CN111088282B

CN111088282B - Aavs1和h11安全港位点在重组表达蛋白中的应用

Info

Publication number: CN111088282B
Application number: CN202010205308.5A
Authority: CN
Inventors: 朱颂成; 赵晓梅; 倪华
Original assignee: Shanghai Anmin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Anmin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-03-23
Also published as: CN111088282A

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种AAVS1和H11安全港位点在重组表达蛋白中的应用。所述表达载体为基于人细胞基因组AAVS1和H11安全港位点整合的非病毒表达载体。本发明首次公开了一种采用人AAVS1和H11安全港单位点整合含多个启动子分别驱动同一个基因表达的多顺反子以提高人细胞重组蛋白表达水平的方法。成功构建了分别含3个拷贝和2个拷贝人血白蛋白基因的串联表达盒的重组载体，分别利用人基因组上的AAVS1和H11位点作为整合位点高表达重组人血白蛋白，并且以人肝细胞直接作为表达细胞，得到的人血清白蛋白更加安全，大大降低了其安全性风险。

Description

AAVS1和H11安全港位点在重组表达蛋白中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种AAVS1和H11安全港位点在重组表达蛋白中的应用。

背景技术

利用DNA重组技术生产的治疗性重组蛋白（酶类、细胞因子和抗体等）药品已经成为生物医药最为强劲的生长点，其中治疗性单克隆抗体已经主导了生物医药市场并催生了新的抗体治疗策略（如用抗体治疗原本由抗生素来治疗的感染性疾病）。

重组蛋白药物主要在中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）中表达。在高尔基体内，物种特异的糖基化修饰酶系会给外源重组蛋白带来宿主特异的非人糖基化修饰，人属蛋白在CHO细胞中表达时可发生鼠源糖基化。由非人糖基化修饰引起的有效性和安全性问题成为某些重要和关键药物开发的难题。

目前已知人细胞和其它哺乳动物细胞（包括CHO细胞）糖基化修饰的分子机制差异在于：其一，哺乳动物细胞糖蛋白的N-糖末端含有Galactose-α 1,3-galactose (简写为α-Gal)；人糖基化蛋白的N-多糖末端则没有α-Gal修饰；其二，哺乳动物细胞糖蛋白含有非人唾液酸N-glycolyl-neuraminic acid（简写为Neu5Gc)，人细胞糖蛋白则为人唾液酸N-acetyl-neuraminic acid (简写为Neu5Ac)。人体免疫系统产生针对α-Gal和Neu5Gc的表位多糖的抗体，因此哺乳动物细胞重组生产的人属糖蛋白对人而言具有免疫原性，具有潜在的安全性问题，在药物研发早期必需筛选糖型可被接受的细胞克隆。针对α-Gal和Neu5Gc糖蛋白的抗体具有结合和中和作用，也使得重组糖蛋白的半衰期显著缩短，药物有效性会降低。由于人体细胞缺乏分解Neu5Gc的酶，因此该基团在人体内只能够作为整体被代谢，整合到人细胞自身合成的其它糖蛋白上，从而诱发更为广泛和严重的免疫反应。另外，在小鼠、大鼠和兔等体内都有Neu5Gc存在，因而不会对Neu5Gc糖蛋白产生免疫反应，导致药物临床前的小动物实验研究并不能评估哺乳动物细胞生产的重组糖蛋白所携带的非人唾液酸Neu5Gc在人体内引发何种程度的免疫效应，这也成为药物研发在后期失败的重要原因。

因此，尽管鼠源CHO作为重组蛋白表达平台技术已极为成熟，用人细胞表达重组蛋白药物在有效性和安全性方面比非人细胞具有更巨大的优势。人细胞重组蛋白表达平台能产生与人体天然蛋白相似或相同的构象及其糖基化等翻译后修饰，将极大提高其疗效和消除产品的免疫原性。FDA和EMA批准上市多个基于人细胞表达的产品，如人EPO（红细胞生产素），人凝血因子VIII (FVIII)和人蛋白C (Protein C)等。这些糖蛋白其糖基化修饰所需要的酶在CHO细胞中活性很低甚至缺乏，因此，这些蛋白在CHO等其它非人细胞中表达时并不能获得具有完全功能的分子，必须在人细胞中表达。这也凸显了在人细胞内表达的重组蛋白相对CHO中表达的重组蛋白在功能有效性和安全性方面的优势。

培养人的细胞和哺乳动物细胞在培养成本方面可能差别不大。但是在人细胞中表达药用重组蛋白面临人细胞的无血清培养、人细胞的悬浮培养以及如何提高人细胞表达重组蛋白的产量等诸多挑战。提高CHO细胞生产重组蛋白的水平通常依赖基于四氢叶酸还原酶的MTX筛选策略（Dihydrofolate reductase (DHFR)-based methotrexate (MTX)selection）或基于谷氨酰胺合成酶的MSX筛选(Glutamine Synthetase(GS)-basedmethionine sulfoximine (MSX) selection)策略。这二种筛选方法都基于CHO细胞基因组具有一定的不稳定性，允许基因片段扩增的特性。但是研究证明人细胞基因组中的外源谷氨酰胺合成酶基因在谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX的选择压力下并没有实现基因扩增，而是维持了初始的水平。这表明CHO细胞的高产量筛选策略可能不适用于人细胞。提高人细胞表达重组蛋白的水平需要其它新的策略。

以腺病毒、逆转录病毒或慢病毒基因组为骨架的载体介导外源基因表达，是在人细胞中研究基因功能或表达重组蛋白时的常用方法。从腺病毒、逆转录病毒或慢病毒基因组中剔除病毒复制关键功能蛋白基因，代之以目的基因片段，从而形成病毒复制缺陷型的病毒载体。在工具细胞中人工同时导入病毒复制包装所需所有功能基因和含有目的基因的病毒载体，重组产生病毒包装颗粒。该病毒能够对目的细胞进行感染，从而实现载体上的目的基因片段被导入目的细胞表达，逆转录病毒或慢病毒载体可以实现基因组整合。在此过程完成后由于缺少病毒复制关键基因，病毒不能完成下一轮复制，因而形成了高效且安全的基因转移方法。

腺病毒载体可装载的DNA片段容量比逆转录病毒和慢病毒载体大，但是不能整合到基因组中，细胞内的载体拷贝数随细胞分裂而逐渐减少，因而只能瞬时高表达目的基因。逆转录和慢病毒载体可整合到基因组中从而实现稳定外源基因表达，但是逆转录和慢病毒载体被病毒外壳蛋白包装的效率随装载的外源片段的增大逐渐下降，以至于装载的DNA片段在大小超过4-5kb时即不能高效形成病毒颗粒，限制了病毒载体用于高表达重组蛋白药物的潜能，并且不能用于转录本长的基因的重组表达。因此采用病毒载体表达药用重组蛋白，由于受到病毒包装能力固有属性的限制，利用病毒载体大幅提高重组蛋白的潜力有限。利用病毒载体提高人细胞表达重组蛋白的产量主要可能还是需要通过增加插入基因组中的编码该重组蛋白的基因的拷贝数来实现。

AAVS1是位于人类基因组第19号染色体上的基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列。该位点是一个开放的染色体结构，能保证插入该位点的基因能被正常转录，是一个经过验证、能确保所插入的 DNA 片段表达的“安全港（Safe Habor）”。该位点被广泛用于干细胞分化过程中的基因功能研究，因为在干细胞分化过程中，基因组染色质发生剧烈的改变，容易导致一些染色质转录活性位点的失活，而AAVS1位点则不受此影响。在该位点整合的外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。可以通过同源重组实现整合，利用核酸酶Talen或CRISPR/cas9基因编辑技术提高其整合效率。目前研究表明AAVS1位点可以插入的外源片段显著超越逆转录病毒载体和慢病毒载体包装容量。我们发现在该位点能够轻易整合8kb，甚至是10kb的外源DNA片段。

在鼠科动物基因组中首先鉴定出Hipp11位点，证明其可以接受外源基因实现广泛表达，是一个新的 “安全港”位点。在人的基因组中找到与鼠科动物的Hipp11同源的位点H11，位于人的22号染色体。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1位点之外的一个新的 “安全港”位点， H11位点能够接受多大的外源插入片段尚无系统性的探究。

人血清白蛋白( Human Serum Albumin，HSA) 是人血浆中最主要的可溶性蛋白，约占血清总蛋白的一半。HSA主要的生理功能为增加血容量，维持渗透压，运输及解毒；在氮代谢障碍时，HSA可作为氮源为组织提供营养。由于HSA的低免疫原性和较长的半衰期，通过将HSA与分子量小或者半衰期短的药用蛋白融合后，能够极大提高药用蛋白的半衰期，从而明显提高药品的疗效。医学临床中使用从血浆中提取纯化的HSA以治疗失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水、各种低蛋白血症、新生儿高胆红素血症、心肺分流术和烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征等。药用HSA提取自人体血液，但是由于采浆量供应有限，导致HSA供不应求，价格将持续攀升。另外，采用血源制备HSA还存在着血源存在潜在的疾病或病毒污染、批次间差异大等问题。因此通过基因工程的方法重组生产HSA以取代血浆白蛋白的策略成为产业内的关注焦点和趋势。

通过DNA重组技术在大肠杆菌中表达重组HSA的研究，因为产物构象折叠不正确很早即宣告失败。在从酵母和水稻中生产HSA已经取得进步。在中国，酵母和水稻表达的重组HSA产品已经获得政府药监部门的临床实验批准。在酵母中重组表达HAS，通过高密度发酵，在发酵罐内经96小时的甲醇诱导，产量能够达到 10g/L。但是酵母表达系统中产生的重组HSA产品诱导较强的人体免疫反应。其原因可能在于酵母蛋白质折叠系统与人细胞折叠系统不同，导致重组表达的HSA构象与人体天然HSA有差异，从而被当做外源异物引发免疫反应。也有可能与白蛋白结合了酵母宿主细胞的某些致敏成分而不能被有效去除有关。因此，酵母重组人血白蛋白取代血浆来源的白蛋白用于临床仍处于攻克安全性和有效性的研究过程中。

在水稻中表达HSA可以做到每公斤稻米收获10克。研究表明，水稻来源的HSA比酵母来源的重组白蛋白具有更高的精氨酸和赖氨酸糖基化修饰程度，这种修饰程度和位点可随不同的制造商和批次不同而不同。正常人的血浆来源的HSA并无糖基化修饰。糖尿病患者的血浆HSA发生糖基化并随糖尿病程度加重，其糖基化可由20%升至90%。因此，糖基化白蛋白成为糖尿病的表征指标。水稻重组HSA存在的植物特异的糖基化不仅与引起疾病的原因相关联，还有可能干扰HSA的结合和运输功能，并可能诱发强烈的免疫反应。研究表明来源于植物的蛋白质的木糖修饰，是目前已知的最强的免疫反应诱导剂。水稻重组HSA的糖基化修饰无法通过提高纯度予以去除。白蛋白临床使用剂量为每支10g，该注射剂量是抗体等其它重组蛋白药物剂量的1000倍左右，因此在白蛋白的注射剂量水平，水稻来源的含有植物特异糖基化修饰的重组人血白蛋白的临床试验，在有效性和安全性风险方面都存在较高的风险。

肝脏是人体内源和外源分子的代谢中心，具有非常重要而强大的功能。这些功能依赖于肝细胞能合成或分泌多种重要功能蛋白质和酶类。人血白蛋白能够被肝细胞持久而且高效的合成，健康的成年人肝脏每天能合成12-25克人血白蛋白。人肝细胞是人体200多种细胞中唯一可以高效持续地合成人血白蛋白的细胞。因此，肝细胞是合适的用于高表达重组蛋白的细胞，特别是高表达重组人血白蛋白。而人血白蛋白启动子是人肝细胞特异的、活性最强的启动子之一，可以用于启动其它外源基因在人肝细胞中重组表达。

发明内容

本发明的主要目的在于构建一个能够提高人血白蛋白表达的载体和表达细胞体系。

本发明的设计思路如下：

考虑到肝脏是人体内源和外源分子的代谢中心，由肝细胞产生的蛋白组成了现今治疗性血浆蛋白的绝大部分，包括血浆白蛋白、纤维蛋白原（凝血因子I）、凝血酶（凝血因子II）、凝血因子FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII和转铁蛋白等。目前在HEK293中表达并被批准的蛋白药物在人体内实际上都是由肝脏细胞产生的，因此肝脏细胞是合适的人细胞蛋白表达体系。

为了提高在人细胞表达重组蛋白药物时的产量，本发明构建了区别于病毒载体的，基于人细胞基因组AAVS1和H11安全港位点整合的非病毒表达载体。为了提高重组蛋白的表达水平并利用安全港位点具有允许插入大片段的特点，在载体中采用了多个不同的启动子驱动目的基因串联形成多顺反子表达盒。载体中目的基因拷贝数为2个或3个。载体既包含人肝细胞特异的人血白蛋白基因启动子Palb，又包含在各种人细胞中均具有强活性的启动子，包括人类巨细胞病毒来源的强CMV（Pcmv）、人类泛素基因C启动子（Pubc）和人延长因子1α的启动子(Pef1α)。本发明选取治疗性血浆蛋白中最典型的白蛋白为目的蛋白，验证该策略。

用于整合到AAVS1位点的载体含有由以下元件组成的表达盒，并有三个拷贝的白蛋白基因：人血白蛋白启动子-人血白蛋白基因-polyA-人延长因子1α的启动子-人血白蛋白基因-人类泛素基因C启动子-人血白蛋白基因-wpre元件（Palb-hALB-polyA-Pef1α-hALB-Pubc-hALB-wpre）。用于整合到H11位点的载体含有由以下元件组成的表达盒并含有二个拷贝的白蛋白基因：CMV启动子-人血白蛋白基因-人血白蛋白启动子-人血白蛋白基因-wpre元件（Pcmv-hALB-Palb-hALB-wpre）。以上串联的表达盒DNA片段分别被置于含有AAVS1位点同源臂的载体和含H11位点同源臂载体上的同源臂之间。含单拷贝表达盒的载体为为Palb-hALB-polyA。采用电穿孔方法和Talen或CRISPR/cas9介导的同源重组定点整合到人肝细胞基因组AAVS1位点和H11位点，含AAVS1载体细胞采用G418筛选，含 H11载体细胞采用Puromycin（嘌呤霉素）筛选，最终得到稳定整合的细胞株。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种表达载体，所述表达载体为基于人细胞基因组AAVS1和H11安全港位点整合的非病毒表达载体。

优选的，所述表达载体包括基因表达盒A或基因表达盒B；

所述基因表达盒A包括依次连接的人血白蛋白启动子（Palb）、目的基因、polyA、人延长因子1α启动子（Pef1α）、目的基因、人泛素基因启动子（Pubc）、目的基因和wrpe元件；该表达盒串联有3个启动子驱动3个拷贝人血白蛋白基因表达（此处“该表达盒”指基因表达盒A）；

所述基因表达盒B包括依次连接的CMV启动子、目的基因、人血白蛋白启动子、目的基因和wrpe元件；该表达盒串联有2个启动子驱动2个拷贝的人血白蛋白基因表达（此处“该表达盒”指基因表达盒B）。

更优选的，所述目的基因为人血清白蛋白基因。

在本发明的一些具体实施例中，所述基因表达盒A为Palb-hALB-polyA-Pef1α-hALB-Pubc-hALB-wpre(3X)；所述基因表达盒B为Pcmv-hALB-Palb-hALB-wpre（2X）。

本发明第二个方面公开了一种构建上述的表达载体的方法，包括：将基因表达盒克隆到含有AAVS1位点同源臂或H11位点同源臂的载体中。

优选的，将基因表达盒A克隆到含有AAVS1位点同源臂的载体中或将基因表达盒B克隆到含有H11位点同源臂的载体中；

所述基因表达盒A包括依次连接的人血白蛋白启动子、目的基因、polyA、人延长因子1α启动子、目的基因、人泛素基因启动子、目的基因和wrpe元件；

所述基因表达盒B包括依次连接的CMV启动子、目的基因、人血白蛋白启动子、目的基因和wrpe元件。

在本发明的一些优选实施例中，人血白蛋白启动子（Palb）的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。人血清白蛋白（hALB）的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示。人泛素基因启动子（Pubc）的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，人CMV启动子（Pcmv）的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。人延长因子1α启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。wpre元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。polyA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明第三个方面公开了一种表达细胞，所述表达细胞包含上述的表达载体。

优选的，所述表达细胞为人肝细胞。在本发明的一些具体实施例中，所述表达细胞为HepG2/C3A细胞。

优选的，采用电穿孔和Talen或CRISPR/cas9介导的同源重组方法得到表达细胞。

本发明第四个方面公开了一种构建上述的表达细胞的方法，包括以下步骤：

S1：构建表达载体；

S2：将表达载体和TALEN核酸酶表达载体共同电穿孔转染人肝细胞；

S3：将转染后的人肝细胞进行筛选，得到稳定的能表达人血清白蛋白的表达细胞。

应当理解，上述步骤并不局限于步骤S1、S2和S3，在S1之前、S1和S2之间、S2和S3之间、在S3之后，还可以包括其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，含AAVS1载体细胞采用G418筛选，含 H11载体细胞采用Puromycin筛选。

本发明第五个方面公开了一种生产人血清白蛋白的方法，通过培养上述的表达细胞得到。

优选的，该方法还包括人血清白蛋白的回收步骤。

得到的人血清白蛋白安全性好，可用于制备蛋白类药物。

本发明第六个方面公开了如下应用：

a）上述的表达载体在制备能表达人血清白蛋白的细胞或生产人血清白蛋白中的应用；

b）上述的表达细胞在生产人血清白蛋白中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明的创新性在于提供了一种在人细胞中提高表达重组蛋白水平的策略，包括采用定点的非病毒载体以及载体中含多启动子驱动同一种基因表达的特征，具体的：1、载体含有人细胞类型特异的人源启动子（ALB基因启动子）和人细胞普适的强表达启动子组合（CMV启动子，Ubc基因启动子，CAG启动子），2、载体中含有多个启动子驱动人血白蛋白基因的串联表达盒，3、利用人基因组上的AAVS1和H11位点作为整合位点高表达重组人血白蛋白，4、利用人肝细胞作为表达细胞载体。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明首次公开了一种采用人AAVS1和H11安全港单位点整合多顺反子以提高人细胞重组蛋白表达水平的方法，成功构建了二种串联表达盒，分别利用人基因组上的AAVS1和H11位点作为整合位点高表达重组人血白蛋白，并且以人肝细胞直接作为表达细胞，得到的人血清白蛋白更加安全，大大降低了其安全性风险。

附图说明

图1为本发明中AAVS1位点整合载体A3X中人血白蛋白基因及启动子的排列；

图2为本发明中H11位点整合载体H2X中人血白蛋白基因及启动子的排列；

图3为本发明中AAVS1位点整合载体A1X中元件构成的排列；

图4为本发明中细胞基因组中检测A3X插入实例；

图5为本发明中细胞基因组中检测H2X插入实例；

图6为本发明中含A1X、H2X和A3X的HepG2/C3A细胞表达的白蛋白检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例构建含三个拷贝的白蛋白基因的AAVS1位点整合载体Palb-hALB-polyA-Pef1α-hALB-Pubc-hALB-wpre（排列如图1所示），命名为A3X，包括以下步骤：

1、首先构建3个载体，以PGK-H2BmCherry（Addgene Plasmid #21217）为骨架含有表达盒Palb-hALB-polyA和Pef1α-hALB的载体，以FUGW（Addgene Plasmid #14883）为骨架含有表达盒Pubc-hALB-wpre的载体。

2、以上述3个载体质粒为模板，采用PCR扩增相应片段，利用多片段重组拼接，将Palb-hALB-polyA， Pef1α-hALB和Pubc-hALB-wpre三个片段拼接，拼接总片段长度为9172bp。连接到AAVS1整合载体上的左同源臂和右同源臂之间，获得重组载体A3X。

实施例2

本实施例构建含二个拷贝的白蛋白基因的H11位点整合载体Pcmv-hALB-Palb-hALB-wpre（排列如图2所示），命名为H2X，包括以下步骤：

1、首先构建2个载体，以PGK-H2BmCherry（Addgene Plasmid #21217）为骨架，分别含有表达盒Pcmv-hALB和Palb-hALB-wpre的载体。

2、以上述2个载体质粒为模板，采用PCR扩增相应片段，利用多片段重组拼接，拼接总片段长度为5346bp。将Pcmv-hALB和Palb-hALB-wpre连接到含有H11定点整合同源臂的载体上的左同源臂和右同源臂之间，获得重组载体H2X。

另外，构建一个含单拷贝白蛋白基因的AAVS1位点整合载体用于与A3X和H2X进行表达水平比较。排列如图3所示。

实施例3

本实施例重组载体和AAVS1或H11位点特异的TALEN核酸酶表达载体共同电穿孔转染HepG2/C3A细胞，具体步骤如下：

1、C3A在含10%FBS的DMEM/F12的培养皿中培养至80%融合度。

2、对AAVS1位点整合：在1.5ml无菌管加入1μg A3X 质粒，1μg AAVS1 sgRNA/Cas9质粒（SH000，广州易锦生物技术有限公司，广州，中国）。对H11位点整合：在1.5ml无菌管加入1μg H2X质粒，0.5μgTalen1（Addgene plasmid#51555，USA），0.5μgTalen2 （Addgeneplasmid#51554, USA）。质粒总体系不超过2μl。

为每个DNA体系配制电穿孔缓冲液：在1.5ml无菌管中配制20μl电穿孔缓冲液（V4XC-2032，Lonza，Basel，Switzerland），按说明书操作。

3、取出C3A细胞，用胰酶按常规细胞分盘处理，制成单细胞悬液，对细胞悬液进行计数。按每个电击转化需要4×10⁵个细胞计算，取相应体积的细胞悬液离心后去除大部分上清，并用移液器去除残留的微量培养液上清。用步骤2中配制的电穿孔缓冲液重悬细胞，将重悬的细胞（20μl）转移至装有DNA的无菌管中，再转移至电穿孔电击杯中。

4、放入电转仪中，选定HepG2细胞电转程序，进行电穿孔。

5、取出细胞，将电穿孔过的细胞悬液加入2ml含10%FBS的DMEM/F12培养基中。放入培养箱培养，48小时后更换新鲜培养液。

6、72小时后加药进行筛选。转A3X的细胞用800μg/ml 的G418筛选，转H2X的细胞用0.5μg/ml的细胞Puromycin筛选。隔天换新鲜培养基。G418筛选14天后不再加药筛选，Puromycin筛选6天后不再加药，用正常培养液培养。

实施例4

本实施例公开了稳定细胞株C3A基因组中插入片段的检测方法，如下：

通过实施例3中经G418筛选获得的稳定细胞株的基因组DNA，在人细胞第19号染色体上AAVS1位点处存在按Palb-hALB-polyA-Pef1α-hALB-Pubc-hALB-wpre顺序排列的DNA插入片段。以G418筛选后得到的稳定细胞株的基因组DNA为模板，以位于19号染色体上AAVS1位点的引物，配对位于插入片段Palb-hALB-polyA-Pef1α-hALB-Pubc-hALB-wpre上位于白蛋白基因以外的区域的引物（因为插入片段中有多个白蛋白基因，以白蛋白基因上的序列为引物进行PCR扩增时，引物有多个位点可以结合，导致PCR结果无法预知），通过DNA聚合酶链式反应（PCR）可以从稳定细胞株的基因组中扩增出预期的片段，该片段的序列可以通过DNA测序予以验证。在没有插入片段的细胞基因组中，AAVS1位点位于人的第19号染色体上，人血白蛋白基因及其启动子位于人4号染色体上，EF1α启动子位于6号染色体，Ubc启动子位于12号染色体上，它们不在同一条染色体上，因此在没有插入片段的细胞基因组中采用上述引物没有办法扩增得到大小符合预期，含上述序列组成的PCR扩增产物。

同理，通过实施例3中经Puromycin筛选获得的稳定细胞株的基因组DNA，在人细胞第22号染色体上H11位点处存在按Pcmv-hALB-Palb-hALB-wpre顺序排列的外源DNA插入片段。以Puromycin筛选后得到的稳定细胞株的基因组DNA为模板，以位于22号染色体上H11位点上的引物，配对位于插入片段Pcmv-hALB-Palb-hALB-wpre上除白蛋白基因以外的区域的引物，通过DNA聚合酶链式反应（PCR），可以从稳定细胞株的基因组中扩增出预期的片段，该片段DNA序列可以通过DNA测序予以确认。没有插入片段的细胞基因组中，人细胞中H11位点位于第22号染色体上，人血白蛋白基因及其启动子位于人4号染色体上，二者不在同一条染色体上，并且细胞中不存在CMV序列。因此在没有插入片段的细胞基因组中采用上述引物没有办法得到大小符合预期且含上述序列组成的PCR扩增产物。

具体验证操作实例：

1、收集1×10⁶个细胞，按常规细胞基因组提取方法提取细胞的基因组DNA。

2、以引物A3XF-ubc（位于启动子Pubc序列的中部）和引物Chr19R-aav1（位于19号染色体AAVS1上插入位置的下游）为配对引物，对筛选获得的细胞基因组A3X进行扩增，获得3kb产物，其中包含部分Pubc序列、一个完整的白蛋白基因序列、wpre序列和染色体上AAVS1序列。具体的，将获得的产物跑0.8%琼脂糖DNA凝胶电泳，采用溴化乙锭染色，在紫外线365nm照射的条件下，通过成像仪拍摄，实验结果如图4所示。

3、以引物CHR22FH11（位于22号染色体H11位点，插入位点上游）和引物H2XR-wpre（位于插入的表达盒的末端wpre元件上）为配对引物，对筛选获得的细胞基因组H2X进行扩增，获得约5kb产物，包含了完整的插入序列。具体的，将获得的产物跑0.8%琼脂糖DNA凝胶电泳，采用溴化乙锭染色，在紫外线365nm照射的条件下，通过成像仪拍摄，实验结果如图5所示。

引物信息如下表1所示：

表1

实施例5

本实施例公开了HepG2/C3A细胞含A1X、H2X和A3X插入表达盒片段表达的白蛋白检测及不同拷贝数与白蛋白表达量的关系。

1、1.3×10⁶个A1X、H2X、A3X细胞用10ml 含10%FBS DMEM/F12 培养基铺种于6cm细胞培养皿中，37℃，5%CO₂培养箱培养24hr。

2、去除细胞培养基，用2ml PBS溶液洗三次以充分去除血清。加入4毫升不含血清的DMEM/F12培养基培养24小时。

3、取培养基20μl样品，加5X蛋白上样缓冲液，加热变性3分钟后经蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳，并进行蛋白质考马斯亮蓝染色，结果如图6所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海安民生物技术有限公司

<120> AAVS1和H11安全港位点在重组表达蛋白中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atagtaaaaa agacacagaa gccctaaaat atgtatgtat gtatatgtgt gtgtgcatgc 60

gtgagtactt gtgtgtaaat ttttcattat ctataggtaa aagcacactt ggaattagca 120

atagatgcaa tttgggactt aactctttca gtatgtctta tttctaagca aagtatttag 180

tttggttagt aattactaaa cactgagaac taaattgcaa acaccaagaa ctaaaatgtt 240

caagtgggaa attacagtta aataccatgg taatgaataa aaggtacaaa tcgtttaaac 300

tcttatgtaa aatttgataa gatgttttac acaactttaa tacattgaca aggtcttgtg 360

gagaaaacag ttccagatgg taaatataca caagggattt agtcaaacaa ttttttggca 420

agaatattat gaattttgta atcggttggc agccaatgaa atacaaagat gagtctagtt 480

aataatctac aattattggt taaagaagta tattagtgct aatttccctc cgtttgtcct 540

agcttttctc ttctgtcaac cccacacgcc tttggcaca 579

<210> 2

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa 1830

<210> 3

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu

<210> 4

<211> 1211

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60

ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120

cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180

gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240

aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300

gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360

cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct 420

ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc 480

caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg 540

cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga 600

ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt 660

cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct 720

gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt 780

tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc 840

gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg 900

cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat 960

cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg 1020

gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg 1080

ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca 1140

atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct 1200

tttttgttag a 1211

<210> 5

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480

acggtgggag gtctatataa gcagagct 508

<210> 6

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60

ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120

gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180

tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc 240

ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt 300

acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg 360

cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc 420

gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca 480

tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg 540

cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc 600

gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg 660

gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta 720

tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat 780

ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc 840

gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat 900

gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga 960

gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt 1020

gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc 1080

tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc 1140

ttccatttca ggtgtcgtga g 1161

<210> 7

<211> 1738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtctcg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 240

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 420

tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 480

gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg 540

aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc 600

gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc 660

ggcgggcggg gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc 720

gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg 780

cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg 840

gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg 900

gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg 960

ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag 1020

cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt 1080

gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc 1140

ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg 1200

tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc 1260

gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg 1320

gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg 1380

cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg 1440

ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat 1500

gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg 1560

gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt 1620

ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt 1680

cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaa 1738

<210> 8

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

tatcatgtct ggat 134

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga g 31

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cactgagaac cgggcaggtc acgcatc 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaggtcagt ttaatcttgg aaattac 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggggaggc ggcccaaagg gagatcc 27

Claims

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为基于人细胞基因组AAVS1或H11安全港位点整合的非病毒表达载体；

所述表达载体包括基因表达盒A或基因表达盒B；

所述基因表达盒A包括依次连接的人血清白蛋白启动子、目的基因、polyA、人延长因子1α启动子、目的基因、人泛素基因启动子、目的基因和wrpe元件；所述目的基因为人血清白蛋白基因，该表达盒串联有3个启动子驱动3个拷贝人血清白蛋白基因表达；

所述基因表达盒B包括依次连接的CMV启动子、目的基因、人血清白蛋白启动子、目的基因和wrpe元件；所述目的基因为人血清白蛋白基因，该表达盒串联有2个启动子驱动2个拷贝的人血清白蛋白基因表达。

2.一种构建权利要求1所述的表达载体的方法，其特征在于，包括：将基因表达盒克隆到含有AAVS1位点同源臂或H11位点同源臂的载体中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将基因表达盒A克隆到含有AAVS1位点同源臂的载体中或将基因表达盒B克隆到含有H11位点同源臂的载体中；

所述基因表达盒A包括依次连接的人血清白蛋白启动子、目的基因、polyA、人延长因子1α启动子、目的基因、人泛素基因启动子、目的基因和wrpe元件；

所述基因表达盒B包括依次连接的CMV启动子、目的基因、人血清白蛋白启动子、目的基因和wrpe元件。

4.一种表达细胞，其特征在于，所述表达细胞包含权利要求1所述的表达载体，所述表达细胞为动物细胞。

5.根据权利要求4所述的表达细胞，其特征在于，所述表达细胞为人肝细胞。

6.根据权利要求4所述的表达细胞，其特征在于，采用电穿孔和Talen介导的同源重组方法或采用电穿孔和CRISPR/cas9介导的同源重组方法得到表达细胞。

7.一种构建权利要求4-6所述的表达细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：构建表达载体；

S2：将表达载体和核酸酶表达载体共同电穿孔转染表达细胞；

S3：将转染后的表达细胞进行筛选，得到稳定的能表达人血清白蛋白的表达细胞。

8.一种生产人血清白蛋白的方法，其特征在于，通过培养权利要求4-6所述的表达细胞得到。

9.如下应用：

a）权利要求1所述的表达载体在制备能表达人血清白蛋白的细胞或生产人血清白蛋白中的应用；

b）权利要求4-6所述的表达细胞在生产人血清白蛋白中的应用。