KR20230025020A - 인간 시토메갈로바이러스 gB 폴리펩티드 - Google Patents

인간 시토메갈로바이러스 gB 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야생형 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV) 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 및 시토메갈로바이러스 (CMV) 항원에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 gB 융합후 입체형태에 대해 대안적인 입체형태로 안정화된다. 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도가 또한 개시된다.

Description

인간 시토메갈로바이러스 gB 폴리펩티드
관련 출원
본 출원은 2020년 6월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 63/041,945 및 2021년 6월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/208,457을 우선권 주장한다. 각각의 상기 출원의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자 출원되고, .txt 포맷의 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2021년 6월 7일에 생성되고 1,427 KB의 크기를 갖는 "PC72639_June2021_ST25.txt"이라는 명칭의 서열 목록을 함유한다. 이러한 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV) 조성물 및 그의 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
인간 시토메갈로바이러스 (HCMV)는 β-헤르페스바이러스 패밀리의 이중 가닥 DNA 바이러스이다. HCMV는 임신한 여성에서의 감염 또는 잠재성 바이러스의 재활성화 후의 수직 바이러스 전달로부터 초래되는 선천성 및 신생아 청력 상실의 주요 원인이다. 또한, HCMV는 면역억제된 환자, 예컨대 실질 기관 및 줄기 세포 이식 환자, AIDS 환자 등에 영향을 미치는 흔한 기회 병원체이다. HCMV에 대한 백신의 개발이 의학 연구소(Institute of Medicine)에 의해 최상위 우선순위로서 열거되었지만, 지금까지 허가된 것은 없다.
HCMV 게놈은 여러 외피 당단백질을 코딩하며, 그 중 하나는 당단백질 B (gB)이다. 당단백질 B는 세포 내로의 바이러스 진입에 필요한 푸소겐이고, 감염에 대한 중화 항체 (nAb) 반응을 위한 중요한 표적이다. gB 서브유닛 항원을 합체시킨 HCMV 백신이 개발 중에 있다. 임상 연구는 일부 gB 서브유닛-기반 백신 후보가 안전하고 면역원성이지만, 보호 효능 및 보호 지속성의 개선이 요구된다는 것을 제시하였다.
따라서, HCMV 감염으로부터 보호하는 안전하고 효과적인 면역원성 조성물이 필요하다. HCMV에 대한 면역 반응을 검출하고, gB-기반 HCMV 백신의 설계를 안내하고, HCMV에 대한 치료적 또는 예방적 항체의 개발을 지지하는 진단 시약이 또한 필요하다.
발명의 개요
이들 및 다른 요구를 충족시키기 위해, 한 측면에서, 본 발명은 HCMV에 대한 면역 반응을 도출하기 위한 항원으로서 면역원성 조성물에 포함될 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 야생형 시토메갈로바이러스 (CMV) 당단백질 B (gB) 단백질의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체를 제공한다:
(1) 조작된 디술피드 결합 돌연변이;
(2) 추가의 돌연변이; 및
(3) 적어도 1개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합.
한 측면에서, 아미노산 돌연변이는 적어도 2개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합을 포함한다. 또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체는 삼량체의 형태이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 조작된 디술피드 돌연변이는 D217C 및 Y589C; M371C 및 W506C; 및 N524C 및 M684C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가 측면에서, 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
(2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
(3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환;
(4) 위치 655에서의 P의 S로의 치환;
(5) 위치 678에서의 F의 S로의 치환; 및
(6) 위치 680에서의 L의 T로의 치환;
(7) 위치 685에서의 R의 A로의 치환;
(8) 위치 648-653에서의 MIALDI의 GSGKDG로의 치환;
(9) 위치 693에서의 R의 V로의 치환;
(10) 위치 675에서의 I의 S로의 치환;
(11) 위치 767 및 768에서의 I의 C로의 치환;
(12) 위치 703에서의 D 및 위치 704에서의 P의 C로의 치환; 및
(13) 위치 696에서의 Y 및 위치 697에서의 V의 C로의 치환.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 분비된 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 가용성이다.
본 발명은 또한 (i) 본원에 기재된 실시양태 및 측면에 따른 CMV gB 단백질 돌연변이체 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 제약 조성물은 백신이다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 HCMV gB 융합후 입체형태가 아닌 입체형태를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HCMV gB 융합전-특이적 항체에 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비스(아릴)티오우레아 화합물에 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1A의 구조 좌표, 즉, pdb 파일, "표 1A-prefusion_gB_121918pdb" (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩될 때 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1B의 구조 좌표, 즉, pdb 파일, "표1B-refine_apply_ncs_14pdb" (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩될 때 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 시스테인 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 디술피드 결합이 형성되도록 하는 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 정전기적 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 페닐알라닌 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 류신 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 돌연변이는 폴리펩티드의 융합전 입체형태를 안정화시키고, 폴리펩티드는 HCMV gB 융합전-특이적 항체에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1과 비교하여 표 2의 (ii) 열에 열거된 아미노산 위치 중 어느 하나에서 시스테인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1과 비교하여 표 3의 (ii) 열에 열거된 아미노산 위치 중 어느 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Q98C 및 I653C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T100C 및 S269C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 D217C 및 F584C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Y242C 및 K710C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Y242C 및 D714C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 S367C 및 L499C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T372C 및 W506C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 S550C 및 D652C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T608C 및 D679C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 K695C 및 K724C를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1-43 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기 위치: R562, P577, S587, Y588, G592, G595, L601/H605, C610, L612, P613, Y625, Y627, F632, 및 K633 중 어느 하나에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 HCMV gB의 세포질 꼬리를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 막횡단 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 HCMV gB의 세포질 꼬리를 포함하며, 막횡단 영역을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화의 곤충 세포 패턴을 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합후 입체형태에서 천연 gB와 비교하여 개선된 용해도 또는 안정성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 면역원성이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자기-복제성 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 변형된 RNA 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하고, CMV 항원을 추가로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하기 폴리펩티드: gO, gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 희석제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아주반트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역원성이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시토메갈로바이러스에 대한 면역 반응을 도출하는 데 사용하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 도출하는 방법에 관한 것이다. 방법은 포유동물에게 유효량의 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 시토메갈로바이러스 바이러스 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 포유동물에게 유효량의 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 적어도 1종의 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항원을 코딩한다. 본원에 개시된 항원은 야생형 (즉, 감염원으로부터 유래됨)일 수 있거나, 또는 바람직하게는 변형된 것 (예를 들어, 조작된 것, 설계된 것 또는 인공인 것)일 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자, 구체적으로 폴리뉴클레오티드는, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 관심 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 항원 또는 항원 분자로서 작용할 수 있다. 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물을 포함한다. 이들 중합체는 "폴리뉴클레오티드"로 지칭된다. 본 발명의 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한 리보핵산 (RNA), 및 데옥시리보핵산 (DNA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 번역시에 적절한 단백질 입체형태를 생성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 hCMV gB 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2종 이상의 추가의 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2종 이상의 추가의 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 2종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 1종 이상의 추가의 폴리펩티드는 단일 폴리뉴클레오티드 상에서 코딩될 수 있거나, 또는 다중 (예를 들어, 2종 이상의) 폴리뉴클레오티드 상에서 개별적으로 코딩될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 추가의 폴리펩티드, 바람직하게는 HCMV 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 HCMV 항원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 폴리펩티드는 gH, gL, gB, gO, gN 및 gM 및 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 pp65이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131A, 및 그의 단편으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 추가의 폴리펩티드, 바람직하게는 HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 폴리펩티드는 HCMV gH, gL, gB, gO, gN 및 gM 및 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV pp65이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131A, 및 그의 단편으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 면역 반응을 유도하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 조성물은 포유동물에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 제제화될 수 있다.
도 1A-1B는 gB 이형태체의 2차원 (2D) 부류 평균을 기재한다. 도 1A는 융합후 gB 구조로부터의 2D 투사도를 도시한다. 항체 Fab와 결합된 융합후 gB의 전자 극저온 현미경검사 구조의 투사 영상이 제시된다. 도 1B는 2D 부류 평균을 도시한다. 융합 억제제 및 가교제로의 처리 및 항체 단편의 결합 후에 CMV 비리온으로부터 추출된 gB의 제제로부터 수득된 전자 극저온 현미경검사 영상으로부터의 2차원 부류 평균이 우측에 제시된다. 참조 융합후 gB 2차원 투사도 중 어느 것과도 유사하지 않은 부류 평균화된 영상은 원에 의해 확인된다.
도 2는 본 발명자들의 전자 극저온 현미경검사 구조로부터의 융합전 및 융합후 gB-Fab 복합체 모델에 포함된 당단백질 B 아미노산을 기재한다. 전자 극저온 현미경검사 밀도 맵에서 모델링될 수 있는 아미노산은 도메인 색 코드로 강조된다 (도메인 I (이탤릭체 단독, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 133-344; 하부 서열 (융합후) 잔기 133-344); 도메인 II (볼드체 및 밑줄표시, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 121-132 및 345-436; 하부 서열 (융합후) 잔기 121-132 및 345-439); 도메인 III (볼드체 단독, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 86-120 및 483-550; 하부 서열 (융합후) 잔기 86-120 및 474-550); 도메인 IV (이탤릭체 및 밑줄표시, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 551-641; 하부 서열 (융합후) 잔기 551-641); 도메인 V (이탤릭체 및 볼드체, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 642-724; 하부 서열 (융합후) 잔기 642-697); MPR (밑줄표시 단독, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 25-7507; 하부 서열 (융합후) 잔기 없음); TM (이탤릭체, 볼드체 및 밑줄표시, 즉 상부 서열 (융합전) 잔기 751-769; 하부 서열 (융합후) 잔기 없음)). 상부 및 하부 서열은 각각 융합전 및 융합후 구조 모델에 대한 것이다.
도 3A-3B는 밀도 맵으로의 모델의 피팅을 도시한다. 억제제 화합물 안정화된 융합전 (도 3A) 및 융합후 gB 입체형태 (도 3B)의 모델을 밝은 회색 밀도 맵에 피팅한다. gB 성분은 암회색이고, SM5-1 fab 성분은 흑색이다. 융합전 구조 내의 TM 영역의 위치에 의해 결정된 바와 같은 바이러스 외피의 대략적인 위치는 흑색 수평선에 의해 표시된다.
도 4A-4B는 2가지 입체형태의 gB의 구조의 비교를 도시한다. gB 안정화된 융합전 구조 (도 4A) 및 융합후 구조 (도 4B)는 도메인: I, II, III, IV, V, MPR 및 TM을 나타내는 하나의 프로토머와 함께 제시된다. 융합전 구조물의 상부로부터 연장되는 수직 흑색 파선은 덜 한정된 밀도 맵으로 인해 모델로부터 누락된 잔기를 나타낸다. 구조의 구축가능한 엑토도메인 부분의 전체 치수는 파선 직사각형에 의해 표시된다. 화살표는 각각의 입체형태의 도메인 III 내의 중심 3-나선 다발의 C-말단이 가리키는 방향을 나타낸다. 융합전 구조 상의 115Å 치수 (도 4A)는 엑토도메인의 모델링된 부분의 높이를 나타낸다.
도 5A-5D: 도 5A는 융합전 gB 모델에서의 융합 억제제 화합물 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드의 위치가 흑색으로 나타나 있음을 도시한다. 화합물의 화학 구조를 도 5D에 나타냈다. 도 5B: 화합물 주위의 전자 밀도의 근접도 (회색 투명 표면). 인근의 아미노산 잔기가 제시되고, 도메인이 표지된다. 도 5C: 화합물 주위의 상호작용 잔기가 제시된다.
도 6A-6C는 막 융합 동안 gB의 구조적 재배열의 모델을 도시한다. FL (및 별표) - 융합 루프. DI - 도메인 1. DII - 도메인 2. DV - 도메인 5. TM - 막횡단 영역. 밝은 청색 선은 바이러스 막을 도시한다. 선은 막을 도시한다. 도 6A (융합전)는 융합전 입체형태를 도시하고; 도 6B (연장된 중간체)는 확장된 중간 입체형태를 도시하고; 도 6C (융합후)는 융합후 입체형태를 도시한다.
도 7A-7B는 융합전 입체형태에서 gB를 안정화시키기 위한 예시적인 디술피드 결합 돌연변이를 도시한다. 디술피드 결합에 참여하는 잔기의 위치는 융합전 입체형태 (도 7A) 및 융합후 입체형태 (도 7B)의 회색 구체로서 도시된다.
도 8은 구조 생물정보학 단백질 데이터 은행에 대한 연구 협회 (RCSB PDB) 파일: 5CXF, 인간 시토메갈로바이러스로부터의, 인간 시토메갈로바이러스 (균주 AD169)로부터의 당단백질 B의 세포외 도메인의 결정 구조, 2015-07-28에 기탁됨; DOI: 10.2210/pdb5CXF/ pdb로부터의 정보를 도시한다.
단위 셀:
Figure pct00001

도 9는 임상 및 실험실-적합화된 HCMV 균주로부터의 gB의 서열 (서열식별번호: 110 - 서열식별번호: 111)을 도시한다. 추가의 서열은 문헌 [Burke et al., PLoS Pathog. 2015 Oct 20;11(10):e1005227]으로부터의 S4 도면에서 발견되는 임상 및 실험실-적합화된 HCMV로부터의 gB의 아미노산 서열 정렬에서 발견될 수 있다. 문헌 [Burke et al.]에 따라, NCBI의 RefSeq 데이터 베이스로부터 다운로드된 임상 및 실험실-적합화된 균주로부터의 60개의 HCMV gB 서열을 정렬하고, 클러스탈W2 및 ESPript 3.x를 사용하여 분석하였다. 동일한 잔기는 적색 배경 상에 백색 텍스트로 제시되고, 유사한 잔기는 버크(Burke) 등의 S4 도면에서 황색으로 강조되고, 상기 S4 도면 및 그의 설명은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 10은 서열식별번호: 1-43 및 서열식별번호: 47-106에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 11은 gB1666 및 야생형 gB (타운(Towne)) 면역화된 마우스 둘 다에서의 용량-의존성 IgG 반응을 도시한다. 그래프는 야생형 gB DNA로 면역화된 10마리 마우스 중 10마리, 및 gB1666 DNA로 면역화된 10마리 마우스 중 9마리가 검출가능한 항-gB IgG 역가를 생성하였다는 것을 보여준다. 평균 ± SD, LLOQ = 25.
도 12는 조작된 gB1666 (연회색, 구조 코드:P-GB-002)의 구조 모델이 야생형 HCMV gB (암회색, 구조 코드:P-GB-001)의 구조 모델과 중첩되어 있음을 도시한다. 새로운 구조는 분자의 막 원위 말단에서 추가의 잔기 437-448 및 478-482 및 막횡단 도메인에서 770-779의 모델링을 허용한다.
도 13은 융합전 gB를 추가로 안정화시킬 수 있는 pSB1666 배경 상의 추가의 돌연변이 조합의 예를 도시한다. M371, W506에서의 디술피드 결합은 도메인 II 및 III를 연결할 수 있다. N524, M684 및 F541, E681에서의 디술피드 결합은 도메인 IV 및 V를 연결할 수 있다. E686에서의 음으로 하전된 패치의 소수성 잔기로의 돌연변이는 융합전 입체형태에서 gB를 추가로 안정화시킬 수 있다. 각각의 도메인이 확인된다. 약어: 막 근위 영역 (MPR), 및 막횡단 도메인 (TMD).
도 14는 재조합 gB2459 단백질의 발현 및 정제를 입증하는 SDS-PAGE를 도시한다. pSB2459 발현 플라스미드를 Expi293F 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 펠릿을 형질감염 68시간 후에 수거하고, 당단백질 생성물 gB2459를 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% n-도데실 β-D-말토시드 (DDM), 0.002% 콜레스테릴 헤미-숙시네이트 (CHS) 중에서 일련의 가용화, 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피 공정을 통해 정제하였다. 본 도면은 환원 조건 하에 무염색 4-20% SDS-PAGE에 의해 분석된 정제된 단백질을 보여준다. 단백질 밴드의 스미어링은 gB2459가 고도로 글리코실화된 것과 일치한다. 레인 M: 단백질 마커; 레인 1: gB2457; 및 레인 2: gB2459.
도 15는 pSB1666 배경 상에 N524C 및 M684C 돌연변이를 함유하는 구축물 pSB2459를 도시한다. 단백질 생성물 gB2459를 임의의 융합 억제제의 존재 없이 친화성 태그를 통해 정제하였다. 2D 부류 평균화된 영상에서 관찰된 융합전 부류가 있다 (명백한 융합전 특색이 있는 2개의 부류가 숫자 1 및 2로 지시됨). 또한, 융합전 gB2459는 수일의 기간에 걸쳐 안정하다. gB2459의 샘플 용액을 4℃에서 저장하고, 샘플의 분취물을 제1일 및 제7일에 수득하여 음성 염색된 그리드를 제조하였다. 영상 데이터세트를 수집하고, 이들 2개의 그리드 상에서 처리하였다. 각각의 데이터세트에 대해, 융합전 및 융합후 2D 부류 내의 입자 집단을 계수하였다: 융합전 및 융합후 입체형태 사이의 비는 제1일에 샘플에 대해 5:1이고, 제7일에 3:1이었다.
도 16A-16D는 가용성, 세제-무함유 gB 엑토도메인의 설계를 도시한다. 도 16A는 MPR, TM 및 CT 영역이 제거된 gB 엑토도메인 (1-707)을 나타낸다. 도 16B는 도메인 V에서 추가의 시스테인 돌연변이, 예를 들어 D703C 및 P704C로 안정화된 gB 엑토도메인을 보여준다. 도 16C는 C-말단 GCN4 삼량체화 모티프에 융합된 gB 엑토도메인을 보여준다. 도 16D는 C-말단 T4 피브리틴 폴드온 도메인에 융합된 gB 엑토도메인을 보여준다. 범례: 도메인 I (잔기 134-344) - 암회색 3D 부피 구조; 도메인 II (잔기 121-133 및 345-436) - 담회색 3D 부피 구조; 도메인 III (잔기 97-111, 475-539 및 640-648) - 상부 중심 담회색 수직 코일; 도메인 V (잔기 649-707) - 하부 내부 암회색 코일 (화살표 도 16B 참조); 및 직사각형 - 삼량체화 위치.
도 17은 20 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl 중에서 슈퍼로스(Superose) 6 인크리즈 10/300에 의해 분석된 정제된 gB 엑토도메인, gB2264-gB2269의 겔-여과 프로파일을 도시한다.
도 18A - 18B는 결합된 융합 억제제가 없는 재조합 gB2555의 음성 염색 EM으로부터의 음성 염색 EM 영상 (도 18A) 및 대표적인 2D 부류 평균 (도 18B)을 도시하며, 이는 단분산 gB 단백질이 억제제 및 세제의 부재 하에 융합전 형태의 gB에 대해 보다 많은 안정화 돌연변이를 부가하기 위한 프레임워크로서 사용하기에 적합함을 보여준다.
도 19A - 19B는 결합된 융합 억제제가 없는 재조합 gB2556의 음성 염색 EM으로부터의 음성 염색 EM 영상 (도 19A) 및 대표적인 2D 부류 평균 (도 19B)을 도시하며, 이는 단분산 gB 단백질이 억제제 및 세제의 부재 하에 융합전 형태의 gB에 대해 보다 많은 안정화 돌연변이를 부가하기 위한 프레임워크로서 사용하기에 적합함을 보여준다.
도 20A - 20B는 환원 조건 하에 트리스/글리신/SDS 완충제 중 4-20% 미니-프로테안(Mini-PROTEAN)® TGX 스테인-프리(STAIN-FREE)® 단백질 겔 (바이오라드(Biorad)) 상에서 분석된 정제된 단백질 (화살표는 겔 상의 단백질을 나타냄) (도 20A); 및 전자 현미경검사에 의한 음성 염색된 단백질의 영상 (도 20B)을 도시한다.
도 21은 gB2796 및 사노피(Sanofi) gB 면역화된 마우스 둘 다에서의 gB에 대한 용량-의존성 IgG 반응을 도시한다.
도 22A - 22B는 (i) 도 22A: gB1666과 gB1764 (야생형 CMVgB) 사이의 SEC 프로파일 비교 (SEC는 완충제 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% DDM, 0.002% CHS, 3 ug/ml WAY-174865 중 슈퍼로스6 인크리즈 5/150 칼럼 상에서 실행됨); 및 (ii) 도 22B: gB1666과 gB1764 사이의 열 안정성 비교 (검정은 티코(Tycho) NT.6 상에서 20℃/분 가열 속도로 실행됨)를 도시한다.
도 23A - 23B는 (i) 도 23A: 억제제 WAY-174865의 존재 또는 부재 하의 gB1666의 SEC 프로파일 (SEC는 완충제 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% DDM, 0.002% CHS, 3 ug/ml WAY-174865 중 슈퍼로스6 인크리즈 5/150 칼럼 상에서 실행됨); 및 (ii) 도 23B: gB1666, gB1666과 억제제, 및 gB1764 사이의 열 안정성 비교 (검정은 티코 NT.6 상에서 20℃/분 가열 속도로 실행됨)를 도시한다.
도 24A - 24B는 (i) 도 24A: gB2457 및 gB2459의 SEC 프로파일 비교 (SEC는 완충제 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% DDM, 0.002% CHS 중 슈퍼로스6 인크리즈 5/150 칼럼 상에서 실행됨); 및 (ii) 도 24B: gB2457과 gB2459 사이의 열 안정성 비교 (검정은 티코 NT.6 상에서 20℃/분 가열 속도로 실행됨)를 도시한다.
도 25A - 25D는 (i) 도 25A: gB2555 및 gB2556의 SEC 프로파일 비교 (SEC는 완충제 20 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl 중 슈퍼로스6 인크리즈 5/150 칼럼 상에서 실행됨); (ii) 도 25B: gB2555와 gB2556 사이의 열 안정성 비교 (검정은 티코 NT.6 상에서 20℃/분 가열 속도로 실행됨); (iii) 도 25C: gB2555의 음으로 염색된 EM 영상으로부터 평균화된 2D 부류; 및 (iv) 도 25D: gB2556의 음으로 염색된 EM 영상으로부터 평균화된 2D 부류를 도시한다. 도 25C 및 25D에서, 융합전 gB (점감 형상)에 대한 대표적인 부류는 원으로 표시되고, 융합후 gB는 정사각형으로 표시된다.
도 26A - 26B는 (i) 도 26A: gB2796의 SEC 프로파일 비교 (SEC는 완충제 20 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl 중 슈퍼로스6 인크리즈 5/150 칼럼 상에서 실행됨); 및 도 26B: gB2796의 열 안정성 (검정은 티코 NT.6 상에서 20℃/분 가열 속도로 실행됨)을 도시한다.
서열 식별자
서열식별번호: 1은 천연 HCMV gB (균주 타운)로부터 유래된 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 2는 하기 돌연변이: Q98C, G271C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 3은 하기 돌연변이: Q98C, I653C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 4는 하기 돌연변이: G99C, A267C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 5는 하기 돌연변이: T100C, A267C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 6은 하기 돌연변이: T100C, S269C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 7은 하기 돌연변이: T100C, L651C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 8은 하기 돌연변이: D217C, F584C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 9는 하기 돌연변이: Y218C, A585C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 10은 하기 돌연변이: S219C, D654C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 11은 하기 돌연변이: N220C, D652C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 12는 하기 돌연변이: T221C, D652C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 13은 하기 돌연변이: W240C, G718C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 14는 하기 돌연변이: Y242C, K710C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 15는 하기 돌연변이: Y242C, D714C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 16은 하기 돌연변이: S269C, I653C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 17은 하기 돌연변이: G271C, P614C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 18은 하기 돌연변이: S367C, L499C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 19는 하기 돌연변이: T372C, W506C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 20은 하기 돌연변이: F541C, Q669C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 21은 하기 돌연변이: L548C, A650C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 22는 하기 돌연변이: A549C, I653C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 23은 하기 돌연변이: S550C, D652C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 24는 하기 돌연변이: G604C, F661C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 25는 하기 돌연변이: N605C, E665C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 26은 하기 돌연변이: R607C, S675C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 27은 하기 돌연변이: T608C, D679C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 28은 하기 돌연변이: E609C, F678C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 29는 하기 돌연변이: R673C, S674C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 30은 하기 돌연변이: N676C, V677C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 31은 하기 돌연변이: L680C, E681C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 32는 하기 돌연변이: I683C, M684C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 33은 하기 돌연변이: F687C, N688C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 34는 하기 돌연변이: Y690C, K691C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 35는 하기 돌연변이: K695C, K724C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 36은 하기 돌연변이: T746C, F747C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 37은 하기 돌연변이: K749C, N750C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 38은 하기 돌연변이: K670L이 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 39는 하기 돌연변이: K670F가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 40은 하기 돌연변이: R673L이 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 41은 하기 돌연변이: R673F가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 42는 하기 돌연변이: K691L이 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 43은 하기 돌연변이: K691F가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 44는 발현되었을 때 융합후 입체형태로 폴딩되는 천연 HCMV gB (AD169; PDB: 5CXF)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 45는 발현되었을 때 융합후 입체형태로 폴딩되는 HCMV gB 변이체 (gB705)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 46은 발현되었을 때 융합후 입체형태로 폴딩되는 천연 HCMV gB (메를린(Merlin) 균주)에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 47은 하기 돌연변이: M96C 및 D660C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 48은 하기 돌연변이: Q98C 및 N658C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 49는 하기 돌연변이: T100C 및 R258C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 50은 하기 돌연변이: T100C 및 L656C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 51은 하기 돌연변이: T100C 및 N658C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 52는 하기 돌연변이: I117C 및 T406C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 53은 하기 돌연변이: I117C 및 S407C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 54는 하기 돌연변이: Y153C 및 L712C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 55는 하기 돌연변이: L162C 및 M716C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 56은 하기 돌연변이: D217C 및 S587C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 57은 하기 돌연변이: D217C 및 Y589C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 58은 하기 돌연변이: S219C 및 F584C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 59는 하기 돌연변이: S219C 및 A585C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 60은 하기 돌연변이: S219C 및 N586C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 61은 하기 돌연변이: N220C 및 T659C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 62는 하기 돌연변이: S223C 및 T659C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 63은 하기 돌연변이: W240C 및 A732A가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 64는 하기 돌연변이: W240C 및 G735C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 65는 하기 돌연변이: Y242C 및 V728C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 66은 하기 돌연변이: Y242C 및 G731C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 67은 하기 돌연변이: R258C 및 L656C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 68은 하기 돌연변이: S269C 및 L656C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 69는 하기 돌연변이: S269C 및 N658C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 70은 하기 돌연변이: D272C 및 P614C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 71은 하기 돌연변이: V273C 및 V629C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 72는 하기 돌연변이: W349C 및 A650C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 73은 하기 돌연변이: S367C 및 A500C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 74는 하기 돌연변이: S367C 및 A503C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 75는 하기 돌연변이: K370C 및 Q501C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 76은 하기 돌연변이: K522C 및 I683C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 77은 하기 돌연변이: I523C 및 I683C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 78은 하기 돌연변이: I523C 및 M684C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 79는 하기 돌연변이: N524C 및 M684C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 80은 하기 돌연변이: P525C 및 E681C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 81은 하기 돌연변이: R540C 및 L680C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 82는 하기 돌연변이: F541C 및 L680C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 83은 하기 돌연변이: L548C 및 P655C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 84는 하기 돌연변이: A549C 및 N658C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 85는 하기 돌연변이: S550C 및 P655C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 86은 하기 돌연변이: S550C 및 E657C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 87은 하기 돌연변이: Q591C 및 S668C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 88은 하기 돌연변이: L603C 및 Y667C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 89는 하기 돌연변이: G604C 및 L672C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 90은 하기 돌연변이: R607C 및 N688C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 91은 하기 돌연변이: T608C 및 Q692C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 92는 하기 돌연변이: E609C 및 K691C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 93은 하기 돌연변이: E610C 및 S674C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 94는 하기 돌연변이: E610C 및 S675C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 95는 하기 돌연변이: Q612C 및 V663C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 96은 하기 돌연변이: V737C 및 F755C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 97은 하기 돌연변이: V741C 및 A754C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 98은 하기 돌연변이: V741C 및 F755C가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 99는 하기 돌연변이: D679S가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 100은 하기 돌연변이: D679N이 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 101은 하기 돌연변이: E682S가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 102는 하기 돌연변이: E682Q가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 103은 하기 돌연변이: E686S가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 104는 하기 돌연변이: E686Q가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 105는 하기 돌연변이: N118P가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 106은 하기 돌연변이: D646P가 포함된 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 107은 도 8로부터의 >5CXF:A|PDBID|쇄|서열에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 108은 도 8로부터의 >5CXF:B|PDBID|쇄|서열에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 109는 도 8로부터의 >5CXF:C|PDBID|쇄|서열에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 110은 HAN13 gi|242345614|gb|GQ221973.1|:81988-84705 인간 헤르페스바이러스 5 균주 HAN13, 완전 게놈 역 상보체로부터의 gB 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시하며, 이는 도 9에 대한 설명에서 언급된다.
서열식별번호: 111은 VR1814 gi|270355759|gb|GU179289.1|:81925-84642 인간 헤르페스바이러스 5 균주 VR1814, 완전 게놈 역 상보체로부터의 gB 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시하며, 이는 도 9에 대한 설명에서 언급된다.
서열식별번호: 112-140은 도 9에 기재된 다양한 CMV gB 균주로부터의 gB 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 141 - 서열식별번호: 210은 HCMV로부터 유래하는 폴리펩티드, 예컨대 예를 들어 gH, gL, UL128, UL130, UL131, gB 또는 pp65를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 211 - 서열식별번호: 223은 HCMV로부터 유래하는 폴리펩티드, 예컨대 예를 들어 gH, gL, UL128, UL130, UL131, gB 또는 pp65에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 224는 HCMV로부터 유래하는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 225 - 서열식별번호: 254는 HCMV로부터 유래하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열식별번호: 255는 하기 돌연변이: D217C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907인 CMV gB1666의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 256은 하기 돌연변이: D217C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907을 코딩하는 CMV gB1666의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 257은 하기 돌연변이: D217C, M371C, W506C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907인 CMV gB2457 (융합전, 전장)의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 258은 하기 돌연변이: D217C, M371C, W506C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907을 코딩하는 CMV gB2457 (융합전, 전장)의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 259는 하기 돌연변이: D217C, N524C, Y589C, M684C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907인 CMV gB2459 (융합전, 전장)의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 260은 하기 돌연변이: D217C, N524C, Y589C, M684C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V907을 코딩하는 CMV gB2459 (융합전, 전장)의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 261은 하기 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, M371C, C246S, W506C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V702인 CMV gB2555 (융합전, 삼량체화 도메인 (GCN4 CC tri2) 포함)의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 262는 하기 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, M371C, C246S, W506C, Y589C, 및 I675S를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V702를 코딩하는 CMV gB2555 (융합전, 삼량체화 도메인 (GCN4 CC tri2) 포함)의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 263은 YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, C246S, N524C, Y589C, I675S, 및 M684C로의 돌연변이를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V702인 CMV gB2556 (융합전, 삼량체화 도메인 (GCN4 CC tri2) 포함)의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 264는 하기 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, C246S, N524C, Y589C, I675S, 및 M684C를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 V702를 코딩하는 CMV gB2556 (융합전, 삼량체화 도메인 (GCN4 CC tri2) 포함)의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 265는 하기 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, C246S, M371C, W506C 및 Y589C를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 잔기 V23 내지 D646인 CMV gB2796 (융합전, 엑토도메인)의 아미노산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)은 포함하지 않는다.
서열식별번호: 266은 하기 아미노산 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, C246S, M371C, W506C, 및 Y589C를 갖는 서열식별번호: 1 (타운)의 아미노산 V23 내지 D646을 코딩하는 CMV gB2796 (융합전, 엑토도메인)의 핵산 서열을 제시한다. 신호 서열 (서열식별번호: 1의 잔기 M1-A22)을 코딩하는 뉴클레오티드는 포함하지 않는다.
서열식별번호: 267은 서열식별번호: 1의 V23 내지 P707 (타운 균주)인 CMV gB 엑토도메인을 제시한다.
서열식별번호: 268은 wt HCMV gB (타운)의 신호 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 269는 GCN4 CC tri2 삼량체화 도메인의 아미노산 서열을 제시한다 (표 9 참조).
서열식별번호: 270은 GCN4 CC tri2 삼량체화 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 271은 T4 피브리틴 폴드온 도메인의 아미노산 서열을 제시한다 (표 9 참조).
서열식별번호: 272 - 273은 다양한 GCN4 삼량체화 도메인의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호: 274는 표 9에 기재된 C-말단 융합 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
상세한 설명
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 융합후 입체형태와 상이하고 본 발명자들이 융합전 입체형태로 지칭하는 입체형태의 HCMV 당단백질 B (gB) 폴리펩티드의 3차원 구조를 밝혔다. 융합전 입체형태의 폴리펩티드를 안정화시키는 돌연변이가 또한 발견되었다. 상기 구조를 사용하여 선행 HCMV gB-기반 면역원으로 달성된 것에 비해 더 큰 HCMV 중화 항체 반응을 생성할 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드, 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 다른 용도들 보다도, 예를 들어 HCMV에 대한 백신에서의 잠재적 면역원으로서, 그리고 진단 도구로서 사용될 수 있다.
본 발명자들은 특히 융합전 입체형태에서 안정화된 gB 항원의 생산 및 후속 정제를 크게 용이하게 하고/거나; 융합전 입체형태에서 gB 폴리펩티드의 생산 효율을 유의하게 개선시키고/거나; 야생형 gB 폴리펩티드와 비교하여 gB 폴리펩티드의 항원성을 변경시키고/거나; 융합전 gB에 대한 집중 면역 반응을 용이하게 하고/거나; gB의 중화 에피토프의 입체 폐쇄를 감소시키고/거나 제거할 수 있는, 시토메갈로바이러스 (CMV) gB 폴리펩티드에 도입될 수 있는 돌연변이를 추가로 발견하였다.
정의
본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 단수뿐만 아니라 복수 둘 다를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "항원"은 단일 또는 복수의 항원을 포함하고, 어구 "적어도 하나의 항원"과 동등한 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "추가의 돌연변이"는 천연 HCMV gB와 비교하여, 정전기적 돌연변이를 도입하고, 공동을 채우고, 잔기의 패킹을 변경하고, N-연결된 글리코실화 부위를 도입하고, 프로토머간 디술피드 결합을 도입하는 아미노산 치환, 및 그의 조합 (그의 보존적 치환 포함)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "추가의 돌연변이"의 예는 본 설명 전반에 걸쳐 발견될 수 있지만, 가장 구체적으로 표 3 및 4 및 실시예에 제시된다.
용어 "아주반트"는 면역원 또는 면역원성 조성물, 예컨대 백신 (그 자체로는 면역원성이 아님)에 대한 신체의 면역 반응을 증진, 가속 또는 연장시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 아주반트는 면역원성 조성물, 예컨대 백신에 포함될 수 있거나, 또는 면역원성 조성물과 별도로 투여될 수 있다.
용어 "투여"는 선택된 경로에 의한 대상체 내로의 물질 또는 조성물의 도입을 지칭한다. 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 예를 들어, 선택된 경로가 근육내인 경우에, 조성물 (예컨대 개시된 면역원을 포함하는 조성물)은 조성물을 대상체의 근육 내로 도입함으로써 투여된다.
용어 "항원"은 항체에 의해 인식될 수 있는 분자를 지칭한다. 항원의 예는 폴리펩티드, 펩티드, 지질, 폴리사카라이드, 및 항원 결정기, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 핵산을 포함한다.
용어 "보존적 치환"은 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 아미노산 치환은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 하기 6개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
용어 참조 폴리뉴클레오티드의 "축중성 변이체"는 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하지만 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것과 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 20개의 천연 아미노산이 있으며, 이들 대부분은 1개 초과의 코돈에 의해 특정된다. 예를 들어, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 단백질 코딩 서열 내에 명시된 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 단백질을 변경시키지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 유전자 코드의 축중성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 폴리펩티드를 코딩한다.
용어 "유효량"은 목적하는 반응을 생성하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 이는 바이러스 복제를 억제하거나 또는 바이러스 감염의 외부 증상을 측정가능하게 변경시키는 데 필요한 양일 수 있다.
용어 "에피토프" (또는 "항원 결정기" 또는 "항원 부위")는 항체, B 세포 수용체 또는 T 세포 수용체가 결합하거나 반응하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산 또는 단백질의 2차, 3차 또는 4차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시 유지되는 반면, 보다 고차의 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로의 처리 시 상실된다.
용어 "대상체"는 인간 또는 비-인간 포유동물을 지칭한다. 용어 "포유동물"은 포유동물 부류의 임의의 동물 종을 지칭한다. 포유동물의 예는 인간; 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이; 실험 동물, 예컨대 래트, 마우스, 기니 피그; 가축, 예컨대 고양이, 개, 토끼, 소, 양, 염소, 말 및 돼지; 및 포획 야생 동물, 예컨대 사자, 호랑이, 코끼리 등을 포함한다.
용어 "당단백질"은 폴리펩티드 측쇄에 공유 부착된 올리고사카라이드 쇄 (글리칸)를 함유하는 단백질을 지칭한다. 탄수화물은 글리코실화로 공지된 공동번역 또는 번역후 변형으로 단백질에 부착된다. 용어 "글리코실화 부위"는 글리칸의 부착을 수용하는 폴리펩티드, 예컨대 단백질의 표면 상의 아미노산 서열을 지칭한다. N-연결된 글리코실화 부위는 NX(S/T)의 삼중체 서열이며, 여기서 N은 아스파라긴이고, X는 프롤린을 제외한 임의의 잔기이고, (S/T)는 세린 또는 트레오닌 잔기이다. 글리칸은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드이다. 글리칸은 또한 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 벡터가 증식되고 그의 DNA 또는 RNA가 발현될 수 있는 세포를 지칭한다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬될 때 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일단 정렬되면, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 내에 존재하는 위치의 개수를 카운팅함으로써 매칭물의 개수가 결정된다. 퍼센트 서열 동일성은 매치의 수를 확인된 서열에 제시된 서열의 길이로, 또는 분절된 길이 (예컨대 확인된 서열에 제시된 서열로부터의 100개의 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기)로 나눈 후, 생성된 값에 100을 곱함으로써 결정된다. 예를 들어, 1554개의 아미노산을 갖는 시험 서열과 정렬될 때 1166개의 매치를 갖는 펩티드 서열은 시험 서열과 75.0 퍼센트 동일하다 (1166÷1554*100=75.0).
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) 및 Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, through supplement 104, 2013)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
용어 "면역원"은 하기 본원에 정의된 바와 같은 면역원성인 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다.
용어 "면역원성"은 아주반트의 존재 또는 부재 하에 대상체에서 특정한 항원에 대한 면역 반응을 유발, 도출, 자극 또는 유도하는 물질의 능력을 지칭한다.
용어 "면역 반응"은 선천성 면역 반응 (예를 들어, 톨 수용체 신호전달 캐스케이드의 활성화), 세포-매개 면역 반응 (예를 들어, T 세포, 예컨대 항원-특이적 T 세포, 및 면역계의 비-특이적 세포에 의해 매개되는 반응), 및 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 세포에 의해 매개되는 반응, 예컨대 혈장, 림프 및/또는 조직 유체 내로의 항체의 생성 및 분비)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 자극 (예컨대 면역원)에 대한 숙주 포유동물의 면역계의 세포 또는 세포들의 임의의 검출가능한 반응을 지칭한다. 면역 반응의 예는 톨-유사 수용체 활성화, 림포카인 (예를 들어, 시토카인 (예를 들어, Th1, Th2 또는 Th17 유형 시토카인) 또는 케모카인) 발현 또는 분비의 변경 (예를 들어, 증가), 대식세포 활성화, 수지상 세포 활성화, T 세포 (예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포) 활성화, NK 세포 활성화, B 세포 활성화 (예를 들어, 항체 생성 및/또는 분비), MHC 분자에 대한 면역원 (예를 들어, 항원 (예를 들어, 면역원성 폴리펩티드))의 결합, 세포독성 T 림프구 ("CTL") 반응의 유도, B 세포 반응 (예를 들어, 항체 생산)의 유도, 및 면역계의 세포 (예를 들어, T 세포 및 B 세포)의 확장 (예를 들어, 세포 집단의 성장), 및 항원 제시 세포에 의한 항원의 증가된 프로세싱 및 제시를 포함한다. 용어 "면역 반응"은 또한 시험관내에서 척추 동물의 면역계의 1개 이상의 구성요소에 의한 특정한 물질 (예컨대 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출가능한 반응을 포괄한다.
용어 "면역원성 조성물"은 면역원을 포함하는 조성물을 지칭한다.
용어 "돌연변이"는 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 지칭한다. 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단백질 서열 내의 하나의 특정한 위치에서의 아미노산의 치환은 표기 "(야생형 단백질 내의 아미노산 잔기)(아미노산 위치)(조작된 단백질 내의 아미노산 잔기)"를 사용하여 지칭된다. 예를 들어, 표기법 Y75A는 (참조 단백질의 돌연변이체에서) 참조 단백질의 아미노산 서열의 제75 위치에서의 티로신 (Y) 잔기의 알라닌 (A) 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 상이한 야생형 서열 중에서 동일한 위치의 아미노산 잔기에 변이가 존재하는 경우에, 위치 번호 앞의 아미노산 코드는 표기법에서, "75A"와 같이 생략될 수 있다.
용어 "천연" 또는 "야생형" 단백질, 서열 또는 폴리펩티드는 선택적 돌연변이에 의해 인공적으로 변형되지 않은 자연적으로 존재하는 단백질, 서열 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 활성 성분과 조합되는 경우에 활성 성분과 상용성이고 대상체, 특히 포유동물에게 투여되는 경우에 독성 또는 달리 원치 않는 반응을 유발하지 않는 물질 또는 조성물을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체의 예는 용매, 계면활성제, 현탁화제, 완충제, 윤활제, 유화제, 흡수제, 분산 매질, 코팅 및 안정화제를 포함한다.
용어 "융합전-특이적 항체"는 융합전 입체형태에서는 CMV gB 당단백질에 특이적으로 결합하지만 융합후 입체형태에서는 CMV gB 단백질에 결합하지 않는 항체를 지칭한다.
용어 "융합전 삼량체-특이적 항체"는 융합전 삼량체 입체형태에서 CMV gB 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 융합후 입체형태 또는 또한 삼량체가 아닌 융합전 입체형태에서는 CMV gB 단백질에 결합하지 않는 항체를 지칭한다. "융합전 삼량체-특이적 항체"는 "융합전-특이적 항체"의 하위세트이다.
용어 "프라임-부스트 백신접종"은 대상체에게 제1 면역원성 조성물 (프라이머 백신)을 투여한 후 제2 면역원성 조성물 (부스터 백신)을 투여하여 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는 면역요법 요법을 지칭한다. 프라이머 백신 및 부스터 백신은 전형적으로 동일한 면역원을 함유하고, 동일하거나 유사한 포맷으로 제시된다. 그러나, 이들은 또한 상이한 포맷, 예를 들어 하나는 벡터의 형태이고 다른 것은 네이키드 DNA 플라스미드의 형태로 제시될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 프라이머 백신 및 부스터 백신의 투여 사이의 적합한 시간 간격을 이해할 것이다. 추가로, 프라이머 백신, 부스터 백신, 또는 프라이머 백신 및 부스터 백신 둘 다는 아주반트를 추가로 포함한다.
용어 "가용성 단백질"은 수성 액체에 용해될 수 있고 용해된 채로 남아있는 단백질을 지칭한다. 단백질의 용해도는 수계 액체 중 단백질의 농도, 액체의 완충 조건, 액체 중 다른 용질의 농도, 예를 들어 염 및 단백질 농도, 및 액체의 온도에 따라 변할 수 있다.
주어진 표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여 용어 "특이적으로 결합한다"는 항체가 표적 분자와, 다른 시험된 물질과의 그의 결합보다 더 높은 친화도로 결합하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 융합전 입체형태의 CMV gB 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 융합후 입체형태의 CMV gB 단백질에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 융합전 입체형태의 CMV gB 단백질에 결합하는 항체이다.
용어 "치료 유효량"은 장애의 증상 및/또는 기저 원인을 예방, 치료 (예방 포함), 감소 및/또는 개선하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다.
용어 "백신"은 대상체에서 예방적 또는 치료적 면역 반응을 도출할 수 있는 면역원을 포함하는 제약 조성물을 지칭한다. 전형적으로, 백신은 병원체, 예를 들어 바이러스 병원체의 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 도출한다.
용어 "벡터"는 외래 핵산 분자를 수송 또는 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 발현 벡터 및 전사 벡터 둘 다를 포괄한다. 용어 "발현 벡터"는 표적 세포에서 삽입물을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하고, 일반적으로 삽입물의 발현을 유도하는 제어 서열, 예컨대 인핸서, 프로모터 및 종결인자 서열을 함유한다. 용어 "전사 벡터"는 전사될 수 있지만 번역되지는 않는 벡터를 지칭한다. 전사 벡터를 사용하여 그의 삽입물을 증폭시킨다. 외래 핵산 분자는 "삽입물" 또는 "트랜스진"으로 지칭된다. 벡터는 일반적으로 삽입물 및 벡터의 백본으로서의 역할을 하는 보다 큰 서열로 이루어진다. 벡터의 구조 또는 기원에 기초하여, 벡터의 주요 유형은 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 및 인공 염색체를 포함한다.
천연 HCMV gB
천연 HCMV gB는 N- 및 O-연결 부위에서의 글리코실화 및 편재성 세포 엔도프로테아제에 의한 아미노- 및 카르복시-말단 단편으로의 절단을 포함한 광범위한 번역후 변형을 겪은 906 또는 907개 아미노산 폴리펩티드 (CMV의 균주에 따름)로서 합성된다. gB, gp116 및 gp55의 N- 및 C-말단 단편은 각각 디술피드 결합에 의해 공유 연결되고, 성숙한 글리코실화된 gB는 삼량체 배위를 취한다. gB 폴리펩티드는 큰 엑토도메인 (이는 gp116 및 gp55의 엑토도메인으로 절단됨), 막횡단 도메인 (TM), 및 바이러스내 (또는 세포질) 도메인 (세포도메인)을 함유한다.
다양한 균주로부터의 천연 HCMV gB가 공지되어 있다. 예를 들어, 임상 및 실험실-적합화된 균주로부터의 적어도 60개의 HCMV gB 서열은 문헌 [Burke et al., "Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B." PLoS Pathog. 2015 Oct 20;11(10):e1005227, S4 도면 참조]에 기재된 바와 같이 NCBI의 RefSeq 데이터베이스로부터 이용가능하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 본원에 사용된 용어 "CMV gB" 폴리펩티드 또는 "HCMV gB" 폴리펩티드는 임의의 인간 HCMV 균주 (타운 균주에 제한되지 않음) 유래의 천연 HCMV gB 폴리펩티드로 이해되어야 한다. 실제 잔기 위치 번호는 실제 서열 정렬에 따라 다른 인간 CMV 균주로부터의 gB에 대해 조정이 필요할 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 한 균주에서 또 다른 균주로의 상응하는 잔기 위치를 확인하기 위해 상이한 균주로부터의 서열을 정렬하는 방법을 이해할 것이다.
HCMV gB는 HCMV 게놈의 UL55 유전자에 의해 코딩된다. 이는 HCMV 바이러스 막과 숙주 세포 막의 융합을 매개하는 외피 당단백질이다. 단백질은 융합전 형태로부터 융합후 형태로의 일련의 입체형태적 변화를 겪는다. 융합후 형태의 gB의 결정 구조가 이용가능하고 (PDB 수탁 코드 5CXF), 융합전 입체형태가 본원에 제시된다.
입체형태
HCMV gB 융합후 입체형태는 숙주 세포 막과 바이러스 외피의 융합에 후속하여 HCMV gB에 의해 채택되는 구조적 입체형태를 지칭한다. 천연 HCMV gB는 또한 예를 들어 열에 대한 노출, 막으로부터의 추출, 엑토도메인으로서의 발현 또는 저장과 같은 스트레스 조건하에서의 융합 사건의 맥락 외에서 융합후 입체형태를 취할 수 있다. 보다 구체적으로, gB 융합후 입체형태는, 예를 들어 문헌 [Burke et al., Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B. PLoS Pathog. 2015 Oct 20;11(10): e1005227]에 기재되어 있다. 또한, 구조 생물정보학 단백질 데이터 은행에 대한 연구 협회 (RCSB PDB): 5CXF, 인간 시토메갈로바이러스로부터의, 인간 시토메갈로바이러스 (균주 AD169)로부터의 당단백질 B의 세포외 도메인의 결정 구조, 2015-07-28에 기탁됨; DOI: 10.2210/pdb5CXF/pdb; 및 문헌 [Burke et al., PLoS Pathog. 2015 Oct 20;11(10):e1005227]을 참조한다. 발현될 때 융합후 입체형태로 폴딩될 수 있는 단백질의 서열은 서열식별번호: 44로서 제공된다. 발현될 때 융합후 입체형태로 폴딩되는 단백질의 또 다른 예는 서열식별번호: 45로서 제공된다. 융합후 입체형태는 약 165Å 높이 및 65Å 폭이다.
본원에 사용된 "융합전 입체형태"는 적어도 분자 치수 또는 3차원 좌표의 관점에서 HCMV gB 융합후 입체형태와 상이한, 폴리펩티드에 의해 채택된 구조적 입체형태를 지칭한다. 융합전 입체형태는 gB의 융합후 입체형태로의 전이로 이어지는 융합생성 사건의 촉발 전에 HCMV gB에 의해 채택된 구조적 입체형태를 지칭한다. HCMV gB를 안정한 융합전 입체형태로 단리하는 것은 시토메갈로바이러스 감염의 중요한 공중 보건 문제를 해결하기 위해 개선된 백신 및 면역원성 조성물의 개발을 통지하고 지시하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합전 입체형태는 융합전-특이적 항체에 결합할 수 있는 입체형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합전 입체형태는 표 1A에 제시된 좌표를 특징으로 하는 입체형태를 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1A에 제시된 구조 좌표에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩된 경우에 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 융합전 입체형태는 표 1B에 제시된 좌표를 특징으로 하는 입체형태를 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1B에 제시된 구조 좌표에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩된 경우에 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, HCMV gB 융합전 입체형태를 갖는 폴리펩티드는 삼량체의 3중 축 상에 중심을 두고 각각의 프로토머의 잔기 L479 내지 K522를 포함하는 삼량체 나선 다발을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 3중 축 (도 4A 및 4B에서 화살표로 제시됨)을 따른 N-말단에서 C-말단으로의 다발의 방향은 삼량체의 각각의 도메인 I의 팁 근처의 융합 루프 내에 있는 각각의 프로토머의 잔기 W240에 의해 한정된 평면에 의해 교차되는 3중 축 상의 지점을 향한다. 일부 실시양태에서, 나선 다발은 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 L479와 K522 사이의 잔기를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드
본 발명은 상응하는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 아미노산 돌연변이는 야생형 HCMV gB에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 따라서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 특정의 유익한 특징, 예컨대 면역원성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상응하는 야생형 HCMV gB와 비교하여 융합전 입체형태에서 증가된 면역원성 특성 또는 개선된 안정성을 보유한다. 안정성은 융합전으로부터 융합후로의 HCMV gB 입체형태의 전이가 방해 또는 방지되는 정도를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 융합전 입체형태에서 개선된 안정성을 또한 발생시킬 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 도입된 돌연변이를 나타내는 폴리펩티드를 제공한다. HCMV gB에 도입된 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체의 아미노산 서열에서의 유일한 돌연변이는 야생형 HCMV gB 대비 아미노산 치환이다.
폴리펩티드 입체형태를 안정화시키는 몇 가지 양식은, 천연 HCMV gB와 비교하여 디술피드 결합을 도입하고, 정전기적 돌연변이를 도입하고, 공동을 채우고, 잔기의 패킹을 변경하며, N-연결된 글리코실화 부위를 도입하는 아미노산 치환, 및 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 융합후 입체형태가 아닌 입체형태를 나타내는 폴리펩티드에 관한 것이다. 즉, 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같은 융합전 입체형태를 나타내고, 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 예를 들어, 도 3B에 도시된 융합후 입체형태와 비교한 도 3A에 도시된 융합전 입체형태; 도 4B에 도시된 융합후 입체형태와 비교한 도 4A에 도시된 융합전 입체형태; 및 도 6C에 도시된 융합후 입체형태와 비교한 도 6A에 도시된 융합전 입체형태를 참조한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1A의 구조 좌표에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩된 경우에 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 1B의 구조 좌표에 의해 기재된 백본 원자 상에 중첩된 경우에 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단리되며, 즉 융합후 입체형태를 갖는 HCMV gB 폴리펩티드로부터 분리된다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 융합후 입체형태의 HCMV gB 폴리펩티드로부터 적어도 80% 단리되거나, 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.9% 단리될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 HCMV gB 융합전-특이적 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정한 입체형태의 폴리펩티드의 균질 집단은 폴리펩티드의 입체형태 상태를 변경시키지 않는 변이 (예컨대 폴리펩티드 변형 변이, 예를 들어 글리코실화 상태)를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 여러 실시양태에서, 폴리펩티드의 집단은 시간 경과에 따라 균질하게 유지된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 수용액에 용해될 때 적어도 12시간, 예컨대 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 또는 그 초과 동안 융합전 입체형태로 안정화된 폴리펩티드의 집단을 형성한다.
이론에 얽매이지는 않지만, 본원에 개시된 폴리펩티드는 HCMV gB 폴리펩티드의 안정화된 융합전 입체형태를 용이하게 하는 것으로 여겨진다. 폴리펩티드는 상응하는 천연 HCMV gB 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리펩티드가 포유동물에서 CMV에 대한 면역 반응을 도출하는 데 유용하다는 것을 이해할 것이다.
천연 HCMV gB는 HCMV 진입 당단백질 사이에서 보존되며, 모든 세포 유형으로의 진입에 요구된다. HCMV gB 서열의 실질적인 보존의 관점에서, 상이한 천연 HCMV gB 서열 사이의 아미노산 위치를 비교하여 상이한 HCMV 균주 사이의 상응하는 HCMV gB 아미노산 위치를 확인할 수 있다. 따라서, 균주에 걸친 천연 HCMV gB 서열의 보존은 HCMV gB 폴리펩티드 중 특정 위치에서의 아미노산의 비교를 위한 참조 HCMV gB 서열의 사용을 허용한다. 따라서, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 본원에 제공되는 폴리펩티드 아미노산 위치는 서열식별번호: 1에 제시된 HCMV gB 폴리펩티드의 참조 서열을 지칭한다.
그러나, 상이한 천연 HCMV gB 서열은 서열식별번호: 1과 상이한 넘버링 시스템을 가질 수 있으며, 예를 들어 타운 이외의 균주로부터 유래된 천연 HCMV gB 서열에서 서열식별번호: 1과 비교하여 부가 또는 제거된 추가의 아미노산 잔기가 존재할 수 있음을 주목해야 한다. 이에 따라, 특정 아미노산 잔기가 그의 번호로 지칭되는 경우, 상기 기재는 주어진 아미노산 서열의 시작부로부터 계수하였을 때 정확하게 그 번호지정된 위치에 위치하는 아미노산으로만 제한되는 것이 아니라, 임의의 및 모든 HCMV gB 서열에서의 등가의 또는 상응하는 아미노산 잔기가 그 잔기가 동일한 정확한 번호지정된 위치에 있지 않더라도, 예를 들어 HCMV 서열이 서열식별번호: 1보다 더 짧거나 (예를 들어, 단편) 또는 더 길거나, 또는 서열식별번호: 1과 비교하여 삽입 또는 결실을 가지더라도 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전장이며, 여기서 폴리펩티드는 성숙 전장 야생형 HCMV gB와 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단편이며, 여기서 폴리펩티드는 성숙 전장 야생형 HCMV gB로서 아미노산 잔기의 총 수 미만을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "단편" 및 "말단절단된"은 상호교환가능하다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 gB 폴리펩티드는 엑토도메인 서열만을 포함한다.
1. 시스테인 (C) 치환
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 HCMV gB와 비교하여 도입되는 시스테인 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 시스테인 치환 중 어느 하나를 포함한다. 이론 또는 메카니즘에 얽매이지는 않지만, 본원에 기재된 시스테인 치환은 HCMV gB 융합후 입체형태가 아닌 입체형태로 폴리펩티드의 안정성을 용이하게 하는 것으로 여겨진다. 도입된 시스테인 치환은 단백질 조작에 의해, 예를 들어 디술피드 결합을 형성하는 1개 이상의 치환된 시스테인 잔기를 포함시킴으로써 도입될 수 있다. 여러 실시양태에서, 시스테인의 아미노산 위치는 HCMV gB의 융합전 입체형태에서 디술피드 결합의 형성을 위해 충분히 가까운 거리 내에 있으며, 융합후 입체형태는 아니다.
디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 2개 이상의 아미노산 치환에 의해 천연 HCMV gB 서열로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 2개의 시스테인 잔기가 천연 HCMV gB 서열에 도입되어 디술피드 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합전 입체형태에서 서로 가깝고 융합후 입체형태에서 더 먼 한 쌍의 아미노산 위치에 도입된 시스테인 사이의 디술피드 결합에 의해 융합전 입체형태로 안정화된 재조합 HCMV gB를 포함한다.
천연 HCMV gB와 비교하여 예시적인 시스테인 치환은 그의 넘버링이 서열식별번호: 1의 넘버링에 기초하는 표 2에서 선택되는 임의의 돌연변이를 포함한다.
표 2. 디술피드 결합 안정화를 위한 예시적인 시스테인 쌍
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 101 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 시스테인 치환을 포함하며, 여기서 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 47, 69 또는 91 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 시스테인 치환을 포함하며, 여기서 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 101 행 중 어느 하나에 열거된 바와 같은 2개의 시스테인 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합전 입체형태를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 98 및 653 (표 2의 2 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 100 및 269 (표 2의 5 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 217 및 584 (표 2의 7 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 710 (표 2의 13 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 714 (표 2의 14 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 367 및 499 (표 2의 17 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 372 및 506 (표 2의 18 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 550 및 652 (표 2의 22 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 608 및 679 (표 2의 26 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 695 및 724 (표 2의 34 행, (ii) 열에 열거됨)에서 시스테인 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 열 (ii)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 및 101 행 중 하나 이상에 열거된 위치의 쌍 중 어느 하나에서 치환된 시스테인 잔기의 쌍 사이에 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 98 및 653 (표 2의 2 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 100 및 269 (표 2의 5 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 217 및 584 (표 2의 7 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 710 (표 2의 13 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 714 (표 2의 14 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 367 및 499 (표 2의 17 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 372 및 506 (표 2의 18 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 550 및 652 (표 2의 22 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 608 및 679 (표 2의 26 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 695 및 724 (표 2의 34 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 217 및 589 (표 2의 47 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 524 및 684 (표 2의 69 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 371 및 506 (표 2의 91 행, 열 (ii)에 열거됨)에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (iii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 행 중 하나 이상에 열거된 위치 쌍 중 어느 하나에서 시스테인 아미노산 치환에 의해 도입된 시스테인 잔기 쌍 사이에 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 디술피드 결합을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (iii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 70, 71 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 101 행 중 하나 이상에 열거된 위치 쌍 중 어느 하나에서 시스테인 아미노산 치환에 의해 도입된 시스테인 잔기 쌍 사이에 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 디술피드 결합을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 101 행 중 어느 하나에 열거된 위치 쌍 중 어느 하나에서 치환된 시스테인 잔기의 쌍 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV 융합전 입체형태를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 Q98C 및 I653C (표 2의 2 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 T100C 및 S269C (표 2의 5 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 D217C 및 F584C (표 2의 7 행, 열 (iii)에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 Y242C 및 K710C (표 2의 13 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 Y242C 및 D714C (표 2의 14 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 S367C 및 L499C (표 2의 17 행, 열 (iii)에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 T372C 및 W506C (표 2의 18 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 S550C 및 D652C (표 2의 22 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 T608C 및 D679C (표 2의 26 행, 열 (iii)에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 K695C 및 K724C (표 2의 34 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 D217C 및 Y589C (표 2의 47 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 N524C 및 M684C (표 2의 69 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 M371C 및 W506C (표 2의 91 행, (iii) 열에 열거됨)에서의 시스테인 치환을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 96 및 660에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 98 및 658에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 100 및 258에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 100 및 656에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 100 및 658에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 117 및 406에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 117 및 407에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 153 및 712에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 162 및 716에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 217 및 587에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 217 및 589에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 219 및 584에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 219 및 585에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 219 및 586에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 220 및 659에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 223 및 659에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 240 및 732에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 240 및 735에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 728에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 242 및 731에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 258 및 656에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 269 및 656에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 269 및 658에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 272 및 614에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 273 및 629에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 349 및 650에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 367 및 500에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 367 및 503에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 370 및 501에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 522 및 683에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 523 및 683에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 523 및 684에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 524 및 684에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 525 및 681에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 540 및 680에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 541 및 680에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 548 및 655에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 549 및 658에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 550 및 655에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 550 및 657에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 591 및 668에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 603 및 667에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 604 및 672에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 607 및 688에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 608 및 692에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 609 및 691에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 610 및 674에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 610 및 675에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 612 및 663에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다.바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 737 및 755에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 741 및 754에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 741 및 755에서 치환된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2에 열거된 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 6; 서열식별번호: 7; 서열식별번호: 8; 서열식별번호: 9; 서열식별번호: 10; 서열식별번호: 11; 서열식별번호: 12; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 14; 서열식별번호: 15; 서열식별번호: 16; 서열식별번호: 17; 서열식별번호: 18; 서열식별번호: 19; 서열식별번호: 20; 서열식별번호: 21; 서열식별번호: 22; 서열식별번호: 23; 서열식별번호: 24; 서열식별번호: 25; 서열식별번호: 26; 서열식별번호: 27; 서열식별번호: 28; 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34; 서열식별번호: 35; 서열식별번호: 36; 및 서열식별번호: 37로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69, 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 94, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96, 서열식별번호: 97 및 서열식별번호: 98로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 60으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 70 및 서열식별번호: 78로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 바람직하게는 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 50 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 (iv) 열에 열거된 서열식별번호 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 즉, 예시적인 폴리펩티드는 서열식별번호: 2; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 4; 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 6; 서열식별번호: 7; 서열식별번호: 8; 서열식별번호: 9; 서열식별번호: 10; 서열식별번호: 11; 서열식별번호: 12; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 14; 서열식별번호: 15; 서열식별번호: 16; 서열식별번호: 17; 서열식별번호: 18; 서열식별번호: 19; 서열식별번호: 20; 서열식별번호: 21; 서열식별번호: 22; 서열식별번호: 23; 서열식별번호: 24; 서열식별번호: 25; 서열식별번호: 26; 서열식별번호: 27; 서열식별번호: 28; 서열식별번호: 29; 서열식별번호: 30; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34; 서열식별번호: 35; 서열식별번호: 36; 및 서열식별번호: 37 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69, 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 94, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96, 서열식별번호: 97 및 서열식별번호: 98 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 6; 서열식별번호: 8; 서열식별번호: 14; 서열식별번호: 15; 서열식별번호: 18; 서열식별번호: 19; 서열식별번호: 23; 서열식별번호: 27; 및 서열식별번호: 35 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 94% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99.6% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99.7% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99.8% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 907에 대해 적어도 99.85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 94% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99.6% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99.7% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99.8% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 707에 대해 적어도 99.85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 94% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99.6% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99.7% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99.8% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 아미노산 23 내지 646에 대해 적어도 99.85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 특정 잔기 쌍이 융합전 입체형태에서 디술피드 결합을 형성하기에 충분히 가까운 거리 내에 있지만 융합후 입체형태에서는 그렇지 않도록 폴리펩티드 구조에서의 잔기의 정렬을 조정하기 위해 천연 HCMV gB 서열로부터 아미노산이 삽입 (또는 결실)될 수 있다. 여러 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 1개의 아미노산 삽입을 포함하는 것에 추가로, 표 2의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 101 행 중 하나 이상에 열거된 위치의 쌍 중 임의의 것에 위치한 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 HCMV gB와 비교하여 페닐알라닌 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 HCMV gB와 비교하여 류신 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합후 입체형태의 HCMV gB 폴리펩티드와 비교하여, 폴리펩티드의 폴딩된 구조에서 서로 근접한 잔기 사이의 이온 반발을 감소시키는 아미노산 돌연변이 (예컨대, 예를 들어 페닐알라닌 (F) 및 류신 (L) 치환)에 의해 안정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 융합후 입체형태의 HCMV gB와 비교하여, 폴리펩티드의 폴딩된 구조에서 서로 근접한 잔기들 사이의 이온성 인력을 증가시키는 아미노산 돌연변이에 의해 안정화될 수 있다.
예시적인 돌연변이는 천연 HCMV gB와 비교하여 서열식별번호: 1의 넘버링에 따라 표 3으로부터 선택되는 임의의 돌연변이를 포함한다:
표 3. 예시적인 페닐알라닌 (F) 및 류신 (L) 치환
Figure pct00007
표 4. 추가의 치환
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 치환된 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 잔기를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV gB 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV gB 융합전 입체형태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 4의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 치환된 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 잔기를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV gB 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV gB 융합전 입체형태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 670 (표 3의 1 및 2 행, (ii) 열에 열거됨)에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 673 (표 3의 3 및 4 행, (ii) 열에 열거됨)에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 691 (표 3의 5 및 6 행, (ii) 열에 열거됨)에서 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 670에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 682에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 686에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 118에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 위치 646에서 돌연변이를 포함한다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3의 (iii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 치환에 의해 도입된 정전기적 돌연변이를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K670L (표 3의 1 행, (iii) 열에 열거됨)을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K670F (표 3의 2 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 R673L (표 3의 3 행, (iii) 열에 열거됨)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 R673F (표 3의 4 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691L (표 3의 5 행, (iii) 열에 열거됨)을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 6 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 7 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 8 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 9 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 10 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 K691F (표 3의 11 행, (iii) 열에 열거됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3에 열거된 페닐알라닌 (F) 및 류신 (L) 치환 중 2개 이상의 조합을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 D679S를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 D679N을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 E682S를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 E682Q를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 E686S를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 E686Q를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 N118P를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 치환 D646P를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3에 열거된 페닐알라닌 (F) 및 류신 (L) 치환 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 38; 서열식별번호: 39; 서열식별번호: 40; 서열식별번호: 41; 서열식별번호: 42; 및 서열식별번호: 43으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 99; 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 106으로부터 선택된 임의의 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3의 (iv) 열에 열거된 서열식별번호 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 즉, 예시적인 폴리펩티드는 서열식별번호: 38; 서열식별번호: 39; 서열식별번호: 40; 서열식별번호: 41; 서열식별번호: 42; 및 서열식별번호: 43 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 99; 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 106 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 4의 (iii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 어느 하나에서 치환된 1개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 잔기를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV gB 융합후 입체형태를 나타내지 않는다. 한 실시양태에서, 생성된 폴리펩티드는 HCMV gB 융합전 입체형태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 특정 잔기 쌍이 융합전 입체형태에서 원하는 정전기적 상호작용을 형성하기에 충분히 가까운 거리 내에 있지만 융합후 입체형태에서는 그렇지 않도록 폴리펩티드 구조에서의 잔기의 정렬을 조정하기 위해 천연 HCMV gB 서열로부터 아미노산이 삽입 (또는 결실)될 수 있다. 여러 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 3의 (ii) 열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 행 중 하나 이상에 열거된 위치 중 임의의 것에서 목적하는 정전기적 상호작용을 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 HCMV 융합후 입체형태를 나타내지 않는다.
본 발명은 야생형 시토메갈로바이러스 (CMV) 당단백질 B (gB) 단백질의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체를 제공한다:
(1) 조작된 디술피드 결합 돌연변이;
(2) 추가의 돌연변이; 및
(3) 적어도 1개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합.
한 측면에서, 아미노산 돌연변이는 적어도 2개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합을 포함한다. 또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체는 삼량체의 형태이다.
또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체는 상응하는 야생형 CMV gB 단백질과 비교하여 융합전 형태에서 증가된 안정성을 가지며, 여기서 안정성은 융합전-특이적 항체의 결합, 열 이동 검정 또는 EM 영상화에 의해 측정된다.
또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB의 돌연변이체는 타운 균주이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 조작된 디술피드 돌연변이는 D217C 및 Y589C; M371C 및 W506C; 및 N524C 및 M684C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가 측면에서, 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
(2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
(3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환;
(4) 위치 655에서의 P의 S로의 치환;
(5) 위치 678에서의 F의 S로의 치환; 및
(6) 위치 680에서의 L의 T로의 치환;
(7) 위치 685에서의 R의 A로의 치환;
(8) 위치 648-653에서의 MIALDI의 GSGKDG로의 치환;
(9) 위치 693에서의 R의 V로의 치환;
(10) 위치 675에서의 I의 S로의 치환;
(11) 위치 767 및 768에서의 I의 C로의 치환;
(12) 위치 703에서의 D 및 위치 704에서의 P의 C로의 치환; 및
(13) 위치 696에서의 Y 및 위치 697에서의 V의 C로의 치환.
본 발명의 또 다른 측면에서, 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
(2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
(3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환; 및
(4) 위치 675에서의 I의 S로의 치환.
본 발명의 또 다른 측면에서, 아미노산 돌연변이는 적어도 2개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합이고, 여기서:
(i) 조작된 디술피드 돌연변이가 D217C 및 Y589C; M371C 및 W506C; 및 N524C 및 M684C로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(ii) 추가의 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
(2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
(3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환;
(4) 위치 655에서의 P의 S로의 치환;
(5) 위치 678에서의 F의 S로의 치환; 및
(6) 위치 680에서의 L의 T로의 치환;
(7) 위치 685에서의 R의 A로의 치환;
(8) 위치 648-653에서의 MIALDI의 GSGKDG로의 치환;
(9) 위치 693에서의 R의 V로의 치환;
(10) 위치 675에서의 I의 S로의 치환;
(11) 위치 767 및 768에서의 I의 C로의 치환;
(12) 위치 703에서의 D 및 위치 704에서의 P의 C로의 치환; 및
(13) 위치 696에서의 Y 및 위치 697에서의 V의 C로의 치환.
본 발명의 또 다른 측면에서, 아미노산 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 조합이다:
(1) D217C 및 Y589C, M371C 및 W506C, 및 I675S의 조합;
(2) D217C 및 Y589C, N524C 및 M684C, 및 I675S의 조합;
(3) D217C 및 Y589C, M371C 및 W506C, Y155G I156H H157R, W240A, C246S 및 I675S의 조합; 및
(4) D217C 및 Y589C, N524C 및 M684C, Y155G I156H H157R, W240A, C246S 및 I675S의 조합.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 371 (371C) 및 위치 506 (506C)에, 및 세린 (S)을 위치 675 (675S)에 포함하며, 여기서 돌연변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 서열식별번호: 257에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
(2) 서열식별번호: 257의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 524 (524C) 및 위치 684 (684C)에, 및 세린 (S)을 위치 675 (675S)에 포함하며, 여기서 돌연변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 서열식별번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
(2) 서열식별번호: 259의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 371 (371C) 및 위치 506 (506C)에, 세린 (S)을 위치 675 (675S)에, 글리신 (G)을 위치 155 (155G)에, 히스티딘을 위치 156 (156H)에, 아르기닌을 위치 157 (157R)에, 알라닌을 위치 240 (240A)에, 및 세린을 위치 246 (246S)에 포함하며, 여기서 돌연변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 서열식별번호: 261에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
(2) 서열식별번호: 261의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; (1) 서열식별번호: 261에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체;
(3) 서열식별번호: 265에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
(4) 서열식별번호: 265의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 524 (524C) 및 위치 684 (684C)에, 세린 (S)을 위치 675 (675S)에, 글리신 (G)을 위치 155 (155G)에, 히스티딘을 위치 156 (156H)에, 아르기닌을 위치 157 (157R)에, 알라닌을 위치 240 (240A)에, 및 세린을 위치 246 (246S)에 포함하며, 여기서 돌연변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 서열식별번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
(2) 서열식별번호: 263의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
본 발명의 또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체의 아미노산 서열은 신호 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 23-907을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체의 아미노산 서열은 MPR, TM 또는 CT 도메인을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 23-707을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체의 아미노산 서열은 말단절단된 도메인 V 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 23-702 또는 23-703을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체의 아미노산 서열은 도메인 V 영역을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 23-646을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 돌연변이체의 C 말단에 연결된 삼량체화 모티프를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 삼량체화 모티프는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 프로토머간 디술피드 고리;
(ii) GCN4;
(iii) T4 피브리틴 폴드온; 및
(iv) C-말단 융합 서열.
본 발명의 또 다른 측면에서,
(i) GCN4가 서열식별번호: 269, 272 또는 273에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) T4 피브리틴 폴드온이 서열식별번호: 271에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(iii) C-말단 융합 서열이 서열식별번호: 274에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 프로토머간 디술피드 고리는 하기로부터 선택된 적어도 2개의 조작된 시스테인 돌연변이를 포함한다:
(i) 696C 및 697C;
(ii) 703C 및 704C; 또는
(iii) 767C 및 768C.
가용성 단백질의 안정한 삼량체의 형성을 촉진하는 여러 외인성 다량체화 도메인이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본 개시내용에 의해 제공된 돌연변이체에 연결될 수 있는 이러한 다량체화 도메인의 예는 (1) GCN4 류신 지퍼 (Harbury et al. 1993 Science 262: 1401-1407); (2) 폐 계면활성제 단백질로부터의 삼량체화 모티프 (Hoppe et al. 1994 FEB S Lett 344: 191-195); (3) 콜라겐 (McAlinden et al. 2003 Biol Chem 278:42200-42207); 및 (4) 파지 T4 피브리틴 폴드온 (Miroshnikov et al. 1998 Protein Eng 11:329-414)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 다량체화 도메인은 C-말단에서 CMV gB 돌연변이체에 연결된다. 구체적 실시양태에서, 삼량체화 도메인은 서열식별번호: 269-274에 제시되어 있다. 다량체화 도메인을 gB 폴리펩티드에 연결하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 "프로토머간 디술피드 고리"는 다량체 (예를 들어 삼량체)의 기능적 위상학 및 안정화를 확립하는, 인접한 시스테인 잔기의 쌍을 포함하는 고리계에 의해 형성된 3개의 나선간 디술피드 결합에 의해 달성된 3개의 나선 사이의 공유 고리 형성을 의미할 것이다. 문헌 [Stewart-Jones GBE, et al. (2015) A Cysteine Zipper Stabilizes a Pre-Fusion F Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. PLoS ONE 10(6): e0128779. doi:10.1371/journal.pone.0128779]을 참조한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 분비된 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 돌연변이체는 가용성이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 107-140 또는 224로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드 서열은 서열식별번호: 225-254에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 실시양태 및 측면에 따른 CMV gB 단백질 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 핵산은 서열식별번호: 225-254에 제시된 서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 (i) 본원에 기재된 실시양태 및 측면에 따른 CMV gB 단백질 돌연변이체 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 제약 조성물은 백신이다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본원의 실시양태에 제시된 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 대상체는 인간이다.
2. 폴리펩티드의 추가 실시양태
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 46의 넘버링에 따른 하기 아미노산 위치: 280, 281, 283, 284, 285, 286, 290, 292, 295, 297, 298, 299 또는 그의 임의의 조합 중 어느 하나에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 예시적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 46의 넘버링에 따라 하기 잔기: Y280; N281; T283; N284; R285; N286; F290; E292; N293; F297; F298; I299; F298; 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나의 치환을 포함하지 않는다. 이론 또는 메카니즘에 얽매이지는 않지만, 중화 항체에 중요한 잔기는 Y280/N284 및 Y280/N293/D295를 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 46과 비교하여 Y280, N293, N284, 및 D295에 돌연변이를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 44의 넘버링에 따른 하기 아미노산 위치: R562, P577, S587, Y588, G592, G595, L601/H605, C610, L612, P613, Y625, Y627, F632, 및 K633, 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 44의 넘버링에 따른 하기 아미노산 돌연변이: R562C, P577L, S587L, Y588C, G592S, G595D, L601P/H605N, C610Y, L612F, P613Y, Y625C, Y627C, F632L 및 K633T 또는 그의 임의의 조합 중 어느 하나를 포함하지 않는다. 이론 또는 메카니즘에 얽매이지는 않지만, P577 및 Y627은 도메인 IV 코어 내에서 서로의 옆에 위치하는 반면, C610은 보존된 디술피드 결합에 참여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 3개의 잔기 모두가 융합전 구조 내의 도메인 IV의 위치, 및 따라서 전체 항원 부위 AD-1의 안정성을 유지하는 것을 도울 수 있다. 또한, 이론 또는 메카니즘에 얽매이지는 않지만, F632 및 G595는 gB의 융합전 형태의 표면 상에 노출되는 것으로 생각된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 참조 서열 서열식별번호: 44의 넘버링에 따라 P577, Y627, C610, F632, 및 G595, 또는 그의 임의의 조합에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
3. 공동 충전 돌연변이
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 1개 이상의 공동 충전 돌연변이인 아미노산 돌연변이를 포함한다. 공동 충전의 목표로 대체될 수 있는 아미노산의 예는 소형 지방족 (예를 들어 Gly, Ala 및 Val) 또는 소형 극성 아미노산 (예를 들어 Ser 및 Thr), 및 융합전 입체형태에서 매립되지만 융합후 입체형태에서 용매에 노출된 아미노산을 포함한다. 대체 아미노산의 예는 대형 지방족 아미노산 (Ile, Leu 및 Met) 또는 대형 방향족 아미노산 (His, Phe, Tyr 및 Trp)을 포함한다.
4. 돌연변이의 조합
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 2개의 조작된 디술피드 결합 돌연변이, 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이, 예컨대 각각 본원에 기재된 바와 같은 공동 충전 돌연변이, 정전기적 돌연변이, 프로토머간 디술피드 고리로부터 선택된 2종 이상의 상이한 유형의 돌연변이의 조합을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 디술피드 결합 돌연변이 및 적어도 1개의 정전기적 돌연변이를 포함한다. 보다 구체적으로, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 시스테인 치환 및 적어도 1개의 페닐알라닌 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 시스테인 치환 및 적어도 1개의 류신 치환을 포함한다.
일부 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이 및 표 3의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이 및 표 4의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 2개의 돌연변이, 표 3의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 1개의 돌연변이 및 표 4의 돌연변이 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다.
폴리펩티드의 제조
본원에 기재된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 상용 방법에 의해, 예컨대 적합한 벡터를 사용하는 재조합 숙주 시스템에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 적합한 재조합 숙주 세포는 예를 들어 곤충 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 박테리아 및 효모 세포를 포함한다. 적합한 곤충 세포의 예는, 예를 들어 Sf9 세포, Sf21 세포, Tn5 세포, 슈나이더(Schneider) S2 세포, 및 하이 파이브(HIGH FIVE) 세포 (모 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) BTI-TN-5B1-4 세포주로부터 유래된 클론 단리물)를 포함한다. 적합한 포유동물 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포 (전형적으로 전단된 아데노바이러스 유형 5 DNA에 의해 형질전환된 HEK293 또는 Expi 293 세포), NIH-3T3 세포, 293-T 세포, Vero 세포, 및 HeLa 세포를 포함한다. 적합한 조류 세포는, 예를 들어 닭 배아 줄기 세포 (예를 들어, EBx.RTM. 세포), 닭 배아 섬유모세포, 닭 배아 배세포, 메추라기 섬유모세포 (예를 들어 ELL-O), 및 오리 세포를 포함한다. 적합한 곤충 세포 발현 시스템, 예컨대 바큘로바이러스-벡터화 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 물질 및 방법은 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 조류 세포 발현 시스템 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 유사하게, 박테리아 및 포유동물 세포 발현 시스템이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다.
곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현을 위한 다수의 적합한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이다. 적합한 벡터는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 성분을 함유할 수 있다: 복제 기점; 선택가능 마커 유전자; 1개 이상의 발현 제어 요소, 예컨대 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결인자), 및/또는 1개 이상의 번역 신호; 및 선택된 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 기원의 또는 이종성 포유동물 또는 비-포유동물 종으로부터의 것) 내의 분비 경로에 대한 표적화를 위한 신호 서열 또는 리더 서열. 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 위해, 적합한 바큘로바이러스 발현 벡터, 예컨대 PFASTBAC를 사용하여 재조합 바큘로바이러스 입자를 생산한다. 바큘로바이러스 입자를 증폭시키고, 이를 사용하여 곤충 세포를 감염시켜 재조합 단백질을 발현시킨다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해, 목적하는 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포)에서 구축물의 발현을 유도할 벡터가 사용된다.
폴리펩티드는 임의의 적합한 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 침전, 및 소수성 상호작용, 이온 교환, 친화도, 킬레이트화 및 크기 배제와 같은 다양한 유형의 크로마토그래피를 포함한 목적하는 폴리펩티드를 정제하는 적합한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 정제 계획은 이들 또는 다른 적합한 방법 중 2종 이상을 사용하여 생성될 수 있다. 원하는 경우에, 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 "태그", 예컨대 에피토프 태그 또는 히스티딘 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그부착된 폴리펩티드는 예를 들어 킬레이팅 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 조건화 배지로부터 정제될 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 핵산 분자는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 포함한다. 폴리펩티드의 엑토도메인만을 코딩하는 핵산 분자 또한 본 발명에 포괄된다. 핵산 분자는 벡터, 예컨대 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 자기-복제성 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 변형된 RNA 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
화합물-안정화된 폴리펩티드
본 발명자들은, 예를 들어 HCMV gB에 대한 비스(아릴)티오우레아 화합물의 결합에 의해 확인될 수 있는 융합전 입체형태로 안정화된 폴리펩티드를 발견하였다. 구조 1a,b (화학식 I)에 의해 예시된 바와 같은 비스(아릴)티오우레아 화합물은 CMV의 고도로 강력하고 특이적인 억제제이다. 한 측면에서, 본 발명은 비스(아릴)티오우레아 화합물에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 화합물은 HCMV gB 폴리펩티드의 융합후 입체형태에 결합하지 않는다.
Figure pct00010
바람직한 실시양태에서, 화합물은 그의 비스(아릴)티오우레아 티오지올 유사체이다. 가장 바람직하게는, 일부 실시양태에서, 화합물은 하기 구조를 갖는 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드이다.
Figure pct00011
또 다른 실시양태에서, 화합물은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00012
여러 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 HCMV gB 융합후 입체형태에서 존재하지 않는 HCMV gB 융합전 에피토프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 약 90%의 폴리펩티드 (예컨대, 균질 집단 내의 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%의 폴리펩티드)가 비스(아릴)티오우레아 화합물 (예를 들어, 예컨대 비스(아릴)티오우레아 화합물의 티아졸 유사체, 보다 바람직하게는 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드)에 의해 결합된다. 일부 실시양태에서, 비스(아릴)티오우레아 화합물에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 융합후 입체형태를 갖지 않는다. 오히려, 폴리펩티드는 융합전 입체형태, 예컨대 HCMV gB 융합전 입체형태를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 비스(아릴)티오우레아 화합물에 의해 특이적으로 결합되지 않은 HCMV gB 폴리펩티드로부터 적어도 80% 단리되거나, 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 바람직하게는 99.9% 단리될 수 있다.
폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 면역원성 조성물의 성분으로서 직접 전달될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 생체내에서 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 생산하기 위해 투여될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 특정의 바람직한 실시양태, 예컨대 단백질 제제, 재조합 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 자기-복제성 RNA, 또는 그의 임의의 변형) 및 바이러스 벡터 (예를 들어, 생, 단일-라운드, 비-복제성 어셈블리된 비리온, 또는 달리 바이러스-유사 입자, 또는 알파바이러스 VRP)가 본원에 추가로 기재되고, 조성물에 포함될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 면역원성 조성물은 추가적인 CMV 단백질, 예컨대 gO, gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131, pp65, 이들의 면역원성 단편 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 gH 또는 그의 오량체-형성 단편, gL 또는 그의 오량체-형성 단편, pUL128 또는 그의 오량체-형성 단편, pUL130 또는 그의 오량체-형성 단편, 및 pUL131 또는 그의 오량체-형성 단편을 포함하는 CMV 오량체 복합체와 조합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 gH 또는 그의 삼량체-형성 단편, gL 또는 그의 삼량체-형성 단편, 및 gO 또는 그의 삼량체-형성 단편을 포함하는 CMV 삼량체 복합체와 조합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 적어도 1종의 관심 폴리펩티드, 예를 들어 항원을 코딩한다. 본원에 개시된 항원은 야생형 (즉, 감염원으로부터 유래됨)일 수 있거나, 또는 바람직하게는 변형된 것 (예를 들어, 조작된 것, 설계된 것 또는 인공인 것)일 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자, 구체적으로 폴리뉴클레오티드는, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 관심 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 항원 또는 항원 분자로서 작용할 수 있다. 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물을 포함한다. 이들 중합체는 "폴리뉴클레오티드"로 지칭된다. 본 발명의 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 mRNA를 포함한 리보핵산 (RNA), 및 데옥시리보핵산 (DNA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 mRNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 번역시에 적절한 단백질 입체형태를 생성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 hCMV gB 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2종 이상의 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2종 이상의 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 2종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 1종 이상의 항원성 폴리펩티드는 단일 폴리뉴클레오티드 상에서 코딩될 수 있거나, 또는 다중 (예를 들어, 2종 이상의) 폴리뉴클레오티드 상에서 개별적으로 코딩될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 추가의 폴리펩티드, 바람직하게는 HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가의 폴리펩티드는 HCMV gH, gL, gB, gO, gN 및 gM 및 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV pp65이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131A, 및 그의 단편으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gH 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gL 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gB 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gO 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 HCMV gM 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 변이체 gH 폴리펩티드, 변이체 gL 폴리펩티드 또는 변이체 gB 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 변이체 HCMV gH, gL 또는 gB 폴리펩티드는 하기 도메인 서열들 중 1종 이상이 결핍되어 있는 말단절단된 폴리펩티드이다: (1) 소수성 막 근위 도메인, (2) 막횡단 도메인 및 (3) 세포질 도메인. 일부 실시양태에서, 말단절단된 HCMV gH, gL 또는 gB 폴리펩티드는 소수성 막 근위 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인이 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 HCMV gH, gL 또는 gB 폴리펩티드는 엑토도메인 서열만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 UL83, UL123, UL128, UL130 및 UL131A 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프에서 선택되는 HCMV 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 HCMV UL83 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 HCMV UL123 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 HCMV UL128 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 HCMV UL130 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 HCMV UL131 폴리펩티드이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열식별번호: 211-223에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열식별번호: 141-210으로부터 선택된 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열식별번호: 211-223으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 추가의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 225-254 중 임의의 것으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 141-147 중 임의의 것으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 220-223 중 임의의 것으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 2종 이상의 HCMV 단백질, 그의 단편 또는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 그의 2종 이상의 당단백질, 단편 또는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드는 적어도 1종의 HCMV 폴리펩티드, 그의 단편 또는 에피토프 및 적어도 1종의 다른 HCMV 단백질, 그의 단편 또는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 단일 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 2종 이상의 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되며, 예를 들어 각각의 HCMV 폴리펩티드는 별개의 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 HCMV gH, gL, gB, gO, gN 및 gM 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 pp65 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프; 및 HCMV gH, gL, gB, gO, gN 및 gM 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 HCMV gB, 및 gH, gL, gO, gN 및 gM 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 1종 이상의 HCMV 폴리펩티드의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 HCMV gH, 및 gL, gO, gN 및 gM 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 1종 이상의 HCMV 폴리펩티드의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 HCMV gL, 및 gB, gH, gO, gN 및 gM 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 1종 이상의 HCMV 폴리펩티드의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 gB 및 gH이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 gB 및 gL이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 gH 및 gL이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 gB, gL 및 gH이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 단백질은 HCMV UL83, UL123, UL128, UL130 및 UL131A 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 UL123 및 UL130이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 UL123 및 131A이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 UL130 및 131A이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 UL 128, UL130 및 131A이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 단백질은 HCMV gB, gH, gL, gO, gM, gN, UL83, UL123, UL128, UL130 및 UL131A 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 HCMV gH, 및 gL, UL128, UL130 및 UL131A 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 1종 이상의 HCMV 폴리펩티드의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 당단백질은 HCMV gL, 및 gH, UL128, UL130 및 UL131A 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 1종 이상의 HCMV 폴리펩티드의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 폴리펩티드는 gL, gH, UL 128, UL130 및 131 A이다. 조성물이 2종 이상의 HCMV 단백질을 포함하는 이들 실시양태 중 어느 것에서, HCMV gH는 변이체 gH, 예컨대 본원에 개시된 변이체 HCMV gH 당단백질 중 어느 것, 예를 들어 본원에 개시된 변이체 HCMV gH 중 어느 것일 수 있다. 조성물이 2종 이상의 HCMV 단백질을 포함하는 이들 실시양태 중 어느 것에서, HCMV gB는 변이체 gB, 예컨대 본원에 개시된 변이체 HCMV gB 당단백질 중 어느 것, 예를 들어 본원에 개시된 변이체 HCMV gB 중 어느 것일 수 있다. 조성물이 2종 이상의 HCMV gL 단백질을 포함하는 이들 실시양태 중 어느 것에서, HCMV gL은 변이체 gL, 예컨대 본원에 개시된 변이체 HCMV gL 당단백질 중 어느 것, 예를 들어 본원에 개시된 변이체 HCMV gL 중 어느 것일 수 있다.
조성물이 2종 이상의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 2종 이상의 RNA 폴리뉴클레오티드 (단일 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나 또는 2종 이상의 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨, 예를 들어 각각의 단백질은 별개의 RNA 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨)를 포함하는 특정 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 단백질은 변이체 gB, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 변이체 gB 폴리펩티드, 및 gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프로부터 선택된 HCMV 단백질이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 단백질은 변이체 gH, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 변이체 gH 폴리펩티드, 및 gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131A 폴리펩티드로부터 선택된 HCMV 단백질 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 HCMV 단백질은 변이체 gH, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 변이체 gH 폴리펩티드, 및 gH, gL, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131 폴리펩티드로부터 선택된 HCMV 단백질 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프이다. 변이체 HCMV 단백질이 변이체 HCMV gB, 변이체 HCMV gL 및 변이체 HCMV gH인 일부 실시양태에서, 변이체 HCMV 폴리펩티드는 하기 말단절단된 폴리펩티드로부터 선택되는 말단절단된 폴리펩티드이다: 소수성 막 근위 도메인이 결핍됨; 막횡단 도메인이 결핍됨; 세포질 도메인이 결핍됨; 소수성 막 근위, 막횡단 및 세포질 도메인 중 2종 이상이 결핍됨; 및 엑토도메인만을 포함함. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 다량체 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 RNA 폴리뉴클레오티드의 5'UTR은 패턴화된 UTR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 패턴화된 UTR은 반복 또는 교대 패턴, 예컨대 ABABAB 또는 AABBAABBAABB 또는 ABCABCABC 또는 1회, 2회 또는 3회 초과로 반복되는 그의 변이체를 갖는다. 이들 패턴에서, 각각의 문자, A, B 또는 C는 뉴클레오티드 수준에서 상이한 UTR을 나타낸다. 일부 실시양태에서, RNA 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 핵산)의 5' UTR은 또 다른 RNA 폴리뉴클레오티드 (제2 핵산)의 UTR과 상보성인 영역을 갖는다. 예를 들어, (예를 들어, 다량체 분자 내의) 연결시키고자 하는 2개의 폴리뉴클레오티드의 UTR 뉴클레오티드 서열은 2개의 UTR이 혼성화하여 다량체 분자를 형성하도록 상보성 영역을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 다량체성 서열의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, UL128, UL130, UL131로부터 선택되는 HCMV 단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 다량체성 서열의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, HCMV 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 다량체성 서열의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, gH, gL, gB, gO, gM 및 gN으로부터 선택되는 HCMV 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 다량체성 서열의 형성을 허용하도록 변형된다. 임의의 이들 실시양태에서, 다량체는 이량체, 삼량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, gH, gL, gB, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131에서 선택되는 HCMV 단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 이량체의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, gH, gL, gB, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131A에서 선택되는 HCMV 단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 삼량체의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, gH, gL, gB, gO, gM, gN, UL128, UL130 및 UL131에서 선택되는 HCMV 단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드의 5' UTR은 오량체의 형성을 허용하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2종 이상 (예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그 초과)의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 또는 에피토프를 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 갖는 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그 초과의 HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 1종 초과의 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그 초과의 오픈 리딩 프레임을 갖는 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 실시양태 중 어느 하나에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 gH, gB, gL, gO, gM, gN, UL83, UL123, UL128, UL130, UL131A, 및 그의 단편 또는 에피토프로부터 선택되는 2종 이상의 HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 UL83 및 UL123을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 gH 및 gL을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 UL128, UL130 및 UL131을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131을 코딩한다. 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드가 2종 이상 (예를 들어, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그 초과)의 HCMV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 갖는 일부 실시양태에서, RNA 폴리뉴클레오티드는 추가의 서열, 예를 들어 링커 서열 또는 HCMV RNA 전사체 또는 폴리펩티드의 프로세싱을 보조하는 서열, 예를 들어 절단 부위 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 서열은 프로테아제 서열, 예컨대 푸린 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 서열은 자기-절단 2A 펩티드, 예컨대 P2A, E2A, F2A 및 T2A 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열 및 절단 부위 서열은 HCMV 폴리펩티드를 코딩하는 서열 사이에 배치된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 임의의 핵산 서열, 또는 본원에 개시된 핵산 서열에 대해 적어도 80% (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%) 동일성을 갖는 그의 상동체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임은 코돈-최적화되어 코딩된다. 일부 실시양태는 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 코딩하는 적어도 1종의 RNA 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 5' 말단 캡을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 말단 캡은 7mG(5')ppp(5')NlmpNp이다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 141-210 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 211-223의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 216의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 216의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 152의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드는 제2 화학적 변형을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 RAN이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드는 5' 말단 캡을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 적어도 80% (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%)는 화학적 변형을 갖고, 임의로 여기서 조성물은 지질 나노입자 내에 제제화된다. 일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 100%는 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 우라실의 5-위치에 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 N1-메틸 슈도우리딘이다.
일부 실시양태에서, (예를 들어, mRNA 조성물 내의) 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 추가의 폴리펩티드 또는 면역원성 단편은 gB, gH, gL, gO, gM, gN, UL83, UL123, UL128, UL130, UL131A, pp65 및 IE1 항원으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물이 포유동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 제2 조성물은 HCMV pp65 또는 그의 항원 단편 또는 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 제2 조성물은 HCMV gH, gL, UL128, UL130 및 UL131로부터 선택된 추가의 폴리펩티드, 또는 그의 항원 단편 또는 에피토프를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 면역 반응을 유도하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물은 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포 반응 또는 B 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포 반응 및 B 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 조성물의 단일 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 부스터 용량의 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 포유동물에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 제제화될 수 있다.
면역원성 조성물은 아주반트를 포함할 수 있다. 조성물의 유효성을 증진시키기 위한 예시적인 아주반트는 하기를 포함한다: (1) 알루미늄 염 (명반), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀젼 제제 (다른 특정 아주반트, 예컨대 뮤라밀 펩티드 (하기 참조) 또는 박테리아 세포벽 성분을 함유하거나 함유하지 않음), 예컨대 예를 들어 (a) 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제제화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈(TWEEN) 80, 및 0.5% 스팬 85를 함유하는 MF59 (PCT 공개 번호 WO 90/14837), (b) 서브마이크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 볼텍싱되어 보다 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성하는, 10% 스쿠알란, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터의 1종 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (데톡스(DETOX)™)를 함유하는 리비(RIBI)™ 아주반트 시스템 (RAS) (리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem), 몬타나주 해밀턴); (3) 사포닌 아주반트, 예컨대 QS-21, 스티물론(STIMULON)™ (캠브리지 바이오사이언스(Cambridge Bioscience), 매사추세츠주 우스터) (이것이 사용되거나 또는 그로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOM (면역자극 복합체)이 사용될 수 있음); (4) 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아주반트 (IFA); (5) 시토카인, 예컨대 인터류킨 (IL-1, IL-2 등), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 등; 및 (6) 조성물의 유효성을 증진시키기 위한 아주반트로서 작용하는 다른 물질. 바람직한 실시양태에서, 아주반트는 사포닌 아주반트, 즉 QS-21이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아주반트를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 지질 나노입자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 나노입자로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 프로타민 또는 다른 양이온성 펩티드 또는 단백질, 예컨대 폴리-L-리신 (PLL)을 포함한 양이온성 또는 다가양이온성 화합물을 추가로 포함한다.
본원에 논의된 각각의 면역원성 조성물은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 항원과 조합되어 사용될 수 있으며, 후자는 동일한 바이러스 병원체로부터 유래되거나 또는 또 다른 병원성 공급원 또는 공급원들로부터 유래된다. 이들 조성물은 (감염을 예방하기 위한) 예방적 또는 (감염 후 질환을 치료하기 위한) 치료적 목적으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 "제약상 허용되는 담체"를 포함할 수 있으며, 이는 그 자체가 조성물을 받은 개체에 유해한 항체의 생산을 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적합한 담체는 전형적으로 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 (예컨대 오일 액적 또는 리포솜), 및 불활성 바이러스 입자이다. 이러한 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 추가로, 이들 담체는 아주반트로서 기능할 수 있다. 또한, 항원은 박테리아 톡소이드, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 에이치. 필로리(H. pylori) 등 병원체로부터의 톡소이드에 접합될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 희석제, 예컨대 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 면역학적 유효량의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 상기 언급된 성분을 포함할 수 있다. "면역학적 유효량"은 단일 용량으로 또는 일련의 투여의 일부로서 개체에게 상기 양을 투여하는 것이 면역 반응을 유도하는 데 효과적임을 의미한다. 도출된 면역 반응은, 예를 들어 질병, 감염 또는 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 발생률의 감소에 충분할 수 있다. 이 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 치료될 개체의 분류학상 군 (예를 들어, 비인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신의 제제화, 의료 상황의 치료 의사의 평가, 및 다른 관련 인자에 따라 달라진다. 양은 상용 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
조성물은 비경구로, 예를 들어 주사에 의해 피하로 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 포유동물에게 피내 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 추가의 제제는 경구 및 폐 제제, 비강 제제, 좌제 및 경피 적용을 포함한다. 경구 제제가 특정 바이러스 단백질에 바람직할 수 있다. 투여 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다. 면역원성 조성물은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 시토메갈로바이러스에 대한 면역 반응의 도출을 필요로 하는 대상체에게 상기 기재된 바와 같은 단백질, DNA 분자, RNA 분자 (예를 들어, 자기-복제 RNA 분자) 또는 VRP를 포함하는 면역학적 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 시토메갈로바이러스에 대한 면역 반응을 도출하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 면역 반응은 CMV에 대한 중화 항체의 생산을 포함한다.
면역 반응은 체액성 면역 반응, 세포-매개 면역 반응, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 각각의 전달된 CMV 단백질에 대해 유도된다. 세포-매개 면역 반응은 헬퍼 T-세포 (Th) 반응, CD8+ 세포독성 T-세포 (CTL) 반응, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하고, 항체는 중화 항체이다.
중화 항체는 세포의 바이러스 감염을 차단한다. CMV는 상피 세포 및 또한 섬유모세포를 감염시킨다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 두 세포 유형 모두의 감염을 감소시키거나 예방한다. 중화 항체 반응은 보체-의존성 또는 보체-비의존성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중화 항체 반응은 보체-비의존성이다. 일부 실시양태에서 중화 항체 반응은 교차-중화이며; 즉, 투여된 조성물에 대해 생성된 항체는 조성물에 사용된 균주 이외의 균주의 CMV 바이러스를 중화시킨다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및/또는 면역원성 조성물은 또한 비-감염된 포유동물의 CMV 감염의 가능성을 감소시키거나, 또는 감염된 포유동물에서 증상을 감소시키는데, 예를 들어 발병의 수, CMV 배출, 및 바이러스를 다른 포유동물로 확산시킬 위험을 감소시키는 데 효과적인 면역 반응을 도출할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 CMV 바이러스 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에서 소변 중 CMV 바이러스 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에서 타액 중 CMV 바이러스 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 CMV 바이러스 역가를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청 내의 CMV 핵산을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 용어 "바이러스 배출"은 의학 및 바이러스학에서의 그의 일반적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 감염된 세포로부터의 바이러스의 생산 및 방출을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 포유동물의 세포로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 감염된 포유동물로부터 환경으로 방출된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 포유동물 내의 세포로부터 방출된다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 CMV 바이러스 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 본원에 기재된 변형된 CMV gB 폴리펩티드 및/또는 면역원성 조성물을 CMV에 감염되었거나 또는 감염될 위험이 있는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물에서의 CMV 바이러스 배출의 감소는 변형된 CMV gB를 투여받지 않은 포유동물에서의 바이러스 배출과 비교한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물에서의 CMV 바이러스 배출의 감소는 CMV 오량체 단독 투여 후 또는 폴리펩티드 부재 하의 CMV 오량체 투여 후의 바이러스 배출과 비교한 것이다.
일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 인간은 소아, 예컨대 유아이다. 일부 다른 실시양태에서, 인간은 청소년기 여성, 가임 연령의 여성, 임신 계획 중인 여성, 임신한 여성, 및 최근에 출산한 여성을 포함한 여성이다. 일부 실시양태에서, 인간은 이식 환자이다.
한 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 인간 CMV 균주이다. 한 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 폴리펩티드가 유래된 CMV 균주와 상동성이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 CMV 균주 VR1814와 상동성이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 CMV 균주 타운과 상동성이다.
한 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 변형된 CMV gB 폴리펩티드가 유래된 CMV 균주에 대해 이종성인 인간 CMV 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 VR1814 CMV 균주에 대해 이종성인 인간 CMV 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 VR1814 CMV 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 CMV 균주 타운에 대해 이종성인 인간 CMV 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 CMV 균주 타운이다.
또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 마카신 헤르페스바이러스 3 단리물 21252 CMV 균주에 상동성인 레서스 CMV 균주이다. 또 다른 실시양태에서, 챌린지 시토메갈로바이러스 균주는 마카신 헤르페스바이러스 3 단리물 21252 CMV 균주이다.
관련 기술분야에서 항체 효력의 유용한 척도는 "50% 중화 역가"이다. 항체 효력의 또 다른 유용한 척도는 하기 중 어느 하나이다: "60% 중화 역가"; "70% 중화 역가"; "80% 중화 역가"; 및 "90% 중화 역가". 예를 들어, 50% 중화 역가를 결정하기 위해, 면역화된 동물로부터의 혈청을 희석하여 희석된 혈청이 세포 내로의 감염성 바이러스의 50%의 진입을 차단하는 능력을 얼마나 유지할 수 있는지를 평가한다. 예를 들어, 역가 700은 혈청이 700배 희석된 후에 감염성 바이러스의 50%를 중화시키는 능력을 보유하였음을 의미한다. 따라서, 보다 높은 역가는 보다 강력한 중화 항체 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이 역가는 약 200, 약 400, 약 600, 약 800, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 약 3000, 약 3500, 약 4000, 약 4500, 약 5000, 약 5500, 약 6000, 약 6500, 또는 약 7000의 하한을 갖는 범위이다. 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중화 역가 범위는 약 400, 약 600, 약 800, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 약 3000, 약 3500, 약 4000, 약 4500, 약 5000, 약 5500, 약 6000, 약 6500, 약 7000, 약 8000, 약 9000, 약 10000, 약 11000, 약 12000, 약 13000, 약 14000, 약 15000, 약 16000, 약 17000, 약 18000, 약 19000, 약 20000, 약 21000, 약 22000, 약 23000, 약 24000, 약 25000, 약 26000, 약 27000, 약 28000, 약 29000, 또는 약 30000의 상한을 가질 수 있다. 예를 들어, 50% 중화 역가는 약 3000 내지 약 6500일 수 있다. "약"은 언급된 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 중화 역가는 하기 구체적 예에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
면역 반응은 단백질, DNA 분자, RNA 분자 (예를 들어, 자기-복제성 RNA 분자 또는 뉴클레오시드 변형된 RNA 분자), 또는 VRP를 개체, 전형적으로 인간을 포함한 포유동물에게 투여함으로써 자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 면역 반응은 보호성 면역 반응이고, 즉, 반응은 CMV 감염의 위험 또는 중증도 또는 임상 결과를 감소시킨다. 보호성 면역 반응의 자극은 특히 CMV 감염 및 질환의 위험이 있는 일부 집단에서 특히 바람직하다. 예를 들어, 위험이 있는 집단은 실질 기관 이식 (SOT) 환자, 골수 이식 환자, 및 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 환자를 포함한다. VRP는 이식 공여자에게 이식전, 또는 이식 수용자에게 이식전 및/또는 이식후 투여될 수 있다. 모체로부터 아이로의 수직 전파는 영아를 감염시키는 통상적인 공급원이기 때문에, 임신 중이거나 임신할 수 있는 여성에게 VRP를 투여하는 것이 특히 유용하다.
본 개시내용에 의해 제공된 조성물, 예컨대 제약 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 임의의 적합한 투여 경로가 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 근육내로, 복강내로, 피하로 또는 경피로 투여될 수 있다. 일부 실시양태는 점막내 경로를 통해, 예컨대 구강내로, 비강내로, 질내로, 및 직장내로 투여될 것이다. 조성물은 임의의 적합한 스케줄에 따라 투여될 수 있다.
또한, 세포를 본원에 기재된 면역원성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내로의 시토메갈로바이러스 진입을 억제하는 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에서 CMV에 대한 면역 반응을 도출할 수 있는 면역원성 조성물이다. 일부 특정한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본 개시내용에 의해 제공된 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 백신이다.
일부 실시양태에서, 조성물, 예컨대 면역원성 조성물 또는 백신은 상기 기재된 2종 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 2종 이상의 상이한 폴리펩티드는 동일한 도입된 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있으나, 상이한 HCMV 균주 또는 하위유형 유래의 gB로부터 유래할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 폴리펩티드는 천연 HCMV gB와 비교하여 서로 상이한 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 수용액에서 가용성이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 세제가 결여된 용액에서 가용성이다.
항체 및 진단 용도
상기 기재된 폴리펩티드는 폴리클로날 및 모노클로날 둘 다의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체를 원하는 경우, 선택된 포유동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 기니 피그, 말 등)을 CMV 에피토프(들)를 보유하는 면역원성 폴리펩티드로 면역화시킨다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수집하고, 공지된 절차에 따라 처리한다. CMV 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우, 폴리클로날 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클로날 항혈청의 생산 및 가공 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
CMV 에피토프에 대해 지시된 모노클로날 항체는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 하이브리도마에 의해 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법은 공지되어 있다. 불멸 항체-생산 세포주는 세포 융합에 의해, 및 또한 다른 기술, 예컨대 종양원성 DNA를 사용한 B 림프구의 직접 형질전환, 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 형질감염에 의해 생성될 수 있다. CMV 에피토프에 대해 생산된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 특성, 즉 이소형, 에피토프 친화도 등에 대해 스크리닝될 수 있다.
CMV 에피토프에 대해 지시된 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다는 진단에 특히 유용하고, 중화하는 것들은 수동적 면역요법에 유용하다. 모노클로날 항체는 특히 항-이디오타입 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
CMV 항체를 함유하는 혈청과 면역학적으로 반응하는 폴리펩티드, 및 이들 폴리펩티드에 대해 생성된 항체 둘 다는, 예를 들어 혈액 또는 혈청 샘플을 포함한 생물학적 샘플에서 CMV 항체의 존재 또는 바이러스의 존재를 검출하기 위한 면역검정에 유용할 수 있다. 면역검정의 설계에 많은 변형이 적용되며, 다양한 것들이 관련 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 면역검정은 서열식별번호: 2-106 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
대안적으로, 면역검정은 본원에 기재된 폴리펩티드로부터 유래된 바이러스 항원의 조합을 사용할 수 있다. 이는, 예를 들어 본원에 기재된 적어도 1종의 폴리펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체, 본원에 기재된 폴리펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체의 조합, 상이한 바이러스 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체, 본원에 기재된 폴리펩티드에 대해 지시된 폴리클로날 항체, 또는 상이한 바이러스 항원에 대해 지시된 폴리클로날 항체를 사용할 수 있다. 프로토콜은, 예를 들어 경쟁 또는 직접 반응에 기초할 수 있거나, 또는 샌드위치 유형 검정일 수 있다. 프로토콜은 또한, 예를 들어 고체 지지체를 사용할 수 있거나, 또는 면역침전에 의한 것일 수 있다. 대부분의 검정은 표지된 항체 또는 폴리펩티드의 사용을 수반하고; 표지는 예를 들어 형광, 화학발광, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다. 프로브로부터의 신호를 증폭시키는 검정이 또한 공지되어 있으며; 그의 예는 비오틴 및 아비딘을 이용하는 검정, 및 효소-표지되고 매개된 면역검정, 예컨대 ELISA 검정이다.
면역진단에 적합하고 적절한 표지된 시약을 함유하는 키트는 CMV 에피토프를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 에피토프에 대해 지시된 항체를 포함한 적절한 물질을 적합한 용기 내에, 검정의 수행에 필요한 나머지 시약 및 물질과 함께, 뿐만 아니라 검정 지침서의 적합한 세트와 함께 패키징함으로써 구축된다.
폴리뉴클레오티드 프로브는 또한 진단 키트에 패키징될 수 있다. 진단 키트는 표지될 수 있는 프로브 DNA를 포함하고; 대안적으로, 프로브 DNA는 표지되지 않을 수 있고, 표지를 위한 성분이 키트에 포함될 수 있다. 키트는 또한 특정한 혼성화 프로토콜에 필요한 다른 적합하게 패키징된 시약 및 물질, 예를 들어 표준물질, 뿐만 아니라 시험을 수행하기 위한 지침서를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 적어도 하나의 5' 말단 캡을 갖는 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HCMV 백신을 제공한다. 일부 실시양태에서, 5' 말단 캡은 7mG(5')ppp(5')NlmpNp이다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HCMV 백신을 제공하며, 여기서 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드는 제2 화학적 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드는 5' 말단 캡을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 적어도 1종의 HCMV 항원성 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 적어도 1종의 리보핵산 (RNA) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HCMV 백신을 제공하며, 여기서 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 적어도 80% (예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%)는 화학적 변형을 갖고, 임의로 여기서 백신은 지질 나노입자 중에 제제화된다. 일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 100%는 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 우라실의 5-위치에 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 N1-메틸 슈도우리딘이다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 본원에서 이온화가능한 양이온성 지질 나노입자, 이온화가능한 지질 나노입자 및 지질 나노입자로도 지칭되는 (이들은 상호교환가능하게 사용됨) 양이온성 지질 나노입자 내에 제제화된 HCMV 백신을 제공한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, PEG-변형된 지질, 스테롤 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 이온화가능한 양이온성 지질이고, 비-양이온성 지질은 중성 지질이고, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트 (DLin-MC3-DMA), 및 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트 (L319)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 20-60% 양이온성 지질, 약 5-25% 비-양이온성 지질, 약 25-55% 스테롤 및 약 0.5-15% PEG-변형된 지질의 몰비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 0.4 미만의 다분산도 값을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 중성 pH에서 순 중성 전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 50-200 nm의 평균 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 80%는 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임 내 우라실의 100%는 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 우라실의 5-위치에 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘이다. 일부 실시양태에서, 백신은 지질 나노입자 내에 제제화된다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, PEG-변형된 지질, 스테롤 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 이온화가능한 양이온성 지질이고, 비-양이온성 지질은 중성 지질이고, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트 (DLin-MC3-DMA), 및 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트 (L319)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 대상체에게 HCMV RNA 백신을 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 면역 반응은 T 세포 반응 또는 B 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 면역 반응은 T 세포 반응 및 B 세포 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 방법은 백신의 단일 투여를 수반한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 부스터 용량의 백신을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 피내 또는 근육내 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
또한, 대상체에게 HCMV RNA 백신을 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 HCMV RNA 백신이 본원에 제공된다.
대상체에게 HCMV RNA 백신을 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 HCMV RNA 백신의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
대상체에게 본 개시내용의 백신을 투여하는 것을 포함하는, HCMV 감염을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 본원에 개시된 HCMV 백신은 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 유효량으로 제제화될 수 있다.
용어 "폴리펩티드 변이체"는 그의 아미노산 서열이 천연 또는 참조 서열과 상이한 분자를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 천연 또는 참조 서열과 비교하여 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유할 수 있다. 통상적으로, 변이체는 천연 또는 참조 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연 또는 참조 서열에 대해 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 공유한다.
일부 실시양태에서, "변이체 모방체"가 제공된다. 본원에 사용된 용어 "변이체 모방체"는 활성화된 서열을 모방할 적어도 1개의 아미노산을 함유하는 것이다. 예를 들어, 글루타메이트는 포스포로-트레오닌 및/또는 포스포로-세린에 대한 모방체로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 변이체 모방체는 탈활성화를 유발할 수 있거나, 또는 모방체를 함유하는 불활성화된 생성물을 유발할 수 있으며, 예를 들어 페닐알라닌은 티로신에 대한 불활성화 치환으로서 작용할 수 있거나; 또는 알라닌은 세린에 대한 불활성화 치환으로서 작용할 수 있다. "오르토로그"는 종분화에 의해 공통 조상 유전자로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 지칭한다. 통상적으로, 오르토로그는 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. 오르토로그의 확인은 새로 서열분석된 게놈에서 유전자 기능의 신뢰가능한 예측에 중요하다. "유사체"는 모 또는 출발 폴리펩티드의 특성 중 하나 이상을 여전히 유지하는 1개 이상의 아미노산 변경, 예를 들어 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 따라 다른 폴리펩티드 변이체를 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용은 변이체 및 유도체를 포함한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 기반인 여러 유형의 조성물을 제공한다. 이들은, 예를 들어 치환, 삽입, 결실 및 공유 변이체 및 유도체를 포함한다. 용어 "유도체"는 용어 "변이체"와 동의어로 사용되지만, 일반적으로 참조 분자 또는 출발 분자에 비해 임의의 방식으로 변형 및/또는 변화된 분자를 지칭한다.
따라서, 참조 서열, 특히 본원에 개시된 폴리펩티드 서열과 관련하여 치환, 삽입 및/또는 부가, 결실 및 공유 변형을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 예를 들어, 서열 태그 또는 아미노산, 예컨대 1개 이상의 리신이 펩티드 서열에 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 단부에서) 부가될 수 있다. 서열 태그는 펩티드 검출, 정제 또는 국재화에 사용될 수 있다. 리신은 펩티드 용해도를 증가시키거나 비오티닐화를 허용하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 및 아미노 말단 영역에 위치한 아미노산 잔기는 임의로 결실되어 말단절단된 서열을 제공할 수 있다. 특정 아미노산 (예를 들어, C-말단 또는 N-말단 잔기)은 대안적으로 서열의 사용에 따라, 예를 들어 서열이 가용성인 보다 큰 서열의 일부로서, 또는 고체 지지체에 연결되어 발현됨에 따라, 결실될 수 있다. 폴리펩티드를 언급할 때 "치환 변이체"는 천연 또는 출발 서열 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 상이한 아미노산이 동일한 위치에서 그 자리에 삽입된 것이다. 치환은 분자 내의 단지 1개의 아미노산이 치환된 경우에 단일일 수 있거나, 또는 동일한 분자 내에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 경우에 다중일 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CMV gB 폴리펩티드는 서열식별번호: 1과 비교하여 하기 도메인 서열 중 하나 이상이 결여된 말단절단된 폴리펩티드이다: (1) 도메인 V (잔기 124-344), (2) MPR 도메인 (잔기 705-750), (3) TM 도메인 (잔기 751-772), 또는 (3) CT 도메인 (잔기 773-907). 본원에 사용된 용어 "말단절단된"은 서열이 본원에 제시된 바와 같은 도메인을 포함하는 잔기의 일부 또는 전부가 결여되어 있음을 의미할 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, CMV gB 폴리펩티드는 하기 도메인 및 잔기 (서열식별번호: 1)를 포함한다: (i) 도메인 I (잔기 134-344), (ii) 도메인 II (잔기 121-133 및 345-436), (iii) 도메인 III (잔기 97-111, 475-539 및 640-648), (iv) 도메인 IV (잔기 88-96, 540-639 및 551-641), (v) 도메인 V (잔기 649-707), (vi) 막-근위 영역 (MPR) (잔기 705-750), (vii) 막횡단 도메인 (TM) (잔기 751-772), 및 (viii) 세포질 도메인 (CT) (잔기 773-907). 또 다른 측면에서, CMV gB의 엑토도메인은 서열식별번호: 1의 잔기 1-707 또는 23-707 (신호 서열 없음)을 포함한다. 또 다른 측면에서, 엑토도메인은 도메인 V가 결여되어 있고, 잔기 1-646 또는 23-646 (신호 서열 없음)을 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 예시적인 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 한다.
실시예 1: 융합 억제제를 사용한 가교된 및 천연 HCMV gB (타운 균주)의 단리 및 정제
샘플 제조 동안, HCMV 융합 억제제 (문헌 [Bloom et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14 (2004) 3401-3406]에 기재된 화합물 28; 또한 도 5D 참조)를 바이러스 농축, 처리, 추출 및 정제 동안 각 단계에 첨가하여 gB의 융합후 형태로의 전환을 억제하였다.
비리온 표면 상의 단백질을 비스(술포숙신이미딜) 글루타레이트 (BS2G)와 가교시키고, 세제를 사용하여 비리온으로부터 gB를 추출한 후, SM5-1 His/Strep-태그부착된 Fab (Potzsch et al., PLoS pathogens 7(8):e1002172, 2011)를 첨가하여 전자 극저온 현미경검사에 의한 gB의 정제 및 확인을 보조하였다. Fab-gB 복합체를 친화성 칼럼에 의해 정제하였다.
이어서, 이들 추출 및 정제된 단백질을 전자 극저온 현미경검사에 의해 융합전 gB의 존재에 대해 분석하고, 융합전 형태의 구조를 해석하는 데 사용하였다.
실시예 2: 전자 현미경검사
그래핀 옥시드 필름-지지된 전자 현미경검사 그리드를 제조하였다. gB 샘플 용액을 비트로보트(Vitrobot) (써모피셔(ThermoFisher))를 사용하여 유리화시켰다. 동결 그리드를 300 kV에서 작동하는 FEI 티탄 크리오스(Titan Krios) 투과 전자 현미경으로 옮겼다. 표적 위치를 SerialEM 프로그램에서 설정하고, 고해상도 동영상 모드를 사용하는 K2 직접 검출기 카메라 (가탄(Gatan))를 사용하여 상기 프로그램으로 고배율 (18000X) 영상을 자동으로 수집하였다. 언비닝 픽셀 크기는 0.638Å이었고, 빔 강도는 ~8e/언비닝 픽셀/s였다. 각각의 동영상에 대한 샘플 상의 총 전자 선량은 ~40e/Å2이었다. 각각 28개의 프레임을 갖는 총 7,771개의 동영상을 3개의 세션에서 수집하였다.
영상 처리
드리프트 보정은 MotionCor2 프로그램 (Zheng S et al. Nature Methods 14, 331-332 (2017))을 사용하여 수행하였고, 최종 현미경사진은 2X 비닝하고, 모든 프레임으로부터 평균내었다. 조영제 전달 함수 파라미터는 Gctf로 계산하였다 (Kai Zhang, Journal of Structural Biology 193(1), 1-12 (2016)). 입자 선발을 위해, 융합후 입체형태의 HCMV gB의 공개된 구조 (PDB:5CXF)를 사용하여 pdb2mrc (EMAN)를 사용한 30Å 밀도 지도를 생성하였다 (Ludtke, S. et al. Journal of Structural Biology 128(1), 82-97 (1999)). 이 밀도 맵으로부터의 투사 영상을 project3d (EMAN)로 생성하고 (도 1), 가우토매치(Gautomatch) 프로그램을 사용하여 자동 입자 선별을 위한 주형으로서 사용하였다 (Urnavicius L, et al. Science 347(6229):1441-1446 (2015)). 릴리온(Relion) v2.1-베타 (Scheres, S.H. Journal of Structural Biology 180(3): 519-530 (2012))를 사용하여 생성된 ~190만개의 입자를 추출하고, 2D 분류, 3D 분류, 자동-정밀화 및 후-처리를 포함한 모든 후속 영상 처리 단계를 수행하였다. 2D 부류는 영상 특색에 기초하여 3개의 군으로 분류되었다: 제1 군은 결정학적으로 결정된 융합후 gB 구조와 유사한 특색을 보인 2D 부류로 이루어졌고 (>50%); 제2 군은 융합후 gB로부터의 구조적 특색과 유사하지 않은 잘 풀린 단백질 특색을 갖는 2D 부류를 함유하였고 (<10%); 제3 군은 명백하게 규정된 단백질을 함유하지 않은 2D 부류를 함유하였다 (~40%) (도 1). 제1 및 제2 군을 3D 분류, 자동 정밀화 및 렐리온(Relion)으로의 후처리 절차로 추가로 처리하였다. 이 처리 후에, 융합후 입체형태 구조를 나타내는 ~3.5Å 해상도 전자 밀도 맵을 제1 군으로부터 재구성하고; 융합전 입체형태 구조를 나타내는 ~3.6Å 해상도 전자 밀도 맵을 제2 군으로부터 재구성하였다. 이들 밀도 맵 및 공지된 HCMV gB 아미노산 서열 (타운 균주 P13201, 서열식별번호: 1)에 기초하여, 융합전 및 융합후 입체형태 구조에 대해 Coot 프로그램 (Emsley P. et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 4): 486-501 (2010))을 사용하여 원자 모델을 구축하였다. 융합후 gB 결정 구조 (PDB 수탁 코드 5CXF) 및 SM5-1 fab와 gB 도메인 II 사이의 복합체의 결정 구조 (PDB 수탁 코드 4OT1)를 두 구조에 대한 초기 모델로서 사용하였다. 융합후 구조 모델의 경우, 작은 조정으로 전자 밀도에 대한 우수한 핏을 충분히 얻었다. 융합전 입체형태 모델의 경우, 참조 PDB 모델로부터의 도메인 I, II, III 및 IV는 출발점으로서 전자 밀도 맵 내로 강성체로서 도킹될 수 있다. 이어서, 최적 피팅을 위해 개별 잔기의 조정을 수행하였다. 도메인 V, MPR 및 TM에 대한 모델을 새로 구축하였다. 모델을 피닉스.리얼_스페이스_리파인(Phenix.real_space_refine) 도구 (Afonine PV et al. Acta Crystallogr D Struct Biol 74(Pt 6): 531-544 (2018))로 반복적으로 정밀화한 후, 수회의 라운드 동안 국부 수동 조정하였다.
결과
cryoEM에 의한 샘플 스크리닝
gB의 융합전 입체형태는 불안정하며, 샘플 취급 동안을 포함하여 융합후 상태로 재배열되는 경향이 있다. 따라서, 연구된 샘플은 구조 결정을 복잡하게 하는 gB 이형태체의 혼합물을 함유하였다. 또한, 융합전 gB의 도메인의 배열 또는 독특한 구조적 특색에 대한 기존의 신뢰할 수 있는 정보는 없었다. 본 발명자들은 상이한 샘플 제조 조건을 스크리닝하기 위해 전자 현미경검사 및 영상 처리에 의한 직접 시각화를 사용하였다. 2D 및 3D 분류에 의한 영상 분류는 다중 구조가 불균질 샘플로부터 결정되도록 한다. 그러나, 이는 각각의 구조에 대한 충분한 입자가 조합되어 우수한 신호를 갖는 부류 평균을 생성할 수 있도록 하는 큰 데이터 세트를 필요로 한다. 이는 특히 gB 샘플의 경우였는데, 융합전 gB가 혼합물 중 소집단이기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 각각의 조건에 대해 ~1,000개의 동영상을 수집하고, 동일한 샘플로부터의 보다 많은 데이터로 영상 처리를 진행할지 또는 2D 분류 단계에서 또 다른 것으로 전환할지 여부를 결정하였다. 항체 Fab-결합된 융합후 입체형태 gB의 구조는 많은 데이터세트로부터 용이하게 수득되었다. 이들 Fab-결합된 융합후 입체형태 구조로부터의 투사 영상을 참조로서 사용하여 융합전 영상 재구성을 위한 영상을 선택하는 것을 피하였다. 본 발명자들은 추가의 영상 처리를 위해 임의의 융합후 gB 투사 영상과 유사하지 않은 단백질 특색을 갖는 임의의 우수한 부류 평균을 선택하였다. 본 발명자들은 이러한 전략으로 샘플 제조를 위한 수십 개의 조건을 스크리닝하였고, 마침내 입자 집단에서 부차적 종으로서 일부 대안적 2D 부류를 생산한 샘플을 발견하였다 (도 1B, 원형). 이어서, 총 7,771개의 동영상을 그 샘플로부터 수집하고, 융합전 gB 구조의 결정에 사용하였다.
항체 Fab-결합된 융합후 gB 구조의 투사 영상은 도 1A에 제시된다. 수집된 데이터세트로부터의 2D 부류 평균은 도 1B에 제시된다. 융합후 gB 참조 2D 투사도 중 어느 것과도 유사하지 않은 일부 부류는 동그라미로 표시된다.
융합전 입체형태 구조의 수득
대략 190만개의 미가공 입자 영상을 데이터 세트로부터 자동으로 선택하였다. 2D 분류 후, 영상을 융합후 부류 (입자 집단의 55%) 및 융합전 부류 (입자 집단의 10%)로 그룹화하였다. 2개의 군을 3D로 추가로 처리하고, C3 대칭을 적용하여 3.5Å 해상도에서 SM5-1 Fab-결합된 융합후 gB의 밀도 맵 및 3.6Å 해상도에서 SM5-1 Fab-결합된 융합전 gB의 밀도 맵을 수득하였다.
SM5-1 Fab 및 융합후 gB의 엑토도메인의 X선 결정학-기반 모델을 강성체 도킹으로 융합후 밀도 맵에 피팅하였다. Fab의 불변 도메인 (이는 강한 전자 밀도를 생성하기에는 너무 가요성일 가능성이 있음)을 제외하고는, 융합후 gB-Fab 복합체의 밀도 맵 및 모델은 서로 잘 일치하였다 (도 3A). 막 근위 영역, 막횡단 영역 및 세포질 도메인은 본 발명자들의 최종 융합후 gB 밀도 지도에서 해소되지 않았으며, 이는 이들 융합후 gB 영역이 본질적으로 또는 샘플 제제에서 세제 가용화를 통해 가요성임을 시사한다 (도 2, 하부 선). 전자 극저온 현미경검사-기반 모델에서 융합후 gB의 Fab 및 DII의 상호작용은 이전에 결정된 복합체의 결정 구조 (PDB 수탁 코드 4OT1)와 잘 일치한다.
공지된 Fab 결합 위치에 의해 안내되는 융합전 gB 모델을 구축하기 위해, 융합후 gB 결정 구조로부터의 도메인 I, II, III, 및 도메인 IV의 부분을 융합전 gB-Fab 복합체의 밀도 맵에 개별적으로 도킹하고, 전자 밀도의 최적 적합화를 위해 필요에 따라 개별 잔기를 수동으로 조정하였다. 융합전 gB 구조의 나머지를 새로 구축하였다. 융합전 구조로 모델링된 gB의 아미노산은 도 2의 상단 라인에 표시된다. 융합전 gB-Fab 복합체의 모델은 융합전 밀도 맵의 대다수의 부분에 적합하며, Fab 밀도의 존재는 신규 구조에서 gB의 정체를 확인시켜 준다 (도 3B).
본 실시예와 관련된 융합전 gB의 모델에 대한 좌표 및 구조 인자가 표 1A에 제공된다.
융합전 입체형태의 gB의 구조 및 융합후 gB와의 비교
융합전 gB 및 SM5-1 Fab의 복합체에 대한 전자 밀도는 gB 엑토도메인, 막 근위 영역 (MPR - 바이러스 막에 평행하게 배향된 나선 영역), 및 단일 스팬 막횡단 나선 (TM)을 포함하는 융합전 gB 모델의 구축을 허용하였다 (도 3B 및 도 4B). MPR 및 TM 영역은 융합후 gB에 대한 구조적 데이터에서 해소되지 않았거나 또는 융합후 gB 모델에 포함되지 않았다.
융합전 및 융합후 gB의 전반적인 치수는 상이하다 (도 4A 대 도 4B). 융합후 gB 삼량체 엑토도메인은 막대 형상을 갖고, 대략 165Å의 높이 (막 원위 말단에서 각각의 프로토머의 프롤린 (570) 및 막 근위 말단에서 각각의 프로토머의 트립토판 (240)에 의해 형성된 평면 사이의 거리; 도 4A)를 갖는다. 이는 대략 65Å의 폭 (인접한 프로토머 상의 알라닌 315 사이의 거리)을 갖는다. 본원에 기재된 구조는 HCMV 균주 타운의 gB로부터 유래되었다. gB 아미노산 서열의 일부 천연 변이가 존재하지만, 타운 gB의 전체 융합후 구조는 균주 AD169 (PDB 수탁 코드 5CXF)로부터의 gB의 융합후 구조와 거의 동일하다. 따라서, 융합후 gB 구조의 기재를 두 균주에 적용하고, 서열 정렬로부터의 동등한 아미노산으로부터 측정한다.
융합전 gB 삼량체는 융합후 gB 삼량체보다 더 작달막한 형상을 갖는다 (도 4A 대 도 4B). 각각의 프로토머의 W240에 의해 형성된 평면과 융합전 구조 내에서 가장 막 원위에 모델링된 잔기인 Q483 사이의 거리는 대략 115Å이다. 융합전 모델은 95Å 폭 (상이한 프로토머로부터의 임의의 2개의 A315 사이의 거리에 의해 측정됨)이다.
도메인 I, II, III 및 IV의 개별 서브유닛 구조는 융합전 및 융합후 입체형태에서 유사하다. 그러나, 이들 도메인의 전체 배열은 2개의 입체형태에서 매우 상이하다 (도 4A-4B 및 도 6A-6C). 융합전 입체형태에서, DI의 팁에서의 융합 루프 및 도메인 III 내의 중심 나선 다발의 C-말단은 모두 TM 영역의 위치에 의해 확인되는 바와 같이 비리온 외피를 향해 동일한 방향을 향한다 (도 4AI 및 도 6A). 대조적으로, 융합후 입체형태에서, 융합 루프 및 중심 나선 다발의 C-말단은 반대 방향을 가리킨다 (도 4B 및 도 6C).
융합전 구조에서, 융합 루프 내의 소수성 잔기 (잔기 Y155, I156, H157 및 W240, L241)는 MPR에 매우 근접하고, 아마도 세제에 의해 둘러싸인다 (도 4AI 및 도 6A).
융합전으로부터 융합후로의 전이에서, 도메인 II는 도메인 III 중심 코일드-코일의 중간-방향의 위치에서 코일드-코일의 막 근위 단부 및 융합 루프에 대향하는 도메인 I의 단부 근처의 위치로 이동한다 (도 4A 및 도 4B).
DIII의 구조 (도 4A-4B 및 도 6A-6C)는 융합전 및 융합후 입체형태에서 매우 유사하다. 두 입체형태의 중심 나선은 L479에서 P525까지 걸쳐있으며, 이것은 융합전으로부터 융합후로의 전이 동안의 최소 재배열을 나타낸다. 그러나, 다른 도메인은 도메인 III의 중심 나선에 비해 그의 위치를 변화시켜, 상기 언급된 바와 같이, DIII 나선 다발의 (N-말단에서 C-말단으로의) 방향은 융합 루프로부터 융합후 입체형태에서 삼량체의 원위 말단을 향해 및 바이러스 막을 향해, 융합전 입체형태에서의 융합 루프와 동일한 방향으로 향한다.
융합전 구조에서, 도메인 IV (도 4A 및 도 6A)는 삼량체의 외부의 도메인 I와 삼량체의 중심의 도메인 III 및 V 사이의 계면에 매립된다. 대조적으로, 융합후 구조에서, 도메인 IV는 삼량체의 막-원위 팁에서 고도로 노출된 "크라운"을 형성한다.
도메인 V는 융합전 gB (도 4A 및 도 6A) 및 융합후 gB (도 4B 및 도 6C)에서 상이한 구조를 갖는다. 융합전 gB에서, 도메인의 N-말단 절반 (약 잔기 642-660)은 인접한 프로토머의 도메인 I와 도메인 IV 사이에 샌드위치되고, 용매로부터 격리된다. 도메인 V의 잔기 683-704 사이의 영역은 다른 프로토머에서 그의 대응물과 함께 삼량체 나선 다발을 형성한다. 이 나선 다발은 대부분 도메인 IV에 의해 형성된 "크라운"의 포켓 내부에 모여있다. 나선 다발을 도메인 V로부터 MPR 영역에 연결하는 추가의 짧은 나선 (대략 잔기 710-719)이 존재한다. 대조적으로, 융합후 입체형태 (도 4B 및 도 6C)에서, 도메인 V는 용매 노출되고, 도메인 III 나선 다발의 외부 및 인접한 프로토머로부터의 도메인 I 사이의 계면에 의해 형성된 홈을 따라 연장된다.
융합전 및 융합후 gB 구조의 비교는 다른 잘 연구된 융합 단백질로부터 익숙한 입체형태 변화의 진행을 시사한다 (Harrison, S.C. Virology 0:498-507 (2015)). 비교는 본 발명에 기재된 구조가 사실상 융합전 입체형태라는 확신을 제공한다. 융합전 상태에서 (도 6A), 도메인 I의 융합 루프는 MPR 및 잠재적으로 바이러스 막과의 상호작용에 의해 매립된다. 원위 gB 상동체인 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질의 융합전 구조에서, 융합 루프는 또한 바이러스 막 (또한 MPR 영역의 예상된 위치, 이것은 그 구조에서 보이지 않음)을 향한다 (Roche et al. Science 315:843-8 (2007)).
다른 융합 단백질과의 유사성에 기초하여, 융합전 및 융합후 상태 사이의 제안된 연장된 중간체로의 전이의 일부로서 중심 나선의 연장과 함께 재배열이 진행될 가능성이 있다 (도 6B). 제안된 연장된 중간체 상태에서, TM 영역은 여전히 바이러스 막에 고정될 것이고, 이제 회전되고 전위된 도메인 I의 팁에서 바이러스 막으로부터 멀리 연장된 융합 루프는 세포 막과 상호작용할 것이다. 제안된 연장된 중간체로부터 융합후 입체형태로의 전이는 막횡단 영역 및 융합 루프가 다시 분자의 동일한 말단에서 서로 근접하도록 하는 폴드-백을 수반할 것이며, 이 때 둘 다 융합된 바이러스 및 세포 막과 상호작용한다 (도 6C).
본 발명자들은, 융합전 gB에서 중심 나선의 길이의 동적 변화가 있을 수 있고, 본 발명자들이 결정한 융합전 구조가 "호흡" 분자의 "스냅샷"을 나타내며, 이는 전자 극저온 현미경검사에 의해 연구된 샘플을 제조하는 데 사용된 융합 억제제 및 가교제에 의한 전자 밀도에서 본 발명자들이 보는 입체형태로 잠금된 것으로 추측한다.
관찰된 융합전 입체형태에 대한 안정화 인자
gB 아미노산을 전자 밀도 맵으로 모델링한 후, 아미노산 잔기에 의해 채워지지 않은 밀도의 영역은 MPR, 도메인 V, 및 융합 루프를 함유하는 도메인 I의 팁 사이에 남아있었다 (도 5A). 채워지지 않은 밀도의 크기 및 형상은 HCMV 융합 억제제인 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드의 화학 구조 (도 5D)에 부합하며, 이는 전자 극저온 현미경검사에 의해 연구된 샘플의 제조 전반에 걸쳐 존재하였다 (도 5B). 화합물은 트리플루오로메틸 페닐 모이어티와 화합물의 나머지 부분 사이에 꼬임이 있는 포즈를 채택하였다. 티아졸은 인접한 프로토머로부터의 L712, A738 및 Y153, Y155의 소수성 잔기와 접촉을 형성한다. 페닐은 L715의 잔기, 인접한 프로토머의 도메인 V로부터의 D714, MPR로부터의 G734 및 I730, 및 TM 도메인으로부터의 F752에 의해 형성된 소수성 환경에서 둘러싸인다. 트리플루오로메틸 페닐은 또 다른 프로토머로부터의 MPR 및 TM 나선 사이의 힌지 근처의 소수성 환경에 존재한다. 이는 MPR 및 TM 도메인의 외향 이동을 방지하기 위한 후크로서 작용할 수 있다. 억제제 화합물에 의해 조정되는 상호작용 이외에도, 다른 융합 루프로부터의 W240, Y242는 각각 MPR 영역로부터의 소수성 패치 및 도메인 V에서의 L715와 반 데르 발스 상호작용을 형성하고 있다 (도 5C). 융합 억제제 주위의 이들 특이적 상호작용은 도메인 I, 도메인 V 및 MPR을 함께 보유하고, 융합 프로세스 동안 도메인 I, 도메인 V 및 MPR 사이의 이동을 제한할 것으로 예상될 것이다 (도 6A-6C).
융합전 입체형태의 안정성에 대한 가교의 효과를 또한 시험하였다. 샘플 제조 단계 동안, BS2G 가교 시약을 첨가하였거나 또는 첨가하지 않았다. 가교제의 부재 하에, 융합전 대 융합후 입체형태의 입자의 비는 1:100인 반면, BS2G 시약에 의해 가교된 샘플에서의 비는 1:4였다. 가교제는 전자 밀도에서 확인되지 않았다.
본원에 기재된 도면에 제시된 CMV gB의 융합전 구조 및 융합전 및 융합후 구조의 컬러 버전은 또한 문헌 [Liu et al. Science Advances 7(10): eabf3178 (2021)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예 3: gB1666의 발현 및 정제
gB1666의 생산을 위해, PSB1666 구축물을 Expi293F 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포 펠릿을 형질감염 96시간 후에 수거하였다. PSB1666 단백질을 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% DDM, 0.002% CHS, 3 μg/ml WAY-174865 (억제제, 도 5D 참조) 내에서 일련의 가용화, 친화도 칼럼 및 크기 배제 크로마토그래피 공정을 통해 정제하였다. 단백질을 SDS-PAGE 상에서 및 EM에 의해 음성 염색으로 분석하여 단백질의 적어도 50%가 융합전 입체형태를 나타내는 것을 보장하였다. PSB1666 단백질은 Expi293F 세포의 형질감염에서 효율적으로 발현되고, 1L 발현은 ~0.1 mg의 정제된 PSB1666을 고품질로 생성할 것이다.
폴리펩티드 gB1666 (PSB1666) (서열식별번호: 57)은 도메인 I 및 IV에 돌연변이를 포함한다. 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 제시된 상응하는 야생형 gB (타운)에 비해 하기 돌연변이, D217C 및 Y589C를 포함한다.
실시예 4: DNA-발현된 gB1666은 Balb/c 마우스에서 면역원성이다
제안된 안정화된 전장 융합전 gB 구축물 중 하나인 gB1666 (서열식별번호: 57)은 EM에 의해 융합 억제제 (WAY-174865; 도 5D 참조)의 존재 하에 형질감염된 포유동물 세포로부터의 정제 후에 타운 균주의 야생형 gB에 비해 융합전 입체형태의 분자의 비율이 증가된 것으로 나타났다. 이 분자가 생체내에서 면역 반응을 도출할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, gB1666 및 야생형 gB에 상응하는 DNA 서열을 사내 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 10마리의 Balb/c 마우스에 gB1666을 코딩하는 DNA 100 ug을 3주 간격으로 2회 전기천공하였다 (D0 및 D21). 추가의 10마리의 마우스를 야생형 gB를 코딩하는 DNA로 동일한 프로토콜에 의해 전기천공하고, 제3 군을 포스페이트-완충 염수로 이루어진 위약으로 전기천공하였다. 혈청 샘플을 제28일에 수집하였다. 표준 프로토콜에 따라 항-gB IgG 반응을 결정하기 위해, 타운 균주의 야생형 서열에 기초하지만 막횡단 도메인이 제거된 (시노 바이올로지칼스(Sino Biologicals)) 포유동물 세포로부터 생산된 재조합 gB 단백질에 대해 ELISA를 수행하였다. 야생형 gB DNA 면역화된 마우스로부터의 10마리의 동물 중 10마리 및 10마리의 gB1666 DNA 면역화된 마우스 중 9마리가 검출가능한 항-gB IgG 역가를 생성하였다 (도 11, 평균 ± SD, LLOQ = 25를 나타냄). 연구는 gB1666이 Balb/c 마우스에서 면역원성임을 입증한다.
실시예 5: 안정화된 융합전 gB1666 단백질의 면역원성 연구
마우스에서의 gB1666의 면역원성 연구. 마우스에서 항체 반응을 평가하기 위해, 하기 면역화 계획을 따를 것이다. 제8주에, 마우스를 방혈시키고, 면역화된 동물 혈청으로부터의 중화 역가를 결정하고, gB705 (융합후) 및/또는 gB 야생형 단백질로 면역화된 것과 비교할 것이다.
표 5. gB1666 단백질을 사용한 마우스 면역원성 연구 설계
Figure pct00013
실시예 6
실시예 2에서, 본 발명자들은 항체 단편과 복합체화된 융합전 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV) 균주 타운 당단백질 B (gB)의 전자 극저온 현미경검사 (cryoEM) 구조를 개시하였다. 구조 결정에 사용된 gB는 소분자 융합 억제제, WAY-174865를 포유동물 세포 배양물 중 정격 HCMV의 발효에 첨가하고, gB의 생산 및 분석 전반에 걸쳐 억제제의 존재를 유지하고; 바이러스를 정제하고; 바이러스를 화학적 가교 링커, 비스(술포숙신이미딜) 글루타레이트 (BS2G; 7.7Å 스페이서 아암)로 처리하고; 세제로 바이러스로부터 gB를 추출하고; 비리온 상의 gB를 친화도 태그부착된 항체 단편과 결합시키고; gB를 친화도 및 크기결정 칼럼에 의해 정제함으로써 수득하였다. 본 발명자들은 또한 융합전 상태에서 gB를 안정화시키는 돌연변이를 조작하기 위한 융합전 gB cryoEM 구조의 용도를 개시하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 2개의 잔기가 시스테인으로 돌연변이된 (D217C, Y589C) 재조합 gB 단백질 gB1666을 개시하였다. 생성된 C217과 C589 사이의 조작된 디술피드 결합의 형성은 융합전 상태에서 재조합 gB의 입체형태적 안정성을 증가시킨다. gB1666은 그것이 Expi293F 세포에서 발현되고 융합 억제제인 화합물 WAY-174865의 존재 하에 정제될 때 융합전 구조적 특색을 유지하였다. 억제제의 부재 하에, gB1666은 입체형태적 변화를 겪고 그의 융합전 구조적 상태를 상실하는 경향이 있다. 억제제의 부재 하에 융합전 입체형태적 안정성의 상실은 면역화를 위한 항원으로서의 재조합 당단백질의 사용에 바람직한 특징이 아니다. gB1666이 억제제와 함께 제제화되더라도, 사람 또는 동물에의 주사 시, 생체내 억제제의 희석이 gB1666으로부터의 그의 해리 및 gB1666의 융합전 입체형태의 상실로 이어질 위험이 있다. 따라서, HCMV gB는 WAY-174865의 부재 하에 융합전 상태로 유지되도록 융합전 입체형태로 충분히 안정화되는 것이 바람직하다. 융합전 gB 면역원이 제조성을 개선시키고, 용해도를 개선시키고, 균질성을 개선시키고, gB 막횡단 영역에 의해 매개되는 응집 또는 침전을 방지하기 위해 세제 또는 다른 부형제와 함께 제제화할 필요성을 감소시키거나 제거하도록 가용성 엑토도메인을 포함하는 것이 또한 바람직하다.
본 발명자들은 지금에 이르러, 구조-기반 조작 접근법을 통해, 면역원으로서 융합전 gB의 사용을 위한 이들 개선된 특징을 부여하는 HCMV gB에서의 새로운 돌연변이에 관한 본 발명을 보고한다. 먼저, 본 발명자들은 나노디스크에 고정시킴으로써 가용화되고 WAY-174865의 존재에 의해 융합전 입체형태에서 안정화된 gB1666의 구조를 cryoEM에 의해 결정하였다 (도 12). 재조합, D217C 및 Y589C 돌연변이 gB의 대부분의 새로운 구조는 본 발명자들이 이전에 결정한 비리온-유래, 화학적으로 가교된 항체 단편 결합된 HCMV 타운 융합전 gB의 구조와 유사하지만, 특정 국부 영역에서 2개의 구조 사이에 미묘한 차이가 있다. 구조에서의 차이는 제제에서의 하기 여러 차이를 반영할 수 있다: 첫째로, 당단백질의 호흡 운동을 제한할 gB1666에서의 조작된 디술피드 결합의 존재; 둘째로, 이전 구조 결정을 위해 용액 중에서 gB를 추출하고 유지하는 데 사용된 세제보다 막횡단 도메인에 대해 보다 천연 국부 지질 환경을 제공하는 나노디스크에서의 gB1666의 고정; 셋째로, gB1666의 화학적 가교의 부재; 넷째로, 아미노산 측쇄의 보다 정확한 모델링을 가능하게 하는, 이전 구조의 3.6Å 해상도와 비교하여 새로운 구조의 3.3Å에서의 보다 높은 해상도.
새로운 구조적 정보에 기초하여, 본 발명자들은 전장 gB 구축물 pSB1666의 배경에 추가의 안정화 돌연변이를 설계하였다 (표 6 및 표 7). 본 발명자들은 pSB1666 배경에 이들 추가의 돌연변이를 부가하면 융합전 상태에서 gB를 추가로 안정화시킬 것으로 가정하였다 (도 13). 예를 들어, 잔기 M371 및 W506에서의 시스테인 돌연변이는 도메인 II와 III 사이에 디술피드 결합을 도입할 수 있고; (F541, E681) 및 (N524, M684)의 쌍에서의 시스테인 돌연변이는 도메인 IV와 V 사이에 디술피드 결합을 도입할 수 있고; 잔기 E686, D679의 소수성 잔기로의 돌연변이는 국부적 탈안정화 동일 전하 반발 패치를 제거하고 단백질 안정성을 증가시킬 수 있다. 새로운 부가된 돌연변이의 선택을 갖는 재조합 당단백질을 융합 억제제의 부재 하에 및 화학적 가교 없이 발현시키고 정제하였다. SDS-PAGE에 의한 발현된 당단백질의 전기영동 이동성은 글리코실화와 일치하는 예상된 겉보기 분자량 및 불균질성을 보여주었다 (도 14). 샘플을 4℃에서 보관하고, 제1일 및 제7일에 음성 염색된 전자 현미경검사 분석을 위해 분취물을 취하였다. 2D 부류 평균화된 영상에서, gB의 융합전 입체형태의 "상면도"와 유사한 삼각형 형상의 특색이 명백하였다. 융합전 및 융합후 부류에 속하는 집단 내의 입자의 비는 제1일에 5:1 및 제7일에 3:1이었다 (도 15).
새로운 구조적 정보에 기초하여, 본 발명자들은 도 16A-16D에 도시된 바와 같이 융합전-안정화 돌연변이를 갖는 여러 가용성, 세제-무함유 gB 엑토도메인 (표 8)을 설계하였다. HCMV gB의 정제된 엑토도메인인 잔기 1-707은 로제트-유사 응집체를 형성하였으며, 여기서 gB 단백질은 그의 노출된 융합 루프를 통해 회합하였다. 응집을 제거하고 조건화 배지에 대한 단백질 분비를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 융합 루프 내의 4개의 노출된 소수성 잔기를 단순 헤르페스 바이러스-1 (HSV-1) gB로부터의 상응하는 보다 친수성인 아미노산, 예를 들어 YIH (155-157)→GHR, W240→A로 대체하였다. 본 발명자들은 또한 노출된 Cys246을 Ser (C246→S)로 돌연변이시켜 의사 디술피드 결합의 형성을 방지하였다. 항원의 융합전 삼량체 상태를 추가로 안정화시키기 위해, 본 발명자들은 프로토머간 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하거나 또는 C-말단 삼량체화 모티프, 예를 들어 T4-박테리오파지 피브리틴으로부터의 GCN4 또는 폴드온을 부가하였다. 디술피드 돌연변이, 예를 들어 D217C-Y589C, M317C-W506C, N524C-M684C를 추가로 도입하여 단백질을 융합전 상태로 잠갔다. 재조합 당단백질을 발현시키고, 조건화 배지로 분비시키고, 융합 억제제의 부재 하에 화학적 세제 없이 정제하였다. 특히, GCN4 삼량체화 모티프에 융합된 재조합 변이체는 최적의 크기-배제 크로마토그래피 프로파일을 나타냈다 (도 17). 음성 염색된 전자 현미경검사는 억제제 및 세제의 부재 하에 단분산 단백질로서 재조합 단백질, gB2555 및 gB2556을 나타냈다. 예상된 gB 단백질 특색은 2D 부류 평균화된 영상에서 관찰된다 (도 18 및 도 19). 이들 결과는 이들 조작된 구축물이 필요한 경우에 억제제 및 세제의 부재 하에 융합전 형태의 gB에 대해 보다 많은 안정화 돌연변이를 부가하기 위한 프레임워크로서 사용하기에 적합하다는 것을 확인시켜 준다.
본 실시예와 관련된 융합전 gB의 모델에 대한 좌표 및 구조 인자가 표 1B에 제공된다.
표 6. 디술피드 결합 안정화를 위한 예시적인 시스테인 쌍 돌연변이
Figure pct00014
표 7. 안정화를 위한 예시적인 전하 돌연변이
Figure pct00015
표 8. 구축물 돌연변이.
Figure pct00016
표 8에 제시된 구축물을 상이한 조건 하에 정제된 재조합 단백질 제제에서 융합전 gB의 존재를 시험할 목적으로 제조하였다.
표 9. 예시적인 가용성, 세제-무함유 gB 엑토도메인 단백질
Figure pct00017
* YIH (155-157)→GHR, W240→A 및 C246→S를 포함한 돌연변이를 gB에 혼입시켜 응집을 감소시키고 단백질 분비를 증가시켰다.
실시예 7: 안정화된 융합전 gB를 조작하기 위한 전반적인 전략
안정화된 융합전 gB를 조작하기 위해, 2가지 전략을 사용하였다:
i) 제1 전략은 융합전 구조에서 매우 근접한 잔기 사이의 디술피드 결합을 조작하고 분자의 다른 부분으로부터의 구조를 방해하지 않으면서 안정한 구조 모티프를 C-말단 단부에 그라프팅하는 것을 포함하는, 융합전 구조에서의 상호작용을 강화하는 것이고;
ii) 제2 전략은 융합전 입체형태로부터 에너지적으로 불리한 국부 구조를 제거하는 것이다. 이들은 하기를 포함한다: (a) 표면 노출된 소수성 잔기의 제거, (b) 루프 영역에서 프롤린의 비-프롤린 및 친수성 잔기로의 변화, 및 (c) 융합 과정 동안 큰 입체형태적 변화를 겪은 도메인 V의 제거 및 재조작. 이러한 설계의 조합을 사용하여 융합전 gB에 대한 충분한 안정화를 수득하였다. 이러한 설계된 돌연변이를 보유하는 단백질을 개별적으로 정제하고, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 열 용융 검정 (TM)에서의 그의 특성 및 전자 현미경검사 영상 (EM)으로부터의 그의 특색에 의해 스크리닝하였다.
돌연변이체 시스테인 쌍 구축물의 패널을 CMV gB 전장 융합후 구축물 pSB1764에 대해 스크리닝하였다. 제1 라운드에서, 각각의 새로운 구축물은 1개의 돌연변이체 시스테인 쌍을 포함하였다. 스크리닝된 돌연변이체의 완전한 목록은 표 10에 있다.
표 10: 전장 CMV gB 상에서 스크리닝된 한 쌍의 디술피드 결합 돌연변이체의 목록
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
억제제 WAY-174865와 조합된 시스테인 쌍 D217C-Y589C (pSB1666)가 융합전 상태에서 CMV gB를 안정화시켰음이 스크린으로부터 결정되었다.
융합 억제제의 존재 하에, 구축물 gB1666 (D217C 및 Y589C를 돌연변이시킴으로써 조작된 디술피드)은 SEC 체류 부피의 우측 이동 및 ~73℃에서의 뚜렷한 전이 온도를 나타냈으며, 이는 야생형 gB의 것과 상이한 입체형태를 나타낸다 (도 22A 및 22B). gB1666을 EM 영상화 실험에 의해 추가로 특징화하였다. cryoEM 데이터세트 2D 분류 결과로부터, 융합전 부류가 우세한 집단으로서 관찰되었고, 3D 구조 밀도 맵은 융합전 gB 구조를 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 억제제의 부재 하에, SEC로부터의 우측 이동된 피크 및 ~73℃에서의 전이 온도 피크는 덜 뚜렷하다 (도 23). 이는 단일 디술피드 결합이 융합전 상태에서 gB1666을 보유하는 제한된 효과를 가짐을 시사하였다.
따라서, 제2 라운드의 돌연변이를 gB1666의 프레임에서 스크리닝하여 억제제의 부재 하에 융합전 입체형태의 추가의 안정성을 생성하였다 (표 11). 제2 시스테인 쌍이 구축물 pSB1666 내로 도입된 새로운 돌연변이체 패널을 클로닝하고 스크리닝하였다. 목적은 융합전 상태에서 CMV gB를 추가로 안정화시키기 위해 또 다른 안정화 디술피드 가교를 첨가하는 것이었다.
표 11: 전장 CMV gB 상에서 스크리닝된 두 쌍의 디술피드 결합 돌연변이체의 목록
Figure pct00021
Figure pct00022
이러한 스크린으로부터, 시스테인 쌍 D217C-Y589C가 쌍 M371C-W506C (pSB2457) 또는 쌍 N524C-M684C (pSB2459)와 조합되어 안정화 억제제를 필요로 하지 않으면서 융합전 상태에서 CMV gB를 안정화시켰음이 결정되었다. gB2457 및 gB2459 단백질은 SEC 및 TM 결과에서 융합전 형태 (gB1666 + 억제제)와 유사한 프로파일을 나타냈다 (도 24A-24B). gB2457은 열 안정성 검정에서 ~73℃에서 보다 뚜렷한 전이를 가졌다 (도 24B). 또한, gB2457 및 gB2459 둘 다는 음성 염색 EM 2D 부류 평균화된 영상에서 융합전 gB 특색을 나타냈다 (데이터는 제시되지 않음). 융합 억제제의 부재 하에, gB2457 및 gB2459는 그의 모 설계, 즉 gB1666보다 융합전 gB의 보다 안정한 버전을 나타낸다. 이러한 개선은 또한 안정화 돌연변이 부위의 올바른 조합이 융합전 입체형태의 전반적인 안정성에 상승작용적으로 기여할 수 있다는 것을 확인시켜 준다.
융합전 gB의 전장 및 막 결합된 형태와 비교하여, 가용성 포맷의 융합전 gB는 단백질 생산의 확장성 및 정제의 용이성에서 이점을 제공하는 세제를 필요로 하지 않는다. 공지된 구조에 기초하여, gB로부터의 막 상호작용 도메인은 막 근위 영역 (MPR), 막횡단 (TM) 도메인 및 융합 루프이다. 세포질 꼬리 도메인은 또한 시토졸 측으로부터의 막과 상호작용할 수 있다. 따라서, 이들 막-상호작용 소수성 영역은 가용성 형태의 융합전 gB를 위한 설계에서 제거되거나 친수성 유형으로 전환되었다. 또한, 구조적으로 안정한 삼량체화 태그 (예를 들어, GCN4, 시스테인 고리, 삼량체 폴드온)를 MPR 도메인 앞에서 말단절단된 단백질의 카르복시 말단에 부가하였다. 몇몇 말단절단 설계를 시험한 후에 GCN4 태그 (gB2267)를 엑토도메인 구축물 프레임으로서 사용하도록 선택하였다. 전장 프레임으로부터 확인된 안정화 돌연변이 부위를 상기 엑토도메인 프레임 상에 만들고, 스크리닝하였다 (표 12).
정제 후에 잘 거동하는 단백질인 생성된 gB2555 및 gB2556에서 (도 25A), 보다 낮은 온도 ~73°에서의 상 전이 피크는 명백하지 않았다 (도 25B). 그러나, 음성 염색 EM 영상으로부터의 2D 분류는 융합전 및 융합후 형태 둘 다가 존재하고 (데이터는 제시되지 않음), 추가의 안정화가 엑토도메인 융합전 gB에 대해 여전히 필요하다는 것을 나타냈다. 제3의 디술피드 결합 쌍을 pSB2556 배경 상에서 스크리닝하였지만 (표 12), 많은 개선은 관찰되지 않았다.
표 12. 삼중 디술피드 결합 쌍을 갖는 엑토도메인 CMV gB 돌연변이체
Figure pct00023
Figure pct00024
도메인 V는 큰 입체형태적 변화를 겪고 바이러스 세포와 숙주 세포 사이의 막 융합을 유도하기 위한 에너지를 제공할 것으로 예상되기 때문에, 새로운 접근법은 엑토도메인 gB로부터 도메인 V를 제거하는 것이었다. SB2562를 출발 구축물로서 선택하였다 (표 13 및 표 14).
표 13. 추가의 엑토도메인 설계
Figure pct00025
설계 중 하나는 D646 뒤의 잔기가 말단절단된 전체 도메인 V를 제거하였다. 디술피드 쌍은 N524C 및 M684C에서 더 이상 형성될 수 없었기 때문에, N524C를 그의 야생형 아스파라긴 잔기 (N)로 복귀시켜 유리 시스테인을 제거하였다 (pSB2796) (표 14). 이 구축물을 gB2796으로 명명하였고, SEC 프로파일에서 ~70℃에서 뚜렷한 상 전이 온도를 갖는 단일 피크로서 잘-거동된 단백질을 나타냈다 (도 26A 및 26B). cryoEM 데이터세트로부터, 2D 부류 평균은 엑토도메인 융합전 gB의 모델로부터의 구조적 특색에 상응하는 분명한 예상 단백질 밀도를 보여주었다. 3D 재구성된 밀도 엔벨로프는 또한 예상 엑토도메인 구조에 상응하였다 (데이터는 나타내지 않음).
표 14. 디술피드 결합 쌍을 갖는 도메인 V 말단절단된 엑토도메인 CMV gB 돌연변이체
Figure pct00026
구축물 pSB2796을 동물 연구에 사용하기 위해 상이한 N-말단 태그부착된 버전으로 재설계하였다 (표 15). Flag 태그를 6xHis 태그로 교체하였고, 이는 정제 규모 확대에 더 적합하다. 태그부착되지 않은 버전을 또한 생성하였다. HA 신호 서열은 또한 His 태그와 보다 상용성이기 때문에 IgK 신호 서열로 대체되었다.
표 15. CMV gB 엑토도메인 융합전 마우스 연구를 위한 구축물 설계
Figure pct00027
이들 데이터는 융합전 gB가 준안정성이고, 그의 융합전 구조를 유지하기에 충분한 구속을 달성하기 위해 다중 부위에서의 안정화 돌연변이가 필요하다는 것을 보여주었다. 디술피드 결합 및 불안정한 도메인 V의 변형의 조합은 융합전 입체형태를 잠그는 예를 제공한다. 안정화된 gB는 융합전 gB 항원으로서 사용하기에 적합한 전장 (gB1666, gB2457, gB2459) 및 엑토도메인 단백질 포맷 (gB2796)으로 조작될 수 있다. 또한, SEC, 열 이동 검정 및 EM 영상화 접근법은 융합전 또는 융합후 특이적 항체에 대한 필요 없이 gB 샘플의 입체형태적 상태를 평가하는 방식을 제공하였다.
방법
시스테인 돌연변이체 구축물 설계 및 클로닝
모든 구축물을 pcDNA3.1(+) 벡터 백본 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 내로 클로닝하였다. 각각 시스테인 점 돌연변이를 함유하는 프라이머들을 아이디티(IDT) (아이오와주 코랄빌)로부터 주문하였다. 부위 지정 돌연변이유발은 퀵체인지(QuikChange) 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트 (애질런트(Agilient), 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 수행하였다. 돌연변이유발된 DNA를 DH5 알파 세포 내로 형질전환시켰다. 콜로니를 선택하고, 서열분석을 위해 보냈다. 양성 형질전환체를 DNA 서열분석 분석에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA를 DNA 제조 키트를 사용하여 증폭시켰다.
포유동물 세포 발현
EXPI293 세포를 3 x 106개 세포/mL의 OD로 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 옵티멤(OptiMem) 배지 중에 희석하고, PEI 용액과 1:1로 혼합하였다. 이어서, DNA-PEI 혼합물을 EXPI293 세포 내로 1 ug DNA/mL 배양물의 농도로 형질감염시켰다. 인핸서를 형질감염 24시간 후에 첨가하였다. 세포를 형질감염 4 내지 5일 후에 원심분리에 의해 모니터링하고 수거하였다.
단백질 정제
CMVgB 단백질을 일련의 가용화, 친화도 칼럼 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 공정을 통해 정제하였다. SEC를 완충제 25 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.02% DDM, 0.002% CHS 중 슈퍼로스6 인크리즈 칼럼 상에서 실행한다. 억제제를 사용한 실험을 위해, 3 ug/ml WAY-174865를 첨가하였다.
열 안정성 검정
융합전 안정한 돌연변이체의 확인을 돕기 위한 gB 돌연변이체의 보완적 생물물리학적 연구로서, 정제된 gB 단백질의 열 안정성을 35℃에서 95℃로의 20℃/분 가열 속도로 티코 NT.6 상에서 분석하였다.
음성 염색 그리드 제조
얇은 탄소 지지된 그리드를 사용 전에 30초 동안 -20 mA 전류로 EZ-글로우에 의해 글로우 방전시켰다. 0.02 mg/ml의 단백질 농도의 4 ul 샘플 용액의 분취물을 그리드의 탄소 표면에 적용하고, 45초 동안 정치시켰다. 이어서, 샘플 용액을 여과지로 블롯팅하고, 동일한 탄소 표면을 여과수로 헹구고, 잉여량의 물을 여과지로 블롯팅하였다. 그리드를 2% 우라닐 아세테이트 용액으로 염색하고, 공기 건조시킨 후, 영상화를 위해 TF20 전자 현미경에 로딩하였다.
냉동(cryo) 그리드 제조
퀀티호일 그리드를 아르곤/산소로 플라즈마 세정하였다. 0.2 mg/ml 농도로 희석된 그래핀 옥시드 원액 (시그마(Sigma))을 처리된 그리드의 표면에 적용하고, 2분 동안 정치시켰다. 잉여량의 용액을 여과지로 블롯팅하고, 1 액적의 물로 세척하여 잉여량의 그래핀 옥시드를 제거하였다. 그리드를 사용 전에 밤새 건조시켰다. 샘플 용액의 분취물을 그래핀 옥시드 필름-지지된 그리드 상에서 비트로보트 (써모피셔)를 사용하여 유리화시켰다. 그리드를 영상화를 위해 냉동 조건 하에 현미경에 로딩할 때까지 액체 질소에 저장하였다.
CryoEM 데이터 수집, 영상 처리
데이터 수집은 초해상도 동영상 모드를 사용하는 K2 직접 검출기 카메라 (가탄)를 사용하여 공칭 배율 (165,000 X)에서 SerialEM 프로그램으로 300 kV에서 작동하는 써모 피셔 티탄 크리오스 투과 전자 현미경 상에서 수행하였다. 언비닝 픽셀 크기는 0.434Å이었고, 빔 강도는 ~8e/언비닝 픽셀이었다. 각각의 동영상에 대한 샘플 상의 총 전자 선량은 ~40e/Å2였다. 릴리온 및 cisTEM 프로그램 둘 다를 데이터 프로세싱에 사용하였다.
실시예 8: gB2796 면역원성
하기 돌연변이: YIH에서 GHR (155-157), D217C, W240A, C246S, M371C, W506C 및 Y589C를 갖는 아미노산 23-646을 함유하는 설계된 융합전 안정화된 엑토도메인 gB 단백질 (gB2796) 중 하나를 융합 억제제의 부재 하에 FLAG 태그를 통해 형질감염된 포유동물로부터 정제하였다. 간략하게, 20 mM 트리스 pH 7.5, 200 mM NaCl을 SB2796을 과다발현하는 3L 세포 배지에 첨가함으로써 단백질을 정제하였다. 4시간 동안 회전시키면서 4℃에서 10 ml의 M2 칼럼으로 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고, 칼럼을 PBS로 완전히 세척하였다. 이어서, 단백질을 150 μg/ml FLAG 펩티드를 함유하는 PBS로 용리시키고, 후속적으로 농축시켰다. 크기-배제 크로마토그래피를 0.5 ml/분으로 PBS 중 슈퍼로스6 인크리즈 10/300 상에서 수행하고, 분획을 수집하였다. 정제된 단백질을 트리스/글리신/SDS 완충제 중 4-20% 미니-프로테안® TGX 스테인-프리™ 단백질 겔 (바이오라드) 상에서 (도 20A) 뿐만 아니라 음성 염색으로 전자 현미경검사에 의해 (도 20B) 분석하였다. EM 영상은 전형적인 융합전 입체형태인 단백질 입자의 삼각형 형상을 보여주었다.
gB2796이 융합후 gB와 비교하여 더 우수한 면역 반응을 도출할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 막횡단 도메인이 제거된 동일한 HCMV 균주를 기반으로 분비된 융합후 gB를 생성시켰다. 단백질은 사노피에 의한 이전 임상 시험에서 사용된 gB 단백질과 동등하기 때문에 사노피 gB로 명명되었다 (Pass, et al. 2009). 렌틸 렉틴-세파로스(Lentil Lectin-Sepharose) (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 이어서 토요펄 기가캡(Toyopearl GigaCap) Q-650M (토소(Tosoh)) 상에서의 음이온-교환 크로마토그래피, 및 슈퍼덱스(Superdex) 200 (지이 헬스케어) 칼럼 상에서의 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 이러한 태그가 없는 gB의 정제를 달성하였다.
마우스에서 하기 표 16에 제시된 바와 같이 상기 기재된 융합전 및 융합후 gB를 사용하여 생체내 면역원성 연구를 수행하였다.
표 16. 면역화 용량 및 스케줄
Figure pct00028
제5주 (제2 용량 2주 후)에, 마우스 혈청 샘플을 ELISA에 의해 분석하여 gB2796에 대한 IgG 역가를 결정하였다. 결과는 gB2796 및 사노피 gB 면역화된 마우스 둘 다에서 용량-의존성 IgG 반응을 보여준다 (도 21).
미가공 서열의 목록
Figure pct00029
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*신호 서열 M1..A22 (서열식별번호: 268)은 제거됨
Figure pct00039
본 발명의 실시양태는 하기 넘버링된 항목에 제시된다:
C1. 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하며, HCMV gB 융합후 입체형태가 아닌 입체형태를 포함하는 폴리펩티드.
C2. HCMV gB 융합전-특이적 항체에 결합하는 폴리펩티드.
C3. 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하며, HCMV gB 융합전-특이적 항체에 결합할 수 있는 폴리펩티드.
C4. 야생형 HCMV 당단백질 B (gB)의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 도입된 아미노산 돌연변이를 포함하며, 비스(아릴)티오우레아 화합물에 결합할 수 있는 폴리펩티드.
C5. 항목 C3에 있어서, 화합물이 N-{4-[({(1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에틸}카르바모티오일)아미노]페닐}-1,3-티아졸-4-카르복스아미드인 폴리펩티드.
C6. 항목 C1에 있어서, 표 1A의 구조 좌표에 의해 기재되는 백본 원자 상에 중첩될 때 보존된 잔기 백본 원자의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 포함하는 구조 좌표를 특징으로 하는 폴리펩티드.
C7. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 시스테인 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C8. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 디술피드 결합이 형성되도록 하는 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
C9. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 정전기적 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
C10. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 페닐알라닌 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C11. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 류신 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C12. 야생형 HCMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 돌연변이는 폴리펩티드의 융합전 입체형태를 안정화시키고, 폴리펩티드는 HCMV gB 융합전-특이적 항체에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩티드.
C13. 서열식별번호: 1과 비교하여 표 2의 (ii) 열에 열거된 아미노산 위치 중 어느 하나에서 시스테인을 포함하는 폴리펩티드.
C14. 서열식별번호: 1과 비교하여 표 2의 (ii) 열에 열거된 아미노산 위치 중 어느 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
C15. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Q98C 및 I653C를 포함하는 폴리펩티드.
C16. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T100C 및 S269C를 포함하는 폴리펩티드.
C17. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 D217C 및 F584C를 포함하는 폴리펩티드.
C18. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Y242C 및 K710C를 포함하는 폴리펩티드.
C19. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 Y242C 및 D714C를 포함하는 폴리펩티드.
C20. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 S367C 및 L499C를 포함하는 폴리펩티드.
C21. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T372C 및 W506C를 포함하는 폴리펩티드.
C22. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 S550C 및 D652C를 포함하는 폴리펩티드.
C23. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 T608C 및 D679C를 포함하는 폴리펩티드.
C24. 서열식별번호: 1의 넘버링에 따른 돌연변이 K695C 및 K724C를 포함하는 폴리펩티드.
C25. 서열식별번호: 1-43 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
C26. 항목 C1-C25 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩티드가 하기 위치: R562, P577, S587, Y588, G592, G595, L601/H605, C610, L612, P613, Y625, Y627, F632, 및 K633 중 어느 하나에서 돌연변이를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
C27. 항목 C1-C26 중 어느 한 항목에 있어서, HCMV gB의 세포질 꼬리를 포함하지 않는 폴리펩티드.
C28. 항목 C1-C26 중 어느 한 항목에 있어서, 막횡단 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드.
C29. 항목 C1-C26 중 어느 한 항목에 있어서, HCMV gB의 세포질 꼬리를 포함하고 막횡단 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드.
C30. 항목 C1-C29 중 어느 한 항목에 있어서, 곤충 세포 패턴의 글리코실화를 함유하지 않는 폴리펩티드.
C31. 항목 C1-C30 중 어느 한 항목에 있어서, 융합후 입체형태의 천연 gB와 비교하여 개선된 용해도 또는 안정성을 나타내는 폴리펩티드.
C32. 항목 C1-C31 중 어느 한 항목에 있어서, 면역원성인 폴리펩티드.
C33. 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
C34. 항목 C33에 있어서, 자기-복제 RNA 분자를 포함하는 핵산.
C35. 항목 C33에 있어서, 변형된 RNA 분자를 포함하는 핵산.
C36. 항목 C33-C35 중 어느 한 항목에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
C37. 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 포함하고, CMV 항원을 추가로 포함하는 조성물.
C38. 항목 C36-C37 중 어느 한 항목에 있어서, 하기 폴리펩티드: gO, gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함하는 조성물.
C39. 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드, 및 희석제를 포함하는 조성물.
C40. 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드, 및 아주반트를 포함하는 조성물.
C41. 항목 C36-C40 중 어느 한 항목에 있어서, 면역원성인 조성물.
C42. 항목 C36-C41 중 어느 한 항목에 있어서, 시토메갈로바이러스에 대한 면역 반응을 도출하는 데 사용하기 위한 조성물.
C43. 포유동물에게 유효량의 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 도출하는 방법.
C44. 포유동물에게 유효량의 항목 C1-C32 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 시토메갈로바이러스 바이러스 배출을 감소시키는 방법.
C45. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 1-43 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C46. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C47. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 47-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C48. 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C49. gH, gL, UL128, UL130 및 UL131 중 어느 하나로부터 선택된 HCMV 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; HCMV gB 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pp65 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C50. 서열식별번호: 141-210 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C51. 서열식별번호: 224-254 중 어느 하나로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C52. 서열식별번호: 211-223 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리펩티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C53. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 1-43 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
C54. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
C55. 야생형 HCMV gB의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 47-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1과 비교하여 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
C56. 서열식별번호: 57에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C57. gH, gL, UL128, UL130 및 UL131 중 어느 하나로부터 선택된 HCMV 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; HCMV gB 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; pp65 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C58. 서열식별번호: 141-210 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C59. 서열식별번호: 224-254 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C60. 서열식별번호: 211-223 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리펩티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C61. 항목 C49-C51 및 C57-C59 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 조성물.
C62. 항목 C49-C51 및 C57-C59 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 RNA인 조성물.
C63. 항목 C49-C51 및 C57-C59 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 것인 조성물.
C64. 항목 C61에 있어서, 화학적 변형이 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
C65. 항목 C49-C51 및 C57-C59 중 어느 하나에 있어서, 양이온성 지질 나노입자 내에서 제제화되는 조성물.
C66. 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 152 및 서열식별번호: 158 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C67. 서열식별번호: 211, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216 및 서열식별번호: 217 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 1종의 폴리펩티드; 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
C68. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
C69. 항목 C68에 있어서, 서열이 서열식별번호: 56을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C70. 항목 C68에 있어서, 서열이 서열식별번호: 57을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C71. 항목 C68에 있어서, 서열이 서열식별번호: 58을 포함하는 것인 폴리펩티드.
C72. 항목 C68에 있어서, 서열이 서열식별번호: 75를 포함하는 것인 폴리펩티드.
C73. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
C74. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 희석제를 포함하는 조성물.
C75. 항목 C74에 있어서, 서열이 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 50 중 어느 하나를 포함하지 않는 것인 조성물.
C76. 항목 C74에 있어서, 서열식별번호: 211-224로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
C77. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 희석제를 포함하는 조성물.
C78. 항목 C77에 있어서, 서열식별번호: 141-210 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 조성물.
C79. 항목 C77에 있어서, 서열식별번호: 224-254 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 조성물.
C80. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 희석제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 도출하는 방법.
C81. 서열식별번호: 1-106 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 희석제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 도출하는 방법.
표 1A
비고 3
비고 3 정밀화.
비고 3 프로그램 : 피닉스(PHENIX) (dev_3092: 피닉스.리얼_스페이스_리파인)
비고 3 저자 : 아담스(Adams), 아포닌(Afonine), 분코치(Bunkoczi), 번리(Burnley), 첸(Chen), 다르(Dar), 데이비스(Davis),
비고 3 : 드라이젠(Draizen), 에콜스(Echols), 길데아(Gildea), 그로스(Gros), 그로스-쿤슬리브(Grosse-Kunstleve), 헤드(Headd),
비고 3 : 힌츠(Hintze), 헝(Hung), 뢰거(Ioerger), 리브쉬너(Liebschner), 맥코이(McCoy), 맥키(McKee), 모리아티(Moriarty),
비고 3 : 오프너(Oeffner), 푼(Poon), 리드(Read), 리차드슨(Richardson), 리차드슨(Richardson), 사쉐티니(Sacchettini),
비고 3 : 자우터(Sauter), 소볼레브(Sobolev), 스토로니(Storoni), 테르빌리허(Terwilliger), 윌리암스(Williams), 지바르트(Zwart)
비고 3
비고 3
비고 3 : 분산 표: N_가우시안
비고 3
비고 3: 정밀화 표적: 실제 공간 (원자 중심에서 가중 맵 합)
비고 3
비고 3 맵 핏팅에 대한 모델.
비고 3 CC_마스크 : 0.7786
비고 3 CC_부피 : 0.7566
비고 3 CC_피크 : 0.5466
비고 3
기하구조 구속 라이브러리: CDL v1.2
이상적인 값으로부터의 편차.
결합 : 0.004 0.033 17103
각 : 0.769 10.302 23835
키랄성 : 0.056 0.568 2595
평면도 : 0.004 0.043 2907
2면각 : 11.547 179.989 9717
최소 비결합 거리 : 1.763
몰프로비티(MOLPROBITY) 통계.
전체-원자 클래쉬점수 : 7.96
라마찬드란(RAMACHANDRAN) 플롯:
이상치 : 0.00%
허용 : 15.80%
선호 : 84.20%
회전이성질체 이상치: 0.36%
C베타 편차 : 0
펩티드 평면:
시스-프롤린 : 10.5263157895
시스-일반 : 0.162337662338
트위스트 프롤린 : 0.0
트위스트 일반 : 0.162337662338
비고 3
HELIX(나선); SHEET(시트); LINK(링크); SSBOND(SS결합); SCALE(스케일); ATOM(원자)
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표 1B
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SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. 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accggacaaa gaggagcacc 1320 gacggaaaca atgctacaca cctttccaac atggagtctg tccacaatct ggtttatgca 1380 cagcttcagt tcacttatga cacactgcgg ggctacataa acagggctct ggcacagata 1440 gccgaggctt gctgtgtgga ccagcggaga accctggagg tatttaaaga actgtctaag 1500 atcaacccct ctgcgattct gagcgctatt tacaacaaac ccattgccgc acgcttcatg 1560 ggggacgtcc tcggtcttgc ctcctgtgtg acaattaacc agacgagcgt gaaggtgctg 1620 cgagatatga acgtgaagga atcccctggg cggtgttaca gtaggcctgt ggtgattttc 1680 aacttcgcca actcttcctg tgtccaatac ggtcaactcg gtgaagataa cgagattctg 1740 ctgggcaatc atcggacaga agaatgccag ttgccaagcc ttaaaatctt tattgcagga 1800 aattcagcct acgagtacgt cgactatctg tttaaaagaa tgattgatct gagcagcatt 1860 tccactgtgg ac 1872 <210> 267 <211> 685 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 267 Val Ser Ser Ser Ser Thr Arg Gly Thr Ser Ala Thr His Ser His His 1 5 10 15 Ser Ser His Thr Thr Ser Ala Ala His Ser Arg Ser Gly Ser Val Ser 20 25 30 Gln Arg Val Thr Ser Ser Gln Thr Val Ser His Gly Val Asn Glu Thr 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Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser Tyr Phe Gly Glu Asn Ala 260 265 270 Asp Lys Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr Ile Val Ser Asp Phe Gly 275 280 285 Arg Pro Asn Ser Ala Leu Glu Thr His Arg Leu Val Ala Phe Leu Glu 290 295 300 Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile Gln Asp Glu Lys Asn Val 305 310 315 320 Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser Glu Arg Thr Ile Arg Ser 325 330 335 Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser Ala Lys Met Thr Ala Thr 340 345 350 Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met Ser Asp Ser Ala Leu Asp 355 360 365 Cys Val Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gln Gln Ile Phe Asn Thr 370 375 380 Ser Tyr Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn Val Ser Val Phe Glu 385 390 395 400 Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln Gly Ile Lys Gln Lys Ser 405 410 415 Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg Ser Ser Leu Asn Leu Thr 420 425 430 His Asn Arg Thr Lys Arg Ser Thr Asp Gly Asn Asn Ala Thr His Leu 435 440 445 Ser Asn Met Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr Ala Gln Leu Gln Phe 450 455 460 Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg Ala Leu Ala Gln Ile 465 470 475 480 Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr Leu Glu Val Phe Lys 485 490 495 Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ala Ile Tyr Asn 500 505 510 Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val Leu Gly Leu Ala Ser 515 520 525 Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val Leu Arg Asp Met Asn 530 535 540 Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Val Val Ile Phe 545 550 555 560 Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly Gln Leu Gly Glu Asp 565 570 575 Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro 580 585 590 Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Glu Tyr Val Asp 595 600 605 Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser Ile Ser Thr Val Asp 610 615 620 Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu Asn Thr Asp Phe Arg 625 630 635 640 Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe 645 650 655 Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys Gln Arg Val 660 665 670 Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu Pro Pro 675 680 685 <210> 268 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 268 Met Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly Ala Ala 20 <210> 269 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 269 Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gln Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile 1 5 10 15 Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly 20 <210> 270 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 270 aagatcgagg agatcctgtc caagcagtac cacatcgaga acgagatcgc ccgcatcaag 60 aagctgatcg gc 72 <210> 271 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 271 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 272 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 272 Arg Ile Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gln 1 5 10 15 Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly 20 25 30 <210> 273 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 273 Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile 1 5 10 15 Gly <210> 274 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 274 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 1 5 10 15 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 30

Claims (39)

  1. 야생형 시토메갈로바이러스 (CMV) 당단백질 B (gB) 단백질의 아미노산 서열에 비해 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 야생형 CMV gB 단백질의 돌연변이체:
    (1) 조작된 디술피드 결합 돌연변이;
    (2) 추가의 돌연변이; 및
    (3) 적어도 1개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 적어도 2개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합을 포함하는 것인 돌연변이체.
  3. 제1항에 있어서, 삼량체의 형태인 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상응하는 야생형 CMV gB 단백질과 비교하여 융합전 형태에서 증가된 안정성을 가지며, 여기서 안정성은 융합전-특이적 항체의 결합, 열 이동 검정 또는 EM 영상화에 의해 측정되는 것인 돌연변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 CMV gB가 타운(Towne) 균주인 돌연변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 디술피드 돌연변이가 D217C 및 Y589C; M371C 및 W506C; 및 N524C 및 M684C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이체:
    (1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
    (2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
    (3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환;
    (4) 위치 655에서의 P의 S로의 치환;
    (5) 위치 678에서의 F의 S로의 치환; 및
    (6) 위치 680에서의 L의 T로의 치환;
    (7) 위치 685에서의 R의 A로의 치환;
    (8) 위치 648-653에서의 MIALDI의 GSGKDG로의 치환;
    (9) 위치 693에서의 R의 V로의 치환;
    (10) 위치 675에서의 I의 S로의 치환;
    (11) 위치 767 및 768에서의 I의 C로의 치환;
    (12) 위치 703에서의 D 및 위치 704에서의 P의 C로의 치환; 및
    (13) 위치 696에서의 Y 및 위치 697에서의 V의 C로의 치환.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이체:
    (1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
    (2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
    (3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환; 및
    (4) 위치 675에서의 I의 S로의 치환.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 적어도 2개의 조작된 디술피드 돌연변이 및 적어도 1개의 추가의 돌연변이의 조합이고,
    (i) 조작된 디술피드 돌연변이가 D217C 및 Y589C; M371C 및 W506C; 및 N524C 및 M684C로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) 추가의 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이체:
    (1) 위치 155-157에서의 YIH의 GHR로의 치환;
    (2) 위치 240에서의 W의 A로의 치환;
    (3) 위치 246에서의 C의 S로의 치환;
    (4) 위치 655에서의 P의 S로의 치환;
    (5) 위치 678에서의 F의 S로의 치환; 및
    (6) 위치 680에서의 L의 T로의 치환;
    (7) 위치 685에서의 R의 A로의 치환;
    (8) 위치 648-653에서의 MIALDI의 GSGKDG로의 치환;
    (9) 위치 693에서의 R의 V로의 치환;
    (10) 위치 675에서의 I의 S로의 치환;
    (11) 위치 767 및 768에서의 I의 C로의 치환;
    (12) 위치 703에서의 D 및 위치 704에서의 P의 C로의 치환; 및
    (13) 위치 696에서의 Y 및 위치 697에서의 V의 C로의 치환.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이의 조합인 돌연변이체:
    (1) D217C 및 Y589C, M371C 및 W506C, 및 I675S의 조합;
    (2) D217C 및 Y589C, N524C 및 M684C, 및 I675S의 조합;
    (3) D217C 및 Y589C, M371C 및 W506C, Y155G I156H H157R, W240A, C246S 및 I675S의 조합; 및
    (4) D217C 및 Y589C, N524C 및 M684C, Y155G I156H H157R, W240A, C246S 및 I675S의 조합.
  11. 제1항에 있어서, 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 371 (371C) 및 위치 506 (506C)에, 및 세린 (S)을 위치 675 (675S)에 포함하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이체:
    (1) 서열식별번호: 257에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
    (2) 서열식별번호: 257의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
  12. 제1항에 있어서, 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 524 (524C) 및 위치 684 (684C)에, 및 세린 (S)을 위치 675 (675S)에 포함하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이체:
    (1) 서열식별번호: 259의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
    (2) 서열식별번호: 259의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
  13. 제1항에 있어서, 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 371 (371C) 및 위치 506 (506C)에, 세린 (S)을 위치 675 (675S)에, 글리신 (G)을 위치 155 (155G)에, 히스티딘을 위치 156 (156H)에, 아르기닌을 위치 157 (157R)에, 알라닌을 위치 240 (240A)에, 및 세린을 위치 246 (246S)에 포함하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이체:
    (1) 서열식별번호: 261에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
    (2) 서열식별번호: 261의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; (1) 서열식별번호: 261에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체;
    (3) 서열식별번호: 265에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
    (4) 서열식별번호: 265의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
  14. 제1항에 있어서, 시스테인 (C)을 위치 217 (217C) 및 위치 589 (589C)에, 시스테인 (C)을 위치 524 (524C) 및 위치 684 (684C)에, 세린 (S)을 위치 675 (675S)에, 글리신 (G)을 위치 155 (155G)에, 히스티딘을 위치 156 (156H)에, 아르기닌을 위치 157 (157R)에, 알라닌을 위치 240 (240A)에, 및 세린을 위치 246 (246S)에 포함하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이체:
    (1) 서열식별번호: 263의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체; 및
    (2) 서열식별번호: 263의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 제시된 것인 돌연변이체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체의 아미노산 서열이 신호 서열을 포함하지 않는 것인 돌연변이체.
  17. 제16항에 있어서, 서열식별번호: 1의 잔기 23-907을 포함하는 돌연변이체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체의 아미노산 서열이 MPR, TM 또는 CT 도메인을 포함하지 않는 것인 돌연변이체.
  19. 제18항에 있어서, 서열식별번호: 1의 잔기 23-707을 포함하는 돌연변이체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체의 아미노산 서열이 말단절단된 도메인 V 영역을 포함하는 것인 돌연변이체.
  21. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 1의 잔기 23-702 또는 23-703을 포함하는 돌연변이체.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체의 아미노산 서열이 도메인 V 영역을 포함하지 않는 것인 돌연변이체.
  23. 제22항에 있어서, 서열식별번호: 1의 잔기 23-646을 포함하는 돌연변이체.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체의 C 말단에 연결된 삼량체화 모티프를 추가로 포함하는 돌연변이체.
  25. 제24항에 있어서, 삼량체화 모티프가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이체:
    (i) 프로토머간 디술피드 고리;
    (ii) GCN4;
    (iii) T4 피브리틴 폴드온; 및
    (iv) C-말단 융합 서열.
  26. 제25항에 있어서,
    (i) GCN4가 서열식별번호: 269, 272 또는 273에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) T4 피브리틴 폴드온이 서열식별번호: 271에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (iii) C-말단 융합 서열이 서열식별번호: 274에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인
    돌연변이체.
  27. 제25항에 있어서, 프로토머간 디술피드 고리가 하기로부터 선택된 적어도 2개의 조작된 시스테인 돌연변이를 포함하는 것인 돌연변이체:
    (i) 696C 및 697C;
    (ii) 703C 및 704C; 또는
    (iii) 767C 및 768C.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분비된 것인 돌연변이체.
  29. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성인 돌연변이체.
  30. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드 서열이 서열식별번호: 107-140 또는 224로부터 선택되는 것인 돌연변이체.
  31. 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 CMV gB 폴리펩티드 서열이 서열식별번호: 225-254에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 돌연변이체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 CMV gB 단백질 돌연변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  33. 제32항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 225-254에 제시된 서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산 분자.
  34. (i) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 CMV gB 단백질 돌연변이체 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 백신인 제약 조성물.
  36. 대상체에게 유효량의 제35항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 감소시키는 방법.
  37. 대상체에게 유효량의 제35항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염에 대한 면역 반응을 도출하는 방법.
  38. 대상체에게 유효량의 제35항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CMV 감염을 예방하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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