JP2013540425A - インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行うためのポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、本明細書中に開示される一般式のポリペプチドであって、インフルエンザＡ型ヘマグルチニンを認識し、かつ該ヘマグルチニンに対する強力な結合剤であり、例えば、インフルエンザ感染の治療および発症の制限のうち少なくとも一方を行うために使用されうるポリペプチドを提供する。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸、適切な制御配列に作動可能なように連結された本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクター、および本発明の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞をさらに提供する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、および１つ以上の本発明のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。加えて、本発明は、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行う方法、インフルエンザ感染を診断するか、またはインフルエンザ感染の進行を監視する方法、インフルエンザワクチン候補を同定する方法、および、インフルエンザ感染の治療、制限および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法を提供する。

Description

本発明は、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行うためのポリペプチドに関する。

政府支援について
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与された助成番号第５Ｐ４１ＲＲ０１１８２３‐１５号および米国国防総省国防高等研究事業局（Defense Advanced Research Projects Agency）により授与された助成番号第ＨＲ００１１‐０８‐００８５号および米国国防脅威削減局（Defense Threat Reduction Agency）により授与された助成番号第ＨＤＴＲＡ１‐１０‐１‐００４０号のもとで政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科に属している。インフルエンザウイルスにはＡ、ＢおよびＣ型で示される３つのサブタイプがある。インフルエンザのビリオンは、数あるタンパク質の中でも特にヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードしている分節マイナス鎖ＲＮＡゲノムを包含している。インフルエンザウイルス感染は、シアル酸を含有する細胞レセプター（糖タンパク質および糖脂質）へのビリオン表面ＨＡタンパク質の付着によって開始される。ＮＡタンパク質は該シアル酸レセプターのプロセシングを仲介し、細胞内へのウイルス侵入は、ＨＡ依存性のレセプターを介したエンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを包含している内在化エンドソームの酸性領域において、ＨＡ２タンパク質は立体配座変化を生じ、その結果としてウイルス膜および細胞膜の融合ならびにウイルスの脱外被およびヌクレオカプシドと会合したリボ核タンパク質（ＲＮＰ）からのＭ１タンパク質のＭ２を介した放出がもたらされ、ＲＮＰはウイルスＲＮＡ合成のために細胞核へ移動する。ＨＡタンパク質に対する抗体は、ウイルスの感染性を中和することによりウイルス感染を防止する。

インフルエンザは重大な公衆衛生上の課題を提示しており、既存の抗ウイルス薬に抵抗性であるかまたは免疫系による中和を回避するウイルスと戦うために新たな治療法が必要とされている。

第１の態様では、本発明は、一般式Ｉ
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、上記式中、
Ｒ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、およびＡｓｐからなる群から選択され；
Ｒ２は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ３は、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ４はＬｅｕおよびＰｈｅからなる群から選択され；
Ｒ５は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ６は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ７は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１０はＴｒｐおよびＰｈｅからなる群から選択され；
Ｒ１１は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ１２は、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｒ１３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１４は、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、およびＬｅｕからなる群から選択され；
Ｒ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｒ１６は、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択される。

一実施形態では、ポリペプチドは、
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６‐Ｘ１‐Ｒ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
を含むかまたは上記式で構成され、上記式中、
Ｘ１は４〜８アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ１７はＰｈｅまたはＴｙｒである。

別の態様では、本発明は、一般式ＩＩ
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、上記式中、
Ｒ１はＰｈｅおよびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ３はＧｌｕおよびＡｓｐからなる群から選択され；
Ｒ４は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ７は、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＴｙｒからなる群から選択される。

一実施形態では、一般式ＩＩのポリペプチドは、
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ‐Ｘ１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｘ２‐Ｒ１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）
を含むかまたは上記式で構成され、上記式中、
Ｘ１は５〜１５アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｙからなる群から選択され；
Ｒ１３は、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｒ１４は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、およびＬｙｓからなる群から選択される。

別の態様では、本発明は、

からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。

第３の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。第４の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能なように連結された、本発明の第３の態様の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。第５の態様では、本発明は、本発明の第４の態様の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。第６の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。

第７の態様では、本発明は、本発明による１つ以上のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
第８の態様では、本発明は、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行う方法であって、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行うために、投与を必要とする対象者に、治療上有効な量の１つ以上の本発明のポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドのコンジュゲート、または該ポリペプチドの医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。

第９の態様では、本発明は、インフルエンザ感染を診断するか、またはインフルエンザ感染の進行を監視する方法であって、
（ａ）インフルエンザに感染している疑いのある対象者由来の生体試料を、診断上有効な量の１つ以上の本発明のポリペプチドと、該試料中に存在するウイルスＨＡタンパク質への該ポリペプチドの結合に適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）ポリペプチド‐ウイルスＨＡ結合複合体を検出するステップと
からなり、
そのような結合複合体の存在は、該対象者がインフルエンザに感染していることを示すか、またはインフルエンザ感染の進行の程度（a measure progression）を提示する方法を提供する。

第１０の態様では、本発明は、インフルエンザワクチン候補を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物を、本発明のポリペプチドと、ポリペプチドの結合に適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）結合していない試験化合物を除去するステップと；
（ｃ）本発明のポリペプチドに結合する試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザワクチン候補である、ステップと
からなる方法を提供する。

第１１の態様では、本発明は、インフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インフルエンザＨＡタンパク質を、（ｉ）試験化合物および（ｉｉ）本発明のポリペプチドと、ＨＡタンパク質の本発明のポリペプチドへの結合に適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）ＨＡタンパク質への結合に関してポリペプチドより優れた試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
からなる方法を提供する。

設計過程の大要を示す図。このフローチャートは、新規な結合タンパク質の設計過程における重要なステップについて、１９１８ ＨＡの基部を標的とする結合剤の作出の各ステップを例証するサムネイルとともに示している。 １９１８ ＨＡの基部を標的とするＨＢ３６およびＨＢ８０の設計を示す図。（Ａ）１９１８年パンデミックウイルス由来の三量体ＨＡ構造（ＰＤＢ ３Ｒ２Ｘ）の表面表示。広域中和抗体ＣＲ６２６１は、ウイルス膜（底部）の近くで基部領域内の高度に保存されたエピトープに結合する。（Ｂ）ＣＲ６２６１接触残基をスティック表示した、ＣＲ６２６１エピトープの拡大図。ＨＡ上のこの標的部位は、内側が多数の疎水性残基によって覆われた溝を包含している。この疎水性の溝のいずれの側（上方および下方）のループも、この領域への接近を抑制している。ＨＡ２上の重要な残基が一文字記号で表記されている。（ＣおよびＤ）ＨＢ３６（Ｃ）およびＨＢ８０（Ｄ）と、ＨＡ上の標的部位との間の設計された相互作用を示す正面図。ＨＡは図２Ａに関してほぼ６０°回転されている。ＨＢ３６およびＨＢ８０の残基はスティック表示され、ホットスポット残基（ＨＢ３６についてはＦ４９およびＭ５３、ＨＢ８０についてはＬ２１、Ｆ２５およびＹ４０）が表記されている。明瞭にするために、該設計物からは非接触領域が省略されている。（ＥおよびＦ）ＨＢ３６（Ｅ）およびＨＢ８０（Ｆ）の１９１８／Ｈ１ ＨＡとの設計された相互作用をさらに詳細に示す図。 ＨＢ３６設計物についての初期結合データ（親和性成熟前）。１μＭの１９１８ ＨＡとともにインキュベートされると、この設計タンパク質をディスプレイ（提示）する酵母は、１９１８ ＨＡが存在しない場合と比較して蛍光フィコエリトリンシグナル（Ｘ軸）の増大を示す。 ＨＢ８０設計物についての初期結合データ（親和性成熟前）。１μＭの１９１８ ＨＡとともにインキュベートされると、この設計タンパク質をディスプレイ（提示）する酵母は、１９１８ ＨＡが存在しない場合と比較して蛍光フィコエリトリンシグナル（Ｘ軸）の増大を示す。 親和性成熟について示す図。初期設計物の親和性を増大させる置換は、（ＡおよびＢ）反発相互作用ＨＢ３６ Ａｌａ６０Ｖａｌ（Ａ）、ＨＢ８０ Ｍｅｔ２６Ｔｈｒ（Ｂ）；（ＣおよびＤ）静電作用ＨＢ３６ Ａｓｎ６４Ｌｙｓ（Ｃ）、ＨＢ８０ Ａｓｎ３６Ｌｙｓ（Ｄ）；（ＥおよびＦ）ならびに溶媒和作用ＨＢ３６ Ａｓｐ４７Ｓｅｒ（Ｅ）、ＨＢ８０ Ａｓｐ１２Ｇｌｙ（Ｆ）、のモデル化に際して欠陥として分類される可能性がある。 酵母表面ディスプレイによって測定されたＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡへのＨＢ３６．４の結合滴定。丸印は親和性成熟がなされた設計物を、四角は該設計物の由来元であるスカフォールド（足場）タンパク質を表し、バツ印は７５０ｎＭの抑制性ＣＲ６２６１ Ｆａｂの存在下における該設計物を表す。 酵母表面ディスプレイによって測定されたＨＢ８０．３の結合滴定。丸印は親和性成熟がなされた設計物を、四角は該設計物の由来元であるスカフォールドタンパク質を表し、バツ印は７５０ｎＭの抑制性ＣＲ６２６１ Ｆａｂの存在下における該設計物を表す。 ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１複合体の結晶構造によるコンピュータ設計の精度の検証を示す図。（Ａ）ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１複合体の結晶構造とコンピュータ設計物との重ね合せから、主要な認識ヘリックスの配置状態における十分な一致と、タンパク質ドメインの残り部分にわずかな回転を伴うこととが明らかである。重ね合せはＨＡ２サブユニットを使用して行なわれた。明瞭にするために、ここでは結晶構造からのＨＡのみが示されている（設計物の重ね合せに使用されたＨＡ（結晶構造とほとんど同一）は省略された）。（Ｂ）ＳＣ１９１８ ＨＡ‐ＨＢ３６．３境界面の拡大図であり、設計物と結晶構造との間がほぼ一致していることが強調されている。主要な認識ヘリックスは（Ａ）とほぼ同じように配向されている。（Ｃ）ＨＢ３６．３の主要な認識ヘリックスについての、バイアスなしの２Ｆｏ‐Ｆｃ（灰色メッシュ、１σでの等高面）およびＦｏ‐Ｆｃ（暗色メッシュ、３σでの等高面）電子密度マップ。該ヘリックスは（Ｂ）のように配向され、この図中のヘリックスの左面の重要な接触残基が表記されている（右側表面はＨＢ３６．３タンパク質のコアと直面かつ相互作用する）。Ｆ４９、Ｍ５３、Ｗ５７、Ｆ６１およびＦ６９（この図では見えていない）を含む、ＨＡとの境界面におけるほとんどの大きな側鎖について著明な密度が観察された。ここでは側鎖は実験上の電子密度との一致を例証するために示されているが、マップは、以下の側鎖すなわちＦ４９、Ｍ５３、Ｍ５６、Ｗ５７、Ｆ６１およびＦ６９のアラニンへの短縮を用いたＨＡ‐ＨＢ３６．３モデルの最初の精密化の後で計算された（現存の側鎖を用いた事前の精密化なし）。 ＨＢ８０．３は多数のＨＡサブタイプに結合かつ抑制することを示す図。（Ａ）１６個のインフルエンザＡ型ヘマグルチニンサブタイプの関連性を示す進化系統樹。これらのサブタイプは２つの主要な系統（グループ１および２）に分けられる。ＣＲ６２６１はグループ１ウイルスに対する幅広い活性を有する。ＨＢ８０．３は同様の交差反応性プロファイルを有し、Ｈ１およびＨ５を含む多数のグループ１サブタイプに結合する。（Ｂ）一群のＨＡに対するＨＢ８０．３およびＣＲ６２６１ Ｆａｂの結合データ。「＋」、「＋＋」および「＋＋＋」は相対的な結合の程度を示し（それぞれおよそ１０^−７、１０^−８、および１０^−９Ｍ）、一方「−」は試験された最も高い濃度（１００ｎＭ）でも検出可能な結合がないことを示す。（Ｃ）ＨＢ８０．３は、膜融合を促進するｐＨ誘導型の立体配座変化を抑制する。低いｐＨへの曝露は１９１８Ｈ１ ＨＡ（トップパネル）およびＶｉｅｔ０４Ｈ５ ＨＡをプロテアーゼ感受性状態に変換し（レーン１）、中性ｐＨに維持されたＨＡはトリプシンに対して高度に抵抗性である（レーン３）。ＨＢ８０．３をＨ１およびＨ５とともにプレインキュベートするとｐＨ誘導型の立体配座変化が妨げられ、ＨＡはプロテアーゼ抵抗性の融合前の状態に保持される（レーン２）。 酵母表面ディスプレイにより測定されたＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡへのＨＢ３６の結合滴定。丸印はコンピュータ設計物を表し、四角は該設計物の由来元であるスカフォールドタンパク質を表し、×印は１．５μＭの抑制性ＣＲ６２６１ Ｆａｂの存在下における設計物を表す。 ＨＢ８０設計物についてのフィコエリトリン（ＰＥ）強度ヒストグラムを示す図。破線は１μＭ Ｈ１ ＨＡの非存在下、暗色線は存在下における、設計物をディスプレイする酵母細胞の集団を表す。 ＨＢ８０設計物の由来元であるスカフォールド（ＰＤＢコード２ＣＪＪ）についてのフィコエリトリン（ＰＥ）強度ヒストグラムを示す図。破線は１μＭ Ｈ１ ＨＡの非存在下、暗色線は存在下における、設計物をディスプレイする酵母細胞の集団を表す。 ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６Ｋの部位５４の後ろで切端化すると平均表面ディスプレイが増大することを示す図。（ａ．）ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６Ｋおよび（ｂ．）ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６ＫΔ５４‐９５のＦＩＴＣ強度ヒストグラム。いずれの場合においても、灰色の線は非標識細胞を表し、黒色の線は抗ｃｍｙｃ ＦＩＴＣで標識された細胞を表す。 ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６Ｋの部位５４の後ろで切端化すると平均表面ディスプレイが増大することを示す図。（ａ．）ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６Ｋおよび（ｂ．）ＨＢ８０ Ｍ２６Ｔ Ｎ３６ＫΔ５４‐９５のＦＩＴＣ強度ヒストグラム。いずれの場合においても、灰色の線は非標識細胞を表し、黒色の線は抗ｃｍｙｃ ＦＩＴＣで標識された細胞を表す。 ＨＢ３６．３の設計境界面における、結合を完全に解消する重要残基のアラニンスキャニング変異導入を示す図。結合は酵母表面ディスプレイ滴定法によって測定された。 およびＨＢ８０．１の設計境界面における、結合を完全に解消する重要残基のアラニンスキャニング変異導入を示す図。結合は酵母表面ディスプレイ滴定法によって測定された。 Ｈ１およびＨ５ ＨＡサブタイプへの設計物の酵母ディスプレイ滴定により、ＨＢ３６．４設計バリアントのヘテロサブタイプ型の結合が示されることを示す図。丸印はＳＣ／１９１８／Ｈ１ ＨＡの結合滴定、四角はＶＮ／２００４／Ｈ５ ＨＡについての滴定データである。 Ｈ１およびＨ５ ＨＡサブタイプへの設計物の酵母ディスプレイ滴定により、ＨＢ８０．３設計バリアントのヘテロサブタイプ型の結合が示されることを示す図。丸印はＳＣ／１９１８／Ｈ１ ＨＡの結合滴定、四角はＶＮ／２００４／Ｈ５ ＨＡについての滴定データである。 ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対するＨＢ３６．３についてのプロテアーゼ感受性‐阻害アッセイ。（Ａ）上側パネルは、ＳＣ１９１８ ＨＡ単独に対する様々なｐＨ処理およびトリプシン消化の効果を示す。ほとんどのＨＡは、ｐＨ〜６．０‐６．５より下方においてプロテアーゼ感受性の融合後の立体配座に変換される。下側パネルは、ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８複合体（ＨＢ３６．３で飽和し、ゲルろ過で精製してから実験；ＨＢ３６．３とＨＡとのモル比はおよそ１：１）についての同一アッセイを示す。反応物中の予め結合したＨＢ３６．３の存在は、ＨＡのプロテアーゼ抵抗性状態への変換を阻止することができない。（Ｂ）図５Ｃに示されたＨＢ８０．３について使用されたのと同一の条件下で行われたアッセイ（ＨＢ３６．３とＨＡとのモル比はおよそ１０：１）。ＨＢ３６．３はこれらの条件下では保護効果を有していない。

発明の詳細な説明
引用される参照文献はすべて、参照によりその全体が本願に組み込まれる。本願においては、別途記載のない限り、利用される技術はいくつかのよく知られた参照文献、例えば：サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、（コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年）、Ｄ．ゲッデル（D. Goeddel）編、「酵素学実験法（Methods in Enzymology）」第１８５巻、「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」（カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press）、１９９１年）、Ｍ．Ｐ．ドイツァー（M.P. Deutshcer）編、「酵素学実験法（Methods in Enzymology）」の「タンパク質精製の手引き（Guide to Protein Purification）」（アカデミックプレス社（Academic Press, Inc.）、１９９０年）；イニス（Innis）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用の手引き（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）」（カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press）、１９９０年）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（R.I. Freshney）、「動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）」、第２版、ニューヨーク州ニューヨーク、リス社（Liss, Inc.）、１９８７年）、Ｅ．Ｊ．マレー（E.J. Murray）編、「遺伝子の導入および発現プロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）、ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（The Humana Press Inc.）、第１０９〜１２８ページ、ならびにアンビオン（Ambion）１９９８年カタログ（テキサス州オースティン、アンビオン）、のうちいずれかに見られるものである。

本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（and）」は、明示的にそうでないことが定められた場合を除き、「または、もしくは（or）」と互換的に使用される。

本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
第１の態様では、本発明は、一般式Ｉ
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、上記式中、
Ｒ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、およびＡｓｐからなる群から選択され；
Ｒ２は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ３は、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ４はＬｅｕおよびＰｈｅからなる群から選択され；
Ｒ５は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ６は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ７は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１０はＴｒｐおよびＰｈｅからなる群から選択され；
Ｒ１１は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ１２は、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｒ１３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１４は、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、およびＬｅｕからなる群から選択され；
Ｒ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｒ１６は、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択される。

一実施形態では、一般式Ｉは、Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６‐Ｘ１‐Ｒ１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であり、前記式中、
Ｘ１は４〜８アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ１７はＰｈｅまたはＴｙｒである。

様々な実施形態において、Ｘ１は４、５、６、７、または８アミノ酸の長さである。別の実施形態では、Ｘ１はアミノ酸配列Ｚ１‐Ａｒｇ‐Ｚ２‐Ｉｌｅ‐Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含み、前記配列中、Ｚ１はＬｙｓまたはＡｓｎであり、Ｚ２はＬｙｓ、Ｐｒｏ、およびＴｈｒからなる群から選択される。

本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることが可能な別の実施形態では、一般式Ｉは、Ａ１‐Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６‐Ｘ１‐Ｒ１７‐Ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であり、前記式中、Ｒ１〜Ｒ１７およびＸ１は上記に定義された通りであり、Ａ１およびＢ１のうち少なくとも一方は任意選択で存在し、
Ａ１は、アミノ酸配列：
ＭＳＮＡＭＤＧＱＱＬＮＲＬＬＬＥＷＩＧＡＷＤＰＦＧＬＧＫＤＡＹＤ（Ｄ／Ｖ／Ｙ）ＥＡ（Ａ／Ｄ）（Ａ／Ｋ／Ｒ）ＶＬ（Ｑ／Ｋ）ＡＶＹ（Ｅ／Ａ）Ｔ（Ｎ／Ｄ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含み、
Ｂ１は、アミノ酸配列
（Ｌ／Ａ／Ｖ）ＨＡ（Ｑ／Ｐ）ＫＬＡＲＲＬＬＥＬＫ（Ｑ／Ｌ）ＡＡＳＳＰＬＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む。本発明者らは、一般式Ｉのアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列で構成されたポリペプチド（添付文書により詳細に記載されているように、ＨＢ３６．４に由来する）が、系統発生上のグループＩのインフルエンザウイルス、好ましくはＨ１またはＨ５サブタイプのＨＡを含むＡ型インフルエンザウイルスのような、インフルエンザＡ型ヘマグルチニン（「ＨＡ」）を認識し、かつ該ＨＡへの強力な結合剤であるヘリックスを形成することを発見した。したがって、該ポリペプチドは例えば、インフルエンザ感染の治療および発症の制限のうち少なくとも一方を行うために使用されうる。

一実施形態では、該ポリペプチドは、ポリペプチド
ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦＫＲＰＩＰＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、または、一般式Ｉの任意の実施形態に従う、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上の変位部位を備えたバリアントまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７もしくは８を含む。他の実例となる実施形態では、ポリペプチドは、以下（括弧内の記載に由来するスカフォールド）すなわち：

からなる群から選択されたポリペプチドを含むかまたは該ポリペプチドで構成される。

様々な好ましい実施形態において、ＨＢ３６．４（ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））は、下記すなわち：Ｒ１はＨｉｓであること；Ｒ７はＬｙｓであること；Ｒ９はＴｙｒ、Ａｓｎ、またはＨｉｓであること；Ｒ１３はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎであること；Ｒ１６はＴｒｐであること、のうち１つ以上が真であるように改変される。別の実施形態では、Ｒ１０はＴｒｐである。さらなる実施形態では、Ｒ２およびＲ５のうち少なくともいずれか一方はＡｌａである。さらなる実施形態では、Ｒ１７はＰｈｅである。

当業者には当然のことであるが、これらは特許請求の範囲に含まれる実例となるポリペプチドにすぎない。下記の表はＨＢ３６．４スカフォールドにおける許容可能な置換を部位ごとに提示している。

ＨＢ３６．４：
（１）中央のヘリックス認識モチーフであるセリン４７‐フェニルアラニン６３（ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））；
さらにその認識モチーフの外側のＰｈｅ６９

（２）許容可能な部位は、大規模な配列決定と合わせたＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対するＨＢ３６．４バリアントの酵母ディスプレイ選択から決定された（さらなる詳細については添付文書を参照のこと）。閾値は、ＦＡＣＳによる２回の選択ソート後の、選択ライブラリ内の所与の突然変異の頻度の最大８０％減少であった。太字フォントで記入された部位は、ＨＡ表面と接触する部位を示す。

下記の表は、ＨＢ３６．４（ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））からの単一の点突然変異が結合親和性の増大をもたらすことが示される場所を示している。したがって、他の実施形態では、ポリペプチドは、以下のようなＨＢ３６．４に関するアミノ酸置換を（単独で、または組み合わせて）含む：

これらの実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の実施形態と組み合わせうる。

第２の態様では、本発明は、一般式ＩＩ
Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、上記式中、
Ｒ１はＰｈｅおよびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ３はＧｌｕおよびＡｓｐからなる群から選択され；
Ｒ４は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ７は、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＶａｌからなる群から選択され；
Ｒ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
Ｒ１１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＴｙｒからなる群から選択される。

一実施形態では、一般式ＩＩは、Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ‐Ｘ１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｘ２‐Ｒ１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）であり、前記式中、Ｒ１〜Ｒ１１は上記に定義された通りであり、
Ｘ１は５〜１５アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｙからなる群から選択され；
Ｒ１３は、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｒ１４は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、およびＬｙｓからなる群から選択される。

様々な実施形態において、Ｘ１は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸の長さである。別の実施形態では、Ｘ１はアミノ酸配列ＴＮＫＤＴＰＤＲＷ‐Ｚ１‐ＫＶＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）を含み、前記配列中のＺ１はＡｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＴｈｒである。

本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることが可能な別の実施形態において、一般式ＩＩはＡ１‐Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ‐Ｘ１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｘ２‐Ｒ１４‐Ｂ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）であり、前記式中、Ｒ１〜Ｒ１４およびＸ１は上記に定義された通りであり、Ａ１およびＢ１のうち少なくともいずれか一方は任意選択で存在し：
Ａ１はアミノ酸配列Ｚ１‐ＡＳＴＲＧＳＧＲＰＷ‐Ｚ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）を含み、前記式中のＺ１は存在しないかまたはＭｅｔであり、Ｚ２は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐからなる群から選択され、
Ｂ１はアミノ酸配列Ｇ‐Ｚ１‐ＴＰＥＥＶＫＫＨＹＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）を含み、前記式中のＺ１はＲまたはＫである。

本発明者らは、一般式ＩＩのアミノ酸配列を含むポリペプチド（添付文書により詳細に記載されているように、ＨＢ８０．３に由来する）が、インフルエンザＡ型ヘマグルチニンを認識し、かつ該ヘマグルチニンへの強力な結合剤であるヘリックスを形成することを発見した。したがって、該ポリペプチドは例えば、インフルエンザ感染の治療および発症の制限のうち少なくとも一方を行うために使用されうる。

一実施形態において、該ポリペプチドは、ペプチドＦＳＥＮＬＡＦＥＬＡＬＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）、または一般式ＩＩに従うＦＳＥＮＬＡＦＥＬＡＬＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の変位部位を含むバリアントを含む。他の実施形態では、該ポリペプチドは、ＨＢ８０．３に関して以下のようなアミノ酸置換を（単独で、または組み合わせて）含む。

部位 ＨＢ８０．３残基 親和性増大
１２ Ｒ−１ Ｇｌｙ Ｌｙｓ／Ａｒｇ
１４ Ｒ２ Ｓｅｒ Ｌｙｓ／Ａｒｇ
１７ Ｒ５ Ｌｅｕ Ｖａｌ／Ｉｌｅ
１８ Ｒ６ Ａｌａ Ｔｈｒ／Ｌｙｓ
２１ Ｒ９ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
２４ Ｒ１２ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
３９ Ｇｌｎ Ａｒｇ／Ｔｙｒ
４２ Ｓｅｒ Ｌｙｓ／Ａｒｇ
その他の実例となる実施形態では、ポリペプチドは

からなる群から選択されたポリペプチドを含むかまたは該ポリペプチドで構成される。

当業者には当然のことであるが、これらは特許請求の範囲に含まれる実例となるポリペプチドにすぎない。下記の表はＨＢ８０．３スカフォールドにおける許容可能な置換を部位ごとに提示している。

（１）中央のヘリックス認識モチーフであるフェニルアラニン１３‐フェニルアラニン２５；さらには該認識モチーフの外側のチロシン４０。

許容可能な部位は、大規模な配列決定と合わせたＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対するＨＢ８０．３バリアントの酵母ディスプレイ選択から決定された（さらなる詳細については添付文書を参照のこと）。閾値は、ＦＡＣＳによる２回の選択ソート後の、選択ライブラリ内の所与の突然変異の頻度の最大８０％減少であった。太字フォントで記入された部位は、ＨＡ表面と接触する部位を示す。

下記の表は、ＨＢ８０．３からの単一の点突然変異が結合親和性の増大をもたらすことが示される場所を示している。したがって、他の実施形態では、ポリペプチドは、以下のようなＨＢ８０．３に関するアミノ酸置換を（単独で、または組み合わせて）含む。

様々な好ましい実施形態において、ＨＢ８０．３（ＦＳＥＮＬＡＦＥＬＡＬＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９））は、下記すなわち：Ｒ２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであること；Ｒ５はＩｌｅまたはＶａｌであること；Ｒ６はＬｙｓまたはＡｒｇであること；Ｒ８はＳｅｒであること；Ｒ９はＩｌｅであること；Ｒ１１はＴｙｒであること；のうち１つ以上が真であるように改変される。

これらの実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の実施形態と組み合わせうる。
第３の態様では、本発明は、

からなる群から選択されたポリペプチドを含むかまたは該ポリペプチドで構成されるポリペプチドを提供する。

上記ポリペプチドはそれぞれ、インフルエンザＡ型ヘマグルチニンを認識し、かつ該ヘマグルチニンへの強力な結合剤であるヘリックスを形成する。したがって、該ポリペプチドは例えば、インフルエンザ感染の治療および発症の制限のうち少なくとも一方を行うために使用されうる。

第４の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドによって認識されるＨＡエピトープにドッキングかつ結合するペプチドまたはタンパク質由来の任意のヘリックスを含むかまたは該ヘリックスで構成されているポリペプチドを提供する。一実施形態では、該ヘリックスは、上記に開示されたＨＢ３６．４およびＨＢ８０．３のヘリックスと同様に、１５〜１７残基の長さである。

本願の全体にわたって使用されるように、用語「ポリペプチド」は、一続きのアミノ酸サブユニットを指す該用語の最も広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸（ｉｎ ｖｉｖｏのＬ‐アミノ酸特異的プロテアーゼに抵抗性である）、またはＤ‐アミノ酸とＬ‐アミノ酸との組み合わせを含むことができる。本明細書中に記載されるポリペプチドは、化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。該ポリペプチドは、例えばＰＥＧ化、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、グリコシル化によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期延長を促進するために他の化合物に連結されてもよいし、Ｆｃ融合体として、または脱免疫化（deimmunized）バリアント内で、生産されてもよい。当業者には理解されるように、そのような連結は共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。

さらなる実施形態では、本発明の任意の態様の任意の実施形態のポリペプチドは、検出可能な部分または治療薬のようなタグをさらに含むことができる。タグは、共有結合形成、例えば、限定するものではないが、ジスルフィド結合形成、水素結合形成、静電気結合形成、組換え融合および立体配座的結合形成により、ポリペプチドに連結されうる。別例として、タグは、１つ以上の連結化合物によりポリペプチドに連結されてもよい。ポリペプチドにタグをコンジュゲートするための技術は当業者には周知である。検出可能なタグを含むポリペプチドは、診断的に、例えば、対象者がインフルエンザウイルスに感染したかどうかを評価するために、または、例えば所与の治療レジメンの有効性を判断するための臨床試験手順の一部としてインフルエンザウイルス感染の発症もしくは進行を監視するために、使用可能である。しかしながら、タグは、その他の検出、および分析的もしくは診断的目的のうち少なくともいずれかのためにも使用されうる。任意の適切な検出タグ、例えば、限定するものではないが、酵素、補欠分子族団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが使用されうる。使用されるタグは、使用される特定の検出／分析／診断の技術かつ／または方法、例えば（組織）試料の免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、レーザー走査型サイトメトリー検出、蛍光免疫測定法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（例えば中和アッセイ）、ウェスタンブロッティングの適用などに応じて変化することになろう。組織試料の免疫組織化学的染色については、好ましいタグは検出可能な生成物の生産および局所堆積を触媒する酵素である。ポリペプチドの免疫組織化学的視覚化を可能にするために該ポリペプチドに一般的にコンジュゲートされる酵素はよく知られており、例えば、限定するものではないが、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびウレアーゼが挙げられる。視覚的に検出可能な生成物の生産および堆積のための一般的な基質も当業者にはよく知られている。ポリペプチドは、コロイド金を使用して標識されてもよいし、^３３Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ、および^１２５Ｉのような放射性同位元素で標識されてもよい。本発明のポリペプチドは、当分野でよく知られた方法によってキレート剤を介して直接または間接的に放射性核種に取り付けられてもよい。

本発明のポリペプチドが、フローサイトメトリー検出、レーザー走査型サイトメトリー検出、または蛍光免疫測定法に使用される場合、タグは例えば発蛍光団を含むことができる。本発明のポリペプチドを蛍光標識するために有用な種々様々の発蛍光団は、当業者には周知である。ポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏでの診断用途に使用される場合、タグは、例えば、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸のような磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）造影剤、超音波造影剤、もしくはＸ線造影剤を含むこともできるし、または放射性同位体標識によってもよい。

本発明のポリペプチドは固体支持体に取り付けられてもよく、固体支持体はインフルエンザウイルスまたはＨＡタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体は、多孔性でも非多孔性でも、平面状でも非平面状であることも考えられ、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンの支持体が挙げられる。該ポリペプチドはさらに、例えば、親和性クロマトグラフィー用のＮＨＳ活性化セファロースまたはＣＮＢｒ活性化セファロースのような濾過媒体に、有用なようにコンジュゲートされてもよい。さらに該ポリペプチドは、一般的にはビオチン‐ストレプトアビジン相互作用によって、常磁性ミクロスフェアに有用なように取り付けられてもよい。該ミクロスフェアは、インフルエンザウイルスまたはＨＡタンパク質を含有する試料からのインフルエンザウイルスまたはＨＡタンパク質の単離に使用されうる。別の実施例として、本発明のポリペプチドは、ＥＬＩＳＡ用の微量定量プレートの表面に有用なように取り付けられてもよい。

本発明のポリペプチドは、精製を容易にするためにマーカー配列に融合されてもよい。例としては、限定するものではないが、ヘキサヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたはフラグタグが挙げられる。

本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドが投与される対象者の免疫系によって認識される抗原にコンジュゲートされてもよい。該抗原とポリペプチドとを接続するためのコンジュゲート法は当分野においてよく知られており、限定するものではないが、架橋剤の使用が挙げられる。該ポリペプチドはインフルエンザウイルスＨＡタンパク質に結合し、該抗原は、インフルエンザウイルスの破壊を促進する、該コンジュゲートに対するＴ細胞の攻撃を開始させることになる。

本明細書中の任意の態様の別の実施形態では、本発明は本発明のポリペプチドに対応するレトロインバルソ型ポリペプチドを提供する。本発明のレトロインバルソ型ポリペプチドは、上記に開示されたポリペプチドのＬ‐配列型のポリペプチドとは逆の順序に組み立てられたＤ‐アミノ酸を含むかまたは該Ｄ‐アミノ酸で構成され、その結果として該ポリペプチドの全体的なトポロジーを維持し、かつＨＡへの結合を維持する。

第５の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。該単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。本明細書中で使用されるように、「単離核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中において正常時にその周囲にある核酸配列から取り出されている核酸である。そのような単離核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および精製のうち少なくともいずれか一方を容易にするのに有用な追加の配列、例えば、限定するものではないが、ｐｏｌｙＡ配列、修飾コザック配列、ならびに、エピトープタグ、移出シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および原形質膜局在シグナルをコードする配列、を含むことができる。本明細書中の教示に基づけば、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードすることになるかは当業者には明白であろう。

第６の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能なように連結された本発明の任意の態様の単離核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、核酸コード領域または遺伝子を該遺伝子産物の発現を達成することができる任意の制御配列に作動可能なように連結するベクターが含まれる。本発明の核酸配列に作動可能なように連結される「制御配列」は、核酸分子の発現を達成することができる核酸配列である。制御配列は、該制御配列が核酸配列の発現を導くように機能する限り、該核酸配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモータ配列と核酸配列との間に存在することが可能であり、その場合も該プロモータ配列はコード配列に「作動可能なように連結された」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられる。そのような発現ベクターは当分野において既知の任意の種類のものであってよく、例えば、限定するものではないが、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが挙げられる。開示された核酸配列の発現を哺乳類の系において駆動するために使用される制御配列は、構成的（様々なプロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦプロモータによって駆動される）であってもよいし、誘導型（例えばいくつかの誘導プロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性のプロモータによって駆動される）であってもよい。原核細胞のトランスフェクションに使用される発現ベクターの構築は当分野においてよく知られており、よって標準的技法により達成可能である。（例えば、サムブルック（Sambrook）、フリッチェ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年；Ｅ．Ｊ．マレー（E.J. Murray）編、「遺伝子の導入および発現プロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）」、ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（The Humana Press Inc.）、第１０９〜１２８ページ、ならびにアンビオン（Ambion）１９９８年カタログ（テキサス州オースティン、アンビオン）を参照）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込みにより、宿主生物体内において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明は、ウイルスベクターのような同等の機能を果たす他の発現ベクターを含むことも意図されている。

第７の態様では、本発明は、本明細書中に開示された組換え発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を提供し、該宿主細胞は原核細胞であってもよいし真核細胞であってもよい。細胞は、一過性に、または安定的に、トランスフェクションされうる。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、当分野で既知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションによって行うことができる。（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年；Ｒ．Ｉ．フレシュニー（R.I. Freshney）、「動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）」、第２版、ニューヨーク州ニューヨーク、リス社（Liss, Inc.）、１９８７年を参照のこと）。本発明のポリペプチドを生産する方法は本発明の補足部分である。該方法は、（ａ）本発明のこの態様の宿主を該ポリペプチドの発現の助けになる条件下で培養するステップと、（ｂ）任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物から回収可能であるが、培地から回収されることが好ましい。無細胞抽出物または培地からポリペプチドを回収する方法は、当業者にはよく知られている。

第８の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、およびこれらのフラグメントであってよく、当業者に既知の技術を使用して作製可能である。本明細書中で使用されるように、「選択的に結合する」とは、当業者には十分に理解されるように、該抗体が、１つ以上の他の生体分子、構造物、細胞、組織などにではなく本発明のポリペプチドに優先的に結合することを意味する。

第９の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、下記に記載された本発明の方法において使用されうる。該医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、（ａ）リオプロテクタント；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤：（ｄ）等張化剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）防腐剤および（ｇ）バッファーのうち少なくともいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のバッファーは、トリスバッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである。医薬組成物は、リオプロテクタント、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含むこともできる。ある実施形態では、該医薬組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、フェノール、ｍ‐クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ‐クレゾール、ｐ‐クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、該医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、該医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート‐２０、ポリソルベート‐４０、ポリソルベート‐６０、ポリソルベート‐６５、ポリソルベート‐８０、ポリソルベート‐８５、ポロキサマー‐１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレアート、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はさらに、等張化剤、例えば調合物をヒト血液とほぼ等張または等浸透圧にする化合物も含むことができる。典型的な等張化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物はさらに、安定化剤、例えば、対象とするタンパク質と組み合わされたときに、凍結乾燥形態または液体形態における該対象タンパク質の化学的かつ／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子を含む。典型的な安定化剤にはスクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。

ポリペプチドは医薬組成物中の唯一の活性物質であってもよいし、該組成物が、用途に適した１つ以上の他の活性物質、例えば、限定するものではないが抗ＨＡ抗体および抗ＮＡ抗体をさらに含むこともできる。

第１０の態様では、本発明は、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行う方法であって、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行うために、投与を必要とする対象者に、治療上有効な量の本発明の１つ以上のポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドのコンジュゲート、または該ポリペプチドの医薬組成物を投与することを含む方法、を提供する。該方法がインフルエンザ感染を治療することからなる場合、１つ以上のポリペプチドは、インフルエンザウイルスに既に感染している対象者、および／またはインフルエンザウイルスに感染しているであろうことを示す症状（例えば、限定するものではないが、悪寒、発熱、咽喉痛、筋痛、咳嗽、衰弱、倦怠、および全身不快感など）を患っている対象者に投与される。本明細書中で使用されるように、「治療」または「治療する」とは、下記すなわち：（ａ）対象者におけるインフルエンザウイルス力価の低減；（ｂ）対象者におけるインフルエンザウイルス力価の何らかの増大の制限；（ｃ）インフルエンザ症状の重症度の低減；（ｄ）感染後のインフルエンザ症状の発症の制限または予防；（ｅ）インフルエンザ症状の悪化の抑制；（ｆ）以前にインフルエンザ感染の症状を示した対象者におけるインフルエンザ症状の再発の制限、のうち１つ以上を達成することを意味する。

該方法がインフルエンザ感染を制限することからなる場合、１つ以上のポリペプチドは、感染しているかどうか不明であるがインフルエンザウイルスに曝露したリスクを有しうる対象者に予防的に投与される。本明細書中で使用されるように、「制限（すること）」とは、インフルエンザ感染のリスクを有する対象者のインフルエンザ感染を制限することを意味する。季節性インフルエンザの大発生という性質を前提とすれば、事実上すべての対象者が少なくとも年間の一定時期において曝露のリスクを有する。特に高いリスクを有するグループは、１８歳未満の小児、６５歳を超える成人、および喘息、糖尿病、心臓病または任意の種類の免疫不全のうち１つ以上に罹患している人を含む。

本発明の方法は、インフルエンザウイルス、例えば、限定するものではないが、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスに感染した人を治療するために使用することができる。該方法は、系統発生的グループＩのＡ型インフルエンザウイルス、特にＨ１またはＨ５サブタイプのＨＡを含むものによって引き起こされたＡ型インフルエンザウイルス感染を治療するために使用されることが好ましい。

本明細書中で使用されるように、「治療上有効な量」とはインフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくともいずれか一方を行うために有効なポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、一般的には上記に開示されたもののような医薬組成物として製剤化され、任意の適切な経路を介して、例えば経口的に、parentally、吸入スプレーにより、経直腸的に、または局所的に、従来の薬学的に許容可能な担体、補助剤および賦形剤を含有する投与単位で投与されうる。本明細書中で使用される非経口という用語には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸内、点滴技法または腹腔内が含まれる。投与レジメンは最適の望ましい応答（例えば治療的応答または予防的応答）を提供するために調節されうる。適切な用量域は、例えば、体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇであってよく；別例として、適切な用量域は体重１ｋｇあたり０．５μｇ〜５０ｍｇ；１μｇ〜２５ｍｇ、または５μｇ〜１０ｍｇであってよい。ポリペプチドは単回のボーラス投与で送達されてもよいし、主治医の決定により２回以上（例えば２、３、４、５回またはそれ以上）投与されてもよい。

ある実施形態では、本発明のポリペプチドはインフルエンザウイルスの感染力を中和する。いかなる作用機序にも限定されるものではないが、中和活性は、インフルエンザウイルスと標的細胞の細胞膜、例えばエンドソームのような細胞内区画の細胞膜などとの融合を阻害することにより達成されうる。本発明のポリペプチドは、ＨＡの立体配座変化後にはみられないＨＡエピトープを標的とするように設計された。ＨＡタンパク質の立体配座変化はウイルスと細胞膜との融合をもたらすので、融合前の形態のＨＡタンパク質へのポリペプチドの結合は、融合を防止する可能性がある。様々な実施形態において、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドの非存在下でのインフルエンザウイルスによる宿主細胞の感染と比較して、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するのを少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％防止する。中和は、例えば、Ｆ．‐Ｘ．メスリン（F. -X. Meslin）、Ｍ．Ｍ．カプラン（M. M. Kaplan）およびＨ．コプロウスキー（H. Koprowski）編、「インフルエンザの実験技法（Laboratory techniques in influenza）」、第４版、スイス国ジュネーブ、世界保健機関、１９９６年、１５〜１７章に記載されているようにして測定されうる。

本発明によるポリペプチドは、治療的または予防的な利点を提供する任意の適切な親和定数（Ｋ_ｄ値）でＨＡタンパク質に結合することができる。様々な実施形態において、該Ｋ_ｄ値は、０．２×１０^−４Ｍ、１．０×１０^−５Ｍ、１．０×１０^−６Ｍ、１．０×１０^−７Ｍ、１．０×１０^−８Ｍ、１．０×１０^−９Ｍ、１．０×１０^−１０Ｍ、１．０×１０^−１１Ｍ、または１．０×１０^−１２Ｍ未満である。親和定数は、例えば、表面プラズモン共鳴、すなわちバイオセンサマトリクス内のタンパク質濃度変化の検出によりリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を使用して、例えばＢＩＡＣＯＲＥシステム（スウェーデン国ウプサラのファルマシア・バイオセンサ社（Pharmacia Biosensor AB））を使用して、測定されうる。

第１１の態様では、本発明は、インフルエンザ感染の診断、またはインフルエンザ感染の進行の監視のための方法を提供し、該方法は、
（ａ）インフルエンザに感染している疑いのある対象者由来の生体試料を、診断上有効な量の本発明の１つ以上のポリペプチドと、該ポリペプチドが該試料中に存在するウイルスＨＡタンパク質に結合するのに適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）結合していないポリペプチドおよび試料のうち少なくともいずれか一方を除去するステップと；
（ｃ）ポリペプチド‐ウイルスＨＡ結合複合体を検出するステップと
を含み、そのような結合複合体の存在は、該対象者がインフルエンザに感染していることを示すか、またはインフルエンザ感染の進行の程度を提供する。

本発明のこの態様の方法は、インフルエンザ感染に罹患している可能性のある患者をより正確に同定するために、また、したがってより十分な情報に基づいた介護担当者による治療選択肢の決定をもたらすために、使用することができる。インフルエンザ感染のリスクを有する人は上記に記載のとおりである。該方法はインフルエンザ感染の進行を監視するために使用することも可能であり；この実施形態では、対象者は感染していることが分かっており、該方法は、例えば、介護担当者がノイラミニダーゼまたはＭ２タンパク質阻害剤を用いた治療など特定の治療を開始、修正、または継続するべきかどうかを決定するためのデータポイントとして、使用されうる。

生体試料は、感染のリスクを有する対象者由来の、任意の適切な生体試料、例えば、限定するものではないが、血液、血清、鼻分泌物、組織またはその他の生体物質であってよい。

試料は、該試料を検出方法により適したものにするために最初に処置が施されてもよい。「処置」には、限定するものではないが、試料中の全てのインフルエンザウイルスが崩壊してタンパク質、ポリペプチドまたは他の抗原性フラグメントのような抗原成分になるような方法で該試料を処理することが含まれる。本発明のポリペプチドは、該ヒトポリペプチドと試料中に存在しうるインフルエンザウイルスまたはその抗原成分との間の複合体の形成を可能にする条件下で該試料と接触させる。そのような複合体の形成（存在する場合は試料中のインフルエンザウイルスの存在を示す）は、その後、適切な手段により検出および測定される。そのような方法には、限定するものではないが、ホモジニアスおよびヘテロジニアスな結合免疫測定法、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、免疫組織化学法、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥおよびウエスタンブロット解析が含まれる。本発明の１つ以上のポリペプチドへの試験化合物の結合を促進する適切な条件は、本明細書中の教示に基づいて、当業者により決定されうる。

この態様で使用される本発明のポリペプチドは、所与のアッセイに適した任意の検出技法に有用なタグを提供するために、上記に開示されるようなコンジュゲートからなることもできる。使用されるタグは、使用される特定の検出／分析／診断の技法および／または方法に応じて変化することになろう。該方法は溶液中で行われてもよいし、本発明のポリペプチドは、担体または基材、例えば微量定量プレート（例えばＥＬＩＳＡ用）、メンブレンおよびビーズなどに結合または付着させてもよい。担体または基材は、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロンなどで作製されうる。そのような支持体の表面は、一面に均質であっても、多孔性であってもよく、かつ任意の便利な形状のものであってよい。１つの実施形態では、条件は、０．２×１０^−４Ｍ、１．０×１０^−５Ｍ、１．０×１０^−６Ｍ、１．０×１０^−７Ｍ、１．０×１０^−８Ｍ、１．０×１０^−９Ｍ、１．０×１０^−１０Ｍ、１．０×１０^−１１Ｍ、または１．０×１０^−１２Ｍ未満のＫ_ｄ値で本発明のポリペプチドに結合する試験化合物を同定するために選択される。

第１２の態様では、本発明は、インフルエンザワクチン候補を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物を、本発明のポリペプチドと、ポリペプチドの結合に適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）本発明のポリペプチドに結合する試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザワクチン候補である、ステップと
からなる方法を提供する。

上記に議論されるように、本発明のポリペプチドは、ＨＡの立体配座変化後にはみられないＨＡエピトープを標的とするように設計された。したがって、本発明のポリペプチドは、特異的エピトープに結合する抗体と同様の、ＨＡエピトープへの特異的結合剤として見ることができる。ワクチン剤は、例えば、ウイルスエピトープに特異的な抗体に結合する小分子（すなわちミモトープ）を選択することにより生産されうる。したがって、本方法は、インフルエンザワクチン候補を同定するためのそのようなアッセイにおいて抗体の代わりに本発明の１つ以上のポリペプチドを用いることを伴う。

本発明の１つ以上のポリペプチドへの試験化合物の結合を促進する適切な条件は、本明細書中の教示に基づいて、当業者によって決定されうる。この態様で使用される本発明のポリペプチドは、所与のアッセイに適した任意の検出技法に有用なタグを提供するために、上記に開示されるようなコンジュゲートからなることができる。使用されるタグは、上記に議論されたように、使用される特定の検出／分析／診断の技法および／または方法に応じて変化することになろう。該方法は溶液中で行われてもよいし、本発明のポリペプチドは、上記に議論されたように担体または基材に結合または付着させてもよい。本明細書中の教示に基づけば、本発明のこの態様に開示された様々な種類の診断アッセイのための特定の条件を決定することは、当分野の技術の範囲内にある。一実施形態では、条件は、０．２×１０^−４Ｍ、１．０×１０^−５Ｍ、１．０×１０^−６Ｍ、１．０×１０^−７Ｍ、１．０×１０^−８Ｍ、１．０×１０^−９Ｍ、１．０×１０^−１０Ｍ、１．０×１０^−１１Ｍ、または１．０×１０^−１２Ｍ未満のＫ_ｄ値で本発明のポリペプチドに結合する試験化合物を同定するために選択される。

試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。組換え発現は、上記に開示されるように、当分野における標準的な方法を使用して行われうる。そのような発現ベクターは細菌またはウイルスの発現ベクターを含むことが可能であり、そのような宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。固相、液相、もしくはペプチド縮合の技法のうちよく知られた技法、またはこれらの任意の組み合わせを使用して調製された合成ポリペプチドは、天然または非天然のアミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄のプロトコールを用いる標準的Ｂｏｃ（Ｎα‐アミノ基保護化Ｎα‐ｔ‐ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、または標準的な塩基に不安定なＮα‐アミノ基保護化９‐フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃいずれのＮα‐アミノ基保護化アミノ酸も、シグマ（Sigma）、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（Cambridge Research Biochemical）、または当業者によく知られたその他の化学企業から入手可能である。さらに、ポリペプチドは、当業者によく知られたその他のＮα保護基を用いて合成されてもよい。固相ペプチド合成は当業者によく知られた技法により達成可能であり、自動合成機の使用などにより提供されうる。

試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。該抗体は、抗体のヒト化型、完全なヒト型、またはネズミ科動物型であってよい。そのような抗体は、よく知られた方法、例えばハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）、「抗体；実験マニュアル（A Laboratory Manual）」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、コールド・スプリング・ハーバー研究所、１９８８年に記載の方法により作製されうる。

試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸は、化学合成のような任意の適切な方法によって生産されうる。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖であってもよい。同様に、そのような核酸は、当分野の標準的な技法を使用して、手動による反応または自動化反応により化学的または酵素的に合成されうる。化学的に、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素的合成により合成された場合、核酸は細胞内への導入に先立って精製されうる。例えば、核酸は、溶媒もしくは樹脂を用いた抽出、沈澱反応、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせによって、混合物から精製可能である。別例として、核酸は、試料の処理過程に起因する損失を回避するために、精製せずに、または最低限の精製を用いて使用されてもよい。

試験化合物がポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含む場合、そのような化合物は、有機化学合成を行なうための当分野における様々な方法のうちのいずれかによって作製されうる。

第１３の態様では、本発明は、インフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）インフルエンザＨＡタンパク質を、（ｉ）試験化合物および（ｉｉ）本発明のポリペプチドと、本発明のポリペプチドへのＨＡタンパク質の結合に適した条件下において接触させるステップと；
（ｂ）ＨＡタンパク質への結合に関して該ポリペプチドより優れた試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
を含む方法を提供する。

この態様では、該方法は、ＨＡへの結合に関して本発明のポリペプチドと競合する試験化合物を同定し、したがって、そのような候補化合物は、本明細書中に開示された本発明の他の方法のいずれにおいても有用となりうる。本発明の第１１の態様において上記に議論されるように、任意の適切な試験化合物が使用されうる。

一般に、競合的阻害はアッセイによって測定され、該アッセイにおいてＨＡ組成物は本発明のポリペプチドおよびスクリーニングされる試験化合物と混合される。一実施形態では、スクリーニングされる試験化合物は過剰量で存在する。ＥＬＩＳＡに基づいたプロトコールは、そのような競合試験に使用するのに適している。ある実施形態では、本発明のポリペプチドを様々な量のスクリーニングされるべき試験化合物と（例えば１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０または１：１００に）一定期間予め混合してからＨＡ組成物に適用することができる。他の実施形態では、本発明のポリペプチドおよび様々な量のスクリーニングされるべき試験化合物は、ＨＡ組成物に曝露される間に混合される。任意の適切な検出手段が結合に使用されうる。一実施形態では、上記に議論されるように、本発明のポリペプチドが検出のためにタグ付けされる。この実施形態では、検出可能な標識は競合的試験化合物の存在下において減少することになる。試験化合物の非存在下における本発明の（標識された）ポリペプチドの反応性は、１つの適切な対照としての役割を果たすことも考えられる。好ましくは、競合的試験化合物は、過剰量で存在する場合、ＨＡへの本発明のポリペプチドの特異的結合を、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％〜９０％またはさらにそれ以上抑制するであろう。

ＨＡ結合試験のための例示の条件は、以下の実施例において開示されるように実行されうる。
本明細書中に開示された以上の態様／実施形態はすべて、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、任意の他の態様／実施形態と組み合わせることができる。

実施例１．インフルエンザヘマグルチニンに結合するタンパク質の設計
要約
本発明者らは、標的巨大分子上の対象とする表面区画に結合するタンパク質を設計するための一般的なコンピュータ計算方法について述べる。実体のない（disembodied）アミノ酸残基と標的表面との間の良好な相互作用が同定され、新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）設計された境界面を固定するために使用される。該方法は、１９１８年Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルス由来のインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の基部上の保存された表面区画に結合するタンパク質を設計するために使用された。親和性成熟の後、設計されたタンパク質のうちの２つであるＨＢ３６およびＨＢ８０は、Ｈ１およびＨ５のＨＡに低ｎＭの親和性で結合する。さらに、ＨＢ８０は低ｐＨで誘導されるＨＡの融合誘導性の立体配座変化を阻害する。１９１８／Ｈ１ ＨＡとの複合体におけるＨＢ３６の結晶構造から、実際の結合境界面がコンピュータ設計モデルにおける結合境界面とほとんど同一であることが明らかになった。そのような設計タンパク質は、診断薬および治療薬の両方に有用となりうる。

序論
分子認識は生物学の中核をなすものであり、抗体のような高親和性結合タンパク質は診断および治療のいずれにとっても非常に貴重である（１）。対象とするタンパク質に結合する抗体およびその他のタンパク質を生産するための現行の方法には、免疫系またはライブラリ構築により生成された多数のバリアントのスクリーニングを伴う（２）。高親和性結合タンパク質のコンピュータを用いた設計は、分子認識の物理・化学的基礎についての現時点での理解の基本的試験であり、成功すれば、タンパク質表面上の特定区画の標的化が可能となるので、現行のライブラリを用いるスクリーニング方法を強力に補完するものとなろう。タンパク質相互作用のコンピュータ設計における近年の進歩は、相互作用特異性の切替え（３）、適度な親和性の複合体を生成する方法（４、５）、新規なタンパク質境界面の二面設計（６）、および無関係なタンパク質スカフォールド上に既知の重要残基をグラフトすることによる高親和性相互作用の設計（７）をもたらした。しかしながら、任意に選択されたタンパク質表面を標的とする能力は捉えがたいままであった。

インフルエンザは重大な公衆衛生上の課題を提示しており、既存の抗ウイルス薬（８）に抵抗性であるかまたは免疫系による中和を回避するウイルスと戦うために新たな治療法が必要とされている。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、気道の内側を覆う細胞へのウイルスの侵入において大きな役割を果たすことから、薬剤開発の第１の候補である。ほとんどの抗体はＨＡの急速に変化する頭部に結合するが、最近、すべてのグループ１インフルエンザ株において保存されている（１１）ＨＡ基部の領域に結合する２つの抗体ＣＲ６２６１およびＦ１０が、構造的に特徴解析された（９、１０）。本明細書では、本発明者らは、タンパク質間相互作用をｄｅ ｎｏｖｏ設計するためのコンピュータ計算方法について述べ、該方法をインフルエンザＨＡの保存された基部領域への高親和性結合剤を設計するために使用する。

コンピュータ計算による設計法
コンピュータ計算による設計戦略を考案するにあたり、本発明者らは解離可能なタンパク質複合体に共通の特徴を考慮した。タンパク質複合体の形成時、タンパク質は、溶媒に曝露される表面積の平均〜１，６００Å^２を埋没させる（１２）。境界面は、典型的には、パートナータンパク質との高度に最適化されたファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用および静電相互作用をなすいくつかの残基を含有し、これらの相互作用ホットスポットは結合エネルギーの大部分をもたらす（１３）。

したがって本発明者らの戦略は、高い形状相補性と高度に最適化されたホットスポット様の残基相互作用のコア領域との両方を有する境界面の設計に重点を置いている。本発明者らは、スカフォールドタンパク質に設計改変を施して、高親和性相互作用および高い形状相補性を、２ステップ（図１を参照）すなわち：（ｉ）実体のないアミノ酸残基を標的表面に対してコンピュータ上でドッキングまたは位置決めし、該標的表面とのエネルギー的に好ましい配位を同定するステップ、および（ｉｉ）重要な残基を組み込むスカフォールドタンパク質の形状相補的な配位を計算するステップ、において付与した。

ＨＡ結合性タンパク質の設計
中和抗体によって認識されるＨＡ基部上の表面は、エピトープへの結合に厳格な立体障害を設ける２つのループが側方に位置する、疎水性の溝で構成されている（図２Ａ−Ｂ）（１４）。本発明者らの設計プロトコール（図１）の第１のステップにおいて、コンピュータ上のドッキングにより見出される実体のない残基は３つの領域内に分かれる（ＨＳ１、ＨＳ２およびＨＳ３；図１）。ＨＳ１では、Ｐｈｅ側鎖は、ＨＡ第２鎖（ＨＡ２）のＴｒｐ２１とともにエネルギー的に好ましい芳香族スタッキング相互作用を形成する（ＨＡ残基の番号付けはＨ３サブタイプの配列番号付けの慣例に対応する）。ＨＳ２では、非極性残基のＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、およびＶａｌが、疎水性の溝およびＨＳ１の両方とともに有利なファンデルワールス相互作用を生じる（図１）。ＨＳ３では、Ｔｙｒ側鎖が、ＨＡ２のＡｓｐ１８との水素結合およびＨＡ２のＡヘリックスとのファンデルワールス相互作用を形成する。ＨＳ３のＴｙｒは、ＨＡとＣＲ６２６１ Ｆａｂとの複合体の構造において抗体上に観察されるＴｙｒ残基の立体配座に類似しているが；ＨＳ１およびＨＳ２の相互作用は該抗体構造には見出されない（９、１０、１５）。

第２のステップでは、本発明者らは、実体のないホットスポット残基および基部領域に相補的な形状を支持することが可能なスカフォールド用に、実験的操作が容易であるように選択された一連の８６５個のタンパク質構造を探索した（１６）。各スカフォールドタンパク質は、フィーチャマッチングアルゴリズムＰａｔｃｈＤｏｃｋ（商標）（１７）を使用して基部領域に対してドッキングされ、各スカフォールドについて何百もの適合する結合モードが同定された（合計で２６０，０００）。その後、これらの粗視化（coarse-grained）結合モードは、スカフォールドタンパク質の主鎖と可能な限り多くのホットスポット残基との両立性を最大限にする配位を支持するポテンシャル関数を用いて、ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋ（商標）（１８）を使用して精密化された。次に、ホットスポット残基ライブラリからの残基がスカフォールドに組込まれた。最初に、ＨＳ１の各Ｐｈｅ立体配座については、ホットスポット残基の４Å以内に主鎖の原子を備えたスカフォールド残基が同定された。これらの候補部位の各々について、スカフォールドタンパク質はホットスポットの主鎖と同一空間を占めるように配置され、残基は明示的にモデル化され、剛体（rigid-body）の配向は最小化された。立体化学的衝突が観察されず、かつＰｈｅがＨＡ２のＴｒｐ２１およびＴｈｒ４１と接触した場合（図２Ｂ）、第１のホットスポットの配置は成功と考えられ；そうでない場合は、別のＨＳ１ Ｐｈｅ立体配座が選択されて該処理過程が繰り返された。ＨＳ１を用いた各成功例について、スカフォールドタンパク質中の部位であって該部位からＨＳ２相互作用が実現されうる部位に非極性残基が組み込まれ、スカフォールドタンパク質表面の残り部分は次いでＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（商標）（１９）を使用して再設計された。

さらにＨＳ３相互作用を含めてタンパク質を設計することは、考慮されるべき残基配置の多数の組み合わせにより、さらに困難であった。３つのホットスポット領域すべてを含む設計物を生成するために、本発明者らは、ＨＳ３のＴｙｒ残基の主鎖上にスカフォールドタンパク質を重ね合わせることから出発した（上記のＰｈｅ ＨＳ１残基と同様）。本発明者らは次に、ＨＳ１およびＨＳ２の残基に最も近く、かつ該残基に対して最もよく整列される、スカフォールドタンパク質上の２つの部位を探索した。次いでこれらの部位は、ＨＳ１の場合のＰｈｅ、およびＨＳ２の場合の非極性残基に対して同時に設計された。その後、ＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（商標）（１９）が使用されてスカフォールドタンパク質上の境界面の残り部分が再設計され、ＨＡから１０Åの距離範囲内の配列変更が可能となった。

実験的かつ構造的特徴解析
２つのホットスポット残基の概念を使用する合計５１個の設計物、および３つの残基の概念を使用する３７個の設計物が、試験のために選択された。該設計物は７９個の異なるタンパク質スカフォールドに由来し、平均１１個の突然変異によりスカフォールドとは異なっている。該設計物をコードする遺伝子が合成され、酵母ディスプレイベクター内にクローニングされ、酵母菌株ＥＢＹ１００の形質転換に用いられた（２０、２１）。誘導すると、設計タンパク質は、Ａｇａ２ｐ酵母タンパク質の付着サブユニットとＣ末端ｃ‐ｍｙｃタグとの間の融合物として細胞表面にディスプレイされる。設計物を発現する細胞は、１μＭのビオチン化されたＳＣ１９１８／Ｈ１（Ａ／サウスカロライナ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１））ＨＡエクトドメインとともにインキュベートされ、洗浄され、フィコエリトリンとコンジュゲートされたストレプトアビジンおよびフルオレセインとコンジュゲートされた抗ｃ‐ｍｙｃ抗体で二重標識された。結合は、ＨＡへの結合および設計物の表面ディスプレイの同時的調査を可能にする２つの蛍光タグを用いたフローサイトメトリーによって、測定された。

７３個の設計物が表面ディスプレイされ、２個がＨＡ基部領域について再現性のある結合活性を示した（２２）（モデルに関しては図２Ｃ−Ｆを参照）。一方の設計物であるＨＡ結合剤（ＨＡ Ｂｉｎｄｅｒ）３６（ＨＢ３６）は、２残基ホットスポットを用いたものであり、２００ｎＭの見かけの解離定数（Ｋ_ｄ）でＨＡに結合した（２３）（図２Ｇ、図６）。出発物質のスカフォールドである、構造ゲノミクス標的ＡＰＣ３６１０９は、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）由来の機能未知のタンパク質（ＰＤＢエントリー番号１Ｕ８４）であって、ＨＡには結合せず（図６）、このことは結合がＨＢ３６の設計表面を介していることを示している。第２の設計物であるＨＢ８０は、３残基ホットスポットを用いたものであり、ＨＡにごく弱く結合した（図２Ｈ）。この設計物の由来元のスカフォールドである、キンギョソウ（A. Majus）由来のＲＡＤ転写因子ＭＹＢドメイン（ＰＤＢコード：２ＣＪＪ）（２４）も、ＨＡに結合しなかった（図７）。

該２つの設計物のコンピュータ計算モデル（図２Ｃ‐Ｆ）において、ホットスポット残基は、天然のタンパク質‐タンパク質境界面で観察されることの多い、極性かつ荷電した残基の外輪を備えた疎水性残基の同心配置構成により強化されている。いずれの設計物も、ＨＡの疎水性の溝の中に嵌合するヘリックス上に一列の疎水性残基を呈する。該複合体はそれぞれ、ほぼ１，５５０Å^２の表面積（合計）を埋没させるが、これは解離可能なタンパク質相互作用の平均値に近く（１２）、かつ２つの中和抗体の各々によって埋没する総表面積（９、１０）よりわずかに大きい。これらの設計物のヘリックス結合モードは、抗体が結合した構造物で観察されるループを基にした結合とは非常に異なっている。

親和性成熟
コンピュータ設計のプロトコールは完全とはほど遠く、設計物を導くエネルギー関数は多数の近似を含み（２５）、立体配座のサンプリングは不完全である。本発明者らは、設計プロトコール中の欠点を特定するために親和性成熟を使用した。ＨＢ３６およびＨＢ８０バリアントのライブラリが、境界面の単一部位の飽和突然変異誘発によって、またはエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によって生成され、酵母表面ディスプレイを使用したＨＡへの結合に関する２回の選択に供された（２１、２４）。

いずれの設計結合剤についても、選択は、親和性を増大させ、かつ基礎をなすエネルギー関数をいかに改善するかについての洞察を提供する、少数の置換に収束した。巨大分子相互作用のエネルギー学への重要な寄与には、原子の重なり合いに起因する短距離の反発相互作用、荷電原子および極性原子の間の静電相互作用、ならびに溶媒との良好な相互作用の排除（脱溶媒和）がある。親和性を増大させる置換は、初期設計の計算において上記の寄与の各々をいかにしてより良好にモデル化するかを指し示している。

反発相互作用：ＨＢ３６について、等価体Ｔｈｒ／Ｖａｌを用いたＡｌａ６０の置換が見かけの結合親和性を２５倍高めた（すべての設計バリアントについての見かけのＫ_ｄは表５に記載されている）。

これらの置換は、設計タンパク質とＨＡ表面との間の空間を満たすが、ＨＢ３６内部の立体化学的衝突によって不利になるため初期設計物には含まれなかった（図３Ａ）。しかしながら、主鎖の最小化により上記衝突は容易に軽減され、その結果該置換についてより高い親和性が予測された。ＨＢ８０については、Ｍｅｔ２６Ｔｈｒ突然変異が出発設計物と比較して結合を顕著に高めた。モデル化から、Ｍｅｔ２６はＴｙｒホットスポット残基の立体配座に不利であることが示されたが、このことはより小さな残基への置換に合理的説明を与える（図３Ｂ）。設計アルゴリズムに主鎖の最小化をより直接的に組み込むことにより、最初からそのような有利な相互作用を同定することが可能になるはずである一方、ホットスポット残基が設計物中で完全に緩んだ状態にあることを確実にすれば不利な相互作用は排除されるであろう。

静電作用：ＨＢ３６では、６４位におけるＬｙｓへの置換が、ＨＡの保存された基部領域付近の酸性ポケットに隣接して相補的な電荷を設け（図３Ｃ）；ＨＢ８０では、Ａｓｎ３６Ｌｙｓ置換が、ＨＡ２の陰性のＡｓｐ１８から６．５Åに陽電荷を位置づける（図３Ｄ）。これらの置換はすべて、複合体中の静電気的相補性を増強する。リジンは、水素結合形成の範囲の外側の原子間の表面‐静電相互作用の規模が大きく低減されるので、設計計算においては選択されなかった。静電作用モデルの改善は、より親和性の高い結合剤の設計を最初から可能にするであろう。

脱溶媒和：ＨＢ３６では、Ａｓｐ４７における８つの異なる置換が、初期設計物と比較して見かけの親和性を１桁以上増大させ（表６）、親和性の最も高い置換は結合親和性をおよそ４０倍増大させたＡｓｐ４７Ｓｅｒであった。この部位における不利な荷電基の設計は、恐らくはＨＡ２の脂肪族のＩｌｅ１８によるＡｓｐ４７の脱溶媒和のエネルギーコストの過小評価に由来し（図３Ｅ）、置換体は、このＡｓｐを、結合時に脱溶媒和するためにさほどコストのかからない残基に置き換えることにより、上記の誤りを改善する。ＨＢ８０では、Ａｓｐ１２Ｇｌｙ置換が、近隣にあるＨＡ２のＩｌｅ５６による脱溶媒和を軽減する（図３Ｆ）。溶媒和モデルにおける改善を用いれば、有害なＡｓｐ残基は出発設計物中には存在しないであろう。

有利な置換が組み合わされ、該タンパク質は大腸菌においてＨｉｓタグを備えて発現され、ニッケル親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。Ａｓｐ４７ＳｅｒおよびＡｌａ６０Ｖａｌ置換を組み込んだバリアントＨＢ３６．３は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；）、ＥＬＩＳＡ、およびサイズ排除カラムでの同時溶出（データは示さない）によって確認されるように、ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに結合した。Ａｓｐ４７Ｓｅｒ、Ａｌａ６０ＶａｌおよびＡｓｎ６４Ｌｙｓを組み込んだＨＢ３６．４バリアントは、ＳＰＲにより測定された２２ｎＭの解離定数および７・１０^−３ｓ^−１の解離速度（off-rate）でＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに結合した（表７）。過剰量のＣＲ６２６１ ＦａｂとともにコインキュベートすることによりＨＡへの結合は消失したが（図３Ｇ）、これはＨＢ３６．４がＨＡ上の同じ基部エピトープのすぐ近くに結合することと一致している。ＨＢ８０の設計については、親和性を増大する突然変異の組み合わせは酵母での表面発現を低減し、安定性に乏しいことが示された。したがって、本発明者らはＣ末端伸長部を削除し（Δ５４‐９５）、結合親和性の著しい損失を伴わずに該設計物の表面発現を大きく押し上げた（図８）。この短縮化のほかにＡｓｐ１２Ｇｌｙ、Ａｌａ２４Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２６ＴｈｒおよびＡｓｎ３６Ｌｙｓ置換を組み込んだＨＢ８０．３は、ＳＰＲによれば４・１０^−２ｓ^−１の解離速度を備えたＫ_ｄ＝３８ｎＭを有する。ＨＢ３６．４と同様に、ＣＲ６２６１ Ｆａｂを伴ったＨＡとのコインキュベートによりＨＢ８０．３への結合は消失し（図３Ｈ）、これは設計された結合モードと一致する。

親和性成熟がなされた設計物上のいくつかのコア部位の部位特異的アラニン突然変異導入はＨＡ結合を部分的または完全にノックアウトし（表８、図９）、このことは設計された境界面のコンピュータ計算モデルを支持している（２６）。更に、より高い親和性についての選択の間に、設計された結合モードと一致しない突然変異は見出されなかった。

ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８ ＨＡ複合体の結晶構造
ＳＣ１９１８ ＨＡエクトドメインとの複合体におけるＨＢ３６．３の結晶構造は３．１Å分解能まで決定された。探索モデルとして１９１８／Ｈ１ ＨＡ構造のみを使用した分子置換（結晶の非対称単位でタンパク質質量のおよそ８６％）の後、ＨＢ３６．３がその領域内に配置されることは疑いないと考えられるＨＡ基部領域の標的表面付近にＨＢ３６．３について明瞭な電子密度が観察された。配向は、ＨＡ上の疎水性の溝の中にパッキングされる主要な認識ヘリックスの改変表面と共に、設計された結合モードとほとんど同一であった（図４Ａ）。設計された側鎖についてバイアスなしの密度を得るために、ＨＢ３６．３の由来元の天然構造（ＰＤＢエントリー：１Ｕ８６）が手作業で電子密度マップにフィッティングされ、接触側鎖はそのβ‐炭素まで切り詰め処理がなされた。結晶学的精密化の後、ＨＢ３６．３上のほとんどの接触残基の側鎖について電子密度が明らかとなり、Ｐｈｅ４９、Ｔｒｐ５７、Ｐｈｅ６１およびＰｈｅ６９について有力な回転異性体の割り当てが可能となった。このバイアスなしの密度は、上記４つの疎水性側鎖がすべて、設計されたモデルにおけるように位置決めされうることを明白に示している（図４Ｂ）。Ｍｅｔ５３側鎖は設計モデルと一致しているが（図４Ｃ）、他の回転異性体が該マップにフィッティングされることも考えられる。Ｍｅｔ５６については、非常に弱い側鎖密度しか観察されなかった。全体として、該結晶構造は、いずれの接触部位においても著しい偏りを伴うことなく、設計された境界面と非常に良く一致している。

かなり低い（７３個の表面ディスプレイタンパク質のうち２個）設計成功率および出発時の親和性を考えると、設計されたＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８ ＨＡ複合体と実験的に決定された該複合体との間の原子レベルの一致は、非常に有望であるとともに、現行のエネルギー関数および設計方法論がその欠点にもかかわらずタンパク質間相互作用の基本的な特徴を捕らえていることを示唆している。

交差反応性および阻害活性
ＨＢ３６．３が接触する表面は、接近可能でありかつほとんどのグループ１インフルエンザウイルスのＨＡにおいて高度に保存されており、他のＨ１ ＨＡだけでなく他のＨＡサブタイプにも結合する能力を有する可能性があることが示唆される。実際、ＨＢ３６．３によるＡ／サウスカロライナ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）への結合はゲル濾過（データは示さない）により溶液中で、加えてＨＢ３６．４によるＡ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５サブタイプへの高親和性結合は酵母ディスプレイにより、容易に検出可能である（図１０）。

ＨＡとの複合体におけるＨＢ８０の結晶構造は得られていない一方、突然変異のデータおよび抗体との競合の結果は、ＨＢ８０も、ＨＢ３６およびＣＲ６２６１と重複する、意図された標的表面に結合することを示唆している。従って、ＨＢ８０．３も高い交差反応性を有すると予想され、かつ、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５ ＨＡに（図１０）、ならびにバイオレイヤー干渉法によればＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ６サブタイプに（図５Ａ、Ｂ）、高い親和性で結合する。全般に、ＨＢ８０の結合パターンはＣＲ６２６１の結合パターンに酷似しており、試験されたほとんどのグループ１のＨＡに結合するとともに、グループ２のＨＡへの検出可能な結合は伴わない。

抗体ＣＲ６２６１は、宿主細胞のエンドソーム膜とのウイルスエンベロープの融合を推進するｐＨ誘発性のＨＡリフォールディングを阻止することにより、インフルエンザウイルスの複製を阻害する。ＨＢ８０．３およびＣＲ６２６１の結合部位の間の広範囲な重複、ならびにＳＣ１９１８ ＨＡに対するその高親和性を考えると、ＨＢ８０．３もこの立体配座変化を阻止するであろうことは妥当であるように思われた。実際、ＨＢ８０．３はＨ１およびＨ５のＨＡ両方においてｐＨ誘発性の立体配座変化を阻害し（図５Ｃおよび図１１）（１０）、この設計物が複数のインフルエンザサブタイプに対するウイルス中和活性を有する可能性が示唆される（２７）。

実施例１に関する参照文献および注記
１． H. Ledford, Nature 455, 437 (2008).
２． R. A. Lerner, Angew Chem Int Ed Engl 45, 8106 (2006).
３． T. Kortemme et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 371 (2004).
４． R. K. Jha et al., J Mol Biol 400, 257 (2010).
５． P. S. Huang, J. J. Love, S. L. Mayo, Protein Sci 16, 2770 (2007).
６． J. Karanicolas et al., Mol. Cell in press, (2011).
７． S. Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA104, 5330 (2007).
８． E. Bautista et al., N Engl J Med 362, 1708 (2010).
９． J. Sui et al., Nat Struct Mol Biol 16, 265 (2009).
１０． D. C. Ekiert et al., Science 324, 246 (2009).
１１． グループ１は、１６個のＨＡサブタイプのうち１０個：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３およびＨ１６を含む。グループ２は残り６個のサブタイプ：Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５を含む。
１２． L. Lo Conte, C. Chothia, J. Janin, J Mol Biol 285, 2177 (1999).
１３． T. Clackson, J. A. Wells, Science 267, 383 (1995).
１４． M. G. Rossmann, J Biol Chem 264, 14587 (1989).
１５． 他のホットスポット残基（ＨＳ１およびＨＳ２）は、その立体配座または同一性において、結晶構造中に観察された側鎖とは異なっていた。ホットスポット残基はそれぞれ、あらゆる立体配座を構築することによりさらに多様化され、該立体配座の末端原子は上記にモデル化されたものと一致した。例えば、ＨＳ３については、これらは芳香環および水素結合の位置を一致させたあらゆるＴｙｒ立体配座で構成された。この多様化ステップは、ホットスポットライブラリ内の各残基について主鎖部位の「ファン（fan）」を生じた。
１６． スカフォールドセット内のタンパク質はジスルフィドを含有せず、大腸菌で発現され、モノマーを形成することが予想された（補足情報を参照）。
１７． D. Schneidman-Duhovny, Y. Inbar, R. Nussinov, H. J. Wolfson, Nucleic Acids Res 33, W363 (2005).
１８． J. J. Gray et al., J Mol Biol 331, 281 (2003).
１９． B. Kuhlman et al., Science 302, 1364 (2003).
２０． J. Chen, J. J. Skehel, D. C. Wiley, Proc Natl Acad Sci USA 96, 8967 (1999).
２１． G. Chao et al., Nat Protoc 1, 755 (2006).
２２． 第３の設計物ＨＢ３５は低μΜのみかけの親和性でＨＡに結合した；しかしながら、結合は、ＣＲ６２６１ Ｆａｂを伴ったＨＡとのコインキュベートでは部分的にしか消失せず、ＨＡの基部領域上の標的表面と最大でも部分的にしか接触しないことが示唆され、よってこの設計物はさらなる検討から除外された。少数の他の設計物は、弱く、かつ再現性が不完全ではあるがＨＡに結合した。
２３． 本発明者らは２つの主要な方法を使用して、すなわち：酵母表面にディスプレイされた設計物に対するＨＡの滴定により、また、表面プラズモン共鳴を使用する速度論的測定値および平衡測定値の両方のフィッティングにより、解離定数を記録した。Ｋｄの決定において該方法の間に相違があるので、酵母表面ディスプレイ滴定に由来する測定値がみかけのＫｄとして記録されており、該測定値は定性的に考察されるべきである。
２４． C. E. Stevenson et al., Proteins 65, 1041 (2006).
２５． R. Das, D. Baker, Annu Rev Biochem 77, 363 (2008).
２６． アラニンスキャン突然変異は以下すなわち：ＨＢ３６．３についてはＰｈｅ４９、Ｍｅｔ５３およびＴｒｐ５７；ＨＢ８０．１についてはＰｈｅ１３、Ｐｈｅ２５およびＴｙｒ４０（表Ｓ４および補足結果）であった。
２７． ＨＢ３６．４およびＨＢ８０．３はｐＨ７．５において非常に類似した解離定数および速度論的解離速度（kinetic off-rate）を有しているにもかかわらず、ＨＢ３６．４は同一のアッセイ条件下でＨ１ ＨＡのｐＨ誘発性の立体配座変化を阻止することができなかった（図１１）。
２８． コンピュータ設計物は、ロゼッタ＠ホーム（Rosetta＠Home）およびアルゴンヌ国立リーダーシップコンピューティング施設（Argonne National Leadership Computing Facility）の参加者によって惜しみなく提供された資料について生成された。Ｘ線回折データセットは、スタンフォード・シンクロトロン放射光源（Stanford Synchrotron Radiation Lightsource）ビームライン９‐２、および新型光子源（Advanced Photon Source）ビームライン２３ＩＤ‐Ｂ（ＧＭ／ＣＡ‐ＣＡＴ）で収集された。座標および構造因子はエントリー番号３Ｒ２Ｘとしてプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に寄託された。

添付資料
コンピュータ設計の方法論
図１は、該手法のフローチャート式全体図を提供する。この方法は、相互作用するタンパク質対の両側設計のために近年述べられた手法の一般化である（Ｓ１）。該方法では、アンキリン反復タンパク質および標的タンパク質の表面が、周辺の両立可能な相互作用により強化されたホットスポット領域を導入するために同時に突然変異導入された。該方法におけるホットスポット領域は、分子間水素結合を形成する芳香族残基を含むものであった。本発明者らの手法は、ホットスポットまたはスカフォールドタンパク質の性質に関する仮説を立てない。本発明者らは、あらゆる種類の高親和性相互作用をなす残基で構成されるホットスポット領域を生成し、該領域を様々なスカフォールドタンパク質に組み入れる。これらの一般化により、潜在的にはあらゆるタンパク質表面の結合剤を設計することが可能となる。

ホットスポット残基の生成
個々の残基は、抗体フラグメント（Ｆａｂ）ＣＲ６２６１に結合したインフルエンザＡ／ＳＣ／１９１８／Ｈ１ヘマグルチニン（以後ＨＡと呼ばれる）の構造（Ｓ３）を出発点として、ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋ（商標）（Ｓ２）を使用してＨＡの標的表面に対してドッキングされた。本発明者らは、ＨＡの表面に対し、ＨＡ２のＴｒｐ２１（プロテインデータバンク（ＰＤＢ）エントリー番号３ＧＢＮのようなＨ３ ＨＡの配列番号付け）の近傍に疎水性残基Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒを位置付けた。Ｐｈｅの立体配座だけが該表面との十分な接触を形成することが可能であり、他の残基は左側に小さな空隙を残すかまたは極性原子を埋没させるかのうちいずれかであった。芳香環の中心に関して互いにおよそ６０°回転されたＰｈｅの有力な２つの立体配座がホットスポット残基１（ＨＳ１）として選択された（図１）。

第２のホットスポット残基（ＨＳ２）の部位を計算するために、本発明者らは、選択される残基が、ＨＡとともに、加えてＨＳ１とともに、エネルギー的に有利な相互作用を形成することが確実であるように、配置されたＨＳ１由来の２つの主要なＰｈｅ立体配座を伴って、同じ疎水性残基セットをＨＡ表面に対してドッキングした。この探索により、ＨＳ２についてＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、およびＭｅｔの低エネルギーの配置が得られた。

第３に、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基が、この場合もＰｈｅ ＨＳ１残基を含めてＴｈｒ４１にかかるＨＡ２のＡヘリックス領域（図１）に対してドッキングされた。本発明者らは、ドッキングされた各残基について、ＨＡ２のＡｓｐ１９の主鎖カルボニルへの水素結合を形成することを必須とした。単一の有力なＴｙｒの配向のみが必要な水素結合を形成し、境界面で極性基を埋没させず、かつＡヘリックス（図１）との有利なファンデルワールス接点を形成するものと同定された。

ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋ（商標）によって同定されたすべての立体配座は、ＨＡ表面に最も近い側鎖原子から始めて逆の回転異性体を生成することにより多様化された。これらの逆の回転異性体は、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）コマンドラインフラグ−ｅｘ１ −ｅｘ２を用いてダンブラック（Dunbrack）ライブラリ（Ｓ４）のベースの回転異性体から１標準偏差離れた回転異性体を含むように拡張された。

一連のスカフォールドタンパク質
本発明者らは以下の基準すなわち：ジスルフィド、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を含まないこと、２．５Åより高い分解能でＸ線結晶解析により解明されたこと、大腸菌で発現されたことが報告されていること、タンパク質四次構造サーバ（Protein Quaternary Structure server）（Ｓ５）によりモノマーであると予測されること、８０〜２５０アミノ酸の単一ポリペプチド鎖を含むこと、に従って、２００９年３月にＰＤＢから一連の８６５個のタンパク質を選択した。該リストは７０％の配列同一性で除外処理がなされた。各構造は十分な側鎖の再パッキングおよび最小化によりＲｏｓｅｔｔａ（商標）力場の中で精密化された。

標的エピトープに対するスカフォールドタンパク質の低分解能ドッキング
ＨＡに関して形状相補性の高い配位のスカフォールドタンパク質を得るために、本発明者らはＰａｔｃｈＤｏｃｋ（商標）のフィーチャ・マッチング・アルゴリズム（Ｓ６）を使用した。各スカフォールドタンパク質の、ＨＡ２のＴｒｐ２１およびＴｈｒ４１と相互作用しない立体配座を除外するために、制約が使用された。残った立体配座は、４Åの平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）でクラスター分けされた。ＰａｔｃｈＤｏｃｋ（商標）は初期設定パラメータを用いて実行された。

主鎖の制約
ホットスポット残基ライブラリは、ＨＡに対するスカフォールドタンパク質の配位であってこれらのホットスポット残基の配置に対応することが可能なものを同定するために使用される。ライブラリ内のコンピュータ計算された各ホットスポット残基は、スカフォールドタンパク質上の部位に関する近似位置、ならびにＣα‐ＣβおよびＣ‐Ｎベクトルの配向を包含する。各ホットスポット残基ｈおよび各スカフォールド部位ｉについて、本発明者らは、立体配座サンプリングをホットスポット残基の配置に有利に働くであろう配位にバイアスするために、スコアリング制約Ｒ_ｉ ^ｈを公式化する：

上記式中、ΔＧ_ｈはホットスポット残基ｈに関して計算された結合エネルギーであって、常にマイナスであり、かつすべての設計軌道において−３であるように選択され；β、α、Ｃ、およびＮは、Ｃβ、Ｃα、Ｃ、およびＮ原子の座標であり；ｋ（ばね定数）は便宜的に０．５に設定され；ｍｉｎは制約がマイナスまたはゼロであることを確実にするミニマム関数であり；角括弧内の量は関連するベクトルの点乗積であり；

は規格化定数である。

この形式の制約関数（restraint function）は、ホットスポット残基のＣβとスカフォールド上の部位との間の距離が０であり、かつＣα‐ＣβベクトルおよびＣ‐Ｎベクトルが一致する場合に、最小になる。したがって、所与の制約は、スカフォールド上の潜在的なグラフト部位があらかじめ計算されたホットスポット残基と完全に整列するときに最もよく満たされる。ホットスポットｈに関する部位ｉの２つのベクトルのうちどちらかの配向が９０°を上回る場合、Ｒ_ｉ ^ｈは０に設定される。ｎ個のホットスポット残基のライブラリはこのようにｎ個の制約を包含する。その後、残基ｉはそれぞれ上記ｎ個の制約の中で最も小さなものを割り当てられる：
（式２） Ｒ_ｉ’＝ｍｉｎ_ｈ（Ｒ_ｉ ^ｈ）
式２は次に、スカフォールド上の各アミノ酸部位ｉに最小の制約を割り当て、その結果、各スカフォールド部位は立体配座探索の間のいかなる時点でも最も適切なホットスポット制約によってのみ影響を受ける。

式２の値を求める際に必要とされるのはＣβおよび主鎖原子の位置のみであるので、制約は、低分解能のモンテカルロ法に基づいたＨＡ表面に関するスカフォールドタンパク質のドッキングにより効率的に計算されうる。重要なことには、制約は、式１が容易に微分可能であるので最小化の際に使用されうる。

ホットスポット残基の配置
本発明者らは、計算されたホットスポットを組み込むスカフォールドを設計するために２つの異なるプロトコールを使用した。より限定的な設計戦略は、３つのホットスポット残基（ＨＳ３にＴｙｒ、ＨＳ１にＰｈｅ、およびＨＳ２に非極性残基）を組み込み、あまり限定的でない設計戦略は２つ（ＨＳ１にＰｈｅ、およびＨＳ２に非極性残基）を組み込んだ。本発明者らは、設計の様々な段階で使用するための、ホットスポット残基を配置する３つの方法を開発した。各方法は、ホットスポット残基に導かれたドッキングおよびホットスポット残基ライブラリのうちの１つを用いた最小化から得られたスカフォールドタンパク質の配位を始点とする。Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびジスルフィドで連結されたシステインを除いて、標的タンパク質から１０Å以内にあるスカフォールドタンパク質上の境界面の残基は、ホットスポット残基を提供する機会を増大させるためにアラニンに縮小された。

方法１：理想的なホットスポット残基上へのスカフォールドの配置
ホットスポット残基ライブラリ内の残基は、ホットスポット相互作用の実現に最適な配位を規定する。所与の境界面スカフォールド部位について、本発明者らは、ライブラリ内の近隣のホットスポット残基の各々を順に処理し、スカフォールドタンパク質を回転かつ並進して該タンパク質をホットスポット残基の回転異性体と完全に一直線に並ぶようにする。Ｃβ原子が関連するホットスポット残基から４．０Åより遠いか、またはＣ‐ＮもしくはＣα‐Ｃβベクトルがホットスポット残基との間で６０°を上回る位置ずれを生じるスカフォールド部位について、この２つのパートナーの初期の形状相補性の高い配位を損ねないように優先順位付けがなされる。次に、本発明者らは、単にファンデルワールス衝突および回転異性体エネルギーについての懲罰的な（punitive）エネルギー項を考慮するにすぎない縮小された力場における、剛体の配向および配置されたホットスポット残基の側鎖自由度を、最小化する。配置されたホットスポット残基のエネルギーが１．０ロゼッタエネルギーユニット（Ｒ．ｅ．ｕ．）より大きい場合、この配置を廃棄する。

２残基ホットスポット設計物においては、本発明者らは、スカフォールドタンパク質にホットスポット残基Ｐｈｅ（ＨＳ１）を配置するためにこの戦略を使用した。３残基設計物の場合には、本発明者らはＴｙｒ（ＨＳ３）を配置するためにこの戦略を使用した。

方法２：スカフォールド部位へのホットスポット残基の配置
個々の境界面スカフォールド部位について、本発明者らは、ホットスポット残基に由来する単一の制約（式１）に即してスカフォールドタンパク質の配位を標的に関して最小化する。他のすべてのパラメータおよびカットオフは前セクションのとおりである。本発明者らは、２残基ホットスポット設計物にＨＳ２を配置するためにこの戦略を使用した。

方法３：多数のホットスポット残基の同時配置
各ホットスポット残基ライブラリについて、本発明者らは、残りのホットスポット残基ライブラリと比較して、式１によって定義されるような最も有利な制約スコアを生じるスカフォールドタンパク質上の部位を同定する。次に、そのようなスカフォールド部位はそれぞれ適切なホットスポット残基ライブラリに結び付けられる。すべてのホットスポット残基ライブラリが異なるスカフォールド部位にマッチングしない場合、その標的に関する該スカフォールドの配位は廃棄される。成功すれば、本発明者らは同時に、関連するスカフォールド部位を、マッチングしたホットスポット残基ライブラリに含まれる該部位のアミノ酸に再設計する。ごく一握りの部位がこのスキームで設計され、かつ設計される残基が何であるかは関連するホットスポット残基ライブラリに基づいて制限されるので、設計ステップへの回転異性体以外の（off-rotameric）立体配座の追加はコンピュータ上で無理なく行うことができる。本発明者らは、３残基ホットスポット設計物においてＨＳ１およびＨＳ２を配置するためにこのスキームを使用した。

３残基ホットスポットを組み込むスカフォールドの設計における立体配座探索の強化
３残基配置手法（ＨＳ１〜３の組み込み）を使用する予備的試行から、この組み合わせの残基は、スカフォールドタンパク質に対する、スカフォールドセット内のタンパク質によって極めてまれにしか満たされない制約を含むことが明らかとなった。３残基ホットスポットを組み込むことが可能なスカフォールドを同定する機会を高めるために、本発明者らは、スカフォールドタンパク質の主鎖の立体配座およびその剛体の配向の両方の点で探索を強化するプロトコールを使用した。この強化は、同時配置法によって提供される計算効率の上昇により可能となった。

各スカフォールドについて、Ｔｙｒ ＨＳ３残基に対するスカフォールドの配置が試行され、この配置はＴｙｒホットスポット残基のエネルギーが１Ｒ．ｅ．ｕを越えず、かつＴｙｒがＡｓｐ１９の主鎖カルボニルとの水素結合を形成した場合に成功と認められた。本発明者らは次に、４回の剛体ドッキング試行およびその後の（ＨＳ１〜２の）同時配置を行った。ホットスポット残基の同時配置の際に、主鎖の最小化およびバックラブ（backrub）（Ｓ７）が行われて配置成功の機会が高められた。後になってみると、主鎖の再モデル化は、この再設計タンパク質の主鎖が出発時の野生型構造との有意差を示さないように、ＨＢ８０上へのホットスポット残基の配置成功にはほとんど貢献していなかったようである。

ホットスポットの外側の残基の再設計
すべてのホットスポット残基ライブラリからの残基の配置成功に続いて、標的タンパク質から最大でも１０Åにあるスカフォールド部位がＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（８）を使用して再設計される一方、標的タンパク質側鎖は再パッケージが可能である。Ｇｌｙ、Ｐｒｏおよびジスルフィドで連結されたシステインは、野生型配列のまま残される。再設計および最小化の３回反復が使用されて、軟反発ポテンシャルから始めて徐々に反発項を増加させながら、より高い親和性の相互作用が見出される可能性が高められた。最後の設計ステップは、設計される残基が高エネルギーの立体配座を仮定しないことを確実にするために、立体化学的衝突および回転異性体の変形に大きく重み付けした初期設定の全原子力場を使用する。

これらの設計シミュレーションの際、配置されるホットスポット残基の側鎖には、ホットスポット残基ライブラリ内に存在するような理想化されたホットスポット残基の座標に向かってバイアスがかけられる（参照文献（Ｓ９）の実装に類似）。このバイアスは、調和座標の制約として、典型的には側鎖の官能基を規定する３つの原子について実装され、実際には配置されたホットスポット残基の官能基を標的タンパク質に関する該官能基の理想化された部位へ向かって引き寄せる。例えば、これらの原子は、ＴｙｒおよびＰｈｅの芳香環の根幹（root）の３つの炭素原子になるであろう。配置される残基がスカフォールド上での該残基の部位において安定であることを確実にするために、全ての制約はシミュレーション中に徐々に取り除かれ、最後のパッキングおよび最小化のステップは制約のない状態で行なわれる。

得られるモデルはそれぞれ、計算された結合エネルギー（Ｓ１０）、埋没表面積、および形状相補性（Ｓ１１）に従って自動的にフィルタにかけられる。−１５Ｒ．ｅ．ｕを上回る結合エネルギー、１０００Å^２未満の表面積、または０．６５未満の形状相補性スコアを有することが予測された複合体は排除された。この段階では、設計物は手作業で再検討され、さらに厳しい評価のためにサブセットが選択された。その後既述された設計物中の修飾の後、該設計物のうち一部は上記フィルタに不合格の統計データを有していた。ＨＢ３６（結合エネルギー＝−２４、Ｓｃ＝０．６６、埋没表面積＝１６２０Å^２）およびＨＢ８０（結合エネルギー＝−１９、Ｓｃ＝０．７２、埋没表面積＝１５８０Å^２）はいずれも上記フィルタを通過したが、同等の統計データを備えた他の設計物は通過しなかった。

境界面における残基変更数の最小化
上述のフィルタを通過した各設計物については、境界面における各アミノ酸置換の寄与は、残基をその野生型に一つずつ復帰させ、該復帰の計算上の結合エネルギーに対する影響を試験することにより判定される。設計された残基と復帰させた残基との間の結合エネルギーの差が、設計物に有利な０．５Ｒ．ｅ．ｕ未満である場合、該部位をその野生型に復帰させる。

すべての残基変更の報告が作成され、各案は手作業で再検討された。手作業による再検討のこの段階で、追加の変異が導入された。これらは典型的には、ＨＡの荷電表面をより十分に補足するための周辺電荷の導入または除去を伴い、１設計物あたり５個を超える置換を通常は伴うことはなかった。

オリジナルのスカフォールドの配列の変更を最小限にするさらなる方法は、設計の全段階に配列制約を導入することで構成された。簡潔に述べると、野生型配列からの突然変異には、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（Ｓ１２）における該突然変異の距離に従ってペナルティが課せられた。これらの配列制約への重み付けは０．２に設定された。

結合エネルギー計算
参考文献（Ｓ１０）を踏まえ、結合エネルギーは、結合状態および非結合状態における系全体のエネルギーの間の差異として定義された。各状態において、境界面の残基は再パッキングが許された。数値を安定にするため、結合エネルギー計算は３回繰り返されて平均がとられた。

形状相補性
形状相補性は、ｓｃプログラムを使用するＣＣＰ４パッケージｖ．６．０．２（Ｓ１３）を使用して計算された。

実験による特徴解析
ＢｉｒＡの発現および精製
大腸菌ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ酵素）は、既報（Ｓ１４）に類似の方法で、ただしＮ末端Ｈｉｓタグを用いて発現および精製された。ｂｉｒＡ遺伝子は、プライマーＤＥ３８９（５’‐ａｇｔｃａｃｔａｇｇｔｃａｔａｔｇｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃａａｇｇａｔａａｃａｃｃｇｔｇｃｃａｃｔｇ‐３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５））およびＤＥ３９０（５’‐ａｇｔｃａｃｔａｇｇｔａａｇｃｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｇｃａｃｔａｃｇｃａｇｇｇａｔａｔｔｔｃ‐３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９７））を使用して、大腸菌コロニー（野生型菌株ＭＧ１６５５）から増幅された。ＰＣＲ産物はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、同様に消化されたｐＥＴ２１ａに連結されて、ｐＤＣＥ０９５が得られた。このベクターは、タンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換に用いられた。

ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＤＣＥ０９５細胞を、振盪フラスコにおいて低塩濃度ＬＢ培地中３７℃でＯＤ（６００ｎｍ）約０．７まで増殖させ、次いで２３℃に移行して終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド）の添加により誘導させた。該培養物を誘導後２３℃で約１６時間インキュベートし、次いで遠心分離（３０００ｇ、１０分）により収集した。１Ｌ培養物からのペレットは５０〜１００ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０、ロッシュ（Roche）のＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットを含む）に再懸濁され、細胞は溶解されてＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ（商標）Ｃ‐３細胞破砕機（約１００ＭＰａ（１５ｋＰＳＩ））を２回通過させることによりホモジナイズされた。遠心分離（２５，０００ｇ、約１時間）により溶解産物を清澄化した後、上清はＮｉＮＴＡ樹脂（キアゲン（Qiagen））とともにインキュベートされ、過剰量の溶解バッファーで洗浄され、結合したタンパク質が溶出された（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ塩化カリウム、２５０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０を使用）。濃縮および５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．５、５％グリセロール、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）へのバッファー交換の後、ＢｉｒＡはＭｏｎｏＱ（登録商標）カラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））に装荷され、０〜１Ｍ塩化カリウムの直線濃度勾配で溶出された。ＢｉｒＡを含有するフラクションが集め合わされ、濃縮され、ゲル濾過に供された。ＢｉｒＡタンパク質の最終的な収率はおよそ１０ｍｇ／Ｌであり、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる見積りでは＞９５％の純度であった。精製されたＢｉｒＡタンパク質は、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、２００ｍＭ塩化カリウム、５％グリセロール中５ｍｇ／ｍＬに濃縮され、アリコートに小分けされ、液体窒素中で急速凍結され、−８０℃で保管された。

ヘマグルチニンのクローニング、発現および精製
Ｈ３の番号付けに基づき、インフルエンザＡ型ヘマグルチニン（ＨＡ）の残基１１〜３２９（ＨＡ１）および１〜１７６（ＨＡ２）に対応するｃＤＮＡが、基本的に既述（Ｓ３）のようにして、オーバーラップＰＣＲ法によりＮ末端側のｇｐ６７シグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＶＬＶＮＱＳＨＱＧＦＮＫＥＨＴＳＫＭＶＳＡＩＶＬＹＶＬＬＡＡＡＡＨＳＡＦＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２））ならびにＣ末端側の三量体化ドメインおよびＨｉｓタグに融合された。三量体化ドメインおよびＨｉｓタグはトロンビン切断部位によってＨＡエクトドメインから隔てられた。ビオチン化ＨＡについては、ＢｉｒＡ標的ビオチン化部位（アミノ酸配列：ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３））がＨＡとトロンビン部位との間に挿入された。得られたＰＣＲ産物はＳｆｉＩで消化され、独自のバキュロウィルストランスファーベクターｐＤＣＥ１９８に挿入された。Ｂａｃ‐ｔｏ‐Ｂａｃ（登録商標）システム（インビトロジェン（Invitrogen））を使用して組換えバクミド（bacmid）が生成され、ウイルスは、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）ＩＩ（インビトロジェン）を使用して精製バクミドＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクトすることによりレスキューされた。ＨＡタンパク質は、５〜１０ＭＯＩの組換えバキュロウイルスを用いてＨｉ５細胞（インビトロジェン）の懸濁培養物を感染させ、１１０ＲＰＭで振盪しながら２８℃でインキュベートすることにより生産された。７２時間後、培養物は４℃で２０００ｇおよび１０，０００ｇの２回の遠心分離処理により清澄化された。分泌された可溶性ＨＡを含有する上清は濃縮されて１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換された。Ｎｉ‐ＮＴＡ樹脂を使用する金属親和性クロマトグラフィーの後、ＨＡは特定の目的の必要に応じてさらに修飾および精製された（次のセクションを参照されたい）。この段階では、収率はＨＡ単離物にもよるが典型的には１〜１０ｍｇ／Ｌであった。

親和性成熟および結合試験のためのＨＡのビオチン化および精製
Ｎｉ‐ＮＴＡ精製の後、Ｃ末端ビオチン化タグを備えたＨＡは総タンパク量約２〜５ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。該ＨＡは、次の組成すなわち：１００ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、５０μＭビオチンであって５０ｍＭ未満のＮａＣｌを含有するバッファー中で、総タンパク質１ｍｇあたり２５μｇのＢｉｒＡ酵素を添加することによってビオチン化された。ビオチン化反応物は３７℃で１〜２時間インキュベートされた。この時点で、一部のＨＡはトリプシンで消化され（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）、ＨＡ１ｍｇあたり５ｍＵトリプシン、１７℃で１６時間）、融合能を有するＨＡ１／ＨＡ２形態を生じたが、大多数はＨＡ０として未消化のままであった。ビオチン化ＨＡはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され、約５〜２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。

ＣＲ６２６１ Ｆａｂの発現および精製
ＣＲ６２６１の重鎖および軽鎖のＦａｂ領域をコードする遺伝子が合成され（ミスタージーン社（Mr. Gene））、オーバーラップＰＣＲ法によりｇｐ６７シグナルペプチドおよびＣ末端Ｈｉｓタグに融合され、バキュロウイルス中で発現するためにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（インビトロジェン）にクローニングされた。ウイルス産生方法、Ｈｉｇｈ５細胞でのタンパク質発現、収集、およびＮｉ‐ＮＴＡ精製は、基本的にＨＡについて上述されたとおりであった。ＣＲ６２６１ Ｆａｂは、プロテインＧ親和性クロマトグラフィー（グリシンバッファーｐＨ２．７で溶出）；陽イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＳ（登録商標）樹脂、酢酸ナトリウムｐＨ５．０、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配を使用）；およびゲルろ過（１０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）よってさらに精製された。最終収率はおよそ１５ｍｇ／Ｌであった。

結合剤スクリーニングの方法論
設計された結合タンパク質は、酵母表面ディスプレイ（Ｓ１５）を使用して結合について試験された。酵母のコドンに最適化された、設計物をコードする遺伝子は、ジェンスクリプト社（Genscript）（ニュージャージー州ピスカタウェイ）に特別注文され、ｐＥＴＣＯＮ（商標）という名称の自家製酵母ディスプレイプラスミドのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位間にサブクローニングされた。ｐＥＴＣＯＮ（商標）は、オリジナルの酵母ディスプレイプラスミドｐＣＴＣＯＮ（Ｓ１６）に以下の修飾すなわち：（ａ）ＣＤ２０コード領域のフレームシフト突然変異；（ｂ）ＮｈｅＩ部位のすぐ下流のＮｄｅｌ制限酵素切断部位；および（ｃ）ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位のすぐ上流のＸｈｏＩ‐Ｇｌｙ_２スペーサー配列、を備えたものである。完全長配列は請求により入手可能である。結合試験は、１μΜのビオチン化ＳＣ／１９１８／Ｈ１ ＨＡ１‐２エクトドメインを使用して、特記される場合を除いて基本的に既述（Ｓ１５）のとおりに行われた。二次標識は、設計物の表面発現を観察するためには抗ｃｍｙｃ ＦＩＴＣ（ミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotec）、カリフォルニア州オーバーン）、ビオチン化抗原の結合を観察するためにはストレプトアビジン‐フィコエリトリン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）であった。結合シグナルは、サイトペイア社（Cytopeia）のｉｎＦｌｕｘ（登録商標）セルソータまたはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータのいずれかを使用して、励起用に４８８ｎｍレーザーおよび発光用に５７５ｎｍバンドパスフィルタ（適切に補正）を用い、ディスプレイしている細胞集団の平均フィコエリトリン蛍光として定量化された。

結合の陽性対照はＣＲ６２６１ ｓｃＦｖ Ｐｈｅ５４Ａｌａとした。ＣＲ６２６１ ｓｃＦｖは、鋳型としてＣＲ６２６１ ＦａｂをコードするＤＮＡ（Ｓ１７）を使用して、重鎖の可変領域を軽鎖可変領域に接合する（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーにより構築された。ｓｃＦｖはｐＥＴＣＯＮのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素切断部位間に組込むための組換え部位を含めるためにさらに増幅された。Ｐｈｅ５４Ａｌａおよび他のすべての点突然変異はキュンケル（Kunkel）の方法（Ｓ１８）で導入された。

親和性成熟
ＨＢ３６の１回目：第一世代ライブラリは、設計されたＨＢ３６の遺伝子から、アミノ酸をコードするセグメント全体についてのエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）により、またはＨＡから１０Å以内にあるものとしてモデル化される２７残基中２２残基についての単一の部位飽和突然変異誘発により構築された。本例および他の場合において、ｅｐＰＣＲは、ストラタジーン（Stratagene）のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（商標）ＩＩランダム変異誘発キット（アジレント（Agilent）、カリフォルニア州）を使用して、また部位飽和突然変異誘発はキュンケルの方法（Ｓ１９）により行われた。ライブラリ全体の大きさは３ｅ５であった。本発明者らは、これらのライブラリを酵母ディスプレイ選択の２回のソートに供し、ソート１については５０ｎＭ、ソート２については１０ｎＭのＨＡ１‐２で細胞を標識した。親和性を＞１０倍に改善したＡｓｐ４７ＸおよびＡｌａ６０Ｖａｌ／Ｔｈｒ突然変異が回収された。最良の組み合わせが２回目の開始に使用され、該組み合わせはＨＢ３６ Ａｓｐ４７Ｓｅｒ Ａｌａ６０Ｖａｌ（ＨＢ３６．３）であった。

ＨＢ３６の２回目：第二世代ライブラリは、ＨＢ３６．３の遺伝子から、ｅｐＰＣＲを使用して１遺伝子当たり２±１個の突然変異で構築された。合計４回の酵母ディスプレイソートが５．４ｅ６の大きさのライブラリについて行われた。第１のソートについては、細胞は５ｎＭのＨＡ１‐２で標識されてゲーティングされ、該集団の上位５％が収集された。第２および第３のソートについては、細胞は１０ｎＭのＨＡ１‐２で標識され、次いで１ｍｇ／ｍＬのフラクションＶウシ血清アルブミン（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）を含んだリン酸緩衝生理食塩水で徹底的に洗浄された。その後、細胞は１μΜの可溶性ＨＢ３６．３とともに２２℃で４０分間インキュベートされた。第４のソートは６０分間の解離速度（off-rate）インキュベーションとともに行われた。この回で選択されたクローンはすべて突然変異Ａｓｎ６４Ｌｙｓを備えていた。

ＨＢ８０の１回目：第一世代ライブラリは、設計されたＨＢ８０の遺伝子から、１遺伝子当たり突然変異２±１個の突然変異荷重を使用するｅｐＰＣＲにより構築された。形質転換体１．６ｅ６個のライブラリが、１μΜ ＨＡ１‐２の標識濃度および全３回のソートを使用して選択に供された。本発明者らは突然変異体Ｍｅｔ２６Ｖａｌ／ＴｈｒおよびＡｓｎ３６Ｌｙｓを回収し、その各々は親和性を＞１０倍改善した。これらの突然変異ＨＢ８０ Ｍｅｔ２６Ｔｈｒ Ａｓｎ３６Ｌｙｓと５４位以降の切端との組み合わせ（ＨＢ８０．２と命名）をコードする遺伝子は、次回の選択の出発配列であった。

ＨＢ８０の２回目：ＨＢ８０．２遺伝子を出発点として、１遺伝子当たり突然変異２±１個の突然変異荷重を備えたｅｐＰＣＲライブラリが酵母の形質転換に用いられ、２ｅ４個の形質転換体が得られた。細胞は、３ｎＭ（ソート１）および５ｎＭ（ソート２＆３）のＨＡ１‐２で標識されてゲーティングされ、細胞の上位４〜５％が収集された。選択されたクローンはすべてＡｓｐ１２ＧｌｙまたはＡｌａ２４Ｓｅｒ突然変異を有していた。

タンパク質設計物の発現および精製
設計物をコードする遺伝子はｐＥＴ２９ｂ発現ベクター（ＥＭＤ、ニュージャージー州ギブズタウン）にサブクローニングされ（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）、大腸菌のＲｏｓｅｔｔａ（商標）（ＤＥ３）ケミカルコンピテントセルの形質転換に用いられた。タンパク質発現は、スタディア（Studier）の自己誘導法（Ｓ２０）を使用して誘導された。１８℃で２４時間の発現の後、細胞はペレット化され、ＨＢＳバッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））に再懸濁され、超音波処理されて細胞溶解物を放出した。遠心分離による清澄化に続き、上清は精製用のニッケルカラムにアプライされた。タンパク質はＨＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールにおけるステップ溶出により溶出された。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーがＨＢＳバッファー中への最終精製ステップとして使用された。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データおよび分析
ＳＰＲデータはすべてビアコア社（Biacore）のモデル２０００（ビアコア（Biacore）、スウェーデン国ウプサラ）で記録された。ストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングされたチップ（ビアコア）は、２００または４００レスポンスユニット（ＲＵ）のビオチン化ＳＣ／１９１８／Ｈ１ ＨＡ１‐２エクトドメインでコーティングされた。ブランクのフローセルおよび２００ＲＵのビオチン化リゾチームでコーティングされたフローセルが陰性対照として使用された。流速５０μＬ／分で解離時間９００秒とした１５０μＬの設計タンパク質が、全体を通して使用された。少なくとも８通りのタンパク質濃度が使用されて速度論的かつ平衡論的フィッティングが決定された。結合反応速度論は１：１ラングミュア結合モデルを使用して評価された。タンパク質は、ＳＡチップ上への非特異的吸着を最小限にするために、０．１％（ｖ／ｖ）のＰ２０界面活性剤および０．５ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルデキストランナトリウム塩（ビアコア、スウェーデン国ウプサラ）を含んだＨＢＳバッファー中に含められた。標準的なダブルバックグラウンド減算値を使用してデータを大域的にフィッティングするために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（ウェブサイトcores.utah.edu/interaction/を参照）が使用された。

バイオレイヤー干渉法による結合剤交差反応性試験
一連の代表的なＨＡ単離物に対するＨＢ８０．３およびＣＲ６２６１ Ｆａｂの結合は、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ（商標）測定器（フォルテバイオ社（ForteBio, Inc.））を使用してバイオレイヤー干渉法によりアッセイされた。バイオレイヤー干渉法は、概念的には、対象とするタンパク質が表面上に固定化され、次いで溶液中の潜在的結合パートナーに曝露される、表面プラズモン共鳴実験に類似している。固定化タンパク質への分析物の結合は該バイオセンサの光学的性質を変化させ、結合表面から反射される光の波長の変化をもたらす。この波長の変化はリアルタイムで測定可能であり、会合速度および解離速度、ならびにしたがってＫ_ｄの測定を可能とする。上述のようにして精製されたビオチン化ＨＡがこれらの測定に使用された。１×カイネティクスバッファー（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％ＢＳＡ、および０．００２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）中約１０〜５０μｇ／ｍＬのＨＡは、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサ上に装荷され、様々な濃度のＨＢ８０．３またはＣＲ６２６１ Ｆａｂ溶液とともにインキュベートされた。結合データはすべて２５℃で収集された。該実験には、５つのステップすなわち：１．ベースラインの取得（６０秒）；２．センサへのＨＡの装荷（１８０秒）；３．第２のベースラインの取得（１８０秒）；４．ｋ_ｏｎの測定のための設計結合剤の会合（１８０秒）；および５．ｋ_ｏｆｆの測定のための結合剤の解離（１８０秒）、が含まれた。各結合剤について４〜６通りの濃度が、１００ｎＭを最高濃度として使用された。ベースラインおよび解離のステップはバッファーのみの中で行なわれた。本実験で使用されるすべてのタンパク質の配列は、以下の表１０としてＦＡＳＴＡ形式で入手可能である。

結晶化のためのＨＢ３６．３の発現および精製
ｐＥＴ２９ａ‐ＨＢ３６．３構築物を担持するＲｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＢＬ２１／ＤＥ３）細胞を、振盪フラスコにおいて低塩濃度ＬＢ培地中３７℃でＯＤ_６００約０．７まで増殖させ、次いで１８℃に移行して１ｍＭ ＩＰＴＧの添加により誘導させた。培養物は、タンパク質発現のために１８℃で一晩インキュベートされ、次いで遠心分離（３０００ｇ、１０分）により収集した。１Ｌ培養物からのペレットは５０〜１００ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０、ロッシュ（Roche）のＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットを含む）に再懸濁され、細胞は溶解されてＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ（商標）Ｃ‐３細胞破砕機（約１００ＭＰａ（１５ｋＰＳＩ））を２回通過させることによりホモジナイズされた。遠心分離（２５，０００ｇ、約１時間）により溶解産物を清澄化した後、上清はＮｉＮＴＡ樹脂（キアゲン（Qiagen））とともにインキュベートされ、過剰量の溶解バッファーで洗浄され、結合したタンパク質が溶出された（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０を使用）。溶出物質は１０ｍＭトリスｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換され、ＭｏｎｏＱ（商標）陰イオン交換カラムに装荷され、５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出された。ＨＢ３６．３を含有するピークフラクションが集め合わされてゲル濾過に供された。ＨＢ３６．３は高濃度（約１０ｍｇ／ｍＬ）で装荷された時は明らかなダイマーとして溶出されたが、より低い濃度（＜１ｍｇ／ｍＬ）で装荷された時はモノマーとして溶出され、該２つの形態は速やかに平衡化した。ＨＢ３６．３を含有するフラクションは集め合わされて約５ｍｇ／ｍＬに濃縮された。

結晶化のためのＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡ複合体の単離
Ｎｉ‐ＮＴＡ精製に続き、ＳＣ１９１８ ＨＡはトリプシンで消化（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）、１ｍｇのＨＡあたり５ｍＵトリプシン、１７℃で１６時間）されて一様に開裂された（ＨＡ１／ＨＡ２）を生じ、かつ三量体化ドメインおよびＨｉｓタグが除去された。２ｍＭ ＰＭＳＦを用いて消化を停止させた後、消化された物質は、陰イオン交換クロマトグラフィー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５０〜１Ｍ ＮａＣｌ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）によって精製された。結晶化用のＨＢ３６．３／ＳＣ１９１８複合体を調製するために、過剰量のＨＢ３６．３（ＨＡ三量体当たりおよそ５分子のＨＢ３６．３）が１０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中約２ｍｇ／ｍＬの精製ＳＣ１９１８ ＨＡと混合された。該混合物は錯体形成しうるように４℃で一晩インキュベートされた。その後、飽和した複合体は、ゲル濾過により結合していないＨＢ３６．３から精製された。

ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１複合体の結晶化および構造決定
ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡ複合体を含有するゲル濾過フラクションは、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および５０ｍＭ ＮａＣｌ中で約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。最初の結晶化試行は、構造ゲノミクス共同センター（Joint Center for Structural Genomics）（ウェブサイトJCSG.org）において自動Ｒｉｇａｋｕ Ｃｒｙｓｔａｌｍａｔｉｏｎ（商標）ロボットシステムを使用して準備された。いくつかの成功例が得られ、最も有望な候補は約１０％ＰＥＧ８０００中でｐＨ７付近にて成長させた。これらの条件の最適化により回折品質の結晶が得られた。データ収集に使用された結晶は、１０％ＰＥＧ８０００、２００ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭトリスｐＨ７．０を含有するリザーバ溶液（１００μＬ）を用いたシッティングドロップ、蒸気拡散法によって成長させた。１００ｎＬタンパク質＋１００ｎＬ沈殿剤で構成されているドロップが４℃で準備され、結晶が７〜１４日以内に現われた。得られた結晶は、終濃度２５％まで濃度を漸増させた（１ステップで５％、５分／ステップ）エチレングリコールを補足したウェル溶液中に浸漬させることにより凍結防止され、次いで急速冷却されてデータ収集まで液体窒素中に保管された。

ＨＢ３６．３‐ＳＣ１９１８／Ｈ１複合体の回折データは、米国アルゴンヌ国立研究所（Argonne National Laboratory）の先端放射光施設（Advanced Photon Source）（ＡＰＳ）の総合内科／がん研究所共同アクセスチーム（General Medicine/Cancer Institutes-Collaborative Access Team）（ＧＭ／ＣＡ‐ＣＡＴ）ビームライン２３ＩＤ‐Ｄにおいて収集された。該データはＲ３２に指数付けされ、ＨＫＬ２０００（ＨＫＬリサーチ社（HKL Research））を使用して積分され、Ｘｐｒｅｐ（商標）（ブルカー（Bruker））を使用してスケーリングされた。構造は、Ｐｈａｓｅｒ（商標）（Ｓ２１）を使用して分子置換法により分解能３．１０Åまで解が得られた。未公表の、１９１８ＨＡの分解能１．８Åの構造が初期探索モデルとして使用され、非対称単位内に単一のプロトマーが見出された。この段階におけるマップの検討から、ＨＢ３６．３の予測された位置および配向と一致するＨＡの膜先端部辺りの明瞭な陽電子密度が明らかとなった。Ｐｈａｓｅｒ（商標）を使用して分子置換法によりＨＢ３６．３を配置する試みは失敗した（ＰＤＢコード１Ｕ８４由来の様々な探索モデルを使用）。しかしながら、ＨＡ（非対称単位内の質量の約８５％）のみを使用する位相決定から、重要な側鎖の特徴を含む、ＨＢ３６．３についての連続した密度を備えたマップが得られた。この位相決定モデルにより、ＨＢ３６．３をマップ内に手動で一義的にフィッティングさせることが可能となった。剛体および制約条件下の精密化（ＨＡ１について１グループ、ＨＡ２について１グループ、およびＨＢ３６．３について１グループとしたＴＬＳ精密化など）は、Ｐｈｅｎｉｘ（商標）で実行された（Ｓ２２）。繰り返される精密化の間に、Ｃｏｏｔ（商標）を使用してモデルが構築かつ調整された（Ｓ２３）。タンパク質発現に使用された昆虫細胞は完全にグリコシル化されたＨＡを生産し、また、追加の電子密度が、ＨＡ上の５個の予測グリコシル化部位（ＮＸ（Ｓ／Ｔ）モチーフ）すべてにおいてグリカンについて観察された。合計５個の糖残基が上記部位のうち２つにおいて構築された（残る３部位においては、正確なモデル構築を可能にするには密度が弱すぎるかまたは不明瞭であった）。比較的弱いデータが非常に冗長であることは、この中程度の分解能で、みかけのＲ_ｓｙｍおよびＢ値が高いにもかかわらず特にＨＢ３６．１‐ＨＡ境界面（図４Ｃ参照）の周辺において容易に解釈可能な比較的良質な電子密度マップを得るのに有用であった（Ｓ２４）。

構造解析
ＨＢ３６．３とＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡとの間の水素結合およびファンデルワールス接点は、それぞれＨＢＰＬＵＳ（商標）（Ｓ２５）およびＣＯＮＴＡＣＳＹＭ（商標）（Ｓ２６）を使用して計算された。表面積埋没はＲｏｓｅｔｔａ（商標）で分析された（Ｓ２７）。ＭａｃＰｙＭｏｌ（商標）（デラノ・サイエンティフィック （DeLano Scientific））（Ｓ２８）は、構造図を描画するために、また一般的な操作のために、使用された。最終座標は、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（商標）（Ｓ２９）を備えたＪＣＳＧ品質管理サーバ（ｖ２．７）を使用して検証された。

プロテアーゼ感受性アッセイ
各反応には約２．５μｇのＨＡまたは約５μｇの結合剤‐ＨＡ複合体および１％ドデシルマルトシド（融合後のＨＡの凝集を防止するため）を含めた。反応物は室温で準備され、ｐＨは対照以外のすべての試料に１００ｍＭのバッファーを添加することにより低下させた。ｐＨ範囲４．９〜６．１には酢酸ナトリウム、ｐＨ６．２〜７．４にはＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５以上にはトリスが使用された。反応液は徹底的に混合され、＞１２，０００ｇで３０秒間遠心分離され、３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベートの後、反応物は室温に平衡化され、ｐＨは２００ｍＭトリス、ｐＨ８．５の添加によって中和された。トリプシンは、ＳＣ１９１８／Ｈ１の反応物用には最終比１：２５、およびＶｉｅｔ０４／Ｈ５反応物用には１：５０として対照以外のすべての試料に添加された。ＳＣ１９１８／Ｈ１およびＶｉｅｔ０４／Ｈ５試料はそれぞれ３７℃および１７℃で一晩（１８時間）消化された。反応物は非還元型ＳＤＳバッファーの添加によって停止処理され、約２分間煮沸された。試料はＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された。

初期の結合スクリーンの限界；その他の潜在的結合剤
本発明者らの設計物セットから有効な結合剤を回収するにあたり重要な１つの構成要素は、スクリーニング系の選択である。本発明者らは酵母表面ディスプレイアッセイを本発明者らのスクリーンとして選択したが、これは該システムが多数の設計物の迅速な試験を可能とし、酵母表面上へのビオチン化ヘマグルチニン（１μΜ）の非特異的吸着が最小限であり（低バックグラウンド）、かつ該スクリーンはより高親和性のバリアントを選択するために容易に再構成可能であるからである。結合解離定数は酵母ディスプレイ滴定とｉｎ ｖｉｔｒｏの測定との間でほぼ等価であることは報告されているが（Ｓ３０）、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＳＰＲ測定値については酵母表面ディスプレイ滴定と比較しておよそ１０倍弱い親和性であることに気づいた。測定値間の矛盾には多くの理由（例えば局所的ＨＡ濃度を上昇させる非特異的なレクチン吸着）がありうるが、本発明者らは、酵母上への親和性増大に主に寄与するのは結合試験に使用されるヘマグルチニンの三量体エクトドメインと表面にディスプレイされる何千個もの設計物のコピーとの間の結合力効果ではないかと考えている。１μΜのＨＡという試験濃度を考えると、本発明者らは、酵母の表面にディスプレイされたｉｎ ｖｉｔｒｏのＫ_ｄ＜２５μΜの設計物について、結合を検出することが可能であったと推定する。

有効な設計物の回収を阻止する別の重要なパラメータは、ＨＡ‐設計物複合体の解離速度である。ＨＢ３６およびＨＢ８０設計物の親和性成熟の際、本発明者らは、いくつかのバリアントについての、該設計物バリアントの平均表面ディスプレイを支配している、結合飽和における平均フィコエリトリン蛍光（ＰＥ）シグナルの著しい増大に注目した（データは示さない）。このＰＥシグナルの増大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの解離速度が遅いことと関連していた。解離速度からＰＥシグナルによる結合検出の限界を推測すると、本発明者らは、酵母ディスプレイシステムがｋ_ｏｆｆ＜１０ｓ^−１の結合剤を検出可能であると推定する。

よって本発明者らの酵母ディスプレイスクリーンは、本発明者らの設計物セットから、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＫ_ｄ＜２５μＭおよびｋ_ｏｆｆ＜１０ｓ^−１を備えて表面ディスプレイをなす全ての結合剤を回収することができる。いくつかの設計物はこのスクリーンにおいて弱い結合活性を示し；該設計物にはＨＢ３、ＨＢ５４およびＨＢ７８が含まれる（アミノ酸配列は以下の表９において入手可能である）。

特定の結合剤の生成におけるｄｅ ｎｏｖｏ設計の有用性について
タンパク質相互作用のｄｅ ｎｏｖｏ設計には数多くの利用法が見出されうるので、本明細書中で報告されたＨＡ結合剤を単離するのに必要とされた努力に注目することは有益である。多くの技術の進歩、例えば、高度並列計算を利用可能であること、結合タンパク質の高速のスクリーニングおよび親和性成熟のツールとして酵母細胞表面ディスプレイを利用可能であること、低価格遺伝子合成、ならびに商業的供給源のプラスミドを特別注文する能力が、本研究を促進するために融合した。典型的なｄｅ ｎｏｖｏ設計目標については、本発明者らは、実験的試験のための数十の候補物を生成するのには１０万ＣＰＵ時間で十分であろうと推定する。本明細書中で使用された酵母ディスプレイ方式は、各設計物の精製に必要な面倒なステップを取り除き、高速のスクリーニングおよび親和性成熟を可能にする。

本例では抗体に結合した２つの構造物が利用可能であったが、該方法は、抗体上の残基と一致するＨＢ８０中の単一のホットスポット残基（ＨＳ３のＴｙｒ）だけを用い、これらの抗体に含まれる情報の利用を最小限にした。Ｈ１ ＨＡの構造のみが設計過程にとって不可欠であった。ヘマグルチニン標的表面はまさに無極性であり、高親和性相互作用の設計を可能にしている。より極性の強いタンパク質表面を標的とするためにこの方法を用いることができるかどうかは今のところ不明である。

ｄｅ ｎｏｖｏ設計のための多様なタンパク質スカフォールドセットの重要性
多様なタンパク質折り畳み構造の使用は設計法の成功において重大な要素であった。ＨＡ上の疎水性の標的部位への結合は、側方に位置する極性かつ荷電したループおよび残基により高度に制約される（図１）。ＨＢ３６およびＨＢ８０いずれの主鎖も、ＨＡの無極性表面との相互作用からその主鎖の極性基を隔離するヘリックスを備えたこの部位に見事に適合する一方、残りの再設計されたタンパク質はこの側方に位置するＨＡ領域との相互作用を全くではないとしてもほとんど形成しない（図１および２）。したがって、ＰＤＢにおいて入手可能なタンパク質スカフォールドの多様性はこの設計手順の鍵であった。スカフォールドセット中のタンパク質のほぼ４０％はＮＩＨ ＮＩＧＭＳのタンパク質構造イニシアチブ（Protein Structure Initiative）（ＰＳＩ；ウェブサイトはnigms.nih.gov/Initiatives/PSI/）の一部として解明され、ＨＢ３６は、機能未知のＰＳＩ標的タンパク質に由来するものであった（Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）由来のＡＰＣ３６１０９、ＰＤＢエントリー１Ｕ８４）。場合により機能未知の比較的小さな細菌タンパク質の構造の分子生物学への有用性が、一部には盛んに議論されてきたが（Ｓ３１‐３３）、本発明者らは、これらの構造の以前には予期されなかった有益性とは該構造が新しいタンパク質機能の設計への道を開く可能性があるということである、と述べる。

融合後ＨＡを用いた設計タンパク質の比較
興味深いことに、融合後ヘマグルチニンの構造（Ｓ３４）から、ＨＢ３６およびＨＢ８０において観察される主要な認識ヘリックスを連想させるが重要な細部において異なる方法で基部の疎水性領域に結合したヘリックスが明らかとなった。融合後の構造は融合前の形態と比較して標的エピトープの重要な再構成を示し、疎水性表面の両側に位置する２つのループは離れ、該表面への接近は妨害されなくなる。この表面に対して、ＨＡ２由来のヘリックス状セグメントがドッキングし、基部領域上の疎水性表面を埋没させる。このＨＡ２ヘリックス由来のいくつかの疎水性化学基は２つの設計された結合剤の同様の基の上に重なるが、ＨＡ２ヘリックスの角度方向、その長さ、および他の残基が何であるかにより、融合前の形態に対する結合剤を生成する鋳型としての使用は妨げられる。しかしながら本発明者らは、この粗い類似性が、進化的に無関係なタンパク質がある標的エピトープに結合する類似の化学基を提示する構造的擬態という現象（Ｓ３５）の興味深い暗示であると考える。

補足資料（Supplemental material）に関する参照文献

実施例２
酵母にディスプレイされた設計物はＨＡがｐＨ誘発性の立体配座変化を生じないように防御する
ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡは既報に従って生産され、変性ゲル電気泳動を使用してＨＡ１およびＨＡ２に開裂されることが確認された。Ｈ１ ＨＡは、１０倍モル過剰量のスルフォ‐ＮＨＳ‐ＬＣビオチン（ピアス（Pierce））を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で室温にて３０分間化学的にビオチン化され、その後、該タンパク質は脱塩用スピンカラム（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））を使用して脱塩されて１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中に含められ、４℃に保管された。

Ｈ１ ＨＡが設計物の防御効果の非存在下で不可逆的な立体配座変化を生じうるかどうかを判断するために、８０ｎＭのＨ１ ＨＡが、ＢＢＳＦバッファー（２０ｍＭ ＢＴＰ、１５０のｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのフラクションＶ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）またはｐＨＢＳＦバッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのフラクションＶ ＢＳＡ、ｐＨ５．２）のいずれかにおいて最終体積１００μＬとして３７℃で１時間インキュベートされ、その後反応物は２０μＬの１Ｍトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて中和された。反応混合物は渦流混合され、２０，０００×ｇで５分間遠心処理され、１０倍希釈の上清が、ＣＲ６２６１ ｓｃＦｖまたは親和性成熟させた設計物のいずれかのディスプレイがなされる酵母細胞を標識するために使用された。細胞はバッファー中２２℃で３０分間標識処理され、洗浄され、抗ｃｍｙｃ ＦＩＴＣ（ミルテニーバイオテク、カリフォルニア州オーバーン）およびストレプトアビジン‐フィコエリトリン（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバード）を用いて氷上で１０分間二次標識された。洗浄後、細胞はＢＢＳＦバッファー中に再懸濁され、２０，０００個の細胞の蛍光がＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータを使用して定量された。ＣＲ６２６１ ｓｃＦｖおよび設計された結合剤はいずれも、融合後の立体配座変化においては存在しないＨＡ上のエピトープを標的とする。ｐＨ５．２で１時間処理されたＨ１ ＨＡは、３つの表面ディスプレイされたＨＡ結合剤すべてについて対照と比較して有意に低い蛍光を有し、Ｈ１ ＨＡがこれらの処理条件下において融合後の状態への不可逆的な立体配座変化を生じうることが示された（データは示さない）。

酵母にディスプレイされた設計物がＨ１ ＨＡのｐＨ誘発性の立体配座変化に対する防御となりうるかどうかを判断するために、８ｎＭのＨ１ ＨＡが、ＣＲ６２６１ ｓｃＦｖまたは親和性成熟させた設計物のいずれかがディスプレイされた酵母細胞を標識するために使用された。２ｅ６個の細胞が１ｍＬのＢＢＳＦバッファー中２２℃で３０分間標識処理され、１回洗浄され、ＢＢＳＦまたはｐＨＢＳＦバッファーのいずれかに再懸濁され、３７℃で１〜２４時間インキュベートされた。定期的に、試料が体積１００μＬとして採取され、２０μＬの１Ｍトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和された。細胞はペレットにされ、洗浄され、上記の通り正確に一連の処理がなされた。この一連の処理の２４時間までの連続時点が評価された。顕著には、ＣＲ６２６１ ｓｃＦｖまたはＨＢ８０．３設計物のいずれかをディスプレイする酵母細胞は、低ｐＨまたは中性ｐＨのバッファーでインキュベートされた細胞間の結合シグナルにおいて有意差を示さず、これらの設計物がＨ１ ＨＡの低ｐＨ誘発性の立体配座変化に対して防御をなすようであることを示している。ＨＢ３６．４設計物をディスプレイする酵母細胞は、低ｐＨバッファーおよび中性ｐＨバッファーのインキュベーションの間の結合シグナルの差を２４時間時点までは示さず、２４時間時点では低ｐＨインキュベーションにおける結合シグナルのわずかな減少が見られた。

実施例３．次世代ＤＮＡ塩基配列決定法と併せた選択を用いる設計物の配列特異的な結合決定因子のプロファイリング
方法
ライブラリの作成
ＨＢ３６．４およびＨＢ８０．３のための単一部位飽和突然変異誘発ライブラリは、ジーンウィズ（Genewhiz）により合成ＤＮＡから構築された。親配列は、突然変異誘発領域を赤色で強調して表１１に挙げられている。酵母ＥＢＹ１００細胞は、確立されたプロトコールを使用してライブラリＤＮＡおよび直鎖状ｐＥＴＣＯＮ（サイエンス誌、２０１１年）で形質転換され、それぞれＨＢ３６．４およびＨＢ８０．３のｓｓｍライブラリについて１．４ｅ６個および３．３ｅ６個の形質転換体を生じた。形質転換後、細胞をＳＤＣＡＡ培地中で３０ｍＬ培養として３０℃で一晩増殖させ、１回継代し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５、２０％（ｗ／ｖ）グリセロール中で１ｅ７のアリコートとして−８０℃で保管した。

酵母ディスプレイ選択
細胞アリコートは氷上で融解され、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離され、ＳＤＣＡＡ培地１ｍＬにつき細胞１ｅ７個となるように再懸濁され、３０℃で６時間増殖させた。その後、細胞は１３，０００ｒｐｍで遠心分離されてＳＧＣＡＡ培地１ｍＬにつき細胞１ｅ７個となるように再懸濁され、２２℃で１６〜２４時間インキュベートされた。細胞はビオチン化Ｖｉｅｔ／２００４／Ｈ５ ＨＡまたはＳＣ／１９１８／Ｈ１ ＨＡのいずれかで標識され、洗浄され、ＳＡＰＥ（インビトロジェン）および抗ｃｍｙｃ ＦＩＴＣ（ミルテニーバイオテク）を用いて二次標識され、表１２に略述されるような蛍光ゲートによってソートされた。細胞が一晩回収されて、ＳＤＣＡＡ培地１ｍＬにつき収集された細胞が２．５ｅ５個になるとすぐに、少なくとも１ｅ７個の細胞が１３，０００ｒｐｍで１分間遠沈され、大規模な塩基配列決定のためのライブラリ調製まで−８０℃で細胞ペレットとして保管された。

ライブラリ調製および塩基配列決定
１‐４ｅ７個の酵母細胞は、２５Ｕのザイモラーゼ（zymolase）を含んだＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ザイモリサーチ（Zymo Research）酵母プラスミドミニプレップＩＩキット）に再懸濁され、３７℃で４時間インキュベートされた。次に細胞はドライアイス／エタノール槽および４２℃のインキュベータを使用して凍結／融解された。その後、プラスミドは、ザイモリサーチ酵母プラスミドミニプレップＩＩキット（ザイモリサーチ、カリフォルニア州アーバイン）を使用して回収されて最終体積３０μＬの１０ｍＭトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に含められた。混入ゲノムＤＮＡは（２０μＬ反応物につき）２μＬのＥｘｏＩエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）、１μＬのラムダ・エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）および２μＬのラムダ・バッファーを使用して３０℃で９０分間処理された後、８０℃、２０分間で酵素の熱不活性化が行われた。プラスミドＤＮＡは、キアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン（Qiagen））を使用して反応混合物から分離された。次に、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用した１８サイクルのＰＣＲ（９８℃ １０秒、６８℃ ３０秒、７２℃ １０秒）を用いて、テンプレートの増幅およびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）アダプタ部分の付加が行われた。使用されたプライマーは試料に特異的なものであり、表１３に列挙されている。ＰＣＲ反応物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰキット（アジェンコート（Agencourt）、マサチューセッツ州ダンヴァーズ）を使用して、製造業者の説明書に従って精製された。試料は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳキット（インビトロジェン）を使用して定量されて最終収率１〜４ｎｇ／μＬであった。試料は等モル比で組み合わされ、この混合物から０．４ｆｍｏｌの全ＤＮＡが２つの別個のレーンに装荷され、適切なシークエンスプライマー（表１３）を用いてゲノムアナライザＩＩｘ（Genome Analyzer IIx）（イルミナ社（Illumina））を使用して塩基配列決定された。

配列解析
未加工のイルミナのリードからのシークエンスデータのアラインメントおよびクオリティフィルタリングは、基本的に既述のようにして処理された。各シークエンスリードは、固有の８ｂｐバーコード識別子（表１３）に基づいて適正なプールに割り当てられた。プールはすべて、配列解析およびクオリティフィルタリングにおいて同一に処理された。カスタムスクリプトが使用されて、両方のリードの平均Ｐｈｒｅｄクオリティスコアが２０以上のペアエンドリードがすべてアラインされた。ペアエンドリードは大域的なニードルマン‐ブンシュ・アルゴリズムを使用してアラインされ、ギャップを伴わないリードは単一配列にマージされ、配列間の差異は該リードについて高いほうのクオリティスコアを使用して解消された。ナイーブライブラリの配列決定技術上の再現は、ライブラリ調製および配列決定についての計数誤差（enumeration error）がポアソン分布に従うことを示し、したがって、誤差解析の信頼区間を評価するためにブートストラッピングが使用された。記録されたすべての誤差は９５％信頼区間にある。

親和性成熟および特異性
ＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対するより高い親和性をもたらすと予測された有益な変異が組み合わされて単一ライブラリとされた。各設計物のＤＮＡライブラリは可変領域をコードする一本鎖オリゴを使用してＳＯＥ ＰＣＲから構築された。プライマーおよび配列は表１３に記載されており、ライブラリのＤＮＡ塩基配列は表１４に記載されている。ライブラリは酵母ＥＢＹ１００の形質転換に使用され、ビオチン化ＳＣ１９１８ Ｈ１／ＨＡに対するストリンジェンシーを変化させた４回のソートに供された。

ＨＢ３６．４上位ライブラリについては、４回のソート後に有力な系列に収束することはなかった（表１５）。有望な構築物はｐＥＴ２９ｂ（ノバジェン（Novagen））大腸菌発現プラスミドにサブクローニングされた（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）。ＨＢ８０．４上位ライブラリについては、４回ソート後のクローンは、各々が出発時のＨＢ８０．３配列から少なくとも５アミノ酸の突然変異を備えた２つの有力な系列に収束した（表１６）。有望な構築物は、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよびＣ末端Ｈｉｓ_６タグとともに特注のｐＥＴプラスミド（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）にサブクローニングされ、溶解性スクリーニングに供された。

溶解性スクリーニング
親和性成熟ライブラリから選択されたＨＢ８０．３クローンは、ドットブロットアッセイを使用して大腸菌発現系における溶解性によってスクリーニングされた。細胞は、コロニーから深型ウェルプレート中で一晩増殖させ、深型ウェルプレート中で２５倍希釈して３７℃で３時間の後、ＩＰＴＧ誘導（１ｍＭ）が３７℃で４時間行った。誘導後、細胞は３，０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により使用済み培地から分離され、−２０℃で一晩ペレットとして保管された。翌朝、プレートは氷上で少なくとも１５分間かけて融解され、各ウェルに２００μＬの結合バッファー（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）が添加された。該プレートは、超音波プロセッサ９６ウェルソニケータを使用して７０％のパルス出力で３分間超音波処理され、溶解産物は４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離された。１００倍希釈の上清をドットブロット用マニホールドＭｉｎｉｆｏｌｄ（商標）Ｉ（ワットマン（Whatman））に移し、ニトロセルロースメンブレン上で５分間乾燥させた。その後、メンブレンは抗ＦＬＡＧマウス抗体ＨＲＰコンジュゲート（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）で標識され、ＤＡＢ基質（ピアス（Pierce））で視覚化された。

表１７はＨＢ３６．４スカフォールド上の部位ごとの許容可能な置換を提供している。
ＨＢ３６．４：セリン４７‐フェニルアラニン６３の中央のヘリックス認識モチーフ（ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；さらには該認識モチーフの外側のＰｈｅ６９（ＭＳＮＡＭＤＧＱＱＬＮＲＬＬＬＥＷＩＧＡＷＤＰＦＧＬＧＫＤＡＹＤＶＥＡＥＡＶＬＱＡＶＹＥＴＥＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦＫＲＰＩＰＦＰＨＡＱＫＬＡＲＲＬＬＥＬＫＱＡＡＳＳＰＬＰＬＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５））
（２）許容可能な部位は、大規模な塩基配列決定と併せたＨＢ３６．４バリアントのＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対する酵母ディスプレイ選択から決定された（さらなる詳細については添付文書を参照のこと）。閾値は、ＦＡＣＳによる２回の選択ソート後の、選択ライブラリ内の所与の突然変異の頻度の最大８０％減少であった。太字フォントで記載された部位はＨＡ表面と接触する部位を示す。

以下の表は、ＨＢ３６．４（ＳＡＦＤＬＡＭＲＩＭＷＩＹＶＦＡＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））からの単一の点突然変異が結合親和性の増大をもたらすことが示される場所を示している。

以下の表はＨＢ８０．３スカフォールド上の部位ごとの許容可能な置換を提供している。（フェニルアラニン１３‐フェニルアラニン２５の１つの中央のヘリックス認識モチーフ；さらには該認識モチーフの外側のチロシン４０）。

許容可能な部位は、大規模な塩基配列決定と併せたＨＢ８０．３バリアントのＳＣ１９１８／Ｈ１ ＨＡに対する酵母ディスプレイ選択から決定された（さらなる詳細については添付文書を参照のこと）。閾値は、ＦＡＣＳによる２回の選択ソート後の、選択ライブラリ内の所与の突然変異の頻度の最大８０％減少であった。太字フォントで記載された部位はＨＡ表面と接触する部位を示す。

以下の表は、ＨＢ８０．３からの単一の点突然変異が結合親和性の増大をもたらすことが示される場所を示している。

Claims (15)

1. 一般式Ｉ
   Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６（配列番号１）
   のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、上記式中、
   Ｒ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、およびＡｓｐからなる群から選択され；
   Ｒ２は任意のアミノ酸であってよく；
   Ｒ３は、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
   Ｒ４はＬｅｕおよびＰｈｅからなる群から選択され；
   Ｒ５は任意のアミノ酸であってよく；
   Ｒ６は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
   Ｒ７は、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
   Ｒ８は、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
   Ｒ９は、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
   Ｒ１０はＴｒｐおよびＰｈｅからなる群から選択され；
   Ｒ１１は、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ１２は、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
   Ｒ１３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
   Ｒ１４は、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、およびＬｅｕからなる群から選択され；
   Ｒ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
   Ｒ１６は、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択される、ポリペプチド。
2. 一般式Ｉは、
   Ｒ１‐Ｒ２‐Ｐｈｅ‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｒ１４‐Ｒ１５‐Ｒ１６‐Ｘ１‐Ｒ１７（配列番号２）
   であり、上記式中、
   Ｘ１は４〜８アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
   Ｒ１７はＰｈｅまたはＴｙｒである、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 一般式ＩＩ
   Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ（配列番号８３）
   のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、上記式中、
   Ｒ１はＰｈｅおよびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ３はＧｌｕおよびＡｓｐからなる群から選択され；
   Ｒ４は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択され；
   Ｒ５は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、およびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ６は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、およびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ７は、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
   Ｒ８は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＴｒｐからなる群から選択され；
   Ｒ９は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＶａｌからなる群から選択され；
   Ｒ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒからなる群から選択され；
   Ｒ１１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＴｙｒからなる群から選択される、ポリペプチド。
4. 一般式ＩＩは、
   Ｒ１‐Ｒ２‐Ｒ３‐Ｒ４‐Ｒ５‐Ｒ６‐Ｒ７‐Ｒ８‐Ｒ９‐Ａｌａ‐Ｒ１０‐Ｒ１１‐Ｐｈｅ‐Ｘ１‐Ｒ１２‐Ｒ１３‐Ｘ２‐Ｒ１４（配列番号８４）
   であり、上記式中、
   Ｘ１は５〜１５アミノ酸の長さであり、各部位は任意のアミノ酸であってよく；
   Ｒ１２は、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｙからなる群から選択され；
   Ｒ１３は、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、およびＳｅｒからなる群から選択され；
   Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
   Ｒ１４は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、およびＬｙｓからなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
5. （ｄ）ＭＡＤＴＬＬＩＬＧＤＳＬＳＡＧＹＱＭＬＡＥＦＡＷＰＦＬＬＮＫＫＷＳＫＴＳＶＶＮＡＳＩＳＧＤＴＳＱＱＧＬＡＲＬＰＡＬＬＫＱＨＱＰＲＷＶＬＶＥＬＧＧＮＤＧＬＥＧＦＱＰＱＱＴＥＱＴＬＲＱＩＬＱＤＶＫＡＡＮＡＥＰＬＬＭＱＩＲＰＰＡＮＹＧＲＲＹＮＥＡＦＳＡＩＹＰＫＬＡＫＥＦＤＶＰＬＬＰＦＦＭＥＥＶＹＬＫＰＱＷＭＱＤＤＧＩＨＰＮＹＥＡＱＰＦＩＡＤＷＭＡＫＱＬＱＰＬＶＮＨ（配列番号１５５）；
   （ｅ）ＭＡＥＴＫＮＦＴＤＬＶＥＡＴＫＷＧＮＳＬＩＫＳＡＫＹＳＳＫＤＫＭＡＩＹＮＹＴＫＮＳＳＰＩＮＴＰＬＲＳＡＮＧＤＶＮＫＬＳＥＮＩＱＥＱＶＲＱＬＤＳＴＩＳＫＳＶＴＰＤＳＶＹＶＹＲＬＬＮＬＤＹＬＳＳＩＴＧＦＴＲＥＤＬＨＭＬＱＱＴＮＥＧＱＹＮＳＫＬＶＬＷＬＤＦＬＭＳＮＲＩＹＲＥＮＧＹＳＳＴＱＬＶＳＧＡＡＬＡＧＲＰＩＥＬＫＬＥＬＰＫＧＴＫＡＡＹＩＤＳＫＥＬＴＡＹＰＧＱＱＥＶＬＬＰＲＧＴＥＹＡＶＧＴＶＥＬＳＫＳＳＱＫＩＩＩＴＡＶＶＦＫＫ（配列番号１４０）；および
   （ｆ）ＭＦＴＧＶＩＩＫＱＧＣＬＬＫＱＧＨＴＲＫＮＷＳＶＲＫＦＩＬＲＥＤＰＡＹＬＨＹＹＹＰＬＧＹＦＳＰＬＧＡＩＨＬＲＧＣＶＶＴＳＶＥＳＥＥＮＬＦＥＩＩＴＡＤＥＶＨＹＦＬＱＡＡＴＰＫＥＲＴＥＷＩＫＡＩＱＭＡＳＲ（配列番号２１１）
   からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
6. 検出可能なタグを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
8. 適切な制御配列に作動可能なように連結された、請求項７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
9. 請求項８に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
10. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の１つ以上のポリペプチドと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
12. インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行う方法であって、インフルエンザ感染の治療および制限のうち少なくとも一方を行うために、投与を必要とする対象者に、治療上有効な量の１つ以上の本発明のポリペプチド、前記ポリペプチドの塩、前記ポリペプチドのコンジュゲート、または前記ポリペプチドの医薬組成物を投与することを含む方法。
13. インフルエンザ感染を診断するか、またはインフルエンザ感染の進行を監視する方法であって、
    （ａ）インフルエンザに感染している疑いのある対象者由来の生体試料を、診断上有効な量の１つ以上の本発明のポリペプチドと、前記試料中に存在するウイルスＨＡタンパク質への前記ポリペプチドの結合に適した条件下において接触させるステップと；
    （ｂ）ポリペプチド‐ウイルスＨＡ結合複合体を検出するステップと
    からなり、
    そのような結合複合体の存在は、前記対象者がインフルエンザに感染していることを示すか、またはインフルエンザ感染の進行の程度を提供する、方法。
14. インフルエンザワクチン候補を同定する方法であって、
    （ａ）試験化合物を、本発明のポリペプチドと、前記ポリペプチドの結合に適した条件下において接触させるステップと；
    （ｂ）結合していない試験化合物を除去するステップと；
    （ｃ）本発明のポリペプチドに結合する試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザワクチン候補である、ステップと
    からなる方法。
15. インフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物を同定する方法であって、
    （ａ）インフルエンザＨＡタンパク質を、（ｉ）試験化合物および（ｉｉ）本発明のポリペプチドと、ＨＡタンパク質の本発明のポリペプチドへの結合に適した条件下において接触させるステップと；
    （ｂ）ＨＡタンパク質への結合に関して前記ポリペプチドより優れた試験化合物を同定するステップであって、そのような試験化合物はインフルエンザ感染の治療、制限、および診断のうち少なくともいずれかを行うための候補化合物である、ステップと
    からなる方法。