CN116135972A - 基于中国hsv临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于中国HSV临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用。本发明公开了一种单纯疱疹病毒临床分离株HSV1‑CH007株，其保藏编号为CCTCCNO：V202173。该单纯疱疹病毒HSV1‑CH007分离自中国流行的HSV1临床株，通过筛选以其作为溶瘤病毒骨架，经改造和优化所构建的HSV溶瘤病毒更适宜中国肿瘤患者。以HSV1‑CH007作为溶瘤病毒亲本株，经减毒、肿瘤靶向复制、武装化治疗基因等系列遗传改造，构建获得基于HSV1‑CH007临床株的新型溶瘤病毒，该溶瘤病毒毒性低，复制效率、安全性和有效性高，能够高效溶杀实体瘤和转移瘤。

Description

基于中国HSV临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及病毒学、分子生物学及肿瘤学，具体涉及基于中国HSV临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用。
背景技术
近年来，肿瘤免疫疗法已逐渐成为继手术、化疗、放疗之后的第四大肿瘤治疗手段。溶瘤病毒作为一种新型肿瘤免疫生物疗法，为恶性肿瘤的治疗带来了新希望。溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)是一类天然或者经过人工修饰改造，特异在肿瘤细胞内复制杀伤肿瘤而不伤及正常细胞的病毒。溶瘤病毒主要通过直接杀伤肿瘤细胞、诱导机体抗肿瘤系统性免疫以及阻止肿瘤血管生成等多方面实现治疗肿瘤目的，具有杀伤效率高、毒副作用小、适应症广以及成本低等优势。另外，当其与免疫检查点抑制剂、放/化疗等联合应用时，具有协同效应，可进一步提高肿瘤治疗的效果，有着巨大的应用前景，成为未来肿瘤治疗的新方向。
利用病毒治疗肿瘤的概念已有100多年的历史。随着基因工程技术的不断发展，溶瘤病毒已经发展到第三代，如今有160多种不同的溶瘤病毒正在进行临床前及临床试验。全球基于十余类病毒载体在研发溶瘤病毒药物，根据基因组构成，OV载体可分为两大类：一类是DNA病毒载体，其包括腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒和细小病毒等；一类是RNA病毒载体，其包括呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、M1病毒和水疱型口炎病毒等。腺病毒和疱疹病毒是目前应用最多的两类溶瘤病毒载体。
2015年基于单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV1)载体的溶瘤病毒药物Imlygic(又名T-VEC)被美国FDA批准，作为黑色素瘤患者不可切除病灶的局部治疗方案。这是经过FDA批准的首个、也是唯一一个溶瘤病毒疗法，2016年在欧洲和加拿大也获批上市。2021年6月，日本第一三共株式会社的溶瘤HSV病毒产品G47Δ被日本厚生劳动省(MHLW)批准，用于治疗恶性胶质细胞瘤。两种oHSV溶瘤病毒的相继上市标志着溶瘤病毒技术的成熟，全球各大制药巨头纷纷通过收购或合作方式布局溶瘤病毒药物研发。
HSV-1在人群中广泛流行，主要引起口面部疱疹，高达90％的人在65岁时检测出血清HSV既往感染阳性。然而，HSV-1临床株(即从患唇疱疹个体中取样分离的病毒株)在进化生物学特性(如感染力、毒力、复制效率等)方面存在实质性的自然变异。目前全球基于单纯疱疹病毒开发溶瘤病毒多是选用典型的HSV-1“实验室”标准株如17+、KOS或F株，这些毒株已通过长期的连续传代弱化，或可能不是癌症治疗的最佳溶瘤病毒骨架。T-VEC最初是在将两个临床分离株与17+毒株进行比较后筛选的，两株临床株病毒对人肿瘤细胞的杀伤效果均优于17+毒株，其中最有希望的毒株JS1被筛选并构建转化为T-VEC。
目前溶瘤病毒行业尚存在技术瓶颈难题，如溶瘤病毒安全性、临床治疗实体瘤/转移瘤效果不佳、肿瘤靶向性弱、抗体中和作用、载体大规模制备效率低等。随着相关技术的快速发展，病毒载体层面的问题日益凸显，亟待攻关研制高效治疗实体瘤的新型溶瘤病毒，OV病毒载体的深度改造和优化仍是研发核心内容。而且国外HSV-1流行感染株和中国人群流行的HSV-1感染株势必不同、存在实质性的自然变异，所以构建更适合国人和增效的新型HSV溶瘤病毒具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种基于中国HSV临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用。
本发明提供一种单纯疱疹病毒HSV1-CH007株，其保藏编号为CCTCC NO：V202173。
本发明提供一种病毒载体，其通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。
进一步地，所述病毒载体在敲除的γ34.5基因座位插入外源基因表达盒；或，
所述病毒载体在其基因组任何插入不影响功能的位点插入外源基因表达盒；
所述外源基因表达盒中的外源基因选自表达任意目的蛋白的基因。
本发明提供所述的病毒载体在病毒学基础研究、大携载容量病毒载体、溶瘤病毒、目的基因递送、神经系统靶向基因治疗药物、动物感染模型建立或抗病毒药物筛选中的应用。
本发明提供一种溶瘤病毒载体，其通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到靶向肿瘤细胞内复制的重组病毒。
进一步地，在敲除的γ34.5基因座位插入肿瘤治疗序列基因表达盒，进一步增强溶瘤效果；或，
所述在溶瘤病毒载体基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒，进一步增强溶瘤效果；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因选自免疫检查点蛋白抗体基因、肿瘤免疫治疗细胞因子基因和免疫调控增强基因中的一种或以上；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因表达盒包含启动子和肿瘤治疗序列基因；
优选地，在肿瘤治疗序列基因下游引入WPRE增强表达元件；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因为免疫检查点蛋白PD1抗体基因；
优选地，在敲除的γ34.5基因座位还插入荧光蛋白表达盒，便于重组病毒筛选及在体感染标记指示，所述荧光蛋白表达盒的转录方向与所述肿瘤治疗序列基因表达盒保持一致。
本发明提供一种溶瘤病毒，其包含所述的溶瘤病毒载体。
本发明提供一种抗肿瘤药物组合物，包含所述的溶瘤病毒。
本发明提供一种溶瘤病毒载体的构建方法，包括，敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因；
优选地，还包括在敲除的γ34.5基因座位或基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒。
本发明提供一种溶瘤病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)靶向载体构建
克隆γ34.5基因上下游同源臂，将克隆的上下游同源臂片段连入骨架载体，获得重组载体1；构建包括启动子(如hUbC、CMV启动子等)、绿色荧光蛋白基因和WPRE片段的EGFP表达盒(WPRE为土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，用于增强外源基因表达水平)，连入重组载体1，获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体；
优选地，还包括在重组载体1插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：构建包括启动子(如hUbC、CMV启动子等高效启动转录的启动子)、肿瘤治疗序列基因(PD1单链抗体基因)和红色荧光蛋白mCherry基因通过自剪切肽(2A)绑定表达的肿瘤治疗序列基因表达盒，替换表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体的EGFP表达框，获得表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体；
(2)溶瘤病毒构建
将敲除γ34.5基因表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体与HSV1-CH007株基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，挑斑绿色荧光的病毒嗜斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得表达绿色荧光蛋白的重组病毒；
优选地，插入肿瘤治疗序列基因的溶瘤病毒的构建，方法包括：将表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体与表达绿色荧光蛋白的重组HSV1-CH007株病毒基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，在绿色荧光背景下挑斑红色荧光的病毒斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得。
进一步地，本发明上述溶瘤病毒的构建方法，包括如下步骤：
(1)靶向载体构建
克隆临床株HSV1-CH007γ34.5基因上下游同源臂片段，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长440bp，GC含量78％)(SEQ ID NO.1)，下游同源臂(DHA，长500bp，GC含量68％)(SEQ ID NO.2)，将克隆的上下游同源臂片段以infusion技术连入基于pcDNA3.1+骨架构建的3.1+ΔRL1载体(实验室自主构建)，克隆上下游同源臂片段选择的酶切位点分别为MluI和AgeI对，SbfI和XbaI对，在克隆的上下游同源臂中间引入一个多克隆位点接头，引入的6种内切酶分别是-AgeI-ClaI-EcoRI-EcoRV-KpnI-PacI-SbfI-，便于后续克隆外源基因或表达控制元件等插入靶向载体，获得的质粒载体命名为pHSV-CH007Δγ34.5。
以实验室自主构建的含hUbC-3EGFP表达框序列的质粒为模板，克隆三个绿色荧光基因串联的真核表达框片段hUbC-3EGFP(SEQ ID NO.3)，以及WPRE-bGH PA片段(SEQ IDNO.4)，hUbC是选用的启动活性强的泛素启动子，hUbC-3EGFP片段(长度3538bp)经ClaI、KpnI酶切连入pHSVCH007Δγ34.5载体获得pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体；WPRE-bGH PA片段(长度846bp)经KpnI、PacI酶切连入pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体，从而构建获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA载体(SEQ ID NO.5)。
优选地，还包括插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：
合成肿瘤治疗序列基因序列，例如可以为表达PD1抗体(αPD1Ab)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。选择FUGW质粒(Addgene编号14883)作为重组靶向载体的构建骨架，此轮重组以hUbC启动子片段和WPRE片段作为同源臂，可替换掉上述靶向质粒载体中的3EGFP序列；合成PD1抗体的基因序列(αPD1)(SEQ ID NO.6)，通过自剪切肽P2A和红色荧光蛋白(mCherry)基因(SEQ ID NO.7)串联获得表达框mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ IDNO.8)；该表达框片段(长度1599bp)通过Infusion方法克隆入经BamHI、EcoRI双酶切的FUGW质粒，替换掉原来的EGFP荧光基因，获得重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ IDNO.9)。
(2)溶瘤病毒构建
将pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA与HSV1-CH007株基因组DNA共转染293T细胞，待大部分细胞表现出细胞病变后，收集细胞和上清，用离心后的细胞裂解液或上清感染Vero细胞，在细胞上覆盖含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的DMEM维持培养基，1天后观察感染细胞有无荧光表达确定新型病毒是否重组成功；2-3天后，挑斑分离良好的表达绿色荧光的病毒嗜斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮挑斑纯化，经过6轮嗜斑挑斑、单克隆纯化，完全去除无荧光表达的野生型临床株HSV1-CH007病毒，获得纯化的溶瘤病毒HSV CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE；
优选地，插入肿瘤治疗序列基因的溶瘤病毒的构建，方法包括：
将重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab与所述溶瘤病毒HSV CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE基因组DNA共转染293T细胞，待大部分细胞出现细胞病变后，收集细胞和病毒上清，感染Vero细胞，去除上清液，并上铺含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的培养基，2-3天后挑斑分离良好的表达红色荧光的嗜斑，即绿色背景视野中挑取红色荧光斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮纯化，经过5轮挑斑、单克隆纯化，完全去除表达绿色荧光蛋白的HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP母本病毒，获得单克隆化的携带肿瘤治疗序列基因序列的溶瘤病毒HSV CH007-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-肿瘤治疗序列基因序列-WPRE。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH007分离自国内流行的HSV1临床株，而非国外引进的传代很多次的常见实验室标准株，以中国临床分离株HSV1-CH007作为溶瘤病毒骨架，经改造和优化所构建的HSV溶瘤病毒更适宜中国人肿瘤患者治疗。
(2)本发明以HSV1-CH007作为OV亲本株，经减毒、肿瘤靶向复制、武装化治疗基因等系列遗传改造，构建获得基于HSV1-CH007的溶瘤病毒，构建得到的溶瘤病毒复制效率高，能够高效溶杀实体瘤和转移瘤。在HSV1-CH007溶瘤病毒基因组中插入表达PD1抗体(αPD1Ab)的基因，溶瘤病毒感染裂解肿瘤细胞的同时，病毒会直接表达免疫检查点蛋白抑制剂，达到溶瘤+免疫激活的协同杀瘤效应。体外和体内实验表明研制的oHSV-CH007溶瘤病毒具有良好的肿瘤细胞感染效率和溶瘤效果。
(3)本发明敲除HSV1-CH007病毒株最主要的神经毒力基因γ34.5后，可作为一种低毒、大容量的基于HSV临床株的外源基因长效高表达的基因递送病毒载体，可实现外源基因的高效转导及高丰度表达。
(4)本发明基于HSV1-CH007临床株改造的病毒载体适于做溶瘤病毒、外源基因长效高表达的基因递送载体等。另外低毒HSV1-CH007载体在神经系统靶向基因治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立、抗病毒药物筛选等方面具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为HSV1-CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE基因组结构示意图；
图2为HSV1-CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE病毒重组、挑斑纯化的细胞图；
图3为构建的条件复制型HSV1-CH007重组病毒基因组分子鉴定；
图4为条件复制型HSV1-CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE溶瘤病毒骨架载体裂解肿瘤细胞效果分析；
图5为构建的溶瘤病毒oHSV CH007-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab-WPRE(简写为oHSV CH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry)的基因组结构示意图；
图6为oHSV CH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒重组挑斑及纯化的细胞图；
图7为oHSV CH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒的在体毒性测试；
图8为U87MG-GFP恶性胶质瘤细胞株构建、纯化及外源荧光蛋白表达情况；
图9为构建U87MG-GFP恶性胶质瘤颅内荷瘤小鼠模型；
图10为oHSV CH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒能有效感染和溶杀恶性胶质瘤组织。
保藏说明
筛选出来的单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH007，经单克隆纯化后的低传代株野生型病毒按要求和规定数量于2021年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学。HSV1-CH007分类命名为单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH007，保藏编号为CCTCCNO：V202173。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：单纯疱疹病毒临床株HSV1-CH007的分离、筛选
1、HSV临床株的分离与鉴定
我们通过与武汉大学人民医院、中国人民解放军中部战区总医院等临床医院皮肤科医生合作，从门诊口面部疱疹患者采样疱疹水疱液，经过培养、纯化、鉴定分离到18株HSV1型临床病毒株。通过克隆病毒gD、gB基因并测序，和从国外引进的F株、H129临床株比对基因序列均存在一定的碱基突变，而且分离的临床株间基因也存在差异，体现在进化生物学特性(如感染力、毒力、复制效率等)会存在差异，表明从中国健康人群分离的HSV临床株中比较和筛选溶瘤病毒亲本株很有必要。
2、HSV临床株的比较和筛选
我们从临床株筛选溶瘤病毒骨架载体的原则如下：①健康人群口面部疱疹来源；②基因型测序鉴定为HSV1型；③感染肿瘤细胞裂解活性高；④对阿昔洛韦敏感、无耐药性。通过系统比较临床毒株的复制效率、细胞毒性、裂解肿瘤细胞活性等，筛选出临床株CH007作为备选亲本株。单纯疱疹病毒临床株HSV1-CH007的保藏编号为CCTCC NO：V202173。
分离的HSV1临床株野生型病毒毒性还较大，经扩增纯化后颅内注射小鼠在3-5天内全部死亡。为研制溶瘤病毒药物，首先需要对HSV1临床株进行减毒和靶向复制改造等建立安全性的病毒载体。为开发更高效溶杀实体瘤的新型溶瘤病毒，设计集成采用中国临床病毒株、删除致病基因、免疫增强因子武装、携载免疫检查点蛋白抗体等多种增效策略，来研制高效溶杀实体瘤和转移瘤的增效oHSV。
实施例2：肿瘤靶向、条件复制型HSV1-CH007重组改造的靶向载体构建
(1)双拷贝神经毒力基因γ34.5敲除的靶向载体构建
敲除双拷贝γ34.5基因：克隆测序临床株HSV1-CH007γ34.5基因及其上下游序列，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长440bp，GC含量78％)(SEQ ID NO.1)，下游同源臂(DHA，长500bp，GC含量68％)(SEQ ID NO.2)；克隆的上下游同源臂片段以及荧光蛋白表达盒片段利用infusion技术连入基于pcDNA3.1+骨架构建的3.1+ΔRL1载体；克隆上下游同源臂片段时选择的酶切位点分别为MluI和AgeI对，SbfI和XbaI对，获得的质粒载体命名为pHSV-CH007Δγ34.5。该载体在克隆的上下游同源臂中间引入一个多克隆位点接头，引入的6种内切酶分别是-AgeI-ClaI-EcoRI-EcoRV-KpnI-PacI-SbfI-，便于后续克隆外源基因或表达控制元件等插入靶向载体。
具体步骤如下：
首先，分别使用以下引物扩增γ34.5UHA和DHA片段：
UHA-F：gtacgggccagatatacgcgtCGGGGCCGCGGGAGCGGGgggaggagc，
UHA-R：TtaacccatcgatggaccggtGGAGACAGAGAGCGTGCCGgggtggtag；
DHA-F：aatccttaattaaggcctgcaggCGTTACACCCGAGGCGGCctgggtcttc，
DHA-R：ggtttaaacgggccctctagaCGGGCCAATGCGCGAGGGgccgtgtg。
多片段重组使用的是来自南京诺唯赞公司的多片段infusion试剂盒。将获得的载体命名为pHSV-CH007Δγ34.5。
(2)携载绿色荧光蛋白基因表达盒的重组靶向载体构建
以实验室自主构建的含hUbC-3EGFP表达框序列的质粒为模板，克隆三个绿色荧光基因串联的真核表达框片段(hUbC-3EGFP)(SEQ ID NO.3)，以及WPRE-bGH ploy(A)片段(SEQ ID NO.4)，hUbC是选用的启动活性强的泛素启动子。hUbC-3EGFP片段(长度3538bp)经ClaI、KpnI酶切连入pHSV-CH007Δγ34.5载体获得pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体；WPRE-bGH PA片段(长度846bp)经KpnI、PacI酶切连入pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体，从而构建获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA载体(SEQ ID NO.5)。
实施例3：肿瘤靶向、条件复制型HSV1-CH007溶瘤病毒重组、挑斑纯化
双拷贝神经毒力基因γ34.5完全敲除、携带表达EGFP的HSV1-CH007重组病毒构建：
为了获得病毒基因组中最主要神经毒力基因γ34.5双拷贝完全敲除的HSV1-CH007重组株，我们抽提靶向载体pHSV-CH007Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE与临床株病毒HSV1-CH007基因组DNA共转染培养在六孔板中的293T细胞，实验方法按照Lipofectamine2000(Invitrogen)说明书进行：待大部分细胞表现出细胞病变后，收集培养基，用PBS收集细胞。经三轮冷冻-震荡-涡旋后，用上清和细胞裂解液分别感染六孔板中的Vero细胞。感染1小时后，去除上清液，在细胞上覆盖含有2％胎牛血清、1％抗生素和1％琼脂糖的DMEM维持培养基。1天后观察感染细胞有无荧光表达确定新型病毒是否重组成功，2-3天后，挑斑分离良好的表达绿色荧光的病毒嗜斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮挑斑纯化。经过6轮嗜斑挑斑、单克隆纯化，完全去除无荧光表达的野生型临床株HSV1-CH007病毒，获得纯化的重组病毒HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE，病毒基因组示意图如图1，病毒重组挑斑及完全纯化的细胞图如图2所示，上排为重组病毒斑(绿色荧光)的荧光图和明场图；下排为重组病毒完全挑纯后的感染细胞荧光图及明场图。
实施例4：HSV1-CH007重组病毒的扩增制备
纯化后的HSV1-CH007重组溶瘤病毒通过感染生长在10cm平皿上的Vero细胞进行批量生产及纯化。将HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组OV载体按照MOI＝0.01感染Vero细胞，待细胞出现明显的变圆病变之后(大约3天)，将含病毒的上清液收集到50mL离心管中，通过离心去除细胞碎片(6400rpm，10分钟)，上清液使用0.22μm的滤膜过滤，最后使用贝克曼高速离心机进行浓缩(30000rpm，3小时)；将浓缩后的病毒沉淀使用少量PBS(PH＝7.4)重悬，在4℃条件下过夜，并不断摇动；第2天混匀病毒液，接着将重悬的病毒溶液加到20％的蔗糖溶液上层进行超速离心(30000rpm，3小时)、浓缩纯化；最后将溶解后的病毒进行分装，冻存在-80℃冰箱中。使用Vero细胞进行标准嗜斑实验来测定浓缩后HSV CH007重组病毒的滴度，滴度以每毫升的嗜斑形成单位(PFU/mL)表示。浓缩后的HSV1CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组OV病毒滴度经测定约为5×109PFU/mL。
实施例5：条件复制型HSV1-CH007重组病毒基因组分子鉴定
取浓缩纯化的HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组病毒(图3中简写CH007Δ3-G)、野生型wt CH007病毒(阳性对照)，以我们前期基于HSV1 H129株构建的γ34.5双拷贝基因已完全敲除的H306病毒(参看发表论文J Chem Neuroanat.2019；100:101662.doi:10.1016/j.jchemneu.2019.101662)作为阴性对照，在100℃灭活10分钟，后续用于γ34.5基因的分子鉴定。以γ34.5ORF片段(726bp)设计引物，引物序列为γ34.5-F：5'ATGGCCCGCCGCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGG 3'(SEQ ID NO.10)；γ34.5-R：5'TTAGACCGAGTTCGCCGGGCCGGCTCCGCGGGCCAGGGCCCGGGC 3'(SEQ ID NO.11)。由于γ34.5基因GC含量高达82％，需选用高GC buffer体系扩增γ34.5ORF基因片段：PCR反应体系为50ul，其中灭活病毒样用量为1-5μl，2×PrimeStar high-GC buffer25μl，20μM/μl引物各0.7μl，dNTPs 5μl，Prime star HS高保真酶0.6μl，补灭菌水到50μl。PCR扩增条件为：98℃5min，(98℃30s，60℃30s，72℃1min)循环32次，72℃延伸10min，16℃30min。分子鉴定结果如图3所示，阳性对照为野生型HSV1-CH007病毒，经PCR扩增出一条长700bp左右的γ34.5基因目的条带；阴性对照(H306)无条带；而HSV1-CH007重组病毒HSV CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE(图中简写CH007Δ3-G)多次重复实验无论选用1μl、3μl、5μl浓缩病毒进行PCR反应均未扩增出γ34.5目的条带，结果说明HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组溶瘤病毒基因组中的双拷贝γ34.5基因已被完全敲除。
实施例6：肿瘤靶向、条件复制型HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP溶瘤病毒骨架溶瘤效果分析
HSV1-CH007临床株病毒通过遗传改造敲除最主要的神经毒力基因γ34.5，赋予了病毒在机体内只能靶向肿瘤细胞内复制扩增、裂杀肿瘤细胞的特性，而感染正常的机体细胞为复制缺陷型，不能增殖产生子代病毒。为检测构建的HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP溶瘤病毒骨架的溶瘤效果，将HSV1 CH007重组病毒感染常见的肿瘤细胞株进行测试，图4所示为体外培养的恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG以及溶瘤病毒感染裂解细胞的结果：没有感染病毒的U87MG恶性胶质瘤细胞胞体呈现聚团以及长而明显的细胞突起和胞间网络化形态；将制备的HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP溶瘤病毒按MOI＝0.01感染U87MG细胞，感染后12小时就能观察到肿瘤细胞感染重组病毒后表达绿色荧光蛋白，24小时观测大部分肿瘤细胞均被感染、胞体呈绿色荧光；第2天后肿瘤细胞出现明显的细胞病变，细胞突起萎缩变圆；到第3天U87MG细胞全部圆缩，大部分细胞已凋亡(图4)，结果表明基于临床分离的HSV1-CH007临床株改造构建的重组溶瘤病毒HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP能高效的感染并裂杀恶性肿瘤细胞。
实施例7：武装化PD1抗体基因的HSV1-CH007溶瘤病毒构建
目前应用溶瘤病毒开展的临床治疗或临床试验中均发现OV联合免疫检查点抑制剂给药具有协同效应，溶瘤病毒能实现更好的溶瘤效果。我们设计通过遗传改造使HSV溶瘤病毒基因组本身直接携带抗PD-1蛋白的抗体基因，这样oHSV溶瘤病毒感染裂解肿瘤细胞的同时可在肿瘤细胞内组成性表达PD-1蛋白抗体，从而达到联合用药的增效目的，且能降低成本、简化临床联合给药途径，溶瘤病毒复制增殖和免疫检查点抑制剂表达均在感染的肿瘤细胞内完成，能更好的靶向协同实现高效溶杀肿瘤目的。选择FUGW质粒(Addgene编号14883)作为重组靶向载体的构建骨架；合成PD1抗体的基因序列(αPD1)(SEQ ID NO.6)，通过自剪切肽P2A和红色荧光蛋白(mCherry)(SEQ ID NO.7)基因串联获得表达框mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ ID NO.8)；该表达框片段(长度1599bp)通过Infusion方法克隆入经BamHI、EcoRI双酶切的FUGW质粒，替换掉原来的EGFP荧光基因，获得重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ ID NO.9)。oHSV1-CH007基因组携载PD1抗体基因的溶瘤病毒构建步骤如下：将抽提的靶向载体pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab与上述构建的重组病毒HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP基因组DNA共转染293T细胞，质粒转染表达红色荧光蛋白，而病毒感染的细胞同时表达绿色荧光蛋白，如果重组成功mCherry-P2A-αPD1Ab基因序列会同源重组替换掉3EGFP基因，新重组病毒将只表达红色荧光蛋白；待大部分细胞出现细胞病变后，收集细胞和病毒上清。经三轮冷冻-震荡-涡旋后，感染六孔板的Vero细胞，1小时后去除上清液，并上铺含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的培养基。2-3天后挑斑分离良好的表达红色荧光的嗜斑，即绿色背景视野中挑取红色荧光斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮纯化。经过5轮挑斑、单克隆纯化，完全去除表达绿色荧光蛋白的HSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-3GFP母本病毒，获得单克隆化的携带PD1抗体基因的溶瘤病毒oHSV1 CH007-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab-WPRE(缩写为oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe)，病毒基因组示意图如图5，病毒重组挑斑及纯化的细胞图如图6所示。
实施例8：武装化PD1抗体基因的oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒的在体毒性测试
将构建的溶瘤病毒oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe大量扩增、纯化浓缩，经嗜斑实验测定制备的溶瘤病毒滴度为8×109PFU/ml。经颅内注射2×106PFU病毒感染小鼠VTA脑区，观察小鼠一直状态良好；14天后灌流小鼠、取脑组织切片观察，可见在注射脑区VTA和病毒经末梢吸收感染的脑区LH、LHb等都有很好的红色荧光标记，只在注射部位观察到有一定炎症反应，其它脑区标记到的神经元都状态良好(图7)。相对的HSV1-CH007野生型病毒感染小鼠症状明显、一周内小鼠全部死亡。实验表明通过自主技术构建的oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒具有低毒性、携载的外源抗体蛋白等得到高效表达，感染机体正常组织如神经元细胞溶瘤病毒为复制缺陷型，不会增殖传播致死动物。
实施例9：构建表达绿色荧光蛋白的人源恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG-GFP
为构建新型肿瘤荷瘤动物模型测试oHSVCH007溶瘤病毒效果，我们建立了人源肿瘤细胞株工程化改造技术。利用慢病毒会整合到宿主细胞基因组的特性来构建组成性表达目的蛋白的新型U87MG稳转细胞株；为便于新细胞系的流式细胞筛选纯化，首先构建并制备表达绿色荧光蛋白的慢病毒LentiV-hUbC-EGFP-WPRE；人源胶质母细胞瘤细胞株U87MG感染慢病毒后能稳定表达绿色荧光蛋白，经流式分选纯化后获得新型恶性胶质瘤细胞株U87MG-GFP；如图8所示，制备的工程化细胞株U87MG-GFP纯度很高，几乎所有细胞都稳定表达绿色荧光蛋白，而且细胞状态良好，和野生型U87MG一致，保种到基于U87MG工程化改造的胶质瘤细胞库。
实施例10：利用遗传改造的U87MG-GFP建立恶性胶质母细胞瘤动物模型
培养工程化改造的U87MG-GFP细胞株，制备对数生长期的肿瘤细胞悬液；通过脑立体定位方式移植接种于BALB/c裸鼠右侧大脑CPU脑区，接种剂量5微升，肿瘤细胞数量为1×106个；连续观察裸鼠移植胶质瘤后症状，利用小动物磁共振成像仪监测胶质瘤的成瘤状态。磁共振成像(MRI)扫描过程中，使用MSME(multi spin multi echo)T1-weight序列获得功能像。胶质瘤细胞株接种后第4周核磁扫描结果如图9所示，未注射肿瘤细胞的健康裸鼠无肿瘤核磁信号(图9A)，注射U87MG-GFP的裸鼠在CPU区域形成明显的肿瘤病灶(图9B)，说明胶质母细胞瘤荷瘤动物建模成功。
为进一步评估胶质瘤建模情况，第四周核磁扫描后小鼠进行心脏灌流和脑组织取材，冰冻切片得到脑组织切片；经DAPI染色处理后，利用OLYMPUS VS120全玻片扫描系统进行成像。如图9C所示，注射U87MG-GFP的裸鼠在CPU区域形成大而明显的实体肿瘤，因改造的胶质瘤细胞U87MG-GFP组成性表达绿色荧光蛋白，肿瘤组织呈现明亮的绿色荧光(图9C)。以上结果表明工程化改造的胶质瘤细胞株状态良好，在体移植造模脑肿瘤成功，为oHSV溶瘤病毒效果评价打下了坚实基础。
实施例11：oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒能高效溶杀恶性胶质母细胞瘤
我们将纯化制备的oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒在建立的恶性胶质瘤荷瘤动物模型上进行了测试。将上述工程化构建的人脑星形胶质母细胞瘤(WHO IV级)细胞株U87MG-GFP定位接种于BALB/c裸鼠皮层下CPU脑区，4周后经核磁共振检测小鼠大脑已成瘤、呈侵袭性生长(图9C)。制备的oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒通过瘤内给药方式注射到恶性胶质瘤瘤体内，14天后灌流裸鼠，取脑组织切片观察，发现oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒在胶质母细胞瘤体内能有效复制增殖，在病毒感染的肿瘤组织区域出现明显的组织空洞和凋亡炎症反应(图10)，结果说明基于中国临床分离株HSV1-CH007构建的新型溶瘤病毒oHSVCH007-Δγ34.5-αPD1Ab-mChe溶瘤病毒能高效溶杀恶性胶质母细胞瘤细胞，和注射PBS缓冲液的对照组荷瘤小鼠相比肿瘤组织体积明显缩小，验证了基于中国HSV临床分离株构建的增效溶瘤病毒具有良好的安全性和溶瘤活性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 基于中国HSV临床分离株的溶瘤病毒及其构建方法和应用
<130> CP121010893C
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggggccgcg ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 60
agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 120
agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 180
agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 240
agcgggggga ggagcggcca gaccccaaaa acgggccccc cccgaaacac accccccggg 300
ggtcgcgcgc ggccctttaa agcgcggcgg cgcagcccgg gccccccgcg gctagcgagt 360
tagacaggca agcactactc gcctctgcac gcacatgctt gcctgtcaaa ctctaccacc 420
ccggcacgct ctctgtctcc 440
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgttacaccc gaggcggcct gggtcttccg cggagctccc gggagctccg caccaagccg 60
ctctccggag agacgatggc aggagccgcg catatatacg ctgggagccg gcccgccccc 120
aaggcgggcc cgccctcgga gggcgggact ggccaatcgg cggccgccag cgcggcgggg 180
cccggccaac cagcgtttgc cgagtcttcg gggcccggcc cactgggcgg taactcccgc 240
ccagtgggcc gggccgccca cttcccggta tggtaattaa aaacttgcaa gaggccttgt 300
tccgcttccc ggtatggtaa ttagaaactc attaatgggc ggccccggcc gcccttcccg 360
cttccggcaa ttcccgcggc ccttaatggg caaccccggt attccccgcc tcccgcgccg 420
cgcgtaacca ctcccctggg gttccgggtt atgctaattg cttttttggc ggaacacacg 480
gcccctcgcg cattggcccg 500
<210> 3
<211> 3538
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
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tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 9960
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 10020
cacctgacgt c 10031
<210> 6
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggacatcg tgcgcaccca gacccccagc agcctggccg tgagcgtggg cgagaaggtg 60
accatgagct gcaagagcag ccagagcctg ctgtacagca gcaaccagaa gaactacctg 120
gcctggtacc agcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctactg ggccagcacc 180
cgcgagagcg gcgtgcccga ccgcttcacc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 240
agcatcagca gcgtgaaggc cgaggacctg gccgtgtact actgccagca gtactacaac 300
tactggacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagc gcgccgacgc cgcccccacc 360
gtgagcgaca tgcccatggc cgaccccaac cgcttccgcg gcaagaacct ggtgttccac 420
agcgagatca gcgaggtgaa gctggaggag agcggcggcg gcctggtgaa gctgggcggc 480
agcctgaagc tgagctgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcacctacta catgagctgg 540
gtgcgccaga cccccgagcg ccgcctggag ctggtggccg ccatcaacag caacggcggc 600
agcacctact accccgacac cgtgcagggc cgcttcacca tcagccgcga caacgccaag 660
aacaccctgt acctgcagat gagcagcctg cgcagcgagg acaccgccct gtacctgtgc 720
gccagcctgg acggcaaggg ctaccacttc gactactggg gccagggcac ccccctgacc 780
gtgagcagcg ccaagaccac cccccccagc gtgtactag 819
<210> 7
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711
<210> 8
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaaggg aagcggagct 720
actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctgctagc 780
atggacatcg tgcgcaccca gacccccagc agcctggccg tgagcgtggg cgagaaggtg 840
accatgagct gcaagagcag ccagagcctg ctgtacagca gcaaccagaa gaactacctg 900
gcctggtacc agcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctactg ggccagcacc 960
cgcgagagcg gcgtgcccga ccgcttcacc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 1020
agcatcagca gcgtgaaggc cgaggacctg gccgtgtact actgccagca gtactacaac 1080
tactggacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagc gcgccgacgc cgcccccacc 1140
gtgagcgaca tgcccatggc cgaccccaac aggttcaggg gcaagaacct ggtgttccac 1200
agcgagatca gcgaggtgaa gctggaggag agcggcggcg gcctggtgaa gctgggcggc 1260
agcctgaagc tgagctgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcacctacta catgagctgg 1320
gtgcgccaga cccccgagcg ccgcctggag ctggtggccg ccatcaacag caacggcggc 1380
agcacctact accccgacac cgtgcagggc cgcttcacca tcagccgcga caacgccaag 1440
aacaccctgt acctgcagat gagcagcctg cgcagcgagg acaccgccct gtacctgtgc 1500
gccagcctgg acggcaaggg ctaccacttc gactactggg gccagggcac ccccctgacc 1560
gtgagcagcg ccaagaccac cccccccagc gtgtactaa 1599
<210> 9
<211> 10795
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
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tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
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ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
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tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
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ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag 2760
aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg 2820
ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg 2880
agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac 2940
agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc 3000
gtcacttggt gagttgcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct 3060
cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag 3120
gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cacaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga 3180
atggaagacg cttgtaaggc gggctgtgag gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg 3240
gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga 3300
gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc 3360
gggtttgtcg tctggttgcg ggggcggcag ttatgcggtg ccgttgggca gtgcacccgt 3420
acctttggga gcgcgcgcct cgtcgtgtcg tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg 3480
cagggtgggg ccacctgccg gtaggtgtgc ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg 3540
gttcgggcct agggtaggct ctcctgaatc gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg 3600
gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga 3660
agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg 3720
caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa tatgtaattt tcagtgttag actagtaaat 3780
tgtccgctaa attctggccg tttttggctt ttttgttaga cgaagcttgg gctgcaggtc 3840
gactatagag gatccatggt gagcaagggc gaggaggata acatggccat catcaaggag 3900
ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag 3960
ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag 4020
ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag 4080
gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc 4140
ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac 4200
tcctccctgc aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc 4260
tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg 4320
taccccgagg acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc 4380
ggccactacg acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc 4440
ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc 4500
gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac 4560
aagggaagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 4620
cctggacctg ctagcatgga catcgtgcgc acccagaccc ccagcagcct ggccgtgagc 4680
gtgggcgaga aggtgaccat gagctgcaag agcagccaga gcctgctgta cagcagcaac 4740
cagaagaact acctggcctg gtaccagcag aagcccggcc agagccccaa gctgctgatc 4800
tactgggcca gcacccgcga gagcggcgtg cccgaccgct tcaccggcag cggcagcggc 4860
accgacttca ccctgagcat cagcagcgtg aaggccgagg acctggccgt gtactactgc 4920
cagcagtact acaactactg gaccttcggc ggcggcacca agctggagat caagcgcgcc 4980
gacgccgccc ccaccgtgag cgacatgccc atggccgacc ccaacaggtt caggggcaag 5040
aacctggtgt tccacagcga gatcagcgag gtgaagctgg aggagagcgg cggcggcctg 5100
gtgaagctgg gcggcagcct gaagctgagc tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcacc 5160
tactacatga gctgggtgcg ccagaccccc gagcgccgcc tggagctggt ggccgccatc 5220
aacagcaacg gcggcagcac ctactacccc gacaccgtgc agggccgctt caccatcagc 5280
cgcgacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgagca gcctgcgcag cgaggacacc 5340
gccctgtacc tgtgcgccag cctggacggc aagggctacc acttcgacta ctggggccag 5400
ggcacccccc tgaccgtgag cagcgccaag accacccccc ccagcgtgta ctaaggcgcg 5460
ccgaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 5520
tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 5580
ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 5640
ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 5700
ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 5760
ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 5820
cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 5880
aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 5940
ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 6000
cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 6060
gggccgcctc cccgcatcga taccgtcgac ctcgagacct agaaaaacat ggagcaatca 6120
caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca caagaggagg 6180
aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 6240
ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 6300
aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt 6360
ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca gatatccact gacctttgga tggtgctaca 6420
agctagtacc agttgagcaa gagaaggtag aagaagccaa tgaaggagag aacacccgct 6480
tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagta ttagagtgga 6540
ggtttgacag ccgcctagca tttcatcaca tggcccgaga gctgcatccg gactgtactg 6600
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 6660
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 6720
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 6780
gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 6840
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6900
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 6960
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 7020
gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 7080
cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 7140
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acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 7260
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 7320
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 7380
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cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 7620
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 7680
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 7740
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 7800
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 7860
cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc 7920
atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 7980
cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 8040
ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 8100
cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 8160
ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 8220
cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 8280
gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 8340
acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 8400
cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 8460
cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 8520
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 8580
caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 8640
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gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 9060
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 9120
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 9180
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 9240
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 9300
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cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 9420
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 9480
aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 9540
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ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 9900
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ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 10260
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 10320
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 10380
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tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 10500
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 10560
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gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgac 10795
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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Claims (10)

1.一种单纯疱疹病毒HSV1-CH007株，其保藏编号为CCTCC NO：V202173。
2.一种病毒载体，其特征在于，通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体在敲除的γ34.5基因座位插入外源基因表达盒；或，
所述病毒载体在其基因组任何插入不影响功能的位点插入外源基因表达盒；
所述外源基因表达盒中的外源基因选自表达任意目的蛋白的基因。
4.权利要求2所述的病毒载体在病毒学基础研究、大携载容量病毒载体、溶瘤病毒、目的基因递送、神经系统靶向基因治疗药物、动物感染模型建立或抗病毒药物筛选中的应用。
5.一种溶瘤病毒载体，其特征在于，通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。
6.根据权利要求5所述的溶瘤病毒载体，其特征在于，在敲除的γ34.5基因座位插入肿瘤治疗序列基因表达盒；或，
所述在溶瘤病毒载体基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因选自免疫检查点蛋白抗体基因、肿瘤免疫治疗细胞因子基因和免疫调控增强基因中的一种或以上；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因表达盒包含启动子和肿瘤治疗序列基因；
优选地，在肿瘤治疗序列基因下游引入WPRE增强表达元件；
优选地，所述肿瘤治疗序列基因为免疫检查点蛋白PD1抗体基因；
优选地，在敲除的γ34.5基因座位还插入荧光蛋白表达盒，所述荧光蛋白表达盒的转录方向与所述肿瘤治疗序列基因表达盒保持一致。
7.一种溶瘤病毒，其包含权利要求5或6所述的溶瘤病毒载体。
8.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包含权利要求7所述的溶瘤病毒。
9.一种溶瘤病毒载体的构建方法，其特征在于，敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH007株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因；
优选地，还包括在敲除的γ34.5基因座位或基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒。
10.一种溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)靶向载体构建
克隆γ34.5基因上下游同源臂，将克隆的上下游同源臂片段连入骨架载体，获得重组载体1；构建包括启动子、绿色荧光蛋白基因和WPRE片段的EGFP表达盒，连入重组载体1，获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体；
优选地，还包括在重组载体1插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：构建包括启动子、肿瘤治疗序列基因和红色荧光蛋白mCherry基因通过自剪切肽(2A)绑定表达的肿瘤治疗序列基因表达盒，替换表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体的EGFP表达框，获得表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体；
(2)溶瘤病毒构建
将敲除γ34.5基因表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体与HSV1-CH007株基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，挑斑绿色荧光的病毒嗜斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得表达绿色荧光蛋白的重组病毒；
优选地，插入肿瘤治疗序列基因的溶瘤病毒的构建，方法包括：将表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体与表达绿色荧光蛋白的重组HSV1-CH007株病毒基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，在绿色荧光背景下挑斑红色荧光的病毒斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得。
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