KR20230156945A - 백신 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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바바라 머틴스
토마스 폴리어드
임레 매거
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익셉젠 인크.
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Abstract

본 개시내용은 하나 이상의 바이러스 항원 단백질 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 또는 이의 기능성 변이체이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 기능성 바이러스 유사 입자(VLP)의 생산을 개선할 수 있다.

Description

백신 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 3월 17일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 제63/162,496호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
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바이러스 감염 질환, 예를 들어, 독감은 매우 널리 퍼져 있으며 종종 전염성이 있다. 바이러스 질환은 바이러스 감염 유형 및 개인의 연령 및 전반적인 건강 등을 비롯한 다른 요인에 따라 특징 및 중증도가 달라지는 매우 다양한 증상을 일으킨다. 바이러스 감염은 바이러스 유형 및 다른 요인에 따라 다양한 정도의 성공으로 치료될 수 있다. 때로는 치료는 증상 관리만 포함할 수 있다.
바이러스 감염을 방지하는 가장 효과적인 방식은 백신 접종을 사용하는 것이며, 이는 추후 감염을 방지하는 전체론적 세포 및/또는 체액 면역 반응을 유도할 수 있다. 예방 접종은 바이러스 감염의 발생을 예방하거나 중증도를 최소화함으로써 엄청난 공중 보건 및 경제적 이익을 제공한다. 바이러스 감염을 포함하여 20개 초과의 생명을 위협하는 질환을 예방하기 위한 백신이 입수 가능하지만, 새로운 감염성 바이러스, 예를 들어, SARS CoV2의 출현으로 인해 새로운 바이러스 표적에 대한 백신의 신속한 연구 및 개발이 필요할 수 있다. 그러나, 최신 게놈 서열분석(sequencing) 및 다른 기술 발전에도 불구하고 백신 개발은 여전히 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 든다.
따라서 다양한 바이러스를 표적으로 하는 백신 개발에 신속하게 적용할 수 있는 범용성(versatility)을 갖는 방법 및 조성물이 필요하다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 도 1b는 CoVEG2(도 1a) 및 CoVEG1(도 1b)의 플라스미드 맵을 나타낸다. 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus) 인핸서 및 프로모터 및 시미안 바이러스 40 Poly A(SV40PA: Simian virus 40 Poly A)의 상대 위치를 또한 나타낸다.
도 2는 HEK293 세포에서 CoVEG2로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질, SARS-CoV-2 M 단백질, SARS-CoV-2 E 단백질 및 SARS-CoV-2 N 단백질의 발현을 나타낸다.
도 3은 CoVEG2로부터 발현된 SARS-CoV-2 S, N, M 및 E 단백질이 VLP로 조립될 수 있고 세포로부터 분비된다는 것을 나타낸다. 실시예 3을 참조한다. 도 3a는 크기 배제 크로마토그래피 공극 샘플에서 S, N, M, 및 E 단백질 밴드를 나타낸 SDS PAGE 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 도 3b는 크기 배제 VLP 단리 전개의 크로마토그램을 나타내는 반면 VLP를 함유하는 공극 부피 피크는 화살표로 표시된다. 도 3c는 크기 배제 크로마토그래피 공극 샘플에서 S, N, M, 및 E 단백질 밴드를 나타낸 웨스턴 블로팅 실험으로부터의 결과를 나타낸다. E: 외피 단백질; M: 막 단백질; N: 뉴클레오캡시드 단백질; S: 스파이크 단백질; NT: 형질주입되지 않음.
도 4는 마우스에서 CoVEG1 및 CoVEG2 플라스미드의 면역원성을 시험하기 위한 연구 설계를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5o는 각각 CoVEG 3 내지 CoVEG17 각각의 플라스미드 맵을 나타낸다. 도 5p는 대조군 S 단독 플라스미드의 플라스미드 맵을 나타낸다. CMV: 거대세포바이러스; SV40PA: 시미안 바이러스 40 Poly A.
도 6은 CoVEG3 내지 CoVEG17 각각에서 발현 카세트의 개략도를 나타낸다. 플라스미드 CoVEG 3 내지 CoVEG17 각각은 암호화된 유전자, 유전자 요소의 순서 및 조절 요소, 예를 들어, 바이러스 패키징 신호(viral packaging signal)의 존재 또는 부재가 달라진다. "M", "S", "N" 및 "E"로 표시된 상자는 각각 막 단백질, 스파이크 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질 및 외피 단백질을 암호화한 유전자를 나타낸다. "L"로 표시된 상자는 L 인핸서 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다. "S (Mut)"는 내부 내인성 푸린 절단 부위가 다음 아미노산 치환: R682G, R683S, R685S을 포함하도록 돌연변이되고; 2개의 아미노산 치환인 K986P 및 V987P를 더 갖는 주입전 입체배좌 안정화된 스파이크 단백질 돌연변이체를 나타낸다.
도 7은 다른 바이러스 단백질(M, N 또는 E)이 없는 S 단백질만을 발현하는 대조군 플라스미드 또는 제시된 플라스미드 각각으로 형질주입된 HEK293T 세포의 항-스파이크(S) 단백질 항체 면역염색으로부터의 영상을 나타낸다. 영상은 이들 세포에서 S 단백질의 발현을 확인해 준다.
도 8은 제시된 CoVEG 작제물이 일시적으로 형질주입되는 경우 세포 배양 상청액으로부터 단리된 바이러스 유사 입자(VLP: viral-like particle)의 제제의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 나타낸다. "S"는 다른 바이러스 단백질(M, N 또는 E)이 없는 S 단백질만을 발현하는 대조군 플라스미드로의 일시적인 형질주입을 나타낸다. 항-RBD 항체(좌측) 및 항-N 단백질 항체(우측)로의 염색은 시험된 플라스미드가 VLP로서 바이러스 구조 단백질을 발현하고 이를 세포 배양 상청액으로 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. 적색 화살표는 전장 단백질을 나타낸다.
도 9a는 56일 후 제시된 CoVEG 플라스미드 각각이 주사된 BALB/c 마우스로부터의 1:500으로 희석된 혈청 샘플을 사용하여 ELISA 분석으로부터 입수한 전체 신호 값을 나타낸다. 도 9b는 56일 후 제시된 CoVEG 플라스미드 각각이 주사된 BALB/c 마우스로부터의 혈청 샘플을 사용하여 ELISA 분석으로부터 입수한 종점 역가 값을 나타낸다. 종점 역가는 ELISA 신호(450 nm에서의 흡광도)가 배경 신호의 3 표준 편차를 초과하는 상호 최대 항체 희석을 지칭한다.
도 10은 상업적인 cPass™ 중화 검정(GenScript)을 사용하여 제시된 각각의 플라스미드가 주사된 마우스로부터 입수한 혈청 샘플에 의한 ACE2 수용체에 대한 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)의 시험관 내 결합의 저해 백분율(%)을 나타낸다. 결과는 CoVEG5 및 CoVEG8-주사 마우스로부터 입수한 혈청 샘플이 중화 항체를 가짐을 나타낸다. 양성 대조군 및 음성 대조군은 cPass 중화 검정 키트의 검정 대조군이고, 각각 알려진 양의 SARS-CoV-2 중화 항체 또는 혈청음성 샘플을 함유하며, 제조사의 프로토콜에 따라 사용된다.
도 11은 제시된 CoVEG 작제물이 일시적으로 형질주입되는 경우 세포 배양 상청액으로부터 단리된 바이러스 유사 입자(VLP) 제제의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 나타낸다. 항-RBD 항체(좌측) 및 항-N 단백질 항체(우측)로의 염색은 시험된 플라스미드가 VLP로서 바이러스 구조 단백질을 발현하고 이를 다양한 효율로 세포 배양 상청액으로 분비할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12는 제시된 CoVEG 작제물이 일시적으로 형질주입되는 경우 세포 배양 상청액으로부터 단리된 바이러스 유사 입자(VLP) 제제의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 나타낸다. 항-RBD 항체(좌측) 및 항-N 단백질 항체(우측)로의 염색은 시험된 플라스미드가 VLP로서 바이러스 구조 단백질을 발현하고 이를 다양한 효율로 세포 배양 상청액으로 분비할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 13은 15일 후에 제시된 CoVEG 플라스미드 각각을 피부내(ID: intradermally) 또는 근육내(IM: intramuscularly) 주사한 BALB/c 마우스로부터의 ELISA 분석으로부터 입수한 총 신호 값을 나타낸다. "S-only"는 스파이크 단백질의 단독 투여를 나타낸다.
도 14a는 인핸서 단백질(EMCV L1 단백질)과 함께 웨스트 나일 바이러스 단백질, preM 단백질 및 외피 단백질을 암호화하는 플라스미드의 맵을 나타낸다. 도 14b는 웨스트 나일 바이러스 단백질, preM 단백질 및 외피 단백질 CMV: 거대세포바이러스; SV40PA: 시미안 바이러스 40 Poly A만을 암호화하는 대조군 플라스미드의 맵을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 HEK293 세포에서 VLP 분비의 ELISA 분석으로부터 입수한 총 신호 값을 나타낸다. 도 15a는 항스파이크(S 단백질) 항체를 사용하여 수행된 VLP 분비의 ELISA 분석을 나타낸다. 도 15b는 항-뉴클레오캡시드(N 단백질) 항체를 사용하여 수행된 VLP 분비의 ELISA 분석을 나타낸다.
도 16은 CoVEG10 및 CoVEG20 단백질 발현의 투과 전자 현미경(TEM: transmission electron micrographs)을 나타낸다. 도 16, 좌측은 L 조절 단백질을 함유하는 CoVEG10의 TEM을 나타낸다. 도 16, 우측은 L 조절 단백질이 결여된 CoVEG20의 TEM을 나타낸다.
도 17은 제시된 플라스미드 각각이 형질주입된 HEK293T 세포의 항-뉴클레오캡시드(N) 단백질 항체 면역염색으로부터의 영상을 나타낸다.
도 18은 제시된 CoVEG 작제물이 일시적으로 형질주입되는 경우 세포 배양 상청액으로부터 단리된 바이러스 유사 입자(VLP) 제제의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과를 나타낸다. 항-RBD 항체(좌측) 및 항-N 단백질 항체(우측)로의 염색은 시험된 플라스미드가 VLP로서 바이러스 구조 단백질을 발현하고 이를 다양한 효율로 세포 배양 상청액으로 분비할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 19는 CoVEG10 플라스미드의 동시면역침전 실험의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. (좌측) N 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 풀-다운 신호는 N 단백질이 입자 내에 유지되었음을 나타낸다. (우측) 항-RBD 항체 없이 co-IP를 수행하였는데, 이는 N 단백질이 침전 수지에 비특이적으로 결합하지 않았음을 입증한다.
도 20은 C57BL/6 마우스에서 근육내(IM) 또는 피부내(ID) 주사 후 CoVEG5 및 CoVEG9 내지 CoVEG14 플라스미드뿐만 아니라 스파이크(S) 단백질 단독 함유 플라스미드로부터의 항체 결합 역가를 나타낸다.
도 21은 도 20에 도시된 샘플로부터의 중화 항체의 ELISA 분석을 나타낸다.
도 22는 C57BL/6 마우스에서 근육내(IM) 또는 피부내(ID) 주사 후 CoVEG9, CoVEG10 및 CoVEG18 내지 CoVEG20 플라스미드뿐만 아니라 스파이크(S) 단백질 단독 함유 플라스미드로부터의 항체 결합 역가를 나타낸다.
도 23은 C57BL/6 마우스에서 CoVEG9, CoVEG10 및 CoVEG20 플라스미드 근육내(IM) 또는 피부내(ID) 주사에 응답하여 생산된 중화 항체의 ELISA 분석을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 CoVEG10 및 CoVEG20의 T-세포 분석 결과를 나타낸다. 도 24a는 CoVEG10의 T-세포 분석 결과를 나타낸다. 도 24b는 CoVEG20의 T-세포 분석 결과를 나타낸다.
도 25는 인핸서 단백질이 있는 단리되고 재현탁된 웨스트나일 바이러스(WNV: West-Nile Virus) 작제물(WNV + EG, 원) 및 인핸서 단백질이 없는 단리되고 재현탁된 웨스트나일 바이러스(WNV) 작제물(WNC, 사각형)이 형질주입된 HEK293T 세포의 세포 배양 상청액으로부터 정제된 VLP의 ELISA 분석을 나타낸다. ELISA의 특이성을 특이적 ELISA 검정에서 신호를 제공하지 않는 GFP를 함유한 플라스미드에 대해 시험하였다. ELISA 분석은, 인핸서 단백질을 첨가한 초원심분리에 의한 VLP의 단리가 인핸서 단백질이 없을 때보다 더 많은 활성 VLP를 함유하였다는 것을 나타내었다. 이는, 인핸서 단백질의 부재 하에서 생산된 단백질의 총량이 더 높았기 때문에 특히 놀라운 것이었고, 인핸서 단백질의 첨가가 발현된 표적 단백질의 품질을 증가시켰다는 것을 더 입증하였다.
도 26a 및 도 26b는 인핸서 단백질이 있는 과발현된 웨스트나일 바이러스(WNV) 작제물(WNV + L) 및 인핸서 단백질이 없는 과발현된 웨스트나일 바이러스(WNV) 작제물(WNV)을 함유한 상청액을 과발현하는 HEK293T 세포로부터 입수한 세포 배양 상청액의 시간 경과 분석을 나타낸다. 도 26a는 WNV + L(좌측) 작제물에서 VLP 농도가 형질주입 후 72시간에 최고조에 달했고 그 후 점차적으로 감소했음을 입증하는 ELISA 분석을 나타낸다. 발현 프로파일이 일시적인 형질주입으로부터 예상되는 VLP 생산 및 관련 VLP 입자 반감기에 따랐기 때문에, 이는 건강한 세포로부터의 VLP 분비의 증거였다. 대조적으로, 인핸서 단백질이 없는 WNV 작제물은 상청액에서 VLP의 지속적인 증가를 나타내었는데(우측), 이는 활성 분비보다는 세포 사멸 중에 세포로부터의 단백질의 비특이적 방출과 더 일치한다. 도 26b는 세포 영상으로 ELISA 분석을 확인하였다. WNV +L 세포 영상(좌측)은 세포 사멸이 거의 또는 전혀 나타나지 않은 반면, WNV 세포 영상은 형질주입 후 72시간에 시작하여 세포 사멸의 가시적인 징후를 나타내었다(우측, 검은 별표로 표시된 세포 사멸).
도 27a 및 도 27b는 마우스의 면역화 후 제42일 및 제70일에 CoVEG9, 인핸서 단백질이 있는 스파이크 작제물(스파이크 + L) 및 인핸서 단백질이 없는 스파이크 작제물(스파이크)의 중화 항체 분석을 나타낸다. 중화 항체의 존재는 상업적인 cPass™ SARS-CoV-2 대용체 바이러스 중화 시험(sVNT: Surrogate Virus Neutralization Test) 키트(GenScript)를 사용하여 검출하였다. 분석은, 모든 작제물이 시간 경과에 따라 일부 중화 능력을 손실하지만 인핸서 단백질의 첨가는 시험된 동물의 혈청에서 목적하는 중화 항체(CoVEG9 및 스파이크 + L)의 존재가 연장되는 것을 나타내었다. 도 27a는 제42일 및 제70일에 군별 개별 동물을 나타낸다. 도 27b는 동일한 데이터의 각각의 치료군에서의 중화 항체 수준 중앙값을 나타낸다.
도 28은 인핸서 단백질이 있는 웨스트나일 바이러스(WNV) 작제물(WNV + L, 좌측) 또는 인핸서 단백질이 없는 웨스트나일 바이러스(WNV) 작제물(WNV, 우측)을 과발현하는 세포로부터의 면역형광 영상을 나타낸다. 다른 실시예에서 관찰된 바와 같이, WNV(우측)와 비교하여 면역염색에 사용된 2차 항체의 더 약한 Alexa Fluor 488 Fluor 신호에 의해서 나타난 바와 같이(WNV + L, 좌측), 인핸서 단백질을 첨가하는 경우 단백질의 총량이 감소하였다. 그러나, 인핸서 단백질의 부재는 발현된 단백질의 응집 또는 잘못된 접힘과 일치하는 핵 초점의 형성으로 이어졌는데, 이는 인핸서 단백질이 있는 작제물(WNV + L)에 비해서 더 낮은 품질의 발현 단백질을 나타낸다.
본 개시내용은 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 유입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스(HPV: Human Papilloma virus), 웨스트나일 바이러스, 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV: Human Immunodeficiency Virus) 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 코로나바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스이다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질이다. 일부 실시형태에서, 스파이크 단백질은 서열번호 13과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 스파이크 단백질은 서열번호 13이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 막(M) 단백질이다. 일부 실시형태에서, M 단백질은 서열번호 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, M 단백질은 서열번호 33이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 외피(E) 단백질이다. 일부 실시형태에서, E 단백질은 서열번호 22와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, E 단백질은 서열번호 22이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질이다. 일부 실시형태에서, N 단백질은 서열번호 20과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, N 단백질은 서열번호 20이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 웨스트나일 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 전구체 막 단백질(preM), 외피 당단백질(E), 또는 이의 조합물이다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 서열번호 35 내지 서열번호 49, 서열번호 55 및 서열번호 62로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 네이키드 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 데옥시리보핵산(DNA) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 플라스미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 선형 DNA를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등을 포함하며, 일부 경우에는 자율적으로 복제할 수 있거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제되지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오티드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 둘 다로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리-라이신-접합 DNA 또는 RNA, 펩티드-접합 DNA 또는 RNA, 리포솜-접합 DNA 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제 가능 아데노바이러스 벡터, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 비바이러스 플라스미드, 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지, 인공 염색체, 또는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 박테리아 인공 염색체(BAC: bacterial artificial chromosome), 플라스미드, 박테리오파지 P1-유래 벡터(PAC: bacteriophage P1-derived vector), 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome), 또는 포유동물 인공 염색체(MAC: mammalian artificial chromosome)이다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 DNA 폴리뉴클레오티드는 바이러스 패키징 신호를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 RNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 코로나바이러스로부터 유래된다.
본 개시내용은 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 아주반트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 명반(alum)이다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 모노포스포릴 지질 A(MPL: monophosphoryl lipid A)이다.
본 개시내용은 세포를 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 진핵 세포에서 바이러스 항원을 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은, 인핸서 단백질이 없는 벡터보다 (i)더 높은 발현 수준에서의 항원의 발현; 및/또는 (ii)더 긴 시간 기간 동안의 항원의 발현; 및/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원의 발현을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은, 인핸서 단백질이 없는 벡터보다 (i)더 높은 발현 수준에서의 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)의 발현; 및/또는 (ii)더 긴 시간 기간 동안의 항원을 포함하는 VLP의 발현; 및/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원을 포함하는 VLP의 발현을 일으킨다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 바이러스 패키징 신호의 발현을 일으키고, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군 벡터와 비교할 때, 더 많은 수의 VLP의 형성을 일으킨다.
본 개시내용은 본원에 개시된 백신 조성물 중 임의의 하나의 유효랑을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 투여 부위의 조직은 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 투여 부위의 조직은 인핸서 단백질이 없는 벡터가 투여되는 경우보다 (i)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 더 높은 발현 수준으로 발현하고; 그리고/또는 (ii)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP을 더 긴 시간 기간 동안 발현하고; 그리고/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 대상체의 투여 부위의 조직은 바이러스 패키징 신호를 발현하고, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군 벡터와 비교할 때, 더 많은 수의 VLP의 발현을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호를 캡시드화하는 VLP는 항원을 포함하지만 바이러스 패키징 신호가 없는 대조군 VLP보다 더 양호한 면역원성이다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 항체 반응을 유발한다. 일부 실시형태에서, 항체 반응은 중화 항체 반응이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 면역 반응을 유발한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 예방학적, 예방적 및/또는 치료적 면역 반응을 유발한다. 일부 실시형태에서, 투여는 피부내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 비강내 투여이다.
본 개시내용은 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성 또는 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2이다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24이다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 단백질은 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성한다.
본 개시내용은 서열번호 30의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30의 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용은 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 네이키드 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
본 개시내용은 벡터를 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 벡터는 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다.
본 개시내용은 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 발현 카세트는 표적 유전자에 연결된 프로모터를 포함하고, 벡터는 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소는 RNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소는 코로나바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소는 SARS-CoV2로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열과 적어도 약 70%의 동일성을 갖는다.
본 개시내용은 세포를 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 진핵 세포에서 표적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 표적 단백질의 바이러스 유사 입자(VLP)의 형성을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 발현 카세트를 포함하지만 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열이 없는 대조군 벡터와 비교할 때 더 많은 수의 표적 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)의 형성을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열과 적어도 약 70%의 동일성을 갖는다.
본 개시내용은 발현 카세트를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제3 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
본 개시내용은 또한 발현 카세트를 포함하는, 백신으로서 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열, 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
본 개시내용은 또한 백신으로 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 이 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
본 개시내용은 백신으로 사용하기 위한 벡터를 제공하며, 이 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, IRES 서열은 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 .
바이러스 유사 입자(VLP)는 바이러스 구조 단백질로 구성된다. VLP는 면역원성이지만, 이들은 비감염원성이다. 따라서 VLP는 백신 개발에 사용할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있다. VLP는 시험관 내에서 생산된 후 면역화가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, VLP는 대상체의 생체 내에서 생산될 수 있다.
VLP의 생산은 주로 보통 하나 초과의 플라스미드로부터의 하나 초과의 구조 단백질의 발현을 요구하기 때문에 어려움이 있다. 일부 경우에, VLP의 형성을 지원하기 위해 상이한 구조 단백질을 운반하는 몇몇 플라스미드를 정의된 비율로 숙주 세포에 도입해야 할 수도 있다. 이 과정은 신뢰할 수 없으며 보통 필요한 품질의 충분한 수준의 VLP를 생산하지 못한다. VLP의 형성에 필요한 여러 구조 단백질이 단일 플라스미드 또는 단일 RNA 전사체로부터 발현될 수 있는 경우, VLP 제조 과정이 상당히 단순화되어 VLP를 포함하는 백신 개발에 상당한 도움을 줄 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 생체 내에서 높은 수준의 VLP의 신뢰할 수 있는 형성을 가능하게 하고, 따라서 VLP 상의 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 강력한 유도를 가능하게 한다. 또한, 이러한 조성물 및 방법은 상이한 바이러스, 예를 들어, 코로나바이러스(예를 들어, SARS CoV-2), 인플루엔자 바이러스 및 웨스트나일 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다.
정의
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 언급은 하나 이상의 항원을 지칭할 수 있고, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 동등한 단계 및/또는 방법 등에 대한 언급을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치 앞에 존재하는 경우 10% 범위의 플러스 또는 마이너스 값을 나타낸다. 예를 들어 "약 100"은 90 및 110을 포함한다.
본원에서 사용되는, 뉴클레오티드 서열은 달리 명시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 나열되고, 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 나열된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것은 비아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함하며; 변형은 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예를 들어 표지 성분과의 접합을 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다, 그리고 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 자연 및/또는 비자연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 및 기타 동물을 포함한다. 전형적으로 대상체는 인간이다. 예를 들어, 대상체는 성인, 청소년, 아동(2세 내지 14세), 유아(1개월 내지 24개월), 신생아(1개월 까지)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 성인은 약 65세 이상, 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 임신한 여성 또는 임신 계획 중인 여성이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 인간이 아니며; 예를 들어, 비인간 영장류; 예를 들어, 개코원숭이, 침팬지, 고릴라 또는 마카크이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 애완동물, 예를 들어, 개 또는 고양이일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "면역원", "항원" 및 "에피토프"는 면역 반응을 유발할 수 있는 물질, 예를 들어, 당단백질을 비롯한 단백질 및 펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 대상체에서의 "면역원성 반응"은 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응의 대상체에서의 발달을 일으킨다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 결과를 달성하는 데, 예를 들어, 유익하거나 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료될 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 따라야 할 투여 요법, 다른 화합물과 병용하여 투여되는지의 여부, 투여 시기, 투여되는 조직 및 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "바이러스 유사 입자"(VLP)는 적어도 하나의 속성이 바이러스와 유사하지만 감염성이 입증되지 않은 구조를 지칭한다. 본 개시내용에 따른 바이러스 유사 입자는 바이러스 유사 입자의 단백질을 암호화하는 유전 정보를 전달하지 않는다. 일반적으로, 바이러스 유사 입자는 바이러스 게놈이 없기 때문에 비감염성이다. 또한, 바이러스 유사 입자는 보통 이종 발현에 의해 대량으로 생산될 수 있고 쉽게 정제될 수 있다.
본원에서 사용되는, 아미노산 대체라고 상호교환적으로 지칭되는, 단백질 서열상의 특정 위치에서의 아미노산 치환은 본원에서 다음과 같은 방식으로 표시된다: "WT 아미노산 잔기의 한 글자 코드 - 아미노산 위치 - 이러한 WT 잔기를 대체하는 아미노산 잔기의 한 글자 코드". 예를 들어, R682G 돌연변이체인 스파이크(S) 단백질은 682번째 아미노산 위치의 야생형 잔기(R 또는 아르기닌)가 G 또는 글리신으로 대체된 S 단백질을 지칭한다.
벡터
본 개시내용은 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 백신으로 사용되거나 백신 조성물의 일부로 사용된다.
용어 "벡터"는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 성분 사이에서 전파 및/또는 전달될 수 있는 수단을 지칭한다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 벡터는 당업계에 알려진 임의의 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등을 포함하며, 자율적으로 복제할 수 있거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제되지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오티드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 둘 다로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리-라이신-접합 DNA 또는 RNA, 펩티드-접합 DNA 또는 RNA, 리포솜-접합 DNA 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 복제 가능 아데노바이러스 벡터, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 비바이러스 플라스미드, 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지, 인공 염색체, 또는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 박테리아 인공 염색체(BAC), 플라스미드, 박테리오파지 P1-유래 벡터(PAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 포유동물 인공 염색체(MAC)이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 네이키드 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 데옥시리보핵산(DNA) 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 제1 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 제2 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 도 1a 또는 도 1b에 도시된 바와 같은 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 벡터는 CoVEG1이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 CoVEG2이다.
표 1은 CoVEG1 및 CoVEG2의 중요한 영역의 핵산 서열, 및 이들 영역에 의해서 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 1]
i) 발현 카세트
본원에 개시된 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "발현 카세트"는 또 다른 핵산 또는 해당 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질의 생산에 필요한 최소 요소를 포함하는 핵산 분자의 정의된 분절을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함할 수 있고, 발현 카세트는 제1 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 제2 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터; 및 제2 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 둘 다에 작동 가능하게 연결된 공유된 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 연결된 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 코딩 폴리뉴클레오티드는 공유된 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 코딩 폴리뉴클레오티드는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)에 의해서 연결된 인핸서 단백질 및 항원을 암호화하고, 코딩 폴리뉴클레오티드는 공유된 프로모터에 의해서 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 분리 요소(예를 들어, 리보솜 스키핑 부위 또는 2A 요소)에 의해 연결된 항원 및 인핸서 단백질 둘 다를 암호화하는 단일 메신저 RNA의 전사를 위해 구성되며; 여기서 메신저 RNA의 번역은 항원 및 인핸서 단백질(예를 들어, L 단백질)을 별개의 폴리펩티드로서 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 발현 카세트는 하나 이상의 단백질분해 절단 부위, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 단백질분해 절단 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단 부위는 제1 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 제2 항원을 암호화하는 또 다른 폴리뉴클레오티드 사이에 위치된다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단 부위는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치된다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단 부위는 서열번호 50의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질분해 절단 부위는 푸린 절단 부위이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 발현 카세트는 바이러스 액세서리 단백질, 예를 들어 ORF3a 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 54의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 54의 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF3 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF3 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CoVEG3 내지 CoVEG17로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 35 내지 서열번호 49로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 약 70%의 동일성, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5% 또는 약 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 서열번호 35 내지 서열번호 49로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원의 CoVEG3 내지 CoVEG17의 발현 카세트 및 유전 요소의 핵산 서열은 표 2에 열거되어 있다.
[표 2]
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 SARS CoV2 스파이크 단백질을 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 SARS CoV2 막 단백질을 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 SARS CoV2 외피 단백질을 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 SARS CoV2 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 EMCV L 단백질을 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 CoVEG1 내지 CoVEG17 중 임의의 하나로부터의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
ii) 폴리뉴클레오티드
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 자연 공급원으로부터 단리되거나; 예를 들어, PCR 증폭 또는 화학적 합성과 같은 기술을 사용하여 시험관 내에서 제조되거나; 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 생체 내에서 제조되거나; 또는 임의의 적절한 방법으로 제조되거나 입수된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 형상(선형, 원형 등) 또는 토폴로지(단일-가닥, 이중-가닥, 선형, 원형, 슈퍼코일형, 비틀림형(torsional), 니킹(nicked) 등)를 갖는다. 폴리뉴클레오티드는 또한 핵산 유도체, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNAS) 및 폴리펩티드-핵산 접합체; 적어도 하나의 화학적으로 변형된 당 잔기, 골격, 뉴클레오티드간 연결, 염기, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 갖는 핵산; 뿐만 아니라 화학적으로 변형된 5' 또는 3' 단부를 갖는 핵산; 및 이러한 변형 중 2개 이상을 갖는 핵산을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 모든 연결이 동일할 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는, 그것이 단백질의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 생산하기 위해서 전사 및 번역(예를 들어, DNA→RNA→단백질) 또는 번역(RNA→단백질)될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 경우 단백질을 "암호화한다"라고 한다. 생체 내(예를 들어, 진핵 세포 내에서) 전사 및/또는 번역은 내인성 또는 외인성 효소에 의해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 전사는 진핵 세포의 내인성 중합효소 II(polII: polymerase II)에 의해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 외인성 RNA 중합효소는 동일하거나 상이한 벡터상에 제공된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 중합효소가 대안적으로 또는 추가로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 프로모터는 하나 이상의 바이러스 중합효소와 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, RNA 중합효소는 T3 RNA 중합효소, T5 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소, H8 RNA 중합효소, EMCV RNA 중합효소, HIV RNA 중합효소, 인플루엔자 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, CMV RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, T1 RNA 중합효소, SP01 RNA 중합효소, SP2 RNA 중합효소, Phi15 RNA 중합효소 등으로부터 선택된다. 바이러스 중합효소는 RNA 프라이밍 또는 캡핑 중합효소이다. 일부 실시형태에서, IRES 요소는 바이러스 중합효소와 함께 사용된다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 항원; 및/또는 하나 이상의 인핸서 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나의 항원을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나의 인핸서 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 초과의 항원; 하나 초과의 인핸서 단백질, 및/또는 하나 이상의 분리 요소를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 항원성이 아닌 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원성이 아닌 폴리펩티드는 VLP의 일부를 형성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 하나 이상의 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 비항원성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 비항원성 폴리펩티드는 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 항원은 제1 바이러스의 하나 이상의 단백질로부터 유래될 수 있고, 하나 이상의 비항원성 폴리펩티드는 제2 바이러스의 하나 이상의 단백질로부터 유래될 수 있다.
iii) 분리 요소
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항원(들) 및 인핸서 단백질(들)은 동일한 벡터상에 암호화된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항원(들) 및 인핸서 단백질(들)은 별도의 벡터상에 암호화된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 인핸서 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 동일한 벡터에 존재하는 경우, 벡터는 단백질의 개별 발현을 위한 분리 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이시스트론성 벡터 또는 폴리시스트론성 벡터이다. 분리 요소는 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 또는 2A 요소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 2A 요소를 암호화하는 핵산, 또는 IRES를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드, 또는 둘 다는 2A 요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 2A 요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 2A 요소의 비제한적인 예는 P2A, E2A, F2A, 및 T2A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2A 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 17과 적어도 80%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%(이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위 포함)) 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 2A 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 17이다.
일부 실시형태에서, 2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 18 또는 69와 적어도 80%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%(이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위 포함))을 갖는다. 일부 실시형태에서, 2A 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 18 또는 69이다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드, 또는 둘 다는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, IRES 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 또는 67의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%(이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위 포함))을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 또는 67의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항원 및 인핸서 단백질은 단일 융합 단백질에 포함된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 연결 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결 요소는 시스 또는 트랜스의 효소적 절단을 위한 절단 부위(예를 들어 푸린, 카텝신 또는 인테인 절단 부위)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질 또는 연결 요소는 절단 부위를 포함하지 않으며 발현된 융합 단백질은 표적 단백질 및 인핸서 단백질 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결 요소는 2A 요소이다.
iv) 프로모터
본 개시내용에 따른 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터"는 전사를 개시하기 위한 RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 전사 시작으로부터 상류 또는 하류에 위치한 영역 또는 서열을 지칭한다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 당업계에 알려진 임의의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 순방향 프로모터 또는 역방향 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 포유동물 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 천연 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 비천연 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터는 비포유동물 프로모터이다. 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNA 프로모터의 비제한적인 예는 U1, 인간 연장 인자-1 알파(EF-1 알파), 거대세포바이러스(CMV), 인간 유비퀴틴, 비장 병소 형성 바이러스(SFFV: spleen focus-forming virus), U6, H1, tRNALys, tRNASer 및 tRNAArg, CAG, PGK, TRE, UAS, UbC, SV40, T7, Sp6, lac, araBad, trp, 및 Ptac 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 물리적 위치가 아닌 작동 능력에 의해 연결된 핵산 서열의 요소 또는 구조를 지칭한다. 요소 또는 구조는 원하는 작동을 달성할 수 있거나 달성함으로써 특정될 수 있다. 핵산 서열 내의 요소 또는 구조가 작동 가능하게 연결되기 위해 직렬 또는 인접한 순서로 존재할 필요는 없다는 것이 당업자에 의해 인식된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 벡터에 포함된 프로모터는 유도성 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 벡터는 중합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 바이러스 중합효소이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 T7 RNA 중합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 벡터는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 T7 RNA 중합효소로 제2 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다의 전사를 위해서 구성된 T7 프로모터를 포함할 수 있다.
항원
일부 실시형태에서, 항원의 발현 또는 품질은 예를 들어, 하나 이상의 인핸서 단백질과 함께, 개시된 방법에 따른 발현에 의해서 상당히 개선된다. 일부 실시형태에서, 항원은 단일 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 항원은 다수의 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 항원은 하나 이상의 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원이다.
일부 실시형태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은 제한 없이 임의의 바이러스 단백질로부터 유래된 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 바이러스 단백질이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질의 아미노산 서열은 바이러스의 구조 단백질 또는 다수의 구조 단백질의 전체 또는 일부이다. 일부 실시형태에서, 항원 또는 항원은 VLP로 조립되고 발현 세포로부터 방출된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 제한 없이 임의의 코로나바이러스 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스이다. 일부 실시형태에서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스, OC43, 또는 HKU1이다. 일부 실시형태에서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-1이다. 일부 실시형태에서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 다음 단백질 중 임의의 하나 이상의 전체 또는 항원 단편을 포함한다: 코로나바이러스 스파이크 단백질, 코로나바이러스 M 단백질, 코로나바이러스 N 단백질, 및 코로나바이러스 E 단백질.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 SARS-Cov-2 스파이크 단백질, 중동 호흡기 증후군(MERS) 스파이크 단백질, 및 SARS-CoV 스파이크 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 M 단백질은 SARS-Cov-2 M 단백질, MERS M 단백질 및 SARS-CoV M 단백질로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 N 단백질은 SARS-Cov-2 N 단백질, MERS N 단백질, 및 SARS-CoV N 단백질로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 E 단백질은 SARS-Cov-2 E 단백질, MERS E 단백질, 및 SARS-CoV E 단백질로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 또는 서열번호 70의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 또는 서열번호 70의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 13이다.
일부 실시형태에서, SARS-Cov-2 스파이크 단백질은 서열번호 13과 비교할 때 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 S 단백질("S (Mut)"라고도 지칭됨)이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 야생형 S 단백질과 비교할 때 더 높은 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 융합전(prefusion) 입체배좌-안정화된 스파이크 단백질이다. 일부 실시형태에서, S 단백질에서의 돌연변이는 S 단백질의 삼량체 상태를 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 S 단백질의 내부 내인성 단백질분해 절단 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 S 단백질의 내부 내인성 단백질분해 절단 부위의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, S 단백질의 단백질분해 절단 부위 내의 하나 이상의 돌연변이는 조립 과정 동안 S 단백질의 절단을 저해한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 돌연변이체 S 단백질 중 임의의 하나 이상을 포함하는 VLP는 야생형 S 단백질, 예를 들어, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 포함하는 VLP보다 더 면역원성이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 13에 R682, R683, A684, R685, K986, 및 V987로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변형(예를 들어, 치환)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 13에 R682G, R683S, R685S, K986P, 및 V987P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 S 단백질은 서열번호 13에 아미노산 치환, R682G, R683S, R685S, K986P, 및 V987P를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 내부 내인성 푸린 절단 부위에 다음 아미노산 치환을 포함한다: R682G, R683S, R685S. 즉, 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 내부 내인성 푸린 절단 부위에 다음 아미노산을 포함한다: 아미노산 잔기 682에서의 G, 아미노산 잔기 683에서의 S, 아미노산 잔기 684에서의 A, 및 아미노산 잔기 685에서의 S.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 51이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 52의 핵산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 52의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 66의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 또는 서열번호 66의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 M 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 33의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 M 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 33이다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21 또는 서열번호 71의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21 또는 서열번호 71의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 N 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 N 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20이다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 서열번호 72의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 서열번호 72의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 코로나바이러스 E 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는다. 일부 실시형태에서, 코로나바이러스 E 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 볼티모어 분류(Baltimore classification)에 따른 바이러스의 군 I, II, III, IV, V, VI, 또는 VII 중 임의의 하나로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 외피 음성 센스, 단일 가닥, 분절화 RNA 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 외피 DNA 바이러스(예를 들어, B형 간염 바이러스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 비외피 DNA 바이러스(예를 들어, 인간 파필로마바이러스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 양성 가닥 외피 RNA 바이러스(예를 들어, 코로나바이러스, 예를 들어, SARS CoV2, 및 플라비바이러스, 예를 들어, 웨스트나일 바이러스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 SARS-CoV-1, MERS-CoV, 치쿤구니아(chikungunya) 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 지카 바이러스, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, A, B, C), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 에볼라 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, 간염 A, B형 간염, 간염 C, 간염 D, 및 간염 E), 단순 포진 바이러스 타입 1(HSV-1: herpes simplex virus type 1), 단순 포진 바이러스 타입 2(HSV-2: herpes simplex virus type 1), 웨스트나일 바이러스, 및 인간 파필로마바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 웨스트나일 바이러스로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 웨스트 나일 바이러스 단백질은 전구체 막(prM), 외피 당단백질(E), 또는 이의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웨스트나일 바이러스 단백질, 예를 들어, prM 및/또는 E 단백질을 암호화하는 벡터는 도 14a에 도시된 바와 같은 웨스트나일 바이러스 최소 플라스미드(WNV 최소 플라스미드) 또는 도 14b에 도시된 바와 같은 웨스트나일 바이러스 표준 플라스미드(WNV 표준 플라스미드)이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웨스트나일 바이러스 단백질, 예를 들어, prM 및/또는 E 단백질을 암호화하는 벡터는 서열번호 55와 적어도 70%(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 100%)의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웨스트나일 바이러스 단백질, 예를 들어 prM 및/또는 E 단백질을 암호화하는 벡터는 서열번호 64와 적어도 70%(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 100%)의 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 웨스트나일 바이러스 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 60의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 웨스트나일 바이러스 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 60의 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 웨스트나일 바이러스 prM 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 59의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 - 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%이고, 이들 사이의 임의의 값 및 하위 범위를 포함하는 - 을 갖는 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 웨스트나일 바이러스 prM 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 59의 핵산 서열을 갖는다.
본원에 개시된 웨스트 나일 바이러스 항원, 및 그 안의 유전 요소를 암호화하는 벡터의 핵산 서열을 하기 표 3에 열거한다.
[표 3]
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 균주는 제한되지 않으며, 현재 알려지거나 추후에 발견될 임의의 균주, 예를 들어, H1N1, H3N2, 또는 인플루엔자 B 균주일 수 있다. 일부 실시형태에서, 인플루엔자 바이러스 단백질은 HA 단백질, NA 단백질, M1 단백질, M2 단백질, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 B형 간염 바이러스로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, B형 간염 바이러스 단백질은 sAg(S 단백질), sAg(M 단백질), sAg(L 단백질), preS1, preS2, cAg(코어 항원), 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 인간 파필로마 바이러스로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 파필로마 바이러스 단백질은 HPV 6의 L1 단백질, HPV 11의 L1 단백질, HPV 16의 L1 단백질, HPV 18의 L1 단백질, 또는 이의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 하기 표 4에 열거된 바이러스 각각으로부터 유래된 단백질 중 임의의 하나 이상의 전체 또는 항원 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이러스 항원은 조류 인플루엔자 바이러스(H5N3)로부터 유래된 임의의 단백질의 전체 또는 항원 단편을 포함할 수 있다.
[표 4]
인핸서 단백질
어떠한 이론에도 얽매이고자 함은 아니지만, 인핸서 단백질과 항원의 공동 발현은 수율, 품질, 접힘, 번역 후 변형, 활성, 국재화 및 하류 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항원 발현의 하나 이상의 양 개선할 수 있거나, 잘못 접힘, 활성 변형, 잘못된 번역 후 변형 및/또는 독성 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 핵공을 차단함으로써, 핵세포질간 수송(NCT: nucleocytoplasmic transport)을 저해할 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "기능성 변이체"는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질과 상동이고/이거나 피코르나바이러스 리더(L) 단백질과 실질적인 서열 유사성(예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 90%, 95%, 또는 99% 초과의 서열 동일성)을 공유하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 기능성 변이체는 피코르나바이러스 리더(L) 단백질의 하나 이상의 기능성 특징을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질의 기능성 변이체는 NCT를 저해하는 능력을 유지한다.
일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 카디오바이러스, 헤파토바이러스, 또는 아프토바이러스 속으로부터의 L 단백질이다. 예를 들어, 인핸서 단백질은 소 비염 A 바이러스, 소 비염 B 바이러스, 말 비염 A 바이러스, 구제역 바이러스, 헤파토바이러스 A, 헤파토바이러스 B, 마모타 히말라야나(Marmota himalayana) 헤파토바이러스, 포피바이러스, 카디오바이러스 A, 카디오바이러스 B, 테일러 뮤린 뇌척수염 바이러스 바이러스(TMEV: Theiler's Murine encephalomyelitis), 빌류이스크 인간 뇌척수염 바이러스(VHEV: Vilyuisk human encephalomyelitis virus), 테일러 유사 래트 바이러스(TRV: Theiler-like rat virus), 또는 새폴드 바이러스(SAF-V: Saffold virus)로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 테일러 바이러스의 L 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 1과 적어도 90%의 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 1을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 1과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 뇌심근염 바이러스(EMCV: Encephalomyocarditis virus)의 L 단백질 또는 이의 기능성 변이체이다. 일부 실시형태에서, L 단백질은 서열번호 2와 적어도 90%의 동일성을 공유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 2를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 68을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 68과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 공유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 폴리오바이러스의 L 단백질, HRV16의 L 단백질, 멩고 바이러스(mengo virus)의 L 단백질, 및 새폴드 바이러스(Saffold virus) 2의 L 단백질 또는 이의 기능성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 피코르나바이러스 리더(L) 단백질은 표 5에 열거된 단백질 또는 이의 기능성 변이체로부터 선택된다. 피코르나바이러스 리더(L) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표 2에 열거된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 피코르나바이러스 리더(L) 단백질의 아미노산 서열은 표 2에 열거된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 피코르나바이러스 리더(L) 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 12의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 표 2에 열거된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 가질 수 있다.
[표 5]
항원, 인핸서 단백질, 및/또는 융합 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 마커, 표지, 또는 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질은 이의 검출을 가능하게 하는 임의의 표지, 예를 들어, 방사성표지, 형광제, 비오틴, 펩티드 태그, 효소 단편 등으로 표지될 수 있다. 단백질은 친화성 태그, 예를 들어, His-태그, GST-태그, Strep-태그, 비오틴-태그, 면역글로불린 결합 도메인, 예를 들어, IgG 결합 도메인, 칼모둘린 결합 펩티드 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 항생제 저항성 마커를 포함한다.
바이러스 패키징 신호
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(본원에서 "바이러스 패키징 서열" 또는 패키징 신호" 또는 "psi 서열"이라고 상호 교환 가능하게 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 폴리뉴클레오티드, RNA 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 조합이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 RNA 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 하나 초과의 카피, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열의 2, 3, 4 또는 5개의 카피를 포함한다.
바이러스 패키징 신호는 임의의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 벡터로부터 발현되는 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 벡터로부터 발현되는 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호는 SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, MERS-CoV, 치쿤구니아(chikungunya) 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 지카 바이러스, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, A, B, C), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 에볼라 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, 간염 A, B형 간염, 간염 C, 간염 D, 및 간염 E), 단순 포진 바이러스 타입 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스 타입 2(HSV-2), 웨스트나일 바이러스, 및 인간 파필로마바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34의 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 70%의 동일성(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 또는 약 100%)을 가지고, 이들 사이의 모든 값 및 하위범위를 포함한다.
벡터상의 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 위치는 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터상의 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 위치는 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열 모두에 대해서 5'일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터상의 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 위치는 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열 모두에 대해서 3'일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터상의 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하나의 카피의 위치는 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열 모두에 대해서 5'이고, 바이러스 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 다른 카피의 위치는 바이러스 항원을 암호화하는 핵산 서열 모두에 대해서 3'이다. 또한, 바이러스 패키징 신호의 크기는 제한되지 않고, 약 50 bp부터, 약 3 kb, 예를 들어, 약 100 bp, 약 200 bp, 약 300 bp, 약 400 bp, 약 500 bp, 약 550 bp, 약 600 bp, 약 650 bp, 약 700 bp, 약 800, bp, 약 900 bp, 약 1 kb, 약 2 kb, 또는 약 3 kb이고, 이들 사이의 모든 값 및 하위범위를 포함하는 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호의 크기는 약 600 bp 내지 약 700 bp, 예를 들어, 약 650 bp이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호의 크기는 약 661 bp이다.
본 개시내용은 발현 카세트를 포함하는 벡터를 더 제공하며, 상기 발현 카세트는 표적 유전자에 연결된 프로모터를 포함하고, 여기서 벡터는 본원에 개시된 바이러스 패키징 요소 중 임의의 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발현 카세트에서 유전 요소의 순서
본원에 개시된 벡터에서, 하나 이상의 바이러스 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 인핸서를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, CMV 단백질, 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)는 임의의 가능한 조합으로 정렬될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트에서 요소의 순서는 도 6의 플라스미드 CoVEG3 내지 CoVEG17 중 임의의 하나에 대해서 도시된 바와 같을 수 있다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 발현 카세트에서 요소의 순서는 벡터에 의해서 암호화된 항원의 발현 및/또는 VLP의 형성에 관련될 수 있다고 생각된다. 또한, 발현 카세트가 5'에서 3'로 - M, N, S, 및 E - 의 순서로 유전자를 포함하는 경우 그것은 더 높은 단백질 발현 및 더 안정적인 VLP 형성을 일으킬 수 있다고 생각된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 이는 CoVEG3과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트틀 포함하고, 이는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG4와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG5와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG6과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG7과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG8과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG9와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG10과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG11과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG12와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 이는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG13과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG14와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 53 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ORF3a를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG15와 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG16과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 53 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ORF3a를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 CoVEG17과 동일한 5'에서 3' 순서로 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 53을 포함하는 ORF3a를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
세포에서 항원 및 VLP의 발현
본 개시내용은 세포를 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 진핵 세포에서 항원을 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 세포와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 대상체에서 세포(생체 내)와 접촉된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 항원의 발현은 바이러스 유사 입자(VLP)의 형성을 초래한다. 일부 실시형태에서, VLP는 면역원성이다. 일부 실시형태에서, VLP는 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, VLP는 외피로 싸여 있다. 일부 실시형태에서, VLP는 외피로 싸여 있지 않다. VLP에 존재하는 항원의 수는 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, VLP는 1개의 항원, 2개의 항원, 3개의 항원, 4개의 항원, 5개의 항원, 6개의 항원, 7개의 항원, 8개의 항원, 9개의 항원, 10개의 항원, 또는 더 많은 수의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, VLP는 3개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, VLP는 4개의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, VLP를 형성하는 구조 단백질 및 VLP의 일부인 면역원성 바이러스 항원은 동일한 바이러스(즉, 천연 VLP)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, VLP를 형성하는 구조 바이러스 단백질은 하나의 바이러스로부터 유래되고 상기 VLP에 혼입되는 면역원성 바이러스 항원은 또 다른 바이러스로부터 유래된다(즉, 키메라 VLP). 일부 실시형태에서, 바이러스 단백질은 VLP 조립, VLP 분비 및/또는 상기 VLP에 대한 면역원성 항원 또는 항원의 로딩을 향상시키도록 돌연변이된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 세포와 벡터의 접촉은 바이러스 패키징 신호의 발현을 일으킨다. 일부 실시형태에서, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호의 발현은 VLP의 형성을 증가시키거나 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호의 부재 하에서와 비교할 때 바이러스 패키징 신호의 존재 하에서 더 많은 수의 VLP가 형성된다. 일부 실시형태에서, 세포와 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 개시된 벡터 중 임의의 하나의 접촉은 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군 벡터와 비교할 때 더 많은 수의 VLP의 발현을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 세포와 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 개시된 벡터 중 임의의 하나의 접촉은 VLP 내에서 바이러스 패키징 신호의 패키징을 일으키는데, 이것은 결국 개선된 아주베이팅(adjuvating) 특징 또는 다른 기전으로 인해서 향상된 면역 반응으로 이어진다. 일부 실시형태에서, 패키징 신호 및 단백질은 VLP가 형성되는 동일한 바이러스로부터 유래된다(즉, 천연 패키징). 일부 실시형태에서, 패키징 신호 및 단백질은 알려진 패키징 기전(즉, 키메라 패키징)을 갖는 또 다른 바이러스로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 항원, 제2 항원, 제3 항원, 제4 항원, 또는 이의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 항원, 제2 항원, 및 제3 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 제1 항원, 제2 항원, 제3 항원, 및 제4 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 항원은 코로나바이러스 스파이크 단백질이고, 제2 항원은 코로나바이러스 막(M) 단백질이며, 제3 항원은 코로나바이러스 외피(E) 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제1 항원은 코로나바이러스 스파이크 단백질이고, 제2 항원은 코로나바이러스 막(M) 단백질이며, 제3 항원은 코로나바이러스 외피(E) 단백질이고, 제4 항원은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 인핸서 단백질이 없는 벡터와 비교할 때 (i)더 높은 발현 수준에서의 항원의 발현; 및/또는 (ii)더 긴 시간 기간 동안의 발현; 및/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원의 발현을 일으킨다. 일부 실시형태에서, 벡터는 인핸서 단백질이 없는 벡터보다 (i)더 높은 발현 수준에서의 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)의 발현; 및/또는 (ii)더 긴 시간 기간 동안의 항원을 포함하는 VLP의 발현; 및/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원을 포함하는 VLP의 발현을 일으킨다. 본원에서 사용되는, "단백질 품질"은 비제한적으로 단백질 접힘, 번역 후 변형, 기능성 활성, 국재화 및 하류 활성을 지칭할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법 또는 벡터 또는 조성물 중 임의의 것을 사용하여 인핸서 단백질과 함께 공동 발현되는 항원은 인핸서 단백질과 함께 공동 발현되지 않은 항원과 비교할 때 개선된 단백질 접힘, 개선된 번역 후 변형, 개선된 기능성 활성, 개선된 국재화 및 개선된 하류 활성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "형질주입", "형질도입" 및 "형질전환"은 핵산을 세포(예컨대, 진핵 세포) 내로 도입하는 과정을 지칭한다. 본원에 개시된 벡터는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 세포(예를 들어, 진핵 세포) 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 화학적, 물리적, 생물학적 또는 바이러스 수단을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터를 세포 내로 도입하는 방법은, 인산칼슘, 덴드리머, 양이온성 중합체, 리포펙션, 푸진(fugene), 세포 투과 펩티드, 펩티드 덴드리머, 전기천공, 세포 압착, 초음파천공(sonoporation), 광학 형질주입, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 유체역학적 전달, 유전자 총, 마그네토펙션(magnetofection), 입자 충격, 뉴클레오펙션, 바이러스 형질도입, 주입, 형질전환, 형질주입, 직접 흡수, 발사체 충격(projectile bombardment) 및 리포솜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 방법의 다른 비제한적인 예는 바이러스 형질주입, 직접 흡수, 발사체 충격, 전기천공/초음파천공을 사용하거나 사용하지 않는 직접 주입을 포함하며 이들은 양이온성 중합체, 지질, 지질 제형 및 제트 유전자 장치를 사용하거나 또는 사용하지 않는다. 항원 및 인핸서 단백질은 발현 벡터를 사용하여 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 진핵 세포에서의 발현 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. (문헌[Current Protocols in Human Genetics: Chapter 12 "Vector Therapy" & Chapter 13 "Delivery Systems for Gene Therapy"] 참조).
일부 실시형태에서, 벡터는 선택적으로 렌티바이러스 형질주입, 포유동물 세포 내로의 바큘로바이러스 유전자 전달(BacMam), 레트로바이러스 형질주입, CRISPR/Cas9 및/또는 트랜스포존의 사용을 통해, 안정적인 세포주를 생산하기 위한 표준 방법을 사용하여 게놈 내로 삽입됨으로써 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 일시적인 형질주입을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 일시적인 형질주입은 바이러스 벡터, 헬퍼 지질, 예를 들어, PEI, Lipofectamine 및/또는 Fectamine 293의 사용을 통해 수행될 수 있다. 유전 요소는, 예를 들어, 벡터상의 DNA로서 또는 예를 들어, PCR로부터의 RNA로서 암호화될 수 있다. 유전 요소는 상이한 벡터에서 분리되거나 동일한 벡터상에서 조합될 수 있다.
항원 및 인핸서 단백질을 발현시키기 위해서 사용되는 숙주 세포는 제한되지 않으며, 원핵생물 숙주(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵생물 숙주(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 예를 들어, Sf21 세포, 또는 포유동물 세포주 및 1차 세포, 예를 들어, NIH 3T3, HeLa, COS 세포)를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 광범위한 공급원(예를 들어, American Type Culture Collection(미국 메릴랜드주 록랜드 소재); 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel et al.] 참조)으로부터 입수될 수 있다. 곤충 세포의 비제한적인 예는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SI) 세포, 예를 들어, Sf9, Sf21, 트리코플루지아 니(Trichoplusia ni) 세포, 예를 들어, 하이 파이브(High Five) 세포, 및 드로소필라(Drosophila) S2 세포이다. (효모를 포함하는) 진균 숙주 세포의 예는 S 세레비지애, 클루이베로마이세스 락티스(K lactis: Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(C. albicans) 및 칸디다 글라브라타(C. glabrata)를 포함하는 칸디다 종, 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 쉬조사카로마이세스 폼베(S. pombe: Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 야로위아 리폴라이티카(Yarrowia lipolytica)이다. 포유동물 세포의 예는 COS 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, 마우스 L 세포, LNCaP 세포, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, 인간 배아 신장(HEK: human embryonic kidney) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 세포, CV1 세포, HeLa 세포, MDCK 세포, Vero 및 Hep-2 세포이다. 아프리카발톱개구리(Xenopus laevis) 난모세포, 또는 양서류 유래의 다른 세포도 사용될 수 있다. 원핵생물 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 마이코박테리아를 포함한다.
백신 조성물
본 개시내용은 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 및/또는 비히클, 예를 들어, 용매, 완충액, 용액, 분산 배지, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 포유동물, 보다 특별하게는 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 멸균 등장성 수성 완충액 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클은 인산염 완충 식염수, 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 또는 이의 적합한 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 소량의 유화제 또는 습윤제, 또는 pH 완충제를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 고체 형태, 예를 들어, 재구성에 적합한 동결건조 분말, 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 지속 방출형 제형 또는 분말이다. 일부 실시형태에서, 전달 비히클, 예를 들어, 리포솜, 나노캡슐, 나노입자, 미세입자, 미세구, 지질 입자, 소포, 중합체, 펩티드 등이 본원에 개시된 벡터 및 백신 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 벡터 및 백신 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구, 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 전달되도록 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 다른 종래의 약제학적 성분, 예를 들어, 보존제 또는 화학적 안정제(예를 들어, 클로로부탄올, 소르빈산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀 또는 알부민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 또는 티메로살; 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨 및/또는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다.
일부 실시형태에서, 백신 조성물은 아주반트를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "아주반트"는 면역원과 조합하여 사용될 때 면역원에 대해 유도된 면역 반응을 증가시키거나 달리 변경 또는 변형시키는 화합물을 지칭한다. 면역 반응의 변형은 항체 및 세포 면역 반응 중 하나 또는 둘 다의 특이성을 강화하거나 확대하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아주반트는 명반이다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 모노포스포릴 지질 A(MPL)이다. 일부 실시형태에서, 다른 아주반트가 추가로 또는 대안으로서 사용될 수 있다. 사실상 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)"]에 기재된 임의의 아주반트의 포함은 본 개시내용의 범주 내에서 예상된다. 다른 아주반트는 완전 Freund 아주반트(사멸된 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극인자), 불완전 Freund 아주반트 및 수산화알루미늄 아주반트, GMCSP, BCG, MDP 화합물, 예를 들어, thur-MDP 및 nor-MDP, CGP(MTP-PE), 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A(MPL), MF-59, RIBI를 포함하며, 이것은 2% 스쿠알렌/트윈(Tween)® 80 에멀젼에서 박테리아, MPL, 트레할로스 디미콜레이트(TDM: trehalose dimycolate) 및 세포벽 골격(CWS: cell wall skeleton)으로부터 추출된 3개의 성분을 함유한다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 파우시라멜라(paucilamellar) 지질 소포; 예를 들어, Novasomes®일 수 있다. Novasomes®은 약 100 nm 내지 약 500 nm 범위의 파우시라멜라 비인지질 소포이다. 이것은 Brij 72, 콜레스테롤, 올레산 및 스쿠알렌을 포함한다. Novasomes은 효과적인 아주반트인 것으로 나타났다(미국 특허 제5,629,021호, 제6,387,373호 및 제4,911,928호 참조). 일부 실시형태에서, 조성물은 첨가된 아주반트가 없을 수 있다. 강력한 면역 반응을 유도하는 명반 무함유 조성물이 60세 이상의 성인에서 특히 유용하다.
대상체에서 면역 반응을 유빌하는 방법
본 개시내용은 본원에 개시된 백신 조성물 중 임의의 하나의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 더 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 투여 부위의 조직은 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현한다. 일부 실시형태에서, 대상체의 투여 부위의 조직은 인핸서 단백질이 없는 벡터가 투여되는 경우와 비교할 때 (i)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 더 높은 발현 수준으로 발현하고; 그리고/또는 (ii)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP을 더 긴 시간 기간 동안 발현하고; 그리고/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현한다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 항체 반응을 유발한다. 일부 실시형태에서, 항체 반응은 중화 항체 반응이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 면역 반응을 유발한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체에서 예방학적, 예방적 및/또는 치료적 면역 반응을 유발한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 대상체의 투여 부위의 조직은 바이러스 패키징 신호를 발현한다. 일부 실시형태에서, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, VLP는 바이러스 패키징 신호를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, VLP는 바이러스 패키징 신호로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 캡시드화한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호를 캡시드화하는 VLP는 항원을 포함하지만 바이러스 패키징 신호가 없는 대조군 VLP보다 더 양호한 면역원성이다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 바이러스 패키징 신호의 부재 하에서와 비교할 때 바이러스 패키징 신호의 존재 하에서 더 많은 수의 VLP가 형성될 수 있다고 생각된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 개시된 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하지 않는 대조군 벡터와 비교할 때, 더 많은 수의 VLP의 형성을 촉진한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, RNA 바이러스 패키징 신호는 또한 톨 유사 수용체(TLR: Toll-like Receptor)의 효능제로서 작용함으로써 아주반트로서 작용할 수 있다고 생각된다.
본원에 개시된 조성물 또는 벡터 중 임의의 하나를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 정맥내 및 피하), 경막외 및 점막(예를 들어, 비강내 및 경구 또는 폐 경로 또는 좌제에 의해서), 피부하 및 복강내를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 근육내, 정맥내, 피하, 경피 또는 피부내로 투여된다. 조성물 또는 벡터는 임의의 편리한 경로로, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사로, 상피 또는 점막피부 내막(mucocutaneous lining)(예를 들어, 구강 점막, 결장, 결막, 비인두, 구인두, 질, 요도, 방광 및 장점막 등)을 통한 흡수로 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 피부내 투여이다. 일부 실시형태에서, 투여는 근육내 투여이다. 일부 실시형태에서, 투여는 피하 투여이다. 일부 실시형태에서, 투여는 비강내 투여이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 벡터는 주사에 의해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 주사는 바늘, 주사기, 미세바늘 또는 무바늘 장치를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 또는 벡터는 점적액, 큰 입자 에어로졸(약 10 미크론 초과)에 의해서 비강내로 투여되거나 또는 상기도 내로 스프레이되거나 또는 작은 입자 에어로졸(10 미크론 미만) 또는 하기도 내로의 스프레이에 의해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 주사 이후에 전기천공이 이어진다.
본원에 개시된 벡터 또는 백신 조성물은 단회 투여 일정 또는 다회 투여 일정으로 투여될 수 있다. 다회 투여는 1차 면역화 일정 또는 부스터 면역화 일정으로 사용될 수 있다. 다회 투여 일정에서 다양한 용량이 동일한 경로 또는 상이한 경로, 예를 들어, 비경구 프라임과 점막 부스트, 점막 프라임과 비경구 부스트 등으로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 이전 용량 후 약 1시간 내지 약 수 년(예를 들어, 약 12시간, 약 1일, 약 2일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 1개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년이고, 이들 사이의 모든 값 및 하위범위를 포함하는) 기간 이내에 후속 부스트 용량이 투여된다.
면역원성 효과
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 인핸서 단백질을 포함시키는 것은 인핸서 단백질이 없는 폴리뉴클레오티드에 비해서 기능성 바이러스 유사 입자(VLP) 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 벡터에 비해서 기능성 VLP 생산을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350%, 약 400%, 약 500%, 또는 약 1000% 증가시킨다. 본원에서 사용되는 기능성 VLP 생산은 단백질 응집 수준, 생체 내에서 중화 항체의 역가, 유도된 Th1 반응, VLP 반감기에 대한 시간 경과에 따른 VLP의 양, 및/또는 잘못 접힌 VLP와 연관된 세포 사멸을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 당업계에 알려진 방법에 의해서 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 인핸서 단백질을 포함시키는 것은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간 또는 양을 증가시킨다. 일부 실시형태에서 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간 또는 양을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 세포 반응을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 반응을 약 25%, 약 50%, 약 100%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 또는 약 1000% 증가시킨다.
키트 및 제조 물품
본 개시내용은 본원에 개시된 벡터 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트를 더 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 백신 조성물 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 본원에 개시된 키트는 개시된 방법을 수행하거나 이의 성능을 보조하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 키트는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 제품 또는 제형의 적절한 사용 및 안전성 정보에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 의사에 의해서 결정되는 적용 및 투여 방법에 기초한 투여량 정보를 포함한다.
본 출원은 또한 본원에 기재된 백신 조성물 또는 키트 중 임의의 하나를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예는 바이알(예를 들어, 밀봉된 멸균 바이알)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 본원에 개시된 백신 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기 또는 바이알을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 2개의 용기를 포함하는데, 하나는 본원에 개시된 벡터, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 백신 조성물을 함유하고, 나머지는 아주반트를 함유한다. 일부 실시형태에서, 키트는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영하는 통지를 더 포함한다.
본 발명은 제한으로 해석되어서는 안 되는 다음 추가 실시예에 의해 더 설명된다. 당업자는, 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 실시형태에 대해 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 여전히 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1: SARS-CoV-2 및 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 작제
CoVEG1 및 CoVEG2 플라스미드는 SARS-CoV-2 및 L 인핸서 단백질을 암호화한다.
플라스미드 CoVEG1은 SARS-CoV-2의 전장 S 단백질(서열번호 14), M 단백질(서열번호 19), 및 E 단백질(서열번호 23)의 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 플라스미드 CoVEG2는 SARS-CoV-2의 전장 S 단백질, M 단백질, N 단백질(서열번호 21) 및 E 단백질의 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. CoVEG1 및 CoVEG2 플라스미드의 골격은 도 1에 도시되어 있다. 추가로, CoVEG1 및 CoVEG2 플라스미드는 또한 EMCV로부터의 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 16)를 포함한다.
CoVEG2 내의 완전한 삽입물의 핵산 서열이 서열번호 30에 나타나 있다. 표 1을 참조한다. 이 작제물의 발현은 3개의 폴리펩티드, 즉, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 CoVEG2 폴리펩티드 1, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CoVEG2 폴리펩티드 2를 생성시킨다. CoVEG1 내의 삽입물의 핵산 서열이 서열번호 31에 나타나 있다. 이 작제물의 발현은 2개의 폴리펩티드, 즉, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CoVEG1 폴리펩티드를 생성시킨다. 표 1을 참조한다.
두 플라스미드에 대한 플라스미드 골격(pVax1 플라스미드의 설계 원칙에 기초함) 및 삽입물은 유전자 합성을 사용하여 생성하였고 어떠한 동물 또는 인간 기원의 물질도 함유하지 않는다. 플라스미드 골격은 카나마이신 내성 유전자, ColE1 복제 기점, 인간 거대세포바이러스 극초기 프로모터 및 시미안 바이러스(SV40) Poly A 신호로 이루어진다. 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CMV 프로모터와 SV40 PolyA 신호 사이에 클로닝하였다. 유전자 합성과 플라스미드 제조 후에, 플라스미드를 클로닝을 위해서 이. 콜라이로 형질전환시키고, 그 다음 카나마이신을 사용하여 스크리닝하였다. 대표적인 콜로니를 선택하고, 이의 플라스미드 서열을 검증하여 추가 개발을 위한 공급원 플라스미드로 사용하였다. 전사 후, 바이러스 단백질을 단일 폴리시스트론성 mRNA로부터 발현시켰다.
어떠한 특정 이론에도 얽매이고자 함이 아니지만, 공동 발현되는 경우 S, E 및 M 단백질은 VLP로 조립되고 발현 세포에 의해 분비되는 것으로 생각되며; N 단백질이 S, E 및 M 단백질과 함께 발현되는 경우 VLP 분비가 유의하게 증가된다고 생각된다.
실시예 2: 면역형광에 의해서 관찰된 진핵 세포에서 SARS-CoV-2 S, E, M, 및 N 단백질의 발현
HEK 293(진핵생물) 세포에 pCoVEG2 플라스미드를 형질주입시켰다. 24시간 후, 세포를 고정하고, 투과화시키고, 검출을 위해 상용 Alexa Fluor 568로형광 표지된 2차 항체를 사용하여 면역세포화학으로 분석하였다. 도 2는 HEK 293 세포에서 S, M, N 및 E 단백질의 발현을 나타내는데, 이는 본원에 개시된 pCoVEG2가 세포에서 바이러스 항원을 발현한다는 것을 입증한다.
실시예 3: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해서 관찰된 SARS-CoV-2 S, E, M, 및 N 단백질의 발현
HEK 293 세포에 pCoVEG2 플라스미드를 형질주입시키고 96시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포 배양 상청액을 수거하고 농축하였다. PBS를 용리액으로 사용하여 Tricorn 10/300 컬럼에 패킹된 Superose 6 GL 수지 위에서 농축물을 전개시켰다. 분비된 VLP를 함유하는 공극 분획을 소듐 도데실 설페이트 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis) 및/또는 S, N, M 또는 E에 대한 단클론성 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 분석하여 S, N, M 및 E 단백질의 존재를 입증하였다. 도 3을 참조한다
이들 데이터는, 본원에 개시된 DNA 벡터 CoVEG2가 HEK 293 세포에서 모든 SARS-CoV-2 바이러스 구조 단백질(S, M, E 및 N 단백질)을 발현하고 분비된 VLP 성분이 세포 배양 상청액에서 검출될 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 CoVEG1 및 CoVEG2 플라스미드가 잠재적으로 SARS-CoV-2에 대한 매우 효과적인 DNA 백신으로 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 폴리뉴클레오티드 백신의 면역원성
CoVEG1 및 CoVEG2의 면역원성을 결정하기 위해서, 이 플라스미드를 6주령 BALB/c 마우스에게 2주 간격으로 제1일, 제15일, 제29일에 총 3회 주사로 피부내 주사하였다. 유발된 체액성 면역 반응[각각의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용한 항-S 항체의 역가]뿐만 아니라 세포 면역 반응[각각의 IFN-γ 및 IL-4 효소 결합 면역 흡수 스팟(Dual color ELISpot) 검정을 사용하는 항원 반응성 T 세포의 존재]을 측정한다. 중화 대 총 항체를 측정하기 위해서, 시험관 내 바이러스 중화 검정을 수행한다. 이를 위해, 제43일에 단리된 혈청을 희석하고 SARS-CoV-2 라이프 바이러스(life virus)와 함께 인큐베이션시킨 후 VERO 세포에 첨가한다. 바이러스 단리는 천연 바이러스와 비교하여 세포의 성공적인 감염의 부재에 의해서 결정된다.
항-S 단백질 항체 ELISA 검정을 포함하는 항-SARS-CoV-2 항체 분석은 상업적으로 입수 가능한 물질에 기초하여 수행된다. 대안적으로, 인하우스 개발 세포 기반 및 VLP 기반 ELISA 분석이 사용된다. ELISpot 분석을 위해서, 비장을 수집하고 T 세포를 단리한다. ELISpot 평가는 Miltenyi Biotec Peptivator SARS-CoV-2 펩티드 풀로 T 세포를 프라이밍하여 SARS-CoV-2 반응성 T 세포를 활성화함으로써 수행된다. 또한, 플라스미드의 독성동태학적 및 약력학적 특징을 결정한다. 도 4를 참조한다.
체중이 15 g 내지 25 g인 암컷 BALB/c 마우스(6주 내지 8주령)를 각각의 군에 10마리의 동물이 포함된 4개의 군으로 무작위 배정한다. CMV 프로모터 제어 하에 인핸서 단백질(들)을 암호화하는 참조 항목 EG-BB인 비히클-PBS과, 1 μg과 25 μg의 CoVEG1 및 CoVEG2 2개 용량을 마우스에게 피부내로 투여한다. 마우스의 사망률 및 빈사 상태를 매일 2회 평가한다. 임상 관찰 및 체중을 제-1주에서 시작하여 매주 수집하고, 그 후 연구 기간 동안 적어도 2주마다 수집한다.
투여된 마우스는 투여 전 미리 정의된 시점에 채혈하고 원심분리에 의해 혈청을 분리한다. 이어서, 입수된 혈청 샘플을 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 정량적 ELISA를 사용하여 전장 재조합 S 단백질(S1+S2)에 대한 항체에 대해 분석한다.
[표 3]
제43일 시점에, 생성된 혈청을 2개의 대략적으로 동일한 분취량으로 나누고; 첫 번째 분취물은 항-백신 항체(AVA: anti-vaccine antibody) 분석에 사용할 것이고 두 번째 분취물은 중화 항체 시험용으로 보관할 것이다. 분취물을 드라이아이스 위에서 즉시 냉동하거나 -80℃를 유지하도록 설정된 냉동고에서 냉동한다.
연구 완료 시에, 모든 동물을 안락사시킨다. 비장을 ELISpot에 의한 IFN-γ 및 IL-4 평가를 위한 세포 배양 세척 절차를 사용하여 수집한다.
T-세포 매개 독성 평가를 위해서, ELISpot 검정을 사용하여 정량적 평가를 수행한다. 수거된 비장으로부터의 비장세포를 S, M 및 N SARS-CoV-2 단백질의 서열을 포괄하는 Miltenyi Biotec의 SARS-CoV-2 PepTivator 펩티드 풀로 자극한다. 비장세포를 음성(배지) 및 양성 대조군(포르볼 미리스테이트 아세테이트/이오노마이신) 외에 3개의 상이한 SARS-CoV-2 펩티드 풀의 2개 농도에서 시험한다.
실시예 5: 인간에서 폴리뉴클레오티드 백신의 면역원성
CoVEG1 및 CoVEG2의 안전성, 반응원성(reactogenicity) 및 면역원성을 평가하기 위해서, 공개, 다기관, 용량 범위 연구(open-label, multi-center, dose-ranging study)를 건강 상태가 양호하고 모든 자격 기준을 충족하는 18세 이상의 남성과 임신하지 않은 여성에서 수행하였다. 대략 45명의 대상체를 3개 코호트(1 μg, 25 μg 및 200 μg) 중 하나에 등록한다. 대상체에게 제1일 및 제29일에 CoVEG1 및 CoVEG2를 피부내 주사(100 μl)로 제공하고, 두 번째 백신접종 후 12개월(제394일) 동안 추적 관찰하였다. 추적 관찰 방문은 각각의 백신접종 후 제1주, 제2주, 제4주(제8일, 제15일, 제29일, 제36일, 제57일)뿐만 아니라 두 번째 백신접종 후 제3개월, 제6개월, 제12개월(제119일, 제209일, 제394일)에 한다.
건강한 성인의 2회 용량에 걸쳐 28일 간격으로 제공되는 피부내 주사로 투여되는 CoVEG1 및 CoVEG2의 2회 용량 백신접종 일정의 안전성 및 반응원성을 이상 반응(AE: Adverse Event)이 있는 참가자의 백분율, 투여(주사) 부위 반응을 갖는 참가자의 백분율 및 특별 관심 이상 반응(AESI: Adverse Events of Special Interest)을 갖는 참가자의 백분율에 기초하여 평가한다.
면역원성을 평가하기 위해, CoVEG1 및 CoVEG2의 2회 용량 백신접종 일정에 따라 제15일, 제29일(두 번째 용량 전) 및 제57일에 다음 매개변수를 평가한다:
(a) 검증된 ELISA 방법에 의한 S 항체에 대한 IgG, IgM 및/또는 IgA ELISA;
(b) 면역 기억 징후를 제15일, 제29일, 제57일, 제180일, 제270일 및/또는 제394일에 CD49b+T-bet+ 휴면 기억 Th 세포 전구체 및 CXCR4+ S1P1+ 기억 형질 세포 전구체 세포에 초점을 맞춘 유세포 분석법 및 검증된 ELISpot 검정에 의해서 면역 표현형 분석 PBMC로 평가한다. 측정은 다음을 포함한다: 기준선(제1일 내지 제394일)으로부터의 IgG, IgM 및/또는 IgA 역가의 기하 평균 배수 상승(GMFR: geometric mean fold rise); 항체의 기하 평균 역가(GMT: geometric mean titer)(제15일, 제29일, 제57일, 제180일, 제270일 및 제394일); 및 혈청전환된 대상체의 백분율(제1일 내지 제15일, 제29일, 제57일, 제180일, 제270일 및 제394일). 혈청전환은 기준선으로부터의 항체 역가의 4배 변화로 정의됨; 및
(c) CD8 T 세포 반응의 척도로서의 IFN-γ 반응 및 기억 면역 세포의 표현형은 검증된 ELISpot 검정에 의해 대상체로부터 단리된 PBMC에서 측정될 것이다. PBMC를 제15일, 제29일, 제57일, 제180일, 제270일, 제394일에 단리할 것이다.
실시예 6: 인핸서 단백질이 있는 또는 인핸서 단백질이 없는 SARS-CoV-2 S, E, M, 및 N 단백질 및 돌연변이체의 발현을 위한 추가의 폴리뉴클레오티드의 설계
플라스미드 CoVEG3 내지 CoVEG17은 도 6에 제시된 순서로 상이한 바이러스 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 플라스미드에 대한 플라스미드 골격(pVax1 플라스미드의 설계 원칙에 기초함) 및 삽입물을 유전자 합성을 사용하여 생성하였다. 플라스미드 골격은 카나마이신 내성 유전자, ColE1 복제 기점, 인간 거대세포바이러스 극초기 프로모터 및 시미안 바이러스(SV40) Poly A 신호로 이루어진다. 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CMV 프로모터와 SV40 PolyA 신호 사이에 클로닝하였다. 유전자 합성 및 플라스미드 제조 후에, 플라스미드를 클로닝을 위해서 이. 콜라이로 형질전환시키고, 그 다음 카나마이신을 사용하여 스크리닝하였다. 대표적인 콜로니를 선택하고, 이의 플라스미드 서열을 검증하여 추가 개발을 위한 공급원 플라스미드로 사용하였다. 전사 후, 바이러스 단백질을 단일 폴리시스트론성 mRNA로부터 발현시켰다.
실시예 7: 면역형광에 의해서 관찰된 SARS-CoV-2 S 및 N 단백질의 발현
HEK293T 세포를 형질주입 24시간 전에 24웰에 40,000개 세포/웰로 시딩하였다. 제조업체의 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 세포에 pCoVEG3 내지 pCoVEG20 플라스미드를 형질주입시켰다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 배지를 제거하고, 세포를 10분 동안 PBS 중의 0.2% Triton X-100으로 투과시킨 후 10분 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하였다. 면역염색을 수행하기 전에 EZ 블록(SCYTEK)을 첨가하여 비특이적 결합을 차단하였다. 수용체 결합 도메인(RBD)에 결합하는 항-스파이크(S) 단백질 항체를 갖는 염색 - 본원에서 "항-RBD"라고도 지칭 -을 1:500으로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 염색을 제거하고, 세포를 세척하고, 2차 항체(Alexa Fluor 568 형광 표지된 2차 항토끼, 1:1000 희석)를 첨가하였다. 염색을 제거하고 세척하기 전에 염색을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 EVOS 세포 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다. 도 7은 HEK293 세포에서의 S 단백질의 발현을 나타내는데, 이는 시험된 모든 CoVEG 플라스미드가 스파이크 단백질을 발현할 수 있음을 입증한다.
또한, VLP의 발현을 확인하기 위해서, 면역형광 염색을 사용하여 세포를 뉴클레오캡시드(N) 단백질의 발현에 대해서 분석하였다. 이 실험을 위해서, HEK293T 세포를 형질주입 24시간 전에 24웰 플레이트에 40,000개 세포/웰로 시딩하였다. 제조업체의 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 세포에 5, 9 내지 12, 및 14 내지 20 플라스미드를 형질주입시켰다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 배지를 제거하고, 세포를 10분 동안 PBS 중의 0.2% Triton X-100으로 투과시킨 후 10분 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하였다. 면역염색 전에 EZ 블록(SCYTEK)을 첨가하여 비특이적 결합을 차단하였다. 항-뉴클레오캡시드(N) 단백질 항체를 갖는 염색을 1:1000으로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 염색을 제거하고, 세포를 세척하고, 2차 항체(Alexa Fluor 488 형광 표지된 2차 항-마우스, 1:1000 희석)를 첨가하였다. 염색을 제거하고 세척하기 전에 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 EVOS 세포 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다. 도 17은 HEK293 세포에서의 N 단백질의 발현을 나타내는데, 이는 시험된 모든 CoVEG 플라스미드가 뉴클레오캡시드 단백질을 발현할 수 있음을 입증한다.
실시예 8: 검출 가능한 SARS-CoV-2 VLP 형성을 위해서 필요한 L 단백질
온전한 바이러스 유사 입자(VLP)를 단리하기 위해, 제조업체 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 150 mm 접시에서 4 x 106개 HEK293 세포에 pCoVEG3 내지 pCoVEG20 플라스미드를 형질주입시켰다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. VLP 함유 상청액을 수거하고, 스핀 다운(1,500 x g, 15분)시키고, Amicon 원심분리 필터 장치(100 kDa 컷오프)를 사용하여 농축하였다. 농축물을 스핀 다운(4,500 x g, 15분)시켜 침전물을 제거하고 VLP를 20% 수크로스 쿠션을 통해 펠릿화하였다(100,000 x g, 1.5시간). VLP를 PBS에 재현탁시키고, 도 8에 도시된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 8은 CoVEG3 내지 CoVEG8 플라스미드가 S 단백질을 발현할 수 있었고 CoVEG3 및 CoVEG5 내지 CoVEG8 플라스미드가 N 단백질을 발현할 수 있었음을 나타낸다. 이들 데이터는, 본원에 개시된 DNA 벡터 CoVEG3 및 CoVEG5 내지 CoVEG8이 HEK 293 세포에서 VLP 형성에 필요한 SARS-CoV-2 바이러스 구조 단백질을 발현하고 분비된 VLP 성분이 세포 배양 상청액에서 검출될 수 있다는 것을 입증한다.
도 11은 CoVEG5, CoVEG9, CoVEG11, CoVEG16, CoVEG10 및 CoVEG15 플라스미드로부터의 S 단백질 및 N 단백질의 발현을 나타낸다. 결과는 (CoVEG9, CoVEG11, CoVEG10 및 CoVEG15로부터) 돌연변이체 S 단백질을 발현시키면 VLP에서 발현되고 제시되는 스파이크 단백질의 양이 증가한다는 것을 나타내었다. (CoVEG16으로부터) ORF3 단백질의 발현은 VLP에서 S 및 N 단백질의 양을 감소시키는 것으로 나타났다. CoVEG15 플라스미드의 발현 시 인핸서 L 단백질의 부재는 S 단백질의 양은 유사하지만 N 단백질의 양은 훨씬 더 많아지게 하였다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 인핸서 L 단백질의 부재 시에 더 많은 양의 N 단백질이 발현되어 불균형적인 VLP 형성을 일으킨다고 생각된다.
도 12는 CoVEG5, CoVEG12, CoVEG14, CoVEG13, CoVEG10, CoVEG9 및 CoVEG11 플라스미드로부터의 S 단백질 및 N 단백질의 발현을 나타낸다. 이러한 데이터는, (CoVEG9, CoVEG10 및 CoVEG11 플라스미드로부터) 돌연변이체 S 단백질의 발현이 야생형 S 단백질을 발현한 비교 플라스미드와 비교할 때 VLP 상에서 발현되고 제시된 스파이크 단백질의 양을 증가시킨 반면 N의 양은 플라스미드 전체에서 일정하게 나타났다는 것을 입증한다.
도 18은 CoVEG5, CoVEG8, CoVEG9, CoVEG10, CoVEG15, CoVEG16, CoVEG17 및 CoVEG20 플라스미드로부터의 S 단백질 및 N 단백질의 발현을 나타낸다. 특히, 예를 들어, 도 18에서 CoVEG10(L 단백질) 대 CoVEG20(L 단백질 없음) S 및 N 웨스턴 블로팅에 의해 나타난 바와 같이 인핸서 L 단백질의 존재가 상이한 S 및 N 단백질 발현 비율이 나타나게 했다.
분비된 VLP의 존재가 또한 ELISA에 의해서 확인되었다. 이 실험을 위해, 24,000개의 HEK293 세포에 pCoVEG5 및 pCoVEG9 내지 pCoVEG14 플라스미드 또는 대조군으로서 스파이크 단백질 또는 뉴클레오캡시드 단백질을 함유하는 플라스미드를 형질주입시켰다. 제조업체의 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 24웰 플레이트에서 실험을 수행하였다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. VLP 함유 상청액을 수거하고, 스핀 다운시키고(1,500 x g, 15분), 75 μl의 투명해진 상청액을 사용하여 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05% Twen-20으로 2회 세척하고, 웰을 EZ 블록을 사용하여 차단하였다(37℃에서 2시간). 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 코팅 물질에서 VLP를 검출하기 위해서, 항-RBD(Sino Biological, 마우스 항-RBD SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, Mouse Mab, 40592-MM57 SARS-CoV-2, EZ 블록에서 1:500 희석) 또는 항-N(Novus Biologicals, 마우스 항-SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드, 클론: B3449M, N2787B09, EZ 블록에서 1:1000 희석)을 웰에 첨가하였다. 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고, 75 μl의 2차 항체(염소-항-마우스, HRP-접합체, 1:2,000 희석, Southern Biotech, 염소 항-마우스 IgG(H+L), 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase), 다클론성, OB103405)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다시켰다. 웰을 철저하게 세척하고(PBS 중의 0.05% Tween-20으로 5회), 75 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(Surmodisc Inc TMB One Component HRP Microwell Substrate)을 사용하여 결합을 현상시켰다. 75 μl Stop Solution(Surmodisc Inc 450 NM LIQ STOP REAGENT)을 사용하여 30분 동안 반응을 수행하였고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 15는 단일 단백질 S 및 N 발현 벡터와 비교하여 CoVEG5 및 CoVEG9 내지 CoVEG14 플라스미드의 VLP 분비로부터의 ELISA 결과를 나타낸다. 스파이크와 뉴클레오캡시드 단백질 둘 다는 HEK293 세포로부터 분비되었다. 그러나, S 단백질은 단일 단백질 발현에 비해 높은 ELISA VLP 신호를 나타낸 반면, N 단백질은 단일 단백질 발현에 비해 현저히 낮은 VLP 신호를 나타내었다. N 단백질이 VLP 내부에 존재하고 항체에 접근할 수 없기 때문에 VLP에서 N 신호는 VLP에서 S 신호보다 낮을 수 있다.
SARS-CoV2로부터 발현된 구조 단백질이 온전한 VLP를 형성하는지를 더 확인하기 위해서, 제조업체 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 5 mm 내지 150 mm 접시에 20 x 106개 HEK293 세포에 pCoVEG10 플라스미드를 형질주입시켰다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. VLP 함유 상청액을 수거하고, 스핀 다운(1,500 x g, 15분)시키고, Amicon 원심분리 필터 장치(100 kDa 컷오프)를 사용하여 농축하였다. 농축물을 스핀 다운(4,500 x g, 15분)시켜 침전물을 제거하고 VLP를 20% 수크로스 쿠션을 통해 펠릿화하였다(100,000 x g, 1.5시간). VLP를 PBS에 재현탁시키고, 공동 면역침전(co-IP)을 위해서 사용하였다. co-IP의 경우 재현탁된 VLP를 항-S RBD 항체(Sino Biological, 마우스 항-RBD SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, Mouse Mab, 40592-MM57 SARS-CoV-2)와 함께 60분 동안 인큐베이션시킨 후 100 μl의 세척된 단백질 A/G 아가로스 수지(Thermo Fisher scientific)를 첨가하였다. 수지를 120분 동안 인큐베이션시킨 후 0.1 M 글리신 pH 2로 용출시켰다. 5배 부피의 1 M Tris pH 8.0을 첨가하여 용출액을 즉시 중화시켰다. 분획을 항-N 항체(Novus Biologicals, 마우스 항-SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드, 클론: B3449M, N2787B09)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 N 단백질의 존재를 분석하였다.
도 19는 CoVEG10 플라스미드의 co-IP 실험의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. N-단백질은 RBD와 함께 인큐베이션 후 용출 분획에 N-신호가 존재하는 것으로 입증된 바와 같이 온전한 VLP에 패킹되어 있다(좌측, 화살표). 세척 분획에 신호가 없는 것과 비교하여 이 신호는 N 단백질이 입자 내에 유지되어 있음을 나타낸다. 비-특이적 N 단백질이 입자 외부에 결합할 가능성에 대한 대조군으로서, 항-RBD 항체 없이 co-IP를 병렬로 실행하였다(우측). N 단백질 신호는 용출 분획에서 검출되지 않았으며, 이는 N 단백질이 수지에 비특이적으로 결합하지 않았음을 입증한다.
분비된 VLP를 시각화하기 위해서, PEI 복합체를 사용하고 제조업체의 설명에 따라 5 x 150 mm 접시에서 20 x 106개의 HEK293 세포에 pCoVEG10 및 pCoVEG20 플라스미드를 형질주입시켰다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. VLP 함유 상청액을 수거하고, 스핀 다운(1,500 x g, 15분)시키고, Amicon 100 kDa 원심분리 필터 장치를 사용하여 농축하였다. 농축물을 스핀 다운(4,500 x g, 15분)시켜 침전물을 제거하고 VLP를 20% 수크로스 쿠션을 통해 펠릿화하였다(100,000 x g, 1.5시간). VLP를 PBS에 재현탁시키고, 급속 냉동하고, 투과 전자 현미경(TEM)에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
TEM 실험을 위해서, VLP를 TLS-55(Optima TLX Ultracentrifuge, Beckman)를 사용하여 20% 수크로스 쿠션에서 25000 g로 2시간 동안 초원심분리하였다. 10 μl를 현미경 구리 그리드(Sigma Aldrich) 위에 놓고 2%(v/v) 파라포름알데히드로 5분 동안 고정하였다. 그런 다음 샘플을 5 mL의 인텅스텐산(Sigma Aldrich)으로 음성 염색하였다. 그리드를 100 KeV에서 작동하는 Hitachi HT7700 TEM을 사용하여 조사하였다.
도 16은 CoVEG10에 대한 단리된 물질에 VLP의 존재를 나타낸다. CoVEG10에 대해 명확한 스파이크 삼량체화 표면을 갖는 더 큰 입자의 존재가 관찰될 수 있었다(확대 삽도 참조). L 조절 단백질의 존재를 제외하고 CoVEG10과 동일한 CoVEG20은 인식 가능한 VLP를 생성하지 못했다.
온전한 면역원성 VLP는 모든 VLP 형성 단백질의 비율에 상당히 의존적이다. 여기서 L 단백질은 모든 VLP 형성 단백질의 발현 및 VLP의 정확한 형성을 제어한다는 것이 입증되었다.
실시예 9: L 단백질은 생체 내에서 SARS -CoV-2 단백질에 대한 중화 항체를 증가시켰고 Th1 반응에 필요하였다.
플라스미드 CoVEG3 μ내지 CoVEG8의 면역원성을 결정하기 위해서, 플라스미드를 PBS에 1 mg/ml로 희석하고 50 l를 6주령의 BALB/c 마우스에게 2주 간격으로 제1일 및 제15일에 총 2회 주사로 근육내 주사하였다. 제14일, 제28일, 제42일, 제56일에 혈액을 수집하고, 혈청을 단리하고, 항응고제 존재 하에 급속 냉동시켰다.
플라스미드 CoVEG5, CoVEG8 및 CoVEG9 내지 CoVEG14뿐만 아니라 S-단독 플라스미드의 면역원성을 결정하기 위해서, 플라스미드를 PBS에 2 mg/ml 또는 0.5 mg/ml로 희석하고 50 μl를 6주령의 BALB/c 마우스에게 2주 간격으로 제1일 및 제15일에 총 2회 주사로 근육내(2 mg/ml) 또는 피부내(0.5 mg/ml)로 주사하였다. 제14일, 제28일, 제42일, 제56일에 혈액을 수집하고, 혈청을 단리하고, 항응고제 존재하에 급속 냉동시켰다.
플라스미드 CoVEG9, CoVEG10 및 CoVEG20뿐만 아니라 인핸서 단백질이 있는 또는 인핸서 단백질이 없는 S 단독 플라스미드의 면역원성을 결정하기 위해서, 플라스미드를 PBS에 2 mg/ml 또는 0.2 mg/ml로 희석하고, 50 μl를 6주령의 C57BL/6 마우스에게 2주 간격으로 제1일, 제15일 및 제29일에 총 1회 내지 3회 주사로 근육내 주사하였다. 제0일, 제14일, 제28일, 제42일, 제56일 및 제70일에 혈액을 수집하고, 혈청을 단리하고, 항응고제 존재하에 급속 냉동시켰다. 결합 항체 농도, 즉, 유발된 체액성 면역 반응을 측정하기 위해서, 코팅 물질로서 정제된 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 단백질(Creative Diagnostics® DAGC149 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인 [His])을 사용하여 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 수행하였다. 이 실험을 위해서, 고결합 96웰 플레이트를 2 μg/ml SARS-CoV-2-스파이크 RBD 용액 75 μl로 코팅하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05% Twen-20으로 2회 세척하고, 웰을 EZ 블록을 사용하여 차단하였다(37℃에서 2시간). 플레이트를 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 2회 세척하였다. 56일 후에 마우스로부터 혈청을 수집하여 웰에 첨가하였다(결합 항체 검출을 위해 1:500 희석, 종점 역가 측정을 위해 1:100 내지 1:7812500). 혈청을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고, 75 μl의 2차 항체(염소-항-토끼, HRP-접합체, 1:4,000 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 철저하게 세척하고(PBS 중의 0.05% Tween-20으로 5회), 75 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(Surmodisc Inc TMB One Component HRP Microwell Substrate)을 사용하여 결합을 현상시켰다. 75 μl Stop Solution(Surmodisc Inc 450 NM LIQ STOP REAGENT)을 사용하여 30분 동안 반응을 수행하였다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
도 9a는 ELISA를 사용하여 측정한 전체 결합 항체를 나타내고, 도 9b는 측정된 종점 역가를 나타낸다. 이러한 결과는 CoVEG3 내지 CoVEG8 플라스미드가 마우스에 주사되는 경우 강력한 면역 반응을 유발하여 항-SARS CoV2 항체를 생산할 수 있음을 입증한다. CoVEG8은 이들 마우스에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다는 점에서 특히 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본원에 개시된 플라스미드가 SARS-CoV-2에 대해 매우 효과적인 DNA 백신임을 입증한다.
도 13은 CoVEG5, CoVEG9, CoVEG11, CoVEG10, CoVEG12, CoVEG13, CoVEG8 및 CoVEG14 플라스미드를 근육내(IM) 또는 피부내(ID) 주사한 ELISA 결과를 나타낸다. 놀랍게도, CoVEG10의 근육내 주사는 스파이크 단백질 단독 주사와 비교할 때 훨씬 더 높은 면역 반응을 유도하였다. CoVEG5, CoVEG9, CoVEG11의 근육내 주사 또한 S 단백질 단독 주사에 비해 더 높은 면역 반응을 유도하였다. 이들 결과는 본원에 개시된 플라스미드가 스파이크 단백질 단독을 발현하는 백신보다 성능이 더 우수한 SARS CoV2에 대해 매우 효과적인 DNA 백신이라는 것을 더 입증한다.
도 20 및 도 22는 IM 또는 ID 주사 후 제42일에 CoVEG5 및 CoVEG9 내지 CoVEG14, CoVEG18, CoVEG19 및 CoVEG20 플라스미드뿐만 아니라 S 단독으로부터의 항체 결합 역가를 나타낸다. 흥미롭게도, 시험된 모든 CoVEG는 면역 반응을 유도할 수 있었으며 CoVEG9가 가장 효능이 있었다. 특히, VLP 형성 CoVEG9는 스파이크 단백질 단독보다 더 양호한 성능을 나타내었다.
또한, IFN-γ 및 IL-4 효소 결합 면역 흡수 스팟(ELISpot) 분석을 사용하여 항원 반응성 T 세포의 존재를 사용하여 세포 면역 반응을 측정하였다. ELISpot 분석을 위해서, 비장을 수집하고 T 세포를 단리하였다. Miltenyi Biotec Peptivator SARS-CoV-2 펩티드 풀로 T 세포를 프라이밍하여 SARS-CoV-2 반응성 T 세포를 활성화함으로써 ELISpot 평가를 수행하였다. 분석을 위해, Mouse IL-4 Single color ELISPOT 및 Mouse INF-γ Single color ELISPOT(Immunospot, Cellular Technology Limited)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다. 약술하자면, 96웰 PVDF 막 플레이트를 IL-4 또는 INF-γ 포획 항체로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세척 후, 100 μl의 CTL 시험 배지 중의 150,000개의 비장세포를 미리 코팅된 플레이트에 시딩하고, 37℃ 및 4% CO2에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PMA/이오노포어(양성 대조군) 또는 웰당 0.6 μl의 재구성된 Miltenyi Biotec Peptivator SARS-CoV-2 펩티드 풀(S, N 또는 M)을 사용하여 활성화시켰다. ImmunoSpot 분석기(CTL)를 사용하여 현상 및 계수하기 전에 반응을 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
도 24는 CoVEG10 및 CoVEG20의 T-세포 분석 결과를 나타낸다. 중요한 것은, 호흡기 바이러스, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 성공적인 백신을 생성하기 위해서, Th1 선호도(INF-γ) 또는 적어도 균형 잡힌 Th1/Th2 반응이 필요하다는 것이다. 놀랍게도, CoVEG10에 L 조절 단백질을 첨가하면 INF-γ(Th1) 반응을 선호하는 T 세포 면역 반응에 영향을 미쳤다. 특히, CoVEG20에 조절 단백질이 없으면 IL4(Th2)에 대한 세포 반응이 역전되었다. Th1 반응은 바이러스에 대한 오래 지속되는 면역 반응을 생성하는 데 필요하다.
혈청이 스파이크 단백질에 결합하는 SARS CoV2에 대한 중화 항체를 갖는지를 시험하기 위해서, 제조업체의 설명서에 따라 cPass™ 중화 검정(GenScript)을 사용한 시험관 내 바이러스 중화 검정을 수행하였다. cPass™은 시험관 내에서 바이러스와 숙주 세포 사이의 상호작용을 모방함으로써 샘플에서 총 중화 항체를 검출할 수 있다. 검정에서, 중화 항체가 시험될 샘플에 존재하는 경우, 숙주 세포막 수용체인 ACE2에 대한 수용체 결합 도메인(RBD)의 결합이 저해된다. 그러나, 중화 항체가 샘플에 존재하지 않는 경우 RBD가 ACE2에 결합할 수 있다. 도 10은 ACE2 수용체에 대한 RBD 결합의 저해 백분율(%)을 나타낸다. ACE2에 대한 RBD 결합의 저해가 30%를 초과하면(빨간색 점선), 샘플은 중화 항체를 갖는 것으로 식별된다. 도 10에 도시된 바와 같이, COVEG5 및 COVEG8이 주사된 마우스로부터 입수된 혈청 샘플은 높은 억제 비율을 나타내고, 따라서, 중화 항체를 생성하였다. 이러한 결과는 개시된 플라스미드가 SARS-CoV-2에 대해 매우 효과적인 DNA 백신이라는 점을 더 강조한다.
도 21은 도 20에 도시된 샘플의 중화 항체를 도시한다. 이러한 데이터는 생성된 모든 항체가 중화 능력을 보유하는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 이 검정에서 더 낮은 신호는 음성 대조군(점선)의 70% 미만의 신호로 정의된 중화를 확인해 주었다. 음성 대조군의 30% 미만의 신호는 강력하게 중화되는 것으로 확인되었다. 시험된 CoVEG는 설계 및 주사 부위에 따라 다르게 수행되었다. 놀랍게도, ID 주사는 강한 중화 항체를 유도하지 못한 반면, IM 주사는 강한 중화 항체를 유도하였다. 또한 CoVEG13 및 CoVEG14는 중화 기준을 충족하지 못했다. 그러나, CoVEG9는 S 스파이크 단백질 단독 작제물을 포함하여 시험된 모든 작제물 중 가장 높은 중화를 나타냈는데, 이는 VLP 접근법이 소단위 S 스파이크 단독 백신보다 더 강력한 백신을 제공한다는 것을 다시 입증한다.
도 23은 CoVEG9, CoVEG10 및 CoVEG20 플라스미드의 중화 항체를 나타내는데, 여기서 플라스미드 20은 인핸서 L 단백질의 부재에 대한 대조군이다. CoVEG20은 T-세포 분석에서 입증된 바와 같이 중화 가능한 Th2 오버행을 나타내었지만, 이것은 백신에 대한 실행 가능한 옵션은 아니다.
또한, 시간 경과에 따른 인핸서 단백질 유무에 따른 중화 능력을 cPass™로 분석하였다. SARS-CoV-2 대용체 바이러스 중화 시험(sVNT) 키트. 이를 위해, 면역화된 동물(CoVEG9, 스파이크 + 인핸서 단백질 L 및 인핸서가 없는 스파이크로 면역화됨)로부터의 혈청 샘플을 제42일 및 제70일에 수집하고 상기에 기재된 바와 같이 cPass™를 수행하였다.
도 27a는 분석된 혈청 샘플의 개별 값을 나타내고, 도 27b는 요약과 동일한 데이터의 중앙값을 나타낸다. 흥미롭게도, 인핸서 단백질의 첨가는 시간 경과에 따라 중화 항체의 이점을 명확히 나타내었다. 첫째로, 인핸서 단백질 L(CoVEG9 및 스파이크 + L)을 갖는 두 작제물 모두는 더 높은 중앙값 중화 값을 나타내었다(도 27b, CoVEG9 원, 스파이크 + L 사각형). 둘째, 중화 항체의 수준은 인핸서 단백질이 없는 작제물과 비교하여 주사 70일 후에도 높게 유지되었다(도 27b 스파이크 삼각형).
이는 백신 후보에 인핸서 단백질을 첨가하는 이점을 더 입증하였다.
실시예 10: WNV E 및 M 단백질과 공동 발현되는 경우 L 단백질은 기능성 웨스트나일 바이러스(WNV) VLP 생산을 증가시켰다.
WNV의 NY99 균주의 전구체 막 단백질(prM), 외피 당단백질(E) 및 인핸서 단백질을 암호화하는 플라스미드를 실시예 6에 기재된 바와 같이 작제하였다(도 14a, 서열번호 55 참조). 또한, WNV의 NY99 균주의 전구체 막 단백질(prM) 및 외피 당단백질(E)만을 암호화하는 대조군 플라스미드를 작제하였다(도 11b). HEK293T 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 제1일에, 세포를 24웰 플레이트에 웰당 20,000개의 세포로 시딩하고 밤새 성장시켰다. 제2일에, 24웰 플레이트에 시딩된 세포에 전구체 막 단백질(prM), WNV의 NY99 균주의 외피 당단백질(E) 및 인핸서 단백질을 암호화하는 플라스미드를 일시적으로 형질주입시켰다. 모든 실험에 WNV의 NY99 균주의 전구체 막 단백질(prM) 및 외피 당단백질(E)만을 암호화하고 인핸서 단백질은 암호화하지 않는 대조군 플라스미드를 사용하였다.
24웰 플레이트의 각각의 웰을 플라스미드/PEI 복합체를 사용하여 형질주입시켰고 이는 50 μl의 Opti-MEM에서 0.5 ug의 상응하는 플라스미드 및 1 ug의 PEI를 사용하여 형성되었다. 플라스미드/PEI 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 복합체를 형성하였다. 24웰 플레이트에서 세포 배지를 새로운 Opti-MEM으로 교체하고 복합체를 웰에 첨가하였다. 제3일에, 복합체를 형질주입된 세포로부터 제거하고, 새로운 Opti-MEM으로 교체하였다.
제4일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 500xg에서 5분 동안 원심분리하여 세포 잔해로부터 제거하고, ELISA에 의한 하류 분석을 위해 저장하였다. 세포를 250 μl의 10% 중성 완충 포르말린(실온에서 10분)을 사용하여 고정하고, 0.2% Triton-X 100(실온에서 10분)을 사용하여 투과화시키고, 세척하였다.
형광 현미경을 사용하여 다음과 같이 세포에서 단백질 발현을 시각화하였다. 세포를 마우스 항-WNV_E 및 토끼 항-WNV_M 1차 항체(PBS에서 1:500 희석, 실온에서 1시간)를 사용하여 염색하고, 세척하고, 염소 항-마우스 Alexa Fluor 488 2차 항체(PBS에서 1:1000 희석, 실온에서 1시간)로 현상시키고, 세척하고, 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다.
면역염색 실험 결과를 도 28에 나타내었다. 본원에 기재된 다른 실험에서 관찰된 바와 같이, WNV + 인핸서 단백질(EG)의 양은 인핸서 단백질이 없는 WNV의 양과 비교하여 더 낮았다. 그러나, 핵의 형성에 의해서 관찰된 바와 같이 인핸서 단백질이 존재하는 경우 품질이 더 높은 것으로 보였다(도 28, 우측, 화살표로 표시). 이들 데이터는, 본원에 제공된 조성물 및 방법으로 발현된 단백질의 품질이 더 높다는 것을 입증한다.
발현된 항원의 분비를 입증하기 위해 ELISA 검정을 사용하였다. 이를 위해, 형질주입된 세포로부터의 상청액을 제4일(형질주입 후 48시간), 제5일(72시간), 제6일(96시간), 제7일(120시간) 및 제8일(144시간)에 수집하였다. 고결합 96웰 플레이트를 웰당 75 μl의 세포 배양 상청액을 사용하여 세포 배양 상청액으로 코팅하고 +4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 코팅된 웰을 PBST 완충액을 사용하여 세척하고, 웰당 200 μl의 EZ Block™ 시약(Scytek Laboratories)을 사용하여 +37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, 1차 항체(마우스 항-WNV_E, EZ 블록에서 1:1000 희석, 웰당 75 μl)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 웰을 PBST로 3회 세척하고, EZ 블록 시약(웰당 75 μl)에 1:1000으로 희석된 염소 항-마우스 HRP 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 PBST를 사용하여 웰을 5회 세척하고, 각각의 웰에 TMB 기질 75 μl를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후 정지 용액 75 μl를 첨가하고 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추가적으로, VLP 분비가 세포 사멸 및 세포내 단백질의 비특이적 방출에 의해 유발되지 않았음을 입증하기 위해서, 매일 세포를 영상화하고 ELISA 결과를 영상과 비교하였다.
도 26a는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 시간 경과에 따른 형질주입된 세포로부터의 VLP의 분비를 도시한다. 인핸서 단백질이 있는 WNV 작제물은 온전한 VLP 및 건강한 세포에 대해 예상된 바와 같이 형질주입 72시간 후에 가장 높은 분비를 나타낸 반면, 인핸서 단백질이 없는 WNV 작제물은 시간 경과에 따라 분비 물질의 꾸준한 증가를 나타내었다. 후자는 세포 사멸의 증가 및 VLP가 완전히 형성되지 않았을 가능성이 높은 단백질 물질의 비특이적 방출과 더 일치하였다. 결과는 상청액으로부터 수거 당시 촬영된 세포 영상의 분석에 의해서 확인되었다. 인핸서 단백질을 갖는 WNV는 실험 기간 동안 세포 사멸이 거의 또는 전혀 나타나지 않은 반면(별표로 표시), 인핸서 단백질이 없는 WNV는 눈에 띄는 세포 사멸을 나타냈으며(별표로 표시), 72시간 후에는 실험 기간 전체에서 점점 더 뚜렷해졌다. 세포 영상은 인핸서 단백질이 없는 WNV로부터 방출된 물질이 VLP의 조절된 분비보다는 세포 사멸로부터의 단백질 방출로 인한 것일 가능성이 가장 높다는 추가 증거이다.
본 실시예는 본 개시내용의 방법 및 조성물이 생산된 항원의 품질을 향상시킨다는 것을 더 입증한다.
실시예 11: WNV E 및 M 단백질과 공동 발현되는 경우 L 단백질은 총 웨스트나일 바이러스(WNV) VLP 생산을 증가시켰다.
온전한 VLP를 단리하기 위해, 150 mm 접시에서 4 x 106개의 HEK293 세포에 WNV의 NY99 균주의 전구체 막 단백질(prM) 및 외피 당단백질(E) 및 인핸서 단백질을 암호화하는 플라스미드를 형질주입시켰다. 모든 실험에 WNV의 NY99 균주의 전구체 막 단백질(prM) 및 외피 당단백질(E)만을 암호화하고 인핸서 단백질은 암호화하지 않는 대조군 플라스미드를 사용하였다. 형질주입은 150 mm 접시당 40 μg의 플라스미드 및 80 μg의 PEI 복합체를 사용하여 제조업체 설명에 따라 PEI 복합체를 사용하여 수행하였다. 형질주입 12시간 후에 배지를 교체하고 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. VLP 함유 상청액을 수거하고, 스핀 다운(1,500 x g, 15분)시키고, Amicon 초원심분리 필터 장치(100 kDa 컷오프)를 사용하여 농축하였다. 농축물을 스핀 다운(4,500 x g, 15분)시켜 침전물을 제거하고 VLP를 1.5시간 동안 100,000 x g에서 20% 수크로스 쿠션을 통해 펠릿화하였다. VLP를 PBS에 재현탁시키고 ELISA로 분석하였다.
ELISA를 상기 기재된 바와 같이 그리고 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.prot093708]에 기재된 바와 같이 그리고 당업계에 알려진 바와 같이 수행하였다. 약술하자면, 1:20에서 1:72,000까지 연속 희석으로 PBS에 재현탁된 VLP를 사용하여 고결합 96웰 플레이트를 코팅하여 인핸서 단백질이 있는 작제물과 인핸서 단백질이 없는 작제물 간의 발현량 차이를 시각화하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고 EZ 블록(Scytek Laboratories)으로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 항-웨스트나일 바이러스 항체, 클론 E16을 EZ 블록(1:5,000)에 희석하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고 염소 항-마우스 HRP 표지된 검출 항체(Southern Biotech)를 검출을 위해 첨가한 후 세척하고 TMB 기질 및 정지 용액과 함께 인큐베이션팅했다. 플레이트 판독기를 사용하여 신호를 450 nm에서의 흡광도로 판독하였다.
도 25는 인핸서 단백질이 있는 있는 웨스트나일 작제물 및 인핸서 단백질이 없는 웨스트나일 바이러스 작제물의 전체 발현과 분비 사이의 차이를 입증한다. 도시된 바와 같이, 인핸서 단백질의 첨가(원)는 인핸서 단백질이 없는 작제물(사각형)에 비해 웨스트나일 바이러스 입자의 더 높은 발현으로 이어졌다. 이는 본 개시내용의 조성물 및 방법이 WNV VLP 백신 생산에 유익하다는 것을 입증한다.
실시예 12: 마우스에서 L 인핸서 단백질과 공동 발현된 웨스트나일 바이러스 단백질의 면역원성
WNV의 전구체 막(prM), 외피 당단백질(E) 및 인핸서 단백질을 암호화하는 플라스미드로의 백신 접종 시 생체 내에서 면역 반응을 일으키는 능력을 BALB/c 마우스를 사용하여 다음과 같이 평가한다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스를 체중에 기초하여 군으로 무작위 배정하였다. 제1일과 제21일에 피부내 또는 근육내 주사를 사용하여 마우스에게 플라스미드를 투여한다. 제1일(백신접종 전), 제21일(부스트 전) 및 제42일에 마우스 혈청 샘플을 수집한다. 제42일에 마우스를 희생시키고 비장세포를 단리한다.
각각의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 항-M 및 항-E 항체의 역가를 평가함으로써 유발된 체액성 면역 반응을 측정한다. 추가로, 각각의 IFN-γ 및 IL-4 효소 결합 면역 흡수 스팟(Dual color ELISpot) 검정을 사용하여 항원 반응성 T 세포의 존재를 평가함으로써 세포 면역 반응을 측정한다.
ELISA를 본원에 기재된 바와 같이 그리고 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.prot093708]에 기재된 바와 같이 그리고 당업계에 알려진 바와 같이 수행한다. 약술하자면, 고결합 96웰 플레이트를 재조합 prM 및 E 단백질(Abcam)을 사용하여 2 μg/ml 농도로 코팅하고 차단한다. 혈청 샘플을 EZ 블록 시약으로 연속 희석하고, 사전 코팅된 웰에 첨가하고, 세척하고, 염소 항-마우스 HRP 표지 검출 항체를 사용하여 검출한 다음, 세척하고, TMB 기질 및 정지 용액과 함께 인큐베이션시킨다. 종점 역가는 ELISA 신호(450 nm에서의 흡광도)가 배경 신호의 3 표준 편차를 초과하는 상호 최대 항체 희석으로 정의된다.
Dual color ELISpot 검정을 본원에 기재된 바와 같이 그리고, 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harb Protoc 2010 doi:10.1101/pdb.prot5369]에 기재된 바와 같이 그리고 당업계에 알려진 바와 같이 수행한다. 약술하자면, 제42일에 비장세포를 단리하고 각각의 prM 또는 E 펩티드 어레이(Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository)로 자극하고, 미리 준비된 ELISpot 마이크로플레이트에 첨가한다. 음성(배지) 및 양성 대조군(포르볼 미리스테이트 아세테이트/이오노마이신)을 검정에 포함시킨다. 항원-반응성 IFN-감마 및 IL-4 분비 T 세포의 수를 ELISpot 판독기를 사용하여 계수한다.
마지막으로, 상이한 시점(상기 참조)에서 단리된 마우스 혈청 내 WNV 중화 항체의 존재를 본원에 기재된 바와 같이 그리고 문헌[The Journal of Infectious Diseases, Volume 196, Issue 12, 15 December 2007, Pages 1732-1740] 및 문헌[Virology, Volume 346, Issue 1, 1 March 2006, Pages 53-65]에 기재된 바와 같이 평가한다. 약술하자면, WNV 리포터-바이러스 입자(RVP: reporter-virus particles)를 일시적으로 형질주입된 리포터-레플리콘(루시퍼라제) 및 일시적으로 형질주입된 캡시드 단백질이 보충된, WNV prM 및 E 단백질(하위바이러스 입자라고도 알려진 바이러스 유사 입자를 형성하기 위해)을 일시적으로 형질주입시켜 HEK293T 세포에서 생성시킨다. 단리된 RVP를 상이한 연속 희석으로 마우스 혈청 샘플과 함께 인큐베이션시키고, 미리 플레이팅된 PHK-21 세포에 첨가하고, 2일 동안 인큐베이션시킨 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 리포터 유전자 활성을 측정한다. 리포터 유전자 활성의 감소는 마우스 혈청에서 WNV 중화 항체 수준을 반영한다.
실시예 13: 추가적인 폴리뉴클레오티드 작제물의 발현 및 면역원성
다른 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 단백질(예를 들어, HA, NA, M1, M2, 또는 이의 임의의 조합), B형 간염 바이러스 단백질(예를 들어, sAg(S 단백질), sAg(M 단백질), sAg(L 단백질), preS1, preS2, cAg(코어 항원), 또는 이의 임의의 조합), 인간 파필로마바이러스(예를 들어, HPV 6의 L1 단백질, HPV 11의 L1 단백질, HPV 16의 L1 단백질, HPV 18의 L1 단백질, 또는 이의 임의의 조합)로부터 유래된 바이러스 단백질을 암호화하는 플라스미드의 작제를 실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 수행한다. HEK293T 세포에서 이들 단백질의 상이한 조합의 발현 및 VLP의 단리를 실시예 7, 실시예 8, 실시예 10 및 실시예 11에 기재된 방법을 사용하여 수행한다. 이들 단백질을 암호화하는 플라스미드의 면역원성을 실시예 9 및 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 시험한다.
인용에 의한 포함
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 사실상 전체 내용이 참조에 의해 포함된다. 그러나 본원에 인용된 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원의 언급은, 그것이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 모든 나라에서 공통적인 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 어떠한 형태로든 시사하는 것으로 받아들여지지 않고 받아들여져서는 안 된다.
번호를 붙인 실시형태
실시형태 1. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 여기서 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체인, 벡터.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성, 또는 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는, 벡터.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2인, 벡터.
실시형태 4. 실시형태 1 내지 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된, 벡터.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24인, 벡터.
실시형태 6. 실시형태 1 내지 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 단백질은 바이러스 항원인, 벡터.
실시형태 6.1. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 단백질은 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스(HPV), 웨스트나일 바이러스, 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 6.2. 실시형태 6.1에 있어서, 바이러스 단백질은 코로나바이러스로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 실시형태 6.2 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스인, 벡터.
실시형태 8. 실시형태 7에 있어서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스인, 벡터.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스인, 벡터.
실시형태 10. 실시형태 7에 있어서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스인, 벡터.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 실시형태 10 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질인, 벡터.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 벡터.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13인, 벡터.
실시형태 13.1. 실시형태 11에 있어서, 스파이크 단백질은 돌연변이체 스파이크 단백질인, 벡터.
실시형태 13.2. 실시형태 13.1에 있어서, 돌연변이체 스파이크 단백질은 서열번호 13에 아미노산 치환인 R682G, R683S, R685S, K986P, 및 V987P를 포함하는, 벡터.
실시형태 13.3. 실시형태 13.1에 있어서, 돌연변이체 스파이크 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는, 벡터.
실시형태 14. 실시형태 1 내지 실시형태 13.3 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 막(M) 단백질인, 벡터.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, M 단백질은 서열번호 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 벡터.
실시형태 16. 실시형태 14 또는 실시형태 15에 있어서, M 단백질은 서열번호 33인, 벡터.
실시형태 17. 실시형태 1 내지 실시형태 16 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 외피(E) 단백질인, 벡터.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, E 단백질은 서열번호 22와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 벡터.
실시형태 19. 실시형태 17 또는 실시형태 18에 있어서, E 단백질은 서열번호 22인, 벡터.
실시형태 20. 실시형태 1 내지 실시형태 19 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질인, 벡터.
실시형태 21. 실시형태 20에 있어서, N 단백질은 서열번호 20과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 벡터.
실시형태 22. 실시형태 20 또는 실시형태 21에 있어서, N 단백질은 서열번호 20인, 벡터.
실시형태 23. 실시형태 1 내지 실시형태 22 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성하는, 벡터.
실시형태 23.1. 실시형태 6.1에 있어서, 바이러스 단백질은 웨스트나일 바이러스로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 23.2. 실시형태 23.1에 있어서, 바이러스 단백질은 전구체 막 단백질(preM), 외피 당단백질(E), 또는 이의 조합물인, 벡터.
실시형태 24. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
실시형태 25. 실시형태 24에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30의 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
실시형태 26. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31의 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
실시형태 27.1. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 서열번호 35 내지 서열번호 49, 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
실시형태 28. 실시형태 1 내지 실시형태 27.1 중 어느 하나에 있어서, 네이키드 폴리뉴클레오티드인 벡터.
실시형태 29. 실시형태 1 내지 실시형태 28 중 어느 하나에 있어서, 데옥시리보핵산(DNA) 폴리뉴클레오티드인 벡터.
실시형태 30. 실시형태 1 내지 실시형태 28 중 어느 하나에 있어서, 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드인 벡터.
실시형태 31. 실시형태 1 내지 실시형태 30 중 어느 하나에 있어서, 플라스미드를 포함하는 벡터.
실시형태 32. 실시형태 1 내지 실시형태 30 중 어느 하나에 있어서, 선형 DNA를 포함하는 벡터.
실시형태 33. 실시형태 1 내지 실시형태 32 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 벡터.
실시형태 33.1. 실시형태 1 내지 실시형태 33 중 어느 하나에 있어서, DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 DNA 폴리뉴클레오티드는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 벡터.
실시형태 33.2. 실시형태 33.1에 있어서, 바이러스 패키징 신호는 RNA 폴리뉴클레오티드인, 벡터.
실시형태 33.3. 실시형태 33.2에 있어서, 바이러스 패키징 신호는 코로나바이러스로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 34. 백신 조성물로서, 실시형태 1 내지 실시형태 33.3 중 어느 하나의 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
실시형태 35. 실시형태 34에 있어서, 아주반트를 포함하는 백신 조성물.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 아주반트는 명반인, 백신 조성물.
실시형태 37. 실시형태 35에 있어서, 아주반트는 모노포스포릴 지질 A(MPL)인, 백신 조성물.
실시형태 38. 진핵 세포에서 바이러스 항원을 발현시키는 방법으로서, 세포를 실시형태 1 내지 실시형태 33.3 중 어느 하나의 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
실시형태 39. 실시형태 38에 있어서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은: 인핸서 단백질이 없는 벡터보다 (i) 더 높은 발현 수준에서의 항원의 발현; 및/또는 (ii) 더 긴 시간 기간 동안의 항원의 발현; 및/또는 (iii) 더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원의 발현을 일으키는, 방법.
실시형태 40. 실시형태 38 또는 실시형태 39에 있어서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은: 인핸서 단백질이 없는 벡터보다 (i) 더 높은 발현 수준에서의 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)의 발현; 및/또는 (ii) 더 긴 시간 기간 동안의 항원을 포함하는 VLP의 발현; 및/또는 (iii) 더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원을 포함하는 VLP의 발현을 일으키는, 방법.
실시형태 40.1. 실시형태 40에 있어서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 바이러스 패키징 신호의 발현을 일으키고, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화시키는, 방법.
실시형태 40.2. 실시형태 40.1에 있어서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군 벡터와 비교할 때, 더 많은 수의 VLP의 형성을 일으키는, 방법.
실시형태 41. 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 실시형태 34 내지 실시형태 37 중 어느 하나의 백신 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
실시형태 42. 실시형태 41에 있어서, 대상체의 투여 부위의 조직은 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현하는, 방법.
실시형태 43. 실시형태 42에 있어서, 대상체의 투여 부위의 조직은 인핸서 단백질이 없는 벡터가 투여되는 경우보다 (i)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 더 높은 발현 수준으로 발현하고; 그리고/또는 (ii)항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 더 긴 시간 기간 동안 발현하고; 그리고/또는 (iii)더 양호한 단백질 품질을 갖는 항원 및/또는 항원을 포함하는 VLP를 발현하는, 방법.
실시형태 43.1. 실시형태 41 내지 실시형태 43 중 어느 하나에 있어서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 대상체의 투여 부위의 조직은 바이러스 패키징 신호를 발현하고, VLP는 바이러스 패키징 신호를 캡시드화하는, 방법.
실시형태 43.2. 실시형태 43 또는 실시형태 43.1에 있어서, 벡터는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드가 없는 대조군 벡터와 비교할 때, 더 많은 수의 VLP의 발현을 일으키는, 방법.
실시형태 43.3. 실시형태 43 내지 실시형태 43.2 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 패키징 신호를 캡시드화하는 VLP는 항원을 포함하지만 바이러스 패키징 신호가 없는 대조군 VLP보다 더 양호한 면역원성인, 방법.
실시형태 44. 실시형태 41 내지 실시형태 43 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 항체 반응을 유발하는 방법.
실시형태 45. 실시형태 44에 있어서, 항체 반응은 중화 항체 반응인, 방법.
실시형태 46. 실시형태 41 내지 실시형태 43 중 어느 하나에 있어서, 세포 면역 반응을 유발하는 방법.
실시형태 47. 실시형태 41 내지 실시형태 46 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 예방학적, 예방적 및/또는 치료적 면역 반응을 유발하는 방법.
실시형태 48. 실시형태 41 내지 실시형태 47 중 어느 하나에 있어서, 투여는 피부내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 비강내 투여인, 방법.
실시형태 49. 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체인, 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 50. 실시형태 49에 있어서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성, 또는 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 51. 실시형태 49 또는 실시형태 50에 있어서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 52. 실시형태 49 내지 실시형태 51 중 어느 하나에 있어서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 53. 실시형태 52에 있어서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 54. 실시형태 49 내지 실시형태 53 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 항원인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 55. 실시형태 49 내지 실시형태 54 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 56. 실시형태 55에 있어서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 57. 실시형태 56에 있어서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 58. 실시형태 55에 있어서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 59. 실시형태 49 내지 실시형태 58 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 60. 실시형태 59에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 61. 실시형태 59 또는 실시형태 60에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 62. 실시형태 49 내지 실시형태 61 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 막(M) 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 63. 실시형태 62에 있어서, M 단백질은 서열번호 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 64. 실시형태 62 또는 실시형태 63에 있어서, M 단백질은 서열번호 33인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 65. 실시형태 49 내지 실시형태 64 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 외피(E) 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 66. 실시형태 65에 있어서, E 단백질은 서열번호 22와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 67. 실시형태 65 또는 실시형태 66에 있어서, E 단백질은 서열번호 22인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 68. 실시형태 49 내지 실시형태 67 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 69. 실시형태 68에 있어서, N 단백질은 서열번호 20과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 70. 실시형태 68 또는 실시형태 69에 있어서, N 단백질은 서열번호 20인, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 71. 실시형태 49 내지 실시형태 70 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 72. 서열번호 30의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 73. 실시형태 72에 있어서, 서열번호 30의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 74. 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 75. 실시형태 74에 있어서, 서열번호 31의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 76. 실시형태 49 내지 실시형태 75 중 어느 하나에 있어서, 네이키드 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드.
실시형태 77. 실시형태 49 내지 실시형태 76 중 어느 하나에 있어서, 데옥시리보핵산(DNA) 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드.
실시형태 78. 실시형태 49 내지 실시형태 76 중 어느 하나에 있어서, 리보핵산(RNA) 폴리뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드.
실시형태 79. 실시형태 49 내지 실시형태 78 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
실시형태 80. 벡터를 포함하는 키트로서, 벡터는 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체인, 벡터를 포함하는 키트.
실시형태 81. 실시형태 80에 있어서, 인핸서 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성, 또는 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는, 키트.
실시형태 82. 실시형태 80 또는 실시형태 81에 있어서, 인핸서 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된, 키트.
실시형태 83. 실시형태 82에 있어서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24인, 키트.
실시형태 84. 실시형태 80 내지 실시형태 83 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 항원인, 키트.
실시형태 85. 실시형태 80 내지 실시형태 84 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스인, 키트.
실시형태 86. 실시형태 85에 있어서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스인, 키트.
실시형태 87. 실시형태 86에 있어서, SARS 바이러스는 SARS-CoV-2 바이러스인, 키트.
실시형태 88. 실시형태 85에 있어서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스인, 키트.
실시형태 89. 실시형태 80 내지 실시형태 88 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 스파이크 단백질인, 키트.
실시형태 90. 실시형태 89에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 키트.
실시형태 91. 실시형태 90에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13인, 키트.
실시형태 92. 실시형태 80 내지 실시형태 91 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 막(M) 단백질인, 키트.
실시형태 93. 실시형태 92에 있어서, M 단백질은 서열번호 33과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 키트.
실시형태 94. 실시형태 92 또는 실시형태 93에 있어서, M 단백질은 서열번호 33인, 키트.
실시형태 95. 실시형태 80 내지 실시형태 94 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 외피(E) 단백질인, 키트.
실시형태 96. 실시형태 95에 있어서, E 단백질은 서열번호 22와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 키트.
실시형태 97. 실시형태 95 또는 실시형태 96에 있어서, E 단백질은 서열번호 22인, 키트.
실시형태 98. 실시형태 80 내지 실시형태 97 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스 단백질은 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질인, 키트.
실시형태 99. 실시형태 98에 있어서, N 단백질은 서열번호 20과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 공유하는, 키트.
실시형태 100. 실시형태 98 또는 실시형태 99에 있어서, N 단백질은 서열번호 20인, 키트.
실시형태 101. 실시형태 80에 있어서, 발현 카세트는 서열번호 30의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
실시형태 102. 실시형태 80에 있어서, 발현 카세트는 서열번호 31의 핵산 서열과 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
실시형태 103. 실시형태 80 내지 실시형태 102 중 어느 하나에 있어서, 키트는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 키트.
실시형태 104. 벡터로서, 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 표적 유전자에 연결된 프로모터를 포함하고, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
실시형태 105. 실시형태 104에 있어서, 바이러스 패키징 요소는 RNA 폴리뉴클레오티드인, 벡터.
실시형태 106. 실시형태 104 또는 실시형태 105에 있어서, 바이러스 패키징 요소는 코로나바이러스로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 107. 실시형태 106에 있어서, 바이러스 패키징 요소는 SARS-CoV2로부터 유래되는, 벡터.
실시형태 108. 실시형태 104 내지 실시형태 107 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열과 적어도 약 70%의 동일성을 갖는, 벡터.
실시형태 109. 진핵 세포에서 표적 단백질을 발현시키는 방법으로서, 세포를 실시형태 104 내지 실시형태 108 중 어느 하나의 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 110. 실시형태 109에 있어서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 표적 단백질의 바이러스 유사 입자(VLP)의 형성을 일으키는, 방법.
실시형태 111. 실시형태 110에 있어서, 세포를 벡터와 접촉시키는 것은 발현 카세트를 포함하지만 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열이 없는 대조군 벡터와 비교할 때 더 많은 수의 표적 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)의 형성을 일으키는, 방법.
실시형태 112. 실시형태 33.1 내지 실시형태 33.3 중 어느 하나의 벡터, 또는 실시형태 40.1, 실시형태 40.2, 실시형태 43.1 내지 실시형태 43.3 중 어느 하나의 방법으로서, 바이러스 패키징 요소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 34의 핵산 서열과 적어도 약 70%의 동일성을 갖는, 방법.
실시형태 113. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33(M 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20(N 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13(S 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제3 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22(E 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2(인핸서 L 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 114. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33(M 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13(S 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22(E 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24(IRES)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2(인핸서 L 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20(N 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34(바이러스 패키징 신호)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 115. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 116. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로 다음 요소를 포함한다:: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
SEQUENCE LISTING <110> Excepgen Inc. <120> VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> EXCI-003/03WO 336721-2012 <150> US 63/162,496 <151> 2021-03-17 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 71 <212> PRT <213> Cardiovirus Theiler's-like virus <400> 1 Met Ala Cys Lys His Gly Tyr Pro Leu Met Cys Pro Leu Cys Thr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Lys Thr Ser Asp Gly Leu Phe Thr Leu Leu Phe Asp Asn Glu 20 25 30 Trp Tyr Pro Thr Asp Leu Leu Thr Val Asp Leu Glu Asp Glu Val Phe 35 40 45 Tyr Pro Asp Asp Pro His Met Glu Trp Thr Asp Leu Pro Leu Ile Gln 50 55 60 Asp Ile Glu Met Glu Pro Gln 65 70 <210> 2 <211> 67 <212> PRT <213> Cardiovirus Encephalomyocarditis virus <400> 2 Met Ala Thr Thr Met Glu Gln Glu Thr Cys Ala His Ser Leu Thr Phe 1 5 10 15 Glu Glu Cys Pro Lys Cys Ser Ala Leu Gln Tyr Arg Asn Gly Phe Tyr 20 25 30 Leu Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Trp Tyr Pro Glu Glu Leu Leu Thr Asp 35 40 45 Gly Glu Asp Asp Val Phe Asp Pro Glu Leu Asp Met Glu Val Val Phe 50 55 60 Glu Leu Gln 65 <210> 3 <211> 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aacattccca ccaacagagc ctaaaaagga caaaaagaag aaggctgatg 7980 aaactcaagc cttaccgcag agacagaaga aacagcaaac tgtgactctt cttcctgctg 8040 cagatttgga tgatttctcc aaacaattgc aacaatccat gagcagtgct gactcaactc 8100 aggccggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagat gtggaggaga 8160 accctggacc tatgtactca ttcgtttcgg aagagacagg tacgttaata gttaatagcg 8220 tacttctttt tcttgctttc gtggtattct tgctagttac actagccatc cttactgcgc 8280 ttcgattgtg tgcgtactgc tgcaatattg ttaacgtgag tcttgtaaaa ccttcttttt 8340 acgtttactc tcgtgttaaa aatctgaatt cttctagagt tcctgatctt ctggtctaa 8399 <210> 31 <211> 6308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CoVEG1 insert sequence <400> 31 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 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atctgccacg atggcaaggc ccacttccct agagagggcg ttttcgtgtc taacggcaca 3300 cactggtttg tgacccagag aaacttctac gagcctcaga tcatcaccac agacaacacc 3360 tttgtgagcg gcaattgcga cgtggtgatc ggaattgtta ataataccgt gtacgaccct 3420 ctgcagcctg agctcgacag cttcaaggaa gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc 3480 tccccagatg tggacctggg cgatatttca ggcatcaacg cctccgtcgt gaatatccag 3540 aaggagatcg accggctcaa cgaggtggcc aagaacctta acgagagcct gatcgacctg 3600 caggaactgg gcaaatatga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttt 3660 atcgcaggcc tgatcgctat cgtgatggtg accattatgc tgtgttgtat gaccagctgt 3720 tgtagttgtc tgaagggctg ctgttcttgc ggcagctgct gcaagttcga cgaagacgac 3780 tcagagcccg tgctgaaagg cgtgaagctg cactacacct aatccccccc ccctaacgtt 3840 actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 3900 atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 3960 attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 4020 gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 4080 cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 4140 acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 4200 gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 4260 cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 4320 ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 4380 tgataatatg gccacaacca tggaacaaga gacttgcgcg cactctctca cttttgagga 4440 atgcccaaaa tgctctgctc tacaataccg taatggattt tacctgctaa agtatgatga 4500 agaatggtac ccagaggagt tattgactga tggagaggat gatgtctttg atcccgaatt 4560 agacatggaa gtcgttttcg agttacagta a 4591 <210> 66 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS CoV2 M gene <400> 66 atggccgaca gcaacggcac aatcaccgtg gaagagctga agaaactgct ggaacagtgg 60 aacctggtca tcggcttcct gtttctgacc tggatctgtc tgctgcagtt cgcttatgcc 120 aatcggaaca gattcctgta catcatcaag ctgatcttcc tgtggctgct gtggcctgtg 180 accctggctt gcttcgtgct ggccgctgtg taccggatca actggatcac aggcggaatc 240 gccatcgcca tggcctgcct ggtgggcctg atgtggctga gctacttcat cgcttctttc 300 agactgttcg ccagaacccg gagcatgtgg tccttcaacc ccgagacaaa catcctgctg 360 aacgtgcctc tgcacggcac catcctgaca agacctctgc tcgagagcga gctggtgatt 420 ggcgcagtga ttctgagagg ccatctgagg atcgccggac accacctggg cagatgcgac 480 atcaaggacc ttccaaagga aatcaccgtt gccaccagcc ggaccctgtc ctactacaaa 540 ctgggcgcca gccaaagagt ggccggcgat agcggctttg ccgcctacag cagataccgc 600 atcggaaatt acaagctcaa caccgaccac agcagctctt ctgataacat cgccctgctg 660 gtgcagtaa 669 <210> 67 <211> 565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES encoding sequence <400> 67 tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc 60 tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc 120 cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt 180 ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct 240 gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa 300 aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt 360 tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag 420 gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt 480 acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt 540 ttcctttgaa aaacacgatg ataat 565 <210> 68 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L peptide from ECMV encoding sequence <400> 68 atggccacaa ccatggaaca agagacttgc gcgcactctc tcacttttga ggaatgccca 60 aaatgctctg ctctacaata ccgtaatgga ttttacctgc taaagtatga tgaagaatgg 120 tacccagagg agttattgac tgatggagag gatgatgtct ttgatcccga attagacatg 180 gaagtcgttt tcgagttaca g 201 <210> 69 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A skipping site encoding sequence <400> 69 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagatgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 70 <211> 3822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS CoV2 Spike gene <400> 70 atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtcagctccc agtgtgtgaa cctgaccacc 60 agaacccagc tgccacctgc ttatacaaac tccttcactc ggggggtata ctaccccgac 120 aaggtgttca gatctagcgt gctgcattct acacaagacc tgttcctgcc cttcttcagc 180 aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tctggaacca acggaaccaa gagattcgac 240 aaccccgtgc tgcctttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gtccaacatc 300 atcagaggat ggattttcgg caccacactg gacagcaaaa cccagagcct gctgatcgtg 360 aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa tgatcccttc 420 ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg aaagcgagtt cagagtgtat 480 tccagcgcca acaattgcac cttcgagtac gtgagccaac cctttctgat ggaccttgaa 540 ggcaagcagg gcaacttcaa aaatctgcga gaatttgtgt tcaagaacat cgacggatac 600 ttcaagatct actctaagca cacgccaatc aacctggtga gagatctgcc ccagggcttt 660 agcgctttgg aacctctggt ggacctgcct atcggaatca acatcaccag atttcaaact 720 ctcctggccc tgcacagatc ttatctgacc cctggggaca gtagtagcgg ctggacagcc 780 ggcgccgccg cctactacgt gggatacctg cagcctagaa cattcctgct gaagtacaat 840 gagaacggaa caatcacaga cgccgtggac tgcgccctgg atcctttgag cgagacaaag 900 tgcaccctga agtcgttcac cgtcgaaaaa ggcatctacc agaccagcaa cttccgcgtg 960 cagcctacgg aatctatcgt gcggttcccc aacatcacca acctgtgccc tttcggcgag 1020 gtgtttaacg ctacaaggtt cgccagcgtg tatgcctgga acagaaagag aatcagcaat 1080 tgcgtggccg attatagcgt tctgtacaac agcgcttcct tcagcacctt caagtgctac 1140 ggcgtgtctc caaccaagct gaacgacctc tgcttcacca atgtctacgc tgactctttc 1200 gtgattagag gcgatgaggt tagacagatc gcacctggcc agaccggcaa aatcgctgac 1260 tacaactaca agctgcctga tgacttcaca ggctgtgtca ttgcctggaa ctcaaataac 1320 ctggactcta aagtgggcgg caactacaac tacctgtacc ggctgttccg gaagagcaat 1380 ctgaaacctt ttgagcggga catctctaca gagatctacc aggccggcag cacaccctgc 1440 aacggcgttg agggcttcaa ctgctacttc cctctgcaga gctacggctt tcagccaaca 1500 aatggagtgg gctaccagcc gtacagagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgcc 1560 ccagccacag tgtgtggacc taagaagtct accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620 tttaacttta acggcctgac cggcacaggc gtgctgaccg aatccaacaa aaagttcctg 1680 cccttccaac agttcggcag agacatcgcc gatacaaccg atgccgtgcg ggacccccag 1740 accttagaaa tcctagatat caccccgtgc agcttcggcg gagtctctgt tattactcct 1800 ggcaccaaca ccagcaacca agtggctgtt ctgtaccaag gcgtgaactg caccgaagtg 1860 cctgtggcta tccacgccga tcagctgacc ccaacctggc gggtgtatag caccggctct 1920 aacgtgttcc agacccgggc tggctgcctg atcggcgccg aacacgtcaa caactcctat 1980 gaatgtgaca tccccatcgg ggctggcatc tgcgccagtt accagacaca gacaaatagc 2040 cctagacggg ccagaagcgt ggcctcccag agtatcattg cctacaccat gagcctgggc 2100 gccgagaaca gcgtggccta ttctaacaat agcatcgcaa tccctaccaa ctttaccatc 2160 tctgtgacaa ccgagatcct gcctgtgagc atgaccaaaa ccagcgtgga ctgcacgatg 2220 tacatctgtg gcgacagcac agaatgcagt aatctgttgc tgcagtacgg cagcttttgc 2280 acccagttga atagagccct gaccggaatc gccgtagagc aggacaaaaa tacccaggag 2340 gtgttcgccc aggtgaaaca gatctacaag acacctccca ttaaggactt cggaggtttt 2400 aacttcagcc agatcctgcc cgacccttcc aagcctagca aacgctcctt catcgaggac 2460 ctgctcttca acaaggtgac actggctgat gccggcttca tcaagcagta cggagattgt 2520 ctgggagaca tcgccgctag agatctgatc tgcgcccaaa agttcaacgg cctgaccgtg 2580 ctgcctcctc tgcttacaga cgagatgatc gcccagtaca ccagcgccct gctggctggc 2640 accatcacaa gcggctggac cttcggagcc ggagccgctc tgcaaatccc ctttgccatg 2700 cagatggcct accggttcaa cggcatcggc gtgacacaga atgtgctgta cgagaaccag 2760 aagctgatcg ctaaccagtt taacagcgct atcggcaaga tccaggactc gctgagtagc 2820 accgcctctg ccctgggcaa gctgcaggac gtcgtgaacc agaacgccca agccctgaac 2880 acactggtga aacagctgag cagcaacttc ggcgccatca gctctgtgct gaacgatatc 2940 ctgagcagac tggacaaggt ggaagccgag gtccagatcg acagactgat cacaggaaga 3000 ctgcagagcc tgcaaacgta cgtgacacag cagctgatcc gggcagccga aatccgggcc 3060 agcgccaatc tggccgctac caagatgagc gagtgcgtgt taggccagag caagcgggtg 3120 gatttctgcg gtaagggata ccacctgatg agctttcccc agagcgctcc tcacggcgtg 3180 gtgtttctgc acgtgaccta cgttcctgcc caggaaaaga acttcaccac cgcccctgct 3240 atctgccacg atggcaaggc ccacttccct agagagggcg ttttcgtgtc taacggcaca 3300 cactggtttg tgacccagag aaacttctac gagcctcaga tcatcaccac agacaacacc 3360 tttgtgagcg gcaattgcga cgtggtgatc ggaattgtta ataataccgt gtacgaccct 3420 ctgcagcctg agctcgacag cttcaaggaa gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc 3480 tccccagatg tggacctggg cgatatttca ggcatcaacg cctccgtcgt gaatatccag 3540 aaggagatcg accggctcaa cgaggtggcc aagaacctta acgagagcct gatcgacctg 3600 caggaactgg gcaaatatga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttt 3660 atcgcaggcc tgatcgctat cgtgatggtg accattatgc tgtgttgtat gaccagctgt 3720 tgtagttgtc tgaagggctg ctgttcttgc ggcagctgct gcaagttcga cgaagacgac 3780 tcagagcccg tgctgaaagg cgtgaagctg cactacacct aa 3822 <210> 71 <211> 1257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS CoV2 N gene <400> 71 atgagcgaca acggccctca aaaccagaga aatgcccctc ggatcacatt tggcggacct 60 agcgacagca ccggcagcaa ccagaatgga gaaagaagcg gcgccagatc caagcagcgg 120 agacctcagg gactgcccaa caacaccgct agctggttca ccgccctgac ccaacacggc 180 aaggaagatc tgaagttccc cagaggccag ggcgtgccta tcaacacaaa ctcttctccc 240 gacgaccaga tcggatacta tagacgggcc actcggagaa ttcggggcgg cgacggaaaa 300 atgaaggacc tttctccaag atggtacttc tactacctcg gcacaggccc tgaggccggc 360 ctgccttacg gcgccaacaa ggatggcatc atctgggtcg ccaccgaggg cgccctgaac 420 acccctaagg accacatcgg cacaagaaac cccgctaaca acgccgcaat cgtgctgcag 480 ctgcctcagg gcaccaccct gcccaagggc ttctacgccg agggctctag aggtggctcc 540 caggcttcta gccgctcctc cagccgcagc agaaacagca gcaggaacag cacccccggc 600 agctcccggg gcaccagccc cgccagaatg gccggaaatg gcggcgatgc cgccctggcc 660 ctgctcctgc tggacagact gaatcagctg gaaagcaaga tgagcggcaa aggacagcag 720 cagcaaggcc agaccgtgac caagaaaagc gctgctgaag cctccaagaa acctagacaa 780 aagcggaccg ccacaaaggc ctacaacgtg acccaagcct ttggaagaag aggccccgag 840 cagacacagg gcaatttcgg cgaccaggag ctgatccggc agggaaccga ctacaagcac 900 tggcctcaga tcgcccagtt cgcccctagc gccagcgcct tcttcggcat gagcagaatc 960 ggcatggaag tgaccccttc tggcacctgg ctgacctaca ccggcgctat caagctggac 1020 gataaggatc ctaacttcaa ggaccaagtg atcctgctga acaagcatat cgacgcctat 1080 aagacctttc cacctacaga gcctaagaaa gataagaaga agaaagccga cgagacacag 1140 gccctgcctc agagacagaa aaagcagcag acagtgacac tgctgccagc cgctgacctg 1200 gatgacttca gcaagcagct gcagcagagc atgtcttctg ctgatagcac ccaggcc 1257 <210> 72 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS CoV2 Envelope gene <400> 72 atgtattctt ttgtgtccga ggaaaccggc acactgatcg ttaatagcgt gctgctcttc 60 ctggccttcg tggtgttcct gctggtgacc ctggctatcc tgaccgccct gagactgtgt 120 gcctactgct gcaacatcgt gaacgtgtct ctggtcaagc ctagcttcta cgtgtacagc 180 cgggtgaaga acctgaacag cagcagagtg cccgacctgc tggtgtga 228

Claims (59)

  1. 바이러스 항원 단백질 및 인핸서 단백질을 암호화하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드로서, 상기 인핸서 단백질은 피코르나바이러스 리더(L) 단백질 또는 이의 기능성 변이체인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1과 적어도 95%의 동일성을 갖거나, 서열번호 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 인핸서 단백질 아미노산 서열을 암호화하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 인핸서 단백질 아미노산 서열을 암호화하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,상기 인핸서 단백질에 작동 가능하게 연결된 내부 리보솜 유입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 암호화하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, IRES를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 24인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 구조 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 코로나바이러스로부터 유래되는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 코로나바이러스는 베타코로나바이러스인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 베타코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV-2: severe acute respiratory syndrome) 바이러스인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  10. 제7항에 있어서, 베타코로나바이러스는 중동 호흡기 증후군(MERS: Middle East respiratory syndrome) 바이러스인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 스파이크(S) 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 13 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, 스파이크 단백질은 서열번호 51의 돌연변이체 스파이크 단백질 서열 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 막(M) 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, M 단백질은 서열번호 33의 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 외피(E) 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, E 단백질은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 뉴클레오캡시드(N) 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, N 단백질은 서열번호 20의 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 바이러스 유사 입자(VLP: virus-like particle)를 형성하는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  21. 제6항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 웨스트나일 바이러스 단백질인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 전구체 막 단백질(preM) 및/또는 외피 당단백질(E)인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  23. 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 30의 서열, 또는 이와 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  24. 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 31의 서열, 또는 이와 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  25. 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 35 내지 49, 및 55의 서열, 또는 이와 적어도 70%의 동일성, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 이 발현 카세트의 폴리뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  27. 제6항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 인플루엔자 바이러스 단백질로부터 유래되는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  28. 제27항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 HA, NA, M1, 및 M2 중 하나 이상인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  29. 제6항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 B형 간염 바이러스 단백질로부터 유래되는, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 항원 단백질은 sAg(S 단백질), sAg(M 단백질), preS1, preS2, 및 cAg(코어 항원) 중 하나 이상인, 백신에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 패키징 신호(viral packaging signal)를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서, 바이러스 패키징 신호는 코로나바이러스로부터 유래되는, 폴리뉴클레오티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  34. 백신 조성물로서, 제33항의 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 아주반트를 포함하는 백신 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 아주반트는 명반(alum) 및/또는 모노포스포릴 지질 A(MPL: monophosphoryl lipid A)인, 백신 조성물.
  36. 진핵 세포에서 바이러스 항원 단백질을 발현시키는 방법으로서, 제33항의 벡터와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 벡터에 비해서 기능성 바이러스 유사 입자(VLP) 생산을 증가시키는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 벡터에 비해서 기능성 VLP 생산을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350%, 약 400%, 약 500%, 또는 약 1000% 증가시키는, 방법.
  39. 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 제34항 또는 제35항의 백신 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간을 증가시키는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배 증가시키는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 세포 반응을 증가시키는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 반응을 약 25%, 약 50%, 약 100%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 또는 약 1000% 증가시키는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 예방학적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 면역 반응을 유발하는 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적 면역 반응을 유발하는 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 피부내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 비강내 투여인, 방법.
  47. 제34항 또는 제35항의 백신 조성물, 하나 이상의 바이알 및 이의 사용 설명서를 포함하는, 키트.
  48. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제3 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
  49. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제1 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 제2 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
  50. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로: 프로모터, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
  51. 백신으로 사용하기 위한 벡터로서, 발현 카세트를 포함하고, 발현 카세트는 5'에서 3' 순서로: 프로모터, 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열번호 33 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 51 또는 서열번호 52 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 S 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 단백질분해 절단 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 E 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 24 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 IRES 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인핸서 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 34 또는 이와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 패키징 신호를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신으로 사용하기 위한 벡터.
  52. 백신 조성물로서, 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항의 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 아주반트를 포함하는 백신 조성물.
  53. 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 제52항의 백신 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간을 증가시키는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 대상체에서 중화 항체의 기간을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배 증가시키는, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 세포 반응을 증가시키는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 인핸서 단백질의 포함은 인핸서 단백질이 없는 백신 조성물에 비해서 Th1 반응을 약 25%, 약 50%, 약 100%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 또는 약 1000% 증가시키는, 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 예방학적, 예방적 및/또는 치료적 면역 반응을 유발하는 방법.
  59. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 피부내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 비강내 투여인, 방법.
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