CN117264908A - 一种中国hsv临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中国HSV临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用。本发明公开了一种单纯疱疹病毒临床分离株HSV1‑CH003株，其保藏编号为CCTCCNO：V202210。该单纯疱疹病毒HSV1‑CH003分离自中国流行的HSV1临床株，通过筛选以其作为溶瘤病毒骨架，经改造和优化所构建的HSV溶瘤病毒更适宜中国肿瘤患者。以HSV1‑CH003作为溶瘤病毒亲本株，经减毒、肿瘤靶向复制、武装化治疗基因等系列遗传改造，构建获得基于HSV1‑CH003临床株的重组溶瘤病毒，该溶瘤病毒毒性低，复制效率、安全性和有效性高，能够有效溶杀实体瘤和转移瘤。

Description

一种中国HSV临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒学、分子生物学、神经生物学及肿瘤学、免疫学等，具体涉及一种中国HSV临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用，更具体地涉及一种中国HSV临床分离株、中国HSV临床分离株的应用、基于中国HSV临床分离株HSV1-CH003的溶瘤病毒及其构建方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫疗法已逐渐成为继手术、化疗、放疗之后的第四大肿瘤治疗手段。溶瘤病毒作为一种新型肿瘤免疫生物疗法，为恶性肿瘤的治疗带来了新希望。溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)是一类天然或者经过人工修饰改造，特异在肿瘤细胞内复制杀伤肿瘤而不伤及正常细胞的病毒。溶瘤病毒主要通过直接杀伤肿瘤细胞、诱导机体抗肿瘤系统性免疫以及阻止肿瘤血管生成等多方面实现治疗肿瘤目的，具有杀伤效率高、毒副作用小、适应症广以及成本低等优势。另外，当其与免疫检查点抑制剂、放/化疗等联合应用时，具有协同效应，可进一步提高肿瘤治疗的效果，有着巨大的应用前景，成为未来肿瘤治疗的新方向。

利用病毒治疗肿瘤的概念已有100多年的历史。随着基因工程技术的不断发展，溶瘤病毒已经发展到第三代，如今有160多种不同的溶瘤病毒正在进行临床前及临床试验。全球基于十余类病毒载体在研发溶瘤病毒药物，根据基因组构成，OV载体可分为两大类：一类是DNA病毒载体，其包括腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒和细小病毒等；一类是RNA病毒载体，其包括呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、M1病毒和水泡型口炎病毒等。腺病毒和疱疹病毒是目前应用最多的两类溶瘤病毒载体。

2015年基于单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV1)载体的溶瘤病毒药物Imlygic(Amgen公司产品，又名T-VEC)被美国FDA批准上市，作为黑色素瘤患者不可切除病灶的局部治疗方案。这是经过FDA批准的首个、也是唯一一个溶瘤病毒疗法，2016年在欧洲和加拿大也获批上市。2021年6月，日本第一三共株式会社的溶瘤HSV病毒产品G47Δ被日本厚生劳动省(MHLW)批准，用于治疗恶性胶质细胞瘤。两种oHSV溶瘤病毒的相继上市标志着溶瘤病毒技术的成熟，全球各大制药巨头纷纷通过收购或合作方式布局溶瘤病毒药物研发。

HSV-1在人群中广泛流行，主要引起口面部疱疹，国内高达90％的人在65岁时检测出血清HSV既往感染阳性。然而，HSV-1临床株(即从患唇疱疹个体中取样分离的病毒株)在进化生物学特性(如感染力、毒力、复制效率等)方面存在实质性的自然变异。目前全球基于单纯疱疹病毒开发的溶瘤病毒多是选用典型的HSV-1“实验室”标准株如17+、KOS或F株，这些毒株已通过长期的连续传代会被弱化，或可能不是溶瘤治疗的最佳病毒骨架。T-VEC最初是在将两个临床分离株与17+毒株进行比较后筛选的，两株临床株病毒对人肿瘤细胞的杀伤效果均优于17+毒株，其中最有希望的毒株JS1被筛选并构建转化为T-VEC。

目前溶瘤病毒行业尚存在技术瓶颈难题，如溶瘤病毒安全性、临床治疗实体瘤/转移瘤效果不佳、肿瘤靶向性弱、抗体中和作用、载体大规模制备效率低等。随着相关技术的快速发展，病毒载体层面的问题日益凸显，亟待攻关研制高效治疗实体瘤的新型溶瘤病毒，OV病毒载体的深度改造和优化仍是研发核心内容。基于国外HSV-1流行感染株和中国人群流行的HSV-1感染株势必不同、存在实质性的自然变异，所以筛选最适的病毒骨架来构建更适合国人和增效的新型HSV溶瘤病毒具有重要意义。

发明内容

为了解决溶瘤病毒开发现有技术中的不足，本发明旨在提供一种中国HSV临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用。

本发明提供一种单纯疱疹病毒HSV1-CH003株，其保藏编号为CCTCC NO：V202210。

本发明提供一种病毒载体，其通过首先敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。

进一步地，所述病毒载体在敲除的γ34.5基因座位插入外源基因表达盒；或，

所述病毒载体还包括在其基因组任何插入不影响功能的位点插入外源基因表达盒；

所述外源基因表达盒中的外源基因选自表达任意目的蛋白的基因。

本发明提供所述的病毒载体在病毒学基础研究、作为大携载容量病毒载体、作为溶瘤病毒、作为目的基因递送载体、作为神经系统靶向基因治疗药物、在动物感染模型建立或抗病毒药物筛选中的应用。

本发明提供一种重组溶瘤病毒，其通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到靶向肿瘤细胞内复制的重组病毒。

进一步地，重组溶瘤病毒载体还包括在敲除的γ34.5基因座位插入肿瘤治疗序列基因表达盒，进一步增强溶瘤效果；或，

所述溶瘤病毒载体基因组还包括在任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒，进一步增强溶瘤效果；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因选自免疫检查点蛋白抗体基因、肿瘤免疫治疗细胞因子基因和免疫调控增强基因中的一种或以上；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因表达盒包含启动子和肿瘤治疗序列基因；

优选地，在肿瘤治疗序列基因下游引入WPRE增强表达元件；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因为免疫检查点蛋白PD1抗体基因；

优选地，在敲除的γ34.5基因座位还插入荧光蛋白表达盒，便于重组病毒筛选及在体感染标记指示，所述荧光蛋白表达盒的转录方向与所述肿瘤治疗序列基因表达盒保持一致。

本发明进一步提供上述重组溶瘤病毒在制备治疗抗肿瘤药物中的用途；

优选地，所述肿瘤包括脑瘤、恶性胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、恶性黑素瘤、血液肿瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。

本发明提供一种抗肿瘤药物组合物，包含所述的重组溶瘤病毒。

本发明提供一种重组溶瘤病毒的构建方法，包括，敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因；

优选地，还包括在敲除的γ34.5基因座位或基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒。

本发明提供一种溶瘤病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)靶向载体构建

克隆γ34.5基因上下游同源臂，将克隆的上下游同源臂片段连入骨架载体，获得重组载体1；构建包括启动子(如hUbC、CMV启动子等)、绿色荧光蛋白基因和WPRE片段的EGFP表达盒(WPRE为土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，用于稳定和增强外源基因表达水平)，连入重组载体1，获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体；

优选地，还包括在重组载体1插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：构建包括启动子(如hUbC、CMV等高效启动转录的启动子)、肿瘤治疗序列基因(PD1单链抗体基因)和红色荧光蛋白mCherry基因通过自剪切肽(2A)绑定表达的肿瘤治疗序列基因表达盒，替换表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体的EGFP表达盒，获得表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体。

(2)重组溶瘤病毒构建

将敲除γ34.5基因表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体与HSV1-CH003病毒株基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，挑斑绿色荧光的病毒嗜斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得表达绿色荧光蛋白的重组病毒；

优选地，插入肿瘤治疗序列基因的重组溶瘤病毒的构建，方法包括：将表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体与表达绿色荧光蛋白的重组HSV CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE株病毒基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，在绿色荧光背景下挑斑红色荧光的病毒斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得。

进一步地，本发明上述溶瘤病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)靶向载体构建

克隆临床株HSV1-CH003γ34.5基因上下游同源臂片段，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长440bp，GC含量78％)(SEQ ID NO.1)，下游同源臂(DHA，长500bp，GC含量68％)(SEQ ID NO.2)，将克隆的上下游同源臂片段以infusion技术连入基于pcDNA3.1+骨架构建的3.1+ΔRL1载体(实验室自主构建)，克隆上下游同源臂片段选择的酶切位点分别为MluI和AgeI对，SbfI和XbaI对，在克隆的上下游同源臂中间引入一个多克隆位点接头，引入的6种内切酶分别是-AgeI-ClaI-EcoRI-EcoRV-KpnI-PacI-SbfI-，便于后续克隆外源基因或表达控制元件等插入靶向载体，获得的质粒载体命名为pHSV-CH003Δγ34.5。

以实验室自主构建的含hUbC-3EGFP表达框序列的质粒为模板，克隆三个绿色荧光基因串联的真核表达框片段hUbC-3EGFP(SEQ ID NO.3)，以及WPRE-bGH PA片段(SEQ IDNO.4)，hUbC是选用的启动活性强的泛素启动子，hUbC-3EGFP片段(长度3538bp)经ClaI、KpnI酶切连入pHSVCH003Δγ34.5载体获得pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体；WPRE-bGH PA片段(长度846bp)经KpnI、PacI酶切连入pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体，从而构建获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA载体(SEQ ID NO.5)。

优选地，还包括插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：

合成肿瘤治疗序列基因序列，例如可以为表达PD1抗体(αPD1Ab)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。选择FUGW质粒(Addgene编号14883)作为重组靶向载体的构建骨架，此轮重组以hUbC启动子片段和WPRE片段作为同源臂，可替换掉上述靶向质粒载体中的3EGFP序列；合成PD1抗体的基因序列(αPD1)(SEQ ID NO.6)，通过自剪切肽P2A和红色荧光蛋白(mCherry)基因(SEQ ID NO.7)串联获得表达框mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ IDNO.8)；该表达框片段(长度1599bp)通过Infusion方法克隆入经BamHI、EcoRI双酶切的FUGW质粒，替换掉原来的EGFP荧光基因，获得重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ IDNO.9)。

(2)重组溶瘤病毒构建

将pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA与HSV1-CH003病毒株基因组DNA共转染293T细胞，待大部分细胞表现出细胞病变后，收集细胞和上清，用离心后的细胞裂解液或上清感染Vero细胞，在细胞上覆盖含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的DMEM维持培养基，1天后观察感染细胞有无荧光表达确定新型病毒是否重组成功；2-3天后，挑斑分离良好的表达绿色荧光的病毒嗜斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮挑斑纯化，经过5轮嗜斑挑斑、单克隆纯化，完全去除无荧光表达的野生型临床株HSV1-CH003病毒，获得纯化的溶瘤病毒HSV CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE；

优选地，插入肿瘤治疗序列基因的重组溶瘤病毒的构建，方法包括：

将重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab与所述溶瘤病毒HSV CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE基因组DNA共转染293T细胞，待大部分细胞出现细胞病变后，收集病毒上清，离心后取少量感染Vero细胞，去除上清液，并上铺含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的培养基，2-3天后挑斑分离良好的表达红色荧光的嗜斑，即绿色背景视野中挑取红色荧光的病毒斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮纯化，经过5轮挑斑、单克隆纯化，完全去除表达绿色荧光蛋白的HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP母本病毒，获得单克隆化的携带肿瘤治疗序列基因序列的溶瘤病毒HSV CH003-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-肿瘤治疗序列基因序列-WPRE。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH003是通过和临床医院合作从门诊唇疱疹患者采样分离获得，经筛选具备良好的病毒骨架性能，而非国外引进的传代次数不详的常见实验室标准株，以中国临床分离株HSV1-CH003作为溶瘤病毒骨架，经改造和优化所构建的HSV溶瘤病毒更适宜中国肿瘤患者人群治疗。

(2)本发明以HSV1-CH003作为OV亲本株，经减毒、肿瘤靶向复制、武装化治疗基因等系列遗传改造，构建获得基于HSV1-CH003的溶瘤病毒，经验证重组溶瘤病毒复制效率高，能够有效溶杀实体瘤和转移瘤。在HSV1-CH003溶瘤病毒基因组中插入表达PD1抗体(αPD1Ab)的基因，溶瘤病毒感染裂解肿瘤细胞的同时，病毒会直接表达免疫检查点蛋白抑制剂，达到溶瘤和免疫激活的协同杀瘤效应。体外和体内实验表明研制的oHSV-CH003溶瘤病毒具有良好的肿瘤细胞感染效率和溶瘤效果。

(3)本发明敲除HSV1-CH003病毒株最主要的神经毒力因子基因γ34.5后，可作为一种低毒、大容量的基于HSV临床株的外源基因长效高表达的基因递送病毒载体，可实现外源基因的高效转导及高丰度表达。

(4)本发明基于HSV1-CH003临床株改造的病毒载体适于做溶瘤病毒、外源基因长效高表达的基因递送载体等。另外低毒HSV1-CH003载体在神经系统靶向基因治疗、病毒复制与致病机理分析、动物感染模型建立、抗病毒药物筛选等方面具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为HSV1-CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE基因组结构示意图；

图2为HSV1-CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE病毒重组、挑斑纯化的细胞图；

图3为构建的条件复制型HSV1-CH003重组病毒基因组分子鉴定；

图4为条件复制型HSV1-CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE溶瘤病毒骨架载体裂解肿瘤细胞效果分析；

图5为构建的溶瘤病毒oHSV CH003-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab-WPRE(简写为oHSV CH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry)的基因组结构示意图；

图6为oHSV CH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒重组挑斑及纯化的细胞图；

图7为oHSV CH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒的在体毒性测试；

图8为U87MG-GFP恶性胶质瘤细胞株构建、纯化及外源荧光蛋白表达情况；

图9为构建U87MG-GFP恶性胶质瘤颅内荷瘤小鼠模型；

图10为oHSV CH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒能有效在体感染和溶杀恶性胶质瘤。

保藏说明

筛选出来的单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH003，经单克隆纯化后的低传代株野生型病毒按要求和规定数量于2022年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学。HSV1-CH003分类命名为单纯疱疹病毒中国临床分离株HSV1-CH003，保藏编号为CCTCC NO：V202210。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1：单纯疱疹病毒临床株HSV1-CH003的分离、筛选

1、HSV临床株的分离与鉴定

通过与武汉大学人民医院、中国人民解放军中部战区总医院等临床医院皮肤科医生合作，从门诊口面部疱疹患者采样疱疹水疱液，经过培养、纯化、鉴定分离到26株HSV1型临床病毒株。通过克隆病毒gD、gB基因并测序，和从国外引进的F株、H129临床株比对基因序列均存在一定的碱基突变，而且分离的临床株间基因也存在差异，体现在进化生物学特性(如感染力、毒力、复制效率等)会存在差异，表明从中国健康人群分离的HSV临床株中比较和筛选溶瘤病毒亲本株很有必要。

2、HSV临床株的比较和筛选

从临床株筛选溶瘤病毒骨架载体的原则如下：①健康人群口面部疱疹来源；②基因型测序鉴定为HSV1型；③感染肿瘤细胞裂解活性高；④对阿昔洛韦敏感、无耐药性。通过系统比较临床毒株的复制效率、细胞毒性、裂解肿瘤细胞活性等，筛选出临床株CH003作为备选亲本株。单纯疱疹病毒临床株HSV1-CH003的保藏编号为CCTCC NO：V202210。

分离的HSV1临床株野生型病毒毒性还较大，经扩增纯化后颅内注射小鼠在3-5天内全部死亡。为研制溶瘤病毒药物，首先需要对HSV1临床株进行减毒和靶向复制改造等建立安全性的病毒载体。为开发更高效溶杀实体瘤的新型溶瘤病毒，设计集成采用中国临床病毒株、删除致病基因、免疫增强因子武装、携载免疫检查点蛋白抗体等多种增效策略，来研制高效溶杀实体瘤和转移瘤的增效oHSV。

实施例2：肿瘤靶向、条件复制型HSV1-CH003重组改造的靶向载体构建

(1)双拷贝神经毒力基因γ34.5敲除的靶向载体构建

敲除双拷贝γ34.5基因：克隆测序临床株HSV1-CH003γ34.5基因及其上下游序列，设计引物克隆γ34.5基因上游同源臂(UHA，长440bp，GC含量78％)(SEQ ID NO.1)，下游同源臂(DHA，长500bp，GC含量68％)(SEQ ID NO.2)；克隆的上下游同源臂片段以及荧光蛋白表达盒片段利用infusion技术连入基于pcDNA3.1+骨架构建的3.1+ΔRL1载体；克隆上下游同源臂片段时选择的酶切位点分别为MluI和AgeI对，SbfI和XbaI对，获得的质粒载体命名为pHSV-CH003Δγ34.5。该载体在克隆的上下游同源臂中间引入一个多克隆位点接头，引入的6种内切酶分别是-AgeI-ClaI-EcoRI-EcoRV-KpnI-PacI-SbfI-，便于后续克隆外源基因或表达控制元件等插入靶向载体。

具体步骤如下：

首先，分别使用以下引物扩增γ34.5UHA和DHA片段：

UHA-F：gtacgggccagatatacgcgtCGGGGCCGCGGGAGCGGGgggaggagc SEQ ID NO.12

UHA-R：TtaacccatcgatggaccggtGGAGACAGAGAGCGTGCCGgggtggtag SEQ ID NO.13

DHA-F：aatccttaattaaggcctgcaggCGTTACACCCGAGGCGGCctgggtcttc SEQ IDNO.14

DHA-R：ggtttaaacgggccctctagaCGGGCCAATGCGCGAGGGgccgtgtg SEQ ID NO.15

多片段重组使用的是来自南京诺唯赞公司的多片段infusion试剂盒。将获得的载体命名为pHSV-CH003Δγ34.5。

(2)携载绿色荧光蛋白基因表达盒的重组靶向载体构建

以实验室自主构建的含hUbC-3EGFP表达框序列的质粒为模板，克隆三个绿色荧光基因串联的真核表达框片段(hUbC-3EGFP)(SEQ ID NO.3)，以及WPRE-bGH ploy(A)片段(SEQ ID NO.4)，hUbC是选用的启动活性强的泛素启动子。hUbC-3EGFP片段(长度3538bp)经ClaI、KpnI酶切连入pHSV-CH003Δγ34.5载体获得pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体；WPRE-bGH PA片段(长度846bp)经KpnI、PacI酶切连入pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP载体，从而构建获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA载体(SEQ ID NO.5)。

实施例3：肿瘤靶向、条件复制型HSV1-CH003溶瘤病毒重组、挑斑纯化

双拷贝神经毒力基因γ34.5完全敲除、携带表达EGFP的HSV1-CH003重组病毒构建：

为了获得病毒基因组中最主要神经毒力基因γ34.5双拷贝完全敲除的HSV1-CH003重组株，抽提靶向载体pHSV-CH003Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE-bGH PA与临床株病毒HSV1-CH003基因组DNA共转染培养在六孔板中的293T细胞，实验方法按照Lipofectamine2000(Invitrogen)说明书进行：待大部分细胞表现出细胞病变后，收集培养基，用PBS收集细胞。经三轮冷冻-震荡-涡旋后，用上清和细胞裂解液分别感染六孔板中的Vero细胞。感染1小时后，去除上清液，在细胞上覆盖含有2％胎牛血清、1％抗生素和1％琼脂糖的DMEM维持培养基。1天后观察感染细胞有无荧光表达确定新型病毒是否重组成功，2-3天后，挑斑分离良好的表达绿色荧光的病毒嗜斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮挑斑纯化。经过6轮嗜斑挑斑、单克隆纯化，完全去除无荧光表达的野生型临床株HSV1-CH003病毒，获得纯化的重组病毒HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE，病毒基因组示意图如图1，病毒重组挑斑及完全纯化的细胞图如图2所示，上排为重组病毒斑(绿色荧光)的荧光图和明场图；下排为重组病毒完全挑纯后的感染细胞荧光图及明场图。

实施例4：HSV1-CH003重组病毒的扩增制备

纯化后的HSV1-CH003重组病毒通过感染生长在10cm平皿上的Vero细胞进行批量生产及纯化。将重组病毒HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组OV载体按照MOI＝0.01感染Vero细胞，待细胞出现明显的变圆病变之后(大约3天)，将含重组病毒的上清液收集到50mL离心管中，通过离心去除细胞碎片(6400rpm，10分钟)，上清液使用0.22μm的滤膜过滤，最后使用贝克曼高速离心机进行浓缩(30000rpm，3小时)；将浓缩后的重组病毒沉淀使用少量PBS(pH＝7.4)重悬，在4℃条件下过夜，并不断摇动；第2天混匀病毒液，接着将重悬的重组病毒溶液加到20％的蔗糖溶液上层进行超速离心(30000rpm，3小时)、浓缩纯化；最后将溶解后的重组病毒进行分装，冻存在-80℃冰箱中。使用Vero细胞进行标准嗜斑实验来测定浓缩后HSV CH003重组病毒的滴度，滴度以每毫升的嗜斑形成单位(PFU/mL)表示。浓缩后的重组病毒HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE滴度经测定约为5×10⁹PFU/mL。

实施例5：条件复制型HSV1-CH003重组病毒基因组分子鉴定

取浓缩纯化的HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组病毒(图3中简写CH003ΔRL1-U3G)、野生型wt CH003病毒作为阴性对照，在100℃灭活10分钟，后续用于hUbC-3EGFP基因片段的分子鉴定。以hUbC-3EGFP基因片段(3538bp)设计引物，引物序列为U3G-F：5'gcgccgggttttggcgcctcccgcggg 3'(SEQ ID NO.10)；U3G-R：5'CTATAGGATATCGAATTCctTGTACAGC 3'(SEQ ID NO.11)。PCR反应体系为50μL，其中灭活病毒样用量为1-5μL，PCR buffer 10μL，20μM/μL引物各0.7μl，dNTPs 5μL，Prime star HS高保真酶0.6μL，补灭菌水到50μL。PCR扩增条件为：98℃5min，(98℃30s，60℃30s，72℃3min)循环32次，72℃延伸10min，16℃30min。分子鉴定结果如图3所示，阴性对照为野生型HSV1-CH003病毒，hUbC-3EGFP基因片段引物未扩出条带；阴性对照(H306)无条带；而构建的重组溶瘤病毒CH003Δγ34.5-U3G扩增出3.5Kb大小的目的条带，结果说明HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE重组溶瘤病毒外源基因已成功插入并替换敲除了CH003病毒基因组的γ34.5基因。

实施例6：肿瘤靶向、条件复制型HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE溶瘤病毒骨架溶瘤效果分析

HSV1-CH003临床株病毒通过遗传改造敲除最主要的神经毒力基因γ34.5，赋予了病毒在机体内只能靶向肿瘤细胞内复制扩增、裂杀肿瘤细胞的特性，而感染正常的机体细胞为复制缺陷型，不能增殖产生子代病毒。为检测构建的HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE溶瘤病毒骨架的溶瘤效果，以HSV1 CH003重组病毒感染常见的肿瘤细胞株进行测试。

图4所示为体外培养的恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG以及溶瘤病毒感染裂解细胞的结果：没有感染病毒的U87MG恶性胶质瘤细胞胞体呈现聚团以及长而明显的细胞突起和胞间网络化形态；将制备的HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE溶瘤病毒按MOI＝0.01感染U87MG细胞，感染后12小时就能观察到肿瘤细胞感染重组病毒后表达绿色荧光蛋白，24小时观测大部分肿瘤细胞均被感染、胞体呈绿色荧光；第2天后肿瘤细胞出现明显的细胞病变，细胞突起萎缩变圆；到第3天U87MG细胞全部圆缩，大部分细胞已凋亡(图4)，结果表明基于临床分离的HSV1-CH003临床株改造构建的重组溶瘤病毒HSV1CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE能高效的感染并裂杀恶性肿瘤细胞。

实施例7：武装化PD1抗体基因的HSV1-CH003溶瘤病毒构建

目前应用溶瘤病毒开展的临床治疗或临床试验中均发现OV联合免疫检查点抑制剂给药具有协同效应，溶瘤病毒能实现更好的溶瘤效果。本实施例设计通过遗传改造使HSV重组病毒基因组进一步直接携带抗PD-1蛋白的抗体基因，这样其感染裂解肿瘤细胞的同时可在肿瘤细胞内组成性表达PD-1蛋白抗体，从而达到联合用药的增效目的，且能降低成本、简化临床联合给药途径，溶瘤病毒复制增殖和免疫检查点抑制剂表达均在感染的肿瘤细胞内完成，能更好的靶向协同实现高效溶杀肿瘤目的。

选择FUGW质粒(Addgene编号14883)作为重组靶向载体的构建骨架；合成PD1抗体的基因序列(αPD1)(SEQ ID NO.6)，通过自剪切肽P2A和红色荧光蛋白(mCherry)(SEQ IDNO.7)基因串联获得表达框mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ ID NO.8)；该表达框片段(长度1599bp)通过Infusion方法克隆入经BamHI、EcoRI双酶切的FUGW质粒，替换掉原来的EGFP荧光基因，获得重组质粒pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab(SEQ ID NO.9)。oHSV1-CH003基因组携载PD1抗体基因的重组病毒构建步骤如下：将抽提的靶向载体pFUW-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab与上述构建的重组病毒HSV1CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE基因组DNA共转染293T细胞，质粒转染表达红色荧光蛋白，而病毒感染的细胞同时表达绿色荧光蛋白，如果重组成功mCherry-P2A-αPD1Ab基因序列会同源重组替换掉3EGFP基因，新重组病毒将只表达红色荧光蛋白；待大部分细胞出现细胞病变后，收集细胞和病毒上清。经三轮冷冻-震荡-涡旋后，感染六孔板的Vero细胞，1小时后去除上清液，并上铺含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的培养基。2-3天后挑斑分离良好的表达红色荧光的嗜斑，即绿色背景视野中挑取红色荧光斑，连续10倍稀释后感染新的Vero细胞进行下一轮纯化。经过5轮挑斑、单克隆纯化，完全去除表达绿色荧光蛋白的HSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-3EGFP-WPRE母本病毒，获得单克隆化的携带PD1抗体基因的溶瘤病毒oHSV1 CH003-Δγ34.5-hUbC-mCherry-P2A-αPD1Ab-WPRE(缩写为oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry)，病毒基因组示意图如图5，病毒重组挑斑及纯化的细胞图如图6所示。

实施例8：武装化PD1抗体基因的oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒的在体毒性测试

将构建的溶瘤病毒oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry(实验室编号：H526)大量扩增、纯化浓缩，经嗜斑实验测定制备的溶瘤病毒滴度为8×10⁹PFU/mL。经颅内注射2×10⁶PFU病毒感染小鼠VTA脑区，观察小鼠一直状态良好；14天后灌流小鼠、取脑组织切片观察，可见在注射脑区VTA和病毒经末梢吸收感染的脑区LH、LHb等都有很好的红色荧光标记，只在注射部位观察到有一定炎症反应，其它脑区标记到的神经元都状态良好(图7)。相对的HSV1-CH003野生型病毒感染小鼠症状明显、一周内小鼠全部死亡。实验表明本发明构建的oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒具有低毒性、携载的外源抗体蛋白等得到高效表达，感染机体正常组织如神经元细胞溶瘤病毒为复制缺陷型，不会增殖传播致死动物。

实施例9：构建表达绿色荧光蛋白的人源恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG-GFP

为构建新型肿瘤荷瘤动物模型测试oHSVCH003溶瘤病毒效果，建立人源肿瘤细胞株工程化改造技术。利用慢病毒会整合到宿主细胞基因组的特性来构建组成性表达目的蛋白的新型U87MG稳转细胞株；为便于新细胞系的流式细胞筛选纯化，首先构建并制备表达绿色荧光蛋白的慢病毒LentiV-hUbC-EGFP-WPRE；人源胶质母细胞瘤细胞株U87MG感染慢病毒后能稳定表达绿色荧光蛋白，经流式分选纯化后获得新型恶性胶质瘤细胞株U87MG-GFP；如图8所示，制备的工程化细胞株U87MG-GFP纯度很高，几乎所有细胞都稳定表达绿色荧光蛋白，而且细胞状态良好，和野生型U87MG一致，保种到基于U87MG工程化改造的胶质瘤细胞库。

实施例10：利用遗传改造的U87MG-GFP建立恶性胶质母细胞瘤动物模型

培养工程化改造的U87MG-GFP细胞株，制备对数生长期的肿瘤细胞悬液；通过脑立体定位方式移植接种于BALB/c裸鼠右侧大脑CPU脑区，接种剂量5微升，肿瘤细胞数量为1×10⁶个；连续观察裸鼠移植胶质瘤后症状，利用小动物磁共振成像仪监测胶质瘤的成瘤状态。磁共振成像(MRI)扫描过程中，使用MSME(multi spin multi echo)T1-weight序列获得功能像。胶质瘤细胞株接种后第4周核磁扫描结果如图9所示，未注射肿瘤细胞的健康裸鼠无肿瘤核磁信号(图9A)，注射U87MG-GFP的裸鼠在CPU区域形成明显的肿瘤病灶(图9B)，说明胶质母细胞瘤荷瘤动物建模成功。

实施例11：oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒能高效溶杀恶性胶质母细胞瘤

将纯化制备的oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒在建立的恶性胶质瘤荷瘤动物模型上进行了测试。将上述工程化构建的人脑星形胶质母细胞瘤(WHO IV级)细胞株U87MG-GFP定位接种于BALB/c裸鼠皮层下CPU脑区，4周后经核磁共振检测小鼠大脑已成瘤、呈侵袭性生长(图10A)。制备的oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒通过瘤内给药方式注射到恶性胶质瘤瘤体内，14天后灌流裸鼠，取脑组织切片观察，发现oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒在胶质母细胞瘤体内能有效复制增殖，在病毒感染的肿瘤组织区域出现明显的凋亡炎症反应(图10B)，结果说明基于中国临床分离株HSV1-CH003构建的新型溶瘤病毒oHSVCH003-Δγ34.5-αPD1Ab-mCherry溶瘤病毒能高效溶杀恶性胶质母细胞瘤细胞，和注射PBS缓冲液的对照组荷瘤小鼠相比肿瘤组织体积明显缩小，验证了基于中国HSV临床分离株构建的增效溶瘤病毒具有良好的安全性和溶瘤活性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳先进技术研究院

<120> 一种中国HSV临床分离株及基于其的溶瘤病毒和应用

<130> CP122010358C

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggggccgcg ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 60

agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 120

agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 180

agcgggggga ggagcggggg gaggagcggg gggaggagcg gggggaggag cggggggagg 240

agcgggggga ggagcggcca gaccccaaaa acgggccccc cccgaaacac accccccggg 300

ggtcgcgcgc ggccctttaa agcgcggcgg cgcagcccgg gccccccgcg gctagcgagt 360

tagacaggca agcactactc gcctctgcac gcacatgctt gcctgtcaaa ctctaccacc 420

ccggcacgct ctctgtctcc 440

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgttacaccc gaggcggcct gggtcttccg cggagctccc gggagctccg caccaagccg 60

ctctccggag agacgatggc aggagccgcg catatatacg ctgggagccg gcccgccccc 120

aaggcgggcc cgccctcgga gggcgggact ggccaatcgg cggccgccag cgcggcgggg 180

cccggccaac cagcgtttgc cgagtcttcg gggcccggcc cactgggcgg taactcccgc 240

ccagtgggcc gggccgccca cttcccggta tggtaattaa aaacttgcaa gaggccttgt 300

tccgcttccc ggtatggtaa ttagaaactc attaatgggc ggccccggcc gcccttcccg 360

cttccggcaa ttcccgcggc ccttaatggg caaccccggt attccccgcc tcccgcgccg 420

cgcgtaacca ctcccctggg gttccgggtt atgctaattg cttttttggc ggaacacacg 480

gcccctcgcg cattggcccg 500

<210> 3

<211> 3538

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60

agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120

ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180

cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240

gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300

taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360

cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420

gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480

tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540

tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600

aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660

cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720

gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780

gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840

acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900

ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960

gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020

tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080

tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140

ttttcagtgt tagactagta aagcttctgc aggtcgactc tagaaaattg tccgctaaat 1200

tctggccgtt tttggctttt ttgttagacg gcgcgccgtg gagaaccctg gacctatggt 1260

gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1320

cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1380

gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1440

gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1500

cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1560

ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1620

ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagat 1680

ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1740

caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1800

ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1860

gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1920

ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agcagctgtt 1980

gaattttgac cttctcaagc tggcgggaga cgtcgagtcc aaccctgggc caatggtgag 2040

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 2100

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 2160

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 2220

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 2280

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 2340

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 2400

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagatgga 2460

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 2520

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 2580

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 2640

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 2700

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg agggcagagg 2760

aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggtga gcaagggcga 2820

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 2880

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 2940

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 3000

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 3060

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 3120

ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 3180

gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagatgg agtacaacta 3240

caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 3300

caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 3360

cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 3420

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 3480

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag gaattcgata tcctatag 3538

<210> 4

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca gggcccgttt 600

aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 660

cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 720

aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 780

aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 840

ctatgg 846

<210> 5

<211> 10031

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtcggggcc 240

gcgggagcgg ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg 300

ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg 360

ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg 420

ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg 480

ggaggagcgg ccagacccca aaaacgggcc ccccccgaaa cacacccccc gggggtcgcg 540

cgcggccctt taaagcgcgg cggcgcagcc cgggcccccc gcggctagcg agttagacag 600

gcaagcacta ctcgcctctg cacgcacatg cttgcctgtc aaactctacc accccggcac 660

gctctctgtc tccaccggtc catcgatgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc 720

cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgttc ctgatccttc 780

cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta 840

tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc 900

agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc 960

gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc 1020

gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt 1080

gagttgcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg 1140

gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga 1200

actgggggtt ggggggagcg cacaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga atggaagacg 1260

cttgtaaggc gggctgtgag gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg gcggcaagaa 1320

cccaaggtct tgaggccttc gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga gatgggctgg 1380

ggcaccatct ggggaccctg acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc gggtttgtcg 1440

tctggttgcg ggggcggcag ttatgcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga 1500

gcgcgcgcct cgtcgtgtcg tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg cagggtgggg 1560

ccacctgccg gtaggtgtgc ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg gttcgggcct 1620

agggtaggct ctcctgaatc gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg gataagtgag 1680

gcgtcagttt ctttggtcgg ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga agctccggtt 1740

ttgaactatg cgctcggggt tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg caccttttga 1800

aatgtaatca tttgggtcaa tatgtaattt tcagtgttag actagtaaag cttctgcagg 1860

tcgactctag aaaattgtcc gctaaattct ggccgttttt ggcttttttg ttagacggcg 1920

cgccgtggag aaccctggac ctatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt 1980

gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga 2040

gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa 2100

gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag 2160

ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta 2220

cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt 2280

gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga 2340

ggacggcaac atcctggggc acaagatgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat 2400

catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga 2460

ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc 2520

cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa 2580

cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg 2640

catggacgag ctgtacaagc agctgttgaa ttttgacctt ctcaagctgg cgggagacgt 2700

cgagtccaac cctgggccaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 2760

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 2820

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 2880

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 2940

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 3000

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 3060

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 3120

cggcaacatc ctggggcaca agatggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 3180

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 3240

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 3300

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 3360

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 3420

ggacgagctg tacaaggagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa 3480

tcctggccca atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 3540

cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga 3600

tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc 3660

ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga 3720

ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg 3780

caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 3840

cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat 3900

cctggggcac aagatggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa 3960

gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt 4020

gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc 4080

cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga 4140

tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct 4200

gtacaaggaa ttcgatatcc tatagggtac caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 4260

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 4320

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 4380

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 4440

gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 4500

cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 4560

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 4620

ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 4680

gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 4740

gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 4800

cctttgggcc gcctccccgc agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct 4860

tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 4920

gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 4980

tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 5040

aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggtta attaacctgc aggcgttaca 5100

cccgaggcgg cctgggtctt ccgcggagct cccgggagct ccgcaccaag ccgctctccg 5160

gagagacgat ggcaggagcc gcgcatatat acgctgggag ccggcccgcc cccaaggcgg 5220

gcccgccctc ggagggcggg actggccaat cggcggccgc cagcgcggcg gggcccggcc 5280

aaccagcgtt tgccgagtct tcggggcccg gcccactggg cggtaactcc cgcccagtgg 5340

gccgggccgc ccacttcccg gtatggtaat taaaaacttg caagaggcct tgttccgctt 5400

cccggtatgg taattagaaa ctcattaatg ggcggccccg gccgcccttc ccgcttccgg 5460

caattcccgc ggcccttaat gggcaacccc ggtattcccc gcctcccgcg ccgcgcgtaa 5520

ccactcccct ggggttccgg gttatgctaa ttgctttttt ggcggaacac acggcccctc 5580

gcgcattggc ccgtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 5640

tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 5700

cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 5760

tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 5820

tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 5880

gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 5940

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 6000

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 6060

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 6120

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 6180

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 6240

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 6300

gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 6360

ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 6420

gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 6480

ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 6540

cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 6600

gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 6660

ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca 6720

ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 6780

tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 6840

gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 6900

ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 6960

gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 7020

ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 7080

atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 7140

caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 7200

caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 7260

aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 7320

aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 7380

gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 7440

gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 7500

gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 7560

accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 7620

ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 7680

tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 7740

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 7800

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 7860

gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 7920

cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 7980

aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 8040

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 8100

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 8160

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 8220

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 8280

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 8340

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 8400

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 8460

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 8520

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 8580

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 8640

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 8700

actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 8760

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt 8820

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 8880

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 8940

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 9000

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 9060

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 9120

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 9180

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 9240

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 9300

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 9360

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 9420

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 9480

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 9540

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 9600

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 9660

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 9720

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 9780

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 9840

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 9900

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 9960

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 10020

cacctgacgt c 10031

<210> 6

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggacatcg tgcgcaccca gacccccagc agcctggccg tgagcgtggg cgagaaggtg 60

accatgagct gcaagagcag ccagagcctg ctgtacagca gcaaccagaa gaactacctg 120

gcctggtacc agcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctactg ggccagcacc 180

cgcgagagcg gcgtgcccga ccgcttcacc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 240

agcatcagca gcgtgaaggc cgaggacctg gccgtgtact actgccagca gtactacaac 300

tactggacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagc gcgccgacgc cgcccccacc 360

gtgagcgaca tgcccatggc cgaccccaac cgcttccgcg gcaagaacct ggtgttccac 420

agcgagatca gcgaggtgaa gctggaggag agcggcggcg gcctggtgaa gctgggcggc 480

agcctgaagc tgagctgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcacctacta catgagctgg 540

gtgcgccaga cccccgagcg ccgcctggag ctggtggccg ccatcaacag caacggcggc 600

agcacctact accccgacac cgtgcagggc cgcttcacca tcagccgcga caacgccaag 660

aacaccctgt acctgcagat gagcagcctg cgcagcgagg acaccgccct gtacctgtgc 720

gccagcctgg acggcaaggg ctaccacttc gactactggg gccagggcac ccccctgacc 780

gtgagcagcg ccaagaccac cccccccagc gtgtactag 819

<210> 7

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

<210> 8

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaaggg aagcggagct 720

actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctgctagc 780

atggacatcg tgcgcaccca gacccccagc agcctggccg tgagcgtggg cgagaaggtg 840

accatgagct gcaagagcag ccagagcctg ctgtacagca gcaaccagaa gaactacctg 900

gcctggtacc agcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctactg ggccagcacc 960

cgcgagagcg gcgtgcccga ccgcttcacc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 1020

agcatcagca gcgtgaaggc cgaggacctg gccgtgtact actgccagca gtactacaac 1080

tactggacct tcggcggcgg caccaagctg gagatcaagc gcgccgacgc cgcccccacc 1140

gtgagcgaca tgcccatggc cgaccccaac aggttcaggg gcaagaacct ggtgttccac 1200

agcgagatca gcgaggtgaa gctggaggag agcggcggcg gcctggtgaa gctgggcggc 1260

agcctgaagc tgagctgcgc cgccagcggc ttcaccttca gcacctacta catgagctgg 1320

gtgcgccaga cccccgagcg ccgcctggag ctggtggccg ccatcaacag caacggcggc 1380

agcacctact accccgacac cgtgcagggc cgcttcacca tcagccgcga caacgccaag 1440

aacaccctgt acctgcagat gagcagcctg cgcagcgagg acaccgccct gtacctgtgc 1500

gccagcctgg acggcaaggg ctaccacttc gactactggg gccagggcac ccccctgacc 1560

gtgagcagcg ccaagaccac cccccccagc gtgtactaa 1599

<210> 9

<211> 10795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560

agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620

gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680

ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740

acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800

ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860

ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920

tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980

aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040

aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100

aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160

acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220

agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280

tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340

gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400

gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460

tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520

agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580

agatccagtt tggttaatta agggtgcagc ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg 2640

cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgttc 2700

ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag 2760

aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg 2820

ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg 2880

agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac 2940

agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc 3000

gtcacttggt gagttgcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct 3060

cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag 3120

gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cacaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga 3180

atggaagacg cttgtaaggc gggctgtgag gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg 3240

gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga 3300

gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc 3360

gggtttgtcg tctggttgcg ggggcggcag ttatgcggtg ccgttgggca gtgcacccgt 3420

acctttggga gcgcgcgcct cgtcgtgtcg tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg 3480

cagggtgggg ccacctgccg gtaggtgtgc ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg 3540

gttcgggcct agggtaggct ctcctgaatc gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg 3600

gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga 3660

agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg 3720

caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa tatgtaattt tcagtgttag actagtaaat 3780

tgtccgctaa attctggccg tttttggctt ttttgttaga cgaagcttgg gctgcaggtc 3840

gactatagag gatccatggt gagcaagggc gaggaggata acatggccat catcaaggag 3900

ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag 3960

ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag 4020

ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag 4080

gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc 4140

ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac 4200

tcctccctgc aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc 4260

tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg 4320

taccccgagg acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc 4380

ggccactacg acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc 4440

ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc 4500

gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac 4560

aagggaagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 4620

cctggacctg ctagcatgga catcgtgcgc acccagaccc ccagcagcct ggccgtgagc 4680

gtgggcgaga aggtgaccat gagctgcaag agcagccaga gcctgctgta cagcagcaac 4740

cagaagaact acctggcctg gtaccagcag aagcccggcc agagccccaa gctgctgatc 4800

tactgggcca gcacccgcga gagcggcgtg cccgaccgct tcaccggcag cggcagcggc 4860

accgacttca ccctgagcat cagcagcgtg aaggccgagg acctggccgt gtactactgc 4920

cagcagtact acaactactg gaccttcggc ggcggcacca agctggagat caagcgcgcc 4980

gacgccgccc ccaccgtgag cgacatgccc atggccgacc ccaacaggtt caggggcaag 5040

aacctggtgt tccacagcga gatcagcgag gtgaagctgg aggagagcgg cggcggcctg 5100

gtgaagctgg gcggcagcct gaagctgagc tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcacc 5160

tactacatga gctgggtgcg ccagaccccc gagcgccgcc tggagctggt ggccgccatc 5220

aacagcaacg gcggcagcac ctactacccc gacaccgtgc agggccgctt caccatcagc 5280

cgcgacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgagca gcctgcgcag cgaggacacc 5340

gccctgtacc tgtgcgccag cctggacggc aagggctacc acttcgacta ctggggccag 5400

ggcacccccc tgaccgtgag cagcgccaag accacccccc ccagcgtgta ctaaggcgcg 5460

ccgaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 5520

tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 5580

ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 5640

ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca 5700

ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt 5760

ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 5820

cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga 5880

aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt 5940

ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc 6000

cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt 6060

gggccgcctc cccgcatcga taccgtcgac ctcgagacct agaaaaacat ggagcaatca 6120

caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca caagaggagg 6180

aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 6240

ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 6300

aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt 6360

ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca gatatccact gacctttgga tggtgctaca 6420

agctagtacc agttgagcaa gagaaggtag aagaagccaa tgaaggagag aacacccgct 6480

tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagta ttagagtgga 6540

ggtttgacag ccgcctagca tttcatcaca tggcccgaga gctgcatccg gactgtactg 6600

ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 6660

tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 6720

gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 6780

gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 6840

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6900

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 6960

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 7020

gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 7080

cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 7140

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 7200

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 7260

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 7320

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 7380

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 7440

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 7500

aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 7560

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 7620

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 7680

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 7740

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 7800

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 7860

cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc 7920

atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 7980

cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 8040

ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 8100

cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 8160

ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 8220

cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 8280

gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 8340

acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 8400

cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 8460

cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 8520

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 8580

caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 8640

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 8700

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 8760

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 8820

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 8880

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 8940

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 9000

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 9060

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 9120

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 9180

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 9240

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 9300

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 9360

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 9420

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 9480

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 9540

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 9600

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 9660

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 9720

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 9780

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 9840

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 9900

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 9960

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 10020

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 10080

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 10140

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 10200

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 10260

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 10320

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 10380

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 10440

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 10500

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 10560

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 10620

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 10680

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 10740

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgac 10795

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcggg 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctataggata tcgaattcct tgtacagc 28

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtacgggcca gatatacgcg tcggggccgc gggagcgggg ggaggagc 48

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttaacccatc gatggaccgg tggagacaga gagcgtgccg gggtggtag 49

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aatccttaat taaggcctgc aggcgttaca cccgaggcgg cctgggtctt c 51

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtttaaacg ggccctctag acgggccaat gcgcgagggg ccgtgtg 47

Claims (10)

1.一种单纯疱疹病毒HSV1-CH003株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：V202210。

2.一种病毒载体，其特征在于，通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。

3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体在敲除的γ34.5基因座位插入外源基因表达盒；或，

所述病毒载体还包括在其基因组任何插入不影响功能的位点插入外源基因表达盒；

所述外源基因表达盒中的外源基因选自表达任意目的蛋白的基因。

4.权利要求2或3所述的病毒载体在病毒学基础研究、作为大携载容量病毒载体、作为溶瘤病毒、作为目的基因递送载体、作为神经系统靶向基因治疗药物、在动物感染模型建立或抗病毒药物筛选中的应用。

5.一种重组溶瘤病毒，其特征在于，通过敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因得到。

6.根据权利要求5所述的重组溶瘤病毒，其特征在于，溶瘤病毒载体还包括在敲除的γ34.5基因座位插入肿瘤治疗序列基因表达盒；或，

所述溶瘤病毒载体基因组还包括在任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因选自免疫检查点蛋白抗体基因、肿瘤免疫治疗细胞因子基因和免疫调控增强基因中的一种或以上；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因表达盒包含启动子和肿瘤治疗序列基因；

优选地，在肿瘤治疗序列基因下游引入WPRE增强表达元件；

优选地，所述肿瘤治疗序列基因为免疫检查点蛋白PD1抗体基因；

优选地，在敲除的γ34.5基因座位还插入荧光蛋白表达盒，所述荧光蛋白表达盒的转录方向与所述肿瘤治疗序列基因表达盒保持一致。

7.权利要求5或6所述的重组溶瘤病毒在制备治疗抗肿瘤药物中的用途；

优选地，所述肿瘤包括脑瘤、恶性胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、恶性黑素瘤、血液肿瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。

8.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包含权利要求5或6所述的重组溶瘤病毒。

9.一种重组溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，敲除单纯疱疹病毒HSV1-CH003株基因组中神经毒力因子γ34.5双拷贝基因；

优选地，还包括在敲除的γ34.5基因座位或基因组任何插入不影响功能的位点插入肿瘤治疗序列基因表达盒。

10.一种重组溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)靶向载体构建

克隆γ34.5基因上下游同源臂，将克隆的上下游同源臂片段连入骨架载体，获得重组载体1；构建包括启动子、绿色荧光蛋白基因和WPRE片段的EGFP表达盒，连入重组载体1，获得表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体；

优选地，还包括在重组载体1插入肿瘤治疗序列基因表达盒，具体地：构建包括启动子、肿瘤治疗序列基因和红色荧光蛋白mCherry基因通过自剪切肽(2A)绑定表达的肿瘤治疗序列基因表达盒，替换表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体的EGFP表达盒，获得表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体；

(2)重组溶瘤病毒构建

将敲除γ34.5基因表达绿色荧光蛋白的重组靶向质粒载体与HSV1-CH003临床株病毒基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，挑斑绿色荧光的病毒嗜斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得表达绿色荧光蛋白的HSV1-CH003重组病毒；

优选地，插入肿瘤治疗序列基因的重组溶瘤病毒的构建，方法包括：将表达肿瘤治疗序列基因的重组靶向质粒载体与表达绿色荧光蛋白的重组HSV1-CH003株病毒基因组DNA共转染293T细胞，待细胞病变后收集上清，感染Vero细胞，在绿色荧光背景下挑斑红色荧光的病毒斑，经过5轮以上的挑斑纯化后即得。