CN109081868A

CN109081868A - 靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN109081868A
Application number: CN201710446935.6A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 屈攀科
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2037-06-14
Also published as: CN109081868B

Abstract

本发明提供了靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用，具体地本发明用重组表达寨卡病毒E蛋白免疫小鼠，获得针对E蛋白的鼠源单克隆抗体。研究结果显示，本发明的抗体不仅是一种理想的寨卡病毒检测抗体，而且可用于开发针对寨卡病毒的抗体药物。保守中和表位的鉴定也对广谱寨卡病毒疫苗的开发具有指导作用。

Description

靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用。

背景技术

寨卡病毒在生物学分类上属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属 (Flavivirus)，该病毒为单正链RNA病毒。寨卡病毒于1947年首次在乌干达寨卡森林猕猴中分离，并主要通过伊蚊叮咬传播，可通过胎盘垂直传播给胎儿。寨卡病毒感染危害最大的是孕妇及胎儿，目前被怀疑是胎儿及新生儿小头畸形的罪魁祸首，已在小头症胎儿羊水和脑组织中分离出寨卡病毒。另外，最近研究发现，寨卡病毒可以破坏成年雄性小鼠的睾丸，以及在寨卡病毒感染人类泌尿生殖症状已报道包括血精、排尿困难、会阴疼痛等，推测寨卡病毒可能同样也会影响成年男性。近十年来，寨卡病毒感染在太平洋岛国和南美洲数次爆发，疫情日见严重，世界卫生组织已将其列为全球紧急公共卫生事件。目前却没有针对寨卡病毒的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有以下的一个或多个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.1所示的CDR1，

SEQ ID NO.2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述抗体的重链的氨基选序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.5所示的CDR1’，

SEQ ID NO.6所示的CDR2’，和

SEQ ID NO.7所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。

在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。

本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗寨卡病毒包膜蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；

(ii)多肽、蛋白药物序列；以及

(iii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述多肽蛋白药物为单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。

在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6×His标签、GGGS序列、FLAG 标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。

本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.13、14、15、16、17、 18、11、或9所示的序列。

本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。

本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、 MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、脂质体、纳米磁粒、或任何形式的纳米颗粒等。

本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.单克隆抗体对寨卡病毒的中和能力。2倍稀释的单克隆抗体和100PFU 的病毒37度孵育1h，加到细胞上，用空斑减少实验分析抗体的中和能力，数据代表两次独立实验，无关抗体D5作为一个阴性对照。

图2.粘附前和粘附后中和实验。为了研究5F8的作用机制，在病毒粘附细胞前及粘附后分别用单抗进行处理，分析其抑制病毒感染的效果。

图3.单克隆抗体亲和力的测定.用生物膜干涉法测定单抗5F8与ZIKV E80 的亲和力，先将生物素标记的ZIKV E80固定到生物素传感器上，再与不同浓度的5F8抗体反应，测定两者的亲和力。

图4.使用单抗5F8进行寨卡病毒的Western blot检测。(A)灭活的寨卡病毒和S2系统表达的ZKE80蛋白经过12％SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，用5F8作为一抗去检测。(B)以ZKE80作为标准品，通过比较阳性条带的灰度进行寨卡病毒定量。

图5.使用单抗5F8进行寨卡病毒的ELISA检测。用灭活的寨卡病毒包被 ELISA板，20ng/孔，用单抗5F8作为一抗检测。实验中用灭活CVA10病毒作为阴性对照，Vero细胞裂解物作为空白对照。

图6.单抗5F8在免疫荧光法检测病毒中的应用.感染寨卡病毒的Vero细胞 (A-C)用D5(作为阴性对照)孵育，未感染寨卡病毒的Vero细胞(D-F)、感染寨卡病毒的Vero细胞(G-I)用5F8孵育，随后用FITC标记的抗鼠IgG 的二抗孵育。图(A、D、G)用FITC滤光片成像，图(B、E、H)用DAPI滤光片成像，图(C、F、I)是Merge(合并)的图像。

图7.单抗5F8在流式细胞分析中检测寨卡病毒。寨卡病毒感染细胞分别用所标注单抗(1ug/ml)进行染色，接着用流式细胞仪检测。D5单抗为无关抗体，作为同型抗体阴性对照。4G2单抗为抗寨卡病毒阳性对照抗体。

图8.单克隆抗体的表位鉴定。(A)多肽库ELISA。合成79个覆盖ZIKV E80 蛋白的多肽用于鉴定几个寨卡病毒单抗的表位，用多肽包板，5F8作为一抗去检测多肽的反应；(B)序列比对。比较寨卡病毒以及其它黄病毒相应的150loop 序列；(C)两端截短多肽的序列及其结合5F8能力。合成两端同时截短的13aa、 11aa、9aa、7aa多肽，用间接ELISA去测定5F8对这些肽的反应。含15aa的 P31#多肽为阳性对照，HCV来源的多肽为阴性对照。(D)点突变分析。为了确定5F8识别表位上哪些氨基酸对单抗的结合至关重要，合成一系列单突变的多肽并用间接ELISA去测定5F8对这些肽的反应。

图9.单抗5F8的重组表达及验证。用间接ELISA法检测重组表达5F8的细胞上清及转染空载pcDNA3.1(+)的细胞上清(作为阴性对照)。ELISA板用ZIKV E80蛋白进行包被，200ng/孔；用不同稀释度的重组表达细胞上清作为一抗，用HRP偶联的羊抗鼠IgG作为二抗(稀释度1:10000)进行检测。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，利用重组表达寨卡病毒E蛋白免疫小鼠，进一步获得3个针对E蛋白的鼠源单克隆抗体。其中，单抗1C11、4C5只有结合活性、却不能抑制寨卡病毒的感染。而单抗5F8能够中和寨卡病毒，并且能够有效检测寨卡病毒，其识别表位为EDI区的150loop。序列比对显示，不同寨卡病毒株的150loop非常保守，而与其它黄病毒的相应位点差异很大。本发明人的研究结果显示，单抗5F8不仅是一种理想的寨卡病毒检测抗体，而且可用于开发针对寨卡病毒的抗体药物。保守中和表位的鉴定也对广谱寨卡病毒疫苗的开发具有指导作用。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

寨卡病毒包膜蛋白

寨卡病毒的包膜蛋白(E蛋白)是中和抗体的主要靶标。E蛋白分为三个区域： EDI、EDII和EDIII,其中EDIII在受体的结合及病毒与细胞膜融合中起着关键性的作用。大多数特异性抗体主要识别EDIII上的表位；而识别EDI、EDII区表位的抗体很少，目前报道的有针对黄病毒Fusion loop的单抗(能交叉中和寨卡病毒)和几个识别E蛋白二聚体表位的构象性抗体(能部分结合150loop)。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述寨卡病毒的包膜蛋白的氨基酸序列如下所示：

IRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQM AVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGAKRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKSLFGGMSWFSQILIGTLLMWLGLNAKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA(SEQ ID NO.19)；

其中，根据本发明的单克隆抗体5F8的结合表位位于其第153-163位中。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种衍生自寨卡病毒包膜蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列包括：

VNDTGHETDEN(SEQ ID NO.20)；

优选地，所述抗原表位肽的氨基酸序列为VNDTGHETDEN(SEQ ID NO.20)或MIVNDTGHETDENRA(SEQ ID NO.21)。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含上述的抗原表位肽，以及任选地佐剂。优选地，所述佐剂包括：铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、或单磷酰脂A。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了针对本发明抗原表位肽的抗体。优选地，所述针对本发明抗原表位肽的抗体可与本发明的5F8抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的寨卡病毒包膜蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体(5F8)的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3，其中

CDR1：GYIFTDYA，SEQ ID NO.1；

CDR2：ISTKSGAA，SEQ ID NO.2；

CDR3：ARNDYLAWLPY，SEQ ID NO.3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列：

QVQLQQSGAELVRPGVSAKISCKASGYIFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLISTKSGAANYNQKFTDKATLTVDKSSSTAYLELARLTSEDSAIYYCARNDYLAWLPYWGQGTLVTVSAA，SEQ ID NO.4。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链可变区包括三个互补决定区CDR1’、CDR2’、和CDR3’，其中

CDR1’：QSIVHSNGNTY，SEQ ID NO.5；

CDR2’：KVS，SEQ ID NO.6；

CDR3’：FQGSHVPWT，SEQ ID NO.7。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列：

DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK，SEQ ID NO.8。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合寨卡病毒包膜蛋白的多肽，例如具有上述重链可变区和/或轻链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR 形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链和/或轻链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(i ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有寨卡病毒包膜蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在 C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表I

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll， 42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:32-37之一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His) 融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞； CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、 PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素 (Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card 等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53， 345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang 等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128， 2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)； 6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质 (BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合寨卡病毒包膜蛋白分子，因而可用于预防和治疗寨卡病毒感染。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地 0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的免疫球蛋白

在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，寨卡病毒包膜蛋白的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的寨卡病毒包膜蛋白单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

方法和样本

本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测寨卡病毒包膜蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中寨卡病毒包膜蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测寨卡病毒包膜蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别寨卡病毒包膜蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供了一种抗寨卡病毒包膜蛋白的单克隆抗体；

(2)本发明提供的抗寨卡病毒包膜蛋白单克隆抗体不仅能够灵敏地特异性识别抗寨卡病毒包膜蛋白，而且具有中和活性，能够抑制寨卡病毒的感染。

(3)本发明提供的抗体可以在病毒结合到细胞上仍能起抑制作用，有助于研究病毒的作用机理。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

1.细胞、病毒和抗体

Vero细胞、Vero-E6细胞均用含有10％FBS、100U/ml penicillin/streptomycin(Gibco)的DMEM培养基培养；鼠骨髓瘤细胞SP2/0 用含有10％FBS的RPMI 1640的培养基培养；果蝇S2细胞用含有10％FBS、100U/ml penicillin/streptomycin(Gibco)、100mg/L L-谷氨酰胺(Gibco)的Schneider’s Drosophila培养基(SDM；Gibco,Grand Island,NY)培养。

本研究中用到的寨卡毒株为ZIKV/SZ-WIV01株(GenBank:KU963796)，来源于中国科学院武汉病毒研究所微生物菌毒种保藏中心(病毒保藏号：IVCAS 6.6110)。病毒在Vero细胞上传代，在Vero-E6细胞上用空斑分析法测定病毒的滴度。

灭活寨卡病毒的获得：将感染寨卡病毒的细胞培养上清简单离心，收集上清，用β-丙内酯(1:4000)处理，4℃过夜，然后37℃2h，经8％的PEG8000 (NTE buffer，10mM Tris-HCl，pH8.0，120mM NaCl，1mM EDTA))沉淀过夜，用24％的蔗糖将大蛋白沉淀下来，用NTEbuffer将蛋白沉淀重悬，用10％-30％的酒石酸钾梯度离心，39000rpm离心3h，收集含有目的蛋白的层混合后用超滤管(Amino Ultra-4 100KD)进行浓缩,并用NTE buffer置换buffer，用BSA 做标准品，以SDS-PAGE法确定灭活病毒的纯度和浓度^[1]。

灭活CA10/Kowalik病毒制备采用本领域常规方法^[2]。

D5抗体是一个针对肠道病毒EV71的鼠源单克隆抗体^[3]。

4G2是一个抗寨卡病毒包膜蛋白的鼠源单抗，购买于Kerafast公司，货号：FCG006。

2.抗原

果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5-HisA、筛选质粒pCoBlast和磷酸钙转染试剂盒都购自于Invitrogen公司。根据寨卡病毒2015年南美流行株 (GenBank:KU312312)的E蛋白编码序列，进行密码子优化及基因合成 (GenScript公司)，并进一步克隆到载体上，获得质粒pZIKV-E。以pZIKV-E 为模版，经特异性引物PCR扩增后，两端带有Bgl II和Xba I酶切位点，连接到含有Bgl II和Xba I酶切位点的昆虫表达载体pMT/Bip/V5-His A(含有 His标签，有利于目的蛋白质的检测和纯化)，得到携带寨卡病毒包膜蛋白N 端80％区域(ZIKVE80)目的基因片段的重组质粒pMT/Bip/V5-ZIKV E80。将质粒pMT/Bip/V5-ZIKV E80转染果蝇S2细胞并筛选稳转细胞系^[4]。经过1-2 周的筛选获得了表达ZIKV E80(S2/ZIKV-E80细胞)的稳转系细胞。为了获得大量的ZIKV E80，换用无血清培养基ExpressSFM(Gibco)(添加100 U/ml penicillin/streptomycin(Gibco)、100mg/L L-谷氨酰胺(Gibco)， 10ug/ml的杀稻蕴菌素)。从一个T25flask扩大到一个T75flask，最后转接到转瓶中培养，等细胞密度达到2-4x 10⁶细胞/ml时，加入终浓度为5uM 的氯化铬诱导表达，诱导7天左右，离心收取上清，用0.45um的滤膜进行过滤^[4]。然后用以3kDa的超滤离心管(Millipore)进行浓缩，浓缩到原体积的 1/20左右。后用镍柱(Novagen)纯化，上柱之前先binding buffer(0.5M NaCl， 20mM Tris，10mM咪唑，pH7.9)结合特异性不强的位点，接着上样，随后用 binding buffer和washing b uffer(0.5M NaCl，20mM Tris，40mM咪唑，pH7.9) 洗掉杂蛋白后，再用eluting buffer(0.5M NaCl，20mM Tris，250mM咪唑， pH7.9)洗脱目的蛋白。最后用SDS-PAGE和Brandford进行目的蛋白质的定量。

3.杂交瘤细胞的制备、筛选及分泌抗体的亚型鉴定

用ZIKV E80(10μg/mouse)、(500μg/mouse)aluminum hydroxide (Invivogen,USA)腹腔免疫6周大的雌性BALB/c小鼠四次，每次间隔2周。在第8周时采血并测定血清中和效价，选取最高的一只用于做抗体。融合前3天，用50ug ZIKV E80尾静脉加强免疫一次。然后分离脾细胞并用PEG1500与SP2/0细胞融合。培养8天后，收集杂交瘤细胞上清，其中50ul 用间接ELISA法检测与ZIKV E80的结合能力，同时用40ul与16000pfu的ZIKV 孵育来检测其中和能力。

4.单克隆抗体的制备及纯化

将筛选到的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，将约5*10⁶个细胞通过腹腔注射到石蜡油预先一周处理过的BALB/c小鼠，8天左右后采集腹水，并用蛋白 HiTrap^TM Protein A亲和纯化柱(GE Healthcare，NJ，USA)纯化抗体，并用 NanoDrop(Thermo)进行定量。

5.ELISA分析

用间接ELISA去分析单抗对病毒抗原的特异性。用抗原(200ng/孔)或多肽(2ug/孔)包被96孔板，4℃孵育过夜，用PBST洗三次，接着用含5％的脱脂牛奶的PBST封闭1h，单抗(50ng/孔，用含有1％脱脂牛奶的PBST稀释) 37℃孵育2h，接着用HRP偶联的羊抗鼠IgG(1:10000)37℃孵育1h，洗三次后加TMB底物，并用1M H₃PO₄终止反应，最后在96孔酶标仪下测定OD450 吸光值。抗体的分型是用SBA Clonotyping System-HRP Kit(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)测定的。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳和western blot分析

表达的蛋白溶液样品经过SDS-PAGE上样缓冲液作用，并在100℃煮沸5 mins，然后在12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳分离，蛋白质经过考马斯亮蓝染色可见或转移到PVDF上用于Western Blotting分析，斑点用抗寨卡病毒单抗或鼠的抗寨卡病毒的血清或鼠抗登革热病毒的血清来检测，接着用HRP 偶联的羊抗鼠的二抗孵育，显色等来检测特异性条带的位置。

6.病毒空斑实验

病毒的定量用空斑法分析。简单地说，在24孔板上铺Vero-E6单层细胞， 37℃培养过夜，10倍稀释的寨卡病毒在细胞上37℃孵育1h,接着病毒样品被除去并加overlay培养基(含有1:1混合的0.2％agarose and 2％FBS-DMEM)。细胞被转移到4℃15mins。接着37℃培养约80h。最后用4％多聚甲醛固定并用0.1％的结晶紫染色。计数空斑并计算病毒的滴度。

7.病毒中和实验

用空斑减少中和效价来评价单抗的中和能力。在24孔板铺Vero单层细胞， 37℃培养过夜。用含有2％FBS的DMEM培养基2倍稀释单抗，100PFU稀释的寨卡病毒和100ul稀释的单抗37℃孵育1h，并将混合物加到细胞上，37℃孵育 1h,，接着用空斑分析法来检测。

8.病毒与细胞的吸附分析和病毒吸附到细胞表面后抗体的中和能力的分析

在24孔板铺10⁵vero细胞/孔，培养过夜。对于病毒与细胞的吸附分析，稀释的单抗和2000PFU的寨卡病毒4℃孵育1h，然后将其加到细胞上，4℃孵育1h，用预冷的PBS洗三次，接着按体外中和分析实验流程做。对于病毒吸附到细胞表面后抗体的中和能力的分析，寨卡病毒首先吸附到vero细胞，4℃孵育1h，用预冷的PBS洗三次，将稀释的抗体加到细胞上4℃孵育1h，剩余的步骤和病毒与细胞的吸附的分析一样。

9.生物膜干涉法测定单克隆抗体的亲和力

用Octet-Red(ForteBio)测定单克隆抗体对ZIKV E80的亲和力，整个过程使用的缓冲液为：含0.1％BSA和0.02％Tween-20的PBS。步骤:先将ZIKV E80 用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin试剂盒(Themo Scientific)标记上生物素，用(Zeba Spin DesaltingColumns,5mL)(Themo Scientific)洗掉未标记上的生物素，然后将10ug/ml生物素标记的ZIKV E80加载到已经激活的链亲和素标记的生物探头上，反应12min。将探头润洗(120s)后，浸泡在分别含有40,8,1.6,0.32，0.064ug/ml抗体的缓冲液中900s，之后转到缓冲液中维持900s,使其解离，最后用Octet Data Analysis V 6.4(ForteBio)分析结果，计算K_D值。

10.免疫荧光分析

以MOI 0.01在Vero细胞上感染寨卡病毒，3天后先用PBS洗两次，再用 4％的多聚甲醛固定细胞30mins，用0.1％的Triton室温处理10mins，接着用含 10％FBS、10％BSA的封闭液封闭1h。将稀释到10ng/ul的单抗与细胞在37℃孵育1h，PBS洗三次后，加FITC标记的抗鼠IgG的二抗，37℃孵育1h，最后将 1:5000稀释的DAPI与细胞孵育3mins，用PBS洗5次，用倒置显微镜(Leica， Wetzlar，Germany)分别采集FITC和DAPI通道下的信号。

11.流式细胞仪分析

以MOI 0.1在Vero细胞上感染寨卡病毒，2天后移去培养基，用PBS洗1 次，加胰酶消化2分钟，加含有10％FBS的PBS终止，离心，用PBS洗1次，离心，再用4％的多聚甲醛固定细胞，离心，破膜液(eBioscience)洗1次，离心，加一抗染色，加破膜液洗两次，加二抗，4℃30分钟，再破膜液洗2次，加PBS重悬，用流式细胞仪检测(Fortessa)。

12.多肽的合成

79条针对ZIKV E80(ZIKV isolate Z1106033,GenBank ID: KU312312.1)(E80指的是包膜蛋白氨基酸1-409的序列)的重叠多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成；每一个多肽与相邻多肽有10个氨基酸重叠；以第31 号肽为骨架、各含有一个氨基酸突变的15条突变多肽也被合成；此外，以第 31号肽为基础，还设计和合成了不同长度的、两端同时缺失的4条多肽(序列如图8C所示)。

13.单克隆抗体的克隆、分析及重组表达

用Trizol法提取分泌单克隆抗体5F8的杂交瘤细胞总RNA，反转为cDNA，用5’RACE法获得5F8重链、轻链可变区的基因，通过PCR扩增后连接到pMD-19T 载体，测序后将结果在NCBI网站分析，确认是鼠源的抗体序列。随后，根据重链、轻链可变区序列设计特异5’引物，结合保守段设计的3’端通用引物，以cDNA为模板，扩增全长的5F8重链、轻链基因，连接到pcDNA 3.1(+)真核表达载体，测序分析正确后，将其转染到293T细胞，重组表达，用间接ELISA 确定重组抗体的活性，从而可以证明序列的正确性。

实施例1单克隆抗体的筛选及鉴定

经过三轮的筛选，本发明人筛选到3个ZIKV特异性单抗(表1)，其中 1C11、4C5只能结合ZIKV E80,但不能中和寨卡病毒；而5F8既能结合ZIKV E80，又能中和寨卡病毒。单抗4C5、5F8都属于IgG1,1C11属于IgG2a。由于只有 5F8有中和能力，所以后续实验主要分析5F8。

表1.单克隆抗体的特性

单抗杂交瘤	重链	轻链	结合ZKE80能力<sup>a</sup>	病毒中和能力<sup>b</sup>
					1C11	IgG2a	Kappa	++	-
4C5	IgG1	Kappa	++	-
					5F8	IgG1	Kappa	++	+

a.ELISA实验的OD450nm吸光值；吸光值大于1.0标注为“++”。

b.“+”能够抑制细胞出现CPE；“-”：不能抑制CPE。

实施例2.单抗5F8能够中和寨卡病毒

首先用标准的空斑减少实验分析5F8的中和能力，用D5作为对照，2 倍稀释的单抗与100PFU的寨卡病毒37℃孵育1h，将其加到细胞上37℃孵育 1h，吸掉样品，加overlay培养基，4℃15mins,放37℃培养约80h。结果显示5F8的PRNT50值为5.709ug/ml，而D5没有中和效果(图1)。

为了研究5F8的作用机制，分别进行了病毒与细胞的吸附分析和病毒吸附到细胞表面后抗体的中和能力的分析。结果显示，5F8能抑制寨卡病毒吸附到 Vero细胞表面，并且在寨卡病毒吸附到细胞表面后仍能发挥中和作用(图2)。

实施例3.单克隆抗体亲和力的测定

为了测定5F8对ZIKV E80的亲和力，本发明人利用生物膜干涉法在Octet-Red(ForteBio)上测定。结果显示，5F8的K_D值为15nM(图3)。

实施例4.单抗5F8能够在Western blot中检测寨卡病毒

Western blot结果显示，5F8可以检测到灭活的寨卡病毒(图4A)。以ZIKV E80蛋白作为标准品，5F8作为检测抗体，分析Western blot中阳性信号的灰度可以建立起标准曲线(图4B)，通过曲线可以定量寨卡病毒中的E蛋白含量。

实施例5.单抗5F8能够在ELISA实验中检测寨卡病毒

用灭活的寨卡病毒包板，5F8作为检测抗体的间接ELISA实验中，灭活寨卡病毒样品产生很强的阳性读值，而阴性对照灭活CVA10病毒及未感染Vero 细胞裂解物没有明显信号(图5)。该结果表明单抗5F8特异性检测寨卡病毒。

实施例6.单抗5F8能够在免疫荧光实验中检测寨卡病毒

以单抗5F8作为检测抗体的免疫荧光实验中，寨卡病毒感染Vero细胞产生很强的荧光信号，而未感染的Vero细胞没有阳性信号(图6)。同时，用对照抗体D5孵育的寨卡病毒感染细胞也不产生阳性信号。

实施例7.单抗5F8能够在流式细胞实验中检测寨卡病毒感染细胞

为了确定5F8抗体能否在流式分析中检测寨卡病毒，本发明人分别用单抗 5F8、单抗D5(阴性对照)及商品化的4G2单抗(阳性对照)对寨卡病毒感染 Vero细胞进行染色，随后进行流式分析。结果如图7所示，4G2和5F8都能特异地检测到寨卡病毒，而D5不能检测到寨卡病毒。

实施例8.单抗5F8的表位鉴定

单抗5F8能够在Western blot中检测寨卡病毒，提示其识别线性表位。为了鉴定5F8的表位，本发明人合成了79条覆盖ZIKV E80的重叠多肽(命名为P1#至P79#)，每条多肽15个氨基酸，相邻两条多肽重叠10个AA(氨基酸)。用ELISA法检测这些多肽库与单抗5F8的反应。如图8A所示，5F8只与第31 号肽(P31#)产生反应，而与其它78个多肽不反应，提示5F8的识别表位在 P31#中。该多肽对应的病毒空间位置为EDI区的150loop。序列比对发现，不同寨卡病毒株的150loop序列非常保守，而与其它黄病毒的相应序列差异很大(图8B)。

为了进一步确定单抗5F8的识别表位，本发明人以含15个氨基酸(15aa) 的P31#肽为基础，合成了两端同时缩进的4条多肽，分别含13aa、11aa、9aa 及7aa(图8C)。以来源于丙型肝炎病毒(HCV)的一条多肽为阴性对照，检测不同长度多肽与5F8的结合能力，结果显示(图8C)：11aa多肽保持了结合能力，而9aa和7aa多肽没有结合，表明5F8的主要结合位点在11aa多肽 (第153-163位)中。有意思的是，13aa多肽也丧失了结合能力，提示两个末端氨基酸可能不参与结合5F8抗体，但对于中心结合位点构象的维持是很重要。

为明确单个氨基酸对5F8结合的贡献度，本发明人合成了一系列单突变的多肽并用于ELISA检测。结果显示(图8D)，第151、156-161位的单氨基酸突变均能导致5F8结合的完全丧失；同时，第152-153和第164-165位的单突变对5F8结合能力有不同程度(＞50％)的降低；而第154、155、162、163位的单突变对5F8结合的影响不大(＜50％)，甚至还提高其结合能力。

实施例9.单抗5F8编码序列的克隆及分析

克隆出来的5F8重链和轻链序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，为恒定区序列)：

5F8重链核苷酸序列

5F8重链氨基酸序列

5F8轻链核苷酸序列

5F8轻链氨基酸序列

用5’RACE法获得了5F8重链、轻链可变区的编码序列，分别属于IGHV1-67 *01和IGKV1-117*01亚群。采用在线工具IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，在Organism for query sequence为Mouse的条件下做进一步分析，确定重链和轻链的CDR区。

5F8重链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区)：

QVQLQQSGAELVRPGVSAKISCKASGYIFTDYAMHWVKQSHAKSLEWIGLISTKSGAANYNQKFTDKATLTVDKSSSTAYLELARLTSEDSAIYYCARNDYLAWLPYWGQGTLVTVSAA(SEQ ID NO.4)

5F8轻链可变区氨基酸如下(下划线标注的为轻链CDR区)：

DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.8)

各CDR区氨基酸序列和核苷酸序列总结于表2。

表2

实施例10.单抗5F8的重组表达及鉴定

为了验证所获得5F8重链、轻链基因的正确性，将重链和轻链的编码序列分别插入到pcDNA3.1中，构建相应表达载体，然后共转染293T细胞，并通过 ELISA检测细胞上清中是否有特异性结合ZIKV E80的抗体存在。ELISA结果显示，转染重组5F8质粒的细胞上清有剂量依赖性的结合信号，而转染空载体 pcDNA3.1(+)的细胞上清无论多少剂量都没有结合信号(图9)。该结果说明了所扩增和表达的序列确实为单抗5F8的基因。

结论

1.根据本发明的单抗5F8为寨卡病毒特异性抗体；

2.根据本发明的单抗5F8能够较好地抑制寨卡病毒感染，可用于开发治疗性抗体药物；

3.根据本发明的单抗5F8能够有效检测寨卡病毒蛋白及寨卡病毒感染细胞，可用于开发诊断试剂及试剂盒；

4.根据本发明的单抗5F8识别表位非常保守，对于基于保守表位的广谱寨卡病毒疫苗的开发具有重要指导作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

1)Victor A.Kostyuchenko et al.Structure of the thermally stable Zikavirus.Nature.533,425–428(2016).

2)Chaoyun Shen at al.Inactivated coxsackievirus A10experimentalvaccines protect mice against lethal viral challenge.Vaccine. 22；34(41):5005-12(2016).

3)Zhiqiang Ku et al.Single Neutralizing Monoclonal AntibodiesTargeting the VP1GH Loop of Enterovirus 71Inhibit both Virus Attachment andInternalization during Viral Entry.Journal of Virology.89(23):12084-95(2015).

4)Dapeng Li et al.Altered glycosylation patterns increaseimmunogenicity of a subunit HCV vaccine inducing neutralizing antibodieswhich confer protection in mice.J Virol.90(23):10486-10498(2016)。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用

<130> P2017-0180

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Ser Thr Lys Ser Gly Ala Ala

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Arg Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Leu Pro Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Ala Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Thr Lys Ser Gly Ala Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala

115

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Val Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgggttgga gctgtttcat cttctttctg gtagcaacag ctacaggtgt acactcccag 60

gtccagttgc agcagtctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggtctcagc gaagatttcc 120

tgcaaggcgt ctggctacat attcactgat tatgctatgc actgggtgaa gcagagtcat 180

gcaaagagtc tagagtggat tggacttatt agtactaagt ctggtgctgc taactacaac 240

cagaagttca cggacaaggc cacactgact gtagacaaat cttctagcac agcctatttg 300

gaacttgcca gactgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aaatgattac 360

cttgcctggc ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaataa 1386

<210> 10

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Gly Trp Ser Cys Phe Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Val Ser Ala Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Leu Ile Ser Thr Lys Ser Gly Ala Ala Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Thr Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 11

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60

gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca tgcctccatc 120

tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180

ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccta ccgattttct 240

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaa 717

<210> 12

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp His Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

35 40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggctacatat tcactgatta tgct 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attagtacta agtctggtgc tgct 24

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcaagaaatg attaccttgc ctggcttcct tac 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagagcattg tacatagtaa tggaaacacc tat 33

<210> 17

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaagtttcc 9

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttcaaggtt cacatgttcc gtggacg 27

<210> 19

<211> 504

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 19

Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr

35 40 45

Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys

115 120 125

Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His

130 135 140

Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala

165 170 175

Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro

180 185 190

Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn

195 200 205

Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro

210 215 220

Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu

305 310 315 320

Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu

340 345 350

Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp

370 375 380

Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp

385 390 395 400

His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg

405 410 415

Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly

420 425 430

Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile

435 440 445

Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser

450 455 460

Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Ala Lys

465 470 475 480

Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile

485 490 495

Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala

500

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 20

Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 21

Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala

1 5 10 15

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有以下的一个或多个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.1所示的CDR1，

SEQ ID NO.2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的CDR3。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.5所示的CDR1’，

SEQ ID NO.6所示的CDR2’，和

SEQ ID NO.7所示的CDR3’。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性的结合SEQ ID NO.20所示的抗原表位肽；

或者，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区。

优选地，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或权利要求4所述的轻链。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；

(ii)多肽、蛋白药物序列；以及

(iii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；或

(2)如权利要求6所述的重组蛋白。

8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。

10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、如权利要求5所述的抗体的序列、或如权利要求6所述的重组蛋白；和