CN117677847A - 人巨细胞病毒糖蛋白b多肽中的新的可成药区域及其使用方法 - Google Patents

人巨细胞病毒糖蛋白b多肽中的新的可成药区域及其使用方法 Download PDF

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CN117677847A CN202280030567.6A CN202280030567A CN117677847A CN 117677847 A CN117677847 A CN 117677847A CN 202280030567 A CN202280030567 A CN 202280030567A CN 117677847 A CN117677847 A CN 117677847A
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Abstract

本发明涉及一种鉴定由具有糖蛋白B(gB)多肽的人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区的HCMV gB多肽与化合物接触，其中所述化合物的结合表明候选治疗剂。本发明还涉及包含HCMV活性调节剂和抑制剂的候选治疗剂和包含所述调节剂和抑制剂的药物组合物及其使用方法。

Description

人巨细胞病毒糖蛋白B多肽中的新的可成药区域及其使用 方法
相关申请
本申请要求2021年2月24日提交的美国临时申请号63/153,164和2022年2月4日提交的美国临时申请号63/306,669的优先权。前述每个申请的全部内容均通过引用整体并入本文。
序列表参考
这个申请通过EFS-Web以电子方式提交，并包括.txt格式的以电子方式提交的序列表。所述.txt文件包含名为“PC72715_Feb2022_ST25.txt”的序列表，创建于2022年2月3日，大小为1,374KB。这个.txt文件中包含的序列表是本说明书的一部分并且通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白B(gB)多肽中的新的可成药区域及其使用方法，例如用于药物开发。
发明背景
人巨细胞病毒(HCMV)是β-疱疹病毒科的双链DNA病毒。HCMV是在孕妇中潜伏病毒感染或重新激活后垂直病毒传播导致先天性和新生儿听力丧失的主要原因。此外，HCMV是一种常见的机会性病原体，影响免疫抑制患者，例如实体器官和干细胞移植患者、艾滋病患者等。尽管医学研究机构已将开发针对HCMV的疫苗列为首要任务，但迄今为止尚未获得任何许可。
HCMV基因组编码几种包膜糖蛋白，其中之一是糖蛋白B(gB)。糖蛋白B是病毒进入细胞所需的融合蛋白，也是中和抗体(nAb)应答感染的重要靶标。并入gB亚单位抗原的HCMV疫苗正在开发中。
由于融合是病毒感染性的关键步骤，因此鉴定gB蛋白内的可药物区域将进一步鉴定和开发能够特异性抑制融合的疗法，从而抑制HCMV的病毒感染。
发明概述
融合前和融合后构象中HCMV gB蛋白结构已如下文详细描述的那样被分辨，从而提供关于多肽的结构以及其中包含的可成药区域、结构域等信息，所有这些都可以用于基于理性的药物设计工作。
因此，本发明部分提供了HCMV gB蛋白中的新的可成药区域。化合物与这些区域的相互作用、或者用化合物调节这些区域的活性，可以抑制病毒融合，从而抑制病毒感染性。一方面，本发明提供了针对这些可成药区域筛选化合物的方法，以发现用于由具有gB蛋白的HCMV引起的HCMV感染的候选治疗剂，例如病毒融合抑制剂。
此外，本发明提供了鉴定用于治疗或预防由HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使具有包含可成药区域的糖蛋白B(gB)多肽的HCMV与化合物接触，其中所述化合物的结合指示候选治疗剂。在某些实施方案中，化合物可以选自以下类别的化合物：蛋白质、肽、多肽、拟肽、抗体、核酸和小分子，或者可以选自化合物文库。这样的文库可以通过组合合成方法生成。可以在体外或体内测定结合。在这个方法的某些实施方案中，所述蛋白质是HCMV gB蛋白质并且包含来自HCMV gB蛋白的可成药区域的至少一个残基，优选三个残基。这种可成药区域还可用于结构确定、药物筛选、药物设计和本文描述和要求保护的其它方法中。
在一个实施方案中，所述可成药区域包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。这些残基形成在融合后构象中HCMV gB蛋白结构域V的结合口袋。
在又一个实施方案中，所述可成药区域包含在融合后构象中HCMV gB蛋白的融合环或其一部分。
另一方面，本发明提供了鉴定用于治疗或预防由具有gB蛋白的HCMV引起的感染的候选治疗剂的方法。在某些实施方案中，此类方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述gB蛋白的活性的调节指示候选治疗剂。在其它实施方案中，此类方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述可成药区域的移动或相互作用的被阻止指示候选治疗剂。在其它实施方案中，所述gB蛋白的功能或活性的调节涉及阻止融合后构象变化的完成。在另一个实施方案中，所述gB蛋白的功能或活性的调节涉及干扰构象变化的第一阶段。在另一个实施方案中，此类方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述病毒融合的抑制指示候选治疗剂。在又一个实施方案中，所述方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述HCMV的病毒感染性的抑制指示候选治疗剂。在又一个实施方案中，对象中由HCMV感染引起的疾病的至少一个症状的减轻指示候选治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述化合物阻止gB蛋白的结构域V或其片段在其结合口袋中结合。在一个实施方案中，gB蛋白的结构域V的结合口袋包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。
另一方面，了解到的和本文描述的关于gB蛋白的所有信息均可用于设计其生物活性调节剂的方法中。在一个实施方案中，设计用于预防或治疗由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的调节剂的方法，包括：(a)提供gB蛋白的三维结构；(b)通过参考三维结构鉴定用于预防或治疗由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的潜在调节剂；(c)使gB蛋白与所述潜在调节剂接触；以及(d)在与所述调节剂接触后测定gB蛋白的活性或确定具有所述gB蛋白的病毒的存活力，其中所述蛋白质活性或病毒的存活力的变化指示所述调节剂可用于预防或治疗与病毒相关的疾病或病症。在某些实施方案中，通过参考具有gB蛋白的HCMV的三维结构来鉴定潜在调节剂。在其它实施方案中，通过参考gB蛋白或其片段的可成药区域的三维结构来鉴定潜在调节剂。
另一方面，本发明提供了HCMV感染的调节剂(在某些实施方案中是抑制剂)，以及包含其的药物组合物和试剂盒。在某些实施方案中，此类调节剂可以与本发明的可成药区域相互作用。又一方面，本发明涉及调节剂，其是HCMV gB蛋白的结构域V的片段(或此类片段的同源物或此类片段的模拟物)并且竞争所述可成药区域。任何上述可成药区域的调节剂可以单独使用或以补充方法使用来治疗或预防HCMV感染。
最后，本发明提供了HCMV gB的可成药区域，其包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。一方面，所述可成药区域的残基处于融合后构象。
本发明的实施方案和实践、其它实施方案以及其特征和特性从随后的描述、附图和权利要求中将显而易见，所有权利要求由此通过引用并入本发明这个概述中。
附图简述
图1A-1B描述了gB构象异构体的二维(2D)类平均值。图1A描绘了融合后gB结构的2D投影。示出了与抗体Fab结合的融合后gB的电子冷冻显微镜结构的投影图像。图1B描绘了2D类平均值。右侧显示了得自用融合抑制剂和交联剂处理并结合抗体片段后从CMV病毒颗粒中提取的gB制剂的电子冷冻显微镜图像的二维类平均值。与任何参考融合后gB二维投影都不相似的类平均图像用圆圈标识。
图2描述了来自我们的电子冷冻显微镜结构的融合前和融合后gB-Fab复合物模型中包含的糖蛋白B氨基酸。可以在电子冷冻显微镜密度图中建模的氨基酸用结构域代码突出显示(结构域I(仅斜体，即上方序列(融合前)残基133-344；下方序列(融合后)残基133-344)；结构域II(粗体并加下划线，即上方序列(融合前)残基121-132和345-436；下方序列(融合后)残基121-132和345-439)；结构域III(仅粗体，即上方序列(融合前)残基86-120和483-550；下方序列(融合后)残基86-120和474-550)；结构域IV(斜体和下划线，即上方序列(融合前)残基551-641；下方序列(融合后)残基551-641)；结构域V(斜体和粗体，即上方序列(融合前)残基642-724；下方序列(融合后)残基642-697)；MPR(仅下划线，即上方序列(融合前)残基25-7507；下方序列(融合后)无残基)；TM(斜体、粗体和下划线，即上方序列(融合前)残基751-769；下方序列(融合后)无残基))。上方和下方序列分别用于融合前和融合后结构模型。
图3A-3B描绘了模型拟合为密度图。将抑制剂化合物稳定的融合前(图3A)和融合后(图3B)gB构象的模型拟合为浅灰色密度图中。gB组件为深灰色，SM5-1 fab组件为黑色。由融合前结构中TM区域的位置确定的病毒包膜的大致位置由黑色水平线表示。
图4A-4B描绘了两种构象的gB的结构的比较。gB稳定的融合前结构(图4A)和融合后结构(图4B)用一个原聚体示出以指示结构域：I、II、III、IV、V、MPR和TM。从融合前结构顶部延伸的垂直黑色虚线表示由于定义较少的密度图而从模型中丢失的残基。所述结构的可构建的胞外域部分的总体尺寸由虚线矩形表示。箭头表示每个构象的结构域III中中央3-螺旋束的C末端所指向的方向。融合前结构(图4A)上的尺寸表示胞外域建模部分的高度。
图5A-5D：图5A描绘了融合抑制剂化合物N-{4-[({(1S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}硫代氨基甲酰基)氨基]苯基}-1,3-噻唑-4-甲酰胺在融合前gb模型中的位置的以黑色示出。所述化合物的化学结构如图5D所示。图5B：所述化合物周围电子密度的近视图(灰色透明表面)。示出附近的氨基酸残基并标记了结构域。图5C：示出了所述化合物周围相互作用的残基。
图6A-6C描绘了膜融合期间gB的结构重排的模型。FL(和星号)，表示融合环。DI，表示结构域1。DII，表示结构域2。DV，表示结构域5。TM，表示跨膜区。实线描绘膜：宿主细胞膜和病毒膜。图6A(融合前)描绘了融合前构象；图6B(延伸的中间体)描绘了延伸的中间体构象；图6C(融合后)描绘了融合后构象。
图7A-7B描绘了在融合前构象中稳定gB的示例的二硫键突变。在融合前构象(图7A)和融合后构象(图7B)中参与二硫键的残基的位置以灰色球体描绘。
图8描绘了来自结构生物信息学蛋白质数据库研究合作实验室(RCSB PDB)文件的信息：5CXF，来自人巨细胞病毒的糖蛋白B的胞外结构域的晶体结构，来自人巨细胞病毒(AD169毒株)，保藏于2015-07-28；DOI：10.2210/pdb5CXF/pdb。
晶胞(unit cell)：
图9描绘了来自临床和实验室适应的HCMV毒株的gB序列(SEQ ID NO:110-SEQ IDNO:111)。其它序列可见于来自临床和实验室适应的HCMV的gB的氨基酸序列比对，见于Burke et al.,PLoS Pathog.2015Oct 20；11(10):e1005227的S4图。根据Burke等所述，将从NCBI的RefSeq数据库下载来自临床和实验室适应的毒株的60个HCMV gB序列，使用ClustalW2和ESPript 3.x进行比对和分析。在Burke等的S4图中，相同的残基以红色背景上的白色文本示出，相似的残基以黄色突出显示，所述S4图及其描述通过引用整体并入本文。
图10描绘了SEQ ID NO:1-43和SEQ ID NO:47-106的氨基酸序列。
图11描绘了gB1666和野生型gB(Towne)免疫的小鼠中的剂量依赖性IgG应答。该图显示，用野生型gB DNA免疫的10只小鼠中有10只以及用gB1666 DNA免疫的10只小鼠中有9只产生了可检测的抗gB IgG滴度。平均值±SD，LLOQ＝25。
图12描绘了工程化gB1666(浅灰色，结构代码：P-GB-002)的结构模型与野生型HCMV gB(深灰色，结构代码：P-GB-001)的结构模型重叠。新结构允许对所述分子的膜远端的其它残基437-448和478-482以及跨膜结构域中的残基770-779进行建模。
图13描绘了pSB1666背景上的额外突变组合的组合实例，其可以进一步稳定融合前gB。在M371、W506处的二硫键可以连接结构域II和III。在N524、M684和F541、E681处的二硫键可以连接结构域IV和V。在E686处带负电荷的补丁(patche)突变为疏水性残基可以进一步稳定融合前构象的gB。每个结构域均被识别。缩写：膜近侧区(MPR)和跨膜结构域(TMD)。
图14描述了记录重组gB2459蛋白的表达和纯化的SDS-PAGE。将pSB2459表达质粒瞬时转染至Expi293F细胞中。转染后68小时收获细胞团块，并将糖蛋白产物gB2459在25mMHEPES pH 7.5、250mM NaCl、0.02％正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)、0.002％胆固醇琥珀酸单酯(CHS)中通过一系列增溶、亲和色谱和尺寸排阻色谱法进行纯化。这个图显示了在还原条件下通过无染色4-20％ SDS-PAGE分析的纯化的蛋白质。蛋白质条带的拖尾与被严重糖基化的gB2459一致。泳道M：蛋白质标记；泳道1：gB2457；泳道2：gB2459。
图15描绘了构建体pSB2459，其在pSB1666背景上含有N524C和M684C突变。将蛋白质产物gB2459通过亲和标签纯化，不存在任何融合抑制剂。在二维类平均图像中观察到融合前类(具有明显融合前特征的两类用数字1和2表示)。此外，所述融合前gB2459在几天内保持稳定。将gB2459的样品溶液保存在4℃下，在第1天和第7天获得等份样品以制备负染色网格。在这两个网格上收集和处理图像数据集。对于每个数据集，对融合前和融合后2D类中的粒子群进行计数：第1天的样品的融合前和融合后构象之间的比率为5:1，第7天相应为3:1。
图16A-16D描绘了可溶的、无去污剂的gB胞外域的设计。图16A示出了去除了MPR、TM和CT区域的gB胞外域(1-707)。图16B示出了用在结构域V中额外的半胱氨酸突变例如D703C和P704C稳定的gB胞外域。
图16C示出与C末端GCN4三聚化基序融合的gB胞外域。图16D示出与C末端T4fibritin foldon结构域融合的gB胞外域。图例：结构域I(残基134-344)，深灰色3D体积结构；结构域II(残基121-133和345-436)，浅灰色3D体积结构；结构域III(残基97-111、475-539和640-648)，顶部中心浅灰色垂直卷曲；结构域V(残基649-707)，底部内部深灰色卷曲(参见箭头图16B)；以及矩形是三聚化位置。
图17描绘了纯化的gB胞外域gB2264-gB2269的凝胶过滤图，在20mM HEPES pH7.5、250mM NaCl中通过Superose 6Increase 10/300进行分析。
图18A-18B描绘了来自没有结合的融合抑制剂的重组gB2555的负染色EM的负染色EM图像(图18A)和代表性2D类平均值(图18B)，示出单分散的gB蛋白适合用作框架以在没有抑制剂和去污剂的情况下向融合前形式的gB添加更稳定的突变。
图19A-19B描绘了来自没有结合的融合抑制剂的重组gB2556的负染色EM的负染色EM图像(图19A)和代表性2D类平均值(图19B)，示出单分散的gB蛋白适合用作框架以在没有抑制剂和去污剂的情况下向融合前形式的gB添加更稳定的突变。
图20A-20B描绘了在融合前(图20A)和融合后(图20B)结构中的HCMV(Towne株)结构域V(残基I642-V697(SEQ ID NO:281))的空间填充模型。标记了疏水残基。
图21A-21C描绘了(图21A)在融合后构象中的HCMV gB(Towne株)结构域V(浅灰色)及其结合口袋(深灰色)；(图21B)示出了没有结构域V的口袋的空间填充模型；以及(图21C)与图21A相同结构的带状示意图，标记了某些残基。
序列标识符
SEQ ID NO:1示出衍生自天然HCMV gB(Towne株)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Q98C，G271C。
SEQ ID NO:3示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Q98C，I653C。
SEQ ID NO:4示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：G99C，A267C。
SEQ ID NO:5示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C，A267C。
SEQ ID NO:6示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C，S269C。
SEQ ID NO:7示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C，L651C。
SEQ ID NO:8示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D217C，F584C。
SEQ ID NO:9示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y218C，A585C。
SEQ ID NO:10示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S219C，D654C。
SEQ ID NO:11示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N220C，D652C。
SEQ ID NO:12示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T221C，D652C。
SEQ ID NO:13示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：W240C，G718C。
SEQ ID NO:14示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y242C，K710C。
SEQ ID NO:15示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y242C，D714C。
SEQ ID NO:16示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S269C，I653C。
SEQ ID NO:17示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：G271C，P614C。
SEQ ID NO:18示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S367C，L499C。
SEQ ID NO:19示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T372C，W506C。
SEQ ID NO:20示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：F541C，Q669C。
SEQ ID NO:21示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：L548C，A650C。
SEQ ID NO:22示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：A549C，I653C。
SEQ ID NO:23示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S550C，D652C。
SEQ ID NO:24示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：G604C，F661C。
SEQ ID NO:25示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N605C，E665C。
SEQ ID NO:26示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R607C，S675C。
SEQ ID NO:27示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T608C，D679C。
SEQ ID NO:28示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E609C，F678C。
SEQ ID NO:29示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R673C，S674C。
SEQ ID NO:30示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N676C，V677C。
SEQ ID NO:31示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：L680C，E681C。
SEQ ID NO:32示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：I683C，M684C。
SEQ ID NO:33示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：F687C，N688C。
SEQ ID NO:34示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y690C，K691C。
SEQ ID NO:35示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K695C，K724C。
SEQ ID NO:36示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T746C，F747C。
SEQ ID NO:37示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K749C，N750C。
SEQ ID NO:38示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K670L。
SEQ ID NO:39示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K670F。
SEQ ID NO:40示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R673L。
SEQ ID NO:41示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R673F。
SEQ ID NO:42示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K691L。
SEQ ID NO:43示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K691F。
SEQ ID NO:44示出在表达时折叠成融合后构象的天然HCMV gB(AD169；PDB：5CXF)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45示出在表达时折叠成融合后构象的天然HCMV gB变体(gB705)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46示出在表达时折叠成融合后构象的天然HCMV gB(Merlin株)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：M96C和D660C。
SEQ ID NO:48示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Q98C和N658C。
SEQ ID NO:49示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C和R258C。
SEQ ID NO:50示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C和L656C。
SEQ ID NO:51示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T100C和N658C。
SEQ ID NO:52示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：I117C和T406C。
SEQ ID NO:53示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：I117C和S407C。
SEQ ID NO:54示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y153C和L712C。
SEQ ID NO:55示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：L162C和M716C。
SEQ ID NO:56示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D217C和S587C。
SEQ ID NO:57示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D217C和Y589C。
SEQ ID NO:58示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S219C和F584C。
SEQ ID NO:59示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S219C和A585C。
SEQ ID NO:60示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S219C和N586C。
SEQ ID NO:61示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N220C和T659C。
SEQ ID NO:62示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S223C和T659C。
SEQ ID NO:63示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：W240C和A732A。
SEQ ID NO:64示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：W240C和G735C。
SEQ ID NO:65示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y242C和V728C。
SEQ ID NO:66示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Y242C和G731C。
SEQ ID NO:67示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R258C和L656C。
SEQ ID NO:68示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S269C和L656C。
SEQ ID NO:69示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S269C和N658C。
SEQ ID NO:70示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D272C和P614C。
SEQ ID NO:71示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：V273C和V629C。
SEQ ID NO:72示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：W349C和A650C。
SEQ ID NO:73示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S367C和A500C。
SEQ ID NO:74示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S367C和A503C。
SEQ ID NO:75示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K370C和Q501C。
SEQ ID NO:76示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：K522C和I683C。
SEQ ID NO:77示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：I523C和I683C。
SEQ ID NO:78示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：I523C和M684C。
SEQ ID NO:79示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N524C和M684C。
SEQ ID NO:80示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：P525C和E681C。
SEQ ID NO:81示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R540C和L680C。
SEQ ID NO:82示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：F541C和L680C。
SEQ ID NO:83示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：L548C和P655C。
SEQ ID NO:84示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：A549C和N658C。
SEQ ID NO:85示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S550C和P655C。
SEQ ID NO:86示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：S550C和E657C。
SEQ ID NO:87示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Q591C和S668C。
SEQ ID NO:88示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：L603C和Y667C。
SEQ ID NO:89示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：G604C和L672C。
SEQ ID NO:90示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：R607C和N688C。
SEQ ID NO:91示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：T608C和Q692C。
SEQ ID NO:92示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E609C和K691C。
SEQ ID NO:93示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E610C和S674C。
SEQ ID NO:94示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E610C和S675C。
SEQ ID NO:95示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：Q612C和V663C。
SEQ ID NO:96示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：V737C和F755C。
SEQ ID NO:97示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：V741C和A754C。
SEQ ID NO:98示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：V741C和F755C。
SEQ ID NO:99示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D679S。
SEQ ID NO:100示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D679N。
SEQ ID NO:101示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E682S。
SEQ ID NO:102示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E682Q。
SEQ ID NO:103示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E686S。
SEQ ID NO:104示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：E686Q。
SEQ ID NO:105示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：N118P。
SEQ ID NO:106示出SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中包括以下突变：D646P。
SEQ ID NO:107来自图8的>5CXF:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108示出来自图8的>5CXF:B|PDBID|CHAIN|SEQUENCE的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109示出来自图8的>5CXF:C|PDBID|CHAIN|SEQUENCE的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110示出来自HAN13 gi|242345614|gb|GQ221973.1|:81988-84705人疱疹病毒5毒株HAN13的gB多肽的氨基酸序列，完整基因组反向互补体，在图9的描述中引用。
SEQ ID NO:111示出来自VR1814 gi|270355759|gb|GU179289.1|:81925-84642人疱疹病毒5毒株VR1814的gB多肽的氨基酸序列，完整基因组反向互补体，在图9的描述中引用。
SEQ ID NOs:112-140示出在图9中描述的各种CMV gB毒株的gB多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:141至SEQ ID NO:210示出编码衍生自HCMV的多肽例如gH、gL、UL128、UL130、UL131、gB或pp65的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:211至SEQ ID NO:223示出衍生自HCMV的多肽例如gH、gL、UL128、UL130、UL131、gB或pp65的氨基酸序列。
SEQ ID NO:224示出衍生自HCMV的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:225至SEQ ID NO:254示出编码衍生自HCMV的多肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:255至SEQ ID NO:259示出表9中列出的各种gB胞外域蛋白的C末端融合序列。
SEQ ID NO:260至SEQ ID NO:280示出各种融合抑制肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:281示出gB多肽(Towne)的结构域V的氨基酸序列。
SEQ ID NO:282至SEQ ID NO:284示出如图20A-20B所示的HCMV gB蛋白相互作用区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:285至SEQ ID NO:289示出形成HCMV gB蛋白的结构域V的结合口袋的氨基酸残基(除了SEQ ID NO:1的R258-K260、R327-D329和W349-E350之外)。
发明详述
如本文所述，本发明人阐明了HCMV糖蛋白B(gB)多肽的三维结构，其构象不同于融合后构象，我们将其称为融合前构象。还发现了使多肽在融合前构象中稳定的突变。所述结构可用于产生比用现有的基于HCMV gB的免疫原所实现的应答更强的HCMV中和抗体应答。本文所述的多肽和编码该多肽的核酸可以用作例如抗HCMV疫苗中的潜在免疫原和用作诊断工具等。
本发明人还发现了可以引入巨细胞病毒(CMV)gB多肽中的突变，其尤其可以极大地促进在融合前构象中稳定的gB抗原的产生和随后的纯化；显著提高融合前构象中的gB多肽的生产效率；与野生型gB多肽相比，改变gB多肽的抗原性；促进对融合前gB的针对性免疫应答；并减少和/或消除gB中和表位的空间闭阻。
由于融合是病毒感染性的关键步骤，因此鉴定gB蛋白内的可成药区域将进一步开发能够特异性抑制HCMV病毒感染的治疗剂。
A.天然HCMV gB
天然HCMV gB被合成为906或907个氨基酸的多肽(取决于CMV毒株)，经过广泛的翻译后修饰，包括N和O连接位点的糖基化以及被普遍存在的细胞内切蛋白酶切割成氨基和羧基末端片段。gB、gp116和gp55的N末端和C末端片段分别通过二硫键共价连接，成熟的糖基化gB呈现三聚体构型。gB多肽含有一个大的胞外域(其被切割成gp116和gp55的胞外域)、跨膜结构域(TM)和病毒内(或细胞质)结构域(cytodomain)。
已知来自不同毒株的天然HCMV gB。例如，NCBI的RefSeq数据库中提供了至少60个来自临床和实验室适应毒株的HCMV gB序列。也参见图9。
因此，如本文所用，术语“CMV gB”多肽或“HCMV gB”多肽应理解为来自任何人HCMV毒株(不限于Towne毒株)的天然HCMV gB多肽。实际残基位置数可能需要根据实际序列比对，针对其它人CMV毒株的gB进行调整。
HCMV gB由HCMV基因组的UL55基因编码。它是一种包膜糖蛋白，介导HCMV病毒膜与宿主细胞膜的融合。所述蛋白质经历了从融合前形式到融合后形式的一系列构象变化。融合后形式的gB的晶体结构是可获得的(PDB登录代码5CXF)，并且融合前构象描述如下。
B.构象
HCMV gB融合后构象是指病毒包膜与宿主细胞膜融合后HCMV gB采用的结构构象。天然HCMV gB还可以在融合事件的背景之外呈现融合后构象，例如在应激条件下，如暴露于热、从膜中提取、作为胞外域表达或储存条件下。更具体地，gB融合后构象描述于例如Burkeet al.,Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B.PLoSPathog.2015Oct 20；11(10):e1005227。也见于结构生物信息学蛋白质数据库研究合作实验室(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank(RCSB PDB))：5CXF，来自人巨细胞病毒(AD169株)，保藏于2015年7月28日；DOI：10.2210/pdb5CXF/pdb；和图9。当表达时可折叠成融合后构象的蛋白质序列如SEQ ID NO:44所示。SEQ ID NO:45提供了当表达时折叠成融合后构象的蛋白质的另一个实例。融合后构象约为高、宽。
如本文所用，“融合前构象”是指至少在分子尺寸或三维坐标方面不同于HCMV gB融合后构象的多肽所采用的结构构象。融合前构象是指在触发导致gB转变为融合后构象的融合事件之前HCMV gB采用的结构构象。以稳定的融合前构象分离HCMV gB可能有助于告知和指导改进的疫苗和免疫原性组合物的开发，以解决巨细胞病毒感染的重要公共卫生问题。在一些实施方案中，融合前构象包括可以结合融合前特异性抗体的构象。在一些实施方案中，融合前构象包括以WO2021/260510中描述的表1A中列出的坐标为特征的构象，所述专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，多肽的特征在于结构坐标，其包含当叠加在WO2021/260510中描述的表1A的结构坐标所描述的骨架原子上时，保守残基骨架原子的均方根偏差(RMSD)，所述专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，融合前构象包括以WO2021/260510中描述的表1B中列出的坐标为特征的构象，所述专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，多肽的特征在于结构坐标，其包含当叠加在WO2021/260510中描述的表1B的结构坐标所描述的骨架原子上时，保守残基骨架原子的均方根偏差(RMSD)，所述专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，具有HCMVgB融合前构象的多肽是指包括三聚体螺旋束的多肽，其以三聚体的三重轴为中心并且包含每个原聚体的残基L479至K522，其中所述螺旋束的方向沿着三重轴从N末端至C末端的方向(由图4A和图4B中的箭头所示)是朝向与每个原聚体的残基W240所限定的平面相交的三重轴上的点，其位于三聚体每个结构域I尖端附近的融合环中。在一些实施方案中，所述螺旋束包含根据SEQ ID NO:1编号的L479和K522之间的残基。
C.野生型HCMV gB的突变体
本发明包括包含相对于相应野生型HCMV gB的氨基酸序列的氨基酸突变的多肽。所述氨基酸突变包括相对于野生型HCMV gB的氨基酸取代、缺失或添加。因此，所述多肽是野生型HCMV gB的突变体。
在一些实施方案中，所述多肽具有某些有益特征，例如免疫原性。在一些实施方案中，与相应的野生型HCMV gB相比，所述多肽在融合前构象中具有增加的免疫原性特性或改善的稳定性。稳定性是指HCMV gB构象从融合前到融合后的转变被阻碍或阻止的程度。在其它实施方案中，本公开提供了展示一种或多种本文所述引入的突变的多肽，其也可以导致融合前构象的稳定性改善。在HCMV gB中引入的氨基酸突变包括氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，突变体的氨基酸序列中的唯一突变是相对于野生型HCMV gB的氨基酸取代。
与天然HCMV gB相比，稳定多肽构象的几种模式包括引入二硫键、引入静电突变、填充空腔、改变残基的包装、引入N-连接糖基化位点及其组合的氨基酸取代。
一方面，本发明涉及呈现不是融合后构象的构象的多肽。也就是说，所述多肽呈现出如上所述的融合前构象并且未呈现出融合后构象。参见例如图3A中所示的融合前构象，相比之下图3B示出融合后构象；如图4A中所示的融合前构象，相比之下图4B示出融合后构象；以及如图6A中所示的融合前构象，相比之下图6C示出融合后构象。在一些实施方案中，多肽的特征在于结构坐标，其包含当叠加在WO2021/260510中描述的表1A的结构坐标所描述的骨架原子上时，保守残基骨架原子的均方根偏差(RMSD)，所述专利的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，多肽的特征在于结构坐标，其包含当叠加在WO2021/260510中描述的表1B的结构坐标所描述的骨架原子上时，保守残基骨架原子的均方根偏差(RMSD)，所述专利的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述多肽是分离的，即与具有融合后构象的HCMV gB多肽分离。因此，所述多肽可以与融合后构象的HCMV gB多肽例如至少80％分离、至少90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离。一方面，本发明涉及特异性结合HCMV gB融合前特异性抗体的多肽。
应当理解，特定构象的同质多肽群体可以包括不改变多肽构象状态的变异(例如多肽修饰变异，例如糖基化状态)。在一些实施方案中，所述多肽群体随着时间的推移保持同质。例如，在一些实施方案中，当溶解在水溶液中时，所述多肽形成在融合前构象稳定至少12小时、例如至少24小时、至少48小时、至少一周、至少两周或更长时间的多肽群。
不受理论的束缚，本文公开的多肽被认为促进HCMV gB多肽的稳定的融合前构象。与相应的天然HCMV gB多肽相比，所述多肽包括至少一个突变。本领域普通技术人员将意识到，所述多肽可用于在哺乳动物中引发针对CMV的免疫应答。
天然HCMV gB在HCMV进入糖蛋白中是保守的，并且是进入所有细胞类型所必需的。鉴于HCMV gB序列的实质保守性，可以比较不同天然HCMV gB序列之间的氨基酸位置以鉴定不同HCMV毒株之间相应的HCMV gB氨基酸位置。因此，跨毒株的天然HCMV gB序列的保守性允许使用参考HCMV gB序列来比较HCMV gB多肽中特定位置处的氨基酸。因此，除非另有明确说明，本文提供的多肽氨基酸位置是指SEQ ID NO:1中所示的HCMV gB多肽的参考序列。
然而，应当注意，不同的天然HCMV gB序列可能具有与SEQ ID NO:1不同的编号系统，例如在源自Towne以外的毒株的天然HCMV gB序列中可能存在与SEQ ID NO:1相比添加或去除的额外氨基酸残基。因此，应当理解，当特定氨基酸残基通过其编号来提及时，所描述的不限于仅是当从给定氨基酸序列的开头开始计数时恰好位于该编号位置的氨基酸，而是任何和所有HCMV gB序列中的等价或相应的氨基酸残基均是预期的，即使该残基不在相同的精确编号位置，例如如果HCMV序列比SEQ ID NO:1更短(例如是片段)或更长，或与SEQID NO:1相比具有插入或缺失。
在一些实施方案中，所述多肽是全长的，其中所述多肽包含与成熟全长野生型HCMV gB相同数量的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述多肽是片段，其中所述多肽包含少于成熟全长野生型HCMV gB的氨基酸残基总数。在一些实施方案中，截短的gB多肽仅包括胞外域序列。
C.1.半胱氨酸(C)取代
在一些实施方案中，与天然HCMV gB相比，所述多肽包括引入的半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述多肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个半胱氨酸取代中的任一种取代。不受理论或机制的束缚，本文所述的半胱氨酸取代被认为促进所述多肽在非HCMV gB融合后构象的构象中的稳定性。引入的半胱氨酸取代可通过蛋白质工程引入，例如通过包含一个或多个形成二硫键的取代的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述半胱氨酸的氨基酸位置在足够近的距离内，以在HCMV gB的融合前而非融合后构象中形成二硫键。
形成二硫键的半胱氨酸残基可以通过两个或更多个氨基酸取代而被引入天然HCMV gB序列中。例如，在一些实施方案中，将两个半胱氨酸残基引入天然HCMV gB序列中以形成二硫键。
在一些实施方案中，所述多肽包括通过半胱氨酸之间的二硫键在融合前构象稳定的重组HCMV gB，所述半胱氨酸被引入一对氨基酸位置，所述氨基酸在融合前构象中彼此靠近而在融合后构象中远离。
与天然HCMV gB相比的示例的半胱氨酸取代包括选自表2的任何突变，其编号基于SEQ ID NO:1的编号。
表2：示例的用于二硫键稳定的成对半胱氨酸
在一些实施方案中，所述多肽在表2第(ii)列第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36行中的一或多行中列出的任一位置处包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)半胱氨酸取代，其中所得多肽不呈现出HCMV融合后构象。
在一些实施方案中，所述多肽在表2第(ii)列第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、或88行中的一或多行中列出的任一位置处包括一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)半胱氨酸取代，其中所得多肽不呈现出HCMV融合后构象。
在一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列根据SEQ ID NO:1编号的在位置98和653(列于表2的第2列第(ii)行)处的半胱氨酸取代。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列根据SEQ ID NO:1编号的在位置100和269(列于表2的第(ii)列第5行)处的半胱氨酸取代。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置217和584(列于表2的第(ii)列第7行)处的半胱氨酸取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置242和710处(列于表2的第(ii)列第13行)的半胱氨酸取代。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置242和714(列于表2的第(ii)列第14行)处的半胱氨酸取代。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的在位置367和499(列于表2的第(ii)列第17行)处的半胱氨酸取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的在位置372和506处(列于表2的第(ii)列第18行)的半胱氨酸取代。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置550和652(列于表2的第(ii)列第22行)处的半胱氨酸取代。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置608和679(列于表2的第(ii)列第26行)处的半胱氨酸取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置695和724处(列于表2的第(ii)列第34行)的半胱氨酸取代。
在一些实施方案中，所述多肽包括在表2的第(ii)列的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、和88行中的一或多行中列出的任意一对位置处被取代的半胱氨酸残基对之间的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)二硫键。
在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置98和653(列于表2的第(ii)列第2行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置100和269(列于表2的第(ii)列第5行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置217和584(列于表2的第(ii)列第7行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置242和710(列于表2的第(ii)列第13行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置242和714(列于表2的第(ii)列第14行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置367和499(列于表2的第(ii)列第17行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置372和506(列于表2的第(ii)列第18行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置550和652(列于表2的第(ii)列第22行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置608和679(列于表2的第(ii)列第26行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在相对于野生型HCMV gB氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置695和724(列于表2的第(ii)列第34行)取代的一对半胱氨酸残基之间的二硫键。
在进一步的实施方案中，所述多肽在半胱氨酸残基对之间包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)二硫键，所述半胱氨酸残基对是在表2的第(iii)列第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36行中的一或多行中列出的任一对位置通过半胱氨酸氨基酸取代引入的，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
在进一步的实施方案中，所述多肽在半胱氨酸残基对之间包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)二硫键，所述半胱氨酸残基对是在表2的第(iii)列第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 70、71 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、或88行中的一或多行中列出的任一对位置通过半胱氨酸氨基酸取代引入的，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
在一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在Q98C和I653C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第2行)。在另一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ IDNO:1编号的在T100C和S269C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第5行)。在进一步优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在D217C和F584C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第7行)。在一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在Y242C和K710C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第13行)。在另一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在Y242C和D714C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第14行)。在进一步优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在S367C和L499C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第17行)。在一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在T372C和W506C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第18行)。在另一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在S550C和D652C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第22行)。在进一步优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在T608C和D679C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第26行)。在一个优选的实施方案中，所述多肽相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列包括根据SEQ ID NO:1编号的在K695C和K724C处的半胱氨酸取代(列于表2的第(iii)列第34行)。
在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置96和660处被取代。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包含在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置98和658处被取代。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包含在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQID NO:1编号的位置100和258处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置100和656处被取代。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包含在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置100和658处被取代。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置117和406处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置117和407处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置153和712处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置162和716处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置217和587处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置217和589处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置219和584处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置219和585处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置219和586处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置220和659处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置223和659处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置240和732处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置240和735处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置242和728处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置242和731处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置258和656处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置269和656处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置269和658处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置272和614处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置273和629处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置349和650处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置367和500处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置367和503处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置370和501处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置522和683处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置523和683处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置523和684处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置524和684处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置525和681处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置540和680处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置541和680处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置548和655处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置549和658处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置550和655处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置550和657处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置591和668处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置603和667处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置604和672处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置607和688处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置608和692处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置609和691处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ IDNO:1编号的位置610和674处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置610和675处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置612和663处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置737和755处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置741和754处被取代。在一个优选的实施方案中，所述多肽包括在一对半胱氨酸残基之间的二硫键，所述一对半胱氨酸残基相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列在根据SEQ ID NO:1编号的位置741和755处被取代。
在一些实施方案中，所述多肽包括表2中列出的半胱氨酸残基之间的两个或更多个二硫键的组合。
在一些实施方案中，所述多肽包括与选自以下的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％,97％、98％、99％、或100％相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQID NO:35，SEQ ID NO:36，和SEQ ID NO:37。
在一些实施方案中，所述多肽包括与选自以下的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％,97％、98％、99％、或100％相同性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54，SEQ IDNO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ IDNO:61，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66，SEQ IDNO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ IDNO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78，SEQ IDNO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:84，SEQ IDNO:85，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:90，SEQ IDNO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:96，SEQ IDNO:97，和SEQ ID NO:98。
在一些实施方案中，所述多肽包括与选自SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58和SEQ ID NO:60的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％,97％、98％、优选99％、或100％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包括与选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:70和SEQ ID NO:78的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％,97％、98％、优选99％、或100％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述组合物优选不包括具有以下任一所示序列的多肽：SEQID NO:59，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:96，和SEQ ID NO:50。
在另外的实施方案中，所述多肽包括如表2的第(iv)列中列出的任一SEQ ID NO所示的氨基酸序列。也就是说，示例的多肽包括具有选自以下任一氨基酸序列的多肽：SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ IDNO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，和SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，所述多肽具有选自以下任一所示氨基酸序列：SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:60，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65，SEQ IDNO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71，SEQ IDNO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:78，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:84，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89，SEQ IDNO:90，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95，SEQ IDNO:96，SEQ ID NO:97，和SEQ ID NO:98。
在一个优选的实施方案中，所述多肽包含以下任一所述的氨基酸序列：SEQ IDNO:3，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:18，SEQ IDNO:19，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:27，和SEQ ID NO:35。
在一些实施方案中，可以从天然HCMV gB序列中插入(或缺失)氨基酸以调整所述多肽结构中残基的排列，使得特定残基对在足够近的距离内以在融合前而不是融合后构象中形成二硫键。在一些这样的实施方案中，所述多肽除了包括至少一个氨基酸插入之外，还包括在位于表2的第(ii)列的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、或88行中的一或多行列出的任何成对位置处的半胱氨酸残基之间的二硫键。
在一些实施方案中，所述多肽与天然HCMV gB相比包括苯丙氨酸取代。在一些实施方案中，所述多肽与天然HCMV gB相比包括亮氨酸取代。在一些实施方案中，与处于融合后构象的HCMV gB多肽相比，所述多肽可以通过氨基酸突变(例如苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)取代)来稳定，所述氨基酸突变减少在多肽的折叠结构中彼此邻近的残基之间的离子排斥。在一些实施方案中，与处于融合后构象的HCMV gB多肽相比，所述多肽可以通过氨基酸突变来稳定，所述氨基酸突变增加了多肽折叠结构中彼此邻近的残基之间的离子吸引力。
示例的突变包括选自表3的任何突变，所述突变是与天然HCMV gB相比根据SEQ IDNO:1编号的突变。
表3：示例的苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)取代
表4：进一步示例的取代
在一些实施方案中，所述多肽包括在表3的第(ii)列第1、2、3、4、5或6行中的一或多行中列出的任一位置处取代的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)残基，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
在一些实施方案中，所述多肽包括在表4的第(ii)列第1、2、3、4、5、6、7和8行中的一或多行中列出的任一位置处取代的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)残基，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置670处的突变(列于表3的第(ii)列第1行和第2行)。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置673处的突变(列于表3的第(ii)列第3行和第4行)。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置691处的突变(列于表3的第(ii)列第5行和第6行)。
在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置670处的突变。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置682处的突变。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置686处的突变。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置118处的突变。在一些实施方案中，所述多肽包括在根据SEQ ID NO:1编号的位置646处的突变。
在进一步的实施方案中，所述多肽包括通过在表3的第(iii)列的第1、2、3、4、5或6行中的一或多行列出的任一位置处取代而引入的静电突变，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
在优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代K670L(列于表3第(iii)列第1行)。在另一优选实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代K670F(列于表3第(iii)列第2行)。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ IDNO:1编号的取代R673L(列于表3的第(iii)列第3行)。在优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代R673F(列于表3第(iii)列第4行)。在另一优选实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代K691L(列于表3第(iii)列第5行)。在进一步优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代K691F(列于表3第(iii)列第6行)。
在一些实施方案中，所述多肽包括表3中列出的苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)取代中的两个或更多个取代的组合。
在优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代D679S。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代D679N。在另一优选实施方案中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1编号的取代E682S。在另一优选实施方案中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1编号的取代E682Q。在另一优选实施方案中，所述多肽包含根据SEQID NO:1编号的取代E686S。在另一优选实施方案中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1编号的取代E686Q。在另一优选实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代N118P。在另一个优选的实施方案中，所述多肽包括根据SEQ ID NO:1编号的取代D646P。
在一些实施方案中，所述多肽包括表4中列出的苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)取代中的两个或更多个取代的组合。在一些实施方案中，所述多肽包括与选自SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的任何序列具有至少80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包括与选自SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、和SEQ ID NO:106的任何序列具有至少80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同性的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，所述多肽包括如表3的第(iv)列中列出的任一SEQ ID NO所示的氨基酸序列。也就是说，示例的多肽包括具有选自以下任一序列的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，和SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，所述多肽具有选自以下任一序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:99，SEQID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106。
在一些实施方案中，可以从天然HCMV gB序列插入(或缺失)氨基酸以调整多肽结构中残基的排列，使得特定残基对在足够近的距离内以在融合前而不是融合后构象中形成期望的静电相互作用。在一些这样的实施方案中，所述多肽在表3的第(ii)列的第1、2、3、4、5或6行中的一或多行列出的任何位置处包括希望的静电相互作用，其中所述多肽不表现出HCMV融合后构象。
C.2.多肽的进一步实施方案
在一些实施方案中，所述多肽不包括在根据参考序列SEQ ID NO:46编号的以下氨基酸位置中任一处的突变：280、281、283、284、285、286、290、292、295、297、298、299，或其任何组合。在一些示例的实施方案中，所述多肽不包括根据参考序列SEQ ID NO:46编号的以下任一残基的取代：Y280，N281，T283，N284，R285，N286，F290，E292，N293，F297，F298，I299，F298；及其任何组合。不受理论或机制的束缚，对于中和抗体重要的残基可包括Y280/N284和Y280/N293/D295。因此，在一个优选的实施方案中，所述多肽与参考序列SEQ ID NO:46相比不包括在Y280、N293、N284和D295处的突变。
在一些实施方案中，所述多肽不包括根据参考序列SEQ ID NO:44编号以下的任一氨基酸位置处的突变：R562，P577，S587，Y588，G592，G595，L601/H605，C610，L612，P613，Y625，Y627，F632和K633，及其任意组合。在一些实施方案中，所述多肽不包括根据参考序列SEQ ID NO:44编号的以下任一氨基酸突变：R562C，P577L，S587L，Y588C，G592S，G595D，L601P/H605N，C610Y，L612F，P613Y，Y625C，Y627C，F632L和K633T，或其任意组合。不受理论或机制的束缚，认为P577和Y627在结构域IV核心内彼此相邻，而C610参与保守的二硫键。因此，所有这三个残基可能有助于维持结构域IV在融合前结构中的位置，从而维持整个抗原位点AD-1的稳定性。此外，不受理论或机制的束缚，F632和G595被认为暴露在gB的融合前形式的表面上。因此，在一个优选的实施方案中，所述多肽不包括根据参考序列SEQ ID NO:44编号的在P577、Y627、C610、F632和G595或其任何组合处的突变。
C.3.空腔填充突变
在再其它实施方案中，所述多肽包括作为一种或多种空腔填充突变的氨基酸突变。为了填充空腔而可以被置换的氨基酸的实例包括小脂肪族氨基酸(例如Gly、Ala和Val)或小极性氨基酸(例如Ser和Thr)以及隐藏在融合前构象中但在融合后构象中暴露于溶剂的氨基酸。置换氨基酸的实例包括大的脂肪族氨基酸(Ile、Leu和Met)或大的芳香族氨基酸(His、Phe、Tyr和Trp)。
C.4.突变的组合
另一方面，本发明涉及一种多肽，其包括两种或更多种不同类型的突变的组合，所述突变选自工程化的二硫键突变、空腔填充突变和静电突变，每种突变均如上文所述。在一些实施方案中，所述多肽包括至少一个二硫键突变和至少静电突变。更具体地，在一些实施方案中，所述多肽包括至少一个半胱氨酸取代和至少一个苯丙氨酸取代。在一些实施方案中，所述多肽包括至少一个半胱氨酸取代和至少一个亮氨酸取代。
在一些进一步的实施方案中，所述多肽包括选自表2中任一突变的至少一个突变和选自表3中任一突变的至少一个突变。在一些进一步的实施方案中，所述多肽包括选自表2中任一突变的至少一个突变和选自表4中任一突变的至少一个突变。在一些进一步的实施方案中，所述多肽包括选自表3中任一突变的至少一个突变和选自表4中任一突变的至少一个突变。
D.HCMV gB多肽的可成药区域
本发明部分提供了HCMV gB蛋白中新的可成药区域。药物与这些区域的相互作用，或者用药物调节这些区域的活性，可以抑制病毒融合并因此抑制病毒感染性。一方面，本发明提供了针对这些可成药区域筛选化合物的方法，以发现由具有gB蛋白的HCMV引起的HCMV感染的候选治疗剂，例如小分子病毒融合抑制剂。在一个实施方案中，一种鉴定由具有gB蛋白的HCMV引起的HCMV感染的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述化合物的结合指示候选治疗剂。在某些实施方案中，化合物可以选自以下类别：肽、多肽、拟肽或小分子，或者可以选自化合物文库。这样的文库可以通过组合合成方法生成。可以在体外或体内测定结合。在这个方法的某些实施方案中，所述蛋白质是HCMV gB蛋白并且包含来自HCMV gB蛋白的可成药区域的至少一个残基、优选三个残基。此类可成药区域还可用于结构确定、药物筛选、药物设计和本文描述和权利要求的其它方法。
术语“可成药区域”，当在提及多肽、核酸、复合物等使用时，是指HCMV gB蛋白的区域，其是或可能是结合降低或抑制病毒感染性的制剂的靶标。对于多肽，可成药区域通常是指其中多肽的几个氨基酸能够与制剂相互作用的区域。对于多肽或其复合物，示例的可成药区域包括能够参与与另一分子例如细胞膜的相互作用的结合口袋和位点、多肽或复合物的结构域之间的界面、多肽或复合物的表面沟槽或轮廓或表面。
可用多种方式描述和表征可成药区域。例如，可成药区域的特征可以在于构成该区域的一些或全部氨基酸、或其主链原子、或其侧链原子(任选具有或不具有Ca原子)。或者，可成药区域可以通过与相同或其它分子上的其它区域进行比较来表征。例如，术语“亲和区域”是指分子(例如HCMV gB蛋白)上存在于若干其它分子中的可成药区域，因为相同亲和区域的结构足够相同，由此预期其结合相同或相关的结构类似物。亲和区域的一个实例是在多种蛋白激酶(无论是否具有相同来源)中发现的蛋白激酶的ATP结合位点。术语“选择性区域”是指在其它分子上可能未发现的分子的可成药区域，因为不同选择性区域的结构足够不同，由此预期其不会结合相同或相关的结构类似物。示例的选择性区域是对一种底物表现出特异性的蛋白激酶的催化结构域。在某些情况下，单一调节剂可以结合具有基本上相似的生物学功能的多种蛋白质的相同亲和区域，而同一调节剂可以仅结合那些蛋白质之一的一个选择性区域。
继续不同的可成药区域的实例，术语“不希望的区域”是指分子的可成药区域，其在与另一分子相互作用时导致不希望的效果。例如，氧化相互作用分子(例如P-450活性)并由此导致氧化分子毒性增加的结合位点可被视为“不希望的区域”。潜在的不希望的区域的其它实例包括在与药物相互作用时降低药物的膜渗透性、增加药物的排泄或增加药物的血脑转运的区域。可能的情况是，在某些情况下，不希望的区域将不再被视为不希望的区域，因为该区域的影响将是有利的，例如，旨在治疗脑部疾病的药物将受益于与导致血脑转运增加的区域的相互作用，而同一区域对于不打算递送至脑部的药物可能被认为是不希望的区域。
当在提及可成药区域中使用时，诸如调节剂的分子对可成药区域的“选择性”或“特异性”可用于描述所述分子与可成药区域之间的结合。例如，调节剂相对于可成药区域的选择性可以通过与另一种调节剂比较来表示，使用各自的Kd值(即，每个调节剂-可成药区域复合物的解离常数)表示，或者在低于Kd观察到生物效应的情况中，使用各自的EC50比率(即，调节剂与每个可成药区域相互作用产生50％最大应答的浓度)。
当涉及功能性质或生物活性或过程(例如，酶活性或受体结合)使用时，术语“调节”是指上调(例如，激活或刺激)、下调(例如，抑制或阻抑)或以其它方式改变此类性质、活性或过程的能力。在某些情况下，这种调节可能取决于特定事件的发生，例如信号转导途径的激活，和/或可能仅在特定细胞类型中显现。
术语“调节剂”是指肽、多肽、核酸、大分子、复合物、分子、小分子、化合物、物种等(天然存在的或非天然存在的)，或由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织制成的提取物，其可能能够导致调节。可以在包含其的测定中评估调节剂作为功能性质、生物活性或过程或其组合的调节剂或激活剂(直接或间接)的潜在活性(例如，激动剂、部分拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、抗微生物剂、微生物感染或增殖的调节剂等)。在此类测定中，可以一次筛选许多调节剂。调节剂的活性可以是已知的、未知的或部分已知的。术语“抑制剂”是指肽、多肽、核酸、大分子、复合物、分子、小分子、化合物、物种等(天然存在的或非天然存在的)，或由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织制成的提取物，其可能能够下调或抑制功能性质或生物活性或过程。
术语“基序”是指在特定结构或功能的蛋白质中常见的氨基酸序列。通常，共有序列被定义为代表特定基序。共有序列不需要严格定义，并且可以含有可变性、简并性、长度可变性等的位置。共有序列可以用于搜索数据库以鉴定由于在其氨基酸序列中存在所述基序而可能具有相似结构或功能的其它蛋白质。例如，可以用共有序列搜索在线数据库，以鉴定含有特定基序的其它蛋白质。可以使用各种搜索算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分而利用。ENTREZ可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)、国家医学图书馆(National Library of Medicine)、国家卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda，Md)获取。
术语“小分子”是指分子量小于约5kD、小于约2.5kD、小于约1.5kD或小于约0.9kD的化合物。小分子可以是例如核酸、肽、多肽、肽核酸、拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机(含碳)或无机分子。许多制药公司拥有广泛的化学和/或生物混合物文库，通常是真菌、细菌或藻类提取物，其可以用本发明的任何测定法进行筛选。术语“有机小分子”是指通常被鉴定为有机或药用化合物的小分子，并且不包括仅是核酸、肽或多肽的分子。
在一个实施方案中，所述可成药区域包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690，这些残基形成融合后构象中HCMV gB蛋白结构域V的结合口袋。
在又一个实施方案中，可成药区域包含融合环或其一部分。
另一方面，本发明涉及鉴定由具有gB蛋白的HCMV引起的疾病的候选治疗剂的方法。在某些实施方案中，此类方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述gB蛋白的活性的调节指示候选治疗剂。在其它实施方案中，此类方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述可成药区域的移动或相互作用的阻止指示候选治疗剂。在其它实施方案中，所述gB蛋白的功能或活性的调节涉及阻止融合后构象变化的完成。在另一个实施方案中，所述gB蛋白的功能或活性的调节涉及干扰构象变化的第一阶段。在另一个实施方案中，鉴定由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述病毒中融合的抑制指示候选治疗剂。在另一个实施方案中，鉴定由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述HCMV的病毒感染性的抑制指示候选治疗剂。在另一个实施方案中，鉴定由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中对象中所述疾病的至少一种症状的减少指示候选治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB蛋白与化合物接触，其中所述化合物阻止gB蛋白的结构域V或其片段在其结合口袋中结合。在一个实施方案中，gB蛋白的结构域V的结合口袋包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。
另一方面，了解到的和本文描述的关于gB蛋白的所有信息可用于设计其一种或多种生物活性的调节剂的方法中。在一个实施方案中，设计用于预防或治疗由具有gB蛋白的HCMV感染引起的疾病的调节剂的方法，包括：(a)提供gB蛋白的三维结构；(b)通过参考三维结构鉴定用于预防或治疗由具有gB蛋白的HCMV引起的疾病的潜在调节剂(c)使gB蛋白与所述潜在调节剂接触；及(d)在与所述调节剂接触后测定gB蛋白的活性或确定具有所述gB蛋白的病毒的存活力，其中多肽的活性或病毒的存活力的变化指示所述调节剂可用于预防或治疗与病毒相关的疾病或病症。在某些实施方案中，通过参考具有gB蛋白的HCMV的三维结构来鉴定潜在调节剂。在其它实施方案中，通过参考包含gB蛋白的可成药区域或片段的三维结构来鉴定潜在调节剂。
再一方面，本发明提供了gB蛋白活性的调节剂(在某些实施方案中是抑制剂)，以及包含其的药物组合物和试剂盒。在某些实施方案中，此类调节剂可以与本发明的可成药区域相互作用。又一方面，本发明涉及调节剂，其是HCMV gB蛋白的可成药区的片段(或此类片段的同源物或此类片段的模拟物)并与所述可成药区竞争。任何上述可成药区域的调节剂可以单独使用或以补充方法使用来治疗HCMV感染。
最后，本发明涉及鉴定和设计与HCMV gB多肽的活性或结合位点结合、相互作用或调节其功能或活性的调节剂的方法。
如本文所用，术语“化合物”应包括但不限于调节剂、抑制剂、治疗剂、治疗药物、预防剂、药物或制剂。如本文所用，术语“候选治疗剂”(也称为“候选制剂”或“测试制剂”)应包括但不限于化合物、去污剂、蛋白质、肽、拟肽、抗体、核酸、小分子、细胞因子或激素。
下面阐述的是本领域技术人员可用于实施本发明的药物发现的各方面。
D.1.可成药区域
在一个实施方案中，可成药区域包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690或其片段。这些残基在融合后构象中形成gB蛋白的结构域V或其一部分的结合口袋。如本文所使用的，术语“结合口袋”和“结合槽”应当具有相同的含义并且可以互换使用。
在另一个实施方案中，可成药区域包含融合环或其一部分。
另一方面，本发明涉及鉴定和设计与HCMV gB蛋白的活性或结合位点结合、相互作用或调节其功能或活性的调节剂的方法。
D.2.调节剂、调节剂设计和使用所述主题可成药区域的筛选
一方面，本发明提供了筛选所述主题可成药区域的潜在调节剂的方法，以及设计此类调节剂的方法。本发明的HCMV gB多肽的调节剂和其它结构相关的分子以及包含其的复合物可以如下所述以及使用本领域技术人员已知的技术和方法来鉴定和开发。本发明的调节剂可以用于例如抑制和治疗由HCMV引起的疾病。
一方面，本发明涉及与所述主题可成药区域相互作用从而降低HCMV活性的调节剂。在某些实施方案中，此类调节剂可以与病毒的可成药区域相互作用。在某些实施方案中，调节剂与gB多肽的结构域V的结合口袋相互作用，以阻止结构域V在所述结合口袋中结合，从而调节HCMV的活性。又一方面，本发明涉及调节剂，其是HCMV gB蛋白的结构域V的片段(或此类片段的同源物或此类片段的模拟物)并与可成药区域(即结构域V的结合口袋)竞争。一方面，调节剂包含结构域V的片段，其选自具有以下残基(Towne株)的片段：SEQ IDNO:1的M648-K700，M648-V697，S647-V697，S647-V663，I653-V697，I653-Q692，I653-L680，I653-S675，I653-Y667，R662-V697，R662-Q692，R662-L680，R662-S675，L664-F678，S668-V697，S668-Q692，S668-V677，D679-V697，L680-V697，L680-Q692，和R693-K700。更具体地，所述调节剂是具有以下残基的SEQ ID NO:1的片段：M648-K700(SEQ ID NO:260)，M648-V697(SEQ ID NO:261)，S647-V697(SEQ ID NO:262)，S647-V663(SEQ ID NO:263)，I653-V697(SEQ ID NO:264)，I653-Q692(SEQ ID NO:265)，I653-L680(SEQ ID NO:266)，I653-S675(SEQ ID NO:267)，I653-Y667(SEQ ID NO:268)，R662-V697(SEQ ID NO:269)，R662-Q692(SEQ ID NO:270)，R662-L680(SEQ ID NO:271)，R662-S675(SEQ ID NO:272)，L664-F678(SEQ ID NO:273)，S668-V697(SEQ ID NO:274)，S668-Q692(SEQ ID NO:275)，S668-V677(SEQ ID NO:276)，D679-V697(SEQ ID NO:277)，L680-V697(SEQ ID NO:278)，L680-Q692(SEQ ID NO:279)，和R693-K700(SEQ ID NO:280).
任何上述可成药区域的调节剂可以单独使用或以补充方法使用来治疗或预防HCMV感染。
本发明考虑了使用调节剂抑制HCMV生长或感染性的多种方法。例如，示例性方法涉及使HCMV gB蛋白与被认为或显示对此类病原体有效的调节剂接触。
例如，一方面，本发明涉及治疗患有HCMV感染的对象的方法，包括向对象施用有效调节HCMV的表达和/或活性的量的调节剂。本发明还涉及治疗患有HCMV感染的对象的方法，包括向感染的对象施用治疗有效量的使用本发明的方法之一鉴定的分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过刺激针对HCMV的免疫应答来预防对象中HCMV感染的方法。可以通过向对象施用有效调节HCMV的表达和/或活性的量的调节剂来刺激免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是保护性免疫应答，即，该应答降低CMV感染的风险或严重性或临床后果。对于一些特别有CMV感染和疾病风险的人群来说，刺激保护性免疫反应是特别需要的。例如，高危人群包括实体器官移植(SOT)患者、骨髓移植患者和造血干细胞移植(HSCT)患者。调节剂可以在移植前施用于移植供体，或在移植前和/或移植后施用于移植受者。由于母婴垂直传播是感染婴儿的常见来源，因此对怀孕或可能怀孕的妇女施用调节剂特别有用。
在某些情况下，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类。在一些实施方案中，所述人类是儿童，例如婴儿。在一些其它实施方案中，所述人类是女性，包括青春期女性、育龄女性、计划怀孕的女性、怀孕的女性和最近分娩的女性。在一些实施方案中，所述人类是移植患者。
对于非人哺乳动物(例如恒河猴、豚鼠或小鼠)的CMV，预期同源序列及其模拟物具有相同的性质并可用于这些非人哺乳动物的实验性、预防性或治疗性目的。由于CMV具有高度物种特异性，因此构建同源于HCMV结构域V的动物CMV(包括但不限于小鼠CMV、豚鼠CMV和恒河猴CMV)并测试其对于同源于gB的动物CMV活性的结合和抑制以及对于MCMV、gpCMV和rhCMV感染动物的抑制也在本发明计划中。
在另一个实施方案中，HCMV调节剂或抑制剂或含有其的生物复合物可以用于生产多种用途的药物，包括例如预防或治疗对象(包括人类和动物)的任何疾病或其它可治疗的病症，特别是由HCMV感染引起的疾病。
(i)调节剂设计
许多技术可用于筛选、鉴定、选择和设计能够与HCMV gB多肽、结构同源分子和其它分子结合的化学实体。根据本文所述的方法确定的HCMV gB多肽的结构知识使得可以设计和/或鉴定具有与HCMV gB多肽的构象互补的形状的分子和/或其它调节剂，或更具体地其可成药区域。应当理解，除了HCMV gB多肽的精确结构坐标和其它信息之外，此类技术和方法还可以使用上述其结构等同物(包括例如衍生自如上所述可成药区域中含有氨基酸的结构坐标的那些结构坐标)。
如本文所用，术语“化学实体”是指化学化合物、两种或更多种化学化合物的复合物、以及此类化合物或复合物的片段。在某些情况下，需要使用表现出广泛的结构和功能多样性的化学实体，例如呈现出不同形状(例如，扁平芳环、褶皱脂族环、具有单键、双键或三键的直链和支链脂族化合物)和多种官能团(例如，羧酸、酯、醚、胺、醛、酮和各种杂环)的化合物。
一方面，药物设计方法通常包括通过计算评估所选化学实体与本发明的任何分子或复合物(或其部分)结合的潜力。例如，这个方法可以包括以下步骤：(a)采用计算装置来执行所选化学实体和所述分子或复合物的可成药区域之间的拟合操作；以及(b)分析所述拟合操作的结果以量化所述化学实体与可成药区域之间的结合。
化学实体可以通过目视检查或通过使用诸如GRAM、DOCK或AUTODOCK等对接程序的计算机建模来检验(Dunbrack et al.,Folding&Design,2:27-42(1997))。这个程序可包括将化学实体与靶标进行计算机拟合，以确定每个化学实体的形状和化学结构将怎样补充或干扰HCMV gB多肽的结构(Bugg et al.,Scientific American,December:92-98(1993)；West et al.,TIPS,16:67-74(1995))。例如，还可以采用计算机程序来估算所述化学实体对可成药区域的吸引、排斥和空间位阻。一般来说，拟合越紧密(例如，空间位阻越低，和/或吸引力越大)，则所述化学实体就越有效力，因为这些性质与更紧密的结合常数一致。此外，化学实体设计的特异性越高，则该化学实体就越有可能不会干扰相关蛋白质，这可以最大限度地减少由于不需要的相互作用而导致的潜在副作用。
已知多种分子设计的计算方法，其中可成药区域的空间和电子性质用于指导化学实体的设计：Cohen et al.(1990)J.Med.Cam.33:883-894；Kuntz et al.(1982)J.Mol.Biol.161:269-288；DesJarlais(1988)J.Med.Cam.31:722-729；Bartlett et al.(1989)Spec.Publ.,Roy.Soc.Chem.78:182-196；Goodford et al.(1985)J.Med.Cam.28:849-857；和DesJarlais et al.J.Med.Cam.29:2149-2153。直接方法通常分为两类：(1)类比设计，其中使已知化学实体的3-D结构(例如来自晶体学数据库)对接至可成药区域并对拟合优度进行评分；以及(2)从头设计，其中将化学实体在可成药区域中分段构建。所述化学实体可以作为分子文库或数据库的一部分进行筛选。可以使用的数据库包括ACD(Molecular Designs Limited)、NCI(National Cancer Institute)、CCDC(CambridgeCrystallographic Data Center)、CAST(Chemical Abstract Service)、Derwent(DerwentInformation Limited)、Maybridge(Maybridge Chemical Company Ltd)、Aldrich(Aldrich Chemical Company)、DOCK(University of California in San Francisco)、及Directory of Natural Products(Chapman&Hall)。计算机程序如CONCORD(TriposAssociates)或DB-Converter(Molecular Simulations Limited)可用于将以二维表示的数据集转换为以三维表示的数据集。
可以测试化学实体在空间上与靶蛋白的可成药区域或其它部分拟合的能力。如本文所用，术语“空间拟合”是指化学实体的三维结构在几何上被可成药区域容纳。当化学实体的表面积与可成药区域的表面积非常接近而不形成不利的相互作用时，就会出现有利的几何拟合。当化学实体通过疏水性、芳香性、离子性、偶极性或氢供给和接受力相互作用时，会发生有利的互补相互作用。不利的相互作用可能是化学实体中的原子与可成药区域中的原子之间的空间位阻。
如果本发明的模型是计算机模型，则可以通过计算对接将化学实体定位在可成药区域中。另一方面，如果本发明的模型是结构模型，则可以通过例如手动对接将化学实体定位在可成药区域中。如本文所用，术语“对接”是指将化学实体放置在靠近可成药区域的过程，或发现化学实体/可成药区域复合物的低能量构象的过程。
在示例的实施方案中，潜在调节剂的设计从与HCMV gB多肽的可成药区域互补的形状的概观开始，并且采用能够扫描已知三维结构的小分子数据库的搜索算法搜索与靶可成药区域几何形状拟合的化学实体。大多数这种类型的算法提供了一种用于发现与HCMVgB多肽的可成药区域的形状互补的各式各样化学实体的方法。使用对接算法以各种几何允许的方向将来自特定数据库例如Cambridge Crystallographic Data Bank(CCDB)(Allenet al.(1973)J.Chem.Doc.13:119)的一组化学实体中的每一个化学实体都单独对接至HCMV gB多肽的可成药区域。在某些实施方案中，一组称为DOCK的计算机算法可用于表征形成可成药区域的活性位点和识别表面的内陷和沟槽的形状(Kuntz et al.(1982)J.Mol.Biol.161:269-288)。所述程序还可以在小分子数据库中搜索其形状与HCMV gB多肽的特定结合位点互补的模板(DesJarlais et al.(1988)J Med Chem31:722-729)。
评估所述方向的拟合优度，并保留最佳方向以使用分子力学程序(例如AMBER或CHARMM)进行进一步检验。此类算法之前已被证明可以成功发现与可药物区域形状互补的各种化学实体。
Goodford(1985,J Med Chem 28:849-857)和Boobbyer et al.(1989,J MedChem32:1083-1094)已经产生了计算机程序(GRID)，其试图确定可成药区域的不同化学基团(称为探针)的区域或高亲和力。因此，GRID提供了一种工具，用于建议对已知化学实体进行可增强结合的修饰。可以预期，经GRID辨别为高亲和力区域的一些位点对应于从一系列已知配体干扰性确定的“药效模式”。如本文所用，“药效模式”是被认为对于结合重要的化学实体的几何排列特征。已尝试使用药效模式作为新型配体的搜索筛选(Jakes et al.(1987)J Mol Graph 5:41-48；Brint et al.(1987)J Graph 5:49-56；Jakes et al.(1986)J Mol Graph 4:12-20)。
本发明的又一个实施方案利用诸如CLIX的计算机算法，其在诸如CCDB的数据库中搜索化学实体，该化学实体可以以空间上可接受的方式并且具有实现化学实体和周围的氨基酸残基之间有利的化学相互作用的高可能性的方式与可成药区域一起定向。所述方法基于根据不同化学基团的有利结合位置的集合来表征该区域，然后搜索导致各个候选化学基团与该集合的成员最大空间重合的化学实体的方向。CLIX的算法细节在Lawrence et al.(1992)Proteins 12:31-41中描述。
以这种方式，可以通过计算评估来测试和优化化学实体结合或干扰可成药区域的效力。例如，对于与可成药区域的有利结合，化学实体必须优选地表现出其结合态和纯净态之间相对较小的能量差异(即较小的结合变形能)。因此，某些更理想的化学实体将被设计为具有不大于约10kcal/mole、更优选地不大于7kcal/mole的结合变形能。化学实体可以与总结合能相似的一种以上构象的可成药区域相互作用。在这些情况下，结合的变形能被视为游离实体的能量与化学实体与靶标结合时观察到的构象的平均能量之间的差。
以这种方式，本发明提供了用于鉴定或设计HCMV gB多肽活性的潜在调节剂的计算机辅助方法，包括：为计算机建模应用程序提供分子或复合物的一组结构坐标，所述分子或复合物包括来自HCMV gB多肽的可成药区域的至少一部分；为计算机建模应用程序提供化学实体的一组结构坐标；以及确定所述化学实体是否预期结合所述分子或复合物，其中结合所述分子或复合物指示HCMV gB多肽活性的潜在调节。
另一方面，本发明提供了用于鉴定或设计HCMV gB多肽的潜在调节剂的计算机辅助方法，为计算机建模应用程序提供分子或复合物的一组结构坐标，所述分子或复合物包括HCMV gB多肽的可成药区域的至少一部分；为计算机建模应用程序提供化学实体的一组结构坐标；评估所述化学实体与所述分子或分子复合物的活性位点之间的潜在结合相互作用；对所述化学实体进行结构修饰以产生修饰的化学实体的一组结构坐标，并确定修饰的化学实体是否预期结合所述分子或复合物，其中结合所述分子或复合物指示HCMV gB多肽的潜在调节。
在一个实施方案中，可以通过筛选肽或其它化合物或化学文库来获得潜在的调节剂(Scott and Smith,Science,249:386-390(1990)；Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:6378-6382(1990)；Devlin et al.,Science,249:404-406(1990))。然后可以通过计算机建模程序系统地修饰以这种方式选择的潜在调节剂，直到鉴定出一种或多种有希望的潜在药物。这种分析已被证明在HIV蛋白酶调节剂的开发中是有效的(Lam et al.,Science263:380-384(1994)；Wlodawer et al.,Ann.Rev.Biochem.62:543-585(1993)；Appelt,Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48(1993)；Erickson,Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128(1993))。或者，可以从化合物文库中选择潜在的调节剂，例如可以从第三方(例如化学和制药公司)许可的那些文库选择。第三种选项是从头合成潜在的调节剂。
例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备HCMV gB多肽的潜在调节剂的方法，所述方法包括合成化学实体或含有该化学实体的分子以产生HCMV gB多肽的潜在调节剂，所述化学实体在计算机辅助程序期间鉴定出，包括向计算机建模应用程序提供分子或复合物的一组结构坐标，所述分子或复合物包括来自HCMV gB多肽的至少一个可成药区域；向计算机建模应用程序提供化学实体的一组结构坐标；并确定所述化学实体是否预期在活性位点例如可成药区域结合所述分子或复合物，其中与分子或复合物的结合指示潜在的调节。这种方法还可以包括评估所述化学实体与活性位点例如所述分子或分子复合物的可成药区域之间的潜在结合相互作用的步骤，并在结构上修饰所述化学实体以产生修饰的化学实体的一组结构坐标，这些步骤可以重复一次或多次。
一旦鉴定了潜在的调节剂，就可以在任何大分子的标准测定中对其进行测试，当然这取决于大分子，包括在高通量测定中测试。对调节剂结构的进一步细化通常是必要的，并且可以通过特定筛选测定提供的任何和/或所有步骤的连续迭代来进行，特别是通过例如15N NMR弛豫率测定或调节剂与HCMV gB多肽结合的X射线晶体学的进一步结构分析。这些研究可以与生化测定联合进行。
一旦鉴定，则潜在的调节剂可以用作模型结构，并且可以获得该化合物的类似物。然后筛选类似物结合HCMV gB多肽的能力。当潜在调节剂的类似物以比前体调节剂更高的结合亲和力与HCMV gB多肽结合时，可以选择该类似物作为调节剂。
在相关方法中，迭代药物设计用于鉴定靶蛋白的调节剂。迭代药物设计是一种通过确定和评估连续组蛋白质/调节剂复合物的三维结构来优化蛋白质和调节剂之间的结合的方法。在迭代药物设计中，获得一系列蛋白质/调节剂复合物的晶体，然后求解每个复合物的三维结构。这种方法可以深入了解每个复合物的蛋白质和调节剂之间的结合。例如，这个方法可以通过选择具有调节活性的调节剂、获得该新蛋白质/调节剂复合物的晶体、解析该复合物的三维结构、以及比较该新蛋白质/调节剂复合物与先前解析的蛋白质/调节剂复合物之间的结合来实现。通过观察所述调节剂的变化如何影响蛋白质/调节剂结合，可以优化这些结合。
除了如上所述设计和/或鉴定与可成药区域结合的化学实体之外，可以使用相同的技术和方法来设计和/或鉴定与蛋白质靶标的亲和区域、选择性区域或不希望的区域结合或不结合的化学实体。通过此类方法，可以实现对来自相同物种或多个物种的一个或几个靶标、或者可选地对多个靶标的选择性。
例如，可以设计和/或鉴定化学实体，其对于一个可成药区域(例如亲和区域或选择性区域)的结合能比另一区域(例如不期望的区域)的结合能更有利约20％、30％、50％至约60％或更多。可能会出现在以下之间观察到不同的情况：(a)两个以上区域之间，(b)同一靶标的不同区域(选择性、亲和力或不希望的区域)之间，(c)不同靶标的区域之间，(d)来自不同物种的同源物区域之间，或(e)其它组合之间。或者，可以通过参考所述化学实体与所讨论的两个或更多个区域的Kd、通常是表观Kd来进行比较。
另一方面，筛选与靶蛋白上两个邻近的可成药区域结合的潜在调节剂。例如，结合靶多肽的第一区域的调节剂不结合附近的第二区域。与第二区域的结合可以通过监测原始筛选或在第一区域的调节剂(或潜在调节剂)存在下进行的第二筛选中不同组酰胺化学位移的变化来确定。通过对化学位移变化的分析，鉴定了第二区域的潜在调节剂的大致位置。然后通过筛选结构相关的化合物(例如，如上所述的类似物)来优化与该区域结合的第二调节剂。当鉴定了第一区域和第二区域的调节剂时，可以通过实验确定其在三元复合物中的位置和方向。基于该结构信息，合成连接化合物，例如合并的调节剂，其中第一区域的调节剂和第二区域的调节剂是连接的。在某些实施方案中，两种调节剂共价连接以形成合并的调节剂。可以测试该合并的调节剂以确定其是否比两个单独的调节剂中的任何一个具有更高的靶结合亲和力。当合并的调节剂比两个调节剂中的任一调节剂对靶标具有更高的结合亲和力时，选择其作为调节剂。可以以类似的方式构建更大的合并调节剂，例如，连接与靶标上的三个附近区域结合的三个调节剂以形成多连接的合并调节剂，其对靶标具有比连接的调节剂更高的亲和力。在这个实例中，假设需要使调节剂结合到所有可成药区域。然而，可能是与某些可成药区域的结合是不希望的情况，因此可以使用相同的技术来鉴定基于与靶标的至少一个但不是所有可成药区域结合而表现出增加的特异性的调节剂和合并调节剂。
本发明提供了多种使用如上所述的药物设计的方法。例如，一方面，本发明考虑了设计用于筛选HCMV gB多肽调节剂的候选治疗剂的方法，所述方法包括：(a)确定结晶的HCMV gB多肽或其片段的三维结构；和(b)基于所述结晶的多肽或片段的三维结构设计候选治疗剂。
(ii)调节剂文库
组合文库的合成和筛选是鉴定和研究感兴趣的有机分子的有效策略。根据本发明，含有结合、相互作用或调节所述可成药区域的活性/功能的分子的文库的合成可以使用针对溶液相、固相或溶液相和固相组合的合成技术的已建立的组合方法来进行。。组合文库的合成是本领域熟知的并且已被综述(见例如，“Combinatorial Chemistry”,Chemicaland Engineering News,Feb.24,1997,p.43；Thompson et al.,Chem.Rev.(1996)96:555)。许多文库都是可商购的。本领域普通技术人员将认识到，任何具体实施方案的方法选择将取决于待合成的分子的具体数量、具体的反应化学以及具体仪器的可用性，例如用于制备和分析本发明的文库的机器人仪器设备。在某些实施方案中，根据其以高产率并且以立体选择性和区域选择性方式(如果适用)进行反应的能力选择待进行以产生文库的反应。
在本发明的一方面，使用溶液相技术生成本发明的文库。用于合成组合文库的溶液相技术的传统优点包括可进行更广泛的反应、相对容易地表征产物以及易于鉴定文库成员，如下所述。例如，在某些实施方案中，为了生成溶液相组合文库，利用平行合成技术，其中所有产物均在其自己的反应容器中单独组装。在特定的平行合成方法中，使用含有n行和m列小孔的微量滴定板，这些小孔能够容纳几毫升将在其中发生反应的溶剂。然后可以使用反应物A的n个变体(例如配体)和反应物B的m个变体(例如第二配体)，以在n×m个孔中获得n×m个变体。本领域普通技术人员将认识到，当需要较小的文库时，这一特定方法是最有用的，并且所述具体孔可以提供一种现成的手段来鉴定特定孔中的文库成员。
在本发明的其它实施方案中，利用固相合成技术。固相技术驱动反应完成，因为可以使用过量的试剂并且洗掉未反应的试剂。除了平行合成技术之外，固相合成还允许使用Furka开发的称为“均分和合并(split and pool)”的技术。见例如Furka et al.,Abstr.14th Int.Congr.Biochem.,(Prague,Czechoslovakia)(1988)5:47；Furka et al.,Int.J.Pept.Protein Res.(1991)37:487；Sebestyen et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.(1993)3:413。.在这种技术中，可以在同一反应容器中制备相关分子的混合物，从而显着减少合成非常大的文库(例如含有多达或超过一百万个文库成员的那些文库)所需的容器数量。作为示例，可以将附着有起始材料的固体支持物分成n个容器，其中n表示待与这种起始材料反应的试剂A的种类数。反应后，将n个容器中的内容物合并，然后分入m个容器中，其中m表示待与现在改性的起始材料反应的试剂B的种类数。重复这个程序过程直至所需数量的试剂与起始材料反应以产生本发明的文库。
本发明中固相技术的使用还可以包括使用特定编码技术的。Czarnik在CurrentOpinion in Chemical Biology(1997)1:60中对特定编码技术进行了综述。本领域普通技术人员还将认识到，如果在特定反应孔(例如96孔板)或塑料针(plastic pin)上产生较小的固相文库，则这些文库成员的反应历史也可以通过其在特定平板中的空间坐标而被鉴定，并因此被空间编码。在其它实施方案中，编码技术涉及使用附着于固体支持物的特定“鉴定剂”，其使得可以在不参考其空间坐标的情况下确定特定文库成员的结构。此类编码技术的示例包括但不限于空间编码技术、图形编码技术(包括“茶袋(tea bag)”方法)、化学编码方法和分光光度编码方法。本领域普通技术人员将认识到，必须基于所需的文库成员的数量和所采用的反应化学来选择本发明中使用的特定编码方法。
在某些实施方案中，本发明的分子可以使用本领域已知的固体支持化学来制备。例如，具有多达二十个或更多氨基酸的多肽可以使用标准固相技术在可商购设备(例如Advanced Chemtech多重有机合成仪)上产生。在某些实施方案中，起始材料或随后的反应物可以通过连接单元或直接连接至固相，并随后用于合成所需分子。连接的选择将取决于分子和固体支持单元的反应性以及这些连接的稳定性。如果希望文库成员不与固相支持物分离，则通过接头分子直接连接至固相支持物可能是有用的。例如，对于生物活性的直接珠分析，可能需要文库成员和固体支持物之间更强的相互作用。或者，如果需要更容易地将本发明的文库成员从固相支持物上裂解，则使用连接试剂可能是有用的。
关于本发明方法的自动化，可以使用多种仪器以允许容易且有效地制备本发明的化学文库，以及分析此类文库的成员的方法。一般而言，如在本发明化学文库的合成和制备时所使用的，自动化涉及使用仪器完成一个或多个必须重复多次的操作步骤，因为正在制备的是文库而不是单个分子。自动化的实例包括但不限于使仪器完成试剂的添加、试剂的混合和反应、反应混合物的过滤、用溶剂洗涤固体、溶剂的去除和添加等。自动化可以应用于反应方案中的任何步骤，包括制备、纯化和分析用于本发明的组合物中的分子的那些步骤。
一定范围的自动化是可能的。例如，所述文库的合成可以是完全自动化的或仅部分自动化的。如果完全自动化，除了根据需要重新填充试剂瓶或对仪器进行监测或编程之外，在开始合成程序后，可以通过仪器来制备所述文库库，无需任何人为干预。尽管所述文库的合成可以是完全自动化的，但可能需要人为干预来纯化、鉴定文库成员等。
相比之下，所述文库合成的部分自动化涉及一些机器人协助产生所述文库的反应方案的物理步骤，例如混合、搅拌、过滤等，但除了仅重新填充试剂瓶或对仪器进行监控或编程之外仍然需要一些人工干预。这种类型的机器人自动化与传统有机合成和生物技术提供的帮助不同，因为在部分自动化中，仪器仍然完成任何方案的一个或多个步骤，这些步骤需要多次完成，因为制备的是分子文库。
在某些实施方案中，可以在多个反应容器(例如，微量滴定板等)中制备所述文库，并且可以通过每个容器的位置来确文库的特定成员的身份。在其它实施方案中，所述文库可以在溶液中合成，并且通过使用反卷积技术，可以确定特定成员的身份。
在本发明的一方面，所述筛选方法可以利用固定的文库进行。在某些实施方案中，固定的文库将具有结合如上所述微生物的能力。合适的支持物的选择对于本领域技术人员来说是常规的。重要标准可包括支持物的反应性不干扰制备文库所需的反应。不溶性聚合支持物包括基于聚苯乙烯、聚苯乙烯/二乙烯苯共聚物等的官能化聚合物，包括本文所述的任何颗粒。应当理解，所述聚合支持物可以被包被、接枝或以其它方式结合至其它固体支持物。
在另一个实施方案中，所述聚合支持物可以由可逆可溶的聚合物提供。这种聚合支持物包括基于聚乙烯醇或聚乙二醇(PEG)的官能化聚合物。通过添加合适的惰性非溶剂可以使可溶的支持物成为不溶的(例如，可以使其沉淀)。使用可溶性聚合支持物进行的反应的优点之一是溶液中的反应比在不溶性聚合支持物上进行的反应更快、产率更高并且更完全。
一旦完成所需溶液相或固体支持物结合模板的合成，所述模板即可用于进一步反应以产生所需溶液相或固体支持物结合结构。固体支持物结合模板的使用使得能够使用更快速的均分和合并(split and pool)技术。
文库成员的表征可以使用标准分析技术进行，例如质谱法、核磁共振波谱法(包括195Pt和1H NMR)、色谱法(例如液相色谱法等)和红外光谱法。本领域普通技术人员将认识到，具体分析技术的选择将取决于本发明的文库成员是处于溶液相还是固相。除了这样的表征之外，还可以单独合成文库成员以允许更容易的鉴定。
(iii)体外测定
任何形式的HCMV gB多肽，例如包含靶可成药区域的全长多肽或其片段可用于在体外测定中评估候选治疗剂的活性。在此类测定的一个实施方案中，鉴定了调节可成药区域的生物活性、感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用或涉及主题可成药区域的蛋白质复合物的形成的制剂。在此类测定的另一个实施方案中，鉴定了与对象可成药区域结合或相互作用的制剂。在某些实施方案中，测试制剂是有机小分子。候选制剂可以选自例如以下类别的化合物：去污剂，蛋白质，肽，拟肽，抗体，小分子，细胞因子或激素。在一些实施方案中，候选治疗剂(也称为“候选制剂”或“测试制剂”)可以在化合物文库中。这些文库可以使用如上所述的组合合成方法来产生。在本发明的某些实施方案中，所述候选治疗剂结合靶可成药区域的能力可以通过体外测定来评估。在下一节中讨论的任一实施方案中，所述结合测定也可以是体内测定。
本发明还提供了筛选多种化合物以鉴定调节本发明的肽或多肽或编码所述肽或多肽的多核苷酸的作用的化合物的方法。筛选方法可以涉及高通量技术。例如，为了筛选调节剂，将包含HCMV gB多肽和这种多肽的标记底物或配体的合成反应混合物、细胞区室(例如膜、细胞包膜或细胞壁、或其任何制备物)、完整细胞或组织、或甚至完整生物体在不存在或存在候选治疗剂的情况下温育，所述候选治疗剂可以是HCMV gB多肽的调节剂。所述候选治疗剂调节HCMV gB多肽的能力反映在标记配体的结合减少或来自此类底物的产物产生减少。通过使用报告系统可以增强对底物产生产物的速率或水平的检测。在这方面可用的报告系统包括但不限于转化为产物的比色标记底物、响应于本发明的核酸或多肽活性的变化的报道基因、以及本领域已知的结合测定。例如，在一个实施方案中，使调节剂或抑制剂肽与FITC缀合，并且使用荧光偏振测定来测量FITC标记的肽对靶结合口袋的亲和力。所述调节剂或抑制剂对靶结合口袋的特异性可以通过使用所述调节剂或抑制剂的生物素化衍生物示出，使用Schmidt et al.((2010)PLoS Pathog 6(4):e1000851)描述的“下拉(pulldown)”方法来显示。为了检测与病毒粒子相关的调节剂或抑制剂，将生物素标记的调节剂或抑制剂与病毒粒子一起温育，并添加链霉亲和素树脂以通过免疫印迹进行检测。为了进一步确认调节剂或抑制剂与病毒粒子的关联，在存在调节剂或抑制剂的情况下使用芘标记的病毒粒子并检查准分子强度。在一个优选的实施方案中，荧光偏振和FRET是检测结构域V肽的结合和对该结合的抑制的方法。在进一步的实施方案中，使用表面等离子体共振来筛选所述调节剂或抑制剂与可成药区域的结合。
HCMV gB多肽调节剂测定的另一个实例是竞争性测定，其将HCMV gB肽或多肽和潜在调节剂与结合HCMV gB多肽的分子、结合HCMV gB多肽的重组分子、天然底物或配体、或底物或配体模拟物组合，在适当的条件下进行竞争性抑制测定。本发明的肽或多肽可以被标记，例如通过放射性或比色化合物标记，使得可以准确地测定与结合分子结合或转化为产物的HCMV gB肽或多肽的分子数，以评估潜在调节剂的有效性。一方面，HCMV gB肽是具有以下残基的SEQ ID NO:1的片段：M648-K700(SEQ ID NO:260)，M648-V697(SEQ ID NO:261)，S647-V697(SEQ ID NO:262)，S647-V663(SEQ ID NO:263)，I653-V697(SEQ ID NO:264)，I653-Q692(SEQ ID NO:265)，I653-L680(SEQ ID NO:266)，I653-S675(SEQ ID NO:267)，I653-Y667(SEQ ID NO:268)，R662-V697(SEQ ID NO:269)，R662-Q692(SEQ ID NO:270)，R662-L680(SEQ ID NO:271)，R662-S675(SEQ ID NO:272)，L664-F678(SEQ ID NO:273)，S668-V697(SEQ ID NO:274)，S668-Q692(SEQ ID NO:275)，S668-V677(SEQ ID NO:276)，D679-V697(SEQ ID NO:277)，L680-V697(SEQ ID NO:278)，L680-Q692(SEQ ID NO:279)，和R693-K700(SEQ ID NO:280)。
许多用于鉴定调节多肽活性的分子的方法是本领域已知的。例如，在一种这样的方法中，使HCMV gB多肽与测试化合物接触，并测定在所述测试化合物存在下HCMV gB多肽的活性，其中HCMV gB多肽的活性变化指示所述测试化合物调节HCMV gB多肽的活性。在某些情况下，测试化合物激动HCMV gB多肽的活性，而在其它情况下，测试化合物拮抗HCMV gB多肽的活性。
在另一个实例中，调节HCMV的HCMV gB多肽的依赖性生长或感染性的化合物可以通过以下方式鉴定：(a)将HCMV gB多肽与测试化合物接触；及(b)在所述测试化合物存在下测定多肽的活性，其中所述多肽活性的变化指示所述测试化合物可以调节HCMV的生长或感染性。
在某些本发明测定中，为了评估使用本发明组合物的结果，可以与已知分子进行比较，例如对靶标具有已知结合亲和力的分子。例如，可以测定已知的分子和新的感兴趣的分子。可以将所述复合物的测定结果的类型和量级与已知分子的结果进行比较。就所述复合物在测定中表现出的应答类型与已知分子的应答类型在定量方面不同而言，则此类复合物在所述测定中的结果将被视为阳性或阴性结果。在某些测定中，所述应答的量级可以表示为与已知分子结果的应答百分比，例如如果它们相同，则为100％已知结果。
如本领域技术人员将理解的，基于本发明描述，结合测定可用于检测结合多肽的制剂。无细胞测定可用于鉴定能够与多肽相互作用的分子。在一个优选的实施方案中，用于鉴定此类分子的无细胞测定基本上由含有靶标和测试分子或测试分子文库的反应混合物组成。测试分子可以是例如靶标的已知结合配偶体的衍生物，例如生物无活性肽或小分子。待测试其结合能力的制剂可以例如由细菌、酵母或其它生物体产生(例如天然产物)、化学产生(例如小分子，包括拟肽)或重组产生。在某些实施方案中，所述测试分子选自脂质、碳水化合物、肽、肽模拟物、肽核酸(PNA)、蛋白质(包括抗体)、小分子、天然产物、适体和寡核苷酸。在本发明的其它实施方案中，所述结合测定不是无细胞的测定。在优选的实施方案中，用于鉴定结合靶标的分子的此类测定包括含有靶标微生物和测试分子或测试分子文库的反应混合物。
在许多测试分子和天然提取物文库的候选筛选程序中，需要高通量测定，以使在给定时间段内测量的分子数量最大化。在无细胞系统中进行的本发明的测定，例如可以用纯化或半纯化的蛋白质或用裂解物衍生的无细胞系统，通常优选作为“初级”筛选，因为其可以被产生以允许快速进行和相对容易地检测靶标和测试分子之间的结合。此外，在体外系统中，所述测试分子的细胞毒性和/或生物利用度的影响通常可以被忽略，而测定主要集中于分子结合靶标的能力。因此，可以在通过细胞裂解物中感兴趣的功能相互作用的构建而产生的无细胞测定中检测潜在的结合分子。在另一种形式中，所述测定可以作为重建的蛋白质混合物而衍生，如下所述，与基于裂解物的测定相比提供了许多益处。
一方面，本发明提供了可用于筛选结合HCMV gB多肽成药区域的分子的测定法。在示例性结合测定中，使感兴趣的分子与由靶细胞表面多肽产生的混合物接触。与靶多肽的预期结合的检测和定量提供了确定分子结合靶标的效力的方式。可以通过从使用不同浓度的测试分子获得的数据中生成剂量应答曲线来评估所述分子的效力。此外，还可以进行对照测定以提供用于比较的基线。在对照测定中，在不存在所述测试分子的情况下对复合物的形成进行定量。
分子与靶HCMV gB多肽或含有HCMV gB多肽的微生物之间的复合物形成可以通过多种技术来检测，其中许多技术已在上面有效描述。例如，可以使用例如可检测标记的蛋白质(例如放射性标记、荧光标记或酶标记)、通过免疫测定或通过色谱检测来定量复合物形成中的调节。
因此，本发明的一种示例性筛选测定法包括使HCMV gB多肽或其功能片段与测试分子或测试分子文库接触并检测复合物形成的步骤。为了检测目的，例如可以将分子用特定标记物标记，并且将测试分子或测试分子文库用不同的标记物标记。然后可以在温育步骤和洗涤步骤之后通过测定这两种标记的水平来检测测试分子与多肽或其片段的相互作用。洗涤步骤后这两个标记的存在指示存在相互作用。还可以修改这样的测定法以用于整个靶细胞。
HCMV gB多肽靶标和分子之间的相互作用也可以通过使用实时BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor AB)来鉴定，其检测表面等离子体共振(SPR)，这是一种光学现象。检测取决于生物特异性界面处大分子质量浓度的变化，并且不需要对相互作用物进行任何标记。在一个实施方案中，可以将测试分子文库固定在传感器表面上，例如其形成微流动池的一个壁。然后使含有靶标的溶液连续流过所述传感器表面。在信号记录中显示的共振角的变化指示发生了相互作用。这种技术例如在Pharmacia的BIAtechnologyHandbook中进一步描述。
在优选的实施方案中，需要固定靶标以促进复合物与未复合形式的分离，以及适应测定的自动化。多肽与测试分子的结合可以在任何适合容纳反应物的容器中完成。实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供一种融合蛋白，其添加了允许靶标结合基质的结构域。例如，可以使谷胱甘肽-S-转移酶/多肽(GST/多肽)融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后将其与标记的测试分子组合(例如，S35标记的、P33标记的分子等)，并且将所述混合物在有利于复合物形成的条件下温育，例如在盐和pH的生理条件下，尽管可能需要稍微更严格的条件。温育后，将所述珠洗涤以去除任何未结合的标记，固定基质并直接测定放射性标记(例如将所述珠置于闪烁剂中)，或在随后解离复合物后在上清液中测定。或者，可以将复合物与基质解离，通过SDS-PAGE分离，并且在珠级分中发现的多肽或结合配偶体的水平使用例如在所附实施例中描述的标准电泳技术从凝胶中定量。还可以修改上述技术，其中将测试分子固定，并且将标记的靶标与固定的测试分子一起温育。在本发明的一个实施方案中，任选通过接头使所述测试分子固定至本发明的颗粒，例如以产生最终的组合物。
用于将靶标或分子固定在基质上的其它技术可用于本测定中。例如，可以利用生物素和链霉亲和素的缀合来固定靶标或分子。例如，生物素化的多肽分子可以通过使用本领域熟知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)中制备，并固定在链霉亲和素包被的96孔平板(Pierce Chemical)的孔中。或者，可以将与靶标或分子反应的抗体在所述平板孔中衍生，并且通过抗体缀合将靶标或分子捕获在孔中。如上所述，将测试分子的制备物在所述平板的多肽呈递孔中温育，并且可以对孔中捕获的复合物的量进行定量。用于检测此类复合物的示例性方法，除了上述针对GST固定的复合物描述的方法之外，还包括使用与所述复合物反应的抗体或与所述复合物组分之一反应的抗体对复合物进行免疫检测；以及依赖于检测与靶标或分子相关的酶活性(内在或外在活性)的酶联测定。在后者的情况下，所述酶可以与靶标或分子化学缀合或作为融合蛋白提供。为了示例说明，可以使靶多肽与辣根过氧化物酶化学交联或基因融合，并且捕获在与分子的复合物中的多肽的量可以用所述酶的显色底物来评估，例如3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐或4-氯-1-萘酚。同样，可以提供包含所述多肽和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，并且通过使用1-氯-2,4-二硝基苯检测GST活性来定量复合物形成(Habiget al(1974)J Biol Chem 249:7130)。
对于依赖于免疫检测来定量复合物中捕获的组分之一的方法，可以使用针对组分的抗体，例如抗多肽抗体。或者，复合物中待检测的组分可以以融合蛋白的形式被“表位标记”，除了所述多肽序列之外，融合蛋白还包括可容易获得其抗体的第二多肽(例如来自商业来源)。例如，上述GST融合蛋白也可用于使用抗GST部分的抗体来定量结合。其它可用的表位标签包括myc-表位(例如，参见Ellison et al.(1991)J Biol Chem266:21150-21157)，其包括来自c-myc的10个残基的序列，以及pFLAG系统(InternationalBiotechnologies,Inc.)或pEZZ-蛋白A系统(Pharmacia，NJ)。
在本测定的某些体外实施方案中，含有靶标的溶液包含至少半纯化蛋白质的重建蛋白质混合物。半纯化是指重建混合物中使用的组分已预先与其它细胞或病毒蛋白分离。例如，与细胞裂解物相反，靶蛋白质相对于所述混合物中的所有其它蛋白质以至少50％的纯度存在于所述混合物中，并且更优选地以90-95％的纯度存在。在本方法的某些实施方案中，重建的蛋白质混合物通过混合高度纯化的蛋白质而获得，由此重建的混合物基本上没有可能干扰或以其它方式改变测量结合活性的能力的其它蛋白质(例如细胞或病毒来源的蛋白质)。在一个实施方案中，使用重建的蛋白质混合物使得可以更仔细地控制靶标:分子相互作用条件。
在本发明的其它实施方案中，可以利用病毒融合或病毒感染性测定的变化来确定测试分子阻止表达HCMV gB多肽的病毒结合、融合或感染细胞的能力。如果融合、结合或感染被阻止，则该分子或组合物可用作治疗剂。
所有筛选方法都可以通过使用多种测定形式来完成。根据本公开，本文中未明确描述的内容仍然是本领域普通技术人员已知和理解的。如本领域技术人员基于本说明书将理解的，近似于诸如蛋白质复合物或蛋白质-核酸复合物的形成和酶活性的这种条件的测定形式可以以许多不同的形式产生，并且包括但不限于基于无细胞系统的测定，例如纯化的蛋白质或细胞裂解物，以及利用完整细胞的基于细胞的测定。测定由给定的靶标:分子相互作用产生的结合可以在任何适合容纳反应物的容器中完成。实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。任何测定均可以以试剂盒形式提供并且可以是自动化的。以下许多特定测定依赖于一般原理，例如阻断或阻止融合，这可能适用于其它特定测定。
(iv)体内测定
病毒感染和/或疾病的动物模型可用作体内测定，以评估潜在药物靶标在治疗或预防HCMV感染中的有效性。下面简要描述了许多合适的动物模型，然而，这些模型仅是示例，可以根据本发明的方法使用修改的或完全不同的动物模型。动物模型可以通过本领域已知的方法来开发，例如通过用HCMV感染动物，或通过对动物进行基因改造以使其易于这种感染(见例如，Maidji,E.et al.Impaired Surfactant Production by AlveolarEpithelial Cells in a SCID-hu Lung Mouse Model of Congenital HumanCytomegalovirus Infection.J Virol.2012Dec；86(23):12795–12805；Crawford,L.B.etal.Humanized Mouse Models of Human Cytomegalovirus Infection.Curr OpinVirol.2015Aug；13:86–92)。
此外，病毒感染性测定可用作体内测定以评估潜在药物靶标在治疗或预防HCMV感染中的有效性。例如，诸如测量病毒抗原的竞争性、不对称逆转录酶介导的PCR(RT-PCR)测定和流式细胞术测定以及噬菌斑测定可用于评估潜在药物靶标的有效性。
更进一步，细胞-细胞融合测定可用作体内测定以评估潜在药物靶标在治疗或预防HCMV感染中的有效性。
有多种其它体内模型可供使用，并且在适合特定病原体或特定测试剂时可以使用。
还需要注意的是，用于感染模型的动物种类以及该动物的特定基因组成可能有助于有效评估特定测试物质的效果。例如，在某些情况下，无免疫能力的动物可能比免疫能力强的动物更可取。例如，与无免疫能力的动物中的类似感染相比，有能力的免疫系统的作用可能在某种程度上掩盖了测试物质的作用。此外，事实上，许多机会性感染发生在免疫功能低下的患者中，因此在类似的免疫环境中建立感染模型是合适的。
E.药物组合物
本发明的药物组合物包括根据本发明鉴定的任何调节剂或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、佐剂或运载体。术语“药学上可接受的载体”是指在与组合物的其它成分相容且对其接受者无害的意义上是“可接受的”载体。
制备和使用此类药物组合物的方法也包括在本发明中。本发明的药物组合物可以经口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入的储库加以施用。如本文所用，术语胃肠外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
本文所述调节剂的约0.01至约100mg/kg体重/天、优选约0.5至约75mg/kg体重/天的剂量水平可用于预防和治疗由HCMV感染引起的疾病和病症，包括由本发明的多肽来源的致病物种介导的疾病和病症。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。典型的制剂将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。或者，此类制剂含有约20％至约80％的活性化合物。
F.试剂盒
本发明提供了用于治疗或预防HCMV感染的试剂盒。例如，试剂盒可包含含有本文鉴定为HCMV gB多肽调节剂的化合物的组合物。所述组合物可以是包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在涉及试剂盒的其它实施方案中，本发明考虑了包括本发明组合物和任选其使用说明书的试剂盒。试剂盒组分可以被包装以用于前述方法的手动或部分或完全自动化的实践中。此类试剂盒可具有多种用途，包括例如成像、诊断、治疗和其它应用。
G.多肽的制备
本文所述的多肽可以通过本领域已知的常规方法来制备，例如通过使用合适的载体在重组宿主系统中表达。合适的重组宿主细胞包括例如昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌和酵母细胞。合适的昆虫细胞的实例包括例如Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和HIGH FIVE细胞(源自亲本粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离株)。合适的哺乳动物细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞(HEK293或Expi 293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞和HeLa细胞。合适的禽类细胞包括例如鸡胚胎干细胞(例如EBx.RTM.细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鹌鹑成纤维细胞(例如ELL-O)和鸭细胞。合适的昆虫细胞表达系统例如杆状病毒载体系统是本领域技术人员已知的。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式商购。禽类细胞表达系统也是本领域技术人员已知的。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的。
许多用于在昆虫或哺乳动物细胞中表达重组蛋白的合适载体是本领域众所周知和常规的。合适的载体可以含有许多组分，包括但不限于以下的一种或多种：复制起点；选择标记基因；一种或多种表达控制元件，如转录控制元件(例如，启动子、增强子、终止子)，和/或一种或多种翻译信号；以及用于靶向选择的宿主细胞(例如，哺乳动物来源或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中的分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体例如PFASTBAC来产生重组杆状病毒颗粒。使所述杆状病毒颗粒扩增并用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用将驱动所述构建体在期望的哺乳动物宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)中表达的载体。
可以使用任何合适的方法纯化多肽。例如，通过免疫亲和色谱法纯化多肽的方法是本领域已知的。用于纯化期望的多肽的合适方法包括沉淀和各种类型的色谱法，例如疏水相互作用、离子交换、亲和力、螯合和尺寸排阻色谱法是本领域已知的。可以使用这些或其它合适方法中的两种或更多种方法来创建合适的纯化方案。如果需要，所述多肽可以包括有利于纯化的“标签”，例如表位标签或组氨酸标签。此类带标签的多肽可以例如通过螯合色谱法或亲和色谱法从条件培养基中纯化。
1.编码多肽的核酸
另一方面，本发明涉及编码本文所述多肽的核酸分子。这些核酸分子包括DNA、cDNA和RNA序列。所述核酸分子可以掺入载体，例如表达载体。
在一些实施方案中，所述核酸包括自我复制的RNA分子。在一些实施方案中，所述核酸包括修饰的RNA分子。在另一个方面，本发明涉及包含根据本文所述的任一实施方案的核酸的组合物。
2.化合物稳定的多肽
本发明人发现了在融合前构象中稳定的多肽，其可以通过例如双(芳基)硫脲化合物与HCMV gB的结合来鉴定，如WO2021/260510中所述，所述专利文献的全部内容通过引用并入本文。双(芳基)硫脲化合物，如结构1a、b(式I)所示，是高效且特异性的CMV抑制剂。一方面，HCMV gB多肽能够结合双(芳基)硫脲化合物。在优选的实施方案中，所述化合物不结合HCMV gB多肽的融合后构象。
在一个优选的实施方案中，所述化合物是其双(芳基)硫脲噻唑类似物。最优选地，在一些实施方案中，所述化合物是N-{4-[({(1S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}硫代氨基甲酰基)氨基]苯基}-1,3-噻唑-4-甲酰胺，具有以下结构：
在另一个实施方案中，所述化合物具有以下结构：
在一些实施方案中，所述多肽包括HCMV gB融合前表位，其不存在于天然HCMV gB融合后构象中。
在一些实施方案中，同质群体中至少约90％的多肽(例如至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的多肽)被双(芳基)硫脲化合物(例如，双(芳基)硫脲化合物的噻唑类似物，更优选N-{4-[({(1S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}硫代氨基甲酰基)氨基]苯基}-1,3-噻唑-4-甲酰胺)结合。在一些实施方案中，可以结合双(芳基)硫脲化合物的多肽不具有融合后构象。相反，所述多肽具有融合前构象，例如HCMV gB融合前构象。
在另一个实施方案中，所述多肽可以是至少80％分离的，至少90％、95％、98％、99％或优选99.9％分离自与双(芳基)硫脲化合物不特异性结合的HCMV gB多肽。
3.包含多肽的组合物及其使用方法
本发明涉及使用本文描述的调节剂的组合物和方法。例如，本发明的调节剂可以作为免疫原性组合物的组分直接递送。或者，如果调节剂包含氨基酸，则可以施用编码本发明的氨基酸序列的核酸以在体内产生肽、多肽或免疫原性片段。某些优选的实施方案，例如含有编码多肽的序列的蛋白质制剂、重组核酸(例如，DNA、RNA、自复制RNA或其任何变体)和病毒载体(例如，活的、单轮的、非复制性组装的病毒离子或其它病毒样颗粒，或甲病毒属VRP)，在本文中进一步描述并且可以包含在所述组合物中。
一方面，本发明提供了包含本文所述调节剂的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可包含另外的CMV蛋白，例如gO、gH、gL、pUL128、pUL130、pUL131、pp65、其免疫原性片段或其组合。例如，所述调节剂可以与CMV五聚体复合物组合，所述CMV五聚体复合物包含：gH或其五聚体形成片段、gL或其五聚体形成片段、pUL128或其五聚体形成片段、pUL130或其五聚体形成片段，和pUL131或其五聚体形成片段。本发明的调节剂还可与CMV三聚体复合物组合，所述CMV三聚体复合物包含：gH或其三聚体形成片段、gL或其三聚体形成片段、以及gO或其三聚体形成片段。
另一方面，本发明涉及包含可在哺乳动物中引发免疫应答的多核苷酸的组合物。所述多核苷酸编码至少一种感兴趣的多肽，例如抗原。本文公开的抗原可以是野生型的(即，源自感染原)或优选是修饰的(例如，工程化的、设计的或人工的)。在一些实施方案中，本文描述的核酸分子、特别是多核苷酸，编码一种或多种感兴趣的肽或多肽。此类肽或多肽可以充当抗原或抗原分子。术语“核酸”包括任何包含核苷酸聚合物的化合物。这些聚合物被称为“多核苷酸”。本发明的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)，包括mRNA，和脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，所述组合物包含编码本文所述的多肽或其片段的DNA。在一些实施方案中，所述组合物包含编码本文所述的多肽或其片段的RNA。在一些实施方案中，所述组合物包含编码本文所述的多肽或其片段的mRNA多核苷酸。此类组合物可在翻译时产生适当的蛋白质构象。
一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列的至少一个氨基酸突变。
一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种编码多肽的DNA多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列的至少一个氨基酸突变。
一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少一种编码多肽的RNA多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列的至少一个氨基酸突变。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码至少一种hCMV gB多肽或其免疫原性片段或表位的至少一种多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含编码两种或更多种抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包含编码两种或更多种抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的两种或更多种多核苷酸。所述一种或多种抗原性多肽可以在单个多核苷酸上编码，或者可以在多个(例如，两个或更多个)多核苷酸上单独编码。
另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV糖蛋白B(gB)的氨基酸序列的至少一个引入的氨基酸突变；及(b)编码另外的多肽的多核苷酸。
另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV糖蛋白B(gB)的氨基酸序列的至少一个引入的氨基酸突变；及(b)编码另外的多肽、优选HCMV抗原性多肽的多核苷酸。所述另外的多肽可以选自HCMV gH、gL、gB、gO、gN和gM及其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV pp65。在一些实施方案中，所述另外的多肽可以选自gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131A及其片段。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gH多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gL多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gB多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gO多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gN多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是HCMV gM多肽。在一些实施方案中，所述另外的多肽是变体gH多肽、变体gL多肽或变体gB多肽。在一些实施方案中，变体HCMV gH、gL或gB多肽是缺少一个或多个以下结构域序列的截短的多肽：(1)疏水性近膜结构域，(2)跨膜结构域，和(3)胞质结构域。在一些实施方案中，截短的HCMV gH、gL或gB多肽缺少疏水性近膜结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一些实施方案中，截短的HCMV gH、gL或gB多肽仅包括胞外域序列。在一些实施方案中，抗原性多肽是选自UL83、UL123、UL128、UL130和UL131A的HCMV蛋白或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，抗原性多肽是HCMV UL83多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是HCMV UL123多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是HCMV UL128多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是HCMV UL130多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是HCMV UL131多肽。
另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV糖蛋白B(gB)的氨基酸序列的至少一个引入的氨基酸突变；及(b)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:211-223中任一序列的另外的多肽的多核苷酸。另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV糖蛋白B(gB)的氨基酸序列的至少一个引入的氨基酸突变；及(b)具有选自SEQ ID NO:141-210中任一序列的多核苷酸。另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含(a)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV糖蛋白B(gB)的氨基酸序列的至少一个引入的氨基酸突变；及(b)具有选自SEQ ID NO:211-223中任一氨基酸序列的另外的多肽。在一些实施方案中，编码另外的多肽的多核苷酸包括至少一个选自SEQ ID NO:224-254中任一序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码另外的多肽的多核苷酸包括至少一个选自SEQ ID NO:141-147中任一序列的核酸序列。在一些实施方案中，编码另外的多肽的多核苷酸具有选自SEQ ID NO:220-223中任一序列的至少一个序列。
在一些实施方案中，抗原性多肽包括两种或更多种HCMV蛋白、其片段或表位。在一些实施方案中，抗原性多肽包括两种或更多种糖蛋白、其片段或表位。在一些实施方案中，抗原性多肽包括至少一种HCMV多肽、其片段或表位以及至少一种其它HCMV蛋白、其片段或表位。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽由单种RNA多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽由两种或更多种RNA多核苷酸编码，例如，每种HCMV多肽由单独的RNA多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽可以是HCMV gH、gL、gB、gO、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白包括pp65或其免疫原性片段或表位；以及HCMV gH、gL、gB、gO、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的任何组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白可以是HCMV gB与选自gH、gL、gO、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的一种或多种HCMV多肽的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白可以是HCMV gH和选自gL、gO、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的一种或多种HCMV多肽的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白可以是HCMV gL和选自gB、gH、gO、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的一种或多种HCMV多肽的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是gB和gH。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是gB和gL。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是gH和gL。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是gB、gL和gH。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV蛋白可以是HCMV UL83、UL123、UL128、UL130和UL131A多肽或其免疫原性片段或表位的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是UL123和UL130。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是UL123和131A。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是UL130和131A。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是UL128、UL130和131A。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV蛋白可以是HCMV gB、gH、gL、g0、gM、gN、UL83、UL123、UL128、UL130和UL131A多肽或其免疫原性片段或表位的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白可以是HCMV gH和选自gL、UL128、UL130和UL131A多肽或其免疫原性片段或表位的一种或多种HCMV多肽的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种糖蛋白可以是HCMV gL和选自gH、UL128、UL130和UL131A多肽或其免疫原性片段或表位的一种或多种HCMV多肽的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV多肽是gL、gH、UL128、UL130和131A。在其中组合物包含两种或更多种HCMV蛋白的任何这些实施方案中，HCMV gH可以是变体gH，例如本文公开的任何变体HCMV gH糖蛋白，例如本文公开的任何变体HCMVgH。在其中组合物包含两种或更多种HCMV蛋白的这些实施方案的任一种中，HCMV gB可以是变体gB，例如本文公开的任何变体HCMV gB糖蛋白，例如本文公开的任何变体HCMV gB。在其中组合物包含两种或更多种HCMV gL蛋白的任何这些实施方案中，HCMV gL可以是变体gL，例如本文公开的任何变体HCMV gL糖蛋白，例如本文公开的任何变体HCMV gL。
在某些实施方案中，其中所述组合物包含编码两种或更多种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的两种或更多种RNA多核苷酸(由单种RNA多核苷酸编码或由两种或更多种RNA多核苷酸编码，例如每种蛋白质由单独的RNA多核苷酸编码)，所述两种或更多种HCMV蛋白是变体gB，例如本文公开的任何变体gB多肽，以及选自gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131多肽或其免疫原性片段或表位的HCMV蛋白。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV蛋白是变体gH，例如本文公开的任何变体gH多肽，以及选自gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131A多肽或其免疫原性片段或表位的HCMV蛋白。在一些实施方案中，所述两种或更多种HCMV蛋白是变体gH，例如本文公开的任何变体gH多肽，以及选自gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131多肽或其免疫原性片段或表位的HCMV蛋白。在其中变体HCMV蛋白是变体HCMV gB、变体HCMV gL和变体HCMV gH的一些实施方案中，变体HCMV多肽是选自以下截短多肽的截短多肽：缺少疏水近膜结构域；缺少跨膜结构域；缺少细胞质结构域；缺少疏水性近膜结构域、跨膜结构域和细胞质结构域中的两种或多种结构域；以及仅包括胞外域。在一些实施方案中，所述组合物包含编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的多聚体RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包含编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的至少一种RNA多核苷酸，其中RNA多核苷酸的5’UTR包括模式化UTR。在一些实施方案中，模式化UTR具有重复或交替的模式，例如重复一次、两次或三次以上的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表在核苷酸水平的不同UTR。在一些实施方案中，RNA多核苷酸(例如，第一核酸)的5’UTR具有与另一RNA多核苷酸(第二核酸)的UTR互补的区域。例如，寻求连接(例如，在多聚体分子中)的两个多核苷酸的UTR核苷酸序列可以被修饰以包括互补区域，使得两个UTR杂交以形成多聚体分子。在一些实施方案中，编码HCMV抗原性多肽的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成多聚序列。在一些实施方案中，编码选自UL128、UL130、UL131的HCMV蛋白的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成多聚序列。在一些实施方案中，编码HCMV多肽的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成多聚序列。在一些实施方案中，编码选自gH、gL、gB、gO、gM和gN的HCMV多肽的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成多聚序列。在任何这些实施方案中，多聚体可以是二聚体、三聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。因此，在一些实施方案中，编码选自gH、gL、gB、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131的HCMV蛋白的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成二聚体。在一些实施方案中，编码选自gH、gL、gB、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131A的HCMV蛋白的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成三聚体。在一些实施方案中，编码选自gH、gL、gB、gO、gM、gN、UL128、UL130和UL131的HCMV蛋白的RNA多核苷酸的5’UTR被修饰以允许形成五聚体。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种RNA多核苷酸，其具有编码两种或更多种(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的单一开放阅读框。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种RNA多核苷酸，其具有多于一个开放阅读框，例如编码两种、三种、四种、五种或更多种HCMV抗原性多肽的两个、三个、四个、五个或更多个开放阅读框。在这些实施方案的任一个中，至少一种RNA多核苷酸可编码选自gH、gB、gL、g0、gM、gN、UL83、UL123、UL128、UL130、UL131A及其片段或表位的两种或更多种HCMV抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码UL83和UL123。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码gH和gL。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码UL128、UL130和UL131。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码gH、gL、UL128、UL130和UL131。在其中至少一种RNA多核苷酸具有编码两种或更多种(例如，两种、三种、四种、五种或更多种)HCMV抗原性多肽的单个开放阅读框的一些实施方案中，所述RNA多核苷酸进一步包含另外的序列，例如，接头序列或有助于HCMV RNA转录物或多肽加工的序列，例如切割位点序列。在一些实施方案中，所述另外的序列可以是蛋白酶序列，例如弗林蛋白酶序列。在一些实施方案中，所述另外的序列可以是自切割2A肽，例如P2A、E2A、F2A和T2A序列。在一些实施方案中，接头序列和切割位点序列散布在编码HCMV多肽的序列之间。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸包括选自本文公开的任一核酸序列的任何核酸序列，或其与本文公开的核酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)相同性的同源物。在一些实施方案中，所述开放阅读框被编码为密码子优化的。一些实施方案包括一种组合物，该组合物包含编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段的至少一种RNA多核苷酸和至少一个5’末端帽。在一些实施方案中，5’末端帽是7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。
在一些实施方案中，所述至少一种多核苷酸包括选自SEQ ID NO:141-210中任一序列的核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种多核苷酸编码与SEQ ID NO:211-223中任一氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些优选的实施方案中，所述组合物不包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:216的多肽。在一些优选的实施方案中，所述组合物不包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:216的多核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述组合物不包含具有序列SEQ ID NO:152的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种多核苷酸，其中所述至少一种多核苷酸具有至少一种化学修饰。在一些实施方案中，所述至少一种多核苷酸还包括第二化学修饰。优选地，所述多核苷酸是RAN。在一些实施方案中，具有至少一种化学修饰的至少一种多核苷酸具有5’末端帽。在一些实施方案中，所述至少一种化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-0-甲基尿苷。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种多核苷酸，其中开放读码框中至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％、100％)的尿嘧啶具有化学修饰，任选其中所述组合物在脂质纳米颗粒中配制。在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰位于尿嘧啶的5-位置。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，由所述多核苷酸(例如，在mRNA组合物中)编码的另外的多肽或免疫原性片段选自gB、gH、gL、gO、gM、gN、UL83、UL123、UL128、UL130、UL131A、pp65和IE1抗原。
在一些实施方案中，将第一组合物和第二组合物施用给哺乳动物。在一些实施方案中，第一组合物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列的引入的至少一个氨基酸突变；第二组合物包含编码HCMV pp65或其抗原片段或表位的多核苷酸。在一些实施方案中，第一组合物包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含相对于野生型HCMV gB的氨基酸序列的引入的至少一个氨基酸突变；第二组合物包含编码至少一种多核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸编码选自HCMV gH、gL、UL128、UL130和UL131或其抗原片段或表位的另外的多肽。
另一方面，本发明涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物施用有效诱导免疫应答的量的组合物，其中所述组合物包含编码野生型HCMV gB的调节剂的多核苷酸。。
在一些实施方案中，免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。在一些实施方案中，免疫应答包括T细胞应答和B细胞应答。在一些实施方案中，所述方法涉及单次施用所述组合物。在一些实施方案中，方法还包括向对象施用加强剂量的所述组合物。包含本文公开的多核苷酸的组合物可以以有效量配制以在哺乳动物中产生抗原特异性免疫应答。
所述免疫原性组合物可包含佐剂。增强组合物效力的示例性佐剂包括：(1)铝盐(alum)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳液制剂(含有或不含其它特定佐剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59(PCT公开号WO 90/14837)，含有5％角鲨烯、0.5％ TWEEN 80和0.5％ Span 85，使用高压微射流均质机(microfluidizer)配制为亚微粒，(b)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％ Tween 80、5％ Pluronic封闭的聚合物L121和thr-MDP，或者微流化成亚微粒乳液或者涡旋产生更大粒径的乳液，以及(c)RIBITM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)，含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种选自单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(DETOXTM)；(3)皂苷佐剂，例如QS-21、STIMULONTM(CambridgeBioscience，Worcester，Mass.)，可以使用其或由其产生的颗粒例如ISCOM(免疫刺激复合物)、ALFQ；(4)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白细胞介素(IL-1、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；以及(6)充当佐剂以增强所述组合物效力的其它物质。在一个优选的实施方案中，所述佐剂是皂苷佐剂，即包含QS-21。在一些实施方案中，所述组合物不包含佐剂。在一些实施方案中，所述组合物还包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述组合物在纳米颗粒中配制。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含阳离子或聚阳离子化合物，包括鱼精蛋白或其它阳离子肽或蛋白质，例如聚-L-赖氨酸(PLL)。
本文讨论的每种免疫原性组合物可以单独使用或与一种或多种其它抗原组合使用，后者来自相同的病毒病原体或来自另一种或多种病原体来源。这些组合物可用于预防(以防止感染)或治疗(以治疗感染后的疾病)目的。
在一个实施方案中，所述组合物可以包含“药学上可接受的载体”，所述载体包括本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(例如油滴或脂质体)和失活的病毒颗粒。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。另外，这些载体可以起到佐剂的作用。进一步地，抗原可以与细菌类毒素缀合，例如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素。
在一个实施方案中，所述组合物包含稀释剂，例如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可以存在于此类运载体中。
本文所述的组合物可包含免疫有效量的多肽或多核苷酸，以及根据需要的任何其它上述组分。“免疫有效量”是指以单次剂量或作为系列剂量的一部分向个体施用的量可有效引发免疫应答。引发的免疫应答可能足以例如治疗和/或预防和/或减少病症、感染或疾病的发生率。这个量根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群(例如，非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的配方、主治医生对医疗状况的评估以及其它相关因素而变化。预计该量将落在一个相对较宽的范围内，该范围可以通过常规试验确定。
所述组合物可以肠胃外施用，例如通过皮下或肌内注射。在一些实施方案中，通过皮内或肌内注射将所述组合物施用于哺乳动物。适合其它施用模式的其它配制剂包括口服和经肺部制剂、经鼻制剂、栓剂和透皮应用。对于某些病毒蛋白来说，口服制剂可能是优选的。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。所述免疫原性组合物可以与其它免疫调节剂联合施用。
另一方面，本发明提供了引发针对巨细胞病毒的免疫应答的方法，包括向有需要的对象施用免疫有效量的本文所述的多肽和/或免疫原性组合物，所述组合物其包含如上所述蛋白质、DNA分子、RNA分子(例如，自我复制的RNA分子)或VRP。在某些实施方案中，免疫应答包括产生针对CMV的中和抗体。
所述免疫应答可包括体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或两者。在一些实施方案中，针对每种递送的CMV蛋白诱导免疫应答。细胞介导的免疫应答可包括辅助T细胞(Th)应答、CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答或两者。在一些实施方案中，所述免疫应答包括体液免疫应答，并且所述抗体是中和抗体。
中和抗体阻断细胞的病毒感染。CMV感染上皮细胞和成纤维细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答减少或预防这两种细胞类型的感染。中和抗体应答可以是补体依赖性的或补体非依赖性的。在一些实施方案中，中和抗体应答是补体非依赖性的。在一些实施方案中，中和抗体应答是交叉中和；即，针对施用的组合物产生的抗体中和除组合物中使用的毒株之外的毒株的CMV病毒。
本文所述的多肽和/或免疫原性组合物还可以引发有效的免疫应答以降低未感染的哺乳动物的CMV感染的可能性，或减轻感染的哺乳动物的症状，例如减少爆发的次数、CMV脱落、以及将病毒传播给其它哺乳动物的风险。
一方面，本发明涉及减少哺乳动物中CMV病毒排放的方法。在一些实施方案中，本发明涉及减少哺乳动物尿液中CMV病毒排放的方法。在一些实施方案中，本发明涉及减少哺乳动物唾液中CMV病毒排放的方法。另一方面，本发明涉及降低哺乳动物中CMV病毒滴度的方法。一方面，本发明涉及减少哺乳动物血清中CMV核酸的方法。术语“病毒排放”在本文中根据其在医学和病毒学中的普通含义使用，并且是指病毒从受感染的细胞中产生和释放。在一些实施方案中，病毒从哺乳动物的细胞中释放。在一些实施方案中，病毒从受感染的哺乳动物释放到环境中。在一些实施方案中，病毒从哺乳动物体内的细胞中释放。
一方面，本发明涉及减少哺乳动物中CMV病毒排放的方法。所述方法包括将本文所述的修饰的CMV gB多肽和/或免疫原性组合物施用给感染CMV或处于CMV感染风险的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物中CMV病毒排放的减少是与未施用修饰的CMV gB的哺乳动物中的病毒排放相比的结果。在另一个实施方案中，哺乳动物中CMV病毒排放的减少是与单独施用CMV五聚体后或在不存在所述多肽的情况下施用CMV五聚体后的病毒排放相比的结果。
在一些实施方案中，所述哺乳动物是人类。在一些实施方案中，所述人类是儿童，例如婴儿。在一些其它实施方案中，所述人类是女性，包括青春期女性、育龄女性、计划怀孕的女性、怀孕的女性和最近分娩的女性。在一些实施方案中，所述人类是移植患者。
在一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是人CMV毒株。在一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株与衍生所述多肽的CMV毒株同源。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株与CMV株VR1814同源。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株与CMV Towne株同源。
在一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是与衍生修饰的CMV gB多肽的CMV毒株异源的人CMV毒株。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是与VR1814 CMV毒株异源的人CMV毒株。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是VR1814 CMV株。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是与CMV Towne株异源的人CMV株。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是CMV Towne株。
在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是与猕猴疱疹病毒3分离株21252CMV株同源的恒河猴CMV株。在另一个实施方案中，挑战的巨细胞病毒株是猕猴疱疹病毒3分离株21252CMV株。
本领域中抗体效力的可用量度是“50％中和滴度”。抗体效力的另一种可用量度是以下任一项：“60％中和滴度”；“70％中和滴度”；“80％中和滴度”；和“90％中和滴度”。例如，为了确定50％中和滴度，将来自免疫动物的血清进行稀释，以评估稀释的血清如何仍能保留阻止50％感染性病毒进入细胞的能力。例如，滴度为700意味着血清在稀释700倍后仍保留中和50％感染性病毒的能力。因此，滴度越高表明中和抗体应答越有效。在一些实施方案中，这个滴度的下限为约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500或约7000。所述50％、60％、70％、80％或90％中和滴度范围可具有以下上限：约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500、约7000、约8000、约9000、约10000、约1 1000、约12000、约13000、约14000、约15000、约16000、约17000、约18000、约19000、约20000、约21000、约22000、约23000、约24000、约25000、约26000、约27000、约28000、约29000或约30000。例如，50％中和滴度可为约3000至约6500。“约”意指所列举值的加或减10％。中和滴度可以如下文具体实施例中所述进行测量。
可以通过向个体(通常是哺乳动物，包括人)施用蛋白质、DNA分子、RNA分子(例如，自我复制的RNA分子或核苷修饰的RNA分子)或VRP来刺激免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是保护性免疫应答，即，该应答降低CMV感染的风险或严重性或临床结果。对于一些特别具有CMV感染和疾病风险的人群来说，刺激保护性免疫应答是特别需要的。例如，高危人群包括实体器官移植(SOT)患者、骨髓移植患者和造血干细胞移植(HSCT)患者。VRP可以施用于移植前的移植供者，或施用于移植前和/或后的移植受者。由于母婴垂直传播是婴儿感染的常见来源，因此对怀孕或可能怀孕的妇女施用VRP特别有用。
可以使用任何合适的施用途径。例如，组合物可以经肌内、腹膜内、皮下或经皮施用。一些实施方案是通过粘膜内途径施用，例如口腔内、鼻内、阴道内和直肠内。组合物可以根据任何合适的时间表施用。
本文还提供了抑制巨细胞病毒进入细胞的方法，包括使所述细胞与本文所述的组合物接触。
一方面，本发明涉及包含上述调节剂的组合物。另一方面，本发明涉及包含编码此类调节剂的核酸分子或载体的组合物。另一方面，本发明涉及包含上述调节剂和编码此类调节剂的核酸分子或载体的组合物。
在一些实施方案中，所述组合物是能够在对象中引发针对CMV的免疫应答的免疫原性组合物。在一些具体实施方案中，所述免疫原性组合物是药物组合物，其包含本发明提供的调节剂和药学上可接受的载体。在其它实施方案中，所述药物组合物是疫苗。
在一些实施方案中，组合物例如免疫原性组合物或疫苗包含两种或更多种上述不同的调节剂。所述两种或更多种不同的调节剂可以包括相同的引入的氨基酸突变，但可以衍生自来自不同HCMV毒株或亚型的gB。在另一实施方案中，所述两种或更多种不同的调节剂可以包括与天然HCMV gB相比彼此不同的氨基酸突变。
在优选的实施方案中，所述调节剂可溶于水溶液。在一些实施方案中，所述调节剂可溶于缺少去污剂的溶液中。
4.抗体和诊断用途
上述调节剂可用于产生多克隆和单克隆抗体。如果需要多克隆抗体，则用免疫原性调节剂对选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、豚鼠、马等)进行免疫。根据已知程序收集并处理来自免疫动物的血清。如果含有针对CMV表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲和色谱法来纯化所述多克隆抗体。用于生产和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。
本领域技术人员也可以容易地产生针对CMV表位的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是已知的。产生抗体的永生细胞系可以通过细胞融合来创建，也可以通过其它技术来创建，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染。可以筛选针对CMV表位产生的单克隆抗体组的各种性质；即同种型、表位亲和力等。
针对CMV表位的单克隆和多克隆抗体特别用于诊断中，而中和抗体则可用于被动免疫治疗。特别地，单克隆抗体可用于产生抗独特型抗体。
与含有CMV抗体的血清发生免疫反应的调节剂以及针对这些调节剂产生的抗体都可用于免疫测定中以检测生物样品(包括例如血液或血清样品)中CMV抗体的存在或病毒的存在。免疫测定的设计存在大量变化，并且其中多种变化是本领域已知的。例如，免疫测定可以利用具有SEQ ID NO:2-43中任一项所示序列的多肽。
或者，免疫测定可以使用源自本文所述多肽的病毒抗原的组合。例如，可以使用针对至少一种本文所述多肽的单克隆抗体、针对本文所述多肽的单克隆抗体的组合、针对不同病毒抗原的单克隆抗体、针对本文所述多肽的多克隆抗体或针对不同病毒抗原的多克隆抗体。方案可以基于例如竞争或直接反应，或者可以是夹心型测定。方案还可以例如使用固体支持物，或者可以通过免疫沉淀进行。大多数测定涉及使用标记的抗体或多肽；所述标记可以是例如荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。放大来自探针的信号的测定也是已知的；其实例是利用生物素和抗生物素蛋白的测定，以及酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA测定。
适合于免疫诊断并包含适当标记的试剂的试剂盒通过将适当的材料包装在适当的容器中来构建，所述材料包括含有CMV表位或针对表位的抗体的本发明的多肽，以及进行测定所需的其余试剂和材料，以及一套合适的测定说明书。
多核苷酸探针也可以包装在诊断试剂盒中。诊断试剂盒包括可以被标记的探针DNA；或者，探针DNA可以是未标记的，并且用于标记的成分可以包括在试剂盒中。试剂盒还可以包含特定杂交方案所需的其它适当包装的试剂和材料，例如标准品以及进行测试的说明书。
本公开的一些实施方案提供了一种HCMV疫苗，其包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸和至少一个5’末端帽，所述核糖核酸(RNA)多核苷酸具有编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框。在一些实施方案中，5’末端帽是7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。
本公开的一些实施方案提供了包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸的HCMV疫苗，所述核糖核酸(RNA)多核苷酸具有编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸具有至少一种化学修饰。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸还包含第二化学修饰。在一些实施方案中，具有至少一种化学修饰的至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸具有5’末端帽。在一些实施方案中，所述至少一种化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，所述化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
本公开的一些实施方案提供了包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸的HCMV疫苗，所述核糖核酸(RNA)多核苷酸具有编码至少一种HCMV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述开放阅读框中至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％、100％)的尿嘧啶具有化学修饰，任选其中所述疫苗在脂质纳米颗粒中配制。在一些实施方案中，所述开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰位于尿嘧啶的5-位置。在一些实施方案中，化学修饰是N1-甲基假尿苷。
本公开的一些实施方案提供了在阳离子脂质纳米颗粒内配制的HCMV疫苗，所述阳离子脂质纳米颗粒在本文中也称为可电离的阳离子脂质纳米颗粒、可电离的脂质纳米颗粒和脂质纳米颗粒，这些名称可互换使用。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质并且非阳离子脂质是中性脂质，以及甾醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有约20-60％阳离子脂质、约5-25％非阳离子脂质、约25-55％甾醇和约0.5-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于0.4的多元多样性值。在一些实施方案中，纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷。在一些实施方案中，纳米颗粒具有50-200nm的平均直径。
在一些实施方案中，开放阅读框中80％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，开放阅读框中100％的尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰位于尿嘧啶的5-位置。在一些实施方案中，所述化学修饰是N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷。在一些实施方案中，所述疫苗在脂质纳米颗粒内配制。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质并且非阳离子脂质是中性脂质，以及甾醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)。
本公开的一些实施方案提供了在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法，包括向对象施用有效产生抗原特异性免疫应答的量的HCMV RNA疫苗。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。在一些实施方案中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答和B细胞应答。在一些实施方案中，产生抗原特异性免疫应答的方法涉及单次施用疫苗。在一些实施方案中，方法还包括向对象施用加强剂量的疫苗。在一些实施方案中，通过皮内或肌内注射向对象施用疫苗。
本文还提供了用于在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法中的HCMV RNA疫苗，所述方法包括以有效产生抗原特异性免疫应答的量向对象施用疫苗。
本文还提供了HCMV RNA疫苗在生产用于在对象中诱导抗原特异性免疫应答的方法中的药物中的用途，所述方法包括以有效产生抗原特异性免疫应答的量向对象施用疫苗。
本文进一步提供了预防或治疗HCMV感染的方法，包括向对象施用本公开的疫苗。本文公开的HCMV疫苗可以以有效量配制以在对象中产生抗原特异性免疫应答。
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列与天然序列或参考序列不同的分子。与天然序列或参考序列相比，所述氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与天然序列或参考序列具有至少50％的相同性。在一些实施方案中，变体与天然序列或参考序列具有至少80％或至少90％相同性。
在一些实施方案中，提供了“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”含有模拟活化序列的至少一个氨基酸。例如，谷氨酸可以充当磷酸苏氨酸和/或磷酸丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可能导致去活化或导致含有模拟物的失活产物，例如苯丙氨酸可以充当酪氨酸的失活取代物；或丙氨酸可以作为丝氨酸的失活取代物。“直系同源物”是指不同物种中通过物种形成从共同祖先基因进化而来的基因。通常，直向同源物在进化过程中保留相同的功能。直系同源物的鉴定对于可靠预测新测序的基因组中的基因功能至关重要。“类似物”意指包括因一个或多个氨基酸改变而不同的多肽变体，例如仍保持亲本或起始多肽的一种或多种性质的氨基酸残基的取代、添加或缺失。
本公开提供了几种类型的基于多核苷酸或多肽的组合物，包括变体和衍生物。这些包括例如取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，但通常指相对于参考分子或起始分子以任何方式修饰和/或改变的分子。
因此，编码相对于参考序列、特别是本文公开的多肽序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，可以将序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)添加至肽序列(例如，在N末端或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，可以任选地缺失位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基，以提供截短的序列。某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)或者可以被缺失，这取决于序列的用途，例如序列表达作为可溶的较大序列的一部分，或连接至固体支持物。当提及多肽时，“取代变体”是指在天然或起始序列中去除了至少一个氨基酸残基并且在相同位置处插入不同氨基酸的那些变体。取代可以是单一的，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或者可以是多重的，其中同一分子中两个或更多个氨基酸被取代。
实施例
通过以下示例性实施例进一步描述本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明。它们仅用于阐明本发明。
实施例1：使用融合抑制剂分离和纯化交联的和天然的HCMV Gb(Towne株)
在样品制备过程中，将HCMV融合抑制剂(Bloom et al.,Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 14(2004)3401–3406中描述的化合物28；另参见图5D)添加到病毒浓缩、处理、提取和纯化过程中的每个步骤中，以抑制gB向融合后形式的转化。
在用双(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(BS2G)交联在病毒粒子表面的蛋白质，并用去污剂从病毒粒子中提取gB之后，加入SM5-1 His/Strep标记的Fab(Potzsch et al.,PLoSpathogens 7(8):e1002172,2011)以协助通过电子冷冻显微镜纯化和鉴定gB。Fab-gB复合物通过亲和柱纯化。
然后通过电子冷冻显微镜分析这些提取和纯化的蛋白质是否存在融合前gB，并用于分辨融合前形式的结构。
实施例2：电子显微镜分析
制备了氧化石墨烯薄膜支撑的电子显微镜网格。使用Vitrobot(ThermoFisher)对gB样品溶液进行玻璃化。将冷冻的网格移至运行电压为300kV的FEI Titan Krios透射电子显微镜中。在SerialEM程序中设置目标位置，并使用K2直接探测摄像机(Gatan)使用超分辨率影片模式自动收集高放大倍率(18000×)图像。未bin的像素大小为光束强度为约8e/未bin像素/秒。每个影片样品上的总电子剂量为约分三期共收集影片7771个，每个28帧。
图像处理
使用MotionCor2程序进行漂移校正(Zheng S et al.Nature Methods 14,331–332(2017))，对最终的显微照片进行2×bin并对所有帧进行平均。使用Gctf计算衬度转换函数参数(Kai Zhang,Journal of Structural Biology 193(1),1-12(2016))。对于粒子拾取(particle picking)，使用已公布的融合后构象中(PDB:5CXF)的HCMV gB结构，使用pdb2mrc(EMAN)生成密度图(Ludtke,S.et al.Journal of Structural Biology 128(1),82-97(1999))。这个密度图的投影图像是使用project3d(EMAN)(图1)生成的，并用作使用Gautomatch程序进行自动粒子拾取的模板(Urnavicius L,et al.Science347(6229):1441-1446(2015))。Relion v2.1-beta(Scheres,S.H.Journal of StructuralBiology180(3):519-530(2012))用于提取所得的约190万个颗粒并执行所有后续图像处理步骤，包括2D分类、3D分类、自动细化和后处理。根据图像特征将2D类别分为三组：第一组由示出类似于晶体学确定的融合后gB结构的特征的2D类别组成(>50％)；第二组包含具有良好分辨的蛋白质特征的2D类别，这些特征与融合后gB的结构特征不同(<10％)；第三组包含不包含明确定义的蛋白质的2D类别(～40％)(图1)。对第一组和第二组使用Relion进行3D分类、自动细化和后处理程序进一步处理。在此处理之后，从第一组重建了示出融合后构象结构的分辨率电子密度图；从第二组重建了示出融合前构象结构的分辨率电子密度图。基于这些密度图和已知的HCMV gB氨基酸序列(Towne株P13201，SEQ ID NO:1)，使用Coot程序(Emsley P.et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 4):486-501(2010))构建原子模型以用于融合前和融合后构象结构。融合后gB晶体结构(PDB登录代码5CXF)以及SM5-1 fab和gB结构域II之间复合体的晶体结构(PDB登录代码4OT1)被用作这两种结构的初始模型。对于融合后结构模型，小的调整足以获得对电子密度的良好拟合。对于融合前构象模型，参考PDB模型中的结构域I、II、III和IV可以作为刚体停驻在电子密度图中作为起点。然后，对各个残基进行调整以获得最佳拟合。结构域V、MPR和TM的模型是从头构建的。使用Phenix.real_space_refine工具(Afonine PV et al.Acta Crystallogr DStruct Biol 74(Pt 6):531-544(2018))对模型进行迭代细化，然后进行多轮局部手动调整。
结果
通过cryoEM筛选样品
gB的融合前构象不稳定，有重排为融合后状态的倾向，包括在样品处理期间。因此，所研究的样品含有gB构象异构体的混合物，使结构测定变得复杂。此外，关于融合前gB的结构域排列或独特结构特征，没有预先存在的可靠信息。我们使用电子显微镜和图像处理的直接可视化来筛选不同的样品制备条件。通过2D和3D分类进行图像分选可以从异质样品中确定多种结构。然而，它需要一个大的数据集，以便可以组合每个结构的足够粒子以产生具有良好信号的类平均值。对于gB样品尤其如此，因为融合前的gB是混合物中的一小部分。因此，我们针对每种条件收集了约1,000个影片影，并决定是使用同一样品中的更多数据进行图像处理，还是在2D分类阶段切换到另一样品。抗体Fab结合的融合后构象gB的结构很容易从许多数据集中获得。来自这些Fab结合的融合后构象结构的投影图像被用作参考，以避免选择融合前图像重建的图像。我们选择了任何具有与任何融合后gB投影图像都不相似的蛋白质特征的良好类平均值，以进行进一步的图像处理。我们用这种策略筛选了数十种样品制备条件，最终找到了一个样品，该样品产生了一些替代的2D类作为粒子群中的次要物种(图1B，圈出)。然后从该样品中收集了总共7,771个影片并用于确定融合前的gB结构。
抗体Fab结合的融合后gB结构的投影图像显示于图1A中。来自所收集的数据集的2D类平均值如图1B所示。一些与任何融合后gB参考2D投影都不相似的类别被圈出。
获得融合前构象结构
从数据集中自动选择了大约190万张原始粒子图像。经2D分类后，图像被分为融合后类(粒子群的55％)和融合前类(粒子群的10％)。对这两组进行进一步的3D处理，应用C3对称性以产生分辨率为的SM5-1 Fab结合的融合后gB的密度图和分辨率为的SM5-1 Fab结合的融合前gB的密度图。
使SM5-1 Fab和融合后gB胞外域的基于X射线晶体学的模型通过刚体对接拟合于融合后密度图。除了Fab的恒定域(可能太灵活而无法产生强电子密度)之外，融合后gB-Fab复合物的密度图和模型彼此非常一致(图3A)。在我们最终的融合后gB密度图中，近膜区域、跨膜区域和胞质结构域未得到分辨，这表明融合后gB的这些区域本质上或通过样品制备中的去污剂溶解而是柔性的(图2，下行)。在基于电子冷冻显微镜的模型中，融合后gB的Fab和DII的相互作用与先前确定的复合物晶体结构(PDB登录代码4OT1)非常一致。
为了建立融合前gB模型，在已知的Fab结合位置的指导下，使融合后gB晶体结构的结构域I、II、III和部分结构域IV分别对接到融合前gB-Fab复合物的密度图中，并且将各个残基根据需要手动调整以获得电子密度的最佳拟合。融合前gB结构的其余部分是从头构建的。在融合前结构中建模的gB的氨基酸如图2所示，上行。融合前gB-Fab复合物的模型拟合融合前密度图的大部分部分，并且Fab密度的存在证实了新结构中gB的身份(图3B)。
与本实施例相关的融合前gB模型的坐标和结构因素在WO2021/260510中描述的表1A中提供，所述专利的全部内容通过引用并入本文。
融合前构象的gB结构及其与融合后gB的比较
融合前gB和SM5-1 Fab复合物的电子密度允许构建融合前gB模型，其包括gB胞外域、近膜端区域(MPR，平行于病毒膜方向的螺旋区域)和单个跨膜螺旋(TM)(图3B和图4B)。MPR和TM区域未在融合后gB结构数据中分辨或包含在融合后gB模型中。
融合前和融合后gB的整体尺寸不同(图4A与图4B)。融合后gB三聚体胞外域呈杆状，高度约为(膜远端各原聚体的脯氨酸570与膜近端各原聚体的色氨酸240形成的平面之间的距离；图4A)。其宽度约为(相邻原聚体上丙氨酸315之间的距离)。这里描述的结构源自HCMV Towne株的gB。尽管gB氨基酸序列存在一些天然变异，但Towne gB的整体融合后结构与AD169株(PDB登录代码5CXF)的gB融合后结构几乎相同。因此，融合后gB结构的描述适用于这两个株，并通过序列比对从等效氨基酸进行测量。
融合前的gB三聚体比融合后的gB三聚体具有更矮胖的形状(图4A与图4B)。每个原聚体的W240形成的平面与融合前结构中膜最远端的建模残基Q483之间的距离约为融合前模型的宽度为(通过来自不同原聚体的任两个A315之间的距离测量)。
结构域I、II、III和IV的各个亚基结构在融合前和融合后构象中相似。然而，这些结构域的整体排列在这两种构象中非常不同(图4A-4B和图6A-6C)。在融合前构象中，DI尖端的融合环和结构域III中中央螺旋束的C末端都指向相同的方向，朝向病毒粒包膜，如通过TM区域的位置鉴定(图4A和图6A)。相反，在融合后构象中，所述融合环和中心螺旋束的C末端指向相反方向(图4B和图6C)。
在融合前结构中，所述融合环中的疏水残基(残基Y155、I156、H157和W240、L241)非常靠近MPR并且可能被去污剂包围(图4A和图6A)。
在从融合前到融合后的过渡中，结构域II从结构域III中央卷曲螺旋的中路转移到卷曲螺旋的膜近端和与融合环相对的结构域I的近端位置(图4A和图4B)。
DIII的结构(图4A-4B和图6A-6C)在融合前和融合后构象中非常相似。在这两种构象中的中心螺旋都从L479跨越到P525，表明在融合前至融合后过渡期间发生了最小的重排。然而，其它结构域改变了其相对于结构域III的中心螺旋的位置，因此，如上所述，DIII螺旋束的方向(从N末端到C末端)远离融合环指向融合后构象中三聚体的远端以及朝向病毒膜，方向与融合前构象中的融合环相同。
在融合前结构中，结构域IV(图4A和图6A)埋入在三聚体外部的结构域I与三聚体中心的结构域III和V之间的界面处。相反，在融合后结构中，结构域IV在三聚体的膜远端形成高度暴露的“冠”。
结构域V在融合前gB(图4A和图6A)和融合后gB(图4B和图6C)中具有不同的结构。在融合前gB中，结构域的N末端部分(大约残基642-660)夹在相邻原聚体的结构域I和结构域IV之间，并与溶剂隔离。结构域V的残基683-704之间的区域与其它原聚体中的其对应物形成三聚体螺旋束。这个螺旋束大部分依偎在由结构域IV形成的“冠”的口袋内部。还有一个额外的短螺旋(大约残基710-719)将结构域V的螺旋束连接于MPR区域。相反，在融合后构象(图4B和图6C)中，结构域V暴露于溶剂并沿着结构域III螺旋束的外部和由相邻原聚体的结构域I之间的界面形成的沟槽延伸。
融合前和融合后gB结构的比较提示了从其它经过充分研究的融合蛋白熟知的构象变化的进展(Harrison,S.C.Virology 0:498–507(2015))。所述比较提供了本发明中描述的结构实际上处于融合前构象的可信度。在融合前状态(图6A)，结构域I的融合环通过与MPR以及可能与病毒膜的相互作用而被掩埋。在远gB同源物(水泡性口炎病毒G糖蛋白)的融合前结构中，融合环也指向病毒膜(也是MPR区域的预期位置，在该结构中未看到)(Rocheet al.Science 315:843-8(2007))。
基于与其它融合蛋白的类比，重排很可能随着中央螺旋的延长而进行，作为向所提出的融合前和融合后状态之间的延伸中间体转换的一部分(图6B)。在所提出的延伸中间状态下，TM区域仍将锚定在病毒膜中，并且在旋转和易位的结构域I的尖端处远离病毒膜延伸的融合环将与细胞膜相互作用。从所提出的延伸中间体到融合后构象的转换将涉及折返，使得跨膜区域和融合环在分子的同一端再次彼此靠近，这次两者都与融合的病毒和细胞膜相互作用(图6C)。
我们推测，在融合前gB中，中心螺旋的长度可能存在动态变化，我们确定的融合前结构代表了“呼吸”分子的“快照”，锁定在我们在由用于制备电子冷冻显微镜研究的样品的融合抑制剂和交联剂组成的电子密度中看到的构象中。
观察到的融合前构象的稳定因素
在将gB氨基酸建模为电子密度图后，在MPR、结构域V和包含融合环的结构域I的尖端之间保留未被氨基酸残基填充的密度区域(图5A)。未填充密度的大小和形状符合HCMV融合抑制剂N-{4-[({(1S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}硫代氨基甲酰基)氨基]苯基}-1,3-噻唑-4-甲酰胺的化学结构(图5D)，其存在于通过电子冷冻显微镜研究的样品的整个生产过程中(图5B)。所述化合物采用了三氟甲基苯基部分和化合物其余部分之间扭结的位姿。所述噻唑与来自相邻原聚体的L712、A738和Y153、Y155的疏水残基形成接触。所述苯基被包围在由L715、来自结构域V的D714的脂肪族烃、来自MPR的G734和I730以及来自相邻原聚体的TM结构域的F752的残基形成的疏水环境中。所述三氟甲基苯基位于来自另一个原聚体的MPR和TM螺旋之间的铰链附近的疏水环境中。它可以充当阻止MPR和TM结构域向外移动的钩子。除了抑制剂化合物协同的相互作用之外，来自其它融合环的W240、Y242分别与来自MPR区的疏水补丁和结构域V中的L715形成范德华相互作用(图5C)。预期所述融合抑制剂周围的这些特定相互作用将结构域I、结构域V和MPR保持在一起并限制融合过程期间结构域I、结构域V和MPR的运动(图6A-6C)。
还测试了交联对融合前构象稳定性的影响。在样品制备步骤中，添加或不添加BS2G交联剂。在没有交联剂的情况下，融合前构象与融合后构象中的粒子比率为1:100，而在经BS2G试剂交联的样品中，该比率为1:4。在电子密度中未鉴别出交联剂。
本文描述的附图中阐述的CMV gB的融合前结构以及融合前和融合后结构的彩色版本也可见于Liu et al.Science Advances 7(10):eabf3178(2021)，其全部内容通过引用并入本文。
实施例3：gB1666的表达和纯化
为了生产gB1666，将PSB1666构建体瞬时转染至Expi293F细胞中。转染后96小时收获细胞团块。将PSB1666蛋白在25mM HEPES pH 7.5、250mM NaCl、0.02％DDM、0.002％CHS、3μg/ml WAY-174865(抑制剂，参见图5D)中通过一系列增溶、亲和柱和尺寸排阻色谱的过程进行纯化。在SDS-PAGE上和通过负染色EM分析蛋白质，以确保至少50％的蛋白质显示融合前构象。PSB1666蛋白在Expi293F细胞的转染中有效表达，1L表达将产生约0.1mg的高质量纯化的PSB1666。
多肽gB1666(PSB1666)(SEQ ID NO:57)包括结构域I和IV中的突变。所述多肽包括相对于SEQ ID NO:1所示的相应野生型gB(Towne株)的以下突变：D217C和Y589C。
实施例4：DNA-表达的gB1666在Balb/c小鼠中是免疫原性的
所提出的稳定全长融合前gB构建体之一gB1666(SEQ ID NO:57)已通过EM示出在从转染的哺乳动物细胞中在存在融合抑制剂(WAY-174865；参见图5D)条件下纯化后，相对于Towne株的野生型gB在融合前构象中的分子比例增加。为了评估这个分子是否能够在体内引发免疫应答，将相应于gB1666和野生型gB的DNA列克隆到内部哺乳动物表达载体中。将10只Balb/c小鼠用100μg编码gB1666的DNA电穿孔两次，间隔三周(D0和D21)。另外10只小鼠按照相同的方案用编码野生型gB的DNA进行电穿孔，第三组则用由磷酸盐缓冲盐水组成的安慰剂进行电穿孔。在第28天收集血清样品。基于Towne株但去除了跨膜结构域的野生型序列(Sino Biologicals)，针对哺乳动物细胞产生的重组gB蛋白进行ELISA，以根据标准方案确定抗gB IgG应答。来自野生型gB DNA免疫的小鼠的十只动物中的十只和gB1666 DNA免疫的小鼠的十只动物中的九只产生可检测的抗gB IgG滴度(图11，示出平均值±SD，LLOQ＝25)。研究表明gB1666在Balb/c小鼠中具有免疫原性。
实施例5：稳定的融合前gB1666蛋白的免疫原性研究，gB1666在小鼠中的免疫原性研究。
为了评估小鼠中的抗体应答，将遵循以下免疫方案。第8周时，对小鼠放血，测定免疫的动物血清的中和滴度，并与用gB705(融合后)和/或gB野生型蛋白免疫的血清进行比较。
表5：gB1666蛋白的小鼠免疫原性研究设计
实施例6
在实施例2中，我们公开了与抗体片段复合的融合前人巨细胞病毒(HCMV)毒株Towne糖蛋白B(gB)的电子冷冻显微镜(cryoEM)结构。用于结构测定的gB是通过如下步骤获得的：在哺乳动物细胞培养物中真实HCMV发酵中加入小分子融合抑制剂WAY-174865，并在gB的整个生产和分析过程中保持抑制剂的存在；纯化所述病毒；用化学交联剂双(磺基琥珀酰亚胺基)戊二酸酯(BS2G；间隔臂)处理病毒；用去垢剂从病毒中提取gB；用亲和标记的抗体片段将gB结合到病毒颗粒上；并通过亲和柱和尺寸柱纯化gB。我们还公开了使用融合前gB冷冻电镜结构来设计突变，使gB稳定在融合前状态。具体地，我们公开了重组gB蛋白gB1666，其中两个残基被突变为半胱氨酸(D217C，Y589C)。C217和C589之间工程化二硫键的形成增加了融合前状态下重组gB的构象稳定性。当gB1666在Expi293F细胞中表达并在融合抑制剂化合物WAY-174865存在下纯化时，它保持了融合前的结构特征。在没有抑制剂的情况下，gB1666往往会发生构象变化并失去其融合前的结构状态。在不存在抑制剂的情况下融合前构象稳定性的丧失对于使用所述重组糖蛋白作为免疫抗原而言不是理想的特征。即使gB1666与抑制剂一起配制，也存在这样的风险，即注射到人或动物体内后，抑制剂在体内的稀释将导致其与gB1666解离，并丧失gB1666的融合前构象。因此，需要HCMV gB在融合前构象中充分稳定，以在不存在WAY-174865的情况下保持融合前状态。还优选的是，融合前gB免疫原包含可溶性胞外域，以改善可生产性、改善溶解度、改善同质性，并减少或消除需要用去污剂或其它赋形剂配制以防止由gB跨膜区介导的聚集或沉淀。
我们现在通过基于结构的工程化方法报告了HCMV gB中新突变的发明，这些突变赋予了使用融合前gB作为免疫原的这些改进的特性。首先，我们通过冷冻电镜确定了gB1666的结构，其通过锚定在纳米圆盘中而被溶解，并且通过WAY-174865的存在而稳定在融合前构象中(图12)。重组的D217C和Y589C突变体gB的大部分新结构与我们之前确定的病毒粒子衍生的、化学交联的和抗体片段结合的HCMV Towne融合前gB的结构相似，但两个结构之间在某些局部区域存在细微的差异。结构上的差异可能反映了制剂中的几个差异：首先，gB1666中存在工程化的二硫键，这应该限制糖蛋白的呼吸运动(breathing motion)；其次，gB1666锚定在纳米圆盘中，这与用于在溶液中提取和维持gB以进行先前结构测定的去污剂相比为跨膜结构域提供了更自然的局部脂质环境；第三，不存在gB1666的化学交联；第四，与之前结构的分辨率相比，新结构在的分辨率更高，从而可以更准确地对氨基酸侧链进行建模。
基于新的结构信息，我们在全长gB构建体pSB1666的背景下设计了额外的稳定突变(表6和表7)。我们假设在pSB1666背景上添加这些额外的突变将进一步稳定gB在融合前状态(图13)。例如，残基M371和W506处的半胱氨酸突变可能会在结构域II和III之间引入二硫键；在成对的(F541，E681)和(N524，M684)的半胱氨酸突变可能会在结构域IV和V之间引入二硫键；残基E686、D679突变为疏水性残基可以去除局部不稳定的相同电荷排斥补丁(charge repulsion patch)并增加蛋白质稳定性。在没有融合抑制剂且没有化学交联的情况下，表达并纯化了具有选择的新添加突变的重组糖蛋白。通过SDS-PAGE分析表达的糖蛋白的电泳迁移率显示了与糖基化一致的预期表观分子量和异质性(图14)。将样品储存在4℃下，并在第1天和第7天取等分试样进行负染色电子显微镜分析。在2D类平均图像中，类似于gB融合前构象“顶视图”的三角形特征很明显。属于融合前和融合后类别的群体中的粒子比例在第1天为5:1并且在第7天为3:1(图15)。
基于新的结构信息，我们设计了几种可溶的、无去污剂的gB胞外域(表8)，其具有如图16A-16D所示的融合前稳定突变。纯化的HCMV gB胞外域(残基1-707)形成玫瑰花状聚集体，其中gB蛋白通过其暴露的融合环结合。为了消除聚集并增加蛋白质分泌至条件培养基中，我们将融合环内的四个暴露的疏水残基替换为来自单纯疱疹病毒-1(HSV-1)gB的相应更亲水的氨基酸，例如YIH(155-157)→GHR，W240→A。我们还将暴露的Cys246突变为Ser(C246→S)，以防止形成虚假二硫键。为了进一步稳定抗原的融合前三聚体状态，我们引入能够形成原体间二硫键的半胱氨酸残基或附加的C末端三聚化基序，例如GCN4或来自T4噬菌体fibritin的foldon。进一步引入二硫键突变，例如D217C-Y589C、M317C-W506C、N524C-M684C，以将蛋白质锁定在融合前状态。使重组糖蛋白在没有融合抑制剂和化学去污剂的情况下表达、分泌到条件培养基中并纯化。值得注意的是，与GCN4三聚化基序融合的重组变体显示出最佳的尺寸排阻色谱图(图17)。负染色电子显微镜显示重组蛋白gB2555和gB2556在没有抑制剂和去污剂的情况下为单分散蛋白。在2D类平均图像中观察到预期的gB蛋白质特征(图18和图19)。这些结果证实，这些工程化构建体适合用作框架，以便在需要时在缺少抑制剂和去污剂的情况下向融合前形式的gB添加更多稳定突变。
与本实施例相关的融合前gB模型的坐标和结构因素在WO2021/260510中描述的表1B中提供，所述专利的全部内容通过引用并入本文。
表6：用于二硫键稳定的示例半胱氨酸对突变。
表7：用于稳定的示例电荷突变
行 突变
1 E686L
2 E686I
3 D679A
4 R354F
5 R573F
6 D101L，K260L
表8：构建体突变。构建体的设计目的是测试不同条件下纯化的重组蛋白制剂中融合前gB的存在。
构建体 突变1 突变2 突变3 突变4
pSB1688 N524C M684C
pSB2455 M371C W506C
pSB2456 F541C E681C
pSB2457 D217C Y589C M371C W506C
pSB2459 D217C Y589C N524C M684C
pSB1666 D217C Y589C
表9：示例的可溶性、无去污剂的gB胞外域蛋白
*突变，包括YIH(155-157)→GHR、W240→A和C246→S，已被掺入gB中以减少聚集并增加蛋白质分泌。
实施例7：确定HCMV gB多肽的可药物区域
HCMV gB多肽的融合前和融合后结构描述于上文阐述的实施例中。当HCMV gB多肽重排为融合后结构时，会形成长的富含β片层的球状结构域，其尖端是融合环，这些融合环以三聚体形式聚集在一起，在它们之间留下沟槽。靠近蛋白质膜锚的长而延伸的卷曲/α螺旋结构沿着这些沟槽将膜锚和融合环连接在一起，完成实现病毒进入细胞的融合反应。
图20A和20B描绘了融合前(图20A)和融合后(图20B)结构中的HCMV(Towne株)结构域V(残基I642-V697(SEQ ID NO:281))的空间填充模型。疏水残基被标记。在融合前构象中，这些疏水残基是无序的，但它们重新排列成两亲性延伸构象，以与融合后结构其它部分的疏水表面互补。例如，如图20B所示，在I642-F661(SEQ ID NO:282)之间的区域与由来自其它两个原聚体的Q485-L520(SEQ ID NO:283)形成的表面相互作用；在L672-V697(SEQ IDNO:284)之间的区域与来自其它两个原聚体的相同区域相互作用。这种结构排列对于驱动病毒和宿主细胞膜之间的融合是必要的。
这种构象变化在融合后形式的结构域I和II之间的凹槽上HCMV gB多肽结构域V中产生了可成药区域。
图21A-21C示出(图21A)融合后构象中的HCMV gB(Towne株)结构域V(浅灰色)及其结合袋(深灰色)，以及(图21B)没有结构域V的结合口袋的空间填充模型。图21C示出了与图21A中相同的结构的带状结构示意图，带有标记的某些残基。
在一个实施方案中，将对应于在沟槽上的长延伸的卷曲/α-螺旋的部分的肽添加到病毒中，以与它们的真实对应物竞争占据所述沟槽，阻止重排的完成，从而阻止膜融合、病毒进入和病毒感染性。在另一个实施方案中，阻断肽与沟槽的结合可用于筛选小分子文库，导致小分子CMV融合抑制剂的发现。
本发明提供了包含SEQ ID NO:1(Towne株)残基的肽，选自以下一组：M648-K700(SEQ ID NO:260)，M648-V697(SEQ ID NO:261)，S647-V697(SEQ ID NO:262)，S647-V663(SEQ ID NO:263)，I653-V697(SEQ ID NO:264)，I653-Q692(SEQ ID NO:265)，I653-L680(SEQ ID NO:266)，I653-S675(SEQ ID NO:267)，I653-Y667(SEQ ID NO:268)，R662-V697(SEQ ID NO:269)，R662-Q692(SEQ ID NO:270)，R662-L680(SEQ ID NO:271)，R662-S675(SEQ ID NO:272)，L664-F678(SEQ ID NO:273)，S668-V697(SEQ ID NO:274)，S668-Q692(SEQ ID NO:275)，S668-V677(SEQ ID NO:276)，D679-V697(SEQ ID NO:277)，L680-V697(SEQ ID NO:278)，L680-Q692(SEQ ID NO:279)，和R693-K700(SEQ ID NO:280)。
肽活性的验证实验
合成上述肽(也参见表10)并测试其病毒细胞感染抑制活性。与登革热病毒(dengue virus)中具有类似功能的肽相比，所述肽预计在浓度约为10μM或更低时可具有减少50％感染(IC50)的效力(A.G.Schmidt,P.L.Yang,S.C.Harrison,Peptide inhibitorsof dengue-virus entry target a late-stage fusion intermediate.PLoS Pathog 6,e1000851(2010))。所选肽在gB可成药区域中的结合可以通过结合测定进行验证。这些测定包括通过SPR测量结合亲和力，以显示大约10μM或更低的解离常数(Kd)，以及通过冷冻电镜结构以显示gB可成药区域中肽的密度。HCMV gB的可成药区包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。所述可成药区域的残基在融合后构象中。
这些方法对于本领域技术人员来说是众所周知的并且在下面更详细地描述：
1.病毒感染抑制分析
通过微中和测定在MRC-5成纤维细胞和ARPE-19上皮细胞中测试HCMV感染。简而言之，将细胞在37℃、5％ CO2下接种到96孔板中过夜。将系列稀释的肽与HCMV Towne株或VR1814以约500pfu/孔组合，并在37℃下温育1小时。然后将混合物转移至MRC-5或ARPE-19细胞，并在37℃、5％ CO2下感染24小时。用甲醇固定后，使用小鼠单克隆抗HCMV立即早期蛋白IE1抗体(内部开发)通过免疫染色检测HCMV感染的细胞。然后使用二抗，即Alexa Flour488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Molecular Probes)抗体，使用CTL-ImmunoSpot分析仪对感染细胞进行计数。使用四参数非线性回归插值法确定抑制样品50％感染性的滴度(IC50)。
2.通过SPR分析结合亲和力
为了测量HCMV gB蛋白和肽的结合，使用1×HBSP+(0.01M Hepes pH 7.4，0.15MNaCl，0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液准备SPR CM5传感器芯片表面。所有流动池均用0.4M EDC+0.1M NHS激活，并在10mM乙酸盐pH 4.5中与抗-Avi pAb进行胺偶联。然后用在0.2M硼酸盐缓冲液pH 8.5中的0.1M EDA封闭表面，然后用75mM磷酸盐再生3次。
在室温下使用补充有1g/L BSA的1×HBSP+作为运行缓冲液进行多循环动力学测定。为了捕获，将纯化的HCMV gB蛋白稀释至0.2μg/mL，并加载到每个通道的流动池2上。然后，将设计的gB肽以100μM的浓度注射，用于初始结合筛选。如果鉴定出阳性结合肽，则以0、5、10、20、50和100μM的浓度注射阳性肽以测量结合动力学。在每个循环结束时，将表面用75mM磷酸盐再生3次。
3.通过冷冻电镜分析与可成药位点结合
本实验中使用缺少结构域V、MPR、TM和胞质结构域(大致终止于SEQ ID NO:1的残基642)且呈其融合后形式的纯化gB蛋白。将蛋白质与设计的肽在室温下温育4小时，肽的摩尔量超过约两倍。然后对样品进行冷冻网格制备并在冷冻条件下成像。重建结构通过流行的图像处理软件获得，例如CryoSparc(A.Punjani,J.L.Rubinstein,D.J.Fleet,M.A.Brubaker,cryoSPARC:algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structuredetermination.Nat Methods 14,290-296(2017))或Relion(S.H.Scheres,RELION:implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.JStruct Biol 180,519-530(2012))。特定的可成药位点结合通过在融合后结构中相应位置中肽密度的存在来验证。
与其它病毒不同，CMV会导致终身感染。因此，这些CMV调节剂或抑制剂可用于治疗患有CMV感染的对象或预防移植患者或患有免疫缺陷的患者的感染。在另一个实施方案中，所述调节剂或抑制剂可用于治疗患有CMV感染的新生儿以预防或减少先天性CMV的表现。新生儿的预防性治疗还可以包括施用于孕妇。
表10
本发明的实施方案在以下编号的条款中阐述：
C1.一种鉴定用于治疗或预防由人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使具有包含可成药区域的糖蛋白B(gB)多肽的HCMV与化合物接触，其中所述化合物的结合指示候选治疗剂。
C2.一种鉴定用于治疗或预防由HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的HCMV gB多肽与化合物接触，其中所述gB多肽的功能或活性的调节指示候选治疗剂。
C3.根据条款C2的方法，其中所述gB多肽的活性的所述调节涉及阻止融合后构象中结构域V与结构域V结合槽的结合。
C4.一种鉴定用于治疗或预防由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB多肽与化合物接触，其中所述病毒融合的抑制指示候选治疗剂。
C5.一种鉴定用于由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB多肽与化合物接触，其中所述病毒的病毒感染性的抑制指示候选治疗剂。
C6.一种鉴定用于由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB多肽与化合物接触，其中对象中所述疾病的至少一种症状的减轻指示候选治疗剂。
C7.根据条款C1至C6中任一项的方法，其中所述化合物选自以下类别的化合物：蛋白质，肽，多肽，肽模拟物，抗体，核酸和小分子。
C8.根据条款C7的方法，其中结合是使用体外测定确定的。
C9.根据条款C7的方法，其中结合是使用体内测定确定的。
C10.根据条款C7的方法，其中所述可成药区域包含选自以下残基中的至少一个残基：SEQ ID NO:1的K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518或N676-Y690。
C11.根据条款C10的方法，其中所述可成药区域的残基处于融合后构象。
C12.根据条款C1至C11中任一项的方法，其中所述化合物是包含SEQ ID NO:1(Towne株)的残基的肽，选自M648-K700(SEQ ID NO:260)、M648-V697(SEQ ID NO:261)、S647-V697(SEQ ID NO:262)、S647-V663(SEQ ID NO:263)、I653-V697(SEQ ID NO:264)、I653-Q692(SEQ ID NO:265)、I653-L680(SEQ ID NO:266)、I653-S675(SEQ ID NO:267)、I653-Y667(SEQ ID NO:268)、R662-V697(SEQ ID NO:269)、R662-Q692(SEQ ID NO:270)、R662-L680(SEQ ID NO:271)、R662-S675(SEQ ID NO:272)、L664-F678(SEQ ID NO:273)、S668-V697(SEQ ID NO:274)、S668-Q692(SEQ ID NO:275)、S668-V677(SEQ ID NO:276)、D679-V697(SEQ ID NO:277)、L680-V697(SEQ ID NO:278)、L680-Q692(SEQ ID NO:279)、和R693-K700(SEQ ID NO:280)。
C13.根据条款C1至C11中任一项的方法，其中所述化合物在化合物文库中。
C14.根据条款C13的方法，其中所述文库使用组合合成方法生成。
C15.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其与HCMV的糖蛋白B(gB)的结构域V区相互作用。
C16.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其阻止HCMV糖蛋白B(gB)的结构域V的移动。
C17.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其通过与来自融合后三聚体中的任何亚基形成的三聚体界面处的结构域V残基的至少一个残基相互作用来阻止构象变化的完成。
C18.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的多肽序列的HCMV活性抑制剂。
C19.根据条款C15至C18的候选治疗剂，其中候选抑制剂是包含SEQ ID NO:1(Towne株)的残基的肽，选自M648-K700(SEQ ID NO:260)、M648-V697(SEQ ID NO:261)、S647-V697(SEQ ID NO:262)、S647-V663(SEQ ID NO:263)、I653-V697(SEQ ID NO:264)、I653-Q692(SEQ ID NO:265)、I653-L680(SEQ ID NO:266)、I653-S675(SEQ ID NO:267)、I653-Y667(SEQ ID NO:268)、R662-V697(SEQ ID NO:269)、R662-Q692(SEQ ID NO:270)、R662-L680(SEQ ID NO:271)、R662-S675(SEQ ID NO:272)、L664-F678(SEQ ID NO:273)、S668-V697(SEQ ID NO:274)、S668-Q692(SEQ ID NO:275)、S668-V677(SEQ ID NO:276)、D679-V697(SEQ ID NO:277)、L680-V697(SEQ ID NO:278)、L680-Q692(SEQ ID NO:279)、和R693-K700(SEQ ID NO:280)。
C20.根据条款C15至C19的候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是核酸。
C21.一种药物组合物，其包含根据条款C15至C20中任一项的候选治疗剂。
C22.一种治疗患有与HCMV感染相关的疾病或病症的对象的方法，包括向所述对象施用条款C21的药物组合物。
C23.一种预防对象中与HCMV感染相关的疾病或病症的方法，包括向所述对象施用条款C21的药物组合物。
C24.一种用于治疗或预防与HCMV感染相关的疾病或病症的试剂盒，其包含条款C21的药物组合物和任选的使用说明书。
C25.HCMV gB的可成药区域，其包含SEQ ID NO:1的残基K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。
C26.根据条款C25项的HCMV gB的可成药区域，其中可成药区域的残基处于融合后构象。

Claims (26)

1.一种用于鉴定用于治疗或预防由人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使具有包含可成药区域的糖蛋白B(gB)多肽的HCMV与化合物接触，其中所述化合物的结合指示候选治疗剂。
2.一种用于鉴定用于治疗或预防由HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的HCMV gB多肽与化合物接触，其中所述gB多肽的功能或活性的调节指示候选治疗剂。
3.权利要求2的方法，其中所述gB多肽活性的所述调节包括阻止融合后构象中结构域V与结构域V结合槽的结合。
4.一种用于鉴定用于治疗或预防由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB多肽与化合物接触，其中所述病毒的融合的抑制指示候选治疗剂。
5.一种用于鉴定由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区的gB多肽与化合物接触，其中所述病毒的病毒感染性的抑制指示候选治疗剂。
6.一种用于鉴定由具有gB多肽的HCMV感染引起的疾病的候选治疗剂的方法，包括使包含可成药区域的gB多肽与化合物接触，其中对象中所述疾病的至少一种症状的减轻指示候选治疗剂。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述化合物选自以下类别的化合物：蛋白质，肽，多肽，拟肽，抗体，核酸和小分子。
8.权利要求7的方法，其中使用体外测定来确定结合。
9.权利要求7的方法，其中使用体内测定来确定结合。
10.权利要求7的方法，其中所述可成药区域包含来自以下残基的至少一个残基：SEQID NO:1的K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518或N676-Y690。
11.权利要求10的方法，其中所述可成药区域的残基处于融合后构象。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述化合物是包含SEQ ID NO:1(Towne株)残基的肽，选自M648-K700(SEQ ID NO:260)、M648-V697(SEQ ID NO:261)、S647-V697(SEQ IDNO:262)、S647-V663(SEQ ID NO:263)、I653-V697(SEQ ID NO:264)、I653-Q692(SEQ IDNO:265)、I653-L680(SEQ ID NO:266)、I653-S675(SEQ ID NO:267)、I653-Y667(SEQ IDNO:268)、R662-V697(SEQ ID NO:269)、R662-Q692(SEQ ID NO:270)、R662-L680(SEQ IDNO:271)、R662-S675(SEQ ID NO:272)、L664-F678(SEQ ID NO:273)、S668-V697(SEQ IDNO:274)、S668-Q692(SEQ ID NO:275)、S668-V677(SEQ ID NO:276)、D679-V697(SEQ IDNO:277)、L680-V697(SEQ ID NO:278)、L680-Q692(SEQ ID NO:279)、和R693-K700(SEQ IDNO:280)。
13.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述化合物在化合物文库中。
14.权利要求13的方法，其中所述文库使用组合合成方法生成。
15.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其与HCMV糖蛋白B(gB)的结构域V区域相互作用。
16.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其阻止HCMV糖蛋白B(gB)的结构域V的移动。
17.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性调节剂，其通过与来自融合后三聚体中的任何亚基形成的三聚体界面处的结构域V残基的至少一个残基相互作用来阻止构象变化的完成。
18.一种候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是HCMV活性抑制剂，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的多肽序列。
19.根据要求15至18的候选治疗剂，其中所述候选抑制剂是包含SEQ ID NO:1(Towne株)残基的肽，选自M648-K700(SEQ ID NO:260)、M648-V697(SEQ ID NO:261)、S647-V697(SEQ ID NO:262)、S647-V663(SEQ ID NO:263)、I653-V697(SEQ ID NO:264)、I653-Q692(SEQ ID NO:265)、I653-L680(SEQ ID NO:266)、I653-S675(SEQ ID NO:267)、I653-Y667(SEQ ID NO:268)、R662-V697(SEQ ID NO:269)、R662-Q692(SEQ ID NO:270)、R662-L680(SEQ ID NO:271)、R662-S675(SEQ ID NO:272)、L664-F678(SEQ ID NO:273)、S668-V697(SEQ ID NO:274)、S668-Q692(SEQ ID NO:275)、S668-V677(SEQ ID NO:276)、D679-V697(SEQ ID NO:277)、L680-V697(SEQ ID NO:278)、L680-Q692(SEQ ID NO:279)、和R693-K700(SEQ ID NO:280)。
20.权利要求15至19的候选治疗剂，其中所述候选治疗剂是核酸。
21.一种药物组合物，其包含权利要求15至20中任一项的候选治疗剂。
22.一种治疗患有与HCMV感染相关的疾病或病症的对象的方法，包括向所述对象施用权利要求21的药物组合物。
23.一种预防对象中与HCMV感染相关的疾病或病症的方法，包括向所述对象施用权利要求21的药物组合物。
24.一种用于治疗或预防与HCMV感染相关的疾病或病症的试剂盒，其包含权利要求21的药物组合物和任选地使用说明书。
25.包含以下残基的HCMV gB的可成药区域：SEQ ID NO:1的K130-A135、D216-W233、R258-K260、A267-V273、R327-D329、W349-E350、V480-K518和N676-Y690。
26.权利要求25的HCMV gB的可成药区域，其中所述可成药区域的残基处于融合后构象。
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