JP5442452B2 - 単純ヘルペスウイルスおよびウイルス複製法 - Google Patents
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Description
単純ヘルペスウイルス(HSV)ゲノムは、長(L)および短(S)と称される2つの共有結合したセグメントを含む。各セグメントは、逆位末端反復配列対が隣接するユニークな配列を含有する。長反復(RLまたはRL)および短反復(RSまたはRS)が特徴的である。
したがって、1つの側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが抗血管形成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。好ましい態様において、抗血管形成ポリペプチドはING4である。単純ヘルペスウイルスはまた、非神経毒性であってもよい。
本発明記載のHSVは、疾患の医学的治療、より詳細には癌性状態の治療に使用するために提供される。本発明記載のHSVをこうした治療の必要がある個体に、例えば治療上有効な量で投与する工程を含む、癌性状態の治療法を提供する。また、癌性状態の治療用の薬剤の製造において使用するためにもまた、本発明記載のHSVを提供する。腫瘍の治療、例えば腫瘍の腫瘍退縮治療で使用するためにもまた、本発明記載のHSVを提供する。
本発明はまた、in vitroまたはin vivoでING4ポリペプチドを発現する方法であって、本発明の単純ヘルペスウイルスに、関心対象の少なくとも1つの細胞または組織を感染させる工程を含む、前記方法も提供する。
治療法で使用するためのING4ポリペプチドをコードする核酸を、ベクター中で提供してもよい。ベクターは遺伝子治療ベクターであってもよく、例えば投与に際して患者の細胞に進入してもよい。例えば、ベクターはウイルスベクターであってもよく、例えば非腫瘍退縮性HSVであってもよい。
細胞は、HSVによる感染が可能であり、そしてHSVが該細胞中で複製可能である、任意の細胞であってもよい。これらはin vitro培養細胞であってもよい。これらはヒトまたは非ヒト細胞であってもよい。例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類(げっ歯目(Rodentia)中の任意の動物由来の細胞を含む)、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物;および/または非ヒト哺乳動物細胞;および/またはヒト細胞由来であってもよい。
ING4
本明細書におけるING4に対する言及には、NCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)において、寄託番号NM_016162 GI:38201669のもとに記載されるアミノ酸配列を有するING4ポリペプチドに対する言及が含まれる。ING4に対する言及にはまた、ING4のアイソフォーム、相同体および誘導体に対する言及も含まれる。誘導体は、個体間またはファミリーメンバー間に存在しうる天然変異体または多型を含んでもよい。Genbankデータベース中に寄託されるING4ポリペプチドの多くの相同体がある。例えば、データベースのBlast検索は、およそ100の相同体を同定した。相同体には、例えば、BC007781などの他のヒトING4アイソフォーム、マウス(Mus musculus)ING4(例えば、NP_579923.1)、イヌ(Cannis familiaris)ING4(XP_534907.2)、ラット(Rattus norvegicus)(NP_001073356.1)、チンパンジー(Pan troglodytes)ING4(XP_001169091.1)、ウマ(Equus caballus)(XP_001496617.1)、ニワトリ(Gallus gallus)ING4(NP_001006241.1)、アカゲザル(Macaca mulatta)(XP_001118270.1)、オオカンガルー(Monodelphis domestica)(XP_001365016.1)、ウシ(Bos Taurus)(NP_001030466.1)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)(NP_001018304.1)、アフリカツメガエル(Xonpus laevis)(NP_001088224.1)が含まれる。本発明が関連するING4ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくはヒトING4である。
(i)アラニン、セリン、スレオニン;
(ii)グルタミン酸およびアスパラギン酸;
(iii)アルギニンおよびロイシン;
(iv)アスパラギンおよびグルタミン;
(v)イソロイシン、ロイシンおよびバリン;
(vi)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
ING4ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。特に、ING4ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルス17株または1716株に感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルス17株または1716株の複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。
単純ヘルペスウイルス
本明細書において、単純ヘルペスウイルス(HSV)は、任意の単純ヘルペスウイルスであってもよい。適切なHSVには、HSVの任意の実験室株または臨床単離体(非実験室株)が含まれる。好ましくは、HSVは、HSV−1またはHSV−2である。あるいは、HSVは、HSV−1およびHSV−2の種間組換え体であってもよい。HSVは、実験室株HSV−1 17株、HSV−1 F株またはHSV−2 HG52株の1つであってもよい。HSVは、非実験室株JS−1であってもよい。好ましくは、HSVは、HSV−1 17株またはその突然変異体である。HSVは、HSV−1 17株突然変異体1716、HSV−1 F株突然変異体R3616、HSV−1 F株突然変異体G207、HSV−1突然変異体NV1020の1つのさらなる突然変異体であってもよい。
配列同一性パーセント(%)は、配列を並列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、所定の列挙される配列(配列番号によって言及される)中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列同一性は、好ましくは、それぞれの配列の全長に渡って計算される。
(A)
所定の配列:XXXXXXXXXXXXXXX(15アミノ酸)
比較配列 :XXXXXYYYYYYY(12アミノ酸)
所定の配列は、例えばING4をコードするもの(例えば配列番号3)であってもよい。
比較配列が所定の配列より長い場合、配列同一性は所定の配列の全長に渡って決定可能である。例えば:
(B)
所定の配列:XXXXXXXXXX(10アミノ酸)
比較配列 :XXXXXYYYYYYZZYZZZZZZ(20アミノ酸)
ここでも、所定の配列は、例えばING4をコードするもの(例えば配列番号3)であってもよい。
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための並列は、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばClustalW 1.82 T−coffeeまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを用いて、当業者に知られる多様な方法で達成可能である。こうしたソフトウェアを用いる場合、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関して、好ましくはデフォルトパラメーターを用いる。ClustalW 1.82のデフォルトパラメーターは:タンパク質ギャップオープンペナルティ=10.0、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ=0.2、タンパク質マトリックス=Gonnet、タンパク質/DNA ENDGAP=−1、タンパク質/DNA GAPDIST=4である。
本発明にしたがって、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることによって、核酸配列を同定してもよい。
所定の反応のストリンジェンシーは、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度などの要因に応じうる。長いプローブの適切なアニーリングには、一般的に、より高い温度が必要である一方、より短いプローブはより低い温度でアニーリング可能である。プローブおよびハイブリダイズ可能な配列間の望ましい相補性の度合いがより高くなれば、使用可能な相対的温度はより高くなる。その結果、より高い相対的温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、より低い温度は、その傾向がより少ないということになる。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−600/n
式中、nはオリゴヌクレオチド中の塩基数である。
95〜100%の配列相補性を示す配列は、非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、85〜95%の相補性を示す配列は、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、70〜85%の相補性を示す配列は、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、60〜70%の相補性を示す配列は、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、そして50〜60%の相補性を示す配列は、非常に低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能である。
本明細書において、ING4ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号4または配列番号5、これらの配列のいずれか1つのRNA転写物、先行する配列のいずれか1つの断片、あるいはこれらの配列または断片のいずれか1つの相補配列に、特定の度合いの配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、任意の核酸(DNAまたはRNA)であってもよい。あるいは、ING4ポリペプチドをコードする核酸は、高いまたは非常に高いストリンジェンシー条件下で、これらの配列の1つにハイブリダイズするものであってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも60%〜100%の配列同一性であってもよい。より好ましくは、特定の度合いの配列同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性の1つであってもよい。
本発明で使用するためのHSVは、臨床的使用のための薬剤および薬学的組成物としての製剤とされてもよいし、そして薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤またはアジュバントを含んでもよい。組成物は、局所、非経口、全身、静脈内、動脈内、筋内、クモ膜下腔、眼内、腫瘍内、皮下、経口または経皮投与経路用の製剤とされてもよく、これには注射が含まれてもよい。注射可能な製剤は、無菌または等張媒体中の選択される化合物を含んでもよい。薬剤および薬学的組成物は、液体または固体(例えば錠剤)型の製剤とされてもよい。液体製剤は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与用の製剤とされてもよい。
本発明には、こうした組み合わせが明らかに許容しえないかまたは明確に回避される場合を除いて、記載される側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
方法および結果
ING4腫瘍抑制因子遺伝子を発現するHSV1716変異体を以下のように構築した。NCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/寄託番号NM_016162 GI:38201669のもと)に寄託されるヒトING4配列を用いて、ING4のPCR増幅用のプライマーを設計した。順方向プライマー
RL1−del/gfpを生成するため、PGKプロモーター/gfp遺伝子を含有する1.3kbpの平滑末端化EcoRI/AflII断片を、ベクターpSNRG(OligoEngine、米国ワシントン州シアトル)から制限消化後にKlenow処理することによって得て、そして制限酵素NruIで切断し、次いで、アルカリホスファターゼ処理したRL1−delベクター内に連結した。
皮下腫瘍移植物を所持するヌードマウスの腫瘍内注射
最初の実験において、CP70卵巣腫瘍細胞株の皮下移植物を所持する6匹のマウスに、第1日および第3日に、1x107pfuのHSV1716ING4を腫瘍内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。対照マウスには、HSV1790、酵素、ニトロ還元酵素を発現するHSV1716変異体のいずれかを注射するか、あるいは同様の体積のPBSを注射した。生存データを図3に示す。
皮下ヒトSCC A431腫瘍を所持する10匹のマウスの群に、第1日および第3日に、PBS(ウイルスなし)、あるいは1x106pfuのHSV1716またはHSV1716ING4を静脈内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。静脈内注射後、HSV1716ING4は、ウイルスなしの対照または非修飾HSV1716に比較して、腫瘍増殖を有意に減少させた(図6)。注射10日後、HSV1716注射マウスの平均腫瘍体積は、HSV1716ING4注射マウスの193±152mm2に比較して、421±55mm2であり、そしてスチューデントt検定を用いると、この相違は、p=0.0022で非常に有意である。同様に、第14日または20日、HSV1716注射マウスの平均腫瘍体積は、HSV1716ING4を投与されたマウスの、それぞれ476±448mm2または776±438mm2に対して、それぞれ1096±402mm2または1253±155mm2であり、そしてスチューデントt検定を用いると、これらの相違は、それぞれp=0.0125または0.0162で、どちらも有意である。ウイルスを投与されないか、または1x106pfuのHSV1716を投与されたマウスは、およそ14日の生存中央値を有し、一方、HSV1716ING4を投与されたマウスは17日の生存中央値を有し、4/10のマウスが第20日を超えて生存し、この時点では、PBSまたはHSV1716を注射されたすべてのマウスは屠殺されていた。マウス群各々からいくつかの腫瘍を屠殺時点で取り除き、そして機械的にホモジナイズした後、腫瘍抽出物中のウイルスを力価決定し、結果を表1に示した。
異なる細胞株上でのHSV1716ING4の増殖
上記in vivoデータは、HSV1716ING4が、非修飾HSV1716より高い効率で複製することによって、増進された腫瘍退縮を示すことを示唆し、そして低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いて、これをin vitroで確認した。用いた細胞株は、BHK、Vero、A431ヒトSCC、CP70ヒト卵巣腫瘍、MDA−MB−468ヒト乳腺癌、Ovcar3ヒト卵巣癌およびHuH7ヒト肝細胞癌であり、そしてこれらの株におけるHSV1716ING4の増殖を、野生型HSV−1 17+、HSV1716、HSV1716ING4およびHSV1716EGFR(ING4とほぼ同じ分子量のターゲティング部分を発現するEGFRターゲティング化HSV1716変異体)と比較した。
HSV1716ING4を生成するため、ING4 cDNAをまず、哺乳動物発現プラスミドpCDNA4/myc−HisA内にクローニングし、そしてこのベクターを用いて、ING4を恒常的に発現するBHK細胞株を生成した。250μlの血清不含DMEM/F12培地中の10μlリポフェクタミン2000(Invitrogen)と混合した100μgのING4発現ベクターまたは空のpCDNA/myc−HisAプラスミドでBHK細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション72時間後、細胞をトリプシン処理し、そして1mg/mlゼオシン(Invitrogen)を含有する増殖培地を用いてプレーティングした。ゼオシン抗生物質を用いて細胞を2〜3週間選択し、その後、個々のクローンは明らかに可視であった。細胞をトリプシン処理し、そして24ウェルプレート中の限界希釈によってクローニングした。BHK/ING4またはBHK/pCDNA4の5クローンを拡大し、そして0.5mg/mlゼオシンを含有する適切な培地中で維持した。
in vivoデータによって、非修飾HSV1716よりも高い効率で、HSV1716ING4が複製することが示唆された。これは、最初に、以下に記載するように、低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いてin vitroで確認された。これらの実験には、実施例2に記載する実験が続いた。
候補腫瘍抑制因子遺伝子ING4を発現するHSV1716変異体は、HSV1716単独と比較した際、有意に増進された腫瘍増殖阻害、および延長された生存期間を示す。実際、上記実験において直接比較したのではないが、HSV1716ING4で処置したCP70腫瘍所持マウスの生存期間は、プロドラッグCB1954と組み合わせたニトロ還元酵素発現変異体HSV1790での処置後に得られるものと類似であった。転写を制御する際に関与する多様な複合体のサブユニットとしてのING4の仮定される活性を考慮すると、感染した腫瘍細胞におけるこうした作用様式が、HSV1716溶解性感染の背景に対して、細胞毒性に対するこうした劇的な効果を有するとは予期されないため、2つのモデルにおける生存期間の増進は予期されず、そして驚くべきことである。したがって、ウイルス自体は、ING4過剰発現から生じるいかなる毒性効果よりも迅速に、分裂中の腫瘍細胞を、効率的に殺す。ING4発現は、感染しているがウイルス腫瘍退縮に耐性である腫瘍細胞を破壊する可能性があるが、いかなる所定の腫瘍中のこれらの細胞の比率もHSV1716ING4で見られる腫瘍破壊増進を説明するのに十分ではないため、これは可能性が低いようである。
第1日および第3日に、PBSあるいは1x106pfuのHSV1716またはHSV1716ING4の2回の静脈内注射後、皮下A431 SCC腫瘍から抽出されたウイルスの量。
表15. 5pfuのHSV1716、HSV1716EGFRまたはHSV1716/ING4に2つ組で感染した後の、異なる細胞種由来の総ウイルス収量
**HSV1716収量%に比較したウイルス収量%の比
Claims (20)
- (i)過剰なING4を有する単数または複数の細胞を提供し、そして(ii)細胞(単数または複数)を感染させることが可能な単純ヘルペスウイルスと細胞(単数または複数)を接触させる工程を含む、in vitroで単純ヘルペスウイルスを複製する方法。
- 単純ヘルペスウイルスが17株または1716株である、請求項1記載の方法。
- ING4ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドであるか、あるいは、ING4ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルス17株または1716株に感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルス17株または1716株の複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項1または請求項2記載の方法。
- ING4ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を含むin vivo(ヒト由来のin vivoを除く)またはin vitroの細胞であって、単純ヘルペスウイルスに感染した、前記細胞。
- 単純ヘルペスウイルスが17株または1716株である、請求項4記載の細胞。
- 前記核酸配列が、配列番号4または配列番号5、あるいは配列番号3のポリペプチドをコードする核酸を含むか、または、前記核酸配列が、配列番号4または配列番号5、あるいは、配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項4または請求項5記載の細胞。
- 単純ヘルペスウイルスゲノムがING4ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルス。
- 前記核酸配列が、配列番号4または配列番号5、あるいは配列番号3のポリペプチドをコードする核酸を含むか、または、前記核酸配列が、配列番号4または配列番号5、あるいは配列番号3のポリペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項7記載の単純ヘルペスウイルス。
- ING4ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドであるか、または、ING4ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス17株または1716株に感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルス17株または1716株の複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項7または請求項8に記載の単純ヘルペスウイルス。
- 前記単純ヘルペスウイルスゲノムが、ING4をコードする前記核酸に機能可能であるように連結された制御ヌクレオチド配列をさらに含み、前記制御ヌクレオチド配列が前記ING4ポリペプチドの転写を調節する際に役割を果たす、請求項7〜9のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
- 非神経毒性であるか、および/または、腫瘍退縮性(oncolytic)である請求項7〜10のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
- ICP34.5遺伝子が機能するICP34.5遺伝子産物を発現不能であるように、ICP34.5遺伝子の一方または両方が修飾されているか、または、ICP34.5遺伝子が機能するICP34.5遺伝子産物を発現不能であるように、ICP34.5遺伝子のすべてのコピーが修飾されているか、または、前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムの少なくとも1つのRL1遺伝子座に位置するか、または、前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムのICP34.5タンパク質コード配列の少なくとも1つの中に位置するか、あるいは該配列と重複する、請求項7〜11のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
- 寄託番号08021501のもとに、2008年2月15日にECACCに寄託されたHSV1716ING4。
- 疾患の医学的治療法において使用するための請求項7〜13のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルス。
- 癌性状態のまたは腫瘍の治療において使用するための請求項7〜13のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルス。
- 請求項7〜15のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルスを含む、薬剤。
- 請求項7〜15のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルスを含む、薬学的組成物。
- 請求項7〜15のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルスを含む、ワクチン。
- 請求項7〜15のいずれか一項に記載の単純ヘルペスウイルスを、細胞に投与する工程を含む、in vitroで腫瘍細胞を溶解させるかまたは殺傷する方法。
- 単純ヘルペスウイルス、ならびにING4ポリペプチドをコードする核酸および/またはING4ポリペプチドを含む、組成物。
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