CN116284266B - 突变型呼吸道合胞病毒融合前f蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用。本发明提供的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，相较于野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白存在以下突变：(a)F1亚基和/或F2亚基中至少一个氨基酸残基被半胱氨酸取代，(b)野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽部分或全部取代，所述连接肽的氨基酸残基长度至少2个。本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相比于同类品具有优异的中和抗体结合活性和热稳定性，适宜于开发成为呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。2020年，全球5岁以下儿童中呼吸道合胞病毒严重感染人数高达3460万人，其中仅中国的感染人数就达到300万人。每年大约3％～7％的60岁以上老年人会受到RSV感染。老年人因为免疫力下降和基础疾病，出现严重疾病的风险更高。WHO估计每年全球有6400万儿童感染呼吸道合胞病毒，其中15万儿童死于呼吸道合胞病毒感染，且同时引起非常严重的全球医疗负担，据估计2017年全球与RSV相关的直接医疗费用为48.2亿欧元。呼吸道合胞病毒感染可导致严重并发症，包括毛细支气管炎或肺炎，通常伴有急性呼吸窘迫，需要住院治疗。天然的RSV感染不会引起长期的免疫保护，且会反复感染。目前只有一种已获许可的单克隆抗体产品(Palivizumab)用于降低高危新生儿严重疾病的发生率。近30多年来尚无有效的RSV疫苗上市，安全有效的RSV疫苗开发一直被视为非常具有挑战性。因此，呼吸道合胞病毒疫苗已被WHO列为全球最优先发展的疫苗之一。
RSV感染主要由糖蛋白F和G介导，黏附蛋白(G)与宿主细胞膜黏附，促使病毒吸附于细胞表面，融合蛋白(F)介导病毒包膜与宿主细胞膜融合，使病毒进入细胞，在病毒融合和进入期间，F蛋白从亚稳定的融合前构象(pre-F)转变为稳定的融合后构象(post-F)。F蛋白序列在不同亚型间较为保守，是RSV疫苗开发的重要抗原靶点。RSV F蛋白属于Ⅰ型融合蛋白，主要包括以下几个功能区：信号肽(1～26aa)位于F蛋白N端，负责将F蛋白引导至细胞膜表面；两个弗林蛋白酶切位点，主要由碱性氨基酸组成的蛋白酶识别位点分别为酶切位点1(KKRKRR，FCS1)和酶切位点2(RARR，FCS2)；融合肽FP(137～146aa)由19个氨基酸组成，F蛋白的三聚体激活时，融合肽负责插入到相邻的细胞的细胞膜；七肽重复区HRA(146～216aa)和HRB(460～514aa)，在膜融合过程中，HRA和HRB形成稳定的6HB结构；跨膜区(514～574aa)，F蛋白嵌入膜内的区域；CT区，F蛋白位于细胞质内的区域，其可与病毒的M蛋白相互作用，与病毒的包装和出芽有关。
F蛋白首先合成蛋白前体F0，在细胞融合过程中，经弗林蛋白酶酶切后释放一个由27个氨基酸组成的多肽pep27(109～127aa)，形成以二硫键相连接的F1片段和F2片段，从不稳定的融合前构象转变为稳定的融合后构象。比较融合前后RSV F蛋白结构表明，大多数二级和三级结构在融合前和融合后状态下都得到保留，相比之下，F1亚基N端和C端的区域显示出明显的构象变化。位于F1亚基N端的融合肽和五个二级结构元件(α2、α3、α4螺旋和β3、β4折叠)重新排列并与α5螺旋融合，形成的单延伸融合后螺旋(α5post)。在F1亚基C末端，唯一的平行链(β22)散开，使融合前α10螺旋向α5post螺旋移动，以促进膜融合。
近年来，随着F蛋白的构象转变过程逐渐被揭示，融合前构象的F蛋白具有90％以上中和活性的Φ表位被发现，同时用于稳定preF结构的突变位点改造也得到证实，稳定的preF蛋白突变体作为疫苗抗原可以激活更高效的中和抗体。因此，开发稳定的融合前构象F蛋白抗原成为RSV疫苗研发的新目标。以结构生物学为基础开发的稳定融合前构象F蛋白疫苗也已进入临床阶段。杨森制药公司(Janssen)的“SC-TM”结构通过三个点突变(N67I、S215P、E487Q)并将pep27区域替换为连接肽的方式获得了中和活性较高的融合前构象(DOI:10.1038/ncomms9143)。美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)的团队开发的第一个融合前构象F蛋白“DS-Cav1”，通过在F1片段内S155C和S290C点突变获得分子内二硫键，同时加入S190F和V207L点突变以增强关键中和表位的结合活性(DOI:10.1126/science.1243283)。在辉瑞公司公开专利(CN201680075615.8)实施例中提到的一种突变体“pXCS852”在保留pep27的基础上通过加入S55C和L188C分子内二硫键，以及T54H和D486S点突变用于增强融合前构象的稳定性和表位活性。
理想的融合前构象F蛋白突变体设计应具备以下几点特性：(1)维持融合前F蛋白三聚体的构象以获得正确的中和表位；(2)高表达量的三聚体蛋白以诱导产生足够的免疫反应并满足产业化制造需求，即F蛋白应具有高效的表达能力和自组装能力；(3)具有高稳定化的三聚体构象以持续保持融合前构象，保持原始或较高的免疫活性，满足生产制剂等需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，期望该突变蛋白能够具有稳定的融合前构象和高表达量，并可形成稳定的三聚体，从而可用于呼吸道合胞病毒感染的预防、诊断和治疗。
为解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白存在以下突变：
(a)F1亚基和/或F2亚基中至少一个氨基酸残基被半胱氨酸取代，并且该取代使得呼吸道合胞病毒融合前F蛋白F1亚基与F2亚基间存在非天然二硫键连接，所述非天然二硫键包括F1亚基与F2亚基之间形成的除Cys69–Cys212和Cys37–Cys439之外的二硫键；
(b)野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽部分或全部取代，所述连接肽的氨基酸残基长度至少2个；
所述野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.01所示。
需要说明的是，所述“部分或全部取代”是指野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基可以被全部取代或者其中某些片段被部分取代，举例但不限于“第104～110位”、“第104～120位”、“第104～130位”、“第104～137位”、“第110～130位”或“第120～144位”。
在可选的实施方式中，所述半胱氨酸取代包括S55C、T189C、P101C或V152C中至少一种。
在可选的实施方式中，所述半胱氨酸取代包括S55C和T189C，和/或，P101C和V152C。
在可选的实施方式中，野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～137位氨基酸残基被连接肽全部取代。
在可选的实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列为GSGSGGSGSGRS。
在可选的实施方式中，野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽全部取代，所述连接肽的氨基酸序列为GSGSGRS或GS。
第二方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包括以下(a)～(d)中任一项：
(a)编码权利要求1～6任一项所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的核酸分子。
(b)含有(a)所述核酸分子的重组载体，优选地，所述重组载体的原始质粒为pEE12.4。
(c)含有(a)所述核酸分子或(b)所述重组载体的转化细胞，优选地，所述转化细胞的宿主细胞选自哺乳动物细胞、细菌、酵母、真菌或昆虫细胞。
进一步优选地，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、肿瘤细胞、BHK细胞或HEK293细胞。
(d)含有(a)所述核酸分子或(b)所述重组载体的重组病毒，优选地，所述重组病毒包括腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或逆转录病毒载体。
第三方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的制备方法，所述制备方法包括培养前述实施方式所述转化细胞或重组病毒，并诱导表达获得突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白或生物材料在以下(a)～(c)中任一项的应用：
(a)制备呼吸道合胞病毒特异性抗体中的应用；
(b)制备用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物，优选地，所述药物包括重组蛋白疫苗、载体类疫苗或核酸疫苗；
(c)制备呼吸道合胞病毒诊断试剂。
第五方面，本发明提供预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物，包含前述实施方式任一项所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，或前述实施方式所述的呼吸道合胞病毒特异性抗体。
第六方面，本发明提供呼吸道合胞病毒诊断试剂，包含前述实施方式任一项所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，或前述实施方式所述的呼吸道合胞病毒特异性抗体。
优选地，本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白包括半胱氨酸取代突变S55C和T189C以及第104～137位氨基酸残基替换为GSGSGGSGSGRS的突变体，具备成为预防和/或治疗用呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
优选地，本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白包括半胱氨酸取代突变P101C和V152C，具备成为预防和/或治疗用呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
优选地，本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白包括半胱氨酸取代突变P101C和V152C以及第104～137位氨基酸残基替换为GSGSGGSGSGRS的突变体，具备成为预防和/或治疗用呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
优选地，本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白包括半胱氨酸取代突变S55C、T189C、P101C和V152C的突变体，具备成为预防和/或治疗用呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
优选地，本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白包括半胱氨酸取代突变S55C、T189C、P101C和V152C以及第104～137位氨基酸残基替换为GSGSGGSGSGRS的突变体，具备成为预防和/或治疗用呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
本发明中所述突变氨基酸残基位置以野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.01所示，该序列与GenBank登录号：P03420的氨基酸序列相比，存在P102A、I379V和M447V三处天然取代。另外，也可应用其他野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列作为模板，包括但不限于直接使用GenBank登录号：P03420的氨基酸序列，或者在P03420基础上含有1或2处天然取代等。
本发明中所述多种单克隆抗体均通过基因工程技术获得，根据已知抗体序列进行重组表达经亲和层析后获得高纯度抗体作为检测用抗体使用。F蛋白表面存在大量的中和与非中和抗原表位，与中和活性有关的抗原表位有4种(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Φ)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ共同存在于F蛋白融合前和融合后构象。本发明中使用了多种结合表位明确的单克隆抗体，概括表述为：D25(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.02和SEQ ID No.03所示，特异性识别融合前构象表位Φ)、AM14(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.04和SEQ ID No.05所示，特异性识别融合前三聚体构象，跨单体结合Ⅳ和Ⅴ表位)、MPE8(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.06和SEQ ID No.07所示，识别Ⅱ-Ⅴ表位，部分跨单体结合)、101F(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.08和SEQ ID No.09所示，识别Ⅳ表位)、Palivizumab(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，识别Ⅱ表位)、Motavizumab(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示，识别Ⅱ表位)和Nirsevimab(轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示，特异性识别融合前构象表位Φ)。
本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白可应用基因工程技术通过重组表达获得，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、肿瘤细胞系、BHK细胞、HEK293细胞系等哺乳动物细胞或细菌、酵母、真菌、昆虫细胞等，或转基因动物，或转基因植物。亦或者通过病毒载体形式将本发明所述突变蛋白递送至目标宿主细胞中，例如使用腺病毒(人的和黑猩猩的)、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒载体等。亦或者通过裸露或包封后的核酸载体形式将本发明所述突变蛋白递送至目标宿主细胞中，例如使用线性RNA、环状RNA、dsDNA、cDNA等。亦或者本专业领域常用或已知的形式获得突变蛋白。
本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变形式还可在本发明所述突变形式的基础上添加其他突变以稳定或提高融合前构象活性或表达量，例如加入脯氨酸点突变以获得二级/三级结构的刚性固定，加入带有侧链基团的氨基酸点突变以获得空腔填充效应，加入疏水氨基酸点突变以获得疏水效应，加入带电氨基酸点突变以获得静电加强或减弱效果，加入分子间二硫键以获得单体F蛋白分子间的共价连接，在F蛋白C端加入异源标签以提高F蛋白三聚体的稳定性和表达量，在F蛋白两端加入柔性氨基酸链以形成Loop串联结构，在F蛋白C端加入具有α螺旋结构的氨基酸链以提高F蛋白三聚体的稳定性，加入具有改变结构功能的氨基酸链等，亦或者本专业领域常用或已知的突变方式或手段。
本发明中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相比于同类品具有优异的中和抗体结合活性和热稳定性，适宜于开发成为呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中使用的pEE12.4表达载体质粒图谱；
图2为各突变抗原与六种不同单克隆抗体的结合情况(间接法ELISA)；
图3为三种连接肽与五种单克隆抗体的结合情况(间接法ELISA)；
图4为纯化后抗原的还原性SDS-PAGE(左图)和Western Blot(右图)；
图5为纯化后抗原HPLC检测图谱；
图6为双因素突变抗原与AM14单抗的结合情况(间接法ELISA)；
图7为YD22-1和SC-TM的浊点分析图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：构象稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的二硫键突变设计和活性筛选
(1)通过观察呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的空间结构，根据结构生物学原理设计可稳定融合前构象的氨基酸突变。以野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列SEQID No.01或其他野生型病毒株F蛋白氨基酸序列为模板，通过加入分子内二硫键突变以增强融合前F1亚基和F2亚基之间或F1内部的结构稳定性以阻止七肽重复区HRA和HRB区域的构象转变，同时维持或增强Φ表位等重要位点的结合活性，提高突变抗原的融合前F蛋白特异性免疫原性。另外，为实现F蛋白的可溶性表达，在质粒构建时将F蛋白C端的跨膜区域514～574aa替换为“SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID No.47)”，该片段为可溶性T4Fibritin三聚化结构域，以维持F蛋白的三聚体结构。按照上述目标设计二硫键突变如表1所示，详细序列见SEQ ID No.16～No.29。
表1.二硫键突变抗原设计
(2)通过基因工程技术，将表1所述的突变抗原核苷酸序列插入至pEE 12.4表达载体(质粒图谱见图1，SEQ ID No.30)序列中后进行全质粒合成。将突变质粒使用TransIT-X2TM DynamicDelivery System(Mirus,MIR6003)或LipofectamineTM 3000(Invitrogen,L3000001)转染试剂盒将质粒转染至六孔板中培养的HEK 293T细胞，持续培养72h后收集上清培养液进行Western Blot蛋白免疫印迹确认目的蛋白表达情况，一抗Motavizumab，二抗Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 FcAntibody(BioLegend,410603)。将确认表达正常的突变质粒使用ExpiCHOTM表达系统试剂盒(Gibco,A29133)或其他方法瞬转至200mL体积的ExpiCHO-STM(Gibco,A29127)悬浮细胞培养液中，持续培养2～3天后离心收集上清培养液。通过离子交换层析和/或陶瓷羟基磷灰石层析和/或凝胶分子筛层析对目的蛋白进行纯化，最终检测并统计各突变质粒的表达情况如表2所示，使用DS-Cav1(SEQID No.31)、SC-TM(SEQ ID No.32)和pXCS852(SEQ ID No.33)作为阳性对照。其中YD03、YD06、YD07、YD12、YD13、YD16、YD22突变抗原表达正常。
表2.突变抗原的表达情况
| 序号 | 质粒名称 | 目的抗原表达量mg/L |
| 1 | YD03 | 7.37 |
| 2 | YD06 | 9.45 |
| 3 | YD07 | 8.32 |
| 4 | YD10 | 弱表达 |
| 5 | YD11 | 无三聚体 |
| 6 | YD12 | 13.79 |
| 7 | YD13 | 13.92 |
| 8 | YD14 | 弱表达 |
| 9 | YD15 | 弱表达 |
| 10 | YD16 | 16.46 |
| 11 | YD17 | 弱表达 |
| 12 | YD19 | 弱表达 |
| 13 | YD22 | 11.97 |
| 14 | YD23 | 弱表达 |
| 15 | DS-Cav1 | 10.84 |
| 16 | SC-TM | 20.0 |
| 17 | pXCS852 | 13.25 |
(3)进一步对纯化后的突变抗原进行表位活性检测，使用六种针对不同表位的单克隆抗体D25、AM14、MPE8、Palivizumab、Motavizumab和Nirsevimab作为一抗检测与各突变抗原的结合情况。操作方法简单表述为，将纯化后的突变抗原稀释至1.1μg/孔或3.3μg/孔，3倍梯度稀释7个浓度点，使用包被缓冲液包被抗原至96孔板中，2h后加入封闭液过夜，依次加入一抗和二抗Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 Fc Antibody孵育后TMB显色(Solarbio,PR1210)，酶标仪检测450nm处吸收，统计并分析数据(如图2所示)，使用DS-Cav1和SC-TM作为阳性对照。相比较下，YD12和YD22与D25有较强结合，YD16与D25有结合，YD03、YD06、YD07和YD13与D25结合较弱；YD12和YD22与AM14有较强结合，其余抗原结合较弱；YD12、YD22与MPE8有较强结合，YD03和YD16与MPE8有结合，YD06、YD07和YD13与MPE8结合较弱；YD12与Palivizumab结合最强，YD07与Palivizumab结合最弱，其余抗原都有结合；各抗原与Motavizumab都有结合；YD12和YD22与Nirsevimab有较强结合、YD16与Nirsevimab有结合，YD03、YD06、YD07和YD13与Nirsevimab结合较弱，因Nirsevimab与D25同属Φ表位，因此结合趋势一致。综上分析，ELISA结果显示YD12和YD22与各单抗有着较佳的结合活性，其中AM14结合活性要显著优于阳性对照组的DS-Cav1和SC-TM，表现出优异的四级结构稳定性。
(4)使用非标记生物分子分析仪GatorPrime Plus(Gator Bio)检测各突变抗原与七种不同单克隆抗体D25、AM14、MPE8、101F、Palivizumab、Motavizumab和Nirsevimab的结合力，操作方法简单表述为：使用HFC(Anti-Human IgG Fc,Gator Bio)光学探针固化七种不同的单克隆抗体后与不同的突变抗原蛋白进行结合至饱和状态，转移探针至解离缓冲液后监测位移信号(nm)，通过设备数据处理软件计算各突变抗原的解离常数值(Koff)如表3所示。使用DS-Cav1、SC-TM和pXCS852作为阳性对照。由此可见，YD03、YD12和YD22与七种单克隆抗体有着非常优秀的结合能力，体现出突变的二硫键可稳定融合前F蛋白构象并保持原始表位活性。另外，相比于DS-Cav1和SC-TM，pXCS852的各表位活性相对较弱，且与D25和AM14结合活性弱于YD12和YD22。
表3.突变抗原与七种不同单抗的亲和力检测
| 质粒名称 | D25* | AM14 | MPE8 | 101F | Motavizu | Palivizu | Nirsevi |
| YD03 | 21.2 | 61.5 | 71.5 | ND*** | 54 | 16.2 | ND |
| YD06 | NB** | NB | NB | 33.3 | 69.6 | 24.6 | NB |
| YD07 | NB | NB | NB | 74.4 | 144 | 25.6 | NB |
| YD12 | ND | 13.2 | 7.66 | 29.3 | 11.8 | 6.65 | ND |
| YD13 | NB | NB | NB | 58.2 | 11.5 | ND | NB |
| YD16 | 4.87 | NB | NB | 29.9 | 13 | ND | 26.5 |
| YD22 | ND | 18.2 | 23.5 | 32.6 | 15.2 | 7.09 | ND |
| DS-Cav1 | 1.65 | 13.6 | 14.9 | 23.6 | 17.5 | 27.8 | ND |
| SC-TM | ND | 11.6 | 0.955 | 25.9 | 8.72 | 6.18 | ND |
| pXCS852 | 13.6 | 25.7 | 87.8 | 26.5 | 21.7 | 27.5 | ND |
*表格内数值为解离常数(Koff)×105,单位为1/s；**NB代表没有检测到结合信号；***ND代表没有检测到解离信号
实施例2：呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的连接肽设计和活性筛选
(1)天然的野生型F蛋白首先是形成F0前体蛋白再经弗林蛋白酶切后释放出一个由27个氨基酸组成的多肽pep27，形成以两对二硫键相连接的F1和F2片段，三个F0单体经酶切处理后自组装形成一个处于亚稳定状态的融合前三聚体构象，此过程有序且复杂，细胞代谢状态和F0前体蛋白表达量等因素都会直接影响最终融合前F蛋白三聚体的产量和构象。本发明将pep27替换为更短的连接肽，同时敲除FCS1和FCS2两个酶切位点，从而增加F0前体表达量及融合前F三聚体的产量，更为重要的是，连接肽的替换可锁定F1片段N端的FP融合区域与F2片段的连接，达到进一步稳定融合前构象的目的。同时，连接肽序列的选择会影响到该区域附近的带电和疏水情况，从而影响融合前F蛋白的表位活性。本发明根据结构生物学原理，应用生物信息学分析和蛋白质结构预测等方法设计了三种替换连接肽，分别命名为GS12、GRS12和Q4，具体序列如表4所示。所有突变的连接肽以野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.01为模板进行改造，插入至质粒pEE12.4(SEQ IDNo.30)后进行全质粒合成。另外，为实现F蛋白的可溶性表达，在质粒构建时将F蛋白C端的跨膜区域514～574aa替换为“SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL”，该片段为可溶性T4Fibritin三聚化结构域，以维持F蛋白的三聚体结构。
表4.连接肽的氨基酸序列和质粒信息
(2)将合成后的质粒使用ExpiCHOTM表达系统试剂盒或其他方法瞬转至200mL体积的ExpiCHO-STM悬浮细胞培养液中，持续培养2～3天后离心收集上清培养液。将纯化后抗原稀释至特定蛋白浓度，使用包被缓冲液包被抗原至96孔板中，2h后加入封闭液过夜，依次加入一抗和二抗Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 Fc Antibody孵育后TMB显色，酶标仪检测450nm处吸收，数据处理后如图3所示，使用SC-TM作为阳性对照。由结果可观察到在三种不同的替换连接肽中，与GS12和Q4相比，GRS12连接肽突变抗原与五种不同的单克隆抗体(D25、AM14、MPE8、101F和Motavizumab)有着更好的结合活性。同时，在表达水平上GRS12突变抗原与SC-TM无显著性差异。由此可见，GRS12连接肽具备提高表达量且保持融合前构象的潜在能力。
实施例3：构象稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的双因素突变设计和活性筛选
(1)在分子内二硫键突变筛选和连接肽筛选的基础之上，本发明将两种不同策略筛选得到的优选结果进行了结合筛选，即双因素突变筛选。根据融合前F蛋白的特性，本发明以期获得一种具有融合前构象、高表达能力、高表位结合活性并且稳定的突变抗原，从而开发成为一种具有预防或治疗RSV感染能力的重组蛋白。分子内二硫键突变选择S55C-T189C(YD03)、P101C-V152C(YD12)和两对二硫键同时突变(YD22)，将GRS12连接肽突变加入至上述三种二硫键突变形成YD03-1(SEQ ID No.42)、YD12-1(SEQ ID No.43)和YD22-1(SEQID No.44)。同时，为进一步考察连接肽长度对融合前构象的影响，以YD12为模板加入GSGSGRS和GS两种长度的连接肽突变，形成YD12-2(SEQ ID No.45)和YD12-3(SEQ IDNo.46)，所有突变质粒信息如表5所示。
表5.双因素突变筛选的抗原信息
(2)与实施例2中所述方法相同，将合成后的质粒使用ExpiCHOTM表达系统试剂盒或其他方法瞬转至200mL体积的ExpiCHO-STM悬浮细胞培养液中，持续培养2-3天后离心收集上清培养液。将纯化后的抗原蛋白进行还原性SDS-PAGE电泳(SurePAGETM，Genscript)检测抗原单体分子量和纯度，Western Blot蛋白免疫印迹检测抗原(一抗：Motavizumab，二抗：Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 Fc Antibody)，ECL化学发光超敏显色(碧云天，P0018AM)，同时使用DS-Cav1和SC-TM作为阳性对照，结果如图4所示。所表达的8种突变抗原单体分子量大小与理论相符，仔细比对SDS-PAGE和Western Blot条带确认蛋白电泳部分杂带属于抗原相关条带，各突变抗原纯度满足后续实验要求。
(3)使用PierceTM BCA蛋白定量试剂盒(Thermo，23225)检测各纯化后蛋白浓度后计算抗原表达量，结果如表6所示。可以观察到连接肽突变的加入显著增加了二硫键突变抗原的表达量，其中YD03-1相比YD03表达量增加了2.64倍，YD12-1相比YD12表达量增加了6.37倍，YD22-1相比YD22表达量增加了8倍，YD12-1、YD12-2和YD12-3相比DS-Cav1表达量分别高出18.06倍、14.28倍和17.04倍，YD12-1、YD12-2和YD12-3相比SC-TM表达量分别高出2.49倍、1.97倍和2.35倍，具备显著的高表达量特性。
表6.双因素突变抗原的表达情况
| 序号 | 质粒名称 | 目的抗原表达量mg/L |
| 1 | YD03 | 5.3 |
| 2 | YD03-1 | 14.0 |
| 3 | YD12 | 19.0 |
| 4 | YD12-1 | 121.0 |
| 5 | YD12-2 | 95.7 |
| 6 | YD12-3 | 114.2 |
| 7 | YD22 | 5.0 |
| 8 | YD22-1 | 40.0 |
| 9 | DS-Cav1 | 6.7 |
| 10 | SC-TM | 48.6 |
(4)应用分子排阻色谱法检测纯化后抗原的纯度和分子量，检测设备为安捷伦1260高效液相色谱仪，色谱柱使用安捷伦Advance Bio SEC 300A(7.8×300mm)，流动相选择甲酸铵缓冲体系，流速控制0.5～1.0mL/min，DAD检测器监测OD280信号，结果如图5所示。根据分子排阻色谱原理可以分析得到各突变抗原的分子大小从大到小依次为YD03-1、YD03、YD12-2、YD12-3、YD22、YD12、DS-Cav1、YD12-1、YD22-1、SC-TM。各纯化后抗原色谱检测均为单一蛋白峰，满足纯度要求。
(5)与实施例1中所述方法相似，使用非标记生物分子分析仪GatorPrime Plus(Gator Bio)检测各突变抗原与七种不同单克隆抗体D25、AM14、MPE8、101F、Palivizumab、Motavizumab和Nirsevimab的结合力，操作方法简单表述为：首先使用生物素标记待测突变抗原，使用SA(Streptavidin,Gator Bio)光学探针固化突变抗原后与不同的单克隆抗体进行分子间亲和力检测，通过设备数据处理软件计算各突变抗原的亲和常数，结果如表7所示，使用DS-Cav1和SC-TM作为阳性对照。其中，对比YD03和YD03-1、YD12和YD12-1、YD22和YD22-1，可以观察到GRS12连接肽突变的加入增强了上述抗原与D25、AM14和MPE8的亲和力。对比YD12-1、YD12-2和YD12-3与D25、AM14和MPE8的亲和力可以观察到连接肽的长度会影响亲和力强弱。特别值得注意的是，对比YD22-1和YD22的D25(识别Φ位点，关键中和表位)、AM14(特异性识别三聚体四级结构)和MPE8(识别四级结构)亲和力分别增强了至少1000倍、20倍和1000倍，证明GRS12连接肽突变具备显著增强融合前构象的能力，且同时还增加了8倍表达量。YD22-1与SC-TM对比各单克隆抗体的亲和力均处于同一水平且显著优于DS-Cav1，YD22-1具有预防或治疗RSV感染的潜在能力。
表7.双因素突变抗原与七种不同单抗的亲和力检测
*表格内数值为亲和常数(KD),单位为nM；**NB代表没有检测到结合信号
(6)进一步考察双因素突变抗原对融合前构象的增强效果，将纯化后抗原稀释至特定蛋白浓度，使用包被缓冲液包被抗原至96孔板中，2h后加入封闭液过夜，依次加入一抗AM14和二抗Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 Fc Antibody孵育后TMB显色，酶标仪检测450nm处吸收，数据处理后如图6所示，使用DS-Cav1和SC-TM作为阳性对照。与亲和力检测结果趋势一致，YD22-1表现出优异的融合前三聚体构象的结合能力，显著优于SC-TM和其他抗原，同时相比YD22有着极其显著的提升，证明GRS12连接肽具备增强融合前构象的效果。
实施例4：构象稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的热稳定性评价
(1)使用差式扫描荧光法(DSF)检测各双因素突变抗原的熔点温度以考察热稳定性差异。操作方法简单表述为：将SYPROTM Orange(Thermo，S6650)荧光染料按照1:400加入至待测样品中，使用CFX96 Touch荧光定量PCR仪(Bio-Rad)监测荧光信号的变化情况，参数设置为FRET通道，+0.5℃/30s，25℃～90℃，通过设备数据处理软件计算各突变抗原的第一熔解温度Tm1如表8所示。根据差式扫描荧光法原理可知，Tm1值代表了融合前三聚体构象的热稳定性，Tm1值越大三聚体构象越稳定。由此可见，相比于SC-TM(Tm1＝60.5℃)，本发明中突变抗原的热稳定性皆有所增强，其中YD22-1(Tm1＝69.5℃)热稳定性最佳。对比YD03-1和YD03、YD12-1和YD12的Tm1值可以观察到GRS12连接肽突变的加入增强或维持了突变抗原的热稳定性。
表8.突变抗原的熔解温度(Tm1)
| 突变抗原 | YD03 | YD03-1 | YD12 | YD12-1 | YD22-1 | SC-TM |
| Tm1 | 66.0℃ | 68.5℃ | 68.0℃ | 68.0℃ | 69.5℃ | 60.5℃ |
(2)通过对蛋白样品逐步升温同时监测光散射信号的方法测定突变抗原YD22-1和对照抗原SC-TM的浊点(浊点是指样品在加热条件下开始变浑浊时的温度)，调整待测样品浓度为500μg/mL，样品体积500μL，样品每升高5℃测定一次，使用SpectraMax M3多功能酶标仪(Molecular Devices)检测OD350 nm处信号，结果如图7所示。测定的YD22-1浊点在85.0℃左右，而SC-TM的浊点在75.0℃左右，YD22-1相比于SC-TM的浊点高出近10.0℃，YD22-1表现出优异的热稳定性。
(3)为进一步考察在热胁迫条件下突变抗原YD22-1的融合前构象稳定性，将YD22-1和对照抗原SC-TM调整蛋白浓度至500μg/mL，样品体积100μL，取50μL放置于ProFlexTM PCR仪(Applied Biosystems)中60℃热处理1小时(热处理后)，剩余50μL样品置于2～8℃暂存(热处理前)。将热处理前后样品稀释至特定蛋白浓度后，使用包被缓冲液包被抗原至96孔板中，2h后加入封闭液过夜，依次加入一抗(AM14或D25)和二抗Direct-BlotTM HRP anti-human IgG1 Fc Antibody孵育后TMB显色，酶标仪检测OD450nm处吸收，热处理前后数值的比值为抗原与单抗的相对结合活性变化，结果如表9所示。由此可见，YD22-1在60℃热处理1小时后仍能保持绝大部分的特异性三聚体抗体结合活性(AM14相对活性0.83)，显著优于阳性对照SC-TM(AM14相对活性0.65)，说明YD22-1融合前三聚体构象更加稳定。同时，热处理前后YD22-1和SC-TM的融合前构象表位Φ结合活性(D25)均保持不变。
表9.热处理后(60℃，1小时)突变抗原与单克隆抗体的相对活性变化
| 突变抗原 | AM14相对活性 | D25相对活性 |
| YD22-1 | 0.83(0.494/0.598)* | 0.98(1.479/1.506) |
| SC-TM | 0.65(0.646/0.993) | 0.97(1.424/1.463) |
*表格内数值格式为：热处理前后相对活性(热处理后OD450数值/热处理前OD450数值)
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (12)
1.突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，选自YD03-1、YD12-1、YD12-2、YD12-3和YD22-1；
YD03-1的氨基酸序列如SEQ ID No.42所示；
YD12-1的氨基酸序列如SEQ ID No.43所示；
YD12-2的氨基酸序列如SEQ ID No.45所示；
YD12-3的氨基酸序列如SEQ ID No.46所示；
YD22-1的氨基酸序列如SEQ ID No.44所示。
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括以下（a）~（d）中任一项：
（a）编码权利要求1所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的核酸分子；
（b）含有（a）所述核酸分子的重组载体；
（c）含有（a）所述核酸分子或（b）所述重组载体的转化细胞；
（d）含有（a）所述核酸分子或（b）所述重组载体的重组病毒。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体的原始质粒为pEE12.4。
4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述转化细胞的宿主细胞选自哺乳动物细胞、细菌、真菌或昆虫细胞。
5.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述转化细胞的宿主细胞选自酵母。
6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞、肿瘤细胞、BHK细胞或HEK293细胞。
7.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组病毒包括腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒或逆转录病毒载体。
8.权利要求1所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求2中所述的转化细胞或重组病毒，并诱导表达获得突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白。
9.权利要求1所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白或权利要求2~7任一项所述生物材料在以下（a）~（c）中任一项的应用：
（a）制备呼吸道合胞病毒特异性抗体中的应用；
（b）制备用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物；
（c）制备呼吸道合胞病毒诊断试剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括重组蛋白疫苗、载体类疫苗或核酸疫苗。
11.预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物，其特征在于，包含权利要求1所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白。
12.呼吸道合胞病毒诊断试剂，其特征在于，包含权利要求1所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白。
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