KR20220119030A - 암의 처치에 이용하는 ny-eso-1 함유 인공 아주반트 벡터 세포 - Google Patents

암의 처치에 이용하는 ny-eso-1 함유 인공 아주반트 벡터 세포 Download PDF

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야스히데 마스하라
게이스케 오스미
신이치로 후지이
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 과제는, NY-ESO-1 발현 암을 갖는 환자의 처치에 aAVC-NY-ESO-1 세포를 이용하기 위해서, NY-ESO-1을 안정적으로 발현하고, 임상 응용 가능한 aAVC-NY-ESO-1 세포를 제공하는 것에 있다. 본 발명은, 예를 들어, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인간 유래 세포를 제공한다.

Description

암의 처치에 이용하는 NY-ESO-1 함유 인공 아주반트 벡터 세포
본 발명은, 암의 처치에 이용하는 NY-ESO-1 함유 인공 아주반트 벡터 세포(artificial adjuvant vector cell: aAVC-NY-ESO-1 세포)에 관한 것이다.
뉴욕 식도 편평상피암 1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1, NY-ESO-1)은 암/정소 항원의 하나이며, 전립선암, 방광암 등의 광범위한 종양에서 발현이 인정된다. 한편으로 성인의 정상 세포에 있어서는 정소를 제외하고 발현이 나타나지 않기 때문에, 암 치료의 호적한 표적 분자라고 생각되고 있어, 백신을 비롯한 약제의 개발이 진행되고 있다(비특허문헌 1∼3).
NY-ESO-1 단백질과 글루코피라노실 지질 A(glucopyranosyl lipid A, GLA) 아주반트를 혼합한 백신인 G305는, NY-ESO-1 발현 암을 갖는 환자를 대상으로 임상 시험이 실시되고 있고, 백신 투여 후에 NY-ESO-1 특이적 T 세포의 유도가 확인되고 있다(비특허문헌 4).
후지이 등은, 인간 유래 세포에 외래적으로 CD1d 및 암 항원을 발현시키고, 추가로 해당 세포에 α-갈락토실세라마이드(α-Galactosylceramide, α-GalCer)를 펄스한 인공 아주반트 벡터 세포(artificial adjuvant vector cell: aAVC)를 제작했다(특허문헌 1∼3). 당해 aAVC는, CD1d/α-GalCer 복합체를 개재시켜 내추럴 킬러 T(NKT) 세포를 활성화하고, 활성화된 NKT 세포는 인터페론 γ(IFN-γ) 등의 사이토카인을 산생하여 내추럴 킬러(NK) 세포 등을 활성화한다. 마우스 모델에 있어서, aAVC 투여에 의한 NK 세포 의존적인 항종양 효과가 나타나고 있다(특허문헌 1∼3). 또한, 마우스에게 투여된 aAVC는 생체 내에 있어서 활성화된 NKT 세포에 의해 신속하게 살상되고, 해당 aAVC의 단편은 수상 세포에 흡수된다. 당해 aAVC 단편을 흡수한 수상 세포는, 해당 세포 표면 상의 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex, MHC)에 흡수한 암 항원의 단편을 항원 제시하여, 암 항원 특이적인 T 세포를 유도한다. 마우스 모델에 있어서, aAVC 투여에 의한 암 항원 특이적 T 세포의 유도를 개재시킨 항종양 효과가 나타나고 있다(특허문헌 1∼3, 비특허문헌 5 및 6). 이와 같이, aAVC는 NKT 세포 활성화를 개재시킨 NK 세포 활성화에 의한 자연 면역 활성화 및 암 항원 특이적 T 세포 유도에 의한 획득 면역 유도의 2개의 면역 기구를 강력하게 유도할 수 있음이 나타나고 있다.
국제 공개 번호 2007/097370 국제 공개 번호 2010/061930 국제 공개 번호 2013/018778
Thomas R. et al., 「프론티어즈 인 이뮤놀로지(Frontiers in Immunology)」, (스위스), 2018; 9:947 Gasser O. et al., 「캔서 이뮤놀로지, 이뮤노세라피(Cancer Immunology, Immunotherapy)」, (독일), 2018; 67(2):285-298 Robbins P. F. et al., 「클리니컬 캔서 리서치(Clinical Cancer Research)」, (미국), 2015; 21(5):1019-1027 Mahipal A. et al., 「캔서 이뮤놀로지, 이뮤노세라피(Cancer Immunology, Immunotherapy)」, (독일), 2019; 68(7):1211-1222 Shimizu K. et al., 「캔서 리서치(Cancer Research)」, (미국), 2013; 73(1):62-73 Shimizu K. et al., 「캔서 리서치(Cancer Research)」, (미국), 2016; 76(13):3756-3766
본 발명의 과제는, NY-ESO-1 또는 그의 단편을 안정적으로 발현하는 aAVC를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 암 항원으로서 NY-ESO-1을 발현하는 aAVC의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, NY-ESO-1을 안정적으로 발현하는 aAVC를 취득하는 것에 성공했다. 구체적으로는, 본 발명자들은, 항상적으로 NY-ESO-1을 발현시켰을 경우, 배양 일수를 거침에 따라 발현량 및 양성률의 저하가 인정된다고 하는 과제를 발견하여, 예의 검토하여 그 과제를 해결했다. 상세하게는, 유도형 프로모터(특히, 약제 유도형 프로모터)로 유도적으로 NY-ESO-1을 발현시킨 세포는, 항상적으로 NY-ESO-1을 발현시켰을 경우보다도 높은 NY-ESO-1의 발현량을 나타냄을 발견하여, 유도형 프로모터 지배하에서 NY-ESO-1을 안정적으로 고발현시킨 aAVC를 취득하는 것에 성공했다(실시예 2-2). 즉, 본 발명은, 암의 처치에 사용할 수 있는 aAVC, 해당 aAVC의 제조 방법, 해당 aAVC를 포함하는 의약 조성물, 해당 aAVC에 의한 암의 처치 방법 등을 제공한다.
즉, 본 발명은, 의학상 또는 산업상 유용한 물질 또는 방법으로서 이하의 발명을 포함해도 된다.
［1］ CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인간 유래 세포.
［2］ NY-ESO-1이 인간 NY-ESO-1인, ［1］에 기재된 세포.
［3］ CD1d가 인간 CD1d인, ［1］ 또는 ［2］에 기재된 세포.
［4］ 유도형 프로모터가 약제 유도형 프로모터인, ［1］∼［3］ 중 어느 한 항에 기재된 세포.
［5］ 약제 유도형 프로모터가 테트라사이클린계 유도형 프로모터인, ［4］에 기재된 세포.
［6］ 테트라사이클린계 유도형 프로모터가 TRE3G 프로모터인, ［5］에 기재된 세포.
［7］ 인간 유래 세포가 정상 세포인, ［1］∼［6］ 중 어느 한 항에 기재된 세포.
［8］ 인간 유래 세포가 인간 태아 신장 세포 293(HEK293) 세포에서 유래하는 세포인, ［7］에 기재된 세포.
［9］ CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고 있는, ［1］∼［8］ 중 어느 한 항에 기재된 세포.
［10］ NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량이 106세포당 245ng∼45000ng인, ［9］에 기재된 세포.
［11］ 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있는, ［9］ 또는 ［10］에 기재된 세포.
［12］ CD1d 리간드가 α-GalCer인, ［11］에 기재된 세포.
［13］［11］ 또는 ［12］에 기재된 세포를 포함하는 의약 조성물.
［14］ 암의 처치에 이용하기 위한, ［13］에 기재된 의약 조성물.
［15］ 암을 처치하는 방법으로서, ［11］ 또는 ［12］에 기재된 세포를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
［16］ 암을 처치하기 위한, ［11］ 또는 ［12］에 기재된 세포.
［17］ 암의 처치에 이용하는 의약 조성물을 제조하기 위한, ［11］ 또는 ［12］에 기재된 세포의 사용.
［18］ 암의 처치에 이용하는 세포를 제조하는 방법으로서, ［1］∼［8］ 중 어느 한 항에 기재된 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함하는, 방법.
［19］ 세포의 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함하는, ［18］에 기재된 방법.
［20］ 암의 처치에 이용하는 세포를 제조하는 방법으로서,
인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정, 또는
내재적으로 CD1d를 발현하는 인간 유래 세포에 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정
을 포함하는, 방법.
［21］ 상기 공정에서 얻어진 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 추가로 포함하는, ［20］에 기재된 방법.
［22］ 세포의 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함하는, ［21］에 기재된 방법.
［23］ 암을 처치하는 방법으로서, ［11］ 또는 ［12］에 기재된 세포와 면역 체크포인트 저해제를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
［24］ 면역 체크포인트 저해제가 PD-1계 면역 체크포인트 저해제, 또는 CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제인, ［23］에 기재된 방법.
［25］ 암의 처치에 이용하는 의약 조성물을 제조하는 방법으로서,
CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 또한, 클로닝 된 인간 유래의 세포를 포함하는 동결물을 해동하는 공정,
동결물 중에 포함되어 있던 상기 인간 세포를 증식시켜, NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정,
및, 그 세포의 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정
을 포함하는, 방법.
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포 및 본 발명의 의약 조성물은, 암의 처치에 사용할 수 있다.
[도 1a] 도 1a는 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포에 의한 항원 특이적 T 세포 유도 작용을, aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여 마우스에 있어서의 NY-ESO-1 특이적 T 세포의 수에 의해 나타내고 있다. 세로축은 ELISPOT 리더로 카운트했을 때의 4×105 비장 세포 중의 스폿수를 나타낸다. 가로축의 용매는 BICANATE를 투여한 컨트롤군을, aAVC-NY는 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여군을 각각 나타낸다. PAP 및 NY는, 각각 자극에 이용한 PAP 펩티드 및 NY-ESO-1 펩티드를 나타낸다. 「-」는, 펩티드 첨가 없음을 나타낸다. 개체마다의 스폿수와 스폿수의 평균치±평균의 표준 오차를 나타낸다.
[도 1b] 도 1b는 NY-ESO-1 발현 B16 담암 마우스 및 B16-F10 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포의 항종양 효과를 나타낸다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 암 세포 접종 후 일수를 나타낸다. 세로선은 평균치±평균의 표준 오차를 나타내고, 괄호 내는 계측 시의 마우스의 마릿수를 나타낸다. 유의 확률 P치(**: P＜0.01)은, 스튜던트의 t 검정에 의해 용매 투여군과 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여군의 20일째의 종양 체적을 비교하는 것에 의해 산출했다.
[도 1c] 도 1c는 NY-ESO-1 발현 B16 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포의 항종양 효과를 나타낸다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여 후 일수를 나타낸다. 세로선은 평균치±평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의 확률 P치(**: P＜0.01)은, 더넷의 다중 비교 검정에 의해 용매 투여군과 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여군의 10일째의 종양 체적을 비교하는 것에 의해 산출했다.
[도 2a] 도 2a∼도 2d는 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀(도 중의 CMV) 및 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀(도 중의 Tet-on)의 각종 지표에 대한 경시 변화를 나타낸다. 도 2a는 CMV 및 Tet-on의 1×106세포당의 NY-ESO-1 발현량을 나타낸다. 세로축은 NY-ESO-1의 발현량을 나타내고, 가로축은 감염 후 배양 일수를 나타낸다.
[도 2b] 도 2b는 CMV 및 Tet-on의 NY-ESO-1 양성률을 나타낸다. 세로축은 NY-ESO-1 양성률을 나타내고, 가로축은 감염 후 배양 일수를 나타낸다.
[도 2c] 도 2c는 CMV 및 Tet-on의 생존율을 나타낸다. 세로축은 각 풀의 세포 생존율을 나타내고, 가로축은 감염 후 배양 일수를 나타낸다.
[도 2d] 도 2d는 CMV 및 Tet-on의 세포의 배가 시간을 나타낸다. 세로축은 배가 시간을 나타내고, 가로축은 감염 후 배양 일수를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀(도 중의 CMV)과 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀(도 중의 Tet-on)로부터 단리 한 각종 클론에 있어서의 NY-ESO-1 발현량을 나타낸다. No.는 클론의 번호를 나타내고, 수치는 1×106세포당의 NY-ESO-1 발현량을 나타낸다.
[도 4a] 도 4a는 NY-ESO-1 발현 B16 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포, 항PD-1 항체 및 그들을 병용했을 경우의 항종양 효과를 나타낸다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여 후 일수를 나타낸다. 세로선은 평균치±평균의 표준 오차를 나타내고, 괄호 내는 계측 시의 마우스의 마릿수를 나타낸다.
[도 4b] 도 4b는 NY-ESO-1 발현 CT26 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포, 항PD-1 항체 및 그들을 병용했을 경우의 항종양 효과를 나타낸다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여 후 일수를 나타낸다. 세로선은 평균치±평균의 표준 오차를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 NY-ESO-1 발현 CT26 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포, 항CTLA-4 항체 및 그들을 병용했을 경우의 항종양 효과를 나타낸다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 암 세포 접종 후 일수를 나타낸다. 세로선은 평균치±평균의 표준 오차를 나타낸다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포, 항CTLA-4 항체의 병용군의 18일째 이후의 예 수는 9로 한다.
이하에, 본 발명에 대해 상술하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련하여 이용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다.
＜인공 아주반트 벡터 세포＞
본 명세서에 있어서, 「인공 아주반트 벡터 세포」와 「aAVC」는, 동의이며, 상호 호환적으로 이용되고, CD1d 폴리펩티드(이하, 「CD1d」라고도 칭한다)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 1 또는 2 이상의 임의의 암 항원 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「폴리뉴클레오티드를 포함하는」이란, 세포가 내재적으로 해당 폴리펩티드를 갖고 있거나, 또는 외래적인 방법에 의해 해당 폴리뉴클레오티드가 도입된 상태를 나타낸다. 여기에서 「내재」 또는 「내재적」이란, 단리 된 세포가 특정의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있거나, 또는 단백질을 발현하고 있는 등의 당업자에 의해 통상 사용되는 의미로 사용될 수 있다. 또한, 「외래성」 또는 「외래적」이란, 인공적으로 제작된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 유전자 조작 또는 유전자 도입 등의 조작에 의해 목적하는 세포 내에 도입하는 것, 및 목적하는 세포 내에 인위적으로 도입된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 그들이 코딩하는 단백질을 인위적으로 발현시키는 것을 가리키는 용어로서 상호 호환적으로 사용된다.
＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포＞
본 발명은,
CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는, 인간 유래 세포(본 명세서에 있어서, 「aAVC-NY-ESO-1 세포」라고도 칭한다)를 제공한다.
1. 인간 유래 세포
본 발명에서 사용되는 인간 유래 세포는, 정상 세포 또는 암 조직 유래의 세포이며, CD1d를 내재적으로 발현하고 있어도 된다.
정상 세포로서는, 임의의 인간 조직으로부터 단리 및/또는 정제된 세포, 특정의 세포종 유래의 세포, 인간 조직 유래의 주화 세포, 줄기세포로부터 분화시킨 세포 등의 인간 유래의 세포를 이용할 수 있다. 또한, 암 조직 유래의 세포로서는, 환자의 암 조직으로부터 단리 및/또는 정제된 세포, 또는 인간 암 조직 유래의 주화 세포를 이용할 수 있다. 여기에서, 「단리」란, 생체 조직으로부터의 분리를 의미한다. 또한, 「정제」란, 인간 유래의 세포를, 세포가 유래하는 조직에 포함되는 그 외의 성분의 1 이상으로부터의 분리를 의미한다. 세포의 단리 및 정제는, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 인간 유래 세포는, 정상 세포이다.
임의의 인간 조직으로부터 단리 및/또는 정제된 세포는, 예를 들어, 위, 소장, 대장, 폐, 췌장, 신장, 간장, 흉선, 비장, 전립선, 난소, 자궁, 골수, 피부, 근육, 또는 말초혈 등의 임의의 인간 조직 유래의 세포여도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 인간 유래 세포는, 비혈구 세포이다.
특정의 세포종 유래의 세포는, 인간 조직에 있어서의 특정의 세포종(예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 표피 세포, 간질 세포, 섬유아세포, 지방 조직, 유선 세포, 메산지움 세포, 췌β 세포, 신경 세포, 신경교 세포, 외분비 상피 세포, 내분비 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 골아세포, 배세포, 또는 면역 세포(예를 들어, 수상 세포, 매크로파지, B 세포 등) 등) 유래의 세포이다.
인간 조직 유래의 주화 세포는, 당업자에 의해 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있거나 또는 상업적으로 입수할 수 있다. 당해 주화 세포로서는, 예를 들어, 인간 태아 신장 세포 293(HEK293) 세포(J. Gen. Virol.; 1977; 36:59-74), WI-38 세포, SC-01MFP 세포, 혹은 MRC-5 세포, 또는 그들 세포에서 유래하는 세포를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 인간 유래 세포는, HEK293 세포에서 유래하는 세포이다. 하나의 실시형태에 있어서, HEK293 세포에서 유래하는 세포는, FreeStyleTM 293-F 세포이다.
줄기세포로부터 분화시킨 세포는, 인간 유래 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 또는 배성 줄기세포(ES 세포)로부터 분화시킨 세포이다. iPS 세포 또는 ES 세포의 제작 및 해당 세포로부터 분화시킨 세포는, 당업자에 의해 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
암 조직 유래의 세포는, 당업자에게 공지된 방법에 의해, 환자의 암 조직으로부터 단리 및/또는 정제에 의해 취득할 수 있다. 또한, 당업자가 American Type Culture Collection(ATCC(등록상표)) 등의 기관으로부터 일반적으로 입수 가능한 인간 암 조직 유래의 주화 세포를 이용할 수도 있다.
2. NY-ESO-1
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 암 항원으로서 뉴욕 식도 편평상피암 1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1; NY-ESO-1) 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. NY-ESO-1은, 암/정소 항원 1(cancer/testis antigen 1; CTAG1)이라고도 불리는 단백질이며, 다양한 암에 있어서 발현이 인정되지만, 성체의 정상 조직에서는 정소에만 발현함이 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 NY-ESO-1은, 천연에 존재하는 NY-ESO-1이어도 되고, 또는, aAVC로서 투여했을 경우에 NY-ESO-1 특이적 T 세포를 유도하는 한, 그의 개변체여도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 NY-ESO-1은, 포유동물(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 침팬지 등) 유래의 NY-ESO-1이다. 하나의 실시형태에 있어서, NY-ESO-1은, 인간 NY-ESO-1이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 NY-ESO-1은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 NY-ESO-1은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 NY-ESO-1은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼7개, 보다 더 바람직하게는 1∼5개, 1∼3개, 또는 1∼2개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 NY-ESO-1은, aAVC로서 투여했을 경우에 NY-ESO-1 특이적 T 세포를 유도하는 한, NY-ESO-1의 단편이어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, NY-ESO-1의 단편은, 인간 NY-ESO-1의 단편이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 NY-ESO-1의 단편은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열의, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 길이를 갖는 폴리펩티드이다. aAVC로서 투여하는 것에 의한 NY-ESO-1 특이적 T 세포의 유도는, 예를 들어, 후기 실시예 1-2에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 사용되는 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 아미노산 서열로부터 염기 서열을 설계하여, 제작할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, NY-ESO-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에 있어서의 「동일성」이란, EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.; 2015;43:W580-W584)을 이용하여, 디폴트로 준비되어 있는 파라미터에 의해 얻어진 Identity의 값을 의미한다. 상기의 파라미터는 이하와 같다.
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
3. CD1d
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. CD1d는, 세포 표면에 발현하는 MHC 클래스 I양(樣) 당단백질이다. 본 발명에서 사용되는 CD1d는, 인간 유래 세포에 있어서 발현시켰을 경우에 CD1d의 기능을 갖는 한에 있어서, 천연에 존재하는 CD1d 또는 그의 개변체여도 된다. CD1d의 기능으로서는, CD1d 리간드(예를 들어, α-GalCer)에 결합하는 능력을 들 수 있다. CD1d의 CD1d 리간드로의 결합능은 공지된 방법을 이용하여 당업자에게 용이하게 평가 될 수 있다. 또한, CD1d의 기능은, aAVC에 의한 인간 NKT 세포를 활성화하는 능력을 지표로 평가할 수도 있다. 이 인간 NKT 세포의 활성화능은, 예를 들어, 비특허문헌 5의 Fig. 1에 기재된 invitro의 평가계에 있어서 평가할 수 있다. 간단하게는, α-GalCer 존재하에서 배양한 CD1d 발현 세포를 NKT 세포와 공배양하고, 배양액 중의 IFN-γ의 양을 측정하는 것에 의해, NKT 세포의 활성화를 평가할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 CD1d는 포유동물(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 침팬지 등) 유래의 CD1d이다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d는 인간 CD1d이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 CD1d는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 CD1d는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1∼10개, 1∼7개, 1∼5개, 1∼3개, 또는 1∼2개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, CD1d의 기능을 갖는 폴리펩티드이다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 CD1d는, 서열 번호 4에 나타나는 폴리펩티드와 적어도 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, CD1d의 기능을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에서 사용되는 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 사용되는 인간 유래 세포에 내재하는 폴리뉴클레오티드여도 되고, 또는, 외래적으로 도입된 폴리뉴클레오티드여도 된다. CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인간 유래 세포에 외래적으로 도입하는 경우, 해당 폴리뉴클레오티드는, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 사용되는 CD1d의 아미노산 서열로부터 염기 서열을 설계하여, 제작할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다.
4. 프로모터
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서, NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 본 명세서에 있어서, 「작동 가능하게 연결된」이란, 숙주 세포에 있어서의 폴리펩티드의 발현을 프로모터에 의해 제어하기 위해서 당해 프로모터가 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있는 상태를 의미한다. 또한, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인간 유래 세포에 외래적으로 도입하는 경우, 해당 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 작동 가능하게 연결시켜도 된다. 이 경우, CD1d를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 항상적으로 발현을 촉진하는 프로모터 또는 유도형 프로모터의 어느 것도 이용할 수 있다.
「유도형 프로모터」란, 유도적으로 발현을 촉진하는 프로모터이며, 당해 프로모터를 구동하는 유도 인자(본 명세서에 있어서, 「유도형 프로모터의 유도 인자」 또는 간단히 「유도 인자」라고도 칭한다)의 존재하에 있어서, 해당 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 말한다. 유도형 프로모터로서는, 예를 들어, 온열 유도형 프로모터(예를 들어, 히트쇼크 프로모터), 약제 유도형 프로모터를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 유도형 프로모터는, 약제 유도형 프로모터이다. 본 명세서에 있어서, 「약제 유도형 프로모터」란, 유도 인자인 약제에 의해 해당 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절되는 프로모터를 의미한다. 약제 유도형 프로모터로서는, 예를 들어, Cumate 오퍼레이터 서열, λ 오퍼레이터 서열(예를 들어, 12×λOp), 테트라사이클린 유전자 발현 유도계의 유도형 프로모터(이하, 「테트라사이클린계 유도형 프로모터」라고 한다) 등을 들 수 있다. Cumate 오퍼레이터 서열은, CymR 리프레서 존재하에 있어서 불활성이지만, 유도 인자인 Cumate의 존재하에 있어서, CymR 리프레서와 해리되어, 해당 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. λ 오퍼레이터 서열은, 이량체화에 의해 전사 활성화능을 갖는 액티베이터(λRep-GyrB-AD)를 이량체화하는 유도 인자(예를 들어, 쿠머마이신)의 존재하에 있어서, 해당 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 테트라사이클린계 유도형 프로모터는, 유도 인자인 테트라사이클린 또는 그의 유도체(예를 들어, 독시사이클린 등) 및 리버스 테트라사이클린 제어성 트랜스 활성화 인자(rtTA)(예를 들어, Tet-On 3G)의 존재하에 있어서, 해당 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 테트라사이클린계 유도형 프로모터로서는, 예를 들어, TRE3G 프로모터를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 약제 유도형 프로모터는, 테트라사이클린계 유도형 프로모터이며, 하나의 실시형태에 있어서, 테트라사이클린계 유도형 프로모터는, TRE3G 프로모터이다.
항상적으로 발현을 촉진하는 프로모터로서는, 예를 들어, CMV(cytomegalovirus), RSV(respiratory syncytial virus), SV40(simian virus 40) 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터 등을 들 수 있다.
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서, 당해 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현이 유도될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량의 하한치는, 106세포당 88ng을 초과하는, 90ng 이상, 100ng 이상, 150ng 이상, 200ng 이상, 245ng 이상, 250ng 이상, 300ng 이상, 400ng 이상, 500ng 이상, 600ng 이상, 700ng 이상, 800ng 이상, 900ng 이상, 1000ng 이상, 1500ng 이상, 2000ng 이상, 2500ng 이상, 3000ng 이상, 4000ng 이상, 5000ng 이상, 6000ng 이상, 7000ng 이상, 8000ng 이상, 9000ng 이상, 또는 10000ng 이상이며, 상한치는 30000ng 이하, 35000ng 이하, 40000ng 이하, 43890ng 이하, 45000ng 이하, 50000ng 이하, 55000ng 이하, 60000ng 이하이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼50000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼35000ng이다.
5. CD1d 리간드
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 세포 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, 「세포 표면에 CD1d 리간드를 적재한」이란, aAVC 세포의 표면에 CD1d 리간드가 결합하고 있는 상태를 가리킨다.
세포 표면에의 CD1d 리간드의 적재는, ＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법＞의 항에 기재된 바와 같이, CD1d를 발현하는 세포에 CD1d 리간드(예를 들어, α-GalCer)를 펄스하는 것에 의해 행할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「CD1d 리간드를 펄스하는」이란, 배양 배지 중에서 세포를 CD1d 리간드와 접촉시키는 것을 가리킨다. CD1d 리간드를 펄스된 aAVC에 있어서는, 모든, 또는 적어도 일부의 CD1d에 CD1d 리간드가 적재되어 있다.
본 발명에서 사용되는 CD1d 리간드로서는, 예를 들어, α-갈락토실세라마이드(α-GalCer), α-C-갈락토실세라마이드(α-C-GalCer), 7DW8-5, 아이소글로보트라이헥소실세라마이드(iGb3) 등이 존재한다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다. α-GalCer은, 화학명은 (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데케인트라이올이며, CAS RN: 158021-47-7로 등록되고, 분자식: C50H99NO9로 표시되는 물질(분자량: 858.34)이다. α-GalCer은, 당해 분야에서 공지된 기술에 따라 합성해도 되고, 상업적으로 입수 가능한 것(예를 들어, α-Galactosylceramide(후나코시, Cat. KRN7000))을 사용해도 된다.
＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법＞
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 인간 유래 세포에, 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및, 필요에 따라서, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 제작할 수 있다. 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법은, 추가로 aAVC-NY-ESO-1 세포를 배양하는 공정, 세포를 클로닝하는 공정, 및 세포 표면에 CD1d 리간드를 적재시키는 공정을 포함하고 있어도 된다.
1. 인간 유래 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 제작할 수 있다(이하, 도입되는 폴리뉴클레오티드를 「목적 폴리뉴클레오티드」라고도 칭한다). 혹은, 인간 유래 세포로서 CD1d를 내재적으로 발현하는 세포를 이용하는 경우에는, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d를 내재적으로 발현하는 인간 유래 세포에 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 제작할 수 있다.
CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, NCBI RefSeq ID나 GenBank의 Accession 번호로부터 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 취득하여, 표준적인 분자생물학 및/또는 화학적 수법을 이용하여 설계 및 제작할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는, 그의 염기 서열에 기초하여 포스포로아미다이트법 등을 이용하여 합성할 수 있고, 또한 cDNA 라이브러리로부터 폴리메라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 얻어지는 DNA 단편을 조합하여 제작할 수 있다.
인간 유래 세포로의 목적 폴리뉴클레오티드의 도입은, 일렉트로포레이션, 리포펙션, 현미경하 주사법 등의 비바이러스 벡터계의 방법 또는 바이러스 벡터계의 어느 것인가의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 비바이러스 벡터계의 방법을 이용하는 경우는, 목적 폴리뉴클레오티드는, 플라스미드 벡터, cDNA 등의 형태 또는 mRNA의 형태여도 된다.
플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는, 인간 유래 세포 중에서 CD1d 또는 NY-ESO-1 혹은 그의 단편을 외래적으로 발현시키기 위한 발현 벡터로서 사용할 수 있다. 발현 벡터는, 목적으로 하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 당업자에 의해 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 발현 벡터는, 플라스미드 벡터로서는, 예를 들어, pcDNA 시리즈(Thermo Fisher Scientific사), pALTER(등록상표)-MAX(프로메가), 또는 pHEK293 Ultra Expression Vector(다카라 바이오사) 등)를 사용할 수 있고, 바이러스 벡터로서는, 예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노 수반 바이러스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 유래 세포로의 목적 폴리뉴클레오티드의 도입에 렌티바이러스를 사용하는 경우, 해당 렌티바이러스는, pLVSIN-CMV/EF1α 벡터(다카라 바이오사), pLenti 벡터(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여 제작할 수 있다. 인간 유래 세포에 있어서 CD1d와 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 외래적으로 발현시키는 경우, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 1개의 발현 벡터를 이용하여 인간 유래 세포에 도입해도 되고, 별도의 발현 벡터를 이용하여 도입해도 된다. 또한, 발현 벡터에는, 목적으로 하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 확인하기 위한 마커가 될 수 있는 유전자(예를 들어, 약제 내성 유전자, 리포터 효소를 코딩하는 유전자, 또는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 등)를 포함하고 있어도 된다. 발현 벡터는, 추가로 개시 코돈 및 종지 코돈, 인핸서 서열, 비번역 영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법은, 인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법은, 인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법은, 내재적으로 CD1d를 발현하는 인간 유래 세포에, 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 공정을 포함한다. 이들 방법에 대해, 하나의 실시형태에 있어서, 발현 벡터는, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이고, 하나의 실시형태에 있어서, 발현 벡터는, 바이러스 벡터이고, 하나의 실시형태에 있어서, 바이러스 벡터는, 렌티바이러스 벡터이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 제작된 세포이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 제작된 세포이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 내재적으로 CD1d를 발현하는 인간 유래 세포에, 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 제작된 세포이다. 이들 세포에 대해, 하나의 실시형태에 있어서, 발현 벡터는, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이고, 하나의 실시형태에 있어서, 발현 벡터는, 바이러스 벡터이고, 하나의 실시형태에 있어서, 바이러스 벡터는, 렌티바이러스 벡터이다. 하나의 실시형태에 있어서, 제작된 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 염색체외 또는 세포핵의 게놈 DNA 상에, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 하나의 실시형태에 있어서, 제작된 세포는, 그 세포핵의 게놈 DNA 상에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는다.
2. aAVC-NY-ESO-1 세포의 배양
상기의 방법으로 제작된 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 추가로 배양에 의해 증식시킬 수 있다. aAVC-NY-ESO-1 세포를 유지하기 위해, 또는 증식시키기 위한 세포의 배양은, 공지된 방법에 의해 행해진다. 기초 배지로서는, 예를 들어, MEM 배지(Science; 1952; 122:501), DMEM 배지(Virology; 1959; 8:396-397), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199:519-524), 199 배지(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ; 1950; 73:1-8), FreeStyleTM293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 12338022), CD293 Medium(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 11913019), Expi293TM Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사, Cat. A1435101)을 사용할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어, 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청), 혈청 대체물(예를 들어, Knock Out Serum Replacement: KSR), 지방산 또는 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류, 항생 물질 등을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 배양에 사용되는 배지는, 무혈청 배지 또는 화학적으로 정의된 배지이다.
배양 조건(예를 들어, 배양 시간, 온도, 배지의 pH, CO2 농도 등의 배양 조건)은 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하고, 배양 온도는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 약 30∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한, CO2 농도는 약 1∼10%, 바람직하게는 약 5%이다. 배양 시간은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 15∼336시간 행해진다. 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.
aAVC-NY-ESO-1 세포의 배양 시에 aAVC-NY-ESO-1 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자에 접촉시켜, NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시켜도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법은, aAVC-NY-ESO-1 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 유도형 프로모터는 약제 유도형 프로모터이며, 당해 제작 방법은, aAVC-NY-ESO-1 세포를 약제 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 공정을 포함한다. 약제 유도형 프로모터를 사용하는 경우, 유도 인자인 테트라사이클린, 독시사이클린, Cumate, 쿠머마이신 등의 약제를 가한 배지에서 세포를 배양하여, 약제 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도시켜도 된다. 당해 공정은, 일반적인 유전자 유도 시스템을 이용한 유전자 유도 방법에 준거하여 행할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 약제 유도형 프로모터는 테트라사이클린계 유도형 프로모터이며, 당해 제작 방법은, aAVC-NY-ESO-1 세포를 테트라사이클린 또는 그의 유도체 및 rtTA의 존재하에서 배양하는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 테트라사이클린계 유도형 프로모터는 TRE3G 프로모터이며, 당해 제작 방법은, aAVC-NY-ESO-1 세포를 테트라사이클린 또는 그의 유도체 및 Tet-On 3G의 존재하에서 배양하는 공정을 포함한다. 얻어진 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 항CD1d 항체 또는 항NY-ESO-1 항체를 이용한 Western Blot법, ELISA법, 플로 사이토메트리법 등의 당업자에 의해 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
3. aAVC-NY-ESO-1 세포의 클로닝
세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우, 목적 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포 및 도입되어 있지 않은 세포가 혼재하고 있기 때문에, 더욱이, 목적 폴리뉴클레오티드를 세포핵의 게놈 DNA 상에 짜넣는 경우에는, 그 짜넣어지고 있는 장소도 세포에 따라 상이하기 때문에, 불균질(heterogeneous)한 세포의 집단이 되어 있는 경우가 있다. 본 명세서에 있어서, 상기의 불균질한 세포의 집단을 「세포 풀」이라고 칭한다. 해당 세포 풀로부터 단일의 유전자형을 갖는 세포를 취득하는 방법(본 명세서에서, 「클로닝」이라고 한다)에 의해, CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 1 세포(이하, 「클론화된 세포」라고 한다.)를 취득하여 증식시키는 것에 의해, 단일의 유전자형을 갖는 세포 집단(이하, 「클론화된 세포의 집단」이라고 한다.)을 취득할 수 있다. aAVC-NY-ESO-1 세포의 클로닝은, 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 실시할 수 있고, 예를 들어, 한외 희석법, 싱글셀 소팅법, 또는 콜로니 픽업법을 이용할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포의 클로닝 방법은 한외 희석법, 싱글셀 소팅법, 또는 콜로니 픽업법의 1 또는 2 이상의 방법을 조합하여 이용할 수도 있다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포의 클로닝 방법은 한외 희석법이다.
상기 방법으로 취득된 각 클론화된 aAVC-NY-ESO-1 세포에 대해, 그 일부를 유도형 프로모터의 유도 인자에 접촉시키고, 얻어진 세포에 있어서의 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량을 측정하는 것에 의해, 유도 인자의 존재하에 있어서 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편에 대해 목적하는 발현량을 나타내는, 클론화된 aAVC-NY-ESO-1 세포의 집단을 선택할 수 있다. 선택한 클론화된 세포의 집단을 동결 상태로 보존한 것(또는 「동결물」이라고도 말한다)을, 리서치 셀 뱅크(RCB)로서 사용할 수 있다. RCB의 세포를 배양하여 증식시키고, 동결시킨 것을 마스터 셀 뱅크(MCB)로서 사용할 수 있다. MCB의 세포를 배양하여 증식시키고, 동결시킨 것을 워킹 셀 뱅크(WCB)로서 사용할 수 있다. WCB의 세포를 배양한 것을 의약품의 원료로서 사용할 수 있다. 각 셀 뱅크는, 동결 보호제를 포함해도 된다. 각 셀 뱅크는, 복수의 용기(예를 들어, 2∼10000의 용기, 예를 들어, 10∼1000의 용기, 예를 들어, 100∼500의 용기)에 분주되어, 동결 상태로 보관해도 된다. 클론화된 aAVC-NY-ESO-1 세포의 해동, 배양, 및 유도 인자와의 접촉, 및 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량의 측정은 각각, 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있고, 배양, 유도 인자와의 접촉, 및 발현량의 측정은, 예를 들어, 「2. aAVC-NY-ESO-1 세포의 배양」에 기재된 방법 등을 사용하여 행할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 클론화된 aAVC-NY-ESO-1 세포의 배양, 및 유도 인자와의 접촉, 및 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량의 측정은, RCB 및 WCB의 해동 후에 행할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량의 하한치는, 106세포당 88ng을 초과하는, 90ng 이상, 100ng 이상, 150ng 이상, 200ng 이상, 245ng 이상, 250ng 이상, 300ng 이상, 400ng 이상, 500ng 이상, 600ng 이상, 700ng 이상, 800ng 이상, 900ng 이상, 1000ng 이상, 1500ng 이상, 2000ng 이상, 2500ng 이상, 3000ng 이상, 4000ng 이상, 5000ng 이상, 6000ng 이상, 7000ng 이상, 8000ng 이상, 9000ng 이상, 또는 10000ng 이상이며, 상한치는 30000ng 이하, 35000ng 이하, 40000ng 이하, 43890ng 이하, 45000ng 이하, 50000ng 이하, 55000ng 이하, 60000ng 이하이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼50000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, 얻어지는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼35000ng이다.
4. aAVC-NY-ESO-1 세포로의 CD1d 리간드의 적재
aAVC-NY-ESO-1 세포에 CD1d 리간드를 펄스하는 것에 의해, CD1d 리간드를 적재한 aAVC-NY-ESO-1 세포를 제작할 수 있다. CD1d 리간드를 펄스하는 조건(예를 들어, 세포의 배양 배지에 CD1d 리간드를 첨가하는 타이밍, 배양 배지 중의 CD1d 리간드의 농도 및 배양 시간 등)은, 사용하는 세포 및 배양 시의 제 조건을 고려하여 당업자에서 적절히 조정될 수 있다. aAVC-NY-ESO-1 세포의 배양 배지에 첨가하는 CD1d 리간드의 농도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 1ng/mL∼10000ng/mL의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포로의 CD1d 리간드의 적재는, 해당 세포와 유도 인자의 접촉 전에 행해질 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포로의 CD1d 리간드의 적재는, 해당 세포와 유도 인자의 접촉 후에 행해질 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포로의 CD1d 리간드의 적재는, 해당 세포와 유도 인자의 접촉과 동시에 행해질 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포는, 바람직하게는, 클론화되어 있다.
상기에서 제작한 CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, CD1d 리간드를 적재하고 있는 aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서, 해당 세포의 증식을 인위적인 방법을 이용하여 정지시켜도 된다. 당해 세포의 증식을 정지시키는 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 방사선(예를 들어, X선) 조사로 세포 증식을 정지시키는 방법, 마이토마이신 C 등의 약제를 첨가하는 방법 등을 사용할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 증식을 정지시킨 세포일 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, CD1d 리간드를 적재하여, 증식을 정지시킨 세포일 수 있다.
＜본 발명의 의약 조성물 등＞
본 발명은 또한, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 당해 의약 조성물에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 해당 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 의약 조성물은, 암의 처치에 이용하기 위한 의약 조성물이다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다. 당해 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 의약 조성물의 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, aAVC-NY-ESO-1 세포의 동결물을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, aAVC-NY-ESO-1 세포의 동결물 및 동결 보호제를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, aAVC-NY-ESO-1 세포의 현탁액을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, aAVC-NY-ESO-1 세포의 현탁액 및 동결 보호제를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 암의 처치에 이용하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 사용으로서, 해당 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 해당 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있는, 사용을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다. 본 발명은 또한, 암을 처치하기 위한 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포로서, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 해당 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있는, 세포를 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암을 처치하는 방법을 제공한다. 당해 방법에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 해당 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있다. 하나의 실시형태에 있어서, CD1d 리간드는, α-GalCer이다. 본 명세서에 있어서, 「대상」이란, 포유동물(예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 침팬지 등)이며, 하나의 실시형태에 있어서, 대상은 인간이다. 본 명세서에 있어서, 「처치」란, 치료적 처치 및 예방적 처치를 포함하는 의미로 이용된다. aAVC-NY-ESO-1 세포를 대상에게 투여하는 경우, aAVC-NY-ESO-1 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물의 형태로 대상에게 투여할 수 있다. 대상으로의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 투여량 및 투여 횟수는, 암의 종류, 위치, 중증도, 처치를 받는 대상의 연령, 체중 및 상태 등에 따라서 적절히 조절할 수 있다. aAVC-NY-ESO-1 세포의 투여량은, 예를 들어, 대상으로의 1회의 투여에 있어서 1×103cells/kg∼1×109cells/kg을 이용할 수 있다. 대상으로의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 투여 방법으로서는, 예를 들어, 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 또는 동맥내 등으로의 주사 또는 점적에 의해 투여할 수 있다. 본 발명의 처치 방법은, 다른 암 치료 방법과 병용하여 이용할 수 있다. 다른 암 치료 방법으로서는, 수술, 방사선 치료, 조혈 줄기세포 이식, 또는, 다른 항암제에 의한 치료를 들 수 있다.
본 발명의 처치의 대상이 되는 암으로서는, 특별히 한정은 되지 않지만, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 호지킨 림프종, 논호지킨 림프종, B 세포 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종 등의 혈액암, 골수 이형성 증후군, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 중피종, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 두경부암, 자궁암, 자궁경암, 간장암, 담낭암, 담관암, 신장암, 췌장암, 폐암, 결장암, 대장암, 직장암, 소장암, 위암, 식도암, 정소암, 난소암, 뇌종양 등의 고형암, 및 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외에, 연골 육종, 유잉 육종, 악성 혈관 내피종, 악성 슈완종, 골 육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 골수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종, 흉막폐아종, 및 망막아종 등의 아종 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 처치의 대상이 되는 암은, NY-ESO-1 양성의 암이다.
본 발명의 의약 조성물, 사용, 세포, 및 암의 처치 방법에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 106세포당의 발현량은, 예를 들어, 하한치는 88ng을 초과하는, 90ng 이상, 100ng 이상, 150ng 이상, 200ng 이상, 245ng 이상, 250ng 이상, 300ng 이상, 400ng 이상, 500ng 이상, 600ng 이상, 700ng 이상, 800ng 이상, 900ng 이상, 1000ng 이상, 1500ng 이상, 2000ng 이상, 2500ng 이상, 3000ng 이상, 4000ng 이상, 5000ng 이상, 6000ng 이상, 7000ng 이상, 8000ng 이상, 9000ng 이상, 또는 10000ng 이상이며, 상한치는 30000ng 이하, 35000ng 이하, 40000ng 이하, 43890ng 이하, 45000ng 이하, 50000ng 이하, 55000ng 이하, 60000ng 이하이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량의 하한치는, 106세포당 88ng을 초과하는, 90ng 이상, 100ng 이상, 150ng 이상, 200ng 이상, 245ng 이상, 250ng 이상, 300ng 이상, 400ng 이상, 500ng 이상, 600ng 이상, 700ng 이상, 800ng 이상, 900ng 이상, 1000ng 이상, 1500ng 이상, 2000ng 이상, 2500ng 이상, 3000ng 이상, 4000ng 이상, 5000ng 이상, 6000ng 이상, 7000ng 이상, 8000ng 이상, 9000ng 이상, 또는 10000ng 이상이며, 상한치는 30000ng 이하, 35000ng 이하, 40000ng 이하, 43890ng 이하, 45000ng 이하, 50000ng 이하, 55000ng 이하, 60000ng 이하이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼50000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 89ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 106ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 245ng∼35000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼45000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼43890ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼40000ng이다. 하나의 실시형태에 있어서, aAVC-NY-ESO-1 세포에 있어서의 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량은, 1000ng∼35000ng이다.
＜암의 처치에 이용하는 세포 또는 의약 조성물의 제조 방법＞
본 발명은 또한, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자에 접촉시켜 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함하는, 암의 처치에 이용하는 세포 또는 의약 조성물의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 제조 방법은, 당해 aAVC-NY-ESO-1 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 제조 방법은, 세포 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함한다. 세포 표면으로의 CD1d 리간드의 적재는, aAVC-NY-ESO-1 세포와 유도 인자의 접촉 전이어도 후여도 동시여도 된다. 본 발명은 또한, 암의 처치에 이용하는 의약 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한, 이하의 공정을 포함하는, 암의 처치에 이용하는 세포 또는 의약 조성물의 제조 방법을 제공한다:
인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정, 또는
내재적으로 CD1d를 발현하는 인간 유래 세포에 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정.
하나의 실시형태에 있어서, 당해 제조 방법은, 상기 공정에서 얻어진 세포(aAVC-NY-ESO-1 세포)를 유도형 프로모터의 유도 인자에 접촉시켜 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 제조 방법은, 당해 aAVC-NY-ESO-1 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 당해 제조 방법은, 세포 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함한다. 세포 표면으로의 CD1d 리간드의 적재는, aAVC-NY-ESO-1 세포와 유도 인자의 접촉 전이어도 후여도 동시여도 된다.
본항에 기재된 제조 방법에 이용하는 세포 및 공정 등에 관한 구체적인 실시형태에 대해서는, 상기의 ＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포＞ 및 ＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 방법＞의 항에 기재한 바와 같다.
＜본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제의 병용＞
본 발명은 또한, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암을 처치하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 면역 체크포인트 저해제와 병용되는, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포를 포함하는 암을 처치하기 위한 의약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 면역 체크포인트 저해제와 병용되는, 암을 처치하기 위한 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 면역 체크포인트 저해제와 병용되는, 암의 처치에 이용하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 사용을 제공한다. 당해 방법, 의약 조성물, 세포 또는 사용에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고, 해당 세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있다.
본 명세서에 있어서, 「면역 체크포인트 저해제」란, 면역 체크포인트 분자에 의해 야기되는 면역 세포의 억제를 해제하는 것에 의해 면역을 부활(賦活)하는 약제를 의미한다. 면역 체크포인트 분자로서는, 프로그램 세포사-1(Programmed cell death 1; PD-1), 세포 상해성 T 림프구 관련 단백질 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CTLA-4), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3; TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3(lymphocyte activation gene 3; LAG-3), 및 V형 면역글로불린 도메인 함유 T 세포 활성화 억제 인자(V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation; VISTA) 등을 들 수 있다. 이들 분자가 담당하는 면역 체크포인트는 PD-1계 면역 체크포인트, CTLA-4계 면역 체크포인트, TIM-3계 면역 체크포인트, LAG-3계 면역 체크포인트, 및 VISTA계 면역 체크포인트로 불린다. 면역 체크포인트 저해제는, 예를 들어 면역 체크포인트 분자 또는 그의 리간드에 결합하여, 면역 체크포인트의 기능을 저해할 수 있다. 예를 들어, PD-1계 면역 체크포인트 저해제는, PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 결합을 저해하는 것에 의해 PD-1계 면역 체크포인트를 저해할 수 있다. 또한, CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제는, CTLA-4와 CD80 또는 CD86의 결합을 저해하는 것에 의해 CTLA-4계 면역 체크포인트를 저해할 수 있다. 또한, TIM-3계 면역 체크포인트 저해제는, TIM-3과 갈렉틴 9의 결합을 저해하는 것에 의해 TIM-3계 면역 체크포인트를 저해할 수 있다. 또한, LAG-3계 면역 체크포인트 저해제는, LAG-3과 MHC 클래스 II 분자의 결합을 저해하는 것에 의해 LAG-3계 면역 체크포인트를 저해할 수 있다. 또한, VISTA계 면역 체크포인트 저해제는, VISTA와 VSIG-3/IGSF11의 결합을 저해하는 것에 의해, VISTA계 면역 체크포인트를 저해할 수 있다. 면역 체크포인트 저해제란, PD-1계 면역 체크포인트, CTLA-4계 면역 체크포인트, TIM-3계 면역 체크포인트, LAG3계 면역 체크포인트, 및 VISTA계 면역 체크포인트 등의 1 이상의 면역 체크포인트를 저해할 수 있는 물질을 가리키고, 항체, 항원 결합성 단백질, 및 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 항체에는 수용체 또는 리간드의 어느 것인가에 결합하는 것이 존재한다. 예를 들어, PD-1계 면역 체크포인트를 저해하는 항체로서는, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 또는 항PD-L2 항체를 들 수 있고, 예를 들어, 니볼루마브, 펨브롤리주마브, MK-3475, AMP-224, 피딜리주마브, AMP-514, ANB-011, BGB-A317, REGN-2810, HR301210, PF-06801591, JS-001, IBI-308, CBT-501, 아벨루마브, 아테졸리주마브, BMS-936559, LY-3300054, JNJ-61610588, 및 듀르발루마브가 사용될 수 있다. 또한, CTLA-4계 면역 체크포인트를 저해하는 항체로서는, 항CTLA-4 항체, 항CD80 항체, 또는 항CD86 항체를 들 수 있고, 예를 들어, 이필리무마브, 및 트레멜리무마브가 사용될 수 있다. 또한, TIM-3계 면역 체크포인트를 저해하는 항체는, 항TIM-3 항체 또는 항갈렉틴 9 항체를 들 수 있고, 예를 들어, MGB453이 사용될 수 있다. 또한, VISTA계 면역 체크포인트를 저해하는 항체는, 항VISTA 항체 또는 항VSIG-3/IGSF11 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체를 들 수 있고, 예를 들어, JNJ-61610588이 사용될 수 있다. 또한, 저분자 화합물로서 AUPM-170도 이용될 수 있다.
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제의 병용은, aAVC-NY-ESO-1 세포의 항종양 작용을 증강할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용될 수 있는 면역 체크포인트 저해제는 PD-1계 면역 체크포인트 저해제이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 또는 항PD-L2 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브, 펨브롤리주마브, 아벨루마브, 아테졸리주마브, 또는 듀르발루마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브 또는 펨브롤리주마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 펨브롤리주마브이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용될 수 있는 면역 체크포인트 저해제는 CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 항CTLA-4 항체, 항CD80 항체, 또는 항CD86 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 이필리무마브 또는 트레멜리무마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브 또는 펨브롤리주마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 이필리무마브이다.
예를 들어, 대상에게 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 처치하는 방법에 대해, 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 PD-1계 면역 체크포인트 저해제 또는 CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 PD-1계 면역 체크포인트 저해제이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 또는 항PD-L2 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브, 펨브롤리주마브, 아벨루마브, 아테졸리주마브, 또는 듀르발루마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브 또는 펨브롤리주마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용되는 면역 체크포인트 저해제는 펨브롤리주마브이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 병용 될 수 있는 면역 체크포인트 저해제는 CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 항CTLA-4 항체, 항CD80 항체, 또는 항CD86 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 이필리무마브 또는 트레멜리무마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 니볼루마브 또는 펨브롤리주마브이다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상에게 투여되는 면역 체크포인트 저해제는 이필리무마브이다.
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제는, 동시에, 축차적으로, 연속적으로, 또는 중복적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제는, 어느 것을 먼저 투여해도 된다. 하나의 실시형태에서는, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 투여를 면역 체크포인트 저해제의 투여보다도 먼저 개시할 수 있다. 하나의 실시형태에서는, 면역 체크포인트 저해제의 투여를 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포의 투여보다도 먼저 개시할 수 있다. 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제는, 각각 독립하여 단회 투여 또는 복수회 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포와 면역 체크포인트 저해제에 의한 단제 요법의 병용 요법에 있어서, 추가적인 추가의 화학요법제 등의 항암제를 병용해도 된다.
본 발명에 대해 더 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정의 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
［실시예 1: 마우스형 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포의 항종양 작용］
［실시예 1-1: 마우스형 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 제작］
암 항원인 NY-ESO-1을 탑재한 aAVC의 암 백신으로서의 효과를 in vivo 평가계에서 확인하기 위해, 마우스 NIH/3T3 세포(ATCC, Cat. CRL-1658)에 NY-ESO-1 유전자 및 CD1d 유전자의 mRNA를 도입한 마우스형 aAVC(aAVC(3T3)-NY-ESO-1이라고도 칭한다)를 제작했다.
NY-ESO-1 유전자(서열 번호 1)는, 서열 번호 2에 나타나는 인간 NY-ESO-1의 아미노산 서열을 기초로, 인공 유전자 합성으로 제작했다. pGEM(등록상표)-4Z 플라스미드(프로메가사, Cat. P2161)의 HindIII 또는 EcoRI 인식 서열을 포함하는 15염기와 상보적인 서열을 부가한 프라이머를 이용하여, NY-ESO-1 유전자를 PCR법으로 증폭했다. 증폭한 NY-ESO-1 유전자를 pGEM(등록상표)-4Z의 HindIII-EcoRI 사이트에 In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit(다카라 바이오사, Cat. 639648)를 이용하여 삽입했다. 얻어진 플라스미드를, pGEM-4Z-NY-ESO-1 플라스미드라고 칭한다. pGEM(등록상표)-4Z 플라스미드의 HindIII-BamHI 사이트에 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 마우스 CD1d 유전자(UniProt: P11609-1의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 기초로 인공 유전자 합성으로 유전자를 합성)를 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pGEM-4Z-mCD1d 플라스미드라고 칭한다. pGEM-4Z-NY-ESO-1 플라스미드 및 pGEM-4Z-mCD1d 플라스미드를 각각 EcoRI와 BamHI로 절단하여 직쇄로 한 것을 템플릿으로서 이용하여 mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific사, Cat. AMB13455)를 이용하여 NY-ESO-1 mRNA 및 CD1d mRNA를 제작했다. α-GalCer을 500ng/mL 첨가한 10%량의 소 태아 혈청을 포함하는 Dulbecco＇s Modified Eagle 배지(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 10569)에서 2일간 배양한 NIH/3T3 세포를 회수하고, 세포 현탁액에 NY-ESO-1 mRNA와 CD1d mRNA를 첨가하고, NEPA21 일렉트로포레이터(네파 진 주식회사)를 이용하여 일렉트로포레이션(포어링 펄스: 전압 150V, 펄스 폭 8ms, 펄스 간격 50ms, 횟수 2회, 감쇠율 10%, 극성 +, 트랜스퍼 펄스: 전압 20V, 펄스 폭 50ms, 펄스 간격 50ms, 횟수 ±5회, 감쇠율 40%, 극성 +/-)을 실시했다. 세포를 회수해, X선조사 장치 MBR-1520R-3(주식회사 히타치 파워 솔루션즈)을 이용하여 30Gy량의 X선을 조사했다. 상기의 방법에 의해 얻어진 세포를 aAVC(3T3)-NY-ESO-1로 칭한다.
［실시예 1-2: 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 NY-ESO-1 특이적 T 세포 유도능］
각 군 5예의 6주령 C57BL/6J 자성 마우스(일본 찰스·리버)의 꼬리 정맥에, BICANATE Injection(주식회사 오쓰카 제약공업)에 현탁한 5×105cells의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. 투여 7일 후에 마우스로부터 비장 세포를 회수하고, mouse IFN-γ single-color enzymatic ELISPOT assay kit(Cellular Technology Lymited사, Cat. mIFNgp-2M/5)의 플레이트에 4×105cells/웰로 파종했다. 추가로, NY-ESO-1 특이적 T 세포를 자극하기 위해서, NY-ESO-1 단백 서열의 전장을 커버하는 오버래핑 펩티드인 NY-ESO-1 펩티드(PepTivator NY-ESO-1-premium grade, human(밀테니 바이오테크사, Cat. 130-095-381)), 또는, 항원 비특이적 펩티드로서 PAP 펩티드(PepTivator PAP-research grade, human(밀테니 바이오테크사, Cat. 130-096-767))를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 1일간 배양했다. 웰 바닥의 스폿수를 카운트하는 것에 의해, IFN-γ 산생 세포수를 계측했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여 마우스에서는, NY-ESO-1 펩티드 자극에 의해 IFN-γ를 산생하는 세포가 증가했다(도 1a). 항원 비특이적인 PAP 펩티드 자극에 의한 스폿수와의 차가, NY-ESO-1 특이적 T 세포수를 나타낸다. 이 결과로부터, aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여에 의해 NY-ESO-1 특이적 T 세포가 유도됨이 시사되었다.
［실시예 1-3: NY-ESO-1 발현 B16 멜라노마 세포 담암 마우스에 있어서의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 항원 특이적 항종양 효과］
각 군 10예의 8주령 C57BL/6J 자성 마우스(일본 찰스·리버)의 꼬리 정맥에, BICANATE Injection에 현탁한 5×105cells의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. 투여 14일 후, 상기 마우스의 피하에, D-PBS(-)(후지필름 와코 준야쿠 주식회사, Cat. 045-29795)에 현탁한 3×105cells의 B16-F10 멜라노마 세포(ATCC, Cat. CRL-6475), 또는, D-PBS(-)에 현탁한 3×105cells의 NY-ESO-1 유전자를 도입하여 제작한 NY-ESO-1 단백질을 발현하는 B16-F10 멜라노마 세포(이하, B16-NY-ESO-1 또는 B16-NY-ESO-1 세포라고 칭한다)를 각각 접종했다. 암 세포를 접종한 날을 0일째로 설정하여, 20일간의 종양 체적의 변화를 계측했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여에 의해, B16-NY-ESO-1 종양의 증대가 유의하게 억제된 데에 반해, NY-ESO-1을 발현하고 있지 않는 B16-F10 종양의 증대는 억제되지 않았다(도 1b). 이 결과로부터, aAVC(3T3)-NY-ESO-1은, NY-ESO-1 특이적 면역의 유도에 기초하는 NY-ESO-1 특이적 항종양 효과를 가짐이 시사되었다.
［실시예 1-4: NY-ESO-1 발현 B16 멜라노마 세포 담암 마우스에 있어서 항종양 효과를 나타내는 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 세포수의 검토］
8주령 C57BL/6J 자성 마우스(일본 찰스 리버)의 피하에, D-PBS(-)에 현탁한 3×105cells의 B16-NY-ESO-1 세포를 접종했다. 세포 접종 7일 후, 상기 마우스를 종양 체적에 기초하여 각 군 10예의 5개의 군으로 나누고, 꼬리 정맥으로부터, 용매인 BICANATE Injection에 현탁한 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을, 각각 5×102cells/마우스, 5×103cells/마우스, 5×104cells/마우스, 5×105cells/마우스가 되도록 투여했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여한 날을 0일째로 설정하여, 10일간의 종양 체적의 변화를 계측했다. 한편, 5×105cells/마우스 투여군에서는 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여 후에 2개체의 사망이 발생했기 때문에, 0일째 이후의 예 수는 8마리로 한다. 5×103cells/마우스 이상의 투여군에서 B16-NY-ESO-1 종양의 증대가 유의하게 억제되었다(도 1c). 본 실험에 이용한 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 NY-ESO-1의 발현량은, 245ng/1×106cells였다.
실시예 1의 결과로부터, 마우스형 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포는, 마우스 in vivo 평가계에 있어서, NY-ESO-1 특이적 T 세포를 유도하는 것에 의해 NY-ESO-1 특이적 항종양 효과를 나타냄이 확인되었다. 인간에 있어서도, 인간형 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 자연 면역을 야기하여 항종양 효과를 발휘함과 함께, 항원 특이적인 획득 면역을 유도하여, 획득 면역에 기초하는 항종양 효과를 발휘하는 것을 기대할 수 있기 때문에, 인간의 NY-ESO-1 발현 암에 대해서 NY-ESO-1 특이적 항종양 효과를 나타내는 치료약의 창제를 목적으로 하여, 이하에 인간형 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 검토를 행했다.
［실시예 2: 인간형 aAVC-NY-ESO-1 세포의 제작 및 조제］
인간형 aAVC-NY-ESO-1 세포를 이하의 방법으로 제작했다. NY-ESO-1, CD1d, 및 Tet3G 유전자를 각각 탑재한 플라스미드를 이용하여 렌티바이러스를 제작하고, 해당 렌티바이러스를 이용하여 FreeStyle 293-F 세포(Thermo Fisher Scientific사, Cat. R79007)에 해당 유전자를 도입하는 것에 의해, NY-ESO-1, CD1d, 및 Tet3G를 발현하는 aAVC 세포를 구축했다.
［실시예 2-1: 렌티바이러스 제작］
(1) 렌티바이러스 제작용 플라스미드의 구축
렌티바이러스 플라스미드 pLVsyn-CMV(서열 번호 7)를 제작했다. NY-ESO-1 유전자(서열 번호 1)의 5＇말측에 EcoRI 인식 서열, 3＇말측에 BamHI 인식 서열을 부가한 NY-ESO-1 유전자를 인공 유전자 합성으로 제작했다. 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 절출한 NY-ESO-1 유전자를, pLVsyn-CMV 플라스미드의 EcoRI-BamHI 사이트에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 플라스미드라고 칭한다. pTRE3G(다카라 바이오사, Cat. 631173)의 서열에 기초하여, 인공 유전자 합성 서비스로 제작한 TRE3G 플라스미드로부터 제한 효소 ClaI 및 EcoRI로 절출한 TRE3G 프로모터를, 제한 효소 ClaI 및 EcoRI로 CMV 프로모터를 제거한 pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 플라스미드에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1 플라스미드라고 칭한다.
CD1d 유전자(서열 번호 3)는, 서열 번호 4에 나타나는 인간 CD1d의 아미노산 서열을 기초로 설계하고, 유전자의 5＇말측에 XhoI 인식 서열, 3＇말측에 NotI 인식 서열을 부가하여 인공 유전자 합성으로 제작했다. 제한 효소 XhoI 및 NotI로 절출한 CD1d 유전자를, pLVsyn-CMV 플라스미드의 XhoI-NotI 사이트에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pLVsyn-CMV-CD1d 플라스미드라고 칭한다.
Tet-On 3G 유전자는, pCMV-Tet3G 플라스미드(다카라 바이오사, Cat. 631335)의 Tet-On 3G 유전자 서열의 5＇말측에 XhoI 인식 서열, 3＇말측에 NotI 인식 서열을 부가하여, 인공 유전자 합성으로 제작했다. 제한 효소 XhoI 및 NotI로 절출한 Tet-On 3G 유전자를, pLVsyn-CMV 플라스미드의 XhoI-NotI 사이트에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pLVsyn-CMV-Tet3G 플라스미드라고 칭한다.
(2) 렌티바이러스 제작
(1)에서 제작한 pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 플라스미드, pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1 플라스미드, pLVsyn-CMV-CD1d 플라스미드, pLVsyn-CMV-Tet3G 플라스미드를 이용하여, NY-ESO-1, CD1d 및 Tet3G 유전자를 탑재한 렌티바이러스를 제작했다. 얻어진 렌티바이러스를, 각각, CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스, TRE3G-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스, CD1d 탑재 렌티바이러스 및 Tet3G 탑재 렌티바이러스라고 칭한다.
pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 플라스미드, pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1 플라스미드, pLVsyn-CMV-CD1d 플라스미드, 또는 pLVsyn-CMV-Tet3G 플라스미드의 어느 것인가의 플라스미드를 6μg과 ViraPower Lentiviral Packaging Mix(Thermo Fisher Scientific사, Cat. K497500) 18μL를 혼합하고, 3mL의 OptiPROTM SFM(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 12309019)을 가하고 혼합했다(A). Lipofectamine2000 CD Transfection Reagent(Thermo Fischer Scientific사, Cat. 12566-014) 288μL와 OptiProTMSFM 12mL를 혼합하고 5분 정치했다(B). (A)와 3mL의 (B)를 혼합하고 실온에서 20분 정치 후, 전일에 Falcon(등록상표) 100mm TC-treated Cell Culture Dish(Corning사, Cat. 353003)에 5×106cells/plate로 파종한 Lenti-XTM 293T 세포(다카라 바이오사, Cat. 632180)에 (A)와 (B)의 혼합액 3mL/plate로 첨가하여 유전자 도입을 행했다. Lenti-XTM 293T 세포는, 10%량의 소 태아 혈청(SAFC Biosciences사, Cat. 12007C(γ선 조사품))와 0.1%량의 겐타마이신(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 15750060)을 포함하는 DMEM 배지(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 10569010)에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양을 행했다. 유전자 도입 후, 동 조건에서 2일간 배양하고, 각 유전자를 탑재한 렌티바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수했다. 배양 상청을 4℃에서 840×g로 10분간 원심했다. 상청을 0.45μm의 필터(Merck사, Cat. SLHV033RS)로 여과하고, PEG-itTM Virus Precipitaion Solution(5x)(System Biosciences사, Cat. LV810A-1)을 상청액량의 1/4량 첨가하고 혼합하여, 4℃에서 철야 정치했다. 1500×g, 4℃에서 30분간 원심하고, 상청을 제거하고, 재차 1500×g, 4℃에서 5분간 원심하고 상청을 완전히 제거했다. 펠릿을 500μL의 DPBS(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 14190144)에 현탁하여, CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스, TRE3G-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스, CD1d 탑재 렌티바이러스, 및 Tet3G 탑재 렌티바이러스를 얻었다.
［실시예 2-2: Lentivirus 감염 세포의 제작과 클로닝］
FreeStyle 293-F 세포에 실시예 2-1에서 제작한 각 렌티바이러스를 감염시켰다. CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스 및 CD1d 탑재 렌티바이러스를 감염시킨 세포 집단을 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀, TRE3G-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스, CD1d 탑재 렌티바이러스, 및 Tet3G 탑재 렌티바이러스를 감염시킨 세포 집단을 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀이라고 칭한다. 이들 세포 풀로부터 세포의 클로닝을 실시하여, 각 세포 풀 유래의 클론을 복수 취득했다.
(1) FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀의 제작
FreeStyle 293-F 세포에 CD1d 탑재 렌티바이러스 및 CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스를 감염시켜, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1 세포를 얻었다. 감염 방법으로서, CD1d 탑재 렌티바이러스 및 CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스를 동시에 감염시키는 방법(세포 풀 A 제작 방법)과 CD1d 탑재 렌티바이러스 및 CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스를 순차적으로 감염시키는 방법(세포 풀 C 제작 방법)의 2개의 상이한 방법을 이용했다. FreeStyle 293-F 세포의 배양은, 0.1%량의 겐타마이신을 포함하는 FreeStyle 293 Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사, Cat. 12338018)에서 행했다.
세포 풀 A 제작을 이하의 방법으로 행했다. FreeStyle 293-F 세포를 1×106cells/mL의 농도로 조제하고, 1mL/웰량으로 Falcon(등록상표) 셀 컬처 12웰 세포 배양용 멀티 웰 플레이트 평저 덮개 부가(Corning사, Cat. 353043, 이후 12웰 플레이트라고 한다.)에 파종하고, 실시예 2-1에서 얻은, CD1d 탑재 렌티바이러스와 CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스를 각 50μL, 또는 각 100μL 첨가했다. 540×g, 실온에서 30분간 원심한 후, 피페팅으로 온화하게 세포를 현탁하여 진탕 배양을 행했다. 수일 배양 후에 12웰 플레이트로부터 Corning(등록상표) 폴리카보네이트제 삼각 플라스크 벤트 캡 125mL(Corning사, Cat. 431143, 이후 125mL 삼각 플라스크라고 한다.)에 계대하고, 추가로 적당한 간격으로 계대하여 세포 풀 A를 얻었다.
세포 풀 C 제작을 이하의 방법으로 행했다. FreeStyle 293-F 세포를 1×106cells/mL의 농도로 조제하여, 1mL/웰량으로 Falcon(등록상표) 셀 컬처 12웰 세포 배양용 멀티 웰 플레이트 평저 덮개 부가에 파종하고, 실시예 2-1에서 얻은 CD1d 탑재 렌티바이러스를 100μL 첨가했다. 540×g, 실온에서 30분간 원심한 후, 피페팅으로 온화하게 세포를 현탁하여 진탕 배양을 행했다. 수일 배양 후에 12웰 플레이트로부터 125mL 플라스크에 계대하고, 추가로 적당한 간격으로 계대하여, FreeStyle 293F＿CD1d 세포 풀(세포 풀 B라고 칭한다)을 얻었다. 세포 풀 B를 재차 12웰 플레이트에 파종하고, CMV-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스 50μL 또는 200μL첨가하여, 1회째와 마찬가지의 수순으로 2회째의 렌티바이러스 감염을 행했다. 수일 배양 후에 12웰 플레이트로부터 125mL 삼각 플라스크에 계대하고, 추가로 적당한 간격으로 계대하여 세포 풀 C를 얻었다. 세포 풀 A와 세포 풀 C를, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀로 했다.
(2) FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀의 제작
(1) 세포 풀 C 제작 방법의 과정에서 얻어진 세포 풀 B를 재차 12웰 플레이트에 파종하고, 실시예 2-1에서 얻은 TRE3G-NY-ESO-1 탑재 렌티바이러스와 Tet3G 탑재 렌티바이러스를 각 40μL 또는 각 200μL 첨가하고, (1)에 기재한 수순에 준거하여 렌티바이러스 감염을 행했다. 1일 후에 12웰 플레이트로부터 125mL 삼각 플라스크에 계대하고, 추가로 적당한 간격으로 계대하여 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀을 얻었다.
(3) 세포 풀에서의 NY-ESO-1 발현 안정성과 배양 특성
(1), (2)에서 취득한 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 및 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀에 대해, 렌티바이러스 감염 후의 NY-ESO-1 발현량(도 2a) 및 NY-ESO-1 양성률의 타임 코스를 취득했다(도 2b). FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀에 대해서는 감염 후 3, 7, 10, 14 일째에 NY-ESO-1 발현의 해석을 행했다. FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀에 대해서는 감염 후 7, 14일째에 해석을 행했다. 또한, 해석의 2일 전에 배지에 종(終)농도 100ng/mL의 독시사이클린(다카라 바이오사, Cat. 631311)을 첨가하여, Tet-On System를 개재시켜 발현을 유도했다. NY-ESO-1 발현은, ELISA법과 플로 사이토메트리법으로 측정했다. ELISA법에 의한 측정에는, 고상화용 항체로서 Anti-NY-ESO-1 Antibody(Millipore사, Cat. MABC1151), 1차 항체로서 Anti-CTAG1B 항체(ABCAM사, Cat. ab183740), 2차 항체로서 Rabbit IgG Horseradish Peroxidase-conjugated Antibody(R＆D Systems사, Cat. HAF008)를 사용하여, 샌드위치 ELISA법의 일반적인 측정 방법에 준거하여 측정을 행했다. 플로 사이토메트리법에 의한 측정에는, 1차 항체로서 Anti-NY-ESO-1 항체, 2차 항체로서 APC Goat anti Mouse IgG(Lifetecnology사, Cat. A10539)를 사용하여, FACSVerseTM(BD Biosciences사)를 이용한 일반적인 측정 방법에 준거하여 측정을 행했다. 또한, 감염 후의 계대 시에 배양 특성으로서 생존율의 측정(도 2c)과, 배가 시간의 산출(도 2d)을 행했다.
발현량에 관해서는 도 2a 및 양성률에 관해서는 도 2b에 나타내는 바와 같이, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀은 렌티바이러스 감염 직후에는 NY-ESO-1 발현량, 양성률 모두 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀과 비교하여 매우 높은 값을 나타내고 있었지만, 배양 일수를 거침에 따라 발현량 및 양성률의 저하가 인정되었다. 한편으로 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀에서는 이와 같은 발현량과 발현율의 저하는 관찰되지 않았다.
생존율에 관해서는 도 2c 및 배가 시간에 관해서는 도 2d에 나타내는 바와 같이, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀은 렌티바이러스 감염 후 7일째에 걸쳐, 생존율의 저하와 배가 시간의 연장이 인정되었다. 세포 풀 중에서 NY-ESO-1 발현량이 높은 세포의 생존율의 저하에 수반하는 배가 시간의 연장에 의해, 배양 일수를 거침에 따라 세포 풀 전체로서의 NY-ESO-1의 발현량이나 발현율이 저하되어 갔다고 추측된다. 한편으로 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀에서는 이와 같은 배양 특성의 변동은 관찰되지 않았다.
(4) 클로닝
(1) (2)에서 제작한 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀과 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀로부터 한외 희석법에 의한 싱글셀 클로닝을 행하여, 모든 유전자가 안정적으로 발현하는 클론을 선발했다. 96웰 플레이트에 1cell/웰이 되도록 세포를 파종하고, 세포의 증식에 맞추어 계대를 행하여, 세포를 증식시켰다. 증식된 세포의 NY-ESO-1 단백질 및 CD1d 단백질의 발현량을, NY-ESO-1은 ELISA법으로, CD1d는 플로 사이토메트리법으로 측정하여, NY-ESO-1 및 CD1d 단백질을 안정적으로 발현하는 클론을 선발했다. FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 유래의 클론의 NY-ESO-1은, 배지에 종농도 100ng/mL의 독시사이클린을 첨가하여, Tet-On System을 개재시켜 발현을 유도하여 평가를 행했다. ELISA법에 의한 측정에는 고상화용 항체로서 Anti-NY-ESO-1 Antibody, 1차 항체로서 Anti-CTAG1B 항체, 2차 항체로서 Rabbit IgG Horseradish Peroxidase-conjugated Antibody를 사용하여, 샌드위치 ELISA법의 일반적인 측정 방법에 준거하여 측정을 행했다. 플로 사이토메트리법에 의한 측정에는, APC Mouse Anti-Human CD1d 항체(BD Biosciences사, Cat. 563505)를 사용하여, FACSVerseTM(BD Biosciences사)를 이용한 일반적인 측정 방법에 준거하여 측정을 행했다.
(5) 취득 클론의 NY-ESO-1 발현량
(4)에서 취득한 FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 유래 또는 FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 유래의 클론에 대해 NY-ESO-1의 발현량을 측정했다. 측정은 (4)에 기재한 ELISA법을 이용하여 실시했다(도 3).
도 3에 나타내는 바와 같이, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀로부터 단리된 클론의 NY-ESO-1의 발현량은 최대로도 88ng/106cells로 매우 낮았다. 한편으로, FreeStyle 293F＿Tet-on＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 유래의 클론은, 클론간의 차가 커서, 소망의 발현량의 클론을 선택하는 여지를 주는 데다가, FreeStyle 293F＿CMV＿NY-ESO-1＿CD1d 세포 풀 유래의 클론에 비해 고발현의 클론이 많았다.
［실시예 3: aAVC(3T3)-NY-ESO-1과 항PD-1 항체의 병용 효과］
(1) NY-ESO-1 발현 B16 멜라노마 세포 담암 마우스에 있어서의 병용 효과
9주령 C57BL/6J 자성 마우스(일본 찰스·리버)의 피하에, D-PBS(-)에 현탁한 3×105cells의 B16-NY-ESO-1 세포를 접종했다. 세포 접종 7일 후, 상기 마우스를 종양 체적에 기초하여 각 군 10예의 4개의 군으로 나누고, 0.1mg의 항PD-1 항체(InVivoMAb anti-mouse PD-1(CD279), Bio X Cell사, Cat. BE0146), 또는 아이소타입 항체(InVivoMAb rat IgG2a isotype control, anti-trinitrophenol, Bio X Cell사, Cat. BE0089)를 복강내 투여했다. 항체는 3∼4일 간격으로 주에 2회, 합계 5회 투여했다. 항체 투여 개시 3일 후, 상기 마우스의 꼬리 정맥에, 용매인 BICANATE Injection에 현탁한 5×104cells의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여한 날을 0일째로 설정하여, 11일째까지의 종양 체적의 변화를 계측했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1+아이소타입 항체의 투여 및 항PD-1 항체의 투여에 의해 B16-NY-ESO-1 종양의 증대가 억제되었다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여와 항PD-1 항체의 병용은, aAVC(3T3)-NY-ESO-1+아이소타입 항체 투여 및 항PD-1 항체 투여와 비교하여, B16-NY-ESO-1 종양의 증대를 보다 현저히 억제했다(도 4a). 이 결과로부터, 항PD-1 항체의 병용은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 항종양 효과를 증강함이 시사되었다.
(2) NY-ESO-1 발현 CT26 대장암 세포 담암 마우스에 있어서의 병용 효과
7주령 BALB/c 자성 마우스(일본 찰스·리버)의 피하에, D-PBS(-)에 현탁한 7×105cells의 NY-ESO-1 유전자를 도입하여 제작한 NY-ESO-1 단백질을 발현하는 CT26 대장암 세포(ATCC, Cat. CRL-2638)(이하, CT26-NY-ESO-1 세포라고 칭한다)를 접종했다. 세포 접종 14일 후, 상기 마우스를 종양 체적에 기초하여 각 군 8예의 4개의 군으로 나누고, 0.1mg의 항PD-1 항체를 복강내 투여했다. 항체 비투여군에는 투여는 행하지 않았다. 항체는 3∼4일 간격으로 주에 2회, 합계 4회 투여했다. 항체 투여 개시일에, 상기 마우스의 꼬리 정맥에, 용매인 BICANATE Injection에 현탁한 5×105cells의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여한 날을 0일째로 설정하여, 14일째까지의 종양 체적의 변화를 계측했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 단제의 투여 및 항PD-1 항체의 단제의 투여에 의해 CT26-NY-ESO-1 종양의 증대가 억제된 데에 반해, aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여와 항PD-1 항체의 병용은 각 단제의 투여와 비교하여, CT26-NY-ESO-1 종양의 증대를 보다 현저히 억제했다(도 4b). 이 결과로부터, 항PD-1 항체의 병용은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 항종양 효과를 증강함이 시사되었다.
［실시예 4: aAVC(3T3)-NY-ESO-1으로 항CTLA-4 항체의 병용 효과］
7주령 BALB/c 자성 마우스(일본 찰스·리버)의 피하에, D-PBS(-)에 현탁한 7×105cells의 CT26-NY-ESO-1 세포를 접종했다. 세포 접종 7일 후, 상기 마우스를 종양 체적에 기초하여 각 군 10예의 4개의 군으로 나누고, 군나누기 7일 후, 0.15mg의 항CTLA-4 항체(InVivoMAb anti-mouse CTLA-4(CD152), Bio X Cell사, Cat. BE0164)를 복강내 투여했다. 항체 비투여군에는 투여는 행하지 않았다. 항체는 3∼4일 간격으로 주에 2회, 합계 5회 투여했다. 항체 투여 개시일에, 상기 마우스의 꼬리 정맥에, 용매인 BICANATE Injection에 현탁한 5×105cells의 aAVC(3T3)-NY-ESO-1을 투여했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1 세포 투여와 항CTLA-4 항체의 병용군에서는 aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여 후에 1개체의 사망이 발생했다. 컨트롤군에는 200μL의 BICANATE Injection을 투여했다. 암 세포를 접종한 날을 0일째로 설정하여, 32일간의 종양 체적의 변화를 계측했다. aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 단제의 투여 및 항CTLA-4 항체의 단제의 투여에 의해 CT26-NY-ESO-1 종양의 증대가 억제된 데에 반해, aAVC(3T3)-NY-ESO-1 투여와 항CTLA-4 항체의 병용은 각 단제의 투여와 비교하여, CT26-NY-ESO-1 종양의 증대를 보다 현저히 억제했다(도 5). 이 결과로부터, 항CTLA-4 항체의 병용은 aAVC(3T3)-NY-ESO-1의 항종양 효과를 증강함이 시사되었다.
본 발명의 aAVC-NY-ESO-1 세포는, 암의 처치에 유용할 것을 기대할 수 있다.
서열목록의 서열 번호 1로 나타나는 염기 서열은, 인간 NY-ESO-1 단백질을 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다. 서열 번호 3으로 나타나는 염기 서열은, 인간 CD1d 단백질을 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 3에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다. 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열은, 마우스 CD1d 단백질을 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 5에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열은, pLVsyn-CMV의 염기 서열이다. 이하의 서열목록의 숫자 표제＜223＞에 있어서, 「Artificial Sequence」의 설명으로서 기재되는 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. RIKEN <120> Artifitial adjuvant vector cell comprising NY-ESO-1 for use in treating cancer <130> A20027A00 <150> JP2019-217704 <151> 2019-12-02 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 543 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(540) <400> 1 atg cag gcc gag ggc aga ggc aca ggc gga tct act ggg gat gct gat 48 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp 1 5 10 15 gga cct ggc ggc cct ggc att cca gat ggc cca ggc gga aat gct ggc 96 Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly 20 25 30 gga cca ggc gaa gct ggc gct aca ggc gga aga gga cct aga ggc gct 144 Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala 35 40 45 ggc gcc gct aga gct tct gga cct ggg gga ggc gct cct aga gga cct 192 Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro 50 55 60 cat ggc gga gct gcc tct ggc ctg aat ggc tgc tgt aga tgt ggc gcc 240 His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 65 70 75 80 aga ggc ccc gaa agc cgg ctg ctg gag ttt tac ctg gcc atg ccc ttc 288 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe 85 90 95 gcc acc ccc atg gaa gct gag ctg gcc aga aga agc ctg gcc cag gac 336 Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp 100 105 110 gct cct cca ctg cct gtg cca ggc gtg ctg ctg aaa gag ttc acc gtg 384 Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val 115 120 125 tcc ggc aac atc ctg acc atc cgg ctg aca gcc gcc gac cac aga cag 432 Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln 130 135 140 ctg cag ctg agc atc agc agc tgc ctg cag cag ctg tcc ctg ctg atg 480 Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met 145 150 155 160 tgg atc acc cag tgc ttt ctg ccc gtg ttt ctg gcc cag cct cct agc 528 Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser 165 170 175 ggc cag cgg aga taa 543 Gly Gln Arg Arg 180 <210> 2 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro 50 55 60 His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe 85 90 95 Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp 100 105 110 Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val 115 120 125 Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln 130 135 140 Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met 145 150 155 160 Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser 165 170 175 Gly Gln Arg Arg 180 <210> 3 <211> 1008 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1005) <400> 3 atg ggc tgc ctg ctg ttt ctg ctg ctg tgg gcc ctg ctg cag gcc tgg 48 Met Gly Cys Leu Leu Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Gln Ala Trp 1 5 10 15 gga tct gct gaa gtg ccc cag aga ctg ttc ccc ctg cgg tgc ctg cag 96 Gly Ser Ala Glu Val Pro Gln Arg Leu Phe Pro Leu Arg Cys Leu Gln 20 25 30 atc agc agc ttc gcc aac agc agc tgg acc aga acc gat ggc ctg gcc 144 Ile Ser Ser Phe Ala Asn Ser Ser Trp Thr Arg Thr Asp Gly Leu Ala 35 40 45 tgg ctg gga gag ctg cag aca cac agc tgg tcc aac gac agc gac acc 192 Trp Leu Gly Glu Leu Gln Thr His Ser Trp Ser Asn Asp Ser Asp Thr 50 55 60 gtg cgg agc ctg aag cct tgg agc cag ggc acc ttt agc gac cag cag 240 Val Arg Ser Leu Lys Pro Trp Ser Gln Gly Thr Phe Ser Asp Gln Gln 65 70 75 80 tgg gag aca ctg cag cac atc ttc cgg gtg tac aga agc agc ttc acc 288 Trp Glu Thr Leu Gln His Ile Phe Arg Val Tyr Arg Ser Ser Phe Thr 85 90 95 cgg gac gtg aaa gaa ttt gcc aag atg ctg cgg ctg agc tac ccc ctg 336 Arg Asp Val Lys Glu Phe Ala Lys Met Leu Arg Leu Ser Tyr Pro Leu 100 105 110 gaa ctg cag gtg tcc gcc ggc tgt gaa gtg cac cct ggc aac gcc agc 384 Glu Leu Gln Val Ser Ala Gly Cys Glu Val His Pro Gly Asn Ala Ser 115 120 125 aac aac ttc ttc cac gtg gcc ttc cag ggc aag gac ata ctg agc ttt 432 Asn Asn Phe Phe His Val Ala Phe Gln Gly Lys Asp Ile Leu Ser Phe 130 135 140 cag ggc acc agc tgg gag ccc aca cag gaa gct cca ctg tgg gtc aac 480 Gln Gly Thr Ser Trp Glu Pro Thr Gln Glu Ala Pro Leu Trp Val Asn 145 150 155 160 ctg gcc atc cag gtg ctg aac cag gac aag tgg acc cgg gaa acc gtg 528 Leu Ala Ile Gln Val Leu Asn Gln Asp Lys Trp Thr Arg Glu Thr Val 165 170 175 cag tgg ctg ctg aac ggc acc tgt ccc cag ttt gtg tcc ggc ctg ctg 576 Gln Trp Leu Leu Asn Gly Thr Cys Pro Gln Phe Val Ser Gly Leu Leu 180 185 190 gaa agc ggc aag agc gag ctg aag aaa caa gtg aag ccc aaa gcc tgg 624 Glu Ser Gly Lys Ser Glu Leu Lys Lys Gln Val Lys Pro Lys Ala Trp 195 200 205 ctg agc aga ggc cct tct cct gga cct gga cgg ctg ctg ctc gtg tgt 672 Leu Ser Arg Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Val Cys 210 215 220 cac gtg tcc ggc ttc tac ccc aag ccc gtg tgg gtc aag tgg atg cgg 720 His Val Ser Gly Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Lys Trp Met Arg 225 230 235 240 gga gaa cag gaa cag cag ggc acc cag cct ggc gac atc ctg cct aac 768 Gly Glu Gln Glu Gln Gln Gly Thr Gln Pro Gly Asp Ile Leu Pro Asn 245 250 255 gcc gac gag aca tgg tat ctg cgg gcc acc ctg gat gtg gtg gct ggc 816 Ala Asp Glu Thr Trp Tyr Leu Arg Ala Thr Leu Asp Val Val Ala Gly 260 265 270 gaa gca gcc ggc ctg tcc tgt aga gtg aag cac agc agc ctg gaa gga 864 Glu Ala Ala Gly Leu Ser Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu Glu Gly 275 280 285 cag gac atc gtg ctg tac tgg ggc ggc agc tac acc agc atg gga ctg 912 Gln Asp Ile Val Leu Tyr Trp Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Met Gly Leu 290 295 300 att gct ctg gcc gtg ctg gcc tgt ctg ctg ttt ctg ctg atc gtg gga 960 Ile Ala Leu Ala Val Leu Ala Cys Leu Leu Phe Leu Leu Ile Val Gly 305 310 315 320 ttc acc agc cgg ttc aag cgg cag acc agc tac cag ggc gtg ctc tga 1008 Phe Thr Ser Arg Phe Lys Arg Gln Thr Ser Tyr Gln Gly Val Leu 325 330 335 <210> 4 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Cys Leu Leu Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Gln Ala Trp 1 5 10 15 Gly Ser Ala Glu Val Pro Gln Arg Leu Phe Pro Leu Arg Cys Leu Gln 20 25 30 Ile Ser Ser Phe Ala Asn Ser Ser Trp Thr Arg Thr Asp Gly Leu Ala 35 40 45 Trp Leu Gly Glu Leu Gln Thr His Ser Trp Ser Asn Asp Ser Asp Thr 50 55 60 Val Arg Ser Leu Lys Pro Trp Ser Gln Gly Thr Phe Ser Asp Gln Gln 65 70 75 80 Trp Glu Thr Leu Gln His Ile Phe Arg Val Tyr Arg Ser Ser Phe Thr 85 90 95 Arg Asp Val Lys Glu Phe Ala Lys Met Leu Arg Leu Ser Tyr Pro Leu 100 105 110 Glu Leu Gln Val Ser Ala Gly Cys Glu Val His Pro Gly Asn Ala Ser 115 120 125 Asn Asn Phe Phe His Val Ala Phe Gln Gly Lys Asp Ile Leu Ser Phe 130 135 140 Gln Gly Thr Ser Trp Glu Pro Thr Gln Glu Ala Pro Leu Trp Val Asn 145 150 155 160 Leu Ala Ile Gln Val Leu Asn Gln Asp Lys Trp Thr Arg Glu Thr Val 165 170 175 Gln Trp Leu Leu Asn Gly Thr Cys Pro Gln Phe Val Ser Gly Leu Leu 180 185 190 Glu Ser Gly Lys Ser Glu Leu Lys Lys Gln Val Lys Pro Lys Ala Trp 195 200 205 Leu Ser Arg Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Val Cys 210 215 220 His Val Ser Gly Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Lys Trp Met Arg 225 230 235 240 Gly Glu Gln Glu Gln Gln Gly Thr Gln Pro Gly Asp Ile Leu Pro Asn 245 250 255 Ala Asp Glu Thr Trp Tyr Leu Arg Ala Thr Leu Asp Val Val Ala Gly 260 265 270 Glu Ala Ala Gly Leu Ser Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu Glu Gly 275 280 285 Gln Asp Ile Val Leu Tyr Trp Gly Gly Ser Tyr Thr Ser Met Gly Leu 290 295 300 Ile Ala Leu Ala Val Leu Ala Cys Leu Leu Phe Leu Leu Ile Val Gly 305 310 315 320 Phe Thr Ser Arg Phe Lys Arg Gln Thr Ser Tyr Gln Gly Val Leu 325 330 335 <210> 5 <211> 1011 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1008) <400> 5 atg aga tac ctg ccc tgg ctg ctg ctg tgg gcc ttc ctc cag gtg tgg 48 Met Arg Tyr Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Ala Phe Leu Gln Val Trp 1 5 10 15 gga cag tct gag gcc cag cag aag aac tac acc ttc cgg tgc ctg cag 96 Gly Gln Ser Glu Ala Gln Gln Lys Asn Tyr Thr Phe Arg Cys Leu Gln 20 25 30 atg agc agc ttc gcc aac aga agc tgg tcc cgg acc gac agc gtc gtg 144 Met Ser Ser Phe Ala Asn Arg Ser Trp Ser Arg Thr Asp Ser Val Val 35 40 45 tgg ctg gga gat ctg cag acc cac aga tgg tcc aac gac agc gcc acc 192 Trp Leu Gly Asp Leu Gln Thr His Arg Trp Ser Asn Asp Ser Ala Thr 50 55 60 atc agc ttc acc aag ccc tgg tcc cag ggc aag ctg agc aac cag cag 240 Ile Ser Phe Thr Lys Pro Trp Ser Gln Gly Lys Leu Ser Asn Gln Gln 65 70 75 80 tgg gag aag ctg cag cac atg ttc cag gtg tac cgg gtg tcc ttc acc 288 Trp Glu Lys Leu Gln His Met Phe Gln Val Tyr Arg Val Ser Phe Thr 85 90 95 cgg gac atc cag gaa ctc gtg aag atg atg agc ccc aaa gag gac tac 336 Arg Asp Ile Gln Glu Leu Val Lys Met Met Ser Pro Lys Glu Asp Tyr 100 105 110 ccc atc gag atc cag ctg agc gcc ggc tgc gag atg tac cct ggc aat 384 Pro Ile Glu Ile Gln Leu Ser Ala Gly Cys Glu Met Tyr Pro Gly Asn 115 120 125 gcc agc gag agc ttc ctg cac gtg gcc ttc cag ggc aaa tac gtc gtg 432 Ala Ser Glu Ser Phe Leu His Val Ala Phe Gln Gly Lys Tyr Val Val 130 135 140 cgg ttc tgg ggc acc agc tgg cag aca gtg cct ggc gct cct agc tgg 480 Arg Phe Trp Gly Thr Ser Trp Gln Thr Val Pro Gly Ala Pro Ser Trp 145 150 155 160 ctg gac ctg cct atc aag gtg ctg aac gcc gac cag ggc aca agc gcc 528 Leu Asp Leu Pro Ile Lys Val Leu Asn Ala Asp Gln Gly Thr Ser Ala 165 170 175 aca gtg cag atg ctg ctg aac gac aca tgc ccc ctg ttc gtg cgg gga 576 Thr Val Gln Met Leu Leu Asn Asp Thr Cys Pro Leu Phe Val Arg Gly 180 185 190 ctg ctg gaa gcc ggc aag agc gac ctg gaa aag cag gaa aag ccc gtg 624 Leu Leu Glu Ala Gly Lys Ser Asp Leu Glu Lys Gln Glu Lys Pro Val 195 200 205 gcc tgg ctg agc agc gtg cca tct tct gcc gat ggc cac aga cag ctc 672 Ala Trp Leu Ser Ser Val Pro Ser Ser Ala Asp Gly His Arg Gln Leu 210 215 220 gtg tgc cac gtg tcc ggc ttc tac ccc aag ccc gtg tgg gtc atg tgg 720 Val Cys His Val Ser Gly Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Met Trp 225 230 235 240 atg cgg ggc gac cag gaa cag cag ggc aca cac aga ggc gac ttt ctg 768 Met Arg Gly Asp Gln Glu Gln Gln Gly Thr His Arg Gly Asp Phe Leu 245 250 255 ccc aac gcc gac gag aca tgg tat ctg caa gcc acc ctg gac gtg gaa 816 Pro Asn Ala Asp Glu Thr Trp Tyr Leu Gln Ala Thr Leu Asp Val Glu 260 265 270 gct ggc gag gaa gct gga ctg gcc tgc aga gtg aag cac agc tct ctg 864 Ala Gly Glu Glu Ala Gly Leu Ala Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu 275 280 285 ggc ggc cag gac atc atc ctg tac tgg gat gcc aga cag gcc cca gtg 912 Gly Gly Gln Asp Ile Ile Leu Tyr Trp Asp Ala Arg Gln Ala Pro Val 290 295 300 ggc ctg atc gtg ttc atc gtg ctg atc atg ctg gtg gtc gtg ggc gcc 960 Gly Leu Ile Val Phe Ile Val Leu Ile Met Leu Val Val Val Gly Ala 305 310 315 320 gtg gtg tac tac atc tgg cgg aga aga agc gcc tac cag gat atc aga 1008 Val Val Tyr Tyr Ile Trp Arg Arg Arg Ser Ala Tyr Gln Asp Ile Arg 325 330 335 tga 1011 <210> 6 <211> 336 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Arg Tyr Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Ala Phe Leu Gln Val Trp 1 5 10 15 Gly Gln Ser Glu Ala Gln Gln Lys Asn Tyr Thr Phe Arg Cys Leu Gln 20 25 30 Met Ser Ser Phe Ala Asn Arg Ser Trp Ser Arg Thr Asp Ser Val Val 35 40 45 Trp Leu Gly Asp Leu Gln Thr His Arg Trp Ser Asn Asp Ser Ala Thr 50 55 60 Ile Ser Phe Thr Lys Pro Trp Ser Gln Gly Lys Leu Ser Asn Gln Gln 65 70 75 80 Trp Glu Lys Leu Gln His Met Phe Gln Val Tyr Arg Val Ser Phe Thr 85 90 95 Arg Asp Ile Gln Glu Leu Val Lys Met Met Ser Pro Lys Glu Asp Tyr 100 105 110 Pro Ile Glu Ile Gln Leu Ser Ala Gly Cys Glu Met Tyr Pro Gly Asn 115 120 125 Ala Ser Glu Ser Phe Leu His Val Ala Phe Gln Gly Lys Tyr Val Val 130 135 140 Arg Phe Trp Gly Thr Ser Trp Gln Thr Val Pro Gly Ala Pro Ser Trp 145 150 155 160 Leu Asp Leu Pro Ile Lys Val Leu Asn Ala Asp Gln Gly Thr Ser Ala 165 170 175 Thr Val Gln Met Leu Leu Asn Asp Thr Cys Pro Leu Phe Val Arg Gly 180 185 190 Leu Leu Glu Ala Gly Lys Ser Asp Leu Glu Lys Gln Glu Lys Pro Val 195 200 205 Ala Trp Leu Ser Ser Val Pro Ser Ser Ala Asp Gly His Arg Gln Leu 210 215 220 Val Cys His Val Ser Gly Phe Tyr Pro Lys Pro Val Trp Val Met Trp 225 230 235 240 Met Arg Gly Asp Gln Glu Gln Gln Gly Thr His Arg Gly Asp Phe Leu 245 250 255 Pro Asn Ala Asp Glu Thr Trp Tyr Leu Gln Ala Thr Leu Asp Val Glu 260 265 270 Ala Gly Glu Glu Ala Gly Leu Ala Cys Arg Val Lys His Ser Ser Leu 275 280 285 Gly Gly Gln Asp Ile Ile Leu Tyr Trp Asp Ala Arg Gln Ala Pro Val 290 295 300 Gly Leu Ile Val Phe Ile Val Leu Ile Met Leu Val Val Val Gly Ala 305 310 315 320 Val Val Tyr Tyr Ile Trp Arg Arg Arg Ser Ala Tyr Gln Asp Ile Arg 325 330 335 <210> 7 <211> 6486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLVsyn-CMV <400> 7 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020 cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080 ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140 aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260 aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320 gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440 gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560 actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620 gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680 aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740 ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800 tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920 cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980 cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040 gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160 acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa 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tcatgtcatc 3900 ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggccttgac 3960 attgctagcg ttttaccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 4020 tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 4080 aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 4140 ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 4200 gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 4260 cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 4320 tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 4380 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 4440 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 4500 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 4560 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 4620 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 4680 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 4740 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4800 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 4860 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4920 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4980 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 5040 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5100 tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5160 tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 5220 cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5280 ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5340 tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5400 gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5460 agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5520 atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 5580 tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 5640 gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5700 agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5760 cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5820 ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5880 ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5940 actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 6000 ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6060 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6120 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcga cggatcggga 6180 gatcaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 6240 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 6300 atcttatcat gtctggatca actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc 6360 caccccatac cctattacca ctgccaatta cctgtggttt catttactct aaacctgtga 6420 ttcctctgaa ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt 6480 agtagt 6486

Claims (24)

  1. CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인간 유래 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    NY-ESO-1이 인간 NY-ESO-1인, 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    CD1d가 인간 CD1d인, 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유도형 프로모터가 약제 유도형 프로모터인, 세포.
  5. 제 4 항에 있어서,
    약제 유도형 프로모터가, 테트라사이클린계 유도형 프로모터인, 세포.
  6. 제 5 항에 있어서,
    테트라사이클린계 유도형 프로모터가 TRE3G 프로모터인, 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 유래 세포가 정상 세포인, 세포.
  8. 제 7 항에 있어서,
    인간 유래 세포가 인간 태아 신장 세포 293(HEK293) 세포에서 유래하는 세포인, 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD1d 및 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 발현하고 있는, 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현량이 106세포당 245ng∼45000ng인, 세포.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    세포의 표면에 CD1d 리간드를 적재하고 있는, 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    CD1d 리간드가 α-GalCer인, 세포.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 세포를 포함하는 의약 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    암의 처치에 이용하기 위한, 의약 조성물.
  15. 암을 처치하는 방법으로서, 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 세포를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
  16. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    암을 처치하기 위한, 세포.
  17. 암의 처치에 이용하는 의약 조성물을 제조하기 위한, 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 세포의 사용.
  18. 암의 처치에 이용하는 세포를 제조하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    세포의 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 암의 처치에 이용하는 세포를 제조하는 방법으로서,
    인간 유래 세포에 CD1d를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정, 또는
    내재적으로 CD1d를 발현하는 인간 유래 세포에 유도형 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NY-ESO-1 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공정
    을 포함하는, 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 공정에서 얻어진 세포를 유도형 프로모터의 유도 인자의 존재하에서 배양하는 것에 의해 NY-ESO-1 또는 그의 단편의 발현을 유도시키는 공정을 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    세포의 표면에 α-GalCer을 적재하는 공정을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 암을 처치하는 방법으로서, 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 세포와 면역 체크포인트 저해제를 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    면역 체크포인트 저해제가 PD-1계 면역 체크포인트 저해제, 또는 CTLA-4계 면역 체크포인트 저해제인, 방법.
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