KR20230169989A - 단백질 발현을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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바바라 머틴스
토마스 폴리아드
임레 메거
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익셉젠 인크.
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Abstract

본 개시내용은 대상체에서 인핸서 단백질의 동시 발현을 통한, 표적 단백질의 개선된 발현을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 표적 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질의 벡터 시스템을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 작동가능하게 연결되고, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L: leader) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus) ICP27 단백질 및 랍도바이러스 매트릭스(M: matrix) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.

Description

단백질 발현을 위한 시스템 및 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 3월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 제63/160,672호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
서열목록의 참조에 의한 통합
이와 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전체적으로 본원에 참조로서 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형식 카피 (파일명: EXCI_002WO_SeqList_ST25, 파일 크기 405 킬로바이트).
배양에서 성장한 진핵 세포에서 단백질의 재조합 발현은 과학 연구 및 의학에 응용된다. 재조합적으로 생산된 단백질(예를 들어, 항체, 효소, G-단백질 결합 수용체(GPCR: G-protein coupled receptor), 분비 단백질, 이온 채널, 바이러스 단백질 및 성장 인자)은 제약 산업에서 신약 개발(예를 들어, 소분자 발견)을 위해, 치료제(예를 들어, 항체 및 기타 생물학적 약물)로서 및 분석 방법의 중요한 자산으로 사용된다. 제약 산업에서의 용도 외에도, 재조합적으로 생산된 포유류 단백질은 식품 산업(예를 들어, 소위 청정 육류 생산)에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 많은 재조합 단백질의 경우 기능적 형태로 재조합 단백질의 발현을 달성하는 것은 여전히 어려운 일이다.
효모, 식물, 동물 및 인간과 같은 살아있는 유기체에서의 이식유전자 발현은 과학 연구 및 의학에 응용된다. 현대 치료제 분야는 효소나 항체와 같은 생물학적 제제의 생산에 초점을 맞추고 있다. 현재, 이 분야의 많은 치료제는 표적 대상체의 외부에서 생산되어 나중에 주입된다. 이 과정에는 올바른 발현 시스템을 찾고 의약품을 안정적이고 높은 수율로 생산하는 것과 같은 자체적인 과제가 있다. 새로운 치료제의 또 다른 신흥 분야는 폴리뉴클레오타이드를 투여하고 신체 자체 세포를 사용하여 최종 의약품을 생산함으로써 생체 시스템 내에서 유전자를 발현하는 것이다. 체내에서 생물학적 제제를 생산하는 데 따른 장점은 예를 들어, 고유한 번역 후 수정을 포함하여 많은 장점을 갖는다. 또한, 폴리뉴클레오타이드를 치료제로 사용함으로써 생물학적 제제의 생산 및 정제에 있어 많은 단점이 제거되어 저렴하고 확장 가능하며 안전하고 안정적인 의약품을 남길 수 있다. 이러한 형태의 약물 전달은 1990년대 초부터 연구되어 왔지만 치료적 성공은 거의 없었다. 살아있는 동물이나 인간 내에서의 이러한 약물의 생산 실패에 대한 많은 가설이 있지만 아직 해결책은 없다.
동물 또는 인간의 생체 내에서 재조합 단백질 및 생물학적 제제의 생산에 유용한 조성물 및 방법에 대한 미충족 요구가 여전히 존재한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절하는 6가지 예시적인 방식을 도시한다.
도 2a 내지 도 2x는 비제한적인 예시적인 작제물의 개략도이다: EG1, 도 2a; EG2, 도 2b; EG3 및 EG4, 도 2c; EG5, 도 2d; EG6, 도 2e; EG7, 도 2f; EG8, 도 2g; EG9, 도 2h; EG10 및 EG11, 도 2i; EG12 및 EG4, 도 2j; EG10, 도 2k; EG13, 도 2l; EG14, 도 2m; EG15, 도 2n; EG16, 도 2o; EG17, 도 2p; EG18, 도 2q; EG19, 도 2r; EG20, 도 2s; EG21, 도 2t; EG22, 도 2u; EG23, 도 2v; EG24, 도 2w; 및 EG25, 도 2x.
도 3a 내지 도 3d는 대조군 벡터 EG1과 비교하여 작제물 EG2(CMV-GFP-IRES-L)를 사용하여 발현된 GFP의 광학 및 형광 현미경 사진을 보여준다. 도 3a: EG1을 포함하는 세포의 광학 현미경 사진. 도 3b: EG1을 포함하는 세포의 형광 현미경 사진. 도 3c: EG2를 포함하는 세포의 광학 현미경 사진. 도 3d: EG2를 포함하는 세포의 형광 현미경 사진. EG2 작제물로부터 형광 GFP 단백질의 발현은 시스템의 생존 가능성을 나타낸다. EG1을 포함하는 세포(도 3b)와 비교하여 EG2를 포함하는 세포(도 3d)에서 유해한 과발현의 감소는 L-단백질의 도입에 의한 GFP 발현의 개선된 조절을 나타낸다. 도 3a 내지 도 3d에서 막대는 400 미크론을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 대조군 벡터 EG1과 비교하여 작제물 EG3 및 EG4(각각 T7-IRES-L-GFP 및 CMV-T7)를 사용하여 발현된 GFP의 광학 및 형광 현미경 사진을 보여준다. 도 4a: EG1을 포함하는 세포의 광학 현미경 사진. 도 4b: EG1을 포함하는 세포의 형광 현미경 사진. 도 4c: EG3+EG4를 포함하는 세포의 광학 현미경 사진. 도 4d: EG3+EG4를 포함하는 세포의 형광 현미경 사진. EG3+EG4 작제물로부터 형광 GFP 단백질의 발현은 시스템의 생존 가능성을 보여준다. EG1을 포함하는 세포(도 4b)와 비교하여 EG3+EG4를 포함하는 세포(도 4d)에서 발현의 감소는 L-단백질의 도입에 의한 GFP 발현의 개선된 조절을 보여준다. 도 4a 내지 도 4d에서 막대는 400미크론을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 작제물 EG10(CMV-[DRD1-GFP])(도 5a) 또는 EG8(CMV-[DRD1-GFP]-IRES-L)(도 5c)로부터의 DRD1-GFP 융합체의 형광 현미경을 보여준다. 작제물 EG10을 사용하는 DRD1-GFP는 발현되지만 수용체를 외막으로 수송하지 못하여 봉입체를 형성하게 된다(도 5b, 화살표). 작제물 EG8을 사용하는 DRD1-GFP는 발현되고 막 내로 안정적으로 수송되어 고품질의 외막에서 GPCR이 높은 수율로 생성된다(도 5d).
도 6a 및 도 6b는 작제물 EG10(CMV-[DRD1-GFP])(도 6a) 또는 EG12 및 EG4(각각 T7-IRES-L-DRD1-GFP 및 CMV-T7)(도 6b)로부터의 DRD1-GFP 융합체의 형광 현미경을 보여준다. EG10을 사용하는 DRD1-GFP는 발현되지만 수용체를 외막으로 수송하지 못하여 봉입체를 형성하게 된다(도 6a, 화살표). EG4와 조합된 EG12를 사용하는 DRD1-GFP는 발현되고 막 내로 안정적으로 수송되어 고품질의 외막에서 GPCR이 높은 수율로 생성된다(도 6b).
도 7은 항-CFTR 웨스턴 블롯을 보여준다. PCR 생성물 또는 벡터(점선 좌측)로서 전달된 L-단백질과 CFTR의 동시 발현은 수율을 감소시키지만 L-단백질의 동시 발현이 없는 CFTR의 대조군 발현과 비교하여 샘플이 더 균질하다(점선 우측).
도 8a 및 도 8b는 ITK의 His-tag 정제 결과를 보여준다. 도 8a는 His 태그를 사용하여 정제된 ITK 친화성의 SDS-PAGE를 보여준다. 레인: 레인 1, SeeBlue2 + 사전 염색; 레인 2, 500 ng GFP; 레인 3, 2 μg ITK; 레인 4, 5 μg ITK; 레인 5, 10 μg ITK. 도 8b는 도 8a의 SDS-PAGE 후 웨스턴 블롯 분석을 보여주는데, 화살표는 ITK의 단량체 및 이량체를 가리킨다.
도 9a는 CMV 프로모터 하의 루시퍼라제 유전자 작제물의 개략도를 보여준다. 도 9b는 도 9a에 도시된 작제물을 갖는 플라스미드의 맵(map)을 보여준다. 도 9c는 공유 CMV 프로모터 하에서 IRES 서열에 의해 연결된 루시퍼라제 리포터 유전자 및 EMCV L1 단백질의 개략도를 보여준다. 도 9d는 도 9c에 도시된 작제물을 갖는 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 10은 생물발광 판독에 의해 측정된 루시퍼라제 발현을 보여준다. 도 9b에서 플라스미드의 사용은 처음에는 더 높은 루시퍼라제 발현을 나타내지만, 18일 이후에는 발현이 감소한다. 본원에 개시된 플라스미드(도 9d)의 사용은 장기간에 걸쳐 리포터 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 한다.
도 11은 시간에 따른 생물발광 이미지를 보여준다. 주: 실험 중 시험군에서 동물 4의 주사가 수행되지 않았으므로 이 동물은 데이터 분석에서 제외되었다. 도 9b에서 플라스미드의 사용은 18일 이후에는 2마리의 개별 동물(동물 1 및 2)에서 발현의 손실을 포함하여 루시퍼라제를 매우 가변적으로 발현하게 된다. 본원에 개시된 플라스미드(도 9d)의 사용은 동물 간 변동성이 낮으면서 장기간에 걸쳐 리포터 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 한다.
도 12는 루시퍼라제만을 발현하는 대표적인 마우스 및 인핸서 단백질의 존재 하에 루시퍼라제를 발현하는 대표적인 마우스에 대한 시간 경과에 따른 생물발광 이미지를 보여준다. 본원에 개시된 플라스미드(도 9d)의 사용은 장기간에 걸쳐 리포터 유전자의 안정적인 발현을 가능하게 한다.
도 13a는 CMV 프로모터 하에 아달리무맙 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 플라스미드의 맵을 보여준다. 도 13b는 아달리무맙 항체를 인코딩하는 핵산 서열 및 공유된 CMV 프로모터 하에 IRES를 인코딩하는 핵산 서열에 의해 연결된 EMCV L1 단백질을 인코딩하는 유전자를 갖는 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 14a는 EG140 대조군 플라스미드로부터 아달리무맙을 발현하는 HEK293T 세포의 광학 현미경 사진으로부터의 이미지(상단) 및 면역형광 실험으로부터의 이미지(하단)를 보여준다. 도 14b는 EG141 플라스미드로부터 L1 인핸서 단백질과 조합하여 아달리무맙을 발현하는 HEK293T 세포의 광학 현미경(상단)으로부터의 이미지 및 면역형광 실험으로부터의 이미지를 보여준다.
도 15는 EG140 또는 EG141로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포의 상청액에서 아달리무맙의 존재를 검출하기 위해 수행된 ELISA 실험으로부터의 결과를 보여준다. 정제된 재조합 인간 항-TNFa 항체(NBP2-62567 Novus Biologicals)를 이 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다.
도 16은 EG140 또는 EG141로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 의해 분비된 아달리무맙에 대한 인간 TNF-알파의 결합을 검출하기 위해 수행된 ELISA 실험으로부터의 결과를 보여준다.
도 17은 루시퍼라제 리포터 검정으로부터의 결과를 보여준다. EG140 또는 EG141로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포의 상층액에 있는 아달리무맙은 리포터 세포에서 루시퍼라제 발현의 TNF-알파 매개 활성화를 억제할 수 있다.
도 18a는 SDS PAGE로부터의 결과를 보여주며 도 18b는 EG140-형질감염된 세포 또는 EG-141 형질감염된 세포로부터 발현된 아달리무맙의 중쇄 및 경쇄를 도시하는 웨스턴 블롯 실험으로부터의 결과를 보여준다.
도 19는 반딧불이 루시퍼라제 단독(Fluc Std) 및 L 인핸서 단백질과 조합된 Fluc(Fluc EG)을 발현하는 플라스미드의 30 μg 피하 주사 후 생물발광 영상화의 로그 정량화를 보여준다.
도 20은 pAAVtransfer_Adalimumab(Std) 플라스미드 및 인핸서 단백질 플라스미드 pAAVtransfer_Adalimumab + L의 개략적 설계를 보여주며, 이는 5' 및 3' 역 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat) 영역에 대한 아달리무맙 발현 카세트 및 인핸서 단백질 L의 위치를 나타낸다.
도 21은 pAAVtransfer_Adalimumab(Std) 플라스미드의 맵을 보여준다. 아달리무맙 발현 카세트는 AAV 전달 벡터의 5' 및 3' 역 말단 반복(ITR) 영역 사이에 위치된다.
도 22는 인핸서 단백질(EMCVgp1) pAAVtransfer_Adalimumab(EG) 플라스미드의 맵을 보여준다. 아달리무맙 발현 카세트는 AAV 전달 벡터의 5' 및 3' 역 말단 반복(ITR) 영역 사이에 위치된다.
도 23은 pAdalimumab, pAdalimumab + 인핸서 L, pAAVtransfer 아달리무맙 및 pAAVtransfer 아달리무맙 + 인핸서 L 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포의 세포 배양 상층액 중 아달리무맙의 단백질 농도(ng/ml)를 보여준다. 세포 배양 상층액 중 아달리무맙 단백질 농도는 정량적 ELISA를 사용하여 측정되었다.
도 24는 HEK 이중 TNF-알파 리포터 세포 검정으로 측정된 분비된 아달리무맙 단백질 EC50 값을 보여준다. 상단, pAdalimumab_STD 플라스미드 및 인핸서 단백질 pAdalimumab_EG 플라스미드로 형질감염된 세포에서의 아달리무맙 EC50. 하단, pAAVtransfer Adalimumab_STD 및 인핸서 L 단백질 pAAVtransfer Adalimumab_EG 플라스미드로 형질감염된 세포에서의 아달리무맙 EC50. 표 4 및 표 5에는 이러한 결과가 요약되어 있다.
도 25는 분비된 아달리무맙 농도의 양과 인핸서 단백질 L이 결여된 각각의 대조군 벡터의 활성으로 정규화된 상대적인 아달리무맙 활성을 보여준다.
도 26a 및 도 26b는 아달리무맙 단독, AAV_Adalimumab_STD를 인코딩하는 재조합 AAV 벡터 및 인핸서 단백질 L, AAV_Adalimumab_EG로 마우스를 처리한 후 마우스 혈청 중 아달리무맙의 농도를 보여준다. 도 26a는 근육내 주사를 통해 투여된 AAV 벡터의 결과를 보여준다. 도 26b는 피하 주사를 통해 투여된 AAV 벡터의 결과를 보여준다.
도 27은 pGBA-NanoLuc_STD 및 인핸서 단백질 pGBA-NanoLuc_EG 플라스미드의 개략적 설계를 보여준다.
도 28a 및 도 28b는 각각 pGBA-NanoLuc_STD 플라스미드 및 인핸서 단백질(EMCVgp1) pGBA-NanoLuc_EG 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 29는 HEK 293T 세포에서 발현된 pGBA-NanoLuc_STD 및 pGBA-NanoLuc_EG 작제물의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. pGBA-NanoLuc 단백질 키메라의 예상 크기는 대략 75 kDa이다.
도 30a 내지 도 30d는 pGBA-NanoLuc_STD 플라스미드 및 인핸서 단백질 pGBA-NanoLuc_EG 플라스미드로 형질감염 시 HEK293T 세포 용해물(각각 도 30a 및 도 30c) 및 상청액(각각 도 30b 및 도 30d)에서 리포터 단백질의 발현 및 GBA의 효소 활성을 보여준다. NanoLuc와 GBA 활성 둘 다의 총 발현은 인핸서 단백질 L의 부재 시 더 높다.
도 31은 NanoLuc 활성에 대해 정규화된 GBA-NanoLuc 키메라 단백질에서의 상대적인 GBA 활성을 보여준다. HEK293T 세포 용해물 및 상청액에서의 활성은 pGBA-NanoLuc_STD 플라스미드 및 인핸서 단백질 pGBA-NanoLuc_EG 플라스미드로 형질감염 시에 나타난다. 세포 배양 상층액에서 상대적인 GBA 활성은 인핸서 단백질 동시 발현으로 유의미하게 더 높으며, 이는 인핸서 단백질이 발현된 GBA 단백질의 품질을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 32a 내지 도 32c는 지질 나노입자(LNP)로 제형화된 pGBA-NanoLuc_STD 플라스미드 및 인핸서 단백질 GBA-NanoLuc_EG 플라스미드로 처리된 Balb/c 마우스의 생물발광 영상화 결과를 보여준다. 도 32a 및 도 32b에서, 이미지는 각각 복위 자세와 앙와위 자세에서 촬영되었다. 도 32c 및 표 6은 루시퍼라제 활성의 평균 변동 계수(CV%)가 L 인핸서 단백질의 동시 발현 없이 더 높았다는 것을 나타낸다.
발명의 내용
본 발명자들은 특정 인핸서 단백질과 표적 단백질의 동시 발현이 재조합적으로 생성된 단백질의 발현 품질 및/또는 양을 개선하고/하거나 발현 기간을 연장시키며, 시험관 내, 생체 외 및 생체 내에서 관심 대상 유전자의 발현을 연장시킨다는 것을 인식하였다. 다양한 실시형태에서, 개시된 조성물 및 방법은 종래 기술에 비해 하기 장점 중 하나 이상을 나타낸다: (1) 진핵 세포주 또는 살아있는 대상체 내에서 표적 단백질의 단백질 발현(수율)을 증가시킨다; (2) 표적 단백질의 발현의 조절을 제어한다; (3) 감소된 바람직하지 않은 특성(예를 들어, 접힘 오류, 변경된 활성, 부정확한 번역 후 수정 및/또는 독성)을 보이는 표적 단백질을 발현한다; (4) 정확한 접힘 및/또는 재조합 단백질의 높은 수율을 증가시킨다; (5) 하류 활성화 경로의 성능을 향상시킨다(예를 들어, 세포에서의 GPCR 신호전달, 또는 생체 내 발현의 경우 발현된 항원에 대한 면역 시스템 반응); 및/또는 (6) 인핸서 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 기능성 및/또는 세포의 하류 대사에 영향을 미치지 않는다. 일부 실시형태는 이러한 장점을 전혀 나타내지 않거나, 일부 또는 전부를 나타내지 않는 바와 같이, 본 발명은 이러한 열거된 장점에 의해 제한되지 않는다.
한 양태에서, 본 개시내용은 진핵 세포에서 표적 단백질의 재조합 발현을 위한 시스템, 및 하나 이상의 벡터를 포함하는 생체 내 표적 단백질의 발현 방법을 제공한다. 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT: nucleocytoplasmic transport)의 억제제이고/이거나 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L: leader) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M: matrix) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 표적 단백질의 발현을 위한 진핵 세포로서, 세포는 인핸서 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 진핵 세포를 제공한다. 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV: Venezuelan equine encephalitis virus) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 프로모터(선택적으로 천연 프로모터 또는 외인성 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 재조합 발현 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터 시스템을 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 재조합 발현 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터 시스템(또는 벡터)을 진핵 세포 내로 도입함으로써 생성된 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터 시스템(또는 벡터)을 진핵 세포 내로 도입함으로써 발현된 단백질을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드)를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 표적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 단백질의 발현 수준, 용해도 및/또는 활성을 향상시키기 위해 인핸서 단백질의 동시 발현을 활용한다. 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 표적 단백질로 대상체를 면역화시키는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 대한 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 표지된 세포 또는 표지된 표적 단백질, 및 재조합 세포의 집단을 포함하는 용액으로서, 재조합 세포는 각각 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 발현하는, 용액을 제공하는 단계; 및 표지된 세포 또는 표지된 표적 단백질에 결합된 재조합 세포를 검출함으로써 용액으로부터 하나 이상의 재조합 세포를 분류하는 단계를 포함하는, 세포 분류에 의한 항체 발견 방법을 제공한다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 파지-디스플레이 라이브러리를 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 표적 단백질과 혼합하는 단계; 및 세포 또는 표적 단백질에 결합하는 파지-디스플레이 라이브러리의 구성원을 정제 및/또는 농축시키는 단계를 포함하는, 파지-디스플레이 라이브러리를 패닝(panning)하는 방법을 제공한다.
추가 양태 및 실시형태는 하기의 상세한 개시에 의해 제공된다. 본 발명은 이러한 요약에 의해 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 벡터를 포함하는 표적 단백질의 재조합 발현을 위한 시스템이 제공된다. 일부 실시형태에서, 발현은 진핵 세포에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 발현은 제자리(in situ), 생체 내 또는 생체 외에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT: nucleocytoplasmic transport)의 억제제이고/이거나 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L: leader) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M: matrix) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
이론에 구애됨이 없이, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 세포의 조절 메커니즘이 재조합 표적 단백질의 발현에 반응하여 활성화하는 것을 방지하고, 이것이 표적 단백질의 수율 및/또는 기능성을 향상시키는 것으로 여겨진다. 본 개시내용의 방법 및 시스템은 (1) 전사 개시의 억제, (2) 전사 종결 및 폴리아데닐화의 억제; (3) mRNA 프로세싱 및 스플라이싱의 억제, (4) mRNA 외수송(export)의 억제; (5) 번역 개시의 억제; 및 (6) 스트레스 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 세포 메커니즘을 억제하거나 방해할 수 있다(도 1).
다양한 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 인핸서 단백질, 예를 들어, L 단백질의 동시 발현을 통해 표적 단백질 발현을 개선할 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법과 연관된 개선된 표적 단백질 발현은 예를 들어 표적 단백질의 활성을 증가시키고, 발현 수준을 낮추고, 발현 기간을 증가시키고, 안정성을 증가시키고, 세포 또는 대상체에서 지속 기간을 증가시키고, 전달의 균일성을 증가시고, 분해를 감소시키고/시키거나 EC50을 감소시킬 수 있다.
다양한 실시형태가 도 2a 내지 도 2y 및 표 1에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 제1 벡터는 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 벡터는 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단일 벡터는 표적 단백질 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 벡터는 표적 단백질과 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 초과의 인핸서 단백질 및/또는 하나 초과의 표적 단백질이 벡터 또는 벡터들에 의해 인코딩된다.
정의
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나의 단백질 또는 그러한 단백질의 혼합물을 지칭할 수 있고, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 동등한 단계 및/또는 방법, 등에 대한 언급을 포함한다.
본원에 사용되는, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치 앞에 올 때 10% 범위의 플러스 또는 마이너스 값을 나타낸다. 예를 들어, "약 100"은 90과 110을 포함한다.
또한 본원에 사용되는, "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 부재뿐만 아니라, 연관된 나열 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 지칭하고 포함한다.
본원에 사용되는, 뉴클레오타이드 서열은 달리 명시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 나열되고, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 나열된다.
용어 "핵산 서열", "핵산", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용된다. 이는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 중 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 인코딩 또는 비인코딩 영역, 연관 분석으로 정의된 유전자좌(좌위), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 하나 이상의 수정된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 수정은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비(non)-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지 성분과의 접합 등에 의해 중합 후에 추가로 수정될 수 있다.
"조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosomal entry site) 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열과 같은 전사 종결 신호)를 포함한다. 조절 요소는 다양한 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 요소(예를 들어, 조직 특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직 특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특이적인 기관(예를 들어, 간, 췌장) 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)과 같은 관심 대상의 원하는 조직에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 세포 주기 의존적 또는 발달 단계 의존적 방식과 같은 시간 의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이는 또한 조직 또는 세포 유형에 특이적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 pol I 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터 중 하나, 또는 이들의 조합일 수 있다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV: retroviral Rous sarcoma virus) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서 포함), 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서 포함), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK: phosphoglycerol kinase) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예를 들어 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에 있는 R-U5' 세그먼트; SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열이 포함된다.
"벡터"는 유전 물질을 표적 세포로 전달하는 데 사용된다. 벡터는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하고 자유 말단은 포함하지 않는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 알려진 다른 다양한 종류의 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 한 유형은 표준 분자 클로닝 기법에 의한 것과 같이 추가 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 유래 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 연관 바이러스)로 포장하기 위해 벡터에 존재하는 바이러스 벡터이다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제 불능일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로의 형질감염을 위해 바이러스에 의해 운반되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자동복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비(non)-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기법에 유용한 일반적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비(non)-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이 용어는 또한; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에 사용되는, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘다, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산이 포함한다.
본원에 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 및 다른 동물을 포함한다. 통상적으로, 대상체는 인간이다. 예를 들어, 대상체는 성인, 청소년, 아동(2세 내지 14세), 유아(1개월 내지 24개월), 또는 신생아(최대 1개월)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 성인은 약 65세 이상, 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임신한 여성 또는 임신을 계획하는 여성이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이 아니며; 예를 들어 인간이 아닌 영장류; 예를 들어 개코원숭이, 침팬지, 고릴라, 또는 마카크(macaque)이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 개 또는 고양이와 같은 애완동물일 수 있다.
본원에 사용되는, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화시키는" 또는 "개선하는"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 유익한 또는 요망되는 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이익은 치료 중인 하나 이상의 질병, 상태 또는 증상에 대한 치료학적으로 관련된 개선 또는 효과를 지칭한다. 예방적 이익을 위해, 조성물은 특정 질병, 상태 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체, 또는 질병, 상태 또는 증상이 아직 나타나지 않았을 수 있더라도 질병의 하나 이상의 생리적 증상을 보고하는 대상체에게 조성물을 투여될 수 있다.
본원에 사용되는, "아달리무맙"은 HUMIRA™, MABURA™ 또는 EXEMPTIA™의 활성 약학 성분(API: active pharmaceutical ingredient), 또는 이의 기능적 변이체를 지칭한다. 따라서, 아달리무맙은 아달리무맙-adaz, 아달리무맙-adbm, 아달리무맙-afzb, 아달리무맙-atto, 아달리무맙-bwwd 또는 아달리무맙-fkjp를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아달리무맙은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된 국제 공개 WO2011153477호에 따른 서열번호 137 내지 142의 CDR 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 사용되는, 용어 "면역원", "항원" 및 "에피토프"는 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 당단백질을 포함한 단백질 및 펩타이드와 같은 물질을 지칭한다.
본원에 사용되는, 대상체에서의 "면역원성 반응"은 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 대상체에서 발달하게 한다.
폴리뉴클레오타이드
본 개시내용은 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질의 발현을 위한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 발현은 진핵 세포에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 발현은 제자리, 생체 내 또는 생체 외에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(또는 핵산 또는 핵산 분자)는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있으며 본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하여 세포(예를 들어, 진핵 세포)에 전달된다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 천연 공급원으로부터 단리되고; PCR 증폭, 시험관 내 전사 또는 화학적 합성과 같은 기법을 사용하여 시험관 내에서 제조되고; 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 생체 내에서 제조되고; 또는 임의의 적절한 방법으로 제조되거나 수득된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 임의의 모양(선형, 원형 등) 또는 토폴로지(topology)(단일 가닥, 이중 가닥, 선형, 원형, 슈퍼코일형, 비틀림, 흠집 등)를 갖는다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 펩타이드 핵산(PNAS: peptide nucleic acid) 및 폴리펩타이드-핵산 접합체와 같은 핵산 유도체; 적어도 하나의 화학적으로 개질된 당 잔기, 백본, 뉴클레오타이드간 결합, 염기, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체, 또는 염기성 부위를 갖는 핵산; 뿐만 아니라 화학적으로 개질된 5' 또는 3' 말단을 갖는 핵산; 및 그러한 개질 중 2개 이상을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결이 동일할 필요는 없다.
폴리뉴클레오타이드의 예는 올리고뉴클레오타이드(RNA 간섭(RNAi)에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 앱타머, 핵산, 인공 염색체, 클로닝 벡터 및 작제물, 발현 벡터 및 작제물, 유전자 치료 벡터 및 작제물, rRNA, tRNA, mRNA, mtRNA 및 tmRNA 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내 전사(IVT: in vitro transcribed) mRNA이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드이다.
폴리뉴클레오타이드는 상기 단백질의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 생성하기 위해 전사 및 번역(예를 들어, DNA→RNA→단백질) 또는 번역(RNA→단백질)될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 경우 단백질을 "인코딩"한다고 말한다. 생체 내(예를 들어, 진핵 세포 내) 전사 및/또는 번역은 내인성 또는 외인성 효소에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 전사는 진핵 세포의 내인성 중합효소 II(polII)에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 외인성 RNA 중합효소는 동일하거나 상이한 벡터에 제공된다. 일부 실시형태에서, RNA 중합효소는 T3 RNA 중합효소, T5 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소 및 H8 RNA 중합효소로부터 선택된다.
본 개시내용에 따른 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 인코딩하는 "제1 폴리뉴클레오타이드"; 인핸서 단백질을 인코딩하는 "제2 폴리뉴클레오타이드"; 및 하나 이상의 표적 단백질, 하나 이상의 인핸서 단백질 및/또는 하나 이상의 분리 요소를 인코딩하는 "코딩 폴리뉴클레오타이드"를 포함한다.
표적 단백질
본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 관심 대상의 유전자("GOI: gene of interest")라고 지칭한다.
일부 실시형태에서, 단백질의 발현은 전통적인 발현 시스템에서 발현될 때 세포 독성을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 전통적인 발현 시스템에서 발현 수율이 낮은 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 발현 또는 품질은 전통적인 발현 시스템과 비교하여 개시된 방법에 따른 발현에 의해 유의미하게 개선된다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법에 따른 표적 단백질의 발현은 전통적인 발현 시스템과 비교하여 숙주 세포에 대한 독성을 덜 유발한다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법에 따른 표적 단백질의 발현은 숙주 세포에 독성을 유발하지 않는다.
표적 단백질은 제한되지 않으며, 발현을 원하는 임의의 단백질이 될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 바이러스 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 가용성 단백질, 분비 단백질(예를 들어 C-Inh 등) 또는 막 단백질이다. 표적 단백질은 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 하나 이상의 동물 단백질, 하나 이상의 인간 단백질, 하나 이상의 미생물 단백질, 하나 이상의 바이러스 단백질, 하나 이상의 진균 단백질 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 대상체에서 면역원성 반응을 이끌어낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 하나 이상의 항원을 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 단백질 도메인, 하나 이상의 이소형, 또는 키메라 단백질로 구성된다. 일부 실시형태에서, 단백질 도메인은 구조적 도메인, 기능적 도메인, 세포외 도메인, 또는 세포내 도메인이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 자연적으로 발생하는 대응물과 비교하여 변경된 활성 및/또는 변경된 순환 반감기를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 단백질 A의 기능성 도메인과 단백질 B의 구조적 도메인으로 구성된 키메라 단백질이며, 여기서 키메라 단백질은 기능적 활성, 순환 반감기 및/또는 단백질 A 또는 단백질 B와 비교하여 우수한 다른 특성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 항체; 항체 유사 분자; 수용체; 단일클론 항체; 항체 부분 또는 단편; 나노바디; 이중특이적 또는 다중특이적 항체; 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 유사 분자이다. 일부 실시형태에서, 항체는 아달리무맙이다. 일부 실시형태에서, 항체는 압식시맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아미반타맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 부로수맙, 카나키누맙, 카플라시주맙, 카프로맙, 카투막소맙, 세미플리맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 크리잔리주맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 더발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에마팔루맙, 에미시주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엡티네주맙, 에레누맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에볼로쿠맙, 프레마네주맙, 갈카네주맙, 젬투주맙 오조가미신, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 임시로맙, 인플릭시맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 라나델루맙, 로키베트맙, 메폴리주맙, 모가물리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 폴라투주맙 베도틴, 라코투모맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 라불리주맙, 레슬리주맙, 리산키주맙, 리툭시맙, Rmab, 로모소주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 탈케타맙, 테클리스타맙, 테프로투무맙, 틸드라키주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 듀오카마진, 트라스투주맙 엠탄신, 우스테키누맙 및 베돌리주맙이다. 이러한 항체에 대한 폴리펩타이드 서열은 예를 들어 문헌[Raybould et al. (2020) Thera-SAbDab: the Therapeutic Structural Antibody Database. Nucleic Acids Res. 48(D1):gkz827]에 기재된 Thera-SAbDab 데이터베이스(opig.stats.ox.ac.uk에서)에서 공개적으로 이용가능하다.
일부 실시형태에서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 132의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 134의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 135의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 이중특이적 또는 다중특이적 항체; 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 유사 분자이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 블리나투모맙 및 에미시주맙이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 예를 들어 블리나투모맙(MT103) 및 솔리토맙과 같은 이중특이적 T 세포 관여제(BiTE: bi-specific T-cell engager)이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 단백질 스캐폴드(예를 들어, 애드넥틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, 쿠니츠 도메인, 노틴(Knottin), 아피바디(Affibody) 또는 DARPin)에 기초한 결합 리간드 또는 결합제이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 혈액 단백질이다. 혈액 단백질의 비제한적인 예는 트랜스페린, t-PA, 히루딘, C1 에스테라제 억제제, 항트롬빈, 혈장 칼리크레인 억제제, 플라스민, 프로트롬빈 복합체, 보체 성분, 프리알부민(트랜스티레틴), 알파 1 항트립신, 알파-1-산 당단백질, 알파-1-태아단백질, 알파2-마크로글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 마이크로글로불린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C-반응성 단백질(CRP: C-reactive protein), 지질단백질(킬로미크론, 초저밀도 지질단백질(VLDL: very low density lipoprotein), 저밀도 지질단백질(LDL: low density lipoprotein), 고밀도 지질단백질(HDL: high density lipoprotein)), 트랜스페린, 프로트롬빈, 만노스 결합 렉틴(MBL: mannose binding lectin), 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 조절 인자 및 응고 인자, 예를 들어, 인자 I, 인자 II, 인자 III, 인자 IV, 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 프리칼리크레인, 피츠제럴드 인자, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2 및 암 응혈원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 혈전용해제이다. 혈전용해제의 비제한적인 예는 에미나제(아니스트레플라제), 레타바제(레테플라제), 스트렙타제(스트렙토키나제, 카비키나제), 알테플라제, t-PA(악티바제를 포함하는 약물 종류), TNKase(테넥테플라제), 아보키나제 및 킨리틱(로키나제)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 성장 인자이다. 성장 인자의 비제한적인 예는 에리스로포이에틴(EPO: erythropoietin), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1: insulin like growth factor-1), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-GCF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 골 형태 형성 단백질-2(BMP-2: bone morphogenetic protein-2), 골 형태 형성 단백질-7(BMP-7), 각질세포 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 아드레노메둘린(AM: adrenomedullin), 안지오포이에틴(Ang: angiopoietin), 자가분비 운동성 인자, 골 형태 형성 단백질(BMP), 섬모 신경영양 인자 패밀리(family), 섬모 신경 영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 인터류킨-6(IL-6), 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF: macrophage colony-stimulating factor), 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 에프린스 - 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3, 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor) 1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF 11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23의 각각, 소 태아 성장 호르몬(FBS: Foetal Bovine Somatotrophin), 리간드의 GDNF 패밀리, 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor), 뉴투린, 페르세핀, 아르테민, 성장 분화 인자-9(GDF9: growth differentiation factor-9), 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 간암 유래 성장 인자(HDGF: hepatoma-derived growth factor), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자-2(IGF-2), 인터류킨-1(IL-1: interleukin-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL -5, IL-6, IL-7, 각질세포 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), 이동 자극 인자(MSF), 간세포 성장 인자 유사 단백질(HGFLP: hepatocyte growth factor-like protein)로도 알려진 대식세포 자극 단백질(MSP), 미오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린 1(NRG1) 뉴레귤린 2(NRG2), 뉴레귤린 3(NRG3), 뉴레귤린 4(NRG4), 뉴로트로핀, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor), 뉴로트로핀-3(NT-3) 뉴로트로핀-4(NT-4), 태반성장인자(PGF: placental growth factor), 혈소판유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS: renalase), T-세포 성장 인자(TCGF: T-cell growth factor), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α: transforming growth factor alpha), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β: transforming growth factor beta), 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor) 및 Wnt 신호전달 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 호르몬이다. 호르몬의 비제한적인 예는 글루카곤 유사 펩타이드-1, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 난포 자극 호르몬, 칼시토닌, 루트로핀, 글루카곤 유사 펩타이드-2, 렙틴, 부갑상선 호르몬, 융모성 생식선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 및 글루카곤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 효소이다. 효소의 비제한적인 예는 알파-글리코시다제, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-황산염, 알파-갈락토시다제, 요산염 산화효소, N-아세틸-갈락토시다제, 카르복시펩티다제, 히알루로니다제, DNA 분해효소, 아스파라기나제, 요산분해효소, 아데노신 데아미나제 및 다른 엔테로키나제, 사이클라제, 카스파제, 카텝신, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 분해효소, 이성질화효소 및 연결효소를 포함한다. 본 조성물 및 방법의 사용을 통한 발현을 위한 표적 단백질은 효소 대체와 관련된 단백질, 예를 들어 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 이미글루세라제, 탈리굴세라제 알파, 벨라글루세라제 알파, 알글루세라제, 세벨리파제 알파, 라로니다제, 이두설파제, 엘로설파제 알파, 갈설파제, 알글루코시다제 알파, C3 억제제, 헐러 및 헌터 교정 인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 조성물 및 방법은 효소 생성에 사용된다. 이러한 효소는 임상 테스트 키트 또는 다른 진단 검정의 생성에 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 막 단백질이다. 예시적인 막 단백질은 이온 채널, 간극 연접, 이온성 수용체, 수송체, 세포 표면 수용체와 같은 내재 막 단백질, 신호전달에 반응하여 막과 세포질 사이를 왕복하는 단백질 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 G-단백질 결합 수용체(GPCR: G-protein coupled receptor), 티로신 키나제 수용체, 인테그린 등이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 G-단백질 결합 수용체이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 7-(통과)-막횡단 도메인 수용체, 7-막횡단(7-TM: 7-transmembrane) 수용체, 헵타나선형 수용체, 뱀모양 수용체, 또는 G-단백질 연결 수용체(GPLR: G-protein linked receptor)이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 클래스(Class) A GPCR, 클래스 B GPCR, 클래스 C GPCR, 클래스 D GPCR, 클래스 E GPCR 또는 클래스 F GPCR이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 클래스 1 GPCR, 클래스 2 GPCR, 클래스 3 GPCR, 클래스 4 GPCR, 클래스 5 GPCR 또는 클래스 6 GPCR이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 로돕신-유사 GPCR, 세크레틴 수용체 패밀리 GPCR, 대사성 글루탐산염/페로몬 GPCR, 진균 교배 페로몬 수용체, 순환 AMP 수용체, 또는 프리즐드/스무든드(Frizzled/Smoothened) GPCR이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 수용체는 IL-1 수용체, IL-1Ra, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR: tumor necrosis factor receptor), 또는 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor)이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 수용체 모방체이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 Ras 단백질, Rac 단백질, Raf 단백질, Gα 서브유닛, 어레스틴, Src 단백질 및 다른 이펙터 단백질과 같은 신호전달에 반응하여 막과 세포질 사이를 왕복하는 단백질이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 뉴클레오시다제, NAD+ 뉴클레오시다제, 가수분해효소, 글리코실라제, N-글리코실 화합물을 가수분해하는 글리코실라제, NAD+ 글리코하이드롤라제, NADase, DPNase, DPN 가수분해효소, NAD 가수분해효소, 디포스포피리딘 뉴클레오시다제, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 뉴클레오시다제, NAD 글리코하이드롤라제, NAD 뉴클레오시다제, 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 글리코하이드롤라제이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사 및 칼슘 신호전달 경로에 참여하는 효소이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 아바타셉트, 애플리버셉트, 아갈시다제 베타, 알비글루타이드, 알데스류킨, 알레파셉트, 알글루세라제, 알글루코시다제 알파, 알리스키렌, 알파-1-단백질분해효소 억제제, 알테플라제, 아나킨라, 안세스팀, 아니스트레플라제, 인간 탄저병 면역 글로불린, 항혈우병 인자, 항트롬빈 알파, 인간 항트롬빈 III, 항흉선 세포 글로불린, 항흉선 세포 글로불린(말), 항흉선 세포 글로불린(토끼), 아프로티닌, 아르시투모맙, 아스포타제 알파, 아스파라기나제, 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, 베카플러민, 벨라타셉트, 베락탄트, 비발리루딘, 보툴리눔 독소 A형, 보툴리눔 독소 B형, 부세렐린, C1 에스테라제 억제제(인간), C1 에스테라제 억제제, 융모성 생식선 자극 호르몬 알파, 융모성 생식선 자극 호르몬(인간), 융모성 생식선 자극 호르몬, 응고 인자 IX, 응고 인자 VIIa, 인간 응고 인자 X, 응고 인자 XIII A-서브유닛, 콜라게나제, 코네스타트 알파, 코르티코트로핀, 코신트로핀, 답토마이신, 다베포에틴 알파, 데피브로타이드, 데닐류킨 디프티톡스, 데시루딘, 도나제 알파, 드로트레코긴 알파, 둘라글루타이드, 에팔리주맙, 에프모록토코그 알파, 엘로설파제 알파, 엔푸버타이드, 에포에틴 알파, 에포에틴 제타, 엡티피바타이드, 에타너셉트, 엑세나타이드, 인자 IX 복합체(인간), 피브리노겐 농축물(인간), 피브린분해효소 일명 플라스민, 필그라스팀, 필그라스팀-sndz, 폴리트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 갈설파제, 위장 내인자, 글라티라머 아세테이트, 글루카곤 재조합체, 글루카르피다제, 그라미시딘 D, A형 간염 백신, B형 간염 면역 글로불린, 인간 칼시토닌, 인간 클로스트리듐 테타니 톡소이드 면역 글로불린, 인간 광견병 바이러스 면역 글로불린, 인간 Rho(D) 면역 글로불린, 인간 혈청 알부민, 인간 수두-대상포진 면역 글로불린, 히알루로니다제, 히알루로니다제, 이브리투모맙, 이두설파제, 이미글루세라제, 인간 면역 글로불린, 인플릭시맙, 인슐린 아스파르트, 인슐린 비프, 인슐린 데글루덱, 인슐린 디터머, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린 리스프로, 인슐린 포크, 인슐린 레귤러, 인슐린 레귤러, 인슐린, 돼지, 인슐린, 이소판, 인터페론 알파-2a, 재조합형, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n9, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 인터페론 감마-1b, 정맥 면역글로불린, 이필리무맙, 익세키주맙, 라로니다제, 레노그라스팀, 레피루딘, 류프롤라이드, 리라글루타이드, 루시낙탄트, 루트로핀 알파, 루트로핀 알파, 메카세르민, 메노트로핀, 에포에틴 베타, 메트레렙틴, 무로모납, 알파 인터페론, 네시리타이드, 오크리플라스민, 오말리주맙, 오프레베킨, OspA 지질단백질, 옥시토신, 팔리퍼민, 췌장리파제, 포락탄트 알파, 프람린타이드, 프레오탁트, 인간 단백질 S, 라스부리카제, 레테플라제, 릴로나셉트, 리툭시맙, 로미플로스팀, 사크로시다제, 연어 칼시토닌, 사르그라모스팀, 사투모맙 펜데타이드, 세벨리파제 알파, 세크레틴, 세쿠키누맙, 세르모렐린, 혈청 알부민, 요오드처리된 혈청 알부민, 시목토코그 알파, 시플루셀-T, 소마트로핀 재조합형, 소마트로핀 재조합형, 스트렙토키나제, 설로덱사이드, 서스옥토코그 알파, 탈리글루세라제 알파, 테두글루타이드, 테이코플라닌, 테넥테플라제, 테리파라타이드, 테사모렐린, 트롬보모둘린 알파, 티말파신, 갑상선글로불린, 갑상선 자극 호르몬 알파, 갑상선 자극 호르몬 알파, 토실리주맙, 토시투모맙, 투베르쿨린 정제 단백질 유도체, 투록토코그 알파, 요난포자극호르몬, 유로키나제, 바소프레신 및 벨라글루세라제 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 바이오시밀러(biosimilar)이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 생물학적 제제로도 알려진 생물약제; 진단, 예후 또는 예측 바이오마커와 같은 바이오마커 활성화 폴리펩타이드; 보조제, 가용성 항원, 하위 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자와 같은 예방적 폴리펩타이드; 다른 분자의 활성 또는 결합을 지원하거나 다른 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 폴리펩타이드와 같은 보조 폴리펩타이드; 동물에서 새로운 단일클론 및 다중클론 항체를 생성하기 위한 항원, 리포터 단백질 또는 생리학적 또는 병리학적 과정과 동물 모델에서 이러한 과정에 대한 약물의 효과를 연구하기 위한 도구 폴리펩타이드와 같은 연구에 사용되는 폴리펩타이드와 같은 치료용 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 형광 단백질과 같이 현미경 및 영상화에 적용되는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 예를 들어 루시퍼라제와 같은 리포터 단백질이 아니다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 인간 단백질이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 면역조절제이다. 면역조절제의 비제한적인 예는 사이토카인, 케모카인, 인터류킨, 인터페론을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 백신으로 사용하거나 연구를 위한 항원이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 단백질 복합 조립체에서 기능하는 구조 단백질과 같은 구조 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 항미생물 폴리펩타이드; 또는 항바이러스 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 종양 억제인자이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 전사 인자 또는 번역 인자이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 약동학 조절 단백질, 소분자 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 또는 단백질 결합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 도파민 수용체 1(DRD1: dopamine receptor 1), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), C1 에스테라제 억제제(C1-Inh: C1 esterase inhibitor), IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK: inducible T cell kinase) 또는 NADase이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 반딧불이 루시퍼라제이다.
인핸서 단백질
본 개시내용은 표적 단백질 및 인핸서 단백질의 동시 발현에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 수율, 품질, 접힘, 번역 후 수정, 활성, 국소화 및 하류 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표적 단백질 발현의 하나 이상의 양태를 개선할 수 있거나, 접힘 오류, 변경된 활성, 부정확한 번역 후 수정 및/또는 독성 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵공 차단 바이러스 단백질이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵공을 차단하여 핵세포질 수송("NCT")을 억제할 수 있는 천연 또는 합성 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 NCT 억제제이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인핸서 단백질은 본원에 개시된 임의의 단백질의 기능적 변이체이다. 본원에 사용되는 용어 "기능적 변이체"는 원래의 단백질과 상동성이고/이거나 원래의 단백질과 실질적인 서열 유사성(예를 들어, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성)을 공유하며 원래의 단백질의 하나 이상의 기능적 특성을 공유하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, NCT 억제제인 인핸서 단백질의 기능적 변이체는 NCT를 억제하는 능력을 유지한다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스로부터의 리더(L) 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 카디오바이러스(cardiovirus), 헤파토바이러스(hepatovirus), 또는 아프토바이러스(aphthovirus) 속으로부터의 리더 단백질이다. 예를 들어, 인핸서 단백질은 소 비염 A 바이러스, 소 비염 B 바이러스, 말 비염 A 바이러스, 구제역 바이러스, 헤파토바이러스 A, 헤파토바이러스 B, 마르모타 히말라야나 헤파토바이러스, 포피바이러스, 카디오바이러스 A, 카디오바이러스 B, 타일러 쥐 뇌척수염 바이러스(TMEV: Theiler's Murine encephalomyelitis virus), 빌류스크 인간 뇌척수염 바이러스(VHEV: vilyuisk human encephalomyelitis virus), 타일러 유사 쥐 바이러스(TRV: Theiler-like rat virus) 또는 사폴드 바이러스(SAF-V: Saffold virus)로부터 유래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 타일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 1을 포함하거나, 서열번호 1로 구성되거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 인핸서 단백질은 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, L 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV: encephalomyocarditis virus)의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 공유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 2를 포함하거나, 서열번호 2로 구성되거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 인핸서 단백질은 서열번호 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, L 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스의 L 단백질, 및 사폴드 바이러스 2의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 2A 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 엔테로바이러스(enterovirus), 라이노바이러스, 아프토바이러스, 또는 카디오바이러스로부터의 2A 프로테아제이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 라이노바이러스 3C 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나인 3C 프로테아제이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 아프토바이러스 또는 카디오바이러스로부터의 3C 프로테아제이다. 예를 들어, 일부 비제한적 실시형태에서, 인핸서 단백질은 폴리오바이러스, 콕사키바이러스(coxsackievirus), 라이노바이러스, 구제역 바이러스 또는 헤파토바이러스 A로부터의 3C 프로테아제이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 코로나바이러스 ORF6 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵 내수송(import) 복합체 형성을 방해하고/하거나 핵으로의 STAT1 수송을 방해하는 바이러스 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 에볼라바이러스 VP24 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 에볼라바이러스 VP40 단백질 또는 VP35 단백질이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 내수송 단백질 카리오페린-α(KPNA: karyopherin-α)에 결합하는 바이러스 단백질이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 STAT1과 KPNA의 결합을 억제하는 바이러스 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵공 복합체와 상호작용하는 바이러스 캡시드 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 HSV ORF57 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 사이토랍도바이러스(cytorhabdovirus), 디코르하바이러스(dichorhavirus), 에페머로바이러스(ephemerovirus), 리사바이러스(lyssavirus), 노비랍도바이러스(novirhabdovirus), 뉴클레오랍도바이러스(nucleorhabdovirus), 퍼랍도바이러스(perhabdovirus), 시그마바이러스(sigmavirus), 스프리비바이러스(sprivivirus), 티브로바이러스(tibrovirus), 투파바이러스(tupavirus), 바리코사바이러스(varicosavirus), 또는 베시쿨로바이러스(vesiculovirus)로부터의 M 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 표 1에 나열된 단백질 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택된다. 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표 1에 나열된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 표 1에 나열된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 표 1에 나열된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
융합 단백질
일부 실시형태에서, 표적 단백질 및 인핸서 단백질은 단일 융합 단백질에 포함된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 연결 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결 요소는 효소적 절단을 위한 절단 부위를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질 또는 연결 요소는 절단 부위를 포함하지 않으며 발현된 융합 단백질은 표적 단백질과 인핸서 단백질 둘 다를 포함한다.
단백질 수정
표적 단백질, 인핸서 단백질 및/또는 융합 단백질, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 마커, 표지 또는 태그를 포함하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질은 이의 검출을 허용하는 임의의 표지, 예를 들어 방사성 표지, 형광제, 비오틴, 펩타이드 태그, 효소 단편 등으로 표지될 수 있다. 단백질은 친화성 태그, 예를 들어, His-태그, GST-태그, Strep-태그, 비오틴-태그, 면역글로불린 결합 도메인, 예를 들어, IgG 결합 도메인, 칼모듈린 결합 펩타이드 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 선택성 마커, 예를 들어, 항생제 내성 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 하나 이상의 번역 후 수정을 갖는다. 번역 후 수정의 유형은 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 번역 후 수정일 수 있다. 번역 후 수정의 비제한적인 예는 글리코실화, 아세틸화, 알킬화, 메틸화, 비오티닐화, 글루타밀화, 글리실화, 이소프레닐화, 리포일화, 포스포판테테이닐화, 인산화, 황산화, 셀렌화, C-말단 아미드화, 수모화 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
중합효소
표적 단백질(들) 및 인핸서 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 위해, 내인성 또는 외인성 중합효소가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드(들)의 전사는 세포(예를 들어, 진핵 세포)에 포함된 천연 중합효소에 의해 수행된다. 바이러스 중합효소가 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 프로모터는 하나 이상의 바이러스 중합효소와 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 진핵생물 프로모터는 하나 이상의 진핵생물 중합효소와 조합하여 사용된다. 예시적인 바이러스 중합효소는 T7, T5, EMCV, HIV, 인플루엔자, SP6, CMV, T3, T1, SP01, SP2, Phi15 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 중합효소는 RNA 프라이밍 또는 캡핑 중합효소이다. 일부 실시형태에서, IRES 요소는 바이러스 중합효소와 연계하여 사용된다.
본 개시내용에 따른 벡터 또는 벡터들은 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 바이러스 중합효소이다. 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드 및/또는 인핸서 단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 표적 단백질 또는 인핸서 단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는 벡터에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 시스템, 방법 또는 세포에 포함된 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
벡터
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질의 발현을 위한 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 벡터는 당업계에 알려진 임의의 벡터를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 관심 대상의 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 발현할 수 있는 임의의 재조합 벡터, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제 능력이 있는 아데노바이러스, 벡터, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 아데노바이러스(Ad) 벡터 또는 비바이러스 플라스미드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제 능력이 있는 아데노바이러스 벡터, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 아데노바이러스(Ad) 벡터이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 박테리아 인공 염색체(BAC: bacterial artificial chromosome), 플라스미드, 박테리오파지 P1 유래 벡터(PAC: P1-derived vector), 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome), 또는 포유동물 인공 염색체(MAC: mammalian artificial chromosome)이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 노출(naked) 또는 제형화된 플라스미드 DNA 또는 미니서클(minicircle)이다. 제형화는 제한되지 않으며, 예를 들어 펩타이드, 지질, 중합체 또는 양이온과 같은 비(non)-바이러스성 DNA 담체를 기반으로 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 구성적으로, 일시적으로 또는 조절된 방식으로 발현되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절에는 안전 스위치가 포함된다. 벡터로부터의 폴리뉴클레오타이드의 조절된 발현은 유도성 유전자 스위치(예를 들어, 합성 수용체, 단백질 기반 스위치, 유전자 회로, 게놈 편집 도구, 리보자임 또는 앱타자임)와 같은 당업계에 알려진 임의의 기술의 사용; 또는 세포사멸 자살 유전자 및 전구 약물의 사용을 포함할 수 있다. 단백질 기반 스위치는 당업계에 알려져 있으며, 단량체성 카스파제 9의 리미두시드 유도 이량체화와 같은 이량체화 단백질 또는 항체의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 세포, 시스템 및 방법은 하나의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포, 시스템 및 방법은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단일 벡터를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 세포, 시스템 및 방법은 2개의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포, 시스템 및 방법은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터; 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 세포, 시스템 및 방법은 2개 초과의 벡터를 포함할 수 있으며, 여기서 벡터는 다양한 조합 또는 구성으로 표적 단백질(들) 및 인핸서 단백질(들)을 인코딩할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터 또는 벡터들을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 표적 단백질(들) 및 인핸서 단백질(들)을 발현하는 세포가 제공된다.
프로모터
본 개시내용에 따른 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터"는 전사를 개시하기 위한 RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 전사 시작으로부터 상류 또는 하류에 위치한 영역 또는 서열을 지칭한다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 벡터(들)는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 당업계에 알려진 임의의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 정방향 프로모터 또는 역방향 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 포유동물 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 천연 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 비(non)-천연 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 비(non)-포유동물 프로모터이다. 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNA 프로모터의 비제한적인 예는 U1, 인간 신장 인자-1 알파(EF-1 알파), 거대세포바이러스(CMV), 인간 유비퀴틴, 비장 병소 형성 바이러스(SFFV: spleen focus-forming virus), U6, H1, tRNALys, tRNASer 및 tRNAArg, CAG, PGK, TRE, UAS, UbC, SV40, T7, Sp6, lac, araBad, trp 및 Ptac 프로모터를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 물리적 위치가 아닌 작동 능력에 의해 연결된 핵산 서열의 요소 또는 구조를 지칭한다. 요소 또는 구조는 원하는 작동을 수행할 수 있거나 이를 특징으로 한다. 핵산 서열에서 요소 또는 구조가 작동 가능하게 연결되기 위해 직렬 또는 인접 순서로 있을 필요는 없다는 것이 당업자에 의해 인식된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 벡터에 포함된 프로모터는 유도성 프로모터이다.
본 개시내용에 따른 벡터는 하나 이상의 바이러스 중합효소에 의해 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 전사를 가능하게 하는 하나 이상의 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 벡터는 T7 RNA 중합효소에 의한 제1 폴리뉴클레오타이드(즉, 표적 단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드) 또는 제2 폴리뉴클레오타이드(즉, 인핸서 단백질 인코딩 폴리뉴클레오타이드) 중 하나 또는 둘 다의 전사를 위해 구성된 T7 프로모터를 포함할 수 있다.
발현 카세트
본 개시내용에 따른 벡터 또는 벡터들은 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 어구 "발현 카세트"는 다른 핵산 또는 해당 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질의 생성에 필요한 최소 요소를 포함하는 핵산 분자의 정의된 세그먼트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함할 수 있고, 발현 카세트는 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)에 의해 연결된 인핸서 단백질 및 표적 단백질을 인코딩하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)에 의해 연결된, 표적 단백질과 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 전령 RNA의 전사를 위해 구성되고; 여기서, 전령 RNA의 번역은 표적 단백질 및 인핸서 단백질(예를 들어, L 단백질)을 별개의 폴리펩타이드로서 발현시키는 결과를 가져온다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드 링커가 있거나 없는 융합 단백질로서 인핸서 단백질과 표적 단백질을 인코딩하며, 선택적으로 폴리펩타이드 링커는 절단 가능한 링커 또는 인테인 기반 절단 시스템이다.
분리 요소
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 표적 단백질(들) 및 인핸서 단백질(들)은 동일한 벡터 상에 인코딩되거나 별도의 벡터 상에 인코딩된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질에 대한 핵산 서열이 동일한 벡터에 포함되는 경우, 벡터는 단백질의 별도 발현을 위한 분리 요소를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 벡터는 바이시스트로닉 벡터 또는 폴리시스트로닉 벡터이다. 분리 요소는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 2A 요소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 2A 자가 절단 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예시적인 2A 자가 절단 펩타이드는 P2A, E2A, F2A 및 T2A를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 2A 요소에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 도 13a 또는 도 13b에 도시된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 132를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 133을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 134의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 135를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 100의 핵산 서열, 또는 서열번호 100과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
서열번호 100:
CGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACGATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGCGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTCGAGTGGGTCAGCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCAGATAGCGTTGAAGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAAAGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCTAGCACAAAAGGACCTAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACTAGCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAAAGCTCTGGCCTGTATAGCCTTTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACACAGACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCGTGCCCCGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAACCTAAAGACACACTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAACCTAGAGAGGAACAATACAACAGCACATATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAACCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCAAGTAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTAACATGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCTCCTGTTCTGGATTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAGGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTCGAGTGGGTCAGCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCAGATAGCGTTGAAGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAAAGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCTAGCACAAAAGGACCTAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACTAGCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAAAGCTCTGGCCTGTATAGCCTTTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACACAGACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCGTGCCCCGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAACCTAAAGACACACTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAACCTAGAGAGGAACAATACAACAGCACATATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAACCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCAAGTAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTAACATGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCTCCTGTTCTGGATTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAGCAAGCGAAAACGGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAAGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACCCTGCAGAGCGGCGTTCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAACCTGAAGATGTGGCTACATACTACTGCCAGAGATACAATCGGGCCCCTTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCTGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTCACACTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGCGAGTGCTAAGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAAGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACCCTGCAGAGCGGCGTTCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAACCTGAAGATGTGGCTACATACTACTGCCAGAGATACAATCGGGCCCCTTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCTGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTCACACTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGCGAGTGCTAACCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGAACAAGAGACTTGCGCGCACTCTCTCACTTTTGAGGAATGCCCAAAATGCTCTGCTCTACAATACCGTAATGGATTTTACCTGCTAAAGTATGATGAAGAATGGTACCCAGAGGAGTTATTGACTGATGGAGAGGATGATGTCTTTGATCCCGAATTAGACATGGAAGTCGTTTTCGAGTTACAGTAAATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTGACTCTT
일부 실시형태에서, 벡터는 하기의 유전적 요소를 하나 이상 포함한다.
도 13b에 도시된 벡터의 유전적 요소
기타사항: 서열번호 101
CGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTT
CMV 인핸서: 서열번호 102
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG
CMV 프로모터: 서열번호 103
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT
기타사항: 서열번호 104
GGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACG
알부민 신호 펩타이드(코돈 최적화): 서열번호 105
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGC
아달리무맙 중쇄(가변 영역): 서열번호 106
GAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTCGAGTGGGTCAGCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCAGATAGCGTTGAAGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAAAGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCT
인간 IgG1 중쇄(불변 영역): 서열번호 107
GCTAGCACAAAAGGACCTAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACTAGCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAAAGCTCTGGCCTGTATAGCCTTTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACACAGACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCGTGCCCCGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAACCTAAAGACACACTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAACCTAGAGAGGAACAATACAACAGCACATATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAACCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCAAGTAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTAACATGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCTCCTGTTCTGGATTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
아달리무맙 중쇄 완전함: 서열번호 134
GAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTCGAGTGGGTCAGCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCAGATAGCGTTGAAGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAAAGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCTAGCACAAAAGGACCTAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACTAGCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAAAGCTCTGGCCTGTATAGCCTTTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACACAGACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCGTGCCCCGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAACCTAAAGACACACTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAACCTAGAGAGGAACAATACAACAGCACATATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAACCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCAAGTAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTAACATGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCTCCTGTTCTGGATTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAG
푸린 절단 부위: 서열번호 108
CAAGCGAAAACGGCGC
GSG 링커: 서열번호 109
GGAAGCGGA
P2A 자가 절단 펩타이드: 서열번호 110
GCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
아달리무맙 경쇄(가변 영역): 서열번호 111
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAAGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACCCTGCAGAGCGGCGTTCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAACCTGAAGATGTGGCTACATACTACTGCCAGAGATACAATCGGGCCCCTTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
인간 Ig 카파 불변(경쇄의 불변 영역): 서열번호 112
CGGACCGTGGCCGCCCCATCTGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTCACACTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGCGAGTGCTAA
아달리무맙 경쇄 완전함: 서열번호 135
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAAGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACCCTGCAGAGCGGCGTTCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAACCTGAAGATGTGGCTACATACTACTGCCAGAGATACAATCGGGCCCCTTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCTGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTCACACTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGCGAGTGCTAA
기타사항: 서열번호 113
CCCCCCCCCCTA
IRES: 서열번호 114
ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAT
인핸서 펩타이드: 서열번호 115
ATGGCCACAACCATGGAACAAGAGACTTGCGCGCACTCTCTCACTTTTGAGGAATGCCCAAAATGCTCTGCTCTACAATACCGTAATGGATTTTACCTGCTAAAGTATGATGAAGAATGGTACCCAGAGGAGTTATTGACTGATGGAGAGGATGATGTCTTTGATCCCGAATTAGACATGGAAGTCGTTTTCGAGTTACAGTAA
기타사항: 서열번호 116
ATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTT
SV40 폴리(A) 신호: 서열번호 117
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA
링커: 서열번호 118
AGGCGTCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC
네오마이신/카나마이신 내성 유전자: 서열번호 119
ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA
기타사항: 서열번호 120
ATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTC
복제 원점: 서열번호 121
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA
기타사항: 서열번호 122
AACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTGACTCTT
도 13b에 도시된 벡터로부터 발현된 단백질의 아미노산 서열
일부 실시형태에서, 아달리무맙은 단일 전구체 폴리펩타이드(즉, 단일 오픈 리딩 프레임)로서 발현되며, 이는 번역과 동시에 성숙 항체 중쇄 및 경쇄로 처리된다. 단백질의 성분은 하기와 같다:
알부민 신호 펩타이드: 서열번호 123
MKWVTFISLLFLFSSAYS
아달리무맙 중쇄(가변 영역): 서열번호 124
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS
인간 IgG1 중쇄(불변): 서열번호 125
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
푸린 절단 부위(^는 절단 부위를 나타냄): 서열번호 126
RKRR^
링커: 서열번호 127
GSG
P2A 자가 절단 펩타이드(^는 절단 부위를 나타냄): 서열번호 128
ATNFSLLKQAGDVEENPG^P
아달리무맙 경쇄(가변 영역): 서열번호 129
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
인간 Ig 카파 불변(*는 전구체 폴리펩티이드의 정지 코돈을 나타냄): 서열번호 130
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
인핸서 펩타이드는 하기와 같이 내부 리보솜 진입 부위로부터 발현된다.
인핸서 펩타이드(*는 정지 코돈을 나타냄) 서열번호 131
MATTMEQETCAHSLTFEECPKCSALQYRNGFYLLKYDEEWYPEELLTDGEDDVFDPELDMEVVFELQ
아달리무맙 완전 중쇄: 서열번호 132
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
아달리무맙 완전 경쇄: 서열번호 133
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
일부 실시형태에서, 벡터는 아달리무맙의 상보성 결정 영역(CDR: complementary determining region) 중 임의의 것, 예를 들어, 경쇄 CDR의 서열번호 137, 139, 141을 포함한다:
서열번호 137
QRYNRAPYX
서열번호 139
AASTLQS
서열번호 141
RASQGIRNYLA
일부 실시형태에서, 벡터는 아달리무맙의 상보성 결정 영역(CDR) 중 임의의 것, 예를 들어, 중쇄 CDR의 서열번호 138, 140, 142를 포함한다:
서열번호 138
VSYLSTASSLD
서열번호 140
AITWNSGHIDYADSVEG
서열번호 142
DYAMH
일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 136과 적어도 약 70%(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
도 13a에 도시된 벡터의 핵산 서열
서열번호 136
CGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACGATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGCGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCAGGCAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTCGAGTGGGTCAGCGCCATCACCTGGAATAGCGGCCACATCGACTACGCAGATAGCGTTGAAGGCAGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCTCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAAAGTGTCCTACCTGAGCACCGCCAGCTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCTAGCACAAAAGGACCTAGCGTGTTTCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAAAGCACCAGCGGCGGAACCGCCGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACTAGCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAAAGCTCTGGCCTGTATAGCCTTTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACACAGACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCGTGCCCCGCTCCTGAGCTGCTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAACCTAAAGACACACTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTCCACAACGCCAAGACCAAACCTAGAGAGGAACAATACAACAGCACATATAGAGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTCCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAACCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCAAGTAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTAACATGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACACCTCCTGTTCTGGATTCTGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTTATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGAGCCCTGGCAAGCAAGCGAAAACGGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTTTCTTCCGCCTACAGCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAAGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACCCTGCAGAGCGGCGTTCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAACCTGAAGATGTGGCTACATACTACTGCCAGAGATACAATCGGGCCCCTTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCTGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTCACACTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTTAACAGAGGCGAGTGCTAAATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTGACTCTT
형질감염, 형질도입, 형질전환
용어 "형질감염", "형질도입" 및 "형질전환"은 핵산을 세포(예를 들어, 진핵 세포) 내로 도입하는 과정을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 세포(예를 들어, 진핵 세포) 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있고 부분적으로 특정 숙주 세포에 기초하여 선택되는 다양한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 화학적, 물리적, 생물학적 또는 바이러스 수단을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은 인산칼슘, 덴드리머, 양이온성 중합체, 리포펙션, 퓨진(fugene), 세포 침투 펩타이드, 펩타이드 덴드리머, 전기천공, 세포 압착, 초음파천공법, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션, 유체역학적 전달, 유전자 총, 자기감염, 입자 충격, 핵감염 및 바이러스 형질도입의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
표적 단백질을 인코딩하는 표적화 DNA 및/또는 핵산 및 인핸서 단백질을 포함하는 벡터는 다양한 방법(예를 들어, 주입, 형질전환, 형질감염, 직접 흡수, 발사체 충격(projectile bombardment), 리포솜)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 표적 단백질 및 인핸서 단백질은 발현 벡터를 사용하여 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 진핵 세포에서의 발현의 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. (문헌[Current Protocols in Human Genetics: Chapter 12 "Vector Therapy" & Chapter 13 "Delivery Systems for Gene Therapy"] 참조).
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 선택적으로 렌티바이러스 형질감염, 포유류 세포로의 바큘로바이러스 유전자 전달(BacMam), 레트로바이러스 형질감염, CRISPR/Cas9 및/또는 트랜스포존의 사용을 통해 안정한 세포주를 생성하기 위한 표준 방법을 사용하여 게놈에 삽입함으로써 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 일시적 형질감염을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 일시적 형질감염은 바이러스 벡터, 헬퍼 지질, 예를 들어, PEI, 리포펙타민 및/또는 펙타민 293의 사용을 통해 수행될 수 있다. 유전적 요소는 예를 들어, 벡터 상에 DNA로서 또는 예를 들어, PCR로부터 RNA로서 인코딩될 수 있다. 유전적 요소는 서로 다르게 분리되거나 동일한 벡터 상에 조합될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 화학적, 물리적, 생물학적 또는 바이러스 수단을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다.
표적 단백질의 생체 내 전달
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 대상체 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 방법에 의해 대상체 내로 도입될 수 있다. 표적 단백질을 인코딩하는 표적화 DNA 및/또는 핵산 및 인핸서 단백질을 포함하는 벡터는 다양한 방법(예를 들어, 주입, 바이러스 형질감염, 직접 흡수, 발사체 충격)에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
주사에 의한 투여는 예를 들어, 근육내, 정맥내, 심장내, 복강내, 정맥내, 동맥내, 피내, 피하, 두개내, 요추, 유리체내, 비강내 또는 다른 주사를 포함할 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드는 화학적, 물리적, 생물학적 또는 바이러스 수단을 사용하여 대상체의 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 대상체에게 투여하고/하거나 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 대상체의 세포 내로 도입하는 방법은 양이온성 또는 다른 중합체, 지질, 지질 제형, 세포 투과성 펩타이드, 나노입자 기반 전달 운반체, 나노젤, 유전자 총, 제트 유전자 장치, 입자 충격 및 바이러스 형질도입을 사용하거나 사용하지 않는 동안 전기천공법/초음파천공법을 사용하거나 사용하지 않고 직접 주사하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 투여는 피하 주사에 의한다. 본 출원의 다른 곳에서도 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 폴리뉴클레오티이드는 임의의 바이러스 유전자 전달 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 랍도바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 폭스바이러스, 피코르나바이러스 또는 임의의 다른 바이러스 전달 시스템을 사용하여 대상체의 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 표적 단백질 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 질병의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 관리하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 단일클론 항체(예를 들어, 아달리무맙)와 같은 항체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 표적 단백질(예를 들어 아달리무맙)의 발현에 의해 치료, 예방 또는 관리되는 것으로 알려졌거나 향후에 발견될 임의의 상태를 갖는 대상체이다. 예를 들어, 아달리무맙을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 투여에 의해 치료될 수 있는 상태의 비제한적인 예는 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농성 한선염, 포도막염 및 청소년 특발성 관절염을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 대상체에게 본원에 개시된 표적 단백질 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 결과를 달성하는 데, 예를 들어 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 치료할 대상체 및 질병 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다. 특이적인 용량은 선택된 특정 제제, 따라야 할 투여 요법, 다른 화합물과의 병용 투여 여부, 투여 시기, 영상화할 조직 및 제제가 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
인핸서의 존재 하에 표적 단백질을 발현시키는 개시된 방법은 하기에 기재된 바와 같이 몇몇 장점을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현된 표적 단백질은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현되는 표적 단백질보다 기능적으로 더 활성이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현되는 표적 단백질은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현되는 표적 단백질보다 적어도 약 1.2배(예를 들어, 그 사이에 있는 모든 값과 하위 범위를 포함하여, 약 1.5배, 약 1.7배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 또는 약 50배) 더 활성이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현된 표적 단백질은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현된 표적 단백질과 비교하여 더 긴 지속 기간 동안 발현된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현되는 표적 단백질은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현되는 표적 단백질과 비교하여 적어도 약 1시간(예를 들어, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 6개월, 또는 약 1년) 더 오랫동안 발현된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현된 표적 단백질의 더 적은 비율은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현되는 표적 단백질과 비교하여 바람직하지 않은 특성(예를 들어, 접힘 오류, 변경된 활성, 부정확한 번역 후 변형 및/또는 독성)을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현된 약 30% 미만(예를 들어, 그 사이에 있는 모든 값과 하위 범위를 포함하여, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만)의 표적 단백질은 바람직하지 않은 특성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 방법을 사용하여 인핸서 단백질의 존재 하에 발현된 표적 단백질의 더 높은 비율은 인핸서 단백질의 부재 하에 발현된 표적 단백질과 비교하여 정확한 접힘을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대상체에게 투여된 벡터 또는 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질의 치료적 유효량은 단지 표적 단백질을 인코딩하는 대조군 벡터 또는 대조군 폴리뉴클레오타이드의 치료적 유효량보다 적다. 이론에 구애됨이 없이, 인핸서 단백질의 존재 하에 발현될 시 표적 단백질의 향상된 발현 품질 및/또는 양 및/또는 더 긴 발현 기간으로 인해 벡터 또는 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질(대조군 벡터 또는 표적 단백질만을 인코딩하는 대조군 폴리뉴클레오타이드과 비교하여)의 더 적은 용량은 유사한 생물학적 효과를 이끌어내기에 충분하다고 여겨진다.
일부 실시형태에서, 벡터 또는 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질이 투여된 대상체는 벡터 또는 단지 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 투여된 대조군 대상체와 비교하여 항-표적 단백질 항체의 생성이 감소된 것으로 나타난다. 이론에 구애됨이 없이, 또한 인핸서의 부재 하에 발현되는, 접힘이 잘 안되거나 접혀지지 않은 표적 단백질의 형성은 항-표적 단백질 항체의 생성을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 반면에, 인핸서 단백질의 존재 하에 발현될 시 표적 단백질의 개선된 발현 품질 및/또는 양은 항표적 단백질 항체의 생성을 감소시킨다.
세포, 세포주, 숙주 세포
본 개시내용의 다른 양태는 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 표적 단백질 및 인핸서 단백질은 본원에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 임의의 진핵 세포 또는 세포주이다. 개시된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 시스템 및 방법은 임의의 진핵 1차 세포 및 세포주에서 사용될 수 있다. 진핵 세포주는 인간 및 동물 세포주와 같은 포유동물 세포주를 포함할 수 있다. 진핵 세포주는 또한 곤충, 식물 또는 진균 세포주를 포함할 수 있다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비제한적 예는 Bc HROC277, COS, CHO(예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, 5P2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) 및 perC6 세포뿐만 아니라 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda)(Sf, 예를 들어 Sf9)와 같은 곤충 세포 또는 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 분열효모균(Schizosaccharomyces)과 같은 진균 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질(들) 및 인핸서 단백질(들)을 발현하기 위한 세포 또는 세포주는 인간 세포 또는 세포주이다. 특정 양태에서, 인간 세포주의 선택은 예를 들어 표적 단백질에서 글리코실화, 인산화, 이황화 결합과 같은 번역 후 수정("PTM: post-translational modification")에 유익하다. 일부 실시형태에서, 인간 세포 또는 세포주는 인간 표적 단백질의 발현을 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 단백질의 발현을 위한 진핵 세포로서, 세포는 인핸서 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 진핵 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드는 일시적으로 형질도입되고/되거나 세포의 게놈 내로 혼입되지 않는다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드는 안정적으로 혼입된다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 프로모터(선택적으로 천연 프로모터 또는 외인성 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
시험관 내 및 생체 외 방법
본 개시내용은 진핵 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 방법은 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드)를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 표적 단백질의 발현 수준, 용해도 및/또는 활성을 향상시키기 위해 인핸서 단백질의 동시 발현을 활용한다. 또한, 방법은 인핸서 단백질의 동시 발현을 활용하여 장기간에 걸쳐 표적 단백질의 발현을 연장한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포의 사용을 통해 표적 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 벡터를 포함하는 진핵 세포에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 전술한 섹션에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 DNA 분자를 사용한 진핵 세포의 형질감염, 단일 바이러스 벡터를 사용한 진핵 세포의 형질도입, 및/또는 2개 이상의 바이러스 벡터를 사용한 진핵 세포의 형질도입을 포함할 수 있다.
또한, 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 재조합 발현 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질 발현의 방법은 본 개시내용의 벡터 시스템을 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 막 단백질이다. 일부 실시형태에서, 세포막에 대한 막 단백질의 국소화는 인핸서 단백질 없이 막 단백질이 발현될 때 관찰되는 국소화와 비교하여 증가된다.
생체 내 방법
본 개시내용은 생체 내에서 표적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드)를 대상체의 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 이 방법은 표적 단백질의 발현 수준, 용해도 및/또는 활성을 향상시키기 위해 인핸서 단백질의 동시 발현을 활용한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 면역 반응을 이끌어낸다. 면역 반응은 본질적으로 면역원성일 뿐만 아니라 면역억제성 또는 면역조절성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 질병을 치료하며, 질병은 표적 단백질에 의해 유발되거나, 관련되거나, 연관된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체의 질병을 치료하며, 대상체에서의 표적 단백질의 발현 수준은 대조군 대상체에서의 표적 단백질의 발현 수준보다 낮고, 대조군 대상체는 질병을 갖지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 사용을 통해 표적 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 벡터를 포함하는 생체 내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 전술한 섹션에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 DNA 분자, 단일 바이러스 벡터 및/또는 2개 이상의 바이러스 벡터를 주사하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 생체 내 발현 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질 발현의 방법은 본 개시내용의 벡터 시스템을 대상체 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질 및 인핸서 단백질 DNA 작제물은 지질 나노입자(LNP: lipid nanoparticle)를 통해 전달된다. 일부 실시형태에서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함한다.
하류 적용
일부 실시형태에서, 본 조성물, 시스템 및 방법의 사용을 통해 생성된 표적 단백질은 치료제, 진단제 또는 연구 개발을 위해 사용된다. 예시적 적용은 백신, 효소 대체 요법, 호르몬 대체 요법, 항체 요법, 항바이러스 치료, 항미생물 치료, 면역조절제, 치료용 암 백신, 면역종양학 적용, 이중특이적 T 세포 관여제, 스크리닝 검정, 진단 검정, 임상 테스트 키트, 약물 발견, 항체 발견 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 조성물, 시스템 및 방법의 사용을 통해 생성된 표적 단백질 및 이러한 단백질을 발현하는 세포는 단리, 정제 및/또는 하류 적용을 위해 사용된다. 예시적인 적용은 소분자 스크리닝, 구조 결정(예를 들어, X선 결정학, 저온 전자 현미경 등), 활성 검정, 치료제, 효소 대체 요법, 스크리닝 분석, 진단 검정, 임상 테스트 키트, 약물 발견, 항체 발견 등을 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 본 조성물 및 방법은 항체를 생성하거나 항체 스크리닝 검정을 위한 항원을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질을 발현하는 세포는 예를 들어 전체 세포 시스템에서 세포 상호작용, 항체 결합 또는 소분자 영향을 스크리닝하기 위한 검정 시스템으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 항체 발견을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 표적 단백질로 대상체를 면역화시키는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 대한 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 면역화된 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 인간이 아닌 영장류, 라마, 낙타, 또는 인간이다. 대상체로부터 단리된 세포는 단리된 세포로서 추가 라운드의 선택을 거치거나, 선택적으로 단리된 세포로부터 하이브리도마를 생성한 후에 추가 라운드의 선택을 거칠 수 있다. 유전자 클로닝 및/또는 서열분석을 사용하여 단리된 세포 또는 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 단리할 수 있다. 유전자 클로닝 및/또는 서열분석은 단일 세포 또는 세포 집단에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 대상체의 면역화에 이어 대상체로부터 혈청을 수확하여 다중클론 항체를 생성하는 데 사용된다.
본 개시내용은 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 표지된 세포 또는 표적 단백질, 및 재조합 세포의 집단을 포함하는 용액으로서, 재조합 세포는 각각 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 발현하는, 용액을 제공하는 단계; 및 표지된 세포 또는 표지된 표적 단백질에 결합된 재조합 세포를 검출함으로써 용액으로부터 하나 이상의 재조합 세포를 분류하는 단계를 포함하는, 세포 분류에 의한 항체 발견 방법을 추가로 제공한다. 다른 변형에서, 세포 분류는 면역화된 대상체로부터 유래된 세포에 대해 수행된다. 대상체는 본 개시내용의 방법에 따라 생산된 세포 또는 표적 단백질로, 또는 다른 적합한 면역원을 사용하여 면역화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 세포는 나이브() 항체 라이브러리, 선택적으로 인간 나이브 항체 라이브러리를 포함한다. 다양한 항체 라이브러리 생성 방법이 당업계에 알려져 있으며 본 개시내용의 방법과 조합될 수 있다. 본원에 사용되는, 용어 "분류" 또는 "세포 분류"는 형광 활성화된 세포 분류, 자기 보조 세포 분류, 및 표지된 세포 집단과 표지되지 않은 세포 집단에서 표지된 세포를 선택하는 다른 수단을 지칭한다.
본 개시내용은 파지-디스플레이 라이브러리를 본 개시내용의 시스템 또는 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 표적 단백질과 혼합하는 단계; 및 세포 또는 표적 단백질에 결합하는 파지-디스플레이 라이브러리의 구성원을 정제 및/또는 농축시키는 단계를 포함하는, 파지-디스플레이 라이브러리를 패닝하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 파지-디스플레이 라이브러리는 단일쇄 가변 단편(scFv: single-chain variable fragment) 또는 다른 유형의 항체/항체 단편(Fab 등)의 집단을 발현한다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 임의의 유형의 단백질 결합제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 세포 및 표적 단백질은 표적 단백질에 대한 결합 파트너를 확인하기 위해 약물 및 거대분자(단백질, 핵산 및 단백질:핵산 복합체)를 포함하는 다양한 유형의 분자 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 시스템 및 방법은 단일 웰, 여러 서열의 풀, 또는 유전자 서열의 라이브러리에서 표적 단백질의 라이브러리를 발현하는 데 사용된다.
높은 수율로 및/또는 세포 표면에 존재하는 천연 또는 질병 관련 형태의 항원을 발현하는 능력은 종래 기술 방법보다 항체, 항체 단편 및 다른 분자의 더 확실한 발견 및/또는 생성을 가능하게 한다. 이러한 항체, 항체 단편 및 다른 분자는 치료제 및/또는 연구 도구로서 또는 기타 응용 분야에 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 시스템 및 방법은 표적 분자(예를 들어, 당단백질) 상의 특정 글리코실화 패턴에 결합하고/거나 이에 특이적인 항체의 발견에 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 본래 글리코실화된 단백질에 대해 분류되고, 부적절하게 글리코실화된 또는 탈글리코실화된 동족 단백질에 대해 역분류(counter-sorted)된다. 유사하게 말하면, 탈글리코실화 효소를 사용함으로써 항체는 글리코실화화 패턴에 대해 특이적으로 분류될 수 있다. 추가 실시형태에서, 본 개시내용의 세포 및/또는 표적 단백질은 신규 항체 또는 다른 거대분자의 결합 및/또는 기능적 활성을 확인하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 조성물, 시스템 및 방법의 사용을 통해 생성된 표적 단백질은 치료제, 진단제 또는 연구 개발을 위해 사용된다. 예시적 적용은 백신, 효소 대체 요법, 호르몬 대체 요법, 항체 요법, 항바이러스 치료, 항미생물 치료, 면역조절제, 치료용 암 백신, 이중특이적 T 세포 관여제, 스크리닝 검정, 진단 검정, 임상 테스트 키트, 약물 발견, 항체 발견 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 장점
본 조성물, 시스템 및 방법은 수많은 장점을 가질 수 있다. 예를 들어, 실시예 11에서 나타낸 바와 같이, 일반적으로 세포사멸을 일으켜서 인간 세포주에서 과발현될 때 검출할 수 없는 수율을 생성하는 인간 NADase는 인핸서 단백질이 이 표적 단백질과 함께 발현 동시 발현되는 경우 20 mg/L 초과의 수율을 생성하도록 안정적으로 발현될 수 있다. 또한, 이 예시적인 방법을 통해 발현된 NADase는 기능적이며(인산염 방출 검증에 의해 나타낸 바와 같이) 낮은 배치 대 배치(batch to batch) 변화를 보여준다.
유사하게는, 일부 실시형태에서, 본 방법, 시스템 및 세포는 발현이 어려운 단백질의 확실한 발현을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 낮은 배치 대 배치 변화를 갖는 단백질의 생성에 관한 것이다. 본 개시내용에 따라 생성된 단백질은 하기 개선 사항 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 정제 태그 융합 없는 정제; 개선된 기능적 활성; 확실한 생성; 일관된 활성; 및 치료 적용에 대한 적합성.
본 개시내용의 세포는 표적 단백질 발현의 측면에서 하기 장점 중 하나 이상을 가질 수 있다: 막 내 표적 막 단백질의 더 높은 농도; 더 느리거나 감소된 표적 단백질 분해; 전체 세포 검정에서 개선된 신호 대 잡음비; 하류 세포 대사에 영향을 주지 않고 표적 단백질 및/또는 인핸서 단백질 발현; 막 결합 막 단백질의 탈감작화에 대한 증가된 안정성; 및 더 높은 표적 단백질 수율. 실시예 1은 세포의 하류 대사에 영향을 주지 않고 인핸서 단백질 발현의 예시적인 예를 제공한다. 실시예 1에 예시된 GPCR은 천연 기질과 상호작용할 수 있었고 시험관 내에서 측정할 수 있는 활성화를 생성할 수 있었다.
본 시스템 및 방법은 일부 실시형태에서 하기 장점 중 하나 이상을 가질 수 있다: 임의의 진핵 세포 유형에 대한 적합성; 표적 단백질 발현 최적화에 대한 감소된 필요성; 및 발현이 어려운 단백질의 확실한 발현.
본원에 개시된 생체 내에서 표적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에서 이러한 목적을 위해 사용되는 표준 방법과 비교하여 우수한 특성을 갖는다. 예를 들어, 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본원에 개시된 방법은 장기간에 걸쳐 표적 단백질의 안정적인 발현을 확보하고 동물 간의 발현 수준의 가변성을 감소시킨다. 이들 특성은 질병의 예방 및 치료에 본원에 개시된 방법의 적용을 가능하게 한다.
시스템
본 개시내용은 하나 이상의 벡터를 포함하는 진핵 세포에서 표적 단백질의 재조합 발현을 위한 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법을 추가로 제공하며, 하나 이상의 벡터는 a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및 b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서: i) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나 ii) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 벡터들(또는 벡터)은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 바이러스 단백질이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 NCT 억제제이다.
NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 2A 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 라이노바이러스 3C 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 코로나바이러스 ORF6 단백질 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 에볼라바이러스 VP24 단백질 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, NCT 억제제는 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 타일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인 L 단백질이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, L 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, L 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스의 L 단백질, 및 사폴드 바이러스 2의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
시스템은 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터를 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 인핸서 단백질을 인코딩하는 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 표적 단백질은 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결되고, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결된 표적 단백질 및 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 전령 RNA의 전사를 위해 구성되고; 여기서, 전령 RNA의 번역은 표적 단백질 및 인핸서 단백질(예를 들어, L 단백질)을 별개의 폴리펩타이드로서 발현시키는 결과를 가져온다.
시스템은 하나의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템은 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단일 벡터를 포함할 수 있다.
시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터; 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 시스템에 포함된 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소에 의한 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다의 전사를 위해 구성된 T7 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시스템에 포함된 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 인핸서 단백질, 예를 들어, L 단백질과 동시 발현될 때 표적 단백질의 개선된 발현을 제공한다. 본원에 사용되는, "표적 단백질의 개선된 발현"은 표적 단백질에 비해 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 증가된 활성, 더 낮은 발현 수준, 증가된 발현 기간, 증가된 안정성, 세포 또는 대상체에서 증가된 검출 기간, 전달의 증가된 균일성, 감소된 분해, 및 감소된 EC50.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 세포 또는 대상체에서 표적 단백질의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 낮춘다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 활성 표적 단백질이 세포 또는 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시킨다.
변동 계수(CV%)는 표적 단백질 발현의 균일성의 척도로 제공되며, 진단 모이어티(예를 들어, 형광단 또는 방사성 표지) 신호의 표준 편차를 신호 평균으로 나눈 값으로 정의된다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 조직 또는 대상체에서 표적 단백질의 발현의 균일성을 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 최대 반응의 50%(EC50)를 생성하는 데 효과적인 표적 단백질의 농도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 아달리무맙이고 반응은 세포 또는 대상체에서 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)의 중화이다. 일부 실시형태에서, 아달리무맙의 EC50은 세포 또는 대상체에서 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질 예를 들어, L 단백질의 아달리무맙 단백질과의 동시 발현은 하기로부터 선택된 질병의 치료를 개선시킨다: 류마티스 관절염, 청소년 특발성 관절염(JIA: Juvenile Idiopathic Arthritis), 건선성 관절염(PsA: Psoriatic Arthritis), 강직성 척추염(AS: Ankylosing Spondylitis), 크론병(CD: Crohn's Disease), 궤양성 대장염(CD: Ulcerative Colitis), 판상 건선(Ps: Plaque Psoriasis), 화농성 한선염(HS: Hidradenitis Suppurativa) 및 포도막염(UV: Uveitis). 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 바와 같은 아달리무맙과 인핸서 단백질의 동시 발현은 앞서 언급된 질환의 치료를 인핸서 단백질의 동시 발현이 없는 아달리무맙 치료에 비해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 개선시킨다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질, 예를 들어 L 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 발현을 개선시키며, 여기서 표적 단백질은 아달리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트라스투주맙, 베바시주맙, 우스테키누맙, 오크렐리주맙, 세쿠키누맙, 베돌리주맙, 이발리주맙, 니르세비맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 카시리비맙, 임데비맙, 및 브롤루시주맙을 포함하는(또한 표 8 참조) 군으로부터 선택되는 항체이다.
[표 8]
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질, 예를 들어 L 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 발현을 개선시키며, 여기서 표적 단백질은 rFIX-Fc 응고 인자 IX, 탈리글루세라제, 아갈시다제 베타, 알글루코시다제 알파, 라로니다제, 이두설파제, HLA 클래스 I 알파 사슬(마우스 K2-D1) & B2m(마우스), Nlrc5(마우스), NLRC5(인간), scIL-12 (마우스), scIL-12(인간), 및 HLA 클래스 I 알파 사슬(인간) 및 B2M(인간)을 포함하는(또한 표 9 참조) 군으로부터 선택되는 혈액 단백질 또는 면역 종양학 단백질이다.
[표 9]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질, 예를 들어, L 단백질과 서열번호 191 내지 216의 폴리뉴클레오타이드의 세트와의 동시 발현은 표 8 또는 9로부터의 항체 또는 표적 단백질의 발현을 개선하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 아달리무맙 대신에 발현된다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질, 예를 들어, L 단백질과 서열번호 243 내지 272(AAV 벡터)의 폴리뉴클레오타이드의 세트와의 동시 발현은 표 8 또는 9로부터의 항체 또는 표적 단백질의 발현을 개선하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 아달리무맙 대신에 발현된다.
예시적인 실시형태
실시형태 I
실시형태 I-1. 하나 이상의 벡터를 포함하는 진핵 세포에서 표적 단백질의 재조합 발현을 위한 시스템으로서, 하나 이상의 벡터는:
a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
i) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
ii) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며,
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시형태 I-2. 실시형태 I-1에 있어서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제인, 시스템.
실시형태 I-3. 실시형태 I-2에 있어서, NCT 억제제는 바이러스 단백질인, 시스템.
실시형태 I-4. 실시형태 1-1 내지 실시형태 1-3 중 어느 하나에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
실시형태 I-5. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-6. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 2A 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-7. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 라이노바이러스 3C 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-8. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 코로나바이러스 ORF6 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-9. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 에볼라바이러스 VP24 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-10. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-11. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-12. 실시형태 I-4에 있어서, NCT 억제제는 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-13. 실시형태 I-5에 있어서, L 단백질은 타일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-14. 실시형태 I-5에 있어서, L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 공유하는, 시스템.
실시형태 I-15. 실시형태 I-5에 있어서, L 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 시스템.
실시형태 I-16. 실시형태 I-5에 있어서, L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 공유하는, 시스템.
실시형태 I-17. 실시형태 I-5에 있어서, L 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스의 L 단백질, 및 사폴드 바이러스 2의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
실시형태 I-18. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-17 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터를 포함하며, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 시스템.
실시형태 I-19. 실시형태 I-18에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 시스템.
실시형태 I-20. 실시형태 I-18에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 시스템.
실시형태 I-21. 실시형태 I-20에 있어서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 시스템.
실시형태 I-22. 실시형태 I-20에 있어서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 인핸서 단백질을 인코딩하는 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 표적 단백질은 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결되고, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 시스템.
실시형태 I-23. 실시형태 I-18 내지 실시형태 I-22 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결된 표적 단백질 및 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 전령 RNA의 전사를 위해 구성되고; 여기서, 전령 RNA의 번역은 표적 단백질 및 L 단백질을 별개의 폴리펩타이드로서 발현시키는 결과를 가져오는, 시스템.
실시형태 I-24. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-23 중 어느 하나에 있어서, 하나의 벡터를 포함하는 시스템.
실시형태 I-25. 실시형태 I-1 내지 I-17 중 어느 하나에 있어서,
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터; 및
b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 시스템.
실시형태 I-26. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-17, 또는 실시형태 I-25 중 어느 하나에 있어서, 2개의 벡터를 포함하는 시스템.
실시형태 I-27. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-26 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 작동가능하게 연결되는, 시스템.
실시형태 I-28. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-27 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소에 의한 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다의 전사를 위해 구성된 T7 프로모터를 포함하는, 시스템.
실시형태 I-29. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-28 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 시스템.
실시형태 I-30. 진핵 세포에서 목적 단백질의 재조합 발현을 위한 벡터로서:
a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
i) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
ii) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고,
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시형태 I-31. 실시형태 I-30에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 벡터.
실시형태 I-32. 실시형태 I-30에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 벡터.
실시형태 I-32.1 실시형태 I-30에 있어서, 서열번호 100과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
실시형태 I-32.2 실시형태 I-30에 있어서, 서열번호 132를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 133을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시형태 I-32.3 실시형태 I-30에 있어서, 서열번호 134의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열번호 135를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시형태 I-33. 인핸서 단백질을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 표적 단백질의 발현을 위한 진핵 세포로서:
a) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
b) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고,
외인성 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 세포.
실시형태 I-34. 실시형태 I-33에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 작동가능하게 연결되는, 세포.
실시형태 I-35. 실시형태 I-33 또는 실시형태 I-34에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터인, 세포.
실시형태 I-36. 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 재조합 발현 방법.
실시형태 I-37. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 시스템 또는 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 재조합 발현 방법.
실시형태 I-38. 실시형태 I-36 또는 실시형태 I-37에 있어서, 표적 단백질은 막 단백질인, 방법.
실시형태 I-39. 실시형태 I-38에 있어서, 세포막에 대한 막 단백질의 국소화는 인핸서 단백질 없이 막 단백질이 발현될 때 관찰되는 국소화와 비교하여 증가되는, 방법.
실시형태 I-40. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 시스템 또는 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터를 진핵 세포 내로 도입하여 생성된 세포.
실시형태 I-41. 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 시스템 또는 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터를 진핵 세포 내로 도입하여 발현된 표적 단백질.
실시형태 I-42. 프로모터에 작동가능하게 연결된, 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서,
방법은 표적 단백질의 발현 수준, 용해도 및/또는 활성을 향상시키기 위해 인핸서 단백질의 동시 발현을 활용하며,
여기서,
a) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
b) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태 I-43. 실시형태 I-42에 있어서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 프로모터에 작동가능하게 연결된 인핸서 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는. 방법.
실시형태 I-44. 실시형태 I-42 또는 실시형태 I-43에 있어서, 도입하는 단계 또는 단계들은 하나 이상의 DNA 분자를 사용한 진핵 세포의 형질감염, 단일 바이러스 벡터를 사용한 진핵 세포의 형질도입, 및/또는 2개 이상의 바이러스 벡터를 사용한 진핵 세포의 형질도입을 포함하는, 방법.
실시형태 I-45. 표적 단백질은 가용성 단백질인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-46. 표적 단백질은 분비 단백질인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-47. 표적 단백질은 막 단백질인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-48. 표적 단백질은 도파민 수용체 1(DRD1)인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-49. 표적 단백질은 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR)인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-50. 표적 단백질은 C1 에스테라제 억제제(C1-Inh)인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-51. 표적 단백질은 IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK)인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-52. 표적 단백질은 NADase인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 또는 실시형태 I-36 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-53. 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 실시형태 I-40의 세포, 또는 실시형태 I-41의 표적 단백질로 대상체를 면역화시키는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 대한 항체를 생성하는 방법.
실시형태 I-54. 실시형태 I-53에 있어서, 표적 단백질에 특이적인 면역글로불린 단백질을 발현하는 하나 이상의 면역 세포를 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
실시형태 I-55. 실시형태 I-53 또는 실시형태 I-54에 있어서, 하나 이상의 면역 세포로부터 하나 이상의 하이브리도마를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 I-56. 실시형태 I-53 내지 실시형태 I-55 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 면역 세포로부터 하나 이상의 면역글로불린 유전자를 클로닝하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 I-57. 세포 분류에 의한 항체 발견 방법으로서,
a) 세포 또는 표적 단백질은 표지되는, 실시형태 I-33 내지 실시형태 I-35 중 어느 하나의 세포, 실시형태 I-40의 세포, 또는 실시형태 I-41의 표적 단백질, 및
b) 각각 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 발현하는 재조합 세포의 집단을 포함하는 단계; 및
표지된 세포 또는 표지된 표적 단백질에 결합된 재조합 세포를 분류하여 용액으로부터 하나 이상의 재조합 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 I-58. 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 방법으로서,
a) 파지-디스플레이 라이브러리를 실시형태 I-33 내지 I-35 중 어느 하나의 세포, 실시 형태 I-40의 세포, 또는 실시 형태 I-41의 표적 단백질과 혼합하는 단계; 및
b) 세포 또는 표적 단백질에 결합하는 파지-디스플레이 라이브러리의 구성원을 정제 및/또는 농축하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 I-59. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 하나 이상의 벡터는:
a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
i) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
ii) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며,
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시형태 I-60. 실시형태 I-59에 있어서, 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제인, 방법.
실시형태 I-61. 실시형태 I-60에 있어서, NCT 억제제는 바이러스 단백질인, 방법.
실시형태 I-62. 실시형태 1-59 내지 실시형태 1-61 중 어느 하나에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 I-63. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-64. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 피코르나바이러스 2A 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-65. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 라이노바이러스 3C 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-66. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 코로나바이러스 ORF6 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-67. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 에볼라바이러스 VP24 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-68. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-69. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-70. 실시형태 I-62에 있어서, NCT 억제제는 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-71. 실시형태 I-63에 있어서, L 단백질은 타일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-72. 실시형태 I-63에 있어서, L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 공유하는, 방법.
실시형태 I-73. 실시형태 I-63에 있어서, L 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
실시형태 I-74. 실시형태 I-63에 있어서, L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 공유하는, 방법.
실시형태 I-75. 실시형태 I-63에 있어서, L 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스의 L 단백질, 및 사폴드 바이러스 2의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 I-76. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-75 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터를 포함하며, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
실시형태 I-77. 실시형태 I-76에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-78. 실시형태 I-76에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-79. 실시형태 I-78에 있어서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
실시형태 I-80. 실시형태 I-78에 있어서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 인핸서 단백질을 인코딩하는 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 표적 단백질은 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결되고, 코딩 폴리뉴클레오타이드는 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
실시형태 I-81. 실시형태 I-76 내지 실시형태 I-80 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결된 표적 단백질 및 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 전령 RNA의 전사를 위해 구성되고; 여기서, 전령 RNA의 번역은 표적 단백질 및 L 단백질을 별개의 폴리펩타이드로서 발현시키는 결과를 가져오는, 방법.
실시형태 I-82. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-75 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 하나의 벡터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-83. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-75 중 어느 하나에 있어서, 시스템은
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터; 및
b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-84. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-75 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 2개의 벡터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-85. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-84 중 어느 하나에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 작동가능하게 연결되는, 방법.
실시형태 I-86. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-85 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소에 의한 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 제2 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다의 전사를 위해 구성된 T7 프로모터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-87. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-86 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 I-88. 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 벡터는:
a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
i) 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
ii) 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고,
제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시형태 I-89. 실시형태 I-88에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-90. 실시형태 I-88에 있어서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 방법.
실시형태 I-91. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-90 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 치료 단백질인, 방법.
실시형태 I-92. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-91 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 면역원성 단백질인, 방법.
실시형태 I-93. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-92 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 항체, 나노바디, 수용체, 이중특이적 T 세포 관여제(BiTE), 성장 인자, 호르몬, 효소, 면역조절 단백질, 항원, 구조 단백질, 혈액 단백질, 항미생물 폴리펩타이드, 항바이러스 폴리펩타이드, 종양 억제인자, 전사 인자, 또는 번역 인자인, 방법.
실시형태 I-94. 실시형태 I-93에 있어서, 표적 단백질은 항체인, 방법.
실시형태 I-95. 실시형태 I-93에 있어서, 표적 단백질은 혈액 단백질인, 방법.
실시형태 I-96. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-95 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체에서 면역 반응을 이끌어내는, 방법.
실시형태 I-97. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-96 중 어느 하나에 있어서, 방법은 대상체의 질병을 치료하며, 질병은 표적 단백질에 의해 유발되거나, 관련되거나, 연관되는, 방법.
실시형태 I-98. 실시형태 I-97에 있어서, 방법은 대상체의 질병을 치료하며, 대상체에서의 표적 단백질의 발현 수준은 대조군 대상체에서의 표적 단백질의 발현 수준보다 낮고, 대조군 대상체는 질병을 갖지 않는, 방법.
실시형태 I-99. 실시형태 I-59 내지 실시형태 I-98 중 어느 하나에 있어서, 표적 단백질은 압식시맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아미반타맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 부로수맙, 카나키누맙, 카플라시주맙, 카프로맙, 카투막소맙, 세미플리맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 크리잔리주맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 더발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에마팔루맙, 에미시주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엡티네주맙, 에레누맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에볼로쿠맙, 프레마네주맙, 갈카네주맙, 젬투주맙 오조가미신, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 임시로맙, 인플릭시맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 라나델루맙, 로키베트맙, 메폴리주맙, 모가물리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 폴라투주맙 베도틴, 라코투모맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 라불리주맙, 레슬리주맙, 리산키주맙, 리툭시맙, Rmab, 로모소주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 탈케타맙, 테클리스타맙, 테프로투무맙, 틸드라키주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 듀오카마진, 트라스투주맙 엠탄신, 우스테키누맙 및 베돌리주맙, 블리나투모맙, 에미시주맙, 솔리토맙, 애드넥틴, 안티칼린, 아비머, 피노머, 쿠니츠 도메인, 노틴, 아피바디, DARPin, 혈전용해제, 트랜스페린, t-PA, 히루딘, C1 에스테라제 억제제, 항트롬빈, 혈장 칼리크레인 억제제, 플라스민, 프로트롬빈 복합체, 보체 성분, 프리알부민(트랜스티레틴), 알파 1 항트립신, 알파-1-산 당단백질, 알파-1-태아단백질, 알파2-마크로글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 마이크로글로불린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C 반응성 단백질(CRP), 지질단백질(킬로미크론, VLDL, LDL, HDL), 트랜스페린, 프로트롬빈, 만노스 결합 렉틴(MBL), 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 조절 인자 및 응고 인자, 예를 들어, 인자 I, 인자 II, 인자 III, 인자 IV, 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 프리칼리크레인, 피츠제럴드 인자, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조 인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2, 암 응혈원, EPO, IGF-1, G-CSF, GM-GCF, BMP-2, BMP-7, KGF, PDGF-BB, TMP, 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태형성 단백질(BMPs), 섬모 신경영양 인자 패밀리, 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6), 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 표피 성장 인자(EGF), 에프린스 - 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3, 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장인자(FGF) 1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23의 각각, 소 태아 성장 호르몬(FBS), 리간드의 GDNF 패밀리, 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀, 아르테민, 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자-2(IGF-2), 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 각질세포 성장 인자(KGF), 이동 자극 인자(MSF), 간세포 성장 인자 유사 단백질(HGFLP)로도 알려진 대식세포 자극 단백질(MSP), 미오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린 1(NRG1) 뉴레귤린 2(NRG2), 뉴레귤린 3(NRG3), 뉴레귤린 4(NRG4), 뉴로트로핀, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 태반성장인자(PGF), 혈소판유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS), T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), Wnt 신호전달 경로, 글루카곤 유사 펩타이드-1, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 난포 자극 호르몬, 칼시토닌, 루트로핀, 글루카곤 유사 펩타이드-2, 렙틴, 부갑상선 호르몬, 융모성 생식선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 및 글루카곤, 알파-글리코시다제, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-황산염, 알파-갈락토시다제, 요산염 산화효소, N-아세틸-갈락토시다제, 카르복시펩티다제, 히알루로니다제, DNA 분해효소, 아스파라기나제, 요산분해효소, 아데노신 데아미나제 및 다른 엔테로키나제, 사이클라제, 카스파제, 카텝신, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 분해효소, 이성질화효소 및 연결효소, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 이미글루세라제, 탈리굴세라제 알파, 벨라글루세라제 알파, 알글루세라제, 세벨리파제 알파, 라로니다제, 이두설파제, 엘로설파제 알파, 갈설파제, 알글루코시다제 알파, C3 억제제, 헐러 및 헌터 교정 인자, 이온 채널, 간극 연접, 이온성 수용체, 수송체, 세포 표면 수용체, 도파민 수용체 1(DRD1), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR), C1 에스테라제 억제제(C1-Inh), IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK), 및 NADase로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 I-100. 표적 단백질은 항체인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 시스템, 실시형태 I-30 내지 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 I-35 중 어느 하나의 진핵 세포, 실시형태 I-36 내지 I-39 중 어느 하나의 방법, 실시형태 I-40의 세포, 실시형태 I-41의 표적 단백질, 실시형태 I-42 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법, 실시형태 I-45 내지 I-52 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-53 내지 실시형태 I-93 및 실시형태 I-96 내지 실시형태 I-98 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-101. 표적 단백질은 아달리무맙인, 실시형태 I-1 내지 실시형태 I-29 중 어느 하나의 시스템, 실시형태 I-30 내지 I-32 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 I-33 내지 I-35 중 어느 하나의 진핵 세포, 실시형태 I-36 내지 I-39 중 어느 하나의 방법, 실시형태 I-40의 세포, 실시형태 I-41의 표적 단백질, 실시형태 I-42 내지 실시형태 I-44 중 어느 하나의 방법, 실시형태 I-45 내지 I-52 중 어느 하나의 벡터 시스템, 실시형태 I-53 내지 실시형태 I-93 및 실시형태 I-96 내지 실시형태 I-98 중 어느 하나의 방법.
실시형태 I-102. 실시형태 I-101에 있어서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 132의 아미노산 서열을 갖는, 시스템, 벡터, 벡터 시스템, 진핵 세포, 방법, 세포, 또는 표적 단백질.
실시형태 I-103. 실시형태 I-101 또는 실시형태 I-102에 있어서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는, 시스템, 벡터, 벡터 시스템, 진핵 세포, 방법, 세포, 또는 표적 단백질.
실시형태 I-104. 실시형태 I-101 내지 실시형태 I-103 중 어느 하나에 있어서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 134의 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 시스템, 벡터, 벡터 시스템, 진핵 세포, 방법, 세포, 또는 표적 단백질.
실시형태 I-105. 실시형태 I-101 내지 실시형태 I-104 중 어느 하나에 있어서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 135의 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 시스템, 벡터, 벡터 시스템, 진핵 세포, 방법, 세포, 또는 표적 단백질.
실시형태 I-106. 실시형태 I-88 내지 실시형태 I-99 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질은 표적 단백질의 활성을 증가시키는, 방법.
실시형태 I-107. 실시형태 I-88 내지 실시형태 I-99 및 실시형태 I-106 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질은 표적 단백질의 발현 수준을 낮추는, 방법.
실시형태 I-108. 실시형태 I-88 내지 실시형태 I-99 및 실시형태 I-106 및 실시형태 I-107 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질은 생체 내에서 표적 단백질의 발현의 균일성을 증가시키는, 방법.
실시형태 I-109. 실시형태 I-88 내지 실시형태 I-99 및 실시형태 I-106 및 실시형태 I-107 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질은 세포 또는 유기체에서 활성 표적 단백질의 지속 기간을 증가시키는, 방법.
실시형태 I-110. 실시형태 I-30 내지 실시형태 I-32 중 어느 하나의 벡터 및 하나 이상의 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
실시형태 I-111. 리더 단백질 및 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-112. 실시형태 I-111에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 리더 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-113. 실시형태 I-111 또는 실시형태 I-112에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 124의 아달리무맙 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 129의 아달리무맙 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-114. 실시형태 I-111 내지 실시형태 I-113 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 세포 또는 대상체에서 아달리무맙 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-120. 실시형태 I-111에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 191 내지 216의 세트의 서열 또는 서열번호 217 내지 242의 세트의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-121. 실시형태 I-111의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시형태 I-122. 실시형태 I-121에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV: Adeno-Associated Viral) 벡터인, 벡터.
실시형태 I-123. 실시형태 I-121의 전달 플라스미드 및 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시스템.
실시형태 I-124. 실시형태 I-120의 벡터를 포함하는 지질 나노입자(LNP).
실시형태 I-125. 실시형태 I-123에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-126. 실시형태 I-123에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-127. 실시형태 I-123에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, LNP.
실시형태 I-128. 실시형태 I-122의 시스템 및/또는 실시형태 I-123 내지 실시형태 I-126 중 어느 하나의 LNP를 전달하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법.
실시형태 I-129. 실시형태 I-127에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 I-130. 리더 단백질 및 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-131. 실시형태 I-130에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 리더 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-132. 실시형태 I-130 또는 실시형태 I-131에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 406의 GBA 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-139. 실시형태 I-130의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시형태 I-140. 실시형태 I-139에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 벡터.
실시형태 I-141. 실시형태 I-140의 전달 플라스미드 및 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시스템.
실시형태 I-142. 실시형태 I-139의 벡터를 포함하는 지질 나노입자(LNP).
실시형태 I-143. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-144. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-145. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, LNP.
실시형태 I-146. 실시형태 I-141의 시스템 및/또는 실시형태 I-142 내지 실시형태 I-145 중 어느 하나의 LNP를 전달하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법.
실시형태 I-147. 실시형태 I-146에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 I-148. 리더 단백질 및 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-149. 실시형태 I-130에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 리더 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-150. 실시형태 I-130 또는 실시형태 I-131에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 124, 129, 374 내지 405 및/또는 서열번호 406 내지 422 중 어느 하나의 표적 단백질 아미노산 서열, 및/또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
실시형태 I-157. 실시형태 I-130의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시형태 I-158. 실시형태 I-139에 있어서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 벡터.
실시형태 I-159. 실시형태 I-140의 전달 플라스미드 및 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 시스템.
실시형태 I-160. 실시형태 I-139의 벡터를 포함하는 지질 나노입자(LNP).
실시형태 I-161. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-162. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, LNP.
실시형태 I-163. 실시형태 I-142에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, LNP.
실시형태 I-164. 실시형태 I-141의 시스템 및/또는 실시형태 I-142 내지 실시형태 I-145 중 어느 하나의 LNP를 전달하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법.
실시형태 I-165. 실시형태 I-146에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 II
실시형태 II-52. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 아달리무맙 단백질을 발현시키는 방법으로서, 하나 이상의 벡터는:
a) 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 L 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 아달리무맙 단백질과 L 단백질은 동시 발현된다.
실시형태 II-53. 실시형태 I-52에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 124의 아달리무맙 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 129의 아달리무맙 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 II-54. 실시형태 II-52 및 실시형태 II-53 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 세포 또는 대상체에서 아달리무맙 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-55. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-54 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 대상체의 세포 또는 대상체에서 아달리무맙 단백질의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-56. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-55 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 아달리무맙 단백질이 대상체의 세포 또는 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-57. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-56 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 대상체의 조직 또는 대상체에서 표적 단백질의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-58. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-57 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-59. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-58 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 아달리무맙의 EC50을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-60. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-59 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 서열번호 191 내지 216의 세트의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 217 내지 242의 세트의 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 II-61. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-60 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
실시형태 II-62. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-61 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
실시형태 II-63. 실시형태 II-62에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-64. 실시형태 II-62에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-65. 실시형태 II-62에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
실시형태 II-66. 실시형태 II-52 내지 실시형태 II-65 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 II-67. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 발현시키는 방법으로서, 하나 이상의 벡터는:
a) 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 L 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; GBA 단백질과 L 단백질은 동시 발현된다.
실시형태 II-68. 실시형태 II-67에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 406의 GBA 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 II-69. 실시형태 II-67 및 실시형태 II-68 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 GBA 단백질의 동시 발현은 대상체의 세포 또는 대상체에서 GBA 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-70. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-69 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 GBA 단백질의 동시 발현은 대상체의 세포 또는 대상체에서 GBA의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-71. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-70 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 GBA 단백질의 동시 발현은 GBA가 대상체의 세포 또는 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-72. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-71 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질의 동시 발현은 대상체의 조직 또는 대상체에서 GBA의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-73. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-72 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 GBA 단백질의 동시 발현은 GBA의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-74. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-73 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 GBA 단백질의 동시 발현은 최대 반응의 50%(EC50)를 생성하는 데 효과적인 GBA의 농도를 감소시키는, 방법.
실시형태 II-75. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-74 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
실시형태 II-76. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-75 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
실시형태 II-77. 실시형태 II-76에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-78. 실시형태 II-76에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-79. 실시형태 II-76에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
실시형태 II-80. 실시형태 II-67 내지 실시형태 II-79 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 II-81. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 하나 이상의 벡터는:
a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 L 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 표적 단백질과 L 단백질은 동시 발현된다.
실시형태 II-82. 실시형태 II-81에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 8의 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 표 8의 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 II-83. 실시형태 II-81에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 9의 단백질 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
실시형태 II-84. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-83 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 세포 또는 대상체에서 표적 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-85. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-84 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 대상체의 세포 또는 대상체에서 표적 단백질의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-86. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-85 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 표적 단백질이 대상체의 세포 또는 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-87. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-85 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 대상체의 조직 또는 대상체에서 표적 단백질의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
실시형태 II-88. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-87 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 표적 단백질의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-89. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-88 중 어느 하나에 있어서, 리더 단백질과 표적 단백질의 동시 발현은 표적의 EC50을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
실시형태 II-90. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-89 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
실시형태 II-91. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-90 중 어느 하나에 있어서, 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
실시형태 II-92. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-91 중 어느 하나에 있어서, LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-93. 실시형태 II-92에 있어서, LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
실시형태 II-94. 실시형태 II-92에 있어서, LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
실시형태 II-95. 실시형태 II-81 내지 실시형태 II-94 중 어느 하나에 있어서, 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
실시형태 II-96. 임의의 선행하는 실시형태에 따른 방법에 사용하기 위한 벡터 시스템.
실시예
시험관 내 연구를 위한 재료 및 방법
DNA 분자의 구성
모든 어셈블리는 높은 카피수 복제 원점(ColE1)을 제어하는 프로모터에 이어 터미네이터(rrnB T1 및 T2 터미네이터)를 포함하는 E. 콜라이(E. coli)에서 증식할 수 있는 플라스미드 백본으로 만들어졌다. 그 다음에는 제2 터미네이터(파지 람다로부터의 전사 터미네이터)에 의해 벡터의 나머지 부분으로부터 단리되는 항생제 내성 유전자를 제어하는 프로모터가 이어진다. 백본의 요소를 포함하는 유전자는 포스포라미다이트 화학으로 합성되었다.
플라스미드의 구성에 사용된 구조 유전자는 포스포라미다이트 화학, 화학에 의해 합성되고, 증폭 및 표 2에 나열된 프라이머를 사용하여 NEB HI-FI 또는 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)와 같은 등온 조립 반응을 사용하여 상기 기재된 벡터로 클로닝되었다. 이들 실시예에 사용된 예시적인 작제물에 포함된 선택된 아미노산 서열이 표 3에 제공되어 있다.
[표 2]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 3]
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
세포주 - 배양 및 형질감염
HEK293 세포는 인간 진핵 세포에서 본 시스템, 방법 및 조성물의 적용을 설명하기 위해 사용되었다. HEK293 부착 세포(CLS)를 10% 소 태아 혈청(Gibco) 및 50,000 U Pen 연쇄상 구균(Gibco)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 배지 고포도당(Gibco)에서 배양하였다. HEK293 세포를 제조업체의 지침에 따라 293 펙틴(ThermoFisher)을 사용하여 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 80% 컨플루언시까지 성장시켰다. 0.5% 트립신 용액을 사용하여 37℃에서 5분 동안 세포를 탈착하고 긁어내어 48시간 후에 단백질 발현 세포를 수확하였다. 세포를 펠릿화하고(5,000 × g, 15분, 4℃) 상청액을 폐기하였다. 세포 펠릿은 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다.
CHO-K1 세포는 진핵 동물 세포에서 본 시스템, 방법 및 조성물의 적용을 설명하기 위해 사용된다. CHO-K1 부착 세포(CLS)를 10% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 F-12K 배지(ATCC)에서 배양한다. CHO-K1 세포를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 LTX(ThermoFisher)를 사용하여 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 80% 컨플루언시까지 성장시킨다. 0.5% 트립신 용액을 사용하여 37℃에서 5분 동안 세포를 탈착하고 긁어내어 48시간 후에 단백질 발현 세포를 수확한다. 세포를 펠릿화하고(5,000 × g, 15분, 4℃) 상청액을 폐기한다. 세포 펠릿은 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장한다.
SF9 세포는 진핵 곤충 세포에서 본 시스템, 방법 및 조성물의 적용을 설명하기 위해 사용된다. SF9 현탁 세포(CLS)를 10% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 Grace's 곤충 배지(ThermoFisher)에서 배양한다. SF9 세포를 제조업체의 지침에 따라 Cellfectin II(ThermoFisher)를 사용하여 일시적으로 형질감염시키기 전에 26℃ 및 130 rpm에서 성장시킨다. 단백질 발현 세포를 48시간(5,000 × g, 15분, 4℃) 후에 수확하고 상청액을 폐기한다. 세포 펠릿은 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장한다.
실시예 1: GFP를 이용한 L 인핸서 단백질의 발현은 GFP 단백질의 과발현을 감소시켰다.
CMV 프로모터 시스템
발현 동안 바이러스 핵 기공 차단 단백질의 도입의 영향을 입증하기 위해, HEK293 세포를 EG1, EG2로 형질감염시키거나 EG3 및 EG4 작제물로 공동 형질감염시켰다(작제물 세부사항에 대해서는 표 2 및 도 2 참조). 바이러스 기공 차단 단백질의 발현은 단백질 발현의 제어된 조절을 가져오게 되었다. 결과적으로, 수득된 GFP 신호는 감소되었다. 기공 차단 단백질과 함께 관심 대상 유전자의 제어된 조절에 대한 이유는 바이러스 단백질의 작용 방식 때문이다. 이론에 구애됨이 없이, 단백질 조절에 대한 가능한 메커니즘은 기공 차단 단백질을 발현함으로써 mRNA의 핵 외 수송이 억제될 수 있고 결과적으로 표적 단백질의 번역이 하향조절된다는 것이다. 안정화된 후에는 기공 차단 단백질이 분해되고 mRNA 수송이 재개될 것이다. 이는 다시 표적 단백질과 인핸서 단백질, 예를 들어, 기공 차단 단백질 둘 다의 발현으로 이어진다. 이런 엄격하게 제어되는 피드백은 표적 단백질의 안정화 및 영구적인 발현을 확보하고 단백질 발현을 중단시키는 진핵 세포의 일반적인 조절을 방지한다.
도 3a 내지 도 3d는 본 개시내용에 따른 예시적인 인핸서 단백질로서 ECMV로부터의 L-단백질의 부재 및 존재 하에 GFP 발현에 대한 효과를 보여준다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG1 또는 EG2로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링하였다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석하였다. 이 실시예는 본 개시내용에 따른 표적 단백질 폴리뉴클레오타이드 및 인핸서 단백질 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 예시적인 시스템에서 표적 단백질 발현의 개선된 조절을 나타낸다.
T7 중합효소 시스템
EG2는 진핵 숙주의 천연 중합효소를 사용하는 반면, T7과 같은 다른 바이러스 중합효소는 핵 외부에서 전사를 개시하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 중합효소는 표준 진핵 프로모터의 제어를 받으며 대응 mRNA는 핵 외 수송에 따라 달라질 것이다. 세포질에서 바이러스 중합효소는 번역된 다음 표적 단백질 폴리뉴클레오타이드와 인핸서 단백질 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 발현의 결과로, 바이러스 중합효소의 핵 수송이 감소할 것이다. 시스템이 안정화되면 인핸서 단백질의 분해로 이어지고 바이러스 중합효소의 mRNA 수송이 재개될 것이다. 이론에 구애됨이 없이, 이러한 피드백은 재조합 단백질을 과발현하는 동안 세포의 일반적인 조절을 방지할 수 있다. 일부 상황에서, 바이러스 중합효소를 사용하면 진핵 중합효소를 사용하는 시스템과 비교하여 세포 대 세포 기준으로 더 높은 발현 수준을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
도 4a 내지 도 4d는 T7 보유 벡터로 공동 형질감염될 때 T7 프로모터로부터의 ECMV로부터의 L 단백질과 함께 GFP의 성공적인 발현을 보여준다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG1 또는 EG3 및 EG4로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링하였다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석하였다. 이 실시예는 표적 단백질로서 GFP 및 인핸서 단백질로서 ECMV의 L-단백질과 함께 예시적인 바이러스 중합효소로 T7을 성공적으로 사용했음을 나타낸다. 상기 실시예와 유사하게, L-단백질의 도입으로 인해 발현이 더욱 엄격하게 조절되어 과발현이 전반적으로 감소했다.
실시예 2: L 인핸서 단백질과 DRD1-GFP의 동시 발현은 DRD1 막 단백질의 발현 및 국소화를 개선시켰다.
DRD1은 고밀도의 활성 막 수용체를 생성하기 위해 인핸서 단백질로서 기공 차단 단백질과 조합하여 표적 단백질로서 막 단백질의 동시 발현에 개시된 시스템 및 방법의 적용을 설명하기 위해 사용되었다. DRD1은 G-단백질 결합 수용체이며 학술 표준(academic standards)으로는 표현하기 어려운 것으로 알려져 있다. 세포의 외막으로의 정확한 전위를 시각화하기 위해 DRD1-GFP 융합체(EG8)가 본 시스템에서 사용되었다. 학술 및 산업 환경에서 GPCR의 문제를 설명하기 위해 학술 표준(EG10)을 대조군으로 사용하였다.
개선된 막 단백질 발현 및 막 국소화
DRD1-GFP 융합체는 HEK293 세포에서 발현되었다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG10 또는 EG8로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. DRD1-GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링하였다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석하였다.
도 5a 내지 도 5d는 EG10이 발현된 수용체를 정확하게 전위시키지 못함을 나타낸다. 이론에 구애됨이 없이, EG10 작제물을 사용하여 인간 세포에서 인간 DRD1 수용체를 과발현한 결과, 세포는 발현된 표적 단백질을 분해하거나 제어하기 시작하는 것으로 여겨진다. 이러한 형태의 조절은 봉입체로서 변성된 단백질을 형성하게 된다(도 5b, 적색 화살표). 이러한 방식으로 세포에 의한 막 단백질의 발현을 제어하면 단백질이 비활성화되고 접힘 오류가 생겨서 결과적으로 사용할 수 없게 되고 품질이 떨어지는 단백질이 발현될 수 있다. 대조적으로, 예시적인 인핸서 단백질과 표적 막 단백질의 동시 발현은 정확하게 전위된 DRD1-GFP를 가져왔으며, 이는 막으로의 정확한 삽입 및 봉입체의 부재로 볼 수 있는 바와 같다(도 5c 및 도 5d). 이 실시예는 예시적인 표적 막 단백질(DRD1)과 연계하여 예시적인 인핸서 단백질(ECMV의 L-단백질)의 동시 발현이 막 단백질의 발현 및 국소화를 개선시켰다는 것을 나타낸다. 이론에 구애됨이 없이, 본 시스템은 표적 단백질 발현의 엄격한 조절을 생성함으로써 발현된 막 단백질을 분해하게 하는 세포의 정상적인 조절을 우회하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 시스템은 GPCR의 고수율 발현 및 정제에 적합하다.
목적 단백질과 인핸서 단백질의 분리된 발현
또한, 인핸서 단백질이 별도의 DNA 분자에 위치할 수 있음을 설명하기 위해 DRD1-GFP(EG10) 작제물을 별도의 벡터에서 별도의 프로모터의 제어 하에 ECMV(EG11)의 L 단백질과 함께 공동 발현된다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG10 및 EG11로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. DRD1-GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링한다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석한다.
막 단백질의 기능적 활성
정확하게 전위된 GPCR의 예시 외에도 DRD1-Strep 융합체를 사용하여 활성 테스트를 수행하였다. 연쇄상 구균-태그가 작을수록 세포질에 위치한 G-단백질과의 정확한 상호작용이 손상되지 않고 기능적 분석이 수행될 수 있음을 보장한다. 도파민의 결합 시, DRD1은 이종삼량체 G-단백질을 이의 Gα 서브유닛과 이의 Gβγ 복합체로 방출한다. 휴면 상태에서, Gα는 GDP를 결합하지만 활성화 시 GTP를 GDP로 교환한다. Gα-GTP 복합체는 아데닐산 사이클라제(AC: adenylase cyclase)와 상호작용하여 AC 활성을 활성화하고 결과적으로 cAMP 수준을 증가시키게 된다. 세포내 cAMP의 변화는 표준 cAMP 검정으로 측정할 수 있다. 다시, 학계 및 산업 표준(EG5)을 ECMV의 L-단백질과 동시 발현하는 동일한 표적 단백질과 비교하였다.
DRD1-연쇄상 구균 융합체는 HEK293 세포에서 발현된다. HEK293 세포를 96 웰 백색 투명 바닥 플레이트에 5,000 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG5 또는 EG6으로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. 단백질은 48시간 동안 발현되고 DRD1 활성은 제조업체의 지침에 따라 cAMP(glo) 검정(Promega)을 사용하여 분석된다. 상세하게는, 48시간 후 세포를 pH 7.2의 멸균 PBS 로 세척하고 세포를 37℃에서 1 mM 내지 1 μM 범위의 20 μl 도파민 기질 농도로 2시간 동안 인큐베이션한다. 유도되지 않은 대조군으로서 세포를 pH 7.2의 20 μl PBS 와 함께 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 pH 7.2의 PBS로 세척하고 20 μl 용해 완충액을 첨가한다. 진탕하면서 실온(RT)에서 15분 동안 용해를 수행한다. 이어서, 40 μl 검출 용액을 첨가하고 세포를 진탕시키면서 RT에서 20분 동안 인큐베이션한다. 분석 전 RT에서 15분 동안 인큐베이션된 80 μl 키나제-Glo 시약을 사용하여 반응을 중지한다. 플레이트 판독기(Synergy LX(BioTek))를 사용하여 발광을 측정하고 표준 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 분석한다.
실시예 3: 핵 외부에서 DRD1-GFP 및 L 인핸서 단백질 작제물의 전사를 개시하는 데 성공적으로 사용되는 T7 바이러스 프로모터.
이 실시예를 위해, DRD1-GFP는 T7 프로모터와 조합하여 표적 막 단백질을 발현하기 어려운 예시로 선택되어 T7과 같은 바이러스 중합효소가 핵 외부에서 전사를 시작하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 실시예 1에서와 같이, 바이러스 중합효소는 표준 진핵 프로모터의 제어를 받았으며 대응 mRNA는 핵 외 수송에 의존하였다.
도 6a 및 도 6b는 T7 보유 벡터로 공동 형질감염될 때 T7 프로모터로부터의 ECMV로부터의 L 단백질과 함께 DRD1-GFP의 성공적인 발현을 보여준다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG10 또는 EG12 및 EG4로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. DRD1-GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링하였다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석하였다. 이 실시예는 표적 단백질로서 DRD1-GFP 및 인핸서 단백질로서 ECMV의 L-단백질과 함께 바이러스 중합효소로 T7을 성공적으로 사용했음을 나타낸다.
실시예 4: DRD1-GFP 및 L 인핸서 단백질의 발현은 상이한 포유동물 프로모터와 상용성이다.
본 개시내용에 따른 시스템, 방법 및 조성물은 매우 다양한 포유동물 프로모터와 상용성이다. 표적 단백질과 상이한 프로모터로부터의 인핸서 단백질의 동시 발현의 상용성을 보여주기 위해, DRD1-GFP가 예시적인 표적 단백질로 사용되었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, DRD1-GFP의 정확한 발현 및 전위를 형광 현미경을 통해 용이하게 검출할 수 있다. CMV 프로모터(EG10) 외에 EF1-α(EG22) 및 SV40(EG23)이 사용된 다음 동일한 DRD1-GFP IRES L 어셈블리가 사용된다.
상이한 포유동물 프로모터의 제어 하에 있는 DRD1-GFP 융합체는 HEK293 세포에서 발현된다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG8, EG22 또는 EG23으로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. DRD1-GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링한다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석한다.
실시예 5: 테스트된 임의의 L 인핸서 단백질을 사용하여 DRD1-GFP 발현 및 국소화를 성공적으로 향상시킬 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, 재조합적으로 삽입된 표적 단백질 폴리뉴클레오타이의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있는 한 가지 메커니즘은 기공 차단 단백질의 도입이다. 천연 또는 합성 기공 차단 단백질이 본 시스템의 한 실시형태에서 세포 조절 제어의 이점을 유지하면서 서로 교환될 수 있음을 보여주기 위해, ECMV(EG10)의 리더 단백질, 타일러 바이러스(EG19)의 리더 단백질, 폴리오바이러스(EG21)의 2A 프로테아제 및 수포성 구내염 바이러스(EG20)의 M 단백질을 예시적인 표적 단백질로 DRD1-GFP와 함께 클로닝하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, DRD1-GFP의 정확한 발현 및 전위를 형광 현미경을 통해 용이하게 검출할 수 있다.
상이한 인핸서 단백질과 함께 DRD1-GFP 융합체가 HEK293 세포에서 발현된다. HEK293 세포를 24웰 플레이트에 0.05 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG8, EG19, EG20 또는 EG21로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. DRD1-GFP 발현을 형광 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링한다. CCD 카메라(Amscope)를 사용하여 이미지를 촬영하고 ISCapture(Amscope)로 분석한다.
실시예 6: L 인핸서 단백질의 발현은 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR)의 발현을 개선시킨다.
CFTR은 인핸서 단백질로서 기공 차단 단백질과 조합하여 표적 단백질로서 막 단백질의 동시 발현이 고밀도 활성 이온 채널을 생성한다는 것을 보여주기 위한 추가적인 실시예로 사용되었다. CFTR은 상피 세포막을 가로질러 염화물 이온을 전도하는 ABC-수송체 클래스의 막횡단 수송체이다. CFTR은 학술 표준을 사용할 때 이질적으로 표현되는 것으로 알려져 있다. 이질성은 ABC 수송체를 정제하거나 분석하는 데 어려움을 증가시킨다. 균질성의 개선을 보여주기 위해, CFTR을 예시적인 시스템(EG25)의 백본에 클로닝하거나 PCR 생성물로 사용하였다. 비교로서, 학술 표준(EG24)을 대조군으로 함께 사용하였다.
CFTR 작제물은 HEK293 세포에서 발현되었다. HEK293 세포를 6웰 플레이트에 0.3 × 106 세포/웰로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG25, EG25의 PCR 생성물, 또는 EG24로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. GFTR 발현을 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링하였다. 세포를 수확하고 RIPA 완충액(CellGene)을 사용하여 48시간 후에 용해시켰다. 용해물을 제거하고 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)에 이어 항-CFTR(Abcam, 2nd 항-마우스-hrp)을 사용하여 웨스턴 블롯(NC 멤브레인, ThermoFisher)으로 분석하였다.
도 6은 L-단백질과 CFTR의 동시 발현의 영향을 보여준다. 학술 표준은 웨스턴 블롯에서 넓은 밴드를 생성한 반면, EG25 작제물을 기반으로 한 전사 및 번역은 ABC-수송체의 매우 동질적인 발현을 보여주는 정의된 밴드를 생성하게 되었다. 또한, 이 실시예는 발현 시스템이 벡터로서 또는 PCR 생성물로서 세포 내로 전달될 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 번역 후 수정이 필요한 예시적인 단백질로서 사용되는 C1 에스테라제 억제제(C1-Inh) 단백질의 생성.
C1-Inh는 발현이 어려운 분비 단백질에 대한 개시된 시스템의 적용을 예시하기 위한 예시적인 표적 단백질로서 사용되어 정확한 번역 후 수정을 생성한다. C1-Inh는 세르핀 수퍼패밀리(serpin superfamily)에 속하는 프로테아제 억제제이다. 분비된 단백질로서 C1-Inh는 고도로 글리코실화되어 있으므로 재조합 발현을 위한 어려운 표적이라는 증거가 된다. 시스템이 정확하게 글리코실화된 C1-Inh를 높은 수율로 생산할 수 있음을 보여주기 위해, C1-Inh-his 융합체가 제시된 시스템(EG16)을 사용하여 발현된다. 비교로서, 학술 및 산업 표준(EG15)이 함께 사용된다.
C1-Inh-his 융합체는 HEK293 세포에서 발현된다. HEK293 세포를 T175 플라스크에 4.9 × 106 세포로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG15 또는 EG16으로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. C1-Inh-his 발현을 현미경을 사용하여 24시간 및 48시간 후에 모니터링한다. 상청액 함유 단백질은 48시간 후에 수집되고 상청액은 여과(22 um, 니트로셀룰로오스)에 의해 제거된다. C1-Inh를 정제하기 위해, His-수지(GE Healthcare HisTrap)를 상층액에 첨가하기 전에 pH 7.5의 20 mM Tris, 50 mM NaCl로 평형화한다. 상등액을 진탕시키면서 4℃에서 2시간 동안 수지와 함께 인큐베이션한다. 수지를 침전시키고 pH 7.5의 5 CV 20 mM Tris, 50 mM NaCl로 세척하고 단백질을 pH 7.5의 3 CV 20 mM, 50 mM NaCl, 500 mM 이미다졸로 용출하였다. 정제는 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석하고 단백질 함유 분획을 모으고 농축한다. 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size-exclusion chromatography)(Superdex 200, ThermoFisher)로 추가로 연마되고 분획은 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석된다. 단백질 함유 분획을 모아 글리코실화 패턴 및 서열 분석에 관한 분석을 위해 보낸다.
실시예 8: 용해되기 어려운 예시적인 단백질로 사용되는 IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK)의 생성.
ITK는 발현이 어려운 가용성 단백질에 대한 개시된 시스템의 적용을 예시하기 위한 예시적인 표적 단백질로서 사용되었다. ITK는 키나제의 TEC 패밀리의 구성원이며 T 세포에서 T 세포 증식 및 분화에 역할을 하는 것으로 여겨진다. 또한, ITK는 배치(batch) 간 효소 활성의 일관성과 본원에 개시된 방법의 확장성을 보여주는 데 사용되었다. ITK는 3 × 10 ml, 100 ml 및 1000 ml 성장 배지에서 발현되었다. 또한, ITK-L-his 단백질 융합 작제물(EG9)을 사용하여 조절을 제어하는 능력을 잃지 않으면서 인핸서 단백질이 재조합적으로 발현된 표적 단백질에 융합될 수 있음을 보여준다. ITK-his 융합체는 제시된 시스템(EG17)과 학술 및 산업 표준(EG18)에서 비교로 표현되었다.
ITK-his 및 ITK-L-his 융합체는 HEK293 세포에서 발현되었다. HEK293 세포를 10 ml, 100 ml 또는 1000 ml Expi293 배지에 2 × 106 세포/ml로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG9, EG17 또는 EG18로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃, 120 rpm 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 48시간(5,000 × g, 15분, 4℃) 후에 수확하였으며, 세포 펠릿을 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. ITK를 정제하기 위해, 세포를 용해 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2, 프로테아제 억제제, DNAse)에 재현탁하고 초음파 처리(2분, 10초 ON, 10초 OFF, 40% 진폭) 및 조세포 추출물을 제거하였다(100,000 × g, 45분, 4℃). His-수지(GE Healthcare HisTrap)를 제거된 용해물에 첨가하기 전에 세척 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2)으로 평형화하였다. 용해물을 진탕하면서 4℃에서 2시간 동안 수지와 함께 인큐베이션하였다. 수지를 침전시키고 5 CV 세척 완충액으로 세척하고 단백질을 3 CV 용출 완충액(세척 완충액 + 300 mM 이미다졸)으로 용출시켰다.
정제는 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석되었다. 도 9a는 ITK의 His-tag 정제의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 레인은 단백질 사다리(Seeblue2 + 사전염색), 500 ng GFP, 2 μg ITK, 5 μg ITK 및 10 μg ITK를 보여준다. 그런 다음 SDS-PAGE 겔을 비(non)-환원 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 1차 마우스-항-His 항체 및 2차 항-마우스-HRP 항체와 결합한 후 NBT/BCIP 용액을 사용하여 시각화하였다. 도 9b는 화살표로 표시된 ITK 단백질 단량체 및 이량체를 사용한, 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여준다.
SDS-PAGE 분석 후, 단백질 함유 분획을 모아서 농축한다. 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(Superdex 200, ThermoFisher)로 추가로 정제되고 분획은 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석된다. 단백질 함유 분획을 모아 인산화 패턴 및 서열 분석에 관한 분석을 위해 보낸다.
ITK 활성은 제조업체의 지침에 따라 ADP-Glo 키나제 분석(Promega)을 사용하여 분석한다. E4Y1을 ITK 기질로 사용한다. ITK 농도는 0.1 내지 500 ng 범위에서 다양하다. 재조합적으로 발현된 ITK의 품질을 표준 이용 가능한 ITK와 비교하기 위해, ITK 키나제 효소 시스템(Promega)을 사용한다. ITK, 기질 및 ATP는 세척 완충액에서 작업 농도로 희석된다. ITK를 기질 및 ATP와 혼합하고 실온(RT)에서 60분 동안 인큐베이션한다. ADP-Glo 시약을 첨가하고 반응을 RT에서 40분 동안 인큐베이션한다. 키나제 검출 시약을 첨가하여 반응을 중단하고 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트 판독기(Synergy LX(BioTek))를 사용하여 발광을 측정하고 표준 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 분석한다.
실시예 9: IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK)의 생성은 CHO-K1 세포와 상용성이었다.
다른 진핵 세포주와 본 시스템의 실시형태의 상용성을 보여주기 위해, HEK293 대신 CHO 세포를 사용하여 실시예 7의 실험을 반복한다. ITK-his는 제시된 시스템(EG17) 또는 산업 및 학술 표준(EG18)에서 발현된다.
ITK-his 융합체는 CHO-K1 세포에서 발현된다. CHO-K1 세포를 2 × 106 세포/ml 100 ml로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG17 또는 EG18로 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃, 120 rpm 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 48시간(5,000 × g, 15분, 4℃) 후에 수확하였으며, 세포 펠릿을 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장한다. ITK를 정제하기 위해, 세포를 용해 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2, 프로테아제 억제제, DNAse)에 재현탁하고 초음파 처리(2분, 10초 ON, 10초 OFF, 40% 진폭) 및 조세포 추출물을 제거한다(100,000 × g, 45분, 4℃). His-수지(GE Healthcare HisTrap)를 제거된 용해물에 첨가하기 전에 세척 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2)으로 평형화한다. 용해물을 진탕하면서 4℃에서 2시간 동안 수지와 함께 인큐베이션한다. 수지를 침전시키고 5 CV 세척 완충액으로 세척하고 단백질을 3 CV 용출 완충액(세척 완충액 + 300 mM 이미다졸)으로 용출시켰다. 정제는 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석하고 단백질 함유 분획을 모으고 농축한다. 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(Superdex 200, ThermoFisher)로 추가로 연마되고 분획은 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석되었다. 단백질 함유 분획을 모아 인산화 패턴 및 서열 분석에 관한 분석을 위해 보낸다.
실시예 10: IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK)의 생성은 Sf9 세포와 상용성이었다.
다른 진핵 세포주와 본 시스템의 상용성을 보여주기 위해, HEK293 대신 Sf9 세포를 사용하여 실시예 7의 실험을 반복한다. ITK-his는 제시된 시스템(EG17) 또는 산업 및 학술 표준(EG18)에서 발현된다.
ITK-his 융합체는 CHO-K1 세포에서 발현된다. CHO-K1 세포를 2 × 106 세포/ml 100 ml로 시딩하고 상기 기재된 바와 같이 EG17 또는 EG18로 일시적으로 형질감염시키기 전에 26℃ 및 130 rpm에서 밤새 인큐베이션한다. 세포를 48시간(5,000 × g, 15분, 4℃) 후에 수확하였으며, 세포 펠릿을 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장한다. ITK를 정제하기 위해, 세포를 용해 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2, 프로테아제 억제제, DNAse)에 재현탁하고 초음파 처리(2분, 10초 ON, 10초 OFF, 40% 진폭) 및 조세포 추출물을 제거한다(100,000 × g, 45분, 4℃). His-수지(GE Healthcare HisTrap)를 제거된 용해물에 첨가하기 전에 세척 완충액(40 mM Tris,7.5; 20 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 50 μM DTT; 및 2 mM MnCl2)으로 평형화한다. 용해물을 진탕하면서 4℃에서 2시간 동안 수지와 함께 인큐베이션한다. 수지를 침전시키고 5 CV 세척 완충액으로 세척하고 단백질을 3 CV 용출 완충액(세척 완충액 + 300 mM 이미다졸)으로 용출시켰다. 정제는 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석하고 단백질 함유 분획을 모으고 농축한다. 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size-exclusion chromatography)(Superdex 200, ThermoFisher)로 추가로 연마되고 분획은 SDS-PAGE(6-12% BOLT, ThermoFisher)로 분석된다. 단백질 함유 분획을 모아 인산화 패턴 및 서열 분석의 분석을 위해 보낸다.
실시예 11: 생체 내 연구의 재료 및 방법
DNA 분자의 구성
모든 어셈블리는 높은 카피수 복제 원점(ColE1)을 제어하는 프로모터에 이어 터미네이터(rrnB T1 및 T2 터미네이터)를 포함하는 E. 콜라이에서 증식할 수 있는 플라스미드 백본으로 만들어졌다. 그 다음에는 제2 터미네이터(파지 람다로부터의 전사 터미네이터)에 의해 벡터의 나머지 부분으로부터 단리되는 항생제 내성 유전자를 제어하는 프로모터가 이어진다. 백본의 요소를 포함하는 유전자는 포스포라미다이트 화학으로 합성되었다.
플라스미드의 구성에 사용된 구조 유전자는 포스포라미다이트 화학에 의해 합성되었고, 3' 영역에 대해서는 GATG, 5' 영역에 대해서는 TAAG에 대한 어셈블리 부위를 갖는 Esp3I 제한을 통해 제한 분해 및 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 상기 기재된 벡터에 클로닝되었다. 도 10 참조.
도 10a에 도시된 작제물을 3'에 대한 어셈블리 부위 GATG 및 5'에 대한 어셈블리 부위 TAAG를 갖는 ESP3I를 사용하여 합성되고 pVax1의 적응된 버전으로 클로닝되어 도 10b에 도시된 플라스미드를 수득하였다.
도 10c에 도시된 작제물을 3'에 대한 어셈블리 부위 GATG 및 5'에 대한 어셈블리 부위 TAAG를 갖는 ESP3I를 사용하여 합성되고 pVax1의 적응된 버전으로 클로닝되어 도 13d에 도시된 플라스미드를 수득하였다.
[표 7]
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
세포주 - 배양 및 형질감염
HEK293 세포는 동물에 주사하기 전에 시험관 내에서 작제물을 검증하는 데 사용되었다. HEK293 부착 세포(CLS)를 10% 소 태아 혈청(Gibco) 및 50,000 U Pen 연쇄상 구균(Gibco)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 배지 고포도당(Gibco)에서 배양하였다. HEK293 세포를 제조업체의 지침에 따라 293 펙틴(ThermoFisher)을 사용하여 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃ 및 5% CO2에서 80% 컨플루언시까지 성장시켰다. 0.5% 트립신 용액을 사용하여 37℃에서 5분 동안 세포를 탈착하고 긁어내어 48시간 후에 단백질 발현 세포를 수확하였다. 세포를 펠릿화하고(5,000 × g, 15분, 4℃) 상청액을 폐기하였다. 세포 펠릿은 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다.
HEK293 현탁액 적응된 세포를 Expi293 무혈청 배지(Gibco)에서 배양하였다. HEK293 세포를 제조업체의 지침에 따라 ExpiFectamin 293(Gibco)을 사용하여 일시적으로 형질감염시키기 전에 37℃, 5% CO2 및 120 rpm에서 3.0 × 10^6 세포/ml로 시딩하였다. 실시예에 따라, 단백질 발현을 위해 세포를 펠렛화(5,000 × g, 15분, 4℃)하여 48시간 내지 72시간 후에 세포를 수확하고 상청액을 폐기하였다. 세포 펠릿은 추가 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 분비된 단백질의 경우, 96시간 후에 상청액을 수집하고 원심분리(5,000 × g, 15분, 4℃)를 통해 제거하였다. 상청액을 추가 분석 또는 정제를 위해 즉시 사용하였다.
동물
동물 연구를 위해, BALB/c 마우스(Charles River Laboratories)와 야생형 마우스를 사용하였다. 대응하는 질병 모델을 또한 사용할 수 있었다. 나이는 실시예에 표시되어 있다. 동일한 성별의 동물을 적절한 침구가 들어 있는 폴리카보네이트 우리에 그룹으로 수용하였다. 꼬리에 눈에 띄는 문신을 하거나 전자 식별 칩을 이식하여 마우스를 식별하였다. 마우스를 실험실 환경에 적응시키기 위해 처리 전 적어도 5일 동안 적응시켰다. 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 기재된 바와 같이 사회적 하우징(housing)과 동물 환경 강화를 위한 씹는 물체를 갖춘 하우징을 설치하였다. 목표 환경 조건은 19 내지 25℃의 온도, 30% 내지 70%의 습도, 및 12시간 밝음과 12시간 어두움의 빛 주기였다. 식품(Lab Diet Certified CR Rodent Diet 5CR4)을 펠릿 형태로 자유롭게 제공하였다. 물을 역삼투압 및 자외선 조사로 처리된 도시 수돗물 형태로 자유롭게 제공하였다.
실시예 12: 루시퍼라제를 이용한 L 인핸서 단백질의 생체 내 발현은 루시퍼라제 발현의 안정성 및 지속 기간을 증가시킨다.
생체 내에서 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 평가하기 위해, 각각 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스 4마리로 구성된 그룹을 사용하였다. 그룹에는 (a) 도 9b에 도시된 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드 또는 (b) 도 9d에 도시된 인핸서 단백질을 갖는 루시퍼라제 서열을 인코딩하는 플라스미드의 25 μg의 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4) 중 50 μl가 피내 주사되었다. 기본 측정을 위해, 4마리의 마우스에게 50 μl PBS만을 피내 주사하였다. 복용량의 부피를 등쪽의 요추 또는 천골 영역의 구분된 면적 내에서 주사기/바늘을 사용하여 투여하였다.
동물을 그룹별로 무작위화하고 체중을 1일에 기록한 다음 연구가 끝날 때까지 격주로 기록하였다. 이상반응(RM, SD, RD)을 적정 실험실 표준(good laboratory standards)에 따라 기록하였다. 1회에 >30% 체중 감소가 관찰되거나 3회 연속 측정에서 >25% 체중 감소가 관찰된 임의의 개별 동물을 안락사시켰다.
루시퍼라제의 발현을 2일(주사 후 24시간), 3일(주사 후 48시간), 4일(주사 후 72시간), 11일, 18일, 25일, 32일, 38일, 53일, 67일에 전체 동물의 생물발광 영상화로 측정하였다. 모든 동물이 안락사되는 연구의 종료점은 67일이었다. 생물발광 이미징을 마취 하에 수행하였다. 루시페린의 기질 주입 후 10분 후에 등쪽 이미지를 촬영하였다. 기질을 최근 체중을 기준으로 10 ml/kg에서 150 mg/kg 복강 내로 투여하였다. 도 11 및 도 12 참조.
이러한 결과는 루시퍼라제가 EMCV의 L1 단백질과 같은 인핸서 단백질과 함께 발현될 때 루시퍼라제의 생체 내 발현이 더 오랫동안 유지된다는 것을 보여준다. 도 10에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서 루시퍼라제의 발현 수준은 처음에는 높았다가 치료 후 30일까지 감소하였다. 대조적으로, L1 단백질과 조합하여 발현될 시 루시퍼라제의 발현 수준은 치료 후 110일까지 더 오랜 기간 동안 일정한 수준으로 유지된다. 즉, L1 단백질과 함께 루시퍼라제가 발현되는 경우 시간에 따른 루시퍼라제 발현 수준의 변화가 적다.
또한, 루시퍼라제 및 L1 단백질을 발현하는 동물 간의 루시퍼라제 발현 수준의 변화는 루시퍼라제만을 발현하는 동물 간에 비해 적다. 이 효과는 특히 53일 시점과 같이 시간이 지남에 따라 뚜렷이 나타난다. FIG. 11 참조. 도 9b의 플라스미드를 주사한 동물 중 25%(4마리 중 1마리)만이 주사 후 53일에 검출 가능한 루시퍼라제 발현을 나타내는 반면에, 도 9d의 플라스미드를 주사한 동물의 100%(3마리 중 3마리)는 53일 시점에서 루시퍼라제 발현을 나타내었다. 따라서, 개시된 방법은 동물 간에 표적 단백질의 발현 수준의 가변성을 감소시켜, 치료제에서 중요한 적용을 갖는 표적 단백질의 발현에 더 많은 재현성을 제공한다.
최종적으로, 도 12는 인핸서 단백질의 존재 하에 루시퍼라제의 발현이 장기간에 걸쳐 보다 더 안정적인 발현을 가져온다는 것을 추가로 보여준다. 루시퍼라제만을 발현하는 대조군 마우스는 며칠 동안 높은 수준의 루시퍼라제를 나타낸 후 발현이 최소한으로 까지 서서히 감소하는 반면, L1 단백질의 존재 하에 루시퍼라제를 발현하는 마우스는 123일 동안 검출 가능하고 안정적인 루시퍼라제 발현을 보여준다. 이 결과는 표적 단백질의 생체 내 발현을 위해 개시된 조성물 및 방법의 우수한 장점을 보여준다.
리포터 유전자 발현의 시간 경과에 따른 유익한 효과가 투여 경로 또는 주사 부위에 특이적이지 않음을 보여주기 위해, 피하 투여를 사용하여 실험을 반복하였다. 즉, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스 4마리로 구성된 그룹을 사용하였다. 그룹에는 도 9a 및 도 9b에 도시된 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드 또는 도 9c 및 도 9d에 도시된 인핸서 단백질을 갖는 루시퍼라제 서열을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여, PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4) 중 30 μg 노출 플라스미드의 200 μl가 피하로 1회 주사되었다. 기본 측정을 위해 4마리의 대조군 마우스에 PBS만을 처리하였다. 용량을 견갑골 사이의 피하 주사로 주사기 바늘을 사용하여 투여하였다.
마우스에게 0일에 투여하였고, 루시퍼라제의 발현을 1일, 2일, 3일, 7일, 15일, 21일, 28일, 35일 및 42일에 동물 몸 전체의 생물발광 영상화로 측정하였다(영상 데이터는 도 19에서 정량화됨). 영상화를 위해, 루시페린(즉, 반딧불이 루시퍼라제의 기질)을 10 ml/kg 부피에서 150 mg/kg의 용량으로 마우스의 복강내(i.p.)에 주사하였다. 마취 하에 기질 투여 후 10분 후에 이미지를 획득하였다. 주사 부위에 초점을 맞추기 위해 마우스를 복위 자세로 이미지화하였다.
도 19는 인핸서 단백질과 조합된 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 플라스미드(Fluc EG) 또는 인핸서 단백질이 없는 동일한 플라스미드(Fluc Std)로 Balb/c 마우스를 피하 처리한 후 반딧불이 루시퍼라제(Fluc)의 생물발광 영상화 결과를 보여준다. 전술한 바와 같이, 인핸서 단백질의 첨가는 리포터 유전자가 기능적으로 발현되는 시간을 증가시킨다. 인핸서 단백질은 실험 기간 전체에 걸쳐 안정적인 발현으로 이어지는 반면, 인핸서 단백질이 없으면, 활성 루시퍼라제 발현의 손실을 며칠 내에 검출할 수 있다. 놀랍게도, 인핸서 단백질의 안정화 효과는 주사 부위와 무관하다. 이 결과는 표적 단백질의 생체 내 발현을 위해 본원에 개시된 조성물 및 방법의 일반적인 적용 가능성을 보여준다.
실시예 13: 아달리무맙을 이용한 L 인핸서 단백질의 발현은 아달리무맙 단백질 품질 및 발현 수준을 개선시킨다
아달리무맙을 인코딩하는 핵산 서열(EG140, 도 13a)을 포함하는 대조군 플라스미드 및 아달리무맙을 인코딩하는 핵산 서열(EG141, 도 13b)과 조합된 인핸서 유전자를 포함하는 플라스미드로부터 아달리무맙이 HEK293T 세포에서 발현되었는지 여부를 테스트하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
0일에, HEK293T 세포를 24-웰 플레이트에 20,000 세포/웰로 시딩하였다. 1일에 성장 배지를 Opti-MEM(웰당 450 ul)으로 변경하였다. 그런 다음 표준 형질감염 절차에 따라 웰당 0.5 ug 플라스미드와 1 ug PEI를 1:2 비율로 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 총 6개의 복제물을 사용하였다. 3일에, 면역형광 현미경을 위한 ELISA 및 세포 고정을 위해 세포 배양 상청액의 상청액을 수집하였다. 500X g에서 5분 동안 수행된 원심분리를 사용하여 남은 세포 잔해를 제거하였다. 그런 다음 투명한 상청액을 새로운 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 피펫팅하고 ELISA로 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
세포를 실온(RT)에서 10분 동안 10% 중성 완충 포르말린을 사용하여 고정시키고, 실온에서 10분 동안 0.2% Triton X-100을 사용하여 투과시켰다. 세포를 DyLight488-표지된 항-인간 항체(IgG Fc Cross-Adsorbed Goat anti-Human, DyLight® 488, Invitrogen - PISA510134 ANTI-HUMAN IGG-FC XMIN D488)를 사용하여 1:500 희석으로 RT에서 1시간 동안 염색하고, 세척하였다. FLoid 형광 현미경을 사용하여 세포를 영상화하였다.
면역형광 결과를 도 14에 제시한다. 결과는 아달리무맙이 HEK293T 세포에서 EG140 및 EG141 플라스미드 둘 다로부터 발현되었음을 보여준다. 두 플라스미드 모두에서 아달리무맙의 발현이 용이하게 검출된 반면, EMCV L1 단백질(EG141로부터)과 조합된 아달리무맙의 발현은 아달리무맙이 단독으로 발현되었을 때(EG140로부터)보다 약간 더 낮았다. 놀랍게도, 아달리무맙이 L1 인핸서 단백질과 조합하여 발현되는 경우, 인핸서 단백질의 부재(도 14a)와 비교하여 항체의 세포 내 분포가 더 균일하다(도 14b). 더욱이, 아달리무맙 단독 발현 시 나타나는 잘못 접히거나 접히지 않은 단백질의 존재를 나타내는 세포 내 병소는 아달리무맙이 L1 인핸서와 조합하여 발현되는 경우에는 존재하지 않는다. 이러한 결과는 L1 인핸서 단백질의 존재가 세포에서 발현되는 재조합 아달리무맙 항체의 발현 품질 및/또는 양을 개선시킨다는 것을 추가로 뒷받침한다.
또한, 직접 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 방법을 이용하여 세포 배양 상청액에서 아달리무맙이 검출될 수 있는지 여부를 테스트하였다. ELISA 실험을 위해, 동결된 세포 배양 상층액을 해동하고 ELISA 고결합 플레이트 코팅에 사용하였다. 코팅을 2X 희석 계열의 세포 배양 상청액(웰당 75 ul)을 사용하여 수행하였다. 양성 대조군의 경우, 일련의 재조합 인간 항-TNFa 항체(NBP2-62567, Novus Biologicals)의 희석 시리즈를 대신 사용하였다. 코팅을 4℃에서 밤새 수행하였다.
다음날, ELISA 플레이트를 PBS-T를 사용하여 1회 세척하고 EZ Block을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 웰당 150 ul씩 차단하였다. 플레이트를 세척하고 2차 항체(항-인간 HRP 표지 항체, IgG (H+L) 염소 항-인간, HRP, Invitrogen - A18805 GTXHU IGG HRP AFFINITY)와 1:2000의 희석률로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T를 사용하여 5회 세척하였다. TMB 기질을 첨가하고(웰당 75 ul) 20분 동안 인큐베이션한 후 정지 용액(웰당 75 ul)을 첨가하였다. 450 nm에서의 흡광도를 Biotek 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 15에 제시한다. ELISA 플레이트가 아달리무맙 발현 HEK293T 세포로부터 유래된 세포 배양 상청액으로 코팅되었기 때문에, 결과는 아달리무맙이 EG140 및 EG141 둘 다에 형질감염된 세포의 상청액에서 용이하게 검출될 수 있음을 시사한다. EG140(대조군) 발현 시 아달리무맙 수준은 EG141(아달리무맙 및 L1 인핸서를 인코딩하는 플라스미드) 발현 시보다 3배 초과하여 더 높다.
실시예 14: L 인핸서 단백질의 발현은 아달리무맙 단백질 품질 및 발현 수준을 유의미하게 개선시킨다.
EG140- 또는 EG141-형질감염된 세포로부터 발현되고 분비된 항체가 재조합 인간 TNF-알파에 특이적으로 결합할 수 있는지 여부를 검출하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
플라스미드 EG140 및 EG141 외에도, 동일한 발현 카세트를 상이한 폴리아데닐화 신호 및 동물에서 AAV의 하류 생체내 사용을 위한 재조합 AAV 벡터를 생성하기 위해 역전된 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)가 측면에 있는 발현 카세트에 의해 EG140 및 EG141 백본과는 상이한 AAV 전달 플라스미드 백본에 클로닝하였다(도 20). HEK293T 세포에서 발현된 인핸서 단백질이 없는(도 21) 및 인핸서 단백질이 있는(도 22) AAV 전달 플라스미드로부터의 아달리무맙이 재조합 인간 TNF-알파에 특이적으로 결합할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.
실시예 13에 기재된 바와 같이 세포를 성장시키고 형질감염시켰다. 그러나, 실험 13과 대조적으로, 고결합 ELISA 플레이트는 먼저 재조합 TNF-알파(1 ug/ml, 웰당 75 μl)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 2일에 ELISA 플레이트를 PBST로 세척하고 EZ Block 시약으로 차단하였다. 세포 배양 상청액 샘플을 Opti-MEM(1:256)에서 희석하고 차단된 웰에 첨가하였다(웰당 75 μl, 37℃에서 1시간). 웰을 PBST를 사용하여 3회 세척하고 2차 항체(항-인간 IgG HRP)를 1:2000 희석으로 첨가하였다(웰당 75 μl, 37℃에서 1시간). 그런 다음 웰을 PBST를 사용하여 5회 세척하였다. 75 ul의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 첨가하여 결합된 항체를 검출하였다. 75 μl의 TMB 중지 용액을 사용하여 반응을 정지시켰고, Biotek 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 신호를 판독하였다.
일부 실험에서, 분비된 아달리무맙의 총 농도를 정량적 ELISA를 사용하여 측정하였다. 해당 실험에서, ELISA를 하기와 같이 수정하여 상기에 기재된 바와 같이, 수행하였다. 세포 배양 상층액을 EZ Block 시약에 사전 희석하였고 사전 코팅되고 차단된 웰에 샘플로서 첨가하였다. 양성 대조군 항체인 재조합 단일클론 아달리무맙(Novus Biologicals NB001486)을 EZ Block 시약에 0, 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 농도로 희석하고 사전 코팅 및 차단된 웰에 표준 커브로서 추가하였다. 다른 모든 측면에서, ELISA를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 450 nm에서의 흡광도를 판독한 후, 표준곡선의 흡광도 값을 이용하여 샘플의 흡광도 값을 ng/ml 단위의 총 분비된 아달리무맙 농도로 환산하였다.
결과는 EG140-형질감염된 세포로부터의 세포 배양 상층액이 EG141-형질감염된 세포와 비교하여 대략 3배 더 많은 TNF-알파 결합 인간 항체를 함유함을 보여주었다(도 16).
인핸서 L 단백질이 있거나(서열번호 243 내지 272) 없는(서열번호 217 내지 242) 아달리무맙을 인코딩하는 AAV 전달 플라스미드에 대한 결과를 인핸서 단백질(STD)이 없고 인핸서 단백질(EG)이 있는 아달리무맙을 인코딩하는 형질감염된 플라스미드의 반복 실험과 함께 도 23에 도시하였다. 분비된 아달리무맙 농도를 정량적 ELISA에 의해 ng/ml 단위로 정량화하였다. 두 경우 모두에서, 인핸서 단백질의 존재로 인해 세포 상청액 중 아달리무맙의 총량이 감소했다. 특히, 인핸서 단백질을 갖는 표준 플라스미드에 아달리무맙이 존재하면 상청액에서 아달리무맙 단백질의 존재를 39배 만큼 감소시킨 반면, AAV 전달 플라스미드에 있는 인핸서 단백질은 상청액에서 아달리무맙 단백질의 존재를 77배 만큼 감소시켰다.
아달리무맙 품질의 분석을 세포 배양 상청액에서 TNF-알파 활성화의 수준으로 테스트하였다. 활성 아달리무맙은 TNF-알파를 차단할 것이다. 이 실험을 루시퍼라제 TNF-알파 리포터 세포를 사용하여 수행하였다.
NF-kappaB의 활성화를 평가함으로써 샘플 내 생리활성 TNF-알파의 수준을 모니터링하도록 설계된 리포터 세포를 사용하여 단리된 세포 배양 상청액을 분석하였다. 리포터 HEK-Dual TNF-a 세포주(Invivogen)를 HEK293 세포를 NF-kappaB 유도성 분비 반딧불 루시퍼라제로 형질감염시켜 생성하였다. TNF-알파 처리 시, NF-kappaB 경로가 활성화되어 분비된 루시퍼라제의 발현으로 이어지며, 이는 루시퍼라제 기질을 사용하여 검출할 수 있다. EG140- 및 EG141-형질감염된 세포의 세포 배양 상청액 또는 AAV 전달 플라스미드 백본에 클로닝된 동일한 발현 카세트에서 TNF-알파 중화 항체가 존재 시, NF-kappaB 활성화가 억제되고 루시퍼라제 신호가 감소할 것으로 예측되었다.
실험을 하기와 같이 수행하였다. 리포터 세포를 DMEM + 10% FBS 중 96웰 플레이트(웰당 5000개 세포)에 시딩하였다. 다음날, EG140- 및 EG141-형질감염된 세포로부터의 세포 배양 상청액을 세포 배양 배지에서 지시된 비율로 희석하고 실온에서 30분 동안 1 ng/ml 인간 재조합 TNF-알파와 혼합하였다. 그런 다음 96웰 플레이트에 사전 시딩된 TNF-알파 리포터 세포의 세포 배지를 웰당 100 μl의 혼합물을 사용하여 사전 인큐베이션된 세포 배양 상청액/TNF-알파 샘플로 교체하였다. 그런 다음 리포터 세포를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 분비된 루시퍼라제 신호를 TNF-알파 활성화를 검출하기 위한 제조업체의 지침에 따라 Quanti-Luc Gold 검정(Invivogen)을 사용하여 검출하였고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
결과는 도 17, 도 24 및 표 4 및 표 5에 제시되어 있다. EG140- 및 EG141-형질감염된 세포 둘 다로부터 단리된 세포 배양 상층액은 NF-kappaB 구동 루시퍼라제 발현의 TNF-알파 매개 활성화를 억제할 수 있었던 반면, EG140-형질감염된 세포의 상층액은 EG141-형질감염된 세포의 상청액과 비교하여 TNF-알파 억제에서 약 3배 더 활성이었다.
[표 4]
Figure pct00020
[표 5]
Figure pct00021
또한, 분비된 아달리무맙의 상대적 품질을 추정하기 위해, 상청액 중 분비된 아달리무맙의 총량(정량적 ELISA로 측정한 ng/ml의 단위)을 TNF-알파 신호전달(HEK 이중 TNF-알파 리포터 세포를 사용하여 측정한 EC50 단위)을 억제하기 위해 동일한 상청액의 효능과 비교하였다.
흥미롭게도, 표준 시스템에 대해 생성되고 분비된 아달리무맙의 양이 더 높았음에도 불구하고(도 24 및 표 4 및 5), 생물학적 활성에 의해 정의된 바와 같이 생성된 아달리무맙의 상대적 품질은 인핸서 L을 갖는 작제물에서 더 높았다. 즉, 인핸서 단백질의 활성은 표준 작제물 형질감염된 세포에서 22.2배 더 높았고 AAV 작제물 형질감염된 세포에서 65.3배 더 높았다.
특히, 생물학적으로 활성인 아달리무맙의 상대적 백분율을 추가로 분석하였다. 도 25는 인핸서 단백질 동시 발현을 갖는 활성 아달리무맙의 상대적인 양이 인핸서 단백질 동시 발현이 없는 것보다 더 높았음을 보여준다. 중요한 것은 활성 발현된 아달리무맙의 백분율이 인핸서 단백질 동시 발현을 통해 최대 60% 더 높았다는 것이었다.
실시예 15: L 인핸서의 발현은 비활성 아달리무맙 발현 생성물의 수를 감소시키는 것으로 나타났다.
EG140 및 EG141 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포의 세포 배양 상층액에서 분비된 항체의 총량을 시각화하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 세포를 15 cm 세포 배양 접시에 접시당 4E6개 세포씩 시딩하고 40 ug 플라스미드와 80 ug PEI를 사용하여 형질감염시켰다. 제조업체의 지침에 따라 단백질 A/G 아가로스 수지(MPbio)를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 제조업체의 지침에 따라 SDS-Page와 웨스턴 블롯팅(GenScript)을 통해 동일한 부피의 정제된 항체를 분석하였다.
SDS PAGE(도 18a) 및 웨스턴 블롯(도 18b) 결과는 정제된 아달리무맙 경쇄 및 중쇄가 EG140- 및 EG141-형질감염된 HEK293T 세포 둘 다의 세포 배양 상청액에서 검출되었음을 나타낸다. 결과는 대조군 EG140-형질감염된 세포에서 발현된 정제된 아달리무맙의 양이 EG141-형질감염된 세포에서 L1 인핸서의 존재 하에 발현된 정제된 아달리무맙의 양보다 유의미하게 더 크다는 것을 보여준다. 이론에 구애됨이 없이, EG140-형질감염된 세포에 의해 발현되는 분비된 아달리무맙의 상당 부분은 EG141-형질감염된 세포에 의해 발현되는 분비된 아달리무맙과 비교하여, 접힘 오류 및/또는 세포내 병소에 대한 부적절한 국소화로 인해 잠재적으로 기능하지 않는 것으로 생각된다.
실시예 16: 생체 내에서 L 인핸서 단백질의 발현은 주사 부위 의존성 효과를 감소시킨다.
생체 내에서 아달리무맙의 발현을 평가하기 위해, 각각 6 내지 8주령의 6마리 암컷 BALB/c 마우스의 그룹을 사용하였다. 그룹에는 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4) 중 재조합 AAV의 50 μl의 2x1011 게놈 복사본을 근육내(i.m.) 또는 피하(s.c.) 경로를 통해 1회 주사하였다. 사용된 재조합 AAV 벡터를 (a) 도 21에 도시된 아달리무맙을 인코딩하는 플라스미드 또는 (b) 도 22에 도시된 인핸서 단백질을 갖는 아달리무맙을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 생성하였다. 재조합 AAV 벡터를 AAV 전달 플라스미드를 헬퍼 플라스미드(아데노바이러스 유전자 E4, E2A 및 VA를 인코딩) 및 Rep-Cap 플라스미드(AAV 혈청형 8, AAV8의 Cap 단백질을 인코딩)와 함께 HEK293T 패키징 세포로 삼중 형질감염하여 VectorBuilder Inc.에서 생성하였다. 유사하게는, 바이러스 게놈 복제 및 패키징에 충분한 임의의 복제 유전자 및 바이러스 캡시드 형성에 충분한 임의의 바이러스 캡시드 유전자를 Rep-Cap 대신 사용할 수 있다. 형질감염 후 2일에, 세포를 수확하고, PEG로 농축하고, CsCl 구배 정제로 정제하였다.
AAV8 처리된 마우스에서 아달리무맙의 약동학을 대조군으로서 재조합적으로 생성된 아달리무맙 단백질로 처리된 마우스의 약동학과 비교하였는데, 이는 항-TNFa 요법의 현재 표준 치료를 모방한다. 대조군에는 PBS에 용해된 재조합적으로 생성된 아달리무맙 100 μg의 50 μl를 3마리의 마우스에 피하 주사하였다.
동물을 그룹별로 무작위화하고 체중을 1일에 기록한 다음 연구가 끝날 때까지 격주로 기록하였다. 이상반응(RM, SD, RD)을 적정 실험실 표준에 따라 기록하였다. 20% 초과의 체중 감소, 식사, 음주 및 이동성과 같은 정상적인 생리적 기능을 억제하는 상처, 또는 허탈, 발작 및 출혈의 임상적 관찰이 한 번이라도 관찰된 임의의 개별 동물은 모두 안락사시켰다.
전혈을 턱밑 정맥으로 수집하고 처리하여 분석용 혈청을 수집하였다. 혈액을 0일(투약 전), 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 42일에 수집하였다. 정량적 ELISA를 통해 혈청의 아달리무맙 농도를 분석하였다.
정량적 ELISA를 마우스 혈청 샘플(EZ Block 시약에서 사전 희석된)을 샘플로 사용하여 상기 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였다. 양성 대조군 항체인 재조합 단일클론 아달리무맙(Novus Biologicals NB001486)을 EZ Block 시약에 0, 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 농도로 희석하고 표준 커브로서 사용하였다. 450 nm에서의 흡광도를 판독한 후, 표준곡선의 흡광도 값을 이용하여 샘플의 흡광도 값을 ng/ml 단위의 혈청에서 총 분비된 아달리무맙 농도로 환산하였다.
ELISA 실험의 결과를 도 26a 및 도 26b에 도시한다. 직선 점선 역치는 아달리무맙 농도가 5 μg/ml임을 나타내며, 이를 초과하면 류마티스 관절염 모델에서 아달리무맙의 치료 효과가 관찰된다. 도 26a는 인핸서 단백질이 있는(EG) 및 없는(STD) AAV의 근육내 주사의 결과를 도시한다. 도 26b는 동일한 물질의 피하 주사를 도시한다. 본원에 제시된 다른 실험과 관련하여 상기 기재된 바와 같이, 인핸서 단백질이 없는(STD) 시스템은 인핸서 단백질(EG)이 있는 시스템과 비교하여 혈청 내 아달리무맙의 농도가 더 높은 것을 보였다.
특히, 인핸서 단백질 동시 발현이 없는 아달리무맙의 농도는 주사 부위에 따라 크게 달라졌다. 전체적으로 주사 부위 사이에 10배의 차이가 관찰될 수 있었다. 이는 치료 투여에서 상대적으로 작은 편차가 치료용 이식유전자의 정상 상태 혈청 수준에 큰 변화를 가져올 수 있기 때문에 주사 부위를 다양화할 수 없는 특이적인 유전자 요법의 경우 매우 어려울 수 있다.
대조적으로, 인핸서 단백질이 있는(EG) 시스템은 주사 부위와 상관없이 혈류 투여량을 보여주었다. 이러한 데이터는 인핸서 단백질이 치료 중 세포 유형에 상관없이 유사한 단백질 발현 수준을 확보하며, 이는 강력하고 재현 가능한 치료 효과를 달성하는 데 중요한 결과라는 것을 보여준다. 중요한 것은 근육내 투여와 피하 투여 둘 다에서 치료된 마우스의 혈청에서 필요한 치료 농도를 초과하여 동일한 수준의 아달리무맙이 발견되었다. 놀랍게도, 인핸서 단백질의 첨가로 아달리무맙이 주사 부위와 상관없이 안정적이고 일정한 수준으로 발현되는 것을 확보하였다.
실시예 17: L 인핸서 단백질의 발현은 시험관 내에서 분비된 글루코실세라미다제(GBA)의 활성에 비해 증가한다
HEK293T 세포에서 인핸서 L 단백질이 있거나 없는 글루코실세라미다제(GBA) 발현을 테스트하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
HEK293T 세포를 GBA-NanoLuc 융합 단백질을 발현하는 대조군 플라스미드(도 28a) 및 GBA-NanoLuc 키메라와 함께 인핸서 단백질 L을 동시 발현하는 플라스미드(도 28b)로 형질감염시켰다. 0일에 HEK 293T 세포를 10% FBS를 함유하는 500 μl DMEM에서 24웰 세포 배양 마이크로플레이트에 시딩하였다. 1일에, 제조업체의 지침에 따라 Mirus TransIT-Lenti 형질감염 시약을 사용하여 세포를 각각의 pGBA-NanoLuc_STD(서열번호 273 내지 296) 및 pGBA-NanoLuc_EG(서열번호 297 내지 324) 플라스미드로 형질감염시켰다. 각 웰을 0.2 μg 플라스미드, 0.6 μl Mirus TransIT-Lenti 시약 및 50 μl의 Opti-MEM 배지를 사용하여 만든 복합체로 처리하였다. 3일에, 형질감염된 세포 및 세포 배양 상층액을 NanoLuc 루시퍼라제 및 GBA의 활성에 대해 검정하고 웨스턴 블롯팅을 위해 처리하였다.
NanoLuc 검정을 위해 세포 배양 상층액을 미세원심분리 튜브에 수집하고 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거하였다. 24웰 플레이트에 부착된 세포를 실온에서 PBS 중 0.2% Triton X-100의 250 ul를 사용하여 용해시켰다. 50 μl의 제거된 세포 배양 상층액 또는 50 μl의 세포 용해물을 불투명한 흑색 96웰 마이크로플레이트에 로딩하였다. 각각의 검정 완충액(Promega)에 들어 있는 새로운 1X Nano-Glo 검정 시약 50 μl를 각 웰에 첨가하고 2 내지 5분 동안 인큐베이션한 후 Biotex Synergy LX 플레이트 판독기를 사용하여 발광성을 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라 A660 시약(Thermo Scientific)을 사용하여 세포 용해물을 단백질 농도에 대해 추가로 분석하였다. 간단히 말하면, 40 μl의 샘플 또는 표준을 150 μl의 A660 검정 시약과 혼합하고 Biotek Synergy LX 플레이트 판독기를 사용하여 660 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 표준 곡선을 기반으로 단백질 농도를 정량화했다. 세포 용해물의 발광을 세포 용해물 단백질 μg 당 정규화하였고(즉, 상대적인 광 단위(RLU)/μg 단백질 단위로 발광 값을 산출), 반면에 세포 배양 상청액의 발광을 검정에 사용된 상청액의 부피를 사용하여 표준화하였다(즉, RLU/ml 상청액 단위로 발광 값을 산출).
GBA 활성을 결정하기 위해, 세포를 상기의 NanoLuc 검정에서와 같이 각각의 플라스미드로 시딩하고 형질감염시켰다. 3일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 원심분리에 의해 세포 잔해물로부터 제거하고, 분비된 GBA 활성을 검정하기 위해 저장하였다. 부착 세포를 500 μl PBS를 사용하여 플레이트로부터 탈리하고 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포 펠릿을 1X GBA 검정 완충액(0.1 M 구연산나트륨, 0.2 M 인산나트륨, 0.25% Triton X-100, 0.25% 타우로콜산나트륨, 1.25 mM EDTA, 5 mM DTT)을 사용하여 용해하고, 용해하기 전에 37℃로 평형화했다. 제조업체의 지침에 따라 Pierce A660 단백질 검정을 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 측정한 후, 1X GBA 검정 완충액을 사용하여 세포 용해물을 125 μg/ml의 최종 단백질 농도로 희석하였다. 40 μl의 사전 희석된 세포 용해물을 투명한 96웰 플레이트의 개별 웰에 2벌씩 피펫팅했다. 이전에 수집된 바와 같이, 20 μl의 세포 배양 상청액을 투명한 96웰 플레이트의 개별 웰에 2벌씩 첨가하고, 세포 배양 상청액을 함유하는 각 웰에 20 μl의 2X GBA 검정 완충액을 첨가하였다. 그 후, 20 μl의 검정 기질(1X GBA 분석 완충액에서 제조된 6 mM 4-MU-베타-D-글루코푸라노사이드)을 세포 용해물 또는 세포 배양 상청액을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 인접한 웰에서는 1X GBA 검정 완충액에서 4-메틸-움벨리페론을 사용한 교정 곡선을 작성하였다. 샘플을 검정 기질의 존재 하에 37℃에서 30분 내지 4시간 동안 인큐베이션한 후 100 μl의 정지 용액(0.5 M 글리신, pH10의 0.3 M NaOH)을 첨가하였다. 그 후, Biotek Synergy LX 플레이트 판독기를 사용하여 360/445 nm의 여기/방출 파장에서 각 샘플 및 표준의 형광을 측정하였다. 세포 용해물 샘플에서 GBA 활성은 하기 방정식을 사용하여 계산되었다: 활성 = [B / (T × V × P)] × D = pmol/분/mg = μU/mg, 상기 식에서 B는 표준 곡선을 사용하여 계산한 바와 같이 변환된 4-MU 양(pmol)이고, T는 반응 시간(분)이고, V는 샘플 부피(ml)이고, P는 초기 단백질 샘플 농도이며, D는 샘플 희석 인자(해당되는 경우)이다. 세포 배양 상청액에서 GBA 활성은 하기 방정식을 사용하여 계산되었다: 활성 = [B / (T × V × P)] × D = pmol/분/mg = μU/mg, 상기 식에서 B는 표준 곡선을 사용하여 계산한 바와 같이 변환된 4-MU 양(pmol)이고, T는 반응 시간(분)이고, V는 샘플 부피(ml)이며, D는 샘플 희석 인자(해당되는 경우)이다.
웨스턴 블롯팅을 위해, 형질감염된 세포를 긁어 모아 수확하고 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 1X 프로테아제 억제제 칵테일과 10U의 범용 뉴클레아제가 보충된 100 μl RIPA 완충액(Cell Signaling technologies)을 사용하여 세포 펠렛을 용해시키고 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션한 후 10초 동안 초음파 처리했다. 용해된 샘플을 14,000 g에서 10분간 원심분리하고, 분석을 위해 80 μl의 상층액을 수집하였다. 각 샘플의 단백질 농도를 제조업체의 지침에 따라 Pierce A660 검정을 사용하여 결정하였다. 40 μg의 세포 용해물을 4 내지 12% Bis-Tris MES 겔의 각 웰에 로딩하고 앞서 실시예 15에서 개시된 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 계속한다. GBA를 검출하기 위해, 토끼 항-GBA 항체(Abcam ab128879)를 밤새 1:500 희석하여 사용하였다.
웨스턴 블롯팅을 통해 설계된 pGBA-NanoLuc_STD 및 pGBA-NanoLuc_EG 작제물은 HEK 293T 세포에서 발현될 시 대략 75 kDa의 pGBA-NanoLuc 단백질 키메라에 대한 정확한 예측 크기의 단일 밴드로 검출된다는 것을 밝혀내었다. pGBA-NanoLuc_STD 작제물의 밴드는 pGBA-NanoLuc_EG 작제물의 밴드보다 다소 강했고(도 29), 이는 실시예 15에 제시된 바와 같이 발현된 분비된 단백질에 대한 초기 관찰에 해당한다.
분석 중에 NanoLuc 태그된 GBA 단백질을 사용함으로써 관심 대상의 단백질의 전체 발현(NanoLuc 리포터 판독)과 관심 대상의 기능적으로 활성인 단백질의 발현(GBA 효소 활성)을 구별하는 것이 가능했다. 리포터 단백질(NanoLuc)과 효소 활성(GBA) 둘 다의 총량은 pGBA-NanoLuc_STD 작제물의 경우에 더 높았으며(도 30a 내지 도 30d), 이는 위의 웨스턴 블롯 결과와 일치한다. 그러나, pGBA-NanoLuc_EG 작제물의 경우 인핸서 단백질을 동시 발현시켰을 때 생성된 단백질의 상대적 품질이 훨씬 높았다(도 31). 발현된 GBA 단백질의 상대적 품질은 먼저 NanoLuc 리포터 신호를 사용하여 GBA 효소 활성을 정규화한 다음(즉, 특이적인 GBA 활성 GBA_S = GBA_활성/NanoLuc_신호를 산출함) 2개의 상이한 작제물의 GBA_S를 비교하여 추정하였다. 이 분석은 세포 용해물에서 특이적인 GBA 활성이 pGBA-NanoLuc_STD와 pGBA-NanoLuc_EG 작제물 간에 유사하다는 것을 밝혀 주었다.
그러나, 주목할 만한 점은 세포 상층액에서 인핸서 단백질(즉, pGBA-NanoLuc_EG 작제물)의 존재 하에 특이적인 GBA 활성은 인핸서 L 단백질(즉, pGBA-NanoLuc_STD 작제물)의 부재 하에서의 것보다 대략 300% 더 높았다(도 31). 내인성 GBA가 상청액에서 완전히 활성인 분비된 단백질이라는 점을 고려하면, 이들 데이터는 본원에 제시된 바와 같이 인핸서 단백질 L과 동시 발현될 때 단백질의 품질이 증가되었음을 뒷받침한다.
실시예 18: L 인핸서 단백질의 발현은 생체 내 글루코실세라미다제(GBA) 발현의 균일성을 개선시킨다
생체 내에서 GBA의 발현을 평가하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. pGBA-NanoLuc_STD(인핸서 단백질 L 없음, 서열번호 273 내지 296) 및 pGBA-NanoLuc_EG(인핸서 단백질 L 있음, 서열번호 297 내지 324) 플라스미드 둘 다를 하기와 같이 생체 내 전달을 위해 지질 나노입자(LNP)로 제형화하였다. 300 μg 플라스미드를 2.6 ml의 캡슐화 완충액(EB, pH4에서 25 mM 아세트산나트륨)에 용해시켰다. LNP 지질 혼합물을 1% DMG-PEG(2000), 39% 콜레스테롤, 10% DOPC 및 50% DLin-KC2-DMA 이온화 가능한 지질을 함유하고 최종 총 지질 농도가 4 mM인, 2.6 ml의 100% EtOH에서 제조하였다. EB의 플라스미드와 EtOH의 지질을 동일한 부피(각각 2.6 ml)로 빠르게 혼합하여 조합하였다. 혼합 직후, 5.2 ml의 뉴트리바이오시밀러퍼(neutrbiosimilarffer)(NB, pH6에서 300 mM NaCl + 20 mM 구연산나트륨)를 지질/플라스미드 혼합물에 첨가하고 빠르게 혼합하며 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. Amicon Ultra 15-ml 100 kDa MWCO 스핀 필터를 사용하여 혼합물을 PBS에 대해 정용여과하였다. 캡슐화 효율과 로딩된 플라스미드의 총 농도를 하기와 같이 SYBRSafe 캡슐화 효율 분석을 사용하여 결정하였다. 5 μl의 플라스미드/LNP를 TE 완충액(LNP에 로딩되지 않은 플라스미드의 양을 검출하기 위해)에서 또는 1% Triton X-100을 함유하는 TE 완충액(플라스미드의 총량을 검출하기 위해, 즉, LNP에 로딩된 플라스미드와 로딩되지 않은 플라스미드 둘 다)에서 1X SYBRSafe DNA 결합 염료와 혼합하였다. 플라스미드 DNA 절대량 계산을 위해 표준 곡선을 TE 완충액에서 또는 1% Triton X-100을 함유한 TE 완충액에서 각각 1X SYBRSafe DNA 결합 염료에 혼합된 알려진 양의 기준 노출 플라스미드 DNA를 사용하여 작성하였다. 샘플 또는 표준을 5분 동안 인큐베이션하고 FITC용 필터 세트를 사용하는 Biotek Synergy LX 형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광을 판독하였다. 캡슐화 효율을 하기 방정식을 사용하여 계산하였다: 로딩_효율 = (플라스미드_전체 - 플라스미드_비로딩) / 플라스미드_전체 × 100%.
로딩 효율은 >90%였다. PBS를 사용하여 플라스미드/LNP를 200 μl PBS당 플라스미드 30 μg의 등가 플라스미드 농도로 희석하였다. 암컷 Balb/c 마우스를 마취시키고 견갑골 사이의 피하 주사를 위해 200 μl의 고정 용량을 개별적으로 투여했다, 그룹당 N=3. 표시된 시점에서, Nano-Glo® In Vivo Substrate, FFz를 마우스에 복강내(i.p.) 주사하여 전신 생물발광 이미징(BLI)을 수행하고 복위 자세와 앙와위 자세에서 이미지를 촬영했다. 복위 자세는 주사 부위에 초점을 맞추고 앙와위 자세는 간 부위에 초점을 맞췄다. 발광 값을 정량화하고, 표로 작성하고, 플롯팅했다.
생물발광 영상화(BLI) 결과는 검출된 발광 신호가 LNP-pGBA-NanoLuc_EG 그룹과 비교하여 LNP-pGBA-NanoLuc_STD 그룹에서 약간 더 높지는 않더라도 상대적으로 동일하였는데(도 32a 내지 도 32c 및 표 6), 이는 시험관 내 실험과 일치하였음을 나타내었다. 강한 신호는 복위 자세 BLI(즉, 주사의 부위에서)와 앙와위 자세(즉, 간일 가능성이 높은, 발현된 GBA-NanoLuc 축적의 부위에서, 이는 생체 내에서 생성된 단백질은 분비되고 표적 조직에서 축적됨을 나타냄) 둘 다에서 검출되었다.
[표 6]
Figure pct00022
LNP-pGBA-NanoLuc_STD 그룹에서 BLI 신호는 LNP-pGBA-NanoLuc_EG 그룹과 비교할 경우 동일한 시점에서 측정된 바와 같이 시간에 따라 뿐만 아니라 개별 동물 간에 더 가변적이었다. 이를 각 측정 시점에서 신호의 변동 계수(CV%)를 정량화한 후, 각 처리군에 대한 평균 CV%를 계산하여 추가로 조사하였다. CV%는 신호의 표준 편차를 신호 평균으로 나눈 값으로 정의되었다. 이 분석은 평균 CV%가 인핸서 단백질의 부재 시 더 높았다는 것을 밝혀 주었다(도 32c 및 표 6). 복위 자세(즉, LNP 투여의 부위)에서는 CV%의 차이가 상대적으로 작은 반면, 복위 자세(즉, 분비된 GBA-NanoLuc 단백질 축적의 부위)에서는 차이가 대략 2배였다. 이는 인핸서 단백질 L의 존재 하에 생체 내에서 벡터화된 분비 단백질을 사용하는 것이 인핸서 단백질 L의 부재 하의 경우에 비해 더 균일하고 견고할 것임을 시사한다.
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127 <212> PRT <213> Enterovirus Enterovirus C <400> 3 Asn Tyr His Leu Ala Thr Gln Asp Asp Leu Gln Asn Ala Val Asn Val 1 5 10 15 Met Trp Ser Arg Asp Leu Leu Val Thr Glu Ser Arg Ala Gln Gly Thr 20 25 30 Asp Ser Ile Ala Arg Cys Asn Cys Asn Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Glu 35 40 45 Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Pro Val Ser Phe Val Gly Pro Thr Phe Gln 50 55 60 Tyr Met Glu Ala Asn Asn Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser His Met 65 70 75 80 Leu Ile Gly His Gly Phe Ala Ser Pro Gly Asp Cys Gly Gly Ile Leu 85 90 95 Arg Cys His His Gly Val Ile Gly Ile Ile Thr Ala Gly Gly Glu Gly 100 105 110 Leu Val Ala Phe Ser Asp Ile Arg Asp Leu Tyr Ala Tyr Glu Glu 115 120 125 <210> 4 <211> 219 <212> PRT <213> Erbovirus Equine rhinitis B virus 1 <400> 4 Met Val Thr Met Ala Gly Asn Met Ile Cys Asn Val Phe Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Thr Glu Ile Cys Ser Pro Lys Gln Gly Pro Leu Leu Asp Asn Glu 20 25 30 Leu Pro Leu Pro Leu Glu Leu Ala Glu Phe Pro Asn Lys Asp Asn Asn 35 40 45 Cys Trp Val Ala Ala Leu Ser His Tyr Tyr Thr Leu Cys Asp 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gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360 aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420 taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480 cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 540 cacgatgata at 552 <210> 115 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhancer peptide <400> 115 atggccacaa ccatggaaca agagacttgc gcgcactctc tcacttttga ggaatgccca 60 aaatgctctg ctctacaata ccgtaatgga ttttacctgc taaagtatga tgaagaatgg 120 tacccagagg agttattgac tgatggagag gatgatgtct ttgatcccga attagacatg 180 gaagtcgttt tcgagttaca gtaa 204 <210> 116 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 116 atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 60 ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgtt 105 <210> 117 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 poly(A) signal <400> 117 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 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accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 188 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 188 attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 60 tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 120 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 180 aataatagca cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 240 ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 300 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttc 325 <210> 189 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori <400> 189 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589 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ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180 tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 193 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 193 ggtttagtga accgtcagat cc 22 <210> 194 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiple cloning site (MSC) <400> 194 gctagcgcta ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc 60 gcgggcccgg gatccaccgg t 81 <210> 195 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 195 cgccacg 7 <210> 196 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin signal peptide <400> 196 atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgtttt cttccgccta cagc 54 <210> 197 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adalimumab variable heavy (VH) domain <400> 197 gaagtgcagc tggttgaaag cggaggcgga ctggtccagc caggcagaag cctgagactg 60 tcttgtgccg cctctggctt cacctttgac gactacgcca tgcactgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gactcgagtg ggtcagcgcc atcacctgga atagcggcca catcgactac 180 gcagatagcg 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aggactggct gaacggaaag 600 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctccctgctc caatcgagaa gaccattagc 660 aaggccaagg gccaacctag agagccccag gtctacaccc tgccaccaag tagagatgag 720 ctgaccaaga accaggtgag cctaacatgc ctggtgaagg gcttttaccc cagcgacatc 780 gccgtggaat gggagagcaa cggccagcct gagaacaact acaagacaac acctcctgtt 840 ctggattctg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga cagtggataa gagccggtgg 900 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtt atgcacgagg ccctgcataa tcactacacc 960 cagaagagcc tgtctctgag ccctggcaag 990 <210> 199 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 199 cgaaaacggc gc 12 <210> 200 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG linker <400> 200 ggaagcgga 9 <210> 201 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A cleavage site <400> 201 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagatgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 202 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin signal peptide <400> 202 atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgtttt 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ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 214 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 214 attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 60 tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 120 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 180 aataatagca cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 240 ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 300 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttc 325 <210> 215 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori <400> 215 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 224 cgaaaacggc gc 12 <210> 225 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG linker <400> 225 ggaagcgga 9 <210> 226 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A cleavage site <400> 226 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagatgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 227 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin signal peptide <400> 227 atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgtttt cttccgccta cagc 54 <210> 228 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adalimumab variable light (VL) chain <400> 228 gatatccaga tgacccagtc tccatctagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60 atcacctgta gagcctctca aggcatccgg aactacctgg cctggtatca gcagaaacct 120 ggcaaggctc ctaagctgct gatctacgcc gcttccaccc tgcagagcgg cgttccttct 180 agattcagcg gcagcggctc cggaacagac ttcaccctga caattagctc cctgcaacct 240 gaagatgtgg ctacatacta ctgccagaga tacaatcggg ccccttacac ctttggacag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa g 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tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 233 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 233 gggccgc 7 <210> 234 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' inverted terminal repeat (ITR) <400> 234 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 235 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 235 ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc 60 aaagcaacca tagt 74 <210> 236 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 ori <400> 236 acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggggtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60 ctacacttgc cagcgcctta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120 cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180 gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc 240 catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 300 gactcttgtt ccaaactgga acaacactca actctatctc gggctattct tttgatttat 360 aagggatttt gccgatttcg gtctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420 acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caattt 456 <210> 237 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 237 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 60 cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 120 aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 180 gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 240 tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt g 281 <210> 238 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR promoter <400> 238 cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60 caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagt 105 <210> 239 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR gene <400> 239 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 240 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 240 ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60 aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 120 ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 170 <210> 241 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC ori <400> 241 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 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catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatc 589 <210> 246 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 246 caagtttgta caaaaaagca ggctgccacc 30 <210> 247 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin signal peptide <400> 247 atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgtttt cttccgccta cagc 54 <210> 248 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adalimumab variable heavy (VH) domain <400> 248 gaagtgcagc tggttgaaag cggaggcgga ctggtccagc caggcagaag cctgagactg 60 tcttgtgccg cctctggctt cacctttgac gactacgcca tgcactgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gactcgagtg ggtcagcgcc atcacctgga atagcggcca catcgactac 180 gcagatagcg ttgaaggcag attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ttctctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat accgctgtgt actactgcgc caaagtgtcc 300 tacctgagca ccgccagctc cctggactac tggggccagg gcaccctggt gacagtgagc 360 tct 363 <210> 249 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG1 constant heavy (CH) domain <400> 249 gctagcacaa aaggacctag cgtgtttccc ctggccccta gcagcaaaag caccagcggc 60 ggaaccgccg ctctgggttg tctggtgaag gactatttcc ctgaacctgt gaccgtgtcc 120 tggaactctg gcgccctgac tagcggcgtg cataccttcc ctgccgtgct gcaaagctct 180 ggcctgtata gcctttcttc tgtggtgacc gtgcctagca gctctctggg cacacagaca 240 tacatctgca atgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaaaaa ggtggaaccc 300 aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccgtgccccg ctcctgagct gctgggcggc 360 ccttctgtgt tcctgttccc ccccaaacct aaagacacac tgatgatcag ccggacccct 420 gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt ccacaacgcc aagaccaaac ctagagagga acaatacaac 540 agcacatata gagtggtgtc tgtgctgaca gtgctccacc aggactggct gaacggaaag 600 gaatacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctccctgctc caatcgagaa gaccattagc 660 aaggccaagg gccaacctag agagccccag gtctacaccc tgccaccaag tagagatgag 720 ctgaccaaga accaggtgag cctaacatgc ctggtgaagg gcttttaccc cagcgacatc 780 gccgtggaat gggagagcaa cggccagcct gagaacaact acaagacaac acctcctgtt 840 ctggattctg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga cagtggataa gagccggtgg 900 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtt atgcacgagg ccctgcataa tcactacacc 960 cagaagagcc tgtctctgag ccctggcaag 990 <210> 250 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 250 cgaaaacggc gc 12 <210> 251 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG linker <400> 251 ggaagcgga 9 <210> 252 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A cleavage site <400> 252 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagatgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 253 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin signal 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caccagggcc tgtcctcccc tgtgacaaag 300 agctttaaca gaggcgagtg c 321 <210> 256 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stop codon <400> 256 taa 3 <210> 257 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 257 cccccccccc ta 12 <210> 258 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal ribosome entry site (IRES) (non-coding) <400> 258 acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60 ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120 cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180 tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240 gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300 aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360 aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420 taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480 cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 540 cacgatgata at 552 <210> 259 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhancer protein L <400> 259 atggccacaa ccatggaaca agagacttgc gcgcactctc tcacttttga ggaatgccca 60 aaatgctctg ctctacaata ccgtaatgga ttttacctgc taaagtatga tgaagaatgg 120 tacccagagg agttattgac tgatggagag gatgatgtct ttgatcccga attagacatg 180 gaagtcgttt tcgagttaca g 201 <210> 260 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stop codon <400> 260 taa 3 <210> 261 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 261 acccagcttt cttgtacaaa gtgggaattc ctagagctcg ctgatcagcc tcga 54 <210> 262 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH polyadenylation signal <400> 262 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagagaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 263 <211> 7 <212> 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actctatctc gggctattct tttgatttat 360 aagggatttt gccgatttcg gtctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420 acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caattt 456 <210> 267 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 267 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 60 cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 120 aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac 180 gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 240 tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt g 281 <210> 268 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR promoter <400> 268 cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60 caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagt 105 <210> 269 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR gene <400> 269 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 270 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 270 ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60 aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 120 ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 170 <210> 271 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC ori <400> 271 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589 <210> 272 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 272 aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 60 t 61 <210> 273 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer <400> 273 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catg 304 <210> 274 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 274 gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60 ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120 tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180 tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 275 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 275 ggtttagtga 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ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcgtcgcca g 1491 <210> 280 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSSG linker <400> 280 ggctcgagcg gc 12 <210> 281 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NanoLuc luciferase <400> 281 gtcttcacac tcgaagattt cgttggggac tggcgacaga cagccggcta caacctggac 60 caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt ttgtttcaga atctcggggt gtccgtaact 120 ccgatccaaa ggattgtcct gagcggtgaa aatgggctga agatcgacat ccatgtcatc 180 atcccgtatg aaggtctgag cggcgaccaa atgggccaga tcgaaaaaat ttttaaggtg 240 gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc actatggcac actggtaatc 300 gacggggtta cgccgaacat gatcgactat 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gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 292 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 292 gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt 60 tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg 120 gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga 180 ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg a 231 <210> 293 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV TK polyadenylation 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tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589 <210> 296 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 296 aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 60 ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgccat gcattagtta 120 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccg 174 <210> 297 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer <400> 297 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catg 304 <210> 298 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 298 gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60 ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120 tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180 tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 299 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 299 ggtttagtga accgtcagat cc 22 <210> 300 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multiple cloning site (MSC) <400> 300 gctagcgcta ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc 60 gcgggcccgg gatccaccgg t 81 <210> 301 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker region <400> 301 cgccacc 7 <210> 302 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBA signal peptide <400> 302 atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60 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720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcgtcgcca g 1491 <210> 304 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSSG linker <400> 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Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys 305 310 315 320 Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro 325 330 335 Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn 340 345 350 Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val 355 360 365 Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe 370 375 380 Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser 385 390 395 400 Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala 405 410 415 Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser 420 425 430 Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp 435 440 445 Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val 450 455 460 Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp 465 470 475 480 Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly 485 490 495 Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp 500 505 510 Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly 515 520 525 Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His 530 535 540 Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu 545 550 555 560 Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala 565 570 575 Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser 580 585 590 Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly Ala Leu Ala Ser Tyr Ala 595 600 605 Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly 610 615 620 Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly 625 630 635 640 Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu 645 650 655 Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Gly Leu Tyr 660 665 670 Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln Cys Pro Cys Tyr 675 680 685 Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe Ser Asp His His 690 695 700 Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys Thr Met Ser Gly 705 710 715 720 Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser Ser Pro Leu Ser 725 730 735 His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu 740 745 750 Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys 755 760 765 Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser 770 775 780 Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val 785 790 795 800 Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro 805 810 815 Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Gln Asp Arg 820 825 830 Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile 835 840 845 Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro 850 855 860 Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro 865 870 875 880 Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser 885 890 895 Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile 900 905 910 Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu 915 920 925 Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu 930 935 940 Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val 945 950 955 960 Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn 965 970 975 Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val 980 985 990 Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln 995 1000 1005 Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr 1010 1015 1020 Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys 1025 1030 1035 Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val 1040 1045 1050 Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser 1055 1060 1065 Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala 1070 1075 1080 Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp 1085 1090 1095 Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu 1100 1105 1110 Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala 1115 1120 1125 Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys 1130 1135 1140 Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly 1145 1150 1155 Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 1160 1165 1170 Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys 1175 1180 1185 Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys 1190 1195 1200 His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro 1205 1210 1215 Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr 1220 1225 1230 Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe 1235 1240 1245 Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser 1250 1255 1260 Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val 1265 1270 1275 Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg 1280 1285 1290 Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly 1295 1300 1305 Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser 1310 1315 1320 Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val 1325 1330 1335 Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro 1340 1345 1350 Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro 1355 1360 1365 Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys 1370 1375 1380 Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala 1385 1390 1395 Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn 1400 1405 1410 Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg 1415 1420 1425 Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro 1430 1435 1440 Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro 1445 1450 1455 Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met 1460 1465 1470 Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly 1475 1480 1485 Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile 1490 1495 1500 Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu 1505 1510 1515 Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala 1520 1525 1530 Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr 1535 1540 1545 Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu 1550 1555 1560 Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala 1565 1570 1575 Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu 1580 1585 1590 Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly Val 1595 1600 1605 Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro 1610 1615 1620 Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu 1625 1630 1635 Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu 1640 1645 1650 Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu 1655 1660 1665 Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser 1670 1675 1680 Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys 1685 1690 1695 Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr 1700 1705 1710 Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu 1715 1720 1725 Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly 1730 1735 1740 Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr 1745 1750 1755 Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala 1760 1765 1770 Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala 1775 1780 1785 Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile 1790 1795 1800 Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala 1805 1810 1815 Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu 1820 1825 1830 Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys 1835 1840 1845 Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn 1850 1855 1860 Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His 1865 1870 1875 Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His 1880 1885 1890 Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser 1895 1900 1905 Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr 1910 1915 1920 Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr 1925 1930 1935 Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val 1940 1945 1950 Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn 1955 1960 1965 Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile 1970 1975 1980 Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met 1985 1990 1995 Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly 2000 2005 2010 Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val 2015 2020 2025 Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn 2030 2035 2040 Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys 2045 2050 2055 Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp 2060 2065 2070 Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu 2075 2080 2085 Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro 2090 2095 2100 Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln 2105 2110 2115 Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala 2120 2125 2130 Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln 2135 2140 2145 Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg 2150 2155 2160 Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala 2165 2170 2175 Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly 2180 2185 2190 Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His 2195 2200 2205 Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu 2210 2215 2220 Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu 2225 2230 2235 Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His 2240 2245 2250 Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn 2255 2260 2265 Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly 2270 2275 2280 Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys 2285 2290 2295 Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro 2300 2305 2310 Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn 2315 2320 2325 Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu 2330 2335 2340 Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu 2345 2350 2355 Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala 2360 2365 2370 Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu 2375 2380 2385 Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys 2390 2395 2400 Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val 2405 2410 2415 Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp 2420 2425 2430 Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln 2435 2440 2445 Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu 2450 2455 2460 His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu 2465 2470 2475 Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys 2480 2485 2490 Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile 2495 2500 2505 Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg 2510 2515 2520 Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly 2525 2530 2535 Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg 2540 2545 2550 Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly 2555 2560 2565 Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys 2570 2575 2580 Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg 2585 2590 2595 Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn 2600 2605 2610 Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr 2615 2620 2625 Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu 2630 2635 2640 Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu 2645 2650 2655 Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro 2660 2665 2670 Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys 2675 2680 2685 Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn 2690 2695 2700 Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys 2705 2710 2715 Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala 2720 2725 2730 Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln 2735 2740 2745 Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala 2750 2755 2760 Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn 2765 2770 2775 Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2780 2785 2790

Claims (103)

  1. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 상기 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
    i) 상기 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT: nucleocytoplasmic transport)의 억제제이고/이거나
    ii) 상기 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L: leader) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus) ICP27 단백질 및 랍도바이러스 매트릭스(M: matrix) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 바이러스 단백질인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV: Venezuelan equine encephalitis virus) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 피코르나바이러스 2A 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 라이노바이러스 3C 프로테아제 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 코로나바이러스 ORF6 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 에볼라바이러스 VP24 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 NCT 억제제는 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 L 단백질은 타일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 공유하는, 방법.
  15. 제5항에 있어서, 상기 L 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV: encephalomyocarditis virus)의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
  16. 제5항에 있어서, 상기 L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90% 동일성을 공유하는, 방법.
  17. 제5항에 있어서, 상기 L 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스의 L 단백질, 및 사폴드 바이러스 2의 L 단백질 또는 이의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터를 포함하며, 상기 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 상기 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드와 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 인핸서 단백질을 인코딩하는 상기 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 상기 표적 단백질은 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결되고, 상기 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 공유 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 리보솜 스키핑 부위에 의해 연결된 상기 표적 단백질 및 상기 인핸서 단백질 둘 다를 인코딩하는 단일 전령 RNA의 전사를 위해 구성되고; 여기서, 상기 전령 RNA의 번역은 상기 표적 단백질 및 상기 L 단백질을 별개의 폴리펩타이드로서 발현시키는 결과를 가져오는, 방법.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 하나의 벡터를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은:
    a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터; 및
    b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 2개의 벡터를 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)에 작동가능하게 연결되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소에 의한 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다의 전사를 위해 구성된 T7 프로모터를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터 중 적어도 하나는 T7 RNA 중합효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  30. 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 벡터는:
    a) 상기 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 인핸서 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
    i) 상기 인핸서 단백질은 핵세포질 수송(NCT)의 억제제이고/이거나
    ii) 상기 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질, 피코르나바이러스 2A 프로테아제, 라이노바이러스 3C 프로테아제, 코로나바이러스 ORF6 단백질, 에볼라바이러스 VP24 단백질, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) 캡시드 단백질, 헤르페스 바이러스(HSV) ICP27 단백질, 및 랍도바이러스 매트릭스(M) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 상기 제2 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드와 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 작동가능하게 연결된 공유 프로모터를 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 치료 단백질인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 면역원성 단백질인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체, 나노바디, 수용체, 이중특이적 T 세포 관여제(BiTE: bi-specific T-cell engager), 성장 인자, 호르몬, 효소, 면역조절 단백질, 항원, 구조 단백질, 혈액 단백질, 항미생물 폴리펩타이드, 항바이러스 폴리펩타이드, 종양 억제인자, 전사 인자, 또는 번역 인자인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 표적 단백질은 혈액 단백질인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 면역 반응을 이끌어내는 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체의 질병을 치료하고, 상기 질병은 상기 표적 단백질에 의해 유발되거나, 관련되거나, 연관되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체의 질병을 치료하고, 상기 대상체에서의 상기 표적 단백질의 발현 수준은 대조군 대상체에서의 상기 표적 단백질의 발현 수준보다 낮고, 상기 대조군 대상체는 상기 질병을 갖지 않는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 압식시맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아미반타맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 부로수맙, 카나키누맙, 카플라시주맙, 카프로맙, 카투막소맙, 세미플리맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 크리잔리주맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 더발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에마팔루맙, 에미시주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엡티네주맙, 에레누맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에볼로쿠맙, 프레마네주맙, 갈카네주맙, 젬투주맙 오조가미신, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 임시로맙, 인플릭시맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 라나델루맙, 로키베트맙, 메폴리주맙, 모가물리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 폴라투주맙 베도틴, 라코투모맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 라불리주맙, 레슬리주맙, 리산키주맙, 리툭시맙, Rmab, 로모소주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 탈케타맙, 테클리스타맙, 테프로투무맙, 틸드라키주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 듀오카마진, 트라스투주맙 엠탄신, 우스테키누맙 및 베돌리주맙, 블리나투모맙, 에미시주맙, 솔리토맙, 애드넥틴, 안티칼린, 아비머, 피노머, 쿠니츠 도메인, 노틴, 아피바디, DARPin, 혈전용해제, 트랜스페린, t-PA, 히루딘, C1 에스테라제 억제제, 항트롬빈, 혈장 칼리크레인 억제제, 플라스민, 프로트롬빈 복합체, 보체 성분, 프리알부민(트랜스티레틴), 알파 1 항트립신, 알파-1-산 당단백질, 알파-1-태아단백질, 알파2-마크로글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 마이크로글로불린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 보체 성분 3, 보체 성분 4, C 반응성 단백질(CRP), 지질단백질(킬로미크론, VLDL, LDL, HDL), 트랜스페린, 프로트롬빈, 만노스 결합 렉틴(MBL), 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 조절 인자 및 응고 인자, 예를 들어, 인자 I, 인자 II, 인자 III, 인자 IV, 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 프리칼리크레인, 피츠제럴드 인자, 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조 인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2, 암 응혈원, EPO, IGF-1, G-CSF, GM-GCF, BMP-2, BMP-7, KGF, PDGF-BB, TMP, 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태형성 단백질(BMPs), 섬모 신경영양 인자 패밀리, 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6), 집락 자극 인자, 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 표피 성장 인자(EGF), 에프린스 - 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3, 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장인자(FGF) 1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23의 각각, 소 태아 성장 호르몬(FBS), 리간드의 GDNF 패밀리, 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀, 아르테민, 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린 유사 성장 인자-2(IGF-2), 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 각질세포 성장 인자(KGF), 이동 자극 인자(MSF), 간세포 성장 인자 유사 단백질(HGFLP)로도 알려진 대식세포 자극 단백질(MSP), 미오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린 1(NRG1) 뉴레귤린 2(NRG2), 뉴레귤린 3(NRG3), 뉴레귤린 4(NRG4), 뉴로트로핀, 뇌유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 태반성장인자(PGF), 혈소판유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS), T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), Wnt 신호전달 경로, 글루카곤 유사 펩타이드-1, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 난포 자극 호르몬, 칼시토닌, 루트로핀, 글루카곤 유사 펩타이드-2, 렙틴, 부갑상선 호르몬, 융모성 생식선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 및 글루카곤, 알파-글리코시다제, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-황산염, 알파-갈락토시다제, 요산염 산화효소, N-아세틸-갈락토시다제, 카르복시펩티다제, 히알루로니다제, DNA 분해효소, 아스파라기나제, 요산분해효소, 아데노신 데아미나제 및 다른 엔테로키나제, 사이클라제, 카스파제, 카텝신, 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 분해효소, 이성질화효소 및 연결효소, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 이미글루세라제, 탈리굴세라제 알파, 벨라글루세라제 알파, 알글루세라제, 세벨리파제 알파, 라로니다제, 이두설파제, 엘로설파제 알파, 갈설파제, 알글루코시다제 알파, C3 억제제, 헐러 및 헌터 교정 인자, 이온 채널, 간극 연접, 이온성 수용체, 수송체, 세포 표면 수용체, 도파민 수용체 1(DRD1), 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR), C1 에스테라제 억제제(C1-Inh), IL2 유도성 T 세포 키나제(ITK), 및 NADase로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제35항 및 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체인, 방법.
  43. 제1항 내지 제35항 및 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 아달리무맙인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 132의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 아달리무맙의 중쇄는 서열번호 134의 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  47. 제43항에 있어서, 아달리무맙의 경쇄는 서열번호 135의 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 인핸서 단백질은 상기 대상체에서 상기 표적 단백질의 활성을 증가시키는, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 인핸서 단백질은 상기 대상체에서 상기 표적 단백질의 발현 수준을 낮추는, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 인핸서 단백질은 상기 대상체의 주사 부위에서 상기 표적 단백질의 발현의 균일성을 증가시키는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 인핸서 단백질은 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 활성 표적 단백질의 지속 기간을 증가시키는, 방법.
  52. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 아달리무맙 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 아달리무맙 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 124의 아달리무맙 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 129의 아달리무맙 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 세포 또는 상기 대상체에서 상기 아달리무맙 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 상기 아달리무맙 단백질의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 상기 아달리무맙 단백질이 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 조직 또는 상기 대상체에서 상기 표적 단백질의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 상기 표적 단백질의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
  59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 아달리무맙 단백질의 동시 발현은 아달리무맙의 EC50을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
  60. 제52항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 서열번호 191 내지 216의 세트의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 217 내지 242의 세트의 서열을 포함하는, 방법.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  65. 제62항에 있어서, 상기 LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
  66. 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
  67. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 GBA 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 406의 GBA 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 GBA 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 상기 GBA 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 GBA 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 GBA의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 GBA 단백질의 동시 발현은 GBA가 대상체의 세포 또는 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 조직 또는 상기 대상체에서 GBA의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 GBA 단백질의 동시 발현은 GBA의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 GBA 단백질의 동시 발현은 최대 반응의 50%(EC50)를 생성하는 데 효과적인 GBA의 농도를 감소시키는, 방법.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  79. 제76항에 있어서, 상기 LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
  80. 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
  81. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 표적 단백질을 인코딩하는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 표적 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 8의 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 표 8의 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 9의 단백질 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 세포 또는 대상체에서 상기 표적 단백질의 발현 수준을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 만큼 감소시키는, 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 상기 표적 단백질의 활성을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 증가시키는, 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 상기 표적 단백질이 상기 대상체의 세포 또는 상기 대상체에서 발견되는 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배 약 17배, 약 18배, 약 19배, 또는 약 20배 만큼 증가시키는, 방법.
  87. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 상기 대상체의 조직 또는 상기 대상체에서 상기 표적 단백질의 변동 계수(CV%)를 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3배 만큼 증가시키는, 방법.
  88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 상기 표적 단백질의 분해를 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리더 단백질과 상기 표적 단백질의 동시 발현은 표적의 EC50을 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 60배, 약 70배, 약 80배, 약 90배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 또는 약 300배 만큼 감소시키는, 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 아데노바이러스 유전자 E4, E2A, VA 및 AAV의 Cap 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  91. 제81항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 지질 나노입자(LNP)를 통해 투여되는, 방법.
  92. 제81항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 PEG화된 지질, 콜레스테롤, 및 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 LNP는 약 0.5% 내지 약 2%의 PEG화된 지질, 약 35% 내지 약 45%의 콜레스테롤, 및 약 5% 내지 약 65%의 하나 이상의 이온화 가능한 지질을 포함하는, 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 LNP는 약 1% DMG-PEG(2000), 약 40% 콜레스테롤, 약 10% DOPC 및 약 50% DLin-KC2-DMA의 비율로 DMG-PEG(2000), 콜레스테롤, DOPC 및 DLin-KC2-DMA를 포함하는, 방법.
  95. 제81항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 근육내 또는 피하로 전달되는, 방법.
  96. 임의의 선행하는 청구항에 따른 방법에 사용하기 위한 벡터 시스템.
  97. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 포함하는 조성물로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 아달리무맙 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 아달리무맙 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 124의 아달리무맙 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열번호 129의 아달리무맙 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 조성물.
  99. 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 포함하는 조성물로서, 상기 하나 이상의 벡터는:
    a) 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 글루코실세라미다제(GBA) 단백질을 인코딩하는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 GBA 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 406의 GBA 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 조성물.
  101. 하나 이상의 벡터를 포함하는 조성물로서:
    a) 표적 단백질을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하며;
    상기 표적 단백질을 인코딩하는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 및 상기 L 단백질을 인코딩하는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고; 상기 표적 단백질과 상기 L 단백질은 동시 발현되는, 조성물.
  102. 제101항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 8의 가변 중쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 표 8의 가변 경쇄 서열 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 조성물.
  103. 제102항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 표 9의 단백질 서열, 또는 여기에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는, 조성물.
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