JP4551042B2 - ヘルペスγ34.5遺伝子発現の細胞特異的および/または腫瘍特異的プロモーター再標的化 - Google Patents
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Description
(連邦政府によって支援された研究および開発のもとでなされた本発明に対する権利に関する陳述)
本発明の開発の間に実施された研究のすくなくとも一部は、国立癌研究所からの助成金(助成金番号CA6924602)を利用した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0002】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、腫瘍細胞および/または他の特定の細胞集団を選択的に標的化し得るヘルペスウイルス変異体に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍および特定の細胞型に対して変異体ヘルペスウイルスベクターを再標的化するための、細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの使用に関する。この細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターを使用して、ヘルペスガンマ(γ)34.5遺伝子の発現を駆動する。このヘルペスガンマ(γ)34.5遺伝子の遺伝子産物は、感染した細胞における大量の子孫ウイルス産生を担う。
【0003】
γ34.5遺伝子を有さないヘルペスベクターは十分に複製せず、このことは、臨床的用途に所望されている。しかし、γ34.5遺伝子を欠損することはまた、このウイルスが、腫瘍または任意の他の感染組織を殺傷する能力を減少させる。本発明は、細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターを使用し得る細胞における、ヘルペスウイルスの大量産生を可能にする。しかし、プロモーターをオン(turn on)にし得ない細胞は、ウイルス複製を支持せず、このようにして、それらの細胞およびその近隣の細胞が、活性かつ有害なウイルスの感染および複製から免れ、従って、ヘルペスの毒力を所望される標的細胞に対して再指向する。
【0004】
(関連技術)
(A.従来の癌治療)
新形成は、癌において生じるプロセスであり、これによって、細胞の増殖および分化を調節する正常な制御機構が損なわれ、進行性の増殖が生じる。この制御機構の欠損は、腫瘍を増大させ、そして身体の致命的領域の空間を占拠させる。腫瘍が周辺組織に浸潤し、そして遠位に輸送(転移)される場合、この個体の死を招く可能性がある。
【0005】
1999年に、米国のみにおいて、約563,100人、すなわち一日あたり約1,500人が癌で死亡すると予期される(Landisら,「Cancer Statistics,1999」CA Canc.J Clin.49:8−31(1999))。さらに、癌は、1〜14歳の年齢の小児の間で、事故に次いで2番目の主要な死亡原因である。同書。従って、明らかに、新たな癌治療の開発の必要性が存在する。
【0006】
(1.従来の治療の一般的制限)
癌治療に関して所望される目標は、正常細胞に対して有害な影響を有さずに、優先的に癌細胞を殺傷することである。いくつかの方法(外科手術、放射線療法、および化学療法を含む)が、この目標に到達する試みにおいて使用されてきた。
【0007】
外科手術は、利用可能な第一の癌の処置であった。そしてこれはなお、癌の診断、病期分類、および処置において主要な役割を果たしており、そして早期癌についての主要な処置であり得る(Slapak,C.A.およびKufe,D.W.,「Principles of Cancer Therapy」、Harrison’s Principles of Internal Medicine,Fauci,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill Cos.,Inc.,New York,1998,524を参照のこと)。しかし、外科手術は、特定の部位に限定された腫瘍を治療するに有効な方法であり得るが、これらの腫瘍は、腫瘍の場の外側の微小転移性病態に起因して、切除によって治癒可能でない可能性がある。同書。一定レベルの転移を示す任意の癌が、外科手術のみを通してでは、有効に治療され得ない。同書。
【0008】
放射線療法は、局所的な癌の制御のために使用される別の局所的な(非組織化)形態の処置である。同書(525)。多くの正常細胞は、腫瘍性細胞よりも高い細胞間修復能力を有し、それらを放射線の損傷に対して、より低感受性にする。放射線療法は、照射による損傷に対する感受性における腫瘍性細胞と正常細胞との間のこの差異、および正常細胞が分節的にのみ損傷を受けた場合に十分に機能し続ける正常細胞の能力に依存する。同書。従って、放射線療法の成功は、放射線療法に対する腫瘍周辺の組織の感受性に依存する。同書。放射線療法は、投与部位に一部依存する副作用を付随する。この副作用には、疲労、局所的な皮膚反応、悪心、および嘔吐が挙げられる。同書(526)。さらに、放射線療法は、変異促進性、発癌性、および催奇形性であり、そして患者を、二次性腫瘍を発達させる危険にさらし得る。同書。
【0009】
局所的な治療の他の型が探求されており、これには、局所的過温症(local hyperthermia)(Salcman,M.ら,J Neuro−Oncol.1:225−236(1983))、光放射線治療(Cheng,M.K.ら,Surg.Neurol.25:423−435(1986))、および組織内照射(Gutin,P.H.ら,J Neurosurgery 67:864−873(1987))が含まれる。不幸なことに、これらの治療は、中程度の成功しか満たしていない。
【0010】
局所的処置(例えば、放射線療法および外科手術)は、外科手術技術または高用量の放射線療法を通して到達し得る身体の領域における腫瘍塊を減少させる方法を提供する。しかし、副作用のより少ない、より有効な局所的治療が必要とされる。さらに、これらの処置は、大半の癌患者において最終的に見出される、広範に散在しているかまたは循環している腫瘍細胞の破壊には適用可能でない。腫瘍細胞の蔓延に対抗するために、全身的な治療が使用される。
【0011】
1つのこのような全身的処置が化学療法である。化学療法は、散在性の悪性癌の主要な処置である(Slapak,C.A.およびKufe,D.W.,「Principles of Cancer Therapy」、Harrison’s Principles of Internal Medicine,Fauci,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill Cos.,Inc.,New York,1998,527)。しかし、化学療法剤は、多くの癌の型(多くの一般的な固形腫瘍を含む)を処置するためのその有効性が制限されている。同書。この不全は、多くの腫瘍細胞の固有または獲得性の薬物耐性に一部起因する。同書(533)。化学療法剤の使用に対する別の欠点は、その重篤な副作用である。同書(532)。これらとしては、骨髄抑制、悪心、嘔吐、毛髪喪失、および口内の潰瘍化が挙げられる。同書。明らかに、化学療法剤が、同時に全身的毒性を回避しつつ、悪性腫瘍細胞を殺傷し得る有効性を増強するための新たなアプローチが必要である。
【0012】
(2.中枢神経系腫瘍によって提示されるチャレンジ)
癌の処置における別の問題は、特定の型の癌(例えば、神経膠腫(これは、ヒト脳において生じる最も一般的な原発性悪性疾患である))が、現在の処置様相に抗するということである。外科手術、化学療法、および放射線療法にも関わらず、多形性膠芽腫(最も一般的な神経膠腫)は、ほぼ一般的に致死的である(Schoenberg,Oncology of the Nervous System,M.D.Walker編,Boston,Mass.,Martinus Nijhoff(1983);Levinら,第46章、Cancer:Principles and Practice of Oncology,第2巻,第3版,De Vitaら編,Lippincott Press,Philadelphia(1989),1557−1611頁)。
【0013】
神経膠腫は、原発性脳腫瘍全体のほぼ40%を表し、多形性膠芽腫が、大半の悪性形態を構成する(Schoenberg,「The Epidemiology of Nervous System Tumors」、Oncology of the Nervous System,Walker編,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1983))。現在の処置様相(外科手術、放射線療法および/または化学療法)で仮定すると、この高い悪性度分類型の星状細胞腫を有するヒトについて、5年の生存率は5%未満である(Mahaleyら,Neurosurgery 71:826−836(1989);Schoenberg,Oncology of the Nervous System,Walker編,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1983);Kimら,J.Neurosurg.74:27−37(1991),Daumas−Duportら,Cancer 2:2152−2165(1988))。放射線療法後に、膠芽腫は通常、局所的に再発する。Hochberg,F.H.ら,Neurology 30:907−911(1980)。膠芽腫を有する個体における神経学的機能不全および死亡は、腫瘍の局所的増殖に起因する。全身的な転移は稀である。同書。この理由のために、全身的な方法ではなく局部的(regional)な癌治療方法が、膠芽腫の処置に特に適切であり得る。
【0014】
さらに、膠芽腫は、この腫瘍型に特徴的な増殖におそらく起因して、多くの化学療法剤に対して耐性である。多くの化学療法剤は、細胞周期活性(すなわち、主に活性に周期運動中の細胞(cycling cell)に対して細胞傷害性)である(Slapak,C.A.,およびKufe,D.W.,「Principles of Cancer Therapy」、Harrison’s Principles of Internal Medicine,Fauci,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill Cos.,Inc.,New York,1998,527)。一般的に、化学療法は、少量の腫瘍負荷(ここで、腫瘍の増殖比が最大である)を有する癌に対して最も有効である。同書。膠芽腫瘍についての増殖比は、わずか30%であり、残りの70%の細胞は、G0である休止期にある(G0における細胞は死滅であり得るか、または活性な細胞周期に再エントリーし得る)(Yoshiiら,J.Neurosurg.65:659−663(1986))。活性に分裂する30%の膠芽腫細胞が、この腫瘍の致死的な進行に寄与するが、休止性の70%は、活性に増殖している細胞を標的化する多くの化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性を担う。
【0015】
不幸なことに、局部的な処置(例えば、外科手術および放射線療法)もまた、膠芽腫の処置における成功は限られていることが見出されている(Burgerら,J Neurosurg.58:159−169(1983);Wowraら,Acta Neurochir.(Wien)99:104−108(1989);Zamoranoら,Acta Neurochir.補遺(Wien)46:90−93(1989))。膠芽腫の外科的処置は、腫瘍と周辺の実質との間の明確な境界線の欠如によって、そして原発部位から伸長する白質路(tract)における腫瘍細胞の移動によって妨害され(Burgerら、J.Neurosurg.58:159−169(1983))、これらがその完全な除去を妨げている。急速に増殖している細胞を標的化する放射線療法は、膠芽腫における低い増殖比によって、そして隣接する正常細胞の放射線感受性によって、制限される(Wowraら,Acta Neurochir.(Wien)99:104−108(1989);Zamoranoら,Acta Neurochir.補遺(Wien)46:90−93(1989))。従って、脳腫瘍を処置するための新たなアプローチが特に必要とされる。
【0016】
(B.ウイルスを使用する、癌治療に対する非伝統的アプローチ)
癌治療に対する1つの非伝統的アプローチは、腫瘍性細胞を標的化するために、変異ウイルスを使用する。Chung,R.Y.およびChiocca,E.A.,Surg.Oncol.Clin.N.Am.7:589−602(1998)を参照のこと。
【0017】
提案されたウイルスによる癌治療は、以下の2つの異なるアプローチを包含する:(1)変異誘発されたウイルスによる、直接的な細胞殺傷(腫瘍崩壊)(Martuzaら,Science 252:854−856(1991);Minetaら,Nature Med 1:938−943(1995);Boviatsisら,Cancer Res.54:5745−5751(1994);Kesariら,Lab.Invest.73:636−648(1995);Chambersら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:1411−1415(1995);Lorence,R.M.ら,J.Natl.Cancer.Inst.86:1228−1233(1994);Bischoffら,Science 274:373−376(1996);Rodriguezら,Cancer Res.57:2559−2563(1997));および(2)導入遺伝子(この発現産物が化学療法剤を活性化する)を送達するためのウイルスベクターの使用(Weiら,Human Gene Therapy 5:969−978(1994);ChenおよびWaxman,Cancer Res.55:581−589(1995);Moolten,Cancer Gene Ther.1:279−287(1994);Fakhraiら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 93.2909−2914(1996);Rothら,Nature Med.2:985−991(1996);Moolten,Cancer Res.46:5276−5281(1986);Chenら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 91.3054−3057(1994))。
【0018】
(1.ウイルス性腫瘍崩壊)
腫瘍崩壊剤として使用するためのウイルスの遺伝子操作は、当初、複製能を有さない(replication−incompetent)ウイルスの使用に焦点を当てていた。このストラテジーによって、ウイルスによる非腫瘍細胞への損傷を予防することが期待された。このアプローチの主な制限は、これらの複製能を有さないウイルスが、宿主細胞中に組み込まれ得、および/または複製し得るために、ヘルパーウイルスを必要とすることであった。ウイルスによる腫瘍崩壊アプローチの1つの例である、神経系腫瘍を処置するための複製欠損レトロウイルスの使用は、ウイルスを伝播させるために、プロデューサー細胞株の移植を必要とする。これらのレトロウイルスは、その有効性が制限されている。なぜなら、各複製欠損レトロウイルス粒子は、単一の細胞にのみ進入し得、そしてその後、他の細胞に生産的に感染し得ないからである。従って、これらは、プロデューサー細胞から離れて伝播し得ず、そしてインビボで、深部の多層化腫瘍に完全には侵入し得ない(Markertら,Neurosurg.77:590(1992);Ramら,Nature Medicine 3:1354−1361(1997))。
【0019】
より近年では、腫瘍崩壊性ウイルスの遺伝子操作は、他の腫瘍細胞にウイルスが伝播するのを可能にしつつ、全身的感染を回避する試みにおける条件的複製(replication−conditional)ウイルスの生成に焦点を当てていた。条件的複製ウイルスは、活性に分裂している細胞(例えば、腫瘍細胞)において優先的に複製するように設計される。従って、これらのウイルスは、腫瘍崩壊のために腫瘍細胞を標的化するべきであり、そしてこれらの細胞において複製するべきであり、その結果、ウイルスは他の腫瘍細胞に伝播し得る。
【0020】
抗癌剤として条件的複製ウイルス変異体を作製するための、いくつかの近年のストラテジーは、条件的複製性にさせるための、選択されたアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)遺伝子の変異を使用していた(Martuza,R.L.ら,Science 252:854−856(1991);Mineta,T.ら,Nature Med 1:938−943(1995);Boviatsis,E.J.ら,Cancer Res.54:5745−5751(1994);Kesari,S.ら,Lab.Invest.73:636−648(1995);Chambers,R.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:1411−1415(1995);Lorence,R.M.ら,J.Natl.Cancer.Inst.86:1228−1233(1994);Bischoff,J.R.ら,Science 274:373−376(1996);Rodriguez,R.ら,Cancer Res.57:2559−2563(1997))。例えば、E1B−55Kdをコードする遺伝子において欠失を有するアデノウイルスは、p53欠損腫瘍細胞において選択的に複製することが示されている(Bischoff,J.R.ら,前出)。
【0021】
単一遺伝子における条件的複製HSV変異体の2つの広範な型が、現在までに研究されている。第一は、核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ(Martuza,R.L.ら,Science 252:854−856(1991)),リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)(Goldstein,D.J.&Weller,S.K.,J Virol.62:196−205(1988);Boviatsis,E.J.ら,Gene Ther.1:323−331(1994);Boviatsis,E.J.ら,Cancer Res.54:5745−5751(1994);Mineta,T.ら、Cancer Res.54:3363−3366(1994)),または、ウラシル−N−グリコシラーゼ(Pyles,R.B.およびThompson,R.I.,J Virol.68:4963−4972(1994))の機能において欠損を有する有するウイルス変異体から構成される。
【0022】
第二は、γ34.5遺伝子の機能において欠損を有するウイルス変異体から構成される(Chambers,R.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:1411−1415(1995))。これらは、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して、感染細胞のウイルス放出量を著しく増大させることによって、毒性因子として機能する(Chou,J.ら,Science 250:1262−1266(1990);Chou,J.およびRoizman,B.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 89:3266−3270(1992))。
【0023】
これらの単一変異体株は、特定の固有の制限を有しており、この制限には、TK変異体についてのガンシクロビルおよびアシクロビルに対する耐性(Mineta,T.ら,Cancer Res.54:3363−3366(1994))、野生型ウイルスとの単回の組換え事象による野生型への復帰変異の危険性、および少なくとも特定の腫瘍細胞株におけるγ34.5変異体についての腫瘍崩壊効力の減少(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997);Mohr.I.& Bluzman,Y.,EMBO J 15:4759−4766(1996);Toda,M.ら,Hum.Gene Ther.9:2177−2185(1998))が含まれる。
【0024】
野生型組換えの危険性を減少させる試みにおいて、多重に変異させたHSVウイルスが開発された。これらは、変異体G207(Mineta,T.ら,Nat.Med 1:938−943(1995);Martuzaらに対する米国特許第5,585,096号(1996年12月17日付発行))、およびMGH1(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997)(これは、γ34.5の両方のコピーの欠失およびRRの挿入性変異を有する)を含む。
【0025】
別の多重に変異させたHSVウイルスは、γ34.5/ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)変異体株3616UB(Pyles,R.B.ら,Hum.Gene Ther.8:533−544(1997))である。これらの二重変異体株は、直接的な頭蓋内注射に際して、神経毒性の著しい減少を示し、ガンシクロビルに対する感受性を保持し、そして正常組織と比較して、腫瘍細胞において相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異体HSV株は、欠損性のγ34.5遺伝子を保持し、従って、正常組織に対してほとんど毒力を示さない。これらは明らかに、腫瘍細胞に対して腫瘍崩壊効果を示すが、このような効果は、インタクトなγ34.5遺伝子を有する変異体において観察されるよりも小さい(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997);Qureshi,N.およびChiocca,E.A.未公開データ)。他方で、インタクトなγ34.5遺伝子によって示される毒性は、腫瘍崩壊剤としての後者のウイルスの潜在的な適用を減少させ得る。
【0026】
(2.抗癌性導入遺伝子のウイルス性送達)
ウイルスによる癌治療の第二のアプローチが、抗癌性導入遺伝子のウイルス性送達であり、これによって、標的腫瘍細胞の表現型を遺伝的に改変して、腫瘍の薬物感受性および応答性を増加させる。このアプローチは、さもなくば無害である因子に対する感受性を付与するために、プロドラッグ活性化酵素をコードする「化学的感作」または「自殺」遺伝子を悪性細胞に直接移動させることを包含する(Moolten,F.L.,Cancer Gene Therapy 1:279−287(1994);Freeman,S.M.ら,Semin.Oncol.23:31−45(1996);Deonarain,M.P.ら,Gene Therapy 2:235−244(1995))。
【0027】
いくつかのプロドラッグ活性化遺伝子は癌遺伝子治療における適用のために研究されてきている。1つの例において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)と、プロドラッグガンシクロビルとの組合せは、癌遺伝子治療におけるその可能な適用に関して当該分野における公知のプロトタイプのプロドラッグ/酵素活性化系を代表する。HSV−TKは、プロドラッグであるガンシクロビルをリン酸化し、そして活発に分裂する細胞におけるDNA鎖の終結および細胞死ヌクレオシドアナログを生成する。HSV−TKで形質導入された腫瘍細胞は、ガンシクロビルに対する感受性を獲得する。ガンシクロビルは、もともとウイルス感染の処置のために設計された臨床的に証明された薬剤である。Moolten,F.L.and Wells,J.M.,J.Natl.Cancer Inst.82:297−300(1990);Ezzeddine,Z.D.,et al.,New Biol.3:608−614(1991)。
【0028】
第二の例において、細菌遺伝子シトシンデアミナーゼ(CD)は、公知の癌化学療法剤である5−フルオロウラシルに対しその形質転換の結果、抗真菌剤5−フルオロシトシンに対して腫瘍細胞を感受性にさせることが示されたプロドラッグ/酵素活性化系である(Mullen,C.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:33−37(1992);Huber,B.E.,et al.,Cancer Res.53:46194626(1993);Mullen,C.A.,et al.,Cancer Res.54:1503−1506(1994))。
【0029】
これらの薬物感受性遺伝子を用いた最近の研究は、有望な結果を得ている。例えば、以下を参照のこと:Caruso,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7024−7028(1993);Oldfield,E.,et al.,Hum.Gene Ther.4:39(1993);Culver,K.,Clin.Chem 40:510(1994);O’Malley,Jr.,B.W.,et al.,Cancer Res.56:1737−1741(1996);Rainov,N.G.,et al.,Cancer Gene Therapy 3:99−106(1996)。
【0030】
いくつかの他のプロドラッグ活性化酵素系もまた、研究されている(T.A.Connors,Gene Ther.2:702−709(1995))。これらには、細菌の酵素であるカルボキシペプチダーゼG2(これは、哺乳動物ホモログを有さず、そしてグルタミン酸部分の切断によって特定の合成マスタードプロドラッグを活性化するために使用され、活性な細胞傷害性マスタード代謝物を放出させ得る(Marais,R.,et al.,Cancer Res.56:4735−4742(1996)))、およびE.coliニトロレダクターゼ(これは、プロドラッグCB1954および関連するマスタードプロドラッグアナログを活性化する(Drabek,D.,et al.,Gene Ther.4:93−100(1997);Green,N.K.,et al.,Cancer Gene Ther.4:229−238(1997))が挙げられ、これらのいくつかは、CB1954よりも優れ得る(Friedlos,F.et al.,J Med Chem 40 :1270−1275(1997)))が含まれる。プロドラッグ活性化遺伝子治療に対するこれらのアプローチの元にある原理は、腫瘍細胞集団の外来遺伝子での形質導入によって、その細胞において、独特のプロドラッグ活性化能力、それゆえ、その遺伝子を発現しない宿主細胞にはない化学感受性が付与されることである。
【0031】
より最近になって、薬物活性化/遺伝子治療戦略は、P450遺伝子(「CYP」または「P450」)触媒モノオキシゲナーゼ反応を通じて活性化される癌化学療法剤との組合わせたシトクロムP450に基づいて開発されてきている(Chen,L.and Waxman,D.J.,Cancer Research 55:581−589(1995);Wei,M.X.,et al.,Hum.Gene Ther.5:969−978(1994);米国特許第5,688,773号、1997年11月18日発行)。上記のプロドラッグ活性化戦略とは異なり、P450に基づくの薬物活性化戦略は、(細菌またはウイルスに由来する遺伝子ではなく)哺乳動物薬物活性化遺伝子を利用し、そしてまた、癌療法において広汎に使用される、確立した化学療法剤を利用する。
【0032】
多くの抗癌薬物は、シトクロム450酵素によって酸素化されて腫瘍細胞に対して細胞傷害性または細胞分裂抑止性である代謝物を生成することが知られている。これらには、いくつかの一般に使用される癌化学療法剤が含まれる(例えば、シクロホスファミド(CPA)、その異性体であるイフォスファミド(IFA),ダカルバジン、プロカルバジン、チオテパ、エトポシド、2−アミノアントラセン、4−イポメアノール、およびタモキシフェン(LeBlanc,G.A.and Waxman,D.J.,Drug Metab.Rev.20:395−439(1989);Ng,S.F.and Waxman D.J.,Intl.J.Oncology 2:731−738(1993);Goeptar,A.R.,et al.,Cancer Res.54:2411−2418(1994);van Maanen,J.M.,et al.,Cancer Res.47:4658−4662(1987);Dehal,S.S.,et al.,Cancer Res.57:3402−3406(1997);Rainov,N.G.,et al.,Human Gene Therapy 9:1261−1273(1998))。
【0033】
このアプローチの1つの例において、腫瘍細胞は、高速度のCPAおよびIFA活性化を示す肝臓P450酵素をコードするCYP2B1の形質導入によってCPAまたはIFAに対して高度に耐性にされる(Clarke,L.and Waxman,D.J.,Cancer Res.49:2344−2350(1989);Weber,G.F.and Waxman,D.J.,Biochem.Pharmacol.45:1685−1694(1993))。この亢進された化学感受性は、インビトロおよび皮下齧歯類固形腫瘍モデルおよびヌードマウスにおいて増殖させたヒト胸部腫瘍を用いたインビボの研究の両方で実証されている。そして、これは、これらの動物における薬物活性化のための実質肝関連能力の存在にもかかわらず、驚くほど有効である。(Chen,L.,et al.,Cancer Res.55:581−589(1995);Chen,L.,et al.,Cancer Res.56:1331−1340(1996))。このP450に基づくのアプローチはまた、脳腫瘍の処置における遺伝子適用のために顕著な有用性を示す(Wei,M.X.,et al.,Human Gene Ther.5:969−978(1994);Manome,Y.,et al.,Gene Therapy 3:513−520(1996);Chase,M.,et al.,Nature Biotechnol.16:444−448(1998))。
【0034】
プロドラッグ活性化または「自殺」遺伝子を含む導入遺伝子に加えて、他の型の抗癌導入遺伝子もまた研究されており、これらには、サイトカイン遺伝子(腫瘍に対する免疫防御を増強するため)(Blankenstein,T.,et al.,J.Exp.Met.173:1047−1052(1991);Colombo,M.P.,etal.,Cancer Metastasis Rev.16:421−432(1997);Colombo,M.P.,et al.,Immunol.Today 15:48−51(1994))、および他の殺腫瘍性遺伝子(例えば、ジフテリア毒素(Coll−Fresno,P.M.,et al.,Oncogene 14:243−247(1997))、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子(tumor vaccination gene)、癌抑制遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスRNA、およびリボザイム(Zaia,J.A.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:95−106(1992))。
【0035】
ウイルスに基づくアプローチおよび遺伝子に基づくのアプローチは、腫瘍動物モデルにおいて顕著な治療効果の証拠を提供してきているが、各々の方法は、固有の限界という問題がある。ウイルスに基づくアプローチは腫瘍塊において広がったウイルスの広汎な複製に関する可能性を理論的には提供するものの、その効果は、以下により制限される:ウイルス感染の効率;いくつかのウイルスベクターについてのヘルペスウイルスまたはプロデューサー細胞株の要件;他のウイルスベクターについてウイルス変異体増殖を補完する細胞因子に関する腫瘍細胞異種性(Sidranski et al.,355:846−847(1992);Bigner et al,J.Neuropathol.Exp.Neurol.40:201−229(1981));ならびに抗ウイルス免疫応答。
【0036】
これまで試験された遺伝子ベーアプローチにおいて、腫瘍塊内の細胞の形質導入の効率は、ベクターの欠損特性により制限される。事実、陽性導入される細胞の大部分は、ベクター接種の部位からいくつかの細胞層内で生じる(Nilaver et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 21:98299833(1995);Muldoon et al.,Am.J.Pathol.147:1840−1851(1995);Ram Z.et al.,J.Neurosurg.82,343A(abst.)(1995))。さらに、プロデューサー細胞株が不必要であるかまたは自殺遺伝子/薬物組合せにより殺傷されないウイルスベクター系についてでさえ、ウイルス複製は、使用される薬物により阻害され得る。さらに、自殺遺伝子/薬物組合せがTK/GCVである場合、薬物が腫瘍細胞を殺傷する能力は、GCVはDNA複製のプロセスにおける細胞のみを標的とすることから、その細胞の細胞周期の段階によって制限を受ける。従って、これらの複製欠損ベクターによって治療遺伝子送達が接種部位から離れた腫瘍細胞に影響を与えることは、治療遺伝子がサイトカインまたはCPA代謝物のような自由に拡散する抗癌剤を生成する場合においてでさえ、ありそうもない。
【0037】
従って、正常組織に対して毒性を欠如したまま腫瘍または他の標的化された細胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する安全かつ効率のよいウイルス変異体についての必要性が継続して存在する。
【0038】
(発明の要旨)
従って、本発明は、先行技術の不利益を、γ34.5の作用を転写再標的化することによりウイルス腫瘍崩壊性について腫瘍性細胞を選択的に標的化し得るヘルペスウイルス変異体を提供することによって、克服する。本発明のヘルペスウイルス変異体はまた、他の細胞集団もまた標的化し得る。
【0039】
具体的ではあるが非限定的な例において、本発明者らは、γ34.5遺伝子を細胞周期調節されたB−mybプロモーターの転写制御下でRR/γ34.5二重変異体株(MGH1)に再導入した。これらは、この新規な腫瘍崩壊性ウイルス(「Myb34.5」と呼ばれる)が野生型γ34.5遺伝子を有した単一のRR変異体ウイルスと同じぐらい腫瘍崩壊性を保持したが、なおもγ34.5−欠失変異体のものと類似する有利な毒性プロファイルを保持したことを実証した。従って、これらの知見は、感染した細胞のタンパク質合成の遮断を妨害することを担うウイルス遺伝子の転写再標的化が選択的腫瘍崩壊性を達成するための道筋を提供することを示す。従って、γ34.5の発現の転写再標的化は、腫瘍または他の標的化細胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する。
【0040】
本発明の1つの実施形態において、ヘルペスウイルス変異体は、γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおいて欠失または不活化変異を含み、ここで、γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーは細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下で再導入される。
【0041】
当然、γ34.5遺伝子に加え、ヘルペスウイルス遺伝子の1を超える特異的内因性欠失または不活化変異が存在し得る。これらには、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、またはより特定するとRRのラージサブユニットをコードする遺伝子における欠失が包含される。あるいは、RRをコードする遺伝子は、スモールサブユニット(UL40)をコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺伝子もまた欠失され得る(例えば、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルRNADNAグリコシラーゼ(UNG)またはdUTPaseなど)。これらのウイルス遺伝子が好ましい。なぜなら、これらの遺伝子の哺乳動物ホモログはしばしば、腫瘍性細胞のようなE2Fの上昇したレベルを伴う細胞においてアップレギュレーションされており、従って欠失したウイルス酵素を補完し得、それによりこれらの細胞における選択的複製を促進するからである。
【0042】
別の実施形態において、本発明のヘルペス変異体は、その産物が腫瘍細胞に対して細胞毒性であり得る導入遺伝子を送達し得る。例えば、この導入遺伝子は、化学療法剤(例えば、HSV−TK、CDのような自殺遺伝子またはシトクロムP450)を活性化し得るかまたは増強し得る。あるいは、その導入遺伝子は、腫瘍免疫原性を増強するサイトカイン遺伝子(例えば、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン類(IL−2、IL−4)、インターフェロンγ、顆粒球マクロファージ刺激因子(GM−CSF)、癌抑制遺伝子または当業者に公知の他の任意の殺腫瘍性遺伝子(例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスRNAまたはリボザイム))であり得る。従って、この実施形態において、ヘルペス変異体は、さらに、化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換し得る遺伝子産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または他の任意の腫瘍殺傷遺伝子を含む。この導入遺伝子は、もとのγ34.5欠失またはUL40の遺伝子座のどこかに挿入され得る。
【0043】
本発明は、上記ヘルペスウイルス変異体の好ましい実施形態を提供する。ここで、この導入遺伝子は、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をコードする。そのような自殺遺伝子の特に好ましい例は、哺乳動物シトクロムP450である。より特定すると、このシトクロムP450は、P450 2B1であり得、、またはあるいは、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11またはP450 3A4であり得る。P450 2B1は、特に好ましい。そのような自殺遺伝子が上記ウイルス変異体に存在する場合、活性化される化学療法剤は、オキサゾホリンクラスのメンバーである。特に、シクロホスファミド、イフォスファミド、N−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イフォスファミド、ポリマー性N−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
【0044】
本発明はまた、上記ヘルペスウイルス変異体の実施形態を提供する。ここで、そのヘルペスウイルス変異体は、単純ヘルペスウイルスであり、そしてより特定すると、その変異体は、単純ヘルペスウイルス(HSV)1型または2型である。HSV−1は特に好ましい。
【0045】
本発明の非常に好ましい実施形態において、そのヘルペスウイルス変異体は、HSV−1から誘導され、そして以下を含む:(a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活化変異;および(b)γ34.5遺伝子の発現を細胞型特異的および/または腫瘍特異的プロモーターが制御するような、その細胞型特異的および/または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での、そのγ34.5の少なくとも1つのコピーの挿入。
【0046】
γ34.5に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異体もまた、本発明のヘルペスウイルス変異体において存在し得る。ヘルペスRR、TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失は、例示のヘルペスウイルス遺伝子である。
【0047】
この実施形態において、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍型特異的遺伝子発現および/または細胞型特異的な発現を制御する、十分に特定された制御エレメントのいずれか1つであり得る。概説について、以下を参照のこと:Miller,N.and Whelan,J.,Hum.Gene Ther.8 :803−815(1997);Walther,W.and Stein,U.,J.Mol.Med.74:379−392(1996);Schnierle,B.S.and Groner,B.,Gene Therapy 3:1069−1073(1996);Lan,K−H.,etal.,CancerRes.57:4279−4284(1997);Clary,B.M.,et al.,Cancer Gene Therapy 7:565−574(1998);Dachs,G.U.,et al.,Oncol.Res.9:313−325(1997))。
【0048】
腫瘍特異的なプロモーターの代表的な例としては、例えば以下が挙げられる:DF3(MUC1)(これは、乳癌のほとんどにおいて過剰発現される)(Abe,M.and Kufe,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:282−286(1993);Manome,Y.,et al.,Gene Ther.2:685,A051(1995);Chen,L.,et al.,J.Clin.Invest.96:2775−2782(1995));AFP(これは、肝細胞腫において過剰発現される)(Arbuthnot,P.,et al.,Hepatology 22:1788−1796(1995);Ido,A.,et al.,Cancer Res.55:3105−3109(1995));CEA(これは、結腸および肺癌において過剰発現される)(Thompson,J.A.,et al.,J.Clin.Lab.Anal.5:344−366(1991);Osaki,T.,et al.,Cancer Res.54:5258−5261(1994));PSA(これは、前立腺癌において過剰発現される)(Lundwall,A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.161:1151−1156(1989));チロシナーゼ(これは、メラノーマにおいて過剰発現される)(Vile,R.G.and Hart,I.R.,Cancer Res.53:962−967(1993);Vile,R.G.and Hart,I.R.,Ann.Oncol 5(Suppl.4):S59−S65(1994);Hart,I.R.,et al.,Curr.Opin.Oncol.6 :221−225(1994));およびc−erbB2(これは、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌において過剰発現される)(Hollywood,D,and Hurst,H.,EMBO J 12:2369−2375(1993))。
【0049】
好ましい実施形態において、腫瘍特異的プロモーターはB−mybである。上記ヘルペスウイルス変異体の特に好ましい実施形態において、ウイルス変異体は、Myb34.5である。
【0050】
例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる:内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999));膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albarracinら、Endocrinology 140:2415−2421(1999));破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.274:5588−5596(1999));骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.103:373−381(1999));ノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.Neurochem.71:1813−1826(1998))。
【0051】
本発明はまた、上記のヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供し、この方法は、この腫瘍性細胞にこのヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、このウイルス変異体は、以下の工程:(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活化変異;および(b)この腫瘍特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入を含み、その結果、このプロモーターが、このγ34.5遺伝子の発現を駆動する、工程;ならびに、この腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程、を包含する。
【0052】
腫瘍特異的プロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられる:DF3(MUC1)(これは、大部分の乳癌において過剰発現される)(Abe,M.およびKufe,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:282−286(1993);Manome,Y.ら、Gene Ther.2:685,A051(1995);Chen,L.ら、J.Clin.Invest.96:2775−2782(1995));AFP(これは、ヘパトームにおいて過剰発現される)(Arbuthnot,P.ら、Hepatology 22:1788−1796(1995);Ido,A.ら、Cancer Res.55:3105−3109(1995));CEA(これは、結腸癌および肺癌において過剰発現される)(Thompson,J.A.ら、J.Clin.Lab.Anal.5:344−366(1991);Osaki,T.ら、Cancer Res.54:5258−5261(1994)9;PSA(これは、前立腺癌において過剰発現される)(Lundwall,A.、Biochem.Biophys.Res.Commun.161:1151−1156(1989));チロシナーゼ(これは、黒色腫において過剰発現される)(Vile,R.G.およびHart,I.R.、Cancer Res.53:962−967(1993);Vile,R.G.およびHart,I.R.、Ann.Oncol 5(補遺4):S59−S65(1994);Hart,I.R.ら、Curr.Opin.Oncol.6:221−225(1994));およびc−erbB2(これは、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌において過剰発現される)(Hollywood,D.およびHurst,H.EMBO J 12:2369−2375(1993))。
【0053】
好ましくは、腫瘍特異的プロモーターは、B−mybである。この方法の特に好ましい実施形態において、ウイルス変異体は、Myb34.5である。
【0054】
γ34.5に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異が、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘルペスのRR、TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失が、例示的なヘルペスウイルス遺伝子である。
【0055】
さらに、本発明は、このヘルペスウイルス変異体が、導入遺伝子をさらに含み、この導入遺伝子が、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の殺腫瘍性遺伝子である、腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための上記方法を提供する。この導入遺伝子が、自殺遺伝子である場合、次いで、この方法は、この自殺遺伝子によって活性化され得る化学療法剤をこの腫瘍性細胞に接触させる工程、およびこの腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、シトクロムP450である。P450 2B1が、特に好ましい。あるいは、そのコードされるシトクロムP450は、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4である。さらに、この化学療法剤は、好ましくは、オキサゾスフォリン(oxazosphorine)クラスのメンバー、特に、シクロホスファミド、イホスファミド、N−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソ尿素、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イホスファミド、ポリマー性N−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソ尿素である。
【0056】
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に除去するための方法を提供し、この方法は、以下の工程:この標的細胞にこのヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、このウイルス変異体は、(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活化変異;および(b)この細胞特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入を含み、その結果、このプロモーターが、このγ34.5遺伝子の発現を駆動する、工程;ならびに、この標的細胞を選択的に除去する工程、を包含する。
【0057】
例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる:内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999));膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albarracinら、Endocrinology 140:2415−2421(1999));破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.274:5588−5596(1999));骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.103:373−381(1999));ノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.Neurochem.71:1813−1826(1998))。
【0058】
γ34.5に加えて、他のヘルペスウイルス遺伝子における欠失または変異が、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘルペスのRR、TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失が、例示的なヘルペスウイルス遺伝子である。
【0059】
この実施形態の例示的適用としては、以下が挙げられる。
【0060】
1)有害な細胞集団を除去するための治療的選択肢:例えば、血管の過増殖性の新脈管形成が存在する状態(例えば、脳性モヤモヤ病)において、γ34.5遺伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、この疾患を引き起こす血管の選択的除去を可能にする。別の例は、高度の骨の再造形および骨の除去が存在する状態(例えば、骨粗しょう症)において、γ34.5の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ9または副甲状腺ホルモンレセプターの使用は、骨のさらなる再造形から骨の破骨細胞を除去する。
【0061】
2)発生プロセスを研究するため:発生プロセスに対する細胞集団の除去の効果を研究するために、例えば、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼプロモーターを使用してノルアドレナリン作動性ニューロンを除去し得、次いで、動物発生に対する効果を研究し得る。
【0062】
本発明の別の実施形態は、任意の前述のウイルス変異体を含む薬学的組成物であり、この組成物はまた、1以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。
【0063】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示し、例示目的のみで提供されることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるからである。
【0064】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
本発明は、ウイルス媒介性腫瘍崩壊単独またはウイルス媒介性腫瘍崩壊および自殺遺伝子治療の組み合わせによる、腫瘍性細胞の選択的殺傷に関する。本発明は、ヘルペスウイルス変異体、このヘルペスウイルス変異体を使用して腫瘍性細胞を選択的に殺傷する方法、およびこのウイルス変異体を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して、標的細胞集団を選択的に除去するための方法を提供する。
【0065】
より詳細には、本発明は、(a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活化変異;および(b)腫瘍特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入を有するように遺伝子操作され、その結果、このプロモーターが、このγ34.5遺伝子の発現を駆動する、ヘルペスウイルス変異体を提供する。このヘルペスウイルス変異体はまた、他のヘルペスウイルス遺伝子(例えば、RR,TK、UNG、およびdUTPaseのような)における1以上のさらなる欠失または変異を含み得る。このヘルペスウイルス変異体はまた、化学療法剤を活性化する産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の他の殺腫瘍性遺伝子を送達し得る。
【0066】
(ヘルペスウイルス変異体の設計)
本発明のヘルペスウイルス変異体は、いくつかの異なる型のヘルペスウイルスから誘導され得る。本発明のウイルス変異体を誘導するために使用され得るヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスが挙げられる。
【0067】
単純ヘルペスウイルスが、特に興味深い。「単純ヘルペスウイルス」によって、上記のような欠失または不活化変異を含む亜科ヘルペスウイルス科α(herpesviridae alpha)の任意のメンバーが意図される。本発明の好ましい実施形態は、HSV−1またはHSV−2を使用して、ヘルペスウイルス変異体を作製し、HSV−1が、最も好ましい。
【0068】
HSV−1は、実質的に全ての脊椎動物細胞を感染し得る、ヒト神経向性ウイルスである。自然感染は、溶解性の複製サイクルを伴うか、または潜伏(通常、末梢神経節において)を確立するかのいずれかであり、DNAは、エピソーム状態で不明確に維持される。HSV−1は、153キロベース長の二本鎖の直鎖状DNAゲノムを含み、McGeochによって完全に配列決定されている(McGeochら、J.Gen.Virol.69:1531(1988);McGeochら、Nucleic Acids Res 14:1727(1986)lMcGeoch、J.Mol.Biol.181:1(1985);PerryおよびMcGeochら、J.Gen.Virol.69:2831(1988))。DNA複製およびビリオン構築は、感染された細胞の核において生じる。感染後期で、コンカテマーウイルスDNAが、ゲノム長分子に切断され、この分子がビリオンにパッケージングされる。CNSにおいて、単純ヘルペスウイルスは、経ニューロン的に伝播し、その後、核へ軸索内輸送され(逆行的または順行的のいずれか)、ここで、複製が生じる。
【0069】
(ヘルペスガンマ(γ)34.5遺伝子)
公開された結果は、ヘルペスγ34.5遺伝子の少なくとも1つの機能が、ウイルス感染への宿主細胞応答を妨げること、すなわち、アポトーシス様応答における宿主タンパク質合成遮断の誘因であることを示した(Chou,J.ら、Science 250:1262−1266(1990);Chou,J.およびRoizman,B.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266−3270(1992);Chou,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10516−10520(1995))。類似した機能は、病原性ウイルスの間に広まっている(Cosentino,G.P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9445−9449(1995);Gale,M.,Jr.ら、Mol.Cell Biol.18:5208−5218(1998);Katze,M.G.ら、Trends Microbiol.3:75−78(1995);Sharp,T.V.ら、Nuc.Acids Res.21:4483−4490(1993))。
【0070】
γ34.5は、Vero細胞の培養物中でウイルス増殖に必須ではないが、γ34.5は、ウイルスがマウスの中枢神経系(CNS)で広がることを可能にし、そしてCNS複製において以前に関連付けられたHSVゲノムの領域をマップする(Markovitz,N.S.ら、J.Virol.71:5560−5569(1997);Centifanto−Fitzgerald,Y.M.ら、J.Esp.Med.155:475−489(1982))。これは、γ34.5にコードされるタンパク質が、二本鎖RNA依存性キナーゼ(PKR)を阻害する事実に起因し得る。二本鎖RNA分子への曝露(ウイルス感染によって通常見出されるように)の際、PKRは、伸長開始因子eIF−2のαサブユニットをリン酸化し、タンパク質合成の阻害を引き起こす(Chou,J.ら、Science 250:1262−1266(1990);Chou,J.およびRoizman,B.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266−3270(1992);Chou,J.ら、J.Virol.68:8304−8311(1994))。γ34.5を発現し得ない変異を有する神経細胞起源の細胞の感染は、ウイルス産生の結果として起こる限定を伴って、細胞タンパク質合成の遮断を引き起こす。
【0071】
要約すると、γ34.5の存在下において、HSVは、アポトーシスを回避し、このようにして子孫のウイルスの産生を可能にする。γ34.5の非存在下において、細胞は死滅し、そして感染性HSVは、子孫のウイルスを産生し得ない。従って、器官を通じたHSVの感染/増殖は、排除される。
【0072】
従って、本発明の腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーター/γ34.5アプローチは、このプロモーターを使用し得る細胞中のウイルス産生を可能にするが、このプロモーターを刺激し得ない細胞は、感染を伝播しない。
【0073】
本発明のヘルペスウイルス変異体は、γ34.5遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活性化変異を含み、ここで、γ34.5遺伝子の少なくとも1つのコピーは、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターの制御下で再び導入される。
【0074】
本明細書中に使用される場合、用語「欠失」は、遺伝子(例えば、γ34.5遺伝子)からの核酸の排除を意味することを意図する。
【0075】
本明細書中に使用される場合、用語「不活性化変異」は、遺伝子に対する変異または変更の広い意味を意図し、ここで、この遺伝子の発現は、有意に減少されるか、またはここで、遺伝子産物は、非機能的にされるか、または機能に対するその能力は、有意に減少される。
【0076】
用語「遺伝子」は、別な方法で示されない限り、遺伝子産物をコードする領域ならびにこの遺伝子の調節領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)の両方を含む。
【0077】
このような変更を達成するための方法は、以下が挙げられる:(a)この遺伝子産物の発現を破壊する任意の方法、または(b)発現された遺伝子を非機能的にする任意の方法。遺伝子の発現を破壊する多数の方法は公知であり、これらには、挿入、欠失および/または塩基の変更による、この遺伝子のコード領域またはそのプロモーター配列の変更が挙げられる(Roizman,B.およびJenkins,F.J.,Science 229:1208−1214(1985)を参照のこと)。
【0078】
(細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーター)
本発明のヘルペスウイルス変異において、細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターは、γ34.5の発現を駆動するために使用される。このプロモーターは、腫瘍型特異的遺伝子発現および/または細胞型特異的遺伝子発現を制御する十分に特徴付けられた調節エレメントのうちの任意の1つであり得る。総説に関して、Miller,N.およびWhelan,J.、Hum.Gene Ther.8:803−815(1997);Walther,W.およびStein,U.、J.Mol.Med.74:379−392(1996);Schnierle,B.S.およびGroner,B.、Gene Therapy 3:1069−1073(1996);Lan,K−H.ら、Cancer Res.57:4279−4284(1997);Clary,B.M.ら、Cancer Gene Therapy 7:565−574(1998);Dachs,G.U.ら、Oncol.Res.9:313−325(1997)を参照のこと。
【0079】
「プロモーター」は、DNA領域、通常、遺伝子またはオペロンのコード配列の上流を意味することを意図し、これは、RNAポリメラーゼを結合し、そして酵素を正確な転写開始部位に対して指向する。
【0080】
「細胞特異的プロモーター」は、特定の細胞型における発現を指向するプロモーターが意図される。当業者は、「腫瘍特異的」プロモーターがまた、「細胞特異的」プロモーターを考慮に入れ得ること(すなわち、腫瘍細胞に対して特異的である)を理解する。しかし、明確にするために、本明細書中に使用される場合、「細胞特異的プロモーター」は、他に示されない限り、腫瘍特異的プロモーターを除外することを意図する。例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下が挙げられる:内皮細胞で発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flkl)プロモーター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999));膵臓のベータ細胞で発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞で発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albarracinら、Endocrinology 140:2415−2421(1999));破骨細胞およびケラチノサイトで発現されるマトリクスメタロプロテアーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.274:5588−5596(1999));骨細胞で発現される副甲状腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.103:373−381(1999));およびノルアドレナリン作動性ニューロンに発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.Neurochem.71:1813−1826(1998))。
【0081】
細胞周期調節プロモーターはまた、細胞特異的プロモーターの1つの型である。他の細胞特異的プロモーターが、当業者に公知である。
【0082】
このベクター実施形態の適用としては、器官での選択有害細胞集団の排除、ならびに発生の間の器官中の選択集団の排除を研究するための動物モデルが挙げられる。この実施例の例示的な適用としては、以下が挙げられる:
1)有害細胞集団を排除するための処置選択:1つの例において、血管の豊富な新脈管形成が存在する条件(例えば、脳のモヤモヤ病)において、γ34.5遺伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、これらの疾患を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。
【0083】
別の例において、大規模な骨のリモデリングおよび骨の排除(例えば、骨粗鬆症)が存在する条件下において、γ34.5の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテアーゼ9または甲状腺ホルモンレセプターの使用は、骨のさならるリモデリングから骨の破骨細胞を排除する。
【0084】
2)発達の間の器官における選択的な集団の排除効果の研究。例えば、発達プロセスにおける細胞集団の排除効果を研究するために、例えば、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼプロモーターを使用して、ノルアドレナリン作動性ニューロンを排除し、次いで、動物の発達に対する効果を研究し得る。
【0085】
「腫瘍特異的プロモーター」は、正常細胞よりも標的腫瘍細胞において、選択的に誘導されるかまたはより高いレベルで発現されるプロモーターを意図する。本発明のヘルペスウイルス変異体に対する腫瘍標的化の特異性は、腫瘍特異的プロモーターを使用して、原発性腫瘍部位またはその転移のいずれかにおいて、腫瘍細胞中で形質転換された遺伝子の発現を選択的に活性化することによって達成される(Miller,N.およびWhelan,J.、Hum.Gene Ther.8:803−815(1997);Walther,W.およびStein,U.,J.Mol.Med.74:379−392(1996);Schnierle,B.S.およびGroner,B.,Gene Therapy 3:1069−1073(1996);Lan,K−H.ら、Cancer Res.57:4279−4284(1997);Dachs,G.U.ら、Oncol.Res.9:313−325(1997))。
【0086】
腫瘍特異的プロモーターの例としては、以下をコードする遺伝子由来のものが挙げられる:チロシナーゼ(黒色腫に対する標的化を可能にする)(Vile,R.G.およびHart,I.R.、Cancer Res.53:962−967(1993);Vile,R.G.およびHart,I.R.、Ann.Oncol 5(補遺4):S59−S65(1994);Hart,I.R.ら、Curr.Opin.Oncol.6:221−225(1994));c−erbB−2癌遺伝子(乳癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌を標的化する)(Hollywood,D.およびHurst,H.、EMBO J 12:2369−2375(1993)); 癌胎児抗原(CEA)(結腸癌、膵臓癌および胃癌を含む、肺および胃腸の悪性腫瘍を標的化する)(Thompson,J.A.ら、J.Clin.Lab.Anal.5:344−366(1991);Osaki,T.ら、Cancer Res.54:5258−5261(1994));DF3/MUC1(乳癌を標的化する)(Abe,M.およびKufe,D.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:282−286(1993);Manome,Y.ら、Gene Ther.2:685,A051(1995);Chen,L.ら、J.Clin.Invest.96:2775−2782(1995));前立腺特異的抗原(PSA)(前立腺癌を標的化する)(Lundwall,A.、Biochem.Biophys.Res.Commun.161:1151−1156(1989));およびα−フェトプロテイン(AFP)(肝細胞癌腫を標的化する)(Arbuthnot,P.ら、Hepatology 22:1788−1796(1995);Ido,A.ら、Cancer Res.55:3105−3109(1995))。合成遺伝子調節システム(これは、転写制御および別の形態の調節された発現を可能にする)の使用がまた、用いられ得る(Miller,N.およびWhelan,J.、Hum.Gene Ther.8:803−815(1997);Vile,R.G.、Semin.Cancer Biol.5:429−436(1994);Hwang,J.J.ら、J.Virol.70:8138−8141(1996);Massie,B.ら、J.Virol.72:2289−2296(1998))。
【0087】
腫瘍細胞はまた、特定の癌遺伝子を過剰発現することが公知であり、この結果、アップレギュレートされた遺伝子発現を伴う細胞は、そのような遺伝子のプロモーターエレメントを用いて標的化され得る。B−myb癌遺伝子、C−myb癌遺伝子、c−myc癌遺伝子、c−kit癌遺伝子、およびc−erbB2癌遺伝子は、これらの型のいくつかの代表的な例である。B−mybプロモーター(Lyon,J.ら、Crit.Rev.Oncogenesis 5:373−388(1994)を参照のこと)は、コンセンサスE2F結合部位を含み、細胞周期が厳格に調節され、そして事実G0で抑制される(Lam,E.W.およびWatson,R.J.、EMBO J.12:2705−2713(1993);Lam,E.W.ら、Gene 160:277−281(1995);Bennett,J.D.ら、Oncogene 13:1073−1082(1996))。従って、B−mybプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的プロモーターである。
【0088】
十分に特徴付けられたプロモーターを有する任意の癌の型が、本発明の使用に見出される。そのようなプロモーターの例は、Clary,B.M.ら、Cancer Gene Therapy 7:565−574(1998)の表1;Spear,M.A.、Anticancer Research 18:3223−3232(1998)の表I;Walther,W.およびStein,U.、J.Mol.Med.74:379−392(1996)の表2;ならびにDachs,G.U.ら、Oncol.Res.9:313−325(1997)に見出され得る。
【0089】
全てではないがほとんどの上記の腫瘍特異的プロモーターの遺伝子配列は、GenBank配列データベースから入手可能である。
【0090】
(γ34.5に加えた構築物における他の変異/欠失)
本発明のウイルス変異体はまた、任意のウイルス遺伝子(その哺乳動物ホモログは、上昇したレベルのE2Fによってアップレギュレートされる)、ただし、最もこの好ましくは複製に必要とされる遺伝子中にさらなる変異を保有し得る。
【0091】
例えば、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ(mRR)は、細胞周期のG1期の間にアップレギュレートされ、そしてこの転写は、「遊離」のE2Fによって調節される(DeGregoriら、Mol.Cell.Biol.15:4215−4224(1995);Lukasら、Mol.Cell.Biol.16:1047−1057(1996);Dynlachtら、Genes Dev.8:1772−1786(1994))。RR-ウイルス変異体は、新生物性細胞において補体哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ(mRR)の存在に起因して、これらの細胞において選択的に複製すると仮説が立てられている(GoldsteinおよびWeller、J.Virol.62:196−205(1988))。
【0092】
遊離E2Fレベルの上昇は、いくつかの哺乳動物遺伝子(そのウイルスホモログは、ウイルスの複製に必要とされる)の発現の増加を引き起こす。リボヌクレオチドレダクターゼ(mRR)に加えて、これらの遺伝子としては、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、およびウラシルトリホスファターゼ酵素(dUTPase)が挙げられる。これらの遺伝子の1つ以上に変異を含むウイルスは、上昇したレベルの遊離E2Fを有する細胞において、選択的に複製する。従って、本発明は、γ34.5における変異に加えて、これらの遺伝子の1つ以上に変異を有するヘルペスウイルス変異体を含む。本発明の好ましい実施形態において、この変異は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の中である。
【0093】
E2F(E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5を含む)は、pl6、サイクリンD/cdk4、およびpRBを含む細胞周期調節転写カスケードの初期メディエーターのようである(DeGregoriら、Mol.Cell.Biol.15:4215−4224(1995);Lukasら、Mol.Cell.Biol.16:1047−1057(1996;Dynlachtら、Genes Dev.8:1772−1786(1994))。従って、このカスケードに関与する遺伝子における欠失は、増加したレベルのE2Fを導き得、これによって、哺乳動物のRR、TK、UNGおよびdUTPaseのレベルを増加する。例えば、p16、p21および/またはp27の発現に欠失を有する細胞は、サイクリンD、サイクリンDキナーゼ4(Cdk4)および/またはサイクリンDキナーゼ6(Cdk6)のレベルを増化し得、これは、次には増加したpRBのリン酸化を導き得、それによってE2Fを遊離する。さらに、pRB、p107および/またはp130、DP1、DP2、および/またはDP3の発現に欠失を有する細胞はまた、増加したE2Fの遊離を導き得る。
【0094】
大多数の腫瘍は、このカスケードの成分をコードする遺伝子の不活性化を保有し(Uekiら、Cancer Res.56:150−153(1996))、従って、E2Fを遊離し、そして哺乳動物のRR、TK、UNG、およびdUTPaseの転写を可能にする。さらに、他の癌抑制遺伝子または癌遺伝子における変化はまた、増加したレベルの遊離E2Fを導き得、それによって、哺乳動物のRR、TK、UNG、およびdUTPaseのレベルを増加する。従って、RR-ウイルス変異体、TK-ウイルス変異体、UNG-ウイルス変異体、およびdUTPase-ウイルス変異体は、腫瘍細胞の大きな割合を効果的に標的化し得る(特に、「遊離」E2Fの増加を導くpl6/サイクリンD/pRB経路における欠失を保有する場合)。
【0095】
さらに、多くの異なる起源(例えば、肺、胸部、前立腺、脳、肝臓、膵臓、皮膚など)由来の腫瘍細胞は,上昇したレベルのRR、TK、UNG、およびdUTPaseを導く上記の経路において変化を有し、従って、本発明のウイルス変異体に対する標的である。例えば、神経膠腫瘍細胞株(ラット9L細胞、ヒトU87細胞、およびヒトT98細胞)は、p16の不活性化変異(Van Meirら、Cancer Res.54:649−652(1994))、ならびに上昇したレベルのmRRを保有する。従って、これらの細胞は、野生型KOS株に近いレベルまでHSV−1由来のウイルス変異体rRp450の複製を補完し得、一方、検出可能でないレベルのmRRである(かつ正常なp16経路を有する)ニューロンは、補完しなかった。
【0096】
「リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子」は、酵素(リボヌクレオチドレダクターゼ)の任意のサブユニットまたは一部をコードする核酸を意図し、機能的であろうとまたは非機能的であろうと、この核酸が細胞で発現される場合、この部分またはサブユニットが産生される。リボヌクレオチドレセプターダクターゼ(RR)は、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒する、DNA前駆体のデノボ合成における重要な酵素である。HSV−1は、2つの非同一のサブユニットから構成される自分自身のRR(UL39およびUL40遺伝子)をコードする(Duita,J.Gen.Virol.64:513(1983))。ラージサブユニット(140k分子量)(ICP6と命名される)は、スモールサブユニット(38k分子量)と密接に関連している。単純ヘルペスウイルスRRは、非分裂細胞における効率的なウイルス増殖に必要とされることが見出されているが、多数の分裂細胞では必要とされていない(GoldsteinおよびWeller,J.Virol.62:196(1988);GoldsteinおよびWeller,Virol.166:41(1988);Jacobsonら、Virol.173:276(1989))。RRのスモールサブユニットにおける変異はまた、RR活性および神経病原性の喪失を生じるが(Cameronら、J.Gne.Virol.69:2607(1988))、特に好ましいのは、ラージサブユニットにおける変異である。
【0097】
リボヌクレオチドレダクターゼICP6のプロモーター領域は、ICP6構造遺伝子の5’上流配列にマッピングされる(GoldsteinおよびWeller,J.Virol.62:196(1988);SzeおよびHerman,Virus Res.26:141(1992))。RRのスモールサブユニットの転写開始部位(すなわち、UL40)は、ICP6のコード領域内に分類される(McLauchlanおよびClements,J.Gen.Virol.64:997(1983);McGeochら、J.Gen.Virol.69:1531(1988))。
【0098】
HSV−1ゲノムを用いて本明細書中で示されるウイルス変異体に基づいたHSV−2由来のウイルス変異体は、本発明によって包含される。HSV−2は、両方のRRサブユニットを含み;さらに、HSV−2 ICP10は、HSV−1 ICP6に類似性である。Nilasら、Rroteins 1:376(1986);McLaughlanおよびClements,EMBO J.2:1953(1983);SwainおよびHalloway,J.Virol.57:802(1986)。
【0099】
リボヌクレオチドレダクターゼ欠損(RR-)と他の単純ヘルペスウイルス変異体との間の1つの差異は、アシクロビルおよびガンシクロビルに対する過感受性である。当該分野で公知のTK-HSV−1変異体は、これらの抗ウイルス剤に対して抵抗性であるため、これらの変異体は、全身感染または脳炎の事象の際、除去するのが困難であり得る。対照的に、ウイルス脳炎の事象において、TK+ウイルス変異体(例えば、RR-−HSV変異体)は、抗ウイルス治療に対して応答性である。
【0100】
さらに、RR-−HSV変異体は、感染を行なう能力およびインビトロで39.5℃でウイルスDNAを合成する能力が損なわれる(GoldsteinおよびWeller,Virology 166:41(1988))。従って、これらの変異体は、神経毒性が弱毒化され、そして、感染した宿主における熱の事象において、より増殖しそうにない。このような特徴は、弱毒化された神経毒性でなければららない治療ベクターに対して重要であり、そして、ウイルス脳炎の事象の際、抗ウイルス治療を受け入れられる。
【0101】
RR-ウイルス変異体の温度感受性は、本発明のウイルス変異体の別の利点を実証する。ウイルス変異体で処置された患者において、多数の宿主因子(熱、抗ウイルス免疫応答)が、このウイルス変異体の増殖を阻害することが可能である。これらの場合において、化学療法剤および導入遺伝子による活性化を使用した処置(ウイルス変異体によって感染された細胞のための)が、補充的な抗癌処置を提供することが予測される。
【0102】
本明細書中で使用される場合、「変異」は、その遺伝子の発現が有意に減少するか、またはその遺伝子産物が非機能的になるか、または機能に対するその能力が有意に減少する、遺伝子に対する任意の変更をいう。用語「遺伝子」は、遺伝子産物を含むコード領域およびその遺伝子についての調節領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)の両方を含む。このような変更は、遺伝子の非機能的産物を付与するかまたは遺伝子の発現を減少し、その結果、ウイルス変異体は、本発明の性質を有する。さらに、本発明は、目的の1つ以上の遺伝子における1つ以上の変異を有する変異体を含む。従って、「a」は、1つ以上を意図する。
【0103】
このような変更を達成する方法としては:(a)遺伝子の産物の発現を破壊する任意の方法;または(b)発現タンパク質を非機能的にする任意の方法を包含する。遺伝子の発現を破壊することが公知の多数の方法は、挿入、欠失、および/または塩基変化によって、遺伝子またはそのプロモーター配列のコード領域の変更を含むことが公知である。(Roizman,B.およびJenkins,F.J.,Science 229:1208−1214(1985)を参照のこと)。欠失は、好ましい変異である。
【0104】
操作されたウイルスの構築およびDNA配列の遺伝的操作のための方法は、当該分野で公知である。一般的に、これらは、Ausubelら、16章、Current Protocols in Molecular Biology(John WileyおよびSons,Inc.);Paolettiら、米国特許第4,603,112号(1986年7月)を含む。ウイルス学的考慮はまた、Coen、Virology,1990(第2版)Raven Press 123−150頁において、総説される。
【0105】
HSV−1変異体の構築は、例えば、Martuzaら、米国特許第5,585,096号(1996年12月);Roizmanら、米国特許第5,288,641号(1994年2月);Roizman,B.およびJenkins,F.J.Science 229:1208−1214(1985);Johnsonら、J.Virol.66:2952(1992);Gage,P.J.ら編、J.Virol.66:5509−5515(1992);GoldsteinおよびWeller,J.Virol.62:196−205(1988),Coen,D.,第7章、Virology,1990(第2版)Raven Press;BreakefieldおよびDeLuca,The New Biologist 3:203(1991);LeiおよびOlivo,BioEssays 15:547(1993);Gloriosoら、Seminars in Virology 3:265(1992);Chou、J.およびRoizman,B.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3266−3270(1992)Shihら、Vaccines 85,1985,Cold Spring Harbor Press,177−180頁;Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997);Glorioso,J.C.ら、Annu.Rev.Microbiol.49:675−710(1995);Mocarskiら、Cell 22:243(1980)において記載される。
【0106】
ウイルスゲノムの遺伝的変更は、制限エンドヌクレアーゼ消化したウイルスDNAのサザンブロットハイブリダイゼーション、ウイルスDNAの変異した領域の配列決定、新しい(または失われた)制限エンドヌクレアーゼ部位の検出、リボヌクレオチドレダクターゼ活性の酵素学的活性などの標準的な方法によって、決定され得る(Huszar,D.およびBacchetti,S.,J.Virol.37:580−598(1981))。変異したウイルス遺伝子(例えば、RR)の哺乳動物の相同体を欠く細胞については、ウイルスゲノムの遺伝子変更は、(1)変異したウイルス相同体(例えば、RR)の抗体を使用する感染した細胞タンパク質のウエスタンブロットまたはELISA分析によってか、または、(2)変異したウイルス相同体(例えば、RR)の転写についての感染した細胞のノーザンブロット分析によって、決定され得る(Jacobson,J.G.ら、Virology 173:276−283(1989))。1つ以上の遺伝子において変異したウイルス変異体は、変異誘発後に単離され得るか、または、ウイルスゲノムと遺伝的に操作した配列との間の組換えを介して構築され得る。
【0107】
「アップレギュレーション」は、上流制御される遺伝子産物をコードする遺伝子の発現が、非腫瘍性細胞において見出されるように、この産物の発現の基本レベルよりも、より高いことを意図する。
【0108】
「遊離E2Fのレベルが上昇した」は、細胞中の利用可能な未結合E2Fの量が、非腫瘍性細胞に代表的に見出される量よりもより大きいことを意味する。
【0109】
「選択的に腫瘍性細胞を殺傷する」は、本発明のヘルペスウイルス変異体が、非腫瘍性細胞ではなく、腫瘍性細胞を主に標的にすることを意味する。
【0110】
「腫瘍性細胞」は、正常な増殖制御機構が破壊された(代表的に蓄積された遺伝子変異によって)細胞を意味し、それによって、制御されていない増殖の可能性を提供する。従って、「腫瘍性細胞」は、分裂細胞および非分裂細胞の両方を含む。本発明の目的のために、腫瘍性細胞は、腫瘍、新生物、癌、肉腫、白血病、リンパ腫などの細胞を含む。特に興味深いのは、中枢神経系腫瘍、特に、脳腫瘍である。これらとしては、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫などが挙げられる。本発明は、腫瘍学のために、末梢および脳における良性および悪性腫瘍性細胞の両方を標的するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語末梢は、脳の外側の体の他の全ての部分を意味することが意図される。従って、末梢腫瘍は、脳の外側の体の部分における腫瘍を意味することが意図される。
【0111】
(ヘルペスウイルス変異体によって運搬される導入遺伝子)
ヘルペスγ34.5遺伝子(およびおそらく1つ以上のさらなる変異(上記のように、例えば、RR、TK、UNG、またはdUTPase))の発現を駆動する腫瘍特異的または細胞特異的プロモーターを有することに加えて、本発明のウイルス変異体はまた、異種導入遺伝子を運搬する。
【0112】
導入遺伝子は、自殺遺伝子、すなわち、化学療法剤を、その細胞傷害性形態に活性化可能である遺伝子産物をコードする遺伝子(例えば、HSV−TK、CD、またはシトクロムP450)である。好ましい実施形態において、この自殺遺伝子は、シトクロムP450遺伝子である。
【0113】
「化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換可能である遺伝子産物」は、遺伝子産物が以前にそれに対して作用したよりも、より細胞傷害性を付与する化学療法剤に対して作用する遺伝子産物を意味する。化学療法剤をその最も細胞傷害性形態に変換するために、この遺伝子産物に加えて、他のタンパク質または因子が必要であり得る。
【0114】
「化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換可能な遺伝子産物をコードする導入遺伝子」は、発現の際に、この遺伝子産物を提供する核酸を意味する。
【0115】
「細胞傷害性」は、細胞死を引き起こすまたは細胞死に導くことを意味するように、本明細書中で使用される。
【0116】
「遺伝子産物」は、広く特定の遺伝子によってコードされるタンパク質をいう。
【0117】
「化学療法剤」は、新生物の処置において使用され得る薬剤、およびプロドラッグから細胞傷害性形態へ活性され得る薬剤をいう。好ましくは、本発明における使用のための化学療法剤は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害せず、これは、ウイルス複製が、感染した細胞の死を導き、そして、ウイルスの他の細胞への広がりを増幅させるのに十分なレベルで生じることを意味する。
【0118】
用語「シトクロムP450をコードする遺伝子」は、P450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4などの哺乳動物シトクロムP450遺伝子を意味する。これらの遺伝子のそれぞれは、抗癌薬物シクロホスファミドおよびイホスファミドの活性化に関連しており(Clarkeら、Cancer Res.49:2344−2350(1989);Changら、CancerRes.53:5629−5637(1993);WeberおよびWaxman,Biochmical Pharmacology 45:1685−1694(1993))そして、これらの遺伝子のcDNA配列はまた、公開されている(Nelsonら、DNA and Cell Biology 12:1−51(1993)および本明細書中に記載された参考文献;Yamanoら、Biochem.29:1322−1329(1990);Yamanoら、Biochem.28:7340−7348(1989))。さらに、シトクロムP450はまた、N−メチルシクロホスファミド(N−メチルCPA)、メチルシクロプロピルニトロソウレア(MCPNU)、およびCPA、イホスファミド、N−メチルCPA、およびMCPNUのポリマー形態を活性化し得る。化学療法剤のポリマー形態は、Brem,Biomaterials,11:699−701(1990);BuahinおよびBrem,J.Neurooncol 26:103−110(1995);Tamargoら、Cancer Res.53:329−333(1993);ならびにLanger,Ann.Biomed.Eng.23:101−111(1995)において考察される。
【0119】
当業者は、酵素のシトクロムP450ファミリーのメンバーによって活性化される他の多数の抗癌薬物を使用して(LeBlancおよびWaxman、Drug Metab.Rev.20:395−439(1989))、および、シトクロムP450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4に相同な他の種(例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、イヌなど)由来の薬物代謝シトクロムP450遺伝子(それらのcDNA配列は公知である(Nelsonら、DNA and Cell Biology 12:1−51(1993)))を使用して、本発明の方法を利用し得る。特に好ましい実施形態では、チトクロームP450 2BIをコードする遺伝子が使用される。
【0120】
ヘルペスウイルス変異体が自殺遺伝子を含む場合、ウイルス変異体がウイルス腫瘍崩壊および自殺遺伝子の送達によって腫瘍細胞を殺傷することを可能にするように、自殺遺伝子によって活性化される化学療法剤は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害するべきではない。化学療法剤またはその活性代謝産物が、代わりにDNA架橋によってかまたはDNA修復を阻害することによって作用する、化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせの使用は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害しない。従って、このような化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせが、本発明のウイルス変異体および方法によって包含される。
【0121】
従って、好ましい化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせは、CPA、イホスファミド、N−メチルシクロホスファミド、MCPNU、またはCPA、イホスファミド、N−メチルシクロホスファミドおよびMCPNUのポリマー形態と組み合わせたシトクロムP450である。より好ましい化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせは、CPA/シトクロムP450 2B1である。
【0122】
本発明における使用のための他の化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせは以下を含む:CB1954/E.coliニトロレダクターゼ(Friedlosら、Gene Ther.5:105−112(1998);Greenら、Cancer Gene Ther.4:229−238(1997));トポイソメラーゼIまたはIIインヒビター/エステラーゼ様活性を有する酵素(例えば、CPT−11/カルボキシルエステラーゼ(Jansenら、Int.J.Cancer 70:335−340(1997);Danksら、Cancer Res.58:20−22(1998));4−イポメアノール/シトクロムP450 4B1(Verschoyleら、Toxicol.Appl.Pharmacol.123:193−198(1993));ならびに2−アミノアントラセン/シトクロムP450 4B1(Smithら、Biochem.Pharmacol.50:1567−1575(1995))。
【0123】
CPAなどのアルキル化剤の使用は、抗癌効果を提供するが、ウイルスタンパク質合成またはウイルス複製を有意に阻害しない。この発見についての説明は、これらの薬物の作用の型に存在し得る。CPAの活性代謝物、ホスファミドマスタード(PM)は、細胞内DNAにおける鎖間および鎖内架橋を生成する。多数のDNA鎖の切断が架橋部位で発生する場合、細胞内DNAに対する最大の細胞傷害性は、通常、有糸分裂の間に達成される(Colvin、Cancer Medicine.Hollandら編、1993.LeaおよびFabiger,Philadelphia,733−734頁)。対照的に、非有糸分裂、架橋ウイルスDNAは、広範な損傷から逃れ得、従って、細胞内DNAよりもより簡単に修復され得る。
【0124】
ガンシクロビルは、活性化されたとき、ウイルス複製を阻害する化学療法剤の一例である。hrR3およびガンシクロビルの組み合わせが、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子によるガンシクロビルの変換に起因して有意な抗癌効果を提供することが実証されているが(Boviatsisら、Cancer Res. 54: 5745−5751 (1994))、変換されたガンシクロビル分子もまたウイルス複製を阻害する。この理由のために、TK/GCVの使用は、この範例において好ましい選択ではないかもしれない。プロドラッグ活性化酵素(例えば、HSV−TK)は、「偽」ヌクレオチドとして作用する抗癌代謝産物を生成する。これは、DNA鎖の複製の未熟な終結を生じる。従って、これらのプロドラッグ活性化酵素は、ウイルスDNAおよびゲノムDNAの両方の合成に影響することが予想され、自殺遺伝子を含む本発明のヘルペスウイルス変異体において使用するために良好な選択ではない。
【0125】
その作用機構がDNAの架橋またはDNA修復酵素の阻害である化学療法剤を使用する別の利点は、これらの薬剤がG0の細胞に対してさえも有効であることである。従って、これらの薬剤が腫瘍性細胞の殺傷において有効であるために、標的化された細胞は、その薬物が投与された時点で活発に分裂する必要はない。これは、大部分の細胞がG0期にある腫瘍について有意な利点である。
【0126】
このタイプの腫瘍の一例は、膠芽腫である。膠芽腫については、増殖割合、または任意の一時点で腫瘍において増殖する細胞の相対的割合は、30%でしかなく、残りの70%の細胞は、G0期にある。これらの腫瘍は、特に、活発に分裂する細胞をのみ標的化する化学療法剤に対して耐性である。なぜなら、活発に分裂する30%の膠芽腫細胞は、この腫瘍の致死的進行に寄与するが、この細胞の70%は、G0期にあり、死亡するかもしれないし、または活動細胞周期に再進入するかもしれない。Yoshiiら、J.Neurosurg.65:659−663(1986)。従って、静止している70%が、活発に分裂している細胞を標的化する化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性の原因である。
【0127】
この実施例は、本発明の別の利点を実証する。本発明のウイルス変異体および方法は、条件的複製ウイルスまたは複製能を有さないウイルスの媒介する腫瘍崩壊(oncolysis)単独に基づく治療を超える利点を提供する。これらの治療は、ウイルス変異を補い得る細胞のみを標的化するからである。一方、本発明のウイルス変異体は、導入遺伝子における複製、および溶解、導入遺伝子の発現および活性化について高レベルのE2Fを伴う細胞(主に腫瘍性細胞)を標的化するが、化学療法剤は、次いで周囲の腫瘍細胞に拡散し得る、活性な代謝産物を提供する。これらの代謝産物は、それにより、G0期にある周囲の腫瘍細胞(膠芽腫における細胞の70%)でさえも殺傷し得る。
【0128】
従って、本発明は、膠芽腫の処置において特別の用途を見出す。膠芽腫は、全ての原発性脳腫瘍のおよそ30%または50%を代表し、そして手術、化学療法、および放射線療法にもかかわらず、ほとんど一般的に致死的である。
【0129】
ヘルペスウイルス変異体により保有される遺伝子の遺伝子産物による化学療法剤の局所活性化に起因して、本発明の方法は、同じ薬物濃度では、より腫瘍傷害性となり、従って、正常細胞に対する傷害性を増大させることなく、より高い腫瘍投与量とすることが可能である。さらに、全身腫瘍集団の化学療法処置もまた、本発明の方法を用いることにより改善され得る。なぜなら、薬物のより低い用量が、増大した効力によって可能であり得るからである。
【0130】
さらに、化学療法剤の局所活性化は、別の利点を提供する。いくつかの化学療法剤は、末梢における細胞または器官において活性化または活性状態への変換を必要とするが、しかし、しばしば、活性(細胞傷害性)代謝産物は、血液脳関門を横断し得ず、従って脳腫瘍に対して有効ではない。従って、本発明の方法は、これらの化学療法剤による脳腫瘍の処置を可能にするべきである。1つのこのような化学療法剤は、CPAである。CPAは、中枢神経系新生物に対して大いに有効でない。なぜなら、DNAアルキル化の細胞傷害性代謝産物へのそれの変換は主として肝臓に制限され、そしてこれらの代謝産物は、血液脳関門を容易に横断しないからである。しかし、本発明のウイルス変異体(チトクロームP450遺伝子を保有するように操作され、そして脳腫瘍に適用される)の使用は、CPAの局所活性化を提供し得る。従って、好ましい実施形態では、チトクロームP450遺伝子は、シクロホスファミド(CPA)の細胞傷害効果に対して中枢神経腫瘍細胞を感作するために使用される。
【0131】
「自殺遺伝子」に加えて、導入遺伝子はまた、腫瘍指向性免疫応答を刺激または増強するサイトカインをコードし得る。Blankenstein, T.ら、J. Exp. Med. 173: 1047−1052 (1991); Colombo, M. P.ら、Cancer Metastasis Rev. 16: 421−432 (1997); Colombo, M. P.ら、Immunol. Today 15: 48−51 (1994))を参照のこと。代表例としては、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターフェロン−γ、インターロイキン(IL−2、IL−4)、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF))が挙げられる。
【0132】
導入遺伝子はまた、癌抑制遺伝子、または当業者に公知の任意の他の殺腫瘍性遺伝子(例えば、ジフテリア毒素(Coll Fresno, P. M.ら、Oncogene 14: 243−247 (1997))、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスRNA、またはリボザイム(Zaia, J. A.ら、Ann. N. Y Acad. Sci. 660: 95−106 (1992))をコードし得る。
【0133】
従って、本発明のこの実施形態では、γ34.5遺伝子の腫瘍特異的または細胞特異的プロモーター駆動発現を伴うヘルペスウイルス変異体は、化学療法剤をその細胞傷害形態に変換し得る遺伝子産物をコードする導入遺伝子、または上述したような任意の他の殺腫瘍導入遺伝子をさらに含む。導入遺伝子は、これが発現される任意の位置でウイルスゲノム中に挿入され得る。導入遺伝子についてウイルスゲノムにおける好ましい位置は、もとのγ34.5欠失の遺伝子座であるか、またはヘルペスUL40遺伝子座のいずれでもある。
【0134】
(ヘルペスウイルス変異体の投与)
本発明の方法に従う処置のための例示の候補としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:(i)腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターにより特徴付けられる新生物に罹患した非ヒト動物;(ii)腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターにより特徴付けられる新生物に罹患したヒト;(iii)特定の細胞集団を根絶する必要のあるヒトまたは非ヒト動物。
【0135】
「腫瘍性細胞」とは、正常な増殖制御機構が破壊されて(代表的には、遺伝子変異の蓄積によって)、それによって制御されない増殖能を提供する細胞が意図される。この用語は、中枢神経系および末梢の両方における良性および悪性の両方の腫瘍性細胞を含むことが意図される。本明細書中で使用されるように、用語「末梢」は、脳または脊髄の外側の身体の他の全ての部分を意味することが意図される。
【0136】
本発明の目的のために、腫瘍性細胞は、腫瘍、新生物、癌腫、肉腫、乳頭腫、白血病、リンパ腫などの細胞を包含する。特に興味深いのは、哺乳動物身体の任意の器官または組織において生じ得る固形腫瘍である。
【0137】
悪性脳腫瘍は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、膠芽腫、脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫(neurofibrosarcoma)、および髄芽細胞腫を包含する。
【0138】
好ましくは、この処置は、直接的な新生物内接種によって開始される。脳内の腫瘍について、MRI、CT、または他の画像化誘導定位技術(imaging guided stereotactic techniques)が、ウイルス接種を指示するために使用され得るか、またはウイルスが、開頭時に接種される。特定の細胞集団を根絶しようとする患者について、ベクターが、目的の組織に接種される。
【0139】
一般に、目的の細胞のウイルス感染のための方法は、当該分野で公知である。例えば、ウイルス変異体は、新生物増殖の部位でまたはその近傍に注入され得るか、または血管内接種によって投与され得る。代表的には、ウイルス変異体は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注入可能物として調製され得る;注入前に液体に入れて溶液または懸濁液とするのに適切な固形形態もまた調製され得る。調製物はまた、乳化され得る。活性成分は、好ましくは、薬学的に受容可能であり、かつ活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、調製物は、少量の補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、アジュバントまたは免疫増強剤(これは、ウイルス変異体の有効性を増強する)を含有し得る(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Gennaro, A. R.ら編、Mack Publishing Co.,出版,第18版、1990を参照のこと)。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)である。水性キャリアとしては、水、水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル(例えば、塩化ナトリウム)、リンガーデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充物(replenishers)を含む。薬学的組成物のpHおよび種々の成分の正確な濃度の決定は、慣用的であり、当業者の知識の範囲内である(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis for Therapeutics, Gilman, A. G.ら編、Pergamon Press,出版,第8版、1990を参照のこと)。
適切であるさらなる処方物は、経口処方物を包含する。経口処方物は、以下のような代表的な賦形剤を含む(例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど)。経口組成物は、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物、または粉末の形態をとり得、そして10〜95%の活性成分、好ましくは25〜70%の活性成分を含み得る。
【0140】
投与されるべきウイルス変異体の投薬量(治療数および量に関して)は、処置される被験体、この被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。投与されることが必要とされる活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、そして各個体に特有である。大部分では、ウイルスは、標的細胞を感染および殺傷するのに治療的に有効な量で提供される。
【0141】
(腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法)
本発明はまた、上記のヘルペスウイルス変異体を用いて公知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。この方法は、腫瘍性細胞にヘルペスウイルス変異体を感染させる工程、および腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程を包含し、このウイルス変異体は、(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;および(b)腫瘍特異的プロモーターの転写制御下にある少なくとも1コピーのγ34.5遺伝子の挿入であって、これによりこのプロモーターがγ34.5遺伝子の発現を駆動する、挿入を含む。
【0142】
もちろん、上記方法で使用されるヘルペスウイルス変異体において、γ34.5遺伝子に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の1つより多い特異的内因性欠失または不活性化変異が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)をコードする遺伝子における欠失、またはより特定すると、RRの大きなサブユニットを含む。あるいは、RRをコードする遺伝子は、スモールサブユニットをコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺伝子もまた欠失され得る。例えば、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPase。これらのウイルス遺伝子は好ましい。なぜなら、これらの遺伝子の哺乳動物ホモログが、しばしば、高レベルのE2Fを有する細胞(例えば、腫瘍性細胞)においてアップレギュレートされ、従って、欠失されたウイルス酵素を補い得、それによりそれらの細胞において選択的な複製を促進するからである。
【0143】
例示の腫瘍特異的プロモーターは、上述され、そして、例えば、CEA、AFP、チロシナーゼ、およびPSAを包含する。腫瘍細胞はまた、特定の癌遺伝子を過剰発現することが公知であり、従ってアップレギュレートされた遺伝子発現を伴う細胞は、このような遺伝子のプロモーターエレメントを用いて標的化され得る。B−myb、C−myb、c−myc、c−kit、およびc−erbB2癌遺伝子は、これらのタイプのいくつかの代表的な例である。B−mybプロモーター(Lyon, J.ら、Crit. Rev. Oncogenesis 5: 373−388 (1994)を参照のこと)は、コンセンサスE2F結合部位を含み、細胞の周期において厳密に調節され、そして実際、G0期では抑制される(Lam, E. W.およびWatson, R. J., EMBO J. 12: 2705−2713 (1993); Lam, E. W.ら、Gene 160: 277−281 (1995); Bennett, J. D.ら、Oncogene 13: 1073−1082 (1996))。従って、B−mybプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的プロモーターである。本方法の特に好ましい実施形態では、本方法において使用されるウイルス変異体は、Myb34.5である。
【0144】
よく特徴付けられたプロモーターを有する任意の癌タイプが、本発明の方法において用途を見出す。このようなプロモーターの例は、以下に見出され得る:Clary, B. M.ら、Cancer Gene Therapy 7: 565−574 (1998)のTable 1; Spear,M. A., Anticancer Research 18: 3223−3232 (1998)のTable I; Walther, W.およびStein, U., J. Mol. Med. 74: 379−392 (1996)のTable 2;およびDachs, G. U.,ら、Oncol. Res.9: 313−325 (1997))。
【0145】
上述の腫瘍特異的プロモーターの遺伝子配列の全てではなくてもほとんどが、GenBank Sequence Databaseから入手可能である。
【0146】
さらに、本発明は、腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための上記方法を提供する。ここで、ヘルペスウイルス変異体が導入遺伝子をさらに含み、ここで導入遺伝子は、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子、または任意の殺腫瘍性遺伝子である。導入遺伝子が自殺遺伝子である場合、この方法は、腫瘍性細胞を、自殺遺伝子によって活性化され得る化学療法剤と接触させる工程および腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、チトクロームP450である。P450 2B1が特に好ましい。あるいは、コードされるチトクロームP450は、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4である。さらに、化学療法剤は、好ましくは、オキサゾスフォリンクラスのメンバーであり、特に、シクロホスファミド、イホスファミド、N−メチルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イホスファミド、ポリマー性N−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
【0147】
本発明の別の実施形態は、前述のウイルス変異体を含有する薬学的組成物である。ここで、この組成物は、1つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤もまた含み得る。
【0148】
(標的細胞集団を選択的に排除するための方法)
本発明の別の実施形態は、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を特異的に排除するための方法である。この方法は、この標的細胞をこのヘルペスウイルス変異体で感染する工程であって、このウイルス変異体は以下:(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失および不活性化変異体;および(b)この細胞特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1つのコピーのこのγ34.5遺伝子の挿入であって、その結果、このプロモーターはこのγ34.5遺伝子の発現を駆動する挿入;ならびに標的細胞集団を選択的に排除する工程を包含する。
【0149】
「標的細胞集団を選択的に排除する」によって、多くの標的細胞対非標的細胞における顕著な減少、ならびに、標的細胞の完全かまたはほぼ完全な排除を含むことが意図される。
【0150】
もちろん、上記の方法で使用されるヘルペスウイルス変異体において、γ34.5に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の1より多い特異的内因性欠失または不活性化変異体が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、またはより特定には、RRのラージサブユニットをコードする遺伝子における欠失を含む。あるいは、RRをコードする遺伝子は、スモールサブユニットをコードする。他の任意のヘルペスウイルス遺伝子(例えば、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)またはdUTPaseなど)はまた、欠失され得る。
【0151】
模範的な細胞特異的プロモーターは、以下を含む:上皮細胞に発現される血管上皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999));膵臓のベータ細胞に発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞に発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albarracinら、Endocrinology 140:2415−2421(1999));破骨細胞およびケラチン生成細胞に発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.274:5588−5596(1999));骨細胞に発現される副甲状腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.103:373−381(1999);ノルアドレナリン作動性ニューロンに発現されるドパミンβヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.Neurochem.71:1813−1826(1998))。
【0152】
本実施形態の模範的な適用は以下を含む:
1)有害な細胞集団を排除するための処置選択肢:例えば、血管の豊富な新脈管形成の存在する条件下(例えば、大脳のモヤモヤ病)において、γ34.5遺伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、この疾患を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。別の例は、広範な骨再モデル化および骨の排除が存在する条件下において(例えば、骨粗しょう症)、γ34.5の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ9または副甲状腺ホルモンレセプターの使用は、更なる骨の再モデル化から破骨細胞を排除する
2)発達プロセスを研究するため:発達プロセスにおける細胞集団の排除の効果を研究するために、例えば、ドパミンβヒドロキシラーゼプロモーターを使用してノルアドレナリン作動性ニューロンを排除し、次いで、動物の発達に対する効果を研究し得る。
【0153】
以下の実施例は、限定の目的ではなく例示の目的で提供される。
【0154】
(実施例1)
(序論)
毒力をコードするγ34.5遺伝子の欠失は、単純ヘルペスウイルス(HSV)によって媒介される細胞傷害性を顕著に減少する。腫瘍に対して細胞を溶解する毒力を標的するために、本発明者らは、Myb34.5と名付けられた単純ヘルペスウイルス(HSV1)変異体を作製した。このウイルス変異体は、(UL39またはリボヌクレオチドレダクターゼとしても公知の)ICP6における欠失によって、γ34.5遺伝子(RL1)の2つの内因性コピーとして、そしてE2F応答性の細胞性B−mybプロモーターの制御下でのγ34.5の1つのコピーの再誘導によって特徴付けられる。
【0155】
マウスでの直接の大脳内播種において、Myb34.5は、γ34.5変異体ウイルスとして無毒性であり続けた。しかし、培養物中およびインビボの種々のヒト神経膠腫細胞に対するその腫瘍細胞崩壊性の効果は、野生型γ34.5遺伝子を有する単一のICP6変異体株のそれと類似した。抗腫瘍効果および保持した神経弱毒化の組み合わせは、細胞周期調節プロモーターが腫瘍に対して標的HSV−1毒力を標的するために使用され得、一方、γ34.5変異体の所望の神経弱毒化表現型を維持する。
【0156】
(方法および材料)
(プラスミドおよびウイルス)
HSV株F(野生型)を、ATCC(Manassas,VA)を通じて取得した。変異体ウイルスR3616(Chou,J.,ら、Science 250:1262−1266(1990))(両方のγ34.5座に1000bpのBstEII−StuIの欠失を含む)は、B.Roizman博士(University of Chicago)によって親切にも提供された。変異体ウイルスhrR3(Goldstein,D.J.およびWeiner,S.K.、J.Virol.62:196−205(1988))(S.Weller(University of Connecticut)によって親切にも提供された)は、UL39座に挿入されたE.coli lacZ cDNAを含む。変異体ウイルスMGH1を、UL39座へのEscherichia coli lacZ cDNAの挿入および両方のγ34.5座の欠失によって特徴付け、そしてウイルス変異体R3616(Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))へのhrR3のICP6−lacZ領域の再組換えによって構築した。ICP6(KOS起源、Goldstein,D.J.およびWeller,S.K.、J.Virol.62:2970−2977(1988)を参照のこと)の2.3kbのXhoI領域内にlacZ遺伝子を含むプラスミドpKK−BG3は、2.3kbのICP6(UL39)遺伝子を含むプラスミドpKpX2と同様にS.Wellerによって提供された。γ34.5コード配列の全体を含むプラスミドpBGL34.5は、Xandra BreakefieldおよびPeter Pechan(MGH)によって提供された。B−mybプロモーターを、プラスミドpBGL2myb(R.Watson博士(Ludwig Institute for Cancer Research,UK)によって親切にも提供された)からのKpnI−HindIIIフラグメントとして摘出し、そしてγ34.5の上流に指向性にクローニングした。
【0157】
(Myb34.5およびMyb34.5復帰変異体の操作)
MGH1への相同組換えによるMyb34.5の操作のために使用されるプラスミドを設計し、MGH1中のlacZ cDNAのその全体を置換し、そしてICP6(UL39)配列のさらなる888ヌクレオチドを欠失した。特に、再結合プラスミド(pKpX2−myb34.5)を以下のように操作した。全長γ34.5cDNAをNcoI−SacIフラグメントとしてpBGL34.5から抽出し、平滑末端化し、次いで、pBSKII(Stratagene,La Jolla,Calif)にサブクローニングしてプラスミドpBS34.5を作製した。B−mybプロモーターを、pBGL2mybからKpnI−HindIIIフラグメントとして抽出して、そしてpBS34.5にγ34.5の上流に指向性にクローニングした。γ34.5生じた発現カセット(cDNAの上流にB−mybプロモーターを含む)を、KpnI−XbaIフラグメントとして抽出し、平滑末端化し、次いで、pKpX2のNruI部位にサブクローニングした。このプロセスを通じて、UL39内に介在するNruI−NruIフラグメントを欠失した。次いで、生じたプラスミドpKpX2−myb34.5を、ScaIで直線化し、そしてLipofectamine(Gibco,Gaithersburg,MD)で種々のモル比にてVero細胞にMGH1ウイルスDNAと共に同時トランスフェクトした。細胞病理学的効果が現れた場合に、ウイルスの子孫をトランスフェクションの5〜7日後に回収した。ウイルスの子孫は、3回の凍結融解を通じて細胞から再放出され、次いで、単層のVero細胞上にプレートした。アガロースでこの単層を覆った後、5%二酸化炭素を含む雰囲気下にて37℃でのインキュベーションを実施した。次いで、5−ブロモー4−クロロ−3−インドイリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)でプラークを染色した。染色されなかったプラークを、潜在的な組換え体として選択した。これらの単離体を、サザンブロット分析によって試験された遺伝的同一性を有する前に、プラーク精製を3回行った。親株としてのMyb34.5ならびにICP6座へ戻すlacZ cDNAの相同組換えおよびB−myb/γ34.5発現カセットの欠失のためのプラスミドとしてのpKX−BG3を使用することによって、Myb34.5復帰変異体(MybRevt)を操作した。
【0158】
(サザンブロット分析)
感染させたVero細胞の細胞融解後に、ウイルスDNAを、SDS/プロテイナーゼK、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の反復を反復して単離した。DNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼ(New England Biolabs,Beverly MA)で消化し、アガロース電気泳動で分離し、そしてナイロン膜(Amersham Corp.,Arlington Heights,Illinois)に転写した。プローブは、pKpX2由来のHindIII−XbaIICP6フラグメント、pBSKγ34.5由来のBstEII−BbsIフラグメント、およびpKX−BG3由来のLacZのBbsIフラグメントを含んだ。プローブ標識およびハイブリダイゼーションを、ECL chemiluminescence system(Amersham)を使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。
【0159】
(細胞培養物の研究)
すべての細胞を、10%ウシ胎仔血清、1ml中100Uのペニシリン、および1ml中10μgのストレプトマイシンを補填したDulbecco最小必須培地(DMEM)中で5%二酸化炭素を含む雰囲気下にて37℃で培養した。宿主タンパク質合成遮断研究を、ウイルス株で16時間細胞に感染させることによって実施した。次いで、細胞を、メチオニン不含培地中に10分間置き、次いで、35[S]−メチオニン(New England Nuclear,Boston MA)を使用して90分間標識した。次いで、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(pH7)で洗浄し、可溶化し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写し、そしてオートラジオグラフィーに供した。タンパク質濃度を、市販のキット(Bio−Rad,Hercules CA)で計算した。感染した細胞ポリペプチド(ICP)を、以前に刊行された(Morse,L.S.ら、J.Virol.26:389−410(1978))ように標識した。ヒト神経膠芽細胞株U87、U373、T98GおよびU343;ラット神経膠肉腫9L細胞;ヒト神経芽腫SKNSH細胞およびVero(アフリカミドリザル)細胞を、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から得、そして10%血清および抗生物質を補填したDMEMまたは最小α必須培地(Gibco)で培養した。マウス胎仔線条体神経初代細胞(胎仔段階18)(M.Schwarzchild,Massachusetts General Hospital,Charlestown,MA)によって親切にも提供された)を、刊行された手順(Schwarzschild,M.A.ら、J.Neurosci.17:3455−3466(1997))を使用して単離した。
【0160】
(動物の研究)
ヌードマウス(nu/nu)を、Cox7 breeding facility,Massachusetts General Hospital(MGH)から得た。BALB/Cマウスを、Charles River Laboratories(Wilmington,MA)から得た。皮下の腫瘍を、無胸腺症のマウス(9L神経膠肉腫細胞について1群あたり5動物、およびヒトU87ΔEGFR神経膠腫細胞について1群あたり6動物)の脾腹への2×105細胞を注射することによって得た。腫瘍移植後14日目(9Lについて)または10日目(U87ΔEGFRについて)に、同様の腫瘍塊を有する動物を無作為に隔離し、そして種々のウイルス株を100μl容積中に1容量あたり5×107PFUで、1、3、5および7日目に腫瘍内に注射した。動物を33日目(9Lについて)または34日目(U87ΔEGFRについて)に安楽死させた。腫瘍塊を、以前(Wei,M.X.ら、Hum.Gene Ther.5:969−978(1994))に記載されるように外部測径器で測定した。神経毒性の実験について、BALB/Cマウスに、10μl容量のウイルスをストックの取得し得る最大の力価までの異なる希釈で、右前葉(深さ3mm)に定位的に注射した。動物を28日間毎日チェックした。動物の研究の全てを、Animal CareのMGH Subcommitteeによって発行されるガイドラインに従って実施した。ウイルス播種およびウイルスを保有する動物の世話を、認可されたウイルスベクター室で実施した。
【0161】
(結果)
(Myb34.5の遺伝的操作)
多重に変異されたウイルスMyb34.5を、MGH1のUL39(ICP6またはRRとしても公知の)座にB−mybプロモーター/γ34.5構築物を再連結することによって構築した。MGH1(Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))を、γ34.5欠失変異体R3616(Chou,J.ら、Science 250:1262−1266(1990)のICP6座へのlacZ cDNAの再連結によって作製した。図1Aは、Myb34.5のDNA構造の模式図を提供する。この構造を、制限エンドヌクレアーゼマップ(データは示さず)、サザンブロットハイブリダイゼーション(図1B〜1D)、そしてUL39とB−mybプロモーター/γ34.5発現カセットとの間の連結の配列分析(データは示さず)によって確認した。Myb34.5におけるlacZの欠失を示すために、XhoI消化したMyb34.5DNAを、ICP6(図1B)またはlacZ(図1C)の配列のいずれかを含むプローブとハイブリダイズした。予想通り、親ウイルスであるMGH1は、ICP6プローブ(図1B)とハイブリダイズする9.0kbのXhoI ICP6−lacZフラグメント(Kramm,C.M.ら、前出)を含んだ。相同組換えは、lacZおよびさらなるICP6配列の欠失、ならびにB−mybプロモーター/γ34.5配列の挿入を導いた。これは、Myb34.5DNA(図1B)における6.7kbフラグメントに対するICP6プローブのハイブリダイゼーションによって明白である。lacZプローブでのハイブリダイゼーションは、Myb34.5から消化されたDNAにおけるハイブリダイズするフラグメントの不存在、およびMGH1(図1C)から消化されたDNAにおける期待された9.0kbのハイブリダイズするフラグメントの存在を示した。Myb34.5がγ34.5遺伝子の再誘導を有することを確認するために、BamHI消化したウイルスDNAを、BstE11−Bbsγ34.5フラグメント(欠失した領域の内部)とハイブリダイズした。これは、代表的には野生型F株で観察される、ハイブリダイズするバンドのラダーを示した。Chouら(1991)(前出)の研究において議論されるように、γ34.5はBamHI SおよびPのフラグメントをマップし、500bpずつ増加するバンドの特徴的なラダーを形成する。このラダーは、長い成分の独特の配列に隣接する反復における多くのa配列が連続する。このラダーは、F株(図1Dのレーン1)についてのサザンブロットにおいて観察され、ここで、最も上のハイブリダイズするバンドは、終端のBamHI SフラグメントとBamHI Pとの融合によって形成されたBamHI SPフラグメントを示し、一方、最も下のハイブリダイズするバンドは、BamHI Sフラグメントを示す(Chou,J.らScience 250:1262−1266(1990)。
【0162】
R3616ならびにその誘導体ウイルスであるMGH1、Myb34.5およびMyb34.5Revtにおいて、全長γ34.5cDNAプローブがハイブリダイゼーションに利用される場合、分子サイズが約1kb(R3616におけるγ34.5の内部欠失のサイズ)だけ減少したハイブリダイズするバンドの同様のラダーは期待された。実際に、Chouら(Chou,J.ら、Science 250:1262−1266(1990))の研究において、このハイブリダイゼーションパターンは、R3616について明白であり、Krammら(Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))の研究において、このハイブリダイゼーションパターンは、MGH1について明白である。しかし、図1Dに示されたサザン分析について、R3616、MGH1、Myb34.5およびMyb34.5Revtのγ34.5遺伝子の1kb欠失フラグメントの内部である、BstEII−Bbsγ34.5フラグメントを、プローブとして利用した。従って、MGH1(図1D、レーン2)およびMyb34.5Revt(図1D、レーン4)についてハイブリダイズするバンドは観察されず、一方、γ34.5遺伝子に対応する単一の5.3kbのハイブリダイズするフラグメントが、Myb34.5について観察され(図1D、レーン3)、ICP6座に再導入される。
【0163】
Myb34.5の改変された表現型が、B−myb/γ34.5挿入の結果であったことを示すために、復帰変異体(マーカーが奪還された)ウイルスをまた操作し、そしてMybRevtと称した。これは、親株としてMyb34.5を、そして組換えるプラスミドとして線状化pKX2−BG3を用いる、相同的組換えにより達成した。このプラスミドは、lacZ/ICP6挿入を含み、そしてMGH1中のICP6::lacZ融合領域の供給源であるhrR3を創出するために用いた(Kramm、C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997);Goldstein、D.J.&Weller、S.K.J.Virol.62:2970−2977(1988))。MybRevt復帰変異体は、サザンハイブリダイゼーションで、ICP6(図1B)、lacZ(図1C)、およびγ34.5(図1D)プローブに対するパターンを示し、これは、Myb34.5の親株であるMGH1により示されるそれと同一であった。
【0164】
(γ34.5の機能的発現)
γ34.5が機能的γ34.5タンパク質を産生したことを確認するために、ヒトSKNSH神経芽腫細胞を、種々のウイルス株で感染した。図2は、予期されるように、MGH1および復帰変異体ウイルス(MybRevt)が、インタクトなγ34.5機能であるタンパク質合成の遮断からなる感染細胞応答(Chou、J.1992、前述)を防げないことを示す。しかし、Myb34.5およびインタクトなγ34.5をもつその他の株(野生型FおよびhrR3)は、感染細胞応答(タンパク質合成の遮断)を防ぎ、それ故ウイルスタンパク質産生に至った。
【0165】
Myb34.5が機能的γ34.5タンパク質を発現したことのさらなる証拠は、γ34.5変異体HSV株の複製を制限することを先に注記された(Mohr.I.およびBluzman、Y.、EMBO J.15:4759−5766(1996))、U373膠芽腫の細胞株におけるウイルス複製の評価により提供された。1.0のMOIで、5×105細胞を感染し、そして48時間後のウイルスアウトプットを回収した後、Myb34.5収率は、野生型F株のそれと類似であった(それぞれ、1.1×107PFU 対 5.0×107PFU)。対照的に、MGH1(3.3×104PFU)またはMybRevt(3.4×104PFU、3つの実験の平均)の収率は有意により少なかった。MGH1またはMybRevtのそれとは対照的に、Myb34.5がこの非許容株中で効率的に複製する能力は、Myb34.5中でコードされたγ34.5が機能的であったことを示す。
【0166】
(神経傷害性試験)
任意の複製能を有するHSV株の1つの重要な特徴は、その神経毒性のレベルであり、これは、インビトロおよびインビボの両方で評価され得る。Myb34.5ウイルスが一次ニューロン培養で複製する能力は、F、hrR3、MGH1、およびMybRevt株との比較で測定した。マウス胎児線条体ニューロンを感染し、そしてウイルス収率をVero細胞(これは、効率的ウイルス複製にγ34.5を必要としない)上のプラークアッセイにより評価した。野生型F株はニューロン中で活発な複製を示したが、Myb34.5を含むすべての変異体株は、最小のウイルス複製を示した(表1を参照のこと)。
【0167】
【表1】
*合計2.5×105のマウス胎児(18日)線条体ニューロンを回収し、そして先に記載のようにプレートに撒いた(Chase、M.ら、Nat.Biotechnol.16:444−448(1998))。プレートに撒いて2日後、細胞を、野生型(F株)および変異体ウイルス株を用い二重の実験において0.1のMOIで感染した。感染の24時間後、細胞および上清液を回収し、そして凍結融解サイクルに供し、ウイルス粒子を遊離させた。ウイルスアウトプットは、Vero細胞上のプラークアッセイにより決定した。標準偏差(SEM)を括弧内に示す。4つのウイルス変異体株(hrR3、MGH1、Myb34.5、およびMybRevt)は、グループ間で統計的に異ならなかった(t検定、p>3)。
【0168】
インビボのセッティングにおいて、BALB/CマウスにおけるMyb34.5の直接脳内接種は、このウイルスが、野生型HSVと比較して、顕著に神経弱毒化されていることを示した。表2は、Myb34.5のLD50が、F株のそれより少なくとも3対数単位高く、2.7×107PFUであったことを示す。γ34.5変異体(MGH1、R3616、およびMybRevt)は、良好に生育せず、そして>109PFU/mlの力価の達成は、大スケール生産なくしてはなはだ高価である。これは、これらの実験においてこれらの変異体に対するLD50を正確に推定する能力を制限する。比較目的のために、6匹のマウスのうち1匹は、Myb34.5の107PFUを脳内に接種するときに死亡し、その一方、同じ量のMGH1を接種したとき6匹のマウスは死亡しなかった。これらの知見は、B−mybプロモーターの制御下のγ34.5の再導入が、最小の神経毒性を生成したことを確認した。
【0169】
【表2】
*血清フリー培地(容量10μl)中のウイルスの系列希釈を、3週齢の雌のBALB/C(Charles River Laboratories、Wilmington、MA、PFUレベルあたり6匹の動物)の右半球中に定位的に注射した。動物を、運動性について28日間毎日視察し、そしてLD50をPFUで、比例距離モデルを用いて計算した。R3616およびMGH1についての二重のアスタリスク(**)は、列挙された投与量で死滅がなかったことを示し、これは、所定の注射容量でこれらの株について最高の達成可能なものであった。これは、>109PFU/mlの力価が、工業的スケール生産なくして増殖するVero細胞中でこれらの変異体を用いて技術的に達成できなかったからであり、そして脳内注射は、10μlの最大容量に制限されていた。三重のアスタリスク(***)は、平行する実験において、107PFUの投与量で6匹の動物あたり1匹が死亡したことを示す。急速に分割するVeroまたは腫瘍細胞中でMyb34.5を用いて5×109〜1×1010PFU/mlの力価が達成されたので、より正確なLD50が測定できた。
【0170】
(抑止細胞および周期運動中の細胞におけるγ34.5遺伝子発現の調節)
休止細胞 対 そうでない細胞周期を行う細胞におけるMyb34.5の挙動をさらに評価するために、一次ヒト線維芽細胞をプレートに撒き、そして細胞周期を、20μMのロバスチン(これは、ヘルペスウイルス複製を妨害しないことが示されている(Schang、L.M.ら、J.Virol.72:5626−5637(1998)))で休止させた。休止した一次線維芽細胞、MGH1、Myb34.5、およびMybRevtは、単一RR変異体hrR3より1対数単位(PFU)低いレベルで、F株と比較して、最小のウイルス複製を示した(図3)。対照的に、血清の存在下で、hrR3およびMyb34.5は顕著な複製の誘導を示し、その一方、MGH1およびMybRevtはそうではなかった。これらの結果は:1)この非形質転換細胞型では効率的な複製にγ34.5が必要であること、および2)B−mybプロモーター機能が周期運動中の細胞におけるMyb34.5の効率的な複製を可能にすることを示唆する。Myb34.5が、hrR3のそれより、休止細胞 対 周期運動中の細胞におけるウイルス子孫の産生においてより大きな差動(3 対 2対数単位)を示し、しかも休止細胞におけるそのウイルス産生がγ34.5ウイルスのそれと同じであったことは注目され得る。
【0171】
(腫瘍崩壊効果に関する比較研究)
Myb34.5の腫瘍崩壊効率を決定するために、5つの異なる神経膠腫細胞株(9L、U87、U87ΔEGFR、T98G、およびU343)を、偽感染(ウイルスなし)またはF株、MGH1、Myb34.5、およびMybRevtを含むウイルス株のパネルで感染した。48時間後生存細胞を計数し、そして偽処理プレート上で生存する細胞のパーセントとして表した。ラット9L神経膠腫細胞の公開されたデータ(Kramm、C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))中、およびヒト神経膠腫細胞U343およびT98に関する未公開実験(Qureshi、N.およびChiocca、E.A.、未公開データ)中では、MGH1による腫瘍細胞死滅が、2つのヒト神経膠腫株について、R3616によるそれと類似であることが予備的に示されており(表3)、そしてそれ故、後者の変異体は、さらなる分析から排除された。
【0172】
試験されたすべての腫瘍細胞株において、Myb34.5は、親株MGH1が示したより大きいインビトロ腫瘍崩壊効率を示し、そしていくつかの腫瘍細胞株についてその腫瘍崩壊効力は野生型ウイルスのそれに接近した(表3)。従ってこれらの知見は、Myb34.5の腫瘍崩壊効果がγ34.5変異体ウイルス(MGH1、MybRevt、およびR3616、それらの殺傷効力はMGH1のそれのほぼ2倍)のそれより大きかったことを示した。
【0173】
【表3】
*ヒト(U87MG、U343、T98G、およびU98ΔEGFR)およびラット(9L)神経膠腫由来細胞株を、5×105細胞/60mm直径プレートでプレートに撒き、そして次に注記された株を用い0.1のMOIで感染した。腫瘍崩壊効果は、感染48時間後の細胞生存により反映され、3重の非感染コントロールプレートからの生存細胞の数のパーセントとして表した。値は3重の実験の平均を表す(括弧内はSEM)。Myb34.5 対 MGH1またはMybRevtによる腫瘍細胞の死滅における差は、統計的に有意あった。例えば、U87神経膠腫細胞において、Pは0.001未満であった(Tukeyのペア多重比較手順による分散の1方向分析)。
**R3616の死滅は、この特定のセットの実験には含めなかった。なぜなら、それは、MHG1で観察されたそれと比較的類似であるからである。これは、ラット9L神経膠腫についてKrammら(Kramm、C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))、および本実験とは異なる時点で実施された多くの先の未公開実験で示された。例えば、MGH1またはR3616細胞を用い0.1のMOIで感染したヒトU343神経膠腫細胞について、生存率は、2日目で、それぞれ54%および50%であった。MGH1またはR3616を用い0.1のMOIで感染したヒトT98細胞について、生存率はそれぞれ40%および38%であった。
【0174】
(インビボ抗癌効果)
次いで、Myb34.5のインビボ抗癌効果を決定した。無胸腺マウスの脇腹中に、ラット9L神経膠腫(図4A)またはヒトU87dEGFR神経膠腫(図4B)腫瘍を確立した後、各ウイルスを用いた腫瘍内接種を実施した。平均腫瘍容積により評価したとき、9L腫瘍増殖は、コントロール動物と比較してMyb34.5処理により顕著に低減し、hrR3処理後のそれと定量的に類似の阻害であった(図4A)。通例の短縮形EFGレセプターを発現するヒト神経膠腫であるU87ΔEGFR(Nagane、M.ら、Cancer Res.56:5079−5086(1996);Huang、H.S.ら、J.Biol.Chem.272:2927−2935(1997);Nishikawa、R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7727−7731(1994))に対し、すべての株は、顕著に増殖を阻害し、hrR3およびMyb34.5は、6のうち3で完全な退行を生じ、その一方、MGH1およびMybRevtは、6のうち2で退行を生じた(見える腫瘍はない、図4B)。
【0175】
図4Bのぞんざいな分析は、γ34.5変異体(MGH1およびMybRevt) 対 γ34.5+ウイルス(hrR3およびMyb34.5)で処理されたヒトU87ΔEGFR腫瘍の増殖に有意な差はなかったという結論に至り得るが、34日時点における実際の腫瘍容積のレビューは、有意な差の存在を示す(表4)。これらの結果は、それ故、Myb34.5のインビボ腫瘍崩壊効果が単一RR変異体のそれと平行し、かつγ34.5変異体のそれより優れたことを示した。
【0176】
【表4】
a 実験手順の詳細は、図4への説明文中に提供されている。結果は、34日時点からである。
b 処置群間の中央値における差は、統計的に異なった(P=0.004[ランクに関する分散のKruskal−Wallisの1方向分析])。
【0177】
(考察)
この実施例では、標的とされた二重変異体HSV株Myb34.5が、悪性神経膠腫細胞を、マウスにおける直接脳内接種に対する神経毒性の点から高い程度の安全性を保持しながら、インビトロおよびインビボの両方で効率的に殺傷したことが示された。この株はまた、単一RR変異により特徴付けられるHSVで見られる誘導に類似の、初期休止線維芽細胞中で最小の複製および周期運動中の細胞中の複製の顕著な誘導を示した。腫瘍細胞において、それはまた、親の二重RR/γ34.5変異体であるMGH1と比較して改善された腫瘍崩壊効力で活発に複製した。これは、MGH1およびその他のγ34.5変異体が、感染細胞から得られるより低いウイルス収率に起因して限られた効力を有し得る(Kramm、C.M.ら、前述)ので、適切である。おそらく最も重要なことは、Myb34.5が、MGH1またはその他のγ34.5変異体のように、神経弱毒化されたまま、107PFUの脳内投与量でマウスちにおいてほとんど病原性を示さなかったことである。したがって、Myb34.5は、>107PFUのLD50で、神経弱毒性の特徴を維持しながら、親の変異体MGH1、マーカー奪還復帰変異体MybRevt、およびMGH1の親変異体R3616と比較して改良された腫瘍崩壊効力を示す。この値は、厳密な定量的比較が後者のグループの変異体についてLD50を正確に決定することが技術的にできないことによって制限されたが、γ34.5変異体で観察されたそれに定性的に類似している。
【0178】
癌遺伝子治療における主な目標は、顕著な抗癌効果を提供し、一方で同時に、正常な細胞および組織に対して最小の副作用および毒性を示すウイルス変異体を同定することである。この離れ業は、感染した正常細胞および腫瘍細胞に対して最小の毒性を示す複製欠損ウイルスベクターを操作すること、およびこのベクターに、抗癌遺伝子を発現する能力を付与して、生物学的効果を果たすことによって達成された(Moriuchi,S.ら,Cancer Res.58:5731−5737(1998))。大きなヒト腫瘍塊に対する接種材料として適用される場合、このようなベクターは、そのサイズに起因して十分に拡散せず、従って、抗癌効果は、注射路に近接して位置づけられた細胞に制限される(Bobo,R.H.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:2076−2080(1994);Puumalainen,A.M.ら,Hum.Gene.Ther.9:1769−1774(1998))。
【0179】
この問題に対する1つの潜在的な解決策は、腫瘍または有糸分裂細胞において比較的選択的な様式で複製する能力を維持し、一方で正常細胞ではその複製能力を制限される、条件的複製(腫瘍崩壊性で複製制限的)ウイルス変異体を使用することから構成される。従って、このようなウイルス変異体は、最初に感染した腫瘍細胞から周辺の腫瘍細胞へと伝播し、このようにして、大量の分布および抗癌効果の増強を達成する。しかし、これらの変異体に付随する毒性の増加が予期され得る。条件的複製HSV−1に付随する潜在的毒性を最小化するために、内因性γ34.5遺伝子の欠失は、齧歯類(Chou,J.ら,Science 250:1262−1266(1990);Markert,J.M.ら,Neurosurgery 32:597−603(1993);Markovitz,N.S.ら,J.Virol.71:5560−5569 1997))およびAotusサル(Mineta,T.ら,Nat.Med 1:938−943(1995))での大脳内注射に際して、脳炎または髄膜炎の危険性を有意に制限または排除することが示された。さらに、悪性脳腫瘍に冒されたヒトにおけるフェーズI臨床試験において、この型の変異体は害の証拠を示さなかった(Maruza,R.L.,個人通信)。
【0180】
しかし、1つの懸念は、内因性γ34.5機能の完全な排除がまた、HSVの抗癌効果を制限するということである。公表された実験では、この制限が、インビトロおよびインビボの両方において、ラット9L神経膠肉腫細胞について示された(Kramm,S.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))。本実施例において本発明者らは、5つのヒト神経膠腫細胞株のパネルに対する、γ34.5機能欠失HSV変異体(MGH1およびMybRevt)によって媒介される殺傷を試験した(表2)。予期されたように、これらの変異体は、野生型F株と比較して、その腫瘍崩壊性効力を比較的制限された。同様の知見はまた、R3616、MGH1の親株でもまた観察された(Qureshi,N.およびChiocca,E.A.,未公開データ)。しかし、MGH1の腫瘍崩壊性効力は、B−mybプロモーター制御下での単一のγ34.5遺伝子の挿入に際して、野生型F株で観察されたレベルに近接したレベルまで回復した。
【0181】
この結果の意義は、腫瘍中へのMyb34.5の注射が、腫瘍中へのMGH1、R3616、または他のγ34.5変異体の注射よりも広範な腫瘍崩壊を生じることが予期されるということである。
【0182】
実際、インビボでのMyb34.5の抗癌効力は、単一のRR変異体(hrR3)の効力と量的に類似することが見出されており、このことは、腫瘍細胞におけるγ34.5産物の活性な発現が、Myb34.5をγ34.5陽性表現型へと回復させることを示唆する。しかし、hrR3は単純な挿入変異体であるので、Myb34.5は、潜伏性の既存のHSV感染またはその後のHSV感染の存在下で、野生型へ組換え修復する傾向が低いという理論上の利点を提供する。相同組換えを介したICP6遺伝子座の修復が生じ得るという見込みの低い事象においてさえ、B−myb/γ34.5挿入物は切り出され、そしてR3616(MGH1についての親ウイルス)のγ34.5欠失遺伝子型にMyb34.5を回復させる。
【0183】
公表された結果によって、γ34.5の少なくとも1つの機能は、ウイルス感染に対する宿主細胞応答を防止すること、すなわち、アポトーシス様応答における宿主タンパク質合成の遮断の誘発であることが示された(Chou,J.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:10516−10520(1995);Chou,J.ら,Science 250:1262−1266(1990);Chou,J.およびRoizman,B.,Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:3266−3270(1992))。同様の機能は、病原性ウイルスの間で広範に広がっている(Cosentino,G.P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9445−9449(1995);Gale,M.ら,Mol.Cell.Biol.18:5208−5218(1998);Katze,M.G.,Trends Microbiol.3.75−78(1995);Sharp,T.V.ら,Nucleic Acids Res.21:4483−4490(1993))。γ34.5は、Vero細胞における培養物でのウイルス増殖には必須ではないが、マウス中枢神経系においてウイルスを伝播させ得(Kesari,S.ら,J Gen.Virol.79:525−536(1998);Kesari,S.ら、J Neurosci.16:5644−5653(1996);Markovitz,N.S.ら,J Virol.71:5560−−5569(1997))、そしてCNS複製において以前に関連付けられたHSVゲノムの領域にマッピングさせる(Centifanto−Fitzgerald,Y.M.ら,J Exp.Med 155:475−489(1982);Markovitz,N.S.ら,J Virol.71.5560−−5569(1997))。これは、γ34.5コードタンパク質が、二本鎖RNA依存性キナーゼを阻害するという事実に起因し得る。二本鎖RNA分子への曝露に際して、ウイルス感染で通常見られるように、RNA依存性キナーゼは、延長開始因子2のαサブユニットをリン酸化して、タンパク質合成の阻害を生じさせる(Chou,J.ら,Science 250:1262−1266(1990);Chou J.ら、J.Virol.68:8304−8311(1994);Chou,J.およびRoizman,B.,Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:3266−3270(1992))。γ34.5を発現し得ない変異体を、ニューロン起源の細胞に感染させることは、細胞のタンパク質合成の遮断を生じさせ、結果としてウイルス産生の制限を生じさせる。
【0184】
本研究の1つの重要な局面は、B−mybプロモーター転写制御による、γ34.5機能の回復を示すことであった。これは、MGH1およびMybRevtでの細胞の感染が、タンパク質合成の抑制を生じさせたが、タンパク質合成はMyb34.5が感染性ウイルスであった場合には回復されたということを実証することによってなされた。細胞周期に対するγ34.5機能の新規なB−myb転写依存性についてのさらなる証拠が、ロバスタチン休止実験によって与えられた。これらは明らかに、増殖休止状態下において、B−myb転写活性が最小である場合、Myb34.5の力価がMGH1およびMybRevtの力価と類似しており、そして野生型F株およびhrR3株の力価とは異なることを示した。しかし、細胞が血清刺激された場合、Myb34.5の力価は、3桁増加して、F株およびhrR3で得られた力価に近づくが、γ34.5変異体(MGH1およびMybRevt)の力価は、わずかにのみ増加した。Myb34.5複製の基底レベルが、休止細胞におけるhrR3のレベルよりも低く、そして量的にはRRγ34.5変異体MGH1のレベルにより類似していたことは注目に値した。Myb34.5は、hrR3よりも高い倍率での、周期運動中の細胞における複製誘導を示したが、MGH1およびMybRevtは、最小の誘導を示した。このことは、Myb34.5構築物の効果が、リボヌクレオチドレダクターゼの単純な補完効果に勝ることを示唆する。
【0185】
これらの結果により、B−mybプロモーターが、休止細胞におけるウイルス複製を制限し、そして周期運動中の細胞に対してウイルス複製を再指向させるという仮定が確証された。従って、脳腫瘍治療の状況下では、Myb34.5は、休止している細胞においては比較的低レベル(MGH1で観察されるレベルに類似する)で複製するが、分裂中の脳腫瘍細胞の感染によって、ウイルス力価の顕著な増加を生じさせ、このようにしてMGH1または他のγ34.5変異体を超える治療的利点を与える。正常な脳細胞の感染は、γ34.5変異体で生じ得(Kesari,S.ら,J.Gen.Virol.79:525−536(1998);Kesari,S.ら,J Neurosci.16:5644−5653)(1996);Markovitz,N.S.ら,J Virol.71:5560−5569(1997))、そしてMyb34.5作用が休止している感染神経細胞におけるこれらの変異体の作用を模擬することが予期される。実際、本発明者らのインビトロおよびインビボ研究によって、培養ニューロンおよびマウスの脳におけるMyb34.5複製が、γ34.5変異体ウイルス(MGH1、MybRevt、およびR3616)の複製と類似し、そして野生型F株およびhrR3の複製とは異なることが示された。
【0186】
代替的な説明によれば、Myb34.5の観察された効果が、単一のγ34.5遺伝子による2つの内因性γ34.5遺伝子の置換に起因し、そして、内因性HSV γ34.5プロモーターよりも弱く、かつその厳密な細胞周期調節の特徴が、HSVゲノムの状況下では破壊されるプロモーター(B−myb)を使用することによるということであり得る。この可能性を正式に排除することは、変異体B−mybプロモーターでの広範なさらなる実験を必要とするが、本発明者らは、現在の実験データに照らして、これは見込みが低いままであると考える。この実験が真実である場合には、以下のことが予期される:(i)休止細胞におけるMyb34.5複製は、γ34.5欠失変異体の複製よりも高い(前者の変異体における調節解除されたB−mybプロモーターによるγ34.5遺伝子の低レベル発現が原因);(ii)Myb34.5に感染した神経芽細胞腫細胞において観察される宿主タンパク質合成の遮断の阻害(図2)は、FまたはhrR3に感染した細胞において観察される阻害よりも、さほど明白ではない(内因性HSVプロモーターによって駆動される2つのγ34.5遺伝子によって達成される強力な発現と比較して、より弱いプロモーターでの単一のγ34.5遺伝子のより弱い発現が原因);(iii)U373細胞におけるMyb34.5の複製(γ34.5変異体の厳しく制限された複製に対して公知(Mohr,I.およびGluzman,Y.,EMBO J.15:4759−4766(1996)))はまた、FまたはhrR3の発現と比較した、Myb34.5における弱いγ34.5遺伝子発現によって、幾分制限される;ならびに(iv)休止中の細胞と周期運動中の細胞との間の複製における差異は、Myb34.5(調節解除されたB−mybプロモーターによって駆動される1コピーのγ34.5を発現する)についてよりもhrR3またはF株(内因性HSVプロモーターによって駆動される2コピーのγ34.5を発現する)について高い。
【0187】
本実施例における実験データは、前述の予測と一致しない。この観察された結果について最も見込みある説明は、B−mybプロモーターが、HSVゲノムの状況下においてさえ、比較的厳重な様式で調節を維持し、このようにして、休止細胞においては、存在するにしても最小のγ34.5発現へと導き、そして周期運動中の細胞および腫瘍細胞においては、インタクトなγ34.5機能を有するウイルス株で観察されるレベルと機能的に類似していると思われる発現レベルへと導くということである。
【0188】
HSV変異体が、ベクターとして機能するように操作され得るということが、近年示された。このことは、HSV変異体に、ウイルス腫瘍崩壊機能のみならず、さらなる抗癌効果を発現させることを可能にし、その治療的効果を増加させる(Chase,M.ら,Nat.Biotechnol.16:444−448(1998))。明らかに、Myb34.5はまた、抗癌遺伝子(例えば、プロドラッグを活性化させる遺伝子)の付加のために適切な骨格を提供し得る。腫瘍選択的なプロモーターが同定される場合、正常細胞に対して腫瘍細胞へとウイルス産生をさらに制限するために、γ34.5遺伝子または他の毒力遺伝子の発現を制御するようにこれらを使用することは、比較的容易である。本明細書中に記載したアプローチをまた使用して、細胞特異的プロモーターを用いることにより、組織中の特定の細胞型に毒力を制限し得る。
【0189】
B−mybプロモーターは、コンセンサスなE2F結合部位を含み、周期運動中の細胞に厳密に制限され、そして実際に、G0において発現される(Lam,E.W.およびWatson,R.J.,EMBO J.12:2705−2713(1993);Lam,E.W.ら,Gene 160:277−281(1995);Bennett,J.D.ら,Oncogene 13:1073−1082(1996))。E2F応答性プロモーターを含む複製欠損アデノウイルスを用いて、休止ニューロン組織に対してのみならず、形質転換されていない正常な周期運動中の細胞に対しても相対的な、腫瘍特異的な遺伝子発現が示された(Parr,M.J.ら,Nat.Med 3:1145−1149(1997))。E2Fを調節する、細胞周期調節p16/網膜芽細胞腫/cdk4経路のいくつかの部分の変更は、ヒト神経膠腫ならびに多くの他の腫瘍型におけるほぼ普遍的な事象であるように思われ、そしてウイルス遺伝子産物の腫瘍特異的発現を標的化するための優良な基質を提供する(He,J.ら,Cancer Res.54:5804−5807(1994);Ueki,K.ら,Cancer Res.56:150−153(1996))。
【0190】
別のHSV−1変異体(ここでは、肝細胞に対してICP4発現を調節するために、アルブミンプロモーターを使用した)が記載された(Miyatake,S.ら,J Virol.71:5124−5132(1997))。本報告において記載されたストラテジーからの主要な差異は、肝細胞特異的な代わりに腫瘍特異的または細胞周期特異的と考えられ得るプロモーターを使用すること、および必須の転写因子(例えば、ICP4)ではなく毒力(γ34.5)に直接関係したHSV遺伝子を使用することである。膠芽腫の処置についての研究の下での多くのウイルスベクターとは対照的に、Myb34.5と称される例示されたベクターは複製能を有し、そして標的化した毒力は、ウイルス複製および直接的な腫瘍崩壊を調節することによって得られる。これに関して、Myb34.5は新規な標的化された腫瘍崩壊性ヘルペスウイルスを表し、そして近年記載された2つの腫瘍選択的な腫瘍崩壊性アデノウイルスおよびレオウイルスに加えられる(Bischoff,J.R.ら,Science 274:373−376(1996);Coffey,M.C.ら,Science 282:1332−1334(1998))。E1B欠損アデノウイルスONYX−015は、腫瘍細胞における効率的な複製のためのp53腫瘍抑制経路の変更に依存すると考えられるが、この機構は近年、異議を唱えられている(Goodrum,F.D.ら,J Virol.72:9479−9490(1998))。
【0191】
レオウイルス株は、活性化ras経路を有する細胞において選択的に複製することが示された(Coffey,M.C.ら,前出)。Myb34.5は、pl6/cdk4/RB/E2F経路の変更を利用し得、そして、複数の腫瘍の遺伝的変更が異なるウイルス処置ストラテジーによって標的化され得る可能性に加えられる。γ34.5遺伝子の発現を駆動するために細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターを使用するストラテジーはまた、インビボにおいて選択された細胞集団を排除するための手段として適切であり得る。最終的に、強力な抗腫瘍効力と組み合わせて、安全性増加の知見は、Myb34.5が、悪性腫瘍の処置のための優れた候補であることを示唆する。
【0192】
医学、ウイルス学、分子生物学、免疫学、薬理学、および/または関連の分野の当業者に自明である、本発明を実施するための上記様式の改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【0193】
本明細書中において言及されたすべての刊行物および特許は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示す。すべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されると示された場合と同程度に、本明細書中で参考として援用される。
【0194】
前述の本発明は、理解の明快さの目的のために、例示および実施例によって幾分詳細に記載されたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aは、HSV株F(野生型)、MGH1(二重RR(ICP6)/γ34.5変異体)、およびMyb34.5の概略マップを示す。全ての株は、2つの固有のセグメントであるULおよびUSを有する、代表的なHSVゲノムを含み、このセグメントの各々には、それぞれ、逆方向反復セグメントabおよびcaが隣接する(McGeoch,D.J.ら、J.Gen.Virol.72:3057−3075(1991))。固有のセグメントまたは反復セグメントのいずれかにおける局在に依存して、HSV遺伝子は、1コピーまたは2コピーで存在する。黒ボックスは、ICP6内のBamHI部位へのLacZ挿入を示し(Goldstein,D.J.およびWeller,S.K.、J.Virol.62:2970−2977(1988))、一方、Δは、MGH1およびMyb34.5におけるγ34.5内の欠失を示す(Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−2068(1997))。斜線バーは、ICP6遺伝子座内へのB−mybプロモーター−γ34.5構築物の組換えを示す。
【図1B】 図1Bは、サザンブロット分析による、HSV変異体Myb34.5の特徴付けを示す。ICP6に対する完全長プローブへのXhoI消化ウイルスDNAのハイブリダイゼーションは、MHG1(レーン2)およびMybRevt(レーン4)における完全長lacZ挿入を有するICP6遺伝子の、予測される9.0kBフラグメントサイズを表す。Myb34.5(レーン3)において、B−mybプロモーター/γ34.5カセットによる置換およびICP6のさらなる欠失が存在し、6.7kBのバンドを与える。野生型F株由来のDNAは、レーン1にある。
【図1C】 図1Cは、lacZプローブでのハイブリダイゼーションを示し、そしてMGH1(レーン2)およびMybRevt(レーン4)を有するフラグメントを表す。Myb34.5(レーン3)へのハイブリダイゼーションは存在しない。
【図1D】 図1Dは、R3616およびMGH1の欠失領域に対して内側の、γ34.5のBstEII−Bbフラグメントを示し、これは、BamHI消化Myb34.5 DNA(レーン3)における5.3kBのフラグメントおよびF(レーン1)におけるいくつかのバンドを明らかにするが、MGH1(レーン2)およびMybRevt(レーン4)のいずれにもハイブリダイズしない。
【図2】 図2は、変異体ウイルス株による宿主タンパク質合成の遮断の阻害を実証する、電気泳動分離した感染細胞の溶解物のオートラジオグラフ像を示す。ヒト神経芽細胞腫細胞(SK−N−SH)を、1×106細胞/100mmディッシュでプレートした。24時間後、細胞を、3.0のMOIで感染させた。ウイルス感染の15時間後、細胞を、メチオニンを含まない培地で手短に洗浄し、次いで、60μCi S35−メチオニンを含む培地と共に90分間インキュベートした(Toda,M.ら、Hum.Gene.Ther.9:177−2185(1998))。標識後、細胞を収集し、SDSを含む緩衝液中に可溶化し、そして10%アクリルアミドゲル上で電気泳動した。次いで、ゲルをニトロセルロースに転写しそしてオートラジオグラフィーに供した。感染細胞のポリペプチドを、Morse,L.S.ら、J.Virol.26:389−410(1978)に従って設計した。
【図3】 図3は、分裂停止細胞または周期運動中の細胞(cycling cell)におけるウイルス複製を示す棒グラフである。ヒト胚由来初代線維芽細胞(CRL 7706)を、1×105細胞/60mmディッシュでプレートした。プレーティング後48時間で、培地を、36時間、20μM ロバスタチンを含むDMEMで置換した(斜線バー)。3連のプレートを計数し、そして種々の変異体株を1.0の感染多重度(MOI)で感染させた(3連での実験)。感染後48時間で、細胞および上清を回収し、凍結融解サイクルによってウイルスを遊離させた。並行実験を、10%ウシ胎仔血清(黒バー)を含む培地中に維持させた細胞を用いて行った。ウイルス力価(output)を、ベロ(Vero)細胞に対するプラークアッセイによって決定し、log 10 PFU/1×105侵入(input)ウイルスとして表す(値は、3連での実験の平均を表す)。試験したウイルスについて、ロバスタチンでの力価は、血清を用いて得られた力価よりも統計的に低い(スチューデントT検定値;F、p=0.027;hrR3、p=0.001;MGH1、p=0.011;Myb34.5、p=0.001;MybRevt、p=0.003)。
【図4A】 図4Aおよび4Bは、Myb34.5によるインビボ増殖阻害を示す。類似の実験において、ラット神経膠肉腫9L細胞(図4A)およびヒトU87ΔEGFR神経膠腫細胞(図4B)を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。14日後(9L)または10日後(U87)に開始し(1日目)、ビヒクルまたは変異体ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時(1、3、5、7日目)を示し、一方、値は、1グループあたり5匹のマウス(9L)または1グループあたり6匹のマウス(U87ΔEGFR)の平均を示す。図4Aにおいて、腫瘍体積の差異は、12日目、18日目および33日目の時点で有意であった(p<0.05、分散の一方向反復測定)。
【図4B】 図4Aおよび4Bは、Myb34.5によるインビボ増殖阻害を示す。類似の実験において、ラット神経膠肉腫9L細胞(図4A)およびヒトU87ΔEGFR神経膠腫細胞(図4B)を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。14日後(9L)または10日後(U87)に開始し(1日目)、ビヒクルまたは変異体ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時(1、3、5、7日目)を示し、一方、値は、1グループあたり5匹のマウス(9L)または1グループあたり6匹のマウス(U87ΔEGFR)の平均を示す。図4Bにおいて、腫瘍体積の差異は、18日目、27日目および34日目の時点で有意であった(p<0.05、分散の一方向反復測定)。表4に示されるように、34日目のみについては、p<0.005である。
Claims (32)
- ヘルペスウイルス変異体であって、以下:
(a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活性化変異;ならびに
(b)細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1コピーの該γ34.5遺伝子の挿入
を含む、ヘルペスウイルス変異体。 - 前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス1型である、請求項1に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス2型である、請求項1に記載のヘルペスウイルス変異体。
- ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項1に記載のヘルペスウイルス変異体。
- ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異体。
- ヘルペスウイルス遺伝子の前記内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコードする遺伝子内にある、請求項5に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子の産物が腫瘍性細胞に対して細胞傷害性である、請求項5に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化または増強し得る産物、サイトカイン遺伝子、癌抑制遺伝子、または以下:ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセンスRNA、および、リボザイムからなる群から選択される殺腫瘍性遺伝子をコードする、請求項7に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記導入遺伝子が、本来のγ34.5欠失においてか、またはヘルペスUL40遺伝子座における任意の場所に挿入される、請求項8に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をコードする、請求項8に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記自殺遺伝子が、哺乳動物シトクロムP450である、請求項10に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記哺乳動物シトクロムP450が、P450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4である、請求項11に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記腫瘍特異的プロモーターが、DF3(MUC1);AFP;CEA、PSA;チロシナーゼ、B−myb、またはc−erbB2である、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 前記腫瘍特異的プロモーターがB−mybである、請求項13に記載のヘルペスウイルス変異体。
- 単純ヘルペスウイルス1型変異体であって、以下:
a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異;
b)b−mybプロモーターの転写制御下にある1コピーのγ34.5遺伝子の挿入物;および、
c)リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス1型変異体。 - 前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター;膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター;視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子;破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター;骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター;またはノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーターである、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異体。
- ヘルペスウイルス変異体を含む、既知の腫瘍特異的プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための組成物であって、該ウイルス変異体が、以下:
(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;および
(b)該腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1コピーの該γ34.5遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ34.5遺伝子の発現を駆動する、挿入
を含む、組成物。 - 前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項17に記載の組成物。
- ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項18に記載の組成物。
- 前記ウイルス変異体が、以下:
a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異;
b)b−mybプロモーターの転写制御下にある1コピーのγ34.5遺伝子の挿入物;および、
c)リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス1型変異体である、請求項19に記載の組成物。 - 請求項18に記載の組成物であって、ここで前記ウイルス変異体が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をさらに含み、そして該組成物が、該化学療法剤とともに投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記自殺遺伝子が、シトクロムP450をコードする、請求項21に記載の組成物。
- 前記シトクロムP450が、P450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、および、P450 3A4からなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
- 前記シトクロムP450がP450 2B1である、請求項23に記載の組成物。
- 前記化学療法剤が、シクロホスファミドまたはイホスファミドである、請求項23に記載の組成物。
- 前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロモーターが、DF3(MUC1);AFP;CEA、PSA;チロシナーゼ、B−myb、またはc−erbB2である、請求項17に記載の組成物。
- 前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロモーターがB−mybである、請求項26に記載の組成物。
- 前記ヘルペスウイルス変異体が、以下:
a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失変異;
b)b−mybプロモーターの転写制御下にある1コピーのγ34.5遺伝子の挿入物;および、
c)リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子内の内因性欠失、
を含む、単純ヘルペスウイルス1型変異体である、請求項27に記載の組成物。 - ヘルペスウイルス変異体を含む、既知の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に排除するための組成物であって、該ウイルス変異体が、以下:
(a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;および
(b)該細胞特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1コピーの該γ34.5遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ34.5遺伝子の発現を駆動する、挿入
を含む、組成物。 - 前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項29に記載の組成物。
- ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項30に記載の組成物。
- 前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター;膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター;視床下部の細胞において発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子;破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター;骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター;またはノルアドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーターである、請求項30に記載の組成物。
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