ES2233349T3 - Reordenacion por promotores especificos para una celula y/o especificos para un tumor de la expresion del gen gamma 34,5 herpetico. - Google Patents

Reordenacion por promotores especificos para una celula y/o especificos para un tumor de la expresion del gen gamma 34,5 herpetico.

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Abstract

Un mutante viral herpético que comprende: (a) una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen que codifica 34.5; y (b) una inserción de al menos una copia del gen 34.5 bajo el control transcripcional de un promotor específico para una célula y/o específico para un tumor.

Description

Reorientación por promotores específicos para una célula y/o específicos para un tumor de la expresión del gen \gamma34,5 herpético.
Indicación acerca de los derechos para las invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo patrocinados federalmente
Al menos parte del trabajo realizado durante el desarrollo de esta invención utilizaba una concesión de the National Cancer Institute, Concesion Nº CA6924602. El gobierno de los EE.UU. tiene ciertos derechos en esta inven-
ción.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a un mutante viral herpético capaz de orientarse selectivamente a células tumorales y/u otras poblaciones celulares específicas. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de promotores específicos para una célula y/o específicos para un tumor para reorientar vectores virales herpéticos mutantes hacia tumores y tipos de células específicos. El promotor específico para una célula y/o específico para un tumor se usa para reducir la expresión del gen gamma (\gamma) 34.5 herpético, cuyo producto génico es responsable de producir grandes cantidades de virus de progenie en células infectadas.
Los vectores herpéticos sin el gen \gamma34.5 no se replican bien, lo que es deseable para un uso clínico. Sin embargo, la ausencia del gen \gamma34.5 también disminuye la capacidad del virus para destruir tumores o cualquier otro tejido infectado. La presente invención permite la producción de altas cantidades de virus herpético en células que pueden usar el promotor específico para una célula y/o un tumor. Sin embargo, las células que no pueden activar el promotor, no soportan la replicación viral, salvándolas así a ellas y a sus células vecinas de la infección y replicación virales activas y nocivas, redirigiendo así la virulencia del herpes hacia células diana deseadas.
Técnica relacionada A. Terapias para el cáncer convencionales
La neoplasia es un proceso que se produce en el cáncer, por el que los mecanismos de control normales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular se deterioran, dando como resultado un crecimiento progresivo. Este deterioro de los mecanismos de control permite que un tumor se agrande y ocupe espacios en áreas vitales del cuerpo. Si el tumor invade tejido circundante y es transportado a sitios distantes (metástasis) probablemente dará como resultado la muerte del individuo.
En 1999, solo en los Estados Unidos, se espera que aproximadamente 563.100 personas, o aproximadamente 1.500 personas al día, mueran de cáncer. (Landis, y otros, "Cancer Statistics, 1999", CA Canc. J. Clin. 49:8-31 (1999)). Por otra parte, el cáncer es una causa principal de muerte entre niños de 1 a 4 años, en segundo lugar sólo después de los accidentes. Id. Así, existe claramente una necesidad de desarrollar nuevas terapias contra el cáncer.
1. Limitaciones comunes de las terapias convencionales
El objetivo deseado de la terapia contra el cáncer es destruir las células cancerosas preferentemente, sin tener un efecto perjudicial sobre las células normales. Se han usado varios métodos en un intento de alcanzar este objetivo, incluyendo la cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia. La cirugía fue el primer tratamiento disponible contra el cáncer, y todavía representa un papel principal en el diagnóstico, la clasificación y el tratamiento del cáncer, y puede ser un tratamiento principal para cánceres primarios (véase Slapak, C.A. y Kufe, D.W., "Principies of Cancer Therapy", en Harriron's Principles of Internal Medicine, Fauci, A.S. y otros, eds., 14ª Ed., McGraw-Hill Cos., Inc., Nueva York, 1998. en 524). Sin embargo, aunque la cirugía puede ser un modo eficaz de curar tumores confinados a un sitio particular, estos tumores pueden no ser curables mediante extirpación debido a una enfermedad micrometastática fuera del área del tumor. Id. Cualquier cáncer que muestre un nivel de metástasis no puede curarse eficazmente sólo a través de cirugía. Id.
La terapia de radiación es otra forma local (no sistémica) de tratamiento usada para el control de cánceres localizados. Id. en 525. Muchas células normales tienen una capacidad superior para la reparación intercelular que las células neoplásticas, haciéndolas menos sensibles al daño por radiación. La terapia por radiación se basa en esta diferencia entre las células neoplásticas y normales en la susceptibilidad al daño por radiación y la capacidad de los órganos normales para continuar funcionando bien si solo son dañados parcialmente. Id. Así, el éxito de la terapia por radiación depende de la sensibilidad a la terapia por radiación del tejido que rodea al tumor. Id. La terapia por radiación se asocia con efectos secundarios que dependen en parte del sitio de administración e incluyen fatiga, reacciones locales de la piel, náuseas y vómitos. Id. en 526. Además, la terapia por radiación es mutagénica, carcinogénica y teratogénica, y puede poner al paciente en riesgo de desarrollar tumores secundarios. Id.
Se han explorado otros tipos de terapia local, incluyendo hipertermia local (Salcman; M. y otros, J. Neuro-Oncol. 1:225-236 (1983)), terapia por fotorradiación (Cheng, M.K. y otros, Surg. Neurol. 25:423-435 (1986)) y radiación intersticial (Gutin; P.H. y otros, J. Neurosurgery 67:864-87 3 (1987)). Desgraciadamente, estas terapias solo se han encontrado con un éxito moderado.
Los tratamientos locales, tales como terapia por radiación y cirugía, ofrecen un modo de reducir la masa del tumor en regiones del cuerpo que son accesibles a través de técnicas quirúrgicas o altas dosis de terapia por radiación. Sin embargo, se necesitan terapias locales más eficaces con menos efectos secundarios. Por otra parte, estos tratamientos no son aplicables a la destrucción de células tumorales ampliamente diseminadas o circulantes encontradas a la larga en la mayoría de los pacientes con cáncer. Para combatir la extensión de células tumorales, se usan terapias
sistémicas.
Uno de tales tratamientos sitémicos es la quimioterapia. La quimioterapia es el principal tratamiento para cánceres malignos diseminados (Slapak, C.A. y Kufe, D.W, "Principles of Cancer Therapy" en Harrison's Principles of Internal Medicine, Fauci, A.S. y otros, eds., 14ª Ed., McGcaw-Hill Cos., Inc., Nueva York, 1998, 527). Sin embargo, los agentes quimioterapéuticos están limitados en su eficacia para tratar muchos tipos de cánceres, incluyendo muchos tumores sólidos comunes, Id. Este fracaso se debe en parte a la resistencia a los fármacos intrínseca o adquirida de muchas células tumorales. Id. en 533. Otra desventaja del uso de agentes quimioterapéuticos es sus graves efectos secundarios. Id. en 532. Estos incluyen supresión de la médula ósea, náuseas, vómitos, pérdida de cabello y ulceraciones en la boca. Id. Claramente, se necesitan nuevos sistemas para potenciar la eficacia con la que un agente quimioterapéutico pueda destruir células tumorales malignas, mientras que al mismo tiempo se evite la toxicidad sistémica.
2. Retos presentados por tumores del sistema nervioso central
Otro problema en el tratamiento del cáncer es que ciertos tipos de cáncer, por ejemplo los gliomas, que son la enfermedad maligna primaria más común que se produce en el cerebro humano, desafían a las modalidades de tratamiento actuales. A pesar de la cirugía, la quimioterapia y la terapia por radiación, el glioblastoma multiforme, el más común de los gliomas, es casi universalmente letal (Schoenberg, en Oncology of the Nervous System; M.D. Walker, ed., Boston, Mass., Martinus Nijhoff (1983); Levin y otros, Capítulo 46 en Cancer: Principles and Practice of Oncology, vol. 2, 3ª ed., De Vita y otros, eds., Lippincott Press, Philadelphia (1989), páginas 1557-1611).
Los gliomas representan casi 40% de todos los tumores cerebrales primarios, constituyendo el glioblastoma multiforme la forma más maligna (Schoenberg; "The Epidemiology of Nervous. System Tumors", en Oncology of the Nervous System, Walker, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; N.Y. (1983)). El grado de supervivencia de 5 años para personas con este tipo de astrocitoma de alto grado es menos de 5 por ciento, dadas las modalidades de tratamiento actuales (cirugía, terapia por radiación y/o quimioterapia) (Mahaley y otros, Neurosurgery 71:826-836 (1989); Schoenberg; en Oncology of the Nervous System, Walker, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1983); Kim y otros, J. Neurosurg. 74:27-37 (1991), Daumas-Duport y otros, Cancer 2:2152-2165 (1988)). Después del tratamiento con terapia por radiación, los glioblastomas habitualmente se reproducen localmente. (Hochberg, F.H. y otros, Neurology 30:907-911 (1980). La disfunción neurológica y la muerte en un individuo con glioblastoma se deben al crecimiento local del tumor. Las metástasis sistémicas son raras. Id. Por esta razón, los métodos de terapia del cáncer regionales, en lugar de los métodos sistémicos, pueden ser especialmente adecuados para el tratamiento de glioblastomas.
Por otra parte, los glioblastomas son resistentes a muchos agentes quimioterapéuticos, quizás debido a las características proliferativas de este tipo de tumor. Muchos agentes quimioterapéuticos son activos según el ciclo celular, es decir, citotóxicos principalmente para células que sufren el ciclo activamente (Slapak, C.A., y Kufe, D.W., "Principles of Cancer Therapy", en Harrison's Principles of Internal Medicine; Fauci, A.S. y otros, eds., 14ª Ed., McGraw-Hill Cos., Inc., Nueva York, 1998, 527). Generalmente, la quimioterapia es lo más eficaz para cánceres con un pequeña carga tumoral donde la fracción de crecimiento del tumor es máxima. Id. La fracción de crecimiento para tumores de glioblastoma es solo 30%, estando el 70% restante de las células en G_{0}, una fase de reposo (las células en G_{0} pueden morir o volver a entrar en el ciclo celular activo (Yoshii y otros, J. Neurosurg. 65:659-663 (1986)). Aunque el 30% de las células de glioblastoma que se dividen activamente contribuye a la progresión letal de este tumor, el 70% que son quiescentes son responsables de la resistencia de estos tumores a un número de agentes quimioterapéuticos que se orientan a células que proliferan activamente.
Desgraciadamente, los tratamientos regionales, tales como cirugía y terapia por radiación, también han encontrado un éxito limitado en el tratamiento de los glioblastomas (Burger y otros, J. Neurosurg: 58:159-169 (1983); Wowra y otros, Acta Neurochir. (Wien) 99:104-108 (1989); Zamorano y otros, Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 46:90-93 (1989)). El tratamiento quirúrgico de los glioblastomas está dificultado por la falta de límites claros entre el tumor y el parénquima circundante y por la migración de células tumorales en los tractos de la materia blanca que se extienden fuera del sitio primario (Burger y otros, J. Neurosurg 58:159-169 (1983)), lo que impide su retirada completa. La terapia por radiación, que se orienta a células que proliferan rápidamente, está limitada por la baja fracción de crecimiento en los glioblastomas y por la sensibilidad a la radiación del tejido normal circundante (Wowra y otros, Acta Neurochir. (Wien) 99:104-108 (1989); Zamorano y otros, Acta Néurochir. Suppl. (Wien) 46:90-93 (1989)). Así, son especialmente necesarios nuevos sistemas para tratar tumores cerebrales.
B. Sistemas no tradicionales para la terapia del cáncer que usan virus
Un sistema no tradicional para la terapia del cáncer emplea virus mutados para orientarse a células neoplásticas. Véase Chung, R.Y. y Chiocca, E.A., Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7:589-602 (1998)).
Las terapias contra el cáncer virales propuestas incluyen dos sistemas distintos: (1) destrucción celular directa (oncolisis) mediante un virus mutagenizado (Martuza y otros, Science 232:854-856 (1991); Mineta y otros, Nature Med 1:938-943 (1995); Boviatsis y otros, Cancer Res 54:5745-5751 (1994); Kesari y otros, Lab. Invest. 73:636-648: (1995); Chambers y otros; Proc. Natl Acad Sci. USA 92:1411-1415 (1995); Lorence, R.M. y otros, J Natl. Cancer. Inst. 86:1228-1233 (1994); Bischoff y otros, Science 274:373-376 (1996); Rodríguez y otros, Cancer Res 57:2559-2563 (1997)); y (2) el uso de vectores virales para aportar un transgén cuyo producto de expresión activa un agente quimioterapéutico (Wei y otros, Human Gene Therapy 5:969-978 (1994); Chen y Waxman, Cancer Res. 55:581-589 (1995); Moolten; Cancer Gene Ther. 1:279-287 (1994); Fakhrai y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2909-2914 (1996); Roth y otros, Nature Med.2:985-991(1996); Moolten, Cancer Res. 46:5276-5281 (1986); Chen y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:3054-3057 (1994)).
1. Oncolisis viral
La transformación mediante ingeniería genética de virus para usar como agentes oncolíticos se ha enfocado inicialmente al uso de virus incompetentes con respecto a la replicación. Se esperaba que esta estrategia evitara el daño a células no tumorales por los virus. Una limitación principal de este sistema es que estos virus incompetentes con respecto a la replicación requerían un virus cooperador para poder integrarse y/o replicarse en una célula huésped. Un ejemplo del sistema de la oncolisis viral, el uso de retrovirus defectuosos con respecto a la replicación para tratar tumores del sistema nervioso, requiere la implantación de una línea celular productora para extender el virus. Estos retrovirus están limitados en su eficacia, debido a que cada partícula del retrovirus defectuoso con respecto a la replicación puede entrar solo en una célula y no puede infectar productivamente otras más adelante. Por lo tanto, no pueden extenderse más allá de la célula productora y no pueden penetrar completamente en un tumor multiestratificado profundo in vivo (Markert y otros, Neurosurg 77:590 (1992); Ram y otros, Nature Medicine 3:1354-1361 (1997)).
Más recientemente, la transformación mediante ingeniería genética de virus oncolíticos se ha enfocado a la generación de virus condicionales con respecto a la replicación en un intento de evitar la infección sistémica, mientras se permite que el virus se extienda a otras células tumorales. Los virus condicionales con respecto a la replicación se diseñan para replicarse preferentemente en células que se dividen activamente, tales como células tumorales. Así, estos virus deben orientarse a células tumorales para la oncolisis y replicarse en estas células de modo que el virus pueda extenderse a otras células tumorales.
Algunas estrategias recientes para crear mutantes virales condicionales con respecto a la replicación como agentes anticancerígenos han empleado mutaciones en genes adenovirales o de virus de herpes simple tipo 1 (HSV-1) seleccionados para hacerlos condicionales con respecto a la replicación (Martuza, R.L y otros, Science 252:854-856 (1991); Mineta, T., y otros, Nature Med 1:938-943 (1995); Boviatsis, E.J. y otros, Cancer Res. 54:5745-5751 (1994); Kesari, S. y otros, Lab. Invest. 73:636-648 (1995); Chambers, R. y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:1411-1415 (1995); Lorence, R.M. y otros, J. Natl. Cancer. Inst. 86:1228-1233 (1994); Bischoff, J.R. y otros, Science 274: 373-376 (1996); Rodríguez, R. y otros, Cancer Res 57:2559-2563 (1997)). Por ejemplo, se ha observado que un adenovirus con una deleción en el gen que codifica E1B-55Kd se replica selectivamente en células tumorales defectuosas en p53 (Bischoff, J.R. y otros, previamente).
Se han estudiado hasta la fecha dos tipos amplios de mutantes de HSV condicionales con respecto a la replicación en un solo gen. El primero consiste en mutantes virales con defectos en la función de un gen viral necesario para el metabolismo de los ácidos nucleicos, tal como timidina quinasa (Martuza, R.L. y otros, Science 252:854-856 (1991)), ribonucleótido reductasa (RR) (Goldstein, D.J. y Weller, S.K., J. Virol. 62:196-205 (1988); Boviatsis, E.J. y otros, Gene Ther.1:323-331 (1994); Boviatsis, E.J. y otros, Cancer Res. 54:5745-5751 (1994); Mineta, T. y otros, Cancer Res. 54:3363-3366 (1994) o uracilo-N-glicosilasa (Pyles, R.B. y Thompson, R.I., J. Virol. 68:4963-4972
(1994)).
El segundo consiste en mutantes virales con defectos en la función del gen \gamma34.5 (Chambers, R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1411-1415 (1995)), que funciona como un factor de virulencia potenciando notablemente el tamaño del estallido viral de células infectadas a través de la supresión de la interrupción de la síntesis de proteínas huésped (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. y Roizman, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)).
Estas cepas mutantes simples tienen ciertas limitaciones inherentes, incluyendo la resistencia a ganciclovir y aciclovir para mutantes TK (Mineta T. y otros, Cancer Res. 54:3363-3366 (1994)), el riesgo de inversión hasta el tipo silvestre mediante un solo suceso de recombinación con virus silvestre, y una eficacia oncolítica reducida para mutantes \gamma34.5, al menos en ciertas líneas celulares tumorales (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997); Mohr, I. y Bluzman, Y., EMBO J. 15:4759-4766 (1996); Toda M. y otros, Hum. Gene. Ther. 9:2177-2185 (1998)).
En un esfuerzo para disminuir el riesgo de la recombinación silvestre, se han desarrollado virus de HSV que están múltiplemente mutados. Estos incluyen mutantes G207 (Mineta, T. y otros, Natl. Med. 1:938-943 (1995); Patente de EE.UU. 5.585.096, concedida el 17 de Diciembre de 1996 a Martuza y otros) y MGH1 (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997), que poseen deleciones de ambas copias de \gamma34.5 y una mutación de inserción de
RR.
Otro virus de HSV múltiplemente mutado es la cepa mutante \gamma34.5/uracilo DNA-glicosilasa (UNG) 3616UB
(Pyles, R.B. y otros, Hum. Gene Ther. 8:533-544 (1997)). Estas cepas mutantes dobles demuestran una neurovirulencia notablemente reducida durante la inyección intracraneal directa, retienen sensibilidad a ganciclovir y muestran una replicación relativamente selectiva en células tumorales en comparación con tejidos normales. Tales cepas de HSV mutantes dobles retienen el gen \gamma34.5 defectuoso, demostrando así poca virulencia hacia tejidos normales. Aunque muestran claramente efectos oncolíticos contra células tumorales, tales efectos son menores que los observados en mutantes con genes \gamma34.5 intactos (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997); Qureshi, N. y Chiocca, E.A., datos no publicados). Por otra parte, la toxicidad exhibida por un gen \gamma34.5 intacto podría reducir la aplicación potencial de los últimos virus como agentes oncolíticos.
2. Aporte viral de transgenes anticancerígenos
El segundo sistema en la terapia viral contra el cáncer es el aporte viral de transgenes anticancerígenos, por el que el fenotipo de las células tumorales diana se altera genéticamente para incrementar la sensibilidad y la respuesta al fármaco del tumor. Este sistema implica transferir directamente un gen de "quimiosensibilización" o "suicida" que codifica una enzima de activación de profármaco a células malignas, para conferir sensibilidad a agentes por lo demás inocuos (Moolten, F.L., Cancer Gene Therapy 1:279-287 (1994); Freeman, S.M. y otros, Semin. Oncol. 23:31-45 (1996); Deonarain, M.P. y otros, Gene Therapy 2:235-244 (1995)).
Se han estudiado varios genes de activación de profármacos para la aplicación en la terapia génica del cáncer. En un ejemplo, timidina quinasa de virus del herpes simple (HSV-TK) en combinación con el profármaco ganciclovir representa un sistema de activación de profármaco/enzima prototípico conocido en la técnica con respecto a sus aplicaciones potenciales en la terapia génica del cáncer. HSV-TK fosforila el profármaco ganciclovir y genera análogos nucleosídicos que inducen la terminación de la cadena de DNA y la muerte celular en células que se dividen activamente. Las células tumorales transducidas con HSV-TK adquieren sensibilidad al ganciclovir, un agente clínicamente probado diseñado originalmente para el tratamiento de infecciones virales. Moolten, F.L. y Wells, J.M., J. Natl. Cancer Inst.82:297-300 (1990); Ezzeddine, Z.D. y otros, New. Biol. 3:608-614 (1991).
En un segundo ejemplo, el gen bacteriano citosina desaminasa (CD) es un sistema de activación de profármaco/enzima que se ha observado que sensibiliza células tumorales al agente antifúngico 5-fluorocitosina como resultado de su transformación en 5-fluorouracilo, un agente quimioterapéutico conocido para el cáncer (Mullen, C.A. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37 (1992); Huber, B.E. y otros, Cancer Res. 53:4619-4626 (1993); Mullen, C.A. y otros, Cancer Res. 54:1503-1506 (1994)).
Estudios recientes que usan estos genes de susceptibilidad a fármacos han dado resultados prometedores. Véanse, por ejemplo, Caruso, M. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028 (1993); Oldfield, E. y otros, Hum. Gene Ther. 4:39 (1993); Culver, K. Clin. Chem 40:510 (1994); O'Malley, Jr., B.W. y otros, Cancer Res. 56:1737-1741 (1996); Rainov, N.G. y otros, Cancer Gene Therapy 3:99-106 (1996).
También se han investigado varios otros sistemas de profármaco-enzima activadora (T.A. Connors, Gene Ther. 2:702-709 (1995)). Estos incluyen la enzima bacteriana carboxipeptidasa G2, que no tiene un homólgo de mamífero, y puede usarse para activar ciertos profármacos de mostaza sintéticos mediante la segmentación de un resto de ácido glutámico para liberar un metabolito de mostaza citotóxico activo (Marais, R. y otros, Cancer Res. 56:4735-4742 (1996)), y nitrorreductasa de E. coli, que activa el profármaco CB1954 y análogos de profármaco de mostaza relacionados (Drabek, D. y otros, Gene Ther. 4:93-100 (1997); Green, N.K. y otros, Cancer Gene Ther. 4:229-238 (1997)), algunos de los cuales pueden ser superiores a CB1954 (Friedlos, F. y otros, J. Med Chem 40:1270-1275 (1997)). El principio subyacente a estos sistemas para la terapia génica de activación de profármacos es que la transducción de una población de células tumorales con el gen extraño confiere sobre ella una capacidad de activación de profármacos única, y de ahí una quimiosensibilidad que está ausente de las células huésped que no expresan el gen.
Más recientemente, se ha desarrollado una estrategia de activación de fármaco/terapia génica basada en un gen de citocromo P450 ("CYP" o "P450") en combinación con un agente quimioterapéutico para el cáncer que es activado a través de una reacción de monooxigenasa catalizada por P450. (Chen, L. y Waxman, D.J., Cancer Research 55:581-589 (1995); Wei, M.X. y otros, Hum. Gene Ther. 5:696-678 (1994); Patente de EE.UU. 5.688.773, concedida el 18 de Noviembre de 1997). A diferencia de las estrategias de activación de profármacos mencionadas previamente, la estrategia de activación de fármacos basada en P450 utiliza un gen de activación de fármacos de mamífero (en lugar de un gen derivado bacterianamente o viralmente) y también utiliza fármacos quimioterapéuticos establecidos ampliamente usados en la terapia contra el cáncer.
Se sabe que muchos agentes anticancerígenos son oxigenados por enzimas de citocromo P450 para dar metabolitos que son citotóxicos o citostáticos hacia células tumorales. Estos incluyen varios fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer comúnmente usados, tales como ciclofosfamida (CPA), su isómero ifosfamida (IFA), dicarbazina, procarbazina, tio-TEPA, etopósido, 2-aminoantraceno, 4-ipomeanol y tamoxifeno (LeBlanc, G.A. y Waxman, D.J., Drug. Metab. Rev. 20:395-439 (1989); Ng, S.F. y Waxman, D.J. Int. J. Oncology 2:731-738 (1993); Goeptar, A.R. y otros, Cancer Res. 54:2411-2418 (1994); van Maanen, J.M. y otros, Cancer Res. 47:4658-4662 (1987); Dehal, S.S. y otros, Cancer Res. 57:3402-3406 (1997); Rainov, N.G. y otros, Human Gene Therapy 9:1261-1273 (1998)).
En un ejemplo de este sistema, las células tumorales se hacen altamente sensibles a CPA o IFA mediante transducción de CYP2B1, que codifica una enzima P450 de hígado que exhibe un alto grado de activación de CPA e IFA (Clarke, L. y Waxman, D.J. Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Weber, G.F. y Waxman, D.J., Biochem. Pahrmacol. 45:1685-1694 (1993)). Esta quimiosensibilidad potenciada se ha demostrado tanto in vitro como en estudios que usan un modelo de tumor sólido subcutáneo de roedor y tumor de mama humano desarrollado en ratones desnudos in vivo, y es sorprendentemente eficaz a pesar de la presencia de una capacidad asociada con el hígado substancial para la activación de fármacos en estos animales (Chen L. y otros, Cancer Res. 55:581-589 (1995); Chen., L. y otros, Cancer Res. 56:1331-1340 (1996)). Este sistema basado en P450 también muestra una utilidad significativa para aplicaciones de terapia génica en el tratamiento de tumores cerebrales (Wei, M.X. y otros, Human Gene Ther. 5:969-978 (1994); Manome, Y. y otros, Gene Therapy 3:513-520 (1996); Chase, M. y otros, Nature Biotechnol. 16:444-448 (1998)).
Además de los transgenes que comprenden genes activadores de profármacos o "suicidas", también se han estudiado otros tipos de transgenes anticancerígenos, incluyendo genes de citoquina (para mejorar la defensa inmunitaria contra el tumor) (Blankenstein, T. y otros, J. Exp. Med. 173:1047-1052 (1991); Colombo, M.P. y otros, Cancer Metastasis Rev. 16:421-432 (1997); Colombo, M.P. y otros, Immunol. Today 15:48-51 (1994)), así como otros genes tóxicos para tumores, tales como toxina de la difteria (Coll-Fresno, P.M. y otros, Oncogene 14:243-247 (1997)), toxina de pseudomonas, genes antiangiogénesis, genes de vacunación de tumores, genes supresores de tumores, genes de radiosensibilidad, RNA antisentido y ribozimas (Zaia, J.A. y otros, Ann. N.Y. Acad Sci. 660:95-106 (1992)).
Aunque tanto los sistemas basados en virus como los basados en genes han proporcionado una evidencia de efectos terapéuticos significativos en modelos animales de tumores, cada método tiene limitaciones inherentes. Aunque el sistema basado en virus proporciona teóricamente el potencial de una replicación extensiva del virus con extensión en la masa tumoral, sus efectos están limitados por la eficacia de la infección viral; el requerimiento de un virus cooperador o una línea celular productora para algunos vectores virales; la heterogeneidad de las células tumorales (Sidranski y otros, 355:846-847 (1992); Bigner y otros, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 40: 201-229 (1981)) para el factor o los factores celulares que complementan el crecimiento de mutantes virales para otros vectores virales y las respuestas inmunitarias antivirales.
En los sistemas basados en genes probados hasta ahora, la eficacia de la transducción de células dentro de una masa tumoral está limitada por la naturaleza defectuosa del vector. De hecho, la mayoría de las células transducidas positivamente se produce dentro de unas pocas capas de células a partir del sitio de inoculación del vector (Nilaver y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21:9829-9833 (1995); Muldoon y otros, Am. J. Pathol. 147:1840-1851 (1995); Ram Z. y otros, J. Neurosurg 82, 343A (abst.) (1995)). Por otra parte, incluso para sistemas vectoriales virales en los que no es necesaria una línea de células productoras, o no destruidos por la combinación de gen suicida/fármaco, la replicación viral puede ser inhibida por el fármaco usado. Por otra parte, cuando la combinación de gen suicida/fármaco es TK/GCV, la capacidad del fármaco para destruir células tumorales está limitada por la fase del ciclo celular de las células ya que el GCV se orienta sólo a células en el proceso de replicación de DNA. Así, es improbable que el aporte de genes terapéuticos mediante estos vectores defectuosos con respecto a la replicación afecte a células tumorales distantes del sitio de inoculación, incluso en casos en los que el gen terapéutico produce un agente anticanceroso libremente difundible, tal como citoquinas o metabolitos de CPA.
Por lo tanto, continúa existiendo una necesidad de un mutante viral seguro y eficaz que proporcione un medio para alcanzar virulencia selectiva para tumores u otras poblaciones de células elegidas mientras que retenga falta de toxicidad para tejidos normales.
Sumario de la invención
De acuerdo con esto, la presente invención vence las desventajas de la técnica anterior proporcionando un mutante viral herpético que puede orientarse selectivamente a células neoplásticas para la oncolisis viral mediante la reorientación transcripcional de la acción de \gamma34.5. El mutante viral herpético de la invención también puede orientarse a otras poblaciones celulares.
En un ejemplo específico pero no limitativo, los inventores reintrodujeron el gen \gamma34.5 en una cepa mutante doble RR/\gamma34.5 (MGH1) bajo el control transcripcional del promotor B-myb celular regulado por el ciclo celular. Demostraron que este virus oncolítico (denominado "Myb34.5") seguía siendo tan oncolítico como un virus mutante RR simple que poseía un gen \gamma34.5 silvestre, y sin embargo retenía un perfil de toxicidad favorable similar al de un mutante de deleción de \gamma34.5. Estos hallazgos muestran así que la reorientación transcripcional de un gen viral responsable de evitar la interrupción de la síntesis de proteínas de células infectadas proporciona un camino para alcanzar la oncolisis selectiva. Así, la reorientación transcripcional de la expresión de \gamma34.5 proporciona un medio para alcanzar virulencia selectiva para tumores u otras poblaciones de células elegidas.
En una modalidad de la invención, el mutante viral herpético comprende una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen que codifica \gamma34.5, en donde al menos una copia del gen \gamma34.5 se reintroduce bajo el control transcripcional de un promotor específico para una célula y/o específico para un tumor.
Por supuesto, existe más de una deleción o mutación inactivante endógena específica de un gen viral herpético, además del gen \gamma34.5. Estas incluyen deleciones en el gen que codifica ribonucleótido reductasa (RR) o más particularmente la subunidad grande de RR. Alternativamente, el gen que codifica RR codifica la subunidad pequeña (UL40). También pueden someterse a deleción otros genes virales herpéticos, tales como, por ejemplo, timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) o dUTPasa. Estos genes virales se prefieren ya que los homólogos de mamífero de estos genes a menudo son regulados al alza en células con niveles elevados de E2F, tales como células neoplásticas, y así pueden complementar la enzima viral sometida a deleción, promoviendo de ese modo la replicación selectiva en esas células.
En otra modalidad, el mutante herpético de la invención también es capaz de aportar un transgén cuyo producto podría ser citotóxico para células tumorales. Por ejemplo, el transgén podría codificar un producto capaz de activar o potenciar un agente quimioterapéutico (por ejemplo, un gen suicida, al como HSV- TK, CD o citocromo P450). Alternativamente, el transgén puede ser un gen de citoquina para potenciar la inmunogenicidad tumoral (por ejemplo, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), interleuquinas (IL-2, IL-4), interferón-\gamma, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF)), un gen supresor de tumores o cualquier otro gen tumoricida conocido por los expertos en la técnica, tal como toxina de la difteria, toxina de pseudomonas, genes antiangiogénesis, genes de vacunación de tumores, genes de radiosensibilidad, RNA antisentido o ribozimas. Así, en esta modalidad, el mutante herpético comprende además un transgén que codifica un producto génico capaz de convertir un agente quimioterapéutico en su forma citotóxica, un gen de citoquina o cualquier otro transgén tumoricida. El transgén puede insertarse en la deleción de \gamma34.5 original o en cualquier lugar en el locus de UL40.
La invención proporciona una modalidad preferida del mutante viral herpético precedente en la que el transgén codifica un gen suicida que activa un agente quimioterapéutico. Un ejemplo particularmente preferido de tal gen suicida es citocromo P450 de mamífero. Más particularmente, este citocromo P450 puede ser P450 2B1, o alternativamente P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4. Se prefiere particularmente P450 2B1. Si tal gen suicida está presente en el mutante viral precedente, entonces el agente quimioterapéutico que se activaría sería un miembro de la clase de las oxazosforinas. Particularmente, el agente sería ciclofosfamida, ifosfamida, N-metilciclofosfamida, metilcloropropilnitrosourea, ciclofosfamida polímera, ifosfamida polímera, N-metilciclofosfamida polímera o metilcloropropilnitrosourea polímera.
La invención también proporciona una modalidad de los mutantes virales herpéticos precedentes, en la que el mutante herpético es un virus de herpes simple y, más particularmente, en la que el mutante es virus de herpes simple (HSV) tipo 1 o tipo 2. El HSV-1 se prefiere particularmente.
En una modalidad muy preferida de la invención, el mutante viral herpético se deriva de HSV-1 y comprende: (a) una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de un promotor específico para un tipo de célula y/o específico para un tumor, de modo que dicho promotor conduzca la expresión del gen \gamma34.5.
Además de \gamma34.5, también pueden estar presentes deleciones o mutaciones en otros genes virales herpéticos en el mutante viral herpético de la invención. Las deleciones en RR, TK, UNG o dUTPasa herpéticas son genes virales herpéticos ejemplares.
En esta modalidad, el promotor específico para una célula o el promotor específico para un tumor puede ser uno cualquiera de los elementos reguladores bien caracterizados que controlan la expresión génica específica para el tipo de tumor y/o el tipo de célula. Para una revisión, véanse Miller, N. y Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Walther, W. y Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996); Schnierle, B.S. y Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073 (1996); Lan, K.H. y otros, Cancer Res 57:4279-4284 (1997); Clary B.M. y otros, Cancer Gener Therapy 7:565-574 (1998); Dachs, G.U. y otros, Oncol. Res. 9:313-325 (1997)).
Ejemplos representativos de promotores específicos para un tumor incluyen, por ejemplo DF3 (MUC1) (que se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres de mama) (Abe, M. y Kufe, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:282-286 (1993); Manome Y. y otros, Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L. y otros, J. Clin. Invest. 96:2775-2782 (1995)); AFP (que se sobreexpresa en hepatoma) (Arbuthnot, P. y otros, Hepatolgoy 22:1788-1796 (1995); Ido, A. y otros, Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)); CEA (que se sobreexpresa en cánceres de colon y pulmón) (Thompson, J.A. y otros, J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366 (1991); Osaki, T. y otros, Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)); PSA (que se sobreexpresa en cánceres de próstata) (Lundwall, A. Biochem. Biophys, Res. Commun. 161:1151-1156 (1989)); tirosina (que se sobreexpresa en melanomas) (Vile, R.G. y Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile, R.G. y Hart, I.R., Ann. Oncol 5 (Supl.4):S59-S65 (1994); Hart, I.R. y otros, Curr. Opin. Oncol. 6:221-225 (1994)); y c-erbB2 (que se sobreexpresa en carcinomas mamarios, pancreáticos, ováricos o gástricos) (Hollywood, D. y Hurst, H. EMBO J 12:2369-2375 (1993)).
En una modalidad preferida, el promotor específico para un tumor es B-myb. En una modalidad particularmente preferida del mutante viral herpético precedente, el mutante viral es Myb34.5.
Promotores específicos para una célula ejemplares incluyen los siguientes: promotor del receptor (flk1) de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales (Kappel y otros, Blood 93:4282-4292 (199); promotor de insulina expresado en células beta del páncreas (Ray y otros, J. Surg. Resg. 84:199-203 (1999); gen receptor de hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo (Albarraccín y otros, Endocrinology 140:2415-2421 (1999); promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteoclastos y queratinocitos (Munant y otros, J. Bio. Chem. 274: 5588-5596 (1999); receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas (Amizuma y otros, J. Clin. Invest. 103: 373-381 (1999); promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas (Yang y otros, J. Neurochem. 71:1813-1826 (1998).
La presente invención también proporciona un método para destruir selectivamente células neoplásticas que sobreexpresan un promotor específico para un tumor conocido usando los mutantes virales herpéticos descritos previamente, que comprende: infectar dichas células neoplásticas con dicho mutante viral herpético, comprendiendo dicho mutante viral: (a) una deleción o mutación inactivante en un gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de dicho promotor específico para un tumor, de modo que dicho promotor conduzca la expresión de dicho gen \gamma34.5; y destruir selectivamente dichas células neoplásticas.
Ejemplos representativos de promotores específicos para un tumor incluyen: DF3 (MUCI) (que se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres de mama) (Abe, M. y Kufe, D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:282-286 (1993); Manome, Y. y otros, Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L. y otros, J. Clin. Invest. 96:2775-2782 (1995)); AFP (que se sobreexpresa en hepatoma) (Arbuthnot, P. y otros, Hepatolgoy 22:1788-1796 (1995); Ido, A. y otros, Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)); CEA (que se sobreexpresa en cánceres de colon y pulmón) (Thompson, J.A. y otros, J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366 (1991); Osaki, T. y otros, Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)); PSA (que se sobreexpresa en cánceres de próstata) (Lundwall, A. Biochem. Biophys, Res. Commun. 161:1151-1156 (1989)); tirosina (que se sobreexpresa en melanomas) (Vile, R.G. y Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile, R.G. y Hart, I.R., Ann. Oncol 5 (Supl.4):S59-S65 (1994); Hart, I.R. y otros, Curr. Opin. Oncol. 6:221-225 (1994)); y c-erbB2 (que se sobreexpresa en carcinomas mamarios, pancreáticos, ováricos o gástricos) (Hollywood, D. y Hurst, H. EMBO J 12:2369-2375 (1993)).
Preferiblemente, el promotor específico para un tumor es B-myb. En una modalidad particularmente preferida de este método, el mutante viral es Myb34.5.
Además de \gamma34.5, también pueden estar presentes deleciones o mutaciones en otros genes virales herpéticos en el mutante viral herpético usado en el método de la invención. Las deleciones en RR, TK, UNG o dUTPasa herpéticas son genes virales herpéticos ejemplares.
Además, la invención proporciona el método previo para destruir selectivamente células neoplásticas, en donde dicho mutante viral herpético comprende además un transgén, en el que el transgén es un gen suicida, un gen de citoquina o cualquier gen tumoricida. Si el transgén es un gen suicida, entonces el método comprende además poner en contacto las células neoplásticas con un agente quimioterapéutico capaz de ser activado por dicho gen suicida y destruir selectivamente las células neoplásticas. El gen suicida preferido es citocromo P450. P450 2B1 se prefiere particularmente. Alternativamente, el citocromo P450 codificado es P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4. Además, el agente quimioterapéutico es preferiblemente un miembro de la clase de las oxazosforinas, particularmente ciclofosfamida, ifosfamida, N-metilciclofosfamida, metilcloropropilnitrosourea, ciclofosfamida polímera, ifosfamida polímera, N-metilciclofosfamida polímera o metilcloropropilnitrosourea polímera.
Otra modalidad de la presente invención es un método para eliminar selectivamente una población de células diana que sobreexpresa un promotor específico para una célula conocido usando los mutantes virales herpéticos de la invención, que comprende: infectar dichas células diana con dicho mutante viral herpético, comprendiendo dicho mutante viral: (a) una deleción o mutación inactivante en un gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de dicho promotor específico para una célula, de modo que dicho promotor conduzca la expresión de dicho gen \gamma34.5; y eliminar selectivamente una población de células diana.
Promotores específicos para una célula ejemplares incluyen los siguientes: promotor (flk1) de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales (Kappel y otros, Blood 93: 4282-4292 (1999); promotor de insulina expresado en células beta del páncreas (Ray y otros, J. Surg. Res. 84:199-203 (1999); gen receptor de la hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo (Albarracín y otros, Endocrinology 140:2415-2421 (1999); promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteoclastos y queratinocitos (Munant y otros, J. Biol. Chem. 274:5588-5596 (1999); receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas (Amizuma y otros, J. Clin. Invest. 103:373-381 (1999); promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas (Yang y otros, J. Neurochem. 71:1813-1826 (1998).
Además de \gamma34.5, también pueden estar presentes deleciones o mutaciones en otros genes virales herpéticos en el mutante viral herpético usado en el método de la invención. Las deleciones en RR, TK, UNG o dUTPasa herpéticas son genes virales herpéticos ejemplares.
Aplicaciones ejemplares de esta modalidad incluyen las siguientes:
1) Opciones de tratamiento para eliminar una población de células nocivas: Por ejemplo, en condiciones en las que existe neovascularización exuberante de vasos sanguíneos, tales como enfermedad de Moya-Moya cerebral, el uso del promotor de receptor flk1 para conducir la expresión del gen gamma 34.5 permitiría la eliminación selectiva de los vasos sanguíneos que provocan esta enfermedad. Otro ejemplo es en condiciones en las que existe una remodelación ósea y una eliminación de hueso extensivas, tales como la osteoporosis, el uso de la metaloproteinasa 9 de matriz o el receptor de hormona paratiroidea para conducir la expresión de gamma 34.5 eliminaría osteoclastos óseos de una remodelación adicional del hueso.
2) Para estudiar procesos de desarrollo: Para estudiar el efecto de la eliminación de una población celular sobre procesos de desarrollo, podría usarse, por ejemplo, el promotor de dopamina-beta-hidroxilasa para eliminar las neuronas noradrenérgicas y a continuación estudiar un efecto sobre el desarrollo del animal.
Otra modalidad de la invención es una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los mutantes virales precedentes, en donde esta composición también puede contener uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, serán solamente a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-1D. La Fig. 1A representa mapas esquemáticos de las cepas de HSV F (silvestre), MGH1 (mutante RR(ICP6)/\gamma34.5 doble) y Myb34.5: Todas las cepas contienen el genoma de HSV típico con dos segmentos únicos, UL y US, cada uno flanqueado por elementos repetidos invertidos, ab y ca, respectivamente (McGeoch, D.J. y otros, J. Gen. Virol. 72:3057-3075 (1991)). Dependiendo de su localización en los segmentos únicos o repetidos, los genes de HSV están presentes en una o dos copias. La caja negra indica la inserción de lacZ en un sitio BamHI dentro de ICP6 (Goldstein, D.J. y Weller, S.K., J. Virol. 62:2970-2977 (1988)), mientras que \Delta indica las deleciones dentro de \gamma34.5 en MGH1 y Myb34.5 (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)). La barra rayada indica recombinación del constructo promotor B-myb-\gamma34.5 en el locus ICP6.
La Fig. 1B representa la caracterización del mutante de HSV Myb34.5 mediante análisis de transferencia Southern. La hibridación de DNA viral digerido con XhoI hasta una sonda de longitud completa para ICP6 revela los tamaños de los fragmentos de 9,0 kB esperados para el gen IPC6 con una inserción lacZ de longitud completa en MHG1 (trayectoria 2) y MybRevt (trayectoria 4). En Myb34.5 (trayectoria 3), existe una substitución por el casete promotor B-myb/\gamma34.5 y una deleción adicional de ICP6 para dar una banda de 6,7 kB. El DNA de la cepa F silvestre está en la trayectoria 1.
La Fig. 1C representa hibridación con una sonda lacZ y revela fragmentos con MGH1 (trayectoria 2) y MybRevt (trayectoria 4), sin hibridación de Myb34.5 (trayectoria 3).
La Fig. 1D representa un fragmento BstEII-Bbs de \gamma34.5, interno a las regiones sometidas a deleción de R3616 y MGH1, que revela un fragmento de 5,3 kB en DNA de Myb34.5 digerido con BamHI (trayectoria 3) y varias bandas en F (trayectoria 1), pero no se hibrida a MGH1 (trayectoria 2) o MybRevt (trayectoria 4).
La Figura 2 representa una imagen autorradiográfica de lisados electroforéticamente separados de células infectadas que demuestran la inhibición de la interrupción de las síntesis de proteínas huésped por cepas virales mutantes. Células de neuroblastoma humano (SK-N-SH) se cultivaron en placas a 1 x 10^{6} células/disco de 100 mm. Veinticuatro horas más tarde, las células se infectaron con una MOI de 3,0. Quince horas después de la infección viral, las células se lavaron brevemente con medio libre de metionina y a continuación se incubaron durante 90 minutos con medio que contenía 60 \muCi de S^{35}-metionina (Toda, M. y otros, Hum. Gene. Ther. 9:2177-2185 (1998). Después del marcaje, las células se recogieron, se solubilizaron en un tampón que contenía SDS y se sometieron a electroforesis sobre geles de acrilamida al 10%. Los geles se transfirieron a continuación a nitrocelulosa y se sometieron a autorradiografía. Los polipéptidos celulares infectados se diseñaron de acuerdo con Morse, L.S. y otros, J. Virol. 26:389-410 (1978).
La Figura 3 es un gráfico de barras que representa la replicación viral en células obstaculizadas y sometidas a ciclo. Fibroblastos primarios derivados de embrión humano (CRL 7706) se cultivaron en placas a 1 x 10^{6} células/disco de 60 mm. Cuarenta y ocho horas después del cultivo en placas, el medio se reemplazó por DMEM que contenía lovastatina 20 \muM durante 36 horas (barras rayadas). Placas por triplicado se contaron y se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 1,0 con diversas cepas mutantes (experimentos por triplicado). Cuarenta y ocho horas después de la infección, las células y los sobrenadantes se recogieron y el virus se liberó mediante ciclos de congelación-descongelación. Se realizaron experimentos en paralelo con células que se dejaban en medio que contenía 10% se suero bovino fetal (barras sólidas). La producción viral se determinó mediante ensayo en placas sobre células Vero y se representa como log 10 PFU/1 x 10^{5} virus de entrada (los valores reflejan medios de experimentos por triplicado). Los resultados con lovastatina eran estadísticamente inferiores que los obtenidos con suero para los virus probados (valores de la prueba t de Student: F, p=0,027; hrR3, p=0,001; MGH1, p=0,011; Myb34.5, p=0,001; MybRevt, p=0,003).
Las Figuras 4A y 4B representan inhibición del crecimiento in vivo por Myb34.5. En experimentos similares, células de gliosarcoma 9L de rata (Figura 4A) y glioma U87\DeltaEGFR humano (Figura 4B) se implantaron subcutáneamente en los costados de ratones desnudos. Empezando catorce (9L) y diez (U87) días más tarde (día 1), vehículo o cepas virales mutantes se inocularon intratumoralmente en los tumores. Las flechas indican los momentos de la inyección viral (días 1, 3, 5, 7), mientras que los valores son las medias para cinco ratones por grupo (9L) y seis por grupo (U87\DeltaEGFR).
En la Fig. 4A, las diferencias en los volúmenes de los tumores eran significativas en los puntos temporales de los días 12, 18 y 33 (p<0,05, medidas repetidas unidireccionales de la varianza). En la Fig. 4B, las diferencias en los volúmenes de los tumores eran significativas en los puntos temporales de los días 18, 27 y 34 (p<0,05, medidas repetidas unidireccionales de la varianza). Para el día 34 solo, según se muestra en la Tabla 4, p<0,005.
Descripción detallada de las modalidades preferidas
La presente invención se refiere a la destrucción selectiva de células neoplásticas mediante oncolisis mediada viralmente solo o la combinación de oncolisis mediada viralmente y terapia de genes suicidas. La invención proporciona un mutante viral herpético, un método para destruir selectivamente células neoplásticas usando este mutante viral herpético y una composición farmacéutica que contiene el mutante viral. La invención también proporciona un método para eliminar selectivamente poblaciones de células diana usando el mutante viral herpético de la invención.
Más específicamente, la invención proporciona un mutante viral herpético, en donde el mutante está transformado mediante ingeniería genética para tener (a) una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de un promotor específico para un tumor o específico para un tipo de célula, de modo que dicho promotor conduzca la expresión del gen \gamma34.5. El mutante herpético también puede contener una o más deleciones o mutaciones adicionales en otros genes virales herpéticos, tales como, por ejemplo, RR, TK, UNG y dUTPasa. El mutante viral herpético también puede aportar un transgén que codifica un producto que activa un agente quimioterapéutico, un gen de citoquina o cualquier otro gen tumoricida.
Diseño del mutante viral herpético
Los mutantes virales herpéticos de la invención pueden aportarse a partir de varios tipos diferentes de virus herpéticos. Virus herpéticos que pueden usarse para derivar los mutantes virales de la invención incluyen virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus zóster de varicela y virus de pseudorrabia.
Los virus del herpes simple son de particular interés. Por "virus del herpes simple" se entiende cualquier miembro de la subfamilia herpesviridae alpha que contiene una deleción o mutación inactivante según se describe previamente. Una modalidad preferida de esta invención emplea HSV-1 o HSV-2 para crear el mutante viral herpético, siendo el más preferido el HSV-1.
El HSV-1 es un virus neurotrópico humano que es capaz de infectar virtualmente todas las células de vertebrados. Las infecciones naturales siguen un ciclo replicativo lítico o establecen latencia, habitualmente en ganglios periféricos, donde el DNA se mantiene indefinidamente en un estado episomático. El HSV-1 contiene un genoma de DNA lineal de doble hebra, de 153 kilobases de longitud, que ha sido sometido a secuenciación completamente por McGeoch (McGeoch y otros, J. Gen. Virol. 69:1531 (1988); McGeoch y otros, Nucleic Acids Res 14:1727 (1986); McGeoch y otros, J. Mol. Biol. 181:1 (1985); Perry y McGeoch, J. Gen. Virol. 69:2831 (1988)). Se producen replicación del DNA y ensamblaje del virión en el núcleo de células infectadas. Avanzada la infección, el DNA viral concatemérico se segmenta en moléculas de longitud de genoma que se empaquetan en viriones. En el SNC, el virus del herpes simple se extiende transneuralmente seguido por transporte intraaxonal al núcleo, retrógrado o anterógrado, donde se produce la replicación.
El gen gamma (\gamma) 34.5 herpético
Resultados publicados han demostrado que al menos una función del gen \gamma34.5 herpético es imposibilitar la respuesta de las células huésped a la infección viral, a saber la activación de la interrupción de la síntesis de proteínas huésped en una respuesta similar a la apoptótica (Chou y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. y Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Chou, J. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10513-10520 (1995)). Una función similar está extendida entre los virus patógenos (Cosentino, G.P. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9445-9449 (1995); Gale, M., Jr. y otros, Mol. Cell Biol. 18:5208-5218 (1998); Katze, M.G. y otros, Trends Microbiol. 3:75-78 (1995); Sharp, T.V. y otros, Nuc. Acids Res. 21:4483-4490 (1993)).
Aunque \gamma34.5 no es esencial para el crecimiento viral en cultivo en células Vero, permite que el virus se extienda en el sistema nervioso central (SNC) de ratones y se mapea hasta una región del genoma de HSV previamente implicada en la replicación en el SNC (Markovitz, N.S. y otros, J. Virol. 71:5560-5569 (1997); Centifanto-Fitzgerald, Y.M. y otros, J. Esp. Med. 155:475-489 (1982)). Esto puede deberse al hecho de que la proteína que codifica \gamma34.5 inhibe la quinasa dependiente de RNA de doble hebra (PKR). Durante la exposición a moléculas de RNA de doble hebra, según se observa comúnmente con la infección viral, la PKR fosforila la subunidad alfa del factor de iniciación de la elongación eIF-2, dando como resultado la inhibición de la síntesis de proteínas (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. y Roizman, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Chou, J. y otros, J. Virol 68:8304-8311 (1994)). La infección de células de origen neuronal con mutantes incapaces de expresar \gamma34.5 da como resultado la interrupción de la síntesis de proteínas celulares, con la limitación resultante de la producción viral.
En resumen, en presencia de \gamma34.5, HSV evitará la apóptosis, permitiendo así la producción de virus de progenie. En su ausencia, la célula muere y el HSV infectante no puede generar virus de progenie. Así, la infección/propagación de HSV a lo largo de un organismo se elimina.
El sistema de promotor/\gamma34.5 específico para un tipo de tumor o célula de la invención permite así la producción de virus en células que pueden usar ese promotor, pero las células que no pueden activar el promotor no propagarán la infección.
El mutante viral herpético de la invención comprende una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen \gamma34.5, en donde al menos una copia del gen \gamma34.5 se reintroduce bajo el control de un promotor específico para una célula o específico para un tumor.
Según se usa aquí, el término "deleción" pretende significar la eliminación de ácidos nucleicos de un gen, tal como el gen \gamma34.5.
Según se usa aquí, el término "mutación inactivante" pretende significar ampliamente una mutación o alteración hasta un gen en el que la expresión de ese gen se disminuye significativamente, o en donde el producto génico se hace no funcional, o su capacidad para funcionar se disminuye significativamente.
El término "gen" abarca tanto las regiones que codifican el producto génico como regiones reguladoras para ese gen, tales como un promotor o potenciador, a no ser que se indique otra cosa.
Modos de alcanzar tales alteraciones incluyen: (a) cualquier método para interrumpir la expresión del producto del gen o (b) cualquier método para hacer al gen expresado no funcional. Se conocen numerosos métodos para perturbar la expresión de un gen, incluyendo las alteraciones de la región de codificación del gen, o su secuencia promotora, mediante inserciones, deleciones y/o cambios de bases. (Véase, Roizman, B. y Jenkins, F.J., Science 229:1208-1214 (1985)).
El promotor específico para una célula y/o específico para un tumor
En el mutante viral herpético de la invención, se usa un promotor específico para una célula y/o específico para un tumor para conducir la expresión de \gamma34.5. El promotor puede ser uno cualquiera de los elementos reguladores bien caracterizados que controlan la expresión génica específica para un tipo de tumor y/o un tipo de célula. Para una revisión, véanse Miller, N. y Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Walther, W. y Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996); Schnierle, B.S. y Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073 (1996); Lan, K.H. y otros, Cancer Res. 57:4279-4284 (1997); Clary, B.M. y otros, Cancer Gene Therapy 7:565-574 (1998); Dachs, G.U. y otros, Oncol. Res. 93:313-325 (1997)).
Por "promotor" se pretende hacer referencia a la región de DNA, habitualmente aguas arriba con respecto a la secuencia de codificación de un gen u operón, que se une a RNA polimerasa y dirige a la enzima hacia el sitio de inicio de la transcripción correcto.
Por "promotor específico para una célula" se entiende un promotor que dirige la expresión en tipos de células particulares. Un experto en la técnica sabrá que un promotor "específico para un tumor" también puede considerarse un promotor "específico para una célula" (es decir, es específico para una célula tumoral). Sin embargo, por claridad, se entiende que un "promotor específico para una célula", según se usa aquí, excluye promotores específicos para un tumor, a no ser que se indique otra cosa. Promotores específicos para una célula ejemplares incluyen los siguientes: promotor del receptor (flk1) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales (Kappel y otros, Blood 93:4282-4292 (1999); promotor de insulina expresado en células beta del páncreas (Ray y otros, J. Surg. Res. 84:199-203 (1999); gen receptor de la hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo (Albarracín y otros, Endocrinology 140:2415-2421 (1999); promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteclastos y queratinocitos (Munant y otros, J. Biol. Chem. 274:5588-5596 (1999); receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas (Amizuma y otros, J. Clin. Invest. 103: 373-381 (1999); y promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas (Yang y otros, J. Neurochem. 71:1813-1826
(1998).
Los promotores regulados por el ciclo celular también son un tipo de promotor específico para una célula. Otros promotores específicos para una célula serán conocidos por los expertos en la técnica.
Aplicaciones de esta modalidad vectorial incluyen la eliminación de poblaciones de células nocivas seleccionadas en un órgano, así como modelos animales para estudiar la eliminación de poblaciones seleccionadas en un órgano durante el desarrollo. Aplicaciones ejemplares de esta modalidad incluyen las siguientes:
1) Opciones de tratamiento para eliminar una población de células nocivas: En un ejemplo, en condiciones en las que existe una neovascularización exuberante de vasos sanguíneos, tales como enfermedad de Moya-Moya cerebral, el uso de promotor de receptor flk1 para conducir la expresión del gen gamma 34.5 permitiría la eliminación selectiva de los vasos sanguíneos que provocan esta enfermedad.
En otro ejemplo, en estados en los que hay una remodelación ósea y eliminación de hueso extensivas, tales como osteoporosis, el uso de la metaloproteinasa 9 de matriz o el receptor de hormona paratiroidea para conducir la expresión de gamma 34.5 eliminaría osteoclastos óseos de la remodelación adicional del hueso.
2) Para estudiar el efecto de la eliminación de poblaciones seleccionadas en un órgano durante el desarrollo. Por ejemplo, para estudiar el efecto de la eliminación de una población celular sobre procesos de desarrollo, se podría usar, por ejemplo, el promotor de dopamina-beta-hidroxilasa para eliminar las neuronas noradrenérgicas y a continuación estudiar el efecto sobre el desarrollo del animal.
Por "promotor específico para un tumor" se entiende un promotor que es inducido selectivamente o expresado a un nivel superior en la célula tumoral diana que en una célula normal. La especificidad de orientación al tumor para el mutante viral herpético de la invención se alcanza mediante el uso de promotores específicos para un tumor para activar selectivamente la expresión del gen transducido en la célula tumoral en el sitio tumoral primario o sus metástasis (Miller, N. y Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Walther, W. y Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996); Schnierle, B.S. y Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073 (1996); Lan, K.H. y otros, Cancer Res 57:4279-4284 (1997); Dachs, G.U. y otros, Oncol. Res. 9:313-325 (1997)).
Ejemplos de promotores específicos para un tumor incluyen los que se han derivado de genes que codifican tirosinasa (que permiten la orientación a un melanoma) (Vile, R.G. y Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile, R.G. y Hart, I.R., Ann. Oncol 5 (Supl.4):S59-S65 (1994); Hart, I.R. y otros, Curr. Opin. Oncol. 6:221-225 (1994)); oncogén c-erbB-2 (que se orienta a cánceres mamarios, pancreáticos, gástricos y ováricos) (Hollywood, D. y Hurst, H. EMBO J 12:2369-2375 (1993)); antígeno carcinoembrionario (CEA) (que se orienta a enfermedades malignas pulmonares y gastrointestinales, incluyendo cáncer colónico, pancreático y gástrico) (Thompson, J.A. y otros, J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366 (1991); Osaki, T. y otros, Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)); DF3/MUCI (que se orienta a cáncer de mama) (Abe, M. y Kufe, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:282-286 (1993); Manome Y. y otros, Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L. y otros, J. Clin. Invest. 96:2775-2782 (1995)); antígeno específico de la próstata (PSA) (que se orienta a cáncer de próstata) (Lundwall, A. Biochem. Biophys, Res. Commun. 161:1151-1156 (1989)); alfa-fetoproteína (AFP) (que se orienta a carcinoma hepatocelular) (Arbuthnot, P. y otros, Hepatolgoy 22:1788-1796 (1995); Ido, A. y otros, Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)). También puede utilizarse el uso de sistemas de regulación génica sistémicos, que permite el control transcripcional y otras formas de expresión regulada (Miller, N. y Whelan, J., Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Vile, R.G., Semin. Cancer Biol. 5:429-436 (1994); Hwang, J.J. y otros, J. Virol. 70:8138-8141 (1996); Massie, B. y otros, J. Virol. 72:2289-2296 (1998)).
También se sabe que las células tumorales sobreexpresan oncogenes particulares, de modo que las células con expresión génica regulada al alza pueden elegirse usando elementos promotores de tales genes. B-myb, C-myb, c-myc, c-kit y el oncogén c-erbB2 son algunos ejemplos representativos de estos tipos. El promotor B-myb (véase, Lyon, J. y otros, Crit. Rev. Oncogenesis 5:373-388 (1994)) contiene un sitio de unión a E2F de consenso, está estrictamente regulado en células que sufren el ciclo celular y de hecho se expresa en G_{0} (Lam, E.W. y Watson, R.J., EMBO J. 12:2705-2713 (1993); Lam, E.W. y otros, Gene 160:277-281 (1995); Bennet, J.D. y otros, Oncogene 13:1073-1082 (1996)). De acuerdo con esto, el promotor B-myb es un promotor específico para un tumor particularmente pre-
ferido.
Cualquier tipo de cáncer que tuviera un promotor bien caracterizado encontraría uso en la invención. Ejemplos de tales promotores pueden encontrarse en la Tabla 1 de Clary, B.M. y otros, Cancer Gene Therapy 7:565-574 (1998); la Tabla 1 de Spear, M.A., Anticancer Research 18:3223-3232 (1998); la Tabla 2 de Walther, W. y Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996) y Dachs, G.U. y otros, Oncol. Res. 9:313-325 (1997)).
La mayoría, si la totalidad, de las secuencias génicas de los promotores específicos para un tumor descritos previamente está disponible de the GenBank Sequenece Database.
Otras mutaciones/deleciones en el constructo, además de \gamma34.5
Los mutantes virales de la invención también pueden poseer mutaciones adicionales en cualesquiera gen o genes virales, pero lo más preferiblemente en un gen requerido para la replicación, cuyo homólogo de mamífero está regulado al alza por niveles elevados de E2F.
Por ejemplo, la ribonucleótido reductasa de mamífero (mRR) está regulada al alza durante la fase G_{1} del ciclo celular y su transcripción está regulada por E2F "libre" (DeGregori y otros, Mol. Cell. Biol. 15:4215-4224 (1995); Lukas y otros, Mol. Cell. Biol. 16:1047-1057 (1996); Dynlacth y otros, Genes Dev. 8:1772-1786 (1994)). Se ha hipotetizado que los mutantes virales RR^{-} se replican selectivamente en células neoplásticas debido a la presencia de la ribonucleótido reductasa de mamífero (mRR) complementaria en estas células (Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196-205 (1988).
La elevación en los niveles de E2F libre provoca una expresión incrementada de varios genes de mamífero cuyos homólogos virales se requieren para la replicación del virus. Además de la ribonucleótido reductasa (RR), estos genes incluyen enzimas timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) y uracilo-trifosfatasa (dUTPasa). Los virus que contienen una mutación en uno o más de estos genes se replicarían selectivamente en células con niveles elevados de E2F libre. Así, la invención abarca mutantes virales herpéticos que tienen una mutación en uno o más de estos genes, además de la mutación en \gamma34.5. En una modalidad preferida de la invención, la mutación es en un gen de ribonucleótido reductasa.
E2F (incluyendo E2F1, E2F2, E2F3, 2EF4, E2F5), parece ser el principal mediador de la cascada transcripcional regulada por el ciclo celular que implica p16, ciclina D/cdk4 y pRB (DeGregori y otros, Mol. Cell. Biol. 15:4215-4224 (1995); Lukas y otros, Mol. Cell. Biol. 16:1047-1057 (1996); Dynlacth y otros, Genes Dev. 8:1772-1786 (1994)). Así, los defectos en un gen implicado en esta cascada pueden conducir a niveles incrementados de E2F y de ese modo niveles incrementados de RR, TK, UNG y dUTPasa de mamífero. Por ejemplo, células con defectos en la expresión de p16, p21 y/o p27 pueden tener niveles incrementados de ciclina D, quinasa 4 dependiente de ciclina D (Cdk4) y/o quinasa 6 dependiente de ciclina D (Cdk6), lo que a su vez puede conducir a una fosforilación incrementada de pRB liberando de ese modo E2F. Además, las células con defectos en la expresión de pRB, p107 y/o p130, DP1, DP2 y/o DP3 también pueden conducir a una liberación incrementada de E2F.
La mayoría de los tumores posee una inactivación de un gen que codifica un componente de esta cascada (Ueki, K. y otros, Cancer Res. 56:150-153 (1996)), liberando así E2F y permitiendo la transcripción de RR, TK, UNG y dUTPasa de mamífero. Por otra parte, las alteraciones en otros genes u oncogenes supresores de tumores también puede conducir a niveles incrementados de E2F libre, y de ese modo niveles incrementados de RR, TK, UNG y dUTPasa de mamífero. Por lo tanto, los mutantes virales RR^{-}, TK^{-}, UNG^{-} y dUTPasa^{-} pueden orientarse eficazmente a un gran porcentaje de células tumorales, particularmente si poseen un defecto en la ruta de p16/ciclina D/pRB que conduce a un incremento en E2F "libre".
Por otra parte, células tumorales de muchos orígenes diferentes (por ejemplo, pulmón, mama, próstata, cerebro, hígado, páncreas, piel, etc.) poseen alteraciones en las rutas descritas previamente que conducen a niveles elevados de RR, TK, UNG y dUTPasa y así son dianas para el mutante viral de la invención. Por ejemplo, las líneas de células tumorales de glioma (células 9L de rata, U87 humanas y T98 humanas) poseen mutaciones inactivantes de p16 (van Meir y otros, Cancer Res. 54:649-652 (1994)), así como niveles elevados de mRR. Estas células eran así capaces de complementar la replicación del mutante viral derivado de HSV-1, rRp450, hasta niveles cercanos a los de la cepa KOS silvestre, mientras que las neuronas sin nivel detectable de mRR (y con una ruta de p16 normal) no lo hacían.
Por "gen de ribonucleótido reductasa" se entiende un ácido nucleico que codifica cualquier subunidad o parte de la enzima ribonucleótido reductasa, de modo que cuando este ácido nucleico se expresa en una célula, se produce esta parte o subunidad, ya sea funcional o no funcional. La ribonucleótido reductasa (RR) es una enzima clave en la síntesis de novo de precursores de DNA, catalizando la reducción de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos. HSV-1 codifica su propia RR (genes UL39 y UL40), que está compuesta por dos subunidades no idénticas (Duita, J. Gen. Virol. 64:513 (1983)). La subunidad grande (140k de peso molecular), denominada ICP6, está estrechamente asociada con la subunidad pequeña (38k de peso molecular). Se ha encontrado que la RR del virus de herpes simple se requiere para el crecimiento viral eficaz en células que no se dividen pero no en muchas células que se dividen (Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196 (1988); Goldstein y Weller, Virol. 166:41 (1988); Jacobson y otros, Virol. 173:276 (1989)). Las mutaciones en la subunidad pequeña de RR también conducen a una pérdida de actividad de RR y neuropatogenicidad (Cameron y otros, J. Gen. Virol. 69:2607 (1988)); sin embargo, se prefieren particularmente las mutaciones en la subunidad grande.
La región promotora de ICP6 de ribonucleótido reductasa se ha mapeado hasta las secuencias aguas arriba 5' del gen estructural de ICP6 (Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196 (1988); Sze y Herman, Virus Res. 26:141 (1992)). El sitio de iniciación de la transcripción para la subunidad pequeña de RR, a saber UL40, está dentro de la región de codificación de ICP6 (McLauchlan y Clements, J. Gen. Virol. 64:997 (1983); McGeoch y otros, J. Gen. Virol. 69:1531 (1988)).
Mutantes virales derivados de HSV-2 basados en los mutantes virales ilustrados aquí usando el genoma de HSV-1 están abarcados por la presente invención. HSV-2 contiene ambas subunidades de RR; por otra parte, ICP10 de HSV-2 es análoga a ICP6 de HSV-1. Nikas y otros, Proteins I:376 (1986); McLaughlan y Clements, EMBO J. 2:1953 (1983); Swain y Halloway, J. Virol. 57:802 (1986).
Una diferencia entre mutantes deficientes en ribonucleótido reductasa (RR^{-}) y otros de virus de herpes simples es la hipersensibilidad a aciclovir y ganciclovir. Debido a que los mutantes de HSV-1 TK^{-} conocidos en la técnica son resistentes a estos agentes antivirales, tales mutantes podían ser difíciles de eliminar en el caso de infección sistémica o encefalitis. En contraste, en el caso de una encefalitis viral, los mutantes virales TK^{+}, tales como mutantes de HSV RR^{-}, son sensibles a la terapia antiviral.
Además, los mutantes de HSV RR^{-} están comprometidos en su capacidad para producir infecciones y sintetizar DNA viral a 39,5ºC in vitro (Goldstein y Weller, J. Virol. 166:41 (1988)). Por lo tanto, estos mutantes están atenuados con respecto a la neurovirulencia y son menos propensos a propagarse en el caso de una fiebre en el huésped infectado. Tales características son importantes para un vector terapéutico que debe ser de neurovirulencia atenuada y susceptible de terapia antiviral en el caso de encefalitis viral.
La sensibilidad a la temperatura de mutantes virales RR^{-} muestra otra ventaja del mutante viral de la invención. En pacientes tratados con un mutante viral, es posible que un número de factores del huésped (fiebre, respuestas inmunitarias antivirales) inhibiera la propagación del mutante viral. En estos casos, se esperaría que el tratamiento con un agente quimioterapéutico y la activación por el transgén (para las células infectadas por el mutante viral) proporcionara un tratamiento anticancerígeno complementario.
Según se usa aquí, "mutación" se refiere a cualquier alteración en un gen en la que la expresión de ese gen se disminuye significativamente o en la que el producto génico se hace no funcional, o su capacidad para funcionar se disminuye significativamente. El término "gen" abarca tanto las regiones que codifican el producto génico como regiones reguladoras para ese gen, tales como un promotor o potenciador. Tales alteraciones hacen al producto del gen no funcional o reducen la expresión del gen de modo que el mutante viral tiene las propiedades de la presente invención. Por otra parte, la invención abarca mutantes con una o más mutaciones en uno o más genes de interés. Así, por "un" se entiende uno o más.
Modos de alcanzar tales alteraciones incluyen: (a) cualquier método para perturbar la expresión del producto del gen; o (b) cualquier método para hacer la proteína expresada no funcional. Se conocen numerosos métodos que se sabe que perturban la expresión de un gen, incluyendo la alteración de la región de codificación del gen, o su secuencia promotora, mediante inserciones, deleciones y/o cambios de bases. (Véase, Roizman, B. y Jenkins, F.J., Science 229:1208-1214 (1985)). Una deleción es una mutación preferida.
Métodos para la construcción de virus transformados mediante ingeniería y para la manipulación genética de secuencias de DNA son conocidos en la técnica. Generalmente, estos incluyen (Ausubel y otros, Capítulo 16 en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc.); Paoletti y otros, Patente de EE.UU. 4.603.112 (Julio de 1986). También se revisan consideraciones virológicas en Coen, en Virology, 1990 (2ª ed.) Raven Press, páginas 123-150.
La construcción de mutantes de HSV-1 se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 5.585.096 de Martuza y otros (Diciembre de 1996); la Patente de EE.UU. 5.288.641 de Roizman y otros, (Febrero de 1994); Roizman, B. y Jenkins, F.J., Science 229:1208-1214 (1985); Johnson y otros, J. Virol. 66:2952 (1992); Gage, P.J. y oros, J. Virol. 66:5509-5515 (1992); Goldstein y Weller, J. Virol. 62:196-205 (1988); Coen, D., Capítulo 7, en Virology, 1990 (2ª ed.) Raven Press, Breakefield y DeLuca, The New Biologist 3:203 (1991); Leib y Olivo, BioEssays 15:547 (1993); Glorioso y otros, Seminars in Virology 3:265 (1992); Chou, J. y Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Shih y otros, en Vaccines 85, 1985, Cold Spring Harbor Press, páginas 177-180; Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)); Glorioso, J.C. y otros, Annu. Rev. Microbiol. 49:715-710 (1995); Mocarski y otros, Cell 22:243 (1980)).
Las alteraciones genéticas del genoma viral pueden determinarse mediante métodos estándar tales como hibridación por transferencia Southern de DNA viral digerido por endonucleasas de restricción, secuenciación de regiones mutadas de DNA viral, deleción de sitios de endonucleasas de restricción nuevos (o perdidos), ensayo enzimático para la actividad de ribonucleótido reductasa (Huszar, D. y Bacchetti, S., J. Virol. 37:580-598 (1981)). Para células que carecen del homólogo de mamífero del gen viral mutado, por ejemplo, RR, la alteración genética del genoma viral puede determinarse mediante (1) análisis por transferencia Western o ELISA de proteínas celulares infectadas con anticuerpos del homólogo viral que se ha mutado, por ejemplo, RR, o (2) análisis por transferencia Northern de células infectadas para la transcripción del homólogo viral que se ha mutado, por ejemplo, RR (Jacobson, J.G. y otros, Virology 173:276-283 (1989)). Un mutante viral que se ha mutado en uno o más genes puede aislarse después de la mutagénesis o construirse a través de recombinación entre el genoma viral y secuencias transformadas por ingeniería genética.
Por "regulación al alza" se entiende que la expresión del gen o los genes que codifican el producto génico que se dice que ha de regularse al alza es mayor que el nivel basal de la expresión de este producto según se encuentra en células no neoplásticas.
Por "el nivel de E2F libre es elevado" se entiende que la cantidad de E2F no unido disponible en una célula es mayor que la cantidad típicamente encontrada en células no neoplásticas.
Por "destruir selectivamente células neoplásticas" se entiende que el mutante viral herpético de la invención se orienta principalmente a células neoplásticas, en lugar de a células no neoplásticas.
Por "células neoplásticas" se entienden células cuyos mecanismos de control del crecimiento normales están depteriorados (típicamente por mutaciones genéticas acumuladas), proporcionando de ese modo un potencial para la proliferación descontrolada. Así, "células neoplásticas" puede incluir tanto células que se dividen como que no se dividen. Para los propósitos de la invención, células neoplásticas incluyen células de tumores, neoplasmas, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas y similares. De particular interés son los tumores del sistema nervioso central, especialmente tumores cerebrales. Estos incluyen glioblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, meningiomas, neurofibromas, ependimomas, schwannomas, neurofibrosarcomas, etc. La invención puede utilizarse para orientarse para la oncolisis a células neoplásticas tanto benignas como malignas en la periferia del cerebro. Según se usa aquí, el término periferia pretende significar todas las otras partes del cuerpo fuera del cerebro. Así, se entiende que un tumor periférico significa un tumor de una parte del cuerpo fuera del cerebro.
El transgén soportado por el mutante viral herpético
Además de tener una expresión conducida por promotor específico para un tumor o específico para una célula del gen \gamma34.5 herpético (y posiblemente una o más mutaciones adicionales, tales como, por ejemplo, RR, TK, UNG o dUTPasa, según se describe previamente), los mutantes virales de la presente invención también pueden soportar un transgén heterólogo.
El transgén puede ser un gen suicida, esto es, un gen que codifica un producto génico capaz de activar un agente quimioterapéutico hasta su forma citotóxica, tal como TK de HSV, CD o citocromo P450. En una modalidad preferida, el gen suicida es un gen de citocromo P450.
Por "producto génico capaz de convertir un agente quimioterapéutico en su forma citotóxica" se entiende un producto génico que actúa sobre el agente quimioterapéutico para hacerlo más citotóxico de lo que era antes de que el producto génico actuara sobre él. Pueden requerirse otras proteínas o factores, además de este producto génico, para convertir el agente quimioterapéutico en su forma más citotóxica.
Por "transgén que codifica un producto génico capaz de convertir un agente quimioterapéutico en su forma citotóxica" se entiende un ácido nucleico que durante la expresión proporciona este producto génico.
"Citotóxico" se usa aquí para significar que provoca o que conduce a la muerte celular.
"Producto génico" se refiere a un agente que puede usarse en el tratamiento de neoplasmas y que es capaz de activarse desde un profármaco hasta una forma citotóxica. Preferiblemente, los agentes quimioterapéuticos para usar en la invención no inhiben significativamente la replicación del mutante viral, lo que significa que la replicación viral puede producirse a un nivel suficiente para conducir a la muerte de la célula infectada y para propagar la extensión del virus a otras células.
El término "gen que codifica citocromo P450" significa un gen de citocromo P450 de mamífero, tal como P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4. Cada uno de estos genes se ha relacionado con la activación de los fármacos anticancerígenos ciclofosfamida e ifosfamida (Clarke y otros, Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Chang y otros, Cancer Res. 53:5269-5367 (1993); Weber y Waxman, Biochemical Pharmacology 45:1685-1694 (1993)) y también se han publicado las secuencias de cDNA de estos genes. (Nelson y otros, DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993) y las referencias citadas allí; Yamano y otros, Biochem. 29:1322-1329 (1990); Yamato y otros, Biochem. 28:7340-7348 (1989)). Por otra parte, el citocromo P450 también puede activar N-metilciclofosfamida (N-metil PA), metilcloropropilnitrosourea (MCPNU) y formas polímeras de CPA, ifosfamida, N-metilCPA y MCPNU. Formas polímeras de los agentes quimioterapéuticos se analizan en Brem, Biomaterials, 11:699-701 (1990); Buahin y Brem, J. Neurooncol. 26:103-110 (1995); Tamargo y otros, Cancer Res. 53:329-333 (1993) y Langer, Ann. Biomed. Eng. 23:101-111 (1995).
Los expertos normales en la técnica deben ser capaces de utilizar el método de la presente invención con otros muchos fármacos anticancerígenos que son activados por miembros de la familia de enzimas de citocromo P450, (LeBlanc y Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989)), así como con genes de citocromo P450 que metabolizan fármacos procedentes de otras especies (por ejemplo, ratón, conejo, hámster, perro, etc.) que son homólogos a los citocromos P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4 y cuyas secuencias de cDNA son conocidas (Nelson y otros, DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993)). En una modalidad particularmente preferida, se usa el gen que codifica citocromo P450 2BI.
Si el mutante viral herpético contiene un gen suicida, el agente quimioterapéutico que es activado por el gen suicida no debe inhibir significativamente la replicación del mutante viral a fin de permitir que el mutante viral destruya células tumorales mediante oncolisis viral, así como mediante el aporte del gen suicida. El uso de una combinación de agente quimioterapéutico/transgén en la que el agente quimioterapéutico, o sus metabolitos activos, actúa en cambio reticulando DNA o inhibiendo la reparación de DNA no inhibiría significativamente la replicación del mutante viral. Así, tales combinaciones de agente quimioterapéutico/transgén están abarcadas por el mutante viral y los métodos de la presente invención.
Así, una combinación de agente quimioterapéutico/transgén preferida es citocromo P450 combinado con CPA, ifosfamida, N-metilciclofosfamida, MCPNU o formas polímeras de CPA, ifosfamida, N-metilciclofosfamida y MCPNU. Una combinación de agente quimioterapéutico/transgén más preferida es CPA/citocromo P450 2B1.
Otras combinaciones de agente quimioterapéutico/transgén para usar en la presente invención incluyen: CB1954/
nitrorreductasa de E. coli (Friedlos y otros, Gene Ther. 5:105-112 (1998); Green y otros, Cancer. Gene Ther. 4:229-238 (1997)); inhibidores de topoisomerasa I o II/enzima con actividad similar a esterasa, tal como, por ejemplo, CPT-11/carboxilesterasa (Jansen y otros, Int. J. Cancer 70:335-340 (1997); Danks y otros, Cancer Res. 58:20-22 (1998)); 4-ipomeanol/citocromo P450 4B1 (Verschoyle y otros, Toxicol. Appl. Pharmacol. 123:193-198 (1993)) y 2-aminoantraceno/citocromo P450 4B2 (Smith y otros, Biochem. Pharmacol. 50:1567-1575 (1995)).
El uso de un agente alquilante tal como CPA, aunque proporciona un efecto anticancerígeno, no inhibe significativamente la síntesis de proteínas virales o la replicación viral. La explicación de este hallazgo puede residir en el modo de acción de estos fármacos. El metabolito activo de CPA, mostaza fosforamídica (PM) produce reticulaciones intercatenarias e intracatenarias en DNA celular. La citotoxicidad máxima para DNA celular se alcanza habitualmente durante la mitosis cuando se producen múltiples roturas de cadenas de DNA en sitios de reticulación (Colvin y otros, Cancer Medicine, eds. Holland y otros, 1993, Lea y Fabiger, Philadelphia, páginas 733-734). En contraste, DNA viral reticulado no mitótico puede librarse del daño intensivo y así puede repararse más fácilmente que el DNA celular.
El ganciclovir es un ejemplo de un agente quimioterapéutico que, cuando se activa, inhibe la replicación viral. Aunque se ha demostrado que la combinación de hrR3 y ganciclovir proporciona un efecto anticancerígeno significativo debido a la conversión de ganciclovir por el gen de timidina quinasa viral (Boviatsis y otros, Cancer Res. 54:5745-5751 (1994)), las moléculas de ganciclovir convertidas también inhiben la replicación viral. Por esta razón, el uso de TK/GCV puede no ser una selección preferida en este paradigma. Las enzimas activadoras de profármacos, tales como DK de HSV, generan metabolitos anticancerígenos que actúan como nucleótidos "falsos", produciendo una terminación prematura de cadenas de DNA que se replican. Por lo tanto, se esperaría que estas enzimas activadoras de profármacos afectaran a la síntesis de DNA tanto viral como genómico y no fueran una buena elección para usar en los mutantes virales herpéticos de la invención que contienen un gen suicida.
Otra ventaja de usar agentes quimioterapéuticos cuyo mecanismo de acción es la reticulación de DNA o la inhibición de enzimas de reparación de DNA es que estos agentes son eficaces incluso contra células en G_{0}. Así, para que estos agentes sean eficaces para destruir células neoplásticas, las células elegidas no deben inhibirse activamente en el momento en el que se administra el fármaco. Este es un beneficio significativo para tumores en los que un gran porcentaje de células están en G_{0}.
Un ejemplo de este tipo de tumor es el glioblastoma. Para los glioblastomas, la fracción en crecimiento, o la proporción relativa de células que proliferan en el tumor en cualquier momento, es solo 30%, estando el 70% restante de las células en G_{0}. Estos tumores son especialmente resistentes a agentes quimioterapéuticos que se orientan solo a células que se dividen activamente, debido a que, aunque el 30% de células de glioblastoma que se dividen activamente contribuye a la progresión letal de este tumor, 70% de las células están en G_{0} y pueden morir o pueden reentrar en el ciclo celular activo, Yoshii y otros, J. Neurosurg. 65:659-663 (1986)). Así, el 70% que son quiescentes son responsables de la resistencia de estos tumores a agentes quimioterapéuticos que se orientan a células que proliferan activamente.
Este ejemplo demuestra otra ventaja de la invención. El mutante viral y el método de la presente invención proporcionan una ventaja sobre terapias basadas solamente en la oncolisis mediada viralmente condicional con respecto a la replicación o incompetente con respecto a la replicación, ya que esas terapias se orientarán solo a las células que pueden complementar la mutación viral. Mientras tanto, aunque el mutante viral de la invención se orienta a células con niveles elevados de E2F (principalmente células neoplásticas) para la replicación en y la lisis, la expresión del transgén y la activación, el agente quimioterapéutico proporciona metabolitos activos que pueden difundirse a continuación en células tumorales circundantes. Estos metabolitos pueden de ese modo destruir incluso esas células tumorales circundantes en G_{0} (70% de las células en un glioblastoma).
De acuerdo con esto, la invención encuentra un uso particular en el tratamiento de glioblastomas. El glioblastoma representa aproximadamente 30% o 50% de todos los tumores cerebrales primarios y, a pesar de la cirugía, la quimioterapia y la terapia por radiación, es casi universalmente letal.
Debido a la activación local del agente terapéutico por el producto génico del gen soportado por el mutante viral herpético, el método de la invención debe permitir más toxicidad tumoral a la misma concentración de fármaco, permitiendo así dosis de fármaco superiores sin incrementar la toxicidad para células normales. Además, el tratamiento quimioterapéutico de poblaciones tumorales sistémicas también puede mejorarse usando el método de la presente invención debido a que son posibles dosis inferiores del fármaco en virtud de una eficacia incrementada.
Por otra parte, la activación local del agente quimioterapéutico proporciona otro beneficio. Algunos agentes quimioterapéuticos requieren la activación o la conversión hasta su estado activo en células u órganos de la periferia, sin embargo, a menudo los metabolitos activos (citotóxicos) no pueden cruzar la barrera sangre-cerebro y así no son eficaces contra tumores cerebrales. Así, el método de la invención debe permitir el tratamiento de tumores cerebrales mediante estos agentes quimioterapéuticos. Uno de tales agentes quimioterapéuticos es la CPA. La CPA es completamente ineficaz contra neoplasmas del sistema nervioso central ya que su conversión en metabolitos citotóxicos alquilantes de DNA está restringida principalmente al hígado y estos metabolitos no cruzan fácilmente la barrera sangre-cerebro. Sin embargo, el uso del mutante viral de la invención, alterado para soportar un gen de citocromo P450 y aplicado a un tumor cerebral, proporcionaría activación local de CPA. Así, en una modalidad preferida, se utiliza un gen de citocromo P450 para sensibilizar células tumorales nerviosas centrales a los efectos citotóxicos de la ciclofosfamida (CPA).
Además de un "gen suicida", el transgén también puede codificar una citoquina para estimular o potenciar una respuesta inmunitaria dirigida a un tumor. Véanse, Blankenstein, T. y otros, J. Exp. Med. 173:1047-1052 (1991); Colombo, M.P. y otros, Cancer Metastasis Rev. 16:421-432 (1997); Colombo, M.P. y otros, Immunol. Today 15:48-51 (1994)). Ejemplos representativos incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), interferón-\gamma, interleuquinas (IL-2, IL-4) o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF)).
El transgén también podría codificar un gen supresor de tumores o cualquier otro gen tumoricida conocido por los expertos en la técnica, tal como toxina de la difteria (Coll-Fresno, P.M. y otros, Oncogene 14:243-247 (1997)), toxina de pseudomonas, genes antiangiogénesis, genes de vacunación de tumores, genes de radiosensibilidad, RNA antisentido o ribozimas (Zaia, J.A. y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:95-106 (1992)).
Así, en esta modalidad de la invención, el mutante viral herpético, con un promotor específico para un tumor o específico para una célula que conduce la expresión del gen \gamma34.5, comprende además un transgén que codifica un producto génico capaz de convertir un agente quimioterapéutico en su forma citotóxica o cualquier otro transgén tumoricida, según se menciona previamente. El transgén puede insertarse en el genoma viral en cualquier posición en la que se exprese. Posiciones preferidas en el genoma viral para el transgén son en el locus de la deleción de \gamma34.5 original o en cualquier lugar del locus UL40 herpético.
Administración del mutante viral herpético
Candidatos ejemplares para el tratamiento de acuerdo con los métodos actualmente reivindicados incluyen, pero no se limitan a: (i) animales no humanos que sufren neoplasmas caracterizados por un promotor específico para un tumor o un promotor específico para un tipo de célula; (ii) seres humanos que sufren neoplasmas caracterizados por un promotor específico para un tumor o un promotor específico para un tipo de célula; (iii) seres humanos o animales no humanos que necesiten la erradicación de una población celular particular.
Por "células neoplásticas" se entienden células cuyos mecanismos de control del crecimiento normales están perturbados (típicamente, por mutaciones genéticas acumuladas), proporcionando de ese modo el potencial para la proliferación descontrolada. El término pretende incluir células neoplásticas tanto benignas como malignas tanto en el sistema nervioso central como en la periferia. Según se usa aquí, el término "periferia" pretende significar todas las otras partes del cuerpo fuera del cerebro o la médula espinal.
Para los propósitos de la invención, células neoplásticas incluyen células de tumores, neoplasmas, carcinomas, sarcomas, papilomas, leucemias, linfomas y similares. De particular interés son los tumores sólidos que pueden surgir en cualquier órgano o tejido del cuerpo de un mamífero.
Tumores cerebrales malignos incluyen astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, schwannoma, neurofibrosarcoma y meduloblastoma.
Preferentemente, el tratamiento se iniciará mediante inoculación intraneoplástica directa. Para tumores del cerebro, pueden usarse MRI, CT u otras técnicas estereotácticas guiadas por formación de imágenes para dirigir la inoculación viral, o los virus se inocularán en el momento de la craneotomía. Para pacientes que intentan erradicar una población celular particular, el vector se inocularía en el tejido de interés.
Generalmente, se conocen en la técnica métodos para la infección viral de las células de interés. Por ejemplo, el mutante viral puede inyectarse en el huésped en o cerca del sitio de crecimiento neoplástico, o administrarse mediante inoculación intravascular. Típicamente, el mutante viral se prepararía como un producto inyectable, bien como una solución líquida o bien como una suspensión; también puede preparase una forma sólida adecuada para la solución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsificarse. El ingrediente activo se mezcla preferiblemente con un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y compatible con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la preparación puede contener cantidades menores de substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, adyuvantes o inmunopotenciadores que potencian la eficacia del mutante viral (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A.R. y otros, eds., Mack Publishing Co., pub., 18ª ed., 1990). Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro sódico, dextrosa de Ringer, etc. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes. Determinar el pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica es habitual y está dentro del conocimiento de un experto normal en la técnica (véase Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics, Gilman, A.G. y otros, eds., Pergamno Press, pub., 8ª ed., 1990).
Formulaciones adicionales que son adecuadas incluyen formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen excipientes típicos tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico y similares. Las composiciones orales pueden tomar la forma de tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.
La dosificación del mutante viral que ha de administrarse, en términos de número de tratamientos y cantidad, depende del sujeto que ha de tratarse, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para administrase dependen del juicio del médico y son peculiares para cada individuo. En su mayor parte, el virus se proporciona en una cantidad terapéuticamente eficaz para infectar y destruir células diana.
Métodos para destruir selectivamente células neoplásticas
La presente invención también proporciona un método para destruir selectivamente células neoplásticas que sobreexpresan un promotor específico para un tumor conocido usando los mutantes virales herpéticos descritos previamente, que comprende: infectar dichas células neoplásticas con dicho mutante viral herpético, comprendiendo dicho mutante viral herpético: (a) una deleción o mutación inactivante en un gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de dicho promotor específico para un tumor, de modo que dicho promotor conduzca la expresión de dicho gen \gamma34.5; y destruir selectivamente dichas células neoplásticas.
Por supuesto, en el mutante viral herpético usado en el método previo, puede haber más de una deleción o mutación inactivante endógena específica y un gen viral herpético, además del gen \gamma34.5. Estas incluyen deleciones en el gen que codifica ribonucleótido reductasa (RR) o más particularmente la subunidad grande de RR. Alternativamente, el gen que codifica RR codifica la subunidad pequeña. También pueden someterse a deleción cualesquiera otros genes virales herpéticos, tales como, por ejemplo, timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) o dUTPasa. Estos genes virales se prefieren ya que los homólogos de mamífero de estos genes a menudo son regulados al alza en células con niveles elevados de E2F, tales como células neoplásticas, y así pueden complementar la enzima viral sometida a deleción, promoviendo así la replicación selectiva en esas células.
Promotores específicos para un tumor ejemplares se describen previamente e incluyen, por ejemplo, CEA, AFT, tirosinasa y PSA. También se sabe que las células tumorales sobreexpresan oncogenes particulares, de modo que las células con expresión génica regulada al alza pueden elegirse usando elementos promotores de tales genes. B-myb, C-myb, c-myc, c-kit y el oncogén c-erbB2 son algunos ejemplos representativos de estos tipos. El promotor B-myb (véase, Lyon, J. y otros, Crit. Rev. Oncogenesis 5:373-388 (1994)) contiene un sitio de unión a E2F de consenso, está estrictamente regulado en células sometidas al ciclo y de hecho está reprimido en G_{0} (Lam, E.W. y Watson, R.J., EMBO J. 12:2705-2713 (1993); Lam, E.W. y otros, Gene 160:277-281 (1995); Bennet, J.D. y otros, Oncogene 13:1073-1082 (1996)). De acuerdo con esto, el promotor B-myb es un promotor específico para un tumor particularmente preferido. En una modalidad particular de este método, el mutante viral usado en el método es Myb34.5.
Cualquier tipo de cáncer que tenga un promotor bien caracterizado encontraría uso en el método de la invención. Ejemplos de tales promotores pueden encontrarse en la Tabla 1 de Clary, B.M. y otros, Cancer Gene Therapy 7:565-574 (1998); la Tabla 1 de Spear, M.A., Anticancer Research 18:3223-3232 (1998); la Tabla 2 de Walther, W. y Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996) y Dachs, G.U. y otros, Oncol. Res. 9:313-325 (1997)).
La mayoría, si no la totalidad, de las secuencias génicas de los promotores específicos para un tumor descritos previamente está disponible de the GenBank Sequenece Database.
Además, la invención proporciona el método previo para destruir selectivamente células neoplásticas, en el que dicho mutante viral herpético comprende además un transgén, en el que el transgén es un gen suicida, un gen de citoquina o cualquier gen tumoricida. Si el transgén es un gen suicida, entonces el método comprende además poner en contacto las células neoplásticas con un agente quimioterapéutico capaz de ser activado por dicho gen suicida y destruir selectivamente las células neoplásticas. El gen suicida preferido es citocromo P450. P450 2B1 se prefiere particularmente. Alternativamente, el citocromo P450 codificado es P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4. Además, el agente quimioterapéutico es preferiblemente un miembro de la clase de las oxazosforinas, particularmente ciclofosfamida, ifosfamida, N-metilciclofosfamida, metilcloropropilnitrosourea, ciclofosfamida polímera, ifosfamida polímera, N-metilciclofosfamida polímera o metilcloropropilnitrosourea
polímera.
Otra modalidad de la invención es una composición farmacéutica que contiene los mutantes virales precedentes, en donde esta composición también puede contener uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Métodos para eliminar selectivamente poblaciones de células diana
Otra modalidad de la presente invención es un método para eliminar selectivamente una población de células diana que sobreexpresa un promotor específico para una célula conocido usando los mutantes virales herpéticos de la invención, que comprende: infectar dichas células con dicho mutante viral herpético, comprendiendo dicho mutante viral: (a) una deleción o mutación inactivante en un gen que codifica \gamma34.5; y (b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de dicho promotor específico para una célula, de modo que dicho promotor conduzca la expresión de dicho gen \gamma34.5; y eliminar selectivamente una población de células diana.
Por "eliminar selectivamente una población de células diana" se pretende incluir una reducción significativa del número de células diana frente a células no diana, así como la eliminación completa o casi completa de células diana.
Por supuesto, en el mutante viral herpético usado en el método previo, puede haber más de una deleción o mutación inactivante endógena específica de un gen viral herpético, además del gen \gamma34.5. Estas incluyen deleciones en el gen que codifica ribonucleótido reductasa (RR) o más particularmente la subunidad grande de RR. Alternativamente, el gen que codifica RR codifica la subunidad pequeña. Cualesquiera otros genes virales herpéticos también pueden someterse a deleción, tales como, por ejemplo, timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) o dUTPasa.
Promotores específicos para una célula ejemplares incluyen los siguientes: promotor del receptor (flk1) de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales (Kappel y otros, Blood 93:4282-4292 (199); promotor de insulina expresado en células beta del páncreas (Ray y otros, J. Surg. Resg. 84:199-203 (1999); gen receptor de hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo (Albarraccín y otros, Endocrinology 140:2415-2421 (1999); promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteoclastos y queratinocitos (Munant y tros, J. Bio. Chem. 274: 5588-5596 (1999); receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas (Amizuma y otros, J. Clin. Invest. 103: 373-381 (1999); promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas (Yang y otros, J. Neurochem. 71:1813-1826 (1998).
Aplicaciones ejemplares de esta modalidad incluyen las siguientes:
1) Opciones de tratamiento para eliminar una población de células nocivas: Por ejemplo, en condiciones en las que existe una neovascularización exuberante de vasos sanguíneos, tales como enfermedad de Moya-Moya cerebral, el uso del promotor del receptor flk1 para conducir la expresión del gen gamma 34.5 permitiría la eliminación selectiva de los vasos sanguíneos que provocan esta enfermedad. Otro ejemplo es en estados en los que existe una remodelación ósea y eliminación de hueso extensivas, tales como la osteoporosis, el uso de la metaloproteinasa 9 de matriz o el receptor de hormona paratiroidea para conducir la expresión de gamma 34.5 eliminaría osteoclastos óseos de la remodelación adicional del hueso.
2) Para estudiar procesos de desarrollo: Para estudiar el efecto de la eliminación de una población de células sobre procesos de desarrollo, podría usarse, por ejemplo, el promotor de dopamina-beta-hidroxilasa para eliminar las neuronas noradrenérgicas y a continuación estudiar el efecto sobre el desarrollo del animal.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de eliminación.
Ejemplo 1 Introducción
La deleción del gen \gamma34.5 que codifica para la virulencia reduce marcadamente la citotoxicidad mediada por virus del herpes simple (HSV). Para orientar la virulencia lítica a los tumores, los inventores crearon un mutante de virus del herpes simple (HSV1) denominado Myb34.5. Este mutante viral se caracteriza por deleciones en ICP6 (también conocido como UL39 o ribonucleótido reductasa) y de las dos copias endógenas del gen \gamma34.5 (RL1) y por la reintroducción de una copia de \gamma34.5 bajo el control del promotor B-myb celular sensible a E2F.
Durante la inoculación intracerebral directa en ratones, Myb34.5 permanecerá tan avirulento como un virus mutante \gamma34.5. Sin embargo, su eficacia oncolítica contra una variedad de células de glioma humano en cultivo e in vivo era similar a la de una sola cepa mutante ICP6 que posee un gen \gamma34.5 silvestre. Esta combinación de eficacia antitumoral y neuroatenuación retenida sugiere que pueden usarse promotores regulados por el ciclo celular para orientar la virulencia de HSV-1 hacia tumores, aunque manteniendo el fenotipo neuroatenuado deseable de un mutante \gamma34.5.
Métodos y materiales Plásmidos y virus
La cepa de HSV F (silvestre) se adquirió a través del ATCC (Manassas, VA). El virus mutante R3616 (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990) (que contenía deleciones de BstEII-StuI de 1000 bp dentro de ambos loci \gamma34.5) fue amablemente suministrado por el Dr. B. Roizman, University of Chicago. El virus mutante hrR3 (Goldstein, D.J. y Weiner, S.K., J. Virol. 62:196-205 (1988) (amablemente suministrado por S. Weller, University of Connecticut) contiene un cDNA de lacZ de E. coli insertado en el locus UL39. El virus mutante MGH1 se caracteriza por la inserción de cDNA de lacZ de Esquerichia coli en el locus UL39 y las deleciones de ambos loci \gamma34.5, y se construyó mediante la recombinación de la región ICP6-lacZ de hrR3 como el mutante viral R3616 (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)). El plásmido pKX-BG3, que contiene el gen lacZ dentro de una región XhoI de 2,3 kb de ICP6 (origen KOS, véase Goldstein, D.J y Weller, S.K., J. Virol. 62:2970-2977 (1988)) fue proporcionado por S. Weller, como el plásmido pKpX2, que contiene 2,3 kb del gen ICP6 (UL39). El plásmido pBGL34.5, que contiene toda la secuencia de codificación de \gamma34.5, fue proporcionado por Xandra Breakefield y Peter Pechan (MGH). El promotor B-myb fue cortado como un fragmento KpnI-HindIII del plásmido pBGL2myb (amablemente suministrado por el Dr. R. Watson, Ludwig Institute for Cancer Research, UK) y se clonó direccionalmente aguas arriba de \gamma34.5.
Transformación por ingeniería de Myb34.5 y de un inversor de Myb34.5
El plásmido usado para la transformación por ingeniería de Myb34.5 mediante recombinación homóloga en MGH1 se diseñó para substituir el cDNA de lacZ en MGH1 en su totalidad y suprimir 888 nucleótidos adicionales de la secuencia de ICP6 (UL39). Específicamente, el plásmido recombinante (pKpX2-myb34.5) se transformó por ingeniería como sigue. El cDNA de \gamma34.5 de longitud completa se cortó como un fragmento NcoI-Sacl de pBGL34.5, se acabó en extremos romos y a continuación se subclonó en pBSKII (Stratagene, La Jolla, Calif.) para generar el plásmido pBS34.5. El promotor B-myb se cortó como un fragmento KpnI-HindIII a partir de pBGL2myb y se clonó direccionalmente aguas arriba de \gamma34.5 en pBS34.5. El casete de expresión resultante, que contenía el promotor B-myb aguas arriba del cDNA de \gamma34.5, se cortó como el fragmento KpnI-XbaI, se acabó en extremos romos y a continuación se subclonó en los sitios NruI de pKpX2. A través de este procedimiento, el fragmento NruI-NruI intermedio dentro de UL39 se sometió a deleción. El plásmido resultante, pKpX2-myb34.5, se linealizó a continuación con ScaI y se cotransfectó con DNA viral de MGH1 en células Vero con diversas relaciones molares con lipofectamina (Gibco, Gaithersburg, MD). La progenie del virus se recogió de 5 a 7 días después de la transfección cuando los efectos citopáticos eran evidentes. Esta progenie se liberó de las células a través de tres ciclos de congelación-descongelación y a continuación se cultivó en placas sobre una monocapa de células Vero. Después de recubrir la monocapa con agarosa, se realizó la incubación a 37ºC en una atmósfera que contenía 5% de dióxido de carbono. Las calvas se tiñeron a continuación con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-Gal). Las calvas incoloras se seleccionaron como recombinantes potenciales. Estos aislados sufrían tres rondas de purificación por calvas antes de tener su identidad genética probada mediante análisis de transferencia Southern. Un inversor de Myb34.5 (MybRevt) se manipuló usando Myb34.5 como la cepa parental y pKX-BG3 como el plásmido para la recombinación homóloga del cDNA de lacZ de nuevo en el locus ICP6 y la deleción del casete de expresión B-myb/\gamma34.5.
Análisis por transferencia Southern
Se aislaron DNAs virales después de la lisis celular de células Vero infectadas con SDS/proteinasa K, extracción repetida con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. El DNA se digirió con endonucleasas de restricción apropiadas (New England Biolabs, Beverly, MA), se separó mediante electroforesis en agarosa y se transfirió a una membrana de nailon (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois). Las sondas incluían el fragmento de ICP6 HindIII-XbaI procedente de pKpX2, el fragmento BstEII-BbsI procedente de pBSK\gamma34.5 y un fragmento BbsI de lacZ procedente de pKX-BG3. El marcaje de las sondas y las hibridaciones se realizaron usando el sistema de quimioluminiscencia ECL (Amersham) de acuerdo con el procedimiento del fabricante.
Estudios de cultivo celular
Todas las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera que contenía dióxido de carbono al 5% en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero de ternero fetal, 100 U de penicilina/ml y 10 \mug de estreptomicina/ml. Se realizaron estudios de la interrupción de la síntesis de proteínas huésped infectando células con cepas virales durante 16 horas. Las células se pusieron a continuación en medio libre de metionina durante 10 minutos, a continuación se marcaron usando ^{35}[S]-metionina (New England Nuclear, Boston MA) durante 90 minutos. Las células se lavaron a continuación con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7, se solubilizaron, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a autorradiografía. Las concentraciones de proteína se calcularon con un estuche disponible comercialmente (Bio-Rad, Hercules CA). Los polipéptidos celulares infectados (ICP) se marcaron, según se publica previamente (Morse, L.S. y otros, J. Virol. 26:389-410 (1978)). Se obtuvieron líneas celulares de glioblastoma humano U87, U373, T98G y U343; células de gliosarcoma 9L de rata; células SKNSH de neuroblastoma humano y células Vero (mono verde africano) de the American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron con DMEM o medio esencial alfa mínimo (Gibco) complementado con 10% de suero y antibióticos. Las neuronas estriadas fetales primarias de ratón (fase embrionaria 18) (amablemente suministradas por M. Schwarzchild, Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA) fueron aisladas usando procedimientos publicados (Schwarzschid, M.A. y otros, J. Neurosci. 17:3455-3466 (1997)).
Estudios en animales
Se obtuvieron ratones desnudos (nu/nu) de las instalaciones de cría Cox 7, Massachusetts General Hospital (MGH). Se obtuvieron ratones BALB/C de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se obtuvieron tumores subcutáneos mediante inyección de 2 x 10^{5} células en los costados de ratones atímicos (cinco animales por grupo para células de gliosarcoma 9L y seis animales por grupo para células de glioma U87\DeltaEGFR humano). Catorce (para 9L) o diez (para U87\DeltaEGFR) días después de la implantación del tumor, animales con volúmenes de tumor similares se dividieron aleatoriamente y diversas cepas virales se inyectaron intratumoralmente a 5 x 10^{7} PFU/dosis en volúmenes de 100 \mul los días 1, 3, 5 y 7. Los animales fueron sometidos a eutanasia el día 33 (9L) o el día 34 (U87\DeltaEGFR). Los volúmenes de los tumores se midieron con calibres externos, según se describe previamente (Wei, M.X. y otros, Hum. Gene Ther. 5:696-678 (1994)). Para experimentos de neurotoxicidad, los ratones BALB/C fueron inyectados estereotácticamente en el lóbulo frontal derecho (profundidad 3 mm) con volúmenes de 10 \mul de virus a diferentes diluciones, hasta las concentraciones de reserva más altas obtenibles. Los animales se verificaron diariamente durante 28 días. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las directrices dictadas por the MGH Subcommittee on Animaal Care. La inoculación viral y el cuidado de los animales que portan virus se realizaron en cámaras para vectores virales apropiadas.
Resultados Transformación por ingeniería genética de Myb34.5
El virus múltiplemente mutado Myb34.5 se construyó recombinando un constructo de promotor B-myb/\gamma34.5 en el locus UL39 (también conocido como ICP6 o RR) de MGH1. Se generó MGH1 (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gener Ther. 8:2057-2068 (1997)) recombinando un cDNA de lacZ en el locus ICP6 del mutante de deleción de \gamma34.5 R3616 (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990)). La Figura 1A proporciona un esquema de la estructura de DNA de Myb34.5. Esta estructura se confirmó mediante mapeo con endonucleasas de restricción (datos no mostrado), hibridación por transferencia Southern (Figuras 1B a 1D) y análisis de secuencia (datos no mostrados) de las uniones entre UL39 y el casete de expresión de promotor B-myb/\gamma34.5. Para mostrar la deleción de lacZ en Myb34.5, DNA de Myb34.5 digerido con XhoI se hibridó a sondas que contenían ICP6 (Figura 1B) o la secuencia de lacZ (Figura 1C). Según se esperaba, el virus parental, MGH1, contenía un fragmento de ICP6-lacZ XhoI de 9,0 kb (Kramm, C.M. y otros, previamente) que se hibridaba a una sonda ICP6 (Figura 1B). La recombinación homóloga conducía a la deleción de lacZ y la secuencia de ICP6 adicional y la inserción de la secuencia promotor B-myb/\gamma34.5. Esto es evidente mediante hibridación de la sonda ICP6 a un fragmento de 6,7 kb en DNA de Myb34.5 (Figura 1B). La hibridación con una sonda lacZ revelaba la ausencia de fragmentos hibridantes en DNA digerido de Myb34.5 y la presencia del fragmento hibridante de 9,0 kb esperado en DNA digerido de MGH1 (Figura 1C). Para confirmar que Myb34.5 poseía una reintroducción del gen \gamma34.5, DNA viral digerido con BamHI se hibridó con un fragmento de \gamma34.5 BstE11-Bbs (interno a las regiones sometidas a deleción). Esto demostraba una sucesión de bandas hibridantes que se observa típicamente con la cepa F silvestre. Según se analiza en el trabajo de Chou y otros (1991), previamente, \gamma34.5 se mapea en fragmentos S y SP BamHI, formando una sucesión característica de bandas con incrementos de 500 pb, que son una consecuencia de un número variable de secuencias \alpha en las repeticiones que flanquean las secuencias únicas del componente largo. Esta sucesión se observa en la transferencia Southern para la cepa F (trayectoria 1 de la Figura 1D), donde las bandas hibridantes superiores representan el fragmento SP BamHI, formado por la fusión del fragmento S BamHI terminal con P BamHI, mientras que las bandas hibridantes inferiores representan el fragmento S BamHI (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990)).
En R3616 y sus virus derivados, MGH1, Myb34.5 y Myb34.5Revt, se esperaría una sucesión similar de bandas hibridantes cuyo tamaño molecular se disminuía en aproximadamente 1 kb (el tamaño de la deleción interna de \gamma34.5 en R3616) si se empleaba para la hibridación de una sonda de cDNA de \gamma34.5 de longitud completa. De hecho, en el trabajo de Chou y otros, (Chou, J. y otros, Science: 250:1262-1266 (1990)), este patrón de hibridación es evidente para R3616, y en el trabajo de Kramm y otros (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)), este patrón de hibridación es evidente para MGH1. Sin embargo, para el análisis Southern mostrado en la Fig. 1D, se empleó como una sonda un fragmento de \gamma34.5 BstEII-Bbs que es interno al fragmento sometido a deleción de 1 kb del gen \gamma34.5 de R3616, MGH1, Myb34.5 y Myb34.5Revt. Por lo tanto, no se observaron bandas de hibridación para MGH1 (Fig. 1D, trayectoria 2) y Myb34.5Revt (Fig. 1D, trayectoria 4), mientras que se observa un solo fragmento de hibridación de 5,3 kb para Myb34.5 (Fig. 1D, trayectoria 3) correspondiente al gen \gamma34.5, reintroducido en el locus ICP6.
Para demostrar que el fenotipo alterado de Myb34.5 era el resultado de la inserción de B-myb/\gamma34.5, también se manipuló un virus inversor (rescatado con marcador) y se denominó MybRevt. Esto se alcanzó mediante recombinación homóloga, con Myb34.5 como la cepa parental, y pKX2-BG3 linealizado como el plásmido recombinante. Este plásmido contiene la inserción lacZ/ICP6 y se usó para crear hrR3, la fuente de la región de fusión ICP6::lacZ en MGH1 (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997); Goldstein, D.J. y Weller, S.K., J. Virol. 62:2970-2977 (1988)). El inversor MybRevt demostraba un patrón durante la hibridación Southern con las sondas IPC6 (Fig. 1B), lacZ (Fig. 1C) y \gamma34.5 (Fig. 1D), que era idéntico al mostrado por MGH1, la cepa parental de Myb34.5.
Expresión funcional de \gamma34.5
Para confirmar que Myb34.5 producía proteína \gamma34.5 funcional, células de neuroblastoma SKNSH humano se infectaron con una variedad de cepas virales. La Figura 2 muestra que, según se espera, MGH1 y el virus inversor (MybRevt) fracasaban para prevenir la respuesta de células infectadas que consistía en la interrupción de la síntesis de proteínas, que es característica de la función de \gamma34.5 intacta (Chou, J., 1992, previamente). Sin embargo, Myb34.5 y otras cepas con \gamma34.5 intacta (F silvestre y hrR3) evitaban la respuesta de células infectadas (interrupción de la síntesis de proteínas), conduciendo así a la producción de proteínas virales.
Una evidencia adicional de que Myb34.5 expresaba proteína \gamma34.5 funcional fue proporcionada por la determinación de la replicación viral en la línea celular de glioblastoma U373 que se había apreciado previamente que restringía la replicación de cepas de HSV mutantes \gamma34.5 (Mohr. I. y Bluzman, Y., EMBO J. 15:4579-5766 (1996)). Después de infectar 5 x 10^{5} células con una MOI de 1,0 y recoger la producción viral 48 horas más tarde, los rendimientos de Myb34.5 eran similares a los de la cepa F silvestre (1,1 x 10^{7} PFU frente a 5,0 x 10^{7} PFU, respectivamente). En contraste, los rendimientos de MGH1 (3,3 x 10^{4} PFU) o MybRevt (3,4 x 10^{4} PFU, media de experimentos por triplicado) eran significativamente menores. La capacidad de Myb34.5 para replicarse eficazmente en esta línea no permisiva, en contraste con la de MGH1 o MybRevt, indican que la \gamma34.5 codificada en Myb34.5 era funcional.
Estudios de Neurotoxicidad
Una característica importante de cualquier cepa de HSV competente con respecto a la replicación es su nivel de neurovirulencia, que puede determinarse tanto in vitro como in vivo. La capacidad del virus Myb34.5 para replicarse en cultivos neuronales primarios se midió en comparación con las cepas F, hrR3, MGH1 y MybRevt. Se infectaron neuronas estriadas fetales murinas y los rendimientos virales se determinaron mediante ensayo de calvas sobre células Vero (que no requieren \gamma34.5 para la replicación viral eficaz). Aunque la cepa F silvestre demostraba una replicación vigorosa en neuronas, todas las cepas mutantes, incluyendo Myb34.5, demostraban una replicación viral mínima (véase la Tabla 1).
1 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * \+  \begin{minipage}[t]{145mm} Un total de 2,5 x 10 ^{5} 
neuronas estriadas fetales murinas (día 18) se  recogió y se cultivó
en placas según se describe previamente (Chase, M. y otros,   Nat.
Biotechnol. 16 :444-448 (1998)). Dos días después
del cultivo en placas,  las células se infectaron con una MOI de 0,1
con cepas virales silvestres (cepa  F) y mutantes en experimentos
por duplicado. Veinticuatro horas después de la  infección, las
células y el sobrenadante se recogieron y se sometieron a ciclos  de
congelación-descongelación para liberar partículas
virales. La producción  viral se determinó mediante ensayo de calvas
sobre células Vero. Los errores  estándar (SEM) están entre
paréntesis. Las producciones virales de cuatro cepas  mutantes
(hrR3, MHG1, Myb34.5 y MybRevt) no eran estadísticamente diferentes 
entre grupos (prueba t, p>0,3).
\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
En la situación in vivo, la inoculación intracerebral directa de Myb34.5 en ratones BALB/C demostraba que el virus permanecía marcadamente neuroatenuado con relación a HSV silvestre. La Tabla 2 muestra que la LD_{50} de Myb34.5 era 2,7 x 10^{7} PFU, al menos 3 unidades logarítmicas superior que la de la cepa F (silvestre). Los mutantes \gamma34.5 (MGH1, R3616 y MybRevt) no crecían bien, y el alcance de concentraciones de >10^{9} PFU/ml es prohibitivo sin una producción a gran escala. Esto limitaba la capacidad para estimar exactamente la LD_{50} para estos mutantes en estos experimentos. Con propósitos comparativos, uno de seis ratones perecía cuando eran inoculados intracerebralmente con 10^{7} PFU de Myb34.5, mientras que cero de seis ratones perecía cuando eran inoculados con la misma cantidad de MGH1. Estos hallazgos confirmaban que la reintroducción de \gamma34.5 bajo el control del promotor B-myb producía una nuerovirulencia mínima.
2 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * \+  \begin{minipage}[t]{145mm} Diluciones en serie de virus
en medio libre de suero (volumen 10  \mu l) se  inyectaron
estereotácticamente en el hemisferio derecho de ratones BALB/C
hembra  de tres semanas de edad (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA, 6 animales  por nivel de PFU). Los animales fueron
inspecionados diariamente durante 28 días  con respecto a la
mortalidad, y la LD _{50}  en PFU se calculó usando un modelo  de
distancia proporcional. Los dobles asteriscos (**) para R3616 y MGH1
indican  que no se producían muertes a la dosis listada, que era lo
máximo obtenible para  estas cepas en el volumen de inyección dado.
Esto es debido a que no podían  alcanzarse concentraciones de
>10 ^{9}  PFU/ml con estos mutantes en células  Vero en
crecimiento sin producción a escala industrial y las inyecciones 
intracerebrales estaban limitadas a un volumen máximo de 10  \mu l.
Los  asteriscos triples (***) indican que en experimentos paralelos
se producía una  muerte por seis animales con una dosis de 10 ^{7} 
PFU. Puesto que podían  alcanzarse concentraciones de 5 x 10 ^{9}  a
1 x 10 ^{10}  PFU/ml con Myb34.5 en  células Vero o tumorales que se
dividen rápidamente, podía medirse una LD _{50}   más exacta.
\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Regulación de la expresión del gen \gamma34.5 en células obstaculizadas y sometidas a ciclo
Para determinar adicionalmente el comportamiento de Myb34.5 en células quiescentes frente a sometidas a ciclo, fibroblastos humanos primarios se cultivaron en placa y el ciclo celular se perturbó con lovastatina 20 \muM, que se ha observado que no interfiere con la replicación del virus herpético (Schang, L.M. y otros, J. Virol. 72:5636-5637 (1998)). En fibroblastos humanos primarios obstaculizados, MGH1, Myb34.5 y MybRevt demostraban una replicación viral mínima con relación a la cepa F, a niveles 1 unidad logarítmica (PFU) inferiores que el mutante RR simple hrR3 (Figura 3). En contraste, en presencia de suero, hrR3 y Myb34.5 demostraban una inducción marcada de la replicación, mientras que MGH1 y MybRevt no lo hacían. Estos resultados sugerían que: 1) \gamma34.5 se requiere para la replicación eficaz en este tipo celular no transformado, y 2) el promotor B-myb funciona para permitir la replicación eficaz de Myb34.5 en células sometidas a ciclo. También es notable que Myb34.5 exhiba una mayor diferencia en la producción de progenie viral en células quiescentes frente a sometidas a ciclo que la de hrR3 (3 frente a 2 unidades logarítmicas) y que su producción viral en células quiescentes fuera la misma que la de los virus mutantes \gamma34.5.
Estudios comparativos sobre los efectos oncolíticos
Para determinar la eficacia oncolítica de Myb34.5, cinco líneas celulares de glioma (9L, U87, U87\DeltaEGFR, T98G y U343) se infectaron de forma simulada (sin virus) o se infectaron con un grupo de cepas virales que incluían cepa F, MGH1, Myb34.5 y MybRevt. Las células supervivientes se contaron 48 horas más tarde y se expresaron como un porcentaje de células supervivientes sobre las placas tratadas simuladamente. En estudios publicados de células de gliosarcoma 9L de rata (Kramm, C.M. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)) y en experimentos no publicados sobre células de glioma humano U347 Y T98 (Qureshi, N. y Chiocca, E.A., datos no publicados) se había observado de forma preliminar que la destrucción de células tumorales por MGH1 era similar a la de R3616 para dos líneas de glioma humano (Tabla 3) y así el último mutante se excluía de análisis adicionales.
En todas las líneas celulares tumorales probadas, Myb34.5 demostró mayor eficacia oncolítica in vitro que la cepa parental MGH1, y para algunas líneas celulares tumorales su eficacia oncolítica se aproximaba a la del virus silvestre (Tabla 3). Estos hallazgos mostraban así que el efecto oncolítico de Myb34.5 era mayor que el de virus mutantes \gamma34.5 (MGH1, MybRevt y R3616, cuya eficacia de destrucción replica estrechamente la de MGH1).
3 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * \+  \begin{minipage}[t]{143mm} Líneas celulares derivadas de
glioma de ser humano (U87MG, U343, T98G y  U98 \Delta EGFR) y de
rata (9L) se cultivaron en placas a 5 x 10 ^{5}   células/placa de
60 mm de diámetro y subsiguientemente se infectaron con una MOI  de
0,1 con las cepas apuntadas. El efecto oncolítico se refleja por la 
supervivencia celular a las 48 horas después de la infección,
expresada como un  porcentaje del número de células supervivientes a
partir de placas de control no  infectadas triplicadas. Los valores
representan medias (SEM entre paréntesis) de  experimentos por
triplicado. Las diferencias en la destrucción de células  tumorales
por Myb34.5 frente a MGH1 o MybRevt eran estadísticamente 
significativas. Por ejemplo, para células de glioma U87,  P 
era <0,001  (análisis unidireccional de la varianza con
procedimientos de comparación  múltiples pareados de Tukey).
\end{minipage} \cr  ** \+  \begin{minipage}[t]{143mm} La
destrucción para R3616 no se incluía en este grupo particular de 
experimentos debido a que es relativamente similar a la observada
con MGH1. Esto  fue mostrado por Kramm y otros (Kramm, C.M. y otros,
 Hum. Gene Ther. 8 :2057-2068 (1997)) para
células de gliosarcoma 9L de rata así como en número de 
experimentos previamente no publicados realizados en un momento
diferente del  presente experimento. Por ejemplo, para células de
glioma U343 humano infectadas  con MGH1 o células R3616 con una MOI
de 0,1, los grados de supervivencia eran 54  y 50%, respectivamente,
a los 2 días. Para células T98 humanas infectadas con  MGH1 o R3616
con una MOI de 0,1, los grados de supervivencia eran 40 y 38%, 
respectivamente.
\end{minipage} \cr}
Efectos anticancerígenos in vivo
Se determinaron a continuación los efectos anticancerígenos in vivo de Myb34.5. Después de establecer tumores de gliosarcoma 9L de rata (Figura 4A) o glioma U87dEGFR humano (Figura 4B) en los costados de ratones atímicos, se realizó la inoculación intraneoplástica con cada virus. El crecimiento del tumor 9L, según se determinaba mediante volúmenes de tumor medios, se reducía significativamente mediante el tratamiento con Myb34.5 en comparación con animales de control, con una inhibición cuantitativamente similar a aquella después del tratamiento con hrR3 (Figura 4A). Para U87\DeltaEGFR, un glioma humano que expresa un receptor de EGF truncado común (Nagane, M. y otros, Cancer Res. 56:5079-5086 (1996); Huang, H.S. y otros, J. Biol. Chem. 272:2927-2935 (1997); Nishikawa, R. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7727-7731 (1994)), todas las cepas inhibían significativamente el crecimiento, produciendo hrR3 y Myb34.5 3 de 6 regresiones completas, mientras que MGH1 y MybRevt producían 2 de 6 regresiones (hasta tumor no visible, Figura 4B).
Aunque un análisis superficial de la Figura 4B puede conducir a la conclusión de que no existían diferencias significativas en el crecimiento de tumores U87\DeltaEGFR humanos tratados con los mutantes \gamma34.5 (MGH1 y MybRevt) frente a los virus \gamma34.5^{+} (hrR3 y Myb34.5), la revisión de los volúmenes de tumor reales en el punto del día 34 revela la presencia de una diferencia significativa (Tabla 4). Estos resultados mostraban así que los efectos oncolíticos in vivo de Myb34.5 eran paralelos a los del mutante RR simple y eran superiores a los de los mutantes \gamma34.5.
4 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  \+  \begin{minipage}[t]{143mm} Los detalles de los
procedimientos experimentales se proporcionan en la leyenda de la
Figura 4. Los resultados son a partir del punto temporal del día 34.
\end{minipage} \cr   ^{b}  \+  \begin{minipage}[t]{143mm}
Las diferencias en los valores medianos entre los grupos tratados
eran  significativamente diferentes ( P  = 0,004 [análisis
unidireccional de la  varianza de Kruskal-Wallis
sobre rangos]).
\end{minipage} \cr}
Análisis
En este Ejemplo, se ha demostrado que la cepa de HSV mutante doble elegida, Myb34.5, destruía eficazmente células de glioma malignas tanto in vitro como in vivo, mientras que retenía un alto grado de seguridad en términos de neurotoxicidad durante la inoculación intracraneal directa en ratones. Esta cepa también exhibía replicación mínima en fibroblastos obstaculizados primarios y una inducción notable de la replicación en células sometidas a ciclos, similar a la inducción observada con un HSV caracterizado por una mutación RR simple. En células tumorales, también se replicaba vigorosamente, con una eficacia oncolítica mejorada en comparación con el mutante RR/\gamma34.5 doble parental, MGH1. Esto es pertinente ya que MGH1 y otros mutantes \gamma34.5 pueden tener una eficacia limitada debido a los rendimientos virales menores obtenidos a partir de células infectadas (Kramm, C.M. y otros, previamente). Quizá lo más importante, Myb34.5, como MGH1 u otros mutantes \gamma34.5, demostraba poca patogenicidad en ratones con dosis intracerebrales de 10^{7} PFU, permaneciendo neuroatenuado. Por lo tanto, Myb34.5 exhibe una eficacia oncolítica mejorada en comparación con el mutante parental MGH1, el inversor rescatado con marcador MybRevt y el mutante parental de MGH1 R3616, mientras que mantenía características de neuroatenuación, con una LD_{50} de >10^{7}PFU. Este valor es cualitativamente similar a los observados con mutantes \gamma34.5, aunque las comparaciones cuantitativas estrictas estaban limitadas por la incapacidad técnica para determinar exactamente una LD_{50} para el último grupo de mutantes.
Un objetivo principal en la terapia génica contra el cáncer es identificar mutantes virales que proporcionen efectos anticancerígenos significativos mientras que al mismo tiempo demuestren efectos secundarios y toxicidad hacia células y tejidos normales mínimos. Este logro se ha conseguido transformando mediante ingeniería vectores virales defectuosos con respecto a la replicación, que deben presentar toxicidad mínima hacia células normales y tumorales infectadas, y dotándolos de la capacidad para expresar genes anticancerígenos para alcanzar efectos biológicos (Moriuchi, S. y otros, Cancer Res. 58:5731-5737 (1998)). Cuando se aplican como inóculos a masas tumorales humanas grandes, tales vectores no se difunden bien debido a su tamaño, limitando así los efectos anticancerígenos a células situadas en la proximidad del tracto de inyección (Bobo, R.H. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Puumalainen, A.M. y otros, Hum. Gene Ther. 9:1769-1774 (1998)).
Una solución potencial para este problema consiste en el uso de mutantes virales condicionales con respecto a la replicación (oncolíticos, restringidos con respecto a la replicación) que manifiestan la capacidad para replicarse de un modo relativamente selectivo en células tumorales o mitóticas mientras que están restringidos en su capacidad para replicarse en células normales. Tales mutantes virales deben propagarse así a partir de células tumorales inicialmente infectadas hasta células tumorales circundantes, alcanzando así un volumen mayor de distribución y efectos anticancerígenos potenciados. Sin embargo, podría esperarse una toxicidad incrementada con estos mutantes. Para minimizar las toxicidades potenciales asociadas con HSV-1 condicional con respecto a la replicación, se ha observado que la deleción de los genes \gamma34.5 endógenos limita significativamente o elimina el riesgo de encefalitis o meningitis durante la inyección intracraneal en roedores (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Market, J.M. y otros, Neurosurgery 32:597-603 (1993); Markovitz, N.S. y otros, J. Virol. 71:5560-5569 (1997) y monos Aotus (Mineta, T. y otros, Nat. Med. 1:938-943 (1995)). Además, en una prueba clínica de fase 1 en seres humanos afectados de tumores cerebrales malignos, este tipo de mutante no ha mostrado evidencia de efectos patógenos (Maruza, R.L., comunicación personal).
Sin embargo, un problema es que la eliminación completa de la función de \gamma34.5 endógeno también limitaría los efectos anticancerígenos de HSV. En experimentos publicados, esta limitación se mostró para células de gliosarcoma 9L de rata tanto in vitro como in vivo (Kramm, S. y otros, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)). En el presente Ejemplo, también se ha probado la destrucción mediada por mutantes de HSV con deleciones de la función de \gamma34.5 (MGH1 y MybRevt) contra un grupo de cinco líneas celulares de glioma humano (Tabla 2). Según se esperaba, estos mutantes eran relativamente limitados en su eficacia oncolítica, en comparación con la cepa F silvestre. También se observaron hallazgos similares con R3616, cepa parental de MGH1 (Qureshi, N. y Chiocca, E.A., datos no publicados). Sin embargo, la eficacia oncolítica de MGH1 se restauró hasta niveles que estaban cerca de los observados con la cepa F silvestre con la inserción de un gen \gamma34.5 simple bajo control del promotor B-myb.
La significación de este resultado es que se espera que la inoculación de Myb34.5 en tumores produzca una oncolisis más intensiva que la inoculación de MGH1, R3616 u otros mutantes \gamma34.5 en tumores.
De hecho, se encontró que la eficacia antitumoral de Myb34.5 in vivo era cuantitativamente similar a la de un mutante RR simple (hrR3), sugiriendo que en células tumorales la expresión activa del producto \gamma34.5 devuelve Myb34.5 a un fenotipo positivo a \gamma34.5. Sin embargo, debido a que hrRr3 es un mutante de inserción simple, Myb34.5 ofrece la ventaja teórica de ser menos tendente a la reparación recombinatoria hasta el tipo silvestre en presencia de infección con HSV preexistente latente o subsiguiente. Incluso en el caso improbable de que pudiera producirse la reparación del locus ICP6 a través de recombinación homóloga, la inserción B-myb/\gamma34.5 se cortaría y devolvería Myb34.5 hasta el genotipo sometido a deleción en \gamma34.5 de R3616, el virus parental para MGH1.
Los resultados publicados han demostrado que finalmente una función de \gamma34.5 es impedir la respuesta de células huésped a la infección viral, a saber, la activación de la interrupción de la síntesis de proteínas huésped en una respuesta similar a la apoptosis (Chou, J. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10513-10520 (1995); Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. y Roizman, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)). Una función similar está extendida entre virus patógenos (Cosentino, G.P. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9445-9449 (1995); Gale, M. y otros, Mol. Cell Biol. 18:5208-5218 (1998); Katze, M.G, Trends Microbiol. 3:75-78 (1995); Sharp, T.V. y otros, Nucleic Acids Res. 21:4483-4490 (1993)). Aunque \gamma34.5 no es esencial para el crecimiento viral en células Vero en cultivo, permite que el virus se extienda en el sistema nervioso central del ratón (Kesari, S. y otros, J. Gen. Virol. 79:525-536 (1998); Kesari, S. y otros, J. Neurosci. 16:5644-5653 (1996); Markovitz, N.S. y otros, J. Virol. 71:5560-5569 (1997)) y se mapea hasta una región del genoma de HSV previamente implicada en la replicación en el SNC (Centifanto-Fitzgerald, Y.M. y otros, J. Exp. Med. 155:475-489 (1982); Markovitz, N.S. y otros, J. Virol. 71:5560-5569 (1997)). Esto puede deberse al hecho de que la proteína codificada por \gamma34.5 inhibe la quinasa dependiente de RNA bicatenario. Durante la exposición a moléculas de RNA bicatenario, como se observa comúnmente con la infección viral, la quinasa dependiente de RNA fosforila la subunidad alfa del factor de iniciación de la elongación 2, dando como resultado la inhibición de la síntesis de proteínas (Chou, J. y otros, Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. y otros, J. Virol. 68:8304-8311 (1994); Chou, J. y Roizman, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)). La infección de células de origen neuronal con mutantes incapaces de expresar \gamma34.5 da como resultado la interrupción de la síntesis de proteínas celulares, con la limitación resultante de la producción viral.
Un aspecto crítico del presente estudio era mostrar la restauración de la función de \gamma34.5 mediante el control transcripcional del promotor B-myb. Esto se realizó demostrando que la infección de células con MGH1 y MybRevt daba como resultado la supresión de la síntesis de proteínas, mientras que la síntesis de proteínas se restauraba cuando Myb34.5 era el virus infeccioso. Una evidencia adicional de la nueva dependencia transcripcional con B-myb de la función de \gamma34.5 con el ciclo celular fue proporcionada por los experimentos de represión con lovastatina. Estos mostraban claramente que bajo condiciones de represión del crecimiento, cuando la actividad transcripcional de
B-myb es mínima, las concentraciones de Myb34.5 eran similares a las de MGH1 y MybRevt y diferentes de las de la cepa F silvestre y hrR3. Sin embargo, cuando las células se estimulaban con suero, las concentraciones de Myb34.5 se incrementaban en tres órdenes de magnitud, aproximándose a las concentraciones observadas con cepas F y hrR3, mientras que las concentraciones de los mutantes \gamma34.5 (MGH1 y MybRevt) se incrementaban solo ligeramente. Era notable que el nivel basal de replicación de Myb34.5 era inferior que el de hrR3 en células quiescentes y era más cuantitativamente similar al del MGH1 mutante RR\gamma34.5. Myb34.5 demostraba una inducción de más veces de la replicación en células sometidas a ciclo que hrR3, mientras que MGH1 y MybRevt mostraban una inducción mínima, sugiriendo que los efectos del constructo Myb34.5 superaban el efecto de la complementación simple de ribonucleótido reductasa.
Estos resultados confirman la hipótesis de que el promotor B-myb restringe la replicación viral en células quiescentes y redirige la replicación viral a células sometidas a ciclo. En el contexto de la terapia de tumores cerebrales, Myb34.5 se replicaría así a niveles relativamente bajos (similares a los niveles observados con MGH1) en células que son quiescentes, pero la infección de células tumorales cerebrales que se dividen produciría un incremento significativo en las concentraciones virales, proporcionando así una ventaja terapéutica sobre MGH1 u otros mutantes \gamma34.5. La infección de células cerebrales normales puede producirse con mutantes \gamma34.5 (Kesari, S. y otros, J. Gen. Virol. 79:525-536 (1998); Kesari, S. y otros, J. Neurosci. 16:5644-5653 (1996); Markovitz, N.S. y otros, J. Virol. 71:5560-5569 (1997)) y se esperaría que la acción de Myb34.5 imitara la de estos mutantes en células neurales infectadas quiescentes. De hecho, los presentes estudios in vitro e in vivo muestran que la replicación de Myb34.5 en neuronas cultivadas y en los cerebros de ratones es similar a la de los virus mutantes \gamma34.5 (MGH1, MybRevt y R3616) y diferente de la de la cepa F silvestre y hrR3.
Una explicación alternativa puede ser que los efectos observados de Myb34.5 se deben a la substitución de los dos genes \gamma34.5 endógenos por un solo gen \gamma34.5, y por el uso de un promotor (B-myb) que es más débil que el promotor de \gamma34.5 de HSV y cuyas características de regulación estricta del ciclo celular están perturbadas en el contexto del genoma de HSV. Aunque la exclusión formal de esta posibilidad requeriría una experimentación adicional intensiva con promotores B-myb mutantes, se cree que sigue siendo improbable en vista de los datos experimentales actuales. Si esta explicación fuera cierta, entonces se podría predecir: (i) la replicación de Myb34.5 en células quiescentes sería superior que la de mutantes de deleción de \gamma34.5 debido a la expresión de bajo nivel del gen \gamma34.5 por un promotor B-myb desregulado en los primeros mutantes; (ii) la inhibición de la interrupción de síntesis de proteínas huésped observada en células de neuroblastoma infectadas con Myb34.5 (Fig. 2) sería menos pronunciada que la observada en células infectadas con F o hrR3 debido a una expresión inferior del gen \gamma34.5 simple con un promotor más débil en comparación con la expresión robusta alcanzada por los dos genes \gamma34.5 conducidos por el promotor de HSV endógeno; (iii) la replicación de Myb34.5 en células U373, que se sabe que restringe intensamente la replicación de mutantes \gamma34.5 (Mohr, I. y Gluzman, Y. EMBO J. 15:4759-4766 (1996)), también estaría algo restringida por la expresión más débil del gen \gamma34.5 en Myb34.5 en comparación con la de F o hrR3; y (iv) la diferencia en la replicación entre células quiescentes y sometidas a ciclo sería superior para la cepa hrR3 o F (que expresa dos copias de \gamma34.5 conducidas por el promotor de HSV endógeno) que para Myb34.5 (que expresa una copia de \gamma34.5 conducida por un promotor B-myb desregulado).
Los datos experimentales en este Ejemplo no están de acuerdo con las predicciones mencionadas previamente. La explicación más probable para los resultados observados es que el promotor B-myb permanezca regulado de un modo relativamente estrecho incluso en el contexto del genoma de HSV, conduciendo así a una expresión mínima, si la hay, de \gamma34.5 en células quiescentes y a niveles de expresión en células sometidas a ciclo y tumorales que parecen funcionalmente similares a los observados con cepas virales con función de \gamma34.5 intacta.
Se ha observado recientemente que los mutantes de HSV pueden transformarse mediante ingeniería para funcionar como vectores. Esto los permite expresar no solo funciones oncolíticas virales sino también efectos anticancerígenos adicionales, incrementando de ese modo su eficacia terapéutica (Chase, M. y otros, Nat. Biotechnol. 16:444-448 (1998)). Claramente, Myb34.5 también puede proporcionar un fundamento adecuado para la adición de genes anticancerígenos, tales como los que activan profármacos. A medida que se identifican promotores selectivos para tumores, sería relativamente fácil usar estos para controlar la expresión del gen \gamma34.5 u otros genes de virulencia para restringir adicionalmente la producción viral a células tumorales frente a normales. El sistema descrito aquí también puede usarse para restringir la virulencia a tipos de células específicos en un tejido, empleando promotores específicos para una célula.
El promotor B-myb contiene un sitio de unión a E2F de consenso, está estrictamente regulado en células sometidas a ciclo y de hecho se expresa en G_{0} (Lam, E.W. y Watson R.J., EMBO J. 12:2705-2713 (1993); Lam, E.W. y otros, Gene 160:277-281 (1995); Bennet, J.D. y otros, Oncogene 13:1073-1082 (1996)). Un adenovirus defectuoso con respecto a la replicación que contiene un promotor sensible a E2F se ha usado para demostrar la expresión génica específica para un tumor, con relación no solo a tejido neuronal quiescente sino también a células sometidas a ciclo normales no transformadas (Parr, M.J. y otros, Nat. Med. 3:1145-1149 (1997)). La alteración de alguna porción de la ruta p16/retinoblastoma/cdk4 reguladora del ciclo celular, que regula E2F, parece ser un hecho casi universal en gliomas humanos así como muchos otros tipos de tumores, y proporciona un substrato excelente para elegir la expresión específica para un tumor de productos génicos virales (He, J. y otros, Cancer Res. 54:5804-5807 (1994); Ueki, K. y otros, Cancer Res. 56:150-153 (1996)).
Se ha descrito otro mutante de HSV-1 en el que se empleaba un promotor de albúmina para regular la expresión de ICP4 hacia hepatocitos (Miyatake, S. y otros, J. Virol. 71:5124-5132 (1997)). La diferencia principal con la estrategia descrita en el presente informe es el uso de un promotor que puede considerarse específico para un tumor o el ciclo celular en lugar de específico para hepatocitos, y el uso de un gen de HSV que está directamente relacionado con la virulencia (\gamma34.5) en lugar de un factor de transcripción esencial, tal como ICP4. En contraste con muchos vectores virales bajo investigación para el tratamiento del glioblastoma, el virus ejemplificado, denominado Myb34.5, es competente con respecto a la replicación y la virulencia elegida se obtiene regulando la replicación viral y la oncolisis directa. A este respecto, Myb34.5 representa un nuevo herpesvirus oncolítico elegido y se suma a dos adeno- y reo-virus oncolíticos selectivos para tumores descritos recientemente (Bischoff, J.R. y otros, Science 274:373-376 (1996); Coffey, M.C. y otros, Science 282:1332-1334 (1998)). El adenovirus defectuoso con respecto a E1B ONYX-015 se cree que depende de alteraciones en la ruta supresora de tumores p53 para una replicación eficaz en células tumorales, aunque este mecanismo se ha puesto en cuestión recientemente (Goodrum, F.D. y otros, J. Virol. 72:9479-9490 (1998)).
Se ha observado que una cepa de reovirus se replica selectivamente en células con una ruta ras activada (Coffey, M.C. y otros, previamente). Myb34.5 puede beneficiarse de alteraciones de la ruta p16/cdk4/RB/E2F y se suma a la posibilidad de que puedan elegirse múltiples alteraciones genéticas tumorales mediante diferentes estrategias de tratamiento viral. La estrategia de usar promotores específicos para una célula o específicos para un tumor para conducir la expresión del gen \gamma34.5 puede ser adecuada como un medio para eliminar poblaciones celulares seleccionadas in vivo. Finalmente, el hallazgo de la seguridad incrementada combinada con una eficacia antitumoral potente sugiere que Myb34.5 es un excelente candidato para el tratamiento de tumores malignos.
Se entiende que las modificaciones de los modos descritos previamente para llevar a cabo la invención, que son obvias para los expertos en medicina, virología, biología molecular, inmunología, farmacología y/o campos relacionados, están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica de la que trata esta invención. Todas las publicaciones y patentes se incorporan aquí mediante referencia en la misma extensión que si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorporaba mediante referencia.
Aunque la invención precedente se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, será obvio que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

1. Un mutante viral herpético que comprende:
(a) una deleción o mutación inactivante en ambas copias del gen que codifica \gamma34.5; y
(b) una inserción de al menos una copia del gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de un promotor específico para una célula y/o específico para un tumor.
2. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus herpético es virus del herpes simple tipo 1.
3. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus herpético es virus del herpes simple tipo 2.
4. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además al menos una deleción o mutación inactivante endógena adicional de un gen viral herpético.
5. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además una deleción o mutación inactivante endógena adicional de un gen viral herpético.
6. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha deleción o mutación inactivante endógena de un gen viral herpético es un gen que codifica ribonucleótido reductasa (RR), timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) o dUTPasa.
7. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que comprende además un transgén cuyo producto es citotóxico para células neoplásticas.
8. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho transgén codifica un producto capaz de activar o potenciar un agente quimioterapéutico, un gen de citoquina, un gen supresor de tumores o un gen tumoricida seleccionado del grupo que consiste en toxina de la difteria, toxina de pseudomonas, genes antiangiogénesis, genes de vacunación de tumores, genes de radiosensibilidad, RNA antisentido o ribozimas.
9. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho transgén está insertado en la deleción de \gamma34.5 original o en cualquier lugar del locus UL40 herpético.
10. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho transgén codifica un gen suicida que activa un agente quimioterapéutico.
11. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho gen suicida es citocromo P450 de mamífero.
12. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho citocromo P450 de mamífero es P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 o P450 3A4.
13. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho promotor específico para un tumor es DF3 (MUC1); AFP, CEA PSA; tirosinasa, B-myb o c-erbB2.
14. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho promotor específico para un tumor es B-myb.
15. El mutante viral herpético Myb34.5.
16. El mutante viral herpético de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho promotor específico para una célula es promotor del receptor (flk1) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales; promotor de insulina expresado en células beta del páncreas; gen receptor de la hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo; promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteoclastos y queratinocitos; receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas o promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas.
17. El uso de un mutante viral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 ó 13-15, en la fabricación de un medicamento para destruir selectivamente células neoplásticas que sobreexpresan un promotor específico para un tumor conocido.
18. El uso de un mutante viral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la fabricación de un medicamento para destruir selectivamente células neoplásticas que sobreexpresan un promotor específico para un tumor conocido.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho citocromo P450 es P450 2B1.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en el que dicho agente quimioterapéutico es ciclofosfamida o ifosfamida.
21. El uso de un mutante viral herpético, que comprende:
(a) una deleción o mutación inactivante en un gen que codifica \gamma34.5; y
(b) una inserción de al menos una copia de dicho gen \gamma34.5 bajo el control transcripcional de dicho promotor específico para una célula, de modo que dicho promotor conduzca la expresión de dicho gen \gamma34.5; en la fabricación de un medicamento para eliminar selectivamente una población de células diana que sobreexpresa un promotor específico para una célula conocido.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicho mutante viral herpético comprende además al menos una deleción o mutación inactivante endógena adicional de un gen viral herpético.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicha deleción o mutación inactivante endógena adicional de un gen viral herpético es en un gen que codifica ribonucleótido reductasa (RR), timidina quinasa (TK), uracilo DNA glicosilasa (UNG) o dUTPasa.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho promotor específico para una célula es: promotor del receptor (flk1) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresado en células endoteliales; promotor de insulina expresado en células beta del páncreas; gen receptor de la hormona liberadora de gonadotropina expresado en células del hipotálamo; promotor de metaloproteinasa 9 de matriz expresado en osteoclastos y queratinocitos; receptor de hormona paratiroidea expresado en células óseas o promotor de dopamina beta-hidroxilasa expresado en neuronas noradrenérgicas.
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