CN112771154A - 含有nef的t细胞及其产生方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种产生经修饰T细胞的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入编码Nef蛋白的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性T细胞受体(TCR)的下调，其中所述经修饰T细胞还表达功能性外源性受体，诸如经工程改造TCR(例如嵌合TCR)、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体或嵌合抗原受体(CAR)；通过所述方法来获得的所述经修饰T细胞；以及包含所述经修饰T细胞的药物组合物。还提供了一种包含一个或多个突变的非天然存在的Nef蛋白。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月26日提交的国际专利申请第PCT/CN2018/097235号的优先权权益，所述国际专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。
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技术领域
本申请涉及一种产生具有下调的内源性T细胞受体(TCR)的经修饰T细胞的方法。本申请还提供了一种产生具有下调的内源性TCR的经修饰T细胞的方法，所述经修饰T细胞还表达外源性受体，诸如经工程改造TCR或嵌合抗原受体(CAR)。还提供了通过本文所述的方法产生的经修饰T细胞、其药物组合物、药盒和治疗方法。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法利用携带特异性识别靶标肿瘤抗原以使T细胞定向至肿瘤部位的经工程改造受体的经遗传修饰T细胞。它已在治疗血液癌症和多发性骨髓瘤(MM)方面显示满意效果。然而，由于个体差异，自体CAR-T或TCR-T疗法(使用患者自身的T细胞)在制造和标准化方面呈现出重大挑战，其中制造和治疗成本是极其昂贵的。此外，癌症患者通常具有较低免疫功能，其中淋巴细胞的数目降低，免疫活性较低，并且难以在体外扩增。
通用同种异体CAR-T或TCR-T疗法被视为一种理想模型，其中T细胞源于健康供者。然而，关键挑战是如何有效消除在治疗期间归因于组织不相容性的移植物抗宿主疾病(GvHD)。TCR是一种涉及于T细胞应答于抗原递呈而活化中的细胞表面受体。在人类中，95％的T细胞具有由α(alpha)链和β(beta)链组成的TCR。TCRα链和TCRβ链组合以形成异二聚体，并且与CD3亚基缔合以形成存在于细胞表面上的TCR复合物。GvHD发生在供者的T细胞通过TCR识别非自身主要组织相容性复合物(MHC)分子，并且将宿主(移植接受者)组织感知为抗原性外来物并攻击它们时。为从供者T细胞消除内源性TCR，由此预防GvHD，人们已正在将基因编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)(CRISPR/Cas)用于内源性TCRα或TCRβ基因敲除(KO)，接着使TCR阴性T细胞富集以达成同种异体CAR-T或TCR-T产生。然而，TCR缺失可导致CD3下游信号转导路径受损，并且影响T细胞扩增。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容都据此通过引用以它们的整体并入本文。
发明内容
本申请提供了一种产生表达将内源性TCR的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调的经修饰T细胞的方法。本申请还提供了一种产生表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和外源性受体的经修饰T细胞的方法，所述外源性受体诸如是经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR)。还提供了通过本文所述的方法产生的经修饰T细胞、其药物组合物、药盒和治疗方法。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性T细胞受体(TCR)的下调。在一些实施方案中，下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调至少约50％。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座。
在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和Nef同源性蛋白组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef，诸如包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列的突变Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变Nef(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。
在一些实施方案中，前体T细胞包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。举例来说，前体T细胞可为通过表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)来进一步修饰的经工程改造TCR-T细胞(例如cTCR-T细胞)、TAC-T细胞、TAC样-T细胞或CAR-T细胞。
在实施方案中，例如当前体T细胞未经工程改造时，方法可还包括向前体T细胞中引入编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体的第二核酸的步骤。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上，例如可操作地连接至同一启动子。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列来连接，所述连接序列诸如是包含以下任何核酸序列的连接序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
在一些方案中，携带本文所述的第一和/或第二核酸的载体是病毒载体，诸如选自由以下组成的组的病毒载体：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、游离型载体表达载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物。在一些实施方案中，携带本文所述的第一和/或第二核酸的载体是非病毒载体，诸如Piggybac载体或睡美人(SleepingBeauty)载体。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，相较于由从前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的移植物抗宿主疾病(GvHD)应答，表达Nef的经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，方法还包括分离或富集包含第一和/或第二核酸的T细胞。在一些实施方案中，方法还包括从表达Nef的经修饰T细胞分离或富集TCR阴性T细胞。在一些实施方案中，方法还包括将表达Nef的经修饰T细胞与至少一种药学上可接受的载体一起配制。
在根据使用包含功能性外源性受体的前体T细胞或包括将功能性外源性受体引入至前体T细胞中的步骤的本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述功能性外源性受体是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，cTCR还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，cTCR还包含位于cTCR的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。
在根据使用包含功能性外源性受体的前体T细胞或包括将功能性外源性受体引入至前体T细胞中的步骤的本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，TAC还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，TAC还包含位于TAC的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端处。
在根据使用包含功能性外源性受体的前体T细胞或包括将功能性外源性受体引入至前体T细胞中的步骤的本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述功能性外源性受体是TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于TAC样嵌合受体的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。
在根据使用包含功能性外源性受体的前体T细胞或包括将功能性外源性受体引入至前体T细胞中的步骤的本文所述的方法中的任一者的一些实施方案中，所述功能性外源性受体是嵌合抗原受体(CAR)，诸如CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合片段选自骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、单链Fv抗体和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)的组。在一些实施方案中，抗原结合片段是sdAb或scFv。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的，诸如多特异性或多表位。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素(Mesothelin)、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2(Ephrin B2)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬酰胺内肽酶(legumain)、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白(prostein)、存活素(survivin)和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期素B1(Cyclin B1)、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。在一些实施方案中，肿瘤抗原是BCMA、CD19或CD20。在一些实施方案中，跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。在一些实施方案中，跨膜结构域源于CD8α。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ或DAP12。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含源于选自由以下组成的组的共刺激性分子的共刺激性信号传导结构域：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域包含CD137(4-1BB)的细胞质结构域。在一些实施方案中，功能性外源性受体还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，功能性外源性受体还包含位于多肽的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。
在一些实施方案中，提供了一种通过本文所述的方法来获得的经修饰T细胞。在一些实施方案中，提供了一种包含经修饰T细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人)中的疾病(诸如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物。
在另一方面，提供了一种非天然存在的Nef蛋白(也被称为突变Nef蛋白或非天然存在的突变Nef蛋白)，所述非天然存在的Nef蛋白可包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COPI募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。在另一方面，非天然存在的Nef蛋白是突变SIV Nef蛋白。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，非天然存在的Nef(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。
本文所述的非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)可用于本文所述的方法中的任一者中。
本发明还提供了可用于本文所述的方法的药盒和制品。
附图说明
图1A至图1B显示SIV Nef表达可显著抑制T细胞活化。图1A显示在用编码SIV Nef-LNGFR(M071)的慢病毒转导Jurkat细胞系之后，LNGFR+细胞比率是66.1％，并且磁激活的细胞分选(MACS)进一步使LNGFR+细胞富集至94.3％。图1B显示在用PHA刺激的LNGFR+Jurkat细胞的情况下，T细胞活化标志物CD69显著降低，但在用PMA/ION刺激的LNGFR+Jurkat细胞的情况下不受影响。“UnT”指示未转导Jurkat细胞。“TCRαKO”指示通过CRISPR/Cas方法获得的TCRα敲除Jurkat细胞系。“载体”指示用空载体转导的Jurkat细胞。“M071”代表表达SIVNef-P2A-LNGFR，并且通过MACS来富集的LNGFR+Jurkat细胞群体。
图2显示SIV Nef表达通过抑制TCR/CD3复合物的细胞表面表达来影响TCR介导的信号传导路径。“UnT”指示未转导Jurkat细胞。“TCRαKO”指示通过CRISPR/Cas方法获得的TCRα敲除Jurkat细胞系。“载体”指示用空载体转导的Jurkat细胞。“M071”代表表达SIVNef-P2A-LNGFR，并且通过MACS来富集的LNGFR+Jurkat细胞群体。
图3显示HIV1 Nef和HIV2 Nef表达通过抑制TCR/CD3复合物的细胞表面表达来影响TCR介导的信号传导路径。“UnT”指示未转导Jurkat细胞。“TCRαKO”指示通过CRISPR/Cas方法获得的TCRα敲除Jurkat细胞系。“载体”指示用空载体转导的Jurkat细胞。“M071”代表表达SIV Nef-P2A-LNGFR，并且通过MACS来富集的LNGFR+Jurkat细胞群体。“HIV1 Nef”代表表达HIV1 Nef-T2A-Puro的Jurkat细胞。“HIV2Nef”代表表达HIV2 Nef-T2A-Puro的Jurkat细胞。
图4A至图4D显示关于SIV Nef表达性TCR阴性T细胞的细胞分选策略以及靶标细胞细胞溶解作用。图4A显示用SIV Nef-P2A-LNGFR和BCMA CAR慢病毒共转染之后3天的HEK293T细胞上的BCMA CAR和LNGFR表达的FACS结果。图4B显示用SIV Nef-P2A-LNGFR和BCMACAR-P2A-LNGFR慢病毒共转染，并且用MACSelect LNGFR微珠粒分选的的LNGFR+T细胞的TCRαβ阳性率和阴性率。图4C显示经MACS富集的用SIV Nef-P2A-LNGFR和BCMA CAR慢病毒共转染的CD3ε阴性T细胞中的TCRαβ、CD3ε和LNGFR表达比率。图4D显示CAR+/CD3ε-T细胞对RPMI-8226(BCMA+)和K562(BCMA-)细胞系的特异性和非特异性细胞溶解作用。“UnT”指示未转导原代T细胞。“NC”代表作为阴性对照的未与原代T细胞一起孵育的经Luc标记细胞。“PC”代表作为阳性对照的用Triton X-100使所有经Luc标记细胞溶解。“MACS CD3ε阴性”代表经MACS富集的CD3ε阴性T细胞群体。“TCRαβ-”代表在CD3ε分选之后的TCRαβ阴性T细胞。“TCRαβ+”代表在CD3ε分选之后的TCRαβ阳性T细胞。
图5A至图5C显示用SIV Nef+CAR全合一慢病毒载体诸如BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIVNef(M072)、BCMA CAR-P2A-SIV Nef(M086)、BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef(M090)以及SIV Nef-P2A-BCMA CAR(M091)、SIV Nef-IRES-BCMA CAR(M126)、BCMA CAR-IRES-SIV Nef(M159)、BCMA CAR-PGK-SIV Nef(M160)和SIV Nef-PGK-BCMA CAR(M161)转染的T细胞中的BCMA CAR(CAR阳性)、TCRαβ(TCRαβ阴性)和CD3ε(CD3ε阴性)的表达率。SIV Nef-P2A-LNGFR(M071)用作非CAR编码对照。“UnT”代表未转导Jurkat细胞。“CAR阳性”代表CAR阳性T细胞。“TCRαβ阴性”代表TCRαβ阴性T细胞。“CD3ε阴性”代表CD3ε阴性T细胞。
图6A至图6D显示Nef亚型和突变体对T细胞上的TCRαβ、CDε、CD28和CD4表达的影响。
图7显示SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗(Rituximab))CAR(M167)T细胞(89.7％)、SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR(M168)T细胞(93.3％)、SIV Nef-IRES-CD19×CD20 scFv CAR(M169)T细胞(92.1％)、SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR(M170)T细胞(93.6％)、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1(M171)T细胞(93.5％)、SIV Nef-IRES-BCMABiVHH CAR2(M172)T细胞(87.9％)和SIV Nef-IRES-BCMA单VHH CAR(M173)T细胞(94.0％)在MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率。未转导T细胞(UnT)充当对照。
图8A至图8B显示MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阴性T细胞的CAR介导的特异性肿瘤细胞毒性，其中MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阳性T细胞和未转导T细胞(UnT)作为对照。M167：SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR T细胞。M168：SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR T细胞。M169：SIV Nef-IRES-CD19×CD20 scFv CAR T细胞。M170：SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T细胞。M171：SIVNef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T细胞。M172：SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T细胞。M173：SIV Nef-IRES-BCMA单VHH CAR T细胞。
图9A至图9B显示MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阳性和阴性T细胞的TCR介导的非特异性细胞毒性。MACS分选的TCRαβ阴性T细胞具有少许或不具有TCR介导的非特异性肿瘤细胞杀灭活性。M167：SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR T细胞。M168：SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR T细胞。M169：SIV Nef-IRES-CD19×CD20 scFv CAR T细胞。M170：SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR T细胞。M171：SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1 T细胞。M172：SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2 T细胞。M173：SIVNef-IRES-BCMA单VHH CAR T细胞。
图10A显示用BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116转移质粒(PLLV-M133质粒)转导的T细胞在MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率。图10B显示MACS分选的用PLLV-M133质粒转导的TCRαβ阳性和阴性T细胞的CAR介导的特异性肿瘤细胞毒性(左侧图)和TCR介导的非特异性细胞毒性(右侧图)。未转导T细胞(UnT)充当对照。
图11A显示用被称为M572的SIV Nef M116-IRES-CD20嵌合TCR(抗CD20 scFv(Leu-16)-(GGGGS)3-CD3ε)转导的T细胞在MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率。图11B显示MACS分选的用PLLV-M572质粒转导的TCRαβ阳性和阴性T细胞的CD20嵌合TCR介导的特异性肿瘤细胞毒性(左侧图)和内源性TCR介导的非特异性细胞毒性(右侧图)。未转导T细胞(UnT)充当对照。
图12A显示用被称为PLLV-M574的SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC(抗CD20 scFv(Leu-16)-(GGGGS)3-huUCHT1.Y177T-GGGGS-CD4序列)转导的T细胞在MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率。图12B显示MACS分选的用M574质粒转导的TCRαβ阳性和阴性T细胞的抗CD20TAC介导的特异性肿瘤细胞毒性(左侧图)和内源性TCR介导的非特异性细胞毒性(右侧图)。未转导T细胞(UnT)充当对照。
图13A至图13C显示相较于野生型SIV Nef(M071)，各种SIV Nef氨基酸残基突变对TCRαβ(图13A)、CD4(图13B)和CD28(图13C)的表达的调控作用。未转导Jurkat细胞(UnT)充当阴性对照。用M116(SIV Nef M116，参见实施例6)转导的Jurkat细胞充当阳性对照。
具体实施方式
本申请提供了一种产生可在治疗诸如癌症免疫疗法期间在组织不相容个体中引发降低的GvHD应答的经修饰T细胞(诸如TCR-T细胞(例如cTCR-T细胞)、TAC-T细胞、TAC样-T细胞或CAR-T细胞)的方法。简要来说，前体T细胞(即待修饰的初始T细胞)被修饰来表达Nef(负性调控因子)蛋白，所述Nef蛋白可将内源性TCR下调(在下文中被称为“TCR缺陷性T细胞”或“GvHD最小化T细胞”)，诸如将内源性TCRα或TCRβ的细胞表面表达下调，由此抑制内源性TCR介导的信号转导。这些含有Nef的TCR缺陷性T细胞可接着被进一步工程改造来表达外源性受体，诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR)。本申请还提供了一种通过以下方式来产生GvHD最小化经修饰T细胞(诸如TCR-T细胞(例如cTCR-T细胞)、TAC-T细胞、TAC样-T细胞或CAR-T细胞)的一步方法：用编码Nef的载体和编码外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的载体共转导前体T细胞，或用编码Nef与外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))两者的“全合一(All-in-One)”载体转导前体T细胞。由本文所述的方法获得的经修饰T细胞可有效下调TCR的细胞表面表达，同时保持外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的表达和功能。本发明使在同种异体移植期间GvHD的发生有效地最小化或消除，并且为通用同种异体CAR-T、TCR-T(例如cTCR-T)、TAC-T或TAC样T疗法提供一种便利、有效且廉价的策略。
因此，本申请的一个方面提供了一种产生经修饰T细胞的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；以及通过这类方法来获得的经修饰T细胞。在另一方面，提供了包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及任选的编码功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸的经修饰T细胞。在另一方面，提供了可用于制备本文所述的经修饰T细胞的非天然存在的Nef蛋白(例如突变SIV Nef)。还提供了包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的核酸以及任选的编码功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸的载体(诸如病毒载体)。
I.定义
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长4链抗体或具有免疫球蛋白Fc区的全长仅有重链的抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双功能抗体和单链分子)以及抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与“抗体”互换使用。本文涵盖的抗体包括单结构域抗体，诸如仅有重链的抗体。
术语“仅有重链的抗体”或“HCAb”是指包含重链，但缺乏通常见于4链抗体中的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独sdAb能够在不与相应含CDR多肽配对下结合抗原。在一些情况下，单结构域抗体从骆驼科动物HCAb加以工程改造，并且它们的重链可变结构域在本文中被称为“VHH”。一些VHH还可被称为纳米抗体。骆驼科动物sdAb是一种最小已知抗原结合抗体片段(参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指所述抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于相同类别的其他抗体)，并且含有抗原结合位点。来自骆驼科动物物种的仅有重链的抗体具有被称为“VHH”的单一重链可变区。
术语“可变”是指以下事实：在抗体之间，可变结构域的某些区段在序列方面广泛不同。V结构域介导抗原结合，并且限定特定抗体对它的特定抗原的特异性。然而，跨越可变结构域的整个间距，可变性并非均匀分布。而是在轻链可变结构域与重链可变结构域两者中，它均集中在三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个主要采用β片层构型，由三个HVR连接的FR区，所述HVR形成连接β片层结构，并且在一些情况下形成β片层结构的一部分的环。每个链中的HVR通过FR区紧密邻近固持在一起，并且与来自另一链的HVR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及于抗体与抗原的结合中，但展现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换用于指代与抗体片段不同，呈它的大致上完整形式的抗体。具体来说，全长4链抗体包括具有重链和轻链，包括Fc区的那些。全长仅有重链的抗体包括重链(诸如VHH)和Fc区。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段(或抗原结合片段)的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体(参见美国专利第5,641,870号,实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；单结构域抗体(诸如VHH)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体会产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段；以及残余“Fc”片段，标号反映了易于结晶的能力。Fab片段由整个L链以及H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段关于抗原结合是单价的，即它具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体会产生单一大型F(ab′)2片段，其大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫键连接Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab′片段由于在CH1结构域的羧基末端处具有少许额外残基而不同于Fab片段，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是在本文中对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab′的标号。F(ab′)2抗体片段最初以在它们之间具有铰链半胱氨酸的各对Fab′片段形式产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含两个H链的通过二硫键固持在一起的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，所述Fc区是还由见于某些类型的细胞上的Fc受体(FcR)识别的区域。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由处于紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠，发散出贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并且对抗体赋予抗原结合特异性的六个高变环(来自H链和L链各3个环)。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的半个Fv)也能够识别和结合抗原，但亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”，也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH抗体结构域和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的使得sFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。
本文所述的抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区，或抗体的保留FcR结合能力或具有改进的FcR结合能力的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对……具有特异性”是指可测量和可重现相互作用，诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如抗原结合结构域、配体、经工程改造TCR、CAR或嵌合受体)之间的结合，所述结合确定在包括生物分子的分子的异质群体存在下存在所述靶标。举例来说，特异性结合靶标(其可为表位)的抗原结合蛋白是相比于它结合其他靶标，以更大亲和力、亲合力、更易于和/或以更久持续时间结合这个靶标的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗原结合蛋白与无关靶标的结合程度小于所述抗原结合蛋白与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM或≦0.1nM的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合蛋白质上在来自不同物种的所述蛋白质之间保守的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或sdAb、scFv)对抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体例如具有单特异性。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白(诸如本文所述的任何外源性受体或sdAb)具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同抗原。如本文所用的“双特异性”表示抗原结合蛋白(诸如本文所述的任何外源性受体)具有两种不同抗原结合特异性。如本文所用的术语“单特异性”CAR表示具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的抗原结合蛋白(诸如本文所述的任何外源性受体或sdAb、scFv)。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白(诸如本文所述的任何外源性受体或sdAb、scFv)中存在指定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点，并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白(诸如本文所述的任何外源性受体或sdAb、scFv)中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
本文术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程改造编码抗体的重链的核酸来移除。因此，完整抗体的组合物可包含所有K447残基都被移除的抗体群体、无K447残基被移除的抗体群体以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。适用于本文所述的抗体中的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体、本文所述的任何外源性受体诸如CAR)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原或本文所述的任何外源性受体和抗原，诸如CAR和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法包括本文所述的那些来测量。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于更久保持结合。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，其中任一者都可出于本申请的目的加以使用。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低它所结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体大致上或完全抑制抗原的生物活性。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在将序列对准以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对准所需的任何算法。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可用于将一种或多种抗原特异性移植至免疫效应细胞诸如T细胞上的经遗传工程改造的受体。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，CAR包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)具有特异性的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及T细胞和/或其他受体的细胞内信号传导结构域。“CAR-T”是指表达CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)的T细胞。“BCMA CAR”是指具有对BCMA具有特异性的细胞外结合结构域的CAR。“双表位CAR”是指具有对两种不同表位具有特异性的细胞外结合结构域的CAR。
本文所述的“经分离”核酸分子(例如编码Nef蛋白、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))是脱离至少一种它在它被产生所处的环境中通常与其相伴的污染物核酸分子加以鉴定和分离的核酸分子。优选地，经分离核酸不与和产生环境相关的所有组分相伴。编码本文多肽和抗体的经分离核酸分子呈除它见于自然界中所采用的形式或配置以外的形式。因此，经分离核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文多肽和抗体的核酸。
术语“控制序列”是指为在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞会利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸被放置与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸是“可操作地连接的”。举例来说，如果前序列或分泌前导物的DNA被表达为参与多肽的分泌的前蛋白质，那么所述DNA可操作地连接至所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子可操作地连接至所述编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便有助于翻译，那么所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻近的，并且在分泌前导物的情况下，是邻近的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是邻近的。连接通过在适宜限制位点处进行连接来实现。如果所述位点不存在，那么根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式，并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可在编码所述蛋白质的核苷酸序列可在某一形式中含有一个或多个内含子的程度上包括内含子。
如本文所用的术语“载体”是指能够使它与其连接的另一核酸繁殖的核酸分子。所述术语包括呈自我复制性核酸结构形式的载体以及并入至它已被引入至其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们所操作性地连接的核酸的表达。这类载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源性核酸被转移或引入至宿主细胞中所采用的过程。“经转染”或“经转化”或“经转导”细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和它的子代。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是用于获得包括临床结果的有益或所需结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：减轻一种或多种由疾病所致的症状，减弱疾病的程度，使疾病稳定(例如预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或完全)，降低一种或多种其他药物的为治疗疾病所需的剂量，延迟疾病的进展，增加生活品质和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减轻癌症的病理学后果。本申请方法涵盖这些治疗方面中的任何一者或多者。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。
本文所用的术语“有效量”是指剂诸如本文所述的经修饰T细胞或其药物组合物的足以治疗指定病症、疾患或疾病，诸如改善、缓和、减弱和/或延迟它的一种或多种症状(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的量。关于癌症，有效量包括足以导致肿瘤收缩和/或使肿瘤的生长速率降低(诸如抑制肿瘤生长)或预防或延迟其他非所要细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以使发展延迟的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。有效量的剂(例如经修饰T细胞)或组合物可：(i)降低癌细胞的数目；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)抑制、延缓、在一定程度上减缓，并且优选终止癌细胞浸润至外周器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减缓，并且优选终止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。在感染性疾病诸如病毒性感染的情况下，治疗有效量的本文所述的经修饰T细胞或其组合物可降低由病原体感染的细胞的数目；降低病原体源性抗原的产生或释放；抑制(即在一定程度上减缓，并且优选终止)病原体扩散至未感染细胞；并且/或者在一定程度上减轻一种或多种与感染相关的症状。在一些实施方案中，治疗有效量是使患者的存活期延长的量。
如本文所用，“延迟”疾病的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延后所述疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的发展。视病史和/或所治疗的个体而定，这个延迟可具有不同时长。如为本领域技术人员所显而易知，充分或显著延迟可实际上涵盖预防，因为个体不显现疾病。“延迟”癌症的发展的方法是以下方法：当相较于不使用所述方法时，所述方法在给定时间范围内使疾病发展的概率降低和/或在给定时间范围内使疾病的程度降低。这类比较通常基于使用统计显著个体数目进行的临床研究。癌症发展可为可使用标准方法进行检测的，所述标准方法包括但不限于计算机轴向断层摄影术(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝结测试、动脉造影术或活检。发展还可指在初始时可为不可检测的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
如本文所用，术语“自体”意指任何物质源于它稍后将被再引入至其中的同一个体。
“同种异体”是指移植物源于相同物种的不同个体。“同种异体T细胞”是指来自具有与接受者匹配的组织人白细胞抗原(HLA)类型的供者的T细胞。通常，基于在HLA基因的三个或更多个基因座处的变异性进行匹配，并且在这些基因座处的完全匹配是优选的。在一些情况下，同种异体移植供者可为相关的(通常是密切HLA匹配的兄弟姐妹)，同种同基因的(患者的单卵“全等”双胞胎)或无关的(供者是不相关的，并且被发现具有极其密切的HLA匹配度)。HLA基因分为两个种类(I型和II型)。一般来说，I型基因(即HLA-A、HLA-B或HLA-C)的不匹配使移植物排斥的风险增加。II型HLA基因(即HLA-DR或HLA-DQB1)的不匹配使移植物抗宿主疾病(GvHD)的风险增加。
如本文所用的“患者”包括受疾病(例如癌症、病毒性感染、GvHD)折磨的任何人。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用。术语“供给受试者”或“供者”在本文中是指其细胞正被获得用于进一步体外工程改造的受试者。供给受试者可为待用通过本文所述的方法来产生的细胞群体治疗的患者(即自体供者)，或可为捐献血液样品(例如淋巴细胞样品)的个体(即同种异体供者)，在产生通过本文所述的方法来产生的细胞群体后，所述血液样品将用于治疗不同个体或患者。接受通过本发明方法制备的细胞的那些受试者可被称为“接受者”或“接受受试者”。
术语“T细胞受体”或“TCR”是指由在T细胞的表面上配对的αβ或γδ链组成的异二聚受体。每个α、β、γ和δ链由两个Ig样结构域组成：通过互补决定区(CDR)来赋予抗原识别的可变结构域(V)，继之以通过连接肽和跨膜(TM)区来锚定于细胞膜的恒定结构域(C)。TM区与CD3信号传导装置的不变亚基缔合。每个V结构域具有三个CDR。这些CDR与抗原肽和所述抗原肽所结合的由主要组织相容性复合物编码的蛋白质之间的复合物(pMHC)相互作用(Davis和Bjorkman(1988)Nature,334,395-402；Davis等人(1998)Annu Rev Immunol,16,523-544；Murphy(2012),xix,868页)。
术语“TCR相关信号传导分子”是指具有作为TCR-CD3复合物的一部分的细胞质免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的分子。TCR相关信号传导分子包括CD3γε、CD3δε和ζζ(也被称为CD3ζ或CD3ζζ)。
如本文所用的术语“刺激”是指由细胞表面部分的连接所诱导的初级应答。举例来说，在受体的情形下，这种刺激必然伴有受体的连接以及后续信号转导事件。关于对T细胞的刺激，这种刺激是指T细胞表面部分的连接，在一个实施方案中，所述连接随后诱导信号转导事件，诸如结合TCR/CD3复合物。此外，刺激事件可使细胞活化，并且将分子的表达或分泌上调或下调，诸如将TGF-β下调。因此，即使在不存在直接信号转导事件下，细胞表面部分的连接也可导致细胞骨架结构的重新组织，或细胞表面部分的聚结，所述情况中的每一者都可用于增强、改进或改变后续细胞应答。
如本文所用的术语“活化”是指细胞在进行充分细胞表面部分连接以诱导可觉察的生物化学或形态变化之后的状态。在T细胞的情形内，这种活化是指已被充分刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化还可诱导细胞因子产生以及调控性或细胞溶解性效应功能的执行。在其他细胞的情形内，这个术语暗示特定物理化学过程的上调或下调。术语“活化的T细胞”指示当前正经受细胞分裂、细胞因子产生、调控性或细胞溶解性效应功能的执行，并且/或者新近已经受“活化”的过程的T细胞。
术语“下调”T细胞中的分子(例如内源性TCR或CD4)是指将所述分子的细胞表面表达下调，并且/或者干扰它的信号转导(例如TCR、CD3、CD28介导的信号转导)、T细胞活化以及T细胞增殖。还可涵盖通过即内化、剥离、帽化或改变细胞表面上受体重排的其他形式来对靶标受体的下调。
如本文所用的术语“功能性外源性受体”是指在引入至本文所述的T细胞或Nef表达性T细胞中之后保留它的生物活性的外源性受体(诸如像CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、T细胞抗原偶联物(TAC)或TAC样嵌合受体)。生物活性包括但不限于外源性受体在特异性结合分子(例如癌症抗原或ACTR的抗体)，适当地转导下游信号，诸如诱导细胞增殖、细胞因子产生和/或调控性或细胞溶解性效应功能的执行的方面的能力。
应了解本文所述的本申请的实施方案包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”实施方案。
在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)涉及那个值或参数本身的变化形式。举例来说，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“非”某一值或参数通常意指并且描述“不同于”某一值或参数。举例来说，方法不用于治疗X类型的癌症意指方法用于治疗不同于X的类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文以及随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)”、“或”和“这个(种)”包括复数个(种)指示物。
II.表达Nef蛋白的经修饰T细胞
本发明提供了包含Nef的经修饰T细胞以及产生这类经修饰T细胞的方法。在一些实施方案中，T细胞还表达功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。因此，本申请提供了一种共表达本文所述的任一Nef蛋白(例如非天然存在的Nef蛋白，诸如突变SIV Nef)以及任选的任一功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的经修饰T细胞。在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白是突变Nef，诸如本文所述的任何突变Nef蛋白，例如突变SIV Nef。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的下调。在一些实施方案中，下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，内源性TCR的细胞表面表达被下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，内源性MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的细胞表面表达被Nef蛋白下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白不将CD3ζ下调(例如不将表达下调)，或将CD3ζ下调至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座，诸如TCRα或TCRβ。在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过选自CRISPR-Cas、TALEN、shRNA和ZFN的基因编辑系统加以修饰。在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过CRISPR-Cas系统加以修饰，所述CRISPR-Cas系统包含含有SEQ ID NO:23的核酸序列的gRNA。
在一些实施方案中，编码基因编辑系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸在同一载体上。在一些实施方案中，编码基因编辑系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白的第一核酸在不同载体上。
在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。在一些实施方案中，突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，相较于野生型Nef蛋白，突变Nef使对经修饰T细胞中内源性CD4和/或CD28的下调作用(例如细胞表面表达的下调)降低。在一些实施方案中，内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的下调被降低至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸的经修饰T细胞还包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的表达不将功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，突变Nef(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIVNef)将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调。
在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，但不将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差至多约3％(诸如至多约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，功能性外源性受体是经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))。在一些实施方案中，功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)或TAC样嵌合受体。在一些实施方案中，功能性外源性受体是CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR)。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，cTCR不包含所述TCR亚基的细胞外结构域(或其一部分)(或任何TCR亚基的细胞外结构域)。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，cTCR还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，cTCR还包含位于cTCR的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将cTCR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性cTCR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，TAC不包含所述TCR共受体的细胞外结构域(或其一部分)(或任何TCR共受体的细胞外结构域)。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，TAC还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，TAC还包含位于TAC的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸，以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含所述TCR亚基的细胞外结构域(或其一部分)(或任何TCR亚基的细胞外结构域)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于TAC样嵌合受体的N末端处的信号肽，诸如源于CD8α的信号肽。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC样嵌合受体下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC样嵌合受体被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是sdAb(例如抗BCMA sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含两个或更多个连接在一起的sdAb。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是scFv(例如抗CD19 scFv、抗CD20scFv或CD19×CD20 scFv)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域，其中所述配体或受体是细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体或受体源于选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施方案中，配体源于APRIL或BAFF。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。在一些实施方案中，抗原选自由以下组成的组：间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬酰胺内肽酶、HPV E6,E7、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期素B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19或CD20。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗CD19 scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗CD20scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含直接或间接(例如通过接头)融合至抗CD20 scFv的抗CD19scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，内源性TCR的细胞表面表达被下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，内源性MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的细胞表面表达被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD3ζ下调(例如不将表达下调)，或将CD3ζ下调至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的表达不将功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，表达Nef(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座，诸如TCRα或TCRβ。在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过选自CRISPR-Cas、TALEN和ZFN的基因编辑系统加以修饰。在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过CRISPR-Cas系统加以修饰，所述CRISPR-Cas系统包含含有SEQ ID NO:23的核酸序列的gRNA。在一些实施方案中，编码基因编辑系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸在同一载体上。在一些实施方案中，编码基因编辑系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白的第一核酸在不同载体上。
在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。在一些实施方案中，突变Nef蛋白是突变SIVNef蛋白。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，相较于野生型Nef蛋白，突变Nef使对经修饰T细胞中内源性CD4和/或CD28的下调作用(例如细胞表面表达的下调)降低。在一些实施方案中，内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的下调被降低至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，突变Nef(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIVNef)不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIVNef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，但不将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差至多约3％(诸如至多约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是在表11中所述的任何氨基酸突变位点处包含氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变SIV Nef在属于如表11中所述的同一组的多达2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸突变位点处包含突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在表11中所述的仅一个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在属于如表11中所述的同一组的两个或更多个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变在两个或更多个连续氨基酸突变位点内，其中所述两个或更多个氨基酸突变位点属于如表11中所述的同一组(例如在第3组的aa 185-187和aa 188-190中的突变)。在一些实施方案中，突变是使一个或多个氨基酸突变位点内的所有氨基酸残基都突变(例如全都突变成Ala)，其中所述氨基酸突变位点属于如表11中所述的同一组(例如使第3组的aa 185-187和aa 188-190中的所有残基都突变成Ala)。在一些实施方案中，突变是使来自第一氨基酸突变位点的一个氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，以及使来自第二氨基酸突变位点的另一氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，其中所述两个氨基酸突变位点属于如表11中所述的同一组。在一些实施方案中，突变是邻近的，即至少2个突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 8-10和aa 11-13处)。在一些实施方案中，突变是非邻近的，即没有突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 8-10和aa 44-46处)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)细胞表面表达下调的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。举例来说，在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个中的任一者，或多达2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个中的任一者)氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如突变成Ala)的突变SIV Nef：aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13(例如aa 8-13)、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67(例如aa 44-67)、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112(例如aa 107-112)、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa191-193、aa 194-196(例如aa 164-196)、aa 203-205、aa 206-208(例如aa 203-208)、aa212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223(例如aa 212-223)，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在多达2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸突变位点处(例如突变残基在aa 8-10和aa 44-46处)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在仅一个氨基酸突变位点内(例如仅在aa 8-10内)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在两个或更多个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变是邻近的，即至少两个氨基酸突变位点是彼此紧邻的(例如突变残基在aa 8-10和aa 11-13处)。在一些实施方案中，突变是非邻近的，即没有氨基酸突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 8-10和aa 44-46处)。在一些实施方案中，突变是使一个或多个氨基酸突变位点内的所有氨基酸残基都突变(例如全都突变成Ala)。在一些实施方案中，突变是使来自第一氨基酸突变位点的一个氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，以及使来自第二氨基酸突变位点的另一氨基酸残基突变(例如突变成Ala)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)和CD4细胞表面表达下调的突变SIV Nef，其中由所述突变SIV Nef对内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)细胞表面表达的下调不同于(小于或大于)由野生型SIV Nef进行的下调达不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)，并且其中由所述突变SIV Nef对CD4细胞表面表达的下调小于由野生型SIV Nef进行的下调达至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)，并且将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变SIV Nef将TCRαβ细胞表面表达下调，但不将CD4细胞表面表达下调。举例来说，在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个中的任一者，或多达2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个中的任一者)氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如突变成Ala)的突变SIV Nef：aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa62-64、aa 65-67(例如aa 44-67)、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169(例如aa 164-169)、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181(例如aa176-181)、aa 185-187、aa 188-190(例如aa 185-190)、aa 194-196、aa 203-205，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在多达2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸突变位点处(例如突变残基在aa 2-4和aa 44-46处)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在仅一个氨基酸突变位点内(例如仅在aa 2-4内)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在两个或更多个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变是邻近的，即至少两个氨基酸突变位点是彼此紧邻的(例如突变残基在aa 62-64和aa 65-67处)。在一些实施方案中，突变是非邻近的，即没有氨基酸突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 2-4和aa 44-46处)。在一些实施方案中，突变是使一个或多个氨基酸突变位点内的所有氨基酸残基都突变(例如全都突变成Ala)。在一些实施方案中，突变是使来自第一氨基酸突变位点的一个氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，以及使来自第二氨基酸突变位点的另一氨基酸残基突变(例如突变成Ala)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)和CD28细胞表面表达下调的突变SIV Nef，其中由所述突变SIV Nef对内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)细胞表面表达的下调不同于(小于或大于)由野生型SIV Nef进行的下调达不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)，并且其中由所述突变SIV Nef对CD28细胞表面表达的下调小于由野生型SIV Nef进行的下调达至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)，并且将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变SIV Nef将TCRαβ细胞表面表达下调，但不将CD28细胞表面表达下调。举例来说，在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个中的任一者，或多达2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个中的任一者)氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如突变成Ala)的突变SIV Nef：aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67(例如aa 56-67)、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190(例如aa 164-190)、aa 194-196、aa 203-205，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在多达2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸突变位点处(例如突变残基在aa2-4和aa 56-58处)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在仅一个氨基酸突变位点内(例如仅在aa 2-4内)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在两个或更多个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变是邻近的，即至少两个氨基酸突变位点是彼此紧邻的(例如突变残基在aa 62-64和aa 65-67处)。在一些实施方案中，突变是非邻近的，即没有氨基酸突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 2-4和aa 62-64处)。在一些实施方案中，突变是使一个或多个氨基酸突变位点内的所有氨基酸残基都突变(例如全都突变成Ala)。在一些实施方案中，突变是使来自第一氨基酸突变位点的一个氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，以及使来自第二氨基酸突变位点的另一氨基酸残基突变(例如突变成Ala)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)、CD4和CD28细胞表面表达下调的突变SIV Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)、CD4和CD28细胞表面表达下调的突变SIV Nef，其中由所述突变SIV Nef对内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)细胞表面表达的下调不同于(小于或大于)由野生型SIV Nef进行的下调达不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)，并且其中由所述突变SIV Nef对CD4和CD28细胞表面表达的下调小于由野生型SIV Nef进行的下调达至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)，并且将CD4和CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。举例来说，在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个中的任一者，或多达2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个中的任一者)氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如突变成Ala)的突变SIV Nef：aa2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67(例如aa 56-67)、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169(例如aa 164-169)、aa 176-178、aa 178-179、aa179-181(例如aa 176-181)、aa 185-187、aa 188-190(例如aa 185-190)、aa 194-196、aa203-205，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在多达2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸突变位点处(例如突变残基在aa 2-4和aa 56-58处)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在仅一个氨基酸突变位点内(例如仅在aa 2-4内)。在一些实施方案中，突变(例如突变成一个或多个Ala，诸如使1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何数目的氨基酸残基突变成Ala)在两个或更多个氨基酸突变位点内。在一些实施方案中，突变是邻近的，即至少两个氨基酸突变位点是彼此紧邻的(例如突变残基在aa 62-64和aa 65-67处)。在一些实施方案中，突变是非邻近的，即没有氨基酸突变位点是彼此靠近的(例如突变残基在aa 2-4和aa 65-67处)。在一些实施方案中，突变是使一个或多个氨基酸突变位点内的所有氨基酸残基都突变(例如全都突变成Ala)。在一些实施方案中，突变是使来自第一氨基酸突变位点的一个氨基酸残基突变(例如突变成Ala)，以及使来自第二氨基酸突变位点的另一氨基酸残基突变(例如突变成Ala)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是相比于野生型SIV Nef，以更大程度(诸如多至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)将TCRαβ细胞表面表达下调，但相较于野生型SIV Nef，对CD4和CD28细胞表面表达具有更小程度(诸如少至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)下调的突变SIV Nef。举例来说，在一些实施方案中，Nef蛋白是在氨基酸残基178-179aa处包含一个两个氨基酸突变(诸如氨基酸取代，例如使一个或两个aa突变成Ala)的突变SIV Nef，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，突变SIV Nef包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子、猿猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMVIE)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、泛素-C(UBQ-C)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子、NFAT启动子、
启动子和NFκB启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1-α或PGK启动子。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列来连接。在一些实施方案中，连接序列包含以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物组成的组。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，诸如游离型表达载体、增强的游离型载体(EEV)、PiggyBac转座酶载体或睡美人(SB)转座子系统。
在一些实施方案中，相较于由从经修饰T细胞所源于的前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的GvHD应答，表达Nef的经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，功能性外源性受体是经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))。在一些实施方案中，功能性外源性受体是TAC或TAC样嵌合受体。在一些实施方案中，功能性外源性受体是CAR(例如抗抗原CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)。在一些实施方案中，功能性外源性受体是单价的和单特异性的。在一些实施方案中，功能性外源性受体是多价的和单特异性的。在一些实施方案中，功能性外源性受体是多价的和多特异性的。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性CAR的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性嵌合TCR包含：细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性嵌合TCR包含：细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)上，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座，诸如TCRα或TCRβ。在一些实施方案中，编码基因编辑系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白的第一核酸在同一载体上。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
因此，在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一启动子(例如PGK)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子是相同的。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子是不同的。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIVNef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一启动子下转录。因此，在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES或编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMAsdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种包含载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV IE)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、泛素-C(UBQ-C)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子、NFAT启动子、
启动子和NFκB启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1-α或PGK启动子。
在一些实施方案中，连接序列包含以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。在一些实施方案中，连接序列是IRES。在一些实施方案中，连接序列是编码P2A的核酸序列。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物组成的组。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，诸如游离型表达载体、增强的游离型载体(EEV)、PiggyBac转座酶载体或睡美人(SB)转座子系统。还提供了通过引入本文所述的任何载体(例如病毒载体)来获得的T细胞。还提供了通过本文所述的任何方法来获得的T细胞。
载体
本申请提供了用于克隆和表达本文所述的任一Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的载体。在一些实施方案中，载体适于在真核细胞诸如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已开发许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。举例来说，逆转录病毒提供适宜用于基因递送系统的平台。异源性核酸可使用本领域中已知的技术来插入载体中，并且包装在逆转录病毒粒子中。重组病毒可接着被分离，并且在体外或离体递送至经工程改造哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活性慢病毒载体。举例来说，携带Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)编码序列的自失活性慢病毒载体和/或携带外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的自失活性慢病毒载体可用本领域中已知的方案加以包装。所得慢病毒载体可用于使用本领域中已知的方法来转导哺乳动物细胞(诸如原代人T细胞)。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合以及它在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可转导非增殖细胞。
在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，载体是转座子，诸如睡美人(SB)转座子系统或PiggyBac转座子系统。在一些实施方案中，载体是基于聚合物的非病毒载体，包括例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树状体。在一些实施方案中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，诸如阳离子脂质体、脂质纳米乳液和固体脂质纳米粒子(SLN)。在一些实施方案中，载体是基于肽的基因非病毒载体，诸如聚L-赖氨酸。适于基因组编辑的任何已知非病毒载体都可用于将Nef编码核酸和/或外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))编码核酸引入至经工程改造免疫效应细胞(例如T细胞)。参见例如Yin H.等人Nature Rev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL等人“The Sleeping Beauty transposon system:a non-viralvector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20；以及Zhao S.等人“PiggyBac transposon vectors:the tools of the human gene editing.”Transl.LungCancer Res.(2016)5(1):120-125，所述文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，通过物理方法来将将任何一种或多种编码本文所述的Nef和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸引入至经工程改造免疫效应细胞(例如T细胞)，所述物理方法包括但不限于电穿孔、声致穿孔、光致穿孔、磁性转染、流体动力穿孔。
在一些实施方案中，载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)包含任一编码本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸。核酸可使用本领域中的任何已知分子克隆方法(包括例如使用限制核酸内切酶位点和一种或多种可选择标记)来克隆至载体中。在一些实施方案中，核酸可操作地连接至启动子。已探究用于在哺乳动物细胞中的基因表达的各种启动子，并且本领域中已知的任何启动子都可用于本发明中。启动子可大致分类为组成型启动子或调控型启动子，诸如诱导型启动子。
启动子
在一些实施方案中，编码本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸可操作地连接至组成型启动子。组成型启动子允许异源性基因(也被称为转基因)在宿主细胞中组成性表达。本文涵盖的示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人延伸因子-1α(hEF1α)启动子、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子。已在庞大数目的研究中广泛比较这类组成型启动子驱动转基因表达的效率。举例来说，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在原代人T细胞中驱动CAR表达的效率，并且推断hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且还在CD4和CD8人T细胞中得以最优维持(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，编码本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸可操作地连接至hEF1α启动子或PGK启动子。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-la启动子、泛素C启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)以及骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)启动子、NFAT启动子、
启动子和NFκB启动子。
在一些实施方案中，编码本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调控型启动子的种类。诱导型启动子可通过一种或多种条件来诱导，所述条件诸如是物理条件、经工程改造免疫效应细胞(例如T细胞)的微环境或经工程改造免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或它们的组合。在一些实施方案中，诱导条件不诱导经工程改造哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中内源性基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、照射(诸如电离辐射、光)、温度(诸如热)、氧化还原状态、肿瘤环境以及经工程改造哺乳动物细胞的活化状态。在一些实施方案中，诱导型启动子可为NFAT启动子、
启动子或NFκB启动子。
在一些实施方案中，载体还含有可选择标记基因或报告基因以从通过载体(例如慢病毒载体)来转染的宿主细胞的群体选择表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞。可选择标记与报告基因两者均可由适当调控序列侧接以使得能够在宿主细胞中进行表达。举例来说，载体可含有可用于调控核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
连接序列
在一些实施方案中，载体包含超过一个编码本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸。在一些实施方案中，载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述第一核酸通过连接序列来可操作地连接至所述第二核酸。在一些实施方案中，连接序列是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是允许以帽非依赖性方式达成翻译起始的RNA元件。在一些实施方案中，连接序列包含(例如是)编码自裂解2A肽诸如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A的核酸序列。在一些实施方案中，连接序列是包含SEQ ID NO:34的核酸序列的IRES。在一些实施方案中，连接序列是包含SEQ ID NO:35的核酸序列的PGK。在一些实施方案中，连接序列是编码包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列的P2A肽的核酸序列。在一些实施方案中，连接序列是编码包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的T2A肽的核酸序列。在一些实施方案中，连接序列是编码如处于“V.功能性外源性受体”下的以下“肽接头”章节中所述的肽接头诸如柔性接头的核酸序列。在一些实施方案中，柔性连接序列选自由编码(GS)n、(GSGGS)n(GGGS)n和(GGGGS)n的核酸序列组成的组，其中n是至少为1的整数。在一些实施方案中，连接序列编码可选择标记，诸如LNGFR。在一些实施方案中，连接序列包含本文所述的一种或多种类型的连接序列，诸如编码自裂解2A肽(例如P2A)，继之以Gly-Ser柔性接头(例如(GGGS)3)的核酸序列，或编码自裂解2A肽(例如P2A)，继之以可选择标记(例如LNGFR)的核酸序列。
因此，在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸的载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR下调(例如将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。
在一些实施方案中，Nef蛋白在T细胞中表达后不将CD3ζ、CD4、CD28和/或功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将表达下调)，或将CD3ζ、CD4、CD28和/或功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)还包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸的载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。
在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及例如任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一启动子(例如PGK)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)、编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20cTCR。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ IDNO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸的载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码接头诸如(GGGS)3接头的柔性核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20cTCR。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性CAR的第二核酸，所述功能性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述功能性嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述功能性T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种载体(例如病毒载体，诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码功能性TAC样嵌合受体的第二核酸，所述功能性TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
III.产生经修饰T细胞的方法
本发明的一个方面提供了产生以上所述的任一经修饰T细胞的方法。方法通常涉及将编码Nef(诸如突变Nef)的第二核酸以及任选的编码功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸引入至天然或经工程改造T细胞(在本文中被称为“前体T细胞”)中。
在一些实施方案中，前体T细胞源于血液、骨髓、淋巴液或淋巴器官，是免疫系统的细胞，诸如先天性或适应性免疫细胞。在一些方面，细胞是人细胞。
在一些实施方案中，前体T细胞源于细胞系例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞从异种异体来源，例如从小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪获得。
在一些实施方案中，前体T细胞呈CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞是天然杀伤T(NKT)细胞。在一些实施方案中，前体T细胞是经工程改造T细胞，诸如本文所述的任何功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，在表达本文所述的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))，以及结合靶标细胞诸如BCMA+肿瘤细胞后，前体T细胞产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，在表达本文所述的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))，以及结合靶标细胞后，CD8+T细胞使抗原特异性靶标细胞溶解。
在一些实施方案中，T细胞从干细胞，诸如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞分化。
在一些实施方案中，Nef和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))通过用本文所述的任一核酸或任一载体(例如非病毒载体和病毒载体诸如慢病毒载体)转染来引入至T细胞。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))通过在使细胞穿过微流体系统诸如CELL
时将蛋白质插入至细胞膜中来引入至T细胞(参见例如美国专利申请公布第20140287509号)。
将载体(例如病毒载体)或经分离核酸引入至哺乳动物细胞中的方法在本领域中是已知的。本文所述的载体可通过物理、化学或生物学方法来转移至T细胞中。
用于将载体(例如病毒载体)引入至T细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。在一些实施方案中，载体(例如病毒载体)通过电穿孔来引入至细胞中。
用于将载体引入至T细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入至哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用方法。
用于将载体(例如病毒载体)引入至T细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒以及基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。在体外用作递送载体的一示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在一些实施方案中，编码本文所述的任何Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的RNA分子可通过常规方法(例如体外转录)来制备，接着通过已知方法诸如mRNA电穿孔来引入至T细胞中。参见例如Rabinovich等人,Human Gene Therapy 17:1027-1035。
在一些实施方案中，在引入载体或经分离核酸之后，以离体方式使经转导或经转染T细胞增殖。在一些实施方案中，培养经转导或经转染T细胞以持续至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一者进行增殖。在一些实施方案中，进一步评估或筛选经转导或经转染T细胞以选择经工程改造哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定潜在经转染细胞以及评估调控序列的功能性。一般来说，报告基因是不存在于接受生物体或组织中或不由接受生物体或组织表达，并且编码其表达通过某一可易于检测的性质例如酶活性来显现的多肽的基因。在DNA已被引入至接受细胞中之后，在某一适合时间测定报告基因的表达。适合报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。适合表达系统是熟知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。
用以确认在经工程改造T细胞中存在编码本文所述的任何Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸的其他方法包括例如为本领域技术人员所熟知的分子生物学测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；生化测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫方法(诸如ELISA和蛋白质印迹)、荧光激活的细胞分选(FACS)或磁激活的细胞分选(MACS)(也参见实施例章节)。
因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，前体T细胞包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，方法还包括向前体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被依序引入至T细胞中。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一启动子(例如PGK)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)来连接。
因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的第二核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)在表达后将经修饰T细胞中内源性TCR、MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ下调，诸如将内源性TCR、MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的细胞表面表达下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。在一些实施方案中，表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座，诸如TCRα或TCRβ。在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过选自CRISPR-Cas、TALEN和ZFN的基因编辑系统加以修饰。
在一些实施方案中，内源性TCR基因座通过CRISPR-Cas系统加以修饰，所述CRISPR-Cas系统包含含有SEQ ID NO:23的核酸序列的gRNA。在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2Nef和它们的同源物(诸如HIV F2 Nef、HIVC2 Nef和HIV H2N2Nef)组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中包含一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。在一些实施方案中，突变Nef包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，相较于野生型Nef蛋白，突变Nef(例如突变SIV Nef)使在表达后对经修饰T细胞中内源性CD4和/或CD28的下调作用(例如细胞表面表达的下调)降低，诸如使下调作用降低至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)在表达后不将CD3ζ、CD4、CD28和/或包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将表达下调)，或将CD3ζ、CD4、CD28和/或包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体下调(例如将表达下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV IE)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、泛素-C(UBQ-C)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子、NFAT启动子、
启动子和NFκB启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1-α或PGK启动子。
在一些实施方案中，连接序列包含以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。在一些实施方案中，连接序列是IRES。在一些实施方案中，连接序列是编码P2A的核酸序列。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物组成的组。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，诸如游离型表达载体、增强的游离型载体(EEV)、PiggyBac转座酶载体或睡美人(SB)转座子系统。在一些实施方案中，功能性外源性受体是经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR)。在一些实施方案中，功能性外源性受体是TAC、TAC样嵌合受体。在一些实施方案中，功能性外源性受体是非TCR受体，诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)。
在一些实施方案中，功能性外源性受体是CAR，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是sdAb(例如抗BCMA sdAb)或scFv。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含两个或更多个连接在一起的sdAb。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含两个或更多个连接在一起的scFv。在一些实施方案中，一个或多个结合部分包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域，其中所述配体或受体是细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体或受体源于选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施方案中，配体源于APRIL或BAFF。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。在一些实施方案中，CAR是单价的和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如双特异性的)和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如二价的)和多特异性的(例如双特异性的)。在一些实施方案中，抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19、CD20。在一些实施方案中，跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。在一些实施方案中，跨膜结构域源于CD8α。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、DAP12或CD3γ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域包含CD137的细胞质结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，CAR还包含位于多肽的N末端处的信号肽。在一些实施方案中，信号肽源于CD8α。在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含：CD8α信号肽、细胞外配体结合结构域(例如一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb、APRIL/BAFF配体或Fc受体)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，功能性外源性受体是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，功能性外源性受体是TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。
在一些实施方案中，相较于由从经修饰T细胞所源于的前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的GvHD应答，表达Nef(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。在一些实施方案中，方法还包括分离或富集包含第一和/或第二核酸的T细胞。在一些实施方案中，方法还包括从表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞分离或富集CD3ε阴性T细胞。在一些实施方案中，方法还包括从表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的经修饰T细胞分离或富集内源性TCRα阴性T细胞。在一些实施方案中，方法还包括将表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞与至少一种药学上可接受的载体一起配制。在一些实施方案中，方法还包括向个体施用有效量的表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞，或有效量的包含表达Nef蛋白的经修饰T细胞以及至少一种药学上可接受的载体的药物制剂。在一些实施方案中，个体患有癌症。在一些实施方案中，个体是人。
在一些实施方案中，功能性外源性受体是CAR，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入编码CAR的第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入编码cTCR的第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将cTCR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性cTCR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入编码TAC的第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的(例如全都是CD4)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ IDNO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入编码TAC样嵌合受体的第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC样嵌合受体下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC样嵌合受体被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列来连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，功能性外源性受体是CAR，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调，接着向所述前体T细胞中引入编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，分离或富集Nef阳性和/或内源性TCR/CD3ε阴性经修饰T细胞，接着向经富集的经修饰T细胞中引入编码CAR的第二核酸。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸被同时引入至T细胞中。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括：向前体T细胞中同时引入在一个载体上的编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及在另一载体上的编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ IDNO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一启动子(例如PGK)；编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)来连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第一连接序列IRES、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、编码P2A的第一连接序列、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；第一连接序列IRES；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；编码P2A的第一连接序列；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含两个或更多个连接在一起的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，CAR是单价的和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如双特异性的)和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如二价的)和多特异性的(例如双特异性的)。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列来连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIVNef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将cTCR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性cTCR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一启动子(例如PGK)；编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列来连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至不同启动子(例如EF1-α和PGK)，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第一启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第二启动子(例如PGK)以及编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：第二启动子(例如EF1-α)；编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一启动子(例如PGK)；编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子(例如EF1-α)，并且其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列来连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)、编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIVNef)的第一核酸、第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)、任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)以及编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种产生经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的方法，所述方法包括向前体T细胞中引入载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)，所述载体从上游至下游为：启动子(例如EF1-α)；编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；第一连接序列(例如IRES、编码自裂解2A肽诸如P2A或T2A的核酸序列)；任选的第二连接序列(例如编码柔性接头诸如(GGGS)3接头的核酸序列)；以及编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ IDNO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC样嵌合受体下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC样嵌合受体被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，方法还包括将表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞与至少一种药学上可接受的载体一起配制。在一些实施方案中，方法还包括向个体施用有效量的表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)的经修饰T细胞，或有效量的包含表达Nef蛋白的经修饰T细胞以及至少一种药学上可接受的载体的药物制剂。在一些实施方案中，个体患有癌症。在一些实施方案中，个体是人。
T细胞的来源、细胞制备和培养
在扩增和遗传修饰T细胞(例如前体T细胞)之前，从个体获得T细胞的来源。T细胞可从许多来源获得，包括外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，可使用可在本领域中获得的许多T细胞系。在一些实施方案中，T细胞可从使用为熟练技术人员所知的许多技术诸如FICOLLTM分离从受试者收集的某一单位的血液获得。在一些实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单独采集获得。单独采集产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一些实施方案中，通过单独采集来收集的细胞可加以洗涤以移除血浆级分，以及将细胞放置在适当缓冲液或培养基中以进行后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可缺乏镁，或可缺乏许多(若非全部)二价阳离子。此外，惊人的是，在不存在钙下的初始活化步骤导致放大的活化。如本领域普通技术人员将易于了解，洗涤步骤可通过为本领域中的人士所知的方法来实现，诸如通过根据制造商说明书使用半自动化“流穿”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤之后，可将细胞再悬浮于多种生物可相容缓冲液诸如像无Ca2+无Mg2+PBS、血浆电解质A或具有或不具有缓冲剂的其他盐水溶液中。或者，可移除单独采集样品的不合需要组分，并且将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施方案中，T细胞由脐带血库、外周血库提供，或源于诱导多能干细胞(iPSC)、专能和多能干细胞或人胚胎干细胞。在一些实施方案中，T细胞源于细胞系。在一些实施方案中，T细胞从异种异体来源，例如从小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪获得。在一些实施方案中，T细胞是人细胞。在一些方面，T细胞是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并加以冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括一个或多个T细胞子组，诸如全T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞以及它们的子群体，诸如根据功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况、和/或分化程度加以定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可为同种异体的和/或自体的。在一些情况下，T细胞关于一个或多个预定接受者是同种异体的。在一些情况下，T细胞适于移植，诸如不在接受者中诱导GvHD。
在T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和子群体之中的是原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型诸如干细胞记忆T(TSCM)、中枢性记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的以及适应性调控性T(Treg)细胞、辅助T细胞诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞，α/βT细胞以及δ/γT细胞。
在一些实施方案中，通过使红血细胞溶解以及使单核细胞消减，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血液淋巴细胞分离T细胞。T细胞的特定子群体诸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞可通过正性或负性选择技术来进一步分离。举例来说，在一些实施方案中，T细胞通过与CD3抗体/CD28抗体(即3×28)缀合珠粒一起孵育一段足以对所需T细胞进行正性选择的时期来分离，所述珠粒诸如是
M-450CD3/CD28 T。在一些实施方案中，时期是约30分钟。在另一实施方案中，时期在30分钟至36小时的范围内或更久时间以及介于之间的所有整数值。在另一实施方案中，时期是至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，时期是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时期是24小时。对于从患有白血病的患者分离T细胞，使用较久孵育时间诸如24小时可使细胞产率增加。较久孵育时间可用于在其中相较于其他细胞类型存在少许T细胞的任何情况下分离T细胞，诸如在从肿瘤组织或从免疫损害个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时。此外，使用较久孵育时间可使对CD8+T细胞的捕集的效率增加。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠粒的时间，以及/或者通过增加或降低珠粒与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可在培养起始时或在过程期间的其他时间点优先选择或不选择T细胞的子群体。另外，通过增加或降低珠粒或其他表面上的抗CD3抗体和/或抗CD28抗体的比率，可在培养起始时或在其他所需时间点优先选择或不选择T细胞的子群体。熟练技术人员将认识到还可使用多轮选择。在一些实施方案中，可合乎需要的是进行选择程序，并且在活化和扩增过程中使用“未经选择”细胞。还可使“未经选择”细胞经受其他各轮选择。
通过负性选择来富集T细胞群体可用针对为负性选择细胞所特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过使用针对存在于负性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的负性磁性免疫粘附或流式细胞计量术进行细胞分选和/或选择。举例来说，为通过负性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可合乎需要的是富集或正性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调控性T细胞。或者，在某些实施方案中，T调控性细胞通过C25抗体缀合珠粒或其他类似选择方法来消减。
对于通过正性或负性选择来分离所需细胞群体，可改变细胞和表面(例如粒子诸如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，可合乎需要的是显著降低珠粒和细胞混合在一起所处的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。举例来说，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/毫升的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/毫升的浓度。在另一实施方案中，使用大于10000万个细胞/毫升。在另一实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/毫升的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500或10000万个细胞/毫升的细胞浓度。在其他实施方案中，可使用12500或15000万个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效捕集可微弱表达目标靶标抗原的细胞诸如CD28阴性T细胞，或来自其中有许多肿瘤细胞存在的样品(即白血病性血液、肿瘤组织等)的细胞。这类细胞群体可具有治疗价值，并且将需要获得。举例来说，使用高浓度的细胞允许更高效选择通常具有较微弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可合乎需要的是使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如粒子诸如珠粒)的混合物，粒子与细胞之间的相互作用得以最小化。这会选择表达待结合于粒子的高量所需抗原的细胞。举例来说，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度的情况下，相比于CD8+T细胞，被更高效地捕集。在一些实施方案中，所用细胞浓度是5×106/mL。在一些实施方案中，所用浓度可为约1×105/mL至1×106/mL，以及介于之间的任何整数值。
在一些实施方案中，细胞可在2-10℃下或在室温下在旋转器上在不同速度下孵育不同时长。
用于刺激的T细胞还可在洗涤步骤之后加以冷冻。在不希望受理论束缚下，冷冻和后续解冻步骤通过移除细胞群体中的粒细胞以及在一定程度上移除单核细胞而提供更均一产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮于冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的，并且将可用于这个情形下，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％血浆电解质-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如羟乙基淀粉(Hespan)和血浆电解质A的其他适合细胞冷冻介质，接着将细胞在每分钟1°的速率下冷冻至-80℃，并且储存在液氮储槽的蒸气相中。可使用其他控制冷冻方法，以及在-20℃下或在液氮中进行的非控制立刻冷冻。
在一些实施方案中，低温保存细胞如本文所述加以解冻和洗涤，并且使其在室温下静息一小时，随后进行活化。
本申请中还涵盖在可能需要如本文所述的经扩增细胞所处的时间之前在某一时期从受试者收集血液样品或单独采集产物。因此，待扩增的细胞的来源可在必要的任何时间点收集，并且分离和冷冻所需细胞诸如T细胞以稍后在针对将受益于T细胞疗法的许多疾病或疾患诸如本文所述的那些的T细胞疗法中使用。在一个实施方案中，血液样品或单独采集物取自大体上健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单独采集物取自处于显现疾病的风险下，但尚未显现疾病的大体上健康的受试者，并且分离和冷冻目标细胞以供稍后使用。在某些实施方案中，可扩增、冷冻T细胞，并且在稍后时间使用。在某些实施方案中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一实施方案中，在许多相关治疗模态之前从来自受试者的血液样品或单独采集物分离细胞，所述治疗模态包括但不限于用诸如以下的剂治疗：那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂诸如环孢菌素(cyclosporin)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506，抗体或其他免疫净化剂诸如坎帕斯(CAMPATH)、抗CD3抗体、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、类固醇、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(calcineurin)(环孢灵(cyclosporine)和FK506)，或抑制对于生长因子诱导的信号传导是重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一实施方案中，分离用于患者的细胞，并且冷冻以稍后与骨髓或干细胞移植、使用诸如氟达拉滨、外部射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺的化学治疗剂或诸如OKT3或坎帕斯的抗体的T细胞净化疗法联合使用(例如在之前、同时或在之后)。在另一实施方案中，在B细胞净化疗法诸如与CD20反应的剂例如利妥星(Rituxan)之前分离细胞，并且可加以冷冻以稍后在所述B细胞净化疗法之后用于治疗。
在一些实施方案中，在治疗之后立即从患者获得T细胞。就此而言，已观察到在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在治疗之后不久在患者将通常从治疗恢复所处的时期期间，所得T细胞的就它们离体扩增的能力来说的品质可为最优的或改进的。同样，在使用本文所述的方法进行离体操控之后，这些细胞就达成增强的移入和体内扩增来说可处于优选状态。因此，在本发明的情形内，预期在这个恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如用GM-CSF动员)和调节方案可用于在受试者中创建有利于特定细胞类型的再群体化、再循环、再生和/或扩增所处的条件，尤其是在疗法之后确定时间窗口期间。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
T细胞的活化和扩增
在一些实施方案中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造关联来孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化和/或增殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。这类条件包括被设计来诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露，并且/或者对细胞进行致敏以用于遗传工程改造，诸如用于引入经遗传工程改造的抗原受体的那些。条件可包括以下中的一者或多者：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体以及被设计来使细胞活化的任何其他剂。
无论在用本文所述的Nef(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)或外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))对T细胞进行遗传修饰之前还是之后，T细胞都可通常使用如例如美国专利第6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041号；以及美国专利申请公布第20060121005号中所述的方法来活化和扩增。
通常，T细胞可通过与具有与其连接的刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞的表面上的共刺激性分子的配体的表面接触来扩增。特别地，T细胞群体可如本文所述加以刺激，诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与和钙离子载体联合的蛋白质激酶C活化剂(例如苔藓抑素(bryostatin))接触。对于共刺激T细胞的表面上的辅助分子，使用结合所述辅助分子的配体。举例来说，可使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适于刺激T细胞的增殖的条件下接触。为刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，其可如同本领域中通常已知的其他方法一样加以使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施方案中，T细胞通过添加至使培养起始的组合饲养细胞诸如非分裂外周血液单核细胞(PBMC)，(例如以致在待扩增的初始群体中，对于每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如持续足以使T细胞的数目扩增的时间)来扩增。在一些方面，非分裂饲养细胞可包括经γ射线照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，PBMC用在约3000至3600拉德(rad)的范围内的γ射线照射以防止细胞分裂。在一些方面，饲养细胞在添加T细胞群体之前添加至培养基中。
在一些实施方案中，针对T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同方案来提供。举例来说，提供每种信号的剂可在溶液中，或偶联于表面。当偶联于表面时，剂可偶联于同一表面(即呈“顺式”构造)，或偶联于单独表面(即呈“反式”构造)。或者，一种剂可偶联于表面，而另一剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的剂结合于细胞表面，而提供初级活化信号的剂在溶液中或偶联于表面。在某些实施方案中，两种剂均可在溶液中。在另一实施方案中，剂可呈可溶形式，接着交联于表面，诸如表达将与剂结合的Fc受体或抗体或其他结合剂的细胞。就此而言，对于预期在本发明中用于使T细胞活化和扩增的人工抗原递呈细胞(aAPC)，参见例如美国专利申请公布第20040101519和20060034810号。
在一些实施方案中，使T细胞与经剂包被的珠粒组合，随后将珠粒和细胞分离，接着对细胞进行培养。在一替代性实施方案中，在培养之前，不将经剂包被的珠粒和细胞分离，而是一起培养。在另一实施方案中，珠粒和细胞首先通过施加诸如磁力的力来浓缩，从而导致细胞表面标志物的连接增加，由此诱导细胞刺激。
举例来说，细胞表面蛋白可通过使CD3抗体和CD28抗体与其连接的顺磁性珠粒(3×28珠粒)接触T细胞来连接。在一个实施方案中，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠粒(例如
M-450CD3/CD28 T顺磁性珠粒，在1:1的比率下)在缓冲液，优选是PBS(不具有二价阳离子诸如钙和镁)中组合。此外，本领域普通技术人员可易于了解，可使用任何细胞浓度。举例来说，靶标细胞在样品中可为极其稀少的，并且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可包含目标靶标细胞。因此，任何细胞数目都在本发明的情形内。在某些实施方案中，可合乎需要的是显著降低粒子和细胞混合在一起所处的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。举例来说，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在另一实施方案中，使用大于10000万个细胞/毫升。在另一实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/毫升的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500或10000万个细胞/毫升的细胞浓度。在其他实施方案中，可使用12500或15000万个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更高效捕集可微弱表达目标靶标抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。在某些实施方案中，这类细胞群体可具有治疗价值，并且将需要获得。举例来说，使用高浓度的细胞允许更高效选择通常具有较微弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，可培养混合物数小时(约3小时)至约14天或介于之间的任何以小时计的整数值。在另一实施方案中，可培养混合物21天。在本发明的一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养约八天。在另一实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养2-3天。若干个刺激循环也可为需要的，以致T细胞的培养时间可为60天或更久。适合于T细胞培养的条件包括适当培养基(例如最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，所述培养基可含有为增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或为熟练技术人员所知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制剂以及还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充以适量血清(或血浆)或一组确定激素和/或一定量的一种或多种足以达成T细胞的生长和扩增的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验性培养中，而非待输注至受试者中的细胞的培养中。在为支持生长所必需的条件下维持靶标细胞，所述条件例如是适当温度(例如37℃)和氛围(例如空气加5％CO2)。已暴露了不同刺激时间的T细胞可展现不同特征。举例来说，典型血液或单独采集外周血液单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制T细胞群体(TC，CD8)的辅助T细胞群体(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体来离体扩增T细胞会产生以下T细胞群体：所述T细胞群体在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，所述T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，视治疗目的而定，用主要包含TH细胞的T细胞群体对受试者进行输注可为有利的。类似地，如果已分离抗原特异性TC细胞子组，那么可有益的是在更大程度上扩增这个子组。
此外，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物在细胞扩增过程期间也显著地但在很大程度上可重现地变化。因此，这种可重现性使得能够调适活化的T细胞产物以达成特定目的。
在一些实施方案中，方法包括评估经修饰细胞或待工程改造细胞的表面上的一种或多种标志物的表达。在一个实施方案中，方法包括例如通过基于亲和力的检测方法诸如通过流式细胞计量术来评估TCR或CD3ε的表面表达。在一些方面，当方法揭示抗原或其他标志物的表面表达时，例如使用本文所述的方法来破坏编码抗原或其他标志物的基因，或以其他方式阻遏表达。
内源性基因座的基因编辑
在一些实施方案中，在对T细胞进行修饰以表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))之前或同时，T细胞的内源性基因座诸如内源性TCR基因座(例如TCRα、TCRβ)通过基因编辑方法加以修饰。在一些实施方案中，对内源性基因座的修饰通过在基因中实现破坏诸如敲除、插入、错义或框移突变诸如双等位基因框移突变、缺失基因的全部或一部分例如一个或多个外显子或其部分、和/或敲入来进行。在一些实施方案中，这种基因座修饰使用特异性结合或杂交于基因的DNA靶向分子诸如DNA结合蛋白或DNA结合核酸，或含有所述DNA靶向分子的复合物、化合物或组合物来进行。在一些实施方案中，DNA靶向分子包含DNA结合结构域，例如锌指蛋白(ZFP)DNA结合结构域、转录活化子样蛋白(TAL)或TAL效应物(TALE)DNA结合结构域、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)DNA结合结构域或来自兆碱基大范围核酸酶的DNA结合结构域。
在一些实施方案中，对内源性基因座(例如TCR)的修饰使用一种或多种DNA结合核酸来进行，诸如通过RNA引导的核酸内切酶(RGEN)来进行的破坏，或由另一RNA引导的效应分子达成的其他形式的阻遏。举例来说，在一些实施方案中，阻遏使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白来进行。参见Sander和Joung,NatureBiotechnology,32(4):347-355。
一般来说，“CRISPR系统”总体指代表达CRISPR相关(“Cas”)基因或引导所述基因的活性中涉及的转录物和其他要素，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化性CRISPR)序列(例如tracrRNA或具有活性的部分tracrRNA)、tracr配偶序列(在内源性CRISPR系统的情形下涵盖“同向重复序列”和经tracrRNA加工的部分同向重复序列)、引导序列(在内源性CRISPR系统的情形下也被称为“间隔体”)、和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括以序列特异性方式结合DNA的非编码RNA分子(引导)RNA以及具有核酸酶功能性(例如两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如Cas9)。
在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个要素源于I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个要素源于包含内源性CRISPR系统的特定生物体，诸如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。
在一些实施方案中，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶标序列具有特异性的crRNA和固定tracrRNA的融合)引入至细胞中。一般来说，在gRNA的5′末端处的靶标位点使用互补碱基配对来使Cas核酸酶靶向靶标位点例如基因。在一些实施方案中，靶标位点基于它的紧靠在原间隔体邻近基序(PAM)序列的5′的位置来选择，所述PAM序列诸如通常是NGG或NAG。在这个方面，通过修改引导RNA的前20个核苷酸以对应于靶标DNA序列，使gRNA靶向所需序列。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO:23的核酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR系统在靶标位点处诱导DSB。在其他实施方案中，被视为“切口酶”的Cas9变体用于在靶标位点处对单链产生切口。在一些方面，使用成对切口酶，例如以改进特异性，每种切口酶由对序列进行靶向的一对不同gRNA引导，以致在同时引入切口后，引入5′突出部分。在其他实施方案中，催化非活性的Cas9融合至异源性效应结构域诸如转录阻遏物或活化子以影响基因表达。
在一些实施方案中，在修饰T细胞以表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))之前，T细胞的内源性基因座(例如内源性TCR)通过CRISPR/Cas系统加以修饰。在一些实施方案中，与修饰T细胞以表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))同时，T细胞的内源性基因座(例如内源性TCR)通过CRISPR/Cas系统加以修饰。在一些实施方案中，编码CRISPR/Cas系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的一种或多种核酸在同一载体上。在一些实施方案中，编码CRISPR/Cas系统的一种或多种核酸和编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的一种或多种核酸在不同载体上。
经修饰T细胞的分离和富集
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括分离或富集包含第一和/或第二核酸的T细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括从表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞分离或富集CD3ε/γ/δ阴性T细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括从表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞分离或富集内源性TCRα/β阴性T细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括从表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞分离或富集CD4+和/或CD28+T细胞。在一些实施方案中，对T细胞的分离或富集包括本文所述的方法的任何组合。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子诸如表面标志物例如表面蛋白、细胞内标志物或核酸在细胞中的不存在或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，选择标志物是Nef(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)、外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))、CD4、CD28、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD69、TCRα、TCRβ或MHC。在一些实施方案中，可使用基于这类标志物的任何已知分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。举例来说，在一些方面，分离包括基于细胞对一种或多种通常是细胞表面标志物的标志物的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合这类标志物的抗体或结合配偶体一起孵育，通常继之以洗涤步骤，以及将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合于所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
这类分离步骤可基于正性选择，其中已结合试剂的细胞被保留来供进一步使用，和/或负性选择，其中尚未结合于抗体或结合配偶体的细胞被保留。在一些实例中，两个级分均被保留来供进一步使用。在一些方面，负性选择在没有特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体可用时可为特别有用的，以致分离基于由除所需群体以外的细胞表达的标志物来最佳进行。
分离无需导致100％富集或移除表达特定标志物的特定细胞群体或细胞。举例来说，正性选择或富集特定类型的细胞诸如表达标志物的那些是指使这类细胞的数目或百分比增加，但无需导致完全不存在不表达所述标志物的细胞。同样，负性选择、移除或消减特定类型的细胞诸如表达标志物的那些是指使这类细胞的数目或百分比降低，但无需导致完全移除所有这类细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的经正性或负性选择的级分经受另一分离步骤，诸如后续正性或负性选择。在一些实例中，单一分离步骤可同时消减表达多种标志物的细胞，诸如通过使细胞与各自对被靶向来达成负性选择的标志物具有特异性的多种抗体或结合配偶体一起孵育。同样，多种细胞类型可通过使细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育来同时以正性方式加以选择。
举例来说，在一些方面，通过正性或负性选择技术来分离T细胞的特定子群体，诸如关于一种或多种表面标志物呈阳性或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。
举例来说，CD3+、CD28+T细胞可使用CD3/CD28缀合磁性珠粒(例如
M-450CD3/CD28 T细胞扩增珠粒)加以正性选择。
在一些实施方案中，分离通过以正性选择方式富集特定细胞群体，或以负性选择方式消减特定细胞群体来进行。在一些实施方案中，正性或负性选择分别通过使细胞与一种或多种特异性结合一种或多种在经正性或负性选择的细胞上表达或在相对较高水平(标志物高)下表达(标志物+)的表面标志物的抗体或其他结合剂一起孵育来实现。
在一些方面，使待分离的细胞的样品或组合物与小型可磁化或磁响应性材料诸如磁响应性粒子或微粒诸如顺磁性珠粒(例如像Dynalbead或MACS珠粒)一起孵育。磁响应性材料例如粒子通常直接或间接连接至特异性结合存在于需要分离例如需要负性或正性选择的一种细胞、多种细胞或细胞群体上的分子例如表面标志物的结合配偶体例如抗体。
在一些实施方案中，磁性粒子或珠粒包括结合于特异性结合成员诸如抗体或其他结合配偶体的磁响应性材料。存在许多熟知的用于磁性分离方法中的磁响应性材料。适合磁性粒子包括Molday的美国专利第4,452,773号中，以及欧洲专利说明书EP 452342 B中所述的那些，所述专利据此通过引用并入本文。胶体大小的粒子诸如Owen的美国专利第4,795,698号以及Liberti等人的美国专利第5,200,084号中所述的那些是其他实例。
孵育通常在如果细胞表面分子存在于样品内的细胞上，那么连接至磁性粒子或珠粒的抗体或结合配偶体或特异性结合这类抗体或结合配偶体的分子诸如二级抗体或其他试剂特异性结合所述细胞表面分子所凭借的条件下进行。
在一些实施方案中，将样品放置在磁场中，并且具有与其连接的磁响应性或可磁化粒子的那些细胞将被吸引至磁体，并且与未标记细胞分离。对于正性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于负性选择，保留未被吸引的细胞(未标记细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行正性选择和负性选择的组合，其中正性级分和负性级分被保留，并且进一步处理或经受其他分离步骤。
在某些实施方案中，在初级抗体或其他结合配偶体、二级抗体、凝集素、酶或链霉亲和素中对磁响应性粒子进行包被。在某些实施方案中，磁性粒子通过对一种或多种标志物具有特异性的初级抗体的包被层来连接至细胞。在某些实施方案中，用初级抗体或结合配偶体标记细胞而非珠粒，接着添加经细胞类型特异性二级抗体或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性粒子。在某些实施方案中，经链霉亲和素包被的磁性粒子与生物素化初级或二级抗体联合使用。
在一些实施方案中，使磁响应性粒子连接至待随后加以孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面，使粒子连接至细胞以向患者施用。在一些实施方案中，从细胞移除可磁化或磁响应性粒子。用于从细胞移除可磁化粒子的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非经标记抗体、缀合于可裂解接头的可磁化粒子或抗体等。在一些实施方案中，可磁化粒子是生物可降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择通过磁激活的细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec,Auburn,Calif.)来进行。磁激活的细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择具有与其连接的磁化粒子的细胞。在某些实施方案中，MACS以其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标物质和靶标物质的模式运行。也就是说，连接至磁化粒子的细胞被固定就位，而未连接物质被洗脱。接着，在这个第一洗脱步骤完成之后，以某一方式使被圈闭在磁场中并且防止被洗脱的物质释放，以致它们可被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶标细胞被标记，并且从异质细胞群体消减。
在某些实施方案中，分离或分开使用进行方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一者或多者的系统、装置或设备来进行。在一些方面，系统用于在密闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一者，例如以使误差、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，系统是如公布号是WO2009/072003的国际专利申请或US 20110003380A1中所述的系统。
在一些实施方案中，系统或设备在集成或自含式系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一者或多者，例如全部。在一些方面，系统或设备包括与系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，所述计算机和/或计算机程序允许用户对处理、分离、工程改造和配制步骤的结果进行编程、控制、评估，并且/或者调整所述步骤的各个方面。
在一些方面，分离和/或其他步骤使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)来进行，例如以在密闭和无菌系统中在临床规模水平上自动化分离细胞。部件可包括集成微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的所有部件，并且引导系统以标准化顺序进行重复程序。在一些方面，磁性分离单元包括可移动的永磁体和选择柱固持器。蠕动泵控制在整个管组中的流速，并且连同夹管阀一起确保穿过系统的缓冲液的流动受到控制以及连续悬浮细胞。
在一些方面，CliniMACS系统使用提供在无菌无热原溶液中的抗体偶联的可磁化粒子。在一些实施方案中，在用磁性粒子标记细胞之后，洗涤细胞以移除过量粒子。接着使细胞制备袋连接至管组，所述管组转而连接至含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由包括预柱和分离柱的预组装无菌管组成，并且仅供单次使用。在启动分离程序之后，系统自动将细胞样品施加至分离柱上。经标记细胞被保留在柱内，而未标记细胞通过一系列洗涤步骤来移除。在一些实施方案中，供与本文所述的方法一起使用的细胞群体是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方案中，供与本文所述的方法一起使用的细胞群体是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方案中，供与本文所述的方法一起使用的细胞群体在移除磁场之后从柱加以洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，分离和/或其他步骤使用CliniMACS Prodigy系统(MiltenyiBiotec)来进行。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有容许自动化洗涤以及通过离心来分级分离细胞的细胞处理单元。CliniMACS Prodigy系统还可包括板载照相机和通过辨别来源细胞产物的宏观层来确定最优细胞分级分离终点的图像识别软件。举例来说，外周血液被自动分成红细胞、白血细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可包括实现细胞培养方案诸如像细胞分化和扩增、抗原上样和长期细胞培养的集成细胞培育室。输入口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可使用集成显微镜来监测。
在一些实施方案中，本文所述的细胞群体通过流式细胞计量术来收集和富集(或消减)，其中针对多种细胞表面标志物加以染色的细胞被携带在流体流中。在一些实施方案中，本文所述的细胞群体通过制备规模(FACS)分选来收集和富集(或消减)。在某些实施方案中，本文所述的细胞群体通过使用与基于FACS的检测系统组合的微机电系统(MEMS)芯片来收集和富集(或消减)(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；以及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376。在两种情况下，细胞均可用多种标记加以标记，从而允许在高纯度下分离明确确定的T细胞子组。
在一些实施方案中，抗体或结合配偶体用一种或多种可检测标记加以标记以有助于分离以达成正性和/或负性选择。举例来说，分离可基于与经荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，基于被携带在流体流中的对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来对细胞进行分离，诸如通过荧光激活的细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)，和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞测量检测系统组合。这类方法允许基于多种标志物同时进行正性和负性选择。
对于分离和富集方法，也参见“实施例”章节。
IV.Nef蛋白
本文所述的方法涉及表达Nef蛋白。还提供了特别可用于制备本文所述的经修饰T细胞的非天然存在的突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)。
野生型Nef(负性调控因子)是一种由灵长类动物慢病毒编码的小型27-35kDa肉豆蔻酰化蛋白，所述灵长类动物慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。Nef主要定位于细胞质，但也被部分地募集至质膜(PM)。它充当可操控宿主的细胞机构，因此允许病原体感染、存活或复制的毒力因子。
Nef在所有灵长类动物慢病毒中都是高度保守的。HIV-2和SIV Nef蛋白比HIV-1Nef长10-60个氨基酸。从N末端至C末端，Nef蛋白包含以下结构域：肉豆蔻酰化位点(涉及于CD4下调、MHC I下调以及与信号传导分子的缔合中，为Nef的内质膜靶向和病毒粒子并入所需，并且由此为感染性所需)、N末端α螺旋(涉及于MHC I下调和蛋白质激酶募集中)、基于酪氨酸的AP募集(HIV-2/SIV Nef)、CD4结合位点(WL残基，涉及于CD4下调中，对于HIV-1Nef所表征)、酸性簇(涉及于MHC I下调、与宿主PACS1和PACS2的相互作用中)、基于脯氨酸的重复序列(涉及于MHC I下调和SH3结合中)、PAK(p21活化的激酶)结合结构域(涉及于与信号传导分子的缔合和CD4下调中)、COP I募集结构域(涉及于CD4下调中)、基于二亮氨酸的AP募集结构域(涉及于CD4下调中，HIV-1Nef)以及V-ATP酶和Raf-1结合结构域(涉及于CD4下调以及与信号传导分子的缔合中)。
CD4是一种55kDa I型整合细胞表面糖蛋白。它是II类MHC限定细胞诸如辅助/诱导T淋巴细胞上的T细胞受体以及巨噬细胞/单核细胞谱系的细胞的组分。它充当HIV和SIV的初级细胞受体。
在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef和HIV2 Nef组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Nef蛋白从原代HIV-1亚型C印度分离株获得或源于所述分离株。在一些实施方案中，Nef蛋白从印度分离株的编码全长蛋白的F2等位基因表达(HIV F2-Nef)。在一些实施方案中，Nef蛋白从具有CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列和PAK结合结构域的框内缺失的印度分离株C2等位基因表达(HIV C2-Nef)。在一些实施方案中，Nef蛋白从具有CD4结合位点的框内缺失的印度分离株D2等位基因表达(HIV D2-Nef)。
在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef，诸如包含插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排中的一者或多者的Nef蛋白。在一些实施方案中，本申请提供了非天然存在的突变Nef蛋白，诸如当在T细胞中表达时，不将外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)或经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体))下调的非天然存在的突变Nef蛋白。因此，在一些实施方案中，提供了一种相较于野生型Nef，包含一个或多个突变的非天然存在的突变Nef蛋白，其中当在T细胞中表达时，相较于野生型Nef，所述非天然存在的突变Nef不导致或以更小程度导致外源性受体下调。Nef蛋白可在一个或多个选自由以下组成的组的结构域或基序中包含一个或多个突变(例如非天然存在的突变)：肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域以及它们的任何组合。
举例来说，在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef在基于二亮氨酸的AP募集结构域中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef在基于二亮氨酸的AP募集结构域和PAK结合结构域中包含突变。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef在基于二亮氨酸的AP募集结构域、PAK结合结构域、COP I募集结构域以及V-ATP酶和Raf-1结合结构域中包含突变。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef在基于二亮氨酸的AP募集结构域、COP I募集结构域以及V-ATP酶和Raf-1结合结构域中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef在基于二亮氨酸的AP募集结构域以及V-ATP酶和Raf-1结合结构域中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef包含使部分或整个结构域缺失的截短。
在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef蛋白包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白包含不在任何以上提及的结构域/基序中的一个或多个突变(例如非天然存在的突变)。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变(例如使至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任何数目的氨基酸残基突变，诸如突变成Ala)的突变SIV Nef。在一些实施方案中，突变(例如非天然存在的突变)Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变(例如使至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任何数目的氨基酸残基突变，诸如突变成Ala)的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白(野生型或突变体，例如非天然存在的突变体)在T细胞(例如同种异体T细胞)中的表达将内源性TCR下调。在一些实施方案中，内源性TCR下调包括内源性TCR、CD3ε、CD3δ和/或CD3γ的细胞表面表达的下调，以及/或者干扰TCR介导的信号转导诸如T细胞活化或T细胞增殖(例如通过调节管控必需TCR近端机构诸如Lck和LAT向质膜的运送的囊泡运送途径，以及/或者通过破坏TCR诱导的为TCR近端信号传导机构的时空协调所必需的肌动蛋白重塑事件)。在一些实施方案中，相较于来自同一供者来源的T细胞的细胞表面表达，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的T细胞中内源性TCR、CD3ε、CD3δ和/或CD3γ的细胞表面表达被下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，将内源性TCR下调(例如将表达下调)的突变(例如非天然存在的突变)Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白包含选自SEQ ID NO:12-14以及18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变Nef(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD4的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，但不将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差至多约3％(诸如至多约2％或1％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，并且将功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。
在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白(野生型或突变体，例如非天然存在的突变体)在T细胞(例如同种异体T细胞)中的表达不改变内源性CD3ζ表达或CD3ζ介导的信号转导，或相较于来自同一供者来源的T细胞的内源性CD3ζ表达和/或CD3ζ介导的信号转导，将内源性CD3ζ表达下调和/或将CD3ζ介导的信号转导下调至多约50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白包含选自SEQ ID NO:12-14以及18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在本发明中，Nef不影响或以最小程度影响CD3ζ介导的信号转导的能力是关键的，因为Nef表达意图用于将内源性TCR下调，同时引发少许或不引发对引入至同一细胞中的外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体)、例如或包含配体结合结构域的嵌合受体)的信号转导的影响。还需要Nef表达引发少许或不引发对引入至同一细胞中的外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体)或包含配体结合结构域的嵌合受体)的表达的影响。
在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白(野生型或突变体，例如非天然存在的突变体)在T细胞(例如同种异体T细胞)中的表达不将同一T细胞中的外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体)或包含配体结合结构域的嵌合受体)下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，相较于当外源性受体在来自同一供者来源的无Nef表达的T细胞中表达时，表达本文所述的Nef蛋白的经修饰T细胞中的外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体)或包含配体结合结构域的嵌合受体)被下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，当经修饰T细胞表达本文所述的Nef蛋白时，外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体)或包含配体结合结构域的嵌合受体)的细胞表面表达和/或信号转导未受影响，或被下调至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白包含选自SEQID NO:12-14以及18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
在一些实施方案中，本文所述的Nef蛋白(野生型或突变体，例如非天然存在的突变体)在T细胞(例如同种异体T细胞)中的表达将内源性MHC I、CD4和/或CD28下调，诸如将内源性MHC I、CD4和/或CD28的细胞表面表达下调(例如通过胞吞和降解)。在一些实施方案中，相较于来自同一供者来源的T细胞的细胞表面表达，表达本文所述的Nef蛋白的T细胞中内源性MHC I、CD4和/或CD28的细胞表面表达被下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。
在一些实施方案中，相较于当野生型Nef蛋白在来自同一供者来源的T细胞中表达时，本文所述的突变(例如非天然存在的突变)Nef蛋白(例如具有突变的涉及于CD4或CD28下调中的结构域/基序)在T细胞(例如同种异体T细胞)中的表达将内源性TCR(和/或MHC I)下调，同时具有降低的对内源性CD4或CD28的下调作用(下调少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))。在一些实施方案中，对内源性CD4/CD28的下调作用包括CD4/CD28的细胞表面表达的下调。在一些实施方案中，突变Nef不将内源性CD4下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，突变Nef不将内源性CD28下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，相较于当野生型Nef蛋白在来自同一供者来源的T细胞中表达时，当突变Nef在T细胞中表达时，内源性CD4(和/或CD28)的细胞表面表达的下调降低至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，相较于来自同一供者来源的T细胞的细胞表面表达，突变Nef在T细胞中的表达将内源性TCR(和/或MHC I)的细胞表面表达下调至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％中的任一者，而相较于当野生型Nef蛋白在来自同一供者来源的T细胞中表达时，内源性CD4(和/或CD28)的细胞表面表达的下调降低至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，突变Nef蛋白(例如突变SIV Nef)将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相差不超过约3％(诸如不超过约2％或1％中的任一者)(或将内源性TCR(例如TCRα和/或TCRβ)的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比多至少约3％(包括等于3％；诸如至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者))，并且将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调，与由野生型Nef进行的下调相比少至少约3％(诸如至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者)。在一些实施方案中，突变Nef蛋白包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有较小CD4和/或CD28下调作用的突变Nef是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
在一些实施方案中，提供了一种非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或包含不在任何以上提及的结构域/基序内的一个或多个突变。在一些实施方案中，提供了一种在以下任一者包含一个或多个突变的非天然存在的Nef蛋白：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列的非天然存在的Nef蛋白。
还提供了编码本文所述的任何Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的核酸(例如经分离核酸)。还提供了包含编码本文所述的任何Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的核酸的载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体、细菌表达载体)。这些载体可放置在本文所述的任何载体中。
V.功能性外源性受体
在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。编码功能性外源性受体的核酸可先前存在于前体T细胞中，或连同编码Nef蛋白的核酸一起(例如同时)引入至前体T细胞中。功能性外源性受体可包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，功能性外源性受体是经工程改造TCR，诸如包含细胞外配体结合结构域的传统经工程改造TCR(例如特异性识别BCMA或BCMA/MHC复合物的经工程改造TCR，被称为“抗BCMA TCR”)，所述细胞外配体结合结构域包含源于野生型TCR的共同特异性识别抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA)的Vα和Vβ，其中相对于所述野生型TCR，所述Vα、所述Vβ或两者在一个或多个CDR中包含一个或多个突变。表达传统经工程改造TCR的T细胞在本文中被称为“传统TCR-T”。在一些实施方案中，功能性外源性受体是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。表达嵌合TCR的T细胞在本文中被称为“cTCR-T”。在一些实施方案中，功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于第一TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞外结构域；(f)包含第二TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的跨膜域的跨膜域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的(例如全都是CD4)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。举例来说，在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长TCR共受体(例如CD4、CD8(例如CD8α)或CD28)。表达TAC的T细胞在本文中被称为“TAC-T”。在一些实施方案中，功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体，所述T细胞抗原偶联物样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的(例如CD3ε)。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的(例如CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的(例如CD3ε)。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的(例如CD3ε)，但不同于第一TCR亚基(例如TCRα)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长第二TCR亚基(例如CD3ε)；其中所述第一和第二TCR亚基均选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一和第二TCR亚基是相同的(例如均是CD3ε)。在一些实施方案中，第一(例如TCRα)和第二(例如CD3ε)TCR亚基是不同的。表达TAC样嵌合受体的T细胞在本文中被称为“TAC样-T”。在一些实施方案中，功能性外源性受体是非TCR受体。在一些实施方案中，非TCR受体是嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如本文所述的任何抗原，诸如BCMA、CD20、CD19)的结合部分(例如受体结构域或基于抗体的结合结构域诸如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)包含抗原结合片段的结合部分(在下文中被称为“抗抗原CAR”或“基于抗体的CAR”，例如“抗BCMA CAR”)，诸如sdAb(例如抗BCMA sdAb)或scFv(例如抗CD20 scFv、抗CD19 scFv)。在一些实施方案中，CAR的细胞外配体结合结构域包含一个或多个包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域的结合部分(在下文中也被称为“基于配体/受体的CAR”)，其中所述配体或受体是细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体源于APRIL或BAFF(BCMA的配体)。表达CAR的T细胞在本文中被称为“CAR-T”。包含含有一个或多个包含APRIL或BAFF的结合部分的细胞外配体结合结构域的CAR在下文中被称为“BCMA-配体CAR”。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体(例如FcγR)的细胞外结构域。包含含有一个或多个包含Fc结合结构域(例如FcγR)的结合部分的细胞外配体结合结构域的CAR在下文中也被称为“抗体偶联的T细胞受体(ACTR)”。表达ACTR的T细胞在本文中被称为“ACTR-T”。在一些实施方案中，当将含有Fc的蛋白质施用至ACTR-T细胞或在ACTR-T细胞中共表达时，所述含有Fc的蛋白质赋予ACTR表达性T细胞对本文所述的抗原的结合特异性。在一些实施方案中，含有Fc的蛋白质是含有Fc的抗体(例如全长抗体诸如抗BCMA全长抗体)或Fc融合蛋白，诸如抗原结合片段-Fc融合蛋白(例如抗BCMA sdAb-Fc融合蛋白或抗BCMA HCAb)、Fc-受体/配体融合蛋白(例如APRIL-Fc融合蛋白)、包含TCR的融合至免疫球蛋白G(IgG)的Fc区的可变区的Fc融合蛋白(“TCR-Fc融合蛋白”，诸如抗BCMA TCR-Fc融合蛋白)。ACTR/含有Fc的蛋白质系统在下文中被称为“抗抗原ACTR”，诸如“抗BCMA ACTR”。
还提供了编码本文所述的任何功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸(例如经分离核酸)。还提供了包含编码本文所述的任何功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸的载体(例如病毒载体诸如慢病毒载体)。
抗原
本文所述的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞外配体结合结构域可特异性识别靶标细胞上的任何抗原。在一些实施方案中，抗原是细胞表面分子。在一些实施方案中，抗原充当靶标细胞上与特殊疾病状态相关的细胞表面标志物。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域特异性识别单一肿瘤抗原。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域特异性识别单一肿瘤抗原的一个或多个表位。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域特异性识别两种或更多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与B细胞恶性肿瘤诸如B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤(MM)相关。肿瘤表达可充当免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的靶标抗原的许多蛋白质。由细胞外配体结合结构域特异性识别的抗原可为在单一患病细胞上的抗原，或在各自促进疾病的不同细胞上表达的抗原。由细胞外配体结合结构域特异性识别的抗原可直接或间接涉及于疾病中。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的可引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的蛋白质。对本发明的所靶向抗原的选择将取决于待治疗的特定癌症类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、BCMA(B细胞成熟抗原)、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺特异性蛋白、PSMA、HER2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可充当免疫攻击的靶标抗原的许多蛋白质。这些分子包括但不限于黑素瘤中的组织特异性抗原诸如MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶标分子属于转化相关分子的群组，诸如致癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一组靶标抗原是致癌胎儿抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成为单个肿瘤所特有的真正肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶标抗原的其他候选物。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为肿瘤细胞所特有，并且不存在于身体中的其他细胞上。TAA相关抗原不为肿瘤细胞所特有，而是也在未能诱导对抗原的免疫耐受性的状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可发生在使得免疫系统能够对抗原起应答的条件下。TAA可为在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统是不成熟的并且不能起应答，或它们可为通常在极低水平下存在于正常细胞上，但在高得多的水平下在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过度表达的胚胎抗原诸如CEA；过度表达的致癌基因和突变肿瘤抑制基因诸如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如艾伯斯坦巴尔病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大型基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白(beta-Catenin)、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白(cyclophilin C-associated protein)、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原在B细胞上表达。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19或CD20。
在一些实施方案中，抗原是病原体抗原，诸如真菌、病毒或细菌抗原。在一些实施方案中，真菌抗原来自曲霉属(Aspergillus)或念珠菌属(Candida)。在一些实施方案中，病毒抗原来自单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、偏肺病毒(hMPV)、鼻病毒、副流感病毒(PIV)、艾伯斯坦–巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、JC病毒(约翰坎宁安病毒(JohnCunningham virus))、BK病毒、HIV、寨卡病毒(Zika virus)、人冠状病毒、诺如病毒(norovirus)、脑炎病毒或埃博拉(Ebola)病毒。
在一些实施方案中，细胞表面抗原是配体或受体。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含一个或多个包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域的结合部分，其中所述配体或受体是本文所述的细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体或受体源于选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施方案中，配体源于可结合BCMA的APRIL或BAFF。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。
嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达CAR，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(诸如本文所述的任何抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于四链抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于人抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是sdAb(例如抗BCMA sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含两个或更多个连接在一起的sdAb。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是scFv(例如抗CD19 scFv、抗CD20 scFv或CD19×CD20双特异性scFv)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是非抗体结合蛋白，诸如结合抗原的多肽配体或经工程改造蛋白质。在一些实施方案中，一个或多个结合部分包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域，其中所述配体或受体是细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体或受体源于选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施方案中，配体源于可结合BCMA的APRIL或BAFF。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。在一些实施方案中，CAR是单价的和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如双特异性的)和单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的(例如二价的)和多特异性的(例如双特异性的)。在一些实施方案中，抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19或CD20。在一些实施方案中，跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。在一些实施方案中，跨膜结构域源于CD8α。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于DAP12、CD3ζ或CD3γ。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域包含CD137的细胞质结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，CAR还包含位于多肽的N末端处的信号肽。在一些实施方案中，信号肽源于CD8α。在一些实施方案中，CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD8α信号肽、细胞外配体结合结构域(例如一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb、APRIL/BAFF配体或Fc受体)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR是“抗BCMA CAR”。在一些实施方案中，CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD8α信号肽、包含抗BCMA sdAb的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD8α信号肽、包含第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb是相同的。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb是不同的。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb特异性结合相同BCMA表位。在一些实施方案中，第一抗BCMA sdAb和第二抗BCMA sdAb特异性结合不同BCMA表位。在一些实施方案中，抗BCMACAR包含选自SEQ ID NO:59-61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR是抗CD19 CAR。在一些实施方案中，抗CD19 CAR的细胞外配体结合结构域包含抗CD19 scFv。在一些实施方案中，抗CD19 CAR包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR是抗CD20 CAR。在一些实施方案中，抗CD20 CAR的细胞外配体结合结构域包含抗CD20 scFv。在一些实施方案中，抗CD20 scFv源于抗CD20抗体诸如利妥昔单抗(例如
)或Leu-16。在一些实施方案中，抗CD20 CAR包含SEQ ID NO:55或56的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR是抗CD19/抗CD20双特异性CAR(在本文中也被称为CD19×CD20CAR)。在一些实施方案中，CD19×CD20 CAR的细胞外配体结合结构域包含抗CD20 scFv和/或抗CD19scFv。在一些实施方案中，CD19×CD20 CAR包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR是“BCMA-配体CAR”。在一些实施方案中，CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD8α信号肽、包含一个或多个包含至少一个源于APRIL或BAFF的结构域的结合部分的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含APRIL结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含BAFF结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含APRIL结构域和BAFF结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR是抗体偶联的TCR(ACTR)。携带ACTR的经工程改造T细胞可结合含有Fc的蛋白质(诸如单克隆抗体，例如抗BCMA抗体)，所述含有Fc的蛋白质接着充当到达肿瘤细胞的桥梁。在一些实施方案中，CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD8α信号肽、包含一个或多个包含Fc结合结构域(诸如Fc受体，例如FcγR)的结合部分的细胞外配体结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、源于CD137的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。
本领域中已知或由本发明者开发的任何CAR，包括PCT/CN2017/096938和PCT/CN2016/094408(其内容通过引用以它们的整体并入本文)中所述的CAR，都可用于构建本文所述的CAR。CAR的示例性结构显示于PCT/CN2017/096938的图15A至图15D中。
多价和/或多特异性CAR
在一些实施方案中，本文所述的CAR是多价CAR，所述多价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含两个或更多个(诸如2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如本文所述的任何抗原)的结合部分；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者是抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者包含单结构域抗体(例如抗BCMAsdAb、BCMA VHH)。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者源于骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者源于四链抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者是scFv(例如抗CD20 scFv、抗CD19 scFv)。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者源于人抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一者或多者是特异性结合抗原的多肽配体或其他非抗体多肽。在一些实施方案中，多价CAR是单特异性的，即多价CAR靶向单一抗原，并且包含两个或更多个针对所述单一抗原的结合位点。在一些实施方案中，多价CAR是多特异性的，即多价CAR靶向超过一种抗原，并且多价CAR包含两个或更多个针对至少一种抗原的结合位点。对相同抗原具有特异性的结合部分可结合抗原的相同表位(即“单表位CAR”)，或结合抗原的不同表位(即“多表位CAR”诸如双表位CAR或三表位CAR)。对相同抗原具有特异性的结合位点可包含相同或不同sdAb。在一些实施方案中，抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19或CD20。
在一些实施方案中，本文所述的CAR是多价(诸如二价、三价或更高价数)CAR，所述多价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含多个(诸如至少约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR是多价(诸如二价、三价或更高价数)CAR，所述多价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含多个(诸如至少约2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR是多价(诸如二价、三价或更高价数)CAR，所述多价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的第一表位的第一结合部分(例如sdAb、scFv)以及特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的第二表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是不同的。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是相同的。在一些实施方案中，第一结合部分是sdAb，并且第二结合部分源于人抗体(例如scFv)。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分均是sdAb或scFv。在一些实施方案中，第一结合部分是sdAb，并且第二结合部分是多肽配体或受体(例如APRIL、BAFF、Fc受体)。在一些实施方案中，多价CAR特异性结合抗原上的两个不同表位。在一些实施方案中，多价CAR特异性结合抗原上的三个或更多个不同表位。在一些实施方案中，本文所述的CAR是二价CAR，所述二价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA)的第一表位的第一sdAb以及特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA)的第二表位的第二sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR是二价CAR，所述二价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的第一表位的第一scFv以及特异性结合抗原(诸如肿瘤抗原，例如BCMA、CD19、CD20)的第二表位的第二scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域(在本文中也被称为CD19×CD20 CAR)。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是不同的。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是相同的。在一些实施方案中，本文所述的CAR是二价和双特异性CAR，所述二价和双特异性CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性结合CD19的第一scFv和特异性结合CD20的第二scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。例如在一些实施方案中，抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。在一些实施方案中，抗原是BCMA、CD19或CD20。
在一些实施方案中，本文所述的CAR是二价CAR，所述二价CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性结合BCMA的第一表位的第一sdAb(“抗BCMA sdAb1”或“抗BCMA VHH1”)以及特异性结合BCMA的第二表位的第二sdAb(“抗BCMAsdAb2”或“抗BCMA VHH2”)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb1和抗BCMA sdAb2是相同的。在一些实施方案中，抗BCMA sdAb1和抗BCMAsdAb2是不同的。
细胞外配体结合结构域
本文所述的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)结合部分，诸如sdAb。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于四链抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分源于人抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是sdAb(例如抗BCMA sdAb)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是scFv(例如抗CD19 scFv、抗CD20 scFv或CD19×CD20 scFv)。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是非抗体结合蛋白，诸如结合抗原的多肽配体或经工程改造蛋白质。在一些实施方案中，一个或多个结合部分包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域，其中所述配体或受体是细胞表面抗原。在一些实施方案中，配体或受体源于选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施方案中，配体源于可结合BCMA的APRIL或BAFF。在一些实施方案中，受体源于Fc结合结构域，诸如Fc受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，Fc受体是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施方案中，FcγR选自由CD16A(FcγRIIIa)、CD16B(FcγRIIIb)、CD64A、CD64B、CD64C、CD32A和CD32B组成的组。结合部分可通过肽键直接彼此融合，或通过肽接头来彼此融合。
单结构域抗体(sdAb)
在一些实施方案中，功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))包含含有一个或多个sdAb的细胞外配体结合结构域。sdAb可具有相同或不同来源，并且具有相同或不同大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如VHH或VNAR)、天然地缺乏轻链的结合分子、源于常规4链抗体的单结构域(诸如VH或VL)、人源化的仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb以及经工程改造结构域和除源于抗体的单结构域骨架以外的单结构域骨架。本领域中已知或由本发明者开发的任何sdAb，包括PCT/CN2017/096938和PCT/CN2016/094408(其内容通过引用以它们的整体并入本文)中所述的sdAb，都可用于构建本文所述的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。CAR的示例性结构显示于PCT/CN2017/096938的图15A至图15D中。sdAb可源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文涵盖的单结构域抗体还包括来自除骆驼科(Camelidae)和鲨鱼以外的物种的天然存在的sdAb分子。
在一些实施方案中，sdAb源于被称为缺乏轻链的重链抗体(在本文中也被称为“仅有重链的抗体”)的天然存在的单结构域抗原结合分子。这类单结构域分子例如公开于WO94/04678以及Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature 363:446-448中。为明晰起见，源于天然地缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH以将它与四链免疫球蛋白的常规VH进行区分。这种VHH分子可源于在骆驼科物种例如骆驼、美洲驼、小羊驼、单峰驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科之外，其他物种也可产生天然地缺乏轻链的重链分子，并且这类VHH在本申请的范围内。
来自骆驼科动物的VHH分子是IgG分子的约十分之一小。它们是单一多肽，并且可为极其稳定的，抵抗极端pH和温度条件。此外，它们可对蛋白酶的作用具有抗性，常规4链抗体并非这样。此外，VHH的体外表达会产生高产率的经适当折叠的功能性VHH。此外，在骆驼科动物中产生的抗体可识别除由在体外通过使用抗体文库或通过使除骆驼科动物以外的哺乳动物免疫来产生的抗体识别的那些表位以外的表位(参见例如WO9749805)。因此，相比于包含源于常规4链抗体的抗原结合片段的多特异性或多价CAR，包含一个或多个VHH结构域的多特异性或多价CAR可与靶标更高效地相互作用。因为已知的是VHH会结合至‘不常见’表位诸如空腔或沟槽中，所以相比于常规多特异性多肽，包含这类VHH的CAR的亲和力可更适于治疗性治疗。
在一些实施方案中，sdAb源于见于软骨鱼中的免疫球蛋白的可变区。举例来说，sdAb可源于见于鲨鱼的血清中的被称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源于NAR(“IgNAR”)的可变区的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161以及Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
在一些实施方案中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼源化的、去免疫化的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示来选择)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可通过使框架区中的特定氨基酸残基“骆驼源化”来改变。骆驼源化是指用一个或多个存在于重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处的氨基酸残基置换或取代一个或多个在来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的氨基酸残基。这可例如基于本文进一步描述，以对熟练人士来说将是明确的本身已知的方式进行。所述“骆驼源化”取代优选插入在形成VH-VL界面和/或存在于所述界面处的氨基酸位置处，以及/或者在如本文定义的所谓骆驼科标志残基处(参见例如WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBSLetters 339:285-290,1994；Davies和Riechmann Protein Engineering 9(6):531-537,1996；Riechmann J.Mol.Biol.259:957-969,1996；以及Riechmann和MuyldermansJ.Immunol.Meth.231:25-38,1999)。
在一些实施方案中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见例如US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟的。
在一些实施方案中，针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域可从骆驼科动物VHH序列的(原初或免疫)文库获得。这类方法可或可不涉及利用一种或多种本身已知的筛选技术，使用所述抗原或靶标或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位来筛选这种文库。这类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。或者，可使用源于(原初或免疫)VHH文库的改进合成或半合成文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术来从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库，如例如在WO 00/43507中所述。
在一些实施方案中，sdAb从常规四链抗体产生。参见例如EP 0 368 684；Ward等人(Nature 1989年10月12日；341(6242):544-6)；Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；WO 06/030220；以及WO 06/003388。
肽接头
本文所述的多特异性或多价功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中的各种结合部分(诸如sdAb、配体/受体结构域)可通过肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，结合部分(诸如sdAb、配体/受体结构域)在无任何肽接头下直接彼此融合。连接不同结合部分(诸如sdAb、配体/受体结构域)的肽接头可为相同的或不同的。功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的不同结构域也可通过肽接头来彼此融合。
视sdAb和/或各种结构域(例如配体/受体结构域)的结构性和/或功能性特征而定，功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中的每个肽接头可具有相同或不同长度和/或序列。每个肽接头可独立选择和优化。功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中使用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力的性质具有一定影响。举例来说，可选择较长肽接头以确保两个邻近结构域不在空间上彼此干扰。举例来说，在包含针对多聚抗原的sdAb的本文所述的多价或多特异性功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中，肽接头的长度和柔性优选使得它允许多价功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中的每个sdAb结合多聚体的每个亚基上的抗原决定簇。在一些实施方案中，短肽接头可安置在功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在某一实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，以使邻近结构域相对于彼此自由移动。举例来说，甘氨酸-丝氨酸双联体可为适合肽接头。
肽接头可具有任何适合长度。在一些实施方案中，肽接头的长度是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度是不超过约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度是约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一者。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。举例来说，源于仅有重链的抗体的铰链区的序列可被用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域中已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:40)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:41)、(GGGS)3(SEQ ID NO:42)、(GGGS)4(SEQID NO:43)、GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS(SEQ ID NO:44)、GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:46)或(GGGGS)4(SEQ ID NO:47)。
在一些实施方案中，本文所述的各种肽接头和它们的性质也适用于由在功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))与本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的突变Nef、突变SIV Nef)之间采用的连接序列编码的肽。举例来说，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，可在编码功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的核酸和编码Nef蛋白(例如野生型Nef、突变Nef)的核酸在同一载体上时添加在所述功能性外源性受体与所述Nef蛋白之间，以为功能性外源性受体与Nef蛋白两者的适当折叠提供足够空间，并且/或者以有助于裂解介于之间的连接序列(例如P2A、T2A)。举例来说，(GGGS)3接头用于本文所述的BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef构建体。
跨膜结构域
本申请的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))包含可直接或间接融合至细胞外配体结合结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜，优选是真核细胞膜中在热力学上是稳定的任何蛋白质结构。就在本文所述的CAR中使用来说是可相容的跨膜结构域可从天然存在的蛋白质获得。或者，它可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如在细胞膜中在热力学上稳定的疏水性蛋白质区段。
跨膜结构域基于跨膜结构域的三维结构加以分类。举例来说，跨膜结构域可形成α螺旋、超过一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，跨膜结构域还可或替代地基于跨膜结构域拓扑结构加以分类，所述拓扑结构包括跨膜结构域跨越膜的穿过次数以及蛋白质的定向。举例来说，单次穿过膜蛋白穿过细胞膜一次，并且多次穿过膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如2、3、4、5、6、7次或更多次)。视它们的末端和一个或多个穿膜区段相对于细胞的内部和外部的拓扑结构而定，膜蛋白可被定义为I型、II型或III型。I型膜蛋白具有单一跨膜区域，并且被定向以致蛋白质的N末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧上，并且蛋白质的C末端存在于细胞质侧上。II型膜蛋白也具有单一跨膜区域，但被定向以致蛋白质的C末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧上，并且蛋白质的N末端存在于细胞质侧上。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可基于跨膜区段的数目以及N末端和C末端的位置加以进一步再分类。
在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域源于I型单次穿过膜蛋白。在一些实施方案中，来自多次穿过膜蛋白的跨膜结构域就在本文所述的CAR中使用来说也可为可相容的。多次穿过膜蛋白可包含复合(至少2、3、4、5、6、7个或更多个)α螺旋或β片层结构。优选地，多次穿过膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧上，例如蛋白质的N末端存在于脂质双层的细胞质侧上，并且蛋白质的C末端存在于细胞外侧上。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自以下各者的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CDIIa，CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CDIIa，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。在一些实施方案中，跨膜结构域源于CD8α。在一些实施方案中，跨膜结构域源于CD28。
用于本文所述的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中的跨膜结构域还可包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的非天然存在的α螺旋或β片层。在一些实施方案中，蛋白质区段是至少约20个氨基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例在本领域中是已知的，例如在美国专利第7,052,906B1号和PCT公布第WO 2000/032776A2号中，所述专利的相关公开内容通过引用并入本文。
跨膜结构域可包含跨膜区域和位于跨膜结构域的C末端侧的细胞质区域。跨膜结构域的细胞质区域可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于使跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区域中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的细胞质区域中。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区域包含带正电荷氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区域包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区域包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的跨膜结构域包含人工疏水性序列。举例来说，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可存在于跨膜结构域的C末端处。在一些实施方案中，跨膜区域主要包含疏水性氨基酸残基，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区域是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区域包含多聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的疏/亲水性(hydropathy)或疏水性或亲水性特征可通过本领域中已知的任何方法例如凯特(Kyte)和杜利特尔(Doolittle)疏/亲水性分析来评估。
细胞内信号传导结构域
本申请的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))包含细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域负责使表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应功能活化。术语“效应功能”是指细胞的专化功能。T细胞的效应功能例如可为细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“细胞质信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应功能信号，并且引导细胞执行专化功能的部分。尽管通常可采用整个细胞质信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞质信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可替代完整链使用，只要它转导效应功能信号即可。因此，术语细胞质信号传导结构域意图包括细胞质信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域组成的细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激性方式起诱导免疫效应功能的作用的细胞质信号传导序列。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域含有被称为免疫受体酪氨酸基活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用的“ITAM”是通常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部部分中的保守蛋白质基序。所述基序可包含氨基酸序列YxxL/I的由6-8个氨基酸分隔的两个重复，其中每个x独立地是任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。在信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导是重要的，所述信号转导至少部分地通过在信号传导分子的活化之后，ITAM中酪氨酸残基的磷酸化来介导。ITAM还可充当信号传导路径中涉及的其他蛋白质的对接位点。示例性的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列包括源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12的那些。在一些实施方案中，含有ITAM的初级细胞质信号传导序列源于CD3γ、DAP12或CD3ζ。
在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由CD3ζ的细胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，初级细胞内信号传导结构域是野生型CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
共刺激性信号传导结构域
除抗原特异性信号的刺激之外，许多免疫效应细胞(例如T细胞)还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及以使细胞的效应功能活化。在一些实施方案中，CAR包含至少一个共刺激性信号传导结构域。如本文所用的术语“共刺激性信号传导结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答诸如效应功能的蛋白质的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激性信号传导结构域可为来自对信号进行转导，并且调节由免疫细胞诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞或嗜酸性粒细胞介导的应答的共刺激性蛋白质的细胞质信号传导结构域。“共刺激性信号传导结构域”可为共刺激性分子的细胞质部分。术语“共刺激性分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上特异性结合共刺激性配体，由此介导由免疫细胞达成的共刺激性应答诸如但不限于增殖和存活的同源结合配偶体。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含单一共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(诸如约2个、3个、4个或更多个中的任一者)共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同共刺激性信号传导结构域，例如CD28或CD137(4-1BB)的共刺激性信号传导结构域的两个拷贝。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个来自不同共刺激性蛋白质诸如本文所述的任何两种或更多种共刺激性蛋白质的共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激性信号传导结构域(例如4-1BB)。在一些实施方案中，一个或多个共刺激性信号传导结构域和初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)通过任选的肽接头来彼此融合。初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激性信号传导结构域可以任何适合顺序排列。在一些实施方案中，一个或多个共刺激性信号传导结构域位于跨膜结构域与初级细胞内信号传导结构域(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激性信号传导结构域可提供累加或协同刺激作用。
宿主细胞(例如免疫细胞)中共刺激性信号传导结构域的活化可诱导细胞使细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性增加或降低。任何共刺激性分子的共刺激性信号传导结构域就在本文所述的CAR中使用来说都可为可相容的。共刺激性信号传导结构域的一种或多种类型基于诸如其中将表达效应分子的免疫效应细胞的类型(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞或嗜酸性粒细胞)以及所需免疫效应功能(例如ADCC效应)的因素加以选择。用于CAR中的共刺激性信号传导结构域的实例可为共刺激性蛋白质的细胞质信号传导结构域，所述共刺激性蛋白质包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激性分子，诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、I类HLA、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、树突细胞相关C型凝集素-1(Dectin-1)/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。
在一些实施方案中，一个或多个共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，一个或多个共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含源于4-1BB(CD137)的共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和4-1BB的共刺激性信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含源于CD28的共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和CD28的共刺激性信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含CD28的共刺激性信号传导结构域和CD137的共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域、CD28的共刺激性信号传导结构域以及CD137的共刺激性信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含从N末端至C末端包含以下的多肽：CD28的共刺激性信号传导结构域、CD137的共刺激性信号传导结构域以及CD3ζ的细胞质信号传导结构域。
还在本公开的范围内的是本文所述的任何共刺激性信号传导结构域的变体，以致共刺激性信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，相较于野生型对应物，共刺激性信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变异的这类共刺激性信号传导结构域可被称为变体。相对于不包含突变的共刺激性信号传导结构域，共刺激性信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导增加以及对免疫应答的刺激增强。相对于不包含突变的共刺激性信号传导结构域，共刺激性信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导降低以及对免疫应答的刺激降低。
铰链
本申请的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))可包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。铰链结构域是通常见于蛋白质的两个结构域之间，并且可允许达成所述蛋白质的柔性以及所述结构域中的一者或两者相对于彼此的移动的氨基酸区段。可使用提供效应分子的这种柔性以及细胞外抗原结合结构域相对于跨膜结构域的移动的任何氨基酸序列。
铰链结构域可含有约10-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，铰链结构域在长度方面可为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一者。
在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。本领域中已知包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域就在本文所述的功能性外源性受体(例如嵌合TCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中使用来说都是可相容的。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分，并且对嵌合受体赋予柔性。在一些实施方案中，铰链结构域源于CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如含有CD8α的铰链结构域的至少15(例如20、25、30、35或40)个连续氨基酸的片段。
抗体诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体的铰链结构域就在本文所述的pH依赖性嵌合受体系统中使用来说也是可相容的。在一些实施方案中，铰链结构域是使抗体的恒定结构域CH1和CH2接合的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域来自抗体，并且包含所述抗体的铰链结构域以及所述抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和所述抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域以及所述抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区以及CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可作为铰链结构域用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，在Fc受体的细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，诸如(GXS)n接头，其中x和n独立地可为在3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，或更大。
信号肽
本申请的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))可在多肽的N末端处包含信号肽(也被称为信号序列)。一般来说，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需位置的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌路径，并且将允许效应分子整合和锚定至脂质双层中。就在本文所述的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))中使用来说是可相容的包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列的信号肽将为本领域技术人员所显而易知。在一些实施方案中，信号肽源于选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽源于CD8α。
ACTR是将Fc受体(CD16)与信号转导结构域(4-1BB/CD3ζ)组合的嵌合蛋白。携带ACTR的经工程改造T细胞可结合单克隆抗体，所述单克隆抗体接着充当到达肿瘤细胞的桥梁。
在一些实施方案中，功能性外源性受体是嵌合受体，所述嵌合受体包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含至少一个源于配体或受体的细胞外结构域的结构域，其中所述配体或受体是细胞表面抗原(例如NKG2D、BCMA、IL-3、IL-13)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含至少一个源于BCMA的配体例如APRIL或BAFF的结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含特异性识别BCMA的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb)。
T细胞抗原偶联物(TAC)
在一些实施方案中，本申请的功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)。在一些实施方案中，TAC包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的第一接头；c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)；d)任选的第二接头；e)包含第一TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及f)包含第二TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一和第二TCR共受体均选自CD4、CD28和CD8(例如CD8α)。在一些实施方案中，第一和第二TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一和第二TCR共受体是不同的，例如第一TCR共受体是CD4，并且第二TCR共受体是CD8(例如CD8)，或第二TCR共受体是CD4，并且第一TCR共受体是CD8(例如CD8α)。在一些实施方案中，TAC包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的第一接头；c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；d)任选的第二接头；以及e)包含TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的跨膜结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于第一TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体全都选自CD4、CD28和CD8(例如CD8α)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的(例如全都是CD4)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，TAC的细胞内信号传导结构域包含TCR共受体诸如CD4、CD28或CD8(例如CD8α)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC的跨膜结构域包含TCR共受体诸如CD4、CD28或CD8(例如CD8α)的跨膜结构域。在一些实施方案中，TAC不包含所述TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8(例如CD8α))的细胞外结构域(或其一部分)。在一些实施方案中，TAC不包含任何TCR共受体的细胞外结构域或其一部分。在一些实施方案中，TAC还包含位于细胞外TCR结合结构域(例如scFv或sdAb)的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域(例如当不存在TCR共受体的细胞外结构域，并且细胞外TCR结合结构域在细胞外配体结合结构域的C末端时)。在一些实施方案中，TAC还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域(例如当不存在TCR共受体的细胞外结构域，并且细胞外TCR结合结构域在细胞外配体结合结构域的N末端时)。以上“铰链”和“肽接头”子章节中所述的任何铰链结构域和接头都可在本文中用于TAC中。在一些实施方案中，TAC不包含细胞内共刺激性结构域。在一些实施方案中，细胞外靶标结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端。在一些实施方案中，TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，TAC还包含特异性识别由细胞外TCR结合结构域(例如CD3ε)识别的TCR亚基(例如TCRα)的不同细胞外结构域的第二细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)，其中所述第二细胞外TCR结合结构域位于细胞外TCR结合结构域与细胞外配体结合结构域之间。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含是特异性结合BCMA的sdAb(即抗BCMA sdAb)诸如PCT/CN2016/094408和PCT/CN2017/096938中公开的任何抗BCMA sdAb的抗原结合片段，所述专利的内容通过引用以它们的整体并入本文。
因此，在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD4的细胞外结构域(完全或部分结构域)；(f)源于CD4的跨膜域；以及(g)任选的源于CD4的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD8(例如CD8α)的细胞外结构域(完全或部分结构域)；(f)源于CD8(例如CD8α)的跨膜域；以及(g)任选的源于CD8(例如CD8α)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD28的细胞外结构域(完全或部分结构域)；(f)源于CD28的跨膜域；以及(g)任选的源于CD28的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD4(排除信号肽)。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD8(例如CD8α；排除信号肽)。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD28(排除信号肽)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，TAC还包含特异性识别由细胞外TCR结合结构域(例如CD3ε)识别的TCR亚基(例如TCRα)的不同细胞外结构域的第二细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)，其中所述第二细胞外TCR结合结构域位于细胞外TCR结合结构域与细胞外配体结合结构域之间。
在一些实施方案中，TAC包含结构(从N末端至C末端)：抗CD20 scFv-(GGGGS)3-抗CD3 scFv-(GGGGS)-CD4序列。在一些实施方案中，抗CD20 scFv源于Leu-16抗体。在一些实施方案中，抗CD3 scFv源于UCHT1(例如huUCHT1)、F6A、L2K或OKT3。在一些实施方案中，CD4序列包含CD4的部分细胞外结构域、完全跨膜结构域和完全细胞内结构域，诸如全长CD4的aa 375-458(aa 1从CD4的信号肽开始进行计数)。在一些实施方案中，TAC包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体
在一些实施方案中，本申请的功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的第一接头；c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)；d)任选的第二接头；e)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内结构域的细胞内结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施方案中，第二和第三TCR亚基是相同的，例如均是CD3ε。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的，例如全都是CD3ε。在一些实施方案中，第一TCR亚基与第二和第三TCR亚基是不同的，例如第一TCR亚基是TCRα，而第二和第三TCR亚基是CD3ε。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基全都是不同的。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的第一接头；c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)；d)任选的第二接头；以及e)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；其中所述第一和第二TCR亚基均选自由CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施方案中，第一和第二TCR亚基是相同的，例如均是CD3ε。在一些实施方案中，第一和第二TCR亚基是不同的，例如第一TCR亚基是TCRα，而第二TCR亚基是CD3ε。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一TCR亚基与第二、第三和第四TCR亚基是不同的，例如第一TCR亚基是TCRα，而第二、第三和第四TCR亚基是CD3ε。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基全都是不同的。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含TCR亚基的细胞内信号传导结构域，其中所述TCR亚基选自由CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体的跨膜结构域包含TCR亚基的跨膜结构域，其中所述TCR亚基选自由CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含所述TCR亚基的细胞外结构域或其一部分。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含任何TCR亚基的细胞外结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于细胞外TCR结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域(例如当不存在TCR亚基的细胞外结构域或其一部分，并且细胞外TCR结合结构域在细胞外配体结合结构域的C末端时)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域(例如当不存在TCR亚基的细胞外结构域或其一部分，并且细胞外TCR结合结构域在细胞外配体结合结构域的N末端时)。以上“铰链”和“肽接头”子章节中所述的任何铰链结构域和接头都可在本文中用于TAC样嵌合受体中。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含细胞内共刺激性结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含特异性识别由细胞外TCR结合结构域(例如CD3ε)识别的TCR亚基(例如TCRα)的不同细胞外结构域的第二细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)，其中所述第二细胞外TCR结合结构域位于细胞外TCR结合结构域与细胞外配体结合结构域之间。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含是特异性结合BCMA的sdAb(即抗BCMA sdAb)诸如PCT/CN2016/094408和PCT/CN2017/096938中公开的任何抗BCMA sdAb的抗原结合片段，所述专利的内容通过引用以它们的整体并入本文。
因此，在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD3ε的细胞外结构域；(f)源于CD3ε的跨膜域；以及(g)任选的源于CD3ε的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD3γ的细胞外结构域；(f)源于CD3γ的跨膜域；以及(g)任选的源于CD3γ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于CD3δ的细胞外结构域；(f)源于CD3δ的跨膜域；以及(g)任选的源于CD3δ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于TCRα的细胞外结构域；(f)源于TCRα的跨膜域；以及(g)任选的源于TCRα的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于TCRβ的细胞外结构域；(f)源于TCRβ的跨膜域；以及(g)任选的源于TCRβ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于TCRγ的细胞外结构域；(f)源于TCRγ的跨膜域；以及(g)任选的源于TCRγ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于TCRδ的细胞外结构域；(f)源于TCRδ的跨膜域；以及(g)任选的源于TCRδ的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3γ。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3δ。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长TCRα。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长TCRβ。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长TCRγ。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ中的任一者)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长TCRδ。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的铰链；(f)源于第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜域；以及(g)源于第二TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域；其中所述第一和第二TCR亚基均选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含特异性识别由细胞外TCR结合结构域(例如CD3ε)识别的TCR亚基(例如TCRα)的不同细胞外结构域的第二细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)，其中所述第二细胞外TCR结合结构域位于细胞外TCR结合结构域与细胞外配体结合结构域之间。
在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的第一接头；c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；d)任选的第二接头；e)包含第一TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及f)包含第二TCR亚基的细胞内结构域的细胞内结构域，其中所述第一TCR亚基和所述第二TCR亚基均选自由CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施方案中，第一TCR亚基是CD3ε，并且/或者第二TCR亚基是CD3ε。在一些实施方案中，第一TCR亚基是CD3γ，并且/或者第二TCR亚基是CD3γ。在一些实施方案中，第一TCR亚基是CD3δ，并且/或者第二TCR亚基是CD3δ。在一些实施方案中，第一TCR亚基是TCRα，并且/或者第二TCR亚基是TCRα。在一些实施方案中，第一TCR亚基是TCRβ，并且/或者第二TCR亚基是TCRβ。在一些实施方案中，第一TCR亚基是TCRγ，并且/或者第二TCR亚基是TCRγ。在一些实施方案中，第一TCR亚基是TCRδ，并且/或者第二TCR亚基是TCRδ。在一些实施方案中，第一TCR亚基和第二TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一TCR亚基和第二TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含第一和/或第二TCR亚基的细胞外结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体不包含任何TCR亚基的细胞外结构域。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体多肽不包含细胞内共刺激性结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的N末端。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域在细胞外TCR结合结构域的C末端。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体还包含特异性识别由细胞外TCR结合结构域(例如CD3ε)识别的TCR亚基(例如TCRα)的不同细胞外结构域的第二细胞外TCR结合结构域(例如scFv、sdAb)，其中所述第二细胞外TCR结合结构域位于细胞外TCR结合结构域与细胞外配体结合结构域之间。
经工程改造TCR
在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白诸如突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达经工程改造TCR(例如特异性识别BCMA或BCMA/MHC复合物的经工程改造TCR)，所述经工程改造TCR包含细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含源于野生型TCR的共同特异性识别抗原(诸如本文所述的任何抗原，例如肿瘤抗原、BCMA)的Vα和Vβ，其中相对于所述野生型TCR，所述Vα、所述Vβ或两者在一个或多个CDR中包含一个或多个突变(在下文中也被称为“传统经工程改造TCR”)。在一些实施方案中，突变导致氨基酸取代，诸如保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造TCR结合由野生型TCR结合的相同同源肽-MHC。在一些实施方案中，相较于由野生型TCR达成的结合，经工程改造TCR以更高亲和力结合相同同源肽-MHC。在一些实施方案中，相较于由野生型TCR达成的结合，经工程改造TCR以更低亲和力结合相同同源肽-MHC。在一些实施方案中，经工程改造TCR结合不由野生型TCR结合的非同源肽-MHC。在一些实施方案中，经工程改造TCR是单链TCR(scTCR)。在一些实施方案中，经工程改造TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，野生型TCR结合HLA-A2。在一些实施方案中，经工程改造TCR还包含细胞内信号传导结构域，诸如源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达经工程改造TCR，所述经工程改造TCR包含细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含源于野生型TCR的共同特异性识别BCMA或BCMA-MHC复合物的Vα和Vβ，其中相对于所述野生型TCR，所述Vα、所述Vβ或两者在一个或多个CDR中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，相比于野生型抗BCMATCR，经工程改造抗BCMA TCR对BCMA具有更高结合亲和力。在一些实施方案中，经工程改造TCR还包含细胞内信号传导结构域，诸如源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的经工程改造TCR是嵌合TCR(cTCR)。在一些实施方案中，cTCR包含细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(诸如基于抗体的抗原结合结构域，例如scFv或sdAb)，(直接或间接)融合至TCR亚基的全长或一部分，其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ组成的组。融合多肽可连同其他内源性TCR亚基一起并入至功能性TCR复合物中，并且对所述TCR复合物赋予抗原特异性。在一些实施方案中，cTCR细胞外配体结合结构域融合至CD3ε亚基的全长或一部分。cTCR的细胞内信号传导结构域可源于TCR亚基的细胞内信号传导结构域，诸如CD3ε的细胞内信号传导结构域。cTCR的跨膜结构域可源于TCR亚基。在一些实施方案中，cTCR细胞内信号传导结构域和cTCR跨膜结构域源于同一TCR亚基，例如均来自CD3ε。在一些实施方案中，cTCR细胞外配体结合结构域和TCR亚基(完全或其一部分)可通过接头(诸如GS接头)来融合。在一些实施方案中，cTCR还包含TCR亚基的细胞外结构域或其一部分，所述TCR亚基可与cTCR细胞内信号传导结构域和/或cTCR跨膜结构域所源于的TCR亚基相同或不同。因此，在一些实施方案中，cTCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，cTCR还包含位于细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域(例如当不存在TCR亚基的细胞外结构域或其一部分时)。以上“铰链”和“肽接头”子章节中所述的任何铰链结构域和接头都可在此处用于cTCR中。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单价的和单特异性的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是单体的，即包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的表位的单一抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和单特异性的，即包含两个或更多个特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的相同表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域是多价的和多特异性的，即包含两个或更多个特异性识别相同肿瘤抗原或不同肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的两个或更多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含是特异性结合BCMA的sdAb(即抗BCMA sdAb)诸如PCT/CN2016/094408和PCT/CN2017/096938中公开的任何抗BCMA sdAb的抗原结合片段，所述专利的内容通过引用以它们的整体并入本文。
因此，举例来说，在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达抗CD20嵌合TCR，所述抗CD20嵌合TCR包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别CD20的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的接头(诸如GS接头，例如(GGGGS)3)；c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分(例如CD3ε)；d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域，以及e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，抗CD20 cTCR包含：a)抗CD20 scFv；b)接头(诸如GS接头，例如(GGGGS)3)；以及c)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef，诸如非天然存在的Nef蛋白、突变SIV Nef)的经修饰T细胞还表达抗BCMA嵌合TCR，所述抗BCMA嵌合TCR包含：a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别BCMA的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；b)任选的接头(诸如GS接头，例如(GGGGS)3)；c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分(例如CD3ε)；d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域，以及e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，抗BCMAcTCR包含：a)抗BCMA sdAb；b)接头(诸如GS接头，例如(GGGGS)3)；以及c)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR跨膜结构域、cTCR细胞内信号传导结构域以及TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分源于同一TCR亚基。在一些实施方案中，cTCR跨膜结构域、cTCR细胞内信号传导结构域以及TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分源于CD3ε。在一些实施方案中，cTCR包含融合至全长CD3ε(排除信号肽)的N末端的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，抗CD20 cTCR具有抗CD20 scFv-(GGGGS)3-CD3ε的结构，诸如SEQ IDNO:64。在一些实施方案中，抗BCMA cTCR具有抗BCMA sdAb-(GGGGS)3-CD3ε的结构。
VI.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含任一表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，以及药学上可接受的载体。药物组合物可通过使具有所需纯度的嵌合抗体免疫效应细胞衔接物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合，以冻干制剂或水溶液形式制备。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下应对接受者无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等张调节剂、稳定剂、金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂用于将pH控制在使治疗有效性最优化的范围内，尤其是如果稳定性依赖于pH。缓冲剂优选在约50mM至约250mM的范围内的浓度下存在。适于与本发明一起使用的缓冲剂包括有机酸与无机酸两者以及它们的盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包括组氨酸和三甲胺盐诸如Tris。
防腐剂被添加来延缓微生物生长，并且通常在0.2％-1.0％(w/v)的范围内存在。适于与本发明一起使用的防腐剂包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张力剂，有时称为“稳定剂”，以调整或维持组合物中的液体张力。当与大型带电荷生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常被称为“稳定剂”，因为它们可与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此使分子间和分子内相互作用的潜力减小。在考虑其他成分的相对量的情况下，以重量计，张力剂可以在0.1％至25％，优选是1％至5％之间的任何量存在。优选张力剂包括多羟基糖醇，优选是三羟基或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
额外赋形剂包括可充当以下中的一者或多者的剂：(1)增积剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂以及(4)防止变性或粘附于容器壁的剂。这类赋形剂包括：多羟基糖醇(以上列举)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌糖醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如糊精或右旋糖酐。
存在非离子表面活性剂或清洁剂(也被称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质对抗搅拌诱导的聚集，此还容许制剂暴露于剪切表面应力而不导致活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂在约0.05mg/mL至约1.0mg/mL，优选是约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围内存在。
适合非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
多聚醇、
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
等)、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子清洁剂包括月桂基硫酸钠、丁二酸二辛酯磺酸钠和磺酸钠二辛酯。阳离子清洁剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为使药物组合物用于体内施用，它们必须是无菌的。可通过经无菌过滤膜过滤来致使药物组合物无菌。通常将本文药物组合物放置至具有无菌接入口的容器中，所述容器例如是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
施用途径根据已知和接受的方法，诸如通过以适合方式进行单次或多次团注或历经长久时期输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病变内或关节内途径来注射或输注；经表面施用、吸入或采用持续释放或延长释放手段。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半渗透性基质，所述基质呈成形物品例如薄膜或微胶囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)组成的可注射微球体)以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。
本文所述的药物组合物还可含有超过一种如为所治疗的特定适应症所必需的活性化合物或活性剂，优选是不不利地影响彼此的具有补充活性的那些。或者或此外，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这类分子适合地以有效达成预定目的的量存在于组合中。
活性成分还可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中，或巨乳液中。这类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
VII.治疗方法
本申请还提供了治疗个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所述的任一药物组合物或表达Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)或经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR、TAC样嵌合受体))的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)。
本文所述的方法适于治疗各种癌症，包括实体癌与液体癌两者。方法可适用于所有分期的癌症，包括早期、晚期和转移性癌症。本文所述的方法可在辅助环境或新辅助环境下用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域中已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，所述其他类型的癌症疗法诸如是化学疗法、手术、放射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消除等。
在一些实施方案中，本文所述的方法适于治疗选自由以下组成的组的实体癌：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金氏淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移性病变。
在一些实施方案中，本文所述的方法适于治疗选自以下中的一者或多者的血液癌症：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、慢性骨髓源性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞赘瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性疾患、MALT淋巴瘤、套膜细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合征、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞赘瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)或前白血病。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是基于迪里-萨蒙(Durie-Salmon)分期系统的I期、II期或III期和/或A期或B期多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是基于由国际骨髓瘤工作组(IMWG)发布的国际分期系统的I期、II期或III期多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是意义未确定的单克隆γ球蛋白病(MGUS)。在一些实施方案中，癌症是无症状(郁积性/无痛性)骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是有症状或活动性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，个体不对先前多发性骨髓瘤治疗起响应。在一些实施方案中，个体在先前多发性骨髓瘤治疗之后患有进行性疾病。在一些实施方案中，个体先前已接受至少约以下任一种数的多发性骨髓瘤治疗：2、3、4种或更多种。在一些实施方案中，癌症是复发多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，个体患有活动性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，个体具有至少10％的克隆骨髓浆细胞。在一些实施方案中，个体患有活检证明的骨性或髓外浆细胞瘤。在一些实施方案中，个体具有可归因于潜伏性浆细胞增生性病症的终末器官损害的迹象。在一些实施方案中，个体患有高钙血症，例如血清钙比正常值上限高>0.25mmol/L(>1mg/dL)，或是>2.75mmol/L(>11mg/dL)。在一些实施方案中，个体患有肾功能不全，例如肌酸酐清除率<40mL/分钟，或血清肌酸酐>177mol/L(>2mg/dL)。在一些实施方案中，个体患有贫血，例如血红蛋白值低于正常值下限>20g/L，或血红蛋白值<100g/L。在一些实施方案中，个体患有一种或多种骨病变，例如根据骨骼放射线摄影术、CT或PET/CT的一种或多种溶骨性病变。在一些实施方案中，个体具有以下恶性肿瘤生物标志(MDE)中的一者或多者：(1)根据骨髓检查，60％或更多的克隆浆细胞；(2)血清受累/未受累游离轻链比率是100或更大，前提是受累轻链的绝对水平是至少100mg/L；以及(3)根据MRI，超过一个局灶性病变在尺寸方面是至少5mm或更大。
在一些实施方案中，本文所述的方法适于治疗自体免疫疾病。自体免疫疾病或自体免疫性是生物体未能将它自己的组成部分(下至亚分子水平)识别为“自身”，此导致针对它自己的细胞和组织的免疫应答。由这种异常免疫应答所致的任何疾病都被称为自体免疫疾病。主要实例包括乳糜泻、1型糖尿病(IDDM)、全身性红斑狼疮(SLE)、休格连氏综合征(
syndrome)、多发性硬化症(MS)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷福斯病(Graves'disease)、特发性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎(RA)。
在一些实施方案中，本文所述的方法适于治疗炎症性疾病，包括也是一类与B细胞病症相关的疾病的自体免疫疾病。自体免疫疾病的实例包括但不限于急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肤肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham'schorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺克-舍恩来因紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、阿狄森氏病(Addison's disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、类肉瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病变、多发性结节性动脉炎、僵直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、血栓闭塞性脉管炎。休格连氏综合征、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。最常用治疗是可极具毒性的皮质类固醇和细胞毒性药物。这些药物还抑制整个免疫系统，可导致严重感染，并且对骨髓、肝和肾具有不利影响。迄今为止已用于治疗III类自体免疫疾病的其他治疗剂已针对T细胞和巨噬细胞。存在对治疗自体免疫疾病，特别是III类自体免疫疾病的更有效方法的需要。
药物组合物的施用可以任何适宜方式进行，包括通过注射、摄取、输液、植入或移植。组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内或腹膜内方式施用至患者。在一些实施方案中，药物组合物以全身性方式施用。在一些实施方案中，药物组合物通过输注诸如静脉内输注来施用至个体。用于免疫疗法的输注技术在本领域中是已知的(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。在一些实施方案中，药物组合物通过真皮内或皮下注射来施用至个体。在一些实施方案中，组合物通过静脉内注射来施用。在一些实施方案中，将组合物直接注射至肿瘤或淋巴结中。在一些实施方案中，将药物组合物局部施用至肿瘤部位，诸如直接施用至肿瘤细胞中，或施用至具有肿瘤细胞的组织。
本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可视设想的特定用途而变化。确定适当剂量或施用途径完全属于普通技术人员的技能。动物实验为确定用于人疗法的有效剂量提供可靠指导。物种间缩放有效剂量可遵循由Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use ofInterspecies Scaling in Toxicokinetics,”Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等人编,Pergamon Press,New York 1989,第42-46页制定的原则来进行。在本申请的范围内的是不同制剂将有效用于不同治疗和不同病症，并且意图治疗特定器官或组织的施用可能使得必须以与针对另一器官或组织的方式不同的方式进行递送。
在其中药物组合物包含任一表达本文所述的Nef(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的经修饰T细胞的一些实施方案中，药物组合物在至少约104、105、106、107、108或109个细胞/每kg个体体重中的任一者的剂量下施用。在一些实施方案中，药物组合物在约104至约105、约105至约106、约106至约107、约107至约108、约108至约109、约104至约109、约104至约106、约106至约108或约105至约107个细胞/每kg个体体重中的任一者的剂量下施用。在一些实施方案中，药物组合物在至少约任何1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107个细胞/kg或更大的剂量下施用。在一些实施方案中，药物组合物在约3×105至约7×106个细胞/kg或约3×106个细胞/kg的剂量下施用。
在一些实施方案中，单次施用药物组合物。在一些实施方案中，多次(诸如2、3、4、5、6次或更多次中的任一者)施用药物组合物。在一些实施方案中，每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次施用药物组合物。在一些实施方案中，施用之间的间隔是约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至1年中的任一者。通过监测特定患者的疾病征象以及相应地调整治疗，医学领域技术人员可易于确定用于所述患者的最优剂量和治疗方案。
此外，剂量可通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。在一些实施方案中，药物组合物以分次剂量施用，诸如约2、3、4、5剂或更多剂中的任一者。在一些实施方案中，历经约1周施用分次剂量。在一些实施方案中，剂量是相等拆分的。在一些实施方案中，分次剂量是总剂量的约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施方案中，连续分次剂量之间的间隔是约1天、2天、3天或更久。对于历经数天或更久的重复施用，视情况而定，持续治疗直至发生对疾病症状的所需抑制。然而，其他剂量方案可为有用的。通过常规技术和测定，易于监测这个疗法的进展。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和CAR，所述CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR是单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的。在一些实施方案中，CAR是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，cTCR是单特异性的。在一些实施方案中，cTCR是多价的。在一些实施方案中，cTCR是多特异性的。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将cTCR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性cTCR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，TAC是单特异性的。在一些实施方案中，TAC是多价的。在一些实施方案中，TAC是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病(例如癌症、感染性疾病、GvHD、移植排斥、自体免疫病症或辐射病)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：(1)经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)，所述经修饰T细胞包含Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；以及(2)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，TAC是单特异性的。在一些实施方案中，TAC是多价的。在一些实施方案中，TAC是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC样嵌合受体下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC样嵌合受体被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将经修饰T细胞中的内源性TCR、MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ下调，诸如将内源性TCR、MHC、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ的细胞表面表达下调至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD3ζ、CD4、CD28和/或外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将表达下调)，或将CD3ζ、CD4、CD28和/或外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和它们的同源物组成的组。在一些实施方案中，Nef蛋白是野生型Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是突变Nef。在一些实施方案中，突变Nef在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中包含一个或多个突变。在一些实施方案中，突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在表11中所列的任何氨基酸残基处包含一个或多个突变(例如使至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸残基突变，诸如突变成Ala)的突变SIV Nef。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIVNef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤，诸如复发或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，治疗作用包括导致个体中的客观临床响应。在一些实施方案中，在个体中获得严格临床响应(sCR)。在一些实施方案中，治疗作用包括导致个体中的疾病缓解(部分或完全)。在一些中，在个体接受药物组合物之后，在不超过约6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月或更短时间中的任一者之后获得临床缓解。在一些实施方案中，治疗作用包括预防个体中癌症的复发或疾病进展。在一些实施方案中，持续至少约6个月、1年、2年、3年、4年、5年或更久预防复发或疾病进展。在一些实施方案中，治疗作用包括使个体的存活期(诸如无疾病存活期)延长。在一些实施方案中，治疗作用包括改善个体的生活品质。在一些实施方案中，治疗作用包括抑制实体或淋巴肿瘤的生长，或使实体或淋巴肿瘤的尺寸降低。
在一些实施方案中，实体或淋巴肿瘤的尺寸被降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，提供了一种抑制个体中实体或淋巴肿瘤的生长或使所述实体或淋巴肿瘤的尺寸降低的方法。在一些实施方案中，治疗作用包括抑制个体中的肿瘤转移。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)转移被抑制。在一些实施方案中，提供了一种抑制向淋巴结的转移的方法。在一些实施方案中，提供了一种抑制向肺的转移的方法。在一些实施方案中，提供了一种抑制向肝的转移的方法。转移可通过本领域中的任何已知方法诸如通过血液测试、骨扫描、x射线扫描、CT扫描、PET扫描和活检来评估。
本发明还涉及使用表达本文所述的Nef(或Nef+功能性外源性受体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)、其经分离群体或包含它们的药物组合物来减轻或改善或预防或治疗疾病和病症的方法。在一些实施方案中，表达本文所述的Nef(或Nef+功能性外源性受体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)、其经分离群体或包含它们的药物组合物用于减轻或改善或预防或治疗癌症、感染、一种或多种自体免疫病症、辐射病，或预防或治疗经受移植手术的受试者中的移植物抗宿主疾病(GvHD)或移植排斥。
表达Nef(或Nef+功能性外源性受体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)、其经分离群体或包含它们的药物组合物可用于改变自体免疫或移植排斥，因为这些T细胞可在发育期间在TGF-β的情况下生长，并且将分化以成为经诱导T调控性细胞。在一个实施方案中，功能性外源性受体(例如像经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))用于对这些经诱导T调控性细胞给与为它们在具有疾病的组织部位处执行它们的抑制性功能所需的功能特异性。因此，使许多抗原特异性调控性T细胞生长以在患者中使用。为T调控性细胞分化所必需的FoxP3的表达可通过流式细胞计量术来分析，并且由这些T调控性细胞对T细胞增殖的功能性抑制可通过考查在共培养后在CD3抗体刺激之后，T细胞增殖的降低来分析。
本发明的另一实施方案涉及表达Nef(或Nef+功能性外源性受体)的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞)、其经分离群体或包含它们的药物组合物用于预防或治疗辐射病的用途。在放射治疗或暴露(例如脏弹暴露、辐射漏泄)或使骨髓细胞消除的其他状况(某些药物疗法)之后的一个挑战在于重构造血系统。在经受骨髓移植的患者中，在移植后第15天的绝对淋巴细胞计数与成功结果相关联。具有高淋巴细胞计数的那些患者良好地进行重构，因此重要的是具有良好淋巴细胞重构。这个效应的原因是不明确的，但它可归因于淋巴细胞会进行保护以免遭感染，以及/或者产生有利于造血重构的生长因子。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种使个体中供者T细胞的持久性和/或移入增加的方法，所述方法包括1)提供同种异体T细胞；以及2)向所述同种异体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，同种异体T细胞是同种异体CAR-T细胞、经工程改造TCR-T细胞(例如cTCR-T细胞)、TAC-T细胞。TAC样-T细胞。在一些实施方案中，方法还包括向同种异体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，第二核酸编码CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗CD19 scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗CD20 scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含直接或间接(例如通过接头)融合在一起的一个抗CD20 scFv和一个抗CD19 scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二核酸编码传统经工程改造TCR。在一些实施方案中，第二核酸编码ACTR。在一些实施方案中，第二核酸编码cTCR。在一些实施方案中，cTCR包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，cTCR包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，第二核酸编码TAC。在一些实施方案中，TAC包含(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)任选的源于第一TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞外结构域；(f)包含第二TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的跨膜域的跨膜域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(诸如CD4、CD28或CD8，例如CD8α)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，第二核酸编码TAC样嵌合受体。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如scFv、sdAb)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、cTCR)、TAC、TAC样嵌合受体)是单价的和单特异性的。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、cTCR)、TAC、TAC样嵌合受体)是多价的和单特异性的。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、cTCR)、TAC、TAC样嵌合受体)是多特异性的(和多价的)。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种使个体中供者T细胞的持久性和/或移入增加的方法，所述方法包括1)提供同种异体T细胞；以及2)向所述同种异体T细胞中引入载体(例如病毒载体、慢病毒载体)，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码例如本文所述的功能性外源性受体(诸如CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR、ACTR)、经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、cTCR)、TAC、TAC样嵌合受体)的第二核酸；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至不同启动子。在一些实施方案中，启动子选自由以下组成的组：劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV IE)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、泛素-C(UBQ-C)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹病毒胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子，负性控制区域经缺失，经d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子、NFAT启动子、
启动子和NFκB启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1-α或PGK启动子。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的上游。在一些实施方案中，第一核酸在第二核酸的下游。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接序列来连接。在一些实施方案中，连接序列是以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。在一些实施方案中，连接序列是IRES或编码P2A的核酸。在一些实施方案中，载体是病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物组成的组。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，诸如游离型表达载体、增强的游离型载体(EEV)、PiggyBac转座酶载体或睡美人(SB)转座子系统。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种治疗接受同种异体T细胞移植的个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、自体免疫病症或辐射病)，而不诱导GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，同种异体T细胞是同种异体CAR-T细胞、TCR-T细胞(例如cTCR-T细胞)、TAC-T细胞或TAC样-T细胞。在一些实施方案中，方法还包括向同种异体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))。在一些实施方案中，第二核酸编码CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二核酸编码cTCR，所述cTCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二核酸编码T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，第二核酸编码T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，第二核酸编码TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，第二核酸编码TAC样嵌合受体，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))是单特异性的。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))是多价的。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))是多特异性的。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在单独的载体上。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸在同一载体上。因此，在一些实施方案中，本发明还提供了一种治疗接受同种异体T细胞移植的个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、自体免疫病症或辐射病)，而不诱导GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体T细胞中引入载体，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码CAR的第二核酸，所述CAR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种治疗接受同种异体T细胞移植的个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、自体免疫病症或辐射病)，而不诱导GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体T细胞中引入载体，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码嵌合TCR(cTCR)的第二核酸，所述嵌合TCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种治疗接受同种异体T细胞移植的个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、自体免疫病症或辐射病)，而不诱导GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体T细胞中引入载体，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码T细胞抗原偶联物(TAC)的第二核酸，所述T细胞抗原偶联物包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，提供了一种治疗接受同种异体T细胞移植的个体中的疾病(诸如癌症、感染性疾病、自体免疫病症或辐射病)，而不诱导GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体T细胞中引入载体，所述载体包含编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的第一核酸，以及编码TAC样嵌合受体的第二核酸，所述TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种减轻同种异体CAR-T细胞的GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体CAR-T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体CAR-T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)特异性识别抗原(例如BCMA、CD20、CD19)的结合部分(例如sdAb、scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含含有以下的多肽：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个中的任一者)抗BCMA sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR是单特异性的。在一些实施方案中，CAR是多价的。在一些实施方案中，CAR是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将CAR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性CAR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种减轻同种异体cTCR-T细胞的GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体cTCR-T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体cTCR-T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，cTCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如全都是CD3ε)。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，cTCR包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的接头；以及(c)全长CD3ε(排除信号肽)。在一些实施方案中，cTCR是单特异性的。在一些实施方案中，cTCR是多价的。在一些实施方案中，cTCR是多特异性的。在一些实施方案中，cTCR是包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的抗CD20 cTCR。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将cTCR下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性cTCR被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种减轻同种异体TAC-T细胞的GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体TAC-T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体TAC-T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如CD4)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第三TCR共受体(例如CD4)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施方案中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施方案中，TAC包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如CD3ε)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)CD4的细胞外结构域或其一部分；(f)CD4的跨膜结构域；以及(g)CD4的细胞内信号传导结构域；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC是包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的抗CD20 TAC。在一些实施方案中，TAC是单特异性的。在一些实施方案中，TAC是多价的。在一些实施方案中，TAC是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIV Nef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIVNef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIVNef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种减轻同种异体TAC样-T细胞的GvHD或移植排斥的方法，所述方法包括向所述同种异体TAC样-T细胞中引入编码Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)的核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述同种异体TAC样-T细胞的内源性TCR的下调。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如CD3ε)的任选的细胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)任选的包含第四TCR亚基(例如CD3ε)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施方案中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体包含：(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如BCMA、CD19、CD20)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如TCRα)的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；以及(e)全长CD3ε(排除信号肽)；其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体是单特异性的。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体是多价的。在一些实施方案中，TAC样嵌合受体是多特异性的。在一些实施方案中，Nef蛋白包含SEQ ID NO:12-22中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Nef蛋白是在处于以下任一者的氨基酸残基处包含一个或多个突变的突变SIVNef：(i)aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223；(ii)aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190；(iii)aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190；或(iv)aa 2-4、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190；其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR、CD4和CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR的细胞表面表达下调，但不将CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD4的细胞表面表达下调，但不将CD28的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如突变Nef诸如突变SIV Nef)将TCR和CD28的细胞表面表达下调，但不将CD4的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)将内源性TCR的细胞表面表达下调，但不将TAC样嵌合受体下调(例如不将细胞表面表达下调)。在一些实施方案中，功能性TAC样嵌合受体被Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)下调(例如细胞表面表达被下调)至多约50％、40％、30％、20％、10％或5％中的任一者。
VIII.药盒和制品
还提供了包括任一表达本文所述的Nef蛋白(例如野生型Nef或突变Nef诸如突变SIV Nef)和/或功能性外源性受体(诸如经工程改造TCR(例如传统经工程改造TCR、嵌合TCR(cTCR))、TAC、TAC样嵌合受体或CAR(例如基于抗体的CAR、基于配体/受体的CAR或ACTR))的经修饰T细胞(例如同种异体T细胞、内源性TCR缺陷性T细胞、GvHD最小化T细胞)的药盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供了一种药盒，所述药盒含有本文所述的任一药物组合物，并且优选提供关于它的使用的说明书。
本申请的药盒处于适合包装中。适合包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。药盒可任选地提供额外组分诸如缓冲剂和解释信息。因此，本申请还提供了制品，所述制品包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、柔性包装等。
制品可包括容器和在所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。通常，容器容纳有效治疗如本文所述的疾病或病症(诸如癌症、自体免疫疾病或感染性疾病)，或当治疗疾病或病症时减轻/预防GvHD或移植排斥的组合物，并且可具有无菌接入口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体中的特定疾患。标签或包装插页将还包含关于将组合物施用至个体的说明书。标签可指示关于复原和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可为多次使用小瓶，所述小瓶允许重复施用(例如2-6次施用)复原制剂。包装插页是指惯常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及使用这类治疗性产品的警告的信息。另外，制品可还包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。它可还包括从商业和使用者观点来看可合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
药盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，以足以在药房例如医院药房和混配药房中储存和使用的数量加以包装。
示例性实施方案
实施方案1.一种产生经修饰T细胞的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性T细胞受体(TCR)的下调。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调。
实施方案3.如实施方案2所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约50％。
实施方案4.如实施方案2或3所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约60％。
实施方案5.如实施方案2-4中的任一者所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约70％。
实施方案6.如实施方案2-5中的任一者所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约80％。
实施方案7.如实施方案2-6中的任一者所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约90％。
实施方案8.如实施方案2-7中的任一者所述的方法，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约95％。
实施方案9.如实施方案1-8中的任一者所述的方法，其中所述经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。
实施方案10.如实施方案1-8中的任一者所述的方法，其中所述经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座。
实施方案11.如实施方案10所述的方法，其中所述经修饰T细胞包含经修饰内源性TCRα基因座。
实施方案12.如实施方案10或11所述的方法，其中所述内源性TCR基因座通过CRISPR-Cas(成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas))系统加以修饰。
实施方案13.如实施方案12所述的方法，其中所述CRISPR-Cas系统包含含有SEQID NO:23的核酸序列的引导RNA(gRNA)。
实施方案14.如实施方案1-13中的任一者所述的方法，其中所述Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef和HIV2 Nef组成的组。
实施方案15.如实施方案1-14中的任一者所述的方法，其中所述Nef蛋白是野生型Nef。
实施方案16.如实施方案15所述的方法，其中所述野生型Nef包含SEQ ID NO:12-17中的任一者的氨基酸序列。
实施方案17.如实施方案1-14中的任一者所述的方法，其中所述Nef蛋白是突变Nef。
实施方案18.如实施方案17所述的方法，其中所述突变Nef包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。
实施方案19.如实施方案17或18所述的方法，其中所述突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。
实施方案20.如实施方案17-19中的任一者所述的方法，其中所述突变Nef包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa203-208或aa 212-223，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
实施方案21.如实施方案1-20中的任一者所述的方法，其中所述前体T细胞包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
实施方案22.如实施方案1-20中的任一者所述的方法，所述方法还包括向所述前体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
实施方案23.如实施方案22所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸被依序引入至所述T细胞中。
实施方案24.如实施方案22所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸被同时引入至所述T细胞中。
实施方案25.如实施方案24所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸在单独的载体上。
实施方案26.如实施方案24所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体上。
实施方案27.如实施方案26所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子。
实施方案28.如实施方案27所述的方法，其中所述第一核酸在所述第二核酸的上游。
实施方案29.如实施方案27所述的方法，其中所述第一核酸在所述第二核酸的下游。
实施方案30.如实施方案26-29中的任一者所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过连接序列来连接。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中所述连接序列是以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
实施方案32.如实施方案25-31中的任一者所述的方法，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。
实施方案33.如实施方案1-32中的任一者所述的方法，其中相较于由从所述前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的移植物抗宿主疾病(GvHD)应答，所述经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
实施方案34.如实施方案1-33中的任一者所述的方法，所述方法还包括分离或富集包含所述第一核酸和/或所述第二核酸的T细胞。
实施方案35.如实施方案1-34中的任一者所述的方法，所述方法还包括从表达所述Nef蛋白的所述经修饰T细胞分离或富集CD3ε阴性T细胞。
实施方案36.如实施方案1-35中的任一者所述的方法，所述方法还包括从表达所述Nef蛋白的所述经修饰T细胞分离或富集内源性TCRα阴性T细胞。
实施方案37.如实施方案1-36中的任一者所述的方法，所述方法还包括将表达所述Nef蛋白的所述经修饰T细胞与至少一种药学上可接受的载体一起配制。
实施方案38.如实施方案1-37中的任一者所述的方法，所述方法还包括向个体施用有效量的表达所述Nef蛋白的所述经修饰T细胞。
实施方案39.如实施方案38所述的方法，其中所述个体患有癌症。
实施方案40.如实施方案38或39所述的方法，其中所述个体是人。
实施方案41.如实施方案21-40中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是经工程改造TCR。
实施方案42.如实施方案41所述的方法，其中所述经工程改造TCR是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的接头；
(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是相同的。
实施方案44.如实施方案42所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是不同的。
实施方案45.如实施方案21-40中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第一TCR共受体的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第二TCR共受体的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第三TCR共受体的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且
其中所述第一、第二和第三TCR共受体选自由CD4、CD8和CD28组成的组。
实施方案46.如实施方案45所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是相同的。
实施方案47.如实施方案45所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是不同的。
实施方案48.如实施方案21-40中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体，所述T细胞抗原偶联物样嵌合受体包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别第一TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第二TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第三TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第四TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中至少所述第二、第三和第四TCR亚基是相同的。
实施方案50.如实施方案48所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。
实施方案51.如实施方案21-40中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是非TCR受体。
实施方案52.如实施方案51所述的方法，其中所述非TCR受体是嵌合抗原受体(CAR)。
实施方案53.如实施方案52所述的方法，其中所述CAR包含含有以下的多肽：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案54.如实施方案52所述的方法，其中所述CAR是抗体偶联的TCR(ACTR)，所述抗体偶联的TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含是Fc受体的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案55.如实施方案42-53中的任一者所述的方法，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。
实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述抗原结合片段是sdAb或scFv。
实施方案57.如实施方案42-56中的任一者所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是单价的。
实施方案58.如实施方案42-57中的任一者所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是多价的。
实施方案59.如实施方案58所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是多特异性的。
实施方案60.如实施方案42-53、55、56、58和59中的任一者所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一sdAb和第二sdAb。
实施方案61.如实施方案42-53、55、56、58和59中的任一者所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一scFv和第二scFv。
实施方案62.如实施方案42-53以及55-61中的任一者所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。
实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述肿瘤抗原是BCMA、CD19或CD20。
实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个特异性识别BCMA、CD19或CD20的一个或多个表位的sdAb或scFv。
实施方案65.如实施方案53-64中的任一者所述的方法，其中所述跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。
实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中所述跨膜结构域源于CD8α。
实施方案67.如实施方案42-66中的任一者所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案68.如实施方案67所述的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12。
实施方案69.如实施方案68所述的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ或DAP12。
实施方案70.如实施方案53-69中的任一者所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激性信号传导结构域。
实施方案71.如实施方案70所述的方法，其中所述共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。
实施方案72.如实施方案71所述的方法，其中所述共刺激性信号传导结构域包含CD137(4-1BB)的细胞质结构域。
实施方案73.如实施方案42-72中的任一者所述的方法，所述方法还包括位于所述细胞外配体结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
实施方案74.如实施方案73所述的方法，其中所述铰链结构域源于CD8α。
实施方案75.如实施方案42-74中的任一者所述的方法，所述方法还包括位于所述功能性外源性受体的N末端处的信号肽。
实施方案76.如实施方案75所述的方法，其中所述信号肽源于CD8α。
实施方案77.如实施方案53以及55-76中的任一者所述的方法，其中所述CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：源于CD8α的信号肽、一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb、源于CD8α的铰链结构域、源于CD8α的跨膜结构域、源于CD137(4-1BB)的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案78.一种经修饰T细胞，所述经修饰T细胞通过实施方案1-77中的任一者所述的方法来获得。
实施方案79.一种包含编码Nef蛋白的第一核酸的经修饰T细胞，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性TCR的下调。
实施方案80.如实施方案79所述的经修饰T细胞，其中所述下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调。
实施方案81.如实施方案80所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约50％。
实施方案82.如实施方案80或81所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约60％。
实施方案83.如实施方案80-82中的任一者所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约70％。
实施方案84.如实施方案80-83中的任一者所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约80％。
实施方案85.如实施方案80-84中的任一者所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约90％。
实施方案86.如实施方案80-85中的任一者所述的经修饰T细胞，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约95％。
实施方案87.如实施方案79-86中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述经修饰T细胞包含未修饰内源性TCR基因座。
实施方案88.如实施方案79-86中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座。
实施方案89.如实施方案88所述的经修饰T细胞，其中所述经修饰T细胞包含经修饰内源性TCRα基因座。
实施方案90.如实施方案88或89所述的经修饰T细胞，其中所述内源性TCR基因座通过CRISPR-Cas系统加以修饰。
实施方案91.如实施方案90所述的经修饰T细胞，其中所述CRISPR-Cas系统包含含有SEQ ID NO:23的核酸序列的gRNA。
实施方案92.如实施方案79-91中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef和HIV2 Nef组成的组。
实施方案93.如实施方案79-92中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述Nef蛋白是野生型Nef。
实施方案94.如实施方案93所述的经修饰T细胞，其中所述野生型Nef包含SEQ IDNO:12-17中的任一者的氨基酸序列。
实施方案95.如实施方案79-92中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述Nef蛋白是突变Nef。
实施方案96.如实施方案95所述的经修饰T细胞，其中所述突变Nef包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。
实施方案97.如实施方案95或96所述的经修饰T细胞，其中所述突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。
实施方案98.如实施方案95-97中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述突变Nef包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa203-208或aa 212-223，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
实施方案99.如实施方案79-98中的任一者所述的经修饰T细胞，所述经修饰T细胞还包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
实施方案100.如实施方案99所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸在单独的载体上。
实施方案101.如实施方案99所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体上。
实施方案102.如实施方案101所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子。
实施方案103.如实施方案102所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸在所述第二核酸的上游。
实施方案104.如实施方案102所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸在所述第二核酸的下游。
实施方案105.如实施方案101-104中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过连接序列来连接。
实施方案106.如实施方案105所述的经修饰T细胞，其中所述连接序列是以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
实施方案107.如实施方案100-106中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述载体是病毒载体。
实施方案108.如实施方案107所述的经修饰T细胞，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组。
实施方案109.如实施方案108所述的经修饰T细胞，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
实施方案110.如实施方案79-109中的任一者所述的经修饰T细胞，其中相较于由从所述经修饰T细胞所源于的前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的GvHD应答，所述经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
实施方案111.如实施方案99-110中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述功能性外源性受体是经工程改造TCR。
实施方案112.如实施方案111所述的方法，其中所述经工程改造TCR是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的接头；
(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案113.如实施方案112所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是相同的。
实施方案114.如实施方案112所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是不同的。
实施方案115.如实施方案99-110中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第一TCR共受体的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第二TCR共受体的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第三TCR共受体的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且
其中所述第一、第二和第三TCR共受体选自由CD4、CD8和CD28组成的组。
实施方案116.如实施方案115所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是相同的。
实施方案117.如实施方案115所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是不同的。
实施方案118.如实施方案99-110中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体，所述T细胞抗原偶联物样嵌合受体包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别第一TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第二TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第三TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第四TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案119.如实施方案118所述的方法，其中至少所述第二、第三和第四TCR亚基是相同的。
实施方案120.如实施方案118所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。
实施方案121.如实施方案99-110中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述功能性外源性受体是非TCR受体。
实施方案122.如实施方案121所述的经修饰T细胞，其中所述非TCR受体是CAR。
实施方案123.如实施方案122所述的经修饰T细胞，其中所述CAR包含含有以下的多肽：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案124.如实施方案122所述的方法，其中所述CAR是抗体偶联的TCR(ACTR)，所述抗体偶联的TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含是Fc受体的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案125.如实施方案112-124中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。
实施方案126.如实施方案125所述的经修饰T细胞，其中所述抗原结合片段是sdAb或scFv。
实施方案127.如实施方案112-126中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域是单价的。
实施方案128.如实施方案112-126中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域是多价的。
实施方案129.如实施方案128所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域是多特异性的。
实施方案130.如实施方案128或129所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一sdAb和第二sdAb。
实施方案131.如实施方案128或129所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一scFv和第二scFv。
实施方案132.如实施方案112-123以及125-131中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。
实施方案133.如实施方案132所述的经修饰T细胞，其中所述肿瘤抗原是BCMA、CD19或CD20。
实施方案134.如实施方案133所述的经修饰T细胞，其中所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb。
实施方案135.如实施方案123-134中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。
实施方案136.如实施方案135所述的经修饰T细胞，其中所述跨膜结构域源于CD8α。
实施方案137.如实施方案112-136中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案138.如实施方案137所述的经修饰T细胞，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12。
实施方案139.如实施方案138所述的经修饰T细胞，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ或DAP12。
实施方案140.如实施方案123-139中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激性信号传导结构域。
实施方案141.如实施方案140所述的经修饰T细胞，其中所述共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、CD353(BLAME、SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。
实施方案142.如实施方案141所述的经修饰T细胞，其中所述共刺激性信号传导结构域包含CD137(4-1BB)的细胞质结构域。
实施方案143.如实施方案112-142中的任一者所述的经修饰T细胞，所述经修饰T细胞还包含位于所述细胞外配体结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
实施方案144.如实施方案143所述的经修饰T细胞，其中所述铰链结构域源于CD8α。
实施方案144.如实施方案112-144中的任一者所述的经修饰T细胞，所述经修饰T细胞还包含位于所述功能性外源性受体的N末端处的信号肽。
实施方案145.如实施方案144所述的经修饰T细胞，其中所述信号肽源于CD8α。
实施方案146.如实施方案123以及125-145中的任一者所述的经修饰T细胞，其中所述CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：源于CD8α的信号肽、一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb、源于CD8α的铰链结构域、源于CD8α的跨膜结构域、源于CD137(4-1BB)的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案147.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案78-147中的任一者所述的经修饰T细胞以及药学上可接受的载体。
实施方案148.一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案147所述的药物组合物。
实施方案149.如实施方案148所述的方法，其中所述疾病是癌症。
实施方案150.如实施方案148或149所述的方法，其中所述个体与所述经修饰T细胞所源于的所述前体T细胞的所述供者是组织不相容的。
实施方案151.如实施方案148-150中的任一者所述的方法，其中所述个体是人。
实施方案152.一种非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。
实施方案153.如实施方案152所述的非天然存在的Nef蛋白，其中所述突变选自插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。
实施方案154.如实施方案152或153所述的非天然存在的Nef蛋白，其中相较于野生型Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白在T细胞中表达后具有降低的对所述T细胞中内源性CD4和/或CD28的下调作用。
实施方案155.如实施方案154所述的非天然存在的Nef蛋白，其中所述下调包括将所述内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达下调。
实施方案156.如实施方案155所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约50％。
实施方案157.如实施方案155或156所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约60％。
实施方案158.如实施方案155-157中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约70％。
实施方案159.如实施方案155-158中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约80％。
实施方案160.如实施方案155-159中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约90％。
实施方案161.如实施方案155-160中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性CD4和/或CD28的细胞表面表达的所述下调被降低至少约95％。
实施方案162.如实施方案152-161中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中经分离Nef蛋白在T细胞中表达后导致所述T细胞中内源性TCR的下调。
实施方案163.如实施方案162所述的非天然存在的Nef蛋白，其中所述下调包括将所述内源性TCR的细胞表面表达下调。
实施方案164.如实施方案163所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约50％。
实施方案165.如实施方案163或164所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约60％。
实施方案166.如实施方案163-165中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约70％。
实施方案167.如实施方案163-166中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约80％。
实施方案168.如实施方案163-167中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约90％。
实施方案169.如实施方案163-168中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中内源性TCR的所述细胞表面表达被下调至少约95％。
实施方案170.如实施方案152-169中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，其中所述Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef和HIV2 Nef组成的组。
实施方案171.如实施方案152-170中的任一者所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa203-208或aa 212-223，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
实施方案172.一种病毒载体，所述病毒载体包含编码Nef蛋白的第一核酸。
实施方案173.如实施方案172所述的病毒载体，其中所述Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef和HIV2Nef组成的组。
实施方案174.如实施方案172或173所述的病毒载体，其中所述Nef蛋白是野生型Nef。
实施方案175.如实施方案174所述的病毒载体，其中所述野生型Nef包含SEQ IDNO:12-17中的任一者的氨基酸序列。
实施方案176.如实施方案172或173所述的病毒载体，其中所述Nef蛋白是突变Nef。
实施方案177.如实施方案176所述的病毒载体，其中所述突变Nef包括在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。
实施方案178.如实施方案176或177所述的病毒载体，其中所述突变包括插入、缺失、一个或多个点突变、和/或重排。
实施方案179.如实施方案176-178中的任一者所述的病毒载体，其中所述突变Nef包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa 215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa203-208或aa 212-223，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
实施方案180.如实施方案172-179中的任一者所述的病毒载体，所述病毒载体还包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
实施方案181.如实施方案180所述的病毒载体，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子。
实施方案182.如实施方案181所述的病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-la启动子、泛素C启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
实施方案183.如实施方案181或182所述的病毒载体，其中所述第一核酸在所述第二核酸的上游。
实施方案184.如实施方案181或182所述的病毒载体，其中所述第一核酸在所述第二核酸的下游。
实施方案185.如实施方案180-184中的任一者所述的病毒载体，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过连接序列来连接。
实施方案186.如实施方案185所述的病毒载体，其中所述连接序列是以下任何核酸序列：编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
实施方案187.如实施方案172-186中的任一者所述的病毒载体，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组。
实施方案188.如实施方案187所述的病毒载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
实施方案189.如实施方案180-188中的任一者所述的病毒载体，其中所述功能性外源性受体是经工程改造TCR。
实施方案190.如实施方案189所述的方法，其中所述经工程改造TCR是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的接头；
(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案191.如实施方案190所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是相同的。
实施方案192.如实施方案190所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基是不同的。
实施方案193.如实施方案180-188中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第一TCR共受体的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第二TCR共受体的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第三TCR共受体的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且
其中所述第一、第二和第三TCR共受体选自由CD4、CD8和CD28组成的组。
实施方案194.如实施方案193所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是相同的。
实施方案195.如实施方案193所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是不同的。
实施方案196.如实施方案180-188中的任一者所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体，所述T细胞抗原偶联物样嵌合受体包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别第一TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第二TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第三TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第四TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
实施方案197.如实施方案196所述的方法，其中至少所述第二、第三和第四TCR亚基是相同的。
实施方案198.如实施方案196所述的方法，其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。
实施方案199.如实施方案180-188中的任一者所述的病毒载体，其中所述功能性外源性受体是非TCR受体。
实施方案200.如实施方案199所述的病毒载体，其中所述非TCR受体是CAR。
实施方案201.如实施方案200所述的病毒载体，其中所述CAR包含含有以下的多肽：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案202.如实施方案200所述的方法，其中所述CAR是抗体偶联的TCR(ACTR)，所述抗体偶联的TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含是Fc受体的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
实施方案203.如实施方案190-201中的任一者所述的病毒载体，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(scFv)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定化Fv蛋白(dsFv)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。
实施方案204.如实施方案203所述的病毒载体，其中所述抗原结合片段是sdAb或scFv。
实施方案205.如实施方案190-204中的任一者所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域是单价的。
实施方案206.如实施方案190-204中的任一者所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域是多价的。
实施方案207.如实施方案206所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域是多特异性的。
实施方案208.如实施方案206或207所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一sdAb和第二sdAb。
实施方案209.如实施方案206或207所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域包含第一scFv和第二scFv。
实施方案210.如实施方案190-201以及203-209中的任一者所述的病毒载体，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I受体、EpCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77、PD-L1、PD-L2以及它们的任何组合。
实施方案211.如实施方案210所述的病毒载体，其中所述肿瘤抗原是BCMA、CD19或CD20。
实施方案212.如实施方案211所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb。
实施方案213.如实施方案211所述的病毒载体，其中所述细胞外配体结合结构域包含一个或多个特异性识别CD19或CD20的一个或多个表位的scFv。
实施方案214.如实施方案201-213中的任一者所述的病毒载体，其中所述跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ζ，CD3ε，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137(4-1BB)，CD152，CD154和PD-1。
194.如实施方案193所述的病毒载体，其中所述跨膜结构域源于CD8α。
实施方案215.如实施方案190-214中的任一者所述的病毒载体，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案216.如实施方案215所述的病毒载体，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12。
实施方案217.如实施方案216所述的病毒载体，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、CD3γ或DAP12。
实施方案218.如实施方案201-217中的任一者所述的病毒载体，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激性信号传导结构域。
实施方案219.如实施方案218所述的病毒载体，其中所述共刺激性信号传导结构域源于选自由以下组成的组的共刺激性分子：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、CD353(BLAME、SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。
实施方案220.如实施方案219所述的病毒载体，其中所述共刺激性信号传导结构域包含CD137(4-1BB)的细胞质结构域。
实施方案221.如实施方案190-220中的任一者所述的病毒载体，所述病毒载体还包含位于所述细胞外配体结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
实施方案222.如实施方案221所述的病毒载体，其中所述铰链结构域源于CD8α。
实施方案223.如实施方案190-222中的任一者所述的病毒载体，所述病毒载体还包含位于所述功能性外源性受体的N末端处的信号肽。
实施方案224.如实施方案23所述的病毒载体，其中所述信号肽源于CD8α。
实施方案225.如实施方案201以及203-224中的任一者所述的病毒载体，其中所述CAR包含从N末端至C末端包含以下的多肽：源于CD8α的信号肽、一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb、源于CD8α的铰链结构域、源于CD8α的跨膜结构域、源于CD137(4-1BB)的共刺激性信号传导结构域以及源于CD3ζ的初级细胞内信号传导结构域。
实施方案226.如实施方案201以及203-225中的任一者所述的病毒载体，所述病毒载体从上游至下游包含：编码所述Nef蛋白的所述第一核酸、编码P2A、IRES或PGK的第三核酸、任选的编码(GGGS)3接头的第四核酸以及编码所述CAR的所述第二核酸，所述CAR包含含有一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb的细胞外配体结合结构域。
实施方案227.如实施方案201以及203-225中的任一者所述的病毒载体，所述病毒载体从上游至下游包含：编码所述CAR的所述第二核酸，所述CAR包含含有一个或多个特异性识别BCMA的一个或多个表位的sdAb的细胞外配体结合结构域；编码P2A、IRES或PGK的第三核酸；任选的编码(GGGS)3接头的第四核酸；以及编码所述Nef蛋白的所述第一核酸。
实施方案228.一种经修饰T细胞，所述经修饰T细胞通过将实施方案172-227中的任一者所述的病毒载体引入至前体T细胞中来获得。
实施方案229.如实施方案228所述的经修饰T细胞，其中相较于由从所述经修饰T细胞所源于的所述前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的GvHD应答，所述经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
实施方案230.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案228或229所述的经修饰T细胞以及药学上可接受的载体。
实施方案231.一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案230所述的药物组合物。
实施方案232.如实施方案231所述的方法，其中所述疾病是癌症。
实施方案233.如实施方案231或232所述的方法，其中所述个体与所述经修饰T细胞所源于的所述前体T细胞的所述供者是组织不相容的。
实施方案234.如实施方案231-233中的任一者所述的方法，其中所述个体是人。
实施例
以下实施例和示例性实施方案意图仅例示本发明，并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。
实施例1.SIV Nef抑制TCR介导的信号转导
这个实施例描述表达SIV Nef的示例性T细胞的设计和制备，以及SIV Nef对TCR介导的信号转导的影响。
1.SIV Nef-P2A-LNGFR转移质粒以及表达SIV Nef-P2A-LNGFR的Jurkat细胞系的构建
pLVX-Puro是一种基于HIV-1的慢病毒表达载体。为构建pLVX-hEF1α载体，使用ClaI和EcoRI对pLVX-Puro(Clontech)载体进行酶消化以移除就定位在多克隆位点(MCS)的上游的组成型活性人巨细胞病毒立即早期启动子(PCMV IE)，接着将人EF1α启动子(GenBank：J04617.1)克隆至经消化载体中。接着，依序构建编码SIV Nef、P2A和LNGFR(低亲和力神经生长因子受体)的融合基因。接着将SIV Nef-P2A-LNGFR融合基因(SEQ ID NO:24)克隆至pLVX-hEF1α质粒中，从而产生重组SIV Nef-P2A-LNGFR转移质粒(在下文中被称为“PLLV-M071”，缩写为“M071”)。将M071重组转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，将所述浓缩慢病毒储存在-80℃下。
在90％RPMI 1640培养基(Life Technologies,#22400-089)、10％胎牛血清(FBS，Life Technologies,#10099-141)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies,#15140-122)中培养Jurkat细胞(克隆E6-1，
TIB-152TM)。将携带SIV nef-P2A-LNGFR融合基因的慢病毒添加至Jurkat细胞培养物的上清液中以进行转导。LNGFR用作SIV Nef+细胞的选择标记。在转导后60小时，如下使用Life Attune NxT FACS(FACS)使5×105个Jurkat细胞经受流式细胞计量术分析，LNGFR+细胞百分比是66.1％。将另一1×107个细胞的部分用DPBS再悬浮，接着补充以20μL MACSelect LNGFR微珠粒(Miltenyi Biotec,#130-091-330)，并且在冰上孵育15分钟以进行磁性标记。在孵育之后，添加PBE缓冲液(磷酸钠/EDTA)以将体积调整至500μL。接着根据MACS试剂盒方案(Miltenyi Biotec试剂盒，#130-091-330)使细胞悬液经受磁性分离和富集，从而产生94.3％的表达SIV Nef-P2A-LNGFR的LNGFR+Jurkat细胞系(图1A)。
FACS(荧光激活的细胞分选仪)
简要来说，在室温、1000rpm/min下离心细胞悬液，并且丢弃上清液。将细胞用DPBS再悬浮，接着添加抗体，并且在4℃下孵育30分钟。在这个实施例中，所用抗体是1μL PerCP/Cy5.5抗人CD271 NGFR抗体(
#345111)。在孵育之后，在室温、1000rpm/min下离心细胞悬液，丢弃上清液，接着将细胞用1mL DPBS再悬浮。将离心和用DPBS再悬浮步骤重复一次。接着将细胞用0.4mL DPBS再悬浮以进行FACS。
MACS(磁激活的细胞分选)
简要来说，在室温、1000rpm/min下离心细胞悬液，丢弃上清液。将细胞用DPBS再悬浮，接着补充以20μL MACSelect LNGFR微珠粒(Miltenyi Biotec,#130-091-330)，并且在冰上孵育15分钟以进行磁性标记。在孵育之后，添加PBE缓冲液(磷酸钠/EDTA)以将体积调整至500μL。接着根据MACS试剂盒方案，使细胞悬液经受磁性分离和富集。
2.TCRα敲除(KO)构建体和TCRα缺陷性Jurkat细胞系的构建
设计用于CRISPR/Cas9技术的靶向人TRAC(T细胞受体α恒定区；GenBank：NC_018925.2)的gRNA序列(SEQ ID NO:23)，并且亚克隆至lentiCRISPR v2载体(Addgene质粒，#52961，含有嘌呤霉素可选择标记)中以构建TCRαKO重组质粒。将TCRαKO重组质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，将所述浓缩慢病毒储存在-80℃下。
如上培养Jurkat细胞(克隆E6-1，
TIB-152TM)。将携带TCRαKO序列的慢病毒添加至Jurkat细胞培养物的上清液中以进行转导。在转导后72小时，添加1μg/mL的最终浓度的嘌呤霉素。每三天更换培养基，并且补充以相同浓度的嘌呤霉素以进一步筛选单细胞克隆。
3.SIV Nef抑制TCR/CD3介导的信号转导
为测试SIV Nef过度表达是否影响通过TCR/CD3进行的信号转导，如上所述通过MACS来分离LNGFR+Jurkat细胞、未转导Jurkat细胞(UnT)、TCRαKO Jurkat细胞以及用空载体转导的Jurkat细胞，接着用植物血球凝集素(PHA，2μg/mL)诱导以进行T细胞活化。PHA结合包括TCR的糖基化表面蛋白上的糖，并且由此使它们交联。这触发钙依赖性信号传导路径，从而导致NFAT(活化的T细胞的核因子)活化。在PHA刺激之后3天，使用FACS测试来自每种Jurkat细胞类型的5×105个细胞的CD69+比率。如上进行FACS，使用1μL PE抗人CD69抗体(
#310906)。
如图1B(图的左侧2列)中所示，在PHA刺激之后，CD69阳性率是41.1％(对于未转导Jurkat细胞来说)、1.09％(对于TCRαKO Jurkat细胞来说)、60.1％(对于表达空载体的Jurkat细胞来说)和7.05％(对于M071(SIV Nef-P2A-LNGFR)LNGFR+经富集Jurkat细胞来说)。这些结果证明在SIV Nef过度表达后，显著抑制了TCR介导的T细胞活化(P<0.05)。
4.SIV Nef不抑制在TCR/CD3复合物的下游的信号转导
为测试SIV Nef过度表达是否影响在TCR/CD3的下游的信号转导，用PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，10ng/mL)和ION(离子霉素，250ng/mL)的混合物诱导Jurkat细胞系，接着用FACS测试T细胞活化标志物CD69的表达(参见以上方法)。PMA是蛋白质激酶C(PKC)的特异性活化剂，因此是NF-κB的特异性活化剂。ION是有助于Ca2+转移至细胞中以及转移出细胞的膜可渗透钙离子载体，并且可用于使细胞内钙水平增加。PMA和ION的组合绕过了信号转导装置，并且使转录因子NF-κB和NFAT活化，从而导致T细胞活化。如图1B(参见图的右侧两列)所证明，在PMA/ION刺激后，未转导Jurkat细胞(UnT)、TCRαKO Jurkat细胞、表达空载体的Jurkat细胞和M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞CD69+比率分别是96.7％、97.1％、98.5％和87.4％。这些结果证明在SIV Nef过度表达后，未显著影响下游核内信号转导。
概括来说，以上结果证明Nef显著抑制TCR介导的上游T细胞活化，但不影响在TCR的下游的核内信号转导。
实施例2.SIV Nef将T细胞表面上的TCR/CD3复合物表达下调
获得5×105个如实施例1中所述的未转导Jurkat细胞(UnT)、TCRαKO Jurkat细胞、表达空载体的Jurkat细胞和M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞，并且使其经受FACS以进行CD3ε和TCRαβ阳性率考查。如实施例1中进行FACS。1μL PE/Cy7抗人CD3抗体(
#300316)或1μL PE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)用于FACS。
作为一单独实验，收集1×106个如实施例1中所述的未转导Jurkat细胞(UnT)、TCRαKO Jurkat细胞、表达空载体的Jurkat细胞和M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞，在室温、1000rpm/min下离心，丢弃上清液。将细胞用DPBS再悬浮，添加100μL免疫染色固定溶液(Beyotime,#P0098)以在室温下固定20分钟。接着在室温、1500rpm/min下离心细胞悬液，丢弃上清液。将细胞用200μL DPBS+Triton X-100(0.1％)再悬浮，在室温下持续20分钟。接着添加1μL FITC缀合的CD3ζ/CD247抗体(Life Technologies,#A15754)，并且在室温下孵育细胞悬液15分钟。在孵育之后，在室温、1500rpm/min下离心细胞悬液，丢弃上清液，接着将细胞用1mL DPBS再悬浮。将离心和用DPBS再悬浮步骤重复一次。接着将细胞用0.4mL DPBS再悬浮以进行FACS来考查CD3ζ阳性率。
如图2中所示，在SIV Nef表达后，具有高CD3ε表达的Jurkat细胞以及表达TCRαβ的细胞显著降低。将M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞的15.6％的CD3ε+比率和15.3％的TCRαβ+比率与未转导(UnT)Jurkat细胞的那些比率(分别是85.9％和90.0％)进行比较。M071LNGFR+经富集Jurkat细胞的CD3ζ+比率是93.2％，所述比率不显著不同于未转导Jurkat细胞的比率(95.6％)。作为对照，相较于未转导(UnT)Jurkat细胞中的表达，空载体表达不影响Jurkat细胞对CD3ε、TCRαβ和CD3ζ的表达。
这些结果证明SIV Nef过度表达显著下调T细胞TCR/CD3复合物表面表达(而CD3ζ表达不受影响)，此转而影响TCR介导的T细胞活化。
实施例3.SIV Nef同源物HIV1 Nef和HIV2 Nef抑制TCR/CD3介导的信号转导
1.HIV1 Nef/HIV2 Nef-T2A-Puro转移质粒和细胞系的构建
基于UniProt数据库分析，HIV1 Nef和HIV2 Nef作为SIV Nef同源物加以回收。构建融合基因HIV1nef-T2A-Puro(SEQ ID NO:25)和HIV2 nef-T2A-Puro(SEQ ID NO:26)，并且克隆至pLVX-hEF1α表达载体(如实施例1中所构建)中以分别形成重组转移质粒HIV1Nef-T2A-Puro(在下文中被称为“HIV1”转移质粒)和HIV2 Nef-T2A-Puro(在下文中被称为“HIV2”转移质粒)。将HIV1转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK 293T细胞中。将HIV2转移质粒纯化，并且以类似方式与psPAX2和pMD2.G质粒一起转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，将所述浓缩慢病毒储存在-80℃下。
如实施例1中培养Jurkat细胞(克隆E6-1，
TIB-152TM)。将携带HIV1 Nef-T2A-Puro或HIV2Nef-T2A-Puro融合序列的慢病毒添加至Jurkat细胞培养物的上清液中以进行转导。嘌呤霉素用作HIV1/HIV2Nef+细胞的可选择标记。在转导后72小时，添加1μg/mL的最终浓度的嘌呤霉素。每三天更换培养基，并且补充以相同浓度的嘌呤霉素以进一步筛选单细胞克隆。
2.HIV1 Nef/HIV2 Nef将T细胞表面上的TCR/CD3复合物表达下调
使5×105个如实施例1中所述的HIV1 Nef+Jurkat细胞、HIV2 Nef+Jurkat细胞、未转导Jurkat细胞(UnT)、TCRαKO Jurkat细胞、表达空载体的Jurkat细胞、M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞经受FACS以进行CD3ε和TCRαβ阳性率考查。如实施例1中进行FACS，1μL PE/Cy7抗人CD3抗体(
#300316)或1μL PE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)用于FACS。如同实施例2中一样，作为一单独实验，收集1×106个如实施例1中所述的HIV1 Nef+Jurkat细胞、HIV2 Nef+Jurkat细胞、未转导(UnT)Jurkat细胞、TCRαKO Jurkat细胞、表达空载体的Jurkat细胞和M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞，固定，并且使其经受FACS以进行CD3ζ阳性率考查。1μL FITC缀合的CD3ζ/CD247抗体(Life Technologies,#A15754)用于FACS。
如图3中所示，对于M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞、HIV1 Nef+Jurkat细胞和HIV2Nef+Jurkat细胞，TCRαβ+比率分别是16.1％、15.1％和26.2％，所述比率显著低于表达空载体的Jurkat细胞的TCRαβ+比率(96.5％；P<0.05)。对于M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞、HIV1 Nef+Jurkat细胞和HIV2 Nef+Jurkat细胞，CD3ε+比率分别是19.4％、18.1％和30.6％，所述比率显著低于表达空载体的Jurkat细胞的CD3ε+比率(98.2％；P<0.05)。TCRαKO Jurkat细胞充当阳性对照，其显示显著降低的TCRα+和CD3ε+比率。在另一方面，对于M071 LNGFR+经富集Jurkat细胞、HIV1 Nef+Jurkat细胞和HIV2 Nef+Jurkat细胞，CD3ζ+比率分别是99.0％、94.3％和95.0％，所述比率不显著不同于未转导(UnT)Jurkat细胞或表达空载体的Jurkat细胞的CD3ζ+比率(分别是98.0％和99.7％；P>0.05)。
这些结果证明SIV Nef同源物HIV1 Nef和HIV2 Nef的过度表达可有效下调TCR/CD3的细胞表面表达(而CD3ζ表达不受影响)，此转而抑制TCR/CD3介导的T细胞活化。HIV1Nef和HIV2 Nef的抑制效率与SIV Nef的抑制效率类似。
实施例4.SIV Nef抑制TCR介导的对靶标细胞的细胞溶解
1.抗BCMA CAR和抗BCMA CAR-LNGFR转移质粒的构建
如WO2017025038和WO2018028647实施例中所述构建抗BCMA CAR(在下文中被称为“BCMA CAR”)。WO2018028647的整个内容，包括其中所述的所有BCMA CAR构建体的序列，通过引用明确并入本文。
简要来说，化学合成编码从N末端至C末端包含：CD8α铰链结构域(“CD8α铰链”)、CD8跨膜结构域(“CD8 TM”)、CD28细胞质结构域(“CD28 cyto”)和/或4-1BB(CD137)细胞质结构域(“4-1BB cyto”)以及CD3ζ细胞质结构域(CD3ζ)的CAR骨架多肽的核酸序列，并且克隆至预修饰慢病毒载体中，处于组成型hEF1α启动子的下游并且可操作地连接至所述启动子(如实施例1中所构建的pLVX-hEF1α)。
为构建携带融合序列BCMA CAR-P2A-LNGFR的BCMA CAR-P2A-LNGFR转移质粒，BCMACAR-P2A-LNGFR基因由Genscript直接构建。
将BCMA CAR-P2A-LNGFR转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，将所述浓缩慢病毒储存在-80℃下。
2.对SIV Nef和抗BCMA CAR共表达的测试
使用常规聚乙烯亚胺(PEI)转导方案，将BCMA CAR和SIV Nef-P2A-LNGFR质粒共转染至HEK 293T细胞中。在转染后3天，用FACS考查5×105个细胞的BCMA CAR+和LNGFR+表达。如实施例1中所述进行FACS。将1μL具有Fc标签的经FITC标记人BCMA/TNFRSF17蛋白(ACROBiosystems,#BCA-HF254)和1μL PerCP/Cy5.5抗人CD271 NGFR抗体(
#345111)混合，并且用于FACS。
如图4A中所示，共转染至HEK 293T细胞中的BCMA CAR和SIV Nef-P2A-LNGFR质粒产生了17.3％BCMA CAR+/LNGFR+双阳性细胞。这指示在SIV Nef的过度表达后，BCMA CAR可仍然有效表达在细胞表面上。
3.SIV Nef显著抑制原代T淋巴细胞中的TCR细胞表面表达
从志愿者抽取50mL外周血液。通过密度梯度离心来分离外周血液单核细胞(PBMC)。全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-096-535)用于磁性标记PBMC，并且分离和纯化T淋巴细胞。人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-091-441)用于活化和扩增经纯化T淋巴细胞。收集活化的T淋巴细胞，并且再悬浮于RPMI 1640培养基(Thermo Fisher SCIENTIFIC,#22400-089)中。在活化之后3天，用编码SIV Nef-P2A-LNGFR的慢病毒和编码BCMA CAR-P2A-LNGFR的慢病毒共转导5×106个活化的T淋巴细胞。将T细胞悬液添加至6孔板中，并且在37℃、5％CO2孵育器中孵育过夜。在转导后5天，收集1×107个T细胞，并且使用MACS分离(如实施例1中所述，采用MACSelect LNGFR微珠粒(MiltenyiBiotec,#130-091-330))以获得LNGFR+T细胞。使经分选LNGFR+T细胞扩增和富集2天，接着通过FACS来测试5×105个LNGFR+T细胞的TCRαβ阳性率。如实施例1中进行FACS，使用1μLPE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)。
如图4B中所示，用编码BCMA CAR-P2A-LNGFR的慢病毒和编码SIV Nef-P2A-LNGFR的慢病毒共转导T细胞导致在LNGFR+T细胞群体中具有35.8％TCRαβ-细胞。这指示BCMACAR-P2A-LNGFR和SIV Nef-P2A-LNGFR共转导可有效产生TCRαβ阴性CAR-T细胞。
4.分选和富集TCR/CD3经消减的T淋巴细胞
编码BCMA CAR-P2A-LNGFR的慢病毒和编码SIV Nef-P2A-LNGFR的慢病毒用于共转导5x107个原代T淋巴细胞。在转导后5天，根据试剂盒方案，使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-096-535)来磁性标记细胞，并且分离和纯化CD3ε阴性T淋巴细胞。使经分选CD3ε阴性T细胞扩增和富集2天，接着收集5×105个细胞(对于每个FACS实验来说)，并且通过FACS来考查CD3ε阴性T细胞群体内的TCRαβ、CD3ε和LNGFR阳性率。如实施例1中进行FACS，1μL PE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)用于TCRαβ+测试，1μL PE/Cy7抗人CD3抗体(
#300316)用于CD3ε+测试，并且1μL PerCP/Cy5.5抗人CD271NGFR抗体(
#345111)用于LNGFR+测试。
如图4C中所示，在MACS分选的用编码BCMA CAR-P2A-LNGFR的慢病毒和编码SIVNef-P2A-LNGFR的慢病毒共转导的CD3ε阴性T细胞群体之中，TCRαβ+比率是5.35％，CD3ε+比率是2.27％，并且LNGFR+比率是88.5％(参见“MACS CD3阴性组”)；而对于MACS分选的未转导(UnT)T细胞，TCRαβ+比率是80.9％，CD3ε+比率是91.9％，并且LNGFR+比率仅是1.25％。这指示通过MACS进行的CD3ε阴性细胞分选可进一步分离和富集TCR阴性原代T淋巴细胞。
5.在TCR/CD3经消减的T淋巴细胞的情况下，TCR介导的针对靶标细胞的细胞溶解活性显著降低
将从以上步骤获得的不同群组的经分选的用编码BCMA CAR-P2A-LNGFR的慢病毒和编码SIV Nef-P2A-LNGFR的慢病毒共转导的CD3ε阴性T细胞在20:1或10:1效应与靶标(E:T)细胞比率下与多发性骨髓瘤(MM)细胞系RPMI-8226(BCMA+，具有荧光素酶(Luc)标记)或慢性骨髓源性白血病(CML)细胞系K562(BCMA-，具有Luc标记)混合，并且在
384孔固体白色板中孵育12小时。ONE-GloTM荧光素酶测定系统(Promega,#E6120)用于测量荧光素酶产生。将25μL ONE-GloTM试剂添加至384孔板的每个孔中，孵育，接着放置于SparkTM10M多模式微板读取器(TECAN)上来进行荧光素酶测量，以计算不同T淋巴细胞对靶标细胞的细胞溶解作用。
进一步研究了CAR+/CD3ε-T细胞对RPMI-8226和K562细胞系的特异性和非特异性细胞溶解作用。如图4D中所示，经富集的表达BCMA CAR-P2A-LNGFR和SIV Nef-P2A-LNGFR的CD3ε阴性T细胞无论TCR表达水平如何(CD3ε+/TCRαβ+，“TCR阳性”或CD3ε-/TCRαβ-，“TCR阴性”)都以高于90％的溶解率有效介导对RPMI-8226细胞(BCMA+)的抗BCMA CAR特异性肿瘤细胞杀灭，所述溶解率显著高于在未转导T细胞(“UnT”；P<0.05)的情况下的溶解率。在另一方面，在K562细胞系(BCMA-)的情况下，经富集的表达BCMA CAR-P2A-LNGFR和SIV Nef-P2A-LNGFR的CD3ε阴性T细胞诱导TCR介导的非特异性肿瘤细胞杀灭，因为表达TCRαβ的细胞(CD3ε+/TCRαβ+)比不表达TCRαβ的细胞(CD3ε-/TCRαβ-)具有更大程度的细胞溶解，并且这种细胞溶解作用与在未转导T细胞(UnT；P>0.05)的情况下的细胞溶解作用类似。未与原代T细胞一起孵育的经Luc标记细胞充当阴性对照(NC)。0.25％Triton X-100化学溶解组充当阳性对照(PC)。较高E:T比率导致对RPMI-8226与K562细胞系两者的更大程度的细胞杀灭，这可能归因于慢病毒介导的肿瘤细胞杀灭。这些结果指示SIV Nef的表达有效抑制了TCRαβ介导的T细胞活化，从而导致TCR介导的对靶标细胞的细胞溶解作用降低。
实施例5.在一步中获得TCR/CD3经消减的CAR-T细胞
1.SIV Nef+CAR全合一载体和Jurkat细胞系的构建
化学合成融合基因序列BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef、BCMA CAR-P2A-SIV Nef、BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef、SIV Nef-P2A-BCMA CAR、SIV Nef-IRES-CAR、CAR-IRES-SIV Nef、CAR-PGK-SIV Nef和SIV Nef-PGK-CAR，并且克隆至pLVX-hEF1α载体(参见实施例1)中以构建重组转移质粒BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef(“PLLV-M072”或“M072”)、BCMACAR-P2A-SIV Nef(“PLLV-M086”或“M086”)、BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef(“PLLV-M090”或“M090”)、SIV Nef-P2A-BCMA CAR(“PLLV-M091”或“M091”)、SIV Nef-IRES-BCMA CAR(“PLLV-M126”或“M126”)、BCMA CAR-IRES-SIV Nef(“PLLV-M159”或“M159”)、BCMA CAR-PGK-SIV Nef(“PLLV-M160”或“M160”)和SIV Nef-PGK-BCMA CAR(“PLLV-M161”或“M161”)。将转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，将所述浓缩慢病毒储存在-80℃下。
2.在一步中获得TCR/CD3经消减的CAR-T细胞
分别将携带BCMA CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef、BCMA CAR-P2A-SIV Nef、BCMA CAR-P2A-(GGGS)3-SIV Nef、SIV Nef-P2A-BCMA CAR、SIV Nef-IRES-BCMA CAR、BCMA CAR-IRES-SIV Nef、BCMA CAR-PGK-SIV Nef和SIV Nef-PGK-BCMA CAR序列的慢病毒添加至培养的Jurkat细胞悬液中以进行转导。慢病毒SIV Nef-P2A-LNGFR(M071)用作非CAR编码对照。未转导Jurkat细胞(“UnT”)用作阴性对照。在转导后72小时，收集含有5×105个细胞的悬液，并且如实施例1中所述进行准备以用于FACS来考查CD3ε、TCRαβ和BCMA CAR的阳性率。1μLPE/Cy7抗人CD3抗体(
#300316)、1μL PE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)或1μL具有Fc标签的经FITC标记人BCMA/TNFRSF17蛋白(ACROBiosystems,#BCA-HF254)用于FACS。
如可由图5A至图5C所见，SIV Nef-P2A-CAR(M091)、SIV Nef-IRES-CAR(M126)、CAR-IRES-SIV Nef(M159)、CAR-PGK-SIV Nef(M160)、SIV Nef-PGK-CAR(M161)的TCRαβ-比率分别是59.1％、82.7％、50.4％、43.5％、95.0％，与UnT组(12.6％)相比，TCRαβ被显著下调。同时，CAR-P2A-LNGFR-SIV Nef(M072),CAR-P2A-SIV Nef(M086),CAR-P2A-(GGGS)3-SIVNef(M090)TCRαβ-比率分别是7.94％、16.3％、15.4％，与未转导(UnT)组(12.6％)相比，所述比率不具有显著差异。这些以上结果指示通过自裂解肽P2A来构建在SIV Nef的C’末端的CAR(M091)可将TCR/CD3的细胞表面表达下调，同时保持足够CAR表达。但同时，有可能的是SIV Nef蛋白的N末端空间结构在将TCR/CD3复合物的细胞表面表达下调方面是关键的，并且残余所裂解P2A氨基酸在Nef蛋白的N’末端的M072、M086和M090载体显著影响了它的功能。下表5概述SIV Nef CAR全合一质粒对CD3ε、TCRαβ和BCMA CAR的表达的影响。
表5.全合一质粒以及对TCR/CD3复合物和CAR的表达的影响
实施例6.对T细胞CD4和CD28表达具有降低的负性作用的Nef突变体和亚型
Nef蛋白上的某些氨基酸可结合CD4和CD28，接着将T细胞上的CD4、CD28表达下调(参见表6)。为使Nef对CD4和CD28表达和功能的负性作用降低，我们进一步设计和构建了亚型Nef(HIV F2-Nef、HIV C2-Nef、HIV HV2NZ-Nef)和突变Nef(被称为“mutNef”)。
表6.Nef氨基酸的功能
(源于V.Piguet和D.Trono,“A Structure-function Analysis of the NefProtein of Primate Lentiviruses”,1999,[Rev Med Virol]448-459)
1.亚型或突变Nef质粒以及各种Nef表达性细胞系的构建
我们设计了具有对CD4和CD28结合至关重要的突变氨基酸的SIV Nef序列。我们还设计了一些其他SIV Nef突变体和HIV Nef同源物。化学合成亚型Nef-P2A-LNGFR或mutNef-P2A-LNGFR融合序列，接着克隆至如实施例1中所述的pLVX-hEF1α质粒中，从而产生亚型Nef-P2A-LNGFR和mutNef-P2A-LNGFR转移质粒(参见表7(对于亚型或突变Nef结构)和“序列表”章节(对于突变序列))。M016(乱序序列)充当阴性对照。如实施例1中构建的M071(野生型SIV Nef-P2A-LNGFR)用作阳性对照。
表7.Nef突变体和亚型的结构
*M119、M120和M121 mutNef序列源于S.R.Das和S.Jameel,2005(Biology of theHIV Nef protein,Indian J Med Res.,121(4):315-332)。其他突变体是自行设计的。
将来自表7的转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，接着储存在-80℃下。
如实施例1中培养Jurkat细胞(克隆E6-1，
TIB-152TM)。将携带如表6中的融合序列的慢病毒添加至Jurkat细胞培养物的上清液中以进行转导。嘌呤霉素用作Nef+细胞的可选择标记。在转导后72小时，添加1μg/mL的最终浓度的嘌呤霉素。每三天更换培养基，并且补充以相同浓度的嘌呤霉素以进一步筛选单细胞克隆。
2.测试亚型或突变Nef对T细胞上的CD4和CD28表达的影响
在转导后72小时，收集含有5×105个Jurkat细胞的悬液，并且如实施例1中所述进行准备以用于FACS来考查CD3ε、TCRαβ、CD4和CD28的阳性率。1μL PE/Cy7抗人CD3抗体(
#300316)、1μL PE/Cy5抗人TCRα/β抗体(
#306710)、1μL PE-CD4或APC抗人CD28抗体用于FACS。
如可由图6A至图6D所见，用M116(SIV Nef突变体1或SIV Nef M116)转导的Jurkat细胞展现88.5％TCRαβ阴性率、86.6％CD3ε阴性率，所述阴性率不显著不同于展现73.3％TCRαβ阴性率、87.3％CD3ε阴性率的用M071(野生型SIV Nef；P>0.05)转导的细胞的阴性率。在另一方面，用M116(SIV Nef突变体1或SIV Nef M116)转导的Jurkat细胞展现仅7.44％CD4阴性率和1.67％CD28阴性率，所述阴性率显著低于用M071(野生型SIV Nef；P<0.05)转导的Jurkat细胞的53.3％CD4阴性率和72.9％CD28阴性率。这个结果指示相较于野生型SIVNef蛋白，M116质粒中的SIV Nef突变体1可有效下调T细胞表面上的TCR/CD3复合物表达，同时对CD4和CD28表达具有极小下调作用。M117(SIV Nef突变体2)、M118(SIV Nef突变体3)、M142(SIV Nef突变体4)和M143(SIV Nef突变体5)具有类似的有效下调TCR/CD3复合物表达，同时保持T细胞表面上的CD4和CD28表达(即具有小得多的CD4下调作用和/或CD28下调作用)的作用。HIV亚型Nef蛋白(M119、M120和M121)也对CD4表达具有极小下调作用，但它们对T细胞表面上的TCR/CD3复合物的下调作用不和SIV Nef突变体(M116、M117、M118、M142和M143)同样好。表8概述不同Nef亚型和突变体对T细胞上的TCRαβ、CD3ε、CD4和CD28表达的影响。
表8.Nef亚型或突变体对T细胞上的TCRαβ、CD3ε、CD4和CD28表达的影响
实施例7.在CAR-T细胞免疫疗法中使用SIV Nef
1.SIV Nef+CAR全合一载体的构建
化学合成融合基因序列SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR(SEQ ID NO:48)、SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR(SEQ ID NO:49)、SIV Nef-IRES-CD19×CD20scFv CAR(SEQ ID NO:50)、SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR(SEQ ID NO:51)、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1(SEQ ID NO:52)、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2(SEQ ID NO:53)、SIVNef-IRES-BCMA单VHH CAR(SEQ ID NO:54)，接着克隆至pLVX-hEF1α表达载体(参见实施例1)中以分别构建重组转移质粒PLLV-M167、PLLV-M168、PLLV-M169、PLLV-M170、PLLV-M171、PLLV-M172和PLLV-M173(参见表9)。
将转移质粒纯化，并且以类似方式与psPAX2和pMD2.G质粒一起转导至HEK 293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，并且进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，接着储存在-80℃下。
表9.示例性SIV Nef+CAR全合一载体
2.在一步中获得TCR阴性CAR-T细胞
使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-096-535)从解冻PBMC获得T细胞。将经分离T细胞接种于10cm细胞培养皿中，接着根据制造商说明书补充以微珠粒(Miltenyi Biotec,#130-111-160)，并且在37℃、5％CO2孵育器中孵育72小时。
将携带SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR、SIV Nef-IRES-CD20 scFv CAR、SIV Nef-IRES-CD19×CD20scFv CAR、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHHCAR2或SIV Nef-IRES-BCMA单VHH CAR序列的慢病毒分别添加至培养的原代T细胞悬液中以进行转导。在转导之后，使用TCRαβ细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-092-614)以及MACS来分离和富集TCR阴性CAR-T细胞。
在MACS之后一天，收集含有经富集的5×105个TCRαβ阴性细胞的悬液，并且进行准备以用于FACS来考查TCRαβ的表达。
如可由图7所见，对于用SIV Nef+CAR全合一构建体转导的T细胞，MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率是相当高的，而MACS后的未转导T细胞(UnT)仅产生1.14％的TCRαβ阴性率。参见SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR(M167)T细胞(89.7％)、SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR(M168)T细胞(93.3％)、SIV Nef-IRES-CD19×CD20 scFv CAR(M169)T细胞(92.1％)、SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR(M170)T细胞(93.6％)、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1(M171)T细胞(93.5％)、SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2(M172)T细胞(87.9％)和SIV Nef-IRES-BCMA单VHH CAR(M173)T细胞(94.0％)的MACS后TCRαβ阴性率。
接着将来自以上步骤的MACS分选的TCRαβ阴性T细胞、MACS分选的TCRαβ阳性T细胞和未转导T细胞(UnT)分别在不同效应与靶标(E:T)细胞比率下与靶标细胞或肿瘤细胞混合，并且在
384孔固体白色板中孵育12小时。K562-CD20是经CD20转导的骨髓源性白血病细胞系。Raji是B细胞淋巴瘤细胞系(CD19+、CD20+、BCMA-)。K562-CD19是经CD19转导的骨髓源性白血病细胞系。RPMI-8226是表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞系。One-GloTM荧光素酶测定系统(TAKARA,#B6120)用于测量荧光素酶活性。将25μL One-GloTM试剂添加至384孔板的每个孔中。在孵育之后，使用SparkTM 10M多模式微板读取器(TECAN)测量荧光以计算不同T淋巴细胞对靶标细胞的细胞毒性率。情景是MACS分选的TCRαβ阳性T细胞将显示TCR介导的非特异性杀灭活性，因为TCR未由SIV Nef消减，而MACS分选的TCRαβ阴性T细胞几乎消减了TCR，因此将主要显示CAR介导的特异性杀灭活性。
图8A至图8B显示MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阴性T细胞的CAR介导的特异性肿瘤细胞毒性，其中MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阳性T细胞和未转导T细胞(UnT)作为对照。如可由图8A至图8B所见，相较于MACS分选的TCRαβ阳性T细胞和未转导T细胞，MACS分选的TCRαβ阴性T细胞显示显著更高的肿瘤细胞杀灭活性，并且肿瘤细胞杀灭活性与E:T比率正性相关(E:T越高，CAR介导的杀灭功效越好)。
图9A至图9B显示MACS分选的用各种SIV Nef+CAR全合一构建体转导的TCRαβ阳性和阴性T细胞的TCR介导的非特异性杀灭效率。H929是人多发性骨髓瘤细胞系(CD19-、CD20-)。KG1是人急性骨髓性白血病细胞系(CD19-)。Raji是伯基特淋巴瘤细胞系(CD19+、CD20+、BCMA-)。K562是骨髓源性白血病细胞系(CD20-、CD19-、BCMA-)。如可由图9A至图9B所见，如所预期，MACS分选的TCRαβ阴性T细胞(表达CAR，以及表达少许或不表达TCR)对靶标细胞具有少许或不具有杀灭活性，因为相应CAR抗原(例如CD19、CD20、BCMA)不在相应测试靶标细胞上表达；而MACS分选的TCRαβ阳性T细胞(仅表达TCR)导致高得多的TCR介导的非特异性肿瘤细胞杀灭。
这些结果指示SIV Nef+CAR全合一载体有效并且易于产生TCRαβ阴性CAR-T细胞，所述TCRαβ阴性CAR-T细胞可有效导致CAR介导的特异性肿瘤细胞杀灭(P<0.05)，并且无TCR介导的非特异性细胞毒性。因此，如本文例示的SIV Nef+CAR全合一载体可有效降低原代T细胞上的TCRαβ表达和功能，同时维持CAR表达以及CAR介导的对靶标细胞的特异性细胞毒性。
实施例8.在CAR-T细胞免疫疗法中使用SIV Nef突变体
SIV Nef M116序列(参见实施例6中的SIV Nef突变体1)在这个实验中用于构建SIV Nef+CAR全合一载体。化学合成融合基因序列BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116(SEQ ID NO:62)，并且克隆至PLVX-hEF1α表达质粒(参见实施例1)中，从而产生重组BCMABiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116转移质粒(在下文中被称为“PLLV-M133”)。将PLLV-M133重组转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，接着储存在-80℃下。
如实施例7中所述获得原代T细胞，接着用携带PLLV-M133的慢病毒转导。在转导之后，使用TCRαβ细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,#130-092-614)以及MACS来分离和富集TCR阴性CAR-T细胞。在MACS之后一天，收集含有经富集的5×105个TCRαβ阴性细胞的悬液，并且进行准备以用于FACS来考查TCRαβ的表达。
如图10A中所示，MACS富集后的TCRαβ阴性M133 CAR-T细胞比率是99.7％。未转导T细胞充当对照，其仅显示1.38％TCRαβ阴性率。
如实施例7中所述来进行细胞毒性测定。K562是骨髓源性白血病细胞系(BCMA-)。RPMI-8226是表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞系。如可由图10B左侧图所见，相较于MACS分选的TCRαβ阳性M133 T细胞和未转导T细胞，MACS分选的TCRαβ阴性M133 CAR-T细胞导致对RPMI-8226细胞(BCMA+)的显著更高的细胞毒性(34.99±6.20％)，从而反映CAR-T介导的特异性肿瘤细胞杀灭。MACS分选的TCRαβ阴性M133 T细胞对K562细胞(BCMA-)几乎不具有TCR介导的非特异性细胞杀灭(0.90±3.45％)，MACS分选的TCRαβ阳性T细胞导致高得多的TCR介导的非特异性细胞杀灭(图10B右侧图)。
这些结果指示携带突变SIV Nef序列的SIV Nef+CAR全合一载体也有效并且易于产生TCRαβ阴性CAR-T细胞，并且SIV Nef-IRES-CAR和CAR-IRES-SIV Nef的组构均有效起作用(将实施例7和8进行比较)。两种序列组构均可有效降低原代T细胞上的TCRαβ表达和功能，同时维持CAR表达以及CAR介导的对靶标细胞的特异性细胞毒性。
实施例9.在嵌合TCR-T(cTCR-T)细胞免疫疗法中使用SIV Nef突变体
SIV Nef M116序列(参见实施例6中的M116，SIV NEF突变体1)和抗CD20嵌合TCR(cTCR)序列在这个实验中用于构建SIV-Nef+嵌合TCR全合一载体。抗CD20 cTCR具有抗CD20scFv(Leu-16)-(GGGGS)3-CD3ε(全长，除信号肽之外)的结构，具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列。通过将抗CD20 cTCR融合多肽并入天然TCR复合物中，经修饰TCR复合物可在不需要HLA的情况下识别表达CD20的肿瘤细胞，并且衔接完全TCR机构以驱动为强力、受调节和持久的肿瘤杀灭所需的完全T细胞功能。化学合成融合基因序列SIV Nef M116-IRES-CD20cTCR(SEQ ID NO:63)，并且克隆至PLVX-hEF1α表达质粒(参见实施例1)中，从而产生重组SIV Nef M116-IRES-CD20 cTCR转移质粒(在下文中被称为“PLLV-M572”)。将PLLV-M572重组转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，接着储存在-80℃下。如实施例7中所述，通过用携带PLLV-M572的慢病毒转导原代T细胞，接着进行MACS富集来制备TCRαβ阴性CD20-cTCR阳性T细胞。根据如上所述的类似方法来考查TCRαβ的表达。如图11A中所示，对于用PLLV-M572转导的T细胞，MACS富集后的TCRαβ阴性T细胞比率是94.9％，而未转导T细胞仅具有0.599％TCRαβ阴性率。
如实施例7中所述来进行细胞毒性测定。K562是骨髓源性白血病细胞系(CD20-、CD19-、BCMA-)。Raji是伯基特淋巴瘤细胞系(CD19+、CD20+、BCMA-)。如可由图11B左侧图所见，相较于MACS分选的TCRαβ阳性M572 T细胞和未转导T细胞，MACS分选的TCRαβ阴性CD20cTCR-T细胞导致对Raji细胞(CD20+)的显著更高的细胞毒性(49.21±22.96％)，从而反映CD20 cTCR介导的特异性肿瘤细胞杀灭。此外，在较高E:T比率的情况下，MACS分选的TCRαβ阴性CD20 cTCR-T细胞的杀灭功效是较高的。MACS分选的TCRαβ阴性CD20 cTCR-T细胞对K562细胞(CD20-)具有少许内源性TCR介导的非特异性细胞杀灭(3.76±4.31％)，而MACS分选的TCRαβ阳性M572 T细胞导致高得多的内源性TCR介导的非特异性细胞杀灭(图11B右侧图)。
这些惊人的结果指示SIV Nef+cTCR全合一载体可有效下调原代T细胞上的内源性TCRαβ表达和功能，而不影响与外源性cTCR整合的TCR复合物的功能。此外，TCRαβ阴性cTCR-T细胞有效介导对肿瘤细胞的cTCR特异性细胞毒性(P<0.05)，具有少许或不具有内源性TCR介导的非特异性细胞毒性。
实施例10.在TAC-T细胞免疫疗法中使用SIV Nef突变体
SIV Nef M116(参见实施例6中的M116，SIV NEF突变体1)在这个实验中用于构建SIV Nef+CD20TAC全合一载体。抗CD20 TAC包含抗CD20 scFv(Leu-16)-(GGGGS)3-huUCHT1.Y177T-GGGGS-CD4(部分细胞外结构域+跨膜结构域+细胞内结构域)的结构，具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列。huUCHT1靶向CD3ε。化学合成融合基因序列SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC(SEQ ID NO:65)，并且克隆至PLVX-hEF1α表达质粒(参见实施例1)中，从而产生重组SIV Nef-IRES-CD20 TAC转移质粒(在下文中被称为“PLLV-M574”)。将PLLV-M574重组转移质粒纯化，按比例与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G混合，接着共转导至HEK293T细胞中。在转导后60小时，收集病毒上清液，并且在4℃、3000rpm下离心5分钟。使用0.45μm过滤器过滤上清液，接着进一步使用500KD中空纤维膜切向流过滤来浓缩以获得浓缩慢病毒，接着储存在-80℃下。如实施例7中所述，通过用携带PLLV-M574的慢病毒转导原代T细胞，接着进行MACS富集来制备TCRαβ阴性TAC-T细胞。根据如上所述的类似方法来考查TCRαβ的表达。如图12A中所示，在MACS富集后，用PLLV-M574转导的T细胞的TCRαβ阴性率是95.5％，而未转导T细胞(UnT)仅具有0.971％TCRαβ阴性率。
如实施例7中所述来进行细胞毒性测定。Raji是伯基特淋巴瘤细胞系(CD20+)。H929是人多发性骨髓瘤细胞系(CD20-)。如可由图12B左侧图所见，相较于MACS分选的TCRαβ阳性M574 T细胞和未转导T细胞，MACS分选的TCRαβ阴性CD20 TAC-T细胞导致对Raji细胞(CD20+)的显著更高的细胞毒性(54.58±20.03％)，从而反映抗CD20 TAC介导的特异性肿瘤细胞杀灭。此外，在较高E:T比率的情况下，MACS分选的TCRαβ阴性CD20 TAC-T细胞的杀灭功效是较高的。MACS分选的TCRαβ阴性CD20 TAC-T细胞对H929细胞(CD20-)具有少许内源性TCR介导的非特异性细胞杀灭(3.33±2.80％)，而MACS分选的TCRαβ阳性M574 T细胞导致高得多的内源性TCR介导的非特异性细胞杀灭(图12B右侧图)。
这些惊人的结果指示SIV Nef+TAC全合一载体可有效下调原代T细胞上的内源性TCRαβ表达和功能，而不影响TAC的表达和功能。此外，TCRαβ阴性TAC-T细胞有效介导对肿瘤细胞的TAC特异性细胞毒性(P<0.05)，具有少许或不具有内源性TCR介导的非特异性细胞毒性。
实施例11.关于TCRαβ、CD4和CD28调控来对SIV Nef结构域元件进行的测试
全长SIV Nef具有223个氨基酸。Nef蛋白上的某些氨基酸可结合CD4和CD28，接着将T细胞上的CD4、CD28表达下调(参见实施例6，表6)。为测试各种Nef结构域元件对TCRαβ、CD4和CD28表达和功能的影响，通过跨越除第一甲硫氨酸之外的全长序列，使每三个连续氨基酸突变成丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸(AAA)来设计74种突变体。化学合成这些突变核酸序列，并且克隆至PLVX-hEF1α表达质粒(参见实施例1)中，从而产生74种重组SIV Nef突变体转移质粒。如上所述制备携带每种重组转移质粒的慢病毒，参见例如实施例7。用74种慢病毒分别感染Jurkat细胞，并且使用1μg/mL嘌呤霉素持续2周来选择阳性细胞克隆。如上所述通过FACS来考查Jurkat细胞上TCRαβ、CD4和CD28的表达，参见例如实施例1。未转导Jurkat细胞充当阴性对照。用M071(野生型SIV Nef)或M116(SIV Nef M116，参见实施例6)转导的Jurkat细胞充当阳性对照。将至少3％调控考虑为关于进一步评估SIV Nef突变体调控TCRαβ、CD4和CD28表达的作用的截断值。举例来说，如果突变SIV Nef对TCRαβ的下调水平与由野生型SIV Nef进行的下调水平相差在0％(包括0％)与小于3％之间，或如果相较于由野生型SIV Nef进行的下调，突变SIV Nef将TCRαβ下调大于(或等于)3％，那么突变SIV Nef被视为具有“相较于野生型SIV Nef是类似(或更大)的TCRαβ下调”。如果相较于由野生型SIV Nef进行的下调，突变SIV Nef将CD4(和/或CD28)下调小于3％，那么这种突变SIV Nef被视为具有“相较于野生型SIV Nef是较小的CD4下调”(以及/或者“相较于野生型SIV Nef是较小的CD28下调”)。
如图13A至图13C中所示，关于相较于野生型SIV Nef(M071)，74种SIV Nef突变体调控TCRαβ、CD4和CD28表达的能力来并行地对它们进行了筛选。突变位置和它们的相应功能列于表10中。这个筛选实验产生了具有不同调控功能的SIV Nef突变体的各种集合。相较于野生型SIV Nef(M071)，34种SIV Nef突变体维持对TCRαβ表达的下调作用。在这些突变体之中，18种突变体相较于野生型SIV Nef还显示较小CD4下调，19种突变体相较于野生型SIVNef还显示较小CD28下调，并且发现16种突变体不仅维持野生型SIV Nef(M071)的TCRαβ下调作用，而且相较于野生型SIV Nef(M071)还具有较小CD4和CD28下调作用。对于详细概述，参见表11。
表10.SIV Nef突变体相较于野生型SIV Nef(M071)的调控作用
表11.SIV Nef氨基酸突变位点对TCRαβ、CD4和CD8表达的影响的概述
序列表
SEQ ID NO:1(野生型SIV Nef核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:2(HIV1 Nef核酸序列)
ATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTACTGTAAGGGAAAGAATGAGACGAGCTGAGCCAGCAGCAGATAGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTGGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGCTTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTgGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGATAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGC
SEQ ID NO:3(HIV2 Nef核酸序列)
ATGGGTGCGAGTGGATCCAAGAAGCTTTCCAAGCATTCGCGAGGACTACGAGAGAGACTCTTGCGGGCGCGTGGGGATGGTTATGGGAAGCAGCGCGACGCATCGGGAGGGGAATACTCGCAGTTCCAAGAAGAATCAGGCAGGGAGCAGAACTCGCCCTCCTGTGAGGGACAGCAGTATCAGCAGGGAGAGTACATGAACAGCCCATGGAGAAACCCAGCAACAGAAAGACAGAAAGATTTGTATAGGCAGCAAAATATGGATGATGTAGATTCTGATGATGATGACCTAATAGGAGTTCCTGTTACACCAAGAGTACCACGGAGAGAAATGACCTATAAATTGGCAATAGATATGTCACATTTTATAAAAGAAAAAGGGGGACTGCAAGGGATGTTTTACAGTAGGAGGAGACATAGAATCCTAGACATATACCTAGAAAAAGAGGAAGGGATAATACCAGATTGGCAGAATTATACTCATGGGCCAGGAGTAAGGTACCCAATGTACTTCGGGTGGCTGTGGAAGCTAGTATCAGTAGAACTCTCACAAGAGGCAGAGGAAGATGAGGCCAACTGCTTAGTACACCCAGCACAAACAAGCAGACATGATGATGAGCATGGGGAGACATTAGTGTGGCAGTTTGACTCCATGCTGGCCTATAACTACAAGGCCTTCACTCTGTACCCAGAAGAGTTTGGGCACAAGTCAGGATTGCCAGAGAAAGAATGGAAGGCAAAACTGAAAGCAAGAGGGATACCATATAGTGAA
SEQ ID NO:4(HIV F2-Nef核酸序列)
ATGGGTGGCAAGTGGTCAAAATGCAGCATAGTTGGATGGCCTGATATAAGAGAGAGAATGAGACGAACTGAGCCAGCAGCAGAGCCAGCAGCAGAAGGAGTAGGAGCAGCGTCTCAAGACTTAGATAAACATGGAGCACTTACAAGTAGCAACACAAACACCACTAATGCTGATTGTGCTTGGCCGGAAGCGCAAGAGGATGAAGGAGAAGTAGGCTTTGCAGTCAGACCTCAGAGTCCTTTAAGACCAATGACTTATAAGGGAGCATTTGATCTCGGCTTCTTTTTAAAAGAAGGGGGACTGGAAGGGTTAATTTACTCTAAGAAAAGGCAAGAGATCCTTGATTTGTGGGTCTATCATACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAAAACTACACACCGGGACCAGGGGTCAGATACCCACTGACTTTTGGGTGGTGCTTCAAGCTGGTACCAGTTGACCCAAAGGCAGTAGAAGAGGCCAACGAAGGAGAAGACAACTGTCTGCTACACCCAGTGTGCCAGCATGGAATGGAGGATGAACACAGAGAAGTATTAATGTGGAAGTTTGACAGTCAACTAGCACGCAGACACATGGCCCGAGAGCTACATCCGGAGTTCTACAAAGACTGC
SEQ ID NO:5(HIV C2-Nef核酸序列)
ATGGGTGGCAAGTGGTCAAAATGCAGCATAGGTGGATGGCCTCAGATAAGAGAGAGAATGAGACGAACTGAGCCAGCAGTAGAGCCAGCAGCAGAGCCAGCAGCAGAAGGAGTAGGAGCAGCGTGGCTACTTCCTGATTGGCAAAACTACACACCGGGACCAGGAGTCAGATACCCACTGACTTTTGGGTGGTGCTTCAAGCTGGTACCAGTAGACCCAGGGGCAGTAGAAGAGGCCAACGAAGGAGAAAACAACTGTTTGCTACACCCGGTGTGCCAGCATGGAATGGAGGATGAGCAAAGAGAAGTATTAGTGTGCAAGTTTGACAGTCTACTAGCACGCAGACACATGGCCCGCGAGCTACATCCGGAGTTCTACAAAGACTGC
SEQ ID NO:6(HIV HV2NZ-Nef核酸序列)
ATGGGTGCGAGTGGATCCAAGAAGCGTTCCAAGCCCTTGCAAGGACTACAAGAGAGACTCTTGCAGGCGCGGGGAGAGACTTGTGGAGGGCGCTGCAACGAATCGGGAGGGGGATACTTGCAGTCCCACGAAGGATCAGGCAGGGAGCAGAACTCGCCCTCCTGTGAGGGACAGCGATATCAGCAGGGAGATTTTGTAAATACCCCATGGAGAACCCCAGCAGCAGAAAGGGAGAAAGAATTGTACAAACAGCAAAATATGGATGATGTAGATCTAGATGATGATGACCAAGTAGGATTCCCTGTCACACCAAGAGTACCATTAAGACCAATGACATTCAAATTGGCAGTAGATATGTCTCATTTTATAAAAGAAAAAGGGGGACTGGAAGGGCTGTTTTATAGTCAGAGAAGACATAGAATCTTAGACTTATACTTAGACAAGGCTTTTACTCTGTACCCAGAGGAATTTGGGCATAATTCAGGACTGCCAGAGAAAGAGTGGAAGGCGAGACTGAAAGCAAGGGGAATACCATTTAGT
SEQ ID NO:7(SIV Nef突变体1/SIV Nef M116核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:8(SIV Nef突变体2核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAgctgcaGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:9(SIV Nef突变体3核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAgctgcaGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGcatcacAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGgcggcaCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:10(SIV Nef突变体4核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGcatcacAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGgcggcaCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:11(SIV Nef突变体5核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGgcggcaCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGC
SEQ ID NO:12(野生型SIV Nef氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSERREKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEARNCERHCLMHPAQMGEDPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:13(HIV1 Nef氨基酸序列)
MGGKWSKSSVIGWPTVRERMRRAEPAADRVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKIEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC
SEQ ID NO:14(HIV2 Nef氨基酸序列)
MGASGSKKLSKHSRGLRERLLRARGDGYGKQRDASGGEYSQFQEESGREQNSPSCEGQQYQQGEYMNSPWRNPATERQKDLYRQQNMDDVDSDDDDLIGVPVTPRVPRREMTYKLAIDMSHFIKEKGGLQGMFYSRRRHRILDIYLEKEEGIIPDWQNYTHGPGVRYPMYFGWLWKLVSVELSQEAEEDEANCLVHPAQTSRHDDEHGETLVWQFDSMLAYNYKAFTLYPEEFGHKSGLPEKEWKAKLKARGIPYSE
SEQ ID NO:15(HIV F2-Nef氨基酸序列)
MGGKWSKCSIVGWPDIRERMRRTEPAAEPAAEGVGAASQDLDKHGALTSSNTNTTNADCAWPEAQEDEGEVGFAVRPQSPLRPMTYKGAFDLGFFLKEGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCFKLVPVDPKAVEEANEGEDNCLLHPVCQHGMEDEHREVLMWKFDSQLARRHMARELHPEFYKDC
SEQ ID NO:16(HIV C2-Nef氨基酸序列)
MGGKWSKCSIGGWPQIRERMRRTEPAVEPAAEPAAEGVGAAWLLPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCFKLVPVDPGAVEEANEGENNCLLHPVCQHGMEDEQREVLVCKFDSLLARRHMARELHPEFYKDC
SEQ ID NO:17(HIV HV2NZ-Nef氨基酸序列)
MGASGSKKRSKPLQGLQERLLQARGETCGGRCNESGGGYLQSHEGSGREQNSPSCEGQRYQQGDFVNTPWRTPAAEREKELYKQQNMDDVDLDDDDQVGFPVTPRVPLRPMTFKLAVDMSHFIKEKGGLEGLFYSQRRHRILDLYLDKAFTLYPEEFGHNSGLPEKEWKARLKARGIPFS
SEQ ID NO:18(SIV Nef突变体1/SIV Nef M116氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSERREKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEARNCERHCAAHPAQMGEDPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:19(SIV Nef突变体2氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSEAAEKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEARNCERHCAAHPAQMGEDPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:20(SIV Nef突变体3氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSEAAEKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEHHNCERHCAAHPAQMGAAPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:21(SIV Nef突变体4氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSERREKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEHHNCERHCAAHPAQMGAAPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:22(SIV Nef突变体5氨基酸序列)
MGSSNSKRQQQGLLKLWRGLRGKPGADWVLLSDPLIGQSSTVQEECGKALKKSWGKGKMTPDGRRLQEGDTFDEWDDDEEEVGFPVQPRVPLRQMTYKLAVDFSHFLKSKGGLDGIYYSERREKILNLYALNEWGIIDDWQAYSPGPGIRYPRVFGFCFKLVPVDLHEEARNCERHCAAHPAQMGAAPDGIDHGEVLVWKFDPKLAVEYRPDMFKDMHEHAKR
SEQ ID NO:23(gRNA核酸序列)
GAGAATCAAAATCGGTGAAT
SEQ ID NO:24(SIV Nef-P2A-LNGFR核酸序列；SIV Nef序列用粗体表示，P2A序列加下划线，LNGFR序列用斜体表示，限制位点呈小写形式)
SEQ ID NO:25(HIV1 Nef-T2A-Puro核酸序列；HIV1 Nef序列用粗体表示，T2A序列加下划线，Puro序列用斜体表示，限制位点呈小写形式)
SEQ ID NO:26(HIV2 Nef-T2A-Puro核酸序列；HIV1 Nef序列用粗体表示，T2A序列加下划线，Puro序列用斜体表示，限制位点呈小写形式)
SEQ ID NO:27(SIV Nef-P2A-LNGFR氨基酸序列；SIV Nef序列用粗体表示，P2A序列加下划线，LNGFR序列用斜体表示，限制位点用灰色表示)
SEQ ID NO:28(HIV1 Nef-T2A-Puro氨基酸序列；HIV1 Nef序列用粗体表示，T2A序列加下划线，Puro序列用斜体表示，限制位点用灰色表示)
SEQ ID NO:29(HIV2 Nef-T2A-Puro氨基酸序列；HIV2 Nef序列用粗体表示，T2A序列加下划线，Puro序列用斜体表示，限制位点用灰色表示)
SEQ ID NO:30(P2A核酸序列)
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
SEQ ID NO:31(T2A核酸序列)
GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA
SEQ ID NO:32(E2A核酸序列)
GGAAGCGGACAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCTGGACCT
SEQ ID NO:33(F2A核酸序列)
GGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCT
SEQ ID NO:34(IRES核酸序列)
GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACA
SEQ ID NO:35(PGK核酸序列)
GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCTTACC
SEQ ID NO:36(P2A氨基酸序列)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:37(T2A氨基酸序列)
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:38(E2A氨基酸序列)
GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:39(F2A氨基酸序列)
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:40(接头氨基酸序列)
GGGGS
SEQ ID NO:41(接头氨基酸序列)
(GGGGS)2
SEQ ID NO:42(接头氨基酸序列)
(GGGS)3
SEQ ID NO:43(接头氨基酸序列)
(GGGS)4
SEQ ID NO:44(接头氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS
SEQ ID NO:45(接头氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:46(接头氨基酸序列)
(GGGGS)3
SEQ ID NO:47(接头氨基酸序列)
(GGGGS)4
SEQ ID NO:48(M167，SIV Nef-IRES-CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccATGGCCCTGCCAGTGACCGCCTTGCTCCTTCCCCTGGCTCTTCTGCTGCACGCTGCTAGACCTCAGGTGCAGCTTCAGCAGCCTGGCGCTGAGCTGGTGAAGCCCGGAGCTAGCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTATACCTTCACCTCATACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGCCTCGAGTGGATTGGAGCTATCTACCCTGGAAACGGAGACACCAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCTACCCTGACCGCTGACAAGAGCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCAGCCTTACAAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCACCTATTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTTAGCGCCGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGCGGCGGCGGCGGCTCCCAGATCGTGCTGTCTCAGAGCCCCGCTATCTTGAGCGCCTCCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACTTGCAGAGCTAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAACAGAAGCCAGGCAGCTCCCCTAAGCCTTGGATCTACGCTACCAGCAACCTTGCCTCAGGCGTTCCCGTGAGATTCTCTGGATCTGGAAGCGGCACATCCTACTCCCTGACCATCTCCCGGGTCGAGGCTGAGGACGCTGCTACTTACTACTGCCAGCAGTGGACTAGCAACCCCCCCACATTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAGATCAAGactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:49(M168，SIV Nef-IRES-CD20 scFv(Leu-16)CAR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccATGGCCCTGCCAGTGACCGCCTTGCTCCTTCCCCTGGCTCTTCTGCTGCACGCTGCTAGACCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTATAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCTGGAAACGGAGACACCTCATACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCTACCCTGACCGCTGACAAGAGCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCACTGACCAGCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCCAGAAGCAACTACTACGGAAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGTCAAGCGGCGGCGGAGGcTCCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCTATCCTGTCTGCCAGCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCTAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGAAAAAGCCCGGCAGCTCACCTAAGCCTTGGATCTACGCTACCAGCAACTTAGCCAGCGGCGTGCCTGCTAGATTCTCCGGAAGCGGCTCTGGAACCAGCTACTCCCTTACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCTTCAACCCTCCTACCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAGactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:50(M169，SIV Nef-IRES-CD19×CD20 scFv CAR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccATGGCCCTGCCTGTCACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCAAGACCTGAAGTCCAGCTGCAGCAGTCCGGGGCAGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCCTATAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGAGCAATCTACCCAGGCAACGGCGACACAAGCTATAATCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGCCGATAAGAGCTCCTCTACCGCCTACATGCAGCTGAGCTCCCTGACAAGCGAGGACTCCGCCGATTACTATTGCGCCCGGTCCAATTACTATGGCTCTAGCTACTGGTTCTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCTCTGATATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCAATCCTGTCCGCCTCTCCAGGAGAGAAGGTGACCATGACATGTCGGGCCAGCTCCTCTGTGAACTACATGGACTGGTATCAGAAGAAGCCCGGCAGCTCCCCTAAGCCATGGATCTACGCCACCTCCAATCTGGCATCTGGAGTGCCTGCAAGGTTCAGCGGcTCCGGATCTGGCACCAGCTATTCCCTGACAATCTCTCGCGTGGAGGCAGAGGATGCAGCAACCTACTATTGCCAGCAGTGGAGCTTCAACCCCCCTACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGGAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGACCACATCTAGCCTGTCTGCCAGCCTGGGCGACAGGGTGACAATCAGCTGTCGCGCCTCCCAGGATATCTCTAAGTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGATGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACAAGCCGGCTGCACTCCGGAGTGCCAAGCCGGTTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTATAGCCTGACAATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTATACATTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAGATCACCGGCTCCACATCTGGAAGCGGCAAGCCAGGATCTGGAGAGGGAAGCACCAAGGGAGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCAGGCCTGGTGGCACCTTCCCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTGTCTGGCGTGAGCCTGCCTGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCAAGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACATACTATAACTCCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGATAACTCCAAGTCTCAGGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACCGACGATACAGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTATGGAGGCAGTTATGCTATGGACTATTGGGGGCAGGGCACAAGCGTCACCGTCTCATCAactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:51(M170，SIV Nef-IRES-CD19 scFv CAR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccATGGCCCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCTGCTAGACCTGATATTCAGATGACCCAGACCACTAGCTCCCTGTCCGCCTCTCTGGGCGACAGAGTGACAATCAGCTGCAGGGCCTCCCAGGATATCTCTAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGACGGCACAGTGAAGCTGCTGATCTATCACACCAGCCGCCTGCACTCCGGAGTGCCATCTCGGTTCAGCGGcTCCGGATCTGGCACAGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATCGCCACCTATTTCTGCCAGCAGGGCAATACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACCGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGACCTGGCCTGGTGGCACCAAGCCAGTCCCTGTCTGTGACATGTACCGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCTGATTACGGCGTGTCTTGGATCAGGCAGCCACCTAGGAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACATACTATAATTCTGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGTCCCAGGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACAGACGATACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCAGCTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACATCCGTGACCGTGTCTAGCactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:52(M171，SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR1核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccatggctctgcccgtcaccgctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgctgctcgccctcaggtcaaactggaagaatctggcggaggcctggtgcaggcaggacggagcctgcgcctgagctgcgcagcatccgagcacaccttcagctcccacgtgatgggctggtttcggcaggccccaggcaaggagagagagagcgtggccgtgatcggctggagggacatctccacatcttacgccgattccgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaagacactgtatctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactattgcgcagcaaggagaatcgacgcagcagactttgattcctggggccagggcacccaggtgacagtgtctagcggaggaggaggatctgaggtgcagctggtggagagcggaggcggcctggtgcaggccggaggctctctgaggctgagctgtgcagcatccggaagaaccttcacaatgggctggtttaggcaggcaccaggaaaggagagggagttcgtggcagcaatcagcctgtcccctaccctggcctactatgccgagagcgtgaagggcaggtttaccatctcccgcgataacgccaagaatacagtggtgctgcagatgaactccctgaaacctgaggacacagccctgtactattgtgccgccgatcggaagagcgtgatgagcattagaccagactattgggggcagggaacacaggtgaccgtgagcagcactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagct.gccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:53(M172，SIV Nef-IRES-BCMA BiVHH CAR2核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccATGGCTCTGCCCGTCACCGCACTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCTGCTCGCCCTCAGGTCAAACTGGAAGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGCAGGCAGGCAGGTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGAGCACACCTTTAGCTCCCACGTGATGGGATGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGTCCGTGGCCGTGATCGGCTGGAGGGACATCTCCACATCTTACGCCGATTCTGTGAAGGGCCGGTTTACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAAGACACTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCAGCAAGGAGAATCGATGCAGCAGACTTCGATTCCTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGAAGCGCCGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGGCCGGCGATTCTCTGCGGCTGACCTGTACAGCCTCCGGCAGAGCCTTCTCTACCTACTTTATGGCCTGGTTTAGACAGGCCCCTGGCAAGGAGAGGGAGTTTGTGGCAGGAATCGCATGGAGCGGAGGcTCCACAGCATACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCTCGCGATAACGCCAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGCCGGGGAATCGAGGTGGAGGAATTTGGGGCTTGGGGGCAGGGAACTCAGGTGACCGTCTCATCAactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:54(M173，SIV Nef-IRES-BCMA单VHH CAR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTCTGATGCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccgccaccatggctctgcccgtcaccgctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgctgctcgccctcaggtcaaactggaagaatctggcggaggcctggtgcaggcaggacggagcctgcgcctgagctgcgcagcatccgagcacaccttcagctcccacgtgatgggctggtttcggcaggccccaggcaaggagagagagagcgtggccgtgatcggctggagggacatctccacatcttacgccgattccgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaagacactgtatctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactattgcgcagcaaggagaatcgacgcagcagactttgattcctggggccagggcacccaggtgacagtgtctagcactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO:55(抗CD20 scFv(利妥昔单抗)CAR氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:56(抗CD20 scFv(Leu-16)CAR氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:57(CD19×CD20 scFv CAR氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:58(抗CD19 scFv CAR氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:59(抗BCMA BiVHH CAR1氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFTMGWFRQAPGKEREFVAAISLSPTLAYYAESVKGRFTISRDNAKNTVVLQMNSLKPEDTALYYCAADRKSVMSIRPDYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:60(抗BCMA BiVHH CAR2氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSGGGGSAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:61(抗BCMA单VHH CAR氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVKLEESGGGLVQAGRSLRLSCAASEHTFSSHVMGWFRQAPGKERESVAVIGWRDISTSYADSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAARRIDAADFDSWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:62(M133，BCMA BiVHH CAR1-IRES-SIV Nef M116核酸序列)
gccgccaccatggctctgcccgtcaccgctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgctgctcgccctcaggtcaaactggaagaatctggcggaggcctggtgcaggcaggacggagcctgcgcctgagctgcgcagcatccgagcacaccttcagctcccacgtgatgggctggtttcggcaggccccaggcaaggagagagagagcgtggccgtgatcggctggagggacatctccacatcttacgccgattccgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaagacactgtatctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactattgcgcagcaaggagaatcgacgcagcagactttgattcctggggccagggcacccaggtgacagtgtctagcggaggaggaggatctgaggtgcagctggtggagagcggaggcggcctggtgcaggccggaggctctctgaggctgagctgtgcagcatccggaagaaccttcacaatgggctggtttaggcaggcaccaggaaaggagagggagttcgtggcagcaatcagcctgtcccctaccctggcctactatgccgagagcgtgaagggcaggtttaccatctcccgcgataacgccaagaatacagtggtgctgcagatgaactccctgaaacctgaggacacagccctgtactattgtgccgccgatcggaagagcgtgatgagcattagaccagactattgggggcagggaacacaggtgaccgtgagcagcactagtaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactggttaacagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAggatccgccaccATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtaa
SEQ ID NO:63(M572，SIV Nef M116-IRES-CD20嵌合TCR核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGgatccgccgccaccatgcagtctggaacccactggagggtgctgggactgtgcctgctgagcgtgggcgtgtggggacagGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTATAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCTGGAAACGGAGACACCTCATACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCTACCCTGACCGCTGACAAGAGCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCACTGACCAGCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCCAGAAGCAACTACTACGGAAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGTCAAGCGGCGGCGGAGGcTCCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCTATCCTGTCTGCCAGCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCTAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGAAAAAGCCCGGCAGCTCACCTAAGCCTTGGATCTACGCTACCAGCAACTTAGCCAGCGGCGTGCCTGCTAGATTCTCCGGAAGCGGCTCTGGAACCAGCTACTCCCTTACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCTTCAACCCTCCTACCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAGactagtGGCGGCGGAGGCTCTGGCGGCGGAGGAAGCGGCGGCGGCGGCTCCgatggcaacgaggagatgggcggcatcacccagacaccctacaaggtgtccatctctggcaccacagtgatcctgacctgtccacagtatcccggctctgagatcctgtggcagcacaacgacaagaatatcggcggcgatgaggacgataagaatatcggcagcgacgaggatcacctgtctctgaaggagttcagcgagctggagcagtccggctactacgtgtgctaccctcggggctccaagccagaggacgccaacttttacctgtatctgcgggccagagtgtgcgagaattgtatggagatggacgtgatgtccgtggccaccatcgtgatcgtggatatctgtatcacaggcggcctgctgctgctggtgtactattggagcaagaaccggaaggccaaggccaagcctgtgaccagaggagcaggagcaggaggcaggcagaggggacagaacaaggagaggccacctccagtgcccaatcctgactacgagccaatcaggaagggccagcgcgatctgtatagcggcctgaatcagaggcgcatctgataa
SEQ ID NO:64(抗CD20嵌合TCR氨基酸序列；CD3ε([无信号肽]细胞外-螺旋-细胞质)氨基酸序列加下划线)
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKTSGGGGSGGGGSGGGGSDGNEEMGGITQTPYKVSI SGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRAR VCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKG QRDLYSGLNQRRI
SEQ ID NO:65(M574，SIV Nef M116-IRES-CD20 TAC核酸序列)
ATGGGCTCCAGCAACTCCAAGAGGCAGCAACAGGGCTTGCTCAAGCTCTGGCGAGGGCTGCGAGGGAAGCCTGGGGCAGACTGGGTGCTATTGTCCGATCCGCTTATCGGGCAGTCATCAACAGTCCAAGAAGAGTGCGGCAAGGCCTTGAAAAAGTCCTGGGGTAAAGGTAAAATGACTCCAGACGGCCGCCGCCTGCAAGAAGGAGACACCTTTGATGAGTGGGATGATGATGAAGAAGAAGTAGGCTTCCCTGTGCAACCTCGAGTCCCCTTAAGACAGATGACCTATAAATTAGCAGTGGACTTTTCCCACTTTTTAAAATCAAAGGGGGGACTGGATGGGATATATTACTCTGAAAGAAGAGAAAAGATCCTGAATTTGTATGCCTTGAACGAGTGGGGAATAATAGATGATTGGCAAGCTTACTCACCAGGCCCGGGGATAAGGTACCCGAGAGTCTTTGGCTTCTGCTTTAAGCTAGTCCCAGTGGACCTGCATGAGGAGGCACGCAACTGTGAGAGACACTGTgctgcaCATCCAGCACAGATGGGGGAAGATCCTGATGGAATAGATCATGGAGAAGTCTTGGTCTGGAAGTTTGACCCGAAGTTGGCGGTGGAGTACCGCCCGGACATGTTTAAGGACATGCACGAACATGCAAAGCGCtgaacgcgtGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAGGATCCgccgccaccatgcagtctggaacccactggagggtgctgggactgtgcctgctgagcgtgggcgtgtggggacagGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTATAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCTGGAAACGGAGACACCTCATACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCTACCCTGACCGCTGACAAGAGCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCACTGACCAGCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCCAGAAGCAACTACTACGGAAGCAGCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGTCAAGCGGCGGCGGAGGcTCCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCTATCCTGTCTGCCAGCCCTGGAGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCTAGCAGCAGCGTGAACTACATGGACTGGTATCAGAAAAAGCCCGGCAGCTCACCTAAGCCTTGGATCTACGCTACCAGCAACTTAGCCAGCGGCGTGCCTGCTAGATTCTCCGGAAGCGGCTCTGGAACCAGCTACTCCCTTACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCTTCAACCCTCCTACCTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAGactagtggcggcggcggctctggaggaggaggcagcggcggcggaggctccggcggcggcggctctatggacattcagatgacccagtccccaagctccctgtctgccagcgtgggagacagagtgaccatcacatgcagggccagccaggatatccgcaactatctgaattggtatcagcagaaacccggcaaggcccctaagctgctgatctattacaccagcaggctggagtccggagtgccatcaagattctccggctctggcagcggaaccgactacaccctgacaatctctagcctgcagccagaggatttcgccacatattactgccagcagggcaacaccctgccctggacatttggccagggcaccaaggtggagatcaagggaggaggaggcagcgggggcggcggctccggaggaggcggctctgaggtgcagctggtggagagcggaggaggactggtgcagcctggaggcagcctgcggctgtcctgtgccgccagcggctattccttcaccggctacacaatgaattgggtcagacaggcaccaggaaagggactggagtgggtggccctgatcaaccctaccaagggcgtgtccacatataatcagaagttcaaggacaggtttaccatctctgtggataagagcaagaacacagcctacctgcagatgaatagcctgagggccgaggacaccgccgtgtattactgcgcacgcagcggatattacggagactccgattggtactttgacgtgtggggccagggcaccctggtgacagtgtcctccggcggaggaggcagctccggacaggtgctgctggagtccaatatcaaggtgctgccaacctggtctacacctgtgcagccaatggcactgatcgtgctgggaggagtggcaggactgctgctgttcatcggactgggcatcttcttttgcgtgcgctgtaggcaccggagaaggcaggcagagaggatgtctcagatcaagagactgctgagcgagaagaagacctgccagtgtcctcaccgctttcagaagacatgtagcccaatctgataa
SEQ ID NO:66(抗CD20 TAC氨基酸序列；CD4(部分细胞外-螺旋-细胞质)氨基酸序列加下划线)
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPTKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTC QCPHRFQKTCSPI
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司(Nanjing Legend Biotech Co., Ltd.)
<120> 含有NEF的T细胞及其产生方法
<130> 76142-20017.41
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> PCT/CN2018/097235
<151> 2018-07-26
<160> 66
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)
<400> 1
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 2
<211> 618
<212> DNA
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 2
atgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg attggatggc ctactgtaag ggaaagaatg 60
agacgagctg agccagcagc agatagggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat 120
ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg cttgtgcctg gctagaagca 180
caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 240
tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 300
attcactccc aaagaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 360
ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420
tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataagatag aagaggccaa taaaggagag 480
aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagtg 540
ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600
gagtacttca agaactgc 618
<210> 3
<211> 771
<212> DNA
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 3
atgggtgcga gtggatccaa gaagctttcc aagcattcgc gaggactacg agagagactc 60
ttgcgggcgc gtggggatgg ttatgggaag cagcgcgacg catcgggagg ggaatactcg 120
cagttccaag aagaatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcagtat 180
cagcagggag agtacatgaa cagcccatgg agaaacccag caacagaaag acagaaagat 240
ttgtataggc agcaaaatat ggatgatgta gattctgatg atgatgacct aataggagtt 300
cctgttacac caagagtacc acggagagaa atgacctata aattggcaat agatatgtca 360
cattttataa aagaaaaagg gggactgcaa gggatgtttt acagtaggag gagacataga 420
atcctagaca tatacctaga aaaagaggaa gggataatac cagattggca gaattatact 480
catgggccag gagtaaggta cccaatgtac ttcgggtggc tgtggaagct agtatcagta 540
gaactctcac aagaggcaga ggaagatgag gccaactgct tagtacaccc agcacaaaca 600
agcagacatg atgatgagca tggggagaca ttagtgtggc agtttgactc catgctggcc 660
tataactaca aggccttcac tctgtaccca gaagagtttg ggcacaagtc aggattgcca 720
gagaaagaat ggaaggcaaa actgaaagca agagggatac catatagtga a 771
<210> 4
<211> 630
<212> DNA
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 4
atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata gttggatggc ctgatataag agagagaatg 60
agacgaactg agccagcagc agagccagca gcagaaggag taggagcagc gtctcaagac 120
ttagataaac atggagcact tacaagtagc aacacaaaca ccactaatgc tgattgtgct 180
tggccggaag cgcaagagga tgaaggagaa gtaggctttg cagtcagacc tcagagtcct 240
ttaagaccaa tgacttataa gggagcattt gatctcggct tctttttaaa agaaggggga 300
ctggaagggt taatttactc taagaaaagg caagagatcc ttgatttgtg ggtctatcat 360
acacaaggct acttccctga ttggcaaaac tacacaccgg gaccaggggt cagataccca 420
ctgacttttg ggtggtgctt caagctggta ccagttgacc caaaggcagt agaagaggcc 480
aacgaaggag aagacaactg tctgctacac ccagtgtgcc agcatggaat ggaggatgaa 540
cacagagaag tattaatgtg gaagtttgac agtcaactag cacgcagaca catggcccga 600
gagctacatc cggagttcta caaagactgc 630
<210> 5
<211> 387
<212> DNA
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 5
atgggtggca agtggtcaaa atgcagcata ggtggatggc ctcagataag agagagaatg 60
agacgaactg agccagcagt agagccagca gcagagccag cagcagaagg agtaggagca 120
gcgtggctac ttcctgattg gcaaaactac acaccgggac caggagtcag atacccactg 180
acttttgggt ggtgcttcaa gctggtacca gtagacccag gggcagtaga agaggccaac 240
gaaggagaaa acaactgttt gctacacccg gtgtgccagc atggaatgga ggatgagcaa 300
agagaagtat tagtgtgcaa gtttgacagt ctactagcac gcagacacat ggcccgcgag 360
ctacatccgg agttctacaa agactgc 387
<210> 6
<211> 540
<212> DNA
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 6
atgggtgcga gtggatccaa gaagcgttcc aagcccttgc aaggactaca agagagactc 60
ttgcaggcgc ggggagagac ttgtggaggg cgctgcaacg aatcgggagg gggatacttg 120
cagtcccacg aaggatcagg cagggagcag aactcgccct cctgtgaggg acagcgatat 180
cagcagggag attttgtaaa taccccatgg agaaccccag cagcagaaag ggagaaagaa 240
ttgtacaaac agcaaaatat ggatgatgta gatctagatg atgatgacca agtaggattc 300
cctgtcacac caagagtacc attaagacca atgacattca aattggcagt agatatgtct 360
cattttataa aagaaaaagg gggactggaa gggctgtttt atagtcagag aagacataga 420
atcttagact tatacttaga caaggctttt actctgtacc cagaggaatt tgggcataat 480
tcaggactgc cagagaaaga gtggaaggcg agactgaaag caaggggaat accatttagt 540
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 8
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 9
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
gctgcagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggagcat cacaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 10
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
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cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
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gcaaagcgc 669
<210> 11
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggcggc acctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgc 669
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> 猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus)
<400> 12
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Leu Met His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 13
<211> 206
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 13
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Ile Gly Trp Pro Thr Val
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Arg Val Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu
50 55 60
Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly
85 90 95
Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr
115 120 125
Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys
130 135 140
Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Ile Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu
145 150 155 160
Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro
165 170 175
Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His
180 185 190
His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys
195 200 205
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<211> 257
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 14
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1 5 10 15
Arg Glu Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Gly Lys Gln Arg
20 25 30
Asp Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Ser Gln Phe Gln Glu Glu Ser Gly Arg
35 40 45
Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Gln Tyr Gln Gln Gly Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Asp Asp Asp Asp
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Leu Ile Gly Val Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Arg Arg Glu Met Thr
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115 120 125
Leu Gln Gly Met Phe Tyr Ser Arg Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile
130 135 140
Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr
145 150 155 160
His Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu Trp Lys
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180 185 190
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195 200 205
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Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Lys Ser Gly Leu Pro
225 230 235 240
Glu Lys Glu Trp Lys Ala Lys Leu Lys Ala Arg Gly Ile Pro Tyr Ser
245 250 255
Glu
<210> 15
<211> 210
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 15
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Ile Val Gly Trp Pro Asp Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Thr Glu Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Glu
20 25 30
Gly Val Gly Ala Ala Ser Gln Asp Leu Asp Lys His Gly Ala Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Asn Thr Asn Thr Thr Asn Ala Asp Cys Ala Trp Pro Glu Ala
50 55 60
Gln Glu Asp Glu Gly Glu Val Gly Phe Ala Val Arg Pro Gln Ser Pro
65 70 75 80
Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Phe Asp Leu Gly Phe Phe Leu
85 90 95
Lys Glu Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Lys Lys Arg Gln Glu
100 105 110
Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp
115 120 125
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly
130 135 140
Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Pro Lys Ala Val Glu Glu Ala
145 150 155 160
Asn Glu Gly Glu Asp Asn Cys Leu Leu His Pro Val Cys Gln His Gly
165 170 175
Met Glu Asp Glu His Arg Glu Val Leu Met Trp Lys Phe Asp Ser Gln
180 185 190
Leu Ala Arg Arg His Met Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe Tyr Lys
195 200 205
Asp Cys
210
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 16
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Ile Gly Gly Trp Pro Gln Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Thr Glu Pro Ala Val Glu Pro Ala Ala Glu
20 25 30
Pro Ala Ala Glu Gly Val Gly Ala Ala Trp Leu Leu Pro Asp Trp Gln
35 40 45
Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp
50 55 60
Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Pro Gly Ala Val Glu Glu Ala Asn
65 70 75 80
Glu Gly Glu Asn Asn Cys Leu Leu His Pro Val Cys Gln His Gly Met
85 90 95
Glu Asp Glu Gln Arg Glu Val Leu Val Cys Lys Phe Asp Ser Leu Leu
100 105 110
Ala Arg Arg His Met Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Phe Tyr Lys Asp
115 120 125
Cys
<210> 17
<211> 180
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)
<400> 17
Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Lys Arg Ser Lys Pro Leu Gln Gly Leu
1 5 10 15
Gln Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Cys Gly Gly Arg Cys
20 25 30
Asn Glu Ser Gly Gly Gly Tyr Leu Gln Ser His Glu Gly Ser Gly Arg
35 40 45
Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Arg Tyr Gln Gln Gly Asp
50 55 60
Phe Val Asn Thr Pro Trp Arg Thr Pro Ala Ala Glu Arg Glu Lys Glu
65 70 75 80
Leu Tyr Lys Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Asp Asp Asp
85 90 95
Gln Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
100 105 110
Phe Lys Leu Ala Val Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Phe Tyr Ser Gln Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Leu
130 135 140
Tyr Leu Asp Lys Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Asn
145 150 155 160
Ser Gly Leu Pro Glu Lys Glu Trp Lys Ala Arg Leu Lys Ala Arg Gly
165 170 175
Ile Pro Phe Ser
180
<210> 18
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 19
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Ala Ala Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 20
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Ala Ala Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu His His Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 21
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu His His Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 22
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu
1 5 10 15
Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys
35 40 45
Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg
50 55 60
Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu
65 70 75 80
Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly
100 105 110
Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu
115 120 125
Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser
130 135 140
Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His
165 170 175
Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Ala Ala Pro Asp Gly Ile Asp
180 185 190
His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu
195 200 205
Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg
210 215 220
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
gagaatcaaa atcggtgaat 20
<210> 24
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
gaattcatgg gctccagcaa ctccaagagg cagcaacagg gcttgctcaa gctctggcga 60
gggctgcgag ggaagcctgg ggcagactgg gtgctattgt ccgatccgct tatcgggcag 120
tcatcaacag tccaagaaga gtgcggcaag gccttgaaaa agtcctgggg taaaggtaaa 180
atgactccag acggccgccg cctgcaagaa ggagacacct ttgatgagtg ggatgatgat 240
gaagaagaag taggcttccc tgtgcaacct cgagtcccct taagacagat gacctataaa 300
ttagcagtgg acttttccca ctttttaaaa tcaaaggggg gactggatgg gatatattac 360
tctgaaagaa gagaaaagat cctgaatttg tatgccttga acgagtgggg aataatagat 420
gattggcaag cttactcacc aggcccgggg ataaggtacc cgagagtctt tggcttctgc 480
tttaagctag tcccagtgga cctgcatgag gaggcacgca actgtgagag acactgtctg 540
atgcatccag cacagatggg ggaagatcct gatggaatag atcatggaga agtcttggtc 600
tggaagtttg acccgaagtt ggcggtggag taccgcccgg acatgtttaa ggacatgcac 660
gaacatgcaa agcgcacgcg tggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 720
ggagacgtgg aggagaaccc tggacctgga tccatggggg caggtgccac cggccgcgcc 780
atggacgggc cgcgcctgct gctgttgctg cttctggggg tgtcccttgg aggtgccaag 840
gaggcatgcc ccacaggcct gtacacacac agcggtgagt gctgcaaagc ctgcaacctg 900
ggcgagggtg tggcccagcc ttgtggagcc aaccagaccg tgtgtgagcc ctgcctggac 960
agcgtgacgt tctccgacgt ggtgagcgcg accgagccgt gcaagccgtg caccgagtgc 1020
gtggggctcc agagcatgtc ggcgccgtgc gtggaggccg acgacgccgt gtgccgctgc 1080
gcctacggct actaccagga tgagacgact gggcgctgcg aggcgtgccg cgtgtgcgag 1140
gcgggctcgg gcctcgtgtt ctcctgccag gacaagcaga acaccgtgtg cgaggagtgc 1200
cccgacggca cgtattccga cgaggccaac cacgtggacc cgtgcctgcc ctgcaccgtg 1260
tgcgaggaca ccgagcgcca gctccgcgag tgcacacgct gggccgacgc cgagtgcgag 1320
gagatccctg gccgttggat tacacggtcc acacccccag agggctcgga cagcacagcc 1380
cccagcaccc aggagcctga ggcacctcca gaacaagacc tcatagccag cacggtggca 1440
ggtgtggtga ccacagtgat gggcagctcc cagcccgtgg tgacccgagg caccaccgac 1500
aacctcatcc ctgtctattg ctccatcctg gctgctgtgg ttgtgggcct tgtggcctac 1560
atagccttct gatctaga 1578
<210> 25
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
gaattcatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt agtgtgattg gatggcctac tgtaagggaa 60
agaatgagac gagctgagcc agcagcagat agggtgggag cagcatctcg agacctggaa 120
aaacatggag caatcacaag tagcaataca gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta 180
gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca 240
atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 300
gggctaattc actcccaaag aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa 360
ggctacttcc ctgattggca gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc 420
tttggatggt gctacaagct agtaccagtt gagccagata agatagaaga ggccaataaa 480
ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg agcctgcatg ggatggatga cccggagaga 540
gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg 600
catccggagt acttcaagaa ctgcactagt ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta 660
acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaacgcgta tgaccgagta caagcccacg 720
gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc 780
gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc 840
gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg 900
gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg 960
ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa 1020
cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc 1080
gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga 1140
gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac 1200
ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga 1260
ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgag gatcc 1305
<210> 26
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
gaattcatgg gtgcgagtgg atccaagaag ctttccaagc attcgcgagg actacgagag 60
agactcttgc gggcgcgtgg ggatggttat gggaagcagc gcgacgcatc gggaggggaa 120
tactcgcagt tccaagaaga atcaggcagg gagcagaact cgccctcctg tgagggacag 180
cagtatcagc agggagagta catgaacagc ccatggagaa acccagcaac agaaagacag 240
aaagatttgt ataggcagca aaatatggat gatgtagatt ctgatgatga tgacctaata 300
ggagttcctg ttacaccaag agtaccacgg agagaaatga cctataaatt ggcaatagat 360
atgtcacatt ttataaaaga aaaaggggga ctgcaaggga tgttttacag taggaggaga 420
catagaatcc tagacatata cctagaaaaa gaggaaggga taataccaga ttggcagaat 480
tatactcatg ggccaggagt aaggtaccca atgtacttcg ggtggctgtg gaagctagta 540
tcagtagaac tctcacaaga ggcagaggaa gatgaggcca actgcttagt acacccagca 600
caaacaagca gacatgatga tgagcatggg gagacattag tgtggcagtt tgactccatg 660
ctggcctata actacaaggc cttcactctg tacccagaag agtttgggca caagtcagga 720
ttgccagaga aagaatggaa ggcaaaactg aaagcaagag ggataccata tagtgaaact 780
agtggcagtg gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct 840
ggcccaacgc gtatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 900
cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 960
gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 1020
gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 1080
accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 1140
gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 1200
cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 1260
aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 1320
cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 1380
accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 1440
cccggtgcct gaggatcc 1458
<210> 27
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Phe Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu
20 25 30
Leu Ser Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys
35 40 45
Gly Lys Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp
50 55 60
Gly Arg Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp
65 70 75 80
Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln
85 90 95
Met Thr Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys
100 105 110
Gly Gly Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu
115 120 125
Asn Leu Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala
130 135 140
Tyr Ser Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys
145 150 155 160
Phe Lys Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu
165 170 175
Arg His Cys Leu Met His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly
180 185 190
Ile Asp His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala
195 200 205
Val Glu Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys
210 215 220
Arg Thr Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
225 230 235 240
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gly Ser Met Gly Ala Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
260 265 270
Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr
275 280 285
Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val
290 295 300
Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp
305 310 315 320
Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro
325 330 335
Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu
340 345 350
Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu
355 360 365
Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly
370 375 380
Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys
385 390 395 400
Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu
405 410 415
Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr
420 425 430
Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr
435 440 445
Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln
450 455 460
Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala
465 470 475 480
Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg
485 490 495
Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala
500 505 510
Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe Ser Arg
515 520 525
<210> 28
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Glu Phe Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Ile Gly Trp Pro
1 5 10 15
Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Arg Val
20 25 30
Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser
35 40 45
Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu
50 55 60
Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro
65 70 75 80
Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu
100 105 110
Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn
115 120 125
Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys
130 135 140
Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Ile Glu Glu Ala Asn Lys
145 150 155 160
Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp
165 170 175
Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala
180 185 190
Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys
195 200 205
Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
210 215 220
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr
225 230 235 240
Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu
245 250 255
Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala Thr Arg His Thr Val Asp Pro
260 265 270
Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr
275 280 285
Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala
290 295 300
Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu Ser Val Glu Ala Gly Ala Val
305 310 315 320
Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu
325 330 335
Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu Leu Ala Pro His Arg Pro Lys
340 345 350
Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val Gly Val Ser Pro Asp His Gln
355 360 365
Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala
370 375 380
Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn
385 390 395 400
Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe Thr Val Thr Ala Asp Val Glu
405 410 415
Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala
420 425 430
Gly Ser
<210> 29
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Glu Phe Met Gly Ala Ser Gly Ser Lys Lys Leu Ser Lys His Ser Arg
1 5 10 15
Gly Leu Arg Glu Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Asp Gly Tyr Gly Lys
20 25 30
Gln Arg Asp Ala Ser Gly Gly Glu Tyr Ser Gln Phe Gln Glu Glu Ser
35 40 45
Gly Arg Glu Gln Asn Ser Pro Ser Cys Glu Gly Gln Gln Tyr Gln Gln
50 55 60
Gly Glu Tyr Met Asn Ser Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Gln
65 70 75 80
Lys Asp Leu Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Asp Asp
85 90 95
Asp Asp Leu Ile Gly Val Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Arg Arg Glu
100 105 110
Met Thr Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys
115 120 125
Gly Gly Leu Gln Gly Met Phe Tyr Ser Arg Arg Arg His Arg Ile Leu
130 135 140
Asp Ile Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn
145 150 155 160
Tyr Thr His Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Met Tyr Phe Gly Trp Leu
165 170 175
Trp Lys Leu Val Ser Val Glu Leu Ser Gln Glu Ala Glu Glu Asp Glu
180 185 190
Ala Asn Cys Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Arg His Asp Asp Glu
195 200 205
His Gly Glu Thr Leu Val Trp Gln Phe Asp Ser Met Leu Ala Tyr Asn
210 215 220
Tyr Lys Ala Phe Thr Leu Tyr Pro Glu Glu Phe Gly His Lys Ser Gly
225 230 235 240
Leu Pro Glu Lys Glu Trp Lys Ala Lys Leu Lys Ala Arg Gly Ile Pro
245 250 255
Tyr Ser Glu Thr Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
260 265 270
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr Arg Met Thr Glu Tyr
275 280 285
Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val Pro Arg Ala Val
290 295 300
Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala Thr Arg His Thr
305 310 315 320
Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu Leu Gln Glu Leu
325 330 335
Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val Trp Val Ala Asp
340 345 350
Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu Ser Val Glu Ala
355 360 365
Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala Glu Leu Ser Gly
370 375 380
Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu Leu Ala Pro His
385 390 395 400
Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val Gly Val Ser Pro
405 410 415
Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val Leu Pro Gly Val
420 425 430
Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu Glu Thr Ser Ala
435 440 445
Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe Thr Val Thr Ala
450 455 460
Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys Met Thr Arg Lys
465 470 475 480
Pro Gly Ala Gly Ser
485
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 60
cca 63
<210> 32
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 33
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 34
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585
<210> 35
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc caagcttacc 520
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 45
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 48
<211> 2745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tcaggtgcag cttcagcagc ctggcgctga gctggtgaag 1380
cccggagcta gcgtgaagat gtcctgcaag gccagcggct ataccttcac ctcatacaac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggaaga ggcctcgagt ggattggagc tatctaccct 1500
ggaaacggag acaccagcta taaccagaag ttcaagggaa aggctaccct gaccgctgac 1560
aagagcagca gcaccgctta catgcagctg agcagcctta caagcgagga ctctgccgtg 1620
tactactgcg ccagaagcac ctattacggc ggcgactggt acttcaacgt gtggggagct 1680
ggaaccaccg tgaccgttag cgccggcggc ggaggctctg gcggcggagg aagcggcggc 1740
ggcggctccc agatcgtgct gtctcagagc cccgctatct tgagcgcctc ccctggagag 1800
aaggtgacca tgacttgcag agctagcagc agcgtgagct acatccactg gttccaacag 1860
aagccaggca gctcccctaa gccttggatc tacgctacca gcaaccttgc ctcaggcgtt 1920
cccgtgagat tctctggatc tggaagcggc acatcctact ccctgaccat ctcccgggtc 1980
gaggctgagg acgctgctac ttactactgc cagcagtgga ctagcaaccc ccccacattt 2040
ggcggcggca ccaaactgga gatcaagact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 2100
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 2160
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 2400
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 2460
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2520
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 2580
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 2640
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 2700
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 2745
<210> 49
<211> 2748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
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ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcca gtgaccgcct tgctccttcc cctggctctt 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tgaggtgcag ctgcagcaga gcggagctga gctggtgaag 1380
cctggcgcta gcgtgaagat gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cagctataac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggacag ggactggagt ggatcggagc tatctaccct 1500
ggaaacggag acacctcata caaccagaag ttcaagggaa aggctaccct gaccgctgac 1560
aagagcagca gcaccgctta catgcagctg agctcactga ccagcgagga ctccgccgac 1620
tactactgcg ccagaagcaa ctactacgga agcagctact ggttcttcga cgtgtgggga 1680
gctggaacca ccgtgaccgt gtcaagcggc ggcggaggct ccggaggcgg aggatctggc 1740
ggcggcggca gcgacatcgt gctgacccag agccctgcta tcctgtctgc cagccctgga 1800
gagaaggtga ccatgacctg cagagctagc agcagcgtga actacatgga ctggtatcag 1860
aaaaagcccg gcagctcacc taagccttgg atctacgcta ccagcaactt agccagcggc 1920
gtgcctgcta gattctccgg aagcggctct ggaaccagct actcccttac catcagcaga 1980
gtggaggctg aggacgctgc tacctactac tgccagcagt ggagcttcaa ccctcctacc 2040
ttcggaggag gaaccaagct ggagatcaag actagtacca cgacgccagc gccgcgacca 2100
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2160
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 2220
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2280
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 2340
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 2400
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 2460
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2520
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2580
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2640
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2700
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 2748
<210> 50
<211> 3558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcct gtcaccgccc tgctgctgcc cctggctctg 1320
ctgctgcacg ccgcaagacc tgaagtccag ctgcagcagt ccggggcaga gctggtgaag 1380
ccaggagcct ccgtgaagat gtcttgtaag gccagcggct acaccttcac atcctataac 1440
atgcactggg tgaagcagac ccctggacag ggcctggagt ggatcggagc aatctaccca 1500
ggcaacggcg acacaagcta taatcagaag tttaagggca aggccaccct gacagccgat 1560
aagagctcct ctaccgccta catgcagctg agctccctga caagcgagga ctccgccgat 1620
tactattgcg cccggtccaa ttactatggc tctagctact ggttctttga cgtgtgggga 1680
gcaggaacca cagtgaccgt gtcctctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctggc 1740
ggcggcggct ctgatatcgt gctgacacag agcccagcaa tcctgtccgc ctctccagga 1800
gagaaggtga ccatgacatg tcgggccagc tcctctgtga actacatgga ctggtatcag 1860
aagaagcccg gcagctcccc taagccatgg atctacgcca cctccaatct ggcatctgga 1920
gtgcctgcaa ggttcagcgg ctccggatct ggcaccagct attccctgac aatctctcgc 1980
gtggaggcag aggatgcagc aacctactat tgccagcagt ggagcttcaa cccccctacc 2040
tttggcggcg gcacaaagct ggagatcaag ggcggcggcg gctccggcgg cggcgggagc 2100
ggcggcggcg gctctggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gctccgacat ccagatgacc 2160
cagaccacat ctagcctgtc tgccagcctg ggcgacaggg tgacaatcag ctgtcgcgcc 2220
tcccaggata tctctaagta cctgaattgg tatcagcaga agccagatgg caccgtgaag 2280
ctgctgatct accacacaag ccggctgcac tccggagtgc caagccggtt cagcggctct 2340
ggcagcggca ccgactatag cctgacaatc tccaacctgg agcaggagga tatcgccacc 2400
tacttctgcc agcagggcaa taccctgcct tatacatttg gcggaggaac aaagctggag 2460
atcaccggct ccacatctgg aagcggcaag ccaggatctg gagagggaag caccaaggga 2520
gaggtgaagc tgcaggagtc cggaccaggc ctggtggcac cttcccagtc tctgagcgtg 2580
acctgtacag tgtctggcgt gagcctgcct gactacggcg tgtcctggat caggcagcca 2640
ccaagaaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggggca gcgagacaac atactataac 2700
tccgccctga agagccggct gaccatcatc aaggataact ccaagtctca ggtgttcctg 2760
aagatgaata gcctgcagac cgacgataca gccatctact attgcgccaa gcactactat 2820
tatggaggca gttatgctat ggactattgg gggcagggca caagcgtcac cgtctcatca 2880
actagtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 2940
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 3000
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 3060
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 3120
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 3180
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 3240
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 3300
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 3360
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 3420
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 3480
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 3540
gccctgcccc ctcgctaa 3558
<210> 51
<211> 2745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggccctgcct gtgaccgccc tgctgctgcc cctggccctg 1320
ctgctgcacg ctgctagacc tgatattcag atgacccaga ccactagctc cctgtccgcc 1380
tctctgggcg acagagtgac aatcagctgc agggcctccc aggatatctc taagtatctg 1440
aactggtacc agcagaagcc agacggcaca gtgaagctgc tgatctatca caccagccgc 1500
ctgcactccg gagtgccatc tcggttcagc ggctccggat ctggcacaga ctacagcctg 1560
accatctcca acctggagca ggaggatatc gccacctatt tctgccagca gggcaataca 1620
ctgccctaca cctttggcgg cggcacaaag ctggagatca ccggaggagg aggaagcggc 1680
ggaggaggct ccggcggcgg cggctctgag gtgaagctgc aggagtccgg acctggcctg 1740
gtggcaccaa gccagtccct gtctgtgaca tgtaccgtgt ccggcgtgtc tctgcctgat 1800
tacggcgtgt cttggatcag gcagccacct aggaagggcc tggagtggct gggcgtgatc 1860
tggggcagcg agacaacata ctataattct gccctgaaga gcagactgac catcatcaag 1920
gacaacagca agtcccaggt gttcctgaag atgaatagcc tgcagacaga cgataccgcc 1980
atctactatt gcgccaagca ctactattac ggcggcagct atgccatgga ttactggggc 2040
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gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
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gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 2460
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 2520
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 2580
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 2640
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 2700
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 2745
<210> 52
<211> 2743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
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acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgctc tgctgctgcc tctggctctg 1320
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gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 2220
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 2280
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 2340
actactcaag aggaagatgg ctgtagctcg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga 2400
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caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga 2640
gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga 2700
cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 2743
<210> 53
<211> 2748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgcac tgctgctgcc tctggctctg 1320
ctgctgcacg ctgctcgccc tcaggtcaaa ctggaagaat ctggcggagg cctggtgcag 1380
gcaggcaggt ccctgaggct gtcttgcgca gcaagcgagc acacctttag ctcccacgtg 1440
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ggcctggtgc aggccggcga ttctctgcgg ctgacctgta cagcctccgg cagagccttc 1800
tctacctact ttatggcctg gtttagacag gcccctggca aggagaggga gtttgtggca 1860
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gacacagccg tgtactattg tgccagccgg ggaatcgagg tggaggaatt tggggcttgg 2040
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ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 2220
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2280
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ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2700
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 2748
<210> 54
<211> 2376
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tctgatgcat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgctc tgctgctgcc tctggctctg 1320
ctgctgcacg ctgctcgccc tcaggtcaaa ctggaagaat ctggcggagg cctggtgcag 1380
gcaggacgga gcctgcgcct gagctgcgca gcatccgagc acaccttcag ctcccacgtg 1440
atgggctggt ttcggcaggc cccaggcaag gagagagaga gcgtggccgt gatcggctgg 1500
agggacatct ccacatctta cgccgattcc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 1560
aacgccaaga agacactgta tctgcagatg aacagcctga agcccgagga caccgccgtg 1620
tactattgcg cagcaaggag aatcgacgca gcagactttg attcctgggg ccagggcacc 1680
caggtgacag tgtctagcac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 1740
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 1800
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1860
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1920
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1980
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 2040
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 2100
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 2160
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 2220
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gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 2376
<210> 55
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr
115 120 125
Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val
145 150 155 160
Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser
195 200 205
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
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Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
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Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
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Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
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<210> 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
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485
<210> 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
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Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
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Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
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165 170 175
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195 200 205
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
245 250 255
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
275 280 285
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
290 295 300
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
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tttcggcagg ccccaggcaa ggagagagag agcgtggccg tgatcggctg gagggacatc 240
tccacatctt acgccgattc cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacgccaag 300
aagacactgt atctgcagat gaacagcctg aagcccgagg acaccgccgt gtactattgc 360
gcagcaagga gaatcgacgc agcagacttt gattcctggg gccagggcac ccaggtgaca 420
gtgtctagcg gaggaggagg atctgaggtg cagctggtgg agagcggagg cggcctggtg 480
caggccggag gctctctgag gctgagctgt gcagcatccg gaagaacctt cacaatgggc 540
tggtttaggc aggcaccagg aaaggagagg gagttcgtgg cagcaatcag cctgtcccct 600
accctggcct actatgccga gagcgtgaag ggcaggttta ccatctcccg cgataacgcc 660
aagaatacag tggtgctgca gatgaactcc ctgaaacctg aggacacagc cctgtactat 720
tgtgccgccg atcggaagag cgtgatgagc attagaccag actattgggg gcagggaaca 780
caggtgaccg tgagcagcac tagtaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactggtt 1140
aacagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
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cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aatgaacgcg tgcccctctc 1500
cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg 1560
tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg 1620
gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag 1680
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ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc 1800
aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga 1860
gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga 1920
aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct 1980
ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg 2040
ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg gccacaggat ccgccaccat gggctccagc 2100
aactccaaga ggcagcaaca gggcttgctc aagctctggc gagggctgcg agggaagcct 2160
ggggcagact gggtgctatt gtccgatccg cttatcgggc agtcatcaac agtccaagaa 2220
gagtgcggca aggccttgaa aaagtcctgg ggtaaaggta aaatgactcc agacggccgc 2280
cgcctgcaag aaggagacac ctttgatgag tgggatgatg atgaagaaga agtaggcttc 2340
cctgtgcaac ctcgagtccc cttaagacag atgacctata aattagcagt ggacttttcc 2400
cactttttaa aatcaaaggg gggactggat gggatatatt actctgaaag aagagaaaag 2460
atcctgaatt tgtatgcctt gaacgagtgg ggaataatag atgattggca agcttactca 2520
ccaggcccgg ggataaggta cccgagagtc tttggcttct gctttaagct agtcccagtg 2580
gacctgcatg aggaggcacg caactgtgag agacactgtg ctgcacatcc agcacagatg 2640
ggggaagatc ctgatggaat agatcatgga gaagtcttgg tctggaagtt tgacccgaag 2700
ttggcggtgg agtaccgccc ggacatgttt aaggacatgc acgaacatgc aaagcgctaa 2760
<210> 63
<211> 2685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat gcagtctgga acccactgga gggtgctggg actgtgcctg 1320
ctgagcgtgg gcgtgtgggg acaggaggtg cagctgcagc agagcggagc tgagctggtg 1380
aagcctggcg ctagcgtgaa gatgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccagctat 1440
aacatgcact gggtgaagca gacccctgga cagggactgg agtggatcgg agctatctac 1500
cctggaaacg gagacacctc atacaaccag aagttcaagg gaaaggctac cctgaccgct 1560
gacaagagca gcagcaccgc ttacatgcag ctgagctcac tgaccagcga ggactccgcc 1620
gactactact gcgccagaag caactactac ggaagcagct actggttctt cgacgtgtgg 1680
ggagctggaa ccaccgtgac cgtgtcaagc ggcggcggag gctccggagg cggaggatct 1740
ggcggcggcg gcagcgacat cgtgctgacc cagagccctg ctatcctgtc tgccagccct 1800
ggagagaagg tgaccatgac ctgcagagct agcagcagcg tgaactacat ggactggtat 1860
cagaaaaagc ccggcagctc acctaagcct tggatctacg ctaccagcaa cttagccagc 1920
ggcgtgcctg ctagattctc cggaagcggc tctggaacca gctactccct taccatcagc 1980
agagtggagg ctgaggacgc tgctacctac tactgccagc agtggagctt caaccctcct 2040
accttcggag gaggaaccaa gctggagatc aagactagtg gcggcggagg ctctggcggc 2100
ggaggaagcg gcggcggcgg ctccgatggc aacgaggaga tgggcggcat cacccagaca 2160
ccctacaagg tgtccatctc tggcaccaca gtgatcctga cctgtccaca gtatcccggc 2220
tctgagatcc tgtggcagca caacgacaag aatatcggcg gcgatgagga cgataagaat 2280
atcggcagcg acgaggatca cctgtctctg aaggagttca gcgagctgga gcagtccggc 2340
tactacgtgt gctaccctcg gggctccaag ccagaggacg ccaactttta cctgtatctg 2400
cgggccagag tgtgcgagaa ttgtatggag atggacgtga tgtccgtggc caccatcgtg 2460
atcgtggata tctgtatcac aggcggcctg ctgctgctgg tgtactattg gagcaagaac 2520
cggaaggcca aggccaagcc tgtgaccaga ggagcaggag caggaggcag gcagagggga 2580
cagaacaagg agaggccacc tccagtgccc aatcctgact acgagccaat caggaagggc 2640
cagcgcgatc tgtatagcgg cctgaatcag aggcgcatct gataa 2685
<210> 64
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr
115 120 125
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
180 185 190
Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
195 200 205
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Asn Glu Glu Met
275 280 285
Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr
290 295 300
Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln
305 310 315 320
His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly
325 330 335
Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln
340 345 350
Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala
355 360 365
Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu
370 375 380
Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile
385 390 395 400
Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys
405 410 415
Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln
420 425 430
Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr
435 440 445
Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln
450 455 460
Arg Arg Ile
465
<210> 65
<211> 3147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60
cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120
acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180
ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240
gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300
gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360
agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420
caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480
ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540
ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600
tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660
gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260
acaggatccg ccgccaccat gcagtctgga acccactgga gggtgctggg actgtgcctg 1320
ctgagcgtgg gcgtgtgggg acaggaggtg cagctgcagc agagcggagc tgagctggtg 1380
aagcctggcg ctagcgtgaa gatgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccagctat 1440
aacatgcact gggtgaagca gacccctgga cagggactgg agtggatcgg agctatctac 1500
cctggaaacg gagacacctc atacaaccag aagttcaagg gaaaggctac cctgaccgct 1560
gacaagagca gcagcaccgc ttacatgcag ctgagctcac tgaccagcga ggactccgcc 1620
gactactact gcgccagaag caactactac ggaagcagct actggttctt cgacgtgtgg 1680
ggagctggaa ccaccgtgac cgtgtcaagc ggcggcggag gctccggagg cggaggatct 1740
ggcggcggcg gcagcgacat cgtgctgacc cagagccctg ctatcctgtc tgccagccct 1800
ggagagaagg tgaccatgac ctgcagagct agcagcagcg tgaactacat ggactggtat 1860
cagaaaaagc ccggcagctc acctaagcct tggatctacg ctaccagcaa cttagccagc 1920
ggcgtgcctg ctagattctc cggaagcggc tctggaacca gctactccct taccatcagc 1980
agagtggagg ctgaggacgc tgctacctac tactgccagc agtggagctt caaccctcct 2040
accttcggag gaggaaccaa gctggagatc aagactagtg gcggcggcgg ctctggagga 2100
ggaggcagcg gcggcggagg ctccggcggc ggcggctcta tggacattca gatgacccag 2160
tccccaagct ccctgtctgc cagcgtggga gacagagtga ccatcacatg cagggccagc 2220
caggatatcc gcaactatct gaattggtat cagcagaaac ccggcaaggc ccctaagctg 2280
ctgatctatt acaccagcag gctggagtcc ggagtgccat caagattctc cggctctggc 2340
agcggaaccg actacaccct gacaatctct agcctgcagc cagaggattt cgccacatat 2400
tactgccagc agggcaacac cctgccctgg acatttggcc agggcaccaa ggtggagatc 2460
aagggaggag gaggcagcgg gggcggcggc tccggaggag gcggctctga ggtgcagctg 2520
gtggagagcg gaggaggact ggtgcagcct ggaggcagcc tgcggctgtc ctgtgccgcc 2580
agcggctatt ccttcaccgg ctacacaatg aattgggtca gacaggcacc aggaaaggga 2640
ctggagtggg tggccctgat caaccctacc aagggcgtgt ccacatataa tcagaagttc 2700
aaggacaggt ttaccatctc tgtggataag agcaagaaca cagcctacct gcagatgaat 2760
agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtat tactgcgcac gcagcggata ttacggagac 2820
tccgattggt actttgacgt gtggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc ctccggcgga 2880
ggaggcagct ccggacaggt gctgctggag tccaatatca aggtgctgcc aacctggtct 2940
acacctgtgc agccaatggc actgatcgtg ctgggaggag tggcaggact gctgctgttc 3000
atcggactgg gcatcttctt ttgcgtgcgc tgtaggcacc ggagaaggca ggcagagagg 3060
atgtctcaga tcaagagact gctgagcgag aagaagacct gccagtgtcc tcaccgcttt 3120
cagaagacat gtagcccaat ctgataa 3147
<210> 66
<211> 621
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr
115 120 125
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
180 185 190
Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala
195 200 205
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
275 280 285
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
290 295 300
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
305 310 315 320
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
325 330 335
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
340 345 350
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
355 360 365
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
370 375 380
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
420 425 430
Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg
435 440 445
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Thr
450 455 460
Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile
465 470 475 480
Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
485 490 495
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr
500 505 510
Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
515 520 525
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu
530 535 540
Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met
545 550 555 560
Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly
565 570 575
Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala
580 585 590
Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys
595 600 605
Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
610 615 620
Claims (66)
1.一种产生经修饰T细胞的方法，所述方法包括：向前体T细胞中引入编码Nef蛋白的第一核酸，其中所述Nef蛋白在表达后导致所述经修饰T细胞中内源性T细胞受体(TCR)的下调。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述下调包括将内源性TCR的细胞表面表达下调至少约50％。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述表达Nef的经修饰T细胞包含经修饰内源性TCR基因座。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述Nef蛋白选自由SIV Nef、HIV1 Nef、HIV2 Nef和Nef同源性蛋白组成的组。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Nef蛋白是野生型Nef。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Nef蛋白是突变Nef。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述突变Nef包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述前体T细胞包含第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述前体T细胞中引入第二核酸，所述第二核酸编码包含细胞外配体结合结构域以及任选的细胞内信号传导结构域的功能性外源性受体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸在单独的载体上。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸在同一载体上。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一核酸在所述第二核酸的上游。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过连接序列来连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述连接序列包含编码P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV2A、BmIFV 2A、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n的核酸序列，或IRES、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK、CAGG的核酸序列，或它们的任何组合，其中n是至少为1的整数。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、游离型载体表达载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物组成的组。
18.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述非病毒载体是Piggybac载体或睡美人载体。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中相较于由从所述前体T细胞的供者分离的原代T细胞引发的移植物抗宿主疾病(GvHD)应答，所述表达Nef的经修饰T细胞在组织不相容个体中不引发或引发降低的GvHD应答。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括分离或富集包含所述第一核酸和/或所述第二核酸的T细胞。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述表达Nef的经修饰T细胞分离或富集TCR阴性T细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述表达Nef的经修饰T细胞与至少一种药学上可接受的载体一起配制。
24.如权利要求8-23中任一项所述的方法，其中所述功能性外源性受体是嵌合TCR(cTCR)，所述嵌合TCR包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的接头；
(c)第一TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(d)包含第二TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(e)包含第三TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR亚基全都是CD3ε。
26.如权利要求8-23中任一项所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，所述T细胞抗原偶联物包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第一TCR共受体的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第二TCR共受体的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第三TCR共受体的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且
其中所述第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一、第二和第三TCR共受体是相同的。
28.如权利要求8-23中任一项所述的方法，其中所述功能性外源性受体是T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体，所述T细胞抗原偶联物样嵌合受体包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)任选的第一接头；
(c)特异性识别第一TCR亚基的细胞外结构域的细胞外TCR结合结构域；
(d)任选的第二接头；
(e)第二TCR亚基的任选的细胞外结构域或其一部分；
(f)包含第三TCR亚基的跨膜结构域的跨膜结构域；以及
(g)任选的包含第四TCR亚基的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；
其中所述第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第二、第三和第四TCR亚基是相同的。
30.如权利要求8-23中任一项所述的方法，其中所述功能性外源性受体是嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含：
(a)细胞外配体结合结构域，所述细胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原的一个或多个表位的抗原结合片段；
(b)跨膜结构域；以及
(c)细胞内信号传导结构域。
31.如权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述抗原结合片段选自由骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、单链Fv抗体和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)组成的组。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗原结合片段是sdAb或scFv。
33.如权利要求24-32中任一项所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是单价的。
34.如权利要求24-32中任一项所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是多价的。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞外配体结合结构域是多特异性的。
36.如权利要求24-35中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬酰胺内肽酶、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期素B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤抗原是BCMA、CD19或CD20。
38.如权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域源于选自由以下组成的组的分子：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)、CD152、CD154和PD-1。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述跨膜结构域源于CD8α。
40.如权利要求30-39中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含源于CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRIb)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcγRIIa、DAP10和DAP12的初级细胞内信号传导结构域。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述初级细胞内信号传导结构域源于CD3ζ、DAP12或CD3γ。
42.如权利要求30-41中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含源于选自由以下组成的组的共刺激性分子的共刺激性信号传导结构域：CARD11、CD2(LFA-2)、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM-1)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD162(SELPLG)、CD258(LIGHT)、CD270(HVEM、LIGHTR)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、NKG2C、CDS、GITR、BAFFR、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、IPO-3、BLAME(SLAMF8)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA-4)、CD223(LAG3)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、DAP10、TRIM、ZAP70、与CD83特异性结合的配体以及它们的任何组合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述共刺激性信号传导结构域包含CD137(4-1BB)的细胞质结构域。
44.如权利要求24-43中任一项所述的方法，所述方法还包括位于所述细胞外配体结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述铰链结构域源于CD8α。
46.如权利要求24-45中任一项所述的方法，所述方法还包括位于多肽的N末端处的信号肽。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述信号肽源于CD8α。
48.一种经修饰T细胞，所述经修饰T细胞通过权利要求1-47中任一项所述的方法来获得。
49.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求48所述的经修饰T细胞以及药学上可接受的载体。
50.一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求49所述的药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述疾病是癌症。
52.一种非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白包含在肉豆蔻酰化位点、N末端α螺旋、基于酪氨酸的AP募集、CD4结合位点、酸性簇、基于脯氨酸的重复序列、PAK结合结构域、COP I募集结构域、基于二亮氨酸的AP募集结构域、V-ATP酶和Raf-1结合结构域或它们的任何组合中的一个或多个突变，或在表11中所列的任何氨基酸残基处的一个或多个突变。
53.如权利要求52所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白是突变SIVNef蛋白。
54.如权利要求52或53所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白包含：
(i)SEQ ID NO:18-22中的任一者的氨基酸序列；
(ii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 8-10、aa 11-13、aa 38-40、aa 44-46、aa 47-49、aa 50-52、aa 53-55、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 110-112、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、aa 178-179、179-181aa、aa 182-184、aa185-187、aa 188-190、aa 191-193、aa 194-196、aa 203-205、aa 206-208、aa 212-214、aa215-217、aa 218-220、aa 221-223、aa 8-13、aa 44-67、aa 107-112、aa 164-196、aa 203-208或aa 212-223，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iii)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 44-46、aa56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 98-100、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 44-67、aa 164-169、aa 176-181、aa185-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；
(iv)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 170-172、aa 173-175、aa 176-178、178-179aa、aa 179-181、aa 182-184、aa 185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67或aa 164-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置；或
(v)在处于以下任一者的氨基酸残基处的一个或多个突变：aa 2-4、aa 56-58、aa 59-61、aa 62-64、aa 65-67、aa 107-109、aa 137-139、aa 152-154、aa 164-166、aa 167-169、aa 176-178、aa 178-179、aa 179-181、aa185-187、aa 188-190、aa 194-196、aa 203-205、aa 56-67、aa 164-169、aa 176-181或aa 185-190，其中所述氨基酸残基位置对应于野生型SIV Nef的氨基酸残基位置。
55.如权利要求52-54中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将内源性TCR的细胞表面表达下调。
56.如权利要求52-55中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将内源性TCR的细胞表面表达下调，与由所述野生型SIV Nef进行的下调相差不超过约3％。
57.如权利要求52-56中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白不将CD4的细胞表面表达下调。
58.如权利要求52-56中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD4的细胞表面表达下调。
59.如权利要求58所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD4的细胞表面表达下调，与由所述野生型SIV Nef进行的下调相差不超过约3％。
60.如权利要求58所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD4的细胞表面表达下调，与由所述野生型SIV Nef进行的下调相比少至少约3％。
61.如权利要求52-60中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白不将CD28的细胞表面表达下调。
62.如权利要求52-60中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD28的细胞表面表达下调。
63.如权利要求62所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD28的细胞表面表达下调，与由所述野生型SIV Nef进行的下调相差不超过约3％。
64.如权利要求62所述的非天然存在的Nef蛋白，所述非天然存在的Nef蛋白将CD28的细胞表面表达下调，与由所述野生型SIV Nef进行的下调相比少至少约3％。
65.一种经修饰T细胞，所述经修饰T细胞包含编码权利要求52-64中任一项所述的非天然存在的Nef蛋白的核酸。
66.如权利要求65所述的经修饰T细胞，所述经修饰T细胞还包含功能性外源性受体。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108795875A (zh) * | 2012-04-30 | 2018-11-13 | 达特茅斯大学理事会 | T细胞受体缺陷型t细胞组合物 |
| WO2024022509A1 (en) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Methods for promoting persistence of cell therapy |
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