CN105188745A - 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供稳定的融合前呼吸道合胞体病毒(RSV)F多肽、包含所述多肽的免疫原性组合物及其用于RSV感染的预防和/或治疗的用途。
Description
本发明涉及医学领域。本发明尤其涉及重组融合前RSVF多肽和它们例如在免疫原性组合物中的用途。
发明背景
呼吸道合胞体病毒(RSV)是一种属于副黏液病毒科肺病毒属的包膜的不分节段的负链RNA病毒。据估计全世界每年发生6400万例RSV感染，引起160.000例死亡(WHO急性呼吸道感染20099月最新(WHOAcuteRespiratoryInfectionsUpdateSeptember2009))。最严重的疾病尤其发生在早产儿、老年人以及免疫受损的个体中。在不足2岁的儿童中，RSV是最常见的呼吸道病原体，占到因呼吸道感染而住院治疗的约50％，其中住院治疗的最高峰发生在2-4月龄。已经报导了几乎所有的儿童在两岁以前都会被RSV感染。在一生中的反复感染被归于低效的天然免疫力。老年人中的RSV疾病负担水平、死亡率以及发病率仅次于由非流行性A型流感感染所引起的那些。
为了感染一个宿主细胞，RSV，像比如流感病毒和HIV的其他包膜病毒一样，需要病毒膜与一个寄主细胞膜的融合。对于RSV，保守的融合蛋白质(RSVF蛋白质)将病毒与宿主细胞的细胞膜进行融合。在当前的模型中，基于副黏液病毒研究，RSVF蛋白质最初折叠成一种“融合前”构象。在细胞进入期间，该融合前构象进行再折叠和构象变化成其“融合后”构象。因此，该RSVF蛋白质是一种亚稳的蛋白质，它通过最初折叠成一种亚稳形式(融合前构象)，该亚稳形式随后进行不连续/逐步的构象变化成一个较低能量的构象(融合后构象)，将不可逆的蛋白质再折叠连接到膜邻近来驱动膜融合。
从RSV-F的电子显微镜术很清楚，融合前与融合后F三聚物之间存在巨大的结构差异，这已经在最近通过结晶学确认(麦格勒朗(McLellanJ.S.)等人《科学》(Science)340(6136):1113-7(2013)和麦格勒朗(McLellanJ.S.)等人《科学》342(6158):592-8(2013))。这些观测结果表明融合前和融合后RSVF蛋白质在抗原性上是独特的(柯尔达(Calder,L.J.)等人《病毒学》(Virology)271,122-131(2000))。
虽然当前不可获得一种针对RSV感染的疫苗，但是需要。基于该RSVF蛋白质的候选疫苗已经由于例如稳定性、纯度、再现性以及效能的问题而失败。如上所指出，晶体结构已经揭露了融合前与融合后状态之间巨大的构象变化。重排的程度表明仅针对RSV-F的融合后构象的一部分抗体将能够与该病毒表面上的融合前刺突的天然构象进行交叉反应。因此，产生一种针对RSV的疫苗的尝试已经集中在对含有RSVF蛋白质的融合前形式的疫苗进行研发(参见例如WO20101149745、WO2010/1149743、WO2009/1079796、WO2012/158613)。然而，这些尝试尚未得到稳定的可以用作用于在人类中进行测试的候选物的融合前RSVF多肽。
发明概述
本发明提供稳定、重组、融合前的呼吸道合胞体病毒(RSV)融合(F)多肽，即稳定化在融合前构象的重组RSVF多肽。本发明的RSVF多肽包含至少一个对该融合前构象F蛋白质具有特异性的表位。在某些实施例中，这些融合前RSVF多肽是可溶性的。在某些实施例中，这些多肽与膜结合。本发明还提供了编码根据本发明的融合前RSVF多肽的核酸分子和包含这些核酸分子的载体。
本发明还涉及到包含一种RSVF多肽、一种核酸分子和/或一种载体的组合物，优选地是免疫原性组合物，以及它们在诱发一种针对RSVF蛋白质的免疫反应中的用途，尤其它们作为一种疫苗的用途。本发明还涉及到用于在一名受试者中诱发一种抗呼吸道合胞体病毒(RSV)免疫反应的方法，包括向该受试者给予有效量的一种融合前RSVF多肽、编码所述RSVF多肽的一种核酸分子和/或包含所述核酸分子的一种载体。优选地，该诱发的免疫反应特征为针对RSV的中和抗体和/或针对RSV的保护性免疫。在具体方面，本发明涉及到用于在一名受试者中诱发中和抗呼吸道合胞体病毒(RSV)F蛋白质抗体的一种方法，包括向该受试者给予有效量的一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含一种融合前RSVF多肽、编码所述RSVF多肽的一种核酸分子和/或包含所述核酸分子的一种载体。
附图简要说明
图1：A)来自离子交换柱的洗脱液A2_F24N67I+S215P的Superdex200凝胶过滤色谱图。这些箭头指示标准蛋白质(1-甲状腺球蛋白669kDa、2-铁蛋白440kDa以及3-IgG150kDa)的洗脱点。B)在还原条件下来自SEC色谱图的含有融合前F蛋白质的峰的SDS-PAGE分析。
图2：装载了含有以下各项的样品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)的蛋白质印迹：1)来自于表达具有异亮氨酸拉链(S)F43的融合前构建体的细胞的上清液；2)来自于表达主要三聚物(顶部带)融合后RSVF蛋白质的细胞的上清液；以及3)纯化的三聚物融合前A2_F24N67I。
图3：相对于未突变A2_F24的点突变的构建体的表达水平。
图4展示实例6中所述的方法的结果：(A)，确定50％CR9501结合损失所在的温度；(B)展示当通过50％融合前特异性抗体CR9501结合损失评估时融合前F(A2_F24N67I+S215P)与未经修饰的胞外结构域的稳定性的比较。
图5：在第1、5以及33天的Octet测量，展示融合前特异性抗体CR9501与融合前构建体的结合的存储-时间依赖性损失；A)A2_F24(SEQIDNO:19)，B)A2_F24K465Q，C)A2_F24S46G，D)A2_F24N67I以及E)A2_F24E92D。
图6：在第1、5以及33天的Octet测量，展示融合前特异性单克隆抗体CR9501与融合前构建体的结合的存储-时间依赖性损失；A)A2_F24K465Q，B)A2_F24K465Q+N67I，C)A2_F24S46G，D)A2_F24S46G+E92D，E)A2_F24S46G+N67I，F)A2_F24E92D，G)A2_F24S46G+E92D，H)A2_F24N67I+E92D以及I)A2_F24E92D+S215P。
图7：在第0和4周用根据表14的免疫原和剂量进行初免加强后在第6周小鼠的VNA滴度。
图8：在第0和4周用根据表15的免疫原和剂量进行初免加强后在第7周棉鼠的VNA滴度。
图9：在鼻内RSV攻击后第5天肺和鼻的病毒负荷量。
发明详细说明
呼吸道合胞体病毒(RSV)的融合蛋白质(F)涉及到病毒膜与一种宿主细胞膜的融合，此融合是感染所需要的。RSVFmRNA被翻译成一种称为F0的574氨基酸前体蛋白质，它在N-末端含有一个信号肽序列(例如SEQIDNO:1的氨基酸残基1-26)，该信号肽序列通过内质网中的一种信号肽酶去除。F0在两个位点(氨基酸残基109/110与136/137之间)通过转运高尔基氏体中的细胞蛋白酶(尤其是弗林蛋白酶)裂解，去除一个短的糖基化的插入序列(还称作一个p27区，包含氨基酸残基110到136，并且产生被称为F1和F2的两个结构域或亚单元。该F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有一个疏水性融合肽并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区(氨基酸残基551-574)。该F2结构域(氨基酸残基27-109)通过两个二硫桥键共价连接到F1。该F1-F2杂二聚物在病毒粒子中被装配成同三聚物。
虽然当前不可获得一种针对RSV感染的疫苗，但是需要。产生一种疫苗的一种可能的方法是基于纯化的RSVF蛋白质的一种亚单元疫苗。然而，对于此方法来说，所希望的是该纯化的RSVF蛋白质处于类似RSVF蛋白质的融合前状态的构象的随时间推移稳定的一种构象，并且可以按足够的量产生。另外，对于一种基于亚单元的疫苗来说，该RSVF蛋白质需要通过跨膜(TM)和胞质区的缺失来截短以产生一种可溶性的分泌的F蛋白质(sF)。因为TM区负责膜的锚定和三聚，所以无锚的可溶性F蛋白质比全长蛋白质要不稳定得多，并且将容易再折叠成融合后终末状态。为了获得呈稳定的融合前构象的展示高表达水平和高稳定性的可溶性F蛋白质，融合前构象因此需要进行稳定化。
对于副流感类型5(PIV5)已经成功地实现另一副黏液病毒F蛋白质稳定化在融合前构象。殷(Yin)等人(《自然》(Nature)439:38-44(2006))因此通过F0中弗林蛋白酶裂解位点的封阻进展到F1和F2的突变来稳定化PIV-5F蛋白质的融合前结构。此外，跨膜(TM)和胞质结构域被一种众所周知的螺旋状三聚结构域GCN4pII置换。此结构域形成一种三聚的螺旋状卷曲螺旋结构并且是天然二聚的螺旋状卷曲螺旋肽GCN4的一种修饰(奥谢(O'Shea)等人，《科学》243:538-542(1989))。其中GCN4亮氨酸拉链的氨基酸序列在七肽区(heptad)的每个a和d位置上被异亮氨酸残基取代的GCN4-pII肽展示形成一种三链平行的α-螺旋状卷曲螺旋(哈伯瑞(Harbury)等人，《科学》262:1401-1407(1993))。
对于RSVF稳定化在融合前构象，已经试验过相同的策略，比如例如弗林蛋白酶裂解位点的突变和RSV-F胞外结构域与一种GCN4pII三聚结构域(如例如WO2010/149743、WO2010/149745、WO2009/079796、WO2012/158613中披露)或与次要纤维蛋白(fibritin)三聚结构域(麦格勒朗(MCLellan)等人，《自然结构生物学》(NatureStruct.Biol.)17:2-248-250(2010))的融合。此次要纤维蛋白结构域或‘福尔顿(Foldon)’衍生自T4次要纤维蛋白并且早期是被描述为一种人工的天然三聚结构域(赖塔夫(Letarov)等人，《生物化学莫斯科版》(BiochemistryMoscow)64:817-823(1993)；古斯(S-Guthe)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)337:905-915.(2004))。然而，这些尝试未产生稳定的融合前RSV-F蛋白质。此外，这些尝试尚未产生适于在人类中进行测试的候选物。
本发明目前提供了重组的稳定的融合前RSVF多肽，即稳定化在融合前构象的RSVF多肽。在产生本发明的研究中，将若干修饰步骤引入和/或组合以获得所述稳定的可溶性融合前RSVF多肽。本发明的稳定的融合前RSVF多肽处于融合前构象，即它们包含(显示)至少一个对融合前构象F蛋白质具有特异性的表位。一个对融合前构象F蛋白质具有特异性的表位是一个在融合后构象中未呈现的表位。不希望受任何具体的理论束缚，相信RSVF蛋白质的融合前构象可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSVF蛋白质上的表位相同的表位，并且因此可以提供用于引起保护性中和抗体的优点。
在某些实施例中，本发明的多肽包含被以下各项识别的至少一个表位：一种融合前特异性单克隆抗体，包含SEQIDNO:54的一种重链CDR1区、SEQIDNO:55的一种重链CDR2区、SEQIDNO:56的一种重链CDR3区和SEQIDNO:62的一种轻链CDR1区、SEQIDNO:63的一种轻链CDR2区以及SEQIDNO:64的一种轻链CDR3区(下文称为CR9501)；和/或一种融合前特异性单克隆抗体，包含SEQIDNO:58的一种重链CDR1区、SEQIDNO:59的一种重链CDR2区、SEQIDNO:60的一种重链CDR3区和SEQIDNO:66的一种轻链CDR1区、SEQIDNO:67的一种轻链CDR2区以及SEQIDNO:68的一种轻链CDR3区(称为CR9502)。CR9501和CR9502包含重链和轻链可变区，以及因此分别具有抗体58C5和30D8的结合特异性，先前已经展示这些抗体与处于其融合前构象的RSVF蛋白质而非融合后构象特异性地结合(参见WO2012/006596)。
在某些实施例中，这些重组融合前RSVF多肽包含被至少一个如上所述的融合前特异性单克隆抗体识别的至少一个表位并且是三聚的。
在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSVF多肽包含位置67上氨基酸残基的一种突变和/或位置215上氨基酸残基的一种突变。
在某些实施例中，位置67上的氨基酸突变成一种疏水性氨基酸。
在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSVF多肽包含位置67上氨基酸残基N或T的一种突变和/或位置215上氨基酸残基S的一种突变。
在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSVF多肽包含一种F1结构域和一种F2结构域以及将所述F1结构域连接到所述F2结构域的包含从1到10个氨基酸残基的一种连接序列，其中这些多肽进一步包含位置67上氨基酸残基N或T的一种突变和/或位置215上氨基酸残基S的一种突变。
在某些实施例中，根据本发明的稳定的融合前RSVF多肽包含一种截短的F1结构域和一种F2结构域以及将所述截短的F1结构域连接到所述F2结构域的包含从1到10个氨基酸残基的一种连接序列，其中这些多肽进一步包含位置67上氨基酸残基N或T的一种突变和/或位置215上氨基酸残基S的一种突变。
如与一种野生型RSVF蛋白质中的RSVF1和/或F2结构域相比，本发明的多肽因此在F1和/或F2结构域中包含至少一个稳定化突变。
在某些实施例中，融合前RSVF多肽包含位置67上氨基酸残基N或T到I的一种突变(N/T67I)和/或位置215上氨基酸残基S到P的一种突变(S215P)。
众所周知RSV以具有两个抗原性亚群A和B的一种单一血清型存在。两个群组的成熟加工的F蛋白质的氨基酸序列约93％一致。如在本申请中所使用，氨基酸位置参考来自A2病毒株的RSVF蛋白质的序列(SEQIDNO:1)给出。如在本发明中所使用，措辞“RSVF蛋白质的位置“x”上的氨基酸因此意指与SEQIDNO:1的RSVA2病毒株的RSVF蛋白质中位置“x”上的氨基酸相对应的氨基酸。注意，在本申请中所使用的编号系统中，1是指一个未成熟F0蛋白质的N-末端氨基酸(SEQIDNO:1)。当使用一种RSV病毒株而不是A2病毒株时，F蛋白质的氨基酸位置将通过在必要时插入空位使其他RSV病毒株的序列与SEQIDNO:1的F蛋白质比对，参考SEQIDNO:1的A2病毒株的F蛋白质的编号来编号。可以使用本领域中众所周知的方法，例如通过CLUSTALW、Bioedit或CLC工作台来进行序列比对。
根据本发明的一种氨基酸可以是二十种天然存在(或‘标准’氨基酸)的任一种或其变体，比如例如D-氨基酸(具有手性中心的氨基酸的D-对映体)或在蛋白质中未天然发现的任何变体，比如例如正亮氨酸。这些标准氨基酸可以基于其性质分成若干群组。重要因素是电荷、亲水性或疏水性、尺寸以及官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用来说是重要的。一些氨基酸具有特殊的性质，例如可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥键)的半胱氨酸，诱发多肽主链转角的脯氨酸，以及比其他氨基酸更灵活的甘氨酸。表11展示这些标准氨基酸的缩写和性质。
本领域技术人员应了解可以通过常规的分子生物学程序对蛋白质进行突变。根据本发明的突变优选地引起如与不包含该(这些)突变的RSVF多肽相比，融合前RSVF多肽的表达水平增加和/或稳定化增加。
在某些实施例中，这些融合前RSVF多肽是可溶性的。
在某些实施例中，这些融合前RSVF多肽进一步包含一种被连接到所述截短的F1结构域的异源三聚结构域。根据本发明，展示通过将一种异源三聚结构域连接到一种截短的F1结构域的C-末端氨基酸残基，任选地与一种连接F1和F2结构域的连接序列和该(这些)稳定化突变组合，提供了展示高表达并且结合于融合前特异性抗体的RSVF多肽，指示这些多肽处于融合前构象。另外，这些RSVF多肽稳定在融合前构象，即，即使在加工这些多肽后，它们仍然结合于融合前特异性抗体CR9501和/或CR9502，指示该融合前特异性表位被保留。
在其他实施例中，这些融合前RSVF多肽包含一种或多种选自下组的其他突变(如与野生型RSVF蛋白质相比)，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基的一种突变；
(b)位置77上氨基酸残基的一种突变；
(c)位置80上氨基酸残基的一种突变；
(d)位置92上氨基酸残基的一种突变；
(e)位置175上氨基酸残基的一种突变；
(f)位置184上氨基酸残基的一种突变；
(g)位置185上氨基酸残基的一种突变；
(h)位置201上氨基酸残基的一种突变；
(i)位置209上氨基酸残基的一种突变；
(j)位置421上氨基酸残基的一种突变；
(k)位置426上氨基酸残基的一种突变；
(l)位置465上氨基酸残基的一种突变；
(m)位置486上氨基酸残基的一种突变；
(n)位置487上氨基酸残基的一种突变；以及
(o)位置508上氨基酸残基的一种突变。
在优选实施例中，该一种或多种其他突变是选自下组，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基S到G的一种突变(S46G)；
(b)位置77上氨基酸残基K到E的一种突变(K77E)；
(c)位置80上氨基酸残基K到E的一种突变(K80E)；
(d)位置92上氨基酸残基E到D的一种突变(E92D)；
(e)位置175上氨基酸残基N到P的一种突变(N175P)；
(f)位置184上氨基酸残基G到N的一种突变(G184N)；
(g)位置185上氨基酸残基V到N的一种突变(V185N)；
(h)位置201上氨基酸残基K到Q的一种突变(K201Q)；
(i)位置209上氨基酸残基K到Q的一种突变(K209Q)；
(j)位置421上氨基酸残基K到N的一种突变(K421N)；
(k)位置426上氨基酸残基N到S的一种突变(N426S)；
(l)位置465上氨基酸残基K到E或Q的一种突变(K465Q)；
(m)位置486上氨基酸残基D到N的一种突变(D486N)；
(n)位置487上氨基酸残基E到Q、N或I的一种突变(E487Q/N/I)；以及
(o)位置508上氨基酸残基K到E的一种突变(K508E)。
再次注意，对于氨基酸残基的位置，参考SEQIDNO:1。本领域技术人员将能够确定其他RSV病毒株的F蛋白质中相对应的氨基酸残基。
在某些实施例中，融合前RSVF多肽包含至少两个突变(如与一种野生型RVF蛋白质相比)。在优选实施例中，该至少两个突变是位置67上氨基酸N或T突变到I的一种突变(N/T67I)和位置215上氨基酸S到P的一种突变(S215P)。
在某些实施例中，融合前RSVF多肽包含至少一个选自下组的其他突变，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基S到G的一种突变；
(b)位置77上氨基酸残基K到E的一种突变；
(c)位置80上氨基酸残基K到E的一种突变；
(d)位置92上氨基酸残基E到D的一种突变；
(e)位置175上氨基酸残基N到P的一种突变；
(f)位置184上氨基酸残基G到N的一种突变；
(g)位置185上氨基酸残基V到N的一种突变；
(h)位置201上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(i)位置209上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(j)位置421上氨基酸残基K到N的一种突变；
(k)位置426上氨基酸残基N到S的一种突变；
(l)位置465上氨基酸残基K到E或Q的一种突变；
(m)位置486上氨基酸残基D到N的一种突变；
(n)位置487上氨基酸残基E到Q、N或I的一种突变；以及
(o)位置508上氨基酸残基K或R到E的一种突变。
在某些实施例中，这些多肽包含至少三个突变。
在某些实施例中，该异源三聚结构域包含氨基酸序列EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQIDNO:3)。在某些其他实施例中，该异源三聚结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:4)。
如上所述，在某些实施例中，本发明的多肽包含一种截短的F1结构域。如在此所用，一种“截短的”F1结构域是指不是一种全长的F1结构域的一种F1结构域，即其中在N-末端或在C-末端一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据本发明，至少跨膜结构域和胞质尾区已经缺失以允许表达为一种可溶性胞外结构域。
在某些其他实施例中，该F1结构域在该RSVF蛋白质的氨基酸残基495(参考SEQIDNO:1)后截短，即由氨基酸残基496(参考SEQIDNO:1)开始的F1结构域的C-末端部分已经缺失。在某些其他实施例，该F1结构域在RSVF蛋白质的氨基酸残基513后截短。在某些实施例中，该F1结构域在氨基酸残基486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、525或525后截短。
在某些实施例中，该三聚结构域连接到RSVF1结构域的氨基酸残基495。在某些实施例中，该三聚结构域包含SEQIDNO:4并且连接到RSVF1结构域的氨基酸残基495。
在某些其他实施例中，该三聚结构域连接到RSVF1结构域的氨基酸残基513。在某些实施例中，该三聚结构域包含SEQIDNO:3并且连接到RSVF1结构域的氨基酸残基513。
在某些实施例中，任选地截短的该F1结构域与该F2结构域通过一种连接序列连接，该连接序列连接该F2结构域的C-末端氨基酸到该(任选地截短的)F1结构域的N-末端氨基酸。在某些实施例中，连接序列(或连接子)包含从1-10个氨基酸残基，优选从2-9个氨基酸残基，优选地从3-8个氨基酸残基，优选地从4-7个氨基酸残基，更优选地该连接子包含5或6个氨基酸残基。本领域中已知许多在构象上中性的连接子，它们可以根据本发明使用，不破坏融合前RVSF多肽的构象。在优选实施例中，该连接子包含氨基酸序列GSGSG(SEQIDNO:5)。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F2结构域来自一种RSVA病毒株。在某些实施例中，该F1和/或F2结构域来自SEQIDNO:1的RSVA2病毒株。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F2结构域来自一种RSVA病毒株，来自SEQIDNO:69的RSVA病毒株。
在某些实施例中，该F1结构域和/或该F结构域来自一种RSVB病毒株。在某些实施例中，该F1和/或F2结构域来自SEQIDNO:2的RSVB病毒株。
在某些实施例中，该F1和F2结构域来自相同的RSV病毒株。在某些实施例中，融合前RSVF多肽是嵌合多肽，即包含来自不同的RSV病毒株的F1和F2结构域。
在某些实施例中，如与一种不具有该(这些)突变的野生型RSVF多肽胞外结构域(即不具有跨膜和胞质区)相比，本发明的融合前RSVF多肽的表达水平增加。在某些实施例中，表达水平增加至少5倍，优选地多达10倍。在某些实施例中，表达水平增加超过10倍。
根据本发明的融合前RSVF多肽是稳定的，即在加工这些多肽，比如例如纯化、冻融循环和/或存储等时，不容易变成融合后构象。
在某些实施例中，如与一种不具有该(这些)突变的RSVF多肽相比，根据本发明的融合前RSVF多肽在4℃下存储时具有一种增加的稳定性。在某些实施例中，这些多肽在4℃下存储时稳定达至少30天，优选地至少60天，优选地至少6个月，甚至更优选地至少1年。“存储时稳定”意指例如如使用如实例7或9中所述的一种方法所测定，在多肽呈溶液(例如培养基)存储在4℃下至少30天后，这些多肽仍然显示对一种融合前特异性抗体(例如CR9501)具有特异性的至少一个表位。在某些实施例中，在融合前RSVF多肽在4℃下存储时这些多肽显示该至少一个融合前特异性表位达至少6个月，优选地达至少1年。
在某些实施例中，如与不具有所述一种或多种突变的RSVF多肽相比，根据本发明的融合前RSVF多肽在受热时具有一种增加的稳定性。在某些实施例中，这些融合前REVF多肽在55℃的温度下，优选地在58℃下，更优选地在60℃下热稳定至少30分钟。“热稳定”意指例如如使用如实例6中所述的一种方法所测定，在已经经受一种升高的温度(即55℃或更高的温度)至少30分钟后，这些多肽仍然显示该至少一个融合前特异性表位。
在某些实施例中，这些多肽在一种适当的配制缓冲液中经受1至6次冻融循环后显示该至少一个融合前特异性表位。
在某些优选实施例中，本发明的融合前RSVF多肽包含一种选自下组的氨基酸序列，该组由SEQIDNO:21-52和71-89组成。在某些实施例中，本发明的融合前RSVF多肽由一种选自下组的氨基酸序列组成，该组由SEQIDNO:21-52和71-89组成。
如在本申请中所使用，核苷酸序列是从5’到3’方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。
在某些实施例中，根据本发明的编码的多肽进一步包含一种前导序列，又称为信号序列或信号肽，与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:69的氨基酸1-26相对应。它是一种存在于大部分注定去往分泌通路的新合成的蛋白质的N-末端的短(典型地5-30个氨基酸长)肽。在某些实施例中，根据本发明的多肽不包含一种前导序列。
在某些实施例中，这些多肽包含一个HIS-标签。一个His-标签或聚组氨酸-标签是蛋白质中的一种氨基酸基序，它由至少五个组氨酸(H)残基组成，时常在蛋白质的N-或C-末端，一般是用于纯化目的。
在某些实施例中，这些多肽不包含一个HIS-标签。根据本发明，已经意外地展示当HIS-标签缺失时，如与具有一个HIS-标签的多肽相比，表达水平和稳定性增加。
本发明进一步提供了编码根据本发明的RSVF多肽的核酸分子。
在优选实施例中，对编码根据本发明的多肽的核酸分子进行密码子最佳化，以在哺乳动物细胞、优选地人类细胞中表达。密码子最佳化的方法已知并且已经在先前描述(例如WO96/09378)。如与一种野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被一个更优选的密码子置换，那么认为一种序列是密码子最佳化的。在此，一个非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的一个密码子，并且一个更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的一个密码子。对于一种特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表中，比如http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地一种以上非优选密码子、优选地大部分或所有非优选密码子被更优选的密码子置换。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子最佳化序列。被优选的密码子置换一般引起更高表达。
本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，故许多不同的聚核苷酸和核酸分子可以编码相同的多肽。本领域技术人员还了解，可以使用常规的技术进行核苷酸取代，这些取代不影响由这些核酸分子编码的多肽序列反映将表达这些多肽的任何具体的宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包含或可以不包含内含子。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
本发明还提供了包含一种如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，根据本发明的一种核酸分子因此为一种载体的一部分。这些载体可以通过本领域的普通技术人员众所周知的方法容易地操纵，并且可以例如被设计成能够在原核和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以用于真核细胞的转化并且将完全或部分地整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所用的载体可以是适于克隆DNA并且可以用于所关注的一种核酸的转录的任何载体。根据本发明的适合的载体是例如腺病毒载体，比如例如Ad26或Ad35、α病毒、副黏液病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒载体等。本领域的普通技术人员能够选择适合的表达载体，并且以一种功能性方式插入本发明的核酸序列。
包含了编码融合前RSVF多肽的核酸分子的宿主细胞也形成本发明的一部分。融合前RSVF多肽可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术包括在宿主细胞中表达这些分子，宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、比如HEK293细胞、PER.C6细胞的人类细胞系或酵母、真菌、昆虫细胞等等，或转基因动物或植物。在某些实施例中，细胞来自一种多细胞生物体，在某些实施例中，它们具有脊椎动物或无脊椎动物起源。在某些实施例中，这些细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，这些细胞是人类细胞。通常，一种宿主细胞中比如本发明的融合前RSVF多肽的一种重组蛋白质的产生包括将以可表达的格式编码多肽的一种异源核酸分子引入该宿主细胞中，在有助于该核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及允许多肽在所述细胞中表达。以可表达的格式编码一种蛋白质的核酸分子可以呈一种表达盒的形式，并且通常需要能够引起该核酸表达的序列，比如一个或多个增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等等。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。启动子可以是组成型的或调节型的，并且可以从不同的来源中，包括病毒、原核或真核来源获得，或是人工设计的。
细胞培养基可获自不同的供应商，并且一种适合的培养基可以按常规针对一种宿主细胞进行选择以表达所关注的蛋白质，在此是融合前RSVF多肽。适合的培养基可以含有或可以不含有血清。
“异源核酸分子”(在此也称为‘转基因’)是一种不天然存在于宿主细胞中的核酸分子。它是通过标准的分子生物学技术引入例如一种载体中。一种转基因通常可操作地连接到表达控制序列。此可以例如通过将编码该(这些)转基因的核酸放在一种启动子的控制下来进行。可以添加其他调节序列。许多启动子可以用于一种或多种转基因的表达，并且为本领域技术人员所知，例如这些启动子可以包含病毒的、哺乳动物的、合成的启动子等等。用于获得在真核细胞中的表达的一种适合的启动子的一个非限制性实例是一种CMV-启动子(US5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。一种聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(US5,122,458)可以存在于该(这些)转基因后面。可替代地，若干广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、碧迪科学公司(BDSciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达所关注的蛋白质，或获得适合的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列等等。
细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括粘附细胞培养物，例如附着到一个培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料式工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。时下，基于灌注原理的连续工艺正变得更常见的并且也是适合的。适合的培养基也是本领域技术人员众所周知的，并且可以通常从商业来源中大量获得，或根据标准方案定做。培养可以例如在碟、滚瓶中或在生物反应器中，使用分批、分批补料式、连续系统等等进行。用于培养细胞的适合条件已知(参见例如《组织培养》(TissueCulture)，学术出版社(AcademicPress)，克鲁斯(Kruse)和帕特森(Paterson)编辑(1973)，和(R.I.菲西涅(Freshney)，《动物细胞的培养：基本技术指南》(Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique)，第四版(威利-里斯公司(Wiley-LissInc.)，2000,ISBN0-471-34889-9))。
本发明进一步提供了包含如上所述的一种融合前RSVF多肽和/或一种核酸分子和/或一种载体的组合物。本发明因此提供了包含一种融合前RSVF多肽的组合物，该融合前RSVF多肽显示在RSVF蛋白质的一种融合前构象中存在但在融合后构象中缺乏的一种表位。本发明还提供了包含对该融合前RSVF多肽进行编码的一种核酸分子和/或一种载体的组合物。本发明进一步提供了包含如上所述的一种融合前RSVF多肽、和/或一种核酸分子、和/或一种载体的免疫原性组合物。本发明还提供了根据本发明的一种稳定化的融合前RSVF多肽、一种核酸分子、和/或一种载体用于诱发一名受试者中针对RSVF蛋白质的一种免疫反应的用途。进一步提供了用于诱发一名受试者中针对RSVF蛋白质的一种免疫反应的方法，包括向该受试者给予根据本发明的一种融合前RSVF多肽、和/或一种核酸分子、和/或一种载体。还提供了根据本发明的融合前RSVF多肽、核酸分子和/或载体，用于诱发一名受试者中针对RSVF蛋白质的一种免疫反应。进一步提供了根据本发明的融合前RSVF多肽、和/或核酸分子、和/或载体用于制造用于诱发一名受试者中针对RSVF蛋白质的一种免疫反应的一种药剂的用途。
本发明的融合前RSVF多肽、核酸分子或载体可以用于RSV感染的预防(防治)和/或治疗。在某些实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。这些患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁以及优选地≥65岁)、幼童(例如≤5岁、≤1岁)、就医患者以及已经用一种抗病毒化合物治疗但已经展示一种不足的抗病毒反应的患者。
根据本发明的融合前RSVF多肽、核酸分子和/或载体可以用于例如由RSV所引起的一种疾病或病状的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗，比如(现有或将来)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体组合。
本发明进一步提供了用于预防和/或治疗一名受试者中的RSV感染的方法，它利用根据本发明的融合前RSVF多肽、核酸分子和/或载体。在一个特定实施例中，用于预防和/或治疗一名受试者中的RSV感染的一种方法包括向一名有需要的受试者给予有效量的如上所述的一种融合前RSVF多肽、核酸分子和/或一种载体。治疗有效量是指一种多肽、核酸分子或载体有效用于预防、缓解和/或治疗由被RSV感染所引起的一种疾病或病状的量。预防涵盖抑制或减少RSV的传播或抑制或减少与被RSV感染有关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的缓解可以指减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的流感感染表现。
为给予受试者，比如人类，本发明可以采用医药组合物，这些医药组合物包含如在此所述的一种融合前RSVF多肽、一种核酸分子和/或一种载体以及一种医药学上可接受的载剂或赋形剂。在本上下文中，术语“医药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。这些医药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域中众所周知的(参见《雷明登氏制药科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)，第18版，热纳罗(A.R.Gennaro)编，马克出版社(MackPublishingCompany)[1990]；《肽和蛋白质的医药配制品发展》(PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins)，弗罗加尔(S.Frokjaer)和霍夫高(L.Hovgaard)编，泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis)[2000]；以及医药赋形剂手册《HandbookofPharmaceuticalExcipients》，第3版，凯博(A.Kibbe)编，医药出版社(PharmaceuticalPress)[2000])。RSVF多肽或核酸分子优选地呈无菌溶液形式被配制和给予，不过还可以利用冻干制剂。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH3.0到9.5、例如pH5.0到7.5范围内。RSVF多肽典型地处于具有一种适合的医药学上可接受的缓冲液的一种溶液中，并且该组合物还可以含有一种盐。任选地稳定剂可以存在，比如白蛋白。在某些实施例中，添加清洁剂。在某些实施例中，RSVF多肽可以被配制成一种可注射的制剂。
在某些实施例中，根据本发明的一种组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对一种所施加的抗原决定簇的免疫反应。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在此可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，一种佐剂用以增强对本发明的RSVF多肽的一种免疫反应。适合佐剂的实例包括铝盐，比如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油型组合物)，包括角鯊烯-水乳液，比如MF59(参见例如WO90/14837)；皂苷配制品，比如例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US5,057,540；WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰基脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含有CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，比如大肠杆菌热不稳定的肠毒素LT、霍乱毒素CT等等；真核蛋白质(例如抗体或其片段(例如针对抗原自身或CD1a、CD3、CD7、CD80)以及受体(例如CD40L、GMCSF、GCSF等)的配体，在与受体细胞相互作用后刺激免疫反应。在某些实施例中，本发明的组合物包含铝作为一种佐剂，例如呈氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，以每剂量0.05-5mg、例如从0.075-1.0mg铝含量的浓度。
这些融合前RSVF多肽还可以与比如例如聚合物、脂质体、病毒体、病毒样粒子组合或结合来给予。这些融合前F多肽可以在有或者没有佐剂下与纳米粒子组合、用纳米粒子壳体包裹或与纳米粒子结合。封装在脂质体内描述于例如US4,235,877中。与大分子结合披露在例如US4,372,945或US4,474,757中。
在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。
在某些实施例中，本发明提供了用于产生一种针对呼吸道合胞体病毒(RSV)的疫苗的方法，包括提供根据本发明的一种组合物并且将其配制成一种医药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在一名受试者中有效去诱发一定程度的针对某一病原体或疾病的免疫性的一种活性组分的一种药剂或组合物，它将引起与被该病原体或该疾病感染有关的症状的严重程度、持续时间或其他表现的至少降低(多达完全缺乏)。在本发明中，该疫苗包含有效量的一种融合前RSVF多肽和/或编码一种融合前RSVF多肽的一种核酸分子和/或包含所述核酸分子的一种载体，它引起一种针对RSVF蛋白质的免疫反应。这提供了一种在一名受试者中预防引起住院治疗的严重下呼吸道疾病和降低由RSV感染和复制引起的比如肺炎和细支气管炎的并发症频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是一种医药组合物，并且因此典型地包含一种医药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。它可以包含或可以不包含其他活性成分。在某些实施例中，它可以是一种组合疫苗，该组合疫苗进一步包含了诱发一种例如针对RSV的其他蛋白质和/或针对其他传染物的免疫反应的其他组分。其他活性组分的给予可以例如通过分开给予或通过给予本发明的疫苗与其他活性组分的组合产物来进行。
组合物可以给予一名受试者，例如一名人类受试者。用于一次单一给予的一种组合物中RSVF多肽的总剂量可以例如为约0.01μg到约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所推荐的剂量将通过实验进行并且对本领域的普通技术人员来说是常规的。
根据本发明的组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括不经肠给予，比如皮内、肌肉内、皮下、经皮或粘膜给予，例如鼻内、经口等等。在一个实施例中，一种组合物通过肌肉内注射来给予。本领域的技术人员已知给予一种组合物，例如一种疫苗的不同的可能性，以诱发对疫苗中的一种或多种抗原的一种免疫反应。
如在此所使用的一名受试者优选地是一个哺乳动物，例如一个啮齿动物，例如一个小鼠、一个棉鼠或一个非人类灵长类动物或一个人类。优选地，该受试者为一个人类受试者。
多肽、核酸分子、载体和/或组合物还可以在一种同源或异源初免-加强方案中或者作为初免或者作为加强来给予。如果执行一种加强接种，那么典型地，此类加强接种将在该组合物第一次给予受试者(在这些情况下这被称为‘初免接种’)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时间给予相同的受试者。在某些实施例中，给予包括一个初免剂和至少一个加强剂给予。
另外，本发明的多肽可以用作诊断工具，例如以通过确定一名个体的血清中是否存在能够结合于本发明多肽的抗体来测试该个体的免疫状态。本发明因此还涉及了用于检测一名患者中一种RSV感染的存在的一种体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使从所述患者中获得的一种生物样品与根据本发明的一种多肽接触；和b)检测抗体-多肽复合物的存在。
本发明进一步提供了用于稳定一种RSVF多肽的融合前构象的一种方法，包括如与野生型RSVF1和/或F2结构域相比，在一种RSVF1和/或F2结构域中引入一种或多种突变，其中该一种或多种突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)在一个邻接于保守的69-212二硫桥键的区域中锁定HRA结构域以免铰链的一种稳定化突变，所述区域包含氨基酸残基66-68和214-216，
(b)在包含在F2结构域的C-末端的氨基酸残基76-98的螺旋(在F2结构域的C-末端)中的一种突变；
(c)使包含氨基酸486、487以及489的HRB茎区的顶部(HRBN-末端)之间的负电荷斥力减小的一种突变；以及
(d)在该HRA区域中的一种稳定化突变。
在某些实施例中，HRA铰链区中的突变在位置67上。
在某些实施例中，HRA铰链区中的突变在位置215上。
在某些实施例中，HRA铰链区中的突变在位置66或68上和/或在位置214或216上。
在某些实施例中，螺旋中的突变在位置77上。
在某些实施例中，螺旋中的突变在位置80上。
在某些实施例中，位置77和/或80上的氨基酸残基变成一种带负电的氨基酸。
在某些实施例中，突变在位置92上。
在某些实施例中，该突变使包含氨基酸486、487、489的HRB茎区的顶部之间的负电荷斥力减小。
在某些实施例中，突变在位置489上。
在某些实施例中，突变在位置486上。
在某些实施例中，突变使氨基酸残基175-193之间的β-转角稳定化。
在某些实施例中，突变使位置175上的转角稳定化。
在某些实施例中，突变使位置184-185上的转角稳定化。
通过这些方法可获得和/或获得的稳定化的融合前RSVF多肽，以及它们如上所述的用途也成为本发明的一部分。
本发明在以下实例中进一步解释。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。
实例
实例1
稳定的融合前RSVF多肽的制备-连接子和三聚结构域
在产生本发明的研究中，通过使发起再折叠的两个主要区域稳定化来设计可溶性融合前F蛋白质(sF)的稳定化变体。第一策略是通过用一个短环固定和接合F1-F2结构域使该融合肽停滞在其位置并且防止它从头部区域释放。可以通过重建F1的N-末端与F2的C-末端的共价连接来防止该融合肽的释放。如此实例中所示，已经试验过若干不同的连接子。F1与F2之间一个5氨基酸环的插入是最成功的，尤其是包含氨基酸序列GSGSG(SEQIDNO:5)。此连接子是基于在一个3D同源性模型中测量的距离设计，该模型是针对RSV-F类型A2，基于与公开3D结构(殷(Yin)等人，2006)的副流感类型5的F序列的序列比对来产生。
用以构建融合前RSV-F的同源性模型的HRSV类型A和B的F序列与PIV5(顶部序列)之间的比对
另一个不稳定区域是第二七肽重复(HRB)区域，它形成融合前F蛋白质中三聚的螺旋状茎区。该可溶性F蛋白质中跨膜结构域(TM)的缺失进一步使此区域不稳定，这种不稳定通过添加不同的异源三聚结构域来抵消。完全加工的成熟RSV-F胞外结构域在C末端与不同的三聚结构域融合并且在不同的位置(即F1结构域在不同的氨基酸残基上截短)。
若干构建体是基于或者RSVA2或者B1病毒株制成。不同的三聚结构域连接到RSVF1结构域，该RSVF1结构域在不同的位置截短。所测试的三聚结构域包括次要纤维蛋白基序(包含氨基酸序列：GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:4)，和“次要纤维蛋白长”基序，一个较长的N-末端延伸的次要纤维蛋白结构域，它包括其天然螺旋区域(包含氨基酸序列：SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:6)，该三聚结构域与推测的HRB区域的七肽重复序列同框(配准)添加到RSVF1结构域。
制成的其他构建体包含七肽理想螺旋状三聚的卷曲螺旋，或异亮氨酸拉链结构域(IZ)(铃木(Suzuki)等人，《蛋白质工程》(ProteinEngineering)11:1051-1055(1998))，包含氨基酸序列：IEAIEKK(SEQIDNO:7)。根据本发明，使用不同的IZ结构域，称为异亮氨酸拉链(L)，包含氨基酸序列：(I)EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA(SEQIDNO:8)，和异亮氨酸拉链(S)，包含氨基酸序列EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQIDNO:3)。
这些IZ结构域在结构上与GCN4是可比的，然而，这些IZ结构域不是天然序列，而是被设计成最佳的三聚结构域，并且因此是更稳定的。
用其他已知的三聚结构域制成其他构建体：
GCN4II
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA(SEQIDNO:9)
最佳化的GCN4II
EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA(SEQIDNO:10)
软骨基质蛋白-1(长的型式)
EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII(SEQIDNO:11)
只含有拉链结构域的软骨基质蛋白-1(Matrillin-1)短的型式：
EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII(SEQIDNO:12)
制成以下构建体：
构建体F18包含被连接到F1结构域的氨基酸残基513的次要纤维蛋白三聚结构域(SEQIDNO:4)。
构建体F19包含被连接到F1结构域的氨基酸残基499的次要纤维蛋白三聚结构域(SEQIDNO:4)。
构建体F20包含被连接到F1结构域的氨基酸残基516的异亮氨酸拉链(L)结构域(SEQIDNO:8)并且在HRB中包含额外修饰以最佳化七肽位置的疏水性并且促进与IZ结构域的框内融合。
构建体F21还包含异亮氨酸拉链(L)结构域(SEQIDNO:8)，但被连接到F1结构域的氨基酸残基501并且在HRB区域中不具有额外修饰。
构建体F22包含被连接到F1结构域的氨基酸残基495的异亮氨酸拉链(L)结构域(SEQIDNO:8)并且在HRB中包含额外修饰。
构建体F23包含被连接到氨基酸残基495的异亮氨酸拉链(S)结构域(SEQIDNO:3)。
构建体F46还包含异亮氨酸拉链(S)结构域(SEQIDNO:3)，但连接到一个较长的RSV-F胞外结构域，即F1结构域在氨基酸残基513后被截短。
所有构建体都包含一个HIS-标签。
这些构建体针对表达水平、存储稳定性以及与抗体CR9501的抗体结合来测试。此抗体的重链和轻链可变区以及重链和轻链CDR的氨基酸序列在下文中给出。CR9501包含在WO2012/006596中称为58C5的抗体的结合区域。
这些构建体在基因艺术公司(GeneArt)(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的生命技术公司(LifeTechnologies,Carlsbad,CA))进行合成和密码子最佳化。这些构建体被克隆到pCDNA2004中或通过该领域内普遍知道的标准方法，包括定点突变诱发和PCR产生，并且测序。使用的表达平台是293Freestyle细胞(生命技术公司)。使用293Fectin(生命技术公司)，根据制造商的说明书，将这些细胞短暂地转染，并且在37℃和10％CO2下培养5天。将培养物上清液收获并且在300g下旋转5min，以去除细胞和细胞碎片。旋转过的上清液随后使用一个0.22um真空过滤器进行无菌过滤并且存储在4℃下直到使用。
来自第5天的上清液针对F蛋白质表达，通过蛋白质印迹法，使用单克隆抗体CR9503进行评估，该单克隆抗体CR9503包含RSVF抗体莫维珠单抗(称为CR9503)的重链和轻链可变区。这些融合前RSVF蛋白质构建体的近似表达水平是使用CR9503、一种抗人类IR-染料结合的二级抗体(内布拉斯加州林肯市的拉哥公司(Li-Cor,Lincoln,NE))或一种HRP结合的小鼠抗人类IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫市的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA))评估。接着使用纯化过的RSV标准蛋白质的一系列稀释液，或者通过眼睛或者使用OdysseyCLx红外成像系统估计蛋白质的数量。可替代地，定量的Octet(BioLayer干涉量度学)用于测量上清液中的蛋白质浓度。为了评估构建体稳定性和为了识别所引入的三聚基序的正面或负面稳定化作用，能够结合CR9501的构建体在从45℃-65℃的温度范围处理30分钟，以测试CR9501表位的稳定性。此程序详细描述于实例8中。结果概述于表1中。
表1.具有不同的三聚基序的RSVF构建体的表达和稳定性
如表1中可见，表达的唯一构建体是次要纤维蛋白变体(F18)和F23。虽然F18是三聚的并且展示表达，但它在4℃下存储时不稳定。相比之下，F23在4℃下稳定，结合于融合前特异性抗体，但似乎是单体的。因此，两种变体F18和F23都用以针对稳定性和三聚进行最佳化。
然后，制成若干构建体，其中在F1的N-末端的融合肽通过与F2结构域的C-末端融合来固定。所有构建体都包含一个His-标签。
制成若干构建体，包括其中两个弗林蛋白酶裂解位点都突变，产生仍然含有p27肽的一种可溶性F蛋白质的构建体(即F12、F15.1以及F17)。在其他构建体中，从前体F0裂解的27残基区域(P27环)被一种替代性闭合环或连接序列置换：或者通过RSV-F的区域被PIV-5F(已经成功地产生和结晶的融合前F蛋白质)的‘同源’区域置换(F25)，或者通过该区域被一个将F2与F1的末端桥连的最小(GS)n环置换(F24)，或者通过该区域被RSV-G的中心保守区域置换(F26)。基于PIV-5的RSV-F的同源性模型化和计算机模拟的测量导致对残基108与136之间的5氨基酸残基的一种最小环的选择。作为一种连接子，选择Gly(G)和Ser(S)残基，它们是灵活并且极性的并且具有高的被接纳的机会(F24)。另外，F137突变成S，因为由该环引起的局部的修饰可以位移疏水性F并且引起不稳定性。此在下文中展示。还有R106突变成Q并且27个残基(109-135)被GSGSG置换。
如表2中所示，所有变体都展示无或极低表达，除了具有短GSGSG环的变体(F24)，它展示与野生型RSVF构建体，即不具有所述连接子的一种相似构建体(F11)相比，高得多的表达(44μg/ml)。然而，三聚的F24在存储时，像具有一种C-末端次要纤维蛋白三聚基序的所有其他变体一样不稳定。所有变体都含有一个HIS-标签。
表2.具有不同的F1-F2连接子的RSVF构建体的表达和稳定性
*稳定性如实例7中所述来定义。表达水平如实例1中所述来测定。
然后，将最有利的修饰组合以发现最佳的融合前F多肽。将具有该GSGSG环的变体、F1的C-末端截短以及添加或者次要纤维蛋白(SEQIDNO:4)或者异亮氨酸拉链(S)基序(SEQIDNO:3)进行组合(参见表3)。
表3.具有根据表1和2的优化组合的RSVF构建体的表达和稳定性。
ND是未测定
*存储稳定性如实例7中测定。*热稳定性如实例8中测定。表达水平如通过蛋白质印迹法(实例1中描述)测定
GSGSG-环的添加始终增加功能性构建体的表达以及蛋白质的热稳定性。GSGSG-环与截短的F和异亮氨酸拉链(S)基序(F43、F47)的组合展示优良的表达、热稳定性以及在4℃下存储时优良的稳定性。然而，这些变体仍然是单体的。异亮氨酸拉链(S)三聚基序展示在作为在位置495进行C末端截短的F的一种F变体下更高的表达(将F43与F56以及F23与F46比较)。相比之下，对于具有次要纤维蛋白三聚结构域的变体，位置513上的截短展示与展示无表达的位置495上的截短相比的高表达(将F24与F44比较)。
因为该HIS-标签可能干扰三聚物的天然折叠，所以针对次要纤维蛋白和异亮氨酸拉链(S)变体制成不具有该HIS-标签的变体(表4)。
表4.有和没有HIS-标签的RSVF构建体的表达和稳定性
*存储稳定性如实例7中所述来测定；热稳定性如实例8中所述来测定；ND：未测定。
惊人地，HIS-标签的缺失增加F47中的表达。此外，对于F47，它略增加三聚物含量，并且对于F24，它只适度增加表达水平。
然后，若干替代性三聚结构域和截短与GSGSG-环稳定化的F变体(F47)进行组合(参见表5)。所有变体都具有一个GSGSG-环并且含有一个HIS-标签。
表5.具有替代性三聚结构域的RSVF变体的表达和稳定性
抗体结合被定义为在收获当日的结合(如实例7中所述；
+指示结合；-指示无结合。
表达水平如实例1中所述来测定。ND：未测定
发现只有软骨基质蛋白1结构域(达姆斯(Dames-SA)等人，《自然结构与分子生物学》(Nat.Struc.Biol.)，5(8),1998)能够实现比F47更高的表达水平(表5，软骨基质蛋白长)，该软骨基质蛋白1结构域含有N-末端拉链结构域与具有可以潜在地形成三聚物间二硫桥键的半胱氨酸残基的C-末端部分。此外，具有软骨基质蛋白长三聚基序的变体展示三聚的F蛋白质。然而，该产物不结合于融合前特异性MabCR9501并且还展示六聚的物质，这使得软骨基质蛋白1三聚结构域不适合产生三聚的天然F蛋白质。基于软骨基质蛋白或基于GCN4II的拉链基序中没有一个展示相对于F47增加的表达或稳定性(表5，软骨基质蛋白短，GCN4II最佳化)。再次，495上的截短导致更高的表达水平。含有一个最佳化触发序列的一个GCN4基序的添加展示无表达。
GCN4II是一个成功地用于稳定副流感类型5的融合前三聚物的三聚结构域(殷(Yin)等人，《自然》439:38-44,2006)并且也已经被别人试验来稳定RSV融合前F(如例如WO2010/149743、WO2010/14975、WO2009/079796、WO2010/158613中披露)。对GCN4II三聚结构域进行评估并且与含有异亮氨酸拉链(S)结构域(SEQIDNO:3)或次要纤维蛋白(SEQIDNO:4)结构域的构建体相比较(结果展示于表6中)。这些变体也与另一些修饰，即基于一个单一赖氨酸的一个短连接子和L512K突变相比较。所有变体都含有一个HIS-标签。
表6.具有GCN4II、L512K以及p27置换的RSVF变体的表达和稳定性(F1与F2之间的单一氨基酸连接子(K))
存储稳定性如实例7中所述来测定；表达水平如实例1中所述来测定；热稳定性如实例8中所述来测定；ND：未测定。
F1与F2之间的短键似乎与GSGSG环是可比的。GCN4II基序的添加不引起任何所测试的构建体(即WO2010/149743或WO2010/149745中描述的RSVA2F序列、根据本发明使用的RSVA2F序列，也不是RSVB1F序列)中任何F蛋白质的表达。
根据本发明展示这两个类型的修饰的引入，即一个连接序列和异源三聚结构域的引入，不足以能够实现稳定的三聚的融合前F蛋白质的表达。除了如上所述，稳定化不稳定性的两个主要区域，即HRB和融合肽，融合前F蛋白质中的其他区域也促使和/或接纳显著再折叠成融合后F，并且该序列中的更多位置可以进行最佳化以使融合前F蛋白质停止再折叠。因此，HRA和HRB结构域中和接触融合前F中的这些区域的所有结构域中不同的氨基酸残基突变以增加融合前结构稳定性，如以下实例中所述。
实例2
稳定的融合前RSVF多肽的制备-稳定化突变
因为三聚物含量(对于构建体F47)和存储稳定性(对于构建体F24)不是最佳的，所以制成含有点突变以增加表达水平、稳定性以及天然三聚物结构的其他变体。结果展示于表7和8中。
表7.F47-变体的表达和稳定性
ND：未测定；表达水平如实例1中所述来测定。热稳定性如实例8中所述来测定。
基于野生型序列(SEQIDNO:1)的突变的命名。
所有构建体都是F47-的变体：类型A2，异亮氨酸拉链(S)基序(SEQIDNO:3)，GSGSG连接子；端点495，无HIS-标签(SEQIDNO:16)。如表7中所示，许多突变增加F47-的表达，但只有变体F47_S46G也展示除高表达外更高水平的三聚物。
表8展示F24变体的表达和稳定性的结果。所有变体都是RSV类型A2，具有次要纤维蛋白基序、GSGSG连接子；端点513，无HIS-标签。
表8.A2_F24-(SEQIDNO:19)变体的表达和稳定性
*标记的构建体是针对三聚来测试并且发现都是三聚的表达水平如实例1中所述来测定。终点稳定性在此展示为在4℃下存储5天后相对于第1天融合前抗体结合(CR9501)的百分比；缔合期稳定性如实例9中所述来测定。
许多突变增加A2_F24-的表达。对于大部分的突变，在F47-背景(表7)与A2_F24-背景(表8)中提高的表达之间存在一个明显的相关性。N67I对A2_F24-背景中F表达具有更正面的影响。表达最显著的增加是由单一点突变得到：S46G、S215P、N67I、K80E、E92D、D486N、G184N、V185N、E487N、N175P、K209Q、E487I、E487Q、K77E、K201Q、N426S以及K465Q。在使用终点稳定性分析(实例7)的初期筛选中，具有最高表达的变体也展示存储时最好的稳定性(E92D、K465Q、K465E、N426S、S46G、S215P以及N67I)。为了评估是否这些突变实际上使融合前构象稳定化，基于定量的蛋白质分析结果，将培养物上清液稀释到5和10μg/ml，并且这些在4℃下存储达33天。作为单一点突变体，只有N67I和S215P随时间推移完全稳定(参见实例9)。
随后，将展示融合前构象的高表达和优良稳定性的若干突变进行组合以评估稳定化是否是累加的或具有一种可能的协同效应(表9)。
表9.具有两个额外突变的A2_F24的变体的表达和稳定性。
存储稳定性是指实例9中说明的缔合期分析。
表达水平如实例1中所述来测定。
所有变体都是F24-的变体：类型A2，次要纤维蛋白基序、GSGSG连接子；端点513，结合于所有Mab，无HIS-标签(SEQIDNO:19)。
当先前识别的点突变组合时，在表达水平方面，可以观测到非常引人关注的协同效应，其中包括N67I的组合是最有效的。包括或者N67I和S215P的所有产生的双重突变体在4℃下存储超过30天后是稳定的(实例9)。惊人地，当包括在双重突变体内时，发现突变N67I对融合前F的表达水平具有最强烈的影响。然后，具有S215P突变的组合引起一种合理的表达。选择N67I与S215P的组合，因为它引起一种极高的表达水平，并且因为两个点突变在存储时都是稳定的。另外，观测到N67I和S215P都具有稳定一些突变体的能力，这些突变体作为单一突变，是不稳定的，这指示发现这两个突变的区域对在转换成融合后构象期间蛋白质进行的构象改变来说是重要的。
根据本发明，因此已经展示至少一些突变引起融合前RSV蛋白质增加的表达水平和增加的稳定化。预期这些现象是关联的。此实例中描述的突变都引起融合前F多肽增加的产生。这些多肽中只有一种选择在长期存储时保持稳定(参见实例9)。使用的稳定性分析是基于一个结合分析中在融合前F蛋白质的顶部中融合前特异性CR9501表位的损失，并且它可能不足够敏感来测量整个蛋白质稳定性的所有影响因素。仅仅观测到增加的表达的突变因此是(很可能稳定化)可能的突变，它可以与其他稳定化突变组合以获得具有高稳定性和高表达水平的一种融合前F构建体。
然后，验证N67I-S215P双重突变是否像单一突变一样，能够稳定化点突变，这些点突变作为单一突变体，基于使用的标准，被认为是不稳定的。附加的突变是基于根据表8的有利的表达水平和稳定性选择。构建三重突变RSV-F变体，并且针对表达水平和稳定性进行测试(表10)。
表10.具有一种额外突变的F24_N67I+S215P的变体的表达和稳定性。
所有变体都是A2_F24_N67I+S215P的变体：类型A2，次要纤维蛋白基序、GSGSG连接子；端点513，结合于所有Mab，无HIS-标签(SEQIDNO:21)。
*稳定性是指实例9中说明的缔合期分析。
+意指5天后<10％CR9501结合损失；++意指5天后<5％CR9501结合损失；+++意指5天后0％CR9501结合损失。
再次，观测到对表达水平的一个累加效应。正如所料，D479N和E487R三重突变体以略微降低的水平表达，因为这些单一突变体也处于所选突变的最低中(表8)。由于N67I+S215P突变的稳定化作用，所以作为单一突变体不稳定的额外突变在它们添加到A2_F24N67I+S215P背景时产生稳定的融合前F变体。一些非常具有说明性的实例是具有额外的V185N、G184N或E487N的三重突变体，它们展示高表达，但作为单一突变体展示低稳定性(表8)，但在添加到A2_F24N67I+S215P背景时展示甚至更高的表达并且是高度稳定的。
稳定化突变也稳定来自其他病毒株以及加工的F变体中的RSV-F蛋白质。
展示融合前构象的高表达和优良稳定性的若干突变应用于其他病毒株的RSVF蛋白质(SEQIDNO69和70)并且应用于一种不具有弗林蛋白酶裂解位点突变的RSVA2F变体(F18：SEQIDNO71)以评估这些修饰是否是一种稳定化RSV融合前F的通用方案(表11)。
表11.具有额外突变的A2_F18的变体和来自病毒株B1(SEQIDNO:2)以及A型CL57-v224(SEQIDNO:69)的F的表达和稳定性。
蛋白质表达(短暂地转染的细胞的上清液中的浓度)通过定量的Octet方法来测量。
*相对表达相对于A2_F24_N67I、S215P、E487Q的表达归一化(seqID#_33)
**稳定性-表示为相对于收获当日，在4C下存储5天后测量的蛋白质浓度％。这些浓度通过定量的Octet方法，使用CR9501抗体来测量。NA-数据不可用：未检测到CR9501结合。
当先前识别的点突变引入A2_F18(SEQIDNo.71)时，稳定性和表达水平与在F1与F2之间含有一个短环的单链F24(SEQIDNo.21)变体相比较非常相似。再次，观测到协同作用，展示当突变添加到含有N67I或双重突变N67I、S215P的变体时更高的表达和稳定性。双重点突变N67I、S215P不仅稳定A2病毒株的融合前F，而且也稳定B1和CL57-v224病毒株的融合前(表11)。
稳定化突变也稳定全长RSV-F蛋白质。
展示与胞外结构域相对应的RSV-F的可溶性型式中融合前构象的高表达和优良稳定性的若干突变应用于全长RSV-F蛋白质。这些突变引入有或者没有弗林蛋白酶裂解位点突变的全长RSV-F中。无三聚结构域稠合到这些变体(表12)
表12.具有额外突变的A2_F18和A2_F24的全长型式的变体的表达和稳定性。
表达水平使用FACS测定。N.D.-未测定。*所有变体是基于RSVA2F蛋白质序列。**与野生型蛋白质相比较，9503上MFI的增加倍数。
稳定性是通过在46℃、55.3℃、60℃下对HEK293T细胞热处理5-10分钟来评估。
***稳定性读数的说明
-46℃后结合于融合前特异性MabCR9501结合的减少(例如野生型)
+46℃后CR9501结合轻微降低，但不与野生型相同的强烈程度
++高达60℃，CR9501结合无变化，在60℃下CR9501结合有一些减少
+++在60℃下CR9501结合无变化
先前识别的稳定化点突变也在全长F蛋白质中稳定化。表达水平的增加不太显著，但展示相同的趋势。这可能由突变引入的不同的背景引起，但也可能由不同的定量方法(FACS对比蛋白质印迹法)和由于表面蛋白质再循环产生的生物表达最大值引起。连接序列(或短环)的引入增加表达和稳定性，并且点突变也这样。点突变与短环无或几乎无协同作用(与可溶性蛋白质所发现的相似(表9-11)。
因为位置67上的点突变对表达水平和稳定性具有这样的正面影响，所以对此位置测试所有氨基酸取代以研究是否选择最佳或这些位置是否可以改善(表13)。
表13.A2_F24背景中位置67的表达和稳定性的完全取代分析。
*相对表达-蛋白质浓度通过定量的Octet方法，使用CR9503抗体来测量，并且相对于A2_F24(SEQID#19)的浓度表示
**稳定性-表示为相对于收获当日，在4C下存储5和10天后测量的蛋白质浓度％。这些浓度通过定量的Octet方法，使用CR9501抗体来测量。NA-数据不可用：未检测到CR9501结合。
如表13中所示，位置67上的主要疏水性残基和尤其Ile、Leu以及Met能够增加表达和稳定性。Ile是最增加表达和稳定性的残基位置67上残基Glu和Gln、最小残基Gly以及带正电的残基Arg和Lys对融合前构象具有最失稳作用。
根据本发明，稳定RSVF蛋白质的融合前构象的氨基酸突变可以按不同的方式分成稳定该构象的不同的类别。用于融合前F稳定化的策略是基于RSV-F的同源性模型，该模型是基于PIV5晶体结构(殷(Yin)等人，2006)和第27页的比对。
氨基酸残基67和215：
位置67和215上的氨基酸残基在融合前模型与融合后晶体结构的3D结构中都非常靠近。这些残基靠近形成铰链的DIII区域的顶部中保守的二硫桥键，沿着该铰链，HRA区域再折叠成长的伸长的卷曲螺旋延伸的螺旋状三聚物。在此区域中的突变将影响铰链功能，并且因此引入的突变通过阻碍铰链功能来稳定化融合前构象。
氨基酸残基77、80
位置77和80上的氨基酸残基位于F2的C-末端的长螺旋(残基76-98)内，该螺旋与DIII中在F1的N-末端的整个二级结构紧密接触，这些二级结构再折叠成融合后构象的长卷曲螺旋结构。因为该两个区域在从融合前再折叠成融合后期间必须分开，所以在此区域内的防止此分开的氨基酸将稳定融合前构象。因为该两个区域在再折叠期间应分开，所以一些残基可以最佳化以加强相互作用。观测到的一种斥力的一个实例是在带正电的Lys80之间。Lys80到带负电的Glu残基的突变增加了融合前F的表达。由于连续转换到融合后构象，所以这些突变可以与其他的稳定化突变，如N67I和S215P组合，以得到此稳定化的全部益处，如表10中所示。
氨基酸残基92
位置92上的氨基酸残基也位于F2的C-末端的长螺旋(残基76-98)内，该螺旋与DIII中在F1的N-末端的整个二级结构紧密接触，这些二级结构再折叠成融合后构象的长卷曲螺旋结构。当此螺旋与HRA区域分开时，它被拉到含有Synagis表位的DIII区域(表位II)(阿维萨(Arbiza)等人，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)73:2225-2234,1992)并且在融合后构象中带负电的Glu92移动到非常接近带正电的Arg282。降低此拉力的突变将稳定融合前构象。Glu92到一种保守的Asp残基的突变将降低拉力，因为它不能到达Arg282。
氨基酸残基486、487
在融合前构象中在HRB顶部的氨基酸残基486、487以及489形成一个带负电的小片。Glu487到Asn或Ile的突变增加了融合前F表达。Asp486到Asn或Gln和/或Glu489到Asn、Ile或Gln的突变将具有相同的影响。由于连续转换到融合后构象，所以这些突变可以与其他的稳定化突变，如N67I和S215P组合，以得到此稳定化的全部益处，如表10中针对例如D486N所示。
氨基酸残基175、184、185
为了从融合前再折叠到融合后构象，残基175与193之间的区域必须从一个环-β发夹转变到一个螺旋。
此区域显示最显著的结构转换。此区域的一部分实际上具有最高α-螺旋预测。融合前模型中实际的螺旋结构在下文中以灰色突出展示。当它再折叠成融合后构象时，此整个区域转变成一个大的螺旋。在底部序列中，具有基于Agadir(http://agadir.crg.es/)的最高螺旋预测的残基以灰色突出。由此比较很清楚，在融合前构象中维持在一个β-发夹的C-末端部分(残基187-202)具有高的形成一个α-螺旋的倾向。
RSV-F的残基150-212的序列在上文展示。在第二行上，基于PIV-53D同源性模型，顶行的二级结构通过h(对于螺旋)和s(对于链)指示。螺旋以灰影突出。底行是基于序列的螺旋倾向将螺旋打上灰影的相同的序列。
因此，一个脯氨酸引入在位置175上以稳定此转角并且防止再折叠成一个螺旋，此作为一个单一突变，增加表达水平，指示它稳定融合前构象并且能够更好地加工蛋白质。对于发夹中的转角(残基184、185)，布鲁克黑文数据库(Brookhavendatabase)从不再折叠的一个稳定的蛋白质寻找一个在结构上同源的发夹。发现与蛋白质激酶A中的一个发夹环(pdb编码3FHI)具有高度的结构同源性。根据下文所示的比对，残基184Gly或185Val被Asn置换，以稳定此转角并且防止它再折叠。
VVSLSNGVSVLTSKVHRAb1b2178-192
EMDVYVNNEWATSVG3fhi：B179-193
这些突变可以与其他的稳定化突变，如N67I和S215P组合，以得到此稳定化的全部益处，如表10中所示。
氨基酸残基421、426以及46
位置421和426上的氨基酸残基处于DII区域中的一个环中。残基S46在从DI跨越到DIII的一条链上。位置426上的氨基酸残基突变成丝氨酸并且位置46上的氨基酸残基突变成甘氨酸。这些突变增加稳定性和融合前表达水平。
氨基酸残基465
氨基酸残基Lys465位于经历大的构象变化的另一个区域。Lys465位于将DII区域的顶部连接到HRB的一个横贯环上。因为HRB区域从底部往上移到顶部并且与HRA复合，形成六螺旋束，横贯环也从底到顶重新定位。因此此环必须是亚稳的，以允许DII的脱离和在另一个环境的再定位。该横贯环上的Lys465靠近DII区域上的Lys445。Lys465到或者Gln或者Glu的突变中和斥力并且增加稳定性和融合前F表达水平。
实例3
融合前F蛋白质的表达
编码重组融合前RSVF蛋白质的表达质粒通过本领域中普遍知道的标准方法，包括定点突变诱发和PCR产生。使用的表达平台是293Freestyle细胞(英国伦弗鲁郡生命技术公司(LifeTechnologies,Renfreshire,UK))。使用293Fectin(生命技术公司)，根据制造商的说明书，将这些细胞短暂地转染，并且在一个震荡培育箱中，在37℃和10％CO2下培养5天。将培养物上清液收获并且在300g下旋转5min，以去除细胞和细胞碎片。旋转过的上清液随后使用一个0.22um真空过滤器进行无菌过滤并且存储在4℃下直到使用。
实例4
融合前RSVF蛋白质的纯化
这些重组多肽通过一种2步纯化方案来纯化，该方案应用一个阳离子交换柱用于初始纯化并且随后应用一个superdex200柱用于抛光步骤以去除残余污染物。对于初始的离子交换步骤，培养物上清液用2体积的50mMNaOAcpH5.0稀释，并且以每分钟5ml通过一个5mlHiTrapCaptoS柱。随后，柱用10柱体积(CV)的20mMNaOAc、50mMNaCl、0.01％(v/v)tween20pH5洗涤，并且用2CV的20mMNaOAc、1MNaCl、0.01％(v/v)tween20pH5洗脱。洗脱液使用一种旋转浓缩器浓缩并且蛋白质使用一个superdex200柱，使用40mMTris、500mMNaCl、0.01％(v/v)tween20pH7.4作为运行缓冲液来进一步纯化。图1A中，展示来自凝胶过滤柱的色谱图并且主峰含有融合前RSVF蛋白质。将含有此峰的洗脱份再次汇集并且蛋白质浓度使用OD280测定并且存储在4℃下直到使用。图1B中，展示最终蛋白质制剂的一个还原的SDS-PAGE分析并且可以看到纯度>95％。带的身份使用蛋白质印迹法和蛋白质F特异性抗体(未示出)验证。
实例5
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于根据本发明的融合前F多肽的多聚体状态的初始测定，在一个非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Bis-Tris凝胶系统(生命技术公司)中分析来自短暂地转染的细胞的培养物上清液。随后凝胶使用iBlot技术，根据制造商的说明书(生命技术公司)点迹。一种RSVF蛋白质特异性抗体CR9503(序列在以下表17中给出)用作用于检测融合前RSVF蛋白质的主要探针，并且接着使用一种HRP结合的小鼠抗人类IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫市的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA))或一种IRDye800CW结合的亲和力纯化的抗人类IgG(兔)(宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔市的罗克兰免疫化学公司(RocklandImmunochemicals,Gilbertsville,PA))。印迹用标准胶片(柯达(Codak))或者使用OdysseyCLx红外成像系统显影。图2展示来自单体F47-(泳道1)、融合后和主要三聚的RSVF蛋白质(泳道2)以及纯化的融合前RSVF蛋白质(泳道3)的上清液的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，展示纯化后仅三聚的物质存在于融合前RSVF蛋白质制剂中，因为它类似于融合后三聚物带迁移。这也由来自凝胶过滤柱的洗脱体积支持(图1A)。
实例6
定量的蛋白质印迹法
对于融合前RSVF蛋白质构建体的定量，使用定量的蛋白质印迹法。在4％-12％(w/v)Bis-TrisNuPAGE凝胶(生命技术公司)上还原下进行培养物上清液的稀释并且使用iBlot技术(生命技术公司)点迹。这些印迹用CR9503(如上所述)探测，并且用或者一种结合的小鼠抗人类IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫市的杰克逊免疫研究公司)或者一种IRDye800CW结合的亲和力纯化的抗人类IgG(兔)(宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔市的罗克兰免疫化学公司)显影。接着使用纯化过的RSV标准蛋白质的一系列稀释液并且或者OdysseyCLx红外成像系统或者通过眼睛估计蛋白质的数量。图3中，可以看到在整体表达水平方面相对于A2_F24(SEQIDNO:19)构建体的影响。展示单一突变增加表达水平多达5倍。如果产生这些突变中的一些的双重突变体，那么可以观测到协同效应并且在一些情况下，观测到超过A2_F24多达11倍的进一步增加的表达。
实例7
终点稳定性分析
根据本发明的表达的多肽的融合前构象的验证使用BioLayer干涉量度学(Octet)技术，使用融合前特异性抗体CR9501或CR9502或者非构象特异性抗体CR9503进行，该非构象特异性抗体CR9503包含莫维珠单抗的重链及轻链可变区。这些抗体通过标准方案进行生物素化并且固定在抗生蛋白链菌素生物传感器(英国朴次茅斯的福博公司(ForteBio,Portsmouth,UK))上。程序如下。传感器在动力学缓冲液(福博公司)中平衡60s后，尖端(Tipss)转移至具有5ug/ml所需抗体的PBS中。负载进行250s。随后包括在动力学缓冲液中200s的另一个平衡步骤。最后，尖端转移到含有融合前RSVF多肽的表达培养物上清液中并且记录1200s后的结合反应(nm)。此期又称为缔合期。这在收获以后立即(第1天)以及5天后(第5天)进行，并且使用CR9501结合的差异作为一种筛选工具以识别能够稳定融合前构象的突变。如果在第5天观测到不到20％结合损失，那么一种构建体被认为是稳定的，并且如果超过20％结合损失，那么它被认为是不稳定的。接着需要的话，稳定的构建体可以进行一项更严格的稳定性测试。数据分析使用福博数据分析6.4软件(福博公司)进行。
实例8
热稳定性分析
引入到RSVF多肽的特征的稳定化潜能通过热应力来估计。出于此目的，来自短暂地转染的细胞或者纯化的蛋白质的培养物上清液使用一系列温度加热。随后样品在冰上冷却以防止进一步热诱发的构象变化并且使用CR9501抗体在如实例7中所述的octet技术平台上探测。将在缔合期结束时在不同温度下获得的反应作为温度的函数进行制图并且使用Prism软件，通过非线性回归拟合。这产生抗体结合水平是最大值的50％的温度的一个估计并且该值可以用于在融合前热稳定性方面比较不同的构建体。图4中，比较未经修饰的胞外结构域(SEQIDNO:13)和A2_F24N67I+S215P构建体(SEQIDNO:21)。可以观测到如与未经修饰的胞外结构域相比，温度诱发的应力对A2_F24N67I+S215P构建体(SEQIDNO:21)具有较小的影响。因此，可以推断出根据本发明的多肽中引入的稳定化基序，即三聚位点、F1-F2连接子以及2个点突变产生一种更稳定的融合前F蛋白质。
实例9
缔合期稳定性分析
为了评估不同的点突变的稳定性，发展octet结合分析，它是先前描述的终点稳定性分析(实例7)的一个变体。缔合期分析由于一些点突变体的表达水平极高而实施，因为它更严格并且完全防止表达水平偏离。还使用CR9501抗体，但代替在缔合期结束时选择结合反应，使用整个缔合曲线，以减少终点分析的潜在浓度偏离。这使用来自实验的整个缔合期的数据点，使用指示的A2_F24点突变体进行。数据补偿芯片上结合抗体的量。测量在第1、5以及33天进行，并且比较来自该三天的曲线的形状。如果获得一致的曲线，那么该构建体被认为是稳定的，并且如果不一致，那么就是不稳定的。图5中，可以看到四种不同的变体的分析。不稳定的蛋白质融合前构建体可以通过CR9501结合(A2_F24、K465Q、S46G)的时间-依赖性损失来识别，而稳定的融合前构建体(N67I)显示无这样的降低。突变E92D似乎落入具有中间稳定性的两个之间一个群组，因为仅仅观测到呈曲线形状的微小变化。图6中，所选择的点突变已经组合以形成双重突变体并且分析这些突变体。如可以见到的，在稳定性和稳定性诱发方面，不同的突变显示不同的表型。当多肽包含单独或组合的突变K465Q或S46G时，所有三个，即两个单一的和该双重的突变体，都是不稳定的并且融合前特异性抗体结合随时间推移而损失。当突变S46G与先前作为一个单一突变展示具有中间稳定性的E92D组合时，未能观测到稳定性变化，指示E92D突变无法校正不稳定的蛋白质构建体。当突变N67I与或者S46G或者E92D突变组合时，结果是一个完全稳定的构建体。这还可以在S215P突变与E92D突变组合时观测到，展示该两个突变稳定不稳定的融合前构建体的独特潜能。
实例10
定量的Octet
为了测量细胞培养物上清液中融合前RSVF蛋白质的浓度，使用定量的基于Octet的方法。CR9501和CR9503抗体通过标准方案进行生物素化并且固定在抗生蛋白链菌素生物传感器(英国朴次茅斯的福博公司(ForteBio,Portsmouth,UK))上。之后，涂布的生物传感器在模拟的细胞培养物上清液中进行封阻。定量实验如下执行：温度30C，震荡速度1000rpm，分析时间300sec。细胞培养物上清液中蛋白质的浓度使用标准曲线计算。标准曲线使用A2_F24_N67I+S215P(SEQID#_21)蛋白质针对每个涂布的抗体制备，在模拟的细胞培养物上清液中稀释。测量在上清液收获当天(第1天)以及在4C下存储上清液5天或更长后进行。用CR9501测定的浓度的差异用作一种筛选工具以识别能够稳定融合前构象的突变。如果在第5天观测到测量的浓度不到20％降低，那么一种构建体被认为是稳定的。数据分析使用福博数据分析6.4软件(福博公司)进行。
实例11
FACS分析和热稳定性
编码重组全长RSVF蛋白质的表达质粒通过本领域中普遍知道的标准方法，包括定点突变诱发和PCR产生。使用293Fectin(生命技术公司)，根据制造商的说明书，将这些HEK293-T细胞短暂地转染，并且在37℃和10％CO2下培养48小时。细胞使用FACS缓冲液(含5mMEDTA、PBS中1％FBS)从细胞培养皿处分开，洗涤并且再悬浮于相同的缓冲液中。针对表面RSVF蛋白质，通过生物素化的CR9501或CR9503抗体，接着通过APC标记的抗生蛋白链菌素对细胞进行染色。为了区别活细胞与死细胞，在染色程序结束时将碘化丙啶添加到细胞悬浮液中。细胞在FACSCanto(碧迪生物科学公司)上根据任何本领域的普通技术人员众所周知的标准方法分析。数据分析使用FlowJo9.0软件(树星公司(TreeStarInc.)进行。针对活的APC-阳性细胞群体，计算平均荧光强度(MFI)。
引入到全长膜结合的RSVF中的特征的稳定化潜能通过热应力来估计。转染后48小时如上所述将细胞从细胞培养皿处分开，并且使用一系列温度(37℃、46℃、55.3℃、60℃)加热细胞悬浮液5-10分钟。随后如上所述将细胞染色并且通过FASC分析。针对活的APC-阳性细胞群体，计算MFI。针对活的细胞群体计算APC-阳性细胞的百分比。在经受在增加温度下的热休克的样品中用CR9503染色产生相似的MFI和APC-阳性细胞％。用CR9501染色在被不稳定的蛋白质转染的细胞样品中降低。CR9501结合的损失指示细胞表面上融合前RSVF蛋白质的损失。
实例12
融合前F免疫原性的临床前评估
为了评估一种稳定化的融合前RSVF(A2F24、N67I、S215P)(SEQIDNO:21)的免疫原性，根据表14，在初免-加强方案中，在第0周和第4周，用0.5或5ug对小鼠进行免疫接种。如图7中所示，用融合前F免疫接种的小鼠展示比用融合后RSVF免疫接种的小鼠更高的VNA滴度。
表14.免疫接种方案
| 群组 | 制剂 | 剂量 | 佐剂 | N |
| 1 | 融合后F | 0.5μg | - | 9 |
| 2 | 融合后F | 5μg | - | 9 |
| 3 | 融合前F | 0.5μg | - | 9 |
| 4 | 融合前F | 5μg | - | 9 |
| 5 | 融合后F | 0.5μg | 聚(I:C) | 9 |
| 6 | 融合前F | 0.5μg | 聚(I:C) | 9 |
| 8 | FI-RSV | 1/75 | - | 8 |
| 9 | PBS | - | 3 |
然后，用两个不同剂量的处于或者融合后或者融合前构象的RSV-F对棉鼠进行免疫接种(表15)。在第0周和第4周肌肉内对动物进行免疫接种。图8显示在攻击当天(第7周)的高中和抗体滴度。
表15.棉鼠中用于免疫原性评估和功效的群组、免疫原以及剂量
| 群组 | 制剂 | 剂量 | 佐剂 |
| 1 | 融合后F | 0.5ug | - |
| 2 | 融合后F | 5ug | - |
| 3 | 融合前F | 0.5ug | - |
| 4 | 融合前F | 5ug | - |
| 9 | 融合前F | 0.5ug | 聚IC |
| 10 | 融合前F | 5ug | 聚IC |
| 11 | 融合前F | 0.5ug | 磷酸铝(Adju Phos) |
| 12 | 融合前F | 5ug | 磷酸铝(Adju Phos) |
| 13 | Ad26.RSV.FA2 | 10^8 | - |
| 14 | PBS | - | - |
攻击后五天，测量肺和鼻的病毒负荷量(参见图9)。
如所示，根据本发明的融合前F多肽能够诱发一种强烈的保护性免疫反应，该免疫反应降低肺以及甚至鼻中的病毒负荷量。
表16.标准氨基酸、缩写以及性质
| 氨基酸 | 3字母 | 1字母 | 侧链极性 | 侧链电荷(pH 7.4) |
| 丙氨酸 | Ala | A | 非极性 | 中性 |
| 精氨酸 | Arg | R | 极性 | 正性 |
| 天冬酰胺 | Asn | N | 极性 | 中性 |
| 天冬氨酸 | Asp | D | 极性 | 负性 |
| 半胱氨酸 | Cys | C | 非极性 | 中性 |
| 谷氨酸 | Glu | E | 极性 | 负性 |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q | 极性 | 中性 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 非极性 | 中性 |
| 组氨酸 | His | H | 极性 | 正性(10％)中性(90％) |
| 异亮氨酸 | Ile | I | 非极性 | 中性 |
| 亮氨酸 | Leu | L | 非极性 | 中性 |
| 赖氨酸 | Lys | K | 极性 | 正性 |
| 甲硫氨酸 | Met | M | 非极性 | 中性 |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 非极性 | 中性 |
| 脯氨酸 | Pro | P | 非极性 | 中性 |
| 丝氨酸 | Ser | S | 极性 | 中性 |
| 苏氨酸 | Thr | T | 极性 | 中性 |
| 色氨酸 | Trp | W | 非极性 | 中性 |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 极性 | 中性 |
| 缬氨酸 | Val | V | 非极性 | 中性 |
表17.抗体序列
若干融合前RSVF构建体的氨基酸序列在下文给出。注意在此所述的不同的构建体中氨基酸编号是基于野生型序列(SEQIDNO：1)，意指融合前构建体的从位置1到并且包括位置108的所有氨基酸都与野生型序列的氨基酸位置1-108相对应，而从位置138到终末的氨基酸的编号位移22个氨基酸，即野生型序列(SEQIDNO：1)中的L138与所有融合前构建体中的L116相对应。这是由于融合前构建体中已进行一种缺失，即GSGSG连接子的插入，F1中的实际编号在构建体之间的不相同的事实。因此，关于根据本发明的特定突变所使用的编号，例如S215P，是指野生型序列中氨基酸的位置。
序列
RSVF蛋白质A2全长序列(SEQIDNO：1)
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RSVF蛋白质B1全长序列(SEQIDNO：2)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQIDNO：3
EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA
SEQIDNO：4
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQIDNO：5
GSGSG
F8：RSVA2，野生型胞外结构域(SEQIDNO：13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHHHHHHHH
F11：RSVB1，野生型胞外结构域(SEQIDNO：14)
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F47：RSVA2，连接子稳定化，IZ(S)(SEQIDNO：15)
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F47-：RSVA2，连接子稳定化，IZ(S)(SEQIDNO：16)
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F43：RSVB1，连接子稳定化，IZ(S)(SEQIDNO：17)
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F24：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：18)
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A2_F24：RSVA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：19)
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F24-：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：20)
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A2_F24N67I+S215P：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：21)
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F24-N67I+S215P：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：22)
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A2_F24N67I+E92D：RSVA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：23)
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F24-N67I+E92D：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：24)
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A2_F24N67I+K465Q：RSVA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：25)
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F24-N67I+K465Q：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：26)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGQNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24N67I+S46G：RSVA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：27)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-N67I+S46G：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：28)
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A2_F24E92D+S215P：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：29)
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F24-E92D+S215P：RSVB1，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：30)
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A2_F24N67I+S215P+K508E：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：31)
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SDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24N67I+S215P+E487I：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：32)
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A2_F24N67I+S215P+E487Q：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：33)
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A2_F24N67I+S215P+E487N：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：34)
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A2_F24N67I+S215P+D486N：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：35)
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A2_F24N67I+S215P+K465E：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：36)
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A2_F24N67I+S215P+K465Q：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：37)
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A2_F24N67I+S215P+N426S：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：38)
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A2_F24N67I+S215P+K421N：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：39)
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A2_F24N67I+S215P+K209Q：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：40)
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A2_F24N67I+S215P+K201Q：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：41)
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A2_F24N67I+S215P+V185N：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：42)
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A2_F24N67I+S215P+G184N：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：43)
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A2_F24N67I+S215P+N175P：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：44)
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A2_F24N67I+S215P+E92D：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：45)
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A2_F24N67I+S215P+K80E：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：46)
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A2_F24N67I+S215P+K77E：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：47)
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A2_F24N67I+S215P+S46G：A2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：48)
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A2_F24：RSVS46GA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：49)
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A2_F24：RSVK465QA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：50)
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A2_F24：RSVN67IA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：51)
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A2_F24：RSVE92DA2，连接子稳定化，次要纤维蛋白(SEQIDNO：52)
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RSVF蛋白质CL57-v224全长序列(SEQIDNO：69)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
胞外结构域，RSVCL57-v224(SEQIDNO：70)
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PreF，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：71)
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PreFN67IS215P，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：72)
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PreFN67IS215P，RSVB1，次要纤维蛋白(SEQIDNO：73)
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PreFN67IS215P，RSVCL57-v224，次要纤维蛋白(SEQIDNO：74)
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PreFLN67IS215P，RSVB1，次要纤维蛋白，环(SEQIDNO：22)
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PreFLN67IS215P，RSVCL57-v224，次要纤维蛋白，环(SEQIDNO：75)
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PreFN67IS215PE487Q，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：76)
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PreFN67IS215PK201N，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：77)
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PreFN67IS215PE92D，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：78)
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PreFN67IS215PD486N，RSVA2，次要纤维蛋白(SEQIDNO：79)
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FwtN67IS215P，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：80)
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FslN67IS215P，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：81)
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FwtN67IS215PE92D，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：82)
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FslN67IS215PE92D，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：83)
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FwtN67IS215PE487Q，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：84)
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FslN67IS215PE487Q，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：85)
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FwtN67IS215PD486N，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：86)
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FslN67IS215PD486N，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：87)
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FwtN67IS215PS46G，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：88)
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FslN67IS215PS46G，膜结合的RSVF，A2(SEQIDNO：89)
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CR9501重链(SEQIDNO：53)：
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501轻链(SEQIDNO：61)：
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502重链(SEQIDNO：57)：
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502轻链(SEQIDNO：65)：
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
Claims (46)
1.一种重组的融合前呼吸道合胞体病毒(RSV)融合(F)多肽，包含至少一个对该融合前构象F蛋白质具有特异性的表位，其中该至少一个表位被以下各项识别：一种融合前特异性单克隆抗体，包含SEQIDNO:54的一种重链CDR1区、SEQIDNO:55的一种重链CDR2区、SEQIDNO:56的一种重链CDR3区和SEQIDNO:62的一种轻链CDR1区、SEQIDNO:63的一种轻链CDR2区以及SEQIDNO:64的一种轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体，包含SEQIDNO:58的一种重链CDR1区、SEQIDNO:59的一种重链CDR2区、SEQIDNO:60的一种重链CDR3区和SEQIDNO:66的一种轻链CDR1区、SEQIDNO:67的一种轻链CDR2区以及SEQIDNO:68的一种轻链CDR3区。
2.根据权利要求1所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽是三聚的。
3.根据权利要求1或2所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含位置67上氨基酸残基的一种突变和/或位置215上氨基酸残基的一种突变。
4.根据权利要求1、2或3所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含一个F1结构域和一个F2结构域，以及包含从1到10个氨基酸残基的将所述F1结构域连接到所述F2结构域的一个连接序列。
5.根据前述权利要求1到4中任一项所述的融合前RSVF多肽，包含一个截短的F1结构域和一个F2结构域，以及包含1到10个氨基酸残基的将所述F1连接到所述F2结构域的一个连接序列，其中如与该野生型RSVF蛋白质中该RSVF1和/或F2结构域相比，多肽在该F1和/或F2结构域中包含至少一个稳定化突变，其中该至少一个稳定化突变是选自下组，该组由以下各项组成：
(a)位置67上氨基酸残基N/T的一种突变，
(b)位置215上氨基酸残基S的一种突变。
6.根据前述权利要求1到5中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该至少一个稳定化突变选自下组，该组由以下各项组成：
(a)位置67上氨基酸残基N/T到I的一种突变；以及
(b)位置215上氨基酸残基S到P的一种突变。
7.根据权利要求5或6所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含一个连接到所述截短的F1结构域的异源三聚结构域。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含至少一个其他突变，其中所述突变是选自下组，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基的一种突变；
(b)位置77上氨基酸残基的一种突变；
(c)位置80上氨基酸残基的一种突变；
(d)位置92上氨基酸残基的一种突变；
(e)位置175上氨基酸残基的一种突变；
(f)位置184上氨基酸残基的一种突变；
(g)位置185上氨基酸残基的一种突变；
(h)位置201上氨基酸残基的一种突变；
(i)位置209上氨基酸残基的一种突变；
(j)位置421上氨基酸残基的一种突变；
(k)位置426上氨基酸残基的一种突变；
(l)位置465上氨基酸残基的一种突变；
(m)位置486上氨基酸残基的一种突变；
(n)位置487上氨基酸残基的一种突变；以及
(o)位置508上氨基酸残基的一种突变。
9.根据权利要求8所述的融合前RSVF多肽，其中该至少一个其他突变是选自下组，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基S到G的一种突变；
(b)位置77上氨基酸残基K到E的一种突变；
(c)位置80上氨基酸残基K到E的一种突变；
(d)位置92上氨基酸残基E到D的一种突变；
(e)位置175上氨基酸残基N到P的一种突变；
(f)位置184上氨基酸残基G到N的一种突变；
(g)位置185上氨基酸残基V到N的一种突变；
(h)位置201上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(i)位置209上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(j)位置421上氨基酸残基K到N的一种突变；
(k)位置426上氨基酸残基N到S的一种突变；
(l)位置465上氨基酸残基K到E或Q的一种突变；
(m)位置486上氨基酸残基D到N的一种突变；
(n)位置487上氨基酸残基E到Q、N或I的一种突变；以及
(o)位置508上氨基酸残基K到E的一种突变。
10.根据前述权利要求1到9中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含至少两个突变。
11.根据权利要求10所述的融合前RSVF多肽，其中该至少两个突变包含位置67上氨基酸残基N/T到I的一种突变；以及位置215上氨基酸残基S到P的一种突变。
12.根据权利要求11所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含至少一个选自下组的其他突变，该组由以下各项组成：
(a)位置46上氨基酸残基S到G的一种突变；
(b)位置77上氨基酸残基K到E的一种突变；
(c)位置80上氨基酸残基K到E的一种突变；
(d)位置92上氨基酸残基E到D的一种突变；
(e)位置175上氨基酸残基N到P的一种突变；
(f)位置184上氨基酸残基G到N的一种突变；
(g)位置185上氨基酸残基V到N的一种突变；
(h)位置201上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(i)位置209上氨基酸残基K到Q的一种突变；
(j)位置421上氨基酸残基K到N的一种突变；
(k)位置426上氨基酸残基N到S的一种突变；
(l)位置465上氨基酸残基K到E或Q的一种突变；
(m)位置486上氨基酸残基D到N的一种突变；
(n)位置487上氨基酸残基E到Q、N或I的一种突变；以及
(o)位置508上氨基酸残基K到E的一种突变。
13.根据前述权利要求1到12中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该异源三聚结构域包含氨基酸序列EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA(SEQIDNO:3)。
14.根据权利要求13所述的融合前RSVF多肽，其中该三聚结构域连接到该RSVF蛋白质的氨基酸残基495。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该异源三聚结构域包含氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:4)。
16.根据权利要求15所述的融合前RSVF多肽，其中该三聚结构域连接到该RSVF蛋白质的氨基酸残基513。
17.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该F1与该F2结构域之间的该连接子包含5个氨基酸残基。
18.根据权利要求17所述的融合前RSVF多肽，其中该连接子包含氨基酸序列GSGSG(SEQIDNO:5)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该F1结构域和/或该F2结构域来自一种RSVA病毒株。
20.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该F1结构域和/或该F2结构域来自一种RSVB病毒株。
21.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽在55℃下，优选地在58℃下，更优选地在60℃下稳定至少30分钟。
22.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽在4℃下存储至少30天、优选地至少60天、优选地至少6个月、甚至更优选地至少1年后是稳定的。
23.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽包含一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO:21-SEQIDNO:52以及71-89。
24.根据前述权利要求中任一项所述的融合前RSVF多肽，其中该多肽不包含一种HIS-标签。
25.核酸分子，编码根据前述权利要求1到24中任一项所述的融合前RSVF多肽。
26.根据权利要求25所述的核酸分子，其中该核酸分子已经针对在哺乳动物细胞中表达进行密码子最佳化。
27.载体，包含根据权利要求25或权利要求26所述的核酸分子。
28.组合物，包含根据权利要求1到24中任一项所述的融合前RSVF多肽、根据权利要求25或权利要求26所述的核酸分子和/或根据权利要求27所述的载体。
29.根据权利要求1到24中任一项所述的融合前RSVF多肽、根据权利要求25或权利要求26所述的核酸分子和/或根据权利要求27所述的载体，用于诱发一种针对RSVF蛋白质的免疫反应。
30.根据权利要求1到24中任一项所述的融合前RSVF多肽、根据权利要求25或权利要求26所述的核酸分子和/或根据权利要求27所述的载体，用作一种疫苗。
31.根据权利要求1到24中任一项所述的融合前RSVF多肽、根据权利要求25或权利要求26所述的核酸分子和/或根据权利要求27所述的载体，用于RSV感染的防治和/或治疗。
32.一种用于稳定RSVF多肽的融合前构象的方法，包括如与野生型RSVF1和/或F2结构域相比，在一种RSVF1和/或F2结构域中引入一种或多种突变，其中该一种或多种突变是选自下组，该组由以下各项组成：
(e)在一个邻接于保守的69-212二硫桥键的区域中锁定HRA结构域以免铰链的一种稳定化突变，所述区域包含氨基酸残基66-68和214-216，
(f)在包含该F2结构域的C-末端的氨基酸残基76-98的螺旋中的一种突变；
(g)使包含氨基酸486、487的HRB茎区的顶部之间的负电荷斥力减小的一种突变；以及
(h)在该HRA区域中的一种稳定化突变。
33.根据权利要求32所述的方法，其中该HRA铰链区中的该突变在位置67上。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中该HRA铰链区中的该突变在位置215上。
35.根据权利要求32、33或34所述的方法，其中该HRA铰链区中的该突变在位置66或68上，和/或位置214或216上。
36.根据权利要求32所述的方法，其中该螺旋中的该突变在位置77上。
37.根据权利要求32所述的方法，其中该螺旋中的该突变在位置80上。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中位置77和/或80上的该氨基酸残基变成一种带负电的氨基酸。
39.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中该突变在位置92上。
40.根据权利要求32所述的方法，其中该突变使包含氨基酸486、487、489的该HRB茎区的顶部之间的负电荷斥力减小。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该突变在位置489上。
42.根据权利要求40所述的方法，其中该突变在位置486上。
43.根据权利要求32所述的方法，其中该突变使氨基酸残基175-193之间的β-转角稳定化。
44.根据权利要求43所述的方法，其中该突变使位置175上的转角稳定化。
45.根据权利要求43所述的方法，其中该突变使位置184到185上的转角稳定化。
46.稳定化的融合前RSVF多肽，通过权利要求32到45中任一项所述的方法可获得。
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