CN111094323A - 修饰的巨细胞病毒蛋白和稳定的复合物 - Google Patents

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Abstract

描述了突变型人巨细胞病毒(HCMV)五聚体复合物多肽、其制备方法及其在HCMV蛋白复合物和组合物中的用途。具体而言，描述了修饰的HCMV多肽用于稳定HCMV复合物或暴露五聚体表位的用途。

Description

修饰的巨细胞病毒蛋白和稳定的复合物
序列表
本申请含有电子提交的ASCII文本文件格式的序列表(名称：VB66226WO_SeqLstg_ST25.txt；大小：195,491个字节；和创建日期：2018年4月2日)，其在此通过引用以其整体并入。
发明人或共同发明人的公开
发明人、发明人们或从发明人获得主题的另一人已经公开了 Chandramouli等人,2017 Science Immunology 2(12): eaan1457和Protein Data Bank (PDB) ID 5VOB。
发明领域
本发明处于针对人巨细胞病毒(HCMV)的疫苗接种的领域中，并且具体而言提供了突变型gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽以及包含gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽中的两种或更多种的稳定的HCMV复合物，其中两种多肽中的至少一种是突变体，以及其在免疫原性组合物或疫苗组合物中的用途。
发明背景
巨细胞病毒(CMV)是属于被称作疱疹病毒科或疱疹病毒的病毒科的病毒属。感染人的物种通常称作HCMV或人疱疹病毒-5 (HHV-5)。在疱疹病毒科内，HCMV属于乙型疱疹病毒亚科，其还包括来自其他哺乳动物的巨细胞病毒。
尽管它们可见于整个身体，但HCMV感染通常与唾液腺相关。HCMV感染美国的50%至80%的成年人(全世界40%)，如抗体在大量普通人群中的存在所示。HCMV感染在健康人中通常是不引人注意的，但对于免疫功能低下者(诸如感染HIV的人、器官移植受体或新生婴儿)可以是威胁生命的(Mocarski等人, Cytomegalovirus in Fields Virology, 编. DavidM Knipe和Peter M Howley, Philadelphia, Pa., USA: Lippincott Williams andWilkins, 2006)。HCMV是最频繁地传播至发育中的胎儿的病毒。感染后，HCMV具有在宿主终生在体内维持潜伏的能力，伴随偶尔地由潜伏再活化。
HCMV似乎在之后的生命中对免疫参数具有重大影响并且可促成发病率和最终的死亡率增加(Simanek等人, Seropositivity to Cytomegalovirus, Inflammation, All- Cause and Cardiovascular Disease-Related Mortality in the United States, 2011PLoS ONE 6: e16103)。
迄今为止，已对超过20种不同HCMV毒株的基因组测序，包括实验室毒株和临床分离物两者的那些。例如，已对以下HCMV毒株测序：Towne (NCBI GenInfo (GI) 标识符239909366)、AD169 (GI:219879600)、Toledo (GI:290564358)和Merlin (GI:155573956)。HCMV毒株AD169、Towne和Merlin可获得自美国典型培养物保藏中心(分别为ATCC VR538、ATCC VR977和ATCC VR1590)。
HCMV含有未知数目的膜蛋白复合物。在病毒包膜中的已知糖蛋白中，gH和gL由于其存在于几种不同的复合物中而显得特别令人感兴趣：二聚体gH/gL、三聚体gH/gL/gO (也称作gCIII复合物)和五聚体 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A(后一种蛋白也称作pUL131)。认为HCMV使用五聚体复合物以通过胞吞作用和低pH依赖的融合进入上皮和内皮细胞，但认为其在涉及gH/gL或可能gH/gL/gO的过程中在质膜处通过直接融合进入成纤维细胞。gH/gL和/或gH/gL/gO复合物对于成纤维细胞感染是足够的，然而需要五聚体复合物来感染内皮和上皮细胞(Ryckman, BJ, 等人, Characterization of the Human Cytomegalovirus gH/gL/UL128-131 Complex That Mediates Entry into Epithelial and Endothelial Cells, 2008 J. Virol. 82: 60–70)。
五聚体复合物被认为是CMV疫苗接种的主要靶标。病毒基因UL128、UL130和UL131是内皮进入所需的(Hahn等人, Human Cytomegalovirus UL131-128 Genes are Indispensable for Virus Growth in Endothelial Cells and Virus Transfer of Leukocytes, 2004 Journal of Virology 78(18): 10023-10033)。成纤维细胞适应的非内皮嗜性毒株在这三种基因中的至少一种中含有突变。Towne毒株，例如，含有引起UL130基因中的移框的2碱基对插入，而AD169在UL131基因中含有1碱基对插入。Towne和AD169两者都可适应于内皮细胞中的生长，并且在这两种情况下，修复了UL130或UL131基因中的移框突变。
Genini等人 (Serum antibody response to the gH/gL/pUL128–131 five- protein complex of human cytomegalovirus (HCMV) in primary and reactivated HCMV infections, 2011 J. Clin. Vir. 52: 113-118.)公开了在初次和再活化的HCMV感染中对HCMV的五聚体复合物的血清抗体应答。该应答通过使用固定或裂解的上皮(ARPE-19)细胞的间接免疫荧光(IFA)和ELISA确定，所述上皮(ARPE-19)细胞用一种或多种腺病毒载体(各自携带一种HCMV基因)和平行地用对照腺病毒载体感染。通过识别复合物的两种、三种或四种蛋白的人中和单克隆抗体的反应性 确定结果的特异性。在初次感染的14个病例中，在感染开始后的2-4周内一致地检测到IgG抗体血清转换为UL128–131基因产物，同时抗体持续至少12个月。IgG抗体对UL128–131基因产物的应答通常优于对gH的应答并似乎在中和抗体应答之后(如上皮细胞中所测定)。在再活化感染中，抗体应答显示令人联想到加强应答的趋势。在HCMV血清阳性健康成人对照中检测到IgG抗体，但在HCMV血清阴性个体中未检测到。
Kinzler等人(Expression and reconstitution of the gH/gL/gO complex of human cytomegalovirus, 2002 J. Clin. Vir. 25(Supp.2): 87–95)使用重组杆状病毒在昆虫细胞中共表达gH、gL和gO，但无法产生gH/gL/gO三联复合物。而是仅检测到gH/gL异二聚体、gH/gL 异多聚体和gO同多聚体。相反，哺乳动物细胞中gH、gL和gO的共表达产生与HCMV感染的细胞中形成的gH/gL/gO复合物非常类似的高分子量复合物。细胞表面免疫荧光显示这些复合物在被感染的细胞表面表达并展示。
美国专利号7,704,510公开了pUL131A是上皮细胞嗜性所需的；pUL128和pUL130与gH/gL形成复合物，其并入病毒粒子中，并且该复合物是感染内皮和上皮细胞、而非感染成纤维细胞所需的。此外，发现抗CD46抗体抑制上皮细胞的HCMV感染。
WO 2014/005959(也公开为美国授权前公开号2016-0159864)公开了纯化的包含多肽gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A的HCMV五聚体复合物及其在免疫原性组合物或疫苗中的用途。
通常，来自嗜常温生物的蛋白的柔性和该蛋白的热稳定性之间存在反比关系，如最近针对来自嗜常温生物枯草芽孢杆菌的脂酶A酶所显示(参见Rathi等人, Structural rigidity and protein thermostability in variants of Lipase A from Bacillus subtilis, 2015 PLOS ONE 19(7): e0130289; DOI: 10.1371/journal.pone.0130289;24页)。抗原的稳定性增加已先前与免疫原性提高相关，诸如例如，对于呼吸道合胞病毒融合蛋白(McLellan等人, Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus, 2013 Science 342(6158): 592-598.)和脑膜炎奈瑟氏菌H结合蛋白(fHbp)(Rossi等人, Meningococcal Factor H Binding Protein Vaccine Antigens with Increased Thermal Stability and Decreased Binding of Human Factor H, 2016 Infect. Immun. 84(6): 1735-1742.)的融合前构象。
预期HCMV复合物(诸如五聚体复合物)的改进的热稳定性将具有以下优点：(i)促进其制备和生产，以及(ii)对其作为抗原的用途具有影响，提供更好的免疫原性。因此，需要开发HCMV复合物，特别是五聚体复合物，其具有适合用于免疫原性组合物或疫苗中的增强的热稳定性。进一步，据信与HCMV复合物上的中和表位密切接近的聚糖限制表位的可及性。因此，需要开发去糖基化的HCMV复合物，特别是五聚体复合物，其具有更可及的表位(任选地还具有增强的热稳定性)，其适合用于免疫原性组合物或疫苗中。
发明概述
本发明基于包含gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽(其中两种多肽中的至少一种是突变体)中的两种或更多种的稳定的HCMV复合物(例如，gH/gL、gH/gL/gO或gH/gL/UL128/UL130/pUL131A复合物)的重组表达及其在免疫原性组合物或疫苗组合物中的用途。提供了制备和使用它们的方法。还提供了突变型多肽和编码它们的核酸分子，以及抗体、表达载体和宿主细胞。
在本发明的一个方面，提供了包含一个或多个稳定突变的HCMV gH多肽或其复合物形成片段。在本发明的另一个方面，提供了包含一个或多个稳定突变的HCMV gL多肽或其复合物形成片段。在本发明的一个进一步方面，提供了包含一个或多个稳定突变的HCMVpUL128多肽或其复合物形成片段。在本发明的一个进一步方面，提供了包含一个或多个稳定突变的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段。在本发明的一个进一步方面，提供了包含一个或多个稳定突变的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段。
在本发明的一个进一步方面，提供了HCMV多肽的五聚体复合物，其包含gH多肽、gL多肽、pUL128多肽、pUL130多肽和pUL131A多肽，其中至少一种多肽包含一个或多个氨基酸稳定突变。在本发明的一个进一步方面，与非突变型五聚体复合物相比，该五聚体复合物具有增加的稳定性。在本发明的一个进一步方面，提供了包含该HCMV多肽的五聚体复合物的免疫原性组合物。
在本发明的一个进一步方面，提供了HCMV多肽的gH/gL复合物，其包含gH多肽和gL多肽，其中所述多肽中的至少一种包含一个或多个稳定突变。在本发明的一个进一步方面，与非突变型gH/gL复合物相比，该gH/gL复合物具有增加的稳定性。在本发明的一个进一步方面，提供了包含该HCMV多肽的gH/gL复合物的免疫原性组合物。
在本发明的一个进一步方面，提供了HCMV多肽的gH/gL/gO复合物，其包含gH多肽、gL多肽和gO多肽，其中所述gH和gL多肽中的至少一种包含一个或多个氨基酸稳定突变。在本发明的一个进一步方面，与非突变型gH/gL/gO复合物相比，该gH/gL/gO复合物具有增加的稳定性。在本发明的一个进一步方面，提供了包含该HCMV多肽的gH/gL/gO复合物的免疫原性组合物。
在本发明的一个进一步方面，本发明的复合物以高产率产生。例如，在涉及使本发明的宿主细胞在生长培养基中生长的方法中，本发明的蛋白复合物可以积累至大于0.4mg/升生长培养基(例如0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mg/升生长培养基或更多)的水平。
本发明提供了以下内容：
实施方案1. HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个稳定突变。
实施方案2. 实施方案1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
实施方案3. 实施方案1或2的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变。
实施方案4. 实施方案3的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ IDNO:1中所示的序列或在其他HCMV gH多肽中的相应位置处，氨基酸残基A102、A372、A352和L257中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案5. 实施方案1至4中任一项的HCMV gH多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个疏水突变。
实施方案6. 实施方案5的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ IDNO:1中所示的序列或在其他HCMV gH多肽中的相应位置处，氨基酸残基H252、K404、R255、E355、H480、S601和R405中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案7. 实施方案1至6中任一项的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个亲水突变。
实施方案8. 实施方案7的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基G358和H275中的一个或多个被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案9. 实施方案1至8中任一项的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个二硫桥突变。
实施方案10.实施方案9的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基V109和/或L111被半胱氨酸(C)取代。
实施方案11.实施方案1至10中任一项的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个去糖基化突变。
实施方案12.实施方案11的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基N55、N62、N67、N192、N641和N700中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案13.包含氨基酸序列的HCMV gH多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基A102、A372、A352和L257中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案14.包含氨基酸序列的HCMV gH多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基H252、K404、R255、E355、H480、S601和R405中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案15.包含氨基酸序列的HCMV gH多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基G358和H327中的一个或多个被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案16.包含氨基酸序列的HCMV gH多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基V109和/或L11被半胱氨酸(C)取代。
实施方案17.包含氨基酸序列的HCMV gH多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基N55、N62、N67、N192、N641和N700中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案18.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基A102、A372、A352和L257中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案19.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基H252、K404、R255、E355、H480、S601和R405中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案20.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G358和H327中的一个或多个被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案21.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基V109和/或L11被半胱氨酸(C)取代。
实施方案22.包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基N55、N62、N67、N192、N641和N700中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案23.核酸分子，其编码实施方案1-22中任一项的HCMV gH多肽或其复合物形成片段。
实施方案24.HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个稳定突变。
实施方案25.实施方案24的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其组合。
实施方案26.实施方案25的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变。
实施方案27.实施方案26的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ IDNO:7中所示的序列或在其他HCMV gL多肽中的相应位置处，氨基酸残基H177、G224、G140、G145、D146、G218、L119、C233和P272中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案28.实施方案24至27中任一项的HCMV gL多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个疏水突变。
实施方案29.实施方案28的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ IDNO:7中所示的序列或在其他HCMV gL多肽中的相应位置处，氨基酸残基H267、H236、H245、G161和C233中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案30.实施方案24至29中任一项的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个二硫桥突变。
实施方案31.实施方案30的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基G161、D163、G224、G218、R166、G140、R160和A150中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案32.实施方案24至31中任一项的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个去糖基化突变。
实施方案33.实施方案32的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其中N74被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案34.包含氨基酸序列的HCMV gL多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:5具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基H177、G224、G140、G145、D146、G218、L119、C233和P272中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案35.包含氨基酸序列的HCMV gL多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性，但(b)氨基酸残基H267、H236、H245、G161和C233中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案36.包含氨基酸序列的HCMV gL多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性，且(b)其中一个或多个氨基酸残基G161、D163、G224、G218、R166、G140、R160和A150被半胱氨酸(C)取代。
实施方案37.包含氨基酸序列的HCMV gL多肽，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性，且(b)其中氨基酸残基N74被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案38.包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基H177、G224、G140、G145、D146、G218、L119、C233和P272中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案39.包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基H267、H236、H245、G161和C233中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案40.包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其进一步包含一个或多个氨基酸残基G161、D163、G224、G218、R166、G140、R160和A150被半胱氨酸(C)取代。
实施方案41.包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其进一步包含残基N74被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案42.核酸分子，其编码实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽或其复合物形成片段。
实施方案43.HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个稳定突变。
实施方案44.实施方案43的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的组合。
实施方案45.实施方案40的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变。
实施方案46.实施方案45的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:13中所示的序列或在其他HCMV pUL128多肽中的相应位置处，氨基酸残基G123、V77、L103和Q119中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案47.实施方案43至46中任一项的HCMV pUL128多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个疏水突变。
实施方案48.实施方案47的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:13中所示的序列或在其他HCMV pUL128多肽中的相应位置处，氨基酸残基G145、H90和G112中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案49.实施方案43至48中任一项的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个二硫桥突变。
实施方案50.实施方案49的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基R142、N99、Y98、A124、G126、L159、D45、V88、M48、G107、R51、D106和S83中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案51.包含氨基酸序列的HCMV pUL128多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:13具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基G123、V77、L103和Q119中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案52.包含氨基酸序列的HCMV pUL128多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:13具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基G145、H90和G112中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案53.包含氨基酸序列的HCMV pUL128多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:13具有至少90%同一性，且(b)其中氨基酸残基R142、N99、Y98、A124、G126、L159、D45、V88、M48、G107、R51、D106和S83中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案54.包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G123、V77、L103和Q119中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案55.包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G145、H90和G112中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案56.包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基R142、N99、Y98、A124、G126、L159、D45、V88、M48、G107、R51、D106和S83中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案57.核酸分子，其编码实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段。
实施方案58.HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个稳定突变。
实施方案59.实施方案58的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
实施方案60.实施方案59的HCMV pUL130多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变。
实施方案61.实施方案60的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:17中所示的序列或在其他HCMV pUL130多肽中的相应位置处，氨基酸残基D165和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案62.实施方案58至61中任一项的HCMV pUL130多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个疏水突变。
实施方案63.实施方案62的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:17中所示的序列或在其他HCMV pUL130多肽中的相应位置处，氨基酸残基G116、G135、H150和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案64.实施方案54至63中任一项的HCMV pUL130多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个二硫桥突变。
实施方案65.实施方案64的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:17中所示的序列或在其他HCMV pUL130多肽中的相应位置处，氨基酸残基G116、H150、P64、S178、P62、E95、Y204、N211、I213、Y56和T167中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案66.实施方案54至65中任一项的HCMV pUL130多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个去糖基化突变。
实施方案67.实施方案66的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:17中所示的序列或在其他HCMV pUL130多肽中的相应位置处，氨基酸残基N85、N118和N201中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案68.包含氨基酸序列的HCMV pUL130多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:17具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基D165和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案69.包含氨基酸序列的HCMV pUL130多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:17具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基G116、G135、H150和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案70.包含氨基酸序列的HCMV pUL130多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:17具有至少90%同一性，且(b)其中氨基酸残基G116、H150、P64、S178、P62、E95、Y204、N211、I213、Y56和T167中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案71.包含氨基酸序列的HCMV pUL130多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:17具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基N85、N118和N201中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案72.包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基D165和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案73.包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G116、G135、H150和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案74.包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G116、H150、P64、S178、P62、E95、Y204、N211、I213、Y56和T167中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案75.包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基N85、N118和N201中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案76.核酸分子，其编码实施方案58-75中任一项的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段。
实施方案77.HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个稳定突变。
实施方案78.实施方案77的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
实施方案79.实施方案78的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个空腔填充突变。
实施方案80.实施方案79的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:21中所示的序列或在其他HCMV pUL131A多肽中的相应位置处，氨基酸残基G99、S86和S90中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案81.实施方案77至80中任一项的HCMV pUL131A多肽，其中所述稳定突变包含一个或多个疏水突变。
实施方案82.实施方案81的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:21中所示的序列或在其他pUL131A多肽中的相应位置处，氨基酸残基H69、H35、H64、D38、V85、Y52和A67中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案83.实施方案77至82中任一项的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个亲水突变。
实施方案84.实施方案83的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中氨基酸残基R118被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案85.实施方案77至84中任一项的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个二硫桥突变。
实施方案86.实施方案85的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:21中所示的序列或在其他HCMV pUL131A多肽中的相应位置处，氨基酸残基H64和W37中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案87.实施方案77至86中任一项的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中所述稳定突变包含一个或多个去糖基化突变。
实施方案88.实施方案87的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其中相对于SEQ ID NO:21中所示的序列或在其他HCMV pUL131A多肽中的相应位置处，氨基酸残基N85被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案89.包含氨基酸序列的HCMV pUL131A多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:21具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基G99、S86和S90中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案90.包含氨基酸序列的HCMV pUL131A多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:21具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基H69、H35、H64、D38、V85、Y52和A67中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案91.包含氨基酸序列的HCMV pUL131A多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:21具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基R118被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案92.包含氨基酸序列的HCMV pUL131A多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:21具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基H64和W37中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案93.包含氨基酸序列的HCMV pUL131A多肽，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:21具有至少90%同一性，且(b)氨基酸残基N81被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案94.包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基G99、S86和S90中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
实施方案95.包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基H69、H35、H64、D38、V85、Y52和A67中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
实施方案96.包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基R118被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案97.包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基H64和W37中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代。
实施方案98.包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其进一步包含氨基酸残基N81被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
实施方案99.核酸分子，其编码实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段。
实施方案100.分离的抗体或其抗原结合片段，其对于实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽是特异性的。
实施方案101. 分离的抗体或其抗原结合片段，其对于实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽是特异性的。
实施方案102. 分离的抗体或其抗原结合片段，其对于实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽是特异性的。
实施方案103. 分离的抗体或其抗原结合片段，其对于实施方案58至75中任一项的HCMV pUL130多肽是特异性的。
实施方案104. 分离的抗体或其抗原结合片段，其对于实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽是特异性的。
实施方案105. 复合物，其包含实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽以及HCMVgL多肽、HCMV pUL128多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽中的至少一种。
实施方案106. 实施方案105的复合物，其包含实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL128多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽。
实施方案107.复合物，其包含实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽以及HCMVgH多肽、HCMV pUL128多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽中的至少一种。
实施方案108.实施方案107的复合物，其包含实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽以及HCMV gH多肽、HCMV pUL128多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽。
实施方案109.复合物，其包含实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽中的至少一种。
实施方案110.实施方案109的复合物，其包含实施方案43至56中任一项的HCMVpUL128多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL130多肽和HCMV pUL131A多肽。
实施方案111.复合物，其包含实施方案58至75中任一项的HCVM pUL130多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL128多肽和HCMV pUL131A多肽中的至少一种。
实施方案112. 实施方案111的复合物，其包含实施方案58至75中任一项的HCVMpUL130多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL128多肽和HCMV pUL131A多肽。
实施方案113.复合物，其包含实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL128多肽和HCMV pUL130多肽中的至少一种。
实施方案114.实施方案113的复合物，其包含实施方案77至98中任一项的HCMVpUL131A多肽以及HCMV gH多肽、HCMV gL多肽、HCMV pUL128多肽和HCMV pUL130多肽。
实施方案115. 复合物，其包含实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽，实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽，实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽，实施方案58至75中任一项的HCMV pUL130多肽，和实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽，
实施方案116. 实施方案105-115中任一项的复合物，其为修饰的HCMV五聚体复合物，其包含：
((i))
(a)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基142处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基95处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(b)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基74处的谷氨酰胺(Q)的gL多肽；
(c)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基140处的苯丙氨酸(F)的gL多肽；
(d)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基145处的亮氨酸(L)的gL多肽；
(e)具有相对于SEQ ID NO:21编号的残基52处的苯丙氨酸(F)和残基67处的缬氨酸(V)的gUL131多肽；
(f)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基233处的缬氨酸(V)的gL多肽；
(g)具有相对于SEQ ID NO:3编号的残基358处的精氨酸(R)的gH多肽；
(h)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基150处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基64处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(i)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基83处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基167处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(j) 具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基160处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基56处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(k)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基166处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基62处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(l)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基98处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基204处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(m)具有相对于SEQ ID NO:21编号的残基86处的苯丙氨酸(F)的pUL131多肽；
(n)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基48处的半胱氨酸(C)和残基107处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽；
(o)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基77处的异亮氨酸(I)的pUL128多肽；
(p)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基145处的亮氨酸(L)的pUL128多肽；或
(q)其组合，
((ii))其中与对照HCMV五聚体复合物相比，修饰的HCMV五聚体复合物具有增加的热稳定性。
实施方案117. 实施方案116的修饰的HCMV五聚体复合物，其包含((i))(q)和((ii))，其中所述组合(q)包含：
(1)(a)以及(b)、(c)、(d)、(f)和(g)之一；
(2)(c)和(e)；或
(3)(d)和(e)。
实施方案118.免疫原性组合物，其包含实施方案105至117中任一项的复合物。
实施方案119.实施方案118的免疫原性组合物，其进一步包含HCMV gB多肽。
实施方案120.实施方案118或119中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含非抗原组分。
实施方案121.实施方案120的免疫原性组合物，其中所述非抗原组分是免疫有效量的佐剂。
实施方案122. 实施方案121的免疫原性组合物，其中所述佐剂是AS01、水包油乳剂、铝盐、TLR7激动剂(TLR7a)、与铝盐缀合的TLR7a(铝-TLR7a)或其组合。
实施方案123.组合物，其包含非抗原组分和以下中的至少一种：
(i)实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽；
(ii)实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽；
(iii)实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽；
(iv)实施方案58至75中任一项的HCMV pUL130多肽；和
(v)实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽。
实施方案124.核酸分子，其包含一个或多个可操作连接的多核苷酸序列，其一起编码实施方案105至117中任一项的复合物。
实施方案125.表达载体，其包含实施方案124的核酸分子。
实施方案126.表达载体，其包含实施方案23、42、57、76、99和124中任一项的核酸分子。
实施方案127.多种表达载体，其中每种表达载体包含实施方案23、42、57、76和99的核酸分子中的一种或多种，且其中多种表达载体一起编码实施方案105至117中任一项的复合物。
实施方案128.实施方案127的多种表达载体，其中第一表达载体编码HCMV gH多肽和HCMV gL多肽，且其中第二表达载体编码HCMV pUL128多肽、HCMV pUL130多肽和HCMVpUL131A多肽。
实施方案129.宿主细胞，其包含实施方案23、42、57、76、99和124中任一项的核酸分子。
实施方案130.实施方案129的宿主细胞，其中所述核酸分子被并入所述宿主细胞的基因组中。
实施方案131.宿主细胞，其包含实施方案125或126的表达载体。
实施方案132.宿主细胞，其包含实施方案127的多种表达载体。
实施方案133. 细胞培养物，其包含实施方案129至132中任一项的宿主细胞。
实施方案134.制备修饰的HCMV多肽或修饰的HCMV复合物的方法，其包括培养实施方案129至133中任一项的宿主细胞。
实施方案135.实施方案134的方法，其进一步包括使培养基与实施方案100至104中任一项的抗体接触。
实施方案136.实施方案134或135的方法，其进一步包括从培养基分离出修饰的HCMV多肽或修饰的HCMV复合物。
实施方案137.实施方案134至136中任一项的方法，其中所述HCMV复合物是修饰的五聚体复合物。
实施方案138.制备HCMV复合物的方法，其包括将实施方案124的核酸分子引入宿主细胞基因组。
实施方案139.修饰的HCMV多肽，其包含表1B、2B、3B、4B、5B、22或23内列出的突变中的任何一个或多个。
实施方案140.诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法，其包括向受试者施用免疫有效量的实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物。
实施方案141.实施方案140的方法，其中所述免疫应答包括产生针对CMV的中和抗体。
实施方案142.抗体或其抗原结合片段，其通过实施方案140或141的方法产生，并且：
(A)对于实施方案1至22中任一项的HCMV gH多肽是特异性的；
(B)对于实施方案24至41中任一项的HCMV gL多肽是特异性的；
(C)对于实施方案43至56中任一项的HCMV pUL128多肽是特异性的；
(D)对于实施方案58至75中任一项的HCMV pUL130多肽是特异性的；或
(E)对于实施方案77至98中任一项的HCMV pUL131A多肽是特异性的。
实施方案143.药物组合物，其包含实施方案100至104和142中任一项的抗体或其抗原结合片段。
实施方案144.实施方案143的药物组合物，其进一步包含非抗原组分。
实施方案145. 抑制CMV进入细胞的方法，其包括使所述细胞与实施方案105至117中任一项的复合物、实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物或与实施方案100至104和142中任一项的抗体或其抗原结合片段接触。
实施方案146.实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物，其用于诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答。
实施方案147. 实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物，其用于抑制CMV进入细胞。
实施方案147.实施方案143或144的药物组合物，其用于抑制CMV进入细胞。
实施方案148. 实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物用于诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的用途。
实施方案149.实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物用于抑制CMV进入细胞的用途。
实施方案133.实施方案100至104和142中任一项的抗体或其抗原结合片段用于抑制CMV进入细胞的用途。
实施方案150.实施方案143或144的药物组合物用于抑制CMV进入细胞的用途。
实施方案151.实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物用于制备用于诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的药物的用途。
实施方案152.实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物用于制备用于诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的药物的用途，其中所述药物被制备为待施用。
实施方案153. 实施方案118至122中任一项的免疫原性组合物用于制备用于抑制CMV进入细胞的药物的用途。
实施方案154.实施方案100至104和142中任一项的抗体或其抗原结合片段用于制备用于抑制CMV进入细胞的药物的用途。
实施方案155.实施方案143或144的药物组合物用于制备用于抑制CMV进入细胞的药物的用途。
附图简要说明
图1：图1描绘包含gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A(各自的位置通过标记显示)的HCMV五聚体复合物(五聚体)的晶体结构。具体而言，图1提供了五聚体的卡通表示的两个180°-旋转视图。二硫键和建模的Asn连接的寡甘露糖被描绘为黑棒。
图2：图2A描绘包含gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A的HCMV五聚体复合物。将五个界面加框，并提供了放大的子小图，以显示与关键残基的相互作用的细节。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。在图2A内描绘UL130-UL131A、UL128-UL130-UL131A、gL-UL130、gL-UL128和gH-gL界面，其中那些界面的各自的放大描绘分别显示于图2B-2F中。图2B提供了来自图2A的UL130-UL131A界面的子小图的放大视图。图2B显示pUL130的α2和α3螺旋以及pUL130残基L69、Y113和N118。pUL130 α3螺旋的定位用箭头显示。图2B还显示pUL131A的α3螺旋和pUL131A残基D66、H69和L71。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。图2C提供了来自图2A的UL128-UL130-UL131A界面的子小图的放大视图。图2C显示pUL128的α1和α2螺旋β1、β4、β5和β6以及pUL128残基D45、K92和L103。图2C显示pUL130的β5、β4和β6折叠(各自的位置用箭头显示)。图2C还显示pUL130残基H209。图2C显示pUL131A的α1、α2和α3螺旋以及pUL131A残基H35。pUL131A α1和α2螺旋的位置用箭头显示。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。图2D提供了来自图2A的gL-UL130界面的子小图的放大视图。图2D显示gL的β1和β2折叠以及gL残基L82、Y152、R160、Y162和R166。图2D还显示pUL130的α1螺旋和β3折叠以及pUL130残基Y56、P58、F59、L60、Y61、P62、P64、P65、R66和L99。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。图2E提供了来自图2A的gL-UL128界面的子小图的放大视图。图2E显示gL的α4、α3和α2螺旋以及β2和β1折叠以及gL残基L101、L106、L122、V137和D157。图2E还显示pUL128的α3螺旋以及pUL128残基R142、L146、L150、L159、V161和C162。图2E还显示pUL130残基Q97。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。图2F提供了来自图2A的gH-gL界面的子小图的放大视图。图2F显示gH的β1、β3、β4和β5折叠以及gH的α1螺旋(各自的定位用箭头显示)。图2F还显示gH残基C95。图2F显示gL的β5、β4和β3折叠(各自的定位用箭头显示)以及gL的α1和α6螺旋。图2F还显示gL残基C47和C54。二硫化物显示为黑棒，且极性接触显示为黑色虚线。
图3：图3A-3C描绘HCMV五聚体复合物(五聚体)的构象柔性。图3A显示五聚体-8I21Fab的4.0Å和3.0Å分辨率的基于gH的叠加的侧视图和顶视图。图3B显示五聚体-9I6 Fab和3.0Å分辨率的五聚体-8I21 Fab复合物之间的叠加的侧视图。45°的旋转后，在子小图中显示加框区域，以突出gH螺旋接头的位置，所述gH螺旋接头被认为充当UL的刚性臂运动的铰链。图3C显示五聚体-9I6和3.0Å分辨率的五聚体-8I21 Fab复合物的基于pUL130/pUL131A的叠加。
图4：图4A描绘五聚体复合物内的空腔以及可以进行本发明的稳定突变的位置。空腔通过用线填充的不规则形状显示，并且稳定突变位置通过点显示(图4A的点仅描绘位置，即，图4A中的点数目和本发明的稳定突变的数目之间不存在1:1关系)。图4A还用方框标识UL界面和gH-gL-UL界面。图4B提供了来自图4A的gH-gL-UL界面的放大视图。图4B描绘gH-gL-UL界面内的空腔。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图4C提供了来自图4A的UL界面的放大视图。图4C描绘UL界面内的空腔。空腔通过用线填充的不规则形状显示。
图5：图5A描绘由于稳定突变的存在而在HCMV五聚体复合物内的空腔填充。显示五个空腔填充突变，其各自在pUL128、pUL130、pUL131A、gL和gH五聚体复合物亚蛋白之一内。为五个空腔填充突变各自提供子小图。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图5B提供了来自图5A的UL128 G123W空腔填充突变子小图的放大视图。用箭头显示G123W侧链的位置及其在空腔内的存在。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图5C提供了来自图5A的UL130D165W空腔填充突变子小图的放大视图。用箭头显示D165W侧链的位置及其在空腔内的存在。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图5D提供了来自图5A的UL131 G99W空腔填充突变子小图的放大视图。用箭头显示G99W侧链的位置及其在空腔内的存在。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图5E提供了来自图5A的gL H177W空腔填充突变子小图的放大视图。用箭头显示H177W侧链的位置及其在空腔内的存在。空腔通过用线填充的不规则形状显示。图5F提供了来自图5A的gH A102W空腔填充突变子小图的放大视图。用箭头显示A102W侧链的位置及其在空腔内的存在。空腔通过用线填充的不规则形状显示。
图6：图6A描绘HCMV五聚体复合物内的二硫桥突变。显示十六个二硫桥突变和所得的八个二硫键/桥(交联的半胱氨酸残基)并编号为(1)-(8)。二硫键通过棒描绘。图6A的顶部子小图显示二硫键(1)、(2)、(3)、(4)、(7)和(8)。图6B的底部子小图显示二硫键(5)和(6)。图6B提供了来自图6A的顶部子小图的放大视图。二硫键通过棒描绘。(1)显示由二硫桥突变pUL130 G116C和pUL130 H150C导致的多肽内二硫键。(2)显示由二硫桥突变gL G161C和pUL130 P64C导致的多肽间二硫键。(3)显示由二硫桥突变pUL130 S178C和pUL131A H64C导致的多肽间二硫键。(4)显示由二硫桥突变gL D163C和pUL130 P62C导致的多肽间二硫键。(7)显示由二硫桥突变pUL128 R142C和pUL130 E95C导致的多肽间二硫键。(8)显示由二硫桥突变gL R166C和pUL130 P62C导致的多肽间二硫键。图6C提供了来自图6A的底部子小图的放大视图。二硫键通过棒描绘。(5)显示由二硫桥突变gHV109C和gL G224C导致的多肽间二硫键。(6)显示由二硫桥突变gH L111C和gL G218C导致的多肽间二硫键。
图7描绘具有椭圆形的五聚体上的五个不重叠的中和表位(位点1、2、3、4和5)的位置。位点4处的标记显示为“4/6”以表示位点4在位点6上的重叠，且位点3处的标记显示为“3/7”以表示位点3在位点7上的重叠。图7进一步描绘五聚体表面上的十一个聚糖。每个聚糖的一般位置用矩形指定。具体而言，如图7的左侧所示的五聚体分子的面标识十个聚糖(gH中的六个聚糖，gL中的一个聚糖，和UL中的四个聚糖)。在图7的右侧显示的五聚体分子的另一面标识pUL130中与位点2相邻定位的一个(第十一)聚糖。在图7的左侧也显示在图7的右侧显示的其他聚糖。在那些矩形内的是表示碳原子、表示氮原子、表示氧原子和表示氢原子的球体。
详述
本文揭示了由多肽gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A与单克隆抗体(mAb)的抗原结合片段(Fab)的组合构成的HCMV五聚体复合物的晶体结构。本发明人分析了晶体结构并表征(i)复合物的结构域中的一些之间存在小界面，(ii)在结构域界面处存在几个空腔，以及(iii)复合物的固有柔性或动力学。本发明人还表征并且在本文中描述增强五聚体复合物的热稳定性的多肽修饰(即，多肽gH、gL、pUL128、pUL130和/或pUL131A的修饰)。具体而言，本发明人提供了HCMV五聚体复合物的每个多肽中的特定氨基酸，当如本文所述修饰时，其增强包含它们的复合物的热稳定性。不希望受理论的束缚，据信本发明的氨基酸修饰通过降低复合物的构象柔性而增强复合物热稳定性。据信发生这种情况是因为，例如，(A)本发明的突变型氨基酸(由目前描述的稳定突变导致的氨基酸)具有比原始氨基酸(在参考的非突变型蛋白序列中固有存在的氨基酸)更长的侧链)且修饰的氨基酸的侧链的原子填充结构域界面和/或蛋白核心空腔之间的掩埋空腔。以此方式，具有长侧链的突变型氨基酸的结构特征影响结构域界面和/或蛋白核心空腔之间的掩埋空腔的填充，并导致增强的复合物稳定性。此类突变在本文中可以被称为“空腔填充突变”，其中所得突变型氨基酸被称为“空腔填充突变体”。进一步相信，本发明的氨基酸修饰通过如下增强复合物热稳定性：(B)经由增加相邻残基的接触和/或替换蛋白内或蛋白之间不利的带电荷残基的簇来“重新包装”复合物。此类突变在本文中可以被称为“重新包装突变”，其中所得氨基酸被称为“重新包装突变体”。特定的重新包装突变在本文中可以被称为“疏水突变”或“亲水突变”，其中所得突变型氨基酸分别被称为“疏水突变体”或“亲水突变体”。以此方式，参考的突变型氨基酸的结构特征是疏水或亲水的，实现与其相邻残基的接触增加和/或实现带电荷残基的不利簇的减少并导致复合物稳定性增强。此外，据信本发明的氨基酸修饰通过(C)在整个复合物中引入二硫桥而增强复合物热稳定性。据信发生这种情况是因为新引入的二硫桥锁定(约束)多肽且由此降低它们的动力学。以此方式，突变型氨基酸的结构特征是半胱氨酸或另外是在结构上能够形成二硫桥的残基，实现二硫桥的引入并导致复合物稳定性增强。此类突变在本文中可以被称为“二硫桥突变”，其中所得氨基酸被称为“二硫桥突变”。以此方式，本发明提供了修饰的HCMV五聚体复合物蛋白(gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)，任选地在HCMV复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)内，其中一个或多个突变型氨基酸导致A-C中的至少一种，且由此导致复合物热稳定性增强。从已分析HCMV五聚体复合物晶体结构及其中和表位，本发明人已选择与中和表位密切接近并且同样期望限制其各自的HCMV五聚体表位的可及性的额外聚糖。因此，本发明人期望通过将去糖基化突变中的一个或多个引入HCMV复合物中，与非突变体的那些相比，相应的表位将更可及。具体而言，据信除去鉴定的聚糖中的一个或多个将“暴露”相应表位并增加抗原性。本发明人特别提出使用已知技术将鉴定的天冬酰胺残基取代为任何非天冬酰胺氨基酸(例如谷氨酰胺)，以便防止在该位置处的N-连接的糖基化且由此暴露相应的表位。以此方式，本发明提供了修饰的HCMV五聚体复合物蛋白(gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)，任选地在HCMV复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)内，其中一个或多个突变型氨基酸导致去糖基化。这种去糖基化可以暴露表位，使得该表位被例如中和抗体或抗体片段更可及。
本发明的多肽是突变体，且因此与非突变体(例如，野生型或对照)多肽相比具有不同的结构。同样，因此，包含本发明的多肽的复合物与非突变型复合物(例如，野生型或对照复合物)相比具有不同的结构，因为本发明的复合物包含至少一种突变型HCMV gH、gL、UL128、UL130和pUL131A多肽。此外，与非突变型(例如，野生型或对照)复合物相比，本发明的复合物可以具有不同的功能，因为与非突变型复合物相比，本发明的复合物可以具有增加的热稳定性。
因此，本发明的目的是提供如本文所定义的HCMV gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽，其呈现形成具有增强的热稳定性和/或更可及的表位的复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)的优点。尽管本发明适用于源自任何HCMV毒株的多肽，但为了促进其理解，当提及本说明书中的氨基酸位置时，给出的编号与源自Merlin毒株的多肽的氨基酸序列相关，除非另有说明。具体而言，gH氨基酸位置相对于Merlin gH序列SEQ IDNO:1给出；gL氨基酸位置相对于Merlin gL序列SEQ ID NO:7给出；pUL128氨基酸位置相对于Merlin gL序列13给出；pUL130氨基酸位置相对于Merlin pUL130序列SEQ ID NO:17给出；pUL131A氨基酸位置相对于Merlin pUL131A序列SEQ ID NO:21给出；且gO氨基酸位置相对于Merlin gO序列SEQ ID NO:25给出，除非另有说明。然而，本发明不限于Merlin毒株。使用本发明的教导，本领域普通技术人员可以通过使用容易获得的比对算法(诸如使用默认设置的BLAST，使用默认设置的ClustalW2，或使用默认设置的由Corpet (Multiple Sequence Alignment with Hierarchical Clustering, 1998 Nucleic Acids Research16(22):10881-10890)公开的算法)比对氨基酸序列来容易地确定任何其他HCMV毒株的多肽中的相当的氨基酸位置。因此，当提及“ HCMV多肽”时，应理解为来自任何毒株(除了Merlin毒株以外)的HCMV多肽。对于来自其他毒株的多肽，取决于实际的序列比对，可能必须调整氨基酸残基位置的实际数目。
序列内的定位，序列内的位置，“对应于SEQ ID NO:###的残基##”或“对应于SEQID NO:###的残基##”或“相对于SEQ ID NO:###的残基##”或“在对应于SEQ ID NO:###的'X'的位置处”或“在对应于SEQ ID NO:###的残基##的定位的定位处”或“相对于SEQ IDNO:###的残基##编号”的残基或氨基酸是为了清楚起见，特别是在权利要求内，在本发明的意义上使用的示例性短语，以提供通过其标识氨基酸序列内的特定位置的手段。进一步，这些短语用于涵盖例如这样的氨基酸序列：其编码与具有参考氨基酸序列SEQ ID NO:###的蛋白具有相同或相似功能、但具有不同结构的多肽(即，涵盖的多肽具有与参考蛋白相同或相似的功能，但涵盖的多肽和参考蛋白具有不同的氨基酸序列)。通过实例的方式，在包含“对应于pUL131A序列SEQ ID NO:21的P45的氨基酸残基”处的突变的多肽将至少涵盖具有pUL131A序列SEQ ID NO:21(Merlin毒株)的P45处的突变的多肽，具有pUL131A序列SEQ IDNO:23(Towne毒株)的P45处的突变和pUL131A序列SEQ ID NO:24(AD169毒株)的P49处的突变的多肽(其中所有都在SEQ ID NO:21、23和24的以下多重序列比对中加下划线；信号序列残基也加下划线)。
Figure 141415DEST_PATH_IMAGE001
“ HCMV复合物”或简称“复合物”，在本发明的意义上意指一组两个或更多个相关蛋白，其包含HCMV多肽gH、gL、pUL128、pUL130、pUL131A或其复合物形成片段中的至少一个。在本发明的意义上，HCMV复合物或“复合物”包括例如gH/UL115、gH/gL(例如，gH/gL异二聚体或异二聚体的gH/gL二聚体)、gH/gL/gO和五聚体复合物。在本发明的意义上，“突变型HCMV复合物”或简称“突变型复合物”是一组两个或更多个相关蛋白，其包含HCMV多肽gH、gL、pUL128、pUL130、pUL131A或其复合物形成片段中的至少一个，其中至少一个HCMV多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定的突变型氨基酸残基。
“五聚体复合物”在本发明的意义上意指HCMV复合物，其包含五个不同的HCMV多肽：gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A。尽管在说明书中通常称为gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A五聚体(或包含gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A的五聚体复合物)，但5个多肽各自都不必是全长多肽。术语“五聚体复合物”还涵盖由gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽的复合物形成片段形成的五聚体。
在本发明的意义上，术语“复合物亚蛋白”或简称“亚蛋白”可用于指代所提及的HCMV复合物内存在的HCMV多肽。例如，HCMV五聚体复合物的“亚蛋白”意指gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A中的任一种，并且在该实例中是“ HCMV五聚体复合物蛋白”的同义词。在进一步实例中，“gH/gL复合物亚蛋白”意指gH或gL多肽。
HCMV多肽的“复合物形成片段”，在本发明的意义上意指保留与复合物中的其他HCMV多肽形成复合物(例如，五聚体复合物、gH/gL二聚体和gH/gL/gO三聚体)的能力的多肽的任何部分或部分。如本文所用，突变型多肽的“复合物形成片段”包含一个或多个突变型氨基酸残基(即，突变型蛋白的片段包含突变)。可通过进行蛋白纯化并通过非还原性PAGE、Western印迹和/或大小排阻色谱对蛋白进行分析来测试形成本发明的复合物(例如，五聚体复合物)的能力。如果蛋白形成复合物的一部分，则其全部在天然PAGE 胶上的单一条带中存在和/或在大小排阻色谱中的单峰中存在。
“增强的热-稳定性”或“增强的热稳定性”或“较高的热稳定性”或“增加的热稳定性”或简称“增强的稳定性”或“较高的稳定性”或“增加的稳定性”，在本发明的意义上意味着，所述复合物(例如五聚体复合物)在相同条件下的解折叠速率至少低于不包含任何稳定突变的相同复合物(换句话说，该复合物在相同条件下解折叠慢于非突变型复合物)。如本文所用的“条件”包括例如实验条件和生理条件。可以指定，与包含非突变型复合物的组合物相比，包含本发明的稳定复合物的组合物具有增加的保存期限。参见，例如，美国公开号2011/0229507 A1，其在此以其整体通过引用并入；Clapp等人, Vaccines with Aluminum- Containing Adjuvants: Optimizing Vaccine Efficacy and Thermal Stability, 2011J. Pharm. Sci. 100(2): 388-401，其讨论经由佐剂增加的稳定性并评价在改变的pH、水合和温度条件下的抗原稳定性；和Rossi等人, 2016 Infect. Immun. 84(6): 1735-1742。本文中的稳定性可以通过δ稳定性(d稳定性或dS)评分方法提供，其为计算机芯片上突变型蛋白的相对热稳定性和相应的野生型或非突变型蛋白的相对热稳定性之间的计算测定的差异。实施例3提供了测定d稳定性的方法，并且包括例如已知的工具，诸如分子操作环境(MOE)软件(参考：分子操作环境(MOE)软件; Chemical Computing Group Inc.，可得自WorldWideWeb(www).chemcomp.com)。dS通过kcal/mol测量。较低的dS值表示较高的蛋白稳定性，相反，较高的dS值表示较低的蛋白稳定性。可以指定，在相同的实验条件下，与非突变型多肽相比，本发明的突变型多肽具有较高的相对热稳定性(以kcal/mol计)。可以进一步指定，在相同的实验条件下，本发明的突变型多肽具有比非突变型多肽更低的dS值。从本发明将理解，在相同的实验条件下，与非突变型多肽相比具有较低dS值的突变型多肽比非突变型多肽更稳定。可以使用例如如Bruylants等人(Differential Scanning Calorimetry in Life Sciences:Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design, 2005 Curr. Med. Chem. 12: 2011-2020)和CalorimetrySciences Corporation的“Characterizing Protein stability by DSC” (LifeSciences Application Note, Doc. No. 20211021306 February 2006)中所讨论的差示扫描量热法(DSC)或通过差示扫描荧光法(DSF)来评价稳定性增强。稳定性的增加可以表征为热转变中点(Tm)增加至少约2℃，如通过DSC或DSF评价。参见，例如，Thomas等人, Effect of single-point mutations on the stability and immunogenicity of a recombinant ricin A chain subunit vaccine antigen, 2013 Hum. Vaccin.Immunother. 9(4): 744-752。热稳定性的“显著”增加或增强被定义为复合物的计算Tm(例如，通过实施例4.7提供的方案计算)增加至少约5℃。
“突变”在本发明的意义上意指氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。关于核酸序列，该取代经由编码区的相应密码子内的错义突变来实现(由一种此类突变型核酸序列编码的突变型多肽可以被称为“突变蛋白”)。如本文所用的术语“突变”还包括将非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物引入多肽的修饰。如本文所用的“突变”不包括“相同突变”，其为氨基酸残基被具有相同化学结构的天然或合成产生的氨基酸取代。通过实例的方式，序列SEQ ID NO:1的位置102处的丙氨酸被丙氨酸取代(A102A)是如本文所用的“相同突变”，并且在本发明的意义上不在“突变”的含义内。因此，可以阐明本发明的突变，条件是不包括相同突变。
“稳定突变”或“稳定突变体”在本发明的意义上意指HCMV多肽中的任何突变，其在形成五聚体复合物后，产生与用不包含这种突变的HCMV多肽形成的五聚体复合物相比具有增强的热稳定性的复合物。在本发明的意义上，稳定突变特别涵盖空腔填充突变、重新包装突变(其包括疏水突变和亲水突变)和二硫桥突变。本发明的稳定突变对使用突变蛋白作为抗原是无害的。具体而言，稳定突变不禁止所有可以引发产生可以结合至少如本文所述的HCMV复合物的抗体和/或可以中和所述HCMV复合物的生物学效应的抗体的表位。另外，本发明的稳定突变不阻止突变型多肽形成复合物。“稳定的复合物”在本发明的意义上意指包含至少一种包含至少一个稳定突变的多肽的复合物(例如五聚体复合物)。
如本文所用的术语“氨基酸”、“残基”和“氨基酸残基”都是指含有至少一个氨基(-NH2)和一个羧基(-COOH)的有机化学化合物。然而，为了清楚起见，且尤其在权利要求内，存在于野生型或非突变型序列内特定位置处的氨基酸(例如，野生型氨基酸)可以被称为“氨基酸”，而存在于突变型序列内的该相应位置处的化合物(突变型氨基酸)可以被称为“残基”(即，由错义突变导致的氨基酸可以被称为“残基”)。
“非突变体”在本发明的意义上意指所提及的分子(例如，序列、多肽或复合物)不包含本发明的稳定突变或去糖基化突变。以该方式，术语“非突变体”涵盖“野生型”结构，但其也涵盖例如截短的野生型多肽。例如，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCMV gH多肽是“非突变型”多肽，至少因为其被截短并且因此不具有“野生型” HCMV gH结构。进一步通过实例，在本发明的意义上，具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCMV gL多肽是“非突变型”多肽。为了清楚起见，“非突变体”在本文中用作提及结构，而不是提及功能。例如，可以将非突变型多肽描述为具有野生型功能(诸如，包含SEQ ID NO:3的HCMV gH多肽)。
“空腔填充突变”在本发明的意义上意指第一氨基酸(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸取代，其中第二氨基酸具有比第一氨基酸更长的侧链。换句话说，本文的空腔填充突变是氨基酸被残基取代，其中所述残基具有比氨基酸更长的侧链。具有长侧链的此类氨基酸残基包括：色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)。
“重新包装突变”在本发明的意义上意指第一氨基酸残基(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸残基取代，所述第二氨基酸残基增加多肽中的相邻残基的相互作用。重新包装突变包括氨基酸取代，其例如，(1)增强疏水相互作用(例如，通过疏水氨基酸)或氢键形成(例如，通过极性或带电荷(即亲水)氨基酸)，或(2)减少相邻残基的不利或排斥相互作用(例如，通过消除相似带电荷残基的簇)。在本发明的意义上，重新包装突变尤其涵盖疏水突变和亲水突变。
“疏水突变”在本发明的意义上意指第一氨基酸残基(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸残基取代，其中所述第二氨基酸具有疏水侧链。具有疏水侧链的此类氨基酸残基包括：色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)。酪氨酸(Y)也可以归为疏水的。
“亲水突变”在本发明的意义上意指第一残基(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸取代，其中所述第二氨基酸具有亲水侧链。“亲水侧链”既涵盖取代为具有极性侧链的氨基酸，也涵盖取代为具有带电荷侧链的氨基酸。在本领域中通常理解，极性氨基酸侧链是亲水的，但不带电荷，并且带电荷的氨基酸侧链是亲水的且带电荷的。“极性突变”在本发明的意义上意指第一氨基酸残基(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸残基取代，其中所述第二氨基酸具有极性侧链。具有极性侧链的氨基酸残基包括：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。“带电荷突变”在本发明的意义上意指第一氨基酸残基(例如，野生型氨基酸)被第二氨基酸残基取代，其中所述第二氨基酸具有带电荷侧链。具有带电荷侧链的氨基酸残基包括：精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)。
“二硫桥突变”在本发明的意义上意指氨基酸残基被半胱氨酸(C)残基取代，以便在多肽内或多肽之间形成二硫桥。本发明包括由一个二硫桥突变(即一个氨基酸被半胱氨酸取代)组成的单一蛋白(例如，gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)。二硫桥形成于两个残基 之间，并且是“多肽内二硫桥”(在同一多肽内的两个残基之间形成)，或者“多肽间二硫桥”(在两个残基之间形成，第一残基在第一多肽内，且第二残基在第二多肽内)。因此，为了仅使用二硫桥突变来增加蛋白的复合物的稳定性，必须将二硫桥突变引入成对(2的倍数)的复合物中，其中至少一对二硫桥突变各自在复合物亚蛋白中的一种或多种内。可以指定该复合物包含2n个二硫桥突变，其中“n”是包括零的任何正整数。可以进一步指定，该复合物包含两个、四个、六个、八个、十个、十二个、十四个、十六个、十八个、二十个、二十二个、二十四个、二十六个、二十八个、三十个、三十二个、二十四个、三十六个、三十八个、四十个、四十二个、四十四个、四十六个或2的更高倍数的二硫桥突变。例如，本发明涵盖由一对二硫桥突变组成的稳定的五聚体复合物，其中第一二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:17的pUL130的G116C的残基处，且第二二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:17的pUL130的H150C的残基处(参见下表21)。进一步例如，本发明涵盖由一对二硫桥突变组成的稳定的五聚体复合物，其中第一二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:7的gL的D163C的残基处，且第二二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:17的pUL130的P62C的残基处(参见下表21)。进一步例如，本发明包括由两对二硫桥突变组成的稳定的五聚体复合物，其中第一对二硫桥突变由对应于具有序列SEQ ID NO:7的gL的D163C的残基处的第一二硫桥突变组成，且第二二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:17的pUL130的P62C的残基处，且其中第二对二硫桥突变由对应于具有序列SEQ ID NO:1的gH的V109C的残基处的第三二硫桥突变组成，且第四二硫桥突变在对应于具有序列SEQ ID NO:7的gL的G224C的残基处(参见下表21)。对于包含例如一个重新包装突变和一个二硫桥突变的本发明的稳定复合物，本领域普通技术人员将认识到没有必要指定一对二硫桥突变，因为单独的一个重新包装突变可能足以实现增加的稳定性。
“去糖基化突变”在本发明的意义上意指天冬酰胺氨基酸(例如，野生型天冬酰胺氨基酸)被第二氨基酸取代，其由此防止将聚糖添加至在该残基位置处的天冬酰胺氮原子(即，防止该位置处的N-连接的糖基化)。第二氨基酸可以是任何非天冬酰胺残基。因此，可以指定包含去糖基化突变的多肽或复合物包含谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)残基，其中非-突变体(例如，野生型或对照)多肽或复合物分别包含天冬酰胺(N)残基。本发明的HCMV多肽或其复合物形成片段或HCMV复合物可以包含一个或多个去糖基化突变或可以包含一个或多个稳定突变(即，空腔填充、重新包装和/或二硫桥突变)和一个或多个去糖基化突变的组合。
“抗原性”在本文中用于指抗原与抗体组合的能力，例如结合中和抗体的能力。因此，“增加的抗原性”或“增强的抗原性”涵盖，例如，中和抗体对突变型抗原的结合亲和力与其对非突变型抗原的结合亲和力相比增加。可以提供增加的结合亲和力作为降低的解离常数(Kd)值(以nM计)。通常参见，例如，Ma等人. Envelope Deglycosylation Enhances Antigenicity of HIV-1 gp41 Epitopes for Both Broad Neutralizing Antibodies and Their Unmutated Ancestor Antibodies, 2011 PLoS Path. 7(9), e1002200。
“免疫原性”在本文中用于指抗原诱导免疫应答的能力。通常参见，例如，Ma等人,2011 PLoS Path. 7(9), e1002200。
如在本公开和权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定；即，“一个/种(a)”意指“一个/种或多个/种”，除非另有说明。
术语“约”或“近似”意指大致、周围或其区域内。术语“约”或“近似”进一步意指如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的上下文误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，即，测量系统或特定目的(例如培养基内的复合物的量)所需的精度的限制。当术语“约”或“近似”结合数值范围使用时，它通过延伸所示数值的上限和下限而修改范围。例如，“在约5.5至6.5 mg/ml之间”意味着数值范围的边界延伸低于5.5且高于6.5，使得所讨论的特定值实现与该范围内相同的功能结果。例如，“约”和“近似”可以意指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”和“近似”可以意指给定值的最多达20%、优选最多达10%、更优选最多达5%和更优选最多达1%的范围。
如在短语诸如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"和"B"。同样地，如短语诸如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有指定，否则所有名称"A%-B%"、"A-B%"、"A%至B%"、"A至B%"、"A%-B"、"A%至B"均给予它们的普通和习惯意义。在一些实施方案中，这些名称是同义词。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由...组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括额外物质，例如X + Y。当在本文中用作过渡短语时，术语“包含”和“具有”是开放式的，而当在本文中用作过渡短语时，术语“由…组成”是封闭式的(即，限于所列的且没有更多)。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
“有效量”，诸如在“治疗有效量的抗原和/或佐剂”中，意指足以引起参考效果或结果的量。“有效量”可以使用与所述目的相关的已知技术凭经验且以常规方式确定。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，且然后该组合可以与第三组分组合，等。类似地，尽管方法的步骤可以编号(诸如(1)、(2)、(3)等或(i)、(ii)、(iii))，步骤的编号并不意味着必须以该顺序执行步骤(即，步骤1，然后步骤2，然后步骤3等)。词语“然后”可用于指定方法的步骤的顺序。
如本文中用于描述多核苷酸的“重组”指基因组、cDNA、RNA(包括mRNA)、半合成或合成来源的多核苷酸，凭借其来源或操作，所述多核苷酸：(1)与在自然界中与其缔合的全部或部分多核苷酸不缔合；和/或(2)连接至除了在自然界中与其相连的多核苷酸以外的多核苷酸。就蛋白或多肽而言所用的术语“重组”意指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。当核酸分子可操作连接至其在自然界中不与其缔合的另一种多核苷酸时，该核酸分子可被称为“异源的”(即，该核酸分子与至少该多核苷酸是异源的)。类似地，当多肽与其在自然界中不与其缔合的另一种蛋白接触或复合时，该多肽可被称为“异源的”(即，该多肽与该蛋白异源)。进一步，当宿主细胞包含其天然不包含的核酸分子或多肽时，该核酸分子和多肽可被称为“异源的”(即，该核酸分子与宿主细胞是异源的且该多肽与宿主细胞是异源的)。
优选通过使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch, A General Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins, 1970 J. Mol. Biol. 48(3): 443-453)的逐对比对算法、使用默认参数(例如空位开放罚分＝10.0，且空位延伸罚分 ＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)来测定多肽序列之间的序列同一性。在EMBOSS软件包中的needle工具中方便地执行该算法(Rice等人, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 2000 TrendsGenetics 16: 276-277)。应当在本发明的多肽序列的全长上计算序列同一性。
gH多肽
由UL75基因编码的HCMV糖蛋白H(gH)是一种病毒粒子糖蛋白，其是感染性所必需的且在α-、β-和γ-疱疹病毒的成员间保守。
来自HCMV毒株Merlin的gH已被报道(NCBI GI:52139248 (其也是NCBI GenBank登录号YP_081523.1), SEQ ID NO:1)由 742个氨基酸组成。来自HCMV毒株Towne的gH(NCBIGI:138314，其也是NCBI UniProtKB登录号P17176.1; SEQ ID NO:5)也由742个氨基酸组成(SEQ ID NO:5)。来自HCMV毒株AD169的gH被公开为NCBI UniProtKB登录号P12824.1(本文为SEQ ID NO:6)。HCMV gH已被报道为具有6个N-糖基化位点(在残基55、62、67、192、641和700处)，并且由其N-末端处的疏水信号序列(SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-23)、从细胞中凸出至胞外空间的胞外域(SEQ ID NO:1的残基24-717)、疏水TM结构域(SEQ ID NO:1的残基718-736)和C-末端胞质结构域(SEQ ID NO:1的残基737-742)组成。
gH的胞外域对应缺乏于疏水TM的gH的一部分。可基于将给定序列与SEQID NO:1进行成对比对来预测胞外域的位置和长度，例如通过比对目标gH多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:1并鉴定与SEQ ID NO:1的残基24-717对齐的序列。类似地，可通过将目标gH多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1进行成对比对并分别鉴定与SEQ ID NO:1的残基718-736和737-742对齐的序列来预测TM和C-末端结构域的位置。或者，可基于沿给定gH蛋白序列长度的疏水性的计算机分析来预测胞外域、信号序列和TM结构域的位置和长度。信号序列和TM结构域具有最高水平的疏水性且这两个区域侧接疏水性较低的胞外域。TM结构域的不存在意味着修饰的多肽不存在于脂质双层中。在一些实施方案中，所述gH多肽缺乏全长天然TM结构域；在其他实施方案中，其可保留天然TM结构域的一部分，但不足以使蛋白存在于脂质双层中。因此，该多肽可含有天然gH TM结构域的最多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。
通常，gH多肽的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的 gH蛋白。在一个优选实施方案中，根据本发明突变的HCMV gH多肽缺乏N-末端信号序列。缺乏N-末端序列的HCMV gH多肽的实例是SEQ ID NO:2。在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明突变的HCMV gH多肽缺乏N-末端信号序列、跨膜(TM)结构域和C-末端结构域。全长UL75基因序列的表达阻碍包含gH的可溶性复合物的纯化。相反，可通过省略gH的TM结构域的至少一部分来以高产率和纯度纯化包含gH 的复合物。例如，可使用仅编码gH的N-末端信号序列和胞外域(或gH胞外域的大部分)、但非TM结构域的构建体来表达容易纯化的gH的形式(参见，例如，WO 2014/005959，也公开为美国授权前公开号2016-0159864)。所述构建体可编码gH的胞外域的大部分(例如70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更多)，但不编码TM结构域或仅编码TM结构域的一小部分。本发明的gH多肽可包括gH胞外域的全部或gH胞外域的截短形式(诸如由SEQ ID NO:3或4组成的gH多肽，其不包含SEQ ID NO:1的胞外域的残基716或717，并且也不包含TM或C-末端结构域)。相对于全长HCMV gH蛋白，所述胞外域的截短形式可缺乏其N-末端和/或C-末端处的1至20个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基)。在替代实施方案中，根据本发明突变的HCMV gH多肽缺乏N-末端信号序列、TM结构域和C-末端结构域。用于本发明中的优选的HCMVgH多肽的实例是SEQ ID NO:3，其具有截短的胞外域，缺乏跨膜(TM)结构域，并且缺乏gH序列SEQ ID NO:1的C-末端胞质结构域。SEQ ID NO:3由SEQ ID NO:1的氨基酸1-715组成。本发明的优选的gH蛋白的一个实例是SEQ ID NO:4，其缺乏gH的N –末端信号序列，具有截短的胞外域，缺乏TM结构域且缺乏gH序列SEQ ID NO:1的C-末端结构域。SEQ ID NO:4由SEQID NO:1的氨基酸残基24-715组成。
如实施例内所示，gH多肽在相对于gH氨基酸序列SEQ ID NO:1编号的六个天冬酰胺残基处被糖基化(经由N-连接的糖基化包含聚糖)：N55、N62、N67、N192、N641和N700。用于本发明中的HCMV gH多肽或其复合物形成片段可以在位于相对于gH序列SEQ ID NO:1编号的残基55、62、67、192、641和700处的天冬酰胺中的一个或多个处包含去糖基化突变。所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)。进一步具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)。
本发明的gH蛋白可含有额外的氨基酸残基，诸如N-末端或C-末端延伸。此类延伸可包括一个或多个标签，其可促进gH蛋白的检测(例如用于通过单克隆抗体进行检测的表位标签)和/或纯化(例如允许在镍螯合树脂上进行纯化的聚组氨酸标签)。例如，本发明的gH蛋白可以包含与C-末端延伸融合的截短的gH胞外域(参见，例如，WO 2014/005959，也公开为美国授权前公开号2016-0159864)。
本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:1具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:1中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:2具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:2中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:3具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:3中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:4具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:4中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:5具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:5中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gH蛋白可以与SEQ ID NO:6具有各种程度的同一性，诸如与SEQID NO:6中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的gH蛋白或其片段：(i)可与HCMVgL二聚化；(ii) 形成三聚体gH/gL/gO复合物的一部分；(iii)形成五聚体 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(iv)包含至少一个来自SEQ IDNO:1、2、3、4、5或6的表位；和/或(v)可在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。gH的示例性复合物形成片段包含SEQ ID NO:2的残基Arg1至Leu125，当与全长gL(可能使用gL的柔性C-末端作为接头)、全长pUL128、全长pUL130和全长pUL131A复合时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。
本发明的HCMV gH多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定突变，合适地，一个或多个空腔填充突变，一个或多个疏水突变，一个或多个亲水突变，一个或多个二硫桥突变，或其中一者或多者的任何组合。具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中所示的序列的任何gH多肽，或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少90%同一性的序列的任何gH多肽可以合适地包含如本文所鉴定和定义的任何一个或多个稳定突变。因此，在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1中所示的序列的HCMV gH多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:2中所示的序列的HCMV gH多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:3中所示的序列的HCMV gH多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:4中所示的序列的HCMV gH多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。
如实施例3中进一步详述和图2A-2F中所举例说明，本发明人在五聚体复合物的晶体结构中鉴定了在gH/gL/UL界面处的一些空腔。因此，预期任何空腔填充突变(其目的在于填充在HCMV gH多肽中的这种界面处观察到的空腔)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)的稳定性。类似地，预期任何重新包装突变，诸如任何疏水突变或任何亲水突变(其目的在于增加HCMV gH多肽中相邻残基的接触)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)的稳定性。类似地，任何二硫桥突变(其目的在于将多肽内二硫桥引入HCMV gH多肽中和/或在HCMV gH多肽和复合物的其他组分中的任一种(例如，HCMV五聚体复合物的HCMV gL、HCMV pUL128、HCMV pUL130或HCMV pUL131A多肽)之间引入多肽间二硫桥)有利地促成具有增强的热稳定性的复合物。
鉴定HCMV gH多肽中的相关氨基酸残基以针对空腔填充和/或重新包装和/或二硫桥突变，可以例如通过借助分子图形软件目视检查三维结构或通过使用任何适当的计算机芯片上诱变方法进行。例如，软件，诸如分子操作环境(MOE)(由Chemical Computing GroupInc.编辑)允许系统分析氨基酸序列，以鉴定多肽中的特定区域或特定氨基酸，其突变被预测为增强热稳定性。
表1中提供了在HCMV gH多肽中突变的合适的非限制性示例性氨基酸残基，其仅使用如SEQ ID NO:1中所示的序列作为参考。在本发明中还考虑其他HCMV gH多肽(诸如例如具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的序列的多肽)或源自不同于Merlin毒株的HCMV毒株的gH多肽中的类似位置处的突变。确定其他HCMV gH多肽中的此类相似位置在技术人员的能力之内。给定HCMV多肽中的相当的氨基酸位置可以通过使用容易获得和众所周知的比对和算法(诸如BLAST或ClustalW2)比对氨基酸序列来确定。对于其他HCMV gH多肽，可能必须根据实际序列比对来调整氨基酸位置的实际数目。
表1A
Figure 589714DEST_PATH_IMAGE002
因此，在一些实施方案中，在HCMV gH多肽中突变用于空腔填充的氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的A102、A372、A352或L257，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含对应于SEQ IDNO:1的102、372、352和257的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
在HCMV gH多肽中突变用于疏水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的H252、K404、R255、E355、H480、S601或R405，或在源自不同HCMV毒株的HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含位置252、404、255、355、480、601和405处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
在HCMV gH多肽中突变用于亲水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的G358或H275，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含对应于SEQ ID NO:1的G358和H275的位置处的至少一个氨基酸被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)的氨基酸取代。在HCMV gH多肽中突变用于极性突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:1中所示的序列的G358或H275，或在源自不同HCMV毒株的 HCMVgH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含对应于SEQ ID NO:1的G358和H275的位置处的至少一个氨基酸被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)的氨基酸取代。在HCMV gH多肽中突变用于带电荷突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的G358或H275，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被氨基酸残基精氨酸(R)或谷氨酸(E)取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的G358和H275的位置处的至少一个氨基酸被氨基酸精氨酸(R)或谷氨酸(E)取代。
在HCMV gH多肽中突变用于二硫桥突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的V109或L111，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV多肽至少包含对应于SEQ ID NO:1的V109的残基被半胱氨酸(C)取代或对应于SEQ ID NO:1的L111的残基被半胱氨酸(C)取代，合适地，两者。
因此，在一些实施方案中，在HCMV gH多肽中突变用于去糖基化的氨基酸是SEQ IDNO:1中所示的序列的N55、N62、N67、N192、N641和N700，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽包含对应于SEQ ID NO:1的55、62、67、192、641和700的位置处的至少一个氨基酸被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
表1B
Figure 464391DEST_PATH_IMAGE003
gL多肽
由UL115基因编码的HCMV糖蛋白L(gL)被认为是病毒复制所必需的。gL的全部已知功能特性都与其与gH的二聚化直接相关。gL/gH复合物是病毒和质膜的融合所需的，所述融合导致病毒进入宿主细胞。已报道来自HCMV毒株Merlin (NCBI GI:39842115 (其也是NCBIGenBank登录号AAR31659.1), SEQ ID NO:7)和HCMV毒株Towne (NCBI GI:239909463，其也是NCBI GenBank登录号ACS32410.1; 本文的SEQ ID NO:11)的gL长度为278个氨基酸。已报道来自HCMV毒株AD169 (NCBI GI:2506510，其也是NCBI UniProtKB登录号P16832.2; 本文的SEQ ID NO:12)的gL长度为278个氨基酸，包括在其N-末端的信号序列(氨基酸残基1-35)，具有两个N-糖基化位点(在残基74和114处)并缺乏TM结构域(Rigoutsos等人, In silico pattern-based analysis of the human cytomegalovirus genome, 2003 J. ofVirology 77: 4326-44)。对来自22至39种临床分离物以及实验室毒株AD169、Towne和Toledo的全长gL基因的测序揭示，分离物间的氨基酸序列中的小于2%变异(Rasmussen等人, The Genes Encoding the gCIII Complex of Human Cytomegalovirus Exist in Highly Diverse Combinations in Clinical Isolates, 2002 J. of Virology 76:10841-10888)。通常，gL蛋白的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的gL多肽。用于本发明中的pL多肽可以缺乏N-末端信号序列。缺乏N-末端序列的HCMV pL多肽的一个实例是SEQ ID NO:8，其由SEQ ID NO:7的氨基酸残基31-278组成。用于本发明中的优选的gL多肽的实例是SEQ ID NO:9或10，其包含据信是蛋白酶识别位点的位点处的LSG突变，其中所述突变减少蛋白酶切割。用于本发明中的优选的gL多肽的实例是SEQ ID NO:29或30，其包含据信是蛋白酶识别位点的位点处的IDG突变，其中所述突变减少蛋白酶切割。
如实施例内所示，gL多肽在一个天冬酰胺残基(相对于gL氨基酸序列SEQ ID NO:7编号的N74)处被糖基化(经由N-连接的糖基化包含聚糖)。用于本发明中的HCMV gL多肽或其复合物形成片段可以包含相对于gL序列SEQ ID NO:7编号的残基74处的去糖基化突变。所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)。进一步具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)。
本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:7具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:7中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:8具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:8中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:9具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:9中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:10具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:10中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:11具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:11中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:12具有各种程度的同一性，诸如与SEQID NO:12中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:29具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:29中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gL蛋白可以与SEQ ID NO:30具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:30中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的gL蛋白或其片段：(i)可与HCMVgH二聚化；(ii)形成三聚体 gH/gL/gO复合物的一部分；(iii)形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A 复合物的一部分；(iv)包含至少一个来自SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、29或30的表位；和/或(v)可在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。gL的示例性复合物形成片段包含SEQ ID NO:7的残基Thr76至Tyr169，当与全长pUL128、全长pUL130和全长pUL131A复合(即，gH不存在)时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。
本发明的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定突变，合适地，一个或多个空腔填充突变，一个或多个疏水突变，一个或多个亲水突变，一个或多个二硫桥突变，或其中一者或多者的任何组合。具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中所示的序列的任何gL多肽，或具有与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90%同一性的序列的任何gH多肽或其复合物形成片段可以合适地包含如本文所鉴定和定义的任何一个或多个稳定突变。因此，在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:7中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:8中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:9中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:10中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:29中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:30中所示的序列的HCMV gL多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。
如实施例3中进一步详述和图2A-2F中所举例说明，本发明人在五聚体复合物的晶体结构中鉴定了在gH/gL/UL界面处的一些空腔。因此，预期任何空腔填充突变(其目的在于填充在HCMV gL多肽中的这种界面处观察到的空腔)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)的稳定性。类似地，预期任何重新包装突变，诸如任何疏水突变或任何亲水突变(其目的在于增加HCMV gL多肽中相邻残基的接触)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体，gH/gL或gH/gL/gO复合物)的稳定性。类似地，任何二硫桥突变(其目的在于将多肽内二硫桥引入HCMV gL多肽中和/或在HCMV gL多肽和复合物的任何其他组分(例如，HCMV五聚体复合物的HCMV gH、HCMV pUL128、HCMV pUL130或HCMV pUL131A多肽)之间引入多肽间二硫桥)有利地促成具有增强的热稳定性的复合物。
鉴定HCMV gL多肽中的相关氨基酸残基以针对空腔填充和/或重新包装和/或二硫桥突变，可以例如通过借助分子图形软件目视检查三维结构或通过使用任何适当的计算机芯片上诱变方法进行。例如，软件，诸如分子操作环境(MOE)(由Chemical Computing GroupInc.编辑)允许系统分析氨基酸序列，以鉴定多肽中的特定区域或特定氨基酸，其突变被预测为增强热稳定性。
表2中提供了在HCMV gL多肽中突变的合适的非限制性示例性氨基酸残基，其仅使用如SEQ ID NO:7中所示的序列作为参考。在本发明中还考虑其他HCMV gL多肽(诸如例如具有如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30中所示的序列的多肽)或源自不同于Merlin毒株的HCMV毒株的gL多肽中的类似位置处的突变。确定其他HCMV gL多肽中的此类相似位置在技术人员的能力之内。给定HCMV gL多肽中的相当的氨基酸位置可以通过使用容易获得和众所周知的比对和算法(诸如BLAST或ClustalW2)比对氨基酸序列来确定。对于其他HCMV gL多肽，可能必须根据实际序列比对来调整氨基酸位置的实际数目。
因此，在一些实施方案中，在HCMV gL多肽中突变用于去糖基化的氨基酸是SEQ IDNO:7中所示的序列的N74，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gL多肽中的相应位置处。合适地，该氨基酸残基的突变可以由以下组成：其被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gL多肽至少包含对应于SEQ ID NO:7的74的位置处的氨基酸被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
表2A
Figure 390759DEST_PATH_IMAGE004
因此，在一些实施方案中，在HCMV gL多肽中突变用于空腔填充的氨基酸是SEQ IDNO:7中所示的序列的H177、G224、G140、G145、D146、G218、L119、C233或P272，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gL多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gL多肽包含对应于SEQ ID NO:7的177、224、140、145、146、218、119、233和272的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
在HCMV gL多肽中突变用于疏水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:7中所示的序列的H267、H236、H245、G161或C233，或在源自不同HCMV毒株的HCMV gL多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gL多肽包含对应于SEQ ID NO:7的267、236、245、161和233的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
在HCMV gL多肽中突变用于二硫桥突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ IDNO:7中所示的序列的G161、D163、G224、G218、R166、G140、R160或A150，或在源自不同HCMV毒株的HCMV gL多肽中的相应位置处。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gL多肽至少包含选自以下的取代：G161C、D163C、G224C、G218C、R166C、G140C、R160C、A150C及其组合。
表2B
Figure 595344DEST_PATH_IMAGE005
pUL128多肽
已报道来自HCMV毒株Merlin的pUL128(或简称“UL128”)(NCBI GI:39842124 (其也是NCBI GenBank登录号AAR31668.1), SEQ ID NO:13)由130个氨基酸组成且含有一(1)个引起成熟前终止的核苷酸取代。已报道来自 HCMV毒株Towne (NCBI GI:39841882 (其也是NCBI GenBank登录号AAR31451.1), SEQ ID NO:15)和AD169 (NCBI GI:59803078 (其也是NCBI UniProtKB登录号P16837.2), SEQ ID NO:16)的pUL128由171个氨基酸组成。由于SEQID NO:13、15和17的成熟前终止，SEQ ID NO:13和15仅在SEQ ID NO:13的全长上共有75%同一性。预测pUL128具有N-末端信号序列，其位于SEQ ID NO:13的残基1-27处，但预测其缺乏TM结构域。通常，pUL128多肽的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的pUL128蛋白。用于本发明中的pUL128多肽可以缺乏N-末端信号序列。缺乏N-末端序列的HCMV pUL128多肽的一个实例是SEQ ID NO:14，其由SEQ ID NO:13的氨基酸残基28-130组成。
本发明的pUL128蛋白可以与SEQ ID NO:13具有各种程度的同一性，诸如与SEQ IDNO:13中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL128蛋白可以与SEQ ID NO:14具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:14中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL128蛋白可以与SEQ ID NO:15具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:15中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL128蛋白可以与SEQ ID NO:16具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:16中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的pUL128蛋白或其片段：(i)可以形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(ii)包含至少一个SEQ ID NO:13、14、15或16的表位；和/或(iii)可以在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。
本发明的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定突变，合适地，一个或多个空腔填充突变，一个或多个疏水突变，一个或多个亲水突变，一个或多个二硫桥突变，或其中一者或多者的任何组合。具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16中所示的序列的任何pUL128多肽，或具有与SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90%同一性的序列的任何pUL128多肽或其复合物形成片段可以合适地包含如本文所鉴定和定义的任何一个或多个稳定突变。因此，在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:13中所示的序列的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:14中所示的序列的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQ ID NO:15中所示的序列的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在进一步替代实施方案中，具有SEQID NO:16中所示的序列的HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。
如实施例3中进一步详述和图2A-2F中所举例说明，本发明人在五聚体复合物的晶体结构中鉴定了在gH/gL/UL界面处的一些空腔。因此，预期任何空腔填充突变(其目的在于填充在HCMV pUL128多肽中的这种界面处观察到的空腔)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性。类似地，预期任何重新包装突变，诸如任何疏水突变或任何亲水突变(其目的在于增加HCMV pUL128多肽中相邻残基的接触)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性，其具有增强的热稳定性。类似地，任何二硫桥突变(其目的在于将多肽内二硫桥引入HCMV pUL128多肽中和/或在HCMV pUL128多肽和复合物的其他组分中的任一种(例如，HCMV五聚体复合物的HCMV gH、HCMV gL、HCMV pUL130或HCMV pUL131A多肽)之间引入多肽间二硫桥)有利地促成具有增强的热稳定性的复合物。
鉴定HCMV pUL128多肽中的相关氨基酸残基以针对空腔填充和/或重新包装和/或二硫桥突变，可以例如通过借助分子图形软件目视检查三维结构或通过使用任何适当的计算机芯片上诱变方法进行。此类方法是技术人员已知的。例如，软件，诸如分子操作环境(MOE)(由Chemical Computing Group Inc.编辑)允许系统分析氨基酸序列，以鉴定多肽中的特定区域或特定氨基酸，其突变被预测为增强热稳定性。
表3中提供了在HCMV pUL128多肽中突变的合适的非限制性示例性氨基酸残基，其仅使用如SEQ ID NO:13中所示的序列作为参考。在本发明中还考虑其他HCMV pUL128多肽(诸如例如具有如SEQ ID NO:14中所示的序列的多肽)或源自不同于Merlin毒株的HCMV毒株的gH多肽(诸如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)中的类似位置处的突变。确定其他HCMVpUL128多肽中的此类相似位置在技术人员的能力之内。给定HCMV pUL128多肽中的相当的氨基酸位置可以通过使用容易获得和众所周知的比对和算法(诸如BLAST或ClustalW2)比对氨基酸序列来确定。对于其他HCMV pUL128多肽，可能必须根据实际序列比对来调整氨基酸位置的实际数目。
表3A
Figure 948965DEST_PATH_IMAGE006
因此，在一些实施方案中，在HCMV pUL128多肽中突变用于空腔填充的氨基酸是SEQ ID NO:13中所示的序列的G123、V77、L103或Q119，或在源自不同HCMV毒株的 HCMVpUL128多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL128多肽包含对应于SEQ ID NO:13的123、77、103和119的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
在HCMV pUL128多肽中突变用于疏水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQID NO:13中所示的序列的G145、H90或G112，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL128多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL128多肽包含对应于SEQ ID NO:13的145、90和112的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
在HCMV pUL128多肽中突变用于二硫桥突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:13中所示的序列的R142、N99、Y98、A124、G126、L159、D45、V88、M48、G107、R51、D106或S83，或在源自不同HCMV毒株的HCMV pUL128多肽中的相应位置处。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL128多肽至少包含选自以下的取代：R142C、N99C、Y98C、A124C、G126C、L159C、D45C、V88C、M48C、G107C、R51C、D106C、S83C及其组合。
表3B
Figure 622523DEST_PATH_IMAGE007
pUL130多肽
pUL130 (或简称为“UL130”)是HCMV UL131A-128基因座的中央和最大(214个密码子)基因。来自HCMV毒株Merlin的pUL130的序列是公开可得的(NCBI GI: 39842125 (其也是NCBI GenBank登录号AAR31669.1)和本文的SEQ ID NO:17)。来自HCMV毒株Towne的pUL130的序列是公开可得的(NCBI GI:239909473 (其也是NCBI ACS32420.1)和本文的SEQ IDNO:19)。同样，来自HCMV毒株AD169的pUL130的序列是公开可得的(NCBI UniprotKB登录号P16772和本文的SEQ ID NIO: 20)。Merlin和Towne pUL130序列分别由214和229个氨基酸组成。Merlin pUL130序列SEQ ID NO: 17包含在亲水蛋白之前的残基1-25处的25氨基酸长的N-末端信号序列，所述亲水蛋白含有推定的趋化因子结构域(氨基酸46至120)内的两个潜在的N-连接的糖基化位点(Asn85和Asn118)和靠近独特的C-末端区域的末端的额外N-糖基化位点(Asn201)。预测pUL130缺乏TM结构域。
通常，pUL130多肽的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的pUL130蛋白。用于本发明中的pUL130多肽可以缺乏N-末端信号序列。缺乏N-末端序列的HCMV pUL130多肽的一个实例是SEQ ID NO:18，其由SEQ ID NO:17的氨基酸残基26-214组成。
如实施例内所示，pUL130多肽在相对于pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17编号的三个天冬酰胺残基处被糖基化(经由N-连接的糖基化包含聚糖)：N85、N118和N201。用于本发明中的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段可以在位于相对于pUL130序列SEQ ID NO:17编号的残基85、118和201处的天冬酰胺中的一个或多个处包含去糖基化突变。所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)。进一步具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)。
本发明的pUL130蛋白可以与SEQ ID NO:17具有各种程度的同一性，诸如与SEQ IDNO:17中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL130蛋白可以与SEQ ID NO:18具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:18中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL130蛋白可以与SEQ ID NO:19具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:19中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL130蛋白可以与SEQ ID NO:20具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:20中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的pUL130蛋白或其片段：(i)可以形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物，(ii)包含至少一个SEQ ID NO:17、18、19或20的表位；和/或(iii)可以在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。pUL130的示例性复合物形成片段包含SEQ ID NO:17的残基Thr45至Val214，当与全长pUL131A复合(即，gH、gL或pUL128无一存在)时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。或者，pUL130的复合物形成片段包含SEQ ID NO:17的残基Thr45至Val214，当与包含SEQ ID NO:21的残基Gln19至Asn129的pUL131A的复合物形成片段复合(即，gH、gL或pUL128无一存在)时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。
本发明的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定突变，合适地，一个或多个空腔填充突变，一个或多个疏水突变，一个或多个亲水突变，一个或多个二硫桥突变，或其中一者或多者的任何组合。具有如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20中所示的序列的任何pUL130多肽，或具有与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少90%同一性的序列的任何pUL130多肽或其复合物形成片段可以合适地包含如本文所鉴定和定义的任何一个或多个稳定突变。因此，在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:17中所示的序列的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:18中所示的序列的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:19中所示的序列的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:20中所示的序列的HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。
如实施例3中进一步详述和图2A-2F中所举例说明，本发明人在五聚体复合物的晶体结构中鉴定了在gH/gL/UL界面处的一些空腔。因此，预期任何空腔填充突变(其目的在于填充在HCMV pUL130多肽中的这种界面处观察到的空腔)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性。类似地，预期任何重新包装突变，诸如任何疏水突变或任何亲水突变(其目的在于增加HCMV pUL130多肽中相邻残基的接触)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性。类似地，任何二硫桥突变(其目的在于将多肽内二硫桥引入HCMV pUL130多肽中和/或在HCMV gH多肽和复合物的其他组分中的任一种(例如，HCMV五聚体复合物的HCMV gH、HCMVgL、HCMV pUL128或HCMV pUL131A多肽)之间引入多肽间二硫桥)有利地促成具有增强的热稳定性的复合物。
鉴定HCMV pUL130多肽中的相关氨基酸残基以针对空腔填充和/或重新包装和/或二硫桥突变，可以例如通过借助分子图形软件目视检查三维结构或通过使用任何适当的计算机芯片上诱变方法进行。此类方法是技术人员已知的。例如，软件，诸如分子操作环境(MOE)(由Chemical Computing Group Inc.编辑)允许系统分析氨基酸序列，以鉴定多肽中的特定区域或特定氨基酸，其突变被预测为增强热稳定性。
表4中提供了在HCMV pUL130多肽中突变的合适的非限制性示例性氨基酸残基，其仅使用如SEQ ID NO:17中所示的序列作为参考。在本发明中还考虑其他HCMV pUL130多肽(诸如例如具有如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20中所示的序列的多肽)或源自不同于Merlin毒株的HCMV毒株的pUL130多肽中的类似位置处的突变。确定其他HCMVpUL130多肽中的此类相似位置在技术人员的能力之内。给定HCMV pUL130多肽中的相当的氨基酸位置可以通过使用容易获得和众所周知的比对和算法(诸如BLAST或ClustalW2)比对氨基酸序列来确定。对于其他HCMV pUL130多肽，可能必须根据实际序列比对来调整氨基酸位置的实际数目。
表4A
Figure 352582DEST_PATH_IMAGE008
因此，在一些实施方案中，在HCMV pUL130多肽中突变用于空腔填充的氨基酸是SEQ ID NO:17中所示的序列的D165或H209，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL130多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL130多肽包含对应于SEQ ID NO:17的165和209的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
在HCMV pUL130多肽中突变用于疏水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQID NO:17中所示的序列的G116、G135、H150或H209，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL130多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL130多肽包含对应于SEQ ID NO:17的G116、G135、H150和H209的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
在HCMV pUL130多肽中突变用于二硫桥突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:17中所示的序列的G116、H150、P64、S178、P62、E95、Y204、N211、I213、Y56或T167，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL130多肽中的相应位置处。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL130多肽至少包含选自以下的取代：G116C、H150C、P64C、S178C、P62C、E95C、Y204C、N211C、I213C、Y56C、T167C及其组合。
因此，在一些实施方案中，在HCMV pUL130多肽中突变用于去糖基化的氨基酸是SEQ ID NO:17中所示的序列的N85、N118和N201，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL130多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL130多肽包含对应于SEQ ID NO:17的85、118和201的位置处的至少一个氨基酸被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
表4B
Figure 175788DEST_PATH_IMAGE009
pUL131A多肽
pUL131A功能是HCMV复制所需的，不仅是在内皮细胞中，而且在上皮细胞中。已报道来自HCMV毒株Merlin (NCBI GI:39842126 (其也是NCBI GenBank登录号AAR31670.1)，SEQID NO:21)和Towne (NCBI GI:239909474 (其也是NCBI GenBank登录号ACS32421.1)，SEQID NO:23)和AD169 (NCBI GI:219879712 (其也是NCBI GenBank登录号DAA06452.1)，SEQID NO:24)的pUL131A分别由129、129和76个氨基酸组成。pUL131A含有位于SEQ ID NO:21的残基1-18处的N-末端信号序列，并且缺乏TM结构域。已报道来自毒株AD169的UL131A含有一(1)个碱基对插入，其引起移框(Wang和Shenk, Human Cytomegalovirus UL131 Open Reading Frame Is Required for Epithelial Cell Tropism, 2005 J. Virol. 79:10330–10338)。SEQ ID NO:21在N-末端的28个氨基酸上与SEQ ID NO: 4具有96%同一性，但由于AD169 UL131A基因中的移框，其在SEQ ID NO: 21的全长上仅与SEQ ID NO:24具有36%同一性。
通常，pUL131A多肽的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的pUL131A蛋白。用于本发明中的pUL131A多肽可以缺乏N-末端信号序列。缺乏N-末端序列的HCMV pUL131A多肽的一个实例是SEQ ID NO:22，其由SEQ ID NO:21的氨基酸残基19-129组成。
如实施例内所示，pUL131A多肽在相对于gH氨基酸序列SEQ ID NO:21编号的天冬酰胺残基N81处被糖基化(经由N-连接的糖基化包含聚糖)。用于本发明中的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段可以包含位于相对于pUL131A序列SEQ ID NO:21编号的残基81处的天冬酰胺处的去糖基化突变。所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或丙氨酸(A)。进一步具体而言，所述去糖基化突变可以是谷氨酰胺(Q)。
本发明的pUL131A蛋白可以与SEQ ID NO:21具有各种程度的同一性，诸如与SEQID NO:21中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL131A蛋白可以与SEQID NO:22具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:22中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL131A蛋白可以与SEQ ID NO:23具有各种程度的同一性，诸如与SEQID NO:23中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的pUL131A蛋白可以与SEQID NO:24具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:24中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的pUL131A蛋白：(i)可以形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物，(ii)包含至少一个SEQ ID NO: 21、22、23或24的表位；和/或(iii)可在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。pUL131A的示例性复合物形成片段包含SEQ ID NO:21的残基Gln19至Asn129，当与全长pUL130复合(即，gH、gL或pUL128无一存在)时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。或者，pUL131A的复合物形成片段包含SEQ ID NO:21的残基Gln19至Asn129，当与包含SEQ ID NO:17的残基Thr45至Val214的pUL130的复合物形成片段复合(即，gH、gL或pUL128无一存在)时；其可以形成截短的HCMV五聚体复合物，所述截短的HCMV五聚体复合物仍然维持图7中描述的五个构象表位位点。
本发明的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段包含一个或多个稳定突变，合适地，一个或多个空腔填充突变，一个或多个疏水突变，一个或多个亲水突变，一个或多个二硫桥突变，或其中一者或多者的任何组合。具有如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24中所示的序列的任何pUL131A多肽，或具有与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24具有至少90%同一性的序列的任何pUL131A多肽或其复合物形成片段可以合适地包含如本文所鉴定和定义的任何一个或多个稳定突变。因此，在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:21中所示的序列的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:22中所示的序列的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:23中所示的序列的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。在替代实施方案中，具有SEQ ID NO:24中所示的序列的HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的任何组合。
如实施例3中进一步详述和图2A-2F中所举例说明，本发明人在五聚体复合物的晶体结构中鉴定了在gH/gL/UL界面处的一些空腔。因此，预期任何空腔填充突变(其目的在于填充在HCMV pUL131A多肽中的这种界面处观察到的空腔)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性。类似地，预期任何重新包装突变，诸如任何疏水突变或任何亲水突变(其目的在于增加HCMV pUL131A多肽中相邻残基的接触)，当与所述复合物的其他组分缔合时，都有利地促成复合物(例如，五聚体复合物)的稳定性。类似地，任何二硫桥突变(其目的在于将多肽内二硫桥引入HCMV pUL131A多肽中和/或在HCMV gH多肽和复合物的其他组分中的任一种(例如，HCMV五聚体复合物的HCMVgH、HCMV gL、HCMV pUL128或HCMV pUL130多肽)之间引入多肽间二硫桥)有利地促成具有增强的热稳定性的复合物。
鉴定HCMV pUL131A多肽中的相关氨基酸残基以针对空腔填充和/或重新包装和/或二硫桥突变，可以例如通过借助分子图形软件目视检查三维结构或通过使用任何适当的计算机芯片上诱变方法进行。此类方法是技术人员已知的。例如，软件，诸如分子操作环境(MOE)(由Chemical Computing Group Inc.编辑)允许系统分析氨基酸序列，以鉴定多肽中的特定区域或特定氨基酸，其突变被预测为增强热稳定性。
表5中提供了在HCMV pUL131A多肽中突变的合适的非限制性示例性氨基酸残基，其仅使用如SEQ ID NO:21所示的序列作为参考。在本发明中还考虑其他HCMV pUL131A多肽(诸如例如具有如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的序列的多肽)或源自不同于Merlin毒株的HCMV毒株的pUL131A多肽中的类似位置处的突变。确定其他HCMVpUL131A多肽中的此类相似位置在技术人员的能力之内。给定HCMV pUL131A多肽中的相当的氨基酸位置可以通过使用容易获得和众所周知的比对和算法(诸如BLAST或ClustalW2)比对氨基酸序列来确定。对于其他HCMV pUL130多肽，可能必须根据实际序列比对来调整氨基酸位置的实际数目。
表5A
Figure 700310DEST_PATH_IMAGE010
因此，在一些实施方案中，在HCMV pUL131A多肽中突变用于空腔填充的氨基酸是SEQ ID NO:21中所示的序列的G99、S86或S90，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV pUL131A多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL131A多肽包含对应于SEQ ID NO:21的99、86或90的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代。
在HCMV pUL131A多肽中突变用于疏水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQID NO:21中所示的序列的H69、H35、H64、D38、V85、Y52或A67，或在源自不同HCMV毒株的HCMV pUL131A多肽中的相应位置处。合适地，这些氨基酸残基的突变可以由以下组成：它们中的任一个和/或它们中的多于一个，可能它们中的全部，被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL131A多肽包含对应于SEQID NO:21的69、35、64、38、85、52和67的位置处的至少一个氨基酸被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代。
在HCMV pUL131A多肽中突变用于亲水突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQID NO:21中所示的序列的R118，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，该氨基酸残基的突变可以由以下组成：其被取代为选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)的氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL131A多肽至少包含对应于SEQ ID NO:21的R118的位置处的氨基酸被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)和谷氨酸(E)的氨基酸取代。在HCMV pUL131A多肽中突变用于极性突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:21中所示的序列的R118，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，该氨基酸残基的突变可以由以下组成：其被取代为选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)的氨基酸。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL131A多肽至少包含位置R118处的氨基酸被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)的氨基酸取代。在HCMV pUL131A多肽中突变用于带电荷突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:21中所示的序列的R118，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，该氨基酸残基的突变可以由以下组成：其被取代为精氨酸(R)或谷氨酸(E)。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV gH多肽至少包含在对应于SEQ ID NO:21的R118的位置处的氨基酸被氨基酸精氨酸(R)或谷氨酸(E)取代。
在HCMV pUL131A多肽中突变用于二硫桥突变的合适的非限制性示例性氨基酸是SEQ ID NO:21中所示的序列的H64或W37，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV多肽至少包含对应于SEQ ID NO:21的H64的残基被半胱氨酸(C)取代或对应于SEQ ID NO:21的W37的残基被半胱氨酸(C)取代，合适地，两者。
因此，在一些实施方案中，在HCMV pUL131A多肽中突变用于去糖基化的氨基酸是SEQ ID NO:21中所示的序列的N81，或在源自不同HCMV毒株的 HCMV gH多肽中的相应位置处。合适地，该氨基酸残基的突变可以由以下组成：其被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸残基取代。因此，在一些实施方案中，本发明的HCMV pUL131A多肽至少包含SEQ ID NO:21的位置81处的氨基酸被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代。
表5B
Figure 595585DEST_PATH_IMAGE011
gO多肽
已报道由UL74基因编码的HCMV糖蛋白O(gO)充当分子伴侣，增加gH/gLER输出和并入病毒粒子中。已经提出gO与pUL128-131A 竞争结合至gH/gL上，但从gH/gL释放，使得gH/gL(缺乏pUL128-131A)并入病毒粒子中(Ryckman等人, Human Cytomegalovirus TR Strain Glycoprotein O Acts as a Chaperone Promoting gH/gL Incorporation into Virions but Is Not Present in Virions, 2010 Journal of Virology 84: 2597–2609)。与其他病毒基因相比，HCMV gO在不同的HCMV毒株间是异常可变的：22至39种临床分离物以及实验室毒株AD169、Towne和Toledo间的gO氨基酸序列的可变性接近45% (即不同分离物之间的gO氨基酸序列之间仅存在55%同一性)(Rasmussen, 等人, The Genes Encoding the gCIII Complex of Human Cytomegalovirus Exist in Highly Diverse Combinations in Clinical Isolates, 2002 J. Virol. 76: 10841-10888)。已报道来自HCMV毒株Merlin (NCBI GI:39842082 (其也是NCBI GenBank登录号AAR31626.1)，本文的SEQ IDNO:25)、AD169 (NCBI GI:136968 (其也是NCBI UniProtKB登录号P16750.1)，本文的SEQID NO:28)和Towne (NCBI GI:239909431 (其也是NCBI GenBank登录号ACS32378.1)，本文的SEQ ID NO:27)的gO分别由472、466和457个氨基酸组成。与SEQ ID NO:25共有73%氨基酸相似性的HCMV毒株AD169的gO具有18个N-糖基化位点(在残基75、83、87、103、130、157、162、171、219、242、288、292、350、385、392、399、433和454处)，且可在其N-末端包括成熟多肽中不存在的可切割信号序列(预测由氨基酸残基1-30组成)。Rigoutsos等人 (In silico pattern-based analysis of the human cytomegalovirus genome, 2003 J. Virol.77: 4326-4344)预测TM结构域(在区域10-28 和190-212中)和卷曲螺旋区域(残基240-272)的存在。
通常，gO蛋白的N-末端信号序列被宿主细胞信号肽酶切割以产生成熟的gO蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的gO蛋白可以缺乏N-末端信号序列。优选的本发明的gO蛋白的一个实例是SEQ ID NO:26，其缺乏N-末端信号序列且由SEQ ID NO:25的氨基酸残基31-472组成。
本发明的gO蛋白可以与SEQ ID NO:25具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:25中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gO蛋白可以与SEQ ID NO:26具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:26中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gO蛋白可以与SEQ ID NO:27具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:27中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gO蛋白可以与SEQ ID NO:28具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:28中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。本发明的gO核苷酸序列可以与SEQ ID NO:39具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:39中所述的序列具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。优选的gO蛋白或其片段：(i)可以形成三聚体gH/gL/gO 复合物的一部分；(ii)不能形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(iii)包含至少一个SEQ ID NO:25、26、27或28的表位；和/或(iv)可以在体内引发与HCMV病毒粒子免疫交叉反应的抗体。
复合物
在另一个方面，本发明提供了五聚体复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV gH多肽中的任一种，(ii)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV gL多肽中的任一种，(iii)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV pUL128多肽中的任一种，(iv)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV pUL130多肽中的任一种，和(v)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV pUL131A多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(vi)上述HCMV gH、gL、pUL130和pUL131A去糖基化突变中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了gH/gL复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV gH多肽中的任一种，和/或(ii)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV gL多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(iii)上述HCMV gH和gL去糖基化突变中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了gH/gL/gO复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个稳定突变的HCMVgH多肽中的任一种，和/或(ii)上述包含一个或多个稳定突变的HCMV gL多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(iii)上述HCMV gH和gL去糖基化突变中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了五聚体复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个去糖基化突变的HCMV gH多肽中的任一种，(ii)上述包含去糖基化突变的HCMV gL多肽中的任一种，(iii)上述包含一个或多个去糖基化突变的HCMV pUL130多肽中的任一种，和(iv)上述包含去糖基化突变的HCMV pUL131A多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(vi)上述HCMVgH、gL、pUL130和pUL131A稳定突变中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了gH/gL复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个去糖基化突变的HCMVgH多肽中的任一种，和/或(ii)上述包含去糖基化突变的HCMV gL多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(iii)上述HCMV gH和gL稳定突变中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了gH/gL/gO复合物，其包含本文所述的突变的HCMV多肽或其复合物形成片段。此类复合物包括，例如，(i)上述包含一个或多个去糖基化突变的HCMV gH多肽中的任一种，和/或(ii)上述包含去糖基化突变的HCMV gL多肽中的任一种。此类复合物可以进一步包括，例如，(iii)上述HCMV gH和gL稳定突变中的任一个。
组合物
在另一个方面，本发明提供了包含突变型多肽或其突变型复合物形成片段的组合物，其中所述突变型多肽或突变型片段是HCMV gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A中的至少一种，且其中所述突变型多肽或突变型片段包含至少一个稳定突变。在另一个方面，本发明提供了包含突变型多肽或其突变型复合物形成片段的组合物，其中所述突变型多肽或突变型片段是HCMV gH、gL、pUL130和pUL131A中的至少一种，且其中所述突变型多肽或突变型片段包含至少一个去糖基化突变。在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含具有至少一个突变型多肽或其突变型复合物形成片段的复合物，其中所述突变型多肽或突变型片段是HCMVgH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A中的至少一种，且其中所述突变型多肽或突变型片段包含至少一个稳定突变。在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含具有至少一个突变型多肽或其突变型复合物形成片段的复合物，其中所述突变型多肽或突变型片段是HCMV gH、gL、pUL130和pUL131A中的至少一种，且其中所述突变型多肽或突变型片段包含至少一个去糖基化突变。本发明的复合物包括gH/gL、gH/gL/gO和五聚体复合物。本发明的组合物可以是免疫原性组合物。本发明的组合物可以是疫苗组合物。此类组合物可用于在哺乳动物(例如人、鼠、豚鼠或猕猴)中产生抗体。
本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的稳定的HCMV复合物(例如，五聚体复合物)。类似地，本发明提供了用于制备药物组合物的方法，其涉及将本发明的稳定的HCMV复合物(例如，五聚体复合物)与药学上可接受的载体组合。
除了它们的抗原以外，本发明的免疫原性和药物组合物通常包括“非抗原组分”，如就本发明而言使用，其可以是佐剂或药学上可接受的载体。此类载体的详细讨论可见于Remington: The Science and Practice of Pharmacy。药学上可接受的载体包括本身不诱导中和抗体产生的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。无菌、无热原、磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。非抗原组分可以是稀释剂，诸如水、盐水、甘油等。另外，非抗原组分可以是辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。本发明的非抗原组分包括抗微生物剂，尤其是当以多剂量形式包装时。本发明的非抗原组分包括去污剂，例如TWEEN™(聚山梨酯)，诸如TWEEN80™。去污剂通常以低水平(例如<0.01%)存在。本发明的非抗原组分包括钠盐(例如氯化钠)以产生张力。1.0±2mg/ml NaCl的浓度是典型的。本发明的非抗原组分包括缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲剂。本发明的非抗原组分包括例如约15-30mg/ml (例如25 mg/ml)的糖醇(例如甘露醇)或二糖(例如蔗糖或海藻糖)。
所述组合物的pH通常为6-8，并且更优选6.5-7.5(例如，约7)。稳定pH可通过采用缓冲剂(例如Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂)来维持。因此，组合物通常可包括缓冲剂。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可与人体等张。组合物包含免疫学有效量的所提及抗原。“免疫学有效量”是指当施用于受试者时有效引发针对所述抗原的抗体应答的量。该量可根据待治疗个体的健康和生理状况、其年龄、该个体的免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的制剂、治疗医生对医疗状态的评估以及其他相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽范围内。本发明的组合物的抗原含量将通常以每剂量的蛋白的质量表示。10-500μg(例如50μg)/抗原的剂量可以是有用的。免疫原性组合物可包括免疫学佐剂。
组合物可包括抗微生物剂，特别是当以多剂量形式包装时。在疫苗中常见抗微生物剂诸如硫柳汞和2-苯氧乙醇，但优选使用不含汞的防腐剂或完全不用防腐剂。组合物可包含去污剂，例如聚山梨酯，诸如聚山梨酯80。去污剂以通常低水平(例如<0.01%)存在。组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生张力。10±2mg/ml NaCl的浓度是典型的，例如约9mg/ml。
本发明的组合物将通常直接施用于受试者。可以通过肠胃外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射至组织的间隙空间)，或通过任何其他合适的途径实现直接递送。优选肌肉内施用，例如施用至大腿或上臂。注射可以经由针头(例如皮下针头)进行，但或者可以采用无针注射。
本发明的疫苗可以是预防性(即预防疾病)或治疗性(即减少或消除疾病的症状)。
表达系统
在一个方面，本发明提供了用于表达本发明的突变型HCMV多肽的方法。用于本发明中的合适的表达系统详细描述于例如Doyle (High Throughput Protein Expression and Purification: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, HumanaPress, Doyle编, 2008)中。可以使用适合于维持、增殖和表达核酸分子以在所需宿主中产生多肽的系统或载体。可通过例如Sambrook (J. Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 第3版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)中描述的技术将适当的核苷酸序列插入表达系统中。通常，可将编码基因置于控制元件(诸如启动子和任选操纵子)的控制下，使得编码期望肽的DNA序列在转化的宿主细胞中转录为RNA。
合适的表达系统的实例包括例如染色体、附加体和病毒来源的系统，包括例如来源于以下物质的载体：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(诸如杆状病毒、乳多空病毒(诸如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒)或其组合，诸如来源于质粒和噬菌体遗传元件的那些，包括粘粒和噬菌粒。人工染色体(HAC)也可用于递送DNA的比质粒中可以含有和表达的片段更大的片段。合适的表达系统包括用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的微生物(诸如细菌)；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染或转染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统，或者动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用于产生本发明的蛋白。优选地，在真核细胞(诸如哺乳动物细胞)中产生本发明的蛋白。
可瞬时或稳定地表达重组多肽。优选地，稳定地表达重组蛋白。例如，可使用表达载体转染稳定表达目标肽的细胞系，所述表达载体可含有同一或分开的载体上的病毒复制起始点和/或内源性表达元件和可选择的标记基因。在引入载体之后，可以使细胞在富集培养基中培养1-2天，然后将它们转换至选择性培养基。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和恢复。可使用适于细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性克隆。
可用作表达宿主(宿主细胞)的哺乳动物细胞系是本领域中已知的，并且包括可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、人胚肾(HEK) 293细胞、Bowes黑色素瘤细胞和人肝细胞癌(例如HepG2)细胞和许多其他细胞系。优选在哺乳动物细胞中进行表达，因为产生的蛋白将具有真正的哺乳动物糖基化模式，并因此具有感染性HCMV颗粒上存在的表位。因此，哺乳动物细胞中本发明的膜蛋白复合物的产生将导致在感染期间产生能够结合天然存在的HCMV颗粒的抗体。
在杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料尤其以试剂盒的形式购自Invitrogen, San Diego CA (“MaxBac”试剂盒)。这些技术完全描述于Summers等人. (Summers和Smith, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555, 1987)中。特别适用于该系统中的宿主细胞包括昆虫细胞(诸如果蝇(Drosophila)S2，即通过重组杆状病毒感染稳定转染的果蝇S2细胞)和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞。在一些实施方案中，不在昆虫细胞中产生本发明的蛋白。本领域中已知许多植物细胞培养和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的实例包括美国专利5,693,506；美国专利5,659,122；美国专利5,608,143中描述的那些。具体而言，可以利用所有可以从其中分离原生质体并培养以生成整株再生植物的植物，使得回收含有转移的基因的植物。实际上，所有植物都可再生自培养的细胞或组织，包括但不限于以下植物的所有主要物种：甘蔗、甜菜、棉花、果树和其他树木、豆科植物和蔬菜。
原核表达系统的实例包括使用链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E. coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为宿主细胞的那些。
真菌表达系统的实例包括使用酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))和曲霉菌(Aspergillus)作为宿主细胞的那些。
HEK293细胞适用于本发明的HCMV蛋白的瞬时表达，这是因为其通过各种技术的可转染性高，所述技术包括磷酸钙和聚乙烯亚胺(PEI)方法。一种有用的HEK293细胞系是表达EBV的EBNA1蛋白的HEK293细胞系，诸如293-6E (Loignon等人, Stable high volumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells, 2008BMC Biotechnology 8:65)。已显示，转化的HEK293细胞向生长培养基中分泌高水平的本发明的蛋白复合物，因此允许从生长培养基直接纯化此类蛋白复合物。
CHO细胞是特别适用于用作免疫原或抗原的本发明的HCMV蛋白的工业生产的哺乳动物宿主，因为其允许长期、稳定的基因表达和高蛋白产率。
在一些实施方案中，本发明的突变型HCMV多肽或突变型复合物分泌自其中表达它们的细胞。在本发明的其他实施方案中，不分泌本发明的突变型多肽或突变型复合物。例如，在大肠杆菌中，非分泌的蛋白可积累在包涵体中。用于从包涵体纯化重组蛋白的方法是本领域中众所周知的。
可使用各种方法进行转染，所述方法包括使用磷酸钙、电穿孔或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将运载物保存于其内的脂质体。
核酸分子
本发明提供了具有核苷酸序列的重组核酸分子，所述核苷酸序列编码本文所述的突变的HCMV gH多肽、突变的HCMV gL多肽、突变的HCMV pUL128多肽、突变的HCMV pUL130多肽和/或突变的HCMV pUL131A多肽。本发明的重组核酸分子可以在载体(例如表达载体)内，并且可以可操作连接至一个或多个控制元件(例如启动子和/或增强子)。所述重组核酸的实例可以是单一分子，其编码本发明的gL多肽、本发明的gH多肽、本发明的pUL128多肽、本发明的pUL130多肽和本发明的pUL131A多肽。所述重组核酸的一个进一步实例可以是单一分子，其编码本发明的gL多肽和本发明的gH多肽，其任选地进一步编码本发明的gO多肽。本发明还提供了多种重组核酸分子，其编码一种或多种本发明的突变的多肽。例如，在一个实施方案中，本发明提供了两种核酸分子：编码本发明的gH多肽和本发明的gL多肽的第一分子，和编码本发明的pUL128蛋白、本发明的pUL130蛋白和本发明的pUL131A多肽的第二分子。例如，在一个实施方案中，本发明提供了三种核酸分子：编码本发明的gL蛋白的第一重组核酸分子；编码本发明的gH蛋白的第二重组核酸分子；和编码一种或多种额外HCMV蛋白、诸如gO、pUL128、pUL130或pUL131A的第三重组核酸分子。例如，在一个实施方案中，本发明提供了五种核酸分子：编码本发明的gL蛋白的第一重组核酸分子；编码本发明的gH蛋白的第二重组核酸分子；编码本发明的pUL128蛋白的第三重组核酸分子；编码本发明的pUL130蛋白的第四重组核酸分子；和编码本发明的pUL131A蛋白的第五重组核酸分子。优选地，本发明的重组核酸分子(a)不是自我复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(c) 不编码任何α病毒非结构蛋白，诸如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(d)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，诸如EMCV或EV71；和/或(e)不含有病毒2A位点，诸如FMDV。因此，编码复合物中各单独多肽的序列可以存在于单一核酸分子中，或者分布在两个或更多个核酸分子间。
在一个实施方案中，本发明提供了多种重组核酸，其包含：(i)编码本发明的gL蛋白的第一重组核酸分子，(ii)编码本发明的gH蛋白的第二重组核酸分子，(iii)编码本发明的pUL128蛋白的第三重组核酸分子，(iv)编码本发明的pUL130蛋白的第四重组核酸分子，和(v)编码本发明的pUL131A蛋白的第五重组核酸分子。参见，例如，WO 2014/005959(也公开为美国授权前公开号2016-0159864)。优选地，所述第一、第二、第三、第四和/或第五重组核酸分子：(a)不是自我复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(b)不编码任何α病毒非结构蛋白，诸如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(c)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，诸如EMCV或EV71；和/或(d)不含有病毒2A位点，诸如FMDV。
编码本发明的gH蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:1具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:1的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的gH蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:3具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:3的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的gL蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:7具有各种程度的同一性，诸如与SEQID NO:7的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的gL蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:9具有各种程度的同一性，诸如与SEQ IDNO:9的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的gL蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:29具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:29的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的pUL128蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:13具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:13的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的pUL130蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:17具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:17的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。编码本发明的pUL131A蛋白的核酸分子可以与SEQ ID NO:21具有各种程度的同一性，诸如与SEQ ID NO:21的序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
本发明的重组核酸分子可以包含DNA，任选地包括内含子，和/或cDNA。当内含子存在时，一些基因更有效地表达。基因组UL128和UL131A基因各自由两个外显子组成，而UL130不含有任何内含子。本发明的重组核酸分子可以包含核糖核酸(RNA)，包括mRNA，条件是本发明的RNA分子(a)不是自我复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(c) 不编码任何α病毒非结构蛋白，诸如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(d)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，诸如EMCV或EV71；和/或(e)不含有病毒2A位点，诸如FMDV。本发明的核酸分子可以包含已经密码子优化用于在宿主细胞内表达、例如经密码子优化用于在细菌或哺乳动物宿主细胞内表达的多核苷酸序列(DNA或RNA)。
本发明提供了包含本发明的核酸分子的载体。本发明的载体可以是表达载体，其包含适合于在宿主细胞内表达的启动子和终止子。此类启动子和终止子已经由例如美国授权前公开号2015/0322115和2015/0359879描述。所述重组核酸分子可以是质粒，或者可并入细胞的基因组中。这些载体中的启动子可以是HCMV启动子或非HCMV启动子(参见，例如，美国授权前公开号2015/0322115和2015/0359879)。
足以通过产生本发明的重组HCMV核酸指导本领域普通技术人员的示例性程序可见于Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989;Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (以及2003年的增刊);和Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 第4版, Wiley & Sons, 1999。
本发明还提供了通过如下表达包含一种或多种本发明的突变的HCMV gH、gL、pUL128、pUL13和/或pUL131A多肽的HCMV复合物(例如，HCMV五聚体复合物)的方法：将编码所述一种或多种突变多肽的一种或多种重组核酸分子引入表达系统；在所述表达系统中表达所述一种或多种核酸分子；和纯化所述HCMV复合物。在一些实施方案中，该方法包括用第一核酸构建体转染细胞，所述第一核酸构建体编码：本发明的突变的HCMV gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A多肽。在一些实施方案中，该方法可以包括用以下转染细胞：编码本发明的HCMV gH多肽的第一核酸构建体，编码本发明的HCMV gL多肽的第二核酸构建体；和编码一种或多种额外的本发明的HCMV糖蛋白的一种或多种第三核酸构建体。在一些实施方案中，该方法可以包括用以下转染细胞：编码本发明的gH多肽和本发明的gL多肽的第一核酸构建体；和编码本发明的HCMV pUL128、HCMV pUL130和HCMV pUL131A多肽的第二核酸构建体。所述HCMV复合物可以在哺乳动物细胞中表达。可以任选地纯化所述分离的HCMV膜蛋白复合物。
细胞
本发明还提供了表达本发明的核酸分子或多种核酸分子的细胞，其中所述细胞不包含完整的HCMV基因组。所述细胞可以用所述本发明的核酸分子或多种核酸分子稳定地转化。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如293-6E细胞(参见WO 2014/005959，也公开为美国授权前公开号2016/0159864)或CHO细胞(参见WO 2016/116904)。
本发明还提供了产生本发明的复合物的细胞，所述细胞不(i)含有HCMV基因组，和/或(ii)产生HCMV病毒粒子，和/或(iii)表达任何非包膜 HCMV蛋白。理想情况下，所述细胞缺乏(i)、(ii)或(iii)之一；优选地，其缺乏两者；更优选地，其缺乏(i)、(ii)和(iii)的全部三者。因此，可以指定本发明的细胞不含HCMV基因组和/或不产生HCMV病毒粒子和/或不表达任何非包膜HCMV蛋白。
抗体
尽管它们的结构不同于非突变型多肽，但本发明的修饰的多肽(及其突变型构建体形成片段)维持免疫原性或表位，因此本发明的一个进一步目的是在多肽/抗体相互作用中利用突变型多肽及其突变型片段。非突变型多肽的多肽/抗体相互作用已由例如如下描述：WO2014/005959 (也公开为美国授权前公开号2016/0159864); Macagno等人, Isolation of Human Monoclonal Antibodies that Potently Neutralize Human Cytomegalovirus Infection by Targeting Different Epitopes on the gH/gL/UL128-131A complex,2010 J. Virol. 84(2): 1005-1013; 和Gerna等人, Monoclonal antibodies to different components of the human cytomegalovirus (HCMV) pentamer gH/gL/ pUL128L and Trimer gH/gL/gO as well as antibodies elicited during primary HCMV infection prevent epithelial cell syncytium formation, 2016 J. Virol. 90(14): 6216-6223。还参见美国专利号9,527,902。在本发明之前，五聚体复合物的一系列构象表位是已知的。例如，Macagno等人(2010 J. Virol. 84: 1005-1013)分离了一组中和内皮细胞、上皮细胞和骨髓细胞的HCMV感染的人单克隆抗体。除了与UL128 基因产物中的保守表位结合的抗体的单个例外以外，所有其他抗体都与需要表达gH/gL/UL128-131A复合物的两种或更多种蛋白的构象表位结合。优选地，本发明的五聚体复合物具有由Macagno等人(2010 J. Virol. 84:1005-1013)鉴定和/或本文的实施例进一步描述的构象表位中的一个或多个。
本发明提供了识别修饰的HCMV gH、gL、pUL128、pUL130或pUL131A多肽；或本发明的复合物的抗体。可以使用本发明的分离的多肽或包含其的分离的复合物作为抗原来产生本发明的抗体。优选地，本发明的抗体是中和抗体。本发明的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、标记的抗体或抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段(各自具有单一抗原结合位点)，和残余的“Fc”片段(其名称反映其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原组合位点且仍能够交联抗原。
或者，本发明的HCMV多肽或HCMV复合物可用于使用体外选择方法、诸如使用多种抗体文库的噬菌体展示来鉴定抗体。本发明还提供了用于使用本发明的分离的HCMV多肽或HCMV复合物产生抗体的方法。本发明的抗体可以是人或人源化抗体。本发明的抗体可以用于诊断测定中并且可以直接或间接地标记。在一些实施方案中，本发明的抗体可以用于疗法中，例如用于HCMV感染的治疗中，并且可以呈中和抗体的形式，其可以抑制或中和抗原的生物学活性。
复合物的分离和纯化
优选以分离的形式制备和使用本发明的复合物。如本文所用的术语“分离的”意指从其天然环境移出。因此，“分离的HCMV膜蛋白复合物”不涵盖HCMV感染的细胞的表面上或感染性HCMV病毒粒子中或与抗体(或抗体片段)结合的HCMV膜蛋白复合物。使用实施例和例如WO2014/005959 (也公开为美国授权前公开号2016/0159864和WO 2016/116904)中所述的表达方法以高产率产生本发明的复合物。例如，在涉及使本发明的细胞在生长培养基中生长的方法中，本发明的蛋白复合物可以积累至大于0.4 mg/升生长培养基(例如0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mg/升生长培养基或更多)的水平。
本发明提供了用于纯化本发明的HCMV膜复合物的方法。本发明的此类方法允许以>85%、>86%、>87%、>88%、>89%、>90%、>91%、>92%、>93%、 >94%或>95%总蛋白的纯度(以质量计)产生HCMV膜蛋白复合物，所述纯度如通过凝胶电泳所测定。这些高水平的纯度使复合物适用于作为诊断应用中的免疫原或作为疫苗制剂中的抗原。可以各种纯度水平制备本发明的HCMV膜蛋白复合物，例如至少80%、85%、90%、95%或99%总蛋白(以质量计)，即复合物构成组合物中总蛋白质量的至少80%。该组合物可不含聚丙烯酰胺。
本发明提供了用于纯化本发明的HCMV复合物(例如HCMV五聚体复合物)的方法。在本发明的一个实施方案中，所述纯化包括一个或多个色谱步骤。所述一个或多个色谱步骤包括亲和色谱，诸如Ni2+亲和色谱和/或大小排阻色谱。在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个色谱步骤包括离子交换色谱。参见，例如，WO 2014/005959 (也公开为美国授权前公开号2016/0159864); WO 2016/116904; 和WO2015/181142。因此，本发明的多肽可以包含用于例如分离多肽的标签(例如，亲和标签，诸如strep标签、myc标签、聚组氨酸标签或其组合)(参见Kimple等人,Overview of Affinity Tags for Protein Purification,2015 Curr. Protoc. Protein. Sci. 73: Unit-9.9. doi:10.1002/0471140864.ps0909s73，其概述已知标签及其在生物技术应用中的用途)。
佐剂
本发明的疫苗和免疫原性组合物除了抗原以外还可以包含佐剂。佐剂是疫苗中使用的“非抗原组分”，以增强和调节对抗原的免疫应答。然而，佐剂可以导致反应原性增加。佐剂包括(但不限于)AS01、水包油乳剂(例如MF59和AS03)、脂质体、皂苷、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、铝盐、纳米颗粒、微粒、ISCOMS、氟化钙和有机化合物复合材料或其组合。参见，例如，美国授权前公开号2015/0093431和WO2011/027222 (也公开为美国授权前公开号2012/0237546)。在一个具体实施方案中，本发明的疫苗或免疫原性组合物包含抗原和佐剂，其中所述佐剂是AS01、水包油乳剂(例如MF59和AS03以及它们各自的亚型，包括亚型B和E)、铝盐(例如磷酸铝和氢氧化铝)、皂苷(例如QS21)、Toll样受体(TLRa)(例如TLR4a和TLR7a)的激动剂或其组合(例如，铝-TLR7a (Buonsanti等人, Novel adjuvant Alum-Tlr7a significantly potentiates immune response to glycoconjugate vaccines, 2016 Sci. Rep. 6:29063 (DOI: 10.1038/srep29063))。“TLR激动剂”意指能够通过TLR信号传导途径作为直接配体或间接通过生成内源或外源配体来引起信号传导应答的组分(Sabroe等人, Toll- like Receptors in Health and Disease: Complex Questions Remain, 2003 J.Immunol. 171(4): 1630-1635)。TLR4激动剂例如能够通过TLR-4信号传导途径引起信号传导应答。TLR-4激动剂的合适实例是脂多糖，合适地脂质A的无毒衍生物，具体地单磷酰脂质A，或更具体地3-脱酰基单磷酰基脂质A (3D – MPL)。本文所述的佐剂可以与本文所述的任何抗原组合。
在本发明中考虑以下实施方案：
HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其包含相对于序列SEQ ID NO:1确定的位置处的突变，且其为：
Figure 739121DEST_PATH_IMAGE012
Figure 793665DEST_PATH_IMAGE013
。
HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其包含相对于序列SEQ ID NO:7确定的位置处的突变，且其为：
Figure 112257DEST_PATH_IMAGE014
Figure 150621DEST_PATH_IMAGE015
。
HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其包含相对于序列SEQ ID NO:13确定的位置处的突变，且其为：
Figure 566689DEST_PATH_IMAGE016
Figure 741319DEST_PATH_IMAGE017
。
HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其包含相对于序列SEQ ID NO:17确定的位置处的突变，且其为：
Figure 732278DEST_PATH_IMAGE018
Figure 992358DEST_PATH_IMAGE019
。
HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其包含相对于序列SEQ ID NO:21确定的位置处的突变，且其为：
Figure 336751DEST_PATH_IMAGE020
Figure 241253DEST_PATH_IMAGE021
。
实施例
鉴于上述教导，本发明的许多改变和变化是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内，本领域技术人员将认识到，可以以不同于具体描述的方式来实践本发明。说明性实施方案和实施例不应被解释为限制本发明。
实施例1 –五聚体复合物在哺乳动物细胞中的表达
通过两种载体(其中一种载体编码gH和gL(分别具有序列SEQ ID NO:3和7)且另一种载体编码pUL128、pUL130和pUL131A(分别具有序列SEQ ID NO:13、17和21))的瞬时或稳定转染(双载体策略)，在293GnTi-细胞中实施野生型或硒甲硫氨酸标记的(SeMet)-五聚体的表达，如Hofmann等人 (Expression of the Human Cytomegalovirus Pentamer Complex for Vaccine use in a CHO System, 2015 Biotech. & Bioeng. 112(12): 2505-2515)中所概述。
对于抗五聚体Fab表达，将重链Fab片段和全长轻链各自克隆至哺乳动物pRS5a表达载体(Novartis AG)中。重链Fab的C-末端上存在可切割的双Strep-标签。根据制造商的推荐，使用Expifectamine 293转染试剂盒(ThermoFisher)，通过以1:1比率转染编码抗体的重链Fab片段和全长轻链的两种载体，在293Expi细胞(Invitrogen Inc.)中瞬时表达抗五聚体Fab。
实施例2 –五聚体复合物的纯化
对于五聚体纯化，将表达培养基直接上样至StrepTrap HP柱(GE Lifesciences)上，并根据制造商的推荐使用洗脱缓冲液(IBA Lifesciences)中的0.1M Tris pH 8.0, 150 mMNaCl和2.5 mM脱硫生物素洗脱蛋白。将洗脱物与TEV蛋白酶(ThermoFisher)在4℃下孵育过夜。将样品用20mM Hepes pH 7稀释3倍，以将总盐浓度降低至50mM，然后上样至MonoS10/30柱(GE Lifesciences)上用于离子交换色谱。经10个柱体积以0至1 M NaCl的线性梯度从柱洗脱蛋白。将蛋白浓缩并上样至Superose 6 10/300柱上，并将洗脱的峰浓缩至大于1 mg/mL。
对于Fab纯化，将表达培养基浓缩10倍，并使用具有10 kDa截止值的切向流过滤系统(Millipore)缓冲液交换成25 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl和1 mM EDTA。随后将样品上样至StrepTrap HP柱上，并类似于上述五聚物纯化进行洗脱。根据制造商的推荐，使用PreScission蛋白酶(GE Lifesciences)切割掉Strep标签。然后将切割的Fab通过S200柱(GE Lifesciences)上的大小排阻色谱纯化，所述S200柱用含有25 mM Tris pH 8.0和150mM NaCl的缓冲液平衡。
为了纯化五聚体-Fab复合物用于结晶，将从MonoS柱洗脱的五聚体与2倍摩尔过量的纯化的Fab一起孵育，并在室温下孵育至少15分钟。随后将样品上样在Superose 6 10/300柱上，以将Pentamer-Fab复合物与过量Fab分离。将峰级分合并，并浓缩至>5 mg/mL。
实施例3 –五聚体复合物的结晶
对于结晶实验，在与Fab形成复合物之前，根据制造商的指南，使用Endo Hf (NewEngland Biolabs)将纯化的野生型或硒甲硫氨酸标记的(SeMet)-五聚体去糖基化。对于五聚体和单克隆抗体(mAb) 8I21和9I6的抗原结合片段(Fab)之间的复合物获得初始晶体命中物(Macagno等人 (2010 J. Virol. 84:1005-1013)，并且在20℃下，这些在含有0.1 µl蛋白和0.1 µl 20%乙醇、0.1 M Tris pH 8.5的滴液中呈现为小微晶。在随后的实验中，乙醇用挥发性较低的异丙醇代替，并使用苯甲脒作为添加剂(来自Hampton Research添加剂筛选)以优化该结晶条件。使用含有10% (wt/vol) PEG400、10%异丙醇、2% (wt/vol)苯甲脒和0.1 M Tris pH 8.2的储库获得WT或SeMet-五聚体-8I21 Fab晶体的最佳晶体。最初在0.1 M MES pH 6.5和15% (wt/vol) PEG甲醚500中获得与9I6 Fab复合的五聚体的晶体命中物。用各种添加剂优化这些晶体用于生长。使用含有10% (wt/vol) PEG甲醚500、0.1 MMES pH 6.2和10 µM苯酚的储库中获得最佳衍射晶体。
3.1结果-晶体结构
五聚体结构采用长度为180Å且交叉点(cross-over)为30-80Å的螺旋体形状(图1)。复合物的gH/gL部分具有与其他疱疹病毒gH/gL相似的结构域组织和结构，其中四个gH结构域(D-I至D-IV)堆叠在彼此的顶部上，并且最N-末端的结构域(D-I)与gL共折叠。UL的多肽链高度互连，并形成结合N-末端gL处的延伸的柔和弯曲的亚复合物。对五聚体表面的分析揭示11个N-连接的糖基化位点：6个在gH中，1个在gL中，且剩余4个在UL上。
尽管结构比较揭示HCMV gH与γ-疱疹病毒爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的gH的密切相似性，但HCMV gH采用让人联想到α-疱疹病毒水痘带状疱疹病毒(VZV)和疱疹单纯病毒-2(HSV-2) gH/gL的靴形，而不是EBV gH/gL的棒状构象。EBV和HCMV gH之间的显著差异是在后者中存在三个额外的与来自gH的残基相互作用的N-末端β-链。
UL形成在相对末端侧接两个小球状结构域的中央核心结构域(图1和2A-2F)。核心结构域由pUL130 C-末端和pUL131A(两者均由N-末端α螺旋和随后的3个长度相似的β-链构成)形成(图2A-2F)。各链组装成大且相当平坦的反平行β-折叠，其在一面上被螺旋覆盖。UL128的N-末端形成位于五聚体尖端的球形结构域，其中前80个残基采用CC-型趋化因子折叠，而C-末端UL128通过50Å长接头锚定至gH/gL，并且末端螺旋对接在由gL的3个α-螺旋和2个β-链形成的疏水性凹槽上。
10P3(位点4)和15D8(位点1)结合入UL的凹面中，而10F7(位点2)沿着UL130/UL131Aβ折叠结合在五聚体的另一面上。
9I6 CDR接触UL128(趋化因子结构域上的残基47-52和α2β4β5β6上的残基92-93和106-109)和UL131A(残基23-24和27-31)两者。该表位与公开的NS-EM数据和作图研究一致，表明位点5抗体需要所有三个UL用于结合，这可能是由于UL130和UL131A的共同折叠。
五聚体-8I21 Fab复合物的主要特征是Fab的长HCDR3和UL130趋化因子结构域之间的相互作用。在HCDR3的尖端的Arg104和Trp105伸入裂缝，所述裂缝由来自N-末端UL130-α1螺旋和UL130/gL β-折叠的疏水残基和极性残基构成，其分别与UL130 Ser47和gLAsp156建立H-键。HCDR3 Trp105突变为丙氨酸导致结合亲和力下降超过150倍，这与其在相互作用中的突出作用一致。几种其他相互作用稳定复合物，包括HCDR3 Arg107的胍基和UL130 Tyr46的羟基之间的氢键，以及HCDR3的主链羰基氧和LCDR3 Trp94和Trp97的侧链之间的H-键。
总之：
五聚体结构揭示在所述结构域的一些之间存在小界面，以及在结构域界面处存在几个空腔(图2)。对来自五聚体-nAb复合物的负染电子显微镜(NS-EM)的数据(先前公开，参见Ciferri等人, Antigenic Characterization of the HCMV gH/gL/gO and Pentamer Cell Entry Complexes Reveals Binding Sites for Potently Neutralizing Human Antibodies,2015 PLOS Path DOI:10.1371/journal.ppat.1005230)、来自氢-氘交换与质谱的耦合(HDX-MS)的数据以及在与两种不同的中和抗体的复合物中解析的五聚体晶体结构的叠加进行分析。该信息一起揭示五聚体蛋白复合物的内在柔性的存在。具体地，UL经历围绕gH D-I/D-II接头-螺旋的刚性体旋转，所述gH D-I/D-II接头-螺旋充当铰链或“肩”。作为结果，UL可以作为刚性臂移动，其中位移最大达30Å(图3)。HDX-MS数据还显示抗体与五聚体的结合可以如何影响远离表位(或直接参与抗体的结合的区域)定位的肽，表明抗体结合后，可以稳定五聚体复合物。
本文揭示的五聚体结构揭示，复合物的gH和gL组分与EBV gH/gL具有紧密的结构相似性，而UL的特征在于在相对末端侧接UL128和UL130趋化因子结构域的α/β核心结构域。值得注意的是，HCMV gL具有在EBV和HSV gL中缺失的独特的N-末端延伸，其形成UL128 C-末端α3螺旋和UL130趋化因子结构域的对接位点。
五聚体结构的特征性特征包括一些结构域之间的相对小的界面和空腔，表明该复合物的内在柔性。结构比较揭示gH/gL D-I结构域和UL臂围绕gH D-I/D-II接头-螺旋的大刚性体旋转，导致UL的大位移。尽管8I21表位在五聚体-9I6 Fab复合物中保持相同，但据信抗体结合使五聚体稳定在离散、但不同的构象状态中。实际上，单一颗粒重构揭示，与8I21和9I6 Fab复合物相比，与10F7 Fab结合的五聚体中的UL的大刚性体旋转。与此信念一致，对五聚体-Fab复合物的HDX-MS分析显示，抗体稳定远离其相应表位的五聚体区域。因此，HDX-MS和晶体学数据的组合揭示其中可引入突变以生成更稳定复合物的五聚体区域(参见，例如，McLellan等人, 2013 Science 342: 592-598，其显示呼吸道合胞病毒融合蛋白的融合前构象的更大稳定性与改进的免疫原性相关)。
五聚体-Fab复合物的这种结构分析连同细胞结合分析提供了对于抗体介导的HCMV中和机制的新见解。我们显示五聚体结合成人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)细胞，但不结合MRC-5细胞。
使五聚体与mAb 15D8(位点1)、10P3(位点4)、2C12和9I6(位点5)或7I13(位点6)预孵育，抑制五聚体与内皮细胞的结合(图6A-6C)。相反，mAb 4N10和8I21(分别为位点3和7)和10F7(位点2)不影响五聚体与细胞的结合。因此，我们的数据表明五聚体-特异性抗体可能通过在病毒感染期间干扰多种五聚体功能来中和HCMV。本发明人显示，抗体与位于五聚体尖端(9I6，位点5)、UL128-α3螺旋(15D8，位点1)且靠近将UL128-α2β4β5β6连接至UL128-α3的接头(10P3，位点4和6)的UL128和UL131A残基的结合阻止五聚体与细胞的结合。因此，这些抗体可以通过直接竞争或空间位阻抑制五聚体与细胞表面受体的相互作用，并且据信抗体结合位点对应于五聚体表面上用于细胞表面受体结合的位点。
相反，抗体与UL臂的肘部(分别为4N10和8I21，位点3和7)以及UL130/UL131A β-折叠的溶剂暴露侧(10F7，位点2)的结合不影响五聚体与细胞的结合，提示不同的中和机制。8I21用长重链CDR3(HCDR3)结合UL130上的带正电荷的表面，所述长重链CDR3(HCDR3)同时伸入UL130趋化因子结构域中的凹槽中并接触UL130 N-末端残基，其两者都牵涉于趋化因子中的受体结合。据信UL130中的该位点在细胞表面或进入后步骤中结合共受体。因此，位点2和位点3/7抗体可干扰这些相互作用和过程，而不影响五聚体与细胞的结合。
不希望受理论的束缚并且基于中和mAb的结构和功能表征，本发明人提出五聚体介导的HCMV进入的活化的潜在机制。本发明人表明，细胞受体将结合UL128附近的表面和位点1和4/6中和抗体的表位。受体结合可以进而导致由UL128接头介导的gH/gL D-I的旋转以及UL128-α3与gL 3-螺旋束的相互作用。D-I的重新定位可影响D-I/D-II凹槽的宽度，其牵涉于EBV gH/gL中的gB结合，最终触发膜融合。
总而言之，本文描述的五聚体结构揭示有效和广泛中和的mAb的结合位点，提示抗体治疗剂的重要功能位点和靶标的位置。该结构还揭示抗体结合后UL的动态重新定位，表明细胞进入期间配体诱导的构象变化的机制。最后，此处报道的HCMV五聚体的结构、生物化学和基于细胞的功能分析至少为五聚体的活性机理和抗原设计提供了原子水平框架。
3.2掩蔽五聚体表位的聚糖的分析和去糖基化突变
先前已鉴定并广泛定位五聚体上的七个中和表位(位点1至7)(参见，例如，Macagno等人, 2010 J. Virol. 84: 1005-1013和美国专利号9,527,902)。所述位点中的五个是不重叠的(位点1、2、3、4和5)，但位点3与位点7重叠，且位点4与位点6重叠。结合那七个位点的抗体也是已知的，并且包括，例如，已知结合位点1的15D8抗体，已知结合位点2的10F7抗体，已知结合位点3的4N10抗体，已知结合位点4的10P3抗体，已知结合位点5的9I6和2C12抗体，已知结合位点6的7I13抗体和已知结合位点7的8I21抗体(参见，例如，Macagno等人，2010 J.Virol. 84: 1005-1013和美国专利号9,527,902)。使用如上所述获得的五聚体结构，本发明人通过首先在Fab结合后用差异HDX并入来将五聚体表位序列(五聚体上的中和表位的氨基酸残基)作图来表征具有更高特异性的位点1、4、5和2表位(15D8、10P3、2C12和10F7 Fab分别被用作结合位点1、4、5和2的代表性中和抗体)。其次，本发明人手动检查和分析X-射线结构、HDX-MS数据和EM拟合结果，以提出位点1表位序列对应于相对于序列SEQ ID NO:13编号的pUL128残基149-171；位点4表位序列对应于相对于序列SEQ ID NO:13编号的pUL128残基56-72和131-148；位点5表位序列对应于相对于序列SEQ ID NO:21编号的pUL131A残基31-40和42-56；且位点2表位序列对应于相对于序列SEQ ID NO:21编号的pUL131A残基92-122。这些表位序列各自在五聚体结构的表面上的位置显示于图7中(一般位置用椭圆形表示)。
五聚体表面上的十一个聚糖的一般位置也显示于图7中(位置用矩形表示，在那些矩形内是表示碳原子、表示氮原子、表示氧原子和表示氢原子的球体)。在五聚体的一个面上存在十个，其中六个聚糖在gH中，一个在gL中，且四个在UL中(参见图7左侧显示的五聚体面)。五聚体的另一面的特征在于UL130中的一个聚糖(显示于图7的右侧，与位点2相邻)以及带正电荷的区域，其具有暴露的精氨酸和赖氨酸残基的簇。五聚体-8I21 Fab结构揭示两个聚糖(相对于序列SEQ ID NO:17附接至pUL130-Asn85和pUL130-Asn118的那些)侧接8I21表位。基于获得的结构信息和本发明人对其的分析，本发明人相信UL130-Asn85和pUL130-Asn118聚糖限制表位的可及性(即，聚糖“掩蔽”或“遮蔽”表位)。因此，本发明人期望除去这些聚糖中的一个或两个将使表位更可及。具体而言，除去聚糖将“暴露”表位。
本发明人已选择与中和表位密切接近并且同样期望限制其各自表位的可及性的额外聚糖：在相对于SEQ ID NO:1编号的 gH-Asn55、gH-Asn62、gH-Asn67、gH-Asn192、gH-Asn641和gH-Asn700处的聚糖；在相对于SEQ ID NO:7编号的gL-Asn74处的聚糖；在相对于SEQ ID NO:17编号的pUL130-Asn201(除了pUL130-Asn85和pUL130-118以外)处的聚糖；和在相对于SEQ ID NO:21编号的pUL131A-Asn81处的聚糖。本发明人因此期望通过除去上面列出的聚糖中的一个或多个，相应表位将更可及。具体而言，除去聚糖将“暴露”表位。本发明人特别提出使用已知技术将上面列出的天冬酰胺残基取代为任何非天冬酰胺氨基酸(例如谷氨酰胺)，以便防止在该位置处的N-连接的糖基化且由此暴露五聚体的表位。可以通过使用已知技术将突变型多肽或突变型复合物的抗原性与非突变型多肽或复合物的抗原性进行比较来测定去糖基化突变是否暴露表位和/或使表位更可及(参见，例如，Zhou等人,Quantification of the Impact of the HIV-1-Glycan Shield on Antibody Elicitation, 2017 Cell Reports 19:719-732; 和Ma等人. Envelope Deglycosylation Enhances Antigenicity of HIV-1 gp41 Epitopes for Both Broad Neutralizing Antibodies and Their Unmutated Ancestor Antibodies, 2011 PLoS Path. 7(9),e1002200)。中和抗体与表位的增强结合(即增加的抗原性)表明去糖基化突变具有暴露表位和/或使表位更可及的作用(同上)。
基于已知的去糖基化和所得的表位的暴露对多种抗原的免疫原性具有的积极作用，但不希望被理论束缚，据信通过经由本文所述的去糖基化突变来暴露HCMV五聚体表位，与非突变型(例如野生型)多肽或复合物相比，突变型HCMV多肽(或其片段)或突变型HCMV复合物将分别具有增加的免疫原性(参见Liu等人, Unmasking Stem-Specific Neutralizing Epitopes by Abolishing N-Linked Glycosylation Sites of Influenza Virus Hemagglutinin Proteins for Vaccine Design, 2016 J. of Virol. 90(19):8496-8508; Zhou等人, 2017 Cell Reports 19:719-732; 和Ma等人, 2011 PLoS Path.7(9), e1002200)。去糖基化后抗原性的增加已成为用于经由去糖基化增加免疫原性的可接受的概念证明(参见，例如，Ma等人, 2011 PLoS Path. 7(9), e1002200)。
3.3参与五聚体复合物稳定性的氨基酸的计算分析
除了人工检查以外，还使用分子图形程序Pymol (The PyMOL Molecular GraphicsSystem, 版本1.8 Schrödinger, LLC，可得自WorldWideWeb(www).pymol.org)和晶体对象导向工具包(“Coot”) (Emsley等人, 2010，可得自WorldWideWeb(www)2.mrc-lmb.cam.ac.uk/Personal/pemsley/coot/)进行来自上述部分3.1的结构的分析。其后，使用分子操作环境(MOE)软件(参考：分子操作环境(MOE)软件; Chemical Computing GroupInc.，可得自WorldWideWeb(www).chemcomp.com)。具体而言，将MOE内的“蛋白设计”模块的“残基扫描”和“样品序列”变体应用于如上述部分中所述获得的五聚体复合物晶体结构。“残基扫描”模拟依次突变输入蛋白的全部残基或残基子集。“样品序列”以随机方式突变所有指定的残基。单点突变和多点突变两者都使用MOE生成。
具体而言，将MOE内的蛋白设计模块的计算机芯片上的“二硫化物扫描”变体应用于如上述部分中所述获得的五聚体复合物的晶体结构。用该工具，分析残基的周围环境，以评估足够接近以形成二硫键的其他残基的存在。一般而言，如果两个氨基酸的β碳在彼此的5Å内，则两个残基被表征为足够接近以形成二硫键。一旦选择此类残基对，就利用MOE来将两个残基突变为半胱氨酸并表征所得的对蛋白复合物的稳定性的影响。
将来自每个MOE方案的结果编译并手动检查。对于上述所有MOE方案，将每个提出突变的影响使用δ稳定性评分方法针对稳定性进行评分(表示为dS，并且测量为kcal/mol)。dS在MOE中被定义为某个突变相对于野生型或非突变型蛋白的相对热稳定性，且dS的负值越大，表明突变越稳定。该评分方法考虑突变后的构象变化和相对于野生型或非突变型的变化。进一步，从突变型蛋白和其野生型(或非突变型)两者之间在折叠和未折叠状态下的稳定性的差异来预测dS。
表 6：在gH内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 544059DEST_PATH_IMAGE022
表 7：在gL内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 183113DEST_PATH_IMAGE023
表 8：在UL128内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 206563DEST_PATH_IMAGE024
表 9：在UL130内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 90206DEST_PATH_IMAGE025
表 10：在pUL131A内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 298333DEST_PATH_IMAGE026
表 11：在gH和gL两者内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 657639DEST_PATH_IMAGE027
表 12：在pUL128和pUL130两者内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 967005DEST_PATH_IMAGE028
表 13：在gL和pUL130两者内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 580520DEST_PATH_IMAGE029
表 14：在pUL130和pUL131A两者内包含稳定突变的五聚体复合物的MOE d稳定性数据–所有突变体都具有负的d稳定性值，且因此表明与非突变型复合物相比稳定性增强(从最低d稳定性值至最高值分选)。
Figure 225128DEST_PATH_IMAGE030
实施例4 –突变型五聚体复合物的稳定测定
4.1关于至少gH的复合物稳定性的表征
gH的结构分析揭示，存在几个掩埋的空腔，其主要位于gH N-末端区域(与gL的界面附近)和gH胞外域的C-末端。相对于gH序列SEQ ID NO:3，野生型(WT) gH的残基A102位于短的α-螺旋(由gH残基100-108构成)上，其平行于gLα-螺旋(由gL残基216-234构成，相对于gL序列SEQ ID NO:7)。gH A102的甲基(CH3)侧链基团指向与gL α-螺旋的界面，其中存在明显的空腔。因此，本发明人表明gH A102的空腔填充突变可能有助于在该掩埋界面环境内更好的包装。此外，观察到gH残基H480部分暴露在表面上，且因此被本发明人鉴定为重新包装突变以引入与残基的周围环境更有利的包装的靶位点。另外，鉴于在gH-gL界面处引入两个额外的二硫桥(参见表11处的突变V109C(gH)-G224C(gL) 和L111C(gH)-G218C(gL))，本发明人表明通过引入二硫桥突变且由此以更刚性的方式将gH一起锁定至gL残基216-234处的gLα-螺旋来稳定该区域。
4.2关于至少gL的复合物稳定性的表征
gL内掩埋的空腔的定位跨越整个N-末端至C-末端掩埋区域。值得注意的是，gL残基H177(相对于gL序列SEQ ID NO:7编号)位于gL内中央，夹在三个结构之间：在其侧面的一个环，在其底部的一个环，和在顶部的α-螺旋。gL H177的侧链指向覆盖这两个环内的大部分区域的空腔。因此，本发明人提出将H177突变为疏水的空腔填充残基以稳定该区域(即，在gL H177处引入空腔填充突变)。同样，由于在gL残基G224及其周围环境处，可以观察到大空腔被掩埋在gH螺旋-环-螺旋基序(对应于SEQ ID NO:3的108-122的gH残基)和gL α-螺旋(对应于SEQ ID NO:7的216-234的gL残基)之间，本发明人提出在其中引入空腔填充突变(gL残基G224)以稳定该区域。同样，在gH残基92-101(相对于SEQ ID NO:3编号)处的gH螺旋-环-螺旋区域和约gL残基228-242(相对于SEQ ID NO:7编号)处的gL螺旋-环-螺旋区域之间的界面处，在gL C233的侧链之前存在空腔。因此，本发明人提出在gL残基C233处引入空腔填充突变或疏水突变。最后，gL-UL130界面由主链和侧链氢键以及大侧链的疏水接触构成。部分基于对该区域的结构分析，本发明人提出经由二硫桥突变将二硫键插入gL-UL130界面，以将这两个亚基锁定在一起(例如，通过将对应于SEQ ID NO:7的G161的gL残基处的G161C突变与对应于SEQ ID NO:17的P64的UL130残基处的P64C突变锁定在一起)。
4.3关于至少UL128的复合物稳定性的表征
对应于SEQ ID NO:13的G123的UL128残基位于显著掩埋空腔下方，并被掩埋在pUL128和pUL130和pUL131A之间的界面处的30-残基的小结构域中。至少由于残基G123位于显著掩埋空腔下方，本发明人提出在UL128 G123处进行空腔填充突变，以增加复合物稳定性。另外，小的UL128 G145残基(相对于SEQ ID NO:13编号)位于对接至gL 3-螺旋束上的最终UL128 C-末端α-螺旋中，且因此是本发明人鉴定的用于引入重新包装突变以增加在gL-UL128界面处的相互作用且由此增加复合物稳定性的靶标。最后，由于残基UL128 R142和UL130 E95(分别相对于UL128序列SEQ ID NO:13和UL130序列SEQ ID NO:17编号)沿着将UL128的N-末端结构域连接至gL的50Å长接头的环境和三维排列，本发明人提出将UL128R142C和UL130 E95C二硫桥突变引入复合物中，以将UL128锁定至UL130，且因此促成UL区域的稳定性增加和总体复合物的稳定性增加。
4.4关于至少UL130的复合物稳定性的表征
在pUL130-pUL131A界面中，pUL130残基H209(相对于pUL130序列SEQ ID NO:17编号)指向pUL131A H35(相对于pUL131A序列SEQ ID NO:21编号)，本发明人据此表明如果质子化，这些组氨酸会彼此排斥，引起构象变化或赋予该区域柔性。因此，本发明人提出将重新包装突变引入对应于UL130 H209的残基中以降低UL的该区域的柔性并增加复合物稳定性。此外，在pUL130 H209附近检测到显著的掩埋空腔，本发明人提出向其中引入空腔填充和重新包装突变中的一个或两个，以增加复合物稳定性。同样在pUL130-pUL131A界面中，对应于序列SEQ ID NO:17的H150的pUL130残基指向pUL131A H69(相对于SEQ ID NO:21编号)，因此本发明人同样提出将重新包装突变引入pUL130 H150中，以降低该UL区域的柔性并增加复合物稳定性。
4.5关于至少pUL131A的复合物稳定性的表征
在pUL130-pUL131A界面(αβ-核心)中，pUL131A G99(相对于pUL131A序列SEQ ID NO:21编号)位于平坦的130-131-混合的大β-折叠的外围链上，并且其C-b骨架原子(即G99侧链的第一个碳原子)指向其中pUL130和pUL131A螺旋以及大的掩埋空腔定位的掩埋区域。本发明人靶向pUL131A G99用于引入空腔填充突变以增强复合物稳定性。类似地，pUL131A残基S86(相对于pUL131A序列SEQ ID NO:21编号)位于pUL131A螺旋上，并指向平坦的大的pUL130-pUL131A混合的β-折叠。因此，本发明人提出在pUL131A S86处引入空腔填充突变以增加复合物稳定性。同样，pUL131A残基H64(相对于pUL131A序列SEQ ID NO:21编号)指向pUL130-pUL131A混合的αβ-核心之间的掩埋环境，因此本发明人提出将pUL131A H64的重新包装突变(特别是疏水突变)引入至例如大体积的更疏水的残基(诸如色氨酸(W))，以引入增加复合物的热稳定性的相互作用。
4.6设计的稳定突变体
如上述部分中所示，本发明人进行计算分析(以上在实施例3.3中概述)，通过手动检查和操作处理该数据(以上在实施例4.1-4.5中概述)，且由此设计gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A内的突变，(当单独或组合时)，改进包含它们的复合物的稳定性。尽管不希望受理论的束缚，但据信，通过(A)用来自由比野生型蛋白中发现的侧链更长的侧链构成的氨基酸的原子填充结构域界面之间的掩埋的空腔，通过(B)增加邻近残基的接触或替换带电残基的不利簇，和/或通过(C)在整个结构中引入多肽内二硫桥或多肽间二硫桥，构象柔性降低并且复合物的总体热稳定性增加。示例性的本发明人设计的实现A-C中的一种或多种的突变体列于下表15-21中。
尽管组织下表以例举特定五聚体复合物亚基内的特定突变，但设计的突变体包括这些突变的 组合 (“堆积的突变”，即一种多肽内的突变的组合(例如，gH内的几个突变)以及不同多肽内的突变的组合(例如，突变型gH和突变型gL，其两者都可以包含多于一个突变)。通过实例的方式，本发明人设计的突变型HCMV五聚体复合物包含下面的表20和21内列出的任何一个或多个突变。
表 15：
Figure 415937DEST_PATH_IMAGE031
表 16：
Figure 296038DEST_PATH_IMAGE032
表 17：
Figure 623114DEST_PATH_IMAGE033
表 18：
Figure 313989DEST_PATH_IMAGE034
表 19：
Figure 257675DEST_PATH_IMAGE035
表 20：
Figure 551253DEST_PATH_IMAGE036
尽管以上表15-20例举用于引入复合物亚基(例如，引入五聚体复合物亚基蛋白gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A之一)的二硫桥突变，因为在两个残基之间(同一多肽内的两个半胱氨酸残基之间(多肽内二硫桥)或两个半胱氨酸残基(第一多肽和第二多肽各自中的一个半胱氨酸)之间(多肽间二硫桥))形成二硫桥，本发明人在下表21处提供了组合的设计的二硫桥突变的概述(在最左边栏中编号为二硫桥突变的组)，以增加包含它们的复合物的稳定性。可以堆叠表21中提供的二硫桥突变的组合(例如，第1组中列出的突变可以与第2组中列出的突变组合)或将其与至少一个上表15-20中列出的空腔填充突变和/或重新包装突变组合。
表 21：
Figure 890092DEST_PATH_IMAGE037
4.7 表达和纯化包含至少一种设计的突变体的复合物
HCMV五聚体显示双峰解折叠，其反映为其在差示扫描荧光(DSF)测定中具有两个热转变中点(Tm)值(两个峰)(第一个较低的温度值被称为“ Tm1”且第二个较高的温度值被称为“ Tm2”)。本发明的空腔填充、重新包装、二硫化物桥接或去糖基化突变可以偏移(即增加或减少)复合物的一个或几个Tm峰。增加Tm值(即，在DSF测定的所得S形图中，Tm峰向右偏移)用大于零的温度变化(正Tm偏移)表示。减小Tm值(即，Tm峰向左偏移)用小于零的温度变化(负Tm偏移)表示。对于HCMV五聚体复合物，本发明的突变可以仅偏移Tm1和Tm2中的一者或两者。对于这些实验，突变或突变的组合是稳定、中性还是去稳定取决于Tm1偏移、Tm2偏移或两者的大小。与对照相比将Tm1和Tm2中的至少一者增加至少2℃被认为是HCMV复合物的热稳定性的增加(即，如果突变或突变的组合导致与对照相比Tm1偏移或Tm2偏移至少2℃，则其被称为“稳定”)。与对照相比将Tm1和Tm2中的至少一者增加至少5℃被认为是复合物的热稳定性的显著增加(即，如果突变或突变的组合导致与对照相比Tm1偏移或Tm2偏移至少5℃，则其被称为“显著稳定”)。当与对照相比，Tm1偏移和Tm2偏移值两者均在2℃和-2℃之间(不包括端点)时，则突变或突变的组合被称为“中性”。当与对照相比，Tm1偏移和Tm2偏移值中的至少一者为-2℃或更小时，则突变或突变的组合被称为“去稳定”。在此，如果由于例如测定中的蛋白的表达或量不足而无法评估Tm1偏移、Tm2偏移或两者和/或对稳定性的任何影响，则突变体或突变体的组合被标记为“不确定”。
表达和纯化修饰的HCMV五聚体复合物，如以上实施例1和2中所述。HCMV五聚体复合物各自包含至少一种修饰的亚基多肽gH、gL、UL128、UL130和pUL131A，其中所述修饰的亚基多肽包含如表22-23中所列的突变。使用Nanotemper Prometheus NT.48仪器，在差示扫描荧光(DSF)测定中评价纯化的突变型HCMV五聚体复合物。芳香族残基(诸如Tyr和Trp)的固有荧光通过如下获得：在280nm波长处激发并在温度斜变(25-85℃)内测量330nm(代表折叠状态)和350nm(代表解折叠状态)处的发射光谱。使用仪器软件来绘制荧光比(350nm/330nm)的差，并将对应于曲线的拐点的温度作为突变型HCMV五聚体的解链温度(Tm)。将每种突变型HCMV五聚体复合物的Tm1和Tm2与对照(非突变型)HCMV五聚体复合物的相应Tm1或Tm2进行比较。利用的对照复合物是HCMV五聚体复合物，其包含gH复合物形成片段和在蛋白酶识别位点内具有突变的gL多肽(具体地，gH多肽包含序列SEQ ID NO:4；gL多肽包含序列SEQ ID NO:10；pUL128多肽包含序列SEQ ID NO:14；pUL130多肽包含序列SEQ ID NO:18；且pUL131A多肽包含序列SEQ ID NO:22)。如果可能，计算与对照相比的Tm1和/或Tm2的任何变化(偏移)，并概述在表22和23中。表22和23中的残基编号分别相对于gH序列SEQ ID NO:3；gL序列SEQ ID NO:7；pUL128序列SEQ ID NO:13；pUL130序列SEQ ID NO:17；和pUL131A序列SEQ ID NO:21。计算的Tm中的至少5℃的增加被认为是复合物的热稳定性的显著增加。使用生物层干涉术(BLI)技术和10P3抗体测定表22和23中所述的稳定突变型HCMV五聚体复合物的野生型构象表位的存在。表22和23中列出的所有复合物均维持被10P3抗体识别的野生型HCMV五聚体复合物构象表位。
4.8设计的突变对五聚体复合物的稳定性的影响
尽管通过这些方法产生的突变型HCMV五聚体复合物中的一些比对照更热稳定，但其他在影响方面是中性的或去稳定的。与对照相比，包含gL和pUL130多肽内的二硫化物突变；pUL128和pUL130多肽内的二硫化物突变；或仅pUL128多肽内的二硫化物突变的突变型HCMV五聚体复合物具有增加的热稳定性(表22)。同样，与对照相比，包含gL多肽中的空腔填充突变；pUL128多肽中的空腔填充突变；pUL131多肽中的空腔填充突变的突变型HCMV五聚体复合物具有增加的热稳定性(表22)。
堆叠(组合)一种类型的突变(参见表23的A列)与第二种类型的突变(参见表23的B列)也是稳定的(表23)。具体而言，组合gL内的空腔填充突变与pUL128和pUL130内的二硫桥突变；组合pUL128和pUL130内的二硫桥突变与gL内的去糖基化突变；组合gH内的重新包装(亲水)突变与pUL128和pUL130内的二硫桥突变；组合gL内的重新包装(疏水)突变与pUL128和pUL130内的二硫桥突变；和组合pUL131内的两个重新包装(疏水)突变与gL内的空腔填充突变都是稳定的(表23)。
不希望受理论的束缚，据信这些空腔填充、重新包装和二硫桥突变通过优化局部相互作用或降低构象柔性而增强HCMV五聚体复合物的热稳定性。同样相信，这些去糖基化突变使HCMV五聚体复合物表位更可及。
Figure 345344DEST_PATH_IMAGE038
Figure 651692DEST_PATH_IMAGE039
Figure 748961DEST_PATH_IMAGE040
Figure 706422DEST_PATH_IMAGE041
Figure 332575DEST_PATH_IMAGE042
Figure 250852DEST_PATH_IMAGE043
Figure 761599DEST_PATH_IMAGE044
Figure 183353DEST_PATH_IMAGE045
Figure 134735DEST_PATH_IMAGE046
Figure 9151DEST_PATH_IMAGE047
Figure 713801DEST_PATH_IMAGE048
序列的解释
氨基酸序列以N-末端至C-末端方向书写，核酸序列以5’-至3’方向书写：
SEQ ID NO:1 – 来自HCMV Merlin毒株的全长gH多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-23加下划线)(NCBI GI No.:52139248；NCBI登录号YP_081523.1)。
Figure 865428DEST_PATH_IMAGE049
SEQ ID NO:2 – 来自HCMV Merlin毒株的缺乏信号序列的gH多肽(即成熟的gH多肽)的氨基酸序列。SEQ ID NO:2代表SEQ ID NO:1的氨基酸24至742。
Figure 364543DEST_PATH_IMAGE050
SEQ ID NO:3 – 来自HCMV Merlin毒株的缺乏跨膜(TM)结构域和C-末端胞质结构域以及胞外域残基716和717的gH多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:3由SEQ ID NO:1的氨基酸1至715组成(预期信号序列残基1-23加下划线)。参见WO 2014/005959(也公开为美国公开号2016/0159864)。
Figure 116467DEST_PATH_IMAGE051
SEQ ID NO:4 – 来自HCMV Merlin毒株且也缺乏TM结构域和C-末端胞质结构域的成熟gH多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:4由SEQ ID NO:1的氨基酸24至715组成。
Figure 93650DEST_PATH_IMAGE052
SEQ ID NO:5 – 来自HCMV Towne毒株的全长gH多肽的氨基酸序列(NCBI GI No.:138314；NCBI登录号P17176.1)。
Figure 489996DEST_PATH_IMAGE053
SEQ ID NO:6 – 来自HCMV AD169毒株的全长gH多肽的氨基酸序列(NCBI GI No.:138313；NCBI登录号P12824.1)。
Figure 769799DEST_PATH_IMAGE054
SEQ ID NO:7 – 来自HCMV Merlin毒株的全长gL多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)(NCBI GI No.:39842115；NCBI登录号AAR31659.1)。
Figure 884386DEST_PATH_IMAGE055
SEQ ID NO:8 – 来自HCMV Merlin毒株的缺乏信号序列的成熟gL多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:8由SEQ ID NO:7的氨基酸31至278组成。
Figure 291358DEST_PATH_IMAGE056
SEQ ID NO:9 – 来自HCMV Merlin毒株的包含据信是蛋白酶识别位点的位点的突变的全长gL多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)。SEQ ID NO:9由SEQ IDNO:7和修剪突变A96L、N97S和S98G(其也加下划线)组成。参见WO2016/116904。
Figure 542211DEST_PATH_IMAGE057
SEQ ID NO:10 – 来自HCMV Merlin毒株的包含据信是蛋白酶识别位点的位点的突变的成熟gL多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:10由SEQ ID NO:9的残基31-278组成(突变型修剪残基加下划线)。参见WO2016/116904。
Figure 383128DEST_PATH_IMAGE058
SEQ ID NO:11 – 来自HCMV Towne毒株的全长gL多肽的氨基酸序列(NCBI GINo.:239909463；NCBI GenBank登录号ACS32410.1)。
Figure 594798DEST_PATH_IMAGE059
SEQ ID NO:12 – 来自HCMV AD169毒株的全长gL多肽的氨基酸序列(NCBI GINo.:2506510；NCBI登录号P16832.2)。
Figure 179363DEST_PATH_IMAGE060
SEQ ID NO:13 – 来自HCMV Merlin毒株的全长pUL128多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-27加下划线)(NCBI GI No.:39842124；NCBI登录号AAR31668.1)。
Figure 674935DEST_PATH_IMAGE061
SEQ ID NO:14 – 来自HCMV Merlin毒株的缺乏信号序列的成熟pUL128多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:14由SEQ ID NO:13的氨基酸28至171组成。
Figure 421174DEST_PATH_IMAGE062
SEQ ID NO:15 – 来自HCMV Towne毒株的全长pUL128多肽的氨基酸序列(NCBI GINo.:39841882；NCBI GenBank登录号AAR31451.1)。
Figure 244774DEST_PATH_IMAGE063
SEQ ID NO:16 – 来自HCMV AD169毒株的全长pUL128多肽的氨基酸序列(NCBI GINo.:59803078；NCBI登录号P16837.2)。
Figure 242817DEST_PATH_IMAGE064
SEQ ID NO:17 – 来自HCMV Merlin毒株的全长pUL130多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-25加下划线)(NCBI GI No.:39842125；NCBI登录号AAR31669.1)。
Figure 468262DEST_PATH_IMAGE065
SEQ ID NO:18 – 来自HCMV Merlin毒株的缺乏信号序列的成熟pUL130多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:18由SEQ ID NO:17的氨基酸26-214组成。
Figure 385402DEST_PATH_IMAGE066
SEQ ID NO:19 – 来自HCMV Towne毒株的全长pUL130多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-25加下划线)(NCBI GI No.:239909473；NCBI登录号ACS32420.1)。
Figure 874063DEST_PATH_IMAGE067
SEQ ID NO:20 – 来自HCMV AD169毒株的全长pUL130多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-25加下划线)。(NCBI UniProtKB登录号P16772.1)
Figure 534851DEST_PATH_IMAGE068
SEQ ID NO:21 – 来自HCMV Merlin毒株的全长pUL131A多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-18加下划线)(NCBI GI No.:39842126；NCBI登录号AAR31670.1)。
Figure 490169DEST_PATH_IMAGE069
SEQ ID NO:22 – 来自HCMV Merlin毒株的成熟pUL131A多肽的氨基酸序列。SEQID NO:22由SEQ ID NO:21的氨基酸19-129组成。
Figure 843790DEST_PATH_IMAGE070
SEQ ID NO:23 – 来自HCMV Towne毒株的全长pUL131A多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-18加下划线)(NCBI GI No.:239909474；NCBI登录号ACS32421.1)。
Figure 766615DEST_PATH_IMAGE071
SEQ ID NO:24 – 来自HCMV AD169毒株的全长pUL131A多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-18加下划线)。(NCBI GI No.:219879712; NCBI GenBank登录号DAA06452.1)。
Figure 496674DEST_PATH_IMAGE072
SEQ ID NO:25 – 来自HCMV Merlin毒株的全长gO多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)。(NCBI GI No.:39842082; NCBI GenBank登录号AAR31626.1)。
Figure 165553DEST_PATH_IMAGE073
SEQ ID NO:26 – 来自HCMV Merlin毒株的成熟gO多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:26由SEQ ID NO:25的氨基酸31-472组成。
Figure 831020DEST_PATH_IMAGE074
SEQ ID NO:27 – 来自HCMV Towne毒株的全长gO多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)。(NCBI GI No.:239909431; NCBI登录号ACS32378.1)。
Figure 116508DEST_PATH_IMAGE075
SEQ ID NO:28 – 来自HCMV AD169毒株的全长gO多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)。(NCBI GI No.:136968; NCBI UniProtKB登录号P16750.1)。
Figure 745198DEST_PATH_IMAGE076
SEQ ID NO:29 – 来自HCMV Merlin毒株的包含据信是蛋白酶识别位点的位点的突变的全长gL多肽的氨基酸序列(预期信号序列残基1-30加下划线)。SEQ ID NO:29由SEQID NO:7和修剪突变A96I、N97D和S98G(其也加下划线)组成。参见WO2016/116904。
Figure 799742DEST_PATH_IMAGE078
SEQ ID NO:30 – 来自HCMV Merlin毒株的包含据信是蛋白酶识别位点的位点的突变的成熟gL多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO:30由SEQ ID NO:29的残基31-278组成(突变型修剪残基加下划线)。参见WO2016/116904。
Figure 495165DEST_PATH_IMAGE079
SEQ ID NO:31 – 编码全长gH氨基酸序列SEQ ID NO:1的核酸序列(序列对应于NCBI GenBank登录号AY446894.2的碱基对109224-111452(以3’至5’方向编码))。
Figure 877736DEST_PATH_IMAGE080
SEQ ID NO:32 – 编码gH氨基酸序列SEQ ID NO:3的核酸序列(针对哺乳动物表达而密码子优化)
Figure 870969DEST_PATH_IMAGE081
SEQ ID NO:33 – 编码全长gL氨基酸序列SEQ ID NO:7的核酸序列。
Figure 920964DEST_PATH_IMAGE082
SEQ ID NO:34 – 编码全长LSG gL氨基酸序列SEQ ID NO:9的核酸序列，LSG突变的位置加下划线。
Figure 521710DEST_PATH_IMAGE083
SEQ ID NO:35 – 编码全长IDG gL氨基酸序列SEQ ID NO:29的核酸序列，IDG突变的位置加下划线。
Figure 670538DEST_PATH_IMAGE084
SEQ ID NO:36 – 编码全长pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13的核酸序列。
Figure 14932DEST_PATH_IMAGE085
SEQ ID NO:37 – 编码全长pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17的核酸序列。
Figure 44068DEST_PATH_IMAGE086
SEQ ID NO:38 – 编码全长pUL131A氨基酸序列SEQ ID NO:21的核酸序列。
Figure 691081DEST_PATH_IMAGE087
SEQ ID NO:39 – 编码全长gO氨基酸序列SEQ ID NO:25的核酸序列(对应于GenBank登录号AY446894.2的碱基对108848 – 107454)。
Figure 438457DEST_PATH_IMAGE088
SEQ ID NO:40 – 对应于HCMV Merlin毒株gH氨基酸序列SEQ ID NO:3，其进一步包含G358R突变(加下划线)。预期信号序列残基1-23也加下划线。
Figure 976755DEST_PATH_IMAGE089
SEQ ID NO:41 – 对应于HCMV Merlin毒株gH氨基酸序列SEQ ID NO:4，其进一步包含G358R突变(加下划线)。
Figure 798080DEST_PATH_IMAGE090
SEQ ID NO:42 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含N74Q突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 740628DEST_PATH_IMAGE091
SEQ ID NO:43 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含N74Q突变(加下划线)。
Figure 335820DEST_PATH_IMAGE092
SEQ ID NO:44 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含G140F突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 22016DEST_PATH_IMAGE093
SEQ ID NO:45 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含G140F突变(加下划线)。
Figure 494586DEST_PATH_IMAGE094
SEQ ID NO:46 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含G145L突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 873615DEST_PATH_IMAGE095
SEQ ID NO:47 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含G145L突变(加下划线)。
Figure 939791DEST_PATH_IMAGE096
SEQ ID NO:48 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含A150C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 695257DEST_PATH_IMAGE097
SEQ ID NO:49 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含A150C突变(加下划线)。
Figure 678126DEST_PATH_IMAGE098
SEQ ID NO:50 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含R160C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 228056DEST_PATH_IMAGE099
SEQ ID NO:51 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含R160C突变(加下划线)。
Figure 171741DEST_PATH_IMAGE100
SEQ ID NO:52 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含R166C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 75106DEST_PATH_IMAGE101
SEQ ID NO:53 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含R166C突变(加下划线)。
Figure 787847DEST_PATH_IMAGE102
SEQ ID NO:54 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:9，其进一步包含C233V突变(加下划线)。预期信号序列残基1-30也加下划线。
Figure 397426DEST_PATH_IMAGE103
SEQ ID NO:55 – 对应于HCMV Merlin毒株gL氨基酸序列SEQ ID NO:10，其进一步包含C233V突变(加下划线)。
Figure 828408DEST_PATH_IMAGE104
SEQ ID NO:56 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含M48C和G107C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 660098DEST_PATH_IMAGE105
SEQ ID NO:57 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含M48C和G107C突变(加下划线)。
Figure 102711DEST_PATH_IMAGE106
SEQ ID NO:58 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含V77I突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 260023DEST_PATH_IMAGE107
SEQ ID NO:59 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含V77I突变(加下划线)。
Figure 37355DEST_PATH_IMAGE108
SEQ ID NO:60 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含S83C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 672736DEST_PATH_IMAGE109
SEQ ID NO:61 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含S83C突变(加下划线)。
Figure 94490DEST_PATH_IMAGE110
SEQ ID NO:62 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含Y98C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 298069DEST_PATH_IMAGE111
SEQ ID NO:63 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含Y98C突变(加下划线)。
Figure 438064DEST_PATH_IMAGE112
SEQ ID NO:64 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含L103I突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 503234DEST_PATH_IMAGE113
SEQ ID NO:65 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含L103I突变(加下划线)。
Figure 45074DEST_PATH_IMAGE114
SEQ ID NO:66 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:13，其进一步包含R142C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-27也加下划线。该信号序列在残基12处(加双下划线)不同于SEQ ID NO:13的信号序列。
Figure 278609DEST_PATH_IMAGE115
SEQ ID NO:67 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL128氨基酸序列SEQ ID NO:14，其进一步包含R142C突变(加下划线)。
Figure 781266DEST_PATH_IMAGE116
SEQ ID NO:68 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含Y56C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 492870DEST_PATH_IMAGE117
SEQ ID NO:69 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含Y56C突变(加下划线)。
Figure 168177DEST_PATH_IMAGE118
SEQ ID NO:70 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含P62C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 431668DEST_PATH_IMAGE119
SEQ ID NO:71 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含P62C突变(加下划线)。
Figure 546255DEST_PATH_IMAGE120
SEQ ID NO:72 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含P64C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 936916DEST_PATH_IMAGE121
SEQ ID NO:73 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含P64C突变(加下划线)。
Figure 187769DEST_PATH_IMAGE122
SEQ ID NO:74 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含E95C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 28686DEST_PATH_IMAGE123
SEQ ID NO:75 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含E95C突变(加下划线)。
Figure 991088DEST_PATH_IMAGE124
SEQ ID NO:76 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含T167C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 575653DEST_PATH_IMAGE125
SEQ ID NO:77 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含T167C突变(加下划线)。
Figure 681012DEST_PATH_IMAGE126
SEQ ID NO:78 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:17，其进一步包含Y204C突变(加下划线)。预期信号序列残基1-25也加下划线。
Figure 568197DEST_PATH_IMAGE127
SEQ ID NO:79 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL130氨基酸序列SEQ ID NO:18，其进一步包含Y204C突变(加下划线)。
Figure 391796DEST_PATH_IMAGE128
SEQ ID NO:80 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL131A氨基酸序列SEQ ID NO:21，其进一步包含Y52F和A67V突变(加下划线)。预期信号序列残基1-18也加下划线。
Figure 527855DEST_PATH_IMAGE129
SEQ ID NO:81 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL131A氨基酸序列SEQ ID NO:22，其进一步包含Y52F和A67V突变(加下划线)。
Figure 487721DEST_PATH_IMAGE130
SEQ ID NO:82 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL131A氨基酸序列SEQ ID NO:21，其进一步包含S86F突变(加下划线)。预期信号序列残基1-18也加下划线。
Figure 545807DEST_PATH_IMAGE131
SEQ ID NO:83 – 对应于HCMV Merlin毒株pUL131A氨基酸序列SEQ ID NO:22，其进一步包含S86F突变(加下划线)。
Figure 856702DEST_PATH_IMAGE132
本文提及的所有专利和出版物都以其整体通过引用并入本文。
Figure IDA0002325930730000011
Figure IDA0002325930730000021
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Claims (21)

1.HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
2.HCMV gH多肽或其复合物形成片段，其包含氨基酸序列，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:1具有至少90%同一性，且(b)：
(i)氨基酸残基A102、A372、A352和L2S7中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代；
(ii)氨基酸残基H252、K404、R255、E355、H480、S601和R405中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代；
(iii)氨基酸残基G358和H327中的一个或多个被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；
(iv)氨基酸残基V109和/或L11被半胱氨酸(C)取代；
(v)氨基酸残基N55、N62、N67、N192、N641和N700中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；或
vi.)其组合。
3.HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其组合。
4.HCMV gL多肽或其复合物形成片段，其包含氨基酸序列，其中(a)所述序列与SEQ IDNO:5具有至少90%同一性，且(b)：
(i)氨基酸残基H177、G224、G140、G145、D146、G218、L119、C233和P272中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代；
(ii)氨基酸残基H267、H236、H245、G161和C233中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代；
(iii)氨基酸残基G161、D163、G224、G218、R166、G140、R160和A150中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代；
(iv)氨基酸残基N74被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；或
v.)其组合。
5.HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变或其中一者或多者的组合。
6.HCMV pUL128多肽或其复合物形成片段，其包含氨基酸序列，其中(a)所述序列与SEQID NO:13具有至少90%同一性，且(b)：
(i)氨基酸残基G123、V77、L103和Q119中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代；
(ii)氨基酸残基G145、H90和G112中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代；
(iii)氨基酸残基R142、N99、Y98、A124、G126、L159、D45、V88、M48、G107、R51、D106和S83中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代；或
(iv)其组合。
7.HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
8.HCMV pUL130多肽或其复合物形成片段，其包含氨基酸序列，其中(a)所述序列与SEQID NO:17具有至少90%同一性，且(b)：
(i)氨基酸残基D165和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代；
(ii)氨基酸残基G116、G135、H150和H209中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代；
(iii)氨基酸残基G116、H150、P64、S178、P62、E95、Y204、N211、I213、Y56和T167中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代；
(iv)氨基酸残基N85、N118和N201中的一个或多个被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；或
v.)其组合。
9.HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其包含一个或多个空腔填充突变、一个或多个疏水突变、一个或多个亲水突变、一个或多个二硫桥突变、一个或多个去糖基化突变或其中一者或多者的组合。
10.HCMV pUL131A多肽或其复合物形成片段，其包含氨基酸序列，其中(a)所述序列与SEQ ID NO:21具有至少90%同一性，且(b)：
(i)氨基酸残基G99、S86和S90中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和亮氨酸(L)的氨基酸取代；
(ii)氨基酸残基H69、H35、H64、D38、V85、Y52和A67中的一个或多个被选自色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸取代；
(iii)氨基酸残基R118被选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；
(iv)氨基酸残基H64和W37中的一个或多个被半胱氨酸(C)取代；
(v)氨基酸残基N81被选自谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的氨基酸取代；或
(vi)其组合。
11.核酸分子，其编码权利要求1至10中任一项的HCMV多肽或其复合物形成片段。
12.复合物，其包含权利要求1至11中任一项的HCMV多肽或其复合物形成片段。
13.权利要求12的复合物，其为修饰的HCMV五聚体复合物，其包含：
((i))
(a)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基142处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基95处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(b)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基74处的谷氨酰胺(Q)的gL多肽；
(c)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基140处的苯丙氨酸(F)的gL多肽；
(d)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基145处的亮氨酸(L)的gL多肽；
(e)具有相对于SEQ ID NO:21编号的残基52处的苯丙氨酸(F)和残基67处的缬氨酸(V)的gUL131多肽；
(f)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基233处的缬氨酸(V)的gL多肽；
(g)具有相对于SEQ ID NO:3编号的残基358处的精氨酸(R)的gH多肽；
(h)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基150处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基64处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(i)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基83处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基167处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(j)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基160处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基56处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(k)具有相对于SEQ ID NO:7编号的残基166处的半胱氨酸(C)的gL多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基62处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(1)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基98处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽，和具有相对于SEQ ID NO:17编号的残基204处的半胱氨酸(C)的pUL130多肽；
(m)具有相对于SEQ ID NO:21编号的残基86处的苯丙氨酸(F)的pUL131多肽；
(n)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基48处的半胱氨酸(C)和残基107处的半胱氨酸(C)的pUL128多肽；
(o)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基77处的异亮氨酸(I)的pUL128多肽；
(p)具有相对于SEQ ID NO:13编号的残基145处的亮氨酸(L)的pUL128多肽；或
(q)其组合；
((ii))其中与对照HCMV五聚体复合物相比，所述修饰的HCMV五聚体复合物具有增加的热稳定性。
14.权利要求13的修饰的HCMV五聚体复合物，其包含((i))(q)和((ii))，其中所述组合(q)包含：
(1) (a)以及(b)、(c)、(d)、(f)和(g)之一；
(2) (c)和(e)；或
(3) (d)和(e)。
15.免疫原性组合物，其包含权利要求12-14中任一项的复合物和任选非抗原组分。
16.核酸分子，其包含一个或多个可操作连接的多核苷酸序列，其一起编码权利要求12-14中任一项的复合物。
17.表达载体，其包含权利要求11或16的核酸分子。
18.宿主细胞，其包含权利要求11或16的核酸分子或权利要求17的表达载体。
19.制备修饰的HCMV多肽或修饰的HCMV复合物的方法，其包括培养权利要求18的宿主细胞。
20.诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法，其包括向受试者施用免疫有效量的权利要求15的免疫原性组合物。
21.抑制CMV进入细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求12-14中任一项的复合物接触。
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