CN108794624A - 抗h7n9流感病毒的中和性单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗H7N9流感病毒的中和性单克隆抗体。具体地本发明公开了两株针对H7N9流感病毒的单克隆抗体，该抗体对H7N9流感病毒抗原具有显著的结合活性。

Description

抗H7N9流感病毒的中和性单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及两种抗H7N9流感病毒的中和性单克隆抗体。
背景技术
流感病毒属正粘病毒科，是有包膜的，单股负链RNA病毒。流感病毒可分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒宿主多、流行广、致病强，是致流感的主要类型。根据表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，甲型流感病毒被分为18个HA亚型和11个NA亚型。根据HA抗原差异，可划分为两个进化组。
流感病毒的基因组分为8个片段，编码10种以上蛋白。它们在病毒感染、复制、释放和抵抗机体免疫等多种过程中发挥重要作用。流感病毒表面有两种糖蛋白(HA和NA)及一种基质蛋白(M2)。颗粒内8个片段的负链RNA，分别被病毒核蛋白(NP)包裹，和由PA、PB1和PB2组成的聚合酶复合物，共同组成核糖核蛋白复合体(vRNP)。基质蛋白1(M1)包裹vRNP，构成病毒基本骨架。
目前，流感病毒的预防与治疗方法主要有以下三种：1)疫苗。根据分离出的H7N9禽流感毒株A/Shanghai/2/2013(H7N9)或A/Anhui/1/2013(H7N9)，利用反向遗传学构建疫苗备选株，或制备减毒活疫苗。尚无有效抗H7N9禽流感病毒疫苗上市。2)抗病毒药物金刚烷胺、奥司他韦、扎那米韦等治疗。有报道显示新型H7N9流感病毒具有抗药性。3)治疗性抗体治疗流感。中和活性抗体可以阻断病毒与靶细胞结合，诱导补体、免疫细胞，杀死被病毒感染的细胞，在治疗流感感染中具有极大优势。
因此，本领域有必要针对H7N9流感病毒开发亲和性良好的治疗性中和抗体，以应对禽流感防控的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种H7N9流感病毒的中和性单克隆抗体及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的CDR1”，
SEQ ID NO:20所示的CDR2”，和
SEQ ID NO:22所示的CDR3”；
优选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明的第一方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.2所示的CDR1，
SEQ ID NO.4所示的CDR2，
SEQ ID NO.6所示的CDR3，
SEQ ID NO.10所示的CDR1，
SEQ ID NO.12所示的CDR2，和
SEQ ID NO.14所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明的第三方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的轻链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的轻链；和/或如本发明的第四方面所述的重链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗H7N9流感病毒HA蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的轻链可变区的序列、如本发明的第二方面所述的轻链的序列、如本发明的第三方面所述的重链可变区的序列、如本发明的第四方面所述的重链的序列、或如本发明的第五方面所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6×His标签、GGGS序列、FLAG 标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合H7N9流感病毒HA蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的轻链可变区、如本发明的第二方面所述的轻链、如本发明的第三方面所述的重链可变区、如本发明的第四方面所述的重链、或如本发明的第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23所示的序列。
本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明的第一方面所述的轻链可变区、如本发明的第二方面所述的轻链、如本发明的第三方面所述的重链可变区、如本发明的第四方面所述的重链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、 MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质 (BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明的第一方面所述的轻链可变区、如本发明的第二方面所述的轻链、如本发明的第三方面所述的重链可变区、如本发明的第四方面所述的重链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗H7N9流感病毒感染的药物。
本发明的第十二方面，提供了如本发明的第一方面所述的轻链可变区、如本发明的第二方面所述的轻链、如本发明的第三方面所述的重链可变区、如本发明的第四方面所述的重链、如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测H7N9流感病毒。
在另一优选例中，所述药剂用于治疗或预防H7N9流感病毒感染。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中H7N9流感病毒血凝素HA蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在 H7N9流感病毒血凝素HA蛋白。
本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第六方面所述的重组蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1HA基因在293T细胞中表达情况。
图2小鼠免疫过程示意图。
图3对于H7N9疫苗的小鼠血清抗体滴定。
图4各组小鼠血清稀释128000倍时抗体滴度。
图5抗体s-6-8-10对抵抗H7N9流感病毒的中和活性。
图6抗体S-496-4对抵抗H7N9流感病毒的中和活性。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地的获得二株针对H7N9流感病毒的单克隆抗体，这两株单克隆抗体具有相同的轻链可变区序列。该抗体对H7N9 流感病毒抗原具有显著的结合活性。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明中，为了高效、快速和安全地制备抗H7N9流感病毒中和抗体，采用DNA疫苗免疫的策略，免疫BALB/c小鼠，并利用小鼠杂交瘤制备及筛选获得中和性抗体细胞株，获得了2株有中和活性的鼠源抗体，分别为S-6-8-10、 S-496-4，其中S-6-8-10抗体的中和活性优于S-496-4。
H7N9流感病毒
H7N9流感病毒是一种甲型禽流感病毒，既往仅在禽类中发现。基因测序和进化分析显示，H7N9病毒是由家养鸭H7N3亚型流感病毒的HA基因，野生水禽 H7N9亚型流感病毒的NA基因，和家禽H9N2亚型流感病毒的PA、PB1、PB2、 NP、NS、M基因组成的重组病毒。该病毒对人类具有高致病性，感染人体后，可诱发炎症风暴，引起呼吸窘迫综合症(ARDS)、脓毒性休克、多器官功能障碍综合症(MODS)，甚至死亡。接触过禽类或到过活禽市场者，尤其是中老年人是高危人群。目前对H7N9流感病毒传播途径和致病机制尚不清楚，是否具有人与人传播的可能有待研究，但不排除大流行的可能。有研究表明，新型H7N9 流感病毒对抗病毒药物金刚烷胺、奥司他韦、扎那米韦等具有抗性。因此，筛选抗H7N9流感病毒的中和性抗体，对其预防与控制具有重大意义。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和 IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA 和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗H7N9 流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如 Fab或(Fab”)2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
CDR1，其氨基酸序列为GFNIKDTY(SEQ ID NO.:2)，其编码核苷酸序列为，
GGCTTCAACATTAAAGACACCTAT(SEQ ID NO.:1)；
CDR2，其氨基酸序列为IDPANGNT(SEQ ID NO.:4)，其编码核苷酸序列为，
ATTGATCCTGCGAATGGTAATACT(SEQ ID NO.:3)；
CDR3，其氨基酸序列为TSVYYGYFYV(SEQ ID NO.:6)，其编码核苷酸序列为，ACTAGTGTCTACTATGGTTACTTCTATGTC(SEQ ID NO.:5)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVNQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSVYYGYFYVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO.:8)，
其编码核苷酸序列为：
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAACCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTAGTGTCTACTATGGTTACTTCTATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO.:7)。
在本发明的另一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
CDR1，其氨基酸序列为GYTFSSYW(SEQ ID NO.:10)，其编码核苷酸序列为GGCTACACATTCAGTAGTTACTGG(SEQ ID NO.:9)；
CDR2，其氨基酸序列为ILPGSGST(SEQ ID NO.:12)，其编码核苷酸序列为
ATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACT(SEQ ID NO.:11)；
CDR3，其氨基酸序列为ASPPTGTWYFDV(SEQ ID NO.:14)，其编码核苷酸序列为GCAAGCCCCCCAACTGGGACTTGGTACTTCGATGTC(SEQ ID NO.:13)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKASGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYHEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPPTGTWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO.:16)，
其编码核苷酸序列为：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCAGTAGTTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACCATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCTTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGCCCCCCAACTGGGACTTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT CA(SEQ ID NO.:15)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
CDR1”，其氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.:18)，其编码核苷酸序列为，AAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTAT(SEQ ID NO.:17)；
CDR2”，其氨基酸序列为LVS(SEQ ID NO.:20)，其编码核苷酸序列为，CTTGTATCCAAC(SEQ ID NO.:19)；
CDR3”，其氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.:22)，其编码核苷酸序列为，CAGCACATTAGGGAGCTTACACG(SEQ ID NO.:21)。
在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO.:24)，
其编码核苷酸序列为：
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGA GCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA(SEQ ID NO.:23)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合抗H7N9流感病毒的抗体，例如具有重链可变区(如 SEQ ID NO.:8和/或SEQID NO.:16所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:24所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗H7N9流感病毒HA蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2 等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少约90％同源性，较佳地至少约95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基) 被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有抗H7N9流感病毒HA蛋白结合活性的、包括上述CDR 区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/ 或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组 DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或 (2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:16和/ 或SEQ ID NO.:24所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞； CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、 PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH 肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunologyand Immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如 IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin 等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko 等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng 等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合H7N9流感病毒HA蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的H7N9流感病毒HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler 等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292, 1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自 American Type Culture Col lection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用 (MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63 页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长 (Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对H7N9流感病毒的单克隆抗体，特别是针对H7N9 流感病毒HA蛋白的单克隆抗体。本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10-20天可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供了两种能与H7N9流感病毒特异性结合的单克隆抗体 S-6-8-10和S-494-6；
(2)本发明的单克隆抗体S-6-8-10对H7N9流感病毒表现出极高的中和活性；
(3)本发明的单克隆抗体易于表达纯化。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。其中，使用的细胞株如293T细胞、MDCK细胞购自美国ATCC，骨髓瘤细胞购自中科英沐公司；pBUDCE4.1质粒购自Invitrogen；嵌合病毒 A/shanghai/02/2013(H7N9)、A/turkey/Italy/1265/1999(H7N1)和 A/Quzhou/1/2015(H7N9)的HA、NA基因通过全人工合成准备，其余基因基于(H1N1病毒的基因序列)通过PCR扩增或全人工合成制备。 A/shanghai/02/2013(H7N9)裂解疫苗获自上海生物制品研究所；羊抗鼠IgG抗体购自中科英沐公司；酶KOD Fx NeoPolymerase购自TOYOBO公司，Taq Ex Polymerase购自TAKARA公司；费氏完全佐剂购自Sigma公司；BALB/c小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。
实施例1流感病毒DNA疫苗构建和制备
PCR法分别扩增A/Shanghai/02/2013(H7N9)、 A/turkey/Italy/1265/1999(H7N1)和A/Quzhou/1/2015(H7N9)的HA基因，连接至pBUDCE4.1-GMSCF质粒载体上。用脂质体法转染293T细胞，收集上清，用 western blot鉴定HA表达情况。
扩增A/Shanghai/02/2013(H7N9)、A/turkey/Italy/1265/1999(H7N1)和 A/Quzhou/1/2015(H7N9)的HA基因，双酶切后连入pBUDCE4.1-GMCSF载体 (pBUDCE4.1质粒购自Invitrogen，由本实验室改造加入GMCSF)。转染293T，检测上清内HA表达，结果如图1所示，三个毒株的HA基因均正确表达，NC为转染pBUDCE4.1-GMCSF空载质粒的样品，无对应条带表达，1-4是重复。
实施例2免疫后小鼠血清效价
2.1小鼠免疫、筛选及血清中和活性评价
参见图2，采取常规免疫方法，免疫小鼠。每组5只6-8周的BALB/c雌性小鼠，肌肉注射构建的HA DNA疫苗100ug/只。连续免疫3次，每次间隔两周。第三次免疫10天后小鼠眼眶取血，分离血清，测定血清效价。选取效价最高的小鼠，进行加强免疫，即在第3次免疫2周后将100μg的HA蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，完全乳化后采用皮下注射方法免疫小鼠。3天后，进行回忆刺激。再3天后取该小鼠脾脏用于细胞融合。同时，眼眶取血，分离血清检测抗体效价。
2.2 ELISA检测血清抗体效价
包被上海H7N9裂解疫苗于ELISA板，10μg/ml，每孔100μl，4℃过夜。次日PBST洗板三次，1％BSA封闭2小时，PBST洗板三次。将小鼠血清按1:500、 1:2000、1:8000等4倍梯度稀释8个梯度，每孔100ul，37℃孵育2小时，PBST 洗板三次。羊抗-鼠IgG(Fc特异性)-过氧化物酶抗体，1:10000稀释，每孔 100μl，37℃,1小时，PBST洗板三次。底物每孔100ul，避光15分钟，加 2M H2SO4终止。测定OD450，计算抗体效价。
结果
按上述2.1和2.2中的实验步骤，检测免疫后小鼠血清中抗体效价，结果如图3和图4所示，免疫成功，小鼠体内含抗H7N9的抗体，且效价较高，即使稀释至128000倍，与对照NC(肌肉注射pBUDCE4.1-GMCSF空载)相比仍为阳性。比较同组内5只小鼠血清抗体效价，最终选择实验组2号和4号(图4红色方框)进行回忆刺激，收集脾脏制备杂交瘤细胞。
实施例3单克隆杂交瘤细胞获得
3.1小鼠杂交瘤制备及筛选获得中和性抗体细胞株
根据ELISA检测结果，选取抗体效价最高的小鼠为免疫细胞供体。小鼠的脾细胞与经8-氮鸟嘌呤筛选过的骨髓瘤细胞混合，在PEG4000处理下融合，然后加HAT进行筛选，待未融合细胞完全死亡，杂交瘤克隆长出后，收集培养上清，用ELISA法进行抗体检测。选择抗体阳性且滴度高的，进行有限稀释，挑出单克隆细胞。取BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL降植烷(pristane)，7-10天后，再腹腔注射0.5mL，所得单克隆1×106杂交瘤细胞，约10天-20天后小鼠长出腹水，收获腹水即可得含单克隆抗体的腹水。对腹水产生的抗体进行纯化和鉴定。
结果
经克隆化，获得了2株杂交瘤克隆，其分泌抗体命名及效价如表2所示。
表2抗流感单克隆抗体效价检测及亚型鉴定
实施例4获得流感病毒单克隆中和性抗体的可变区基因
取杂交瘤单克隆细胞，抽提RNA并反转为cDNA。参考Novagen Ig-Primer Sets引物库，合成鼠抗体可变区引物库的引物，用KOD Fx Neo Polymerase扩增cDNA。用Taq ExPolymerase加poly A尾并连接至T载。转化后用蓝白斑筛选出阳性克隆，抽提质粒送测序，最终获得抗体可变区序列。
抽提单克隆杂交瘤细胞RNA，反转录成cDNA后用鼠抗体可变区引物库，克隆抗体可变区基因，测序后得到基因序列：SEQ ID NO.:7抗体S-6-8-10重链可变区，351bp；SEQ IDNO.:15抗体S-496-4重链可变区，357bp；SEQ ID NO.:23抗体 S-6-8-10轻链(kappa链)可变区/抗体S-496-4轻链(Kappa链)可变区，324bp。
实施例5抗流感病毒单克隆抗体中和活性评价
对腹水中抗体进行流感病毒微中和活性评价。MDCK细胞铺至96孔板备用。抗体两倍梯度稀释，终体积50μl/well，每孔再加入50ul含100个TCID50的 H7N9流感病毒。37℃5％CO2,1h，使血清与病毒充分作用，后加入MDCK 96 孔板细胞中。37℃,5％CO2,培养20h，PBS洗板一次，用预冷的80％丙酮-PBS 溶液固定10min。anti-NP ELISA检测吸光度值计算抗体中和活性。
检测两抗体对流感病毒H7N9中和活性，结果如图5和图6所示，两抗体均可中和H7N9病毒，保护感染细胞。参见表3，其中抗体S-6-8-10IC50为 3.147，抗体S-496-4IC50为11.13。
表3抗体对H7N9流感病毒的中和活性IC50值
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海巴斯德研究所
<120> 抗H7N9流感病毒的中和性单克隆抗体
<130> P2017-0069
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcttcaaca ttaaagacac ctat 24
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attgatcctg cgaatggtaa tact 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actagtgtct actatggtta cttctatgtc 30
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Thr Ser Val Tyr Tyr Gly Tyr Phe Tyr Val
1 5 10
<210> 7
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaaccagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tagtgtctac 300
tatggttact tctatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Val Tyr Tyr Gly Tyr Phe Tyr Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggctacacat tcagtagtta ctgg 24
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
attttacctg gaagtggtag tact 24
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcaagccccc caactgggac ttggtacttc gatgtc 36
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Ala Ser Pro Pro Thr Gly Thr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 15
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaaaata 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcagt agttactgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180
catgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcttccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagcccccca 300
actgggactt ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr His Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Pro Thr Gly Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aaaagtgtca gtacatctgg ctatagttat 30
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cttgtatcca ac 12
<210> 20
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Leu Val Ser
1
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cagcacatta gggagcttac acg 23
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg
1 5
<210> 23
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaa 324
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys
100 105

Claims (14)

1.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的CDR1”，
SEQ ID NO:20所示的CDR2”，和
SEQ ID NO:22所示的CDR3”；
优选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求1所述的轻链可变区和轻链恒定区。
3.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.2所示的CDR1，
SEQ ID NO.4所示的CDR2，
SEQ ID NO.6所示的CDR3，
SEQ ID NO.10所示的CDR1，
SEQ ID NO.12所示的CDR2，和
SEQ ID NO.14所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求3所述的重链可变区和重链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的轻链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的重链可变区。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的轻链可变区的序列、如权利要求2所述的轻链的序列、如权利要求3所述的重链可变区的序列、如权利要求4所述的重链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的轻链可变区、如权利要求2所述的轻链、如权利要求3所述的重链可变区、如权利要求4所述的重链、或如权利要求5所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的轻链可变区、如权利要求2所述的轻链、如权利要求3所述的重链可变区、如权利要求4所述的重链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
11.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的轻链可变区、如权利要求2所述的轻链、如权利要求3所述的重链可变区、如权利要求4所述的重链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
12.如权利要求1所述的轻链可变区、如权利要求2所述的轻链、如权利要求3所述的重链可变区、如权利要求4所述的重链、如权利要求5所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
13.一种检测样品中H7N9流感病毒血凝素HA蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求5所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在H7N9流感病毒血凝素HA蛋白。
14.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110028578A (zh) * 2019-03-12 2019-07-19 中国科学院武汉病毒研究所 广谱抗h7流感病毒的中和性人源单克隆抗体及其应用
CN110627901A (zh) * 2019-09-25 2019-12-31 中国农业大学 流感病毒基质蛋白m1的单克隆抗体及其应用
CN111423507A (zh) * 2019-01-10 2020-07-17 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 广谱性中和流感病毒的全人抗体
CN114805564A (zh) * 2022-06-10 2022-07-29 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
CN114835805A (zh) * 2022-06-10 2022-08-02 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111423507A (zh) * 2019-01-10 2020-07-17 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 广谱性中和流感病毒的全人抗体
CN111423507B (zh) * 2019-01-10 2022-04-15 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 广谱性中和流感病毒的全人抗体
CN110028578A (zh) * 2019-03-12 2019-07-19 中国科学院武汉病毒研究所 广谱抗h7流感病毒的中和性人源单克隆抗体及其应用
CN110627901A (zh) * 2019-09-25 2019-12-31 中国农业大学 流感病毒基质蛋白m1的单克隆抗体及其应用
CN110627901B (zh) * 2019-09-25 2021-02-23 中国农业大学 流感病毒基质蛋白m1的单克隆抗体及其应用
CN114805564A (zh) * 2022-06-10 2022-07-29 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
CN114835805A (zh) * 2022-06-10 2022-08-02 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用
CN114835805B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 抗SARS-CoV-2 spike蛋白的单克隆抗体及应用
CN114805564B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用

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