CN114787344A - 用于处置癌症的含有ny-eso-1的人工佐剂载体细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供稳定表达NY‑ESO‑1、能够临床应用的aAVC‑NY‑ESO‑1细胞，以在患有NY‑ESO‑1表达癌的患者的处置中使用aAVC‑NY‑ESO‑1细胞。本发明例如提供一种人来源细胞，其含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY‑ESO‑1或其片段的多核苷酸。

Description

用于处置癌症的含有NY-ESO-1的人工佐剂载体细胞
技术领域
本发明涉及用于处置癌症的含有NY-ESO-1的人工佐剂载体细胞(artificialadjuvant vector cell：aAVC-NY-ESO-1细胞)。
背景技术
纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1、NY-ESO-1)为癌/睾丸抗原之一，在前列腺癌、膀胱癌等宽范围的肿瘤中观察到表达。另一方面，在成人的正常细胞中，除了睾丸外观察不到表达，因此被认为是癌症治疗的合适靶标分子，正在推进以疫苗为代表的药剂的开发(非专利文献1～3)。
作为将NY-ESO-1蛋白与吡喃葡萄糖基脂质A(glucopyranosyl lipid A、GLA)佐剂混合而成的疫苗的G305正在以患有NY-ESO-1表达癌的患者为对象实施临床试验，在疫苗给药后确认到NY-ESO-1特异性T细胞的诱导(非专利文献4)。
藤井等人使人来源细胞外源性表达CD1d和癌抗原、再对该细胞进行α-半乳糖神经酰胺(α-Galactosylceramide、α-GalCer)冲击而制作人工佐剂载体细胞(artificialadjuvant vector cell：aAVC)(专利文献1～3)。该aAVC通过CD1d/α-GalCer复合体活化自然杀伤T(NKT)细胞，活化NKT细胞产生干扰素γ(IFN-γ)等细胞因子、活化自然杀伤(NK)细胞等。在小鼠模型中，通过aAVC给药而显示出NK细胞依赖性抗肿瘤效果(专利文献1～3)。另外，给药到小鼠中的aAVC在生物体内会被活化NKT细胞迅速杀伤，该aAVC的片段被摄入到树突细胞中。摄入了该aAVC片段的树突细胞对该细胞表面上的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex、MHC)所摄入的癌抗原的片段进行抗原提呈，诱导癌抗原特异性T细胞。在小鼠模型中，通过aAVC给药显示出癌抗原特异性T细胞的诱导所介导的抗肿瘤效果(专利文献1～3、非专利文献5和6)。可见，表明aAVC能够强力诱导基于由NKT细胞活化介导的NK细胞活化的天然免疫激活以及基于癌抗原特异性T细胞诱导的获得性免疫诱导这两个免疫机制。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开号2007/097370
专利文献2：国际公开号2010/061930
专利文献3：国际公开号2013/018778
非专利文献
非专利文献1：Thomas R.et al.，“Frontiers in Immunology”、(瑞士)、2018；9：947
非专利文献2：Gasser O.et al.，“Cancer Immunology，Immunotherapy”、(德国)、2018；67(2)：285-298
非专利文献3：Robbins P.F.et al.，“Clinical Cancer Research”、(美国)、2015；21(5)：1019-1027
非专利文献4：Mahipal A.et al.，“Cancer Immunology，Immunotherapy”、(德国)、2019；68(7)：1211-1222
非专利文献5：Shimizu K.et al.，“Cancer Research”、(美国)、2013；73(1)：62-73
非专利文献6：Shimizu K.et al.，“Cancer Research”、(美国)、2016；76(13)：3756-3766
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供稳定表达NY-ESO-1或其片段的aAVC。
用于解决问题的方法
本发明人在制作表达作为癌抗原的NY-ESO-1的aAVC时反复进行了颇具创意性的研究，结果成功获得了稳定表达NY-ESO-1的aAVC。具体而言，本发明人在使NY-ESO-1恒定地表达时，发现了表达量和阳性率随着培养天数经过而下降的课题，并进行了深入研究，从而解决了该课题。详细而言，发现利用诱导型启动子(特别是药剂诱导型启动子)诱导表达NY-ESO-1的细胞显示出与恒定地表达NY-ESO-1的情况相比更高的NY-ESO-1的表达量，成功地获得了在诱导型启动子支配下稳定地高表达NY-ESO-1的aAVC(实施例2-2)。即，本发明提供可用于处置癌症的aAVC、该aAVC的制造方法、含有该aAVC的药物组合物、利用该aAVC的癌症的处置方法等。
即，本发明可以包括作为医学上或产业上有用的物质或方法的以下发明。
[1]一种人来源细胞，其含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。
[2]根据[1]所述的细胞，其中，NY-ESO-1为人NY-ESO-1。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞，其中，CD1d为人CD1d。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞，其中，诱导型启动子为药剂诱导型启动子。
[5]根据[4]所述的细胞，其中，药剂诱导型启动子为四环素系诱导型启动子。
[6]根据[5]所述的细胞，其中，四环素系诱导型启动子为TRE3G启动子。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞，其中，人来源细胞为正常细胞。
[8]根据[7]所述的细胞，其中，人来源细胞为来源于人胚肾细胞293(HEK293)细胞的细胞。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的细胞，其表达CD1d和NY-ESO-1或其片段。
[10]根据[9]所述的细胞，其中，NY-ESO-1或其片段的表达量为每106个细胞245ng～45000ng。
[11]根据[9]或[10]所述的细胞，其中，在细胞的表面负载有CD1d配体。
[12]根据[11]所述的细胞，其中，CD1d配体为α-GalCer。
[13]一种药物组合物，其含有[11]或[12]所述的细胞。
[14]根据[13]所述的药物组合物，其用于处置癌症。
[15]一种处置癌症的方法，其包括将[11]或[12]所述的细胞给药于对象的步骤。
[16]根据[11]或[12]所述的细胞，其用于处置癌症。
[17][11]或[12]所述的细胞在制造用于处置癌症的药物组合物中的应用。
[18]一种制造用于处置癌症的细胞的方法，其包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养[1]～[8]中任一项所述的细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。
[19]根据[18]所述的方法，其中，还包括在细胞的表面负载α-GalCer的步骤。
[20]一种制造用于处置癌症的细胞的方法，其包括：
向人来源细胞中导入编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤；或者
向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤。
[21]根据[20]所述的方法，其中，还包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养上述步骤中得到的细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。
[22]根据[21]所述的方法，其中，还包括在细胞的表面负载α-GalCer的步骤。
[23]一种处置癌症的方法，其包括向对象给药[11]或[12]所述的细胞和免疫检查点抑制剂的步骤。
[24]根据[23]所述的方法，其中，免疫检查点抑制剂为PD-1系免疫检查点抑制剂或CTLA-4系免疫检查点抑制剂。
[25]一种制造用于处置癌症的药物组合物的方法，其包括：
将含有来源于人的细胞的冷冻物解冻的步骤，所述来源于人的细胞含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸、并且进行了克隆；
使冷冻物中所含的上述人细胞增殖，诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤；以及
在该细胞的表面负载α-GalCer的步骤。
发明效果
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和本发明的药物组合物能够用于癌症的处置。
附图说明
图1-1通过aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药小鼠中的NY-ESO-1特异性T细胞数来示出基于aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞的抗原特异性T细胞诱导作用。纵轴表示利用酶联免疫斑点分析仪(ELISPOT Reader)计数时的4×105个脾细胞中的斑点数。横轴的溶剂表示给药了BICANATE的对照组，aAVC-NY表示aAVC(3T3)-NY-ESO-1给药组。PAP和NY分别表示用于刺激的PAP肽和NY-ESO-1肽。“-”表示未添加肽。示出每个个体的斑点数以及斑点数的平均值±平均的标准误差。
图1-2示出NY-ESO-1表达B16荷瘤小鼠和B16-F10荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞的抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤体积，横轴表示癌细胞接种后天数。纵线表示平均值±平均的标准误差，括号内表示计测时的小鼠的只数。显著性概率P值(**：P＜0.01)通过利用学生t检验比较溶剂给药组与aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药组的第20天的肿瘤体积来计算。
图1-3示出NY-ESO-1表达B16荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞的抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤体积，横轴表示aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药后天数。纵线表示平均值±平均的标准误差。显著性概率P值(**：P＜0.01)通过利用邓尼特多重比较检验比较溶剂给药组与aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药组的第10天的肿瘤体积来计算。
图2-1～图2-4示出FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池(图中的CMV)和FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池(图中的Tet-on)的针对各种指标的经时变化。图2-1示出CMV和Tet-on的每1×106个细胞的NY-ESO-1表达量。纵轴表示NY-ESO-1的表达量，横轴表示感染后培养天数。
图2-2示出CMV和Tet-on的NY-ESO-1阳性率。纵轴表示NY-ESO-1阳性率，横轴表示感染后培养天数。
图2-3示出CMV和Tet-on的存活率。纵轴表示各池的细胞存活率，横轴表示感染后培养天数。
图2-4示出CMV和Tet-on的细胞的倍增时间。纵轴表示倍增时间，横轴表示感染后培养天数。
图3示出从FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池(图中的CMV)和FreeStyle293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池(图中的Tet-on)单离出的各种克隆的NY-ESO-1表达量。No.表示克隆的编号，数值表示每1×106个细胞的NY-ESO-1表达量。
图4-1示出NY-ESO-1表达B16荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞、抗PD-1抗体和将它们组合使用时的抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤体积，横轴表示aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药后天数。纵线表示平均值±平均的标准误差，括号内表示计测时的小鼠的只数。
图4-2示出NY-ESO-1表达CT26荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞、抗PD-1抗体和将它们组合使用时的抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤体积，横轴表示aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药后天数。纵线表示平均值±平均的标准误差。
图5示出NY-ESO-1表达CT26荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞、抗CTLA-4抗体和将它们组合使用时的抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤体积，横轴表示癌细胞接种后天数。纵线表示平均值±平均的标准误差。aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞、抗CTLA-4抗体的组合使用组的第18天以后的例数设定为9。
具体实施方式
以下详细说明本发明，但是本发明不受这些限定。本说明书中，只要没有特别定义，则本发明中关联使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
＜人工佐剂载体细胞＞
本说明书中，“人工佐剂载体细胞”与“aAVC”的含义相同，可以彼此互换地使用，是指含有编码CD1d多肽(以下也称为“CD1d”)的多核苷酸和编码1种或2种以上任意的癌抗原或其片段的多核苷酸的细胞。
本说明书中，“含有多核苷酸”是指细胞内源性地具有该多肽或通过外源性方法导入了该多核苷酸的状态。在此，“内源性”或“内源的”可以以经单离的细胞含有特定的基因或多核苷酸、或者表达蛋白质等本领域技术人员通常使用的含义来使用。另外，“外源性”或“外源的”作为是指将人工制作的基因或多核苷酸通过基因操作或基因导入等操作导入到目标细胞内、以及由人为地导入到目标细胞内的基因或多核苷酸人为地表达它们所编码的蛋白质的术语彼此互换地使用。
＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞＞
本发明提供一种人来源细胞(本说明书中也称为“aAVC-NY-ESO-1细胞”)，其含有编码CD1d的多核苷酸、和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。
1.人来源细胞
本发明中使用的人来源细胞为来源于正常细胞或癌组织的细胞，可内源性表达CD1d。
作为正常细胞，可使用从任意的人组织单离和/或纯化的细胞、来源于特定细胞种类的细胞、来源于人组织的株化细胞、由干细胞分化而成的细胞等来源于人的细胞。另外，作为来源于癌组织的细胞，可使用从患者的癌组织单离和/或纯化的细胞或来源于人癌组织的株化细胞。在此，“单离”是指从生物体组织分离。另外，“纯化”是指将来源于人的细胞与细胞所来源的组织中所含的1种以上其它成分分离。细胞的单离和纯化可以通过公知的方法进行。一个实施方式中，本发明中使用的人来源细胞为正常细胞。
从任意的人组织单离和/或纯化的细胞例如可以为来源于胃、小肠、大肠、肺、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、脾脏、前列腺、卵巢、子宫、骨髓、皮肤、肌肉或外周血等任意的人组织的细胞。一个实施方式中，本发明中使用的人来源细胞为非血细胞。
来源于特定细胞种的细胞为来源于人组织中的特定细胞种(例如上皮细胞、内皮细胞、表皮细胞、间质细胞、成纤维细胞、脂肪组织、乳腺细胞、系膜细胞、胰岛β细胞、神经细胞、神经胶质细胞、外分泌上皮细胞、内分泌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、胚细胞或免疫细胞(例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞等)等)的细胞。
来源于人组织的株化细胞可以由本领域技术人员使用公知的方法制作或商业上获得。作为该株化细胞，可列举例如人胚肾细胞293(HEK293)细胞(J.Gen.Virol.；1977；36：59-74)、WI-38细胞、SC-01MFP细胞或MRC-5细胞、或者来源于这些细胞的细胞。一个实施方式中，本发明中使用的人来源细胞为来源于HEK293细胞的细胞。一个实施方式中，来源于HEK293细胞的细胞为FreeStyleTM 293-F细胞。
由干细胞分化而成的细胞为由人来源的人工诱导多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)分化而成的细胞。iPS细胞或ES细胞的制作和由该细胞分化而成的细胞可以由本领域技术人员使用公知的方法来制作。
来源于癌组织的细胞可以利用本领域技术人员公知的方法由患者的癌组织单离和/或纯化而获得。另外，也可以使用本领域技术人员通常可由美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC(注册商标))等机构获得的人癌组织来源的株化细胞。
2.NY-ESO-1
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞含有编码作为癌抗原的纽约食管鳞状细胞癌1(NewYork esophageal squamous cell carcinoma 1；NY-ESO-1)或其片段的多核苷酸。NY-ESO-1为也被称为癌/睾丸抗原1(cancer/testis antigen 1；CTAG1)的蛋白质，可在各种癌中观察到表达，但是已知在成体的正常组织中仅在睾丸中表达。
本发明中使用的NY-ESO-1可以是天然存在的NY-ESO-1，或者，只要在以aAVC形式进行给药的情况下诱导NY-ESO-1特异性T细胞则也可以为其改造体。一个实施方式中，本发明中使用的NY-ESO-1为来源于哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、黑猩猩等)的NY-ESO-1。一个实施方式中，NY-ESO-1为人NY-ESO-1。一个实施方式中，人NY-ESO-1为由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽。一个实施方式中，人NY-ESO-1为由与由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％以上的一致性的氨基酸序列构成的多肽。一个实施方式中，人NY-ESO-1为由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或数个、优选1～10个、更优选1～7个、进一步更优选1～5个、1～3个或1～2个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。另外，只要在以aAVC形式进行给药的情况下诱导NY-ESO-1特异性T细胞，则本发明中使用的NY-ESO-1也可以为NY-ESO-1的片段。一个实施方式中，NY-ESO-1的片段为人NY-ESO-1的片段。一个实施方式中，人NY-ESO-1的片段为具有序列号2所示的氨基酸序列的20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的长度的多肽。由通过以aAVC形式进行给药而产生的NY-ESO-1特异性T细胞的诱导例如可通过后述实施例1-2中记载的方法来评价。可以使用该领域中公知的方法由所使用的NY-ESO-1或其片段的氨基酸序列来设计碱基序列，制作本发明中使用的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。一个实施方式中，编码NY-ESO-1的多核苷酸为由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸。
本说明书中的“一致性”是指使用EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res.；2015；43：W580-W584)由以默认准备的参数得到的一致性(Identity)的值。上述参数如以下所述。
空位开放罚分(Gap Open Penalty)＝10
空位扩展罚分(Gap Extend Penalty)＝0.5
矩阵(Matrix)＝EBLOSUM62
末端空位罚分(End Gap Penalty)＝false
3.CD1d
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞含有编码CD1d的多核苷酸。CD1d为在细胞表面表达的MHC I类样糖蛋白。本发明中使用的CD1d只要在人来源细胞中表达时具有CD1d的功能则可以是天然存在的CD1d或其改造体。作为CD1d的功能，可列举与CD1d配体(例如α-GalCer)结合的能力。CD1d与CD1d配体结合的能力可以使用公知的方法由本领域技术人员容易地评价。另外，还可以以aAVC活化人NKT细胞的能力作为指标来评价CD1d的功能。例如可以在非专利文献5的Fig.1中记载的体外评价系统中评价该人NKT细胞的活化能力。简单而言，将在α-GalCer存在下培养的CD1d表达细胞与NKT细胞共培养，测定培养液中的IFN-γ的量，由此可以评价NKT细胞的活化。
一个实施方式中，本发明中使用的CD1d为来源于哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、黑猩猩等)的CD1d。一个实施方式中，CD1d为人CD1d。一个实施方式中，人CD1d为由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽。一个实施方式中，人CD1d为由在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个、1～7个、1～5个、1～3个或1～2个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且具有CD1d的功能的多肽。一个实施方式中，人CD1d为由与序列号4所示的多肽具有至少90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的一致性的氨基酸序列构成、且具有CD1d的功能的多肽。
本发明中使用的编码CD1d的多核苷酸可以是所使用的人来源细胞中内源的多核苷酸，或者，可以为外源性导入的多核苷酸。在将编码CD1d的多核苷酸外源性导入到人来源细胞中的情况下，可以使用该领域中公知的方法由所使用的CD1d的氨基酸序列设计碱基序列而制作该多核苷酸。一个实施方式中，编码CD1d的多核苷酸为由序列号3所示的碱基序列构成的多核苷酸。
4.启动子
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中，编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸与诱导型启动子有效连接。本说明书中，“有效连接”是指为了利用启动子控制宿主细胞中的多肽的表达而使该启动子与多核苷酸连接的状态。另外，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中，将编码CD1d的多核苷酸外源性导入到人来源细胞中的情况下，可以将该多核苷酸与启动子有效连接。这种情况下，作为用于表达CD1d的启动子，可以使用恒定地促进表达的启动子或诱导型启动子中的任一者。
“诱导型启动子”是指诱导地促进表达的启动子，是指在驱动该启动子的诱导因子(本说明书中，也称为“诱导型启动子的诱导因子”或简称为“诱导因子”)存在下能够诱导与该启动子有效连接的多核苷酸的表达的启动子。作为诱导型启动子，可列举例如温热诱导型启动子(例如热休克启动子)、药剂诱导型启动子。一个实施方式中，诱导型启动子为药剂诱导型启动子。本说明书中，“药剂诱导型启动子”是指通过作为诱导因子的药剂来调节与该启动子有效连接的多核苷酸的表达的启动子。作为药剂诱导型启动子，可列举例如Cumate操纵子序列、λ操纵子序列(例如12×λOp)、四环素基因表达诱导系的诱导型启动子(以下称为“四环素系诱导型启动子”)等。Cumate操纵子序列在CymR阻遏物存在下为非活性，在诱导因子Cumate存在下与CymR阻遏物解离并诱导与该启动子有效连接的多核苷酸的表达。λ操纵子序列在使通过二聚体化具有转录活化能力的激活因子(λRep-GyrB-AD)二聚体化的诱导因子(例如香豆霉素)存在下诱导与该启动子有效连接的多核苷酸的表达。四环素系诱导型启动子在作为诱导因子的四环素或其衍生物(例如多西环素等)和反向四环素控制性反式激活因子(rtTA)(例如Tet-On 3G)存在下诱导与该启动子有效连接的多核苷酸的表达。作为四环素系诱导型启动子，可列举例如TRE3G启动子。一个实施方式中，药剂诱导型启动子为四环素系诱导型启动子，一个实施方式中，四环素系诱导型启动子为TRE3G启动子。
作为恒定地促进表达的启动子，可列举例如来源于CMV(巨细胞病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、SV40(猿猴病毒40)等病毒的启动子、肌动蛋白启动子、EF(延伸因子)1α启动子等。
对于本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞而言，通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养该细胞，可诱导NY-ESO-1或其片段的表达。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞表达NY-ESO-1或其片段。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞表达CD1d和NY-ESO-1或其片段。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量的下限值为每106个细胞超过88ng的、90ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、245ng以上、250ng以上、300ng以上、400ng以上、500ng以上、600ng以上、700ng以上、800ng以上、900ng以上、1000ng以上、1500ng以上、2000ng以上、2500ng以上、3000ng以上、4000ng以上、5000ng以上、6000ng以上、7000ng以上、8000ng以上、9000ng以上或10000ng以上，上限值为30000ng以下、35000ng以下、40000ng以下、43890ng以下、45000ng以下、50000ng以下、55000ng以下、60000ng以下。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～50000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～45000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～43890ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～40000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～35000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～45000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～43890ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～40000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～35000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～45000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～43890ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～40000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～35000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～45000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～43890ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～40000ng。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～35000ng。
5.CD1d配体
一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以在细胞表面负载有CD1d配体。本说明书中，“在细胞表面负载有CD1d配体”是指在aAVC细胞的表面结合有CD1d配体的状态。
CD1d配体向细胞表面的负载可如＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法＞项中记载那样，通过对表达CD1d的细胞进行CD1d配体(例如α-GalCer)冲击来进行。本说明书中，“进行CD1d配体冲击”是指使细胞在培养用培养基中与CD1d配体接触。经CD1d配体冲击的aAVC中，在全部或至少一部分的CD1d上负载有CD1d配体。
作为本发明中使用的CD1d配体，存在有例如α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)、α-C-半乳糖神经酰胺(α-C-GalCer)、7DW8-5、异球三己糖基神经酰胺(iGb3)等。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。α-GalCer是化学名为(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-N-十六烷酰基-2-氨基-1,3,4-十八烷三醇、以CAS RN：158021-47-7登录、分子式如C50H99NO9所示的物质(分子量：858.34)。α-GalCer可以按照该领域中公知的技术合成，也可以使用可商业上获得的物质(例如α-Galactosylceramide(フナコシ、Cat.KRN7000))。
＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法＞
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以通过向人来源细胞中导入与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸、和根据需要使用的编码CD1d的多核苷酸而制作。本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法可以进一步包括培养aAVC-NY-ESO-1细胞的步骤、对细胞进行克隆的步骤和在细胞表面负载CD1d配体的步骤。
1.多核苷酸向人来源细胞中的导入
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以通过向人来源细胞中导入编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸而制作(以下，将要导入的多核苷酸也称为“目标多核苷酸”)。或者，在使用内源性表达CD1d的细胞作为人来源细胞时，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以通过向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸而制作。
编码CD1d的多核苷酸和编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸例如可以由NCBIRefSeq ID、GenBank登录号获得编码氨基酸序列的碱基序列并使用标准的分子生物学和/或化学手法进行设计和制作。例如，上述多核苷酸可以基于其碱基序列使用亚磷酰胺法等合成，或者，可以将使用聚合酶链式反应(PCR)由cDNA文库得到的DNA片段组合而制作。
目标多核苷酸向人来源细胞中的导入可以使用电穿孔、脂质体转染、显微注射等非病毒载体系的方法或病毒载体系中的任一方法来进行。在使用非病毒载体系的方法的情况下，目标多核苷酸可以为质粒载体、cDNA等形态或mRNA形态。
质粒载体或病毒载体可作为用于在人来源细胞中外源性表达CD1d或NY-ESO-1或其片段的表达载体来使用。表达载体只要能够表达目标多肽就没有特别限制，可以由本领域技术人员使用公知的方法制作。关于表达载体，作为质粒载体，可使用例如pcDNA系列(Thermo Fisher Scientific公司)、pALTER(注册商标)-MAX(プロメガ)或pHEK293 Ultra表达载体(宝生物公司)等)，作为病毒载体，可使用例如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒或腺相关病毒。例如，在使用慢病毒向人来源细胞中导入目标多核苷酸时，该慢病毒可以使用pLVSIN-CMV/EF1α载体(宝生物公司)、pLenti载体(Thermo Fisher Scientific公司)来制作。在人来源细胞中外源性表达CD1d和NY-ESO-1或其片段时，可以使用一个表达载体将编码CD1d的多核苷酸和编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸导入到人来源细胞中，也可以使用不同的表达载体进行导入。另外，表达载体中可以含有可成为用于确认目标基因或多核苷酸的表达的标记的基因(例如药剂抗性基因、编码报告基因酶的基因或编码荧光蛋白的基因等)。表达载体可以还含有起始密码子和终止密码子、增强子序列、非翻译区、剪接位点、多聚腺苷酸化位点或可复制单元等。
一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法包括向人来源细胞中导入含有编码CD1d的多核苷酸的表达载体和含有与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体的步骤。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法包括向人来源细胞中导入含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体的步骤。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法包括向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入含有与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体的步骤。关于这些方法，一个实施方式中，表达载体为质粒载体或病毒载体，一个实施方式中，表达载体为病毒载体，一个实施方式中，病毒载体为慢病毒载体。
一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞为通过向人来源细胞中导入含有编码CD1d的多核苷酸的表达载体和含有与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体而制作的细胞。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞为通过向人来源细胞中导入含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体而制作的细胞。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞为通过向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入含有与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的表达载体而制作的细胞。关于这些细胞，一个实施方式中，表达载体为质粒载体或病毒载体，一个实施方式中，表达载体为病毒载体，一个实施方式中，病毒载体为慢病毒载体。一个实施方式中，所制作的aAVC-NY-ESO-1细胞在染色体外或细胞核的基因组DNA上具有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。一个实施方式中，所制作的细胞在其细胞核的基因组DNA上具有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。
2.aAVC-NY-ESO-1细胞的培养
通过上述方法制作的aAVC-NY-ESO-1细胞可进一步通过培养而使其增殖。用于维持或增殖aAVC-NY-ESO-1细胞的细胞的培养通过公知的方法进行。作为基础培养基，可以使用例如MEM培养基(Science；1952；122：501)、DMEM培养基(Virology；1959；8：396-397)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199：519-524)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73：1-8)、FreeStyleTM293表达培养基(Thermo FisherScientific公司、Cat.12338022)、CD 293培养基(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.11913019)、Expi293TM表达培养基(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.A1435101)。培养用培养基例如可以含有血清(例如胎牛血清)、血清替代物(例如KnockOut SerumReplacement：KSR)、脂肪酸或脂质、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、抗生素等。一个实施方式中，培养中使用的培养基为无血清培养基或化学限定培养基。
培养条件(例如培养时间、温度、培养基的pH、CO2浓度等培养条件)可由本领域技术人员适当选择。培养基的pH优选为约6～8，培养温度没有特别限定，例如为约30～40℃，优选为约37℃。另外，CO2浓度为约1～10％、优选为约5％。培养时间没有特别限定，进行约15～336小时。根据需要，也可以进行通气、搅拌。
培养aAVC-NY-ESO-1细胞时，可以使aAVC-NY-ESO-1细胞与诱导型启动子的诱导因子接触而诱导NY-ESO-1或其片段的表达。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养aAVC-NY-ESO-1细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。一个实施方式中，该诱导型启动子为药剂诱导型启动子，该制作方法包括在药剂诱导型启动子的诱导因子存在下培养aAVC-NY-ESO-1细胞的步骤。在使用药剂诱导型启动子的情况下，可以在添加了作为诱导因子的四环素、多西环素、Cumate、香豆霉素等药剂的培养基中培养细胞，从而诱导与药剂诱导型启动子有效连接的基因或多核苷酸的表达。该步骤可以按照通常的使用基因诱导系统的基因诱导方法来进行。一个实施方式中，该药剂诱导型启动子为四环素系诱导型启动子，该制作方法包括在四环素或其衍生物和rtTA存在下培养aAVC-NY-ESO-1细胞的步骤。一个实施方式中，四环素系诱导型启动子为TRE3G启动子，该制作方法包括在四环素或其衍生物和Tet-On 3G存在下培养aAVC-NY-ESO-1细胞的步骤。得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的CD1d和NY-ESO-1或其片段的表达量可以通过使用抗CD1d抗体或抗NY-ESO-1抗体的蛋白免疫印迹法(Western blot)、ELISA法、流式细胞术法等本领域技术人员公知的方法来测定。
3.aAVC-NY-ESO-1细胞的克隆
在向细胞中导入多核苷酸的情况下，导入了目标多核苷酸的细胞和未导入目标核酸的细胞混杂存在，而且，在使目标多核苷酸整合到细胞核的基因组DNA上的情况下，其整合位置也根据细胞而不同，因此有时形成不均质(heterogeneous)的细胞群。本说明书中，将上述的不均质的细胞群称为“细胞池”。利用由该细胞池获得具有单一基因型的细胞的方法(本说明书中称为“克隆”)获得导入了编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的单个细胞(以下称为“克隆化细胞”)并使其增殖，由此能够获得具有单一基因型的细胞群(以下称为“克隆化细胞群”)。aAVC-NY-ESO-1细胞的克隆可以使用本领域技术人员熟知的方法来实施，例如可以使用有限稀释法、单细胞分选法或菌落挑取法。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞的克隆方法也可以使用有限稀释法、单细胞分选法或菌落挑取法中的1种方法或2种以上方法的组合。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞的克隆方法为有限稀释法。
对于通过上述方法获得的各克隆化aAVC-NY-ESO-1细胞，使其一部分与诱导型启动子的诱导因子接触并测定所得到的细胞中的CD1d和NY-ESO-1或其片段的表达量，由此可以选择在诱导因子存在下对CD1d和NY-ESO-1或其片段显示出目标表达量的、克隆化aAVC-NY-ESO-1细胞群。可将所选择的克隆化细胞群以冷冻状态保存后的物质(或者也称为“冷冻物”)作为研发细胞库(RCB)使用。可将培养RCB的细胞使其增殖并冷冻后的物质作为主细胞库(MCB)使用。可将培养MCB的细胞使其增殖并冷冻后的物质作为工作细胞库(WCB)使用。可将培养WCB的细胞而得的物质作为药品的原料来使用。各细胞库可以含有冷冻保护剂。各细胞库可分注于多个容器(例如2～10000个容器、例如10～1000个容器、例如100～500个容器)中以冷冻状态保管。克隆化aAVC-NY-ESO-1细胞的解冻、培养和与诱导因子的接触、以及CD1d和NY-ESO-1或其片段的表达量的测定分别可以通过本领域技术人员公知的方法来进行，培养、与诱导因子的接触和表达量的测定例如可以使用“2.aAVC-NY-ESO-1细胞的培养”中记载的方法等来进行。一个实施方式中，克隆化aAVC-NY-ESO-1细胞的培养和与诱导因子的接触、以及CD1d和NY-ESO-1或其片段的表达量的测定可以在RCB和WCB解冻后进行。
一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量的下限值为每106个细胞超过88ng的、90ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、245ng以上、250ng以上、300ng以上、400ng以上、500ng以上、600ng以上、700ng以上、800ng以上、900ng以上、1000ng以上、1500ng以上、2000ng以上、2500ng以上、3000ng以上、4000ng以上、5000ng以上、6000ng以上、7000ng以上、8000ng以上、9000ng以上或10000ng以上，上限值为30000ng以下、35000ng以下、40000ng以下、43890ng以下、45000ng以下、50000ng以下、55000ng以下、60000ng以下。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～50000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～45000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～43890ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～40000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～35000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～45000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～43890ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～40000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～35000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～45000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～43890ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～40000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～35000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～45000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～43890ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～40000ng。一个实施方式中，得到的aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～35000ng。
4.CD1d配体向aAVC-NY-ESO-1细胞上的负载
通过对aAVC-NY-ESO-1细胞进行CD1d配体冲击，由此可以制作负载有CD1d配体的aAVC-NY-ESO-1细胞。进行CD1d配体冲击的条件(例如，向细胞的培养用培养基中添加CD1d配体的时机、培养用培养基中的CD1d配体的浓度和培养时间等)可考虑所使用的细胞和培养时的诸条件由本领域技术人员适当调整。添加于aAVC-NY-ESO-1细胞的培养用培养基中的CD1d配体的浓度没有特别限定，例如，可在1ng/mL～10000ng/mL的范围内适当选择。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。一个实施方式中，CD1d配体向aAVC-NY-ESO-1细胞上的负载可在该细胞与诱导因子接触之前进行。一个实施方式中，CD1d配体向aAVC-NY-ESO-1细胞上的负载可在该细胞与诱导因子接触之后进行。一个实施方式中，CD1d配体向aAVC-NY-ESO-1细胞上的负载可与该细胞与诱导因子的接触同时进行。这些实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞优选进行了克隆化。
对于上述制作的表达CD1d和NY-ESO-1或其片段、且负载有CD1d配体的aAVC-NY-ESO-1细胞而言，可以使用人工方法使该细胞的增殖停止。使该细胞的增殖停止的方法没有特别限定，例如，可以使用通过放射线(例如X射线)照射使细胞增殖停止的方法、添加丝裂霉素C等药剂的方法等。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以为表达CD1d和NY-ESO-1或其片段、且停止了增殖的细胞。一个实施方式中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞可以为表达CD1d和NY-ESO-1或其片段、负载有CD1d配体且停止了增殖的细胞。
＜本发明的药物组合物等＞
本发明另外提供含有本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的药物组合物。该药物组合物中，aAVC-NY-ESO-1细胞表达CD1d和NY-ESO-1或其片段、且在该细胞的表面负载有CD1d配体。一个实施方式中，该药物组合物为用于处置癌症的药物组合物。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。该药物组合物可以使用该领域中通常所使用的赋形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等并且利用通常所使用的方法来制备。在药物组合物的制剂化时，可以以药学上可接受的范围使用与这些剂型对应的赋形剂、载体、添加剂等。作为这些药物组合物的剂型的例子，可列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂。一个实施方式中，本发明的药物组合物可含有aAVC-NY-ESO-1细胞的冷冻物。一个实施方式中，本发明的药物组合物可含有aAVC-NY-ESO-1细胞的冷冻物和冷冻保护剂。一个实施方式中，本发明的药物组合物可含有aAVC-NY-ESO-1细胞的悬浮液。一个实施方式中，本发明的药物组合物可含有aAVC-NY-ESO-1细胞的悬浮液和冷冻保护剂。本发明另外提供本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞在制造用于处置癌症的药物组合物中的应用，其中，该细胞表达CD1d和NY-ESO-1或其片段且在该细胞的表面负载有CD1d配体。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。本发明另外提供一种细胞，其为用于处置癌症的本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞，其表达CD1d和NY-ESO-1或其片段且在该细胞的表面负载有CD1d配体。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。
本发明另外提供一种处置癌症的方法，其包括将本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞给药于对象的步骤。该方法中，aAVC-NY-ESO-1细胞表达CD1d和NY-ESO-1或其片段且在该细胞的表面负载有CD1d配体。一个实施方式中，CD1d配体为α-GalCer。本说明书中，“对象”为哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、黑猩猩等)，一个实施方式中，对象为人。本说明书中，“处置”以包含治疗性处置和预防性处置的含义来使用。将aAVC-NY-ESO-1细胞给药于对象时，可以以含有aAVC-NY-ESO-1细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形态给药于对象。aAVC-NY-ESO-1细胞向对象的给药量和给药次数可根据癌症的种类、位置、重症度、接受处置的对象的年龄、体重和状态等适当调节。就aAVC-NY-ESO-1细胞的给药量而言，例如在向对象的一次给药中可以使用1×103个细胞/kg～1×109个细胞/kg。作为向对象给药aAVC-NY-ESO-1细胞的方法，例如，可以通过向静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内或动脉内等的注射或点滴来进行给药。本发明的处置方法可以与其它癌症治疗方法组合使用。作为其它癌症治疗方法，可列举手术、放射线治疗、造血干细胞移植或者利用其它抗癌剂的治疗。
作为成为本发明的处置对象的癌症，没有特别限定，可列举：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤等血液癌；骨髓增生异常综合征、腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈癌、头颈癌、子宫癌、宫颈癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、脑瘤等实体癌；和骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌症；以及软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤；肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤和视网膜母细胞瘤等母细胞瘤等。一个实施方式中，成为本发明的处置对象的癌症为NY-ESO-1阳性癌症。
本发明的药物组合物、应用、细胞和癌症的处置方法中，aAVC-NY-ESO-1细胞的NY-ESO-1或其片段的每106个细胞的表达量的下限值例如为超过88ng的、90ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、245ng以上、250ng以上、300ng以上、400ng以上、500ng以上、600ng以上、700ng以上、800ng以上、900ng以上、1000ng以上、1500ng以上、2000ng以上、2500ng以上、3000ng以上、4000ng以上、5000ng以上、6000ng以上、7000ng以上、8000ng以上、9000ng以上或10000ng以上，上限值为30000ng以下、35000ng以下、40000ng以下、43890ng以下、45000ng以下、50000ng以下、55000ng以下、60000ng以下。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量的下限值为每106个细胞超过88ng的、90ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、245ng以上、250ng以上、300ng以上、400ng以上、500ng以上、600ng以上、700ng以上、800ng以上、900ng以上、1000ng以上、1500ng以上、2000ng以上、2500ng以上、3000ng以上、4000ng以上、5000ng以上、6000ng以上、7000ng以上、8000ng以上、9000ng以上或10000ng以上，上限值为30000ng以下、35000ng以下、40000ng以下、43890ng以下、45000ng以下、50000ng以下、55000ng以下、60000ng以下。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～50000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～45000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～43890ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～40000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为89ng～35000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～45000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～43890ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～40000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为106ng～35000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～45000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～43890ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～40000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为245ng～35000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～45000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～43890ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～40000ng。一个实施方式中，aAVC-NY-ESO-1细胞中的NY-ESO-1或其片段的表达量为1000ng～35000ng。
＜用于处置癌症的细胞或药物组合物的制造方法＞
本发明另外提供用于处置癌症的细胞或药物组合物的制造方法，其包括使本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞与诱导型启动子的诱导因子接触而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。一个实施方式中，该制造方法包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养该aAVC-NY-ESO-1细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。一个实施方式中，该制造方法还包括在细胞表面负载α-GalCer的步骤。CD1d配体向细胞表面的负载可以在aAVC-NY-ESO-1细胞与诱导因子接触之前、之后或同时。本发明另外提供本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞在制造用于处置癌症的药物组合物中的应用。
本发明另外提供用于处置癌症的细胞或药物组合物的制造方法，其包括以下步骤：向人来源细胞中导入编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤；或向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤。
一个实施方式中，该制造方法还包括使上述步骤中得到的细胞(aAVC-NY-ESO-1细胞)与诱导型启动子的诱导因子接触而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。一个实施方式中，该制造方法包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养该aAVC-NY-ESO-1细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。一个实施方式中，该制造方法还包括在细胞表面负载α-GalCer的步骤。CD1d配体向细胞表面的负载可以在aAVC-NY-ESO-1细胞与诱导因子接触之前、之后或同时。
关于与本项中记载的制造方法中使用的细胞和步骤等有关的具体实施方式，如上述＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞＞和＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的制作方法＞项中所记载。
＜本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞与免疫检查点抑制剂的组合使用＞
本发明另外提供处置癌症的方法，其包括将本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂给药于对象的步骤。本发明另外提供与免疫检查点抑制剂组合使用的、含有本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞的用于处置癌症的药物组合物。本发明另外提供与免疫检查点抑制剂组合使用的、用于处置癌症的本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞。本发明另外提供本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞在制造与免疫检查点抑制剂组合使用的用于处置癌症的药物组合物中的应用。该方法、药物组合物、细胞或应用中，本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞表达CD1d和NY-ESO-1或其片段且在该细胞的表面负载有CD1d配体。
本说明书中，“免疫检查点抑制剂”是指通过解除由免疫检查点分子引起的免疫细胞抑制、从而激活免疫的药剂。作为免疫检查点分子，可列举程序性细胞死亡-1(Programmed cell death 1；PD-1)、细胞杀伤性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4；CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域-3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3；TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3；LAG-3)和含有V型免疫球蛋白结构域的T细胞活化抑制因子(V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation；VISTA)等。这些分子所负责的免疫检查点被称为PD-1系免疫检查点、CTLA-4系免疫检查点、TIM-3系免疫检查点、LAG-3系免疫检查点和VISTA系免疫检查点。免疫检查点抑制剂例如可与免疫检查点分子或其配体结合并抑制免疫检查点的功能。例如，PD-1系免疫检查点抑制剂可以通过抑制PD-1与PD-L1或PD-L2的结合来抑制PD-1系免疫检查点。另外，CTLA-4系免疫检查点抑制剂可以通过抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合来抑制CTLA-4系免疫检查点。另外，TIM-3系免疫检查点抑制剂可以通过抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9的结合来抑制TIM-3系免疫检查点。另外，LAG-3系免疫检查点抑制剂可以通过抑制LAG-3与MHC II类分子的结合来抑制LAG-3系免疫检查点。另外，VISTA系免疫检查点抑制剂可以通过抑制VISTA与VSIG-3/IGSF11的结合来抑制VISTA系免疫检查点。免疫检查点抑制剂是指能够抑制PD-1系免疫检查点、CTLA-4系免疫检查点、TIM-3系免疫检查点、LAG3系免疫检查点和VISTA系免疫检查点等中的一种以上免疫检查点的物质，可列举抗体、抗原结合性蛋白和低分子化合物等。抗体存在有与受体或配体中的任一者结合的抗体。例如，作为抑制PD-1系免疫检查点的抗体，可列举抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体，可使用例如纳武单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、匹地利珠单抗、AMP-514、ANB-011、BGB-A317、REGN-2810、HR301210、PF-06801591、JS-001、IBI-308、CBT-501、阿维单抗、阿特珠单抗、BMS-936559、LY-3300054、JNJ-61610588、和德瓦鲁单抗。另外，作为抑制CTLA-4系免疫检查点的抗体，可列举抗CTLA-4抗体、抗CD80抗体或抗CD86抗体，可使用例如伊匹木单抗和曲美木单抗。另外，抑制TIM-3系免疫检查点的抗体可列举抗TIM-3抗体或抗半乳糖凝集素-9抗体，可使用例如MGB453。另外，抑制VISTA系免疫检查点的抗体可列举选自由抗VISTA抗体或抗VSIG-3/IGSF11抗体组成的组中的抗体，可使用例如JNJ-61610588。另外，作为低分子化合物，可使用AUPM-170。
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞与免疫检查点抑制剂的组合使用可增强aAVC-NY-ESO-1细胞的抗肿瘤作用。一个实施方式中，可与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为PD-1系免疫检查点抑制剂。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为纳武单抗、派姆单抗、阿维单抗、阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为纳武单抗或派姆单抗。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为派姆单抗。另外，另一实施方式中，可与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为CTLA-4系免疫检查点抑制剂。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、抗CD80抗体或抗CD86抗体。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为伊匹木单抗或曲美木单抗。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为纳武单抗或派姆单抗。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为伊匹木单抗。
例如，包括向对象给药本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂的步骤的处置癌症的方法的一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为PD-1系免疫检查点抑制剂或CTLA-4系免疫检查点抑制剂。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为PD-1系免疫检查点抑制剂。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为纳武单抗、派姆单抗、阿维单抗、阿特珠单抗或德瓦鲁单抗。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为纳武单抗或派姆单抗。一个实施方式中，与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为派姆单抗。另外，另一实施方式中，可与本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞组合使用的免疫检查点抑制剂为CTLA-4系免疫检查点抑制剂。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、抗CD80抗体或抗CD86抗体。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为伊匹木单抗或曲美木单抗。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为纳武单抗或派姆单抗。一个实施方式中，给药于对象的免疫检查点抑制剂为伊匹木单抗。
本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂可以同时、逐次地、连续地或重复地给药。本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂任一者先给药均可。一个实施方式中，可以在给药免疫检查点抑制剂之前先开始给药本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞。一个实施方式中，可以在给药本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞之前先开始给药免疫检查点抑制剂。本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂可以分别独立地单次给药或多次给药。一个实施方式中，利用本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞和免疫检查点抑制剂的单剂疗法的联用疗法中，可以组合使用进一步追加的化学疗法剂等抗癌剂。
在此提供为了进一步理解本发明而参照的特定实施例，但这些是出于例示目的，并非对本发明进行限定。
实施例
[实施例1：小鼠型aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞的抗肿瘤作用]
[实施例1-1：小鼠型aAVC(3T3)-NY-ESO-1的制作]
为了通过体内评价系统确认搭载有作为癌抗原的NY-ESO-1的aAVC作为癌症疫苗的效果，制作了向小鼠NIH/3T3细胞(ATCC、Cat.CRL-1658)中导入NY-ESO-1基因和CD1d基因的mRNA而成的小鼠型aAVC(也称为aAVC(3T3)-NY-ESO-1)。
NY-ESO-1基因(序列号1)是基于序列号2所示的人NY-ESO-1的氨基酸序列通过人工基因合成而制作的。使用添加了与含有pGEM(注册商标)-4Z质粒(プロメガ公司、Cat.P2161)的HindIII或EcoRI识别序列的15个碱基互补的序列的引物，通过PCR法扩增NY-ESO-1基因。用In-Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(宝生物公司、Cat.639648)将扩增得到的NY-ESO-1基因插入到pGEM(注册商标)-4Z的HindIII-EcoRI位点。将得到的质粒称为pGEM-4Z-NY-ESO-1质粒。在pGEM(注册商标)-4Z质粒的HindIII-BamHI位点插入由序列号5所示的碱基序列构成的小鼠CD1d基因(基于UniProt：P11609-1的氨基酸序列(序列号6)，通过人工基因合成而合成基因)。将得到的质粒称为pGEM-4Z-mCD1d质粒。将pGEM-4Z-NY-ESO-1质粒和pGEM-4Z-mCD1d质粒分别用EcoRI和BamHI切断而成为直链，将其作为模板使用，用mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.AMB13455)制作NY-ESO-1mRNA和CD1d mRNA。将在添加了500ng/mLα-GalCer的含有10％量的胎牛血清的杜尔贝科改良伊戈尔培养基(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.10569)中培养了2天的NIH/3T3细胞回收，向细胞悬浮液中添加NY-ESO-1mRNA和CD1dmRNA，使用NEPA21电穿孔仪(ネッパジーン株式会社)进行电穿孔(穿孔脉冲：电压150V、脉冲宽度8ms、脉冲间隔50ms、次数2次、衰减率10％、极性+、传输脉冲：电压20V、脉冲宽度50ms、脉冲间隔50ms、次数±5次、衰减率40％、极性+/-)。回收细胞，使用X射线照射装置MBR-1520R-3(株式会社日立パワーソリューションズ)照射30Gy量的X射线。将通过上述方法得到的细胞称为aAVC(3T3)-NY-ESO-1。
[实施例1-2：小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1的NY-ESO-1特异性T细胞诱导能力]
向每组5例的6周龄C57BL/6J雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的尾静脉给药悬浮于BICANATE注射液(株式会社大塚制药工业)中的5×105个细胞的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。给药7天后，从小鼠回收脾细胞，以4×105个细胞/孔播种于小鼠IFN-γsingle-color enzymatic ELISPOT分析试剂盒(Cellular TechnologyLymited公司、Cat.mIFNgp-2M/5)的板中。进而，为了刺激NY-ESO-1特异性T细胞，添加作为覆盖NY-ESO-1蛋白序列全长的重叠肽的NY-ESO-1肽(PepTivator NY-ESO-1-premiumgrade，human(ミルテニーバイオテク公司、Cat.130-095-381))或作为抗原非特异性肽的PAP肽(PepTivator PAP-research grade，human(ミルテニーバイオテク公司、Cat.130-096-767))，在37℃、5％CO2条件下培养1天。通过对孔底的斑点数进行计数，由此计测IFN-γ产生细胞数。给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1的小鼠的情况下，产生IFN-γ的细胞由于NY-ESO-1肽刺激而增加(图1-1)。与抗原非特异性PAP肽刺激所引起的斑点数的差表示NY-ESO-1特异性T细胞数。该结果表明，通过给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1而诱导了NY-ESO-1特异性T细胞。
[实施例1-3：NY-ESO-1表达B16黑素瘤细胞荷瘤小鼠中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1的抗原特异性抗肿瘤效果]
向每组10例的8周龄C57BL/6J雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的尾静脉给药悬浮于BICANATE注射液中的5×105个细胞的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。给药14天后，向上述小鼠的皮下分别接种悬浮于D-PBS(-)(富士胶片和光纯药株式会社、Cat.045-29795)中的3×105个细胞的B16-F10黑素瘤细胞(ATCC、Cat.CRL-6475)或悬浮于D-PBS(-)中的3×105个细胞的通过导入NY-ESO-1基因而制作的表达NY-ESO-1蛋白的B16-F10黑素瘤细胞(以下称为B16-NY-ESO-1或B16-NY-ESO-1细胞)。将接种癌细胞当天设为第0天，计测20天的肿瘤体积的变化。通过给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1而显著抑制了B16-NY-ESO-1肿瘤的增大，与此相对地，不表达NY-ESO-1的B16-F10肿瘤的增大未受到抑制(图1-2)。该结果表明，aAVC(3T3)-NY-ESO-1具有基于NY-ESO-1特异性免疫诱导的NY-ESO-1特异性抗肿瘤效果。
[实施例1-4：NY-ESO-1表达B16黑素瘤细胞荷瘤小鼠中显示抗肿瘤效果的aAVC(3T3)-NY-ESO-1的细胞数的研究]
向8周龄C57BL/6J雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的皮下接种悬浮于D-PBS(-)中的3×105个细胞的B16-NY-ESO-1细胞。在细胞接种7天后，将上述小鼠根据肿瘤体积以每组10例分成5组，从尾静脉分别以5×102个细胞/小鼠、5×103个细胞/小鼠、5×104个细胞/小鼠、5×105个细胞/小鼠给药悬浮于作为溶剂的BICANATE注射液中的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。将给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1当天设为第0天，计测10天的肿瘤体积的变化。需要说明的是，5×105个细胞/小鼠给药组中，在给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1后有2个个体死亡，因此第0天以后的例数为8只。5×103个细胞/小鼠以上的给药组中显著抑制了B16-NY-ESO-1肿瘤的增大(图1-3)。本实验中使用的aAVC(3T3)-NY-ESO-1的NY-ESO-1的表达量为245ng/1×106个细胞。
由实施例1的结果确认到，小鼠型aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞在小鼠体内评价系统中通过诱导NY-ESO-1特异性T细胞而显示出NY-ESO-1特异性抗肿瘤效果。由于可期待人型aAVC-NY-ESO-1细胞在人类中引发天然免疫而发挥抗肿瘤效果、并且诱导抗原特异性获得性免疫而发挥基于获得性免疫的抗肿瘤效果，因此，以创制对人的NY-ESO-1表达癌显示NY-ESO-1特异性抗肿瘤效果的治疗药为目的，以下进行人型aAVC-NY-ESO-1细胞的制作研究。
[实施例2：人型aAVC-NY-ESO-1细胞的制作和制备]
通过以下方法制作人型aAVC-NY-ESO-1细胞。使用分别搭载有NY-ESO-1、CD1d和Tet3G基因的质粒制作慢病毒，使用该慢病毒向FreeStyle 293-F细胞(Thermo FisherScientific公司、Cat.R79007)中导入该基因，由此构建表达NY-ESO-1、CD1d和Tet3G的aAVC细胞。
[实施例2-1：慢病毒制作]
(1)慢病毒制作用质粒的构建
制作了慢病毒质粒pLVsyn-CMV(序列号7)。通过人工基因合成制作了在NY-ESO-1基因(序列号1)的5’末侧添加了EcoRI识别序列、在3’末侧添加了BamHI识别序列的NY-ESO-1基因。将用限制酶EcoRI和BamHI切出的NY-ESO-1基因插入到pLVsyn-CMV质粒的EcoRI-BamHI位点。将得到的质粒称为pLVsyn-CMV-NY-ESO-1质粒。将用限制酶ClaI和EcoRI从基于pTRE3G(宝生物公司、Cat.631173)的序列并利用人工基因合成服务制作的TRE3G质粒中切出的TRE3G启动子插入到用限制酶ClaI和EcoRI除去了CMV启动子的pLVsyn-CMV-NY-ESO-1质粒。将得到的质粒称为pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1质粒。
CD1d基因(序列号3)是基于序列号4所示的人CD1d的氨基酸序列而设计、在基因的5’末侧添加XhoI识别序列、在3’末侧添加NotI识别序列并通过人工基因合成而制作的。将用限制酶XhoI和NotI切出的CD1d基因插入到pLVsyn-CMV质粒的XhoI-NotI位点。将得到的质粒称为pLVsyn-CMV-CD1d质粒。
Tet-On 3G基因是在pCMV-Tet3G质粒(宝生物公司、Cat.631335)的Tet-On 3G基因序列的5’末侧添加XhoI识别序列、在3’末侧添加NotI识别序列并通过人工基因合成而制作的。将用限制酶XhoI和NotI切出的Tet-On 3G基因插入到pLVsyn-CMV质粒的XhoI-NotI位点。将得到的质粒称为pLVsyn-CMV-Tet3G质粒。
(2)慢病毒制作
使用(1)中制作的pLVsyn-CMV-NY-ESO-1质粒、pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1质粒、pLVsyn-CMV-CD1d质粒、pLVsyn-CMV-Tet3G质粒制作搭载有NY-ESO-1、CD1d和Tet3G基因的慢病毒。将得到的慢病毒分别称为CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒、TRE3G-NY-ESO-1搭载慢病毒、CD1d搭载慢病毒和Tet3G搭载慢病毒。
将pLVsyn-CMV-NY-ESO-1质粒、pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1质粒、pLVsyn-CMV-CD1d质粒或pLVsyn-CMV-Tet3G质粒中的任一质粒6μg与ViraPower慢病毒包装混合物(ThermoFisher Scientific公司、Cat.K497500)18μL混合，加入3mL的OptiPROTM SFM(ThermoFisher Scientific公司、Cat.12309019)并混合(A)。将Lipofectamine2000 CD转染试剂(Thermo Fischer Scientific公司、Cat.12566-014)288μL与OptiProTMSFM 12mL混合，静置5分钟(B)。将(A)与3mL的(B)混合，在室温下静置20分钟后，向前一天以5×106个细胞/板播种到Falcon(注册商标)100mm TC处理的细胞培养皿(Corning公司、Cat.353003)的Lenti-XTM 293T细胞(宝生物公司、Cat.632180)中，以3mL/板添加(A)与(B)的混合液，进行基因导入。将Lenti-XTM 293T细胞在含有10％量的胎牛血清(SAFC Biosciences公司、Cat.12007C(γ射线照射品))和0.1％量的庆大霉素(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.15750060)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.10569010)中在37℃、5％CO2条件下进行培养。基因导入后，在相同条件下培养2天，回收含有搭载了各基因的慢病毒的培养上清。将培养上清在4℃下以840×g离心10分钟。将上清用0.45μm的过滤器(Merck公司、Cat.SLHV033RS)过滤，添加上清液量的1/4量的PEG-itTM病毒沉淀液(5x)(SystemBiosciences公司、Cat.LV810A-1)并混合，在4℃下静置过夜。以1500×g在4℃下离心30分钟，除去上清，再次以1500×g在4℃下离心5分钟，完全除去上清。将颗粒悬浮于500μL的DPBS(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.14190144)中，得到CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒、TRE3G-NY-ESO-1搭载慢病毒、CD1d搭载慢病毒和Tet3G搭载慢病毒。
[实施例2-2：慢病毒感染细胞的制作和克隆]
使实施例2-1中制作的各慢病毒感染FreeStyle 293-F细胞。将感染了CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒和CD1d搭载慢病毒的细胞群称为FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池，将感染了TRE3G-NY-ESO-1搭载慢病毒、CD1d搭载慢病毒和Tet3G搭载慢病毒的细胞群称为FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池。从这些细胞池实施细胞的克隆，获得多个来源于各细胞池的克隆。
(1)FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池的制作
使CD1d搭载慢病毒和CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒感染FreeStyle 293-F细胞，得到FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1细胞。作为感染方法，使用同时感染CD1d搭载慢病毒和CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒的方法(细胞池A制作方法)和依次感染CD1d搭载慢病毒和CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒的方法(细胞池C制作方法)这两种不同的方法。FreeStyle 293-F细胞的培养在含有0.1％量的庆大霉素的FreeStyle 293表达培养基(Thermo Fisher Scientific公司、Cat.12338018)中进行。
通过以下方法来进行细胞池A制作。将FreeStyle 293-F细胞制备成1×106个细胞/mL的浓度，以1mL/孔的量播种于Falcon(注册商标)细胞培养12孔平底带盖的细胞培养用多孔板(Corning公司、Cat.353043、此后称为12孔板)，添加实施例2-1中得到的CD1d搭载慢病毒和CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒各50μL或各100μL。以540×g在室温下离心30分钟后，通过吹打轻轻地悬浮细胞，进行振荡培养。培养数天后，从12孔板传代到Corning(注册商标)125mL聚碳酸酯制带通气盖的锥形瓶(Corning公司、Cat.431143、此后称为125mL锥形瓶)，进一步以适当的间隔传代，得到细胞池A。
通过以下方法来进行细胞池C制作。将FreeStyle 293-F细胞制备成1×106个细胞/mL的浓度，以1mL/孔的量播种于Falcon(注册商标)细胞培养12孔平底带盖的细胞培养用多孔板，添加实施例2-1中得到的CD1d搭载慢病毒100μL。以540×g在室温下离心30分钟后，通过吹打轻轻地悬浮细胞，进行振荡培养。培养数天后，从12孔板传代到125mL烧瓶，进一步以适当的间隔传代，得到FreeStyle 293F_CD1d细胞池(称为细胞池B)。将细胞池B再次播种到12孔板，添加CMV-NY-ESO-1搭载慢病毒50μL或200μL，通过与第1次相同的步骤进行第2次慢病毒感染。培养数天后，从12孔板传代到125mL锥形瓶，进一步以适当的间隔传代，得到细胞池C。将细胞池A和细胞池C作为FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池。
(2)FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池的制作
将(1)细胞池C制作方法的过程中得到的细胞池B再次播种于12孔板，添加实施例2-1中得到的TRE3G-NY-ESO-1搭载慢病毒和Tet3G搭载慢病毒各40μL或各200μL，按照(1)中记载的步骤进行慢病毒感染。1天后从12孔板传代到125mL锥形瓶，进一步以适当的间隔传代，得到FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池。
(3)细胞池中的NY-ESO-1表达稳定性和培养特性
对于(1)、(2)中获得的FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池和FreeStyle293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池，获得慢病毒感染后的NY-ESO-1表达量(图2-1)和NY-ESO-1阳性率的时程(图2-2)。对于FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池，在感染后第3、7、10、14天进行NY-ESO-1表达的分析。对于FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池，在感染后第7、14天进行分析。另外，在分析前2天，向培养基中添加终浓度100ng/mL的多西环素(宝生物公司、Cat.631311)，通过Tet-On系统诱导表达。通过ELISA法和流式细胞术法测定NY-ESO-1表达。在利用ELISA法的测定中，使用抗NY-ESO-1抗体(Millipore公司、Cat.MABC1151)作为固相化用抗体，使用抗CTAG1B抗体(ABCAM公司、Cat.ab183740)作为一抗，使用兔IgG辣根过氧化物酶结合抗体(R&D Systems公司、Cat.HAF008)作为二抗，按照夹心ELISA法的常规测定方法进行测定。在利用流式细胞术法的测定中，使用抗NY-ESO-1抗体作为一抗，使用APC山羊抗小鼠IgG(Lifetecnology公司、Cat.A10539)作为二抗，按照使用FACSVerseTM(BD Biosciences公司)的常规测定方法进行测定。另外，在感染后的传代时，作为培养特性，进行存活率的测定(图2-3)和倍增时间的计算(图2-4)。
表达量如图2-1所示，阳性率如图2-2所示，FreeStyle293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池在刚感染慢病毒后，NY-ESO-1表达量、阳性率与FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池相比均显示出非常高的值，但随着培养天数经过，观察到表达量和阳性率的下降。另一方面，FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池则未观察到这样的表达量和表达率的下降。
存活率如图2-3所示，倍增时间如图2-4所示，FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池在慢病毒感染后第7天观察到存活率的下降和倍增时间的延长。推测由于伴随细胞池中NY-ESO-1表达量高的细胞的存活率下降而产生的倍增时间的延长，从而使细胞池整体上的NY-ESO-1表达量、表达率随着培养天数经过而下降。另一方面，FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池则未观察到这样的培养特性的变动。
(4)克隆
从(1)(2)中制作的FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池和FreeStyle293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池进行利用有限稀释法的单细胞克隆，筛选出稳定表达所有基因的克隆。以1个细胞/孔将细胞播种到96孔板中，根据细胞的增殖进行传代，使细胞增殖。对于增殖而得的细胞的NY-ESO-1蛋白和CD1d蛋白的表达量，通过ELISA法测定NY-ESO-1，通过流式细胞术法测定CD1d，筛选出稳定表达NY-ESO-1和CD1d蛋白的克隆。来源于FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池的克隆的NY-ESO-1通过向培养基中添加终浓度100ng/mL的多西环素、并通过Tet-On系统诱导表达来进行评价。利用ELISA法的测定中，使用抗NY-ESO-1抗体作为固相化用抗体，使用抗CTAG1B抗体作为一抗，使用兔IgG辣根过氧化物酶结合抗体作为二抗，按照夹心ELISA法的常规测定方法进行测定。利用流式细胞术法的测定中，使用APC小鼠抗人CD1d抗体(BD Biosciences公司、Cat.563505)，按照使用FACSVerseTM(BD Biosciences公司)的常规测定方法进行测定。
(5)所得克隆的NY-ESO-1表达量
对于(4)中获得的来源于FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池的克隆或来源于FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池的克隆，测定NY-ESO-1的表达量。使用(4)中记载的ELISA法实施测定(图3)。
如图3所示，从FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池单离出的克隆的NY-ESO-1表达量最大为88ng/106个细胞，非常低。另一方面，对于来源于FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d细胞池的克隆而言，克隆之间的差异大，给予选择期望表达量的克隆的余地，而且与来源于FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d细胞池的克隆相比高表达的克隆多。
[实施例3：aAVC(3T3)-NY-ESO-1与抗PD-1抗体的组合使用效果]
(1)NY-ESO-1表达B16黑素瘤细胞荷瘤小鼠中的组合使用效果
向9周龄C57BL/6J雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的皮下接种悬浮于D-PBS(-)中的3×105个细胞的B16-NY-ESO-1细胞。细胞接种7天后，将上述小鼠根据肿瘤体积以每组10例分成4组，腹腔内给药0.1mg的抗PD-1抗体(InVivoMAb抗小鼠PD-1(CD279)、Bio X Cell公司、Cat.BE0146)或同种型抗体(InVivoMAb大鼠IgG2a同种型对照、抗三硝基苯酚(anti-trinitrophenol)、Bio X Cell公司、Cat.BE0089)。以3～4天的间隔每周2次给药抗体，合计给药5次。在开始给药抗体3天后，向上述小鼠的尾静脉给药悬浮于作为溶剂的BICANATE注射液中的5×104个细胞的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。将给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1当天设为第0天，计测至第11天为止的肿瘤体积的变化。通过aAVC(3T3)-NY-ESO-1+同种型抗体的给药和抗PD-1抗体的给药抑制了B16-NY-ESO-1肿瘤的增大。aAVC(3T3)-NY-ESO-1给药和抗PD-1抗体的组合使用与aAVC(3T3)-NY-ESO-1+同种型抗体给药和抗PD-1抗体给药相比，更显著地抑制了B16-NY-ESO-1肿瘤的增大(图4-1)。由该结果暗示了，抗PD-1抗体的组合使用会增强aAVC(3T3)-NY-ESO-1的抗肿瘤效果。
(2)NY-ESO-1表达CT26大肠癌细胞荷瘤小鼠中的组合使用效果
向7周龄BALB/c雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的皮下接种悬浮于D-PBS(-)中的7×105个细胞的通过导入NY-ESO-1基因而制作的表达NY-ESO-1蛋白的CT26大肠癌细胞(ATCC、Cat.CRL-2638)(以下称为CT26-NY-ESO-1细胞)。细胞接种14天后，将上述小鼠根据肿瘤体积以每组8例分成4组，腹腔内给药0.1mg的抗PD-1抗体。抗体非给药组未进行给药。以3～4天的间隔每周2次给药抗体，合计给药4次。在抗体给药开始日，向上述小鼠的尾静脉给药悬浮于作为溶剂的BICANATE注射液中的5×105个细胞的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。将给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1当天设为第0天，计测至第14天为止的肿瘤体积的变化。通过aAVC(3T3)-NY-ESO-1的单剂的给药和抗PD-1抗体的单剂的给药，CT26-NY-ESO-1肿瘤的增大得到了抑制，与此相对地，aAVC(3T3)-NY-ESO-1给药与抗PD-1抗体的组合使用与各单剂的给药相比，更显著地抑制了CT26-NY-ESO-1肿瘤的增大(图4-2)。由该结果暗示了，抗PD-1抗体的组合使用会增强aAVC(3T3)-NY-ESO-1的抗肿瘤效果。
[实施例4：aAVC(3T3)-NY-ESO-1与抗CTLA-4抗体的组合使用效果]
向7周龄BALB/c雌性小鼠(日本查尔斯河实验室)的皮下接种悬浮于D-PBS(-)中的7×105个细胞的CT26-NY-ESO-1细胞。在细胞接种7天后，将上述小鼠根据肿瘤体积以每组10例分成4组，分组7天后，腹腔内给药0.15mg的抗CTLA-4抗体(InVivoMAb抗小鼠CTLA-4(CD152)、Bio X Cell公司、Cat.BE0164)。抗体非给药组中，未进行给药。以3～4的间隔每周2次给药抗体，合计给药5次。在抗体给药开始日，向上述小鼠的尾静脉给药悬浮于作为溶剂的BICANATE注射液中的5×105个细胞的aAVC(3T3)-NY-ESO-1。aAVC(3T3)-NY-ESO-1细胞给药与抗CTLA-4抗体的组合使用组中，给药aAVC(3T3)-NY-ESO-1后有一个个体死亡。对照组中，给药200μL的BICANATE注射液。将接种癌细胞当天设为第0天，计测32天的肿瘤体积的变化。通过aAVC(3T3)-NY-ESO-1的单剂的给药和抗CTLA-4抗体的单剂的给药抑制了CT26-NY-ESO-1肿瘤的增大，与此相对地，aAVC(3T3)-NY-ESO-1给药与抗CTLA-4抗体的组合使用与各单剂的给药相比，更显著地抑制了CT26-NY-ESO-1肿瘤的增大(图5)。由该结果暗示了，抗CTLA-4抗体的组合使用会增强aAVC(3T3)-NY-ESO-1的抗肿瘤效果。
产业上的可利用性
能够期待本发明的aAVC-NY-ESO-1细胞在癌症的处置中有用。
序列表自由文本
序列表的序列号1所示的碱基序列为编码人NY-ESO-1蛋白的碱基序列，序列表的序列号2所示的氨基酸序列为序列号1所编码的氨基酸序列。序列号3所示的碱基序列为编码人CD1d蛋白的碱基序列，序列表的序列号4所示的氨基酸序列为序列号3所编码的氨基酸序列。序列号5所示的碱基序列为编码小鼠CD1d蛋白的碱基序列，序列表的序列号6所示的氨基酸序列为序列号5所编码的氨基酸序列。序列表的序列号7所示的碱基序列为pLVsyn-CMV的碱基序列。在以下的序列表的数字标题＜223＞中，作为“人工序列”的说明进行记载。
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社
国立研究开发法人理化学研究所
<120> 用于处置癌症的含有NY-ESO-1的人工佐剂载体细胞
<130> A20027A00
<150> JP2019-217704
<151> 2019-12-02
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(540)
<400> 1
atg cag gcc gag ggc aga ggc aca ggc gga tct act ggg gat gct gat 48
Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp
1 5 10 15
gga cct ggc ggc cct ggc att cca gat ggc cca ggc gga aat gct ggc 96
Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly
20 25 30
gga cca ggc gaa gct ggc gct aca ggc gga aga gga cct aga ggc gct 144
Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala
35 40 45
ggc gcc gct aga gct tct gga cct ggg gga ggc gct cct aga gga cct 192
Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
50 55 60
cat ggc gga gct gcc tct ggc ctg aat ggc tgc tgt aga tgt ggc gcc 240
His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala
65 70 75 80
aga ggc ccc gaa agc cgg ctg ctg gag ttt tac ctg gcc atg ccc ttc 288
Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe
85 90 95
gcc acc ccc atg gaa gct gag ctg gcc aga aga agc ctg gcc cag gac 336
Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp
100 105 110
gct cct cca ctg cct gtg cca ggc gtg ctg ctg aaa gag ttc acc gtg 384
Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
115 120 125
tcc ggc aac atc ctg acc atc cgg ctg aca gcc gcc gac cac aga cag 432
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln
130 135 140
ctg cag ctg agc atc agc agc tgc ctg cag cag ctg tcc ctg ctg atg 480
Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met
145 150 155 160
tgg atc acc cag tgc ttt ctg ccc gtg ttt ctg gcc cag cct cct agc 528
Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser
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<211> 180
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala
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Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
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Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe
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100 105 110
Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
115 120 125
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Gln Arg Arg
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<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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20 25 30
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Ile Ser Ser Phe Ala Asn Ser Ser Trp Thr Arg Thr Asp Gly Leu Ala
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tgg gag aca ctg cag cac atc ttc cgg gtg tac aga agc agc ttc acc 288
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Asn Asn Phe Phe His Val Ala Phe Gln Gly Lys Asp Ile Leu Ser Phe
130 135 140
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ctg gcc atc cag gtg ctg aac cag gac aag tgg acc cgg gaa acc gtg 528
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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<211> 336
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 6
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cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
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gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
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gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
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gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
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ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
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cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
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aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
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atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580
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acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa gaggggactg gaagggctaa 3660
ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 3720
agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 3780
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ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggccttgac 3960
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tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 4080
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tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 4380
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catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 4500
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cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4800
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 4860
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4920
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4980
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 5040
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5100
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5160
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cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5280
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5340
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5400
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5460
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5520
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 5580
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 5640
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5700
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5760
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5820
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5880
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 5940
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 6000
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6060
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6120
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcga cggatcggga 6180
gatcaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 6240
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 6300
atcttatcat gtctggatca actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc 6360
caccccatac cctattacca ctgccaatta cctgtggttt catttactct aaacctgtga 6420
ttcctctgaa ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt 6480
agtagt 6486

Claims (24)

1.一种人来源细胞，其含有编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，NY-ESO-1为人NY-ESO-1。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中，CD1d为人CD1d。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞，其中，诱导型启动子为药剂诱导型启动子。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中，药剂诱导型启动子为四环素系诱导型启动子。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中，四环素系诱导型启动子为TRE3G启动子。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞，其中，人来源细胞为正常细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中，人来源细胞为来源于人胚肾细胞293(HEK293)细胞的细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞，其表达CD1d和NY-ESO-1或其片段。
10.根据权利要求9所述的细胞，其中，NY-ESO-1或其片段的表达量为每106个细胞245ng～45000ng。
11.根据权利要求9或10所述的细胞，其中，在细胞的表面负载有CD1d配体。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中，CD1d配体为α-GalCer。
13.一种药物组合物，其含有权利要求11或12所述的细胞。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于处置癌症。
15.一种处置癌症的方法，其包括将权利要求11或12所述的细胞给药于对象的步骤。
16.根据权利要求11或12所述的细胞，其用于处置癌症。
17.权利要求11或12所述的细胞在制造用于处置癌症的药物组合物中的应用。
18.一种制造用于处置癌症的细胞的方法，其包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养权利要求1～8中任一项所述的细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，还包括在细胞的表面负载α-GalCer的步骤。
20.一种制造用于处置癌症的细胞的方法，其包括：
向人来源细胞中导入编码CD1d的多核苷酸和与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤；或者
向内源性表达CD1d的人来源细胞中导入与诱导型启动子有效连接的编码NY-ESO-1或其片段的多核苷酸的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，还包括通过在诱导型启动子的诱导因子存在下培养所述步骤中得到的细胞而诱导NY-ESO-1或其片段的表达的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，还包括在细胞的表面负载α-GalCer的步骤。
23.一种处置癌症的方法，其包括向对象给药权利要求11或12所述的细胞和免疫检查点抑制剂的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，免疫检查点抑制剂为PD-1系免疫检查点抑制剂或CTLA-4系免疫检查点抑制剂。
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