어, 다량체 항원에 대해 지시되는 sdAb를 포함하는 본원에 기재된 다가 또는 다중특이적 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에서, 펩티드 링커의 길이 및 가요성은 바람직하게는 다가 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에서 각각의 sdAb가 다량체의 각각의 서브유닛 상의 항원성 결정기에 결합하도록 허용한다. 일부 실시양태에 있어서, 짧은 펩티드 링커는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 막관통 도메인과 세포 내 시그널링 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커는 근접 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 가요성 잔기 (예컨대, 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다.
펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100 개 이상 중 임의의 것 이상의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커는 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개 이하 중 임의의 것 이하의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커의 길이는 약 1 개의 아미노산 내지 약 10 개의 아미노산, 약 1 개의 아미노산 내지 약 20 개의 아미노산, 약 1 개의 아미노산 내지 약 30 개의 아미노산, 약 5 개의 아미노산 내지 약 15 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산 내지 약 25 개의 아미노산, 약 5 개의 아미노산 내지 약 30 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산 내지 약 30 개의 아미노산 길이, 약 30 개의 아미노산 내지 약 50 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산 내지 약 100 개의 아미노산, 또는 약 1 개의 아미노산 내지 약 100 개의 아미노산 중 임의의 것이다.
펩티드 링커는 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO1996/34103을 참고한다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n 포함, 여기서 n은 1 이상의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (서열번호 40), (GGGGS)2 (서열번호 41), (GGGS)3 (서열번호 42), (GGGS)4 (서열번호 43), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS (서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 45), (GGGGS)3 (서열번호 46) 또는 (GGGGS)4 (서열번호 47)를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 다양한 펩티드 링커 및 이들의 특성은 또한 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))와 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 돌연변이 Nef, 돌연변이 SIV Nef) 사이에 사용되는 연결 서열에 의해 코딩되는 펩티드에 적용된다. 예를 들어, 펩티드 링커는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))와 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef, 돌연변이 Nef)을 코딩하는 핵산이 동일한 벡터 상에 있는 경우 이들 사이에 첨가될 수 있는 가요성 잔기 (예컨대, 글리신 및 세린)를 포함하여, 기능적 외인성 수용체 및 Nef 단백질 둘 모두의 적절한 폴딩을 위한 충분한 공간을 제공하고/하거나 그 사이에서 연결 서열 (예컨대, P2A, T2A)의 절단을 용이하게 한다. 예를 들어, (GGGS)3 링커는 본원에 기재된 BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef 작제물에 사용된다.
막관통 도메인
본 출원의 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 세포 외 리간드 결합 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 자연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에 기재된 CAR에서 사용하기에 양립가능한 막관통 도메인은 자연 발생 단백질로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 이는 합성, 비-자연 발생 단백질 세그먼트, 예컨대, 세포막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 세그먼트일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3 차원 구조에 기반하여 분류된다. 예를 들어, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴 또는 세포의 인지질 이중층을 스패닝할 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 더욱이, 막관통 도메인은 또한 또는 대안적으로 막관통 도메인이 막을 가로지르는 통과 수 및 단백질의 배향을 포함하여 막관통 도메인 토폴로지에 기반하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 한 번 가로지르고, 다중-통과 막 단백질은 세포막을 2 회 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 회 이상) 가로지른다. 막 단백질은 세포 내부 및 외부에 대한 말단 및 막-통과 세그먼트(들)의 토폴로지에 따라 I 형, II 형 또는 III 형으로서 정의될 수 있다. I 형 막 단백질은 단일 막-스패닝 영역을 가지며, 단백질의 N-말단이 세포 지질 이중층의 세포 외 측면에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포질 측면에 존재하도록 배향된다. II 형 막 단백질은 또한 단일 막-스패닝 영역을 갖지만, 단백질의 C-말단이 세포 지질 이중층의 세포 외 측면에 존재하고 단백질의 N-말단이 세포질 측면에 존재하도록 배향된다. III 형 막 단백질은 다중 막-스패닝 세그먼트를 가지며 막관통 세그먼트의 수 및 N-및 C-말단의 위치에 기반하여 추가로 하위-분류될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 CAR의 막관통 도메인은 I 형 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 다중-통과 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본원에 기재된 CAR에서 사용하기에 양립가능할 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합체 (적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개 이상의) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대 측면에 존재하며, 예컨대, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측면에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포 외 측면에 존재한다.
일부 실시양태에 있어서, CAR의 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDIIa, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CDIIa, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 CD28로부터 유래된다.
본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에서 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한 합성, 비-자연 발생 단백질 세그먼트의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인은 합성, 비-자연 발생 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시양태에 있어서, 단백질 세그먼트는 대략 20 개 이상의 아미노산, 예컨대, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개 이상의 아미노산이다. 합성 막관통 도메인의 예는 당업계, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,052,906 B1 및 PCT 공개공보 번호 WO 2000/032776 A2에서 공지되어 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 참고로 원용된다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 C-말단 측면에 위치한 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포질 영역은 3 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 일부 실시양태에 있어서, 지질 이중층에서 막관통 도메인의 배향을 돕는다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 막관통 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 양전하를 띤 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 리신을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 막관통 도메인의 C 말단에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 영역은 대부분 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 실시양태에 있어서, 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 세그먼트의 친수도 또는 소수성 또는 친수성 특징은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, Kyte 및 Doolittle 친수도 분석에 의해 사정될 수 있다.
세포 내 시그널링 도메인
본 출원의 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 세포 내 시그널링 도메인은 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포의 정상 효과기 기능 중 하나 이상의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포질 시그널링 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특화 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 보통 전체 세포질 시그널링 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우 전체 쇄을 사용할 필요는 없다. 세포질 시그널링 도메인의 절두된 일부가 사용되는 경우, 이러한 절두된 일부는 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포질 시그널링 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포질 시그널링 도메인의 임의의 절두된 일부를 포함하는 것을 의미한다.
일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 본질적으로 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인으로 이루어진 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. "일차 세포 내 시그널링 도메인"은 면역 효과기 기능을 유도하기 위해 자극성 방식으로 작용하는 세포질 시그널링 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 시그널링 모티프를 함유한다. 본원에 사용된 "ITAM"은 일반적으로 많은 면역 세포에서 발현되는 시그널링 분자의 꼬리 부분에 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6-8 개의 아미노산으로 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2 개의 반복체를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 임의의 아미노산이며, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생산한다. 시그널링 분자 내의 ITAM은 시그널링 분자의 활성화 이후 ITAM에서 티로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 세포 내의 신호 전달에 중요하다. ITAM은 또한 시그널링 경로에 관여된 다른 단백질의 도킹 부위로서 기능할 수 있다. 예시적인 ITAM-함유 일차 세포질 시그널링 서열은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, ITAM-함유 일차 세포질 시그널링 서열은 CD3γ, DAP12 또는 CD3ζ로부터 유래된다.
일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인으로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포 내 시그널링 도메인은 야생형 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인이다.
공동-자극성 시그널링 도메인
많은 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진할뿐만 아니라 세포의 효과기 기능을 활성화시키기 위해 항원-특이적 신호의 자극 이외에 공동-자극을 필요로 한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "공동-자극성 시그널링 도메인"은 면역 반응, 예컨대, 효과기 기능을 유도하기 위해 세포 내에서 신호 전달을 매개하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본원에 기재된 키메라 수용체의 공동-자극성 시그널링 도메인은 신호를 전달하고 면역 세포, 예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개되는 반응을 조정하는 공동-자극성 단백질로부터의 세포질 시그널링 도메인일 수 있다. "공동-자극성 시그널링 도메인"은 공동-자극성 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "공동-자극성 분자"는 공동-자극성 리간드와 특이적으로 결합하여 면역 세포에 의한 공동-자극성 반응, 예컨대, 비제한적으로 증식 및 생존을 매개하는 면역 세포 (예컨대, T 세포) 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다.
일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 단일 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 2 개 이상의 (예컨대, 약 2, 3 또는 4 개 이상 중 임의의 것의) 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 동일한 공동-자극성 시그널링 도메인 중 2 개 이상, 예를 들어, CD28 또는 CD137 (4-1BB)의 공동-자극성 시그널링 도메인의 2 개의 카피를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 상이한 공동-자극성 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 2 개 이상의 공동-자극성 단백질로부터의 2 개 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 일차 세포 내 시그널링 도메인 (예컨대, CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인) 및 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인 (예컨대, 4-1BB)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인 및 일차 세포 내 시그널링 도메인 (예컨대, CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인)은 임의적인 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 일차 세포 내 시그널링 도메인 및 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인은 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인은 막관통 도메인과 일차 세포 내 시그널링 도메인 (예컨대, CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인) 사이에 위치한다. 다중 공동-자극성 시그널링 도메인은 부가적 또는 상승작용적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포 (예컨대, 면역 세포)에서 공동-자극성 시그널링 도메인의 활성화는 사이토카인의 생성 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 세포를 유도할 수 있다. 임의의 공동-자극성 분자의 공동-자극성 시그널링 도메인은 본원에 기재된 CAR에서 사용하기에 양립가능할 수 있다. 공동-자극성 시그널링 도메인의 유형(들)은 인자, 예컨대, 효과기 분자가 발현될 면역 효과기 세포의 유형 (예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구) 및 원하는 면역 효과기 기능 (예컨대, ADCC 효과)에 기반하여 선택된다. CAR에서 사용하기 위한 공동-자극성 시그널링 도메인의 예는 비제한적으로 B7/CD28 패밀리의 구성원 (B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원 (예컨대, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원 (예컨대, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동-자극성 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 부류 I, HLA- DR, Ikaros, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1) 및 NKG2C)을 포함하는 공동-자극성 단백질의 세포질 시그널링 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR의 세포 내 시그널링 도메인은 4-1BB (CD137)로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인 및 4-1BB의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR의 세포 내 시그널링 도메인은 CD28로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인 및 CD28의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 CAR의 세포 내 시그널링 도메인은 CD28의 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD137의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인, CD28의 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD137의 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 내 시그널링 도메인은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD28의 공동-자극성 시그널링 도메인, CD137의 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ의 세포질 시그널링 도메인.
또한 본 개시내용의 범주 내에는 공동-자극성 시그널링 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조정할 수 있도록 본원에 기재된 공동-자극성 시그널링 도메인 중 임의의 것의 변이체가 있다. 일부 실시양태에 있어서, 공동-자극성 시그널링 도메인은 야생형 대응물과 비교하여 10 개 이하의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8 개의) 아미노산 잔기 변이를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공동-자극성 시그널링 도메인은 변이체로서 지칭될 수 있다. 공동-자극성 시그널링 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극성 시그널링 도메인에 비해 시그널링 전달의 증가 및 면역 반응의 향상된 자극을 초래할 수 있다. 공동-자극성 시그널링 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극성 시그널링 도메인에 비해 시그널링 전달의 감소 및 면역 반응의 감소된 자극을 초래할 수 있다.
힌지
본 출원의 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 2 개의 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 세그먼트이며, 단백질의 가요성 및 서로에 대한 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 이동을 허용할 수 있다. 효과기 분자의 막관통 도메인에 비해 세포 외 항원 결합 도메인의 이러한 가요성 및 이동을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10-100 개의 아미노산, 예컨대, 약 15-75 개의 아미노산, 20-50 개의 아미노산 또는 30-60 개의 아미노산 중 어느 하나를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75 개 중 어느 하나 이상의 아미노산 길이일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 것으로 당업계에 알려진 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 키메라 TCR, TAC, TAC-유사 키메라 수용체, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에 사용하기에 양립가능하다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이고 키메라 수용체에 가요성을 부여한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예컨대, CD8α의 힌지 도메인의 15 개 이상의 (예컨대, 20, 25, 30, 35 또는 40 개의) 연속 아미노산을 함유하는 단편이다.
항체, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한 본원에 기재된 pH-의존적 키메라 수용체 시스템에서 사용하기에 양립가능하다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 잇는 힌지 도메인이다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 항체의 것이고 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비-자연 발생 펩티드는 또한 본원에 기재된 키메라 수용체에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 수용체의 세포 외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 펩티드 링커, 예컨대, (GxS)n 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 이상을 포함하는 3과 12 사이의 정수일 수 있다.
신호 펩티드
본 출원의 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 폴리펩티드의 N-말단에 신호 펩티드 (신호 서열로서 또한 알려짐)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩티드는 폴리펩티드를 세포에서 원하는 부위에 표적화하는 펩티드 서열이다. 일부 실시양태에 있어서, 신호 펩티드는 효과기 분자를 세포의 분비 경로에 표적화하고 효과기 분자를 지질 이중층으로 통합 및 고정할 수 있게 할 것이다. 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))에 사용하기에 양립가능한 자연 발생 단백질의 신호 서열, 또는 합성, 비-자연 발생 신호 서열을 포함하는 신호 펩티드는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 신호 펩티드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
ACTR은 Fc 수용체 (CD16)와 신호 전달 도메인 (4-1BB/CD3ζ)을 조합한 키메라 단백질이다. ACTR을 보유한 조작된 T 세포는 단일클론 항체에 결합하여 종양 세포에 대한 브릿지로서 작용할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서 기능적 외인성 수용체는 (a) 리간드로부터 유래된 하나 이상의 도메인 또는 수용체의 세포 외 도메인을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, 여기서 리간드 또는 수용체는 세포 표면 항원 (예컨대, NKG2D, BCMA, IL-3, IL-13)임; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다.
일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 BCMA의 리간드, 예컨대, APRIL 또는 BAFF로부터 유래된 하나 이상의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb)을 포함한다.
T 세포 항원 커플러 (TAC)
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 기능적 외인성 수용체는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 제1 링커; c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb); d) 임의적인 제2 링커; e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 공동-수용체는 둘 모두 CD4, CD28 및 CD8 (예컨대, CD8α)로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 공동-수용체는 상이하며, 예컨대, 제1 TCR 공동-수용체는 CD4이고 제2 TCR 공동-수용체는 CD8 (예컨대, CD8)이거나, 또는 제2 TCR 공동-수용체는 CD4이고 제1 TCR 공동-수용체는 CD8 (예컨대, CD8α)이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 제1 링커; c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; d) 임의적인 제2 링커; 및 e) TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28, 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-프리셉터 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD28 및 CD8 (예컨대, CD8α)로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다 (예컨대, 모두 CD4임). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC의 세포 내 시그널링 도메인은 TCR 공동-수용체, 예컨대, CD4, CD28 또는 CD8 (예컨대, CD8α)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC의 막관통 도메인은 TCR 공동-수용체, 예컨대, CD4, CD28 또는 CD8 (예컨대, CD8α)의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8 (예컨대, CD8α))의 세포 외 도메인 (또는 이의 일부)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 임의의 TCR 공동-수용체의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, (예컨대, TCR 공동-프리셉터의 세포 외 도메인이 없고, 세포 외 TCR 결합 도메인이 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단에 있는 경우) TAC는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv 또는 sdAb)의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, (예컨대, TCR 공동-프리셉터의 세포 외 도메인이 없고, 세포 외 TCR 결합 도메인이 세포 외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 있는 경우) TAC는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 상기 "힌지" 및 "펩티드 링커" 서브섹션에 기재된 힌지 도메인 및 링커 중 임의의 것은 본원에서 TAC에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 세포 내 공동-자극성 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 표적 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 N-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 C-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 N-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, CD3ε)에 의해 인식되는 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 상이한 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포 외 TCR 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인과 세포 외 리간드 결합 도메인 사이에 놓인다. 일부 실시양태에 있어서, BCMA에 특이적으로 결합하는 sdAb (즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대, 이의 내용이 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인.
따라서, 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인 (전체 또는 부분적 도메인); (f) CD4로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD4로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD8 (예컨대, CD8α)로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인 (전체 또는 부분적 도메인); (f) CD8 (예컨대, CD8α)로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD8 (예컨대, CD8α)로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD28로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인 (전체 또는 부분적 도메인); (f) CD28로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD28로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD4 (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD8 (예컨대, CD8α; 신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD28 (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, CD3ε)에 의해 인식되는 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 상이한 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포 외 TCR 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인과 세포 외 리간드 결합 도메인 사이에 놓인다.
일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음의 구조 (N-말단에서 C-말단까지)를 포함한다: 항-CD20 scFv-(GGGGS)3-항-CD3 scFv-(GGGGS)-CD4 서열. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 scFv는 Leu-16 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD3 scFv는 UCHT1 (예컨대, huUCHT1), F6A, L2K 또는 OKT3로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, CD4 서열은 부분적 세포 외 도메인, 전체 막관통 도메인, 및 CD4의 전체 세포 내 도메인, 예컨대, 전장 CD4의 aa 375-458 (CD4의 신호 펩티드로부터 시작하여 aa 1 카운트)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함한다.
T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 기능적 외인성 수용체는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 제1 링커; c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb); d) 임의적인 제2 링커; e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 도메인을 포함하는 세포 내 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하며, 예컨대, 둘 모두 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하며, 예컨대, 모두 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛 및 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하며, 예컨대, 제1 TCR 서브유닛은 TCRα이고 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 제1 링커; c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb); d) 임의적인 제2 링커; 및 e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 여기서 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 둘 모두 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 동일하며, 예컨대, 둘 모두 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 상이하며, 예컨대, 제1 TCR 서브유닛은 TCRα이고 제2 TCR 서브유닛은 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛 및 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하며, 예컨대, 제1 TCR 서브유닛은 TCRα이고 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체의 세포 내 시그널링 도메인은 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하며, 여기서 TCR 서브유닛은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체의 막관통 도메인은 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하며, 여기서 TCR 서브유닛은 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 임의의 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, (예컨대, TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 또는 이의 일부가 없고, 세포 외 TCR 결합 도메인이 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단에 있는 경우) TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 TCR 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, (예컨대, TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 또는 이의 일부가 없고, 세포 외 TCR 결합 도메인이 세포 외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 있는 경우) TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 상기 "힌지" 및 "펩티드 링커" 서브섹션에 기재된 힌지 도메인 및 링커 중 임의의 것은 본원에서 TAC-유사 키메라 수용체에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 내 시그널링 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 내 공동-자극성 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 N-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 C-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20))의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, CD3ε)에 의해 인식되는 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 상이한 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포 외 TCR 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인과 세포 외 리간드 결합 도메인 사이에 놓인다. 일부 실시양태에 있어서, BCMA에 특이적으로 결합하는 sdAb (즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대, 이의 내용이 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인.
따라서, 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD3ε로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) CD3ε로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD3ε로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD3γ로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) CD3γ로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD3γ로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD3δ로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) CD3δ로부터 유래된 막관통; 및 (g) CD3δ로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) TCRα로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) TCRα로부터 유래된 막관통; 및 (g) TCRα로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) TCRβ로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) TCRβ로부터 유래된 막관통; 및 (g) TCRβ로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) TCRγ로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) TCRγ로부터 유래된 막관통; 및 (g) TCRγ로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) TCRδ로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) TCRδ로부터 유래된 막관통; 및 (g) TCRδ로부터 유래된 임의적인 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3γ. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3δ. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 TCRα. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 TCRβ. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 TCRγ. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 중 임의의 것)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 TCRδ. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 임의적인 힌지; (f) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)으로부터 유래된 막관통; 및 (g) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)으로부터 유래된 세포 내 시그널링 도메인; 여기서, 제1 및 제2 TCR 서브유닛은 둘 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, CD3ε)에 의해 인식되는 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 상이한 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포 외 TCR 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인과 세포 외 리간드 결합 도메인 사이에 놓인다.
일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 제1 링커; c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; d) 임의적인 제2 링커; e) 제1 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 f) 제2 TCR 서브유닛의 세포 내 도메인을 포함하는 세포 내 도메인, 여기서 제1 TCR 서브유닛 및 제2 TCR 서브유닛은 둘 모두 CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 CD3ε이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 CD3γ이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 CD3γ이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 CD3δ이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 CD3δ이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 TCRα이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 TCRα이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 TCRβ이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 TCRβ이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 TCRγ이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 TCRγ이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛은 TCRδ이고/이거나 제2 TCR 서브유닛은 TCRδ이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛 및 제2 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 TCR 서브유닛 및 제2 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 제1 및/또는 제2 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 임의의 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체 폴리펩티드는 세포 내 공동-자극성 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 N-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인에 대한 C-말단이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, CD3ε)에 의해 인식되는 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 상이한 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 제2 세포 외 TCR 결합 도메인 (예컨대, scFv, sdAb)을 추가로 포함하며, 여기서 제2 세포 외 TCR 결합 도메인은 세포 외 TCR 결합 도메인과 세포 외 리간드 결합 도메인 사이에 놓인다.
조작된 TCR
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 항원 (예컨대, 본원에 기재된 항원 중 임의의 것, 예컨대, 종양 항원, BCMA)을 함께 특이적으로 인식하는 야생형 TCR로부터 유래된 Vα 및 Vβ를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 조작된 TCR (예컨대, BCMA 또는 BCMA/MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 조작된 TCR)을 추가로 발현하며, 여기서 Vα, Vβ 또는 둘 모두는 야생형 TCR에 비해 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다 (이하 "전통적인 조작된 TCR"로서 또한 지칭됨). 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 아미노산 치환, 예컨대, 보존적 아미노산 치환을 유도한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 것과 비교하여 더 높은 친화도로 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합된 것과 비교하여 더 낮은 친화도로 동일한 동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 야생형 TCR에 의해 결합되지 않은 비-동족 펩티드-MHC에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 단일 쇄 TCR (scTCR)이다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 이량체성 TCR (dTCR)이다. 일부 실시양태에 있어서, 야생형 TCR은 HLA-A2에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 세포 내 시그널링 도메인, 예컨대, CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 BCMA 또는 BCMA-MHC 복합체를 함께 특이적으로 인식하는 야생형 TCR로부터 유래된 Vα 및 Vβ를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 조작된 TCR을 추가로 발현하며, 여기서 Vα, Vβ 또는 둘 모두는 야생형 TCR에 비해 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 항-BCMA TCR은 야생형 항-BCMA TCR보다 BCMA에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 조작된 TCR은 세포 내 시그널링 도메인, 예컨대, CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본 출원의 조작된 TCR은 키메라 TCR (cTCR)이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 TCR 서브유닛의 전체 길이 또는 일부에 (직접적으로 또는 간접적으로) 융합된, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, 항체-기반 항원 결합 도메인, 예컨대, scFv 또는 sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하며, 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 융합 폴리펩티드는 다른 내인성 TCR 서브유닛과 함께 기능적 TCR 복합체에 혼입될 수 있고 TCR 복합체에 항원 특이성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR 세포 외 리간드 결합 도메인은 CD3ε 서브유닛의 전체 길이 또는 일부에 융합된다. cTCR의 세포 내 시그널링 도메인은 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인, 예컨대, CD3ε의 세포 내 시그널링 도메인으로부터 유래될 수 있다. cTCR의 막관통 도메인은 TCR 서브유닛으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR 세포 내 시그널링 도메인 및 cTCR 막관통 도메인은 동일한 TCR 서브유닛, 예컨대, 둘 모두 CD3ε로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR 세포 외 리간드 결합 도메인 및 TCR 서브유닛 (전체 또는 이의 일부)은 링커 (예컨대, GS 링커)를 통해 융합될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 cTCR 세포 내 시그널링 도메인 및/또는 cTCR 막관통 도메인이 유래되는 TCR 서브유닛과 동일하거나 상이할 수 있는 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, (예컨대, TCR 서브유닛의 세포 외 도메인 또는 이의 일부가 없는 경우) cTCR은 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 상기 "힌지" 및 "펩티드 링커" 서브섹션에 기재된 힌지 도메인 및 링커 중 임의의 것은 여기 cTCR에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 단량체성이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 단일 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 단일특이적이며, 즉, 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 동일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가 및 다중특이적이며, 즉, 동일한 종양 항원 또는 상이한 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 2 개 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 2 개 이상의 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, BCMA에 특이적으로 결합하는 sdAb (즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대, 이의 내용이 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 항-BCMA sdAb 중 임의의 것인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인.
따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 다음을 포함하는 항-CD20 키메라 TCR을 추가로 발현한다: a) CD20을 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 링커 (예컨대, GS 라이너, 예컨대, (GGGGS)3); c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 cTCR은 다음을 포함한다: a) 항-CD20 scFv; b) 링커 (예컨대, GS 라이너, 예컨대, (GGGGS)3); 및 c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 비-자연 발생 Nef 단백질, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포는 다음을 포함하는 항-BCMA 키메라 TCR을 추가로 발현한다: a) BCMA를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; b) 임의적인 링커 (예컨대, GS 라이너, 예컨대, (GGGGS)3); c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 항-BCMA cTCR은 다음을 포함한다: a) 항-BCMA sdAb; b) 링커 (예컨대, GS 라이너, 예컨대, (GGGGS)3); 및 c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR 막관통 도메인, cTCR 세포 내 시그널링 도메인, 및 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부는 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR 막관통 도메인, cTCR 세포 내 시그널링 도메인, 및 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부는 CD3ε으로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외)의 N-말단에 융합된 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-CD20 cTCR은 항-CD20 scFv-(GGGGS)3-CD3ε의 구조, 예컨대, 서열번호 64를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 항-BCMA cTCR은 항-BCMA sdAb-(GGGGS)3-CD3ε의 구조를 갖는다.
VI. 약학 조성물
본 출원은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포) 중 어느 하나 및/또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)), 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다. 약학 조성물은 원하는 순도를 갖는 키메라 항체 면역 효과기 세포 관여자를 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다.
허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 소듐 메타바이설파이트를 포함하는 항산화제; 방부제, 등장화제, 안정화제, 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 킬레이트 제, 예컨대, EDTA 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
특히, 안정성이 pH 의존적인 경우, 치료적 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하기 위해 완충액이 사용된다. 완충액은 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기 산 및 이의 염 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 석시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가로, 완충액은 히스티딘 및 트리메틸아민 염, 예컨대, 트리스를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위해 첨가되며, 전형적으로 0.2%-1.0% (w/v) 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 방부제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드 (예컨대, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 벤즈에토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조시놀; 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
때때로 "안정화제"로서 알려진 긴장성제는 조성물에서 액체의 긴장성을 조정하거나 유지하기 위해 존재한다. 크고 하전된 생체분자, 예컨대, 단백질 및 항체와 함께 사용되는 경우, 아미노산 측쇄의 하전된 그룹과 상호작용할 수 있어 분자 간 및 분자-내 상호작용의 가능성이 줄어들기 때문에 종종 "안정화제"라고 칭한다. 긴장성제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여 중량 대비 0.1% 내지 25%, 바람직하게는 1 내지 5%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 긴장성제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당 알콜, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가 부형제는 다음 중 하나 이상으로서 작용할 수 있는 약제를 포함한다: (1) 벌킹제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정화제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 대한 접착을 예방하는 약제. 이러한 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알콜 (상기 나열됨); 아미노산, 예컨대, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예컨대, 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨 (예컨대, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대, 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저 분자량 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (예컨대, 자일로스, 만노스, 과당, 글루코스; 이당류 (예컨대, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대, 라피노스; 및 다당류, 예컨대, 덱스트린 또는 덱스트란.
비-이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤제"로서 또한 알려짐)는 치료제의 가용화를 돕고 교반-유도 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 존재하며, 이는 또한 제형이 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 일으키지 않고 전단 표면 스트레스에 노출되도록 허용한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 바람직하게는 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위로 존재한다.
적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80, 등), 폴리옥사머 (184, 188, 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80, 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포석시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
약학 조성물을 생체 내 투여에 사용하기 위해, 이들은 멸균되어야 한다. 약학 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예컨대, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알에 배치된다.
투여 경로는 알려지고 허용된 방법, 예컨대, 단일 또는 다중 볼루스 또는 적합한 방식으로 장기간에 걸친 주입, 예컨대, 피하, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 병변 내 또는 관절 내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국부 투여, 흡입 또는 지속 방출 또는 연장-방출 수단에 따른다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 성형 물품의 형태, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐로 존재한다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리 (2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리 (비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산의 공중합체 및. 에틸-L-글루타메이트, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
본원에 기재된 약학 조성물은 또한 치료될 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물 또는 약제, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보 적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 면역억압제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐로 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition에 개시된다.
VII. 치료 방법
본 출원은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR, ACTR) 또는 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR, TAC-유사 키메라 수용체))를 발현하는 약학 조성물 또는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포) 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본원에 기재된 방법은 고체암 및 액체암 둘 다를 포함하는 다양한 암을 치료하는 데 적합하다. 방법은 초기 단계, 진행 단계 및 전이성 암을 포함한 모든 단계의 암에 적용가능하다. 본원에 기재된 방법은 보조 설정 또는 신보조 요법 설정으로 제1 요법, 제2 요법, 제3 요법, 또는 당업계에 알려진 다른 유형의 암 요법, 예컨대, 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 요법, 면역요법, 골수 이식, 줄기 세포 이식, 표적 요법, 냉동요법, 초음파 요법, 광역학 요법 또는 무선-주파수 절제 등과의 병용 요법으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 결장암, 직장암, 신장-세포 암종, 간암, 폐의 비-소 세포 암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아의 고체 종양, 방광암, 콩팥암 또는 요관암, 신우의 암종, 중추 신경계 신생물 (CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합,및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택된 고체암을 치료하는 데 적합하다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 (ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병 (B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 소 세포- 또는 큰 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수형성이상 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 전-백혈병 중 하나 이상으로부터 선택된 혈액암을 치료하는 데 적합하다.
일부 실시양태에 있어서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 Durie-Salmon 병기 시스템에 기반한 I 기, II 기 또는 III 기 및/또는 A 기 또는 B 기 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 국제 골수종 워킹 그룹 (IMWG)에 의해 공개된 국제 병기 시스템에 기반한 I 기, II 기 또는 III 기 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 결정되지 않은 유의성의 단일클론 감마병증 (MGUS)이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 증상이 없는 (무증상/무통성) 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 증상성 또는 활성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 불응성 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 전이성 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 다발성 골수종에 대한 이전 치료에 반응하지 않았다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 다발성 골수종의 이전 치료 후 진행성 질환을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 이전에 다발성 골수종에 대한 약 2, 3 또는 4 회 이상 중 어느 하나 이상의 치료를 받았다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 재발성 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에 있어서, 개체는 활성 다발성 골수종을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 10% 이상의 클론성 골수 형질 세포를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 생검으로-입증된 뼈 또는 골수 외 형질세포종을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 기저 형질 세포 증식성 장애에 기인할 수 있는 말단 기관 손상의 증거를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 고칼슘혈증, 예컨대, 정상 상한치보다 높은 >0.25 mmol/L (>1 mg/dL) 또는 >2.75 mmol/L (>11 mg/dL)의 혈청 칼슘을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 신기능부전, 예컨대, 크레아티닌 청소율 <분당 40 mL 또는 혈청 크레아티닌 >177 mol/L (>2 mg/dL)를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 빈혈, 예컨대, 정상 하한치 미만의 >20g/L의 헤모글로빈 값 또는 <100g/L의 헤모글로빈 값을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 하나 이상의 골 병변, 예컨대, 골격 방사선 촬영, CT 또는 PET/CT 상에서 하나 이상의 골용해성 병변을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 개체는 다음의 악성도 바이오마커 (MDE) 중 하나 이상을 갖는다: (1) 골수 조사에서 60% 이상의 클론 형질 세포; (2) 관여된 경쇄의 절대 수준이 100 mg/L 이상인 경우, 100 이상의 혈청 관여된/비관여된 유리 경쇄 비율; 및 (3) MRI 상의 적어도 5 mm 이상의 크기인 하나 초과의 초점 병변.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 자가면역 질환을 치료하는 데 적합하다. 자가면역 질환 또는 자가면역은 유기체가 자신의 구성 부분 (서브-분자 수준까지)을 "자기"로서 인식하지 못하여 자신의 세포 및 조직에 대한 면역 반응을 초래하는 것이다. 이러한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 임의의 질환을 자가면역 질환이라 칭한다. 두드러진 예는 코엘리악 질환, 1 형 당뇨병 (IDDM), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증 (MS), 하시모토 갑상선염, 그레이브스 질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증 및 류마티스 관절염 (RA)을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 방법은 염증성 질환을 치료하는 데 적합하며, 자가면역 질환은 또한 B-세포 장애와 연관된 질환의 부류이다. 자가면역 질환의 예는 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반증, 피부근육염, 시덴함 무도증, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스 열, 다선성 증후군, 수포성 유사천포창, 당뇨병, 헤노호-쇤라인 자반증, 연쇄상구균-후 신염, 결절성 홍반, 다카야수 동맥염, 애디슨 질환, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 다형 홍반, IgA 신장병, 결절성 다발동맥염, 강직성 척추염, 굿파스쳐 증후군, 폐색성 혈전 혈관염. 쇼그렌 증후군, 원발성 담즙성 경변증, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 피부경화증, 만성 활성 간염, 다발성근염/피부근육염, 다발연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축성 축삭경화증, 척수 매독, 거대 세포 동맥염/다발성근육통, 악성빈혈, 급속 진행성 사구체신염, 건선 및 섬유성 폐렴을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가장 일반적인 치료법은 코르티코스테로이드 및 세포독성 약물이며, 이는 매우 독성이 있을 수 있다. 이들 약물은 또한 전체 면역계를 억압하고, 심각한 감염을 초래할 수 있으며, 골수, 간 및 콩팥에 유해 효과를 갖는다. 현재까지 부류 III 자가면역 질환을 치료하는 데 사용된 다른 치료제는 T 세포 및 대식세포에 대한 것이었다. 자가면역 질환, 특히 부류 III 자가면역 질환을 치료하는보다 효과적인 방법이 필요하다.
약학 조성물의 투여는 주사, 섭취, 수혈, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양 내, 비강 내, 골수 내, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 전신 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 주입, 예컨대, 정맥 내 주입에 의해 개체에게 투여된다. 면역요법을 위한 주입 기술은 당업계에 알려져 있다 (예컨대, Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988) 참고). 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 개체에 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 조성물은 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 조성물은 종양 또는 림프절에 직접 주사된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 종양 부위, 예컨대, 종양 세포에 또는 종양 세포를 갖는 조직에 국소 투여된다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효 용량의 결정에 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효량의 종간 스케일링은 Mordenti, J. 및 Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 등, Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46에 의해 규정된 원칙에 따라 수행될 수 있다. 상이한 제형이 상이한 치료 및 상이한 장애에 대해 효과적일 것이며, 특이적 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여가 다른 기관 또는 조직으로의 전달과 상이한 방식으로 전달을 필요하게 만들 수 있다는 것은 본 출원의 범주 내에 있다.
일부 실시양태에 있어서, 여기서 약학 조성물은 Nef (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 본원에 기재된 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 발현하는 변형된 T 세포 중 어느 하나를 포함하며, 약학 조성물은 약 104, 105, 106, 107, 108 또는 109 개의 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것 이상의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 약 108 내지 약 109, 약 104 내지 약 109, 약 104 내지 약 106, 약 106 내지 약 108, 또는 약 105 내지 약 107 개의 세포/개체의 체중 kg 중 임의의 것의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 적어도 약 임의의 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107 개의 세포/kg 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 약 3x105 내지 약 7x106 개의 세포/kg, 또는 약 3x106 개의 세포/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 단일 시간 동안 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 다중 회 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6 회 이상 중 임의의 것) 동안 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 매주 1 회, 2 주 1 회, 3 주 1 회, 4 주 1 회, 매달 1 회, 2 개월당 1 회, 3 개월당 1 회, 4 개월당 1 회, 5 개월당 1 회, 6 개월당 1 회, 7 개월당 1 회, 8 개월당 1 회, 9 개월당 1 회 또는 매년 1회 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 투여 사이의 간격은 약 1 주 내지 2 주, 2 주 내지 1 개월, 2 주 내지 2 개월, 1 개월 내지 2 개월, 1 개월 내지 3 개월, 3 개월 내지 6 개월, 또는 6 개월 내지 1 년 중 어느 하나이다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 양생법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
더욱이, 투여량은 하나 이상의 개별 투여에 의해 또는 계속되는 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 분할 용량, 예컨대, 약 2, 3, 4 또는 5 이상 중 어느 하나의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 분할 용량은 약 1 주에 걸쳐 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 용량은 동등하게 분할된다. 일부 실시양태에 있어서, 분할 용량은 총 용량의 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%이다. 일부 실시양태에 있어서, 연속 분할 용량 사이의 간격은 약 1 일, 2 일, 3 일 이상이다. 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라 원하는 질환 증상의 억압이 발생할 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여량 양생법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포) 및 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 CAR: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, cTCR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 cTCR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택됨; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 다음을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, GvHD, 이식 거부, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다: (1) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 포함하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포): (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택됨; 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC-유사 키메라 수용체를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR, MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ를 하향-조정하며, 예컨대, 내인성 TCR, MHC, CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ의 세포 표면 발현을 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 것 이상으로 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD3ζ, CD4, CD28 및/또는 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않거나 (예컨대, 발현을 하향-조절하지 않거나), CD3ζ, CD4, CD28 및/또는 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR)를 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정한다.
일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이시키는 것, 예컨대, Ala로 돌연변이시키는 것)를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 다발성 골수종, 예컨대, 재발성 또는 불응성 다발성 골수종이다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체에서 객관적인 임상 반응을 유발하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 엄격한 임상 반응 (sCR)은 개체에서 수득된다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체에서 (부분적 또는 완전한) 질환 관해를 유발하는 것을 포함한다. 일부에서 임상적 관해는 개체가 약학 조성물을 받은 후 약 6 개월, 5 개월, 4 개월, 3 개월, 2 개월 또는 1 개월 이하 중 어느 하나 이내 후에 수득된다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체에서 암의 재발 또는 질환 진행을 예방하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 재발 또는 질환 진행은 적어도 약 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년 또는 5 년 이상 동안 예방된다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체에서 생존을 연장하는 것 (예컨대, 무질환 생존)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체의 삶의 질을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 고체 또는 림프성 종양의 성장을 억제하는 것 또는 이의 크기를 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 고체 또는 림프성 종양의 크기는 약 10% 이상 (예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 중 임의의 것 이상 포함) 감소된다. 일부 실시양태에 있어서, 개체에서 고체 또는 림프성 종양의 성장을 억제하거나 이의 크기를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 치료 효과는 개체에서 종양 전이를 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 약 10% 이상의 (예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 중 임의의 것 이상 포함) 전이가 억제된다. 일부 실시양태에 있어서, 림프절로의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 폐로의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 간으로의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 전이는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대, 혈액 테스트, 뼈 스캔, X-선 스캔, CT 스캔, PET 스캔 및 생검에 의해 사정될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 Nef (또는 Nef + 기능적 외인성 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 사용하여 질환 및 장애를 감소시키거나 개량, 또는 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 Nef (또는 Nef + 기능적 외인성 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 암, 감염, 하나 이상의 자가면역 장애, 방사선 질병을 감소시키거나 개량, 또는 예방하거나 치료하기 위해, 또는 이식 수술을 받은 대상체에서 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 이식 거부를 예방하거나 치료하기 위해 사용된다.
Nef (또는 Nef + 기능적 외인성 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 이러한 T 세포가 발달 동안에 TGF-β에서 성장할 수 있고 분화하여 유도성 T 조절 세포가 될 것이기 때문에 자가면역 또는 이식 거부를 변경하는 데 유용하다. 일 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 이러한 유도성 T 조절 세포가 질환의 조직 부위에서 억제 기능을 수행하는 데 필요한 기능적 특이성을 부여하는 데 사용된다. 따라서, 많은 수의 항원-특이적 조절 T 세포가 환자에서 사용하기 위해 성장된다. T 조절 세포 분화에 필수적인 FoxP3의 발현은 유세포분석으로 분석될 수 있으며, 이러한 T 조절 세포에 의한 T 세포 증식의 기능적 억제는 공동-배양시 항-CD3 자극 후 T 세포 증식의 감소를 조사함으로써 분석될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 방사선 질병의 예방 또는 치료를 위한 Nef (또는 Nef + 기능적 외인성 수용체)를 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포), 이의 단리된 집단 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 방사선 치료 또는 노출 (예컨대, 더티밤(dirty bomb) 노출, 방사선 누출) 또는 골수 세포를 절제하는 기타 상태 (특정 약물 요법) 후 한 가지 문제는 조혈계를 재구성하는 것이다. 골수 이식을 받은 환자에서 이식 후-15 일차의 절대 림프구 계수는 성공적인 결과와 상관관계가 있다. 높은 림프구 계수를 갖는 환자들은 재구성이 잘되므로, 우수한 림프구 재구성을 갖는 것이 중요한다. 이 효과의 이유는 명확하지 않지만, 감염으로부터 림프구 보호 및/또는 조혈 재구성에 유리한 성장 인자의 생산 때문일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 1) 동종이계 T 세포를 제공하는 단계; 및 2) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 개체에서 공여자 T 세포의 지속성 및/또는 생착을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 동종이계 T 세포는 동종이계 CAR-T 세포, 조작된 TCR-T 세포 (예컨대, cTCR-T 세포), TAC-T 세포. TAC-유사-T 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 동종이계 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 CAR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-CD19 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-CD20 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 함께 직접적으로 또는 간접적으로 (예컨대, 링커를 통해) 융합된 하나의 항-CD20 scFv 및 하나의 항-CD19 scFv를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 전통적인 조작된 TCR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 ACTR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 cTCR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인을 포함하며; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 TAC를 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-프리셉터 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)로부터 유래된 임의적인 세포 외 도메인; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 막관통을 포함하는 막관통; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4, CD28 또는 CD8, 예컨대, CD8α)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하며; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, scFv, sdAb)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체 기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, cTCR), TAC, TAC-유사 키메라 수용체)는 1가 및 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체 기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, cTCR), TAC, TAC-유사 키메라 수용체)는 다가 및 단일특이성이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체 기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, cTCR), TAC, TAC-유사 키메라 수용체)는 다중특이적 (및 다가)이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 1) 동종이계 T 세포를 제공하는 단계; 및 2) Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 예컨대, 본원에 기재된 기능적 외인성 수용체 (예컨대, CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체 기반 CAR, ACTR), 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, cTCR), TAC, TAC-유사 키메라 수용체)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터)를 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 개체에서 공여자 T 세포의 지속성 및/또는 생착을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 거대세포바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터 (CMV IE), 연장 인자 1 알파 프로모터 (EF1-α), 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터, 유비퀴틴-C (UBQ-C) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 (CAG) 프로모터, 폴리오마 인핸서/단순 포진 티미딘 키나제 (MC1) 프로모터, 베타 액틴 (β-ACT) 프로모터, "골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환 (MND)" 프로모터, NFAT 프로모터, TETON® 프로모터 및 NFκB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 프로모터는 EF1-α 또는 PGK이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연계된다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것이며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에 있어서, 연결 서열은 IRES 또는 P2A를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대, 에피솜 발현 벡터, 향상된 에피솜 벡터 (EEV), 피기백 트랜스포사제 벡터 또는 슬리핑 뷰티 (SB) 트랜스포존 시스템이다.
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산을 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받은 개체에서 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 동종이계 T 세포는 동종이계 CAR-T 세포, TCR-T 세포 (예컨대, cTCR-T 세포), TAC-T 세포 또는 TAC-유사-T 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 코딩하는 제2 핵산을 동종이계 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 CAR을 코딩한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 다음을 포함하는 cTCR을 코딩한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만, 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 핵산은 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받은 개체에서 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 제공한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)을 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받은 개체에서 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 제공한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받은 개체에서 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 제공한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 제1 핵산, 및 다음을 포함하는 TAC-유사 키메라 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 동종이계 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, GvHD 또는 이식 거부를 유도하지 않고 동종이계 T 세포 이식을 받은 개체에서 질환 (예컨대, 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 또는 방사선 질병)을 치료하는 방법을 제공한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 핵산을 동종이계 CAR-T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 CAR-T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 동종이계 CAR-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 항원 (예컨대, BCMA, CD20, CD19)을 특이적으로 인식하는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 결합 모이어티 (예컨대, sdAb, scFv)를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: (a) 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상 중 어느 하나의) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포 내 시그널링 도메인. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CAR을 하향-조정하지는 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 CAR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 핵산을 동종이계 cTCR-T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 cTCR-T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 동종이계 cTCR-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (d) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (e) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다 (예컨대, 모두 CD3ε). 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 링커; 및 (c) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외). 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, cTCR은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 cTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, cTCR을 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 cTCR은 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 핵산을 동종이계 TAC-유사-T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 TAC-유사-T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 동종이계 TAC-유사-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제1 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제2 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제3 TCR 공동-수용체 (예컨대, CD4)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) CD4의 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) CD4의 막관통 도메인; 및 (g) CD4의 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD20 TAC이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC는 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
일부 실시양태에 있어서, 본 발명은 또한 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)을 코딩하는 핵산을 동종이계 TAC-유사-T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 동종이계 TAC-유사-T 세포의 내인성 TCR의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함하는, 동종이계 TAC-유사-T 세포의 GvHD 또는 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) 제1 TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; (e) 제2 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부; (f) 제3 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및 (g) 제4 TCR 서브유닛 (예컨대, CD3ε)의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하지만 제1 TCR 서브유닛과 상이하다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다음을 포함한다: (a) 종양 항원 (예컨대, BCMA, CD19, CD20)의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편 (예컨대, sdAb, scFv)을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인; (b) 임의적인 제1 링커; (c) TCR 서브유닛 (예컨대, TCRα)의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인; (d) 임의적인 제2 링커; 및 (e) 전장 CD3ε (신호 펩티드 제외); 여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다가이다. 일부 실시양태에 있어서, TAC-유사 키메라 수용체는 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 서열번호 12-22 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질은 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나를 포함하는 돌연변이 SIV Nef이다: (i) aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223; (ii) aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190; (iii) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190; 또는 (iv) aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190; 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR, CD4 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절한다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 TCR 및 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하나, TAC-유사 키메라 수용체를 하향-조정하지 않는다 (예컨대, 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는다). 일부 실시양태에 있어서, 기능적 TAC-유사 키메라 수용체는 Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef)에 의해 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 임의의 것 이하로 하향-조정된다 (예컨대, 세포 표면 발현에 대해 하향-조절된다).
VIII. 키트 및 제조 물품
Nef 단백질 (예컨대, wt Nef 또는 돌연변이 Nef, 예컨대, 돌연변이 SIV Nef) 및/또는 기능적 외인성 수용체 (예컨대, 조작된 TCR (예컨대, 전통적인 조작된 TCR, 키메라 TCR (cTCR)), TAC, TAC-유사 키메라 수용체 또는 CAR (예컨대, 항체-기반 CAR, 리간드/수용체-기반 CAR 또는 ACTR))를 발현하는 변형된 T 세포 (예컨대, 동종이계 T 세포, 내인성 TCR-결핍 T 세포, GvHD-최소화 T 세포) 중 어느 하나를 포함하는 키트, 유닛 투여량 및 제조 물품을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 약학 조성물 중 어느 하나를 함유하고 바람직하게는 이의 사용 지침을 제공하는 키트를 제공한다.
본 출원의 키트는 적합한 패키징 중에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 항아리 및 가요성 패키징 (예컨대, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 키트는 추가 구성요소, 예컨대, 완충액 및 해석 정보를 임의로 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알 (예컨대, 밀봉된 바이알), 병, 항아리 및 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
제조 물품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 (예컨대, 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환)를 치료하거나, 질환 또는 장애를 치료할 때 GvHD 또는 이식 거부를 감소/예방하는 데 효과적인 조성물을 담으며, 멸균 액세스 포트 (예를 들어, 용기는 정맥주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체의 특정 병태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 표지 또는 패키지 삽입물은 개체에 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 표지는 재구성 및/또는 사용 지침을 나타낼 수 있다. 약학 조성물을 담는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여 (예컨대, 2-6 회 투여)를 허용하는 다중-용도 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 이러한 치료적 생산물의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료적 생산물의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭한다. 추가로, 제조 물품은 약학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대, 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충된 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 복합 약국에서 저장 및 사용하기에 충분한 양으로 포장된, 약학 조성물 및 사용 지침의 다중 유닛 용량을 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
실시양태 1. 변형된 T 세포를 생산하는 방법으로서, Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계이되, 여기서 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 T 세포 수용체 (TCR)의 하향-조정을 초래하는 단계를 포함한다.
실시양태 2. 실시양태 1의 방법에 있어서, 여기서 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 단계를 포함한다.
실시양태 3. 실시양태 2의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 50% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 4. 실시양태 2 또는 3의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 60% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 5. 실시양태 2-4 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 70% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 6. 실시양태 2-5 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 80% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 7. 실시양태 2-6 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 90% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 8. 실시양태 2-7 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 95% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 9. 실시양태 1-8 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 비변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
실시양태 10. 실시양태 1-8 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
실시양태 11. 실시양태 10의 방법에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCRα 유전자좌를 포함한다.
실시양태 12. 실시양태 10 또는 11의 방법에 있어서, 여기서 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas (일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복체 (CRISPR)-CRISPR 연관 (Cas)) 시스템에 의해 변형된다.
실시양태 13. 실시양태 12의 방법에 있어서, 여기서 CRISPR-Cas 시스템은 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다.
실시양태 14. 실시양태 1-13 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 15. 실시양태 1-14 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 야생형 Nef이다.
실시양태 16. 실시양태 15의 방법에 있어서, 여기서 야생형 Nef는 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시양태 17. 실시양태 1-14 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다.
실시양태 18. 실시양태 17의 방법에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
실시양태 19. 실시양태 17 또는 18의 방법에 있어서, 여기서 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다.
실시양태 20. 실시양태 17-19 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함.
실시양태 21. 실시양태 1-20 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 전구체 T 세포는 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다.
실시양태 22. 실시양태 1-20 중 어느 하나의 방법에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 23. 실시양태 22의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 순차적으로 T 세포에 도입된다.
실시양태 24. 실시양태 22의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동시에 T 세포에 도입된다.
실시양태 25. 실시양태 24의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다.
실시양태 26. 실시양태 24의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다.
실시양태 27. 실시양태 26의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시양태 28. 실시양태 27의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다.
실시양태 29. 실시양태 27의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다.
실시양태 30. 실시양태 26-29 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연계된다.
실시양태 31. 실시양태 30의 방법에 있어서, 여기서 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것이되, n은 1 이상의 정수이다.
실시양태 32. 실시양태 25-31 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터이다.
실시양태 33. 실시양태 1-32 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 이식편-대-숙주 질환 (GvHD) 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다.
실시양태 34. 실시양태 1-33 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 35. 실시양태 1-34 중 어느 하나의 방법에 있어서, Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 CD3ε-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 36. 실시양태 1-35 중 어느 하나의 방법에 있어서, Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포로부터 내인성 TCRα- 음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 37. 실시양태 1-36 중 어느 하나의 방법에 있어서, Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 38. 실시양태 1-37 중 어느 하나의 방법에 있어서, Nef 단백질을 발현하는 변형된 T 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 39. 실시양태 38의 방법에 있어서, 여기서 개체는 암을 갖는다.
실시양태 40. 실시양태 38 또는 39의 방법에 있어서, 여기서 개체는 인간이다.
실시양태 41. 실시양태 21-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR이다.
실시양태 42. 실시양태 41의 방법에 있어서, 여기서 조작된 TCR은 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 43. 실시양태 42의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 44. 실시양태 42의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 45. 실시양태 21-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제1 TCR 공동-수용체의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제2 TCR 공동-수용체의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제3 TCR 공동-수용체의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고;
제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 46. 실시양태 45의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다.
실시양태 47. 실시양태 45의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다.
실시양태 48. 실시양태 21-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제2 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제3 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제4 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 49. 실시양태 48의 방법에 있어서, 여기서 적어도 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 50. 실시양태 48의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 51. 실시양태 21-40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 비-TCR 수용체이다.
실시양태 52. 실시양태 51의 방법에 있어서, 여기서 비-TCR 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
실시양태 53. 실시양태 52의 방법에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 54. 실시양태 52의 방법에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 항체-커플링된 TCR (ACTR)이다:
(a) Fc 수용체인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 55. 실시양태 42-53 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 56. 실시양태 55의 방법에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 sdAb 또는 scFv이다.
실시양태 57. 실시양태 42-56 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가이다.
실시양태 58. 실시양태 42-57 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가이다.
실시양태 59. 실시양태 58의 방법에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다중특이적이다.
실시양태 60. 실시양태 42-53, 55, 56, 58 및 59 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 sdAb 및 제2 sdAb를 포함한다.
실시양태 61. 실시양태 42-53, 55, 56, 58 및 59 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 scFv 및 제2 scFv를 포함한다.
실시양태 62. 실시양태 42-53 및 55-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 63. 실시양태 62의 방법에 있어서, 여기서 종양 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
실시양태 64. 실시양태 63의 방법에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 BCMA, CD19 또는 CD20의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb 또는 scFv를 포함한다.
실시양태 65. 실시양태 53-64 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
실시양태 66. 실시양태 65의 방법에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 67. 실시양태 42-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 68. 실시양태 67의 방법에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 69. 실시양태 68의 방법에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ 또는 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 70. 실시양태 53-69 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 71. 실시양태 70의 방법에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다.
실시양태 72. 실시양태 71의 방법에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137 (4-1BB)의 세포질 도메인을 포함한다.
실시양태 73. 실시양태 42-72 중 어느 하나의 방법에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
실시양태 74. 실시양태 73의 방법에 있어서, 여기서 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 75. 실시양태 42-74 중 어느 하나의 방법에 있어서, 기능적 외인성 수용체의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
실시양태 76. 실시양태 75의 방법에 있어서, 여기서 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 77. 실시양태 53 및 55-76 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α로부터 유래된 신호 펩티드, BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb, CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, CD8α로부터 유래된 막관통 도메인, CD137 (4-1BB)로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 78. 실시양태 1-77 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포.
실시양태 79. Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 변형된 T 세포로서, 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다.
실시양태 80. 실시양태 79의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 것을 포함한다.
실시양태 81. 실시양태 80의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 50% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 82. 실시양태 80 또는 81의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 60% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 83. 실시양태 80-82 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 70% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 84. 실시양태 80-83 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 80% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 85. 실시양태 80-84 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 90% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 86. 실시양태 80-85 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 95% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 87. 실시양태 79-86 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 비변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
실시양태 88. 실시양태 79-86 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함한다.
실시양태 89. 실시양태 88의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 내인성 TCRα 유전자좌를 포함한다.
실시양태 90. 실시양태 88 또는 89의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 내인성 TCR 유전자좌는 CRISPR-Cas 시스템에 의해 변형된다.
실시양태 91. 실시양태 90의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 CRISPR-Cas 시스템은 서열번호 23의 핵산 서열을 포함하는 gRNA를 포함한다.
실시양태 92. 실시양태 79-91 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 93. 실시양태 79-92 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 야생형 Nef이다.
실시양태 94. 실시양태 93의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 야생형 Nef는 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시양태 95. 실시양태 79-92 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다.
실시양태 96. 실시양태 95의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
실시양태 97. 실시양태 95 또는 96의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다.
실시양태 98. 실시양태 95-97 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함.
실시양태 99. 실시양태 79-98 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다.
실시양태 100. 실시양태 99의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 별개의 벡터 상에 있다.
실시양태 101. 실시양태 99의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 벡터 상에 있다.
실시양태 102. 실시양태 101의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시양태 103. 실시양태 102의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다.
실시양태 104. 실시양태 102의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다.
실시양태 105. 실시양태 101-104 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연계된다.
실시양태 106. 실시양태 105의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것이되, n은 1 이상의 정수이다.
실시양태 107. 실시양태 100-106 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 벡터는 바이러스 벡터이다.
실시양태 108. 실시양태 107의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 109. 실시양태 108의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
실시양태 110. 실시양태 79-109 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래되는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 GvHD 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다.
실시양태 111. 실시양태 99-110 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR이다.
실시양태 112. 실시양태 111의 방법에 있어서, 여기서 조작된 TCR은 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 113. 실시양태 112의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 114. 실시양태 112의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 115. 실시양태 99-110 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제1 TCR 공동-수용체의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제2 TCR 공동-수용체의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제3 TCR 공동-수용체의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고;
제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 116. 실시양태 115의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다.
실시양태 117. 실시양태 115의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다.
실시양태 118. 실시양태 99-110 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제2 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제3 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제4 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 119. 실시양태 118의 방법에 있어서, 여기서 적어도 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 120. 실시양태 118의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 121. 실시양태 99-110 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 비-TCR 수용체이다.
실시양태 122. 실시양태 121의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 비-TCR 수용체는 CAR이다.
실시양태 123. 실시양태 122의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 124. 실시양태 122의 방법에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 항체-커플링된 TCR (ACTR)이다:
(a) Fc 수용체인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 125. 실시양태 112-124 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 126. 실시양태 125의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 sdAb 또는 scFv이다.
실시양태 127. 실시양태 112-126 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가이다.
실시양태 128. 실시양태 112-126 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가이다.
실시양태 129. 실시양태 128의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다중특이적이다.
실시양태 130. 실시양태 128 또는 129의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 sdAb 및 제2 sdAb를 포함한다.
실시양태 131. 실시양태 128 또는 129의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 scFv 및 제2 scFv를 포함한다.
실시양태 132. 실시양태 112-123 및 125-131 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 133. 실시양태 132의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 종양 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
실시양태 134. 실시양태 133의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함한다.
실시양태 135. 실시양태 123-134 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
실시양태 136. 실시양태 135의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 137. 실시양태 112-136 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 138. 실시양태 137의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 139. 실시양태 138의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ 또는 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 140. 실시양태 123-139 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 공동-자극성 시그널링 도메인이다.
실시양태 141. 실시양태 140의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, CD353 (BLAME, SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다.
실시양태 142. 실시양태 141의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137 (4-1BB)의 세포질 도메인을 포함한다.
실시양태 143. 실시양태 112-142 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
실시양태 144. 실시양태 143의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 144. 실시양태 112-144 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 기능적 외인성 수용체의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
실시양태 145. 실시양태 144의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 146. 실시양태 123 및 125-145 중 어느 하나의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α로부터 유래된 신호 펩티드, BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb, CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, CD8α로부터 유래된 막관통 도메인, CD137 (4-1BB)로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 147. 실시양태 78-147 중 어느 하나의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 148. 개체의 질환을 치료하는 방법으로서, 실시양태 147의 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태 149. 실시양태 148의 방법에 있어서, 여기서 질환은 암이다.
실시양태 150. 실시양태 148 또는 149의 방법에 있어서, 여기서 개체는 변형된 T 세포가 유래되는 전구체 T 세포의 공여자와 조직비적합성이다.
실시양태 151. 실시양태 148-150 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 개체는 인간이다.
실시양태 152. 비-자연 발생 Nef 단백질로서, 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
실시양태 153. 실시양태 152의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열로부터 선택된다.
실시양태 154. 실시양태 152 또는 153의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 T 세포에서 발현시 비-자연 발생 Nef 단백질은 야생형 Nef 단백질과 비교하여 T 세포에서 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대해 감소된 하향-조정 효과를 갖는다.
실시양태 155. 실시양태 154의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 하향-조정은 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 것을 포함한다.
실시양태 156. 실시양태 155의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 50% 이상으로 감소된다.
실시양태 157. 실시양태 155 또는 156의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 60% 이상으로 감소된다.
실시양태 158. 실시양태 155-157 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 70% 이상으로 감소된다.
실시양태 159. 실시양태 155-158 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 80% 이상으로 감소된다.
실시양태 160. 실시양태 155-159 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 90% 이상으로 감소된다.
실시양태 161. 실시양태 155-160 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향-조절은 약 95% 이상으로 감소된다.
실시양태 162. 실시양태 152-161 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 T 세포에서 발현시 단리된 Nef 단백질은 T 세포에서 내인성 TCR의 하향-조정을 초래한다.
실시양태 163. 실시양태 162의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 하향-조정은 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 것을 포함한다.
실시양태 164. 실시양태 163의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 50% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 165. 실시양태 163 또는 164의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 60% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 166. 실시양태 163-165 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 70% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 167. 실시양태 163-166 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 80% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 168. 실시양태 163-167 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 90% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 169. 실시양태 163-168 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 내인성 TCR의 세포 표면 발현은 약 95% 이상으로 하향-조절된다.
실시양태 170. 실시양태 152-169 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 171. 실시양태 152-170 중 어느 하나의 비-자연 발생 Nef 단백질에 있어서, 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함.
실시양태 172. Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 바이러스 벡터.
실시양태 173. 실시양태 172의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 174. 실시양태 172 또는 173의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 야생형 Nef이다.
실시양태 175. 실시양태 174의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 야생형 Nef는 서열번호 12-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시양태 176. 실시양태 172 또는 173의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 Nef 단백질은 돌연변이 Nef이다.
실시양태 177. 실시양태 176의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
실시양태 178. 실시양태 176 또는 177의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 돌연변이는 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열을 포함한다.
실시양태 179. 실시양태 176-178 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 돌연변이 Nef는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 여기서 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함.
실시양태 180. 실시양태 172-179 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다.
실시양태 181. 실시양태 180의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시양태 182. 실시양태 181의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 프로모터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-la 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터 및 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 183. 실시양태 181 또는 182의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 업스트림에 있다.
실시양태 184. 실시양태 181 또는 182의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 제1 핵산은 제2 핵산의 다운스트림에 있다.
실시양태 185. 실시양태 180-184 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 제1 핵산 및 제2 핵산은 연결 서열을 통해 연계된다.
실시양태 186. 실시양태 185의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 연결 서열은 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 중 임의의 것이되, n은 1 이상의 정수이다.
실시양태 187. 실시양태 172-186 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 188. 실시양태 187의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
실시양태 189. 실시양태 180-188 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 조작된 TCR이다.
실시양태 190. 실시양태 189의 방법에 있어서, 여기서 조작된 TCR은 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 191. 실시양태 190의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 192. 실시양태 190의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 193. 실시양태 180-188 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제1 TCR 공동-수용체의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제2 TCR 공동-수용체의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제3 TCR 공동-수용체의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고;
제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 194. 실시양태 193의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 동일하다.
실시양태 195. 실시양태 193의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체는 상이하다.
실시양태 196. 실시양태 180-188 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제2 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제3 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제4 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 197. 실시양태 196의 방법에 있어서, 여기서 적어도 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 동일하다.
실시양태 198. 실시양태 196의 방법에 있어서, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛은 상이하다.
실시양태 199. 실시양태 180-188 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 기능적 외인성 수용체는 비-TCR 수용체이다.
실시양태 200. 실시양태 199의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 비-TCR 수용체는 CAR이다.
실시양태 201. 실시양태 200의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 202. 실시양태 200의 방법에 있어서, 여기서 CAR은 다음을 포함하는 항체-커플링된 TCR (ACTR)이다:
(a) Fc 수용체인 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 203. 실시양태 190-201 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일 쇄 Fv 항체 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 디설파이드 안정화된 Fv 단백질 (dsFv) 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 204. 실시양태 203의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 항원-결합 단편은 sdAb 또는 scFv이다.
실시양태 205. 실시양태 190-204 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 1가이다.
실시양태 206. 실시양태 190-204 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다가이다.
실시양태 207. 실시양태 206의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 다중특이적이다.
실시양태 208. 실시양태 206 또는 207의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 sdAb 및 제2 sdAb를 포함한다.
실시양태 209. 실시양태 206 또는 207의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 제1 scFv 및 제2 scFv를 포함한다.
실시양태 210. 실시양태 190-201 및 203-209 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, BCMA, CS1, CD138, CD123/IL3Rα, c-Met, gp100, MUC1, IGF-I 수용체, EpCAM, EGFR/EGFRvIII, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, WT1, ROR1, CEA, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, GPC3, 당지질 F77, PD-L1, PD-L2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 211. 실시양태 210의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 종양 항원은 BCMA, CD19 또는 CD20이다.
실시양태 212. 실시양태 211의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함한다.
실시양태 213. 실시양태 211의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 외 리간드 결합 도메인은 CD19 또는 CD20의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 scFv를 포함한다.
실시양태 214. 실시양태 201-213 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄, CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
194. 실시양태 193의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 215. 실시양태 190-214 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 면역 효과기 세포의 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 216. 실시양태 215의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 217. 실시양태 216의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 일차 세포 내 시그널링 도메인은 CD3ζ, CD3γ 또는 DAP12로부터 유래된다.
실시양태 218. 실시양태 201-217 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 세포 내 시그널링 도메인은 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 219. 실시양태 218의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, CD353 (BLAME, SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된다.
실시양태 220. 실시양태 219의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 공동-자극성 시그널링 도메인은 CD137 (4-1BB)의 세포질 도메인을 포함한다.
실시양태 221. 실시양태 190-220 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
실시양태 222. 실시양태 221의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 223. 실시양태 190-222 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 기능적 외인성 수용체의 N-말단에 위치하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
실시양태 224. 실시양태 23의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 신호 펩티드는 CD8α로부터 유래된다.
실시양태 225. 실시양태 201 및 203-224 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 여기서 CAR은 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: CD8α로부터 유래된 신호 펩티드, BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb, CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, CD8α로부터 유래된 막관통 도메인, CD137 (4-1BB)로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인 및 CD3ζ로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인.
실시양태 226. 실시양태 201 및 203-225 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지를 포함한다: Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산, P2A, IRES 또는 PGK를 코딩하는 제3 핵산, (GGGS)3 링커를 코딩하는 임의적인 제4 핵산, 및 BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산.
실시양태 227. 실시양태 201 및 203-225 중 어느 하나의 바이러스 벡터에 있어서, 다음의 업스트림에서 다운스트림까지를 포함한다: BCMA의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 하나 이상의 sdAb를 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 제2 핵산, P2A, IRES 또는 PGK를 코딩하는 제3 핵산, (GGGS)3 링커를 코딩하는 임의적인 제4 핵산, 및 Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산.
실시양태 228. 실시양태 172-227 중 어느 하나의 바이러스 벡터를 전구체 T 세포에 도입함으로써 수득된 변형된 T 세포.
실시양태 229. 실시양태 228의 변형된 T 세포에 있어서, 여기서 변형된 T 세포는 변형된 T 세포가 유래되는 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 GvHD 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어낸다.
실시양태 230. 실시양태 228 또는 229의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 231. 개체의 질환을 치료하는 방법으로서, 실시양태 230의 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태 232. 실시양태 231의 방법에 있어서, 여기서 질환은 암이다.
실시양태 233. 실시양태 231 또는 232의 방법에 있어서, 여기서 개체는 변형된 T 세포가 유래된 전구체 T 세포의 공여자와 조직비적합성이다.
실시양태 234. 실시양태 231-233 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 개체는 인간이다.
실시예
이하의 실시예 및 예시적인 실시양태는 순전히 본 발명을 예시하기위한 것이며, 따라서 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 다음 실시예 및 자세한 설명은 제한의 방식이 아니라 예시의 방식에 의해 제공된다.
실시예 1. SIV Nef는 TCR-매개 신호 전달을 억제한다
이 실시예는 SIV Nef를 발현하는 예시적인 T 세포의 설계 및 제조, 및 TCR- 매개 신호 전달에 대한 SIV Nef의 효과를 설명한다.
1. SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하는 SIV Nef-P2A-LNGFR 전달 플라스미드 및 Jurkat 세포주의 작제
pLVX-Puro는 HIV-1-기반의 렌티바이러스 발현 벡터이다. pLVX-hEF1α 벡터를 작제하기 위해, pLVX-Puro (Clontech) 벡터를 ClaI 및 EcoRI를 사용하여 효소적으로 소화하여 다중 클로닝 부위 (MCS) 바로 업스트림에 위치한 구성적으로 활성 인간 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터 (P CMV IE)를 제거한 다음, 인간 EF1α 프로모터 (GenBank: J04617.1)를 소화된 벡터에 클로닝하였다. 다음으로, SIV Nef, P2A 및 LNGFR (저-친화도 신경 성장 인자 수용체)을 코딩하는 융합 유전자를 순차적으로 작제하였다. 이어서, SIV Nef-P2A-LNGFR 융합 유전자 (서열번호 24)를 pLVX-hEF1α 플라스미드에 클로닝하여, 재조합 SIV Nef-P2A-LNGFR 전달 플라스미드 (이하 "PLLV-M071"로서 지칭됨, "M071"로서 약칭됨)를 생성하였다. M071 재조합 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이를 -80 ℃에 저장하였다.
Jurkat 세포 (Clone E6-1, ATCC® TIB-152™)를 90% RPMI 1640 배지 (Life Technologies, #22400-089), 10% 소 태아 혈청 (FBS, Life Technologies, #10099-141) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies, #15140-122)에서 배양하였다. SIV nef-P2A-LNGFR 융합 유전자를 운반하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상층액에 첨가하였다. LNGFR은 SIV Nef+ 세포의 선택 마커로서 사용되었다. 형질도입 60 시간 후, 5x105 개의 Jurkat 세포는 아래와 같이 Life Attune NxT FACS (FACS)를 사용하여 유세포분석을 수행하였으며, LNGFR+ 세포 백분율은 66.1%였다. 1x107 개의 세포의 다른 부분을 DPBS로 재현탁한 다음, 20 μL MACSelect LNGFR MicroBeads (Miltenyi Biotec, #130-091-330)로 보충하고, 자성 표지를 위해 얼음에서 15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, PBE 완충액 (소듐 포스페이트/EDTA)을 첨가하여 부피를 500 μL로 조정하였다. 이어서, 세포 현탁액을 MACS 키트 프로토콜 (Miltenyi Biotec 키트, #130-091-330)에 따라 자성 분리 및 농축하여 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하는 94.3% LNGFR+ Jurkat 세포주를 생성하였다 (도 1a).
FACS (형광-활성화 세포 분류기)
간단히 말해서, 세포 현탁액을 실온에서 1000 rpm/분으로 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁한 다음, 항체를 첨가하여 4 ℃에서 30 분 동안 항온처리하였다. 이 실시예에서, 사용된 항체는 1μL PerCP/Cy5.5 항-인간 CD271 NGFR 항체 (BioLegend®, #345111)였다. 항온처리 후, 세포 현탁액을 실온에서 1000 rpm/분에서 원심분리하고, 상층액을 버린 다음, 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하였다. DPBS 단계를 포함하는 원심분리 및 재현탁을 1 회 반복하였다. 이어서, 세포를 FACS를 위해 0.4 mL DPBS로 재현탁하였다.
MACS (자성-활성화 세포 분류)
간단히 말해서, 세포 현탁액을 실온에서 1000 rpm/분으로 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁한 다음, 20 μL MACSelect LNGFR MicroBeads (Miltenyi Biotec, #130-091-330)로 보충하고, 자성 표지를 위해 얼음에서 15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, PBE 완충액 (소듐 포스페이트/EDTA)을 첨가하여, 부피를 500 μL로 조정하였다. 이어서, 세포 현탁액을 MACS 키트 프로토콜에 따라 자성 분리 및 농축을 수행하였다.
2. TCRα 녹-아웃 (KO) 작제물 및 TCRα-결핍 Jurkat 세포주의 작제
인간 TRAC (T 세포 수용체 알파 상수; GenBank: NC_018925.2)를 표적화하는 gRNA 서열 (서열번호 23)은 CRISPR/Cas9 기술을 위해 설계되었고, 렌티CRISPR v2 벡터 (Addgene Plasmid, #52961, 퓨로마이신 선택 마커를 함유함)에 서브-클로닝되어, TCRα KO 재조합 플라스미드를 작제하였다. TCRα KO 재조합 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여, 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이를 -80 ℃에 저장하였다.
Jurkat 세포 (Clone E6-1, ATCC® TIB-152™)를 상기와 같이 배양하였다. TCRα KO 서열을 운반하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상층액에 첨가하였다. 형질도입 72 시간 후, 최종 농도 1 μg/mL의 퓨로마이신을 첨가하였다. 배양 배지를 3 일마다 교체하고 동일한 농도의 퓨로마이신을 보충하여 단일 세포 클론을 추가로 스크리닝하였다.
3. SIV Nef는 TCR/CD3-매개 신호 전달을 억제한다
SIV Nef 과-발현이 TCR/CD3를 통한 신호 전달에 영향을 미치는지 테스트하기 위해, LNGFR+ Jurkat 세포, 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT), TCRα KO Jurkat 세포 및 빈 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 위에서 설명한 바와 같이 MACS에 의해 단리한 다음, T 세포 활성화를 위해 피토헤마글루티닌 (PHA, 2 μg/mL)으로 유도하였다. PHA는 TCR을 포함하는 글리코실화된 표면 단백질의 당에 결합하여, 이들을 가교한다. 이는 NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자) 활성화로 이어지는 칼슘-의존적 시그널링 경로를 유발한다. PHA-자극 3 일 후, 각각의 Jurkat 세포 유형으로부터의 5x105 개의 세포를 FACS를 사용하여 CD69+ 비율에 대해 테스트하였다. 위와 같이 FACS를 수행하였으며, 1 μL PE 항-인간 CD69 항체 (BioLegend®, #310906)를 사용하였다.
도 1b (패널의 왼쪽 2 개의 컬럼)에 도시된 바와 같이, PHA 자극 후, CD69 양성 비율은 형질도입되지 않은 Jurkat 세포의 경우 41.1%, TCRα KO Jurkat 세포의 경우 1.09%, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포의 경우 60.1% 및 M071 (SIV Nef-P2A-LNGFR) LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포의 경우 7.05%였다. 이러한 결과는 TCR-매개 T 세포 활성화가 SIV Nef 과-발현시 유의하게 억제되었음을 입증하였다 (P <0.05).
4. SIV Nef는 TCR/CD3 복합체의 신호 전달 다운스트림을 억제하지 않는다
SIV Nef 과-발현이 TCR/CD3의 신호 전달 다운스트림에 영향을 미치는지 테스트하기 위해, Jurkat 세포주를 PMA (포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 10 ng/mL) 및 ION (이오노마이신, 250 ng/mL)의 혼합물로 유도한 다음, T-세포 활성화 마커 CD69의 발현을 FACS로 테스트하였다 (위의 방법 참고). PMA는 단백질 키나제 C (PKC)의 특이적 활성화제이며 따라서 NF-κB의 특이적 활성화제이다. ION은 세포 안팎으로 Ca2+의 전달을 촉진하는 막 투과성 칼슘 이오노포어이며, 세포 내 칼슘 수준을 증가시키는 데 사용할 수 있다. PMA 및 ION의 조합은 신호 전달 장치를 우회하고 전사 인자 NF-κB 및 NFAT를 활성화하여, T-세포 활성화를 야기한다. 도 1b (패널의 오른쪽 2 개의 컬럼 참고)에 보여진 바와 같이, PMA/ION 자극시, 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT), TCRα KO Jurkat 세포, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포 및 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포의 CD69+ 비율은 각각 96.7%, 97.1%, 98.5% 및 87.4%였다. 이러한 결과는 다운스트림 핵내 신호 전달이 SIV Nef 과-발현시 유의하게 영향을 받지 않음을 입증하였다.
요약하면, 위의 결과는 Nef가 TCR-매개된 업스트림 T-세포 활성화를 유의하게 억제하지만, TCR의 핵내 신호 전달 다운스트림에는 영향을 미치지 않음을 입증하였다.
실시예 2. SIV Nef는 T 세포 표면 상의 TCR/CD3 복합체 발현을 하향-조절한다
5x105 개의 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT), TCRα KO Jurkat 세포, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포 및 실시예 1에 기재된 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포를 수득하고 CD3ε 및 TCRαβ 양성 비율 조사를 위해 FACS를 수행하였다. FACS는 실시예 1에서와 같이 수행되었다. 1 μL PE/Cy7 항-인간 CD3 항체 (BioLegend®, #300316) 또는 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710)가 FACS에 사용되었다.
별개의 실험으로, 1x106 개의 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT), TCRα KO Jurkat 세포, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포 및 실시예 1에 기재된 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포를 수집하고, 실온에서 1000 rpm/분에서 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁하고, 100 μL Immunol Staining Fix Solution (Beyotime, #P0098)을 첨가하여 실온에서 20 분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 실온에서 1500 rpm/분에서 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 세포를 200 μL DPBS+Triton X-100 (0.1%)으로 실온에서 20 분 동안 재현탁하였다. 그 다음, 1 μL FITC 접합된 CD3ζ/CD247 항체 (Life Technologies, #A15754)를 첨가하고 세포 현탁액을 실온에서 15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포 현탁액을 실온에서 1500 rpm/분에서 원심분리하고, 상층액을 버린 다음, 세포를 1 mL DPBS로 재현탁하였다. DPBS 단계를 포함하는 원심분리 및 재현탁을 1 회 반복하였다. 이어서, 세포를 CD3ζ 양성 비율 조사를 위해 FACS를 위한 0.4 mL DPBS로 재현탁하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, CD3ε 발현이 높은 Jurkat 세포 및 TCRαβ를 발현하는 세포는 SIV Nef 발현시 유의하게 감소하였다. M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포의 CD3ε+ 비율 15.6% 및 TCRαβ+ 비율 15.3%를 형질도입되지 않은 (UnT) Jurkat 세포의 비율 (각각, 85.9% 및 90.0%)과 비교하였다. CD3ζ+ 비율은 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포의 경우 93.2%였으며, 이는 형질도입되지 않은 Jurkat 세포의 비율 (95.6%)과 유의하게 상이하지 않았다. 대조군으로서, 빈 벡터 발현은 형질도입되지 않은 (UnT) Jurkat 세포와 비교하여 CD3ε, TCRαβ 및 CD3ζ의 Jurkat 세포 발현에 영향을 미치지 않는다.
이러한 결과는 SIV Nef 과-발현이 TCR/CD3 복합체의 T 세포 표면 발현을 유의하게 하향-조절하고 (CD3ζ 발현은 영향을 받지 않음), 결과적으로 TCR-매개 T 세포 활성화에 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
실시예 3. SIV Nef 상동체 HIV1 Nef 및 HIV2 Nef는 TCR/CD3-매개 신호 전달을 억제한다
1. HIV1 Nef/HIV2 Nef-T2A-Puro 전달 플라스미드 및 세포주의 작제
UniProt 데이터베이스 분석에 기반하여, HIV1 Nef 및 HIV2 Nef가 SIV Nef 상동체로서 회수되었다. 융합 유전자 HIV1 nef-T2A-Puro (서열번호 25) 및 HIV2 nef-T2A-Puro (서열번호 26)를 작제하고, pLVX-hEF1α 발현 벡터 (실시예 1에서와 같이 작제)에 클로닝하여, 각각 재조합 전달 플라스미드 HIV1 Nef-T2A-Puro (이하 "HIV1" 전달 플라스미드로서 지칭됨) 및 HIV2 Nef-T2A-Puro (이하 "HIV2" 전달 플라스미드로서 지칭됨)를 형성하였다. HIV1 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. HIV2 전달 플라스미드를 정제하고 psPAX2 및 pMD2.G 플라스미드를 사용하여 HEK 293T 세포에 유사하게 형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이를 -80 ℃에 저장하였다.
Jurkat 세포 (Clone E6-1, ATCC® TIB-152™)를 실시예 1에서와 같이 배양하였다. HIV1 Nef-T2A-Puro 또는 HIV2 Nef-T2A-Puro 융합 서열을 운반하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상층액에 첨가하였다. 퓨로마이신은 HIV1/HIV2 Nef+ 세포에 대한 선택 마커로서 사용되었다. 형질도입 72 시간 후, 최종 농도 1 μg/mL의 퓨로마이신을 첨가하였다. 배양 배지를 3 일마다 교체하고 동일한 농도의 퓨로마이신을 보충하여, 단일 세포 클론을 추가로 스크리닝하였다.
2. HIV1 Nef/HIV2 Nef는 T 세포 표면 상의 TCR/CD3 복합체 발현을 하향-조절한다
5x105 개의 HIV1 Nef+ Jurkat 세포, HIV2 Nef+ Jurkat 세포, 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 (UnT), TCRα KO Jurkat 세포, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포, 실시예 1에 기재된 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포를 CD3ε 및 TCRαβ 양성 비율 조사를 위해 FACS를 수행하였다. FACS는 실시예 1에서와 같이 수행되었고, 1 μL PE/Cy7 항-인간 CD3 항체 (BioLegend®, #300316) 또는 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710)가 FACS에 사용되었다. 별개의 실험으로서, 1x106 개의 HIV1 Nef+ Jurkat 세포, HIV2 Nef+ Jurkat 세포, 형질도입되지 않은 (UnT) Jurkat 세포, TCRα KO Jurkat 세포, 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포 및 실시예 1에 기재된 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포를 수집하고, 고정시키고, 실시예 2에서와 같이 CD3ζ 양성 비율 조사를 위해 FACS를 수행하였다. 1 μL FITC 접합된 CD3ζ/CD247 항체 (Life Technologies, #A15754)를 FACS에 사용하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, TCRαβ+ 비율은 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포, HIV1 Nef+ Jurkat 세포 및 HIV2 Nef+ Jurkat 세포에 대해 각각 16.1%, 15.1% 및 26.2%였으며, 이는 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포의 비율 (96.5%; P <0.05)보다 유의하게 낮았다. CD3ε+ 비율은 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포, HIV1 Nef+ Jurkat 세포 및 HIV2 Nef+ Jurkat 세포에 대해 각각 19.4%, 18.1% 및 30.6%였으며, 이는 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포의 비율 (98.2%; P <0.05)보다 유의하게 낮았다. TCRα KO Jurkat 세포는 양성 대조군으로서 역할을 하였으며, 이는 유의하게 감소된 TCRα+ 및 CD3ε+ 비율을 나타냈다. 반면, CD3ζ+ 비율은 M071 LNGFR+ 농축된 Jurkat 세포, HIV1 Nef+ Jurkat 세포 및 HIV2 Nef+ Jurkat 세포에 대해 각각 99.0%, 94.3%, 95.0%였으며, 이는 형질도입되지 않은 (UnT) Jurkat 세포 또는 빈 벡터를 발현하는 Jurkat 세포의 비율 (각각 98.0% 및 99.7%; P> 0.05)과 유의하게 상이하지 않았다.
이러한 결과는 SIV Nef 상동체 HIV1 Nef 및 HIV2 Nef의 과-발현이 TCR/CD3의 세포 표면 발현을 효과적으로 하향-조절할 수 있음을 입증하고 (CD3ζ 발현은 영향을받지 않음), 이는 결과적으로 TCR/CD3-매개 T 세포 활성화를 억제한다. HIV1 Nef 및 HIV2 Nef의 억제 효율은 SIV Nef의 억제 효율과 비슷하다.
실시예 4. SIV Nef는 표적 세포의 TCR-매개 세포 용해를 억제한다
1. 항-BCMA CAR 및 항-BCMA CAR-LNGFR 전달 플라스미드의 작제
항-BCMA CAR (이하 "BCMA CAR"로서 지칭됨)은 WO2017025038 및 WO2018028647 실시예에 기재된 바와 같이 작제되었다. 여기에 기재된 모든 BCMA CAR 작제물의 서열을 포함하여 WO2018028647의 전체 내용은 구체적으로 본원에 참고로 원용된다.
간단히 말해서, 다음의 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 CAR 백본 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, 사전-변형된 렌티바이러스 벡터 다운스트림에 클로닝하고, 구성적 hEF1α 프로모터 (실시예 1에서와 같이 구성된 pLVX-hEF1α)에 작동가능하게 연결한다: CD8α 힌지 도메인 ("CD8α 힌지"), CD8 막관통 도메인 ("CD8 TM"), CD28 세포질 도메인 ("CD28 cyto") 및/또는 4-1BB (CD137) 세포질 도메인 ("4-1BB cyto") 및 CD3ζ 세포질 도메인 ("CD3ζ").
융합 서열 BCMA CAR-P2A-LNGFR을 운반하는 BCMA CAR-P2A-LNGFR 전달 플라스미드를 작제하기 위해, BCMA CAR-P2A-LNGFR 유전자를 Genscript에 의해 직접 작제하였다.
BCMA CAR-P2A-LNGFR 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이를 -80 ℃에 저장하였다.
2. SIV Nef 및 항-BCMA CAR 공동-발현 테스트
BCMA CAR 및 SIV Nef-P2A-LNGFR 플라스미드를 정규 폴리에티엔이민 (PEI) 형질도입 프로토콜을 사용하여 HEK 293T 세포에 공동-형질주입하였다. 형질주입-3 일 후, 5x105 개의 세포를 FACS를 이용하여 BCMA CAR+ 및 LNGFR+ 발현에 대해 조사하였다. FACS는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA/TNFRSF17 단백질, Fc 태그 (ACROBiosystems, #BCA-HF254) 및 1 μL PerCP/Cy5.5 항-인간 CD271 NGFR 항체 (BioLegend®, #345111)를 혼합하여 FACS에 사용하였다.
도 4a에 도시된 바와 같이. HEK 293T 세포에 공동-형질주입된 BCMA CAR 및 SIV Nef-P2A-LNGFR 플라스미드는 17.3% BCMA CAR+/LNGFR+ 이중 양성 세포를 생산하였다. 이는 BCMA CAR이 SIV Nef의 과-발현시 세포 표면에서 여전히 효과적으로 발현할 수 있음을 나타냈다.
3. SIV Nef는 일차 T 림프구에서 TCR 세포 표면 발현을 유의하게 억제한다
지원자로부터 50 mL 말초 혈액을 추출하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 통해 단리되었다. Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하여 PBMC를 자성 표지하고, T 림프구를 단리 및 정제하였다. 인간 T 세포 활성화/확장 키트 (Miltenyi Biotec, #130-091-441)는 정제된 T 림프구의 활성화 및 확장을 위해 사용되었다. 활성화된 T 림프구를 수집하고 RPMI 1640 배지 (Thermo Fisher SCIENTIFIC, #22400-089)에 재현탁하였다. 활성화 3 일 후, 5x106 개의 활성화된 T 림프구를 SIV Nef-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스 및 BCMA CAR-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질도입하였다. T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37 ℃, 5% CO2 항온처리기에서 밤새 항온처리하였다. 형질도입 5 일 후, 1x107 개의 T 세포를 수확하고, (실시예 1에 기재된 바와 같이, MACSelect LNGFR MicroBeads (Miltenyi Biotec, #130-091-330)와 함께) MACS를 사용하여 분리하여, LNGFR+ T 세포를 수득하였다. 분류된 LNGFR+ T 세포를 2 일 동안 확장하고 농축한 다음, 5x105 개의 LNGFR+ T 세포를 FACS에 의해 TCRαβ 양성 비율에 대해 테스트하였다. FACS를 실시예 1에서와 같이 수행하였고, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710)가 사용되었다.
도 4b에 도시된 바와 같이, BCMA CAR-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스 및 SIV Nef-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 T 세포를 공동-형질도입하면 LNGFR+ T 세포 집단에서 35.8% TCRαβ- 세포가 생성되었다. 이는 BCMA CAR-P2A-LNGFR 및 SIV Nef-P2A-LNGFR 공동-형질도입이 TCRαβ 음성 CAR-T 세포를 효과적으로 생산할 수 있음을 나타낸다.
4. TCR/CD3-고갈된 T 림프구 분류 및 농축
BCMA CAR-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스 및 SIV Nef-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스를 사용하여, 5x107 개의 일차 T 림프구를 공동-형질도입하였다. 형질도입 5 일 후, Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하여 세포를 자성 표지하고, 키트 프로토콜에 따라 CD3ε 음성 T 림프구를 분리 및 정제하였다. 분류된 CD3ε 음성 T 세포를 2 일 동안 확장하고 농축한 다음, (각각의 FACS 실험을 위해) 5x105 개의 세포를 수집하고 CD3ε 음성 T 세포 집단 내의 TCRαβ, CD3ε 및 LNGFR 양성 비율에 대해 FACS에 의해 조사하였다. FACS는 실시예 1에서와 같이 수행되었고, 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710)가 TCRαβ+ 테스트에 사용되었고, 1 μL PE/Cy7 항-인간 CD3 항체 (BioLegend®, #300316)가 CD3ε+ 테스트에 사용되었으며, 1 μL PerCP/Cy5.5 항-인간 CD271 NGFR 항체 (BioLegend®, #345111)가 LNGFR+ 테스트에 사용되었다.
도 4c에 도시된 바와 같이, BCMA CAR-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스 및 SIV Nef-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질도입된 MACS-분류된 CD3ε 음성 T 세포 집단의 TCRαβ+ 비율은 5.35%였고, CD3ε+ 비율은 2.27%였고, LNGFR+ 비율은 88.5%였으나 ("MACS CD3 음성 패널" 참고); MACS 분류된 형질도입되지 않은 (UnT) T 세포의 경우 TCRαβ+ 비율은 80.9%였고, CD3ε+ 비율은 91.9%였으며, LNGFR+ 비율은 오직 1.25%였다. 이는 MACS에 의한 CD3ε 음성 세포 분류가 TCR 음성 일차 T 림프구를 추가로 단리하고 농축할 수 있음을 나타낸다.
5. TCR/CD3-고갈된 T 림프구에서 유의하게 감소된 표적 세포에 대한 TCR-매개 세포용해 활성
BCMA CAR-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스 및 위의 단계로부터 수득된 SIV Nef-P2A-LNGFR을 코딩하는 렌티바이러스를 이용하여 공동-형질도입된 분류된 CD3ε 음성 T 세포의 상이한 그룹을 20:1 또는 10:1의 효과기 대 표적 (E:T) 세포 비 하에서 다발성 골수종 (MM) 세포주 RPMI-8226 (BCMA+, 루시퍼라제 (Luc) 마커 포함) 또는 만성 골수성 백혈병 (CML) 세포주 K562 (BCMA-, Luc 마커 포함)와 혼합하고, 12 시간 동안 Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 항온처리하였다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, #E6120)을 사용하여 루시퍼라제 생산을 측정하였다. 25 μL ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 항온처리한 다음, 루시퍼라제 측정을 위해 Spark™ 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기 (TECAN)에 배치하여, 표적 세포에 대한 상이한 T 림프구의 세포용해 효과를 계산하였다.
RPMI-8226 및 K562 세포주에 대한 CAR+/CD3ε- T 세포의 특이적 및 비-특이적 세포용해 효과를 추가로 연구하였다. 도 4d에 도시된 바와 같이, TCR 발현 수준에 관계없이 BCMA CAR-P2A-LNGFR 및 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하는 농축된 CD3ε 음성 T 세포 (CD3ε+/TCRαβ+, "TCR pos" 또는 CD3ε-/TCRαβ-, "TCR neg")는 90% 초과의 용해율로 RPMI-8226 세포 (BCMA+)에서 항-BCMA CAR-특이적 종양 세포 사멸을 효과적으로 매개하며, 이는 형질도입되지 않은 T-세포 ("UnT"; P <0.05)에서보다 유의하게 높다. 반면, BCMA CAR-P2A-LNGFR 및 SIV Nef-P2A-LNGFR을 발현하는 농축된 CD3ε 음성 T 세포는, TCRαβ를 발현하는 세포 (CD3ε+/TCRαβ+)가 TCRαβ를 발현하지 않는 세포 (CD3ε-/TCRαβ-)보다 더 많은 세포 용해를 보였으므로 K562 세포주 (BCMA-)에서 TCR-매개 비-특이적 종양 세포 사멸을 유도하며, 이러한 세포용해 효과는 형질도입되지 않은 T-세포 (UnT; P> 0.05)에서와 비슷하였다. 일차 T 세포와 함께 항온처리되지 않은 Luc-표지된 세포는 음성 대조군 (NC)으로서 역할을 한다. 0.25% Triton X-100 화학적 용해 그룹은 양성 대조군 (PC)으로서 역할을 한다. 더 높은 E:T 비율은 RPMI-8226 및 K562 세포주 둘 모두에서 더 많은 세포-사멸을 초래하였으며, 이는 렌티바이러스-매개 종양 세포 사멸로 인한 것 같다. 이러한 결과는 SIV Nef의 발현이 TCRαβ-매개 T-세포 활성화를 효과적으로 억제하여, 표적 세포에 대한 감소된 TCR-매개 세포용해 효과를 유발함을 나타낸다.
실시예 5. 하나의 단계로 TCR/CD3-고갈된 CAR-T 세포의 수득
1. SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터 및 Jurkat 세포주 작제
융합 유전자 서열 BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef, BCMA CAR-P2A-SIV Nef, BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef, SIV Nef-P2A-BCMA CAR, SIV Nef-IRES-CAR, CAR-IRES-SIV Nef, CAR-PGK-SIV Nef 및 SIV Nef-PGK-CAR을 화학적으로 합성하고, 재조합 전달 플라스미드 BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef ("PLLV-M072" 또는 "M072"), BCMA CAR-P2A-SIV Nef ("PLLV-M086" 또는 "M086"), BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef ("PLLV-M090" 또는 "M090"), SIV Nef-P2A-BCMA CAR ("PLLV-M091" 또는 "M091"), SIV Nef-IRES-BCMA CAR ("PLLV-M126" 또는 "M126"), BCMA CAR-IRES-SIV Nef ("PLLV-M159" 또는 "M159"), BCMA CAR-PGK-SIV Nef ("PLLV-M160" 또는 "M160") 및 SIV Nef-PGK-BCMA CAR ("PLLV-M161" 또는 "M161")의 작제를 위해 pLVX-hEF1α 벡터 (실시예 1 참고)에 클로닝하였다. 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득하였으며, 이를 -80 ℃에 저장하였다.
2. 하나의 단계로 TCR/CD3-고갈된 CAR-T 세포의 수득
BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef, BCMA CAR-P2A-SIV Nef, BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef, SIV Nef-P2A-BCMA CAR, SIV Nef-IRES-BCMA CAR, BCMA CAR-IRES-SIV Nef, BCMA CAR-PGK-SIV Nef 및 SIV Nef-PGK-BCMA CAR 서열을 각각 운반하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 배양된 Jurkat 세포 현탁액에 첨가하였다. 렌티바이러스 SIV Nef-P2A-LNGFR (M071)은 비-CAR 코딩 대조군으로서 사용되었다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포 ("UnT")를 음성 대조군으로서 사용하였다. 형질도입-72 시간 후, 5x105 개의 세포를 함유하는 현탁액을 수집하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 FACS를 위해 제조하여, CD3ε, TCRαβ 및 BCMA CAR의 양성 비율을 조사하였다. 1 μL PE/Cy7 항-인간 CD3 항체 (BioLegend®, #300316), 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710) 또는 1 μL FITC-표지된 인간 BCMA/TNFRSF17 단백질, Fc 태그 (ACROBiosystems, #BCA-HF254)가 FACS에 사용되었다.
도 5a-5c로부터 알 수 있는 바와 같이, SIV Nef-P2A-CAR (M091), SIV Nef-IRES-CAR (M126), CAR-IRES-SIV Nef (M159), CAR-PGK-SIV Nef (M160), SIV Nef-PGK-CAR (M161)의 TCRαβ- 비율은 각각 59.1%, 82.7%, 50.4%, 43.5%, 95.0%였으며, TCRαβ는 UnT 그룹 (12.6%)과 비교하여 유의하게 하향조절되었다. 한편, CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef (M072), CAR-P2A-SIV Nef (M086), CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef (M090) TCRαβ- 비율은 각각 7.94%, 16.3%, 15.4%였으며, 형질도입되지 않은 (UnT) 그룹 (12.6%)과 비교하여 유의한 상이함이 없었다. 위의 이러한 결과는 자가-절단 펩티드 P2A (M091)를 통해 SIV Nef의 C' 말단에 작제된 CAR이 충분한 CAR 발현을 보존하면서 TCR/CD3의 세포 표면 발현을 하향-조절할 수 있음을 나타냈다. 그러나 한편, SIV Nef 단백질의 N-말단 공간 구조는 TCR/CD3 복합체의 세포 표면 발현을 하향-조절하는 데 중요하며, Nef 단백질의 N' 말단의 M072, M086 및 M090 벡터 잔류 절단된 P2A 아미노산은 이의 기능에 유의하게 영향을 받을 가능성이 있다. 아래 표 5는 CD3ε, TCRαβ 및 BCMA CAR의 발현에 대한 SIV Nef CAR 올-인-원 플라스미드의 효과를 요약한다.
표 5. TCR/CD3 복합체 및 CAR의 발현에 대한 올-인-원 플라스미드 및 효과
실시예 6. T 세포 CD4 및 CD28 발현에 대한 감소된 음성 효과를 갖는 Nef 돌연변이체 및 서브타입
Nef 단백질 상의 특정 아미노산은 CD4 및 CD28에 결합할 수 있고, 이어서 T 세포 상에서 CD4, CD28 발현을 하향-조절할 수 있다 (표 6 참고). CD4 및 CD28 발현 및 기능에 대한 Nef의 음성 효과를 감소시키기 위해, 본 발명자들은 서브타입 Nef (HIV F2-Nef, HIV C2-Nef, HIV HV2NZ-Nef) 및 돌연변이 Nef ("mutNef"로서 지칭됨)를 추가로 설계하고 작제하였다.
표 6. Nef 아미노산의 기능
1. 서브타입 또는 돌연변이 Nef 플라스미드 및 다양한 Nef-발현 세포주의 작제
본 발명자들은 CD4 및 CD28 결합에 중요한 돌연변이된 아미노산을 갖는 SIV Nef 서열을 설계하였다. 본 발명자들은 또한 다른 SIV Nef 돌연변이체 및 HIV Nef 상동체를 설계하였다. 서브타입 Nef-P2A-LNGFR 또는 mutNef-P2A-LNGFR 융합 서열을 화학적으로 합성한 다음, 실시예 1에 기재된 바와 같이 pLVX-hEF1α 플라스미드에 클로닝하여, 서브타입 Nef-P2A-LNGFR 및 mutNef-P2A-LNGFR 전달 플라스미드를 생성하였다 (서브타입 또는 돌연변이된 Nef 구조에 대해 표 7 및 돌연변이체 서열에 대해 "서열 목록" 섹션 참고). M016 (스크램블된 서열)은 음성 대조군으로서 사용되었다. 실시예 1에서 작제된 M071 (야생형 SIV Nef-P2A-LNGFR)을 양성 대조군으로서 사용하였다.
표 7. Nef 돌연변이체 및 서브타입의 구조
표 7로부터의 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입 60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80 ℃에 저장하였다.
Jurkat 세포 (Clone E6-1, ATCC®TIB-152™)를 실시예 1에서와 같이 배양하였다. 표 6에서와 같은 융합 서열을 운반하는 렌티바이러스를 형질도입을 위해 Jurkat 세포 배양물의 상층액에 첨가하였다. 퓨로마이신은 Nef+ 세포에 대한 선택 마커로서 사용되었다. 형질도입 72 시간 후, 최종 농도 1 μg/mL의 퓨로마이신을 첨가하였다. 배양 배지를 3 일마다 교체하고 동일한 농도의 퓨로마이신을 보충하여 단일 세포 클론을 추가로 스크리닝하였다.
2. T 세포 상의 CD4 및 CD28 발현에 대한 서브타입 또는 돌연변이 Nef의 효과 테스트
형질도입-72 시간 후, 5x105 개의 Jurkat 세포를 함유하는 현탁액을 수집하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 FACS를 위해 제조하여, CD3ε, TCRαβ, CD4 및 CD28의 양성 비율을 조사하였다. 1 μL PE/Cy7 항-인간 CD3 항체 (BioLegend®, #300316), 1 μL PE/Cy5 항-인간 TCR α/β 항체 (BioLegend®, #306710), 1 μL PE-CD4 또는 APC 항-인간 CD28 항체가 FACS에 사용되었다.
도 6a-6d로부터 알 수 있는 바와 같이, M116으로 형질도입된 Jurkat 세포 (SIV Nef 돌연변이체 1 또는 SIV Nef M116)는 88.5% TCRαβ-음성 비율, 86.6% CD3ε-음성 비율을 나타냈으며, 이는 73.3% TCRαβ-음성 비율, 87.3% CD3ε-음성 비율을 나타내는 M071로 형질도입된 세포 (wt SIV Nef; P >0.05)의 비율과 유의하게 상이하지 않다. 반면, M116으로 형질도입된 Jurkat 세포 (SIV Nef 돌연변이체 1 또는 SIV Nef M116)는 7.44% CD4-음성 비율 및 1.67% CD28-음성 비율만을 나타냈으며, 이는 M071로 형질도입된 Jurkat 세포 (wt SIV Nef; P <0.05)에서 53.3% CD4-음성 비율 및 72.9% CD28-음성 비율보다 유의하게 낮았다. 이 결과는 야생형 SIV Nef 단백질과 비교하여 M116 플라스미드에서의 SIV Nef 돌연변이체 1이 T 세포 표면 상의 TCR/CD3 복합체 발현을 효과적으로 하향-조절할 수 있는 반면, CD4 및 CD28 발현에 대한 하향-조절 효과는 거의 없음을 나타낸다. M117 (SIV Nef 돌연변이체 2), M118 (SIV Nef 돌연변이체 3), M142 (SIV Nef 돌연변이체 4) 및 M143 (SIV Nef 돌연변이체 5)은 T 세포 표면 상의 CD4 및 CD28 발현을 보존하면서 TCR/CD3 복합체 발현을 효과적으로 하향-조절하는 유사한 효과를 가졌다 (즉, 훨씬 더 적은 CD4 하향-조절 효과 및/또는 CD28 하향-조절 효과를 가짐). HIV 서브타입 Nef 단백질 (M119, M120 및 M121)은 또한 CD4 발현에 대한 하향-조절 효과가 거의 없었지만, T 세포 표면 상의 TCR/CD3 복합체에 대한 하향-조절 효과는 SIV Nef 돌연변이체 (M116, M117, M118, M142 및 M143)만큼 양호하지 않았다. 표 8은 T 세포 상의 TCRαβ, CD3ε, CD4 및 CD28 발현에 대한 상이한 Nef 서브타입 및 돌연변이체의 효과를 요약한다.
표 8. T 세포 상의 TCRαβ, CD3ε, CD4 및 CD28 발현에 대한 Nef 서브타입 또는 돌연변이체의 효과
실시예 7. CAR-T 세포 면역요법에서 SIV Nef의 사용
1. SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터 작제
융합 유전자 서열 SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR (서열번호 48), SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR (서열번호 49), SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR (서열번호 50), SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR (서열번호 51), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 (서열번호 52), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 (서열번호 53), SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR (서열번호 54)을 화학적으로 합성한 다음, 각각 재조합 전달 플라스미드 PLLV-M167, PLLV-M168, PLLV-M169, PLLV-M170, PLLV-M171, PLLV-M172 및 PLLV-M173 (표 9 참고)의 작제를 위해 pLVX-hEF1α 발현 벡터 (실시예 1 참고)에 클로닝하였다.
전달 플라스미드를 정제하고 psPAX2 및 pMD2.G 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포에 유사하게 형질도입시켰다. 형질도입-60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하고, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 이용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80 ℃에 저장하였다.
표 9. 예시적인 SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터
2. 하나의 단계로 TCR 음성 CAR-T 세포의 수득
Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하여 해동된 PBMC로부터 T 세포를 수득하였다. 단리된 T 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 씨딩한 다음, 제조사의 지침에 따라 MicroBeads (Miltenyi Biotec, #130-111-160)를 보충하고, 37 ℃, 5% CO2 항온처리기에서 72 시간 동안 항온처리하였다.
SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR, SIV Nef-IRES-CD20 scFv CAR, SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR, SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1, SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 또는 SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR 서열을 운반하는 렌티바이러스를 각각 형질도입을 위해 배양된 일차 T 세포 현탁액에 첨가하였다. 형질도입 후, TCR 음성 CAR-T 세포를 MACS와 함께 TCRαβ 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-092-614)를 사용하여 단리하고 농축하였다.
MACS 1 일 후, 농축된 5x105 개의 TCRαβ 음성 세포를 함유하는 현탁액을 수집하고 TCRαβ의 발현을 조사하기 위해 FACS를 위해 제조하였다.
도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T 세포 비율은 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물로 형질도입된 T 세포에서 상당히 높은 반면, MACS 후 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 1.14%의 TCRαβ 음성 비율만을 생산하였다. SIV Nef-IRES-CD20 scFv (리툭시맙) CAR (M167) T 세포 (89.7%), SIV Nef-IRES-CD20 scFv (Leu-16) CAR (M168) T 세포 (93.3%), SIV Nef-IRES-CD19xCD20 scFv CAR (M169) T 세포 (92.1%), SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR (M170) T 세포 (93.6%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 (M171) T 세포 (93.5%), SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 (M172) T 세포 (87.9%) 및 SIV Nef-IRES-BCMA 모노-VHH CAR (M173) T 세포 (94.0%)에 대한 MACS-후 TCRαβ 음성 비율을 참고한다.
그 다음, 위의 단계로부터의 MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포, MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)를 상이한 효과기 대 표적 (E:T) 세포 비율 하에서 각각 표적 세포 또는 종양 세포와 혼합하고, 12 시간 동안 Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 항온처리하였다. K562-CD20은 CD20 형질도입된 골수성 백혈병 세포주이다. Raji는 B-세포 림프종 세포주 (CD19+, CD20+, BCMA-)이다. K562-CD19는 CD19 형질도입된 골수성 백혈병 세포주이다. RPMI-8226은 BCMA를 발현하는 다발성 골수종 세포주이다. One-GloTM 루시퍼라제 검정 시스템 (TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25 μL One-GloTM 시약을 384-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 항온처리 후, 형광을 SparkTM 10M 다중모드 마이크로플레이트 판독기 (TECAN)를 사용하여 측정하여, 표적 세포에서 상이한 T 림프구의 세포독성 비율을 계산하였다. MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포는 TCR이 SIV Nef에 의해 고갈되지 않았기 때문에 TCR-매개 비-특이적 사멸 활성을 나타내는 반면, MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포는 TCR이 거의 고갈되었으므로 주로 CAR-매개 특이적 사멸 활성을 나타낼 것이라는 것이 시나리오이다.
도 8a-8b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물로 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 및 대조군으로서의 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)와 함께, 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물로 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포의 CAR-매개 특이적 종양 세포독성을 입증한다. 도 8a-8b로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포는 MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 종양 세포 사멸 활성을 보였고, 종양 세포 사멸 활성은 E:T 비와 양의 상관관계가 있다 (E:T가 높을수록 CAR-매개 사멸 효능이 더 우수하다)
도 9a-9b는 다양한 SIV Nef+CAR 올-인-원 작제물로 형질도입된 MACS-분류된 TCRαβ 양성 및 음성 T 세포의 TCR-매개 비-특이적 사멸 효율을 입증한다. H929는 인간 다발성 골수종 세포주 (CD19-, CD20-)이다. KG1은 인간 급성 골수성 백혈병 세포주 (CD19-)이다. Raji는 버킷 림프종 세포주 (CD19+, CD20+, BCMA-)이다. K562는 골수성 백혈병 세포주 (CD20-, CD19-, BCMA-)이다. 도 9a-9b로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS-분류된 TCRαβ 음성 T 세포 (CAR을 발현하고 TCR을 거의 또는 전혀 발현하지 않음)는 예상대로 표적 세포에서 거의 또는 전혀 사멸 활성을 나타내지 않았는데, 이는 상응하는 CAR-항원 (예컨대, CD19, CD20, BCMA)이 상응하는 테스트된 표적 세포에서 발현되지 않았기 때문이며; 반면 MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포 (TCR 만 발현)는 훨씬 더 높은 TCR-매개 비-특이적 종양 세포 사멸을 일으켰다.
이러한 결과는 SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터가 TCRαβ 음성 CAR-T 세포를 생성하기 효과적이고 쉬우며, 이는 CAR-매개 특이적 종양 세포 사멸을 효과적으로 유발할 수 있고 (P <0.05) TCR-매개 비-특이적 세포독성이 없음을 나타낸다. 따라서, 본원에 예시된 SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터는 표적 세포에서 CAR 발현 및 CAR-매개 특이적 세포독성을 유지하면서 TCRαβ 발현 및 일차 T 세포에서의 기능을 효과적으로 감소시킬 수있다.
실시예 8. CAR-T 세포 면역요법에서 SIV Nef 돌연변이체의 사용
SIV Nef M116 서열 (실시예 6의 SIV Nef 돌연변이체 1 참고)은 SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터를 작제하기 위해 이 실험에서 사용되었다. 융합 유전자 서열 BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116 (서열번호 62)을 화학적으로 합성하고, PLVX-hEF1α 발현 플라스미드에 클로닝하여 (실시예 1 참고), 재조합 BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116 전달 플라스미드 (이하 "PLLV-M133"로서 지칭됨)를 생성하였다. PLLV-M133 재조합 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입-60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80 ℃에 저장하였다.
실시예 7에 기재된 바와 같이 일차 T 세포를 수득한 다음, PLLV-M133을 운반하는 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 후, TCR 음성 CAR-T 세포를 MACS와 함께 TCRαβ 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotec, #130-092-614)를 사용하여 단리하고 농축하였다. MACS 1 일 후, 농축된 5x105 개의 TCRαβ 음성 세포를 함유하는 현탁액을 수집하고 TCRαβ의 발현을 조사하기 위해 FACS를 위해 제조하였다.
도 10a에 도시된 바와 같이, MACS 농축-후 TCRαβ 음성 M133 CAR-T 세포 비는 99.7%였다. 형질도입되지 않은 T 세포는 대조군으로서 역할을 하며, 이는 1.38% TCRαβ 음성 비율만을 나타냈다.
실시예 7에 기재된 바와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. K562는 골수성 백혈병 세포주 (BCMA-)이다. RPMI-8226은 BCMA를 발현하는 다발성 골수종 세포주이다. 도 10b 왼쪽 패널로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS-분류된 TCRαβ 음성 M133 CAR-T 세포는 MACS-분류된 TCRαβ 양성 M133 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 RPMI-8226 세포 (BCMA+)에서 유의하게 더 높은 세포독성 (34.99 ± 6.20%)을 나타냈으며, 이는 CAR-T 매개 특이적 종양 세포 사멸을 반영한다. MACS-분류된 TCRαβ 음성 M133 T 세포는 K562 세포 (BCMA-)에서 TCR-매개 비-특이적 세포 사멸이 거의 없었고 (0.90 ± 3.45%), MACS-분류된 TCRαβ 양성 T 세포는 훨씬 더 높은 TCR-매개 비-특이적 세포 사멸을 유발하였다 (도 10b 오른쪽 패널).
이러한 결과는 돌연변이 SIV Nef 서열을 운반하는 SIV Nef+CAR 올-인-원 벡터가 또한 TCRαβ 음성 CAR-T 세포를 생성하기 효과적이고 쉬우며, SIV Nef-IRES-CAR 및 CAR-IRES-SIV Nef의 조직은 둘 다 효과적으로 작동함을 나타낸다 (실시예 7 및 8 비교). 두 서열 조직 모두는 표적 세포에서 CAR 발현 및 CAR-매개 특이적 세포독성을 유지하면서 TCRαβ 발현 및 일차 T 세포에서의 기능을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
실시예 9. 키메라 TCR-T (cTCR-T) 세포 면역요법에서 SIV Nef 돌연변이체의 사용
SIV Nef M116 서열 (실시예 6의 M116, SIV NEF 돌연변이체 1 참고) 및 항-CD20 키메라 TCR (cTCR) 서열은 SIV-Nef+키메라 TCR 올-인-원 벡터를 작제하기 위해 이 실험에서 사용되었다. 항-CD20 cTCR은 항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-CD3ε의 구조 (신호 펩티드를 제외한 전장)를 가지며, 아미노산 서열은 서열번호 64이다. 항-CD20 cTCR 융합 폴리펩티드를 천연 TCR 복합체에 혼입함으로써, 변형된 TCR 복합체는 HLA에 대한 필요없이 CD20을 발현하는 종양 세포를 인식하고 완전한 TCR 기작을 관여시켜, 강력한, 조정된 및 내구성이 있는 종양 사멸을 필요로 하는 완전한 T 세포 기능을 구동할 수 있다. 융합 유전자 서열 SIV Nef M116-IRES-CD20 cTCR (서열번호 63)을 화학적으로 합성하고, PLVX-hEF1α 발현 플라스미드에 클로닝하여 (실시예 1 참고), 재조합 SIV Nef M116-IRES-CD20 cTCR 전달 플라스미드를 생성하였다 (이하 "PLLV-M572"로서 지칭됨). PLLV-M572 재조합 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입-60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80 ℃에 저장하였다. TCRαβ 음성 CD20-cTCR 양성 T 세포는 실시예 7에 기재된 바와 같이 PLLV-M572를 운반하는 렌티바이러스를 이용하여 일차 T 세포를 형질도입한 다음, MACS 농축함으로써 제조하였다. TCRαβ의 발현은 위에 기재된 바와 같은 유사한 방법에 따라 조사되었다. 도 11a에 도시된 바와 같이, MACS 농축-후 TCRαβ 음성 T-세포 비율은 PLLV-M572로 형질도입된 T 세포의 경우 94.9%였고, 형질도입되지 않은 T 세포는 0.599% TCRαβ 음성 비율만을 가졌다.
실시예 7에 기재된 바와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. K562는 골수성 백혈병 세포주 (CD20-, CD19-, BCMA-)이다. Raji는 버킷 림프종 세포주 (CD19+, CD20+, BCMA-)이다. 도 11b 왼쪽 패널로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 cTCR-T 세포는 MACS-분류된 TCRαβ 양성 M572 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Raji 세포 (CD20+)에서 유의하게 더 높은 세포독성 (49.21±22.96%)을 나타내며, 이는 CD20 cTCR 매개 특이적 종양 세포 사멸을 반영한다. 또한, MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 cTCR-T 세포의 사멸 효능은 E:T 비가 높을수록 더 높았다. MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 cTCR-T 세포는 K562 세포 (CD20-)에서 내인성 TCR 매개 비-특이적 세포 사멸이 거의 없는 (3.76±4.31%) 반면, MACS-분류된 TCRαβ 양성 M572 T 세포는 훨씬 더 높은 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포 사멸을 유발하였다 (도 11b 오른쪽 패널).
이러한 놀라운 결과는 SIV Nef+cTCR 올-인-원 벡터가 외인성 cTCR과 통합된 TCR 복합체의 기능에 영향을 주지 않으면서 일차 T 세포에서 내인성 TCRαβ 발현 및 기능을 효과적으로 하향-조절할 수 있음을 나타낸다. 또한, TCRαβ 음성 cTCR-T 세포는 종양 세포에 대한 cTCR 특이적 세포독성을 효과적으로 매개하였으며 (P <0.05), 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성이 거의 또는 전혀 없다.
실시예 10. TAC-T 세포 면역요법에서 SIV Nef 돌연변이체의 사용
SIV Nef M116 (실시예 6의 M116, SIV NEF 돌연변이체 1 참고)은 SIV Nef+CD20 TAC 올-인-원 벡터를 작제하기 위해 이 실험에서 사용되었다. 항-CD20 TAC는 항-CD20 scFv (Leu-16)-(GGGGS)3-huUCHT1.Y177T-GGGGS-CD4 (부분적 세포 외 도메인 + 막관통 도메인 + 세포 내 도메인)의 구조를 포함하며, 아미노산 서열은 서열번호 66이다. huUCHT1은 CD3ε을 표적화한다. 융합 유전자 서열 SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC (서열번호 65)를 화학적으로 합성하고, PLVX-hEF1α 발현 플라스미드에 클로닝하여 (실시예 1 참고), 재조합 SIV Nef-IRES-CD20 TAC 전달 플라스미드를 생성하였다 (이하 "PLLV-M574"로서 지칭됨). PLLV-M574 재조합 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례적으로 혼합한 다음, HEK 293T 세포에 공동-형질도입하였다. 형질도입-60 시간 후, 바이러스 상층액을 수집하고, 4 ℃, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다.상층액을 0.45 μm 필터를 사용하여 여과한 다음, 500 KD 중공 사막 접선 유동 여과를 사용하여 추가로 농축하여 농축된 렌티바이러스를 수득한 다음, -80 ℃에 저장하였다. TCRαβ 음성 TAC-T 세포는 실시예 7에 기재된 바와 같이 PLLV-M574를 운반하는 렌티바이러스로 일차 T 세포를 형질도입한 다음, MACS 농축함으로써 제조하였다. TCRαβ의 발현은 위에 기재된 바와 같은 유사한 방법에 따라 조사되었다. 도 12a에 도시된 바와 같이, MACS 농축-후 PLLV-M574로 형질도입된 T 세포의 TCRαβ 음성 비율은 95.5%인 반면, 형질도입되지 않은 T 세포 (UnT)는 0.971% TCRαβ 음성 비율만을 가졌다.
실시예 7에 기재된 바와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. Raji는 버킷 림프종 세포주 (CD20+)이다. H929는 인간 다발성 골수종 세포주 (CD20-)이다. 도 12b 왼쪽 패널로부터 알 수 있는 바와 같이, MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 TAC-T 세포는 MACS-분류된 TCRαβ 양성 M574 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 Raji 세포 (CD20+)에서 유의하게 더 높은 세포독성 (54.58±20.03%)을 일으키며, 이는 항-CD20 TAC 매개 특이적 종양 세포 사멸을 반영한다. 또한, MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 TAC-T 세포의 사멸 효능은 E:T 비가 높을수록 더 높았다. MACS-분류된 TCRαβ 음성 CD20 TAC-T 세포는 H929 세포 (CD20-)에서 내인성 TCR 매개 비-특이적 세포 사멸이 거의 없는 (3.33±2.80%) 반면, MACS-분류된 TCRαβ 양성 M574 T 세포는 훨씬 더 높은 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포 사멸를 유발하였다 (도 12b 오른쪽 패널).
이러한 놀라운 결과는 SIV Nef+TAC 올-인-원 벡터가 TAC의 발현 및 기능에 영향을 주지 않으면서 일차 T 세포에서 내인성 TCRαβ 발현 및 기능을 효과적으로 하향-조절할 수 있음을 나타낸다. 또한, TCRαβ 음성 TAC-T 세포는 종양 세포에 대한 TAC 특이적 세포독성을 효과적으로 매개하였으며 (P <0.05), 내인성 TCR-매개 비-특이적 세포독성이 거의 또는 전혀 없다.
실시예 11. TCRαβ, CD4 및 CD28 조절을 위한 SIV Nef 도메인 요소의 테스트
전장 SIV Nef는 223 개의 아미노산을 갖는다. Nef 단백질 상의 특정 아미노산은 CD4 및 CD28에 결합한 다음, T 세포에서 CD4, CD28 발현을 하향-조절할 수 있다 (실시예 6, 표 6 참고). TCRαβ, CD4 및 CD28 발현 및 기능에 대한 다양한 Nef 도메인 요소의 효과를 테스트하기 위해, 제1 메티오닌을 제외하고 전장 서열에 걸쳐 3 개의 연속적인 아미노산을 알라닌-알라닌-알라닌 (AAA)으로 돌연변이시킴으로써 74 개의 돌연변이체를 설계하였다. 이들 돌연변이체 핵산 서열을 화학적으로 합성하고, PLVX-hEF1α 발현 플라스미드에 클로닝하여 (실시예 1 참고), 74 개의 재조합 SIV Nef 돌연변이체 전달 플라스미드를 생성하였다. 각각의 재조합 전달 플라스미드를 운반하는 렌티바이러스를 위에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 예컨대, 실시예 7을 참고한다. Jurkat 세포를 각각 74 개의 렌티바이러스에 의해 감염시켰고, 양성 세포 클론을 2 주 동안 1 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 선택하였다. Jurkat 세포 상의 TCRαβ, CD4 및 CD28의 발현은 상기 기재된 바와 같이 FACS에 의해 조사되었으며, 예컨대, 실시예 1을 참고한다. 형질도입되지 않은 Jurkat 세포는 음성 대조군으로서 역할을 한다. M071 (야생형 SIV Nef) 또는 M116 (SIV Nef M116, 실시예 6 참고)으로 형질도입된 Jurkat 세포 양성 대조군으로서 역할을 한다. TCRαβ, CD4 및 CD28 발현의 조절에 대한 SIV Nef 돌연변이체의 효과의 추가 평가를 위해 3% 이상의 조절이 컷오프로서 간주되었다. 예를 들어, 돌연변이 SIV Nef에 의한 TCRαβ의 하향-조절 수준이 야생형 SIV Nef에 의해 하향-조절된 것과 0% (0% 포함) 내지 3% 미만으로 상이한 경우, 또는 돌연변이 SIV Nef가 야생형 SIV Nef에 의한 것과 비교하여 3% 초과로 (또는 이와 동등하게) TCRαβ를 하향-조절하는 경우, 돌연변이 SIV Nef는 "야생형 SIV Nef와 비교하여 유사한 (또는 초과의) TCRαβ 하향-조절"을 갖는 것으로 간주되었다. 돌연변이 SIV Nef가 야생형 SIV Nef에 의한 것과 비교하여 CD4 (및/또는 CD28)를 3% 미만으로 하향-조절하는 경우, 이러한 돌연변이 SIV Nef는 "야생형 SIV Nef와 비교하여 더 적은 CD4 하향-조절" (및/또는 "야생형 SIV Nef와 비교하여 더 적은 CD28 하향-조절")을 갖는 것으로 간주되었다.
도 13a-13c에 도시된 바와 같이, 74 개의 SIV Nef 돌연변이체를 야생형 SIV Nef (M071)와 비교하여 TCRαβ, CD4 및 CD28 발현을 조절하는 능력에 대해 나란히 스크리닝하였다. 돌연변이 위치와 이들의 상응하는 기능은 표 10에 열거되어 있다. 이 스크리닝 실험은 뚜렷한 조절 기능을 가진 다양한 세트의 SIV Nef 돌연변이체를 생성하였다. 34 개의 SIV Nef 돌연변이체는 야생형 SIV Nef (M071)와 비교하여 TCRαβ 발현에 대한 하향-조절 효과를 유지하였다. 이들 중 18 개의 돌연변이체는 야생형 SIV Nef와 비교하여 더 적은 CD4의 하향-조절을 나타냈고, 19 개의 돌연변이체는 야생형 SIV Nef와 비교하여 더 적은 CD28의 하향-조절을 나타냈으며, 16 개의 돌연변이체는 야생형 SIV Nef (M071)의 TCRαβ 하향조절 효과를 유지할뿐만 아니라 야생형 SIV Nef (M071)와 비교하여 CD4 및 CD28에 대한 더 적은 하향-조절 효과를 갖는다. 자세한 요약은 표 11을 참고한다.
표 10. 야생형 SIV Nef (M071)와 비교한 SIV Nef 돌연변이체의 조절 효과
표 11. TCRαβ, CD4 및 CD8 발현에 대한 SIV Nef 아미노산 돌연변이 부위의 효과 요약
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> Nanjing Legend Biotech Co., Ltd.
<120> NEF-CONTAINING T CELLS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF
<130> 76142-20017.41
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> PCT/CN2018/097235
<151> 2018-07-26
<160> 66
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> Simian Immunodeficiency Virus
<400> 1
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 2
<211> 618
<212> DNA
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 2
atgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg attggatggc ctactgtaag ggaaagaatg 60
agacgagctg agccagcagc agatagggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat 120
ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg cttgtgcctg gctagaagca 180
caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 240
tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 300
attcactccc aaagaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 360
ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420
tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataagatag aagaggccaa taaaggagag 480
aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagtg 540
ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600
gagtacttca agaactgc 618
<210> 3
<211> 771
<212> DNA
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 3
atgggtgcga gtggatccaa gaagctttcc aagcattcgc gaggactacg agagagactc 60
ttgcgggcgc gtggggatgg ttatgggaag cagcgcgacg catcgggagg ggaatactcg 120
cagttccaag aagaatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcagtat 180
cagcagggag agtacatgaa cagcccatgg agaaacccag caacagaaag acagaaagat 240
ttgtataggc agcaaaatat ggatgatgta gattctgatg atgatgacct aataggagtt 300
cctgttacac caagagtacc acggagagaa atgacctata aattggcaat agatatgtca 360
cattttataa aagaaaaagg gggactgcaa gggatgtttt acagtaggag gagacataga 420
atcctagaca tatacctaga aaaagaggaa gggataatac cagattggca gaattatact 480
catgggccag gagtaaggta cccaatgtac ttcgggtggc tgtggaagct agtatcagta 540
gaactctcac aagaggcaga ggaagatgag gccaactgct tagtacaccc agcacaaaca 600
agcagacatg atgatgagca tggggagaca ttagtgtggc agtttgactc catgctggcc 660
tataactaca aggccttcac tctgtaccca gaagagtttg ggcacaagtc aggattgcca 720
gagaaagaat ggaaggcaaa actgaaagca agagggatac catatagtga a 771
<210> 4
<211> 630
<212> DNA
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 4
atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata gttggatggc ctgatataag agagagaatg 60
agacgaactg agccagcagc agagccagca gcagaaggag taggagcagc gtctcaagac 120
ttagataaac atggagcact tacaagtagc aacacaaaca ccactaatgc tgattgtgct 180
tggccggaag cgcaagagga tgaaggagaa gtaggctttg cagtcagacc tcagagtcct 240
ttaagaccaa tgacttataa gggagcattt gatctcggct tctttttaaa agaaggggga 300
ctggaagggt taatttactc taagaaaagg caagagatcc ttgatttgtg ggtctatcat 360
acacaaggct acttccctga ttggcaaaac tacacaccgg gaccaggggt cagataccca 420
ctgacttttg ggtggtgctt caagctggta ccagttgacc caaaggcagt agaagaggcc 480
aacgaaggag aagacaactg tctgctacac ccagtgtgcc agcatggaat ggaggatgaa 540
cacagagaag tattaatgtg gaagtttgac agtcaactag cacgcagaca catggcccga 600
gagctacatc cggagttcta caaagactgc 630
<210> 5
<211> 387
<212> DNA
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 5
atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata ggtggatggc ctcagataag agagagaatg 60
agacgaactg agccagcagt agagccagca gcagagccag cagcagaagg agtaggagca 120
gcgtggctac ttcctgattg gcaaaactac acaccgggac caggagtcag atacccactg 180
acttttgggt ggtgcttcaa gctggtacca gtagacccag gggcagtaga agaggccaac 240
gaaggagaaa acaactgttt gctacacccg gtgtgccagc atggaatgga ggatgagcaa 300
agagaagtat tagtgtgcaa gtttgacagt ctactagcac gcagacacat ggcccgcgag 360
ctacatccgg agttctacaa agactgc 387
<210> 6
<211> 540
<212> DNA
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 6
atgggtgcga gtggatccaa gaagcgttcc aagcccttgc aaggactaca agagagactc 60
ttgcaggcgc ggggagagac ttgtggaggg cgctgcaacg aatcgggagg gggatacttg 120
cagtcccacg aaggatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcgatat 180
cagcagggag attttgtaaa taccccatgg agaaccccag cagcagaaag ggagaaagaa 240
ttgtacaaac agcaaaatat ggatgatgta gatctagatg atgatgacca agtaggattc 300
cctgtcacac caagagtacc attaagacca atgacattca aattggcagt agatatgtct 360
cattttataa aagaaaaagg gggactggaa gggctgtttt atagtcagag aagacataga 420
atcttagact tatacttaga caaggctttt actctgtacc cagaggaatt tgggcataat 480
tcaggactgc cagagaaaga gtggaaggcg agactgaaag caaggggaat accatttagt 540
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 8
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 9
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggagcat cacaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 10
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggagcat cacaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 11
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> Simian Immunodeficiency Virus
<400> 12
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Leu Met His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 13
<211> 206
<212> PRT
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 13
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Ile Gly Trp Pro Thr Val
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Arg Val Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu
50 55 60
Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly
85 90 95
Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr
115 120 125
Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys
130 135 140
Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Ile Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu
145 150 155 160
Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro
165 170 175
Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His
180 185 190
His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys
195 200 205
<210> 14
<211> 257
<212> PRT
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 14
Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Lys Leu Ser Lys His Ser Arg Gly Leu
1 5 10 15
Arg Glu Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Gly Lys Gln Arg
20 25 30
Asp Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Ser Gln Phe Gln Glu Glu Ser Gly Arg
35 40 45
Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Gln Tyr Gln Gln Gly Glu
50 55 60
Tyr Met Asn Ser Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Gln Lys Asp
65 70 75 80
Leu Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Leu Ile Gly Val Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Arg Arg Glu Met Thr
100 105 110
Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly
115 120 125
Leu Gln Gly Met Phe Tyr Ser Arg Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile
130 135 140
Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr
145 150 155 160
His Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu Trp Lys
165 170 175
Leu Val Ser Val Glu Leu Ser Gln Glu Ala Glu Glu Asp Glu Ala Asn
180 185 190
Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Arg His Asp Asp Glu His Gly
195 200 205
Glu Thr Leu Val Trp Gln Phe Asp Ser Met Leu Ala Tyr Asn Tyr Lys
210 215 220
Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Lys Ser Gly Leu Pro
225 230 235 240
Glu Lys Glu Trp Lys Ala Lys Leu Lys Ala Arg Gly Ile Pro Tyr Ser
245 250 255
Glu
<210> 15
<211> 210
<212> PRT
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 15
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Ile Val Gly Trp Pro Asp Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Thr Glu Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Glu
20 25 30
Gly Val Gly Ala Ala Ser Gln Asp Leu Asp Lys His Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Asn Thr Asn Thr Thr Asn Ala Asp Cys Ala Trp Pro Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Asp Glu Gly Glu Val Gly Phe Ala Val Arg Pro Gln Ser Pro
65 70 75 80
Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Phe Asp Leu Gly Phe Phe Leu
85 90 95
Lys Glu Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Lys Lys Arg Gln Glu
100 105 110
Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp
115 120 125
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly
130 135 140
Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Pro Lys Ala Val Glu Glu Ala
145 150 155 160
Asn Glu Gly Glu Asp Asn Cys Leu Leu His Pro Val Cys Gln His Gly
165 170 175
Met Glu Asp Glu His Arg Glu Val Leu Met Trp Lys Phe Asp Ser Gln
180 185 190
Leu Ala Arg Arg His Met Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe Tyr Lys
195 200 205
Asp Cys
210
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 16
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Ile Gly Gly Trp Pro Gln Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Thr Glu Pro Ala Val Glu Pro Ala Ala Glu
20 25 30
Pro Ala Ala Glu Gly Val Gly Ala Ala Trp Leu Leu Pro Asp Trp Gln
35 40 45
Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp
50 55 60
Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Pro Gly Ala Val Glu Glu Ala Asn
65 70 75 80
Glu Gly Glu Asn Asn Cys Leu Leu His Pro Val Cys Gln His Gly Met
85 90 95
Glu Asp Glu Gln Arg Glu Val Leu Val Cys Lys Phe Asp Ser Leu Leu
100 105 110
Ala Arg Arg His Met Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe Tyr Lys Asp
115 120 125
Cys
<210> 17
<211> 180
<212> PRT
<213> Human Immunodeficiency Virus
<400> 17
Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Lys Arg Ser Lys Pro Leu Gln Gly Leu
1 5 10 15
Gln Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Cys Gly Gly Arg Cys
20 25 30
Asn Glu Ser Gly Gly Gly Tyr Leu Gln Ser His Glu Gly Ser Gly Arg
35 40 45
Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Arg Tyr Gln Gln Gly Asp
50 55 60
Phe Val Asn Thr Pro Trp Arg Thr Pro Ala Ala Glu Arg Glu Lys Glu
65 70 75 80
Leu Tyr Lys Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Gln Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
100 105 110
Phe Lys Leu Ala Val Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Phe Tyr Ser Gln Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu
130 135 140
Tyr Leu Asp Lys Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Asn
145 150 155 160
Ser Gly Leu Pro Glu Lys Glu Trp Lys Ala Arg Leu Lys Ala Arg Gly
165 170 175
Ile Pro Phe Ser
180
<210> 18
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 18
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 19
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 19
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Ala Ala Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 20
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 20
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Ala Ala Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu His His Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 21
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 21
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu His His Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 22
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 22
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 23
gagaatcaaa atcggtgaat 20
<210> 24
<211> 1578
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 24
gaattcatgg gctccagcaa ctccaagagg cagcaacagg gcttgctcaa gctctggcga 60
gggctgcgag ggaagcctgg ggcagactgg gtgctattgt ccgatccgct tatcgggcag 120
tcatcaacag tccaagaaga gtgcggcaag gccttgaaaa agtcctgggg taaaggtaaa 180
atgactccag acggccgccg cctgcaagaa ggagacacct ttgatgagtg ggatgatgat 240
gaagaagaag taggcttccc tgtgcaacct cgagtcccct taagacagat gacctataaa 300
ttagcagtgg acttttccca ctttttaaaa tcaaaggggg gactggatgg gatatattac 360
tctgaaagaa gagaaaagat cctgaatttg tatgccttga acgagtgggg aataatagat 420
gattggcaag cttactcacc aggcccgggg ataaggtacc cgagagtctt tggcttctgc 480
tttaagctag tcccagtgga cctgcatgag gaggcacgca actgtgagag acactgtctg 540
atgcatccag cacagatggg ggaagatcct gatggaatag atcatggaga agtcttggtc 600
tggaagtttg acccgaagtt ggcggtggag taccgcccgg acatgtttaa ggacatgcac 660
gaacatgcaa agcgcacgcg tggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 720
ggagacgtgg aggagaaccc tggacctgga tccatggggg caggtgccac cggccgcgcc 780
atggacgggc cgcgcctgct gctgttgctg cttctggggg tgtcccttgg aggtgccaag 840
gaggcatgcc ccacaggcct gtacacacac agcggtgagt gctgcaaagc ctgcaacctg 900
ggcgagggtg tggcccagcc ttgtggagcc aaccagaccg tgtgtgagcc ctgcctggac 960
agcgtgacgt tctccgacgt ggtgagcgcg accgagccgt gcaagccgtg caccgagtgc 1020
gtggggctcc agagcatgtc ggcgccgtgc gtggaggccg acgacgccgt gtgccgctgc 1080
gcctacggct actaccagga tgagacgact gggcgctgcg aggcgtgccg cgtgtgcgag 1140
gcgggctcgg gcctcgtgtt ctcctgccag gacaagcaga acaccgtgtg cgaggagtgc 1200
cccgacggca cgtattccga cgaggccaac cacgtggacc cgtgcctgcc ctgcaccgtg 1260
tgcgaggaca ccgagcgcca gctccgcgag tgcacacgct gggccgacgc cgagtgcgag 1320
gagatccctg gccgttggat tacacggtcc acacccccag agggctcgga cagcacagcc 1380
cccagcaccc aggagcctga ggcacctcca gaacaagacc tcatagccag cacggtggca 1440
ggtgtggtga ccacagtgat gggcagctcc cagcccgtgg tgacccgagg caccaccgac 1500
aacctcatcc ctgtctattg ctccatcctg gctgctgtgg ttgtgggcct tgtggcctac 1560
atagccttct gatctaga 1578
<210> 25
<211> 1305
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 25
gaattcatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt agtgtgattg gatggcctac tgtaagggaa 60
agaatgagac gagctgagcc agcagcagat agggtgggag cagcatctcg agacctggaa 120
aaacatggag caatcacaag tagcaataca gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta 180
gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca 240
atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 300
gggctaattc actcccaaag aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa 360
ggctacttcc ctgattggca gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc 420
tttggatggt gctacaagct agtaccagtt gagccagata agatagaaga ggccaataaa 480
ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg agcctgcatg ggatggatga cccggagaga 540
gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg 600
catccggagt acttcaagaa ctgcactagt ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta 660
acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaacgcgta tgaccgagta caagcccacg 720
gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc 780
gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc 840
gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg 900
gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg 960
ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa 1020
cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc 1080
gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga 1140
gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac 1200
ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga 1260
ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgag gatcc 1305
<210> 26
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 26
gaattcatgg gtgcgagtgg atccaagaag ctttccaagc attcgcgagg actacgagag 60
agactcttgc gggcgcgtgg ggatggttat gggaagcagc gcgacgcatc gggaggggaa 120
tactcgcagt tccaagaaga atcaggcagg gagcagaact cgccctcctg tgagggacag 180
cagtatcagc agggagagta catgaacagc ccatggagaa acccagcaac agaaagacag 240
aaagatttgt ataggcagca aaatatggat gatgtagatt ctgatgatga tgacctaata 300
ggagttcctg ttacaccaag agtaccacgg agagaaatga cctataaatt ggcaatagat 360
atgtcacatt ttataaaaga aaaaggggga ctgcaaggga tgttttacag taggaggaga 420
catagaatcc tagacatata cctagaaaaa gaggaaggga taataccaga ttggcagaat 480
tatactcatg ggccaggagt aaggtaccca atgtacttcg ggtggctgtg gaagctagta 540
tcagtagaac tctcacaaga ggcagaggaa gatgaggcca actgcttagt acacccagca 600
caaacaagca gacatgatga tgagcatggg gagacattag tgtggcagtt tgactccatg 660
ctggcctata actacaaggc cttcactctg tacccagaag agtttgggca caagtcagga 720
ttgccagaga aagaatggaa ggcaaaactg aaagcaagag ggataccata tagtgaaact 780
agtggcagtg gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct 840
ggcccaacgc gtatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 900
cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 960
gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 1020
gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 1080
accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 1140
gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 1200
cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 1260
aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 1320
cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 1380
accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 1440
cccggtgcct gaggatcc 1458
<210> 27
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 27
Glu Phe Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu
20 25 30
Leu Ser Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys
35 40 45
Gly Lys Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp
50 55 60
Gly Arg Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp
65 70 75 80
Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln
85 90 95
Met Thr Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys
100 105 110
Gly Gly Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu
115 120 125
Asn Leu Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala
130 135 140
Tyr Ser Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys
145 150 155 160
Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu
165 170 175
Arg His Cys Leu Met His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly
180 185 190
Ile Asp His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala
195 200 205
Val Glu Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys
210 215 220
Arg Thr Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
225 230 235 240
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gly Ser Met Gly Ala Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
260 265 270
Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr
275 280 285
Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val
290 295 300
Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp
305 310 315 320
Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro
325 330 335
Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu
340 345 350
Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu
355 360 365
Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly
370 375 380
Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys
385 390 395 400
Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu
405 410 415
Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr
420 425 430
Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr
435 440 445
Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln
450 455 460
Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala
465 470 475 480
Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg
485 490 495
Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala
500 505 510
Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe Ser Arg
515 520 525
<210> 28
<211> 434
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 28
Glu Phe Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Ile Gly Trp Pro
1 5 10 15
Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Arg Val
20 25 30
Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser
35 40 45
Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu
50 55 60
Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro
65 70 75 80
Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu
100 105 110
Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn
115 120 125
Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys
130 135 140
Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Ile Glu Glu Ala Asn Lys
145 150 155 160
Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp
165 170 175
Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala
180 185 190
Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys
195 200 205
Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
210 215 220
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr
225 230 235 240
Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu
245 250 255
Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala Thr Arg His Thr Val Asp Pro
260 265 270
Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr
275 280 285
Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala
290 295 300
Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu Ser Val Glu Ala Gly Ala Val
305 310 315 320
Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu
325 330 335
Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu Leu Ala Pro His Arg Pro Lys
340 345 350
Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val Gly Val Ser Pro Asp His Gln
355 360 365
Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala
370 375 380
Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn
385 390 395 400
Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe Thr Val Thr Ala Asp Val Glu
405 410 415
Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala
420 425 430
Gly Ser
<210> 29
<211> 485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 29
Glu Phe Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Lys Leu Ser Lys His Ser Arg
1 5 10 15
Gly Leu Arg Glu Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Gly Lys
20 25 30
Gln Arg Asp Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Ser Gln Phe Gln Glu Glu Ser
35 40 45
Gly Arg Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Gln Tyr Gln Gln
50 55 60
Gly Glu Tyr Met Asn Ser Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Gln
65 70 75 80
Lys Asp Leu Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Asp Asp
85 90 95
Asp Asp Leu Ile Gly Val Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Arg Arg Glu
100 105 110
Met Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys
115 120 125
Gly Gly Leu Gln Gly Met Phe Tyr Ser Arg Arg Arg His Arg Ile Leu
130 135 140
Asp Ile Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn
145 150 155 160
Tyr Thr His Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu
165 170 175
Trp Lys Leu Val Ser Val Glu Leu Ser Gln Glu Ala Glu Glu Asp Glu
180 185 190
Ala Asn Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Arg His Asp Asp Glu
195 200 205
His Gly Glu Thr Leu Val Trp Gln Phe Asp Ser Met Leu Ala Tyr Asn
210 215 220
Tyr Lys Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Lys Ser Gly
225 230 235 240
Leu Pro Glu Lys Glu Trp Lys Ala Lys Leu Lys Ala Arg Gly Ile Pro
245 250 255
Tyr Ser Glu Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
260 265 270
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr
275 280 285
Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val Pro Arg Ala Val
290 295 300
Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala Thr Arg His Thr
305 310 315 320
Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu Leu Gln Glu Leu
325 330 335
Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val Trp Val Ala Asp
340 345 350
Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu Ser Val Glu Ala
355 360 365
Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala Glu Leu Ser Gly
370 375 380
Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu Leu Ala Pro His
385 390 395 400
Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val Gly Val Ser Pro
405 410 415
Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val Leu Pro Gly Val
420 425 430
Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala
435 440 445
Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe Thr Val Thr Ala
450 455 460
Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys Met Thr Arg Lys
465 470 475 480
Pro Gly Ala Gly Ser
485
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 31
ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 60
cca 63
<210> 32
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 33
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 34
<211> 585
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 34
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585
<210> 35
<211> 520
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc caagcttacc 520
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 36
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 37
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 38
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 45
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 48
<211> 2745
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 48
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tcaggtgcag cttcagcagc ctggcgctga gctggtgaag 1380
cccggagcta gcgtgaagat gtcctgcaag gccagcggct ataccttcac ctcatacaac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggaaga ggcctcgagt ggattggagc tatctaccct 1500
ggaaacggag acaccagcta taaccagaag ttcaagggaa aggctaccct gaccgctgac 1560
aagagcagca gcaccgctta catgcagctg agcagcctta caagcgagga ctctgccgtg 1620
tactactgcg ccagaagcac ctattacggc ggcgactggt acttcaacgt gtggggagct 1680
ggaaccaccg tgaccgttag cgccggcggc ggaggctctg gcggcggagg aagcggcggc 1740
ggcggctccc agatcgtgct gtctcagagc cccgctatct tgagcgcctc ccctggagag 1800
aaggtgacca tgacttgcag agctagcagc agcgtgagct acatccactg gttccaacag 1860
aagccaggca gctcccctaa gccttggatc tacgctacca gcaaccttgc ctcaggcgtt 1920
cccgtgagat tctctggatc tggaagcggc acatcctact ccctgaccat ctcccgggtc 1980
gaggctgagg acgctgctac ttactactgc cagcagtgga ctagcaaccc ccccacattt 2040
ggcggcggca ccaaactgga gatcaagact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2100
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 2160
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 2400
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 2460
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2520
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 2580
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 2640
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 2700
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 2745
<210> 49
<211> 2748
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 49
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tgaggtgcag ctgcagcaga gcggagctga gctggtgaag 1380
cctggcgcta gcgtgaagat gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cagctataac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggacag ggactggagt ggatcggagc tatctaccct 1500
ggaaacggag acacctcata caaccagaag ttcaagggaa aggctaccct gaccgctgac 1560
aagagcagca gcaccgctta catgcagctg agctcactga ccagcgagga ctccgccgac 1620
tactactgcg ccagaagcaa ctactacgga agcagctact ggttcttcga cgtgtgggga 1680
gctggaacca ccgtgaccgt gtcaagcggc ggcggaggct ccggaggcgg aggatctggc 1740
ggcggcggca gcgacatcgt gctgacccag agccctgcta tcctgtctgc cagccctgga 1800
gagaaggtga ccatgacctg cagagctagc agcagcgtga actacatgga ctggtatcag 1860
aaaaagcccg gcagctcacc taagccttgg atctacgcta ccagcaactt agccagcggc 1920
gtgcctgcta gattctccgg aagcggctct ggaaccagct actcccttac catcagcaga 1980
gtggaggctg aggacgctgc tacctactac tgccagcagt ggagcttcaa ccctcctacc 2040
ttcggaggag gaaccaagct ggagatcaag actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 2100
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2160
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 2220
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2280
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 2340
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 2400
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 2460
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2520
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2580
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2640
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2700
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 2748
<210> 50
<211> 3558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcct gtcaccgccc tgctgctgcc cctggctctg 1320
ctgctgcacg ccgcaagacc tgaagtccag ctgcagcagt ccggggcaga gctggtgaag 1380
ccaggagcct ccgtgaagat gtcttgtaag gccagcggct acaccttcac atcctataac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggacag ggcctggagt ggatcggagc aatctaccca 1500
ggcaacggcg acacaagcta taatcagaag tttaagggca aggccaccct gacagccgat 1560
aagagctcct ctaccgccta catgcagctg agctccctga caagcgagga ctccgccgat 1620
tactattgcg cccggtccaa ttactatggc tctagctact ggttctttga cgtgtgggga 1680
gcaggaacca cagtgaccgt gtcctctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctggc 1740
ggcggcggct ctgatatcgt gctgacacag agcccagcaa tcctgtccgc ctctccagga 1800
gagaaggtga ccatgacatg tcgggccagc tcctctgtga actacatgga ctggtatcag 1860
aagaagcccg gcagctcccc taagccatgg atctacgcca cctccaatct ggcatctgga 1920
gtgcctgcaa ggttcagcgg ctccggatct ggcaccagct attccctgac aatctctcgc 1980
gtggaggcag aggatgcagc aacctactat tgccagcagt ggagcttcaa cccccctacc 2040
tttggcggcg gcacaaagct ggagatcaag ggcggcggcg gctccggcgg cggcgggagc 2100
ggcggcggcg gctctggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gctccgacat ccagatgacc 2160
cagaccacat ctagcctgtc tgccagcctg ggcgacaggg tgacaatcag ctgtcgcgcc 2220
tcccaggata tctctaagta cctgaattgg tatcagcaga agccagatgg caccgtgaag 2280
ctgctgatct accacacaag ccggctgcac tccggagtgc caagccggtt cagcggctct 2340
ggcagcggca ccgactatag cctgacaatc tccaacctgg agcaggagga tatcgccacc 2400
tacttctgcc agcagggcaa taccctgcct tatacatttg gcggaggaac aaagctggag 2460
atcaccggct ccacatctgg aagcggcaag ccaggatctg gagagggaag caccaaggga 2520
gaggtgaagc tgcaggagtc cggaccaggc ctggtggcac cttcccagtc tctgagcgtg 2580
acctgtacag tgtctggcgt gagcctgcct gactacggcg tgtcctggat caggcagcca 2640
ccaagaaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggggca gcgagacaac atactataac 2700
tccgccctga agagccggct gaccatcatc aaggataact ccaagtctca ggtgttcctg 2760
aagatgaata gcctgcagac cgacgataca gccatctact attgcgccaa gcactactat 2820
tatggaggca gttatgctat ggactattgg gggcagggca caagcgtcac cgtctcatca 2880
actagtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 2940
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 3000
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 3060
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 3120
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 3180
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 3240
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 3300
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 3360
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 3420
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 3480
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 3540
gccctgcccc ctcgctaa 3558
<210> 51
<211> 2745
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 51
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcct gtgaccgccc tgctgctgcc cctggccctg 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tgatattcag atgacccaga ccactagctc cctgtccgcc 1380
tctctgggcg acagagtgac aatcagctgc agggcctccc aggatatctc taagtatctg 1440
aactggtacc agcagaagcc agacggcaca gtgaagctgc tgatctatca caccagccgc 1500
ctgcactccg gagtgccatc tcggttcagc ggctccggat ctggcacaga ctacagcctg 1560
accatctcca acctggagca ggaggatatc gccacctatt tctgccagca gggcaataca 1620
ctgccctaca cctttggcgg cggcacaaag ctggagatca ccggaggagg aggaagcggc 1680
ggaggaggct ccggcggcgg cggctctgag gtgaagctgc aggagtccgg acctggcctg 1740
gtggcaccaa gccagtccct gtctgtgaca tgtaccgtgt ccggcgtgtc tctgcctgat 1800
tacggcgtgt cttggatcag gcagccacct aggaagggcc tggagtggct gggcgtgatc 1860
tggggcagcg agacaacata ctataattct gccctgaaga gcagactgac catcatcaag 1920
gacaacagca agtcccaggt gttcctgaag atgaatagcc tgcagacaga cgataccgcc 1980
atctactatt gcgccaagca ctactattac ggcggcagct atgccatgga ttactggggc 2040
cagggcacat ccgtgaccgt gtctagcact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2100
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 2160
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 2400
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 2460
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2520
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 2580
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 2640
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 2700
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 2745
<210> 52
<211> 2743
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 52
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgctc tgctgctgcc tctggctctg 1320
ctgctgcacg ctgctcgccc tcaggtcaaa ctggaagaat ctggcggagg cctggtgcag 1380
gcaggacgga gcctgcgcct gagctgcgca gcatccgagc acaccttcag ctcccacgtg 1440
atgggctggt ttcggcaggc cccaggcaag gagagagaga gcgtggccgt gatcggctgg 1500
agggacatct ccacatctta cgccgattcc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 1560
aacgccaaga agacactgta tctgcagatg aacagcctga agcccgagga caccgccgtg 1620
tactattgcg cagcaaggag aatcgacgca gcagactttg attcctgggg ccagggcacc 1680
caggtgacag tgtctagcgg aggaggagga tctgaggtgc agctggtgga gagcggaggc 1740
ggcctggtgc aggccggagg ctctctgagg ctgagctgtg cagcatccgg aagaaccttc 1800
acaatgggct ggtttaggca ggcaccagga aaggagaggg agttcgtggc agcaatcagc 1860
ctgtccccta ccctggccta ctatgccgag agcgtgaagg gcaggtttac catctcccgc 1920
gataacgcca agaatacagt ggtgctgcag atgaactccc tgaaacctga ggacacagcc 1980
ctgtactatt gtgccgccga tcggaagagc gtgatgagca ttagaccaga ctattggggg 2040
cagggaacac aggtgaccgt gagcagcact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2100
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 2160
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
actactcaag aggaagatgg ctgtagctcg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga 2400
actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca 2460
gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg 2520
tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta 2580
caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga 2640
gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga 2700
cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 2743
<210> 53
<211> 2748
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 53
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgcac tgctgctgcc tctggctctg 1320
ctgctgcacg ctgctcgccc tcaggtcaaa ctggaagaat ctggcggagg cctggtgcag 1380
gcaggcaggt ccctgaggct gtcttgcgca gcaagcgagc acacctttag ctcccacgtg 1440
atgggatggt tcaggcaggc accaggcaag gagagagagt ccgtggccgt gatcggctgg 1500
agggacatct ccacatctta cgccgattct gtgaagggcc ggtttaccat cagcagagac 1560
aacgccaaga agacactgta tctgcagatg aatagcctga agcctgagga caccgccgtg 1620
tactattgcg cagcaaggag aatcgatgca gcagacttcg attcctgggg acagggaacc 1680
caggtgacag tgtctagcgg aggaggagga agcgccgtgc agctggtgga gtccggcggc 1740
ggcctggtgc aggccggcga ttctctgcgg ctgacctgta cagcctccgg cagagccttc 1800
tctacctact ttatggcctg gtttagacag gcccctggca aggagaggga gtttgtggca 1860
ggaatcgcat ggagcggagg ctccacagca tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc 1920
atctctcgcg ataacgccaa gaatacagtg tatctgcaga tgaactctct gaagagcgag 1980
gacacagccg tgtactattg tgccagccgg ggaatcgagg tggaggaatt tggggcttgg 2040
gggcagggaa ctcaggtgac cgtctcatca actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 2100
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2160
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 2220
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2280
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 2340
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 2400
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 2460
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2520
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2580
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2640
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2700
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 2748
<210> 54
<211> 2376
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgctc tgctgctgcc tctggctctg 1320
ctgctgcacg ctgctcgccc tcaggtcaaa ctggaagaat ctggcggagg cctggtgcag 1380
gcaggacgga gcctgcgcct gagctgcgca gcatccgagc acaccttcag ctcccacgtg 1440
atgggctggt ttcggcaggc cccaggcaag gagagagaga gcgtggccgt gatcggctgg 1500
agggacatct ccacatctta cgccgattcc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 1560
aacgccaaga agacactgta tctgcagatg aacagcctga agcccgagga caccgccgtg 1620
tactattgcg cagcaaggag aatcgacgca gcagactttg attcctgggg ccagggcacc 1680
caggtgacag tgtctagcac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 1740
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 1800
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1860
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1920
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1980
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 2040
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 2100
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 2160
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 2220
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 2280
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 2340
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 2376
<210> 55
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr
115 120 125
Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val
145 150 155 160
Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser
195 200 205
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 56
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp
115 120 125
Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
165 170 175
Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp
180 185 190
Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr
195 200 205
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 57
<211> 759
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 57
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp
115 120 125
Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
165 170 175
Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp
180 185 190
Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr
195 200 205
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
290 295 300
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu
325 330 335
Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
340 345 350
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu
355 360 365
Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro
370 375 380
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser
385 390 395 400
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
405 410 415
Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val
435 440 445
Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val
450 455 460
Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg
465 470 475 480
Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met
485 490 495
Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His
500 505 510
Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
515 520 525
Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
530 535 540
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
545 550 555 560
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
565 570 575
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
580 585 590
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
595 600 605
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
610 615 620
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
625 630 635 640
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
645 650 655
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
660 665 670
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
675 680 685
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
690 695 700
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
705 710 715 720
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
725 730 735
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
740 745 750
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
755
<210> 58
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 59
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 59
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His
35 40 45
Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp
115 120 125
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met
165 170 175
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
180 185 190
Ile Ser Leu Ser Pro Thr Leu Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala
225 230 235 240
Asp Arg Lys Ser Val Met Ser Ile Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 60
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His
35 40 45
Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp
115 120 125
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
145 150 155 160
Asp Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Thr
165 170 175
Tyr Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Ala Gly Ile Ala Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Ser Arg Gly Ile Glu Val Glu Glu Phe Gly Ala Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 61
<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu His
35 40 45
Thr Phe Ser Ser His Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Ile Ser Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Ile Asp Ala Ala Asp Phe Asp
115 120 125
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
145 150 155 160
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
180 185 190
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
195 200 205
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
305 310 315 320
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
325 330 335
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
340 345 350
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 62
<211> 2760
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 62
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgct ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gctgctcgcc ctcaggtcaa actggaagaa tctggcggag gcctggtgca ggcaggacgg 120
agcctgcgcc tgagctgcgc agcatccgag cacaccttca gctcccacgt gatgggctgg 180
tttcggcagg ccccaggcaa ggagagagag agcgtggccg tgatcggctg gagggacatc 240
tccacatctt acgccgattc cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacgccaag 300
aagacactgt atctgcagat gaacagcctg aagcccgagg acaccgccgt gtactattgc 360
gcagcaagga gaatcgacgc agcagacttt gattcctggg gccagggcac ccaggtgaca 420
gtgtctagcg gaggaggagg atctgaggtg cagctggtgg agagcggagg cggcctggtg 480
caggccggag gctctctgag gctgagctgt gcagcatccg gaagaacctt cacaatgggc 540
tggtttaggc aggcaccagg aaaggagagg gagttcgtgg cagcaatcag cctgtcccct 600
accctggcct actatgccga gagcgtgaag ggcaggttta ccatctcccg cgataacgcc 660
aagaatacag tggtgctgca gatgaactcc ctgaaacctg aggacacagc cctgtactat 720
tgtgccgccg atcggaagag cgtgatgagc attagaccag actattgggg gcagggaaca 780
caggtgaccg tgagcagcac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactggtt 1140
aacagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aatgaacgcg tgcccctctc 1500
cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg 1560
tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg 1620
gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag 1680
gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt 1740
ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc 1800
aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga 1860
gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga 1920
aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct 1980
ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg 2040
ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg gccacaggat ccgccaccat gggctccagc 2100
aactccaaga ggcagcaaca gggcttgctc aagctctggc gagggctgcg agggaagcct 2160
ggggcagact gggtgctatt gtccgatccg cttatcgggc agtcatcaac agtccaagaa 2220
gagtgcggca aggccttgaa aaagtcctgg ggtaaaggta aaatgactcc agacggccgc 2280
cgcctgcaag aaggagacac ctttgatgag tgggatgatg atgaagaaga agtaggcttc 2340
cctgtgcaac ctcgagtccc cttaagacag atgacctata aattagcagt ggacttttcc 2400
cactttttaa aatcaaaggg gggactggat gggatatatt actctgaaag aagagaaaag 2460
atcctgaatt tgtatgcctt gaacgagtgg ggaataatag atgattggca agcttactca 2520
ccaggcccgg ggataaggta cccgagagtc tttggcttct gctttaagct agtcccagtg 2580
gacctgcatg aggaggcacg caactgtgag agacactgtg ctgcacatcc agcacagatg 2640
ggggaagatc ctgatggaat agatcatgga gaagtcttgg tctggaagtt tgacccgaag 2700
ttggcggtgg agtaccgccc ggacatgttt aaggacatgc acgaacatgc aaagcgctaa 2760
<210> 63
<211> 2685
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 63
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat gcagtctgga acccactgga gggtgctggg actgtgcctg 1320
ctgagcgtgg gcgtgtgggg acaggaggtg cagctgcagc agagcggagc tgagctggtg 1380
aagcctggcg ctagcgtgaa gatgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccagctat 1440
aacatgcact gggtgaagca gacccctgga cagggactgg agtggatcgg agctatctac 1500
cctggaaacg gagacacctc atacaaccag aagttcaagg gaaaggctac cctgaccgct 1560
gacaagagca gcagcaccgc ttacatgcag ctgagctcac tgaccagcga ggactccgcc 1620
gactactact gcgccagaag caactactac ggaagcagct actggttctt cgacgtgtgg 1680
ggagctggaa ccaccgtgac cgtgtcaagc ggcggcggag gctccggagg cggaggatct 1740
ggcggcggcg gcagcgacat cgtgctgacc cagagccctg ctatcctgtc tgccagccct 1800
ggagagaagg tgaccatgac ctgcagagct agcagcagcg tgaactacat ggactggtat 1860
cagaaaaagc ccggcagctc acctaagcct tggatctacg ctaccagcaa cttagccagc 1920
ggcgtgcctg ctagattctc cggaagcggc tctggaacca gctactccct taccatcagc 1980
agagtggagg ctgaggacgc tgctacctac tactgccagc agtggagctt caaccctcct 2040
accttcggag gaggaaccaa gctggagatc aagactagtg gcggcggagg ctctggcggc 2100
ggaggaagcg gcggcggcgg ctccgatggc aacgaggaga tgggcggcat cacccagaca 2160
ccctacaagg tgtccatctc tggcaccaca gtgatcctga cctgtccaca gtatcccggc 2220
tctgagatcc tgtggcagca caacgacaag aatatcggcg gcgatgagga cgataagaat 2280
atcggcagcg acgaggatca cctgtctctg aaggagttca gcgagctgga gcagtccggc 2340
tactacgtgt gctaccctcg gggctccaag ccagaggacg ccaactttta cctgtatctg 2400
cgggccagag tgtgcgagaa ttgtatggag atggacgtga tgtccgtggc caccatcgtg 2460
atcgtggata tctgtatcac aggcggcctg ctgctgctgg tgtactattg gagcaagaac 2520
cggaaggcca aggccaagcc tgtgaccaga ggagcaggag caggaggcag gcagagggga 2580
cagaacaagg agaggccacc tccagtgccc aatcctgact acgagccaat caggaagggc 2640
cagcgcgatc tgtatagcgg cctgaatcag aggcgcatct gataa 2685
<210> 64
<211> 467
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 64
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr
115 120 125
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
180 185 190
Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
195 200 205
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Asn Glu Glu Met
275 280 285
Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr
290 295 300
Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln
305 310 315 320
His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly
325 330 335
Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln
340 345 350
Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala
355 360 365
Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu
370 375 380
Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile
385 390 395 400
Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys
405 410 415
Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln
420 425 430
Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr
435 440 445
Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln
450 455 460
Arg Arg Ile
465
<210> 65
<211> 3147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 65
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat gcagtctgga acccactgga gggtgctggg actgtgcctg 1320
ctgagcgtgg gcgtgtgggg acaggaggtg cagctgcagc agagcggagc tgagctggtg 1380
aagcctggcg ctagcgtgaa gatgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccagctat 1440
aacatgcact gggtgaagca gacccctgga cagggactgg agtggatcgg agctatctac 1500
cctggaaacg gagacacctc atacaaccag aagttcaagg gaaaggctac cctgaccgct 1560
gacaagagca gcagcaccgc ttacatgcag ctgagctcac tgaccagcga ggactccgcc 1620
gactactact gcgccagaag caactactac ggaagcagct actggttctt cgacgtgtgg 1680
ggagctggaa ccaccgtgac cgtgtcaagc ggcggcggag gctccggagg cggaggatct 1740
ggcggcggcg gcagcgacat cgtgctgacc cagagccctg ctatcctgtc tgccagccct 1800
ggagagaagg tgaccatgac ctgcagagct agcagcagcg tgaactacat ggactggtat 1860
cagaaaaagc ccggcagctc acctaagcct tggatctacg ctaccagcaa cttagccagc 1920
ggcgtgcctg ctagattctc cggaagcggc tctggaacca gctactccct taccatcagc 1980
agagtggagg ctgaggacgc tgctacctac tactgccagc agtggagctt caaccctcct 2040
accttcggag gaggaaccaa gctggagatc aagactagtg gcggcggcgg ctctggagga 2100
ggaggcagcg gcggcggagg ctccggcggc ggcggctcta tggacattca gatgacccag 2160
tccccaagct ccctgtctgc cagcgtggga gacagagtga ccatcacatg cagggccagc 2220
caggatatcc gcaactatct gaattggtat cagcagaaac ccggcaaggc ccctaagctg 2280
ctgatctatt acaccagcag gctggagtcc ggagtgccat caagattctc cggctctggc 2340
agcggaaccg actacaccct gacaatctct agcctgcagc cagaggattt cgccacatat 2400
tactgccagc agggcaacac cctgccctgg acatttggcc agggcaccaa ggtggagatc 2460
aagggaggag gaggcagcgg gggcggcggc tccggaggag gcggctctga ggtgcagctg 2520
gtggagagcg gaggaggact ggtgcagcct ggaggcagcc tgcggctgtc ctgtgccgcc 2580
agcggctatt ccttcaccgg ctacacaatg aattgggtca gacaggcacc aggaaaggga 2640
ctggagtggg tggccctgat caaccctacc aagggcgtgt ccacatataa tcagaagttc 2700
aaggacaggt ttaccatctc tgtggataag agcaagaaca cagcctacct gcagatgaat 2760
agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtat tactgcgcac gcagcggata ttacggagac 2820
tccgattggt actttgacgt gtggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc ctccggcgga 2880
ggaggcagct ccggacaggt gctgctggag tccaatatca aggtgctgcc aacctggtct 2940
acacctgtgc agccaatggc actgatcgtg ctgggaggag tggcaggact gctgctgttc 3000
atcggactgg gcatcttctt ttgcgtgcgc tgtaggcacc ggagaaggca ggcagagagg 3060
atgtctcaga tcaagagact gctgagcgag aagaagacct gccagtgtcc tcaccgcttt 3120
cagaagacat gtagcccaat ctgataa 3147
<210> 66
<211> 621
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 66
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr
115 120 125
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
180 185 190
Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
195 200 205
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
275 280 285
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
290 295 300
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
305 310 315 320
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
325 330 335
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
340 345 350
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
355 360 365
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
370 375 380
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
420 425 430
Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg
435 440 445
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Thr
450 455 460
Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile
465 470 475 480
Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
485 490 495
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr
500 505 510
Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
515 520 525
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu
530 535 540
Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met
545 550 555 560
Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly
565 570 575
Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala
580 585 590
Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys
595 600 605
Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
610 615 620
Claims (66)
- 변형된 T 세포를 생산하는 방법으로서,
Nef 단백질을 코딩하는 제1 핵산을 전구체 T 세포에 도입하는 단계로서, 상기 발현시 Nef 단백질은 변형된 T 세포에서 내인성 T 세포 수용체 (TCR)의 하향-조정을 초래하는, 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 하향-조정이 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 약 50% 이상으로 하향-조절하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Nef를 발현하는 변형된 T 세포가 변형된 내인성 TCR 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef 단백질이 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 Nef 상동 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef 단백질이 야생형 Nef인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef 단백질이 돌연변이 Nef인 것인, 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 돌연변이 Nef가 다음을 포함하는 것인, 방법:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208, 또는 aa 212-223, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 T 세포가 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 외 리간드 결합 도메인 및 임의로 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 기능적 외인성 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 상기 전구체 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산이 별도의 벡터 상에 있는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산이 동일한 벡터 상에 있는 것인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산이 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제1 핵산이 제2 핵산의 업스트림에 있는 것인, 방법.
- 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 및 제2 핵산이 연결 서열을 통해 연계되는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 연결 서열이 P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n을 코딩하는 핵산 서열, 또는 IRES, SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK, CAGG 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열을 포함하되, 상기 n이 1 이상의 정수인 것인, 방법.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 것인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 에피솜 벡터 발현 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 비-바이러스 벡터인 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터가 피기백 벡터 또는 슬리핑 뷰티 벡터인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef를 발현하는 변형된 T 세포가 전구체 T 세포의 공여자로부터 단리된 일차 T 세포에 의해 이끌어낸 이식편-대-숙주 질환 (GvHD) 반응과 비교하여 조직비적합성 개체에서 GvHD 반응을 이끌어내지 않거나 감소된 GvHD 반응을 이끌어내는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef를 발현하는 변형된 T 세포로부터 TCR-음성 T 세포를 단리 또는 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Nef를 발현하는 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 다음을 포함하는 키메라 TCR (cTCR)이되,
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(d) 제2 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(e) 제3 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 상기 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛이 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제24항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 TCR 서브유닛이 모두 CD3ε인 것인, 방법.
- 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)이되:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제1 TCR 공동-수용체의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제2 TCR 공동-수용체의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제3 TCR 공동-수용체의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 상기 TCR 서브유닛이 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체가 모두 CD4, CD8 및 CD28로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 TCR 공동-수용체가 동일한 것인, 방법.
- 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 다음을 포함하는 T 세포 항원 커플러 (TAC)-유사 키메라 수용체이되:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 임의적인 제1 링커;
(c) 제1 TCR 서브유닛의 세포 외 도메인을 특이적으로 인식하는 세포 외 TCR 결합 도메인;
(d) 임의적인 제2 링커;
(e) 제2 TCR 서브유닛의 임의적인 세포 외 도메인 또는 이의 일부;
(f) 제3 TCR 서브유닛의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및
(g) 제4 TCR 서브유닛의 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 임의적인 세포 내 시그널링 도메인;
여기서 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛이 모두 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제28항에 있어서, 상기 제2, 제3 및 제4 TCR 서브유닛이 동일한 것인, 방법.
- 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 외인성 수용체가 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인, 방법:
(a) 종양 항원의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-결합 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인;
(b) 막관통 도메인; 및
(c) 세포 내 시그널링 도메인. - 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 낙타 Ig, Ig NAR, Fab 단편, 단일 쇄 Fv 항체 및 단일-도메인 항체 (sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 sdAb 또는 scFv인 것인, 방법.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 외 리간드 결합 도메인이 1가인 것인, 방법.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 외 리간드 결합 도메인이 다가인 것인, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 세포 외 리간드 결합 도메인이 다중특이적인 것인, 방법.
- 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원이 메조텔린, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 인터루킨-11 수용체 a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y, CD24, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-베타 (PDGFR-베타), SSEA-4, CD20, 엽산 수용체 알파, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, CLDN18.2, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K또는51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이, hTERT, 육종 전위 파열점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사 효소, RU1, RU2, 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 및 IGLL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 종양 항원이 BCMA, CD19 또는 CD20인 것인, 방법.
- 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (4-1BB), CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8α로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 내 시그널링 도메인이 CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ (FCER1G), FcRβ (Fc 엡실론 RIb), CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, Fc 감마 RIIa, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 일차 세포 내 시그널링 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 일차 세포 내 시그널링 도메인이 CD3ζ, DAP12 또는 CD3γ로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 내 시그널링 도메인이 CARD11, CD2 (LFA-2), CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM-1), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD162 (SELPLG), CD258 (LIGHT), CD270 (HVEM, LIGHTR), CD276 (B7-H3), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD319 (SLAMF7), LFA-1 (림프구 기능-연관 항원-1), NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, IPO-3, BLAME (SLAMF8), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), DAP10, TRIM, ZAP70, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극성 분자로부터 유래된 공동-자극성 시그널링 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 공동-자극성 시그널링 도메인이 CD137 (4-1BB)의 세포질 도메인을 포함하는 것인, 방법.
- 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 외 리간드 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치되는 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8α로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치되는 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 CD8α로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 변형된 T 세포.
- 제48항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 제49항의 약학 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질환을 치료하는 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 질환이 암인 것인, 방법.
- 미리스토일화 부위, N-말단 α-나선, 티로신-기반 AP 동원, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복체, PAK 결합 도메인, COP I 동원 도메인, 디-류신 기반 AP 동원 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 표 11에 열거된 아미노산 잔기 중 임의의 것에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항에 있어서, 돌연변이 SIV Nef 단백질인, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 다음을 포함하는 비-자연 발생 Nef 단백질:
(i) 서열번호 18-22 중 어느 하나의 아미노산 서열;
(ii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 8-10, aa 11-13, aa 38-40, aa 44-46, aa 47-49, aa 50-52, aa 53-55, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 110-112, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, aa 178-179, 179-181aa, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 191-193, aa 194-196, aa 203-205, aa 206-208, aa 212-214, aa 215-217, aa 218-220, aa 221-223, aa 8-13, aa 44-67, aa 107-112, aa 164-196, aa 203-208 또는 aa 212-223, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iii) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 44-46, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 98-100, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 44-67, aa 164-169, aa 176-181, aa 185-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함;
(iv) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 170-172, aa 173-175, aa 176-178, 178-179aa, aa 179-181, aa 182-184, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67 또는 aa 164-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함; 또는
(v) 다음 중 임의의 것의 아미노산 잔기에서의 많은 돌연변이 중 하나: aa 2-4, aa 56-58, aa 59-61, aa 62-64, aa 65-67, aa 107-109, aa 137-139, aa 152-154, aa 164-166, aa 167-169, aa 176-178, aa 178-179, aa 179-181, aa 185-187, aa 188-190, aa 194-196, aa 203-205, aa 56-67, aa 164-169, aa 176-181 또는 aa 185-190, 상기 아미노산 잔기 위치는 야생형 SIV Nef의 위치에 상응함. - 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR의 세포 표면 발현을 상기 야생형 SIV Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하로 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, CD4의 세포 표면 발현을 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제58항에 있어서, CD4의 세포 표면 발현을 상기 야생형 SIV Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하로 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제58항에 있어서, CD4의 세포 표면 발현을 상기 야생형 SIV Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 적게 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하지 않는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, CD28의 세포 표면 발현을 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제62항에 있어서, CD28의 세포 표면 발현을 상기 야생형 SIV Nef에 의한 것과 상이하게 약 3% 이하로 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제62항에 있어서, CD28의 세포 표면 발현을 상기 야생형 SIV Nef에 의한 것보다 약 3% 이상 적게 하향-조절하는, 비-자연 발생 Nef 단백질.
- 제52항 내지 제64항 중 임의의 것의 비-자연 발생 Nef 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포.
- 제65항에 있어서, 기능적 외인성 수용체를 추가로 포함하는, 변형된 T 세포.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNPCT/CN2018/097235 | 2018-07-26 | ||
CN2018097235 | 2018-07-26 | ||
PCT/CN2019/097969 WO2020020359A1 (en) | 2018-07-26 | 2019-07-26 | Nef-containing t cells and methods of producing thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20210049806A true KR20210049806A (ko) | 2021-05-06 |
Family
ID=69181353
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020217005328A KR20210049806A (ko) | 2018-07-26 | 2019-07-26 | Nef-함유 T 세포 및 이의 생산 방법 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220177524A1 (ko) |
EP (1) | EP3827075A4 (ko) |
JP (1) | JP2021532742A (ko) |
KR (1) | KR20210049806A (ko) |
CN (1) | CN112771154A (ko) |
AU (1) | AU2019312411A1 (ko) |
CA (1) | CA3103337A1 (ko) |
IL (1) | IL280240A (ko) |
MX (1) | MX2021000934A (ko) |
SG (1) | SG11202012253WA (ko) |
TW (1) | TW202020146A (ko) |
WO (1) | WO2020020359A1 (ko) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9273283B2 (en) * | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
WO2022116086A1 (en) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Janssen Biotech, Inc. | Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma |
JP2024510508A (ja) * | 2021-03-18 | 2024-03-07 | ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー | IL13Rα2を標的とするDNAコード化二重特異性抗体と癌治療における使用方法 |
WO2023077343A1 (en) * | 2021-11-04 | 2023-05-11 | Janssen Biotech, Inc. | Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma |
US20230277589A1 (en) * | 2021-11-04 | 2023-09-07 | Janssen Biotech, Inc. | Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma |
WO2024022509A1 (en) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Methods for promoting persistence of cell therapy |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1778282T3 (en) * | 2004-08-17 | 2016-06-06 | Roussy Inst Gustave | Mutated HIV NEF TO MODULATION OF IMMUNITY |
US9273283B2 (en) * | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
KR102437522B1 (ko) * | 2012-05-25 | 2022-08-26 | 셀렉티스 | 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 t 세포의 조작 방법 |
CA2954014A1 (en) * | 2016-01-21 | 2017-07-21 | Oi Kwan WONG | Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant iii |
CN109415687A (zh) * | 2016-04-07 | 2019-03-01 | 蓝鸟生物公司 | 嵌合抗原受体t细胞组合物 |
CA3059444A1 (en) * | 2017-04-14 | 2018-10-18 | The General Hospital Corporation | Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment |
-
2019
- 2019-07-26 KR KR1020217005328A patent/KR20210049806A/ko unknown
- 2019-07-26 US US17/262,787 patent/US20220177524A1/en active Pending
- 2019-07-26 EP EP19841972.3A patent/EP3827075A4/en active Pending
- 2019-07-26 WO PCT/CN2019/097969 patent/WO2020020359A1/en unknown
- 2019-07-26 JP JP2021504286A patent/JP2021532742A/ja active Pending
- 2019-07-26 MX MX2021000934A patent/MX2021000934A/es unknown
- 2019-07-26 SG SG11202012253WA patent/SG11202012253WA/en unknown
- 2019-07-26 TW TW108126647A patent/TW202020146A/zh unknown
- 2019-07-26 AU AU2019312411A patent/AU2019312411A1/en active Pending
- 2019-07-26 CN CN201980062656.7A patent/CN112771154A/zh active Pending
- 2019-07-26 CA CA3103337A patent/CA3103337A1/en active Pending
-
2021
- 2021-01-18 IL IL280240A patent/IL280240A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112771154A (zh) | 2021-05-07 |
SG11202012253WA (en) | 2021-01-28 |
CA3103337A1 (en) | 2020-01-30 |
EP3827075A4 (en) | 2022-08-03 |
IL280240A (en) | 2021-03-25 |
EP3827075A1 (en) | 2021-06-02 |
MX2021000934A (es) | 2021-05-27 |
JP2021532742A (ja) | 2021-12-02 |
AU2019312411A1 (en) | 2021-01-07 |
TW202020146A (zh) | 2020-06-01 |
US20220177524A1 (en) | 2022-06-09 |
WO2020020359A1 (en) | 2020-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11407803B2 (en) | Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor T cells | |
EP2872526B1 (en) | Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody | |
US20220025001A1 (en) | Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof | |
WO2020020359A1 (en) | Nef-containing t cells and methods of producing thereof | |
KR20200120939A (ko) | 변형된 만능성 줄기 세포, 및 제조 및 사용 방법 | |
CN114656569B (zh) | 包含nkg2d结构域的多特异性嵌合受体和其使用方法 | |
KR20210112295A (ko) | 다수의 hla-g 이소형에 대한 키메라 항원 수용체 | |
US20210269501A1 (en) | Compositions and methods of nkg2d chimeric antigen receptor t cells for controlling triple-negative breast cancer | |
WO2022218402A1 (en) | Fusion proteins and uses thereof | |
WO2021037221A1 (en) | Nef-containing t cells and methods of producing thereof |