JP2024511356A - ワクチン組成物及びその使用方法 - Google Patents

ワクチン組成物及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、１つ以上のウイルス抗原タンパク質及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチンにおいて使用するための組成物及び方法を提供し、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）又はその機能的バリアントである。本明細書で提供される組成物及び方法は、機能的ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生を改善し得る。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年３月１７日に出願された、米国仮特許出願第６３／１６２，４９６号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
配列表の組み込み
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＥＸＣＩ＿００３＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５、記録日：２０２２年３月１７日、ファイルサイズ：２６６キロバイト）。
ウイルス性感染症、例えば、インフルエンザは、非常に蔓延しており、しばしば伝染性である。ウイルス性疾患は、ウイルス感染の型並びにヒトの年齢及び全体的な健康を含む他の因子に依存して、特徴及び重症度が変化する広範な種々の症状を生じる。ウイルス感染の治療は、ウイルスの型及び他の因子に依存して、種々の成功の程度であり得る。時には、治療は、症状の管理のみを含み得る。
ウイルス感染と戦うための最も有効な方法は、ワクチン接種によるものであり、これは、将来の感染に対して防御的である全体的な細胞性及び／又は体液性免疫応答を誘導することができる。ワクチン接種は、ウイルス感染の発生を予防するか、又はその重症度を最小限にすることによって、多大な公衆衛生及び経済的利益を提供する。ワクチンは、ウイルス感染を含む２０を超える生命を脅かす疾患を予防するために利用可能であるが、新たな感染性ウイルス例えば、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２の出現は、新たなウイルス標的に対するワクチンの迅速な研究及び開発を必要とし得る。しかし、ワクチンの開発は、最新のゲノム配列決定及び他の技術的進歩をもってしても、依然として時間がかかり、高価である。
したがって、異なるウイルスを標的とするワクチンの開発に迅速に適合させるための汎用性を有する方法及び組成物が必要とされている。
ＣｏＶＥＧ２（図１Ａ）及びＣｏＶＥＧ１（図１Ｂ）のプラスミドマップを示す。また、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）エンハンサー及びプロモーター、並びにシミアンウイルス４０ポリＡ（Simian virus 40 Poly A、ＳＶ４０ＰＡ）の相対位置も示す。 ＣｏＶＥＧ２（図１Ａ）及びＣｏＶＥＧ１（図１Ｂ）のプラスミドマップを示す。また、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）エンハンサー及びプロモーター、並びにシミアンウイルス４０ポリＡ（Simian virus 40 Poly A、ＳＶ４０ＰＡ）の相対位置も示す。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＣｏＶＥＧ２からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅタンパク質及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の発現を示す。
ＣｏＶＥＧ２から発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質が、ＶＬＰに集合することができ、細胞から分泌されることを示す。実施例３を参照されたい。図３Ａは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ実験からの結果を示す。図３Ｂは、サイズ排除ＶＬＰ単離実行のクロマトグラムを示す一方、ＶＬＰを含有する空隙容量ピークは矢印で示される。図３Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すウェスタンブロッティング実験からの結果を示す。Ｅ：エンベロープタンパク質、Ｍ：膜タンパク質、Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質、Ｓ：スパイクタンパク質、ＮＴ：非トランスフェクト。 ＣｏＶＥＧ２から発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質が、ＶＬＰに集合することができ、細胞から分泌されることを示す。実施例３を参照されたい。図３Ａは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ実験からの結果を示す。図３Ｂは、サイズ排除ＶＬＰ単離実行のクロマトグラムを示す一方、ＶＬＰを含有する空隙容量ピークは矢印で示される。図３Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すウェスタンブロッティング実験からの結果を示す。Ｅ：エンベロープタンパク質、Ｍ：膜タンパク質、Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質、Ｓ：スパイクタンパク質、ＮＴ：非トランスフェクト。 ＣｏＶＥＧ２から発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質が、ＶＬＰに集合することができ、細胞から分泌されることを示す。実施例３を参照されたい。図３Ａは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すＳＤＳ ＰＡＧＥ実験からの結果を示す。図３Ｂは、サイズ排除ＶＬＰ単離実行のクロマトグラムを示す一方、ＶＬＰを含有する空隙容量ピークは矢印で示される。図３Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィ空隙試料中のＳ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質バンドを示すウェスタンブロッティング実験からの結果を示す。Ｅ：エンベロープタンパク質、Ｍ：膜タンパク質、Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質、Ｓ：スパイクタンパク質、ＮＴ：非トランスフェクト。
マウスにおけるＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２プラスミドの免疫原性を試験するための研究設計を示す。
それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 それぞれＣｏＶＥＧ３～１７の各々のプラスミドマップを示す。 対照Ｓのみのプラスミドのプラスミドマップを示す。ＣＭＶ：サイトメガロウイルス、ＳＶ４０ＰＡ：シミアンウイルス４０ポリＡ。
ＣｏＶＥＧ３～１７の各々における発現カセットの概略図を示す。プラスミドＣｏＶＥＧ３～１７の各々は、コードされる遺伝子、遺伝因子の順序、及び調節因子、例えば、ウイルスパッケージングシグナルの存在又は非存在において異なる。「Ｍ」、「Ｓ」、「Ｎ」、及び「Ｅ」と記されたボックスは、それぞれ膜タンパク質、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を示す。「Ｌ」と記されたボックスは、Ｌエンハンサータンパク質をコードする遺伝子を指す。「Ｓ（Ｍｕｔ）」は、内部内因性フューリン切断部位が、以下のアミノ酸置換：Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓを含むように変異されており、２つのアミノ酸置換、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐを更に有する、融合前立体構造安定化スパイクタンパク質変異体を示す。 ＣｏＶＥＧ３～１７の各々における発現カセットの概略図を示す。プラスミドＣｏＶＥＧ３～１７の各々は、コードされる遺伝子、遺伝因子の順序、及び調節因子、例えば、ウイルスパッケージングシグナルの存在又は非存在において異なる。「Ｍ」、「Ｓ」、「Ｎ」、及び「Ｅ」と記されたボックスは、それぞれ膜タンパク質、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を示す。「Ｌ」と記されたボックスは、Ｌエンハンサータンパク質をコードする遺伝子を指す。「Ｓ（Ｍｕｔ）」は、内部内因性フューリン切断部位が、以下のアミノ酸置換：Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓを含むように変異されており、２つのアミノ酸置換、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐを更に有する、融合前立体構造安定化スパイクタンパク質変異体を示す。
示されたプラスミドの各々、又は他のウイルスタンパク質（Ｍ、Ｎ、若しくはＥ）を伴わずにＳタンパク質のみを発現する対照プラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抗スパイク（Ｓ）タンパク質抗体免疫染色からの画像を示す。画像により、これらの細胞におけるＳタンパク質の発現が確認される。
示されたＣｏＶＥＧ構築物で一過的にトランスフェクトされた場合の、細胞培養上清から単離されたウイルス様粒子（viral-like particle、ＶＬＰ）の調製物のウェスタンブロット分析からの結果を示す。「Ｓ」は、他のウイルスタンパク質（Ｍ、Ｎ、又はＥ）を伴わずにＳタンパク質のみを発現する対照プラスミドによる一過性トランスフェクションを示す。抗ＲＢＤ抗体（左）及び抗Ｎタンパク質抗体（右）による染色は、試験されたプラスミドが、ウイルス構造タンパク質をＶＬＰとして細胞培養上清中に発現及び分泌することができることを示す。赤色矢印は、全長タンパク質を示す。
５６日後の、示されたＣｏＶＥＧプラスミドの各々を注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの１：５００希釈血清試料を使用したＥＬＩＳＡ分析から得られた全シグナル値を示す。 ５６日後の、示されたＣｏＶＥＧプラスミドの各々を注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清試料を使用したＥＬＩＳＡ分析から得られたエンドポイント力価値を示す。エンドポイント力価は、ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）がバックグラウンドシグナルの３標準偏差を超える最大抗体希釈の逆数を指す。
市販のｃＰａｓｓ（商標）中和アッセイ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用した、示されたプラスミドの各々を注射されたマウスから得られた血清試料による、ＡＣＥ２受容体へのスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（receptor binding domain、ＲＢＤ）のインビトロ結合のパーセント（％）阻害を示す。結果は、ＣｏＶＥＧ５及びＣｏＶＥＧ８を注射したマウスから得られた血清試料が、中和抗体を有することを示す。陽性対照及び陰性対照は、ｃＰａｓｓ中和アッセイキットのアッセイ対照であり、それぞれ既知量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体又は血清反応陰性試料を含有し、製造元のプロトコールに従って使用される。
示されたＣｏＶＥＧ構築物で一過的にトランスフェクトされた場合の、細胞培養上清から単離されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の調製物のウェスタンブロット分析からの結果を示す。抗ＲＢＤ抗体（左）及び抗Ｎタンパク質抗体（右）による染色は、試験されたプラスミドが、ウイルス構造タンパク質をＶＬＰとして様々な効率で細胞培養上清中に発現及び分泌することができることを示す。
示されたＣｏＶＥＧ構築物で一過的にトランスフェクトされた場合の、細胞培養上清から単離されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の調製物のウェスタンブロット分析からの結果を示す。抗ＲＢＤ抗体（左）及び抗Ｎタンパク質抗体（右）による染色は、試験されたプラスミドが、ウイルス構造タンパク質をＶＬＰとして様々な効率で細胞培養上清中に発現及び分泌することができることを示す。
１５日後に、示されたＣｏＶＥＧプラスミドの各々を皮内（intradermally、ＩＤ）又は筋肉内（intramuscularly、ＩＭ）のいずれかに注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスからのＥＬＩＳＡ分析から得られた全シグナル値を示す。「Ｓのみ」は、スパイクタンパク質単独の投与を示す。
エンハンサータンパク質（ＥＭＣＶ Ｌ１タンパク質）とともに、ウエストナイルウイルスタンパク質、ｐｒｅＭタンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードするプラスミドのマップを示す。 ウエストナイルウイルスタンパク質、ｐｒｅＭタンパク質、及びエンベロープタンパク質のみをコードする対照プラスミドのマップを示す ＣＭＶ：サイトメガロウイルス、ＳＶ４０ＰＡ：シミアンウイルス４０ポリＡ。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析から得られた全シグナル値を示す。図１５Ａは、抗スパイク（Ｓタンパク質）抗体を用いて実施したＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析を示す。図１５Ｂは、抗ヌクレオカプシド（Ｎタンパク質）抗体を用いて実施したＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析を示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析から得られた全シグナル値を示す。図１５Ａは、抗スパイク（Ｓタンパク質）抗体を用いて実施したＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析を示す。図１５Ｂは、抗ヌクレオカプシド（Ｎタンパク質）抗体を用いて実施したＶＬＰ分泌のＥＬＩＳＡ分析を示す。
ＣｏＶＥＧ１０及びＣｏＶＥＧ２０タンパク質発現の透過型電子顕微鏡写真（transmission electron micrograph、ＴＥＭ）を示す。図１６、左は、Ｌ調節タンパク質を含むＣｏＶＥＧ１０のＴＥＭを示す。図１６、右は、Ｌ調節タンパク質を欠くＣｏＶＥＧ２０のＴＥＭを示す。
示されたプラスミドの各々でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抗ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質抗体免疫染色からの画像を示す。
示されたＣｏＶＥＧ構築物で一過的にトランスフェクトされた場合の、細胞培養上清から単離されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）の調製物のウェスタンブロット分析からの結果を示す。抗ＲＢＤ抗体（左）及び抗Ｎタンパク質抗体（右）による染色は、試験されたプラスミドが、ウイルス構造タンパク質をＶＬＰとして様々な効率で細胞培養上清中に発現及び分泌することができることを示す。
ＣｏＶＥＧ１０プラスミドの共免疫沈降実験のウェスタンブロット結果を示す。（左側）溶出中のＮタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）プルダウンシグナルは、Ｎタンパク質が粒子内に保持されたことを示す。（右側）ｃｏ－ＩＰを抗ＲＢＤ抗体なしで実施し、Ｎタンパク質が沈殿樹脂に非特異的に結合しなかったことを示した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射後の、ＣｏＶＥＧ５及び９－１４プラスミド、並びにプラスミドのみを含むスパイク（Ｓ）タンパク質からの抗体結合力価を示す。
図２０に示される試料からの中和抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射後の、ＣｏＶＥＧ９、１０、及び１８－２０プラスミド、並びにプラスミドのみを含むスパイク（Ｓ）タンパク質からの抗体結合力価を示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣｏＶＥＧ９、１０及び２０プラスミドの筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射に応答して産生された中和抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
ＣｏＶＥＧ１０及びＣｏＶＥＧ２０のＴ細胞分析の結果を示す。図２４Ａは、ＣｏＶＥＧ１０のＴ細胞分析の結果を示す。図２４Ｂは、ＣｏＶＥＧ２０のＴ細胞分析の結果を示す。 ＣｏＶＥＧ１０及びＣｏＶＥＧ２０のＴ細胞分析の結果を示す。図２４Ａは、ＣｏＶＥＧ１０のＴ細胞分析の結果を示す。図２４Ｂは、ＣｏＶＥＧ２０のＴ細胞分析の結果を示す。
エンハンサータンパク質を有する（ＷＮＶ＋ＥＧ、丸）及びエンハンサータンパク質を有さない（ＷＮＣ、四角）単離され、かつ再懸濁されたウエストナイルウイルス（West-Nile Virus、ＷＮＶ）構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞培養上清から精製されたＶＬＰのＥＬＩＳＡ分析を示す。ＥＬＩＳＡの特異性を、特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおいてシグナルを出さないＧＦＰを含むプラスミドに対して試験した。ＥＬＩＳＡ分析は、エンハンサータンパク質の添加を伴う超遠心分離によるＶＬＰの単離が、エンハンサータンパク質の非存在下よりも多くの活性ＶＬＰを含有することを明らかにした。これは、産生されたタンパク質の総量が、エンハンサータンパク質の非存在下でより高かったため、特に驚くべきことであり、エンハンサータンパク質の添加が、発現された標的タンパク質の質を増加させたことを更に示した。
エンハンサータンパク質を有する（ＷＮＶ＋Ｌ）及びエンハンサータンパク質を有さない（ＷＮＶ）過剰発現ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）構築物を含有する上清を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた細胞培養上清の経時変化分析を示す。図２６Ａは、ＷＮＶ＋Ｌ（左）構築物中のＶＬＰ濃度が、トランスフェクション後７２時間でピークに達し、その後徐々に減少したことを示すＥＬＩＳＡ分析を示す。これは、発現プロファイルが、一過性トランスフェクションからのＶＬＰの予想される産生、及び関連するＶＬＰ粒子半減期に従うことから、健常細胞からのＶＬＰ分泌の証拠であった。対照的に、エンハンサータンパク質の非存在下でのＷＮＶ構築物は、上清中のＶＬＰの一定の増加を示し（右）、これは、活性分泌ではなく、細胞死の間の細胞からのタンパク質の非特異的放出とより一致する。図２６Ｂは、細胞画像によりＥＬＩＳＡ分析を確認した。ＷＮＶ＋Ｌ細胞画像（左）は、細胞死をほとんど又は全く示さなかったが、ＷＮＶ細胞画像は、トランスフェクションの７２時間後に開始する細胞死の目に見える徴候を示した（右、細胞死は、黒色星印で示される）。 エンハンサータンパク質を有する（ＷＮＶ＋Ｌ）及びエンハンサータンパク質を有さない（ＷＮＶ）過剰発現ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）構築物を含有する上清を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた細胞培養上清の経時変化分析を示す。図２６Ａは、ＷＮＶ＋Ｌ（左）構築物中のＶＬＰ濃度が、トランスフェクション後７２時間でピークに達し、その後徐々に減少したことを示すＥＬＩＳＡ分析を示す。これは、発現プロファイルが、一過性トランスフェクションからのＶＬＰの予想される産生、及び関連するＶＬＰ粒子半減期に従うことから、健常細胞からのＶＬＰ分泌の証拠であった。対照的に、エンハンサータンパク質の非存在下でのＷＮＶ構築物は、上清中のＶＬＰの一定の増加を示し（右）、これは、活性分泌ではなく、細胞死の間の細胞からのタンパク質の非特異的放出とより一致する。図２６Ｂは、細胞画像によりＥＬＩＳＡ分析を確認した。ＷＮＶ＋Ｌ細胞画像（左）は、細胞死をほとんど又は全く示さなかったが、ＷＮＶ細胞画像は、トランスフェクションの７２時間後に開始する細胞死の目に見える徴候を示した（右、細胞死は、黒色星印で示される）。
マウスの免疫後４２日目及び７０日目におけるＣｏＶＥＧ９、エンハンサータンパク質を有するスパイク構築物（スパイク＋Ｌ）、及びエンハンサータンパク質を有さないスパイク構築物（スパイク）の中和抗体の分析を示す。市販のｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２代理ウイルス中和試験（Surrogate Virus Neutralization Test、ｓＶＮＴ）キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、中和抗体の存在を検出した。分析は、全ての構築物が、時間とともにいくらかの中和能力を失うが、エンハンサータンパク質の添加が、試験動物の血清中の所望の中和抗体の存在を延長することを示した（ＣｏＶＥＧ９及びスパイク＋Ｌ）。図２７Ａは、４２日目及び７０日目のグループごとの個々の動物を示す。図２７Ｂは、同じデータの各処置グループにおける中和抗体レベルの中央値を示す。 マウスの免疫後４２日目及び７０日目におけるＣｏＶＥＧ９、エンハンサータンパク質を有するスパイク構築物（スパイク＋Ｌ）、及びエンハンサータンパク質を有さないスパイク構築物（スパイク）の中和抗体の分析を示す。市販のｃＰａｓｓ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２代理ウイルス中和試験（Surrogate Virus Neutralization Test、ｓＶＮＴ）キット（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、中和抗体の存在を検出した。分析は、全ての構築物が、時間とともにいくらかの中和能力を失うが、エンハンサータンパク質の添加が、試験動物の血清中の所望の中和抗体の存在を延長することを示した（ＣｏＶＥＧ９及びスパイク＋Ｌ）。図２７Ａは、４２日目及び７０日目のグループごとの個々の動物を示す。図２７Ｂは、同じデータの各処置グループにおける中和抗体レベルの中央値を示す。
エンハンサータンパク質を有する（ＷＮＶ＋Ｌ、左）又はエンハンサータンパク質を有さない（ＷＮＶ、右）ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）構築物のいずれかを過剰発現する細胞からの免疫蛍光画像を示す。他の実施例で観察されるように、タンパク質の総量は、ＷＮＶ（右）と比較して、免疫染色において使用される二次抗体のより弱いＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆｌｕｏｒシグナルによって示されるように、エンハンサータンパク質が添加された場合に減少した（ＷＮＶ＋Ｌ、左）。しかしながら、エンハンサータンパク質の非存在は、発現されたタンパク質の凝集又はミスフォールディング（右、矢印）と一致する核フォーカスの形成をもたらし、これは、エンハンサータンパク質を有する構築物（ＷＮＶ＋Ｌ）と比較して発現されたタンパク質の質が低いことを示す。
本開示は、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２である。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４である。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（Human Papilloma virus、ＨＰＶ）、ウエストナイルウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、コロナウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ベータコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（severe acute respiratory syndrome、ＳＡＲＳ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、中東呼吸器症候群（Middle East respiratory syndrome、ＭＥＲＳ）ウイルスである。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号１３である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｍタンパク質は、配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、Ｍタンパク質は、配列番号３３である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｅタンパク質は、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、Ｅタンパク質は、配列番号２２である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｎタンパク質は、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、Ｎタンパク質は、配列番号２０である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウエストナイルウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、前駆体膜タンパク質（ｐｒｅＭ）、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、又はそれらの組み合わせである。
本開示は、ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供し、ポリヌクレオチドは、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０の核酸配列を含む。
本開示は、ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供し、ポリヌクレオチドは、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１の核酸配列を含む。
本開示は、配列番号３５～４９、５５、及び６２からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ネイキッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、線状ＤＮＡを含む。ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などを含み、いくつかの場合において自律的に複製するか、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクターはまた、自律的に複製しない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡ及びＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートされたＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートされたＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソームコンジュゲートされたＤＮＡなどであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製可能アデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、非ウイルスプラスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ、人工染色体、又はアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態は、ベクターは、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome、ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（P1-derived vector、ＰＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome、ＹＡＣ）、又は哺乳動物人工染色体（mammalian artificial chromosome、ＭＡＣ）である。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡポリヌクレオチドを含み、当該ＤＮＡポリヌクレオチドは、ウイルスパッケージングシグナルをコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、コロナウイルスに由来する。
本開示は、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つ、及び薬学的に許容され得る担体を含む、ワクチン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバンである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A、ＭＰＬ）である。
本開示は、真核細胞においてウイルス抗原を発現させる方法であって、細胞を、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞をベクターと接触させることは、エンハンサータンパク質を欠くベクターよりも、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原の発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原の発現をもたらす。いくつかの実施形態は、細胞をベクターと接触させることは、エンハンサータンパク質を欠くベクターよりも、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原を含むＶＬＰの発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原を含むＶＬＰの発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドを含み、細胞をベクターと接触させることは、ウイルスパッケージングシグナルの発現をもたらし、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドを欠く対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの形成をもたらす。
本開示は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象の投与部位の組織は、抗原及び／又は抗原を含むＶＬＰを発現する。いくつかの実施形態は、対象の投与部位の組織は、エンハンサータンパク質を欠くベクターが投与される場合よりも、（ｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより高い発現レベルで発現する、並びに／又は（ｉｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより長い期間発現する、並びに／又は（ｉｉｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより良好なタンパク質品質で発現する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドを含み、対象の投与部位の組織は、ウイルスパッケージングシグナルを発現し、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドを欠く対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化するＶＬＰは、抗原を含むがウイルスパッケージングシグナルを欠く対照ＶＬＰよりも免疫原性が高い。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象において抗体応答を誘発する。いくつかの実施形態では、抗体応答は、中和抗体応答である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞性免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象において予防的、防御的、及び／又は治療的免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、投与は、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は鼻腔内投与である。
本開示は、コロナウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであって、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２である。
いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する。
本開示は、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０の核酸配列を含む。本開示は、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ネイキッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、発現カセットは、発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
本開示は、ベクターを含むキットであって、ベクターは、コロナウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含み、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、キットを提供する。
本開示は、発現カセットを含むベクターを提供し、当該発現カセットは、標的遺伝子に連結されたプロモーターを含み、ベクターは、ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素は、ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素は、コロナウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する。
本開示は、真核細胞において標的タンパク質を発現させる方法であって、細胞を、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞をベクターと接触させることは、標的タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞をベクターと接触させることは、発現カセットを含むがウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列を欠く対照ベクターと比較して、標的タンパク質を含む多数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する。
本開示は、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第３のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
本開示はまた、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドであってタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
本開示はまた、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、変異したＳタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
本開示は、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングシグナルをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターを提供する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス構造タンパク質から構成される。ＶＬＰは、免疫原性であるが、それらは、非感染性である。したがって、ＶＬＰは、ワクチンの開発における使用のための莫大な可能性を有する。ＶＬＰをインビトロで産生し、次いで免疫化を必要とする対象に投与し得る。あるいは、ＶＬＰは、対象においてインビボで産生され得る。
ＶＬＰの産生は、主に、２つ以上のプラスミドからの２つ以上の構造タンパク質の発現を必要とすることが多いため、困難である。いくつかの場合において、異なる構造タンパク質を保有するいくつかのプラスミドは、ＶＬＰの形成を支持するために、規定された比で宿主細胞に導入される必要があり得る。このプロセスは、信頼できない可能性があり、必要とされる品質の十分なレベルのＶＬＰを産生することができないことが多い。ＶＬＰの形成に必要とされる複数の構造タンパク質を、単一のプラスミド又は単一のＲＮＡ転写物から発現させることができれば、ＶＬＰを作製するプロセスが大幅に簡略化され、したがって、ＶＬＰを含むワクチンの開発のために非常に必要性の高い後押しをもたらす。
本明細書に開示される組成物及び方法は、インビボで高レベルのＶＬＰの信頼できる形成を可能にし、したがって、ＶＬＰ上のウイルス抗原に対する免疫応答の強固な誘導を可能にする。更に、これらの組成物及び方法を使用して、異なるウイルス、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、及びウエストナイルウイルスに対する免疫応答を誘導し得る。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「抗原」への言及は、１つ以上の抗原を指すことができ、「方法」への言及は、当業者などに公知の同等の複数のステップ及び／又は複数の方法への言及を含む。
本明細書中で使用される場合、数値に先行する用語「約」又は「およそ」は、１０％の範囲でプラスマイナスされた値を示す。例えば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。
本明細書で使用される場合、他に示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’方向に列挙され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に列挙される。
用語は「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状又は分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションである。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシン及びＤ光学異性体又はＬ光学異性体の両方、並びにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣物を含む、天然アミノ酸及び／若しくは非天然アミノ酸又は合成アミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト及び他の動物を含む。典型的には、対象は、ヒトである。例えば、対象は、成人、１３～１９歳の若者（ティーンエイジャー）、小児（２歳～１４歳）、乳児（１ヶ月～２４ヶ月）、又は新生児（最大１ヶ月）であってもよい。いくつかの実施形態では、成人は、約６５歳以上、又は約６０歳以上の高齢者である。いくつかの実施形態では、対象は、妊婦又は妊娠しようとしている女性である。他の実施形態では、対象は、ヒトではなく、例えば、非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、又はマカクである。ある特定の実施形態では、対象は、ペット、例えば、イヌ又はネコであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「免疫原」、「抗原」、及び「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる物質、例えば、糖タンパク質を含むタンパク質、及びペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、対象における「免疫原性応答」は、抗原に対する体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の対象における発生をもたらす。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、成果を達成するのに、例えば、有益な結果又は所望の結果に影響を及ぼすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与様式などのうちの１つ以上に依存して変化し得、これは、当業者によって容易に決定され得る。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、それが他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、及びそれが運ばれる物理的送達系のうちの１つ以上に依存して変化し得る。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの属性においてウイルスに似ているが、感染性であることが示されていない構造を指す。本開示によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有しない。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムを欠いており、したがって非感染性である。更に、ウイルス様粒子は、異種発現によって大量に産生され得ることが多く、容易に精製されることができる。
本明細書で使用される場合、アミノ酸置換（amino acid replacement）と同義で呼ばれる、タンパク質配列上の特定の位置でのアミノ酸置換（amino acid substitution）は、本明細書で、以下の様式：「ＷＴアミノ酸残基の１文字コード－アミノ酸位置－このＷＴ残基を置換するアミノ酸残基の１文字コード」で示される。例えば、Ｒ６８２Ｇ変異体であるスパイク（Ｓ）タンパク質は、６８２番目のアミノ酸位置の野生型残基（Ｒすなわちアルギニン）が、Ｇすなわちグリシンで置換されているＳタンパク質を指す。
ベクター
本開示は、抗原をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む、ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ワクチンとして、又はワクチン組成物の一部として使用される。
用語「ベクター」は、それによって核酸が生物間、細胞間、又は細胞成分間で伝播及び／又は輸送され得る手段を指す。本開示による使用のためのベクターは、当技術分野で公知の任意のベクターを含み得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などを含み、自律的に複製するか、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクターはまた、自律的に複製しない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡ及びＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートされたＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートされたＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソームコンジュゲートされたＤＮＡなどであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製可能アデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、非ウイルスプラスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ、人工染色体、又はアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態は、ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、バクテリオファージＰ１由来ベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、又は哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ネイキッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ベクターは、抗原をコードする第１のポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、図１Ａ又は図１Ｂに示されるような設計を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ２である。
表１に、ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の重要な領域の核酸配列、及びこれらの領域がコードするアミノ酸配列を示す。
Figure 2024511356000002
Figure 2024511356000003
Figure 2024511356000004
Figure 2024511356000005
Figure 2024511356000006
Figure 2024511356000007
Figure 2024511356000008
Figure 2024511356000009
Figure 2024511356000010
Figure 2024511356000011
Figure 2024511356000012
Figure 2024511356000013
Figure 2024511356000014
 ｉ）発現カセット
本明細書に開示されるベクターは、１つ以上の発現カセットを含み得る。語句「発現カセット」は、本明細書で使用される場合、その核酸分子によってコードされる別の核酸又はタンパク質の産生に必要な最小要素を含む核酸分子の定義されたセグメントを指す。いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、発現カセットを含んでもよく、発現カセットは、抗原をコードする第１のポリヌクレオチド、及びエンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター、及び第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、分離要素（例えば、リボソームスキッピング部位又は２Ａ要素）をコードするポリヌクレオチドによって連結された、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、共有プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、コードポリヌクレオチドを含み、コードポリヌクレオチドは、分離要素（例えば、リボソームスキッピング部位又は２Ａ要素）によって連結された、エンハンサータンパク質及び抗原をコードし、コードポリヌクレオチドは、共有プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、分離要素（例えば、リボソームスキッピング部位又は２Ａ要素）によって連結された、抗原及びエンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており、メッセンジャーＲＮＡの翻訳は、別個のポリペプチドとしての抗原及びエンハンサータンパク質（例えば、Ｌタンパク質）の発現を生じる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現カセットは、１つ以上のタンパク質分解切断部位、例えば、１、２、３、４、又は５つのタンパク質分解切断部位を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質分解切断部位は、第１の抗原をコードするポリヌクレオチドと、第２の抗原をコードする別のポリヌクレオチドとの間に位置している。いくつかの実施形態では、タンパク質分解切断部位は、抗原をコードするポリヌクレオチドと、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に位置している。いくつかの実施形態では、タンパク質分解切断部位は、配列番号５０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質分解切断部位は、フューリン切断部位である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される発現カセットは、ウイルスアクセサリータンパク質、例えばＯＲＦ３ａタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ３タンパク質は、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ３タンパク質は、配列番号５３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ３－１７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３５～４９からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は約１００％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３５～４９からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。
ＣｏＶＥＧ３－１７の発現カセットの核酸配列及びその中の遺伝要素を表２に列挙する。
Figure 2024511356000015
Figure 2024511356000016
Figure 2024511356000017
Figure 2024511356000018
Figure 2024511356000019
Figure 2024511356000020
Figure 2024511356000021
Figure 2024511356000022
Figure 2024511356000023
Figure 2024511356000024
Figure 2024511356000025
Figure 2024511356000026
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いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２スパイクタンパク質をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２膜タンパク質をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２エンベロープタンパク質をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ＥＭＣＶ Ｌタンパク質をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＣｏＶＥＧ１～１７のいずれか１つに由来するポリヌクレオチドを含む。
ｉｉ）ポリヌクレオチド
本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然源から単離され、技術、例えばＰＣＲ増幅又は化学合成を使用してインビトロで調製されるか、例えば、組換えＤＮＡ技術を介してインビボで調製されるか、又は任意の適切な方法によって調製若しくは取得される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意の形状（線状、環状など）又はトポロジー（一本鎖、二本鎖、線状、環状、スーパーコイル状、ねじれ状、ニック状など）である。ポリヌクレオチドはまた、核酸誘導体、例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acids、ＰＮＡＳ）及びポリペプチド－核酸複合体、少なくとも１つの化学的に修飾された糖残基、骨格、ヌクレオチド間結合、塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はヌクレオチド類似体若しくは誘導体を有する核酸、並びに化学修飾された５’又は３’末端を有する核酸、及び２つ以上のそのような修飾を有する核酸を含み得る。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。
ポリヌクレオチドは、タンパク質のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を産生するために、転写及び翻訳され得る（例えば、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質）か、又は翻訳され得る（ＲＮＡ→タンパク質）核酸配列を含む場合、当該タンパク質を「コードする」と言われる。インビボ（例えば、真核細胞内）転写及び／又は翻訳は、内因性酵素又は外因性酵素によって実施される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの転写は、真核細胞の内因性ポリメラーゼＩＩ（polymerase II、ｐｏｌＩＩ）によって実施される。いくつかの実施形態では、外因性ＲＮＡポリメラーゼは、同じ又は異なるベクター上に提供される。いくつかの実施形態では、ウイルスポリメラーゼは、代替的に又は追加的に使用され得る。いくつかの実施形態では、ベクタープロモーターは、１つ以上のウイルスポリメラーゼと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈ８ ＲＮＡポリメラーゼ、ＥＭＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ ＲＮＡポリメラーゼ、インフルエンザＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＣＭＶ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ１ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ０１ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ２ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ１５ ＲＮＡポリメラーゼなどから選択される。ウイルスポリメラーゼは、ＲＮＡプライミング又はキャッピングポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、ウイルスポリメラーゼと併せて使用される。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、１つ以上の抗原、及び／又は１つ以上のエンハンサータンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つの抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つのエンハンサータンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の抗原、２つ以上のエンハンサータンパク質、及び／又は１つ以上の分離要素をコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗原性ではないポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、抗原性ではないポリペプチドは、ＶＬＰの一部を形成し得る。したがって、本開示は、１つ以上の抗原をコードするポリヌクレオチド、及び／又は１つ以上の非抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／又は１つ以上のエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原及び１つ以上の非抗原性ポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原は、第１のウイルスの１つ以上のタンパク質に由来してもよく、１つ以上の非抗原性ポリペプチドは、第２のウイルスの１つ以上のタンパク質に由来してもよい。
ｉｉｉ）分離要素
いくつかの実施形態では、本開示による抗原及びエンハンサータンパク質は、同じベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、本開示による抗原及びエンハンサータンパク質は、別々のベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原及び１つ以上のエンハンサータンパク質をコードする核酸配列が同じベクター中に存在する場合、ベクターは、タンパク質の別々の発現のための分離要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、バイシストロニックベクター又はポリシストロニックベクターである。分離要素は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａ要素であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、２Ａ要素をコードする核酸、又はＩＲＥＳをコードする核酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド若しくは第２のポリヌクレオチド、又はその両方は、２Ａ要素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又は抗原をコードするポリヌクレオチドは、２Ａ要素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。２Ａ要素の非限定的な例としては、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、及びＴ２Ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む））を有する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１７である。
いくつかの実施形態では、２Ａペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１８又は６９に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む））を有する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１８又は６９である。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド若しくは第２のポリヌクレオチド、又はその両方は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又は抗原をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４又は６７の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２４又は６７の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、抗原及びエンハンサータンパク質は、単一の融合タンパク質に含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、連結要素を含み得る。いくつかの実施形態では、連結要素は、シス又はトランスでの酵素的切断のための切断部位（例えば、フューリン、カテプシン、又はインテイン切断部位）を含み得る。他の実施形態では、融合タンパク質又は連結要素は、切断部位を含まず、発現された融合タンパク質は、標的タンパク質及びエンハンサータンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態では、連結要素は、２Ａ要素である。
ｉｖ）プロモーター
本開示によるベクターは、１つ以上のプロモーターを含み得る。用語「プロモーター」は、転写を開始するための、ＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する、転写開始点の上流又は下流に位置する領域又は配列を指す。本開示によるポリヌクレオチド又はベクターは、１つ以上のプロモーターを含み得る。プロモーターは、当該分野で公知の任意のプロモーターであり得る。プロモーターは、順方向プロモーター又は逆方向プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物プロモーターである。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロモーターは、天然プロモーターである。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロモーターは、非天然プロモーターである。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロモーターは、非哺乳動物プロモーターである。開示される組成物及び方法における使用のためのＲＮＡプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ１、ヒト伸長因子－１アルファ（elongation factor-1 alpha、ＥＦ－１アルファ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトユビキチン、脾臓フォーカス形成ウイルス（spleen focus-forming virus、ＳＦＦＶ）、Ｕ６、Ｈ１、ｔＲＮＡＬｙｓ、ｔＲＮＡＳｅｒ、及びｔＲＮＡＡｒｇ、ＣＡＧ、ＰＧＫ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、ＵｂＣ、ＳＶ４０、Ｔ７、Ｓｐ６、ｌａｃ、ａｒａＢａｄ、ｔｒｐ、並びにＰｔａｃプロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」は、物理的位置ではなく作動能力によって連結されている核酸配列中の要素又は構造を指す。要素又は構造は、所望の作動を達成することが可能であるか、又は達成することによって特徴付けられる。核酸配列中の要素又は構造が、作動可能に連結されるためにタンデム又は隣接した順序である必要はないことが、当業者によって認識される。
いくつかの実施形態では、本開示によるベクターによって含まれるプロモーターは、誘導性プロモーターである。
いくつかの実施形態では、本開示によるベクターは、ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ウイルスポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、例えば、ベクターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる、抗原をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドのいずれか又は両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含み得る。
抗原
いくつかの実施形態では、抗原の発現又は質は、例えば、１つ以上のエンハンサータンパク質と併せて、開示される方法による発現によって著しく改善される。いくつかの実施形態では、抗原は、単一タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、複数のタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、１つ以上のタンパク質からのアミノ酸配列を含むキメラ抗原である。
いくつかの実施形態では、抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス抗原は、限定されないが、任意のウイルスタンパク質に由来するアミノ酸配列の全体又は一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、ウイルスの１つの構造タンパク質又は複数の構造タンパク質の全体又は一部である。いくつかの実施形態では、抗原（単数又は複数）は、ＶＬＰに集合し、発現細胞から放出される。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、限定されないが、任意のコロナウイルスタンパク質の全体又は抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ベータコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス、ＯＣ４３、又はＨＫＵ１である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
いくつかの実施形態、ウイルス抗原は、以下のタンパク質：コロナウイルススパイクタンパク質、コロナウイルスＭタンパク質、コロナウイルスＮタンパク質、及びコロナウイルスＥタンパク質のうちのいずれか１つ以上の全体又は抗原断片を含む。
いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）スパイクタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｍタンパク質、ＭＥＲＳ Ｍタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｍタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｎタンパク質、ＭＥＲＳ Ｎタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＥタンパク質は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｅタンパク質、ＭＥＲＳ Ｅタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｅタンパク質から選択される。
いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４又は７０の核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４又は７０の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３である。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質は、配列番号１３と比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含む変異体Ｓタンパク質（「Ｓ（Ｍｕｔ）」とも表される）である。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、野生型Ｓタンパク質と比較して、より高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、融合前立体構造安定化スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｓタンパク質における変異は、Ｓタンパク質の三量体状態を安定化する。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の内部内因性タンパク質分解切断部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の内部内因性タンパク質分解切断部位の欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｓタンパク質のタンパク質分解切断部位における１つ以上の変異は、集合プロセスの間のＳタンパク質の切断を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異体Ｓタンパク質のうちのいずれか１つ以上を含むＶＬＰは、野生型Ｓタンパク質、例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＳタンパク質を含むＶＬＰよりも免疫原性が高い。
いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、配列番号１３におけるＲ６８２、Ｒ６８３、Ａ６８４、Ｒ６８５、Ｋ９８６、及びＶ９８７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾（例えば、置換）を含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、配列番号１３におけるＲ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓ、Ｋ９８６Ｐ、及びＶ９８７Ｐからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異Ｓタンパク質は、配列番号１３におけるアミノ酸置換Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓ、Ｋ９８６Ｐ、及びＶ９８７Ｐを含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、内部内因性フューリン切断部位に、以下のアミノ酸置換：Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓを含む。すなわち、いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、内部内因性フューリン切断部位に、以下のアミノ酸：アミノ酸残基６８２にＧ、アミノ酸残基６８３にＳ、アミノ酸残基６８４にＡ、及びアミノ酸残基６８５にＳを含む。
いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５１である。
いくつかの実施形態では、変異体Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２の核酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９又は６６の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９又は６６の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１又は７１の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１又は７１の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２０である。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３又は７２の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３又は７２の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（これらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２である。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ボルティモア分類による、ウイルスのグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩのうちのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、エンベロープを有する、マイナス鎖、一本鎖、セグメント化ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、エンベロープＤＮＡウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、非エンベロープＤＮＡウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、プラス鎖エンベロープＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２、及びフラビウイルス、例えば、ウエストナイルウイルス）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、チクングニアウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、及びＥ型肝炎）、単純疱疹ウイルス１型（herpes simplex virus type 1、ＨＳＶ－１）、単純疱疹ウイルス２型（herpes simplex virus type 2、ＨＳＶ－２）、ウエストナイルウイルス、及びヒトパピローマウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ウエストナイルウイルスに由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルスタンパク質は、前駆体膜（ｐｒＭ）、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つ以上のウエストナイルウイルスタンパク質、例えば、ｐｒＭ、及び／又はＥタンパク質をコードするベクターは、図１４Ａに示されるようなウエストナイルウイルス最小プラスミド（ＷＮＶ最小プラスミド）又は図１４Ｂに示されるようなウエストナイルウイルス標準プラスミド（ＷＮＶ標準プラスミド）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のウエストナイルウイルスタンパク質、例えば、ｐｒＭ及び／又はＥタンパク質をコードするベクターは、配列番号５５に対して少なくとも７０％（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％）の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のウエストナイルウイルスタンパク質、例えば、ｐｒＭ及び／又はＥタンパク質をコードするベクターは、配列番号６４に対して少なくとも７０％（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％）の同一性を有する核酸配列を有する発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルスＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６０の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルスＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６０の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルスｐｒＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９の核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％（それらの間にある任意の値及び部分範囲を含む）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルスｐｒＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９の核酸配列を有する。
本明細書に開示されるウエストナイルウイルス抗原をコードするベクターの核酸配列、及びその中の遺伝要素を表３に列挙する。
Figure 2024511356000062
Figure 2024511356000063
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Figure 2024511356000065
Figure 2024511356000066
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスに由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含む。インフルエンザウイルスの株は、限定されず、現在公知であるか又は後に発見される任意の株、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はインフルエンザＢ株であり得る。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスタンパク質は、ＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、Ｍ１タンパク質、Ｍ２タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質は、ｓＡｇ（Ｓタンパク質）、ｓＡｇ（Ｍタンパク質）、ｓＡｇ（Ｌタンパク質）、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、ｃＡｇ（コア抗原）、又はそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ヒトパピローマウイルスに由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、ヒトパピローマウイルスタンパク質は、ＨＰＶ６のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１１のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１８のＬ１タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、以下の表４に列挙されるウイルスの各々に由来するタンパク質のうちのいずれか１つ以上の全体又は抗原断片を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ３）に由来する任意のタンパク質の全体又は抗原断片を含み得る。
Figure 2024511356000067
 エンハンサータンパク質
いかなる理論にも束縛されるものではないが、エンハンサータンパク質の抗原との共発現は、収量、品質、フォールディング、翻訳後修飾、活性、局在化、及び下流活性を含むがこれらに限定されない抗原発現の１つ以上の態様を改善し得るか、又はミスフォールディング、改変された活性、不正確な翻訳後修飾、及び／若しくは毒性のうちの１つ以上を低減し得ると考えられる。
いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、核孔をブロッキングすることができ、それによって核細胞質輸送（nucleocytoplasmic transport、「ＮＣＴ」）を阻害する。本明細書で使用される場合、用語「機能的バリアント」は、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質と相同であり、かつ／又はピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質と実質的な配列類似性（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える配列同一性）を共有するタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質の１つ以上の機能的特徴を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質の機能的バリアントは、ＮＣＴを阻害する能力を保持する。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、カルジオウイルス属、ヘパトウイルス属、又はアフトウイルス属由来のＬタンパクである。例えば、エンハンサータンパク質は、ウシ鼻炎Ａウイルス、ウシ鼻炎Ｂウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、口蹄疫ウイルス、ヘパトウイルスＡ、ヘパトウイルスＢ、ヒマラヤマーモットヘパトウイルス、Ｐｈｏｐｉｖｉｒｕｓ、脳心筋炎ウイルス、カルジオウイルスＢ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（Theiler’s Murine encephalomyelitis virus、ＴＭＥＶ）、Ｖｉｌｙｕｉｓｋヒト脳脊髄炎ウイルス（Vilyuisk human encephalomyelitis virus、ＶＨＥＶ）、タイラー様ラットウイルス（Theiler-like rat virus、ＴＲＶ）、又はＳａｆｆｏｌｄウイルス（Saffold virus、ＳＡＦ－Ｖ）由来であり得る。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、タイラーウイルスのＬタンパク質又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号１を含み得るか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号に対してと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有し得る。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、脳心筋炎ウイルス（Encephalomyocarditis virus、ＥＭＣＶ）のＬタンパク又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を共有し得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号２を含み得るか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号２に対してと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有し得る。
いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６８を含み得るか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質をコードする核酸配列は、配列番号６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有し得る。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質、及びＳａｆｆｏｌｄウイルス２のＬタンパク質、又はそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質は、表５に列挙されるタンパク質又はその機能的バリアントから選択される。ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表２に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードし得る。ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質のアミノ酸配列は、表２に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、又は１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、表２に列挙されるアミノ酸配列のうちの１つを含み得るか、又はそれからなるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、若しくは１２のアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなるアミノ酸配列を有し得る。
Figure 2024511356000068
抗原、エンハンサータンパク質、及び／若しくは融合タンパク質、又はそれらをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のマーカー、標識、又はタグを含むように修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質は、その検出を可能にする任意の標識、例えば、放射性標識、蛍光剤、ビオチン、ペプチドタグ、酵素断片などで標識され得る。タンパク質は、親和性タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンタグ、免疫グロブリン結合ドメイン、例えば、ＩｇＧ結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチドなどを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、選択マーカー、例えば抗生物質耐性マーカーを含む。
ウイルスパッケージングシグナル
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターは、ウイルスパッケージングシグナル（本明細書では互換的に「ウイルスパッケージング配列」又はパッケージングシグナル」又は「ｐｓｉ配列」と称される）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド配列の２つ以上のコピー、例えば、ポリヌクレオチド配列の２、３、４、又は５つのコピーを含む。
ウイルスパッケージングシグナルは、任意のウイルスに由来し得る。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、ベクターから発現される抗原と同じウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、ベクターから発現される抗原とは異なるウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、チクングニアウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、及びＥ型肝炎）、単純疱疹ウイルス１型（herpes simplex virus type 1、ＨＳＶ－１）、単純疱疹ウイルス２型（herpes simplex virus type 2、ＨＳＶ－２）、ウエストナイルウイルス、及びヒトパピローマウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージング要素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３４のポリヌクレオチドに対して少なくとも約７０％（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は約１００％）の同一性（その間にある全ての値及び部分範囲を含む）を有する。
ベクター上のウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドの位置は限定されない。いくつかの実施形態では、ベクター上のウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドの位置は、ウイルス抗原をコードする全ての核酸配列に対して５’であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター上のウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドの位置は、ウイルス抗原をコードする全ての核酸配列に対して３’であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター上のウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドの一方のコピーの位置は、ウイルス抗原をコードする全ての核酸配列に対して５’であり、ウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドの他方のコピーの位置は、ウイルス抗原をコードする全ての核酸配列に対して３’である。更に、ウイルスパッケージングシグナルのサイズは限定されず、約５０ｂｐｓ～約３ｋｂの範囲、例えば、約１００ｂｐｓ、約２００ｂｐｓ、約３００ｂｐｓ、約４００ｂｐｓ、約５００ｂｐｓ、約５５０ｂｐｓ、約６００ｂｐｓ、約６５０ｂｐｓ、約７００ｂｐｓ、約８００ｂｐｓ、約９００ｂｐｓ、約１ｋｂ、約２ｋｂ、又は約３ｋｂであってもよく、それらの間にある全ての値及び部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルのサイズは、約６００～約７００ｂｐｓ、例えば、約６５０ｂｐｓである。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルのサイズは、約６６１ｂｐｓである。
本開示は、発現カセットであって、標的遺伝子に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含む、ベクターを更に提供し、ベクターは、本明細書に開示されるウイルスパッケージング要素のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む。
発現カセット中の遺伝要素の順序
本明細書に開示されるベクターにおいて、１つ以上のウイルス抗原をコードするポリヌクレオチド配列、及びエンハンサーをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又は１つ以上の調節要素（例えば、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチド、ＣＭＶタンパク質、ウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド、及びタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド）は、任意の可能な組み合わせで順序付けられ得る。例えば、発現カセットにおける要素の順序は、図６のプラスミドＣｏＶＥＧ３～１７のうちのいずれか１つについて示される通りであり得る。理論に束縛されるものではないが、発現カセットにおける要素の順序は、ベクターによってコードされる抗原の発現及び／又はＶＬＰの形成に関連し得ると考えられる。更に、発現カセットが、以下の５’から３’の順序で、Ｍ、Ｎ、Ｓ、及びＥの遺伝子を含む場合、より高いタンパク質発現及びより安定なＶＬＰ形成をもたらし得ると考えられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ３と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、第２のポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、第２のポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ４と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ５と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ６と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ７と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ８と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ９と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１０と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングをコードするポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１１と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１２と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１３と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングシグナルをコードする第１のポリヌクレオチドであって、（ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１４と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ３ａをコードするポリヌクレオチドであって、ＯＲＦ３ａが、配列番号５３又はそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１５と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、（ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１６と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ３ａをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号５３又はそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、及びウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣｏＶＥＧ１７と同じ５’から３’の順序で要素を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングシグナルをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳをコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ３ａをコードするポリヌクレオチドであって、ＯＲＦ３ａが、配列番号５３を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドシグナルを含む、第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む。
細胞における抗原及びＶＬＰの発現
本開示は、真核細胞において抗原を発現させる方法であって、細胞を、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞と接触させられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、対象において細胞（インビボで）と接触させられる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原の発現は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、免疫原性である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、対象において免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、エンベロープを有する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、エンベロープを有さない。ＶＬＰ中に存在する抗原の数は、限定されない。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１つの抗原、２つの抗原、３つの抗原、４つの抗原、５つの抗原、６つの抗原、７つの抗原、８つの抗原、９つの抗原、１０の抗原、又はより多い数の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、３つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、４つの抗原を含む。いくつかの実施形態は、ＶＬＰを形成する構造タンパク質、及びＶＬＰの一部である免疫原性ウイルス抗原は、同じウイルス（すなわち、天然ＶＬＰ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰを形成する構造ウイルスタンパク質は、１つのウイルスに由来し、当該ＶＬＰに組み込まれる免疫原性ウイルス抗原は、別のウイルス（すなわち、キメラＶＬＰ）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＶＬＰ集合、ＶＬＰ分泌及び／又は当該ＶＬＰへの免疫原性抗原（単数又は複数）の負荷を増強するように変異される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞をベクターと接触させることが、ウイルスパッケージングシグナルの発現をもたらすように、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルの発現は、ＶＬＰの形成を増加又は促進する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルの非存在下と比較して、ウイルスパッケージングシグナルの存在下でより多くのＶＬＰが形成される。いくつかの実施形態では、細胞を、ウイルスパッケージングシグナルをコードする開示されるベクターのいずれか１つと接触させることは、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを欠く対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞を、ウイルスパッケージングシグナルをコードする開示されるベクターのいずれか１つと接触させることは、ＶＬＰ内のウイルスパッケージングシグナルのパッケージングをもたらし、これは次に、改善されたアジュバント化特性又は他の機構に起因して増強された免疫応答をもたらす。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナル及びタンパク質は、ＶＬＰが形成される同じウイルスに由来する（すなわち、ネイティブパッケージング）。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナル及びタンパク質は、公知のパッケージング機構（すなわち、キメラパッケージング）を有する別のウイルスに由来する。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、第１の抗原、第２の抗原、第３の抗原、第４の抗原、又はそれらの組み合わせをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、第１の抗原、第２の抗原、及び第３の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、第１の抗原、第２の抗原、第３の抗原、及び第４の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質であり、第２の抗原は、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質であり、第３の抗原は、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質である。第１の抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質であり、第２の抗原は、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質であり、第３の抗原は、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質であり、第４の抗原は、コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、いくつかの実施形態では。
いくつかの実施形態では、ベクターは、エンハンサータンパク質を欠くベクターと比較して、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原の発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、ベクターは、エンハンサータンパク質を欠くベクターよりも、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原を含むＶＬＰの発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原を含むＶＬＰの発現を引き起こす。本明細書中で使用される場合、「タンパク質品質」とは、タンパク質フォールディング、翻訳後修飾、機能的活性、局在化、及び下流活性を指すが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法又はベクター又は組成物のいずれかを使用して、エンハンサータンパク質と共発現される抗原は、エンハンサータンパク質と共発現されない抗原と比較して、改善されたタンパク質フォールディング、改善された翻訳後修飾、改善された機能的活性、改善された局在化、及び改善された下流活性を有し得る。
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション」、「形質導入」、及び「形質転換」は、核酸を細胞（例えば、真核細胞）に導入するプロセスを指す。本明細書に開示されるベクターは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して細胞（例えば、真核細胞）に導入され得る。例えば、ベクターは、化学的、物理的、生物学的、又はウイルス的手段を使用して、細胞に導入することができる。ベクターを細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム、デンドリマー、カチオン性ポリマー、リポフェクション、ｆｕｇｅｎｅ、細胞透過性ペプチド、ペプチドデンドリマー、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、微粒子銃、ヌクレオフェクション、ウイルス形質導入、注入、形質転換、トランスフェクション、直接取り込み、発射体衝撃、及びリポソームの使用が挙げられるが、これらに限定されない。方法の他の非限定的な例としては、カチオン性ポリマー、脂質、脂質製剤、及びジェット遺伝子デバイスを使用するか又は使用せずに、ウイルストランスフェクション、直接取り込み、発射体衝撃、エレクトロポレーション／ソノポレーションを伴うか又は伴わない直接注入が挙げられる。抗原及びエンハンサータンパク質は、発現ベクターを使用して細胞内で安定に又は一過性に発現させることができる。真核細胞における発現技術は、当業者に周知である。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｈａｐｔｅｒ １２「Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」 ＆ Ｃｈａｐｔｅｒ １３「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ベクターは、安定な細胞株を産生するための標準的な方法を使用して、任意選択的に、レンチウイルストランスフェクション、哺乳動物細胞へのバキュロウイルス遺伝子導入（baculovirus gene transfer into mammalian cell、ＢａｃＭａｍ）、レトロウイルストランスフェクション、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、及び／又はトランスポゾンの使用を通じて、ゲノムへの挿入によって宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又はベクターは、一過性トランスフェクションのために宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、一過性トランスフェクションは、ウイルスベクター、ヘルパー脂質、例えば、ＰＥＩ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、及び／又はＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３の使用を通じて行われ得る。遺伝要素は、例えばベクター上のＤＮＡとして、又は例えばＰＣＲからのＲＮＡとしてコードされることができる。遺伝要素は、異なるベクターに分離されてもよく、又は同じベクター上で組み合わされてもよい。
抗原及びエンハンサータンパク質を発現するために使用される宿主細胞は、限定されず、原核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核生物宿主（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞株及び初代細胞、例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ細胞）を含み得る。このような細胞は、広範な供給源（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）から入手可能である。昆虫細胞の非限定的な例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓ１）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、例えばＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣ．ｇｌａｂｒａｔａを含むＣａｎｄｉｄａ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ、ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ及びＨｅｐ－２細胞である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、又は両生類起源の他の細胞も使用し得る。原核宿主細胞には、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びマイコバクテリアが含まれる。
ワクチン組成物
本開示は、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つ、並びに少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はビヒクル、例えば、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含むワクチン組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁によって承認されているか、又はＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ若しくは他の一般的に認識されている薬局方に、哺乳動物、より詳細にはヒトにおける使用について列挙されていることを意味する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はビヒクルは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性緩衝液、及びそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又はビヒクルは、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ポリオール、（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、又はそれらの適切な混合物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、少量の乳化剤若しくは湿潤剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、固体形態、例えば、再構成に適した凍結乾燥粉末、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、又は粉末である。いくつかの実施形態では、送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、ナノ粒子、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞、ポリマー、ペプチドなどは、本明細書に開示されるベクター及びワクチン組成物の適切な宿主細胞への導入のために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクター及びワクチン組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、他の従来の医薬成分、例えば、防腐剤、又は化学安定剤、例えば、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、又はアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、若しくはチメロサール、等張剤、例えば、糖若しくは塩化ナトリウム、並びに／又は吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含む。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントを含む。本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は、免疫原と組み合わせて使用された場合に、免疫原に対して誘導される免疫応答を増強するか、又はそうでなければ改変若しくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾は、抗体及び細胞性免疫応答のいずれか又は両方の特異性の強化又は拡大を含み得る。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ミョウバンである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）である。いくつかの実施形態では、他のアジュバントは、加えて、又は代替として使用され得る。Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている任意のアジュバントの包含は、本開示の範囲内であると想定される。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバント、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ＭＤＰ化合物、例えば、ｔｈｕｒ－ＭＤＰ及びｎｏｒ－ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、リピドＡ、及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＦ－５９、細菌から抽出された３つの成分、ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（trehalose dimycolate、ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（cell wall skeleton、ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、少ラメラ脂質小胞、例えば、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）であり得る。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の少ラメラ非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、コレステロール、オレイン酸、及びスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、有効なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、及び同第４，９１１，９２８号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、組成物は、添加されたアジュバントを含まなくてもよい。強い免疫応答を誘導するミョウバンを含まない組成物は、約６０歳以上の成人において特に有用である。
対象において免疫応答を誘発する方法
本開示は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、対象の投与部位の組織は、抗原及び／又は抗原を含むＶＬＰを発現する。いくつかの実施形態は、対象の投与部位の組織は、エンハンサータンパク質を欠くベクターが投与される場合と比較して、（ｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより高い発現レベルで発現する、並びに／又は（ｉｉ）抗原及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより長い期間発現する、並びに／又は（ｉｉｉ）抗原及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより良好なタンパク質品質で発現する。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象において抗体応答を誘発する。いくつかの実施形態では、抗体応答は、中和抗体応答である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞性免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象において予防的、防御的、及び／又は治療的免疫応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、対象の投与部位の組織がウイルスパッケージングシグナルを発現するように、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルを含むポリヌクレオチドをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ウイルスパッケージングシグナルからなるポリヌクレオチドをカプシド化する。いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化するＶＬＰは、抗原を含むがウイルスパッケージングシグナルを欠く対照ＶＬＰよりも免疫原性が高い。理論に束縛されるものではないが、ウイルスパッケージングシグナルの非存在下と比較して、ウイルスパッケージングシグナルの存在下ではより多くのＶＬＰが形成され得ると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、ウイルスパッケージングシグナルをコードする開示されたベクターは、ウイルスパッケージングシグナルをコードしない対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの形成を促進する。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡウイルスパッケージングシグナルは、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like Receptor、ＴＬＲ）のアゴニストとして作用することによってアジュバントとして作用し得るとも考えられる。
本明細書に開示される組成物又はベクターのいずれか１つを投与する方法としては、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻腔内及び経口若しくは肺経路又は坐剤による）、皮下、及び腹腔内を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、又は皮内に投与される。組成物又はベクターは、任意の好都合な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、尿道、膀胱及び腸粘膜など）を通した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、皮内投与である。いくつかの実施形態では、投与は、筋肉内投与である。いくつかの実施形態では、投与は、皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は、鼻腔内投与である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物又はベクターは、注射によって投与される。いくつかの実施形態では、注射は、針、シリンジ、マイクロニードル、又は無針注射デバイスを使用して実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物又はベクターは、上気道への液滴、大粒子エアロゾル（約１０ミクロン超）、若しくは噴霧、又は下気道への小粒子エアロゾル（１０ミクロン未満）若しくは噴霧のいずれかによって鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、注入の後にエレクトロポレーションが行われる。
本明細書に開示されるベクター又はワクチン組成物は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールで投与され得る。複数回投与は、一次免疫スケジュール又はブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量が、同じ経路又は異なる経路、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなどによって投与され得る。いくつかの態様では、以後のブースト用量は、先の用量の後、約１時間～約数年の期間内に投与される（例えば、約１２時間、約１日、約２日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約１ヶ月、約６ヶ月、約１年、約２年、これらの間にある全ての値及び部分範囲を含む）。
免疫原性効果
いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドへのエンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないポリヌクレオチドと比較して、機能的ウイルス様粒子（ＶＬＰ）産生を増加させる。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないベクターと比較して、機能的ＶＬＰ産生を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約５００％、又は約１０００％増加させる。本明細書で使用される機能的ＶＬＰ産生は、タンパク質凝集のレベル、インビボでの中和抗体の力価、誘導されたＴｈ１応答、ＶＬＰ半減期に対する経時的なＶＬＰの量、及び／又はミスフォールディングされたＶＬＰに関連する細胞死を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法によって測定され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドへのエンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、対象における中和抗体の持続時間又は量を増加させる。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、対象における中和抗体の持続時間又は量を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させる。
いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１細胞応答を増加させる。いくつかの実施形態では、エンハンサータンパク質の包含は、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１応答を約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、又は約１０００％増加させる。
キット及び製造品
本開示は、本明細書に開示されるベクターのいずれか１つ以上を含むキットを提供する。本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含むキットを更に提供する。本開示はまた、本明細書に開示されるワクチン組成物のいずれか１つ以上を含むキットを提供する。本明細書に開示されるキットは、開示される方法を実施するか、又はその実施を補助するのに有用である。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、製品又は製剤の適切な使用及び安全性情報のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、医師によって決定される適用及び投与方法に基づく投与量情報を含む。
本出願はまた、本明細書に記載されるワクチン組成物又はキットのいずれか１つを含む製造品を提供する。製造品の例としては、バイアル（例えば、密封滅菌バイアル）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示されるワクチン組成物の成分のうちの１つ以上で充填された１つ以上の容器又はバイアルを含む。いくつかの実施形態では、キットは、２つの容器を含み、一方は本明細書に開示されるベクター、又はポリヌクレオチド、又はワクチン組成物を含有し、他方はアジュバントを含有する。いくつかの実施形態では、キットは、ヒト投与のための製造、使用、又は販売についての政府機関による承認を反映する通知を更に含む。
本発明は、制限するものとして解釈されるべきではない以下の追加の実施例によって更に図示される。当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に対して多くの変更を行うことができ、それでも同様又は類似の結果を得ることができることを理解することができるであろう。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドの構築
ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２プラスミドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＬエンハンサータンパク質をコードする。
プラスミドＣｏＶＥＧ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長Ｓタンパク質（配列番号１４）、Ｍタンパク質（配列番号１９）、及びＥタンパク質（配列番号２３）のウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。プラスミドＣｏＶＥＧ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質（配列番号２１）、及びＥタンパク質のウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２プラスミドの骨格を図１に示す。更に、ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２プラスミドはまた、ＥＭＣＶ由来のＬタンパク質（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチドを含む。
ＣｏＶＥＧ２における完全なインサートの核酸配列は、配列番号３０によって表される。表１を参照されたい。この構築物の発現は、３つのポリペプチド：配列番号１３のアミノ酸配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣｏＶＥＧ２ポリペプチド１、及び配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣｏＶＥＧ２ポリペプチド２を生じる。ＣｏＶＥＧ１におけるインサートの核酸配列は、配列番号３１によって表される。この構築物の発現は、２つのポリペプチド：配列番号１３のアミノ酸配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、及び配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣｏＶＥＧ１ポリペプチドを生じる。表１を参照されたい。
プラスミド骨格（ｐＶａｘ１プラスミドの設計原理に基づく）及び両プラスミドのインサートは、遺伝子合成を用いて生成され、動物又はヒト起源材料を含まない。プラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１複製起点、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びシミアンウイルス（ＳＶ４０）ポリＡシグナルからなる。ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間にクローニングした。遺伝子合成及びプラスミド調製後、プラスミドをクローニングのためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、次いでカナマイシンを使用してスクリーニングした。代表的なコロニーを選択し、そのプラスミド配列を検証し、更なる開発のためのソースプラスミドとして使用した。転写後、ウイルスタンパク質を単一のポリシストロン性ｍＲＮＡから発現させた。
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、共発現されると、Ｓ、Ｅ、及びＭタンパク質は、ＶＬＰに集合し、発現細胞によって分泌され、Ｎタンパク質もＳ、Ｅ、及びＭタンパク質と一緒に発現されると、ＶＬＰ分泌は、著しく増加すると考えられる。
実施例２：免疫蛍光によって観察された、真核細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質の発現
ＨＥＫ ２９３（真核）細胞をｐＣｏＶＥＧ２プラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を固定し、透過処理し、検出のために市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８蛍光標識二次抗体を使用して免疫細胞化学によって分析した。図２は、ＨＥＫ ２９３細胞における、Ｓ、Ｍ、Ｎ、及びＥタンパク質の発現を示し、本明細書に開示されるｐＣｏＶＥＧ２が、細胞においてウイルス抗原を発現することを示す。
実施例３：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって観察された、真核細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質の発現
ＨＥＫ ２９３細胞をｐＣｏＶＥＧ２プラスミドでトランスフェクトし、９６時間インキュベートした。その後、細胞培養上清を採取し、濃縮した。濃縮物を、Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／３００カラムに充填したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＧＬ樹脂に、溶出液としてＰＢＳを使用して流した。分泌されたＶＬＰを含有するボイド画分を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及び／又はＳ、Ｎ、Ｍ、若しくはＥに対するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって分析して、Ｓ、Ｎ、Ｍ、及びＥタンパク質の存在を示した。図３を参照されたい。
これらのデータは、本明細書中に開示されるＤＮＡベクターＣｏＶＥＧ２が、ＨＥＫ２９３細胞において全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス構造タンパク質（Ｓ、Ｍ、Ｅ、及びＮタンパク質）を発現すること、並びに分泌されたＶＬＰ成分が、細胞培養上清において検出され得ることを示す。これらの結果は、ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２プラスミドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する非常に有効なＤＮＡワクチンとして潜在的に使用され得ることを示唆する。
実施例４：ポリヌクレオチドワクチンの免疫原性
ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の免疫原性を決定するために、これらのプラスミドを６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間間隔で皮内注射し、１日目、１５日目、及び２９日目に合計３回注射する。誘発された体液性免疫応答［それぞれの酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）を使用した抗Ｓ抗体の力価］並びに細胞性免疫応答［それぞれのＩＦＮ－γ及びＩＬ－４酵素結合免疫吸着スポット（Ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用した抗原反応性Ｔ細胞の存在］を測定する。総抗体に対する中和を測定するために、インビトロウイルス中和アッセイを実施する。このために、４３日目から単離した血清を希釈し、ＶＥＲＯ細胞に添加する前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスとともにインキュベートする。ウイルス単離は、天然ウイルスと比較して細胞の感染が成功していないことによって決定される。
抗Ｓタンパク質抗体ＥＬＩＳＡアッセイを含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体分析を、市販の材料に基づいて実施する。あるいは、社内で開発された細胞ベース及びＶＬＰベースのＥＬＩＳＡアッセイが使用される。ＥＬＩＳｐｏｔ分析のために、脾臓を収集し、Ｔ細胞を単離する。ＥＬＩＳｐｏｔ評価は、Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプールでプライミングして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性Ｔ細胞を活性化することによって実施する。更に、プラスミドの毒物動態学及び薬力学的特性を決定する。図４を参照されたい。
体重１５～２５グラムの雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）を無作為に４グループに割り当て、各グループは１０匹の動物を含む。マウスに、ビヒクル－ＰＢＳ、ＣＭＶプロモーターの制御下でエンハンサータンパク質をコードする参照品ＥＧ－ＢＢ、並びに１及び２５μｇの２用量のＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２のいずれかを皮内投与する。マウスを死亡率及び瀕死率について１日２回評価する。臨床観察及び体重を、－１週目から開始して毎週収集し、その後、研究期間中少なくとも２週間ごとに収集する。
投薬されたマウスを、投薬前の所定の時点で採血し、血清を遠心分離によって分離する。次いで、得られた血清試料を、以下の表３に示されるように、定量的ＥＬＩＳＡを使用して、全長組換えＳタンパク質（Ｓ１＋Ｓ２）に対する抗体について分析する。
Figure 2024511356000069
４３日目の時点では、得られた血清を２つのほぼ等しいアリコートに分割し、第１のアリコートは、抗ワクチン抗体（anti-vaccine antibody、ＡＶＡ）分析のために使用され、第２のアリコートは、中和抗体について試験するために保存される。アリコートをドライアイス上で、又は－８０℃を維持するように設定されたフリーザー中で直ちに凍結する。
研究の終わりに、全ての動物を安楽死させる。脾臓を、ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮ－γ及びＩＬ－４評価のために、細胞培養洗浄手順を使用して収集する。
Ｔ細胞媒介性毒性の評価のために、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して定量的評価を実施する。採取した脾臓からの脾細胞を、Ｓ、Ｍ、及びＮ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の配列をカバーするＭｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｏｏｌｓで刺激する。脾細胞を、陰性対照（培地）及び陽性対照（酢酸ミリスチン酸ホルボール／イオノマイシン）に加えて、３つの異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプールの２つの濃度で試験する。
実施例５：ヒトにおけるポリヌクレオチドワクチンの免疫原性
ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の安全、反応源性、及び免疫原性を評価するために、非盲検、多施設、用量範囲研究を、健康であり、全ての適格基準を満たす１８歳（１８歳を含む）から開始して、男性及び妊娠していない女性において行う。約４５人の対象を３つのコホート（１、２５、及び２００μｇ）のうちの１つに登録する。対象は、１日目及び２９日目にＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の皮内注射（１００μｌ）を受け、２回目のワクチン接種の１２ヶ月後（３９４日目）まで追跡される。フォローアップ来院は、各ワクチン接種の１、２、及び４週間後（８、１５、２９、３６、及び５７日目）、並びに２回目のワクチン接種の３、６、及び１２ヶ月後（１１９、２０９、及び３９４日目）に行う。
健康な成人において、皮内注射として投与される、ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の２用量ワクチン接種スケジュールの安全及び反応源性を、２８日間隔で、２回の投薬にわたって、有害事象（Adverse Event、ＡＥ）を有する参加者のパーセンテージ、投与（注射）部位反応を有する参加者のパーセンテージ、及び特に注目すべき有害事象（Adverse Events of Special Interest、ＡＥＳＩ）を有する参加者のパーセンテージに基づいて評価する。
免疫原性を評価するために、ＣｏＶＥＧ１及びＣｏＶＥＧ２の２用量ワクチン接種スケジュールに従って、１５日目、２９日目（２回目の用量の前）、及び５７日目に、以下のパラメータを評価する：
（ａ）検証されたＥＬＩＳＡ法による、Ｓ抗体に対するＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＡ ＥＬＩＳＡ、
（ｂ）免疫記憶適応症を、１５日目、２９日目、５７日目、１８０日目、２７０日目、及び／又は３９４日目のＣＤ４９ｂ＋Ｔ－ｂｅｔ＋休止記憶Ｔｈ細胞前駆細胞及びＣＸＣＲ４＋Ｓ１Ｐ１＋記憶形質細胞前駆細胞に焦点を当てたフローサイトメトリー及び検証されたＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる免疫表現型検査ＰＢＭＣによって評価する。測定値は、ベースライン（１日目～３９４日目）、抗体の幾何平均力価（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎ ｔｉｔｅｒ、ＧＭＴ）（１５日目、２９日目、５７日目、１８０日目、２７０日目、及び３９４日目）、並びに血清転換した対象のパーセンテージ（１日目～１５日目、２９日目、５７日目、１８０日目、２７０日目、及び３９４日目）からのＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＡ力価の幾何平均上昇倍数（Geometric mean fold rise、ＧＭＦＲ）を含む。血清変換は、ベースラインからの抗体力価の４倍の変化として定義される。
（ｃ）ＣＤ８ Ｔ細胞応答の尺度としてのＩＦＮ－γ応答及び記憶免疫細胞の表現型は、検証されたＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって対象から単離されたＰＢＭＣにおいて測定される。ＰＢＭＣを１５、２９、５７、１８０、２７０、及び３９４日目に単離する。
実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｅ、Ｍ、及びＮタンパク質、並びにエンハンサーＬタンパク質を有する及び有さない変異体の発現のための更なるポリヌクレオチドの設計
プラスミドＣｏＶＥＧ３～１７は、図６に示される順序で異なるウイルスタンパク質をコードする発現カセットを含む。プラスミド骨格（ｐＶａｘ１プラスミドの設計原理に基づく）及びプラスミドのインサートを、遺伝子合成を使用して生成した。プラスミド骨格は、カナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１複製起点、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びシミアンウイルス（ＳＶ４０）ポリＡシグナルからなる。ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルとの間にクローニングした。遺伝子合成及びプラスミド調製後、プラスミドをクローニングのためにＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、次いでカナマイシンを使用してスクリーニングした。代表的なコロニーを選択し、そのプラスミド配列を検証し、更なる開発のためのソースプラスミドとして使用した。転写後、ウイルスタンパク質を単一のポリシストロン性ｍＲＮＡから発現させた。
実施例７：免疫蛍光によって観察されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ及びＮタンパク質の発現
トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用してｐＣｏＶＥＧ３～２０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞培地を除去し、細胞をＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００によって１０分間、透過処理した後、１０％中性緩衝ホルマリンで１０分間固定し、た。免疫染色を行う前に、ＥＺブロック（ＳＣＹＴＥＫ）を添加することによって非特異的結合をブロッキングした。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する抗スパイク（Ｓ）タンパク質抗体（本明細書では「抗ＲＢＤ」とも呼ばれる）による染色剤を１：５００の希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。染色剤を除去し、細胞を洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８蛍光標識二次抗ウサギ、１：１０００希釈）を添加した。染色剤を室温で１時間インキュベートした後、染色剤を除去し、洗浄した。細胞を、ＥＶＯＳ細胞撮像システムを使用して撮像した。図７は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳタンパク質の発現を示し、試験した全てのＣｏＶＥＧプラスミドがスパイクタンパク質を発現することができることを示している。
更に、ＶＬＰの発現をチェックするために、免疫蛍光染色を使用してヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の発現について細胞を分析した。この実験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に２４ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用してｐＣｏＶＥＧ５、９～１２、及び１４～２０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞培地を除去し、細胞をＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間透過処理した後、１０％中性緩衝ホルマリンで１０分間固定した。免疫染色の前にＥＺブロック（ＳＣＹＴＥＫ）を添加することによって非特異的結合をブロッキングした。抗ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質抗体による染色剤を１：１０００の希釈で添加し、室温で１時間インキュベートした。染色剤を除去し、細胞を洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光標識二次抗マウス、１：１０００希釈）を添加した。二次抗体を室温で１時間インキュベートした後、染色剤を除去し、洗浄した。細胞を、ＥＶＯＳ細胞撮像システムを使用して撮像した。図１７は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮタンパク質の発現を示し、試験した全てのＣｏＶＥＧプラスミドがヌクレオカプシドタンパク質を発現することができることを示している。
実施例８：検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＬＰ形成に必要なＬタンパク質
インタクトなウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離するために、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用して、１５０ｍｍディッシュ中で４×１０６個のＨＥＫ２９３細胞をｐＣｏＶＥＧ３～２０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶＬＰ含有上清を採取し、スピンダウンし（１，５００×ｇ、１５分）、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルタユニット（１００ｋＤａカットオフ）を使用して濃縮した。濃縮物をスピンダウン（４，５００×ｇ、１５分）して、沈殿物を除去し、２０％スクロースクッションを通してＶＬＰをペレット化した（１００，０００×ｇ、１．５時間）。図８に示すように、ＶＬＰをＰＢＳに再懸濁し、ウェスタンブロットによって分析した。図８は、ＣｏＶＥＧ３～８プラスミドがＳタンパク質を発現することができ、ＣｏＶＥＧ３及び５～８プラスミドがＮタンパク質を発現することができることを示す。これらのデータは、本明細書中に開示されるＤＮＡベクターＣｏＶＥＧ３及び５～８が、ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＬＰの形成に必要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス構造タンパク質を発現すること、並びに分泌されたＶＬＰ成分が、細胞培養上清において検出され得ることを示す。
図１１は、ＣｏＶＥＧ５、９、１１、１６、１０、及び１５プラスミドからの、Ｓタンパク質及びＮタンパク質の発現を示す。結果は、変異体Ｓタンパク質（ＣｏＶＥＧ９、１１、１０、及び１５からの）の発現が、ＶＬＰ上に発現及び提示されるスパイクタンパク質の量を増加させることを示した。ＯＲＦ３タンパク質（ＣｏＶＥＧ１６からの）の発現は、ＶＬＰ中のＳ及びＮタンパク質の量を減少させるようであった。ＣｏＶＥＧ１５プラスミドの発現時にエンハンサーＬタンパク質が存在しないと、同様の量のＳタンパク質が得られたが、はるかに多量のＮタンパク質が得られた。理論に束縛されるものではないが、エンハンサーＬタンパク質の非存在下では、より多量のＮタンパク質が発現され、不均衡なＶＬＰ形成をもたらすと考えられる。
図１２は、ＣｏＶＥＧ５、１２、１４、１３、１０、９、及び１１プラスミドからの、Ｓタンパク質及びＮタンパク質の発現を示す。これらのデータは、（ＣｏＶＥＧ９、１０、及び１１プラスミドからの）変異体Ｓタンパク質を発現させることが、野生型Ｓタンパク質を発現した比較プラスミドと比較して、ＶＬＰ上に発現及び提示されるスパイクタンパク質の量を増加させたが、Ｎタンパク質の量はプラスミド全体にわたって一定であるようであったことを示している。
図１８は、ＣｏＶＥＧ５、８、９、１０、１５、１６、１７、及び２０プラスミドからの、Ｓタンパク質及びＮタンパク質の発現を示す。特に、エンハンサーＬタンパク質の存在は、例えば、図１８におけるＣｏＶＥＧ１０（Ｌタンパク質）対ＣｏＶＥＧ２０（Ｌタンパク質なし）Ｓ及びＮウェスタンブロットによって示されるように、異なるＳ及びＮタンパク質発現比をもたらした。
分泌されたＶＬＰの存在もＥＬＩＳＡによって確認した。この実験のために、２４，０００個のＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣｏＶＥＧ５及び９～１４プラスミド又は対照としてスパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質のいずれかを含有するプラスミドでトランスフェクトした。実験は、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用して２４ウェルプレートで実施した。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶＬＰ含有上清を採取し、スピンダウンし（１，５００×ｇ、１５分）、７５μｌの清澄化上清を使用して、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｎ－２０で２回洗浄し、ウェルをＥＺブロックを使用してブロッキングした（３７℃で２時間）。プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で２回洗浄した。コーティング材料中のＶＬＰを検出するために、抗ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マウス抗ＲＢＤ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）スパイク中和抗体、マウスＭａｂ、４０５９２－ＭＭ５７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＥＺ Ｂｌｏｃｋ中１：５００希釈）又は抗Ｎ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、Ｃｌｏｎｅ：Ｂ３４４９Ｍ、Ｎ２７８７Ｂ０９、ＥＺ Ｂｌｏｃｋ中１：１０００希釈）をウェルに添加した。抗体を室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、７５μｌの二次抗体（ヤギ抗マウス、ＨＲＰコンジュゲート、１：２，０００希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、ポリクローナル、ＯＢ１０３４０５）を添加し、室温で１時間インキュベートする。ウェルを十分に洗浄し（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で５回）、７５μｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｓｃ Ｉｎｃ ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用して結合を発現させた。７５μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｒｍｏｄｉｓｃ Ｉｎｃ ４５０ ＮＭ ＬＩＱ ＳＴＯＰ ＲＥＡＧＥＮＴ）で３０分間反応を行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
図１５は、単一タンパク質Ｓ及びＮ発現ベクターと比較したＣｏＶＥＧ５及び９～１４プラスミドのＶＬＰ分泌からのＥＬＩＳＡ結果を示す。スパイク及びヌクレオカプシドタンパク質の両方が、ＨＥＫ２９３細胞から分泌された。しかしながら、Ｓタンパク質は、単一タンパク質発現と比較して高いＥＬＩＳＡ ＶＬＰシグナルを示したが、Ｎタンパク質は、単一タンパク質発現と比較して顕著に低いＶＬＰシグナルを示した。Ｎタンパク質はＶＬＰの内部にあり、抗体に接近することができないため、ＶＬＰ中のＮシグナルは、ＶＬＰ中のＳシグナルよりも低い可能性がある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からの発現された構造タンパク質が、インタクトなＶＬＰを形成していることを更に確実にするために、２０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用して５～１５０ｍｍディッシュ中でｐＣｏＶＥＧ１０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶＬＰ含有上清を採取し、スピンダウンし（１，５００×ｇ、１５分）、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルタユニット（１００ｋＤａカットオフ）を使用して濃縮した。濃縮物をスピンダウン（４，５００×ｇ、１５分）して、沈殿物を除去し、２０％スクロースクッションを通してＶＬＰをペレット化した（１００，０００×ｇ、１．５時間）。ＶＬＰをＰＢＳ中に再懸濁し、共免疫沈降（co-Immunoprecipitation、ｃｏ－ＩＰ）に使用した。ｃｏ－ＩＰのために、再懸濁したＶＬＰを抗Ｓ ＲＢＤ抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マウス抗ＲＢＤ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）スパイク中和抗体、マウスＭａｂ、４０５９２－ＭＭ５７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と６０分間インキュベートした後、１００μｌの洗浄タンパク質Ａ／Ｇアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。樹脂を１２０分間インキュベートした後、０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出した。溶出液を、５倍容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を添加することによって直ちに中和した。画分を、抗Ｎ抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、Ｃｌｏｎｅ：Ｂ３４４９Ｍ、Ｎ２７８７Ｂ０９）を使用したウェスタンブロットによってＮタンパク質の存在について分析した。
図１９は、ＣｏＶＥＧ１０プラスミドのｃｏ－ＩＰ実験のウェスタンブロット結果を示す。Ｎタンパク質は、ＲＢＤとのインキュベーション後の溶出画分中のＮシグナルの存在によって示されるように（左側、矢印）、インタクトなＶＬＰ中に充填される。このシグナルは、洗浄画分中のシグナルの非存在と比較して、Ｎタンパク質が粒子内に保持されていることを示す。粒子の外側への非特異的Ｎタンパク質結合の可能性についての対照として、ｃｏ－ＩＰを、抗ＲＢＤ抗体なしで並行して行った（右側）。Ｎタンパク質シグナルは、溶出画分において検出可能ではなく、Ｎタンパク質が樹脂に非特異的に結合しなかったことを示した。
分泌されたＶＬＰを可視化するために、２０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、ＰＥＩ複合体を使用し、かつ製造元の説明に従って、５×１５０ｍｍディッシュ中でｐＣｏＶＥＧ１０及び２０プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶＬＰ含有上清を採取し、スピンダウンし（１，５００×ｇ、１５分）、Ａｍｉｃｏｎ１００ｋＤａ遠心分離フィルタユニットを使用して濃縮した。濃縮物をスピンダウン（４，５００×ｇ、１５分）して、沈殿物を除去し、２０％スクロースクッションを通してＶＬＰをペレット化した（１００，０００×ｇ、１．５時間）。ＶＬＰをＰＢＳに再懸濁し、急速冷凍し、透過型電子顕微鏡（transmission electron microcopy、ＴＥＭ）に使用するまで－８０℃で保存した。
ＴＥＭ実験のために、ＶＬＰを、ＴＬＳ－５５（Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して２０％スクロースクッション上で２５０００ｇで２時間超遠心分離した。１０μｌを顕微鏡銅グリッド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に置き、２％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで５分間固定した。次いで、試料を５ｍＬのリンタングステン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でネガティブ染色した。１００ｋｅＶで動作するＨｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００ ＴＥＭを用いてグリッドを調べた。
図１６は、ＣｏＶＥＧ１０について、単離された材料中のＶＬＰの存在を示す。明確なスパイク三量体化表面を有する大粒子の存在は、ＣｏＶＥＧ１０について観察することができた（拡大挿入図参照）。Ｌ調節タンパク質の存在は別としてＣｏＶＥＧ１０と同一であるＣｏＶＥＧ２０は、認識可能なＶＬＰを生成することができなかった。
インタクトなＶＬＰ及び免疫原性ＶＬＰは、全てのＶＬＰ形成タンパク質の比に高度に依存している。本明細書において、Ｌタンパク質が、全てのＶＬＰ形成タンパク質の発現及びＶＬＰの正確な形成を制御することが示された。
実施例９：Ｌタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に対する中和抗体をインビボで増加させ、Ｔｈ１応答に必要であった
プラスミドＣｏＶＥＧ３～８の免疫原性を決定するために、プラスミドをＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間間隔で筋肉内注射し、１日目及び１５日目に合計２回注射した。血液を１４日目、２８日目、４２日目、及び５６日目に採取し、血清を単離し、抗凝固剤の存在下で急速凍結した。
プラスミドＣｏＶＥＧ５、８、及び９～１４、並びにＳのみのプラスミドの免疫原性を決定するために、プラスミドをＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌ又は０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間間隔で筋肉内（２ｍｇ／ｍｌ）又は皮内（０．５ｍｇ／ｍｌ）注射し、１日目及び１５日目に合計２回注射した。血液を１４日目、２８日目、４２日目、及び５６日目に採取し、血清を単離し、抗凝固剤の存在下で急速凍結した。
プラスミドＣｏＶＥＧ９、１０、及び２０、並びにエンハンサータンパク質を含む及び含まないＳのみのプラスミドの免疫原性を決定するために、プラスミドをＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１日目、１５日目、及び２９日目に合計１～３回、２週間間隔で筋肉内注射した。血液を０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、及び７０日目に採取し、血清を単離し、抗凝固剤の存在下で急速凍結した。結合抗体濃度、すなわち誘発された体液性免疫応答を測定するために、コーティング材料として精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤタンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）ＤＡＧＣ１４９ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ［Ｈｉｓ］）を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。この実験のために、高結合９６ウェルプレートを７５μｌの２μｇ／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクＲＢＤ溶液でコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で２回洗浄し、ウェルをＥＺブロックを使用してブロッキングした（３７℃で２時間）。プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で２回洗浄した。５６日後にマウスから血清を収集し、ウェルに添加した（結合抗体検出のために１：５００希釈、エンドポイント力価測定のために１：１００～１：７８１２５００）。血清を室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、７５μｌの二次抗体（ヤギ抗ウサギ、ＨＲＰコンジュゲート、１：４，０００希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを十分に洗浄し（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で５回）、７５μｌの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｓｃ Ｉｎｃ ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用して結合を発現させた。反応を３０分間行った後、７５μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｒｍｏｄｉｓｃ Ｉｎｃ ４５０ ＮＭ ＬＩＱ ＳＴＯＰ ＲＥＡＧＥＮＴ）で停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
図９Ａは、ＥＬＩＳＡを使用して測定された総結合抗体を示し、図９Ｂは、測定されたエンドポイント力価を示す。これらの結果は、ＣｏＶＥＧ３～８プラスミドが、マウスに注射された場合に強力な免疫応答を誘発することができ、したがって抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ２抗体を産生することができることを示す。ＣｏＶＥＧ８は、これらのマウスにおいて強力な免疫応答を誘導することができる点で特に優れていると同定された。これらの結果は、本明細書中に開示されるプラスミドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する非常に有効なＤＮＡワクチンであることを示す。
図１３は、ＣｏＶＥＧ５、９、１１、１０、１２、１３、８、及び１４プラスミドの筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）注射のいずれかからのＥＬＩＳＡ結果を示す。注目すべきことに、ＣｏＶＥＧ１０の筋肉内注入は、スパイクタンパク単独の注入と比較して、より高い免疫応答を誘導した。ＣｏＶＥＧ５、ＣｏＶＥＧ９、及びＣｏＶＥＧ１１の筋肉内注射もまた、Ｓタンパク単独の注射と比較して、より高い免疫応答を誘導した。これらの結果は、本明細書に開示されるプラスミドが、スパイクタンパク質単独を発現するワクチンよりも良好に機能する、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２に対する非常に有効なＤＮＡワクチンであることを更に示す。
図２０及び図２２は、ＩＭ又はＩＤ注射後４２日目のＣｏＶＥＧ５及び９～１４、１８、１９、及び２０プラスミド、並びにＳのみからの抗体結合力価を示す。興味深いことに、試験したＣｏＶＥＧの全てが免疫応答を誘導することができ、ＣｏＶＥＧ９が最も有効であった。注目すべきことに、ＶＬＰ形成ＣｏＶＥＧ９は、スパイクタンパク単独よりも良好に機能した。
更に、細胞性免疫応答を、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－４酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用して、抗原反応性Ｔ細胞の存在を使用して測定した。ＥＬＩＳｐｏｔ分析のために、脾臓を収集し、Ｔ細胞を単離した。ＥＬＩＳｐｏｔ評価は、Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプールでプライミングして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性Ｔ細胞を活性化することによって実施した。分析のために、マウスＩＬ－４単色ＥＬＩＳＰＯＴ及びマウスＩＮＦ－γ単色ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を製造元の指示に従って使用した。手短に言えば、９６ウェルＰＶＤＦ膜プレートを、ＩＬ－４又はＩＮＦ－γ捕捉抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＣＴＬ試験培地中の１５０，０００個の脾細胞を、予めコーティングしたプレート上に播種し、３７℃及び４％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。細胞を、ＰＭＡ／イオノフォア（陽性対照として）又はウェル当たり０．６μｌの再構成されたＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプール（Ｓ、Ｎ、又はＭ）のいずれかで活性化した。反応物を２４時間インキュベートした後、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ分析器（ＣＴＬ）を使用して現像及び計数した。
図２４は、ＣｏＶＥＧ１０及びＣｏＶＥＧ２０のＴ細胞分析の結果を示す。重要なことに、呼吸器ウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する成功したワクチンを生成するために、Ｔｈ１優先性（ＩＮＦγ）又は少なくともバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答が必要とされる。驚くべきことに、ＣｏＶＥＧ１０におけるＬ調節タンパク質の添加は、ＩＮＦγ（Ｔｈ１）応答のためにＴ細胞性免疫応答に影響を与えた。注目すべきことに、ＣｏＶＥＧ２０における調節タンパク質の非存在は、ＩＬ４（Ｔｈ２）に対する細胞応答を逆転させた。Ｔｈ１応答は、ウイルスに対する長く続く免疫応答を生成するために必要である。
血清が、スパイクタンパク質に結合するＳＡＲＳ ＣｏＶ２に対する中和抗体を有するかどうかを試験するために、ｃＰａｓｓ（商標）中和アッセイ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用したインビトロウイルス中和アッセイを、製造元の指示に従って実施した。ｃＰａｓｓ（商標）は、ウイルスと宿主細胞間の相互作用をインビトロで模倣することによって、試料中の総中和抗体の検出を可能にする。アッセイにおいて、中和抗体が試験される試料中に存在する場合、宿主細胞膜受容体ＡＣＥ２への受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の結合が阻害される。しかしながら、中和抗体が試料中に存在しない場合、ＲＢＤは、ＡＣＥ２に結合することができる。図１０は、ＡＣＥ２受容体へのＲＢＤ結合のパーセント（％）阻害を示す。ＡＣＥ２へのＲＢＤ結合の阻害が３０％を超える場合（赤色点線）、試料は、中和抗体を有すると同定される。図１０に示すように、ＣＯＶＥＧ５及びＣＯＶＥＧ８を注射したマウスから得た血清試料は、高い阻害率を示し、したがって、中和抗体を生成した。これらの結果は、開示されたプラスミドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する非常に有効なＤＮＡワクチンであることを更に強調する。
図２１は、図２０に示される試料の中和抗体を示す。これらのデータは、全ての生成された抗体が中和能を有するわけではないことを示す。このアッセイにおけるより低いシグナルは、陰性対照（破線）の７０％未満のシグナルによって定義されるような中和を確認した。陰性対照の３０％未満のシグナルは、強く中和していることが確認された。試験されたＣｏＶＥＧは、設計及び注射部位に応じて異なって機能した。驚くべきことに、ＩＤ注射は、強力な中和抗体を誘導しなかったが、ＩＭ注射は、強力な中和抗体を誘導した。更に、ＣｏＶＥＧ１３及び１４は、中和の基準を満たさなかった。しかしながら、ＣｏＶＥＧ９は、Ｓスパイクタンパク質のみの構築物を含む全ての試験された構築物の最も高い中和を示し、再び、ＶＬＰアプローチがサブユニットＳスパイクのみのワクチンよりも強力なワクチンを提供することを示した。
図２３は、ＣｏＶＥＧ９、１０、及び２０プラスミドの中和抗体を示し、プラスミド２０は、エンハンサーＬタンパク質が存在しない場合の対照である。ＣｏＶＥＧ２０は、中和能力を示したが、Ｔ細胞分析で示されたようにＴｈ２オーバーハングは、ワクチンの実行可能な選択肢ではない。
更に、経時的なエンハンサータンパク質の存在下及び非存在下での中和能をｃＰａｓｓ（商標）によって分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２代理ウイルス中和試験（Surrogate Virus Neutralization Test、ｓＶＮＴ）キット。このために、免疫動物（ＣｏＶＥＧ９、スパイク＋エンハンサータンパク質Ｌ、及びエンハンサーを含まないスパイクの免疫がある）からの血清試料を４２日目及び７０日目に採取し、ｃＰａｓｓ（商標）を上記のように実施した。
図２７Ａは、分析した血清試料の個々の値を示し、図２７Ｂは、要約として同じデータの中央値を示す。興味深いことに、エンハンサータンパク質の添加は、経時的に中和抗体の利益を明らかに示した。第一に、エンハンサータンパク質Ｌを有する両方の構築物（ＣｏＶＥＧ９及びスパイク＋Ｌ）は、より高い中央中和値を示した（図２７Ｂ Ｂ、ＣｏＶＥＧ９ 丸、スパイク＋Ｌ四角）。第二に、中和抗体のレベルは、エンハンサータンパク質を含まない構築物と比較して、注射後７０日後であっても高いままであった（図２７Ｂ、スパイク三角）。
これは、ワクチン候補へのエンハンサータンパク質の添加の利点を更に示した。
実施例１０：Ｌタンパク質は、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）Ｅ及びＭタンパク質と共発現させた場合、機能的ＷＮＶ ＶＬＰ産生を増加させた
前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）、ＷＮＶのＮＹ９９株のエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、及びエンハンサータンパク質をコードするプラスミドを、実施例６に記載されるように構築した（図１４Ａ、配列番号５５を参照されたい）。また、ＷＮＶのＮＹ９９株の前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）及びエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）のみをコードする対照プラスミドを構築した（図１１Ｂ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１日目に、細胞を２４ウェルプレートに、ウェル当たり２０，０００細胞で播種し、一晩増殖させた。２日目に、２４ウェルプレートに播種した細胞を、前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）、ＷＮＶのＮＹ９９株のエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、及びエンハンサータンパク質をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトした。全ての実験において、ＷＮＶのＮＹ９９株の前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）及びエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）のみをコードし、エンハンサータンパク質をコードしない対照プラスミドを使用した。
５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の、０．５ｕｇの対応するプラスミド及び１ｕｇのＰＥＩを使用して形成されたプラスミド／ＰＥＩ複合体を使用して、２４ウェルプレートの各ウェルをトランスフェクトした。プラスミド／ＰＥＩ混合物を室温で３０分間インキュベートすることによって複合体を形成させた。２４ウェルプレート中の細胞培地を新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換し、複合体をウェルに添加した。３日目に、複合体をトランスフェクト細胞から除去し、新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭと交換した。
４日目に、細胞培養上清を収集し、５００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞破片から除去し、ＥＬＩＳＡによる下流分析のために保存した。２５０μｌの１０％中性緩衝ホルマリンを使用して細胞を固定し（室温で１０分間）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を使用して透過処理し（室温で１０分間）、洗浄した。
蛍光顕微鏡を使用して、以下のように細胞におけるタンパク質発現を可視化した。細胞を、マウス抗ＷＮＶ＿Ｅ及びウサギ抗ＷＮＶ＿Ｍ一次抗体（ＰＢＳ中１：５００希釈、室温で１時間）を使用して染色し、洗浄し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（ＰＢＳ中１：１０００希釈、室温で１時間）で発色させ、洗浄し、蛍光顕微鏡を使用して撮像した。
免疫染色実験の結果を図２８に示す。本明細書に記載の他の実験で観察されたように、ＷＮＶ＋エンハンサータンパク質（ＥＧ）の量は、それを含まないＷＮＶの量と比較して低かった。しかし、品質は、核の形成によって観察されるように、エンハンサータンパク質が存在する場合により高いようであった（図２８、右、矢印によって示されるように）。これらのデータは、本明細書において提供される組成物及び方法を用いて発現されたタンパク質のより高い品質を示す。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、発現された抗原の分泌を示した。このために、トランスフェクト細胞からの上清を、４日目（トランスフェクション後４８時間）、５日目（７２時間）、６日目（９６時間）、７日目（１２０時間）、及び８日目（１４４時間）に収集した。ウェル当たり７５μｌの細胞培養上清を使用して、高結合９６ウェルプレートを細胞培養上清でコーティングし、＋４℃で一晩インキュベートした。翌日、コーティングされたウェルをＰＢＳＴ緩衝液を使用して洗浄し、ウェル当たり２００μｌのＥＺ Ｂｌｏｃｋ（商標）試薬（Ｓｃｙｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して＋３７℃で２時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、一次抗体（マウス抗ＷＮＶ＿Ｅ、ＥＺ Ｂｌｏｃｋで１：１０００希釈、ウェル当たり７５μｌ）とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＥＺ Ｂｌｏｃｋ試薬で１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体、ウェル当たり７５μｌとともに室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴを使用して５回洗浄し、７５μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートし、続いて７５μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、プレートリーダを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。更に、ＶＬＰ分泌が細胞死及び細胞内タンパク質の非特異的放出によって引き起こされなかったことを示すために、細胞を毎日撮像し、ＥＬＩＳＡ結果を画像と比較した。
図２６Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定される、トランスフェクト細胞からの経時的なＶＬＰの分泌を示す。エンハンサータンパク質を有するＷＮＶ構築物は、インタクトなＶＬＰ及び健康な細胞について予想されたように、トランスフェクションの７２時間後に最も高い分泌を示したが、エンハンサータンパク質を有さないＷＮＶ構築物は、経時的に分泌物質の着実な増加を示した。後者は、完全に形成されたＶＬＰではない可能性が最も高いタンパク質物質の細胞死及び非特異的放出の増加とより一致していた。結果は、上清からの採取時に撮影した細胞画像の分析によって確認した。エンハンサータンパク質を有するＷＮＶは、実験時間にわたって細胞死をほとんど又は全く示さなかったが（星印によって示されるように）、エンハンサータンパク質を有さないＷＮＶは、目に見える細胞死を示し（星印によって示されるように）、７２時間後、これは、実験時間にわたって次第により顕著になった。細胞画像は、エンハンサータンパク質を含まないＷＮＶからの放出された物質が、ＶＬＰの制御された分泌からではなく、細胞死からのタンパク質の放出に起因する可能性が最も高いことの更なる証拠である。
本実施例は、本開示の方法及び組成物が、産生される抗原の品質を改善することを更に示す。
実施例１１：Ｌタンパク質は、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）Ｅ及びＭタンパク質と共発現させた場合、総ＷＮＶ ＶＬＰ産生を増加させた
インタクトなＶＬＰを単離するために、１５０ｍｍディッシュ中の４×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、ＷＮＶのＮＹ９９株の前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）及びエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、並びにエンハンサータンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。全ての実験において、ＷＮＶのＮＹ９９株の前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）及びエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）のみをコードし、エンハンサータンパク質をコードしない対照プラスミドを使用した。トランスフェクションは、１５０ｍｍディッシュ当たり４０μｇプラスミド及び８０μｇ ＰＥＩを使用して、製造元の説明に従ってＰＥＩ複合体を使用して行った。トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＶＬＰ含有上清を採取し、スピンダウンし（１，５００×ｇ、１５分）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルタユニット（１００ｋＤａカットオフ）を使用して濃縮した。濃縮物をスピンダウン（４，５００×ｇ、１５分）して、沈殿物を除去し、１００，０００×ｇで１．５時間、２０％スクロースクッションを通してＶＬＰをペレット化した。ＶＬＰをＰＢＳ中に再懸濁し、ＥＬＩＳＡによって分析した。
ＥＬＩＳＡは、上記のように、及び当技術分野で公知のように、例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０９３７０８に記載されているように実施した。簡潔には、高結合９６ウェルプレートを、１：２０～１：７２，０００の連続希釈でＰＢＳ中に再懸濁したＶＬＰを使用してコーティングして、エンハンサータンパク質を含む構築物と含まない構築物との間の発現量の差を可視化し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、ＥＺブロック（Ｓｃｙｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。抗ウエストナイルウイルス抗体、クローンＥ１６をＥＺブロックで希釈し（１：５，０００）、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ標識検出抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出のために添加し、続いて洗浄し、ＴＭＢ基質及び停止溶液とともにインキュベートした。シグナルを、プレートリーダを使用して４５０ｎｍでの吸光度として読み取った。
図２５は、エンハンサータンパク質を含むウエストナイルウイルス構築物及びエンハンサータンパク質を含まないウエストナイルウイルス構築物の総発現と分泌との間の差異を示す。示されるように、エンハンサータンパク質の添加（丸）は、エンハンサータンパク質を欠く構築物（四角）と比較して、ウエストナイルウイルス粒子のより高い発現をもたらした。これは、本開示の組成物及び方法がＷＮＶ ＶＬＰワクチン産生に有益であることを示す。
実施例１２：マウスにおいてＬエンハンサータンパク質と共発現されたウエストナイルウイルスタンパク質の免疫原性
前駆体膜（ｐｒＭ）、ＷＮＶのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、及びエンハンサータンパク質をコードするプラスミドによるワクチン接種の際に免疫応答をインビボで誘発する能力を、以下のようにＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して評価する。６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、体重に基づいてグループに無作為化する。マウスに、１日目及び２１日目に皮内注射又は筋肉内注射を使用してプラスミドを投薬する。マウス血清試料を１日目（ワクチン接種前）、２１日目（ブースト前）、及び４２日目に採取する。４２日目に、マウスを屠殺し、脾細胞を単離する。
誘発された体液性免疫応答は、抗Ｍ抗体及び抗Ｅ抗体の力価それぞれの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価することによって測定される。更に、細胞性免疫応答は、それぞれのＩＦＮ－γ及びＩＬ－４酵素結合免疫吸着スポット（Dual color ELISpot）アッセイを使用して抗原反応性Ｔ細胞の存在を評価することによって測定される。
ＥＬＩＳＡは、本明細書に記載されるように、かつ当技術分野で公知のように、例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０９３７０８に記載されているように実施する。簡潔には、高結合９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌ濃度の組換えｐｒＭ及びＥタンパク質（Ａｂｃａｍ）を使用してコーティングし、ブロッキングする。血清試料をＥＺ Ｂｌｏｃｋ試薬で連続希釈し、予めコーティングしたウェルに添加し、洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ標識検出抗体を使用して検出し、続いて洗浄し、ＴＭＢ基質及び停止溶液とともにインキュベートする。エンドポイント力価は、ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）がバックグラウンドシグナルの３標準偏差を超える最大抗体希釈の逆数として定義される。
Ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、本明細書に記載されるように、及び当技術分野で公知のように、例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ ２０１０ ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５３６９に記載されるように行う。簡潔には、脾細胞を４２日目に単離し、それぞれのｐｒＭ又はＥペプチドアレイ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）で刺激し、予め調製したＥＬＩＳｐｏｔマイクロプレートに添加する。陰性（培地）及び陽性対照（酢酸ミリスチン酸ホルボール／イオノマイシン）をアッセイに含める。抗原反応性ＩＦＮ－γ及びＩＬ－４分泌Ｔ細胞の数を、ＥＬＩＳｐｏｔリーダを使用して計数する。
最後に、異なる時点で単離されたマウス血清中のＷＮＶ中和抗体の存在（上記参照）を、本明細書に記載されるように、及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １９６，Ｉｓｓｕｅ １２，１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７，Ｐａｇｅｓ １７３２－１７４０、及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３４６，Ｉｓｓｕｅ １，１ Ｍａｒｃｈ ２００６，Ｐａｇｅｓ ５３－６５に記載されるように評価する。簡潔には、ＷＮＶレポーターウイルス粒子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＲＶＰ）は、ＷＮＶ ｐｒＭ及びＥタンパク質を一過性にトランスフェクトすることによって（サブウイルス粒子としても知られるウイルス様粒子を形成するために）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成され、一過性にトランスフェクトされたレポーターレプリコン（ルシフェラーゼ）及び一過性にトランスフェクトされたカプシドタンパク質で補完される。単離されたＲＶＰを、異なる連続希釈でマウス血清試料とともにインキュベートし、予めプレーティングしたＰＨＫ－２１細胞に添加し、２日間インキュベートし、その後、レポーター遺伝子活性をマイクロプレートリーダを使用して測定する。レポーター遺伝子活性の減少は、マウス血清中のＷＮＶ中和抗体のレベルを反映する。
実施例１３：追加のポリヌクレオチド構築物の発現及び免疫原性
他のウイルスに由来するウイルスタンパク質、例えばインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、又はそれらの任意の組み合わせ）、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（例えば、ｓＡｇ（Ｓタンパク質）、ｓＡｇ（Ｍタンパク質）、ｓＡｇ（Ｌタンパク質）、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、ｃＡｇ（コア抗原）、又はそれらの任意の組み合わせ）、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１１のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１６のＬ１タンパク質、ＨＰＶ１８のＬ１タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせ）をコードするプラスミドの構築は、実施例６に記載の方法を使用して実施される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における異なる組み合わせでのこれらのタンパク質の発現及びＶＬＰの単離は、実施例７、８、１０、及び１１に記載される方法を使用して実施される。最後に、これらのタンパク質をコードするプラスミドの免疫原性を、実施例９及び１２に記載の方法を使用して試験する。
参照による援用
本明細書に引用されている全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により援用される。しかしながら、本明細書に引用されているあらゆる参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願についての言及は、世界のどの国においても、それらが有効な先行技術を構成する、又は共通の一般知識の一部を形成するという承認又はいかなる形態の提案ではなく、またそのように解釈されるべきではない。
番号付き実施形態
実施形態１．ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターであって、エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、ベクター。
実施形態２．エンハンサータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、実施形態１に記載のベクター。
実施形態３．エンハンサータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号２である、実施形態１又は実施形態２に記載のベクター。
実施形態４．エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態１～３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態５．ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２４である、実施形態４に記載のベクター。
実施形態６．ウイルスタンパク質が、ウイルス抗原である、実施形態１～５のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態６．１ ウイルスタンパク質が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウエストナイルウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、実施形態１～６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態６．２ ウイルスタンパク質が、コロナウイルスに由来する、実施形態６．１に記載のベクター。
実施形態７．コロナウイルスが、ベータコロナウイルスである、実施形態１～６．２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態８．ベータコロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスである、実施形態７に記載のベクター。
実施形態９．ＳＡＲＳウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、実施形態８に記載のベクター。
実施形態１０．ベータコロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルスである、実施形態７に記載のベクター。
実施形態１１．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルススパイクタンパク質である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１２．スパイクタンパク質が、配列番号１３に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態１１に記載のベクター。
実施形態１３．スパイクタンパク質が、配列番号１３である、実施形態１２に記載のベクター。
実施形態１３．１ スパイクタンパク質が、変異体スパイクタンパク質である、実施形態１１に記載のベクター。
実施形態１３．２ 変異体スパイクタンパク質が、配列番号１３におけるアミノ酸置換Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｓ、Ｋ９８６Ｐ、及びＶ９８７Ｐを含む、実施形態１３．１に記載のベクター。
実施形態１３．３ 変異体スパイクタンパク質が、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態１３．１に記載のベクター。
実施形態１４．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質である、実施形態１～１３．３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１５．Ｍタンパク質が、配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態１４に記載のベクター。
実施形態１６．Ｍタンパク質が、配列番号３３である、実施形態１４又は実施形態１５に記載のベクター。
実施形態１７．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１８．Ｅタンパク質が、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態１７に記載のベクター。
実施形態１９．Ｅタンパク質が、配列番号２２である、実施形態１７又は実施形態１８に記載のベクター。
実施形態２０．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２１．Ｎタンパク質が、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態２０に記載のベクター。
実施形態２２．Ｎタンパク質が、配列番号２０である、実施形態２０又は実施形態２１に記載のベクター。
実施形態２３．コロナウイルスタンパク質が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２３．１ ウイルスタンパク質が、ウエストナイルウイルスに由来する、実施形態６．１に記載のベクター。
実施形態２３．２ ウイルスタンパク質が、前駆体膜タンパク質（ｐｒｅＭ）、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）、又はそれらの組み合わせである、実施形態２３．１に記載のベクター。
実施形態２４．ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターであって、ポリヌクレオチドが、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ベクター。
実施形態２５．ポリヌクレオチドが、配列番号３０の核酸配列を含む、実施形態２４に記載のベクター。
実施形態２６．ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクターであって、ポリヌクレオチドが、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ベクター。
実施形態２７．ポリヌクレオチドが、配列番号３１の核酸配列を含む、実施形態２６に記載のベクター。
実施形態２７．１ 配列番号３５～４９及び５５からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
実施形態２８．ベクターが、ネイキッドポリヌクレオチドである、実施形態１～２７．１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２９．ベクターが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドである、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３０．ベクターが、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドである、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３１．ベクターが、プラスミドを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３２．ベクターが、線状ＤＮＡを含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３３．発現カセットが、発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３３．１ ベクターが、ＤＮＡポリヌクレオチドを含み、当該ＤＮＡポリヌクレオチドがウイルスパッケージングシグナルをコードする、実施形態１～３３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３３．２ ウイルスパッケージングシグナルが、ＲＮＡポリヌクレオチドである、実施形態３３．１に記載のベクター。
実施形態３３．３ ウイルスパッケージングシグナルが、コロナウイルスに由来する、実施形態３３．２に記載のベクター。
実施形態３４．実施形態１～３３．４のいずれか１つに記載のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、ワクチン組成物。
実施形態３５．ワクチン組成物が、アジュバントを含む、実施形態３４に記載のワクチン組成物。
実施形態３６．アジュバントが、ミョウバンである、実施形態３５に記載のワクチン組成物。
実施形態３７．アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）である、実施形態３５に記載のワクチン組成物。
実施形態３８．真核細胞中でウイルス抗原を発現させる方法であって、細胞を、実施形態１～３３．４のいずれか１つに記載のベクターと接触させることを含む、方法。
実施形態３９．細胞をベクターと接触させることが、エンハンサータンパク質を欠くベクターよりも、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原の発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原の発現をもたらす、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０．細胞をベクターと接触させることが、エンハンサータンパク質を欠くベクターよりも、（ｉ）より高い発現レベルでの抗原を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の発現、及び／又は（ｉｉ）より長い期間にわたる抗原を含むＶＬＰの発現、及び／又は（ｉｉｉ）より良好なタンパク質品質を有する抗原を含むＶＬＰの発現をもたらす、実施形態３８又は実施形態３９に記載の方法。
実施形態４０．１ ベクターが、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、細胞をベクターと接触させることが、ウイルスパッケージングシグナルの発現をもたらし、ＶＬＰが、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４０．２ ベクターが、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを欠く対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの形成をもたらす、実施形態４０．１に記載の方法。
実施形態４１．対象において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の実施形態３４～３７のいずれか１つに記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態４２．対象の投与部位の組織が、抗原及び／又は抗原を含むＶＬＰを発現する、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３．対象の投与部位の組織が、エンハンサータンパク質を欠くベクターが投与される場合よりも、（ｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより高い発現レベルで発現する、並びに／又は（ｉｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより長い期間発現する、並びに／又は（ｉｉｉ）抗原、及び／若しくは抗原を含むＶＬＰをより良好なタンパク質品質で発現する、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４３．１ ベクターが、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、対象の投与部位の組織が、ウイルスパッケージングシグナルを発現し、ＶＬＰが、ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化する、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３．２ ベクターが、ウイルスパッケージングシグナルをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを欠く対照ベクターと比較して、より多数のＶＬＰの発現をもたらす、実施形態４３又は４３．１に記載の方法。
実施形態４３．３ ウイルスパッケージングシグナルをカプシド化するＶＬＰが、抗原を含むがウイルスパッケージングシグナルを欠く対照ＶＬＰよりも免疫原性が高い、実施形態４３～４３．２に記載の方法。
実施形態４４．方法が、対象において抗体応答を誘発する、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５．抗体応答が、中和抗体応答である、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．方法が、細胞性免疫応答を誘発する、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．方法が、対象において予防的、防御的、及び／又は治療的免疫応答を誘発する、実施形態４１～４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８．投与が、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は鼻腔内投与である、実施形態４１～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９．コロナウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含む、ポリヌクレオチドであって、エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、ポリヌクレオチド。
実施形態５０．エンハンサータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、実施形態４９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５１．エンハンサータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号２である、実施形態４９又は実施形態５０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５２．エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態５３．ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２４である、実施形態５２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５４．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルス抗原である、実施形態４９～５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態５５．コロナウイルスが、ベータコロナウイルスである、実施形態４９～５４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態５６．ベータコロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスである、実施形態５５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５７．ＳＡＲＳウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、実施形態５６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５８．ベータコロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルスである、実施形態５５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態５９．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルススパイクタンパク質である、実施形態４９～５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態６０．スパイクタンパク質が、配列番号１３に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態５９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６１．スパイクタンパク質が、配列番号１３である、実施形態５９又は実施形態６０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６２．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質である、実施形態４９～６１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態６３．Ｍタンパク質が、配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態６２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６４．スパイクタンパク質が、配列番号３３である、実施形態６２又は実施形態６３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６５．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質である、実施形態４９～６４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態６６．Ｅタンパク質が、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態６５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６７．スパイクタンパク質が、配列番号２２である、実施形態６５又は実施形態６６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態６８．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、実施形態４９～６７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態６９．Ｎタンパク質が、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態６８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態７０．Ｎタンパク質が、配列番号２０である、実施形態６８又は実施形態６９に記載のポリヌクレオチド。
実施形態７１．コロナウイルスタンパク質が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する、実施形態４９～７０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態７２．配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
実施形態７３．ポリヌクレオチドが、配列番号３０の核酸配列を含む、実施形態７２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態７４．配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
実施形態７５．ポリヌクレオチドは、配列番号３１の核酸配列を含む、実施形態７４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態７６．ポリヌクレオチドが、ネイキッドポリヌクレオチドである、実施形態４９～７５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態７７．ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドである、実施形態４９～７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態７８．ポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドである、実施形態４９～７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態７９．発現カセットが、発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態４９～７１及び７６～７８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態８０．ベクターを含むキットであって、ベクターが、コロナウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びエンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットを含み、エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、キット。
実施形態８１．エンハンサータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有する、実施形態８０に記載のキット。
実施形態８２．エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、実施形態８０又は実施形態８１に記載のキット。
実施形態８３．ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２４である、実施形態８２に記載のキット。
実施形態８４．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルス抗原である、実施形態８０～８３のいずれか１つに記載のキット。
実施形態８５．コロナウイルスが、ベータコロナウイルスである、実施形態８０～８４のいずれか１つに記載のキット。
実施形態８６．ベータコロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスである、実施形態８５に記載のキット。
実施形態８７．ＳＡＲＳウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、実施形態８６に記載のキット。
実施形態８８．ベータコロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルスである、実施形態８５に記載のキット。
実施形態８９．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルススパイクタンパク質である、実施形態８０～８８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態９０．スパイクタンパク質が、配列番号１３に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態８９に記載のキット。
実施形態９１．スパイクタンパク質が、配列番号１３である、実施形態９０に記載のキット。
実施形態９２．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルス膜（Ｍ）タンパク質である、実施形態８０～９１のいずれか１つに記載のキット。
実施形態９３．Ｍタンパク質が、配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態９２に記載のキット。
実施形態９４．Ｍタンパク質が、配列番号３３である、実施形態９２又は実施形態９３に記載のキット。
実施形態９５．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質である、実施形態８０～９４のいずれか１つに記載のキット。
実施形態９６．Ｅタンパク質が、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態９５に記載のキット。
実施形態９７．Ｅタンパク質が、配列番号２２である、実施形態９５又は実施形態９６に記載のキット。
実施形態９８．コロナウイルスタンパク質が、コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、実施形態８０～９７のいずれか１つに記載のキット。
実施形態９９．Ｎタンパク質が、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を共有する、実施形態９８に記載のキット。
実施形態１００．Ｎタンパク質が、配列番号２０である、実施形態９８又は実施形態９９に記載のキット。
実施形態１０１．発現カセットが、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、実施形態８０に記載のキット。
実施形態１０２．発現カセットが、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、実施形態８０に記載のキット。
実施形態１０３．キットが、薬学的に許容される担体を含む、実施形態８０～１０２のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１０４．ベクターであって、発現カセットであって、標的遺伝子に連結されたプロモーターを含む、発現カセットを含み、ベクターが、ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列を含む、ベクター。
実施形態１０５．ウイルスパッケージング要素が、ＲＮＡポリヌクレオチドである、実施形態１０４に記載のベクター。
実施形態１０６．ウイルスパッケージング要素が、コロナウイルスに由来する、実施形態１０４又は１０５に記載のベクター。
実施形態１０７．ウイルスパッケージング要素が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来する、実施形態１０６に記載のベクター。
実施形態１０８．ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列が、配列番号３４の核酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有する、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１０９．真核細胞中で標的タンパク質を発現させる方法であって、細胞を、実施形態１０４～－１０８のいずれか１つに記載のベクターと接触させることを含む、方法。
実施形態１１０．細胞をベクターと接触させることが、標的タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらす、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１．細胞をベクターと接触させることが、発現カセットを含むがウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列を欠く対照ベクターと比較して、標的タンパク質を含む多数のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成をもたらす、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２．ウイルスパッケージング要素をコードする核酸配列が、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する、実施形態３３．１～３３．３のいずれか１つに記載のベクター、又は実施形態４０．１、４０．２、４３．１～４３．３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、配列番号３３（Ｍタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、配列番号２０（Ｎタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、配列番号１３（Ｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、第３のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、配列番号２２（Ｅタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２４（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号２（エンハンサーＬタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
実施形態１１４．５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、配列番号３３（Ｍタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、配列番号１３（Ｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、配列番号２２（Ｅタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２４（ＩＲＥＳ）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２（エンハンサーＬタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、配列番号２０（Ｎタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３４（ウイルスパッケージングシグナル）をコードするポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
実施形態１１５．５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
実施形態１１６．５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングシグナルをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドであって、ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。

Claims (59)

  1. ウイルス抗原タンパク質及びエンハンサータンパク質をコードするワクチンにおいて使用するためのポリヌクレオチドであって、前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質又はその機能的バリアントである、ポリヌクレオチド。
  2. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性、又は配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するエンハンサータンパク質アミノ酸配列をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号２のエンハンサータンパク質アミノ酸配列をコードする、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ポリヌクレオチドが、前記エンハンサータンパク質に作動可能に連結された配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２４である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ウイルス抗原タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ウイルス抗原タンパク質が、コロナウイルスに由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記コロナウイルスが、ベータコロナウイルスである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記ベータコロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記ベータコロナウイルスが、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルスである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ウイルス抗原タンパク質が、スパイク（Ｓ）タンパク質である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記スパイクタンパク質が、配列番号１３、又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記スパイクタンパク質が、配列番号５１の変異体スパイクタンパク質配列アミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記ウイルス抗原タンパク質が、膜（Ｍ）タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記Ｍタンパク質が、配列番号３３の配列、又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記ウイルス抗原タンパク質が、エンベロープ（Ｅ）タンパク質である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記Ｅタンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記ウイルス抗原タンパク質が、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記Ｎタンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記ウイルス抗原タンパク質が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記ウイルス抗原タンパク質が、ウエストナイルウイルスタンパク質である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記ウイルス抗原タンパク質が、前駆体膜タンパク質（ｐｒｅＭ）及び／又はエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  23. 配列番号３０の配列、又はそれに対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンとして使用するためのポリヌクレオチド。
  24. 配列番号３１の配列、又はそれに対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンとして使用するためのポリヌクレオチド。
  25. 配列番号３５～４９、及び５５の配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンとして使用するためのポリヌクレオチド。
  26. 発現カセットが、前記発現カセットのポリヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記ウイルス抗原タンパク質が、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記ウイルス抗原タンパク質が、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、及びＭ２のうちの１つ以上である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記ウイルス抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質に由来する、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記ウイルス抗原タンパク質が、ｓＡｇ（Ｓタンパク質）、ｓＡｇ（Ｍタンパク質）、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、及びｃＡｇ（コア抗原）のうちの１つ以上である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスパッケージングシグナルをコードする、請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ウイルスパッケージングシグナルが、コロナウイルスに由来する、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  34. 請求項３３に記載のベクターと、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントとを含む、ワクチン組成物。
  35. 前記アジュバントが、ミョウバン及び／又はモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）である、請求項３４に記載のワクチン組成物。
  36. 真核細胞中でウイルス抗原タンパク質を発現させる方法であって、細胞を、請求項３３に記載のベクターと接触させることを含む、方法。
  37. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないベクターと比較して、機能的ウイルス様粒子（ＶＬＰ）産生を増加させる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないベクターと比較して、機能的ＶＬＰ産生を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約５００％、又は約１０００％増加させる、請求項３７に記載の方法。
  39. 対象において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の請求項３４又は３５に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  40. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、前記対象における中和抗体の持続時間を増加させる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、対象における中和抗体の持続時間を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１細胞応答を増加させる、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１応答を約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、又は約１０００％増加させる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記方法が、前記対象において予防的又は防御的免疫応答を誘発する、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記方法が、前記対象において治療的免疫応答を誘発する、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記投与が、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は鼻腔内投与である、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 請求項３４又は３５に記載のワクチン組成物、１つ以上のバイアル、及びそれらの使用説明書を含む、キット。
  48. ５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第３のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
  49. ５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第１のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｓタンパク質が、配列番号１３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、第２のタンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチドであって、前記ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
  50. ５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記変異したＳタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、及びエンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
  51. ５’から３’の順序で、以下の要素：プロモーター、ウイルスパッケージングシグナルをコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｍタンパク質が、配列番号３３又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｎタンパク質が、配列番号２０又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、変異したＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｓタンパク質が、配列番号５１若しくは配列番号５２、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、タンパク質分解切断部位をコードするポリヌクレオチド、Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｅタンパク質が、配列番号２２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、ＩＲＥＳ配列をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＩＲＥＳ配列が、配列番号２４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、エンハンサーＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｌタンパク質が、配列番号２又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド、及びウイルスパッケージングシグナルをコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記ウイルスパッケージングシグナルが、配列番号３４又はそれと少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含む、発現カセットを含む、ワクチンとして使用するためのベクター。
  52. 請求項４８～５１のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントとを含む、ワクチン組成物。
  53. 対象において免疫応答を誘発する方法であって、有効量の請求項５２に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  54. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、前記対象における中和抗体の持続時間を増加させる、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、対象における中和抗体の持続時間を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させる、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１細胞応答を増加させる、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記エンハンサータンパク質の包含が、エンハンサータンパク質を含まないワクチン組成物と比較して、Ｔｈ１応答を約２５％、約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、又は約１０００％増加させる、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記方法が、前記対象において予防的、防御的、及び／又は治療的免疫応答を誘発する、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記投与が、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は鼻腔内投与である、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。
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