CN114606251A

CN114606251A - 以外泌体为载体的dna递送系统

Info

Publication number: CN114606251A
Application number: CN202210334169.5A
Authority: CN
Inventors: 尹乐; 顾雨春
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Zhuhai Hengqin New Area Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Zhuhai Hengqin New Area Co ltd
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: WO2023185261A1; CN114606251B

Abstract

本发明公开了一种以外泌体为载体的DNA递送系统。所述DNA递送系统包括DNA包装系统和靶向递送载体。所述DNA包装系统可以把经修饰的RNF112基因的DNA序列导入外泌体中，获得的外泌体施用给受试者可以治疗ALS。本发明的上述研究成果为临床提供了一种治疗ALS的新型药物。

Description

以外泌体为载体的DNA递送系统

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及以外泌体为载体的DNA递送系统。

背景技术

外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径为30～150nm的囊泡，细胞质膜凹陷形成的细胞内小泡，具有与细胞膜相同的膜结构，可以携带诸如RNA、蛋白质等大量成分，与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系。因其特殊的结构，相较人工合成的药物载体，外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在外泌体的膜结构与细胞膜相同，可以提高药物进入细胞的效率，甚至可以透过血脑屏障，同时外泌体引起的有害免疫反应极低，有很好的渗透滞留(EPR)效应从而具有缓释效果等。目前已经尝试用外泌体携带miRNA、siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。但是如何将大分子DNA递送至外泌体从而产生携带DNA的外泌体是本申请需要解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术缺陷，本发明的目的在于提供一种DNA包装系统，所述包装系统能够将目的基因DNA序列导入外泌体。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种融合DNA，所述融合DNA的序列包括DNA结合蛋白的DNA结合基序以及SEQ ID NO.1所示的DNA序列；DNA结合蛋白的DNA结合基序连接于SEQ ID NO.1所示的DNA序列的3’端；

优选地，所述DNA结合蛋白包括TALE蛋白；

优选地，所述DNA蛋白的DNA结合基序包括SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含前面所述的融合DNA。

本发明提供了一种DNA包装系统，所述DNA包装系统包括前面所述的载体，以及表达外泌体蛋白和DNA结合蛋白的载体。

进一步，DNA结合蛋白连接于外泌体膜蛋白的C端。

进一步，所述外泌体蛋白包括外泌体跨膜蛋白、外泌体表面蛋白。

可用于本发明的外泌体蛋白可以包括但不限于：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合组成的组。

在本发明的具体实施方案中，所述外泌体蛋白是CD63。

进一步，所述DNA结合蛋白包括TALE蛋白。

进一步，所述表达外泌体蛋白和DNA结合蛋白的载体还表达Tol2；所述DNA包装系统还包括表达Tol2转座酶的载体。

本发明还提供了一种DNA递送系统，所述DNA递送系统包括前面所述的DNA包装系统和靶向递送载体，所述靶向递送载体表达外泌体蛋白和靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞。

进一步，所述靶向分子连接于外泌体膜蛋白的N端。

在本发明的具体实施方案中，所述外泌体蛋白是Lamp2b。

可用于本发明的所述靶向分子包括与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体。

细胞膜表面抗原包括但不限于ER、PR、P53、EGFR、IGFR、Her2、CD20、CD25、CD117、CD34、CD138、CD33、VEGFR、BCMA、Mesothelin、CEA、PSCA、MUC1、EpCAM、S100、CD22、CD19、CD70、CD30、ALK、RANK、GPC2、GPC3、Her3、EGFRvIII、GD2、PD-L1、PD-L2。

作为靶向分子的实施例，所述靶向分子包括但不限于：GE11、T7、RVG，识别CD19的单链抗体、识别BCMA的单链抗体。

更进一步，所述DNA递送系统还包括促进外泌体生产或分泌的载体。

优选地，所述促进外泌体生产或分泌的载体表达STEAP、syndevan-4和NadB。

本发明还提供了一种外泌体，所述外泌体包括前面所述的融合DNA。

优选地，所述外泌体还包括靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞，优选地，所述靶向分子包括与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体。

进一步，所述靶向分子的限定同前。

本发明还提供了前面所述的外泌体的制备方法，所述制备方法包括以下任一项：

1)将前面所述的融合DNA导入外泌体中；

2)将前面所述的DNA包装系统或前面所述的DNA递送系统导入产生外泌体的细胞中；培养所述细胞产生外泌体。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞为以下任一项：

1)产生并分泌前面所述的外泌体；

2)包含前面所述的融合DNA；

3)导入了前面所述的DNA包装系统或前面所述的DNA递送系统。

本发明还提供了前面所述的细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将前面所述的DNA包装系统引入到产生外泌体的细胞中；

进一步，所述制备方法包括如下步骤：将前面所述的DNA包装系统和前面所述的DNA递送系统引入到产生外泌体的细胞中。

本发明细胞或后续提到的能够分泌外泌体的细胞包括但不限于原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞、或基本上任何其它类型的细胞来源。本发明的细胞包括体内产生外泌体的细胞。根据本发明的细胞可以选自广泛范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(Wharton'sjelly)、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞且更具体地说是任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞、骨髓抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别关注的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系例如微血管内皮细胞或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC)也在本发明的范围内，并且基本上能够产生细胞外囊泡的任何类型的细胞也包括在本文中。通常，外泌体基本上可以源自任何细胞来源，无论是原始细胞来源还是永生化细胞系。外泌体细胞可以是任何胚胎的、胎儿的和成年的体干细胞类型，包括诱导多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对于待治疗的患者而言，细胞本质上可以是同种异体的、自体的、甚至异种的，即细胞可以来自患者本人或者来自无关的、匹配的或不匹配的供体。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的外泌体、前面所述的细胞。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成明显刺激并且不会消除组合物中所施用的细胞外囊泡的生物学活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可以增强或稳定组合物，或者可以用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可以包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以选择载体以最小化受试者的不良副作用和/或最小化一种或多种活性成分的降解。这些配制品中的任何一种中也可以包含佐剂。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。肠胃外施用的配制品可以例如含有赋形剂如无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂(包括例如聚山梨酯20)。

本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。给予的途径和/或方式可以根据所期望的结果而变化。在一些实施例中，施用是玻璃体内、静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施例中，包含至少一种外泌体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以处于适于肠胃外施用的形式。在一些实施例中，药物组合物可以是无菌可注射的水性或悬浮液的形式，其可以根据已知程序进行配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的缓冲液中的无菌可注射悬浮液。

本发明还提供了一种应用，所述应用包括以下任一项：

1)前面所述的DNA包装系统在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是前面所述的外泌体；

2)前面所述的DNA递送系统在在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是前面所述的外泌体；

3)前面所述的细胞在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是前面所述的外泌体；

4)前面所述的外泌体在制备治疗ALS的药物中的应用；

5)前面所述的细胞在制备治疗ALS的药物中的应用；

6)前面所述的DNA包装系统在制备治疗ALS的药物中的应用；

7)前面所述的DNA递送系统在制备治疗ALS的药物中的应用；

8)前面所述的融合DNA在制备治疗ALS的药物中的应用；

9)前面所述的融合DNA在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是前面所述的外泌体；

术语"治疗"是指疾病或病症或它的至少一种可辨别症状的改善、预防或逆转。"治疗"是指至少一种与所治疗的疾病或病症有关的可测量的物理参数的改善、预防或逆转，所述疾病或病症不一定是哺乳动物中可辨别的或可被哺乳动物辨别的。"治疗"是指物理上(例如可辨别症状的稳定)或生理上(例如物理参数的稳定)或既在物理上又在生理上抑制或延缓疾病或病症的进展。"治疗"是指延迟疾病或病症的发病。

本文所用的"预防"是指获得给定疾病或病症的风险的降低。

本发明还提供了一种治疗或预防ALS的方法，所述方法包括将前面所述的外泌体或细胞给有需要的受试者施用。

术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用，是指用本文描述的方法和组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)的任何人或非人动物。对于治疗对特定动物如人受试者具有特异性的病状或疾病状态，术语“受试者”是指该特定动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，例如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在一些实施例中，受试者是人。

本发明的术语“载体”是指能够指导目的基因表达并可以转移基因序列到靶细胞的任何核酸构建体。该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

可用于本发明的载体包括非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括DNA或RNA质粒，DNA MC，裸核酸以及与诸如脂质体，纳米颗粒或泊洛沙姆的递送运载体复合的核酸。病毒载体包括但不限于逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒，牛痘和单纯疱疹病毒载体。

附图说明

图1显示pLenti-EF1α-RVG-Lamp2b-Zeo的载体结构示意图；

图2显示pLenti-EF1α-Tol2 transposase的载体结构示意图；

图3显示pUC57-Kan-Tol2-CD63-TALE-IRES-Puro的载体结构示意图；

图4显示pAAV-SFFV-pepRNF112-TALE识别基序的载体结构示意图；

图5显示激光共聚焦显微镜的细胞荧光图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实验例1构建相关载体

1、实验材料

常规载体pRSV-Rev(Plasmid#12253)、pMDLg/pRRE(Plasmid#12251)、pMD2.G(Plasmid#12259)为慢病毒包装辅助载体，用于慢病毒包装。

2、实验方法

1)pLenti-EF1α-Lamp2b-RVG-Zeo载体构建

构建一种表达外泌体膜蛋白的载体(载体结构示意图如图1所示)，该载体表达的蛋白包括Lamp2b，其N端(由BsmBI酶切位点插入)可表达包括但不限于识别神经元细胞的RVG。该载体含有Zeocin筛选标记，含有EF1α启动子启动表达RVG-Lamp2b融合蛋白；该载体还包含有WPRE原件，可增加相应蛋白表达。

pLenti-EF1α-RVG-Lamp2b-Zeo载体全序列如SEQ ID NO.3所示。

RVG-Lamp2b融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2)pLenti-EF1α-Tol2 transposase载体构建

构建一种Tol2转座酶载体(载体结构示意图如图2所示)，可表达Tol2转座酶。

pLenti-EF1α-Tol2 transposase载体全序列如SEQ ID NO.5所示。

3)pUC57-Kan-Tol2-CD63-TALE-IRES-Puro载体构建

构建一种表达CD63-TALE融合蛋白的载体(载体结构示意图如图3所示)，同时也表达Rep蛋白，CD63蛋白为外泌体膜蛋白，TALE蛋白可识别特定DNA序列“TACCACTCACTATA”(SEQ ID NO.2)，同时载体上含有转座臂，可通过与图2载体共转染细胞，使图3载体转座臂间DNA序列整合进目的细胞基因组中，Rep蛋白可持续复制目的DNA片段。

构建方法：合成SEQ ID NO.6所示的核酸序列经NotI、SphI酶切位点连入pUC57载体。

CD63-TALE融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4)pAAV-SFFV-pepRNF112-TALE识别基序载体构建

构建一种表达含有TALE识别基序“TACCACTCACTATA”及经修饰的RNF112基因(pepRNF112，核酸序列如SEQ ID NO.1所示)的载体(载体结构示意图如图4所示)。pepRNF112和TALE识别基序的连接序列为：pepRNF112-TALE。将pepRNF112-TALE核酸序列经SpeI、EcoRI酶切位点连入pAAV-SFFV载体。

实施例2构建产生外泌体的工程细胞株以及分离外泌体

1、利用pLenti-EF1α-RVG-Lamp2b-Zeo载体包装慢病毒，感染HEK293T细胞株，并使用Zeocin筛选，并挑取单克隆作为工程细胞，命名为RVG-lamp2b细胞株；

2、以pUC57-Kan-Tol2-CD63-TALE-IRES-Puro载体与pLenti-EF1α-Tol2transposase载体瞬时转染步骤1制备好的RVG-lamp2b细胞株，并使用puromycin筛选，构建RVG-lamp2b-CD63-TALE-CX43细胞株；

3、以pAAV-SFFV-pepRNF112-TALE识别基序载体瞬时转染rAAV侵染步骤2中获得的细胞，制备形成分泌外泌体工程细胞株，该细胞株命名为293T-RVG-lamp2b-CD63-TALE-PepRNF112。扩大培养，收集上清获得外泌体。

4、293T-RVG-lamp2b-CD63-TALE-PepRNF112细胞在T175培养瓶中扩增培养，收集上清，0.45μm滤膜过滤后，加入外泌体分离试剂4℃过夜，隔天10000g，1h离心，离心后弃去上清，用400μl DPBS重悬后置于-80℃储藏。

实施例3外泌体侵染293T-TDP43-EGFP细胞模型

1、构建293T-TDP43-EGFP细胞模型

1)包装TDP43-EGFP慢病毒

合成TDP43-EGFP核酸序列后经BsiWI、PflFI酶切位点连入pLenti-EF1a载体。TDP43-EGFP核酸序列如SEQ ID NO.8所示。

慢病毒包装流程：

通过胰酶消化收集293T细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于10cm培养皿上(根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％以上)。将细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8-24h，当细胞贴壁完全后即可开始转染；

混匀核心质粒和包装质粒：取无菌1.5ml EP管，加入400μl Opti-MEM培养基，加入10μg核心质粒和15μg病毒包装质粒(包含PMD2G、VSVG、REV)，及75μl PEI转染试剂，充分混匀，静置15-20min；

孵育：将这400μl的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO₂的37℃温箱孵育；

收取病毒上清：6-10h后吸去培养基，加入10ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，40h左右可以收集含慢病毒的上清，经45μm滤膜过滤后，可用于感染或者分装后置于－80℃储存待用。

2)使用1)中慢病毒感染293T细胞，并使用puromycin进行筛选；

3)2)中细胞挑取单克隆培养作为细胞模型

2、使用实施例2收集到的外泌体侵染293T-TDP43-EGFP细胞，连续侵染数次；

3、使用激光共聚焦显微镜观察293T-TDP43-EGFP细胞胞质荧光变化。

4、结果

1)293T-TDP43-EGFP细胞胞质荧光检测结果如表1和图5所示。

表1荧光检测值

上述结果表明，使用携带表达pepRNF112基因DNA片段的外泌体侵染293T-TDP43-EGFP细胞，细胞胞质中TDP43-EGFP积聚蛋白被降解。

序列表

<110> 呈诺再生医学科技（珠海横琴新区）有限公司

<120> 以外泌体为载体的DNA递送系统

<141> 2022-03-30

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1992

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgctgg tggaggtgct ggccgacccc ctggaccaca gagggtcgac gtcggggtcg 60

gggaagccgg ggtcggggga agggtcgacg aaaggcatgc caaggcccgc cttgtcagtc 120

acttcctttt gtcatcggct tggcaaacgg gagagaaaac agagcttcat gggaaacagc 180

ggcaacagtt ggtcccatac acctttcccc aagttggagc taggcctggg gccccagccc 240

atggcgcccc gggagctccc tacctgctcc atctgcctgg agaggttgcg cgaccccatc 300

tcgctggact gtggccacga cttctgcata cggtgcttca gcacacaccg tctcccgggc 360

tgtgagccgc cctgctgtcc tgagtgccgg aagatatgca agcagaagag gggcctccgg 420

agcctgggcg agaagatgaa gctcctgccg cagcggccgc tgccccctgc actgcaggag 480

acgtgtcctg tgagggcgga gccgctgctg ctggttcgca tcaatgcctc tgggggcctc 540

atccttagga tgggggccat caaccgctgc ctgaagcacc ctctggccag ggacacccca 600

gtctgcctcc tcgctgtcct gggggagcag cactcaggga agtccttcct cctcaaccat 660

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gcatccctgc agggctgcag gtggggcgcc aatggcctcg ccaggggcat atggatgtgg 780

agccacccct tcttgctggg gaaagaaggg aagaaggtgg cggtgttcct ggtggacaca 840

ggggatgcca tgagccctga gctgagcagg gaaacaagga tcaagctctg tgctctcacc 900

acgatgctga gctcctacca gatcctcagc acctcccagg agctgaagga tacagacctg 960

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ccaatccagc atctggacct cttagttcgt gactcatccc accccaacaa ggcagggcag 1080

gggcatgtag gcaacatctt ccagagattg tctggcagat accccaaggt gcaggagctg 1140

ctgcaaggga agcgagcccg ttgctgcctc ttgcctgccc cagggaggcg gcggatgaac 1200

caaggccatg caagccctgg tgacacagat gatgacttcc gccaccttct gggggcctac 1260

gtctcagatg tgctgagtgc ggccccccag cacgctaaga gccgctgcca ggggtactgg 1320

aacgaggggc gcgccgtggc caggggggac agacgcctac tcacggggca gcagctagct 1380

caggaaatca agaacctctc aggatggatg gggaggacag ggcccggttt cacctctccg 1440

gatgagatgg ctgctcagct gcacgacctg aggaaggtgg aagctgccaa gagggagttc 1500

gaggagtatg tgaggcagca ggacgtagcc accaagcgca tattctctgc gctgcgggtc 1560

ctgccagaca ccatgcggaa cctcctctcc acccagaaag atgccattct ggcccgccat 1620

ggtgtggcct tactctgcaa ggggagagat cagaccttgg aggcactgga agctgagctg 1680

caggccacgg ccaaggcctt catggactcc tacacgatgc gcttctgtgg ccacctagct 1740

gctgtggggg gtgctgtggg ggccgggctc atgggcctgg cagggggcgt ggtgggtgct 1800

ggcatggcag cagctgcact ggctgcagag gctgggatgg tggctgctgg agctgccgtg 1860

ggggccacag gggccgctgt ggttgggggt ggcgtgggtg ctgggttggc tgccacagtg 1920

ggctgcatgg agaaggagga ggatgagagg cttctggaag gggaccgaga gccccttctc 1980

caggaagagt aa 1992

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 10985

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60

tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120

cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180

gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

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cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

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cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140

tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200

gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga 1560

gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag 1620

tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag 1680

gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga 1740

cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc 1800

tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc 1860

tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt 1920

ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta 1980

ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta 2040

acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga 2100

atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa 2160

caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa 2220

gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat 2280

cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag 2340

aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatcg gcactgcgtg 2400

cgccaattct gcagacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt 2460

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gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga 2580

gatccagttt ggttaattaa tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga ggaatctttg 2640

cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg 2700

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cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg 2820

cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct 2880

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tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccactg gctgcagtac 3000

gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 3060

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gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 3180

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 3240

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gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 3600

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acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 3720

gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 3780

tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 3840

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gggctcgttc tggtctgcct agtcctggga gctgtgcggt cttatgcagg taactcgact 3960

atgggcagtg gatacaccat ttggatgccc gagaatccga gaccagggac accttgtgac 4020

atttttacca atagcagagg gaagagagca tccaacgggg gcagtggatc tggatccggt 4080

ggctcgagtt tggaacttaa tttgacagat tcagaaaatg ccacttgcct ttatgcaaaa 4140

tggcagatga atttcacagt tcgctatgaa actacaaata aaacttataa aactgtaacc 4200

atttcagacc atggcactgt gacatataat ggaagcattt gtggggatga tcagaatggt 4260

cccaaaatag cagtgcagtt cggacctggc ttttcctgga ttgcgaattt taccaaggca 4320

gcatctactt attcaattga cagcgtttca ttttcctaca acactggtga taacacaaca 4380

tttcctgatg ctgaagataa aggaatcctt actgttgatg aacttttggc catcagaatc 4440

ccattgaatg acctttttag atgcaatagt ttatcaactt tggaaaagaa tgatgttgtc 4500

caacactact gggatgttct tgtacaagct tttgtccaaa atggcacagt gagcacaaat 4560

gagttcctgt gtgataaaga caaaacttca acagtggcac ccaccataca caccactgtg 4620

ccatctccta ctacaacacc tactccaaag gaaaaaccag aagctggaac ctattcagtt 4680

aataatggca atgatacttg cctgctggct accatggggc tgcagctgaa catcactcag 4740

gataaggttg cttcagttat taacatcaac cccaatacaa ctcactccac aggcagctgc 4800

cgttctcaca ctgctctact tagactcaat agcagcacta ttaagtatct tgactttgtc 4860

tttgctgtga aaaatgaaaa ccgattttat ctgaaggaag tgaacatcag catgtatttg 4920

gttaatggct ccgttttcag cattgcaaat aacaatctca gctactggga tgcccccctg 4980

ggaagttctt atatgtgcaa caaagagcag actgtttcag tgtctggagc atttcagata 5040

aatacctttg atctaagggt tcagcctttc aatgtgacac aaggaaagta ttctacagcc 5100

caagagtgtt cgctggatga tgacaccatt ctaatcccaa ttatagttgg tgctggtctt 5160

tcaggcttga ttatcgttat agtgattgct tacgtaattg gcagaagaaa aagttatgct 5220

ggatatcaga ctctgggaag cggataccca tacgatgtgc cagattacgc tgtcaaacaa 5280

actcttaact ttgatttact caaactggct ggggatgtag aaagcaatcc aggtccaatg 5340

gccaagttga ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag 5400

ttctggaccg accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg 5460

gtccgggacg acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac 5520

accctggcct gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc 5580

gtgtccacga acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg 5640

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gagcaggact aagaattcga tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt 5760

tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct 5820

gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg 5880

tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc 5940

gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt 6000

cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc 6060

gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg 6120

ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg 6180

cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc 6240

ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg 6300

atctcccttt gggccgcctc cccgcatcga taccgtcgac ctcgagacct agaaaaacat 6360

ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca 6420

caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 6480

tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 6540

attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 6600

ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca gatatccact gacctttgga 6660

tggtgctaca agctagtacc agttgagcaa gagaaggtag aagaagccaa tgaaggagag 6720

aacacccgct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg atgacccgga gagagaagta 6780

ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcaca tggcccgaga gctgcatccg 6840

gactgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 6900

gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 6960

cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 7020

atctctagca gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 7080

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tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 7260

tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag 7320

ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 7380

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 7440

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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 7560

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 7620

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 7680

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 7740

acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc 7800

ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg 7860

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aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg 8220

ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt 8280

tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg 8340

tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca 8400

ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg 8460

tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt 8520

gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg 8580

agcaggactg acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 8640

gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 8700

tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 8760

atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 8820

ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 8880

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 8940

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cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 9060

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cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 9180

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caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 9300

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 9360

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tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 9540

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ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 9660

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ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 9960

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 10020

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ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 10200

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taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 10380

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 10440

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 10500

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 10560

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 10620

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 10680

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aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 10800

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 10860

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 10920

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 10980

aatgt 10985

<210> 4

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Gly Asn Ser Thr

20 25 30

Met Gly Ser Gly Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly

35 40 45

Thr Pro Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Leu

65 70 75 80

Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met Asn

85 90 95

Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val Thr

100 105 110

Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly Asp

115 120 125

Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe Ser

130 135 140

Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp Ser

145 150 155 160

Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp Ala

165 170 175

Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg Ile

180 185 190

Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu Lys

195 200 205

Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe Val

210 215 220

Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp Lys

225 230 235 240

Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro Thr

245 250 255

Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser Val

260 265 270

Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln Leu

275 280 285

Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro Asn

290 295 300

Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu Arg

305 310 315 320

Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val Lys

325 330 335

Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr Leu

340 345 350

Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr Trp

355 360 365

Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr Val

370 375 380

Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val Gln

385 390 395 400

Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys Ser

405 410 415

Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly Leu

420 425 430

Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg Arg

435 440 445

Lys Ser Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr Leu Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp

450 455 460

Val Pro Asp Tyr Ala

465

<210> 5

<211> 11087

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 60

tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120

cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180

gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

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gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga 1560

gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag 1620

tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag 1680

gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga 1740

cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc 1800

tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc 1860

tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt 1920

ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta 1980

ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta 2040

acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga 2100

atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa 2160

caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa 2220

gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat 2280

cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag 2340

aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatcg gcactgcgtg 2400

cgccaattct gcagacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt 2460

ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat acaaactaaa 2520

gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga 2580

gatccagttt ggttaattaa tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga ggaatctttg 2640

cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg 2700

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cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg 2820

cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct 2880

ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc 2940

tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccactg gctgcagtac 3000

gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 3060

taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc 3120

gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 3180

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 3240

ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt 3300

gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga 3360

cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc 3420

gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg 3480

ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg 3540

gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 3600

gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 3660

acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 3720

gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 3780

tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 3840

ccatttcagg tgtcgtgacg tacgatggag gaagtatgtg attcatcagc agctgcgagc 3900

agcacagtcc aaaatcagcc acaggatcaa gagcacccgt ggccgtatct tcgcgagttc 3960

ttttctttaa gtggtgtaaa taaagattca ttcaagatga aatgtgtcct ctgtctcccg 4020

cttaataaag aaatatcggc cttcaaaagt tcgccatcaa acctaaggaa gcatattgag 4080

agaatgcacc caaattacct caaaaactac tctaaattga cagcacagaa gagaaagatc 4140

gggacctcca cccatgcttc cagcagtaag caactgaaag ttgactcagt tttcccagtc 4200

aaacatgtgt ctccagtcac tgtgaacaaa gctatattaa ggtacatcat tcaaggactt 4260

catcctttca gcactgttga tctgccatca tttaaagagc tgattagtac actgcagcct 4320

ggcatttctg tcattacaag gcctacttta cgctccaaga tagctgaagc tgctctgatc 4380

atgaaacaga aagtgactgc tgccatgagt gaagttgaat ggattgcaac cacaacggat 4440

tgttggactg cacgtagaaa gtcattcatt ggtgtaactg ctcactggat caaccctgga 4500

agtcttgaaa gacattccgc tgcacttgcc tgcaaaagat taatgggctc tcatactttt 4560

gaggtactgg ccagtgccat gaatgatatc cactcagagt atgaaatacg tgacaaggtt 4620

gtttgcacaa ccacagacag tggttccaac tttatgaagg ctttcagagt ttttggtgtg 4680

gaaaacaatg atatcgagac tgaggcaaga aggtgtgaaa gtgatgacac tgattctgaa 4740

ggctgtggtg agggaagtga tggtgtggag ttccaagatg cctcacgagt cctggaccaa 4800

gacgatggct tcgagttcca gctaccaaaa catcaaaagt gtgcctgtca cttacttaac 4860

ctagtctcaa gcgttgatgc ccaaaaagct ctctcaaatg agcactacaa gaaactctac 4920

agatctgtct ttggcaaatg ccaagcttta tggaataaaa gcagccgatc ggctctagca 4980

gctgaagctg ttgaatcaga aagccggctt cagcttttaa ggccaaacca aacgcggtgg 5040

aactcaactt ttatggctgt tgacagaatc cttcaaattt gcaaagaagc aggagaaggc 5100

gcacttcgga atatatgcac ctctcttgag gttccaatgt ttaatccagc agaaatgctg 5160

ttcttgacag agtgggccaa cacaatgcgt ccagttgcaa aagtactcga catcttgcaa 5220

gcggaaacga atacacagct ggggtggctg ctgcctagtg tccatcagtt aagcttgaaa 5280

cttcagcgac tccaccattc tctcaggtac tgtgacccac ttgtggatgc cctacaacaa 5340

ggaatccaaa cacgattcaa gcatatgttt gaagatcctg agatcatagc agctgccatc 5400

cttctcccta aatttcggac ctcttggaca aatgatgaaa ccatcataaa acgaggcatg 5460

gactacatca gagtgcatct ggagcctttg gaccacaaga aggaattggc caacagttca 5520

tctgatgatg aagatttttt cgcttctttg aaaccgacaa cacatgaagc cagcaaagag 5580

ttggatggat atctggcctg tgtttcagac accagggagt ctctgctcac gtttcctgct 5640

atttgcagcc tctctatcaa gactaataca cctcttcccg catcggctgc ctgtgagagg 5700

cttttcagca ctgcaggatt gcttttcagc cccaaaagag ctaggcttga cactaacaat 5760

tttgagaatc agcttctact gaagttaaat ctgaggtttt acaactttga gtaagaattc 5820

gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 5880

attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat 5940

catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg 6000

tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt 6060

gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact 6120

ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc 6180

tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg 6240

tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc 6300

tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg 6360

cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc 6420

tccccgcatc gataccgtcg acctcgagac ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc 6480

aatacagcag ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg 6540

ggttttccag tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat 6600

cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga 6660

caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga ttggcagaac 6720

tacacaccag ggccagggat cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta caagctagta 6780

ccagttgagc aagagaaggt agaagaagcc aatgaaggag agaacacccg cttgttacac 6840

cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tattagagtg gaggtttgac 6900

agccgcctag catttcatca catggcccga gagctgcatc cggactgtac tgggtctctc 6960

tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag 7020

cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct 7080

ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagggcccgt 7140

ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 7200

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tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 7320

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 7380

ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc 7440

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 7500

tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 7560

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 7620

acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 7680

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 7740

gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 7800

tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 7860

ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 7920

agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 7980

tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 8040

cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 8100

ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc 8160

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct 8220

tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata 8280

tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg 8340

ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg 8400

ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc 8460

tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg 8520

tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg 8580

acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc 8640

tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc 8700

tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 8760

gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc 8820

ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 8880

caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 8940

cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc 9000

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 9060

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 9120

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 9180

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 9240

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 9300

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 9360

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 9420

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 9480

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 9540

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 9600

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 9660

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 9720

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 9780

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 9840

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 9900

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 9960

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 10020

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 10080

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 10140

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 10200

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 10260

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 10320

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 10380

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 10440

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 10500

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 10560

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 10620

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 10680

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 10740

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ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 10860

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 10920

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 10980

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 11040

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgt 11087

<210> 6

<211> 9601

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catatgccag aggtgtaaag tacttgagta attttacttg attactgtac ttaagtatta 60

tttttgggga tttttacttt acttgagtac aattaaaaat caatactttt acttttactt 120

aattacattt ttttagaaaa aaaagtactt tttactcctt acaattttat ttacagtcaa 180

aaagtactta ttttttggag atcactttct agaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag 240

cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc 300

tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt 360

cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc 420

aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc 480

tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca ctggctgcag tacgtgattc 540

ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gaggccttgc gcttaaggag 600

ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa 660

tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt 720

tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccaag 780

atctgcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc cgtgcgtccc 840

agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt 900

agtctcaagc tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc 960

cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc 1020

ccggccctgc tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg 1080

agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca 1140

cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc gagcttttgg agtacgtcgt 1200

ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga 1260

ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc ctttttgagt 1320

ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc 1380

aggtgtcgtg agcggccgcg ccaccatggc ggtggaagga ggaatgaaat gtgtgaagtt 1440

cttgctctac gtcctcctgc tggccttttg cgcctgtgca gtgggactga ttgccgtggg 1500

tgtcggggca cagcttgtcc tgagtcagac cataatccag ggggctaccc ctggctctct 1560

gttgccagtg gtcatcatcg cagtgggtgt cttcctcttc ctggtggctt ttgtgggctg 1620

ctgcggggcc tgcaaggaga actattgtct tatgatcacg tttgccatct ttctgtctct 1680

tatcatgttg gtggaggtgg ccgcagccat tgctggctat gtgtttagag ataaggtgat 1740

gtcagagttt aataacaact tccggcagca gatggagaat tacccgaaaa acaaccacac 1800

tgcttcgatc ctggacagga tgcaggcaga ttttaagtgc tgtggggctg ctaactacac 1860

agattgggag aaaatccctt ccatgtcgaa gaaccgagtc cccgactcct gctgcattaa 1920

tgttactgtg ggctgtggga ttaatttcaa cgagaaggcg atccataagg agggctgtgt 1980

ggagaagatt gggggctggc tgaggaaaaa tgtgctggtg gtagctgcag cagcccttgg 2040

aattgctttt gtcgaggttt tgggaattgt ctttgcctgc tgcctcgtga agagtatcag 2100

aagtggctac gaggtgatgg ggtcgacgtc ggggtcgggg aagccggggt cgggggaagg 2160

gtcgacgaaa ggcatgtcca ggacaaggct gccttccccc cccgccccta gccctgcttt 2220

ttccgccgac agctttagcg atctgctgag gcagtttgat cccagcctgt ttaacacaag 2280

cctgtttgac tccctgcctc ctttcggcgc ccaccacacc gaggccgcta ccggagagtg 2340

ggatgaggtg cagagcggcc tgagggccgc cgatgctcca ccacctacca tgagggtggc 2400

cgtgacagcc gccaggcccc ctagagctaa gcctgcccct aggaggaggg ccgcccagcc 2460

ttctgatgcc tcccccgctg cccaggtgga cctgagaacc ctgggctaca gccagcagca 2520

gcaggagaag atcaagccca aggtgagaag caccgtggcc cagcaccacg aggccctggt 2580

gggacacggc tttacccacg cccacatcgt ggccctgtcc cagcaccctg ccgccctggg 2640

aaccgtggct gtgaagtacc aggatatgat cgccgccctg cccgaggcca cacacgaggc 2700

tatcgtgggc gtgggcaagc agtggtccgg cgctagggcc ctggaggctc tgctgaccgt 2760

ggccggagag ctgaggggcc cacctctgca gctggacaca ggccagctgc tgaagatcgc 2820

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gcaggccctg gagaccgttc agagactgct gcctgtgctg tgtcaggacc acggcctgac 3000

ccctgaccag gtggtcgcca tcgcctccaa catcggcggc aagcaagccc tggagacagt 3060

gcagagactg ctccccgtgc tgtgtcaaga tcacggcctg acacccgatc aggtggtggc 3120

tatcgccagc cacgatggcg gcaagcaggc tctggagaca gtccagagac tgctgcccgt 3180

gctgtgccag gatcacggcc tcacacccga tcaagtggtg gccattgcca gccacgacgg 3240

cggcaagcag gcactggaga ccgtgcagag gctgctgccc gtcctgtgtc aggatcacgg 3300

actgacacct gatcaggtgg tcgctatcgc ctccaatatc ggcggcaaac aggccctgga 3360

aaccgtgcag cggctgctgc ccgttctgtg ccaggaccac ggactgaccc ccgatcaggt 3420

cgtggccatc gctagccacg atggaggcaa gcaggccctc gagacagtgc aaaggctgct 3480

gcctgtcctg tgccaggacc atggcctgac ccccgatcaa gtcgtggcca ttgcttccaa 3540

cggcggcggc aaacaagccc tggaaacagt gcagaggctc ctgcccgtgc tctgtcagga 3600

tcatggcctg acaccagatc aggtggttgc catcgcctct cacgatggcg gaaagcaggc 3660

cctggagact gtgcagagac tcctgcctgt gctctgtcaa gaccacggcc tcacccccga 3720

ccaagtggtg gctattgcct ccaacattgg cggcaagcag gccctggaga ccgtccagag 3780

actcctcccc gtgctctgcc aggatcatgg actgacaccc gaccaggtcg tggctatcgc 3840

tagccatgac ggcggcaaac aggctctgga aaccgtccag aggctgctcc ccgtcctgtg 3900

ccaagaccac ggactcaccc ctgatcaggt cgtcgccatc gcttccaatg gcggcggaaa 3960

gcaagccctc gagaccgtgc aaaggctcct gcctgtcctc tgccaggacc acgggctgac 4020

acctgaccag gtcgtcgcta tcgcttccaa catcggaggc aagcaagctc tggagaccgt 4080

gcagcgcctg ctgcctgttc tgtgccaaga tcacggactc acacccgacc aagtcgtggc 4140

tattgcttcc aatggaggcg gcaagcaggc cctggagaca gttcagaggc tgctgccagt 4200

gctgtgtcag gaccatggac tgaccccaga tcaggtcgtt gccatcgctt ctaacatcgg 4260

cggaaagcag gctctcgaga ccgtccaaag gctgctccct gtgctgtgcc aagatcatgg 4320

caggcccgcc ctggagtcca tcgtggctca gctgagcaga cccgatcctg ccctggccgc 4380

cctgacaaac gatcacctgg tggccctggc ctgcctgggc ggaagacctg ctctggacgc 4440

cgtgaagaag ggcctgcccc acgccccagc cctgatcaag agaaccaaca gaagaatccc 4500

cgagaggacc agccacagag tggccgaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt 4560

ggaggagaat cccggcccta tgggtgactg gagcgcctta ggcaaactcc ttgacaaggt 4620

tcaagcctac tcaactgctg gagggaaggt gtggctgtca gtacttttca ttttccgaat 4680

cctgctgctg gggacagcgg ttgagtcagc ctggggagat gagcagtctg cctttcgttg 4740

taacactcag caacctggtt gtgaaaatgt ctgctatgac aagtctttcc caatctctca 4800

tgtgcgcttc tgggtcctgc agatcatatt tgtgtctgta cccacactct tgtacctggc 4860

tcatgtgttc tatgtgatgc gaaaggaaga gaaactgaac aagaaagagg aagaactcaa 4920

ggttgcccaa actgatggtg tcaatgtgga catgcacttg aagcagattg agataaagaa 4980

gttcaagtac ggtattgaag agcatggtaa ggtgaaaatg cgaggggggt tgctgcgaac 5040

ctacatcatc agtatcctct tcaagtctat ctttgaggtg gccttcttgc tgatccagtg 5100

gtacatctat ggattcagct tgagtgctgt ttacacttgc aaaagagatc cctgcccaca 5160

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gggcgttaag gatcgggtta agggaaagag cgacccttac catgcgacca gtggtgcgct 5340

gagccctgcc aaagactgtg ggtctcaaaa atatgcttat ttcaatggct gctcctcacc 5400

aaccgctccc ctctcgccta tgtctcctcc tgggtacaag ctggttactg gcgacagaaa 5460

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tgcagaacaa aatcgaatgg ggcaggcggg aagcaccatc tctaactccc atgcacagcc 5580

ttttgatttc cccgatgata accagaactc taaaaaacta gctgctggac atgaattaca 5640

gccactagcc attgtggacc agcgaccttc aagcagagcc gctagtcgtg ccagcagcag 5700

acctcggcct gatgacctgg agatcgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact 5760

ggctggggat gtagaaagca atccaggtcc aatggatctg aatctgattg agcaggcacc 5820

cctgaccgtg gccgagaagc tgcagcgcga ctttctgacg gaatggcgcc gtgtgagtaa 5880

ggccccggag gcccttttct ttgtgcaatt tgagaaggga gagagctact tccacatgca 5940

cgtgctcgtg gaaaccaccg gggtgaaatc catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat 6000

tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt 6060

cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta 6120

catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat 6180

ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca 6240

tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga 6300

tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt 6360

ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc 6420

cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa 6480

gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga 6540

catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc 6600

ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct 6660

gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc 6720

cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa 6780

gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc 6840

cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga 6900

cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc 6960

aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg 7020

ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg 7080

ggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca tgagttctac gtcaaaaagg gtggagccaa 7140

gaaaagaccc gcccccagtg acgcagatat aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt 7200

tgcgcagcca tcgacgtcag acgcggaagc ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa 7260

caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag 7320

aatgaaccag aactcaaata tctgcttcac tcacggacag aaagactgtt tagagtgctt 7380

tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta 7440

cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgt 7500

gggtttggat gactgcatct ttgaacaata agaattcacg ttactggccg aagccgcttg 7560

gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 7620

aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 7680

cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 7740

gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 7800

ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 7860

caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 7920

agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 7980

ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc 8040

cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaaatg accgagtaca agcccacggt 8100

gcgcctcgcc acccgcgacg acgtcccccg ggccgttcgc accctcgccg ccgcgttcgc 8160

cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga cccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga 8220

gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga 8280

cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt 8340

cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca 8400

gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt 8460

cggcgtttcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt 8520

ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggaa acgtccgcgc cccgcaacct 8580

ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgagtgcc cgaaggaccg 8640

cgcgacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctaacat ggataatcaa cctctggatt 8700

acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 8760

gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 8820

cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 8880

aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 8940

ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 9000

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 9060

ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct 9120

ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 9180

cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 9240

cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcaaac ttgtttattg cagcttataa 9300

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 9360

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa acaagaatct ctagttttct 9420

ttcttgcttt tacttttact tccttaatac tcaagtacaa ttttaatgga gtactttttt 9480

acttttactc aagtaagatt ctagccagat acttttactt ttaattgagt aaaattttcc 9540

ctaagtactt gtactttcac ttgagtaaaa tttttgagta ctttttacac ctctggcatg 9600

c 9601

<210> 7

<211> 1040

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly

20 25 30

Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr

35 40 45

Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu

50 55 60

Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr

65 70 75 80

Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val

85 90 95

Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val Met

100 105 110

Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro Lys

115 120 125

Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe Lys

130 135 140

Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser Met

145 150 155 160

Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn Val Thr Val Gly

165 170 175

Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys Val

180 185 190

Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala

195 200 205

Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala

210 215 220

Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly

245 250 255

Met Ser Arg Thr Arg Leu Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Phe

260 265 270

Ser Ala Asp Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Gln Phe Asp Pro Ser Leu

275 280 285

Phe Asn Thr Ser Leu Phe Asp Ser Leu Pro Pro Phe Gly Ala His His

290 295 300

Thr Glu Ala Ala Thr Gly Glu Trp Asp Glu Val Gln Ser Gly Leu Arg

305 310 315 320

Ala Ala Asp Ala Pro Pro Pro Thr Met Arg Val Ala Val Thr Ala Ala

325 330 335

Arg Pro Pro Arg Ala Lys Pro Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro

340 345 350

Ser Asp Ala Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr

355 360 365

Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val

370 375 380

Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His

385 390 395 400

Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val

405 410 415

Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala

420 425 430

Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala

435 440 445

Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp

450 455 460

Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val

465 470 475 480

Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn

485 490 495

Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

500 505 510

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

515 520 525

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

530 535 540

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

545 550 555 560

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

565 570 575

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

580 585 590

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala

595 600 605

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

610 615 620

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala

625 630 635 640

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

645 650 655

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val

660 665 670

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

675 680 685

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp

690 695 700

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

705 710 715 720

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr

725 730 735

Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

740 745 750

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly

755 760 765

Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

770 775 780

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

785 790 795 800

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

805 810 815

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

820 825 830

Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

835 840 845

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

850 855 860

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala

865 870 875 880

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

885 890 895

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala

900 905 910

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

915 920 925

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val

930 935 940

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

945 950 955 960

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Arg Pro Ala Leu

965 970 975

Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala Ala

980 985 990

Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg Pro

995 1000 1005

Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Ala Leu Ile

1010 1015 1020

Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg Val Ala

1025 1030 1035 1040

<210> 8

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtctgaat atattcgggt aaccgaagat gagaacgatg agcccattga aataccatcg 60

gaagacgatg ggacggtgct gctctccacg gttacagccc agtttccagg ggcgtgtggg 120

cttcgctaca ggaatccagt gtctcagtgt atgagaggtg tccggctggt agaaggaatt 180

ctgcatgccc cagatgctgg ctggggaaat ctggtgtatg ttgtcaacta tccaaaagat 240

aacaaaagaa aaatggatga gacagatgct tcatcagcag tgaaagtgaa aagagcagtc 300

cagaaaacat ccgatttaat agtgttgggt ctcccatgga aaacaaccga acaggacctg 360

aaagagtatt ttagtacctt tggagaagtt cttatggtgc aggtcaagaa agatcttaag 420

actggtcatt caaaggggtt tggctttgtt cgttttacgg aatatgaaac acaagtgaaa 480

gtaatgtcac agcgacatat gatagatgga cgatggtgtg actgcaaact tcctaattct 540

aagcaaagcc aagatgagcc tttgagaagc agaaaagtgt ttgtggggcg ctgtacagag 600

gacatgactg aggatgagct gcgggagttc ttctctcagt acggggatgt gatggatgtc 660

ttcatcccca agccattcag ggcctttgcc tttgttacat ttgcagatga tcagattgcg 720

cagtctcttt gtggagagga cttgatcatt aaaggaatca gcgttcatat atccaatgcc 780

gaacctaagc acaatagcaa tagacagtta gaaagaagtg gaagatttgg tggtaatcca 840

ggtggctttg ggaatcaggg tggatttggt aatagcagag ggggtggagc tggtttggga 900

aacaatcaag gtagtaatat gggtggtggg atgaactttg gtgcgttcag cattaatcca 960

gccatgatgg ctgccgccca ggcagcacta cagagcagtt ggggtatggt gggcatgtta 1020

gccagccagc agaaccagtc aggcccatcg ggtaataacc aaaaccaagg caacatgcag 1080

agggagccaa accaggcctt cggttctgga aataactctt atagtggctc taattctggt 1140

gcagcaattg gttggggatc agcatccaat gcagggtcgg gcagtggttt taatggaggc 1200

tttggctcaa gcatggattc taagtcttct ggctggggaa tggggtcgac gtcggggtcg 1260

gggaagccgg ggtcggggga agggtcgacg aaaggccgta gcatggtgag caagggcgag 1320

gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1380

aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1440

ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 1500

tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 1560

tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 1620

tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 1680

aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 1740

aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 1800

aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 1860

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 1920

gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 1980

gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaag 2019

Claims

1.一种融合DNA，所述融合DNA的序列包括DNA结合蛋白的DNA结合基序以及SEQ IDNO.1所示的DNA序列；DNA结合蛋白的DNA结合基序连接于SEQ ID NO.1所示的DNA序列的3’端；

优选地，所述DNA结合蛋白包括TALE蛋白；

2.一种载体，所述载体包含权利要求1所述的融合DNA。

3.一种DNA包装系统，所述DNA包装系统包括权利要求2所述的载体，以及表达外泌体蛋白和DNA结合蛋白的载体；所述DNA结合蛋白连接于所述外泌体蛋白的C端；

优选地，所述外泌体蛋白包括CD63、Lamp2b、CD9；优选地，所述外泌体蛋白是CD63；

优选地，所述表达外泌体蛋白和DNA结合蛋白的载体还表达Tol2；所述DNA包装系统还包括表达Tol2转座酶的载体。

4.一种DNA递送系统，所述DNA递送系统包括权利要求3所述的DNA包装系统和靶向递送载体，所述靶向递送载体表达外泌体蛋白和靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞；

优选地，所述外泌体蛋白包括CD63、Lamp2b、CD9；优选地，所述外泌体膜蛋白是Lamp2b；

优选地，所述靶向分子包括与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体；

优选地，所述DNA递送系统还包括促进外泌体生产或分泌的载体；优选地，所述载体表达STEAP、syndevan-4和NadB。

5.一种外泌体，所述外泌体包括权利要求1所述的融合DNA；优选地，所述外泌体还包括靶向分子，所述靶向分子识别靶组织或靶细胞；优选地，所述靶向分子包括与细胞膜表面抗原相互作用的靶向肽、识别特定细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段、亲合体。

6.权利要求5所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下任一项：

1)将权利要求1所述的融合DNA导入外泌体中；

2)将权利要求3所述的DNA包装系统或权利要求4所述的DNA递送系统导入产生外泌体的细胞中；培养所述细胞产生外泌体。

7.一种细胞，所述细胞为以下任一项：

1)产生并分泌权利要求5所述的外泌体；

2)包含权利要求1所述的融合DNA；

3)导入了权利要求3所述的DNA包装系统或权利要求4所述的DNA递送系统。

8.权利要求7所述的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将权利要求3所述的DNA包装系统或权利要求4所述的DNA递送系统引入到产生外泌体的细胞中。

9.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求5所述的外泌体、权利要求7所述的细胞；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

10.一种应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项：

1)权利要求1所述的融合DNA在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是权利要求5所述的外泌体；

2)权利要求3所述的DNA包装系统在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是权利要求5所述的外泌体；

3)权利要求4所述的DNA递送系统在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是权利要求5所述的外泌体；

4)权利要求7所述的细胞在制备装载外源DNA的外泌体中的应用；优选地，所述外泌体是权利要求5所述的外泌体；

5)权利要求5所述的外泌体在制备治疗ALS的药物中的应用；

6)权利要求7所述的细胞在制备治疗ALS的药物中的应用；

7)权利要求1所述的融合DNA在制备治疗ALS的药物中的应用；

8)权利要求1所述的DNA包装系统在制备治疗ALS的药物中的应用；

9)权利要求4所述的DNA递送系统在制备治疗ALS的药物中的应用。