CN108026166A - 多瘤病毒中和抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗VP1抗体、抗体片段及其在预防和治疗多瘤病毒感染和相关疾病中的用途。

Description

多瘤病毒中和抗体
技术领域
本公开涉及抗VP1抗体、抗体片段及其在降低多瘤病毒感染可能性或治疗多瘤病毒感染中的用途。
背景技术
BK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)是人多瘤病毒中首先被鉴定出的两种。这两种多瘤病毒分离自免疫抑制患者，并在1971年公开于同一期的Lancet中(Gardner等,Lancet 19711:1253-1527和Padgett等,Lancet 1971 1:1257-1260)。多瘤病毒是二十面体、无包膜、双链DNA病毒。它们直径为40-45nm，由88％蛋白质和12％DNA组成。
BKV基因组是长度约为5Kb的环状双链DNA，包含三个主要分区：早期编码区、晚期编码区和非编码控制区。早期编码区编码三种调节蛋白(大肿瘤抗原[TAg]、小肿瘤抗原[tAg]和截短肿瘤抗原[truncTAg])，这三种调节蛋白是新感染的细胞中表达的首批病毒蛋白质，负责便于病毒DNA复制和建立有利的细胞环境。晚期编码区编码构成病毒壳体的三种结构蛋白质(VP1、VP2和VP3)，以及在病毒复制期间的作用尚不明确的未知蛋白质(agnoprotein)。非编码控制区包含复制起点，以及驱动病毒基因产物表达的早期和晚期启动子。
在许多不同细胞类型中检测到了BKV，包括肾、膀胱和输尿管(持续感染的典型部位)上皮细胞、扁桃体组织及淋巴细胞(所提出的原发感染和传播部位)(Chatterjee等,J.Med.Virol.2000；60:353-362,Goudsmit等,J.Med.Virol.1982；10:91-99,Heritage等,J.Med.Virol.1981；8:143-150,Shinohara等,J.Med.Virol.1993；41(4):301-305)。BKV的主要细胞表面受体是神经节苷脂GT1b、GD1b和GD3，这些神经节苷脂全都具有α2,8连接唾液酸，且非常普遍，允许感染多种细胞类型(Neu等,PLos Patholog.2013；9(10):e1003714和e1003688，还参见O’Hara等,Virus Res.2014；189:208-285)。BKV的无包膜二十面体病毒粒子由三种不同病毒蛋白质组成：360个拷贝排列为72个五聚体的主要病毒壳体蛋白质VP1及72个拷贝次要病毒壳体蛋白质VP2和VP3的组合，每个VP1五聚体结合一个VP2或VP3分子。仅VP1在进入时暴露于病毒粒子表面，每个五聚体具有神经节苷脂受体的五个低亲和力结合部位。VP1五聚体与细胞表面神经节苷脂受体的结合通过胞膜窖介导的胞吞途径起始内化，随后将病毒运输至内质网，最终运输至细胞核(Tsai and Qian,J.Virol 2010；84(19):9840-9852)。
人多瘤病毒BK(BKV)感染基本无处不在，估计全球80％至90％之间的人群受感染(Knowles W.A.,Adv.Exp.Med.Biol.2006；577:19-45)。原发感染最常发生在儿童期(即10岁之前)，引起轻度、非特异性、自限性疾病或完全无症状。持续感染在肾小管、输尿管和膀胱上皮细胞中建立，并被免疫系统有效控制。具有免疫能力的成人尿中偶发暂时性无症状性病毒脱落，但不引起疾病或后果。但是，免疫功能受损，尤其是肾或造血干细胞移植后免疫抑制可导致不受控的BKV复制，最终引起BKV相关肾病(BKVAN)或出血性膀胱炎(HC)、膀胱疼痛疾病。还没有针对BKV的有效抗病毒治疗，目前的标准治疗是降低免疫抑制，而降低免疫抑制提高了急性排斥的风险。即使用目前更激进的方法来监测和干预，也有至多10％的肾移植受体将发展BKVAN，那些患者中的15-30％将由于BKVAN而遭受移植物丢失。在检测到BKV病毒血症(viremia)时进行免疫抑制方案降低的那些患者中，至多30％将因此而出现急性排斥发作。
虽然BKV最先描述于1971年(上文)，但直到20世纪90年代，文献中才将BK相关肾病(BKVAN)报道为肾移植损伤的原因(Purighalla等,Am.J.Kidney Dis.1995；26:671-673和Randhawa等,Transplantation 1999；67:103-109)。在BKVAN的早期治疗中，BK测试阳性具有严重后果，超过50％的患者具有移植物功能障碍和移植物丢失(Hirsch等,NewEngl.J.Med.2002；347:488-496)。BK病毒复活可始于移植后，移植后3个月在约30％-50％的患者中可见(Bressollette-Bodin等,Am J.Transplant.2005；5(8):1926-1933和Brennan等,Am.J.Transplant.2004；4(12):2132-2134)。BK病毒复活可通过先是尿中、然后是血浆中、最后是肾中的病毒和病毒DNA而观察到(Brennan等,Am.J.Transplant.2005；5(3):582-594和Hirsch等,N Eng.J.Med.2002；347(7):488-496)。约80％的肾移植患者尿中有BK病毒(BK病毒尿症(viruria))，这些患者中的5-10％进展至BKVAN(Binet等,Transplantation 1999；67(6):918-922和Bressollette-Bodin等,AmJ.Transplant.2005；5(8):1926-1933)。BKV影响肾小管上皮细胞，导致伴随基底膜剥落的坏死和溶解破坏，使肾小管液累积在间质组织中，引起间质纤维化和肾小管萎缩(Nickeleit等,J.Am.Soc.Neprol.1999；10(5):1080-1089)，它们全都可以影响移植物的状态。患者可出现肾功能恶化、肾小管-间质性肾炎和输尿管狭窄(Garner等,Lancet 1971；1(7712):1253-1257和Hirsch Am.J.Transplant 2002；2(1)25-30)。
BKV还可以在免疫受损宿主中引起肺炎、视网膜炎和脑膜脑炎(meningoencephalitis)(Reploeg等,Clin.Infect.Dis.2001；33(2):191-202)。造血干细胞移植(HSCT)受体中的BKV疾病通常表现为出血性膀胱炎(HC)，其严重度可不同。病毒尿症(但不是病毒血症)和疼痛性血尿与HC的临床表现相关。目前的标准治疗在性质上是支持性的，主要涉及强制水合/利尿和疼痛管理措施。最严重的情况需要输血、血块清除，在一些情况下可导致死亡。任何原因(例如药物、照射、病毒)的HC在HSCT受体中相对常见，但BKV相关HC通常在移植后6个月内发生在约10-12％的患者中。存在其他HC病毒性病因，与成人HSCT受体相比，在儿科HSCT受体中，腺病毒是更常见的HC原因。在其他免疫受损病症(如系统性红斑狼疮)、其他实体器官移植中及在HIV/AIDS患者中也观察到了BK病毒(Jiang等,Virol.2009；384:266-273)。
目前，器官移植相关BK肾病的治疗是降低免疫抑制，力求防止移植物功能紊乱和移植物丢失(Wiseman等,Am.J.Kidney Dis.2009；54(1):131-142和Hirsch等,Transplantation 2005；79(1):1277-1286)。没有固定的临床降低方案，因为虽然降低免疫抑制可有助于防止从病毒血症进展至与临床肾病相关的广泛损伤，但这也提高了急性器官排斥的风险(Brennan等,Am.J.Transplant 2005；5(3):582-594)。临床医生已报道了诸如西多福韦(cidofovir)、来氟米特(leflunomide)或喹诺酮(quinolone)的治疗剂与免疫抑制剂降低组合的用途，但是，该报道发现此方法无效，增加了管理附加副作用的负担(Randhawa和Brennan Am.J.Transplant 2006；6(9):2000-2005)。因此，本领域存在对中和诸如BK的多瘤病毒且可用于免疫受损宿主的治疗的未得到满足和有用的需要。
虽然JC病毒通常晚于BK病毒获得，但JC病毒也是在人群中高度流行的多瘤病毒(80％)(Padgett等,J.Infect.Dis.1973；127(4):467-470和Sabath等,J.Infect.Dis.2002；186Suppl.2:5180-5186)。初始感染后，JC病毒在淋巴器官和肾中建立潜伏，并复活时通过受感染的B淋巴细胞侵入中枢神经系统。一旦进入CNS，JC病毒即引起进行性多灶性白质脑病(PML)，PML是进行性脱髓鞘性中枢神经系统障碍。PML最常作为HIV/AIDS患者中的机会感染出现，在免疫受损患者中也有报道(Angstrom等,Brain 1958；81(1):93-111和Garcia-Suarez等,Am.J.Hematol.2005；80(4):271-281)。PML患者出现意识错乱、精神状态变化、步态共济失调、局灶性神经功能缺损，如轻偏瘫、肢体轻瘫和视觉变化(Richardson E.P.,N.Eng.J.Med.1961；265:815-823)。PML患者预后差，在HIV/AIDS患者中尤其差(Antinori等,J.Neurovirol.2003；9suppl.1:47-53)。这进一步突出了本领域中对中和诸如JC的多瘤病毒的治疗的未能满足和有用的治疗需求。
发明概述
本公开涉及抗人多瘤病毒的中和抗体和/或其片段，识别BK病毒和/或JC病毒和它们各自的VP1五聚体的抗体及其片段。
抗体，其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合VP1。
该抗体，其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合BK病毒血清型I-血清型IVVP1。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段以5.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型I VP1，以29.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型II VP1，以6.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型III VP1，和/或以185.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型IV VP1。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段进一步以高纳摩尔范围内的结合亲和力结合JCV VP1和特异性JCV VP1突变体。
该抗体，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合表1的VP1。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合表1的两种或多种VP1。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型II。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型III。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型IV。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型II和BKV VP1血清型III。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型II和BKV VP1血清型IV。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型I和JCV VP1。在优选实施方案中，该抗体或其抗原结合片段结合BKVVP1血清型I、II、III和IV。此外，该抗体或其抗原结合片段结合BKV VP1血清型I、II、III和IV及JCV VP1。
该抗体，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合VP1表位(SEQ ID NO:500或SEQID NO:501)的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，例如通过本文所述丙氨酸扫描诱变测定，该抗体或抗原结合片段特异性结合氨基酸Y169、R170和K172中的一个或多个，例如结合Y169和R170。
该抗体，其中该抗体或抗原结合片段包含序列GFTFXNYWMT(SEQ ID NO.507)，其中X可以是任意氨基酸(Xaa)。在另一实施方案中，X可以是N(Asn)、S(Ser)、K(Lys)或Q(Gln)。
抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)含有(a)SEQ ID NO:6的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:7的HCDR2、(c)SEQ ID NO:8的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3的轻链可变区；
(ii)含有(a)SEQ ID NO:26的HCDR1、(b)SEQ ID NO:27的HCDR2、(c)SEQ ID NO:28的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:36的LCDR1、(e)SEQ ID NO:37的LCDR2和(f)SEQ ID NO:38的LCDR3的轻链可变区；
(iii)含有(a)SEQ ID NO:46的HCDR1、(b)SEQ ID NO:47的HCDR2、(c)SEQ ID NO:48的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:56的LCDR1、(e)SEQ ID NO:57的LCDR2和(f)SEQ ID NO:58的LCDR3的轻链可变区；
(iv)含有(a)SEQ ID NO:66的HCDR1、(b)SEQ ID NO:67的HCDR2、(c)SEQ ID NO:68的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:76的LCDR1、(e)SEQ ID NO:77的LCDR2和(f)SEQ ID NO:78的LCDR3的轻链可变区；
(v)含有(a)SEQ ID NO:86的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:96的LCDR1、(e)SEQ ID NO:97的LCDR2和(f)SEQ ID NO:98的LCDR3的轻链可变区；
(vi)含有(a)SEQ ID NO:106的HCDR1、(b)SEQ ID NO:107的HCDR2、(c)SEQ ID NO:108的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:116的LCDR1、(e)SEQ ID NO:117的LCDR2和(f)SEQ ID NO:118的LCDR3的轻链可变区；
(vii)含有(a)SEQ ID NO:126的HCDR1、(b)SEQ ID NO:127的HCDR2、(c)SEQ IDNO:128的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:136的LCDR1、(e)SEQ ID NO:137的LCDR2和(f)SEQ ID NO:138的LCDR3的轻链可变区；
(viii)含有(a)SEQ ID NO:146的HCDR1、(b)SEQ ID NO:147的HCDR2、(c)SEQ IDNO:148的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:156的LCDR1、(e)SEQ ID NO:157的LCDR2和(f)SEQ ID NO:158的LCDR3的轻链可变区；
(ix)含有(a)SEQ ID NO:166的HCDR1、(b)SEQ ID NO:167的HCDR2、(c)SEQ ID NO:168的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:176的LCDR1、(e)SEQ ID NO:177的LCDR2和(f)SEQ ID NO:178的LCDR3的轻链可变区；
(x)含有(a)SEQ ID NO:186的HCDR1、(b)SEQ ID NO:187的HCDR2、(c)SEQ ID NO:188的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ ID NO:197的LCDR2和(f)SEQ ID NO:198的LCDR3的轻链可变区；
(xi)含有(a)SEQ ID NO:206的HCDR1、(b)SEQ ID NO:207的HCDR2、(c)SEQ ID NO:208的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:216的LCDR1、(e)SEQ ID NO:217的LCDR2和(f)SEQ ID NO:218的LCDR3的轻链可变区；
(xii)含有(a)SEQ ID NO:226的HCDR1、(b)SEQ ID NO:227的HCDR2、(c)SEQ IDNO:228的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:236的LCDR1、(e)SEQ ID NO:237的LCDR2和(f)SEQ ID NO:238的LCDR3的轻链可变区；
(xiii)含有(a)SEQ ID NO:246的HCDR1、(b)SEQ ID NO:247的HCDR2、(c)SEQ IDNO:248的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:256的LCDR1、(e)SEQ ID NO:257的LCDR2和(f)SEQ ID NO:258的LCDR3的轻链可变区；
(xiv)含有(a)SEQ ID NO:266的HCDR1、(b)SEQ ID NO:267的HCDR2、(c)SEQ IDNO:268的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:276的LCDR1、(e)SEQ ID NO:277的LCDR2和(f)SEQ ID NO:278的LCDR3的轻链可变区；
(xv)含有(a)SEQ ID NO:286的HCDR1、(b)SEQ ID NO:287的HCDR2、(c)SEQ ID NO:288的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:296的LCDR1、(e)SEQ ID NO:297的LCDR2和(f)SEQ ID NO:298的LCDR3的轻链可变区；
(xvi)含有(a)SEQ ID NO:306的HCDR1、(b)SEQ ID NO:307的HCDR2、(c)SEQ IDNO:308的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:314的LCDR1、(e)SEQ ID NO:315的LCDR2和(f)SEQ ID NO:316的LCDR3的轻链可变区；
(xvii)含有(a)SEQ ID NO:322的HCDR1、(b)SEQ ID NO:323的HCDR2、(c)SEQ IDNO:324的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:332的LCDR1、(e)SEQ ID NO:333的LCDR2和(f)SEQ ID NO:334的LCDR3的轻链可变区；
(xviii)含有(a)SEQ ID NO:342的HCDR1、(b)SEQ ID NO:343的HCDR2、(c)SEQ IDNO:344的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:349的LCDR1、(e)SEQ ID NO:350的LCDR2和(f)SEQ ID NO:351的LCDR3的轻链可变区；
(xix)含有(a)SEQ ID NO:356的HCDR1、(b)SEQ ID NO:357的HCDR2、(c)SEQ IDNO:358的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:363的LCDR1、(e)SEQ ID NO:364的LCDR2和(f)SEQ ID NO:365的LCDR3的轻链可变区；
(xx)含有(a)SEQ ID NO:370的HCDR1、(b)SEQ ID NO:371的HCDR2、(c)SEQ ID NO:372的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:377的LCDR1、(e)SEQ ID NO:378的LCDR2和(f)SEQ ID NO:379的LCDR3的轻链可变区；
(xxi)含有(a)SEQ ID NO:384的HCDR1、(b)SEQ ID NO:385的HCDR2、(c)SEQ IDNO:386的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:391的LCDR1、(e)SEQ ID NO:392的LCDR2和(f)SEQ ID NO:393的LCDR3的轻链可变区；
(xxii)含有(a)SEQ ID NO:398的HCDR1、(b)SEQ ID NO:399的HCDR2、(c)SEQ IDNO:400的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:405的LCDR1、(e)SEQ ID NO:406的LCDR2和(f)SEQ ID NO:407的LCDR3的轻链可变区；
(xxiii)含有(a)SEQ ID NO:412的HCDR1、(b)SEQ ID NO:413的HCDR2、(c)SEQ IDNO:414的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:419的LCDR1、(e)SEQ ID NO:420的LCDR2和(f)SEQ ID NO:421的LCDR3的轻链可变区；
(xxiv)含有(a)SEQ ID NO:426的HCDR1、(b)SEQ ID NO:427的HCDR2、(c)SEQ IDNO:428的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:433的LCDR1、(e)SEQ ID NO:434的LCDR2和(f)SEQ ID NO:435的LCDR3的轻链可变区；
(xxv)含有(a)SEQ ID NO:440的HCDR1、(b)SEQ ID NO:441的HCDR2、(c)SEQ IDNO:442的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:447的LCDR1、(e)SEQ ID NO:448的LCDR2和(f)SEQ ID NO:449的LCDR3的轻链可变区；
(xxvi)含有(a)SEQ ID NO:454的HCDR1、(b)SEQ ID NO:455的HCDR2、(c)SEQ IDNO:456的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:461的LCDR1、(e)SEQ ID NO:462的LCDR2和(f)SEQ ID NO:463的LCDR3的轻链可变区；
(xxvii)含有(a)SEQ ID NO:468的HCDR1、(b)SEQ ID NO:469的HCDR2、(c)SEQ IDNO:470的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:475的LCDR1、(e)SEQ ID NO:476的LCDR2和(f)SEQ ID NO:477的LCDR3的轻链可变区；
(xxviii)含有(a)SEQ ID NO:482的HCDR1、(b)SEQ ID NO:483的HCDR2、(c)SEQ IDNO:484的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:489的LCDR1、(e)SEQ ID NO:490的LCDR2和(f)SEQ ID NO:491的LCDR3的轻链可变区。
抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)含有(a)SEQ ID NO:508的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:509的HCDR2、(c)SEQ ID NO:510的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:511的LCDR1、(e)SEQ ID NO:512的LCDR2和(f)SEQ ID NO:513的LCDR3的轻链可变区；
(ii)含有(a)SEQ ID NO:514的HCDR1、(b)SEQ ID NO:515的HCDR2、(c)SEQ ID NO:516的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:517的LCDR1、(e)SEQ ID NO:518的LCDR2和(f)SEQ ID NO:519的LCDR3的轻链可变区；
(iii)含有(a)SEQ ID NO:520的HCDR1、(b)SEQ ID NO:521的HCDR2、(c)SEQ IDNO:522的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:523的LCDR1、(e)SEQ ID NO:524的LCDR2和(f)SEQ ID NO:525的LCDR3的轻链可变区；
(iv)含有(a)SEQ ID NO:526的HCDR1、(b)SEQ ID NO:527的HCDR2、(c)SEQ ID NO:528的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:529的LCDR1、(e)SEQ ID NO:530的LCDR2和(f)SEQ ID NO:531的LCDR3的轻链可变区；
(v)含有(a)SEQ ID NO:532的HCDR1、(b)SEQ ID NO:533的HCDR2、(c)SEQ ID NO:534的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:535的LCDR1、(e)SEQ ID NO:536的LCDR2和(f)SEQ ID NO:537的LCDR3的轻链可变区；
(vi)含有(a)SEQ ID NO:538的HCDR1、(b)SEQ ID NO:539的HCDR2、(c)SEQ ID NO:540的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:541的LCDR1、(e)SEQ ID NO:542的LCDR2和(f)SEQ ID NO:543的LCDR3的轻链可变区。
该抗体，其中用表2的另一抗VP1抗体的相应CDR的相应残基取代CDR内的至少一个氨基酸。
该抗体，其中修饰、缺失或取代CDR内的一个或两个氨基酸。
该抗体，其在可变重链区或可变轻链区内保持至少90％、9％1、92％、93％、94％、95％、96％、9％7、98％或99％同一性。
该抗体，其包含表3中的修饰。
该抗体，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人改造抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
该抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:12的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:22的轻链可变区(VL)；
(ii)含有SEQ ID NO:32的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的轻链可变区(VL)；
(iii)含有SEQ ID NO:52的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:62的轻链可变区(VL)；
(iv)含有SEQ ID NO:72的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:82的轻链可变区(VL)；
(v)含有SEQ ID NO:92的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:102的轻链可变区(VL)；
(vi)含有SEQ ID NO:112的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:122的轻链可变区(VL)；
(vii)含有SEQ ID NO:132的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:142的轻链可变区(VL)；
(viii)含有SEQ ID NO:152的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:162的轻链可变区(VL)；
(ix)含有SEQ ID NO:172的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:182的轻链可变区(VL)；
(x)含有SEQ ID NO:192的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:202的轻链可变区(VL)；
(xi)含有SEQ ID NO:212的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:222的轻链可变区(VL)；
(xii)含有SEQ ID NO:232的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:242的轻链可变区(VL)；
(xiii)含有SEQ ID NO:252的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:262的轻链可变区(VL)；
(xiv)含有SEQ ID NO:272的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:282的轻链可变区(VL)；
(xv)含有SEQ ID NO:292的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:302的轻链可变区(VL)；
(xvi)含有SEQ ID NO:312的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:320的轻链可变区(VL)；
(xvii)含有SEQ ID NO:328的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:338的轻链可变区(VL)；
(xviii)含有SEQ ID NO:348的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:355的轻链可变区(VL)；
(xix)含有SEQ ID NO:362的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:369的轻链可变区(VL)；
(xx)含有SEQ ID NO:376的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:383的轻链可变区(VL)；
(xxi)含有SEQ ID NO:390的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:397的轻链可变区(VL)；
(xxii)含有SEQ ID NO:404的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:411轻链可变区(VL)；
(xxiii)含有SEQ ID NO:418的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:425的轻链可变区(VL)；
(xxiv)含有SEQ ID NO:432的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:439的轻链可变区(VL)；
(xxv)含有SEQ ID NO:446的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:453的轻链可变区(VL)；
(xxvi)含有SEQ ID NO:460的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:467的轻链可变区(VL)；
(xxvii)含有SEQ ID NO:474的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:481的轻链可变区(VL)；或
(xxviii)含有SEQ ID NO:488的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:495的轻链可变区(VL)。
该抗体，其在可变轻链区或可变重链区保持至少90％、9％1、92％、93％、94％、95％、96％、9％7、98％或99％同一性。
该抗体，其中修饰、缺失或取代可变轻链区或可变重链区内的一个、两个、三个、四个或五个但少于10个氨基酸。
该抗体，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人改造抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
前述实施方案中任一个的抗体，其中抗体或其片段糖基化减少或无糖基化或低岩藻糖基化。
组合物，其包含前述实施方案中任一个的多种抗体或抗原结合片段，其中组合物中至少0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％或更多的抗体具有α2,3连接的唾液酸残基，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)含有(a)SEQ ID NO:6的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:7的HCDR2、(c)SEQ ID NO:8的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3的轻链可变区；
(ii)含有(a)SEQ ID NO:26的HCDR1、(b)SEQ ID NO:27的HCDR2、(c)SEQ ID NO:28的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:36的LCDR1、(e)SEQ ID NO:37的LCDR2和(f)SEQ ID NO:38的LCDR3的轻链可变区；
(iii)含有(a)SEQ ID NO:46的HCDR1、(b)SEQ ID NO:47的HCDR2、(c)SEQ ID NO:48的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:56的LCDR1、(e)SEQ ID NO:57的LCDR2和(f)SEQ ID NO:58的LCDR3的轻链可变区；
(iv)含有(a)SEQ ID NO:66的HCDR1、(b)SEQ ID NO:67的HCDR2、(c)SEQ ID NO:68的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:76的LCDR1、(e)SEQ ID NO:77的LCDR2和(f)SEQ ID NO:78的LCDR3的轻链可变区；
(v)含有(a)SEQ ID NO:86的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:96的LCDR1、(e)SEQ ID NO:97的LCDR2和(f)SEQ ID NO:98的LCDR3的轻链可变区；
(vi)含有(a)SEQ ID NO:106的HCDR1、(b)SEQ ID NO:107的HCDR2、(c)SEQ ID NO:108的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:116的LCDR1、(e)SEQ ID NO:117的LCDR2和(f)SEQ ID NO:118的LCDR3的轻链可变区；
(vii)含有(a)SEQ ID NO:126的HCDR1、(b)SEQ ID NO:127的HCDR2、(c)SEQ IDNO:128的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:136的LCDR1、(e)SEQ ID NO:137的LCDR2和(f)SEQ ID NO:138的LCDR3的轻链可变区；
(viii)含有(a)SEQ ID NO:146的HCDR1、(b)SEQ ID NO:147的HCDR2、(c)SEQ IDNO:148的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:156的LCDR1、(e)SEQ ID NO:157的LCDR2和(f)SEQ ID NO:158的LCDR3的轻链可变区；
(ix)含有(a)SEQ ID NO:166的HCDR1、(b)SEQ ID NO:167的HCDR2、(c)SEQ ID NO:168的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:176的LCDR1、(e)SEQ ID NO:177的LCDR2和(f)SEQ ID NO:178的LCDR3的轻链可变区；
(x)含有(a)SEQ ID NO:186的HCDR1、(b)SEQ ID NO:187的HCDR2、(c)SEQ ID NO:188的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ ID NO:197的LCDR2和(f)SEQ ID NO:198的LCDR3的轻链可变区；
(xi)含有(a)SEQ ID NO:206的HCDR1、(b)SEQ ID NO:207的HCDR2、(c)SEQ ID NO:208的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:216的LCDR1、(e)SEQ ID NO:217的LCDR2和(f)SEQ ID NO:218的LCDR3的轻链可变区；
(xii)含有(a)SEQ ID NO:226的HCDR1、(b)SEQ ID NO:227的HCDR2、(c)SEQ IDNO:228的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:236的LCDR1、(e)SEQ ID NO:237的LCDR2和(f)SEQ ID NO:238的LCDR3的轻链可变区；
(xiii)含有(a)SEQ ID NO:246的HCDR1、(b)SEQ ID NO:247的HCDR2、(c)SEQ IDNO:248的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:256的LCDR1、(e)SEQ ID NO:257的LCDR2和(f)SEQ ID NO:258的LCDR3的轻链可变区；
(xiv)含有(a)SEQ ID NO:266的HCDR1、(b)SEQ ID NO:267的HCDR2、(c)SEQ IDNO:268的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:276的LCDR1、(e)SEQ ID NO:277的LCDR2和(f)SEQ ID NO:278的LCDR3的轻链可变区；
(xv)含有(a)SEQ ID NO:286的HCDR1、(b)SEQ ID NO:287的HCDR2、(c)SEQ ID NO:288的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:296的LCDR1、(e)SEQ ID NO:297的LCDR2和(f)SEQ ID NO:298的LCDR3的轻链可变区；
(xvi)含有(a)SEQ ID NO:306的HCDR1、(b)SEQ ID NO:307的HCDR2、(c)SEQ IDNO:308的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:314的LCDR1、(e)SEQ ID NO:315的LCDR2和(f)SEQ ID NO:316的LCDR3的轻链可变区；
(xvii)含有(a)SEQ ID NO:322的HCDR1、(b)SEQ ID NO:323的HCDR2、(c)SEQ IDNO:324的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:332的LCDR1、(e)SEQ ID NO:333的LCDR2和(f)SEQ ID NO:334的LCDR3的轻链可变区；
(xviii)含有(a)SEQ ID NO:342的HCDR1、(b)SEQ ID NO:343的HCDR2、(c)SEQ IDNO:344的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:349的LCDR1、(e)SEQ ID NO:350的LCDR2和(f)SEQ ID NO:351的LCDR3的轻链可变区；
(xix)含有(a)SEQ ID NO:356的HCDR1、(b)SEQ ID NO:357的HCDR2、(c)SEQ IDNO:358的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:363的LCDR1、(e)SEQ ID NO:364的LCDR2和(f)SEQ ID NO:365的LCDR3的轻链可变区；
(xx)含有(a)SEQ ID NO:370的HCDR1、(b)SEQ ID NO:371的HCDR2、(c)SEQ ID NO:372的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:377的LCDR1、(e)SEQ ID NO:378的LCDR2和(f)SEQ ID NO:379的LCDR3的轻链可变区；
(xxi)含有(a)SEQ ID NO:384的HCDR1、(b)SEQ ID NO:385的HCDR2、(c)SEQ IDNO:386的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:391的LCDR1、(e)SEQ ID NO:392的LCDR2和(f)SEQ ID NO:393的LCDR3的轻链可变区；
(xxii)含有(a)SEQ ID NO:398的HCDR1、(b)SEQ ID NO:399的HCDR2、(c)SEQ IDNO:400的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:405的LCDR1、(e)SEQ ID NO:406的LCDR2和(f)SEQ ID NO:407的LCDR3的轻链可变区；
(xxiii)含有(a)SEQ ID NO:412的HCDR1、(b)SEQ ID NO:413的HCDR2、(c)SEQ IDNO:414的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:419的LCDR1、(e)SEQ ID NO:420的LCDR2和(f)SEQ ID NO:421的LCDR3的轻链可变区；
(xxiv)含有(a)SEQ ID NO:426的HCDR1、(b)SEQ ID NO:427的HCDR2、(c)SEQ IDNO:428的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:433的LCDR1、(e)SEQ ID NO:434的LCDR2和(f)SEQ ID NO:435的LCDR3的轻链可变区；
(xxv)含有(a)SEQ ID NO:440的HCDR1、(b)SEQ ID NO:441的HCDR2、(c)SEQ IDNO:442的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:447的LCDR1、(e)SEQ ID NO:448的LCDR2和(f)SEQ ID NO:449的LCDR3的轻链可变区；
(xxvi)含有(a)SEQ ID NO:454的HCDR1、(b)SEQ ID NO:455的HCDR2、(c)SEQ IDNO:456的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:461的LCDR1、(e)SEQ ID NO:462的LCDR2和(f)SEQ ID NO:463的LCDR3的轻链可变区；
(xxvii)含有(a)SEQ ID NO:468的HCDR1、(b)SEQ ID NO:469的HCDR2、(c)SEQ IDNO:470的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:475的LCDR1、(e)SEQ ID NO:476的LCDR2和(f)SEQ ID NO:477的LCDR3的轻链可变区；
(xxviii)含有(a)SEQ ID NO:482的HCDR1、(b)SEQ ID NO:483的HCDR2、(c)SEQ IDNO:484的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:489的LCDR1、(e)SEQ ID NO:490的LCDR2和(f)SEQ ID NO:491的LCDR3的轻链可变区。
组合物，其包含前述实施方案中任一个的多种抗体或抗原结合片段，其中没有一种抗体包含等分GlcNAc。
药物组合物，其包含前述实施方案中任一个的抗体或其片段，其中将组合物制备为冻干物。
药物组合物，其包含前述实施方案中任一个的抗体或其片段和可药用载体。在一个实施方案中，该载体是组氨酸缓冲液。在一个实施方案中，该药物组合物包含糖(例如蔗糖)。
中和BK病毒或JC病毒感染的方法，其包括对有需要的患者通过注射或输注施用有效量的抗体或药物组合物。该方法，其中抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I和BKV血清型II。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I和BKV血清型III。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I和BKV血清型IV。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型II和BKV血清型III。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型II和BKV血清型IV。在另一实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I和JCV。在具体实施方案中，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I、II、III和IV。此外，该抗体或其抗原结合片段中和BKV血清型I、II、III和IV及JCV。在优选实施方案中，抗VP1抗体中和全部四种BKV血清型(I-IV)的感染，这些抗VP1抗体尤其包括P8D11、P8D11的修饰和EBB-C1975-B5。
治疗BK病毒或JC病毒相关障碍或降低BK病毒或JC病毒相关障碍的可能性的方法，其包括对有需要的患者通过注射或输注施用有效量的抗体或药物组合物，其中该障碍是：肾病、BKVAN、出血性膀胱炎(HC)、进行性多灶性白质脑病(PML)、颗粒细胞神经元病(GCN)、间质性肾病(interstitial kidney disease)、输尿管狭窄、脉管炎、结肠炎、视网膜炎、脑膜炎和免疫重建炎性综合征(immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS)。
该方法，其中在注射或输注之前重构抗体或组合物。
该方法，其中将抗体或药物组合物与另一治疗剂组合施用。
该方法，其中治疗剂是免疫抑制剂。
该方法，其中免疫抑制剂是单磷酸脱氢酶抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂。
该方法，其中免疫抑制剂是麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)、麦考酚酸钠(mycophenolate sodium)、硫唑嘌呤(azathioprine)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)或环孢素(cyclosporine)。
该方法，其中治疗剂是另一抗VP1抗体。
前述实施方案中任一个的抗体或其片段，其用作药物。
该抗体或其片段或药物组合物，其用于中和BK病毒或JC病毒感染。
该抗体或其片段或药物组合物，其用于治疗以下或降低以下的可能性：肾病、BKVAN、出血性膀胱炎(HC)、进行性多灶性白质脑病(PML)、颗粒细胞神经元病(GCN)、间质性肾病、输尿管狭窄、脉管炎、结肠炎、视网膜炎、脑膜炎和免疫重建炎性综合征(IRIS)。
与另一治疗剂组合施用的该抗体或其片段的用途。
该抗体或其片段的用途，其中治疗剂是免疫抑制剂。
该抗体或其片段的用途，其中免疫抑制剂是单磷酸脱氢酶抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂。
该抗体或其片段的用途，其中免疫抑制剂是麦考酚酸酯(MMF)、麦考酚酸钠、硫唑嘌呤、他克莫司、西罗莫司或环孢素。
核酸，其编码前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段。
载体，其包含该核酸。
宿主细胞，其包含该载体。
用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养该宿主细胞，并从培养物回收抗体。
诊断试剂，其包含标记的该抗体或其抗原结合片段。
诊断试剂，其中该标记选自放射性标记、荧光团、生色团、显像剂和金属离子。
定义
除非另有说明，本文中所用的以下术语和短语具有以下含义：
本文所用的术语“抗体”指能够非共价、可逆和以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白家族多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含CL一个结构域。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变性区域，分散的更保守的称为构架区(FR)的区域。每个VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗特应型(抗Id)抗体(包括例如抗本公开的抗体的抗Id抗体)。抗体可以属于任意同种型/种类(例如(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
“互补性决定区”或“互补决定区(“CDR”)”可互换地指VL和VH的高变区。CDR是包含对这种靶蛋白的特异性的抗体链的靶蛋白结合部位。每个人VL或VH中有三个CDR(CDR1-3，从N端顺次编号)，构成可变结构域的约15-20％。CDR可通过其区域和顺序来提及。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”都指重链可变区的第一CDR。CDR与靶蛋白的表位结构互补，因此直接负责结合特异性。VL或VH的其余小段序列(所谓的构架区)在氨基酸序列上显示较小变异(Kuby,Immunology,第4版,第4章.W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。
CDR和构架区的位置可以用多种本领域公知的定义确定，例如Kabat,Chothia和AbM(参见例如Johnson等,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原结合部位的定义还描述于以下中：Ruiz等,Nucleic Acids Res.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268–9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.,203:121–153(1991)；和Rees等,In Sternberg M.J.E.(编辑),ProteinStructure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141–172(1996).)。在Kabat和Chothia组合编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于是Kabat CDR、Chothia CDR或二者的部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HC CDR1)、50-65(HC CDR2)和95-102(HC CDR3)，及VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LC CDR1)、50-56(LC CDR2)和89-97(LC CDR3)。
轻链和重链都分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”用在功能上。在这方面，应理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)恒定区赋予重要的生物学特性，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。通常，恒定区结构域编号随着它们离抗原结合部位或抗体氨基端越远而增大。N端是可变结构域，C端是恒定结构域；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端结构域。
本文所用的术语“抗原结合片段”指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)，二硫键连接Fv(sdFv)，Fab片段，F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；及分离的互补决定区(CDR)或抗体的其他表位结合片段。
此外，虽然Fv片段的VL和VH两个结构域由分开的基因编码，但可以使用重组方法，通过使得可将它们制成其中VL和VH区配对形成单价分子的单条蛋白质链的合成接头来将它们连接(称为单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等,Science 242:423-426,1988；andHuston等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。这类单链抗体也旨在涵盖在术语“抗原结合片段”之内。用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并以与完整抗体相同的方式针对效用筛选这些片段。
抗原结合片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、纳米抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。可将抗原结合片段移植入基于诸如III型纤连蛋白(Fn3)的多肽的支架(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该串联Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,Protein Eng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指多肽，包括具有基本相同的氨基酸序列或源自相同遗传来源的抗体和抗体片段。此术语还包括单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位显示单结合特异性和亲和力。
本文所用的术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中构架和CDR区都源自人来源的序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自这类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或包含例如Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)中所述的源自人构架序列分析的共有构架序列的抗体。
本公开的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变、或保守取代以促进稳定性或制备而引入的突变)。
本文所用的术语“识别”指找到并与其表位相互作用(例如结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是线性表位还是构象表位。术语“表位”指本公开的抗体或抗原结合片段与之特异性结合的抗原上的部位。表位可以形成自连续氨基酸或通过蛋白质的三级结构折叠而并置在一起的非连续氨基酸二者。形成自连续氨基酸的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保留，而通过三级结构折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括本领域的技术，例如x射线晶体分析法和二维核磁共振(参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,66卷,G.E.Morris编辑(1996))。“互补位”是抗体识别抗原表位的部分。
在描述抗原(例如蛋白质)和抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂间相互作用的背景中，短语“特异性结合”或“选择性结合”指确定抗原在蛋白质和其它生物制品的异质群体中(例如生物样品，例如血液、血清、血浆或组织样品中)的存在的结合反应。因此，在某些指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合是背景的至少两倍，且不以显著的量实质性结合样品中存在的其他抗原。在一方面，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合是背景的至少十(10)倍，且不以显著的量实质性结合样品中存在的其他抗原。在这类条件下与抗体或结合剂特异性结合可以需要已针对其对特定蛋白质的特异性选择过抗体或结合剂。根据需要或适当时，此选择可通过扣除与来自其他物种(例如小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体而达到。备选地，在一些方面，选择与某些所希望的分子交叉反应的抗体或抗体片段。
本文所用的术语“亲和力”指抗体和抗原之间在单个抗原部位上相互作用的强度。在每个抗原部位中，抗体“臂”的可变区与抗原在许多位点上通过弱非共价力相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。但是，特异性结合一种抗原的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞物质和/或化学药品。
术语“对应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其他已知的可变区氨基酸序列相比，该人可变区氨基酸序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的测定氨基酸序列同一性。对应的人种系序列还可以指与所有其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。对应的人种系序列可以仅是构架区，仅是互补决定区，构架和互补决定区，可变区段(如上文所定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。序列同一性可以用本文所述方法确定，例如，用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一比对算法比对两个序列。对应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
可以用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998),for a description of immunoassayformats and conditions that can be used to determine specificimmunoreactivity)。通常，特异性或选择性结合反应将产生至少两倍于背景信号和更通常至少10至100倍于背景的信号。
术语“平衡解离常数(KD，M)”指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。平衡解离常数可以用本领域已知的任何方法测量。本公开的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”指对患者施用的给定量的药物的全身利用率(例如血液/血浆水平)。生物利用率是指示从所施用的剂型到达体循环的药物的时间(速率)和总量(程度)二者的测量结果的绝对术语。
本文所用的术语“基本由…组成”指包含在方法或组合物中的活性药物成分以及对该方法或组合物的预期目的无活性的任何赋形剂的属或种类。在一些方面，短语“基本由…组成”明确排除了除本公开的抗VP1抗体之外的一种或多种附加活性剂的纳入。在一些方面，短语“基本由…组成”明确排除了除本公开的抗VP1抗体和第二共同施用的活性剂之外的一种或多种附加活性剂的纳入。
术语“氨基酸”指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即结合氢的α-碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化合物。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者在该核酸不编码氨基酸序列时，则指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每一位置上，可将密码子改变成所述任意对应的密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每一核酸序列也描述了该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可修饰核酸中的每个密码子(除了AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子))，以产生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每个沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各取代、缺失或添加，其导致用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领域公知。此类保守修饰变体附加至而不排斥多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
本文所用的术语“优化的”意指已用生产细胞或生物中优选的密码子改变以编码氨基酸序列的核苷酸序列，该生产细胞或生物通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。改造优化的核苷酸序列，以完全或尽可能多地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。
在两条或多条核酸或多肽序列的背景中，术语“百分比同一的”或“百分比同一性”指两条或多条序列或子序列相同的程度。如果两条序列在所比较的区域具有相同的氨基酸或核苷酸序列，则它们是“同一的”。在为了比较窗内或指定区域内的最大对应而用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目检测量来比较和比对时，如果两条序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在特定区域内，或在不指定时，在全长序列内60％同一性，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两条序列“基本相同”。可选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度为100至500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定备选参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
本文所用的“比较窗口”包括参考选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的任一数目的相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数目相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域公知。例如可通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过手工比对和目检(参见例如Brent等,Current Protocols in Molecular Biology,2003)来进行序列最佳比对用于比较。
适合用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字串来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，该短字串匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字串得分阈值(Altschul等,上文)。这些初始邻近字串命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSP。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字串命中。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是大于0)和N(错配残基的罚分；总是小于0)计算累积得分。对于氨基酸序列，用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最高达到值跌落X量、累积得分由于一个或多个负得分残基比对的累积而到达零或以下、或到达任一序列的末端时，停止字串命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序用字长3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2、更优选低于约0.01、最优选低于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
也可使用已经整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法，使用PAM120权重余数表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
除了上文指出的百分比序列同一性外，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是，第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体有免疫交叉反应，如下文所述。因此，例如，在两条肽仅因保守取代而不同时，多肽通常与第二条多肽基本相同。两条核酸序列基本相同的另一指示是，两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两条核酸序列基本相同的又一指示是，可用相同的引物来扩增该序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性质，并且其以与参考核苷酸相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有说明，特定核酸序列也暗含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可通过产生这样的序列来达到简并密码子取代，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer等,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
在核酸的背景中，术语“有效连接”指两个或多个多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，它指转录调节序列与所转录的序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其他表达系统中的转录，则它与编码序列有效连接。通常，与所转录的序列有效连接的启动子转录调节序列与所转录的序列在物理上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要与它们增强其转录的编码序列在物理上邻近或位于其附近。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，特定多肽序列也暗含其保守修饰的变体。
术语“个体”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“个体”在本文中可互换使用。
术语“BKV”或“BK病毒”指多瘤病毒科(Polyomaviridae)Orthopolyomavirus的成员。多瘤病毒是二十面体、无包膜、双链DNA病毒，基因组约有5,000碱基对。它们直径约为40-45nM(Bennett等,Microbes and Infection.2012:14(9):672-683)。
“JCV”或“JC病毒”指多瘤病毒科Orthopolyomavirus的成员。JCV与BKV相关，也是二十面体、无包膜、双链DNA病毒，基因组约有5,000碱基对。它们直径约为40-45nM(Johne等,Arch.Virol.2011；156(9):1627-1634)。
术语“BKV肾病”或“BKV相关肾病”或“BKVAN”指BKV裂解性感染引起的炎性间质性肾病，其特征在于病毒性致细胞病变变化(cytopathogenic change)和病毒基因表达，主要在肾小管上皮中。
术语“VP1”指主要多瘤病毒壳体亚单位蛋白质。“VP1五聚体”由五个VP1单体组成。
表1-VP1序列
“病毒样颗粒”或“VLP”是VP1五聚体组装为病毒壳体。VLP由72个VP1五聚体组成。VLP结构非常类似于实际病毒，但缺乏次要壳体蛋白质(VP2和VP3)以及病毒DNA基因组，因此无感染性。VLP是有用的，因为病毒表位以类似于实际病毒的构象呈现。
“IC50(半数最大抑制浓度)”指具体抗体诱导基线对照和最大可能信号之间一半信号(50％)的浓度。例如，IC50是VP1抗原上50％可用结合部位被占据时的抗体浓度。
“EC50(半数最大有效浓度)”指具体抗体在特定暴露或处理时间之后诱导基线对照和最大可能效应之间一半反应(50％)的浓度。例如，EC50是中和50％病毒感染时的抗体浓度。
“EC90”指具体抗体在特定暴露或处理时间之后诱导对应于90％最大可能效应的浓度。例如，EC90是中和90％病毒感染时的抗体浓度。
“中和”指通过病毒基因表达的缺乏证明的病毒感染宿主细胞的抑制。不受限于任何一种理论，具体抗体中和的机制可包括阻断病毒壳体蛋白质与细胞表面受体的相互作用，或在病毒基因组地送至宿主细胞细胞核之前破坏进入和运输过程的任意阶段。
本文所用的术语“治疗”任意疾病或障碍在一方面指改善疾病或障碍(即减慢或阻断或减少疾病或至少一种其临床症状的发展)。在另一方面，“治疗”指缓解或改善至少一个身体参数，包括患者可察觉不到的那些。还在另一方面，“治疗”指在身体上(例如稳定可察觉到的症状)、生理上(例如稳定物理参数)或在身体和生理上调节疾病或障碍。
短语“降低可能性”指推迟疾病、感染或障碍的起始或发展或进展。
术语“治疗可接受量”或“治疗有效量”可互换地指足以达到所希望的结果(即减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些方面，治疗可接受量不诱导或引起不希望的副作用。治疗可接受量可以这样确定，首先施用低剂量，然后逐渐提高剂量，直至达到所希望的效应。本公开的分子的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”分别可防止疾病症状(包括多瘤病毒感染相关症状)起始或导致疾病症状严重度降低。
术语“共同施用”指个体血液中同时存在两种活性剂。共同施用的活性剂可以同时或顺次递送。
附图简述
图1A-1D图示通过SET测定测量抗VP1抗体对BKV血清型I-IV的VP1五聚体的亲和力。
图2是抗VP1抗体对BKV血清型I-IV的VP1五聚体的SET亲和力值(KD)表格。
图3A-3E图示通过Biacore测量抗VP1抗体对BKV血清型I-IV的VP1五聚体或VLP的亲和力。
图4是通过ELISA测量的抗VP1抗体结合BKV血清型I VLP的图表。
图5是通过ELISA测量的抗VP1抗体结合BKV血清型IV VLP的图表。
图6是通过ELISA测量的抗VP1抗体结合BKV血清型IV VP1五聚体的图表。
图7是通过ELISA产生的抗VP1抗体结合BKV血清型I和IV的VLP或VP1五聚体的IC50值表格。
图8是通过ELISA测量的抗VP1抗体结合BKV血清型I VLP的图表。
图9是通过ELISA产生的抗VP1抗体结合BKV血清型I VLP的IC50值表格。
图10是通过ELISA测量的抗VP1抗体结合JC病毒VLP的图表。
图11是通过ELISA产生的抗VP1抗体结合JCV VLP的IC50值表格。
图12A-B显示两张印迹。上图(图12A)是Western印迹，证明抗VP1抗体与变性BKVVP1无结合。下图(图12B)是非变性BKV VP1五聚体的斑点杂交，证明抗VP1抗体与非变性VP1五聚体结合。
图13A-13F图示通过Biacore测定的抗VP1抗体与野生型BKV血清型I VP1五聚体的结合，但VP1中的点突变可破坏结合。
图14是总结在抗VP1抗体表位中鉴定的结合关键残基的表格。
图15是抗VP1抗体中和BKV血清型I感染的图表。
图16是抗VP1抗体中和BKV血清型II感染的图表。
图17是抗VP1抗体中和BKV血清型III感染的图表。
图18是抗VP1抗体中和BKV血清型IV感染的图表。
图19是总结抗VP1抗体对BKV血清型I-IV和JC病毒的中和活性(EC50和EC90)的表格。
图20是抗VP1抗体中和BKV血清型I、II和IV感染的图表。
图21是总结抗VP1抗体对BKV血清型I-IV的中和活性(EC50和EC90)的表格。
图22是抗VP1抗体中和BKV血清型I感染的图表。
图23是总结抗VP1抗体对BKV血清型I的中和活性(EC50和EC90)的表格。
图24是抗VP1抗体中和JCV感染的图表。
图25是抗VP1抗体中和JCV感染的图表。
图26是总结抗VP1抗体对JCV感染的中和活性(EC50和EC90)的表格。
图27是抗体P8D11对JC病毒VLP和包含点突变的VLP的亲和力的表格。
图28是结合于BKV VP1五聚体的P8D11 Fab的氘交换表位定位。
图29A是显示在通过丙氨酸扫描引入某些突变时EF环中的抗BKV抗体接触残基的表格。图29B-29C显示抗BKV抗体结合VP1中的野生型和突变残基的SPR图表。
图30是与BKV VP1五聚体复合的P8D11的X射线晶体结构。
图31A-B是P8D11如何接触VP1五聚体残基的图示。
发明详述
本公开提供结合并中和BKV的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)。具体而言，本公开涉及结合VP1蛋白质并通过这种结合中和病毒感染的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。此外，本公开提供具有希望的药代动力学特征和其他希望的属性，并因此可用于降低BK病毒相关肾病(例如BKVAN)可能性或治疗BK病毒相关肾病的抗体。本公开还提供包含该抗体的组合物，及制备和使用这类药物组合物来预防和治疗多瘤病毒感染和相关障碍的方法。
抗VP1抗体
本公开提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。本公开的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包括但不限于按下文实施例中所述分离的人单克隆抗体或其片段。
在某些方面，本公开提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252、272、292、312、328、348、362、376、390、404、418、432、446、460、474和488的VH结构域(表2)。本公开还提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有表2中所列VH CDR中任一个的氨基酸序列的VH CDR。在具体方面，本公开提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体包含(或备选地，由其组成)一个、两个、三个或多个具有表2中所列VH CDR中任一个的氨基酸序列的VH CDR。
本公开提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、320、338、355、369、383、397、411、425、439、453、467、481和495的VL结构域(表2)。本公开还提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有表2中所列VL CDR中任一个的氨基酸序列的VL CDR。具体而言，本公开提供特异性结合VP1的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)，该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含(或备选地，由其组成)一个、两个、三个或多个具有表2中所列VL CDR中任一个的氨基酸序列的VL CDR。
本公开的其他抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含已突变但在CDR区中与表2中所述序列中所示CDR区具有至少约60、70、80、90或95％同一性的氨基酸。在一些方面，它包括突变氨基酸序列，其中与表2中所述序列中所示的CDR区相比，在CDR区中突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
本公开还提供编码特异性结合VP1的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。这类核酸序列可以优化用于在哺乳动物细胞中表达。
表2：抗VP1抗体
本公开的其他抗体包括其中已突变氨基酸或编码氨基酸的核酸但与表2中所述序列具有至少60、70、80、90或95％同一性的那些抗体。在一些方面，它包括突变氨基酸序列，其中与表2中所述序列中所示的可变区相比，在可变区中突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸，但基本保持相同的治疗活性。
由于这些抗体中的每一种都可以结合VP1，可以“混合和匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)，以产生其他VP1结合抗体。可用本领域已知的结合测定(例如ELISA和实施例章节中所述的其他测定)测试这类“混合和匹配”的VP1结合抗体。在混合和匹配这些链时，应当用结构相似的VH序列替换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样，应当用结构相似的全长重链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列。同样，应当用结构相似的VL序列替换来自特定VH/VL配对的VL序列。同样，应当用结构相似的全长轻链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列。因此，在一方面，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO:12、32、52、72、92、112、132、152、172、192、212、232、252、272、292、312、328、348、362、376、390、404、418、432、446、460、474和488的氨基酸序列的重链可变区(表2)；包含选自SEQ ID NO:22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、320、338、355、369、383、397、411、425、439、453、467、481和495的氨基酸序列的轻链可变区(表2)；其中抗体特异性结合VP1。
在另一方面，本公开提供：(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含选自SEQ ID NO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、313和330的已优化用于在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长重链；包含选自SEQ ID NO:24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、321、340的已优化用于在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长轻链；或(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
在另一方面，本公开提供包含表2中所述重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的VP1结合抗体。该抗体的VH CDR1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、322、342、356、370、384、398、412、426、440、454、468和482中。该抗体的VH CDR2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、323、343、357、371、385、399、413、427、441、455、469和483中。该抗体的VH CDR3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、324、344、358、372、386、400、414、428、442、456、470和484中。该抗体的VL CDR1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、314、332、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475和489中。该抗体的VL CDR2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO 17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、315、333、350、364、378、392、406、420、434、448、462、476和490中。该抗体的VL CDR3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、316、334、351、365、379、393、407、421、435、449、463、477和491中。
鉴于这些抗体中的每一种都可以结合VP1，且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，可以“混合和匹配”VH CDR1、2和3序列及VL CDR1、2和3序列(即可以混合和匹配来自不同抗体的CDR，但每种抗体必须包含VH CDR1、2和3及VL CDR1、2和3)，以产生本发明的其他VP1结合分子。可用本领域已知的结合测定和实施例中所述的那些(例如ELISA)测试这类“混合和匹配”的VP1结合抗体。在混合和匹配VH CDR序列时，应当用结构相似的CDR序列替换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样，在混合和匹配VL CDR序列时，应当用结构相似的CDR序列替换来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对普通技术人员而言，显而易见的是，可以通过用来自本文所示的本公开的单克隆抗体的CDR序列的结构相似的序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
因此，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其包含：含有选自SEQ IDNO:6、26、46、66、86、106、126、146、166、186、206、226、246、266、286、306、322、342、356、370、384、398、412、426、440、454、468和482的氨基酸序列的重链CDR1；含有选自SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147、167、187、207、227、247、267、287、307、323、343、357、371、385、399、413、427、441、455、469和483的氨基酸序列的重链CDR2；含有选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、324、344、358、372、386、400、414、428、442、456、470和484的氨基酸序列的重链CDR3；含有选自SEQ ID NO:16、36、56、76、96、116、136、156、176、196、216、236、256、276、296、314、332、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475和489的氨基酸序列的轻链CDR1；含有选自SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237、257、277、297、315、333、350、364、378、392、406、420、434、448、462、476和490的氨基酸序列的轻链CDR2；含有选自SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238、258、278、298、316、334、351、365、379、393、407、421、435、449、463、477和491的氨基酸序列的轻链CDR3；其中抗体特异性结合VP1。
在某些方面，特异性结合VP1的抗体是表2中所述的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。
1.表位和结合相同表位的抗体的鉴定
本公开提供结合VP1表位的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。在某些方面，该抗体和抗体片段可以结合全部四种BKV血清型和/或JCV内的相同表位。
本公开还提供结合与表2中所述抗VP1抗体相同的表位的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。因此，可以根据其在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如以统计显著的方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定其他抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。测试抗体抑制本公开的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)与VP1(例如人BKV或JCV VP1)结合的能力证明该测试抗体可以与该抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)竞争结合VP1；根据非限制性理论，这种抗体可以结合与它与之竞争的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)相同或相关(例如结构相似或空间接近)的VP1上的表位。在某个方面，结合与本公开的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)相同的VP1上的表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。这类人或人源化单克隆抗体可以按本文所述制备和分离。
2.Fc区构架的其他改变
本公开公开具体的抗VP1抗体。这些抗体包括修饰的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含对VH和/或VL内构架残基的修饰，例如以改善抗体的特性。通常，进行这类构架修饰来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体而言，已经经历了体细胞突变的抗体含有不同于该抗体所衍生自的种系序列的构架残基。可通过将抗体构架序列与该抗体所衍生自的种系序列比较来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型，可以例如通过定点诱变来将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变的”抗体也旨在为本发明所涵盖。
另一类构架修饰涉及突变构架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号2003/0153043中。
除在构架或CDR区内进行修饰外或作为备选，可改造抗体以在Fc区内包含修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可化学修饰(例如，一个或更多个化学部分可附着到抗体上)或修饰抗体以改变其糖基化，同样以改变抗体的一种或多种功能特性。下文中进一步详细描述了这些方面中的每一个。
在一方面，修饰CH1的铰链区，使得改变(例如增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如以便于轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一方面，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更具体而言，在Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。Ward等的美国专利号6,165,745中进一步详细描述了这种方法。
还在其他方面，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变对其亲和力的效应子配体可以是例如，Fc受体或补体C1组分。例如Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中描述了这种方法。
在另一方面，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合/或降低或消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。例如Idusogie等的美国专利号6,194,551中描述了这种方法。
在另一方面，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。例如Bodmer等的PCT公开WO 94/29351中描述了这种方法。在具体方面，用IgG1亚类和κ同种型的异型氨基酸残基替换本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸。异型氨基酸残基还包括但不限于Jefferis等,MAbs.1:332-338(2009)所述的IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区。
还在另一方面，修饰Fc区以提高抗体介导依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来提高抗体对Fcγ受体的亲和力。例如Presta的PCT公开WO00/42072中描述了这种方法。此外，已定位了人IgG1上的FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn结合部位，并描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
还在另一方面，改变抗体的糖基化。例如，可制备去糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化，例如以提高抗体对“抗原”的亲和力。可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类糖类修饰。例如，可进行导致一个或多个可变区构架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，由此消除该位点处的糖基化。这种去糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。例如Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中描述了这种方法。
此外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式提高抗体的ADCC能力。例如通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现此类糖类修饰。在本领域中已描述了具有改变的糖基化机制的细胞，该细胞可用作在其中表达重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了具有功能上破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)-连接的糖类上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(还参见Shields等,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了这样的细胞系，该细胞系经改造以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在该改造的细胞系中表达的抗体显示增加的等分GlcNAc结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还参见Umana等,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
在另一方面，修饰抗体以增加其生物半衰期。可使用多种方法。例如，如Ward的美国专利号6,277,375中所述，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F。备选地，如Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述，为了增加生物半衰期，可在CH1或CL区内改变抗体以含有从IgG Fc区CH2结构域的两个环取得的救助受体结合表位。
为了使抗体ADCC活性最小化，Fc区中的特定突变产生与效应细胞具有最小相互作用的“Fc沉默”抗体。通常，“IgG Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区通常定义为包含从C226位或从P230位至IgG抗体羧基端的氨基酸残基。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。Fc区的C端赖氨酸(残基K447)可以例如在产生或纯化抗体期间去除。
沉默效应子功能可以通过抗体Fc区中的突变获得，并已在本领域中描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.vol.20(6):685-691)；和D265A(Baudino等,2008,J.Immunol.181:6664-69)。还参见Heusser等,WO2012065950。沉默Fc IgG1抗体的实例是在IgG1Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变的LALA突变体。沉默IgG1抗体的另一实例是DAPA(D265A、P329A)突变(US 6,737,056)。另一沉默IgG1抗体包含N297A突变，其产生去糖基化/无糖基化抗体。
Fc沉默抗体不产生或产生低的ADCC活性，意味着Fc沉默抗体显示低于50％特异性细胞裂解(低ADCC活性)或低于1％特异性细胞裂解(无ADCC活性)的ADCC活性。
3.抗VP1抗体的产生
抗VP1抗体及其抗体片段(例如抗原结合片段)可以通过本领域已知的任何方式产生，其包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶促消化，而全长单克隆抗体可以通过例如杂交瘤或重组产生来获得。重组表达可以来自本领域已知的任何适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本公开还提供编码本文所述抗体的多核苷酸，例如编码包含本文所述互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233、253、273和293的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的多核苷酸与选自SEQ ID NO:23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283和303的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些方面，编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275和295的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225、245、265、285和305的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本公开的多核苷酸可以仅编码抗VP1抗体的可变区序列。它们也可以编码抗体的可变区和恒定区二者。一些多核苷酸序列编码包含所示例的抗VP1抗体之一的重链和轻链二者的可变区的多肽。一些其他多核苷酸编码分别与小鼠抗体之一的重链和轻链可变区同一的两个多肽区段。
多核苷酸序列可通过从头固相DNA合成或通过编码抗VP1抗体或其结合片段的已有序列(例如下文实施例中所述的序列)的PCR诱变来产生。可通过本领域已知的方法实现核酸的直接化学合成，如Narang等,Meth.Enzymol.68:90,1979的磷酸三酯法；Brown等,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持物法。可按例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),FreemanPress,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等(编辑),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等,PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述进行通过PCR向多核苷酸序列中引入突变。
本公开还提供用于产生上述抗VP1抗体的表达载体和宿主细胞。可用多种表达载体来表达编码抗VP1抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如，Harrington等,NatGenet 15:345,1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗VP1多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体及本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参见Brent等,上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择依赖于将在其中表达该载体的预期宿主细胞。通常，该表达载体含有有效连接编码抗VP1抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些方面，用诱导型启动子来防止插入序列除了在诱导条件下之外的表达。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条件下扩大转化生物的培养物，而不偏向编码序列的群体，该编码序列的表达产物能更好地被宿主细胞耐受。除启动子外，还可需要或希望将其他调节元件用于抗VP1抗体链或片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外，可通过包括适合于所使用的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见例如，Scharf等,ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体也可提供分泌信号序列位置，以与所插入的抗VP1抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更经常地，在包含入载体之前，将插入的抗VP1抗体序列与信号序列连接。待用于接受编码抗VP1抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人恒定区。
用于包含和表达抗VP1抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌(E.coli)是用于克隆和表达本公开的多核苷酸的一种原核宿主。适于使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与该宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任意数目的多种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自λ噬菌体的启动子系统。该启动子通常可选地与操纵子序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始并完成转录和翻译。其他微生物，如酵母也可用于表达抗VP1多肽。也可将昆虫细胞与杆状病毒载体组合使用。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本公开的抗VP1多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或包含外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任意正常死亡的或正常或非正常永生的动物细胞或人细胞。例如，已经发展了能够分泌完整免疫球蛋白的大量适宜的宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。例如Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中广泛讨论了哺乳动物组织细胞培养物在表达多肽中的用途。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或衍生自哺乳动物病毒的启动子。适宜的启动子可以是组成型、细胞类型特异型、阶段特异型和/或可调整或可调节型。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(一般参见Sambrook等，上文)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物射弹方法、病毒颗粒、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、DNA的活性剂增强摄取和离体转导。为了长期、高产率产生重组蛋白质，通常将希望稳定表达。例如，可用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体来制备稳定表达抗VP1抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达所引入的序列的细胞在选择性培养基中生长。可以用适于该细胞类型的组织培养技术增殖具有抗性的稳定转染的细胞。
治疗和诊断用途
本公开的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)用于多种应用，包括但不限于多瘤病毒感染和疾病。在某些方面，该抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)用于中和BKV或JCV感染和预防或治疗BK病毒肾病，例如BKVAN。使用的方法可以是体外、离体或体内方法。
在一方面，该抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)用于检测BKV在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在一些方面，生物样品包含细胞或组织。在某些方面，这类组织包括相对于其他组织以更高水平表达BKV的正常组织和/或癌组织。
在一方面，本公开提供检测BKV在生物样品中的存在的方法。在某些方面，该方法包括使该生物样品在允许抗体与抗原结合的条件下与抗VP1抗体接触，并检测抗体和抗原之间是否形成复合物。该生物样品可以非限制性地包括尿或血样。
还包括诊断与BKV或JCV病毒的表达相关的障碍的方法。在某些方面，该方法包括使测试细胞与抗VP1抗体接触；通过检测抗VP1抗体与BK病毒的结合来测定测试细胞中BK病毒的表达水平(定量或定性)；将测试细胞中的感染水平与对照细胞(例如与测试细胞相同组织来源的正常细胞或非BK病毒感染细胞)中的BK病毒感染水平相比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中存在更高水平的BK病毒指示BK病毒感染相关障碍的存在。在某些方面，该测试细胞获自疑似患有BK病毒感染的个体。
在某些方面，诊断或检测的方法(如上文所述的那些)包括检测抗VP1抗体与BKV感染细胞的结合。用于检测抗VP1抗体与BKV感染细胞的结合的示例性测定时“FACS”测定。
某些其他方法可以用于检测抗VP1抗体的结合。这类方法包括但不限于本领域公知的抗原结合测定，如Western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心法”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学(HIC)。
在某些方面，标记抗VP1抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。
在某些方面，将抗VP1抗体固定在不溶性基质上。固定化需要将抗VP1抗体从在溶液中保持游离的任何BKV或JCB蛋白质分开。这通常通过在测定流程之前使抗VP1抗体不溶解来实现，如通过吸附至水不溶性基质或表面(Bennich等,美国专利号3,720,760)，或通过共价偶联(例如使用戊二醛交联)，或通过在抗VP1抗体和BKV或JCV蛋白质之间形成复合物后使抗VP1抗体不溶解，例如通过免疫沉淀。
任意以上诊断或检测方面都可以用本公开的抗VP1抗体替换或附加至另一抗VP1抗体进行。
在一方面，本公开提供治疗疾病、降低疾病可能性或改善疾病的方法，其包括对患者施用该抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)，由此治疗该疾病。在某些方面，用该抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)治疗的疾病是BK病毒或JC病毒感染。可以治疗和/或预防的BKV和JCV疾病的实例包括但不限于肾病、BKVAN、出血性膀胱炎、进行性多灶性白质脑病(PML)、间质性肾病、输尿管狭窄、颗粒细胞神经元病(GCN)、脉管炎、结肠炎、视网膜炎、脑膜炎和免疫重建炎性综合征(IRIS)。在某些方面，该感染的特征在于该抗VP1抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)可以特异性结合的表达BKV或JCB的细胞。
本公开提供治疗BK病毒感染和BKVAN的方法，其包括施用治疗有效量的该抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)。在某些方面，该个体是人。
在某些方面，减少BK病毒感染的方法包括对个体施用治疗有效量的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。在某些方面，该个体是人。在某些方面，该个体免疫抑制。对于免疫抑制个体，由于抗VP1抗体的治疗效果，可以增加或减少免疫抑制的量。
在某些方面，抗VP1抗体所结合的BK病毒感染移植组织。由于BK感染在人群中的发生率高，在肾移植的情况下，有很高的概率接受肾脏的患者是BK病毒阳性或提供肾脏的供体是BK病毒阳性或二者都是BK病毒阳性。为了预防BKVAN，取决于肾脏供体或移植受体的血清阳性，在肾移植手术之前和/或之后，可以对肾移植受体施用抗VP1抗体。在另一方面，在尿中检测到病毒(病毒尿症)时或在血中检测到病毒时(病毒血症)，可以对患者施用抗VP1抗体。
对于BK或JCV病毒感染的治疗，抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)的适当剂量取决于多种因素，如待治疗的感染的类型、感染的严重度和过程、感染的反应性、病毒对治疗的抗性的产生、先前治疗、患者病史等等。抗体可以一次或在持续几天至几个月的一系列治疗中施用，或直至达到治愈或达到感染减少(例如病毒尿或肾病毒损伤减少)。优化的给药方案可以从患者身体中药物累积的测量结果计算，且将取决于各抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)的相对功效而变。在某些方面，剂量从每千克体重0.01mg至10mg(例如0.01mg、0.05mg、0.lmg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、7mg、8mg、9mg或10mg)，可以每天、每周、每月或每年一次或多次施用。在某些方面，本公开的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)每两周施用一次或每三周施用一次。主治医生可以根据抗体在体液或组织中的测量半衰期和浓度估计给药的重复速率。
联合治疗
在某些情况下，将本公开的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)与其他治疗剂联合，如其他抗病毒剂、抗过敏剂、止吐剂(或止吐药)、止痛药、细胞保护剂、免疫抑制剂及其组合。
本文所用的术语“药物联合”指一个剂量单位形式的固定组合，或非固定组合或组合施用的一套部分，其中两种或多种治疗剂可以在同一时间独立施用或在时间间隔内分开施用，尤其是其中这些时间间隔允许组合配偶体显示协助例如协同效应。
术语“联合治疗”指施用两种或多种治疗剂，以治疗本公开中所述的治疗性病症或感染。这种施用涵盖以基本同时的方式共同施用这些治疗剂，如在具有固定比例的活性成分的单个胶囊中。备选地，这种施用涵盖多次或在每种活性成分的分开的容器(例如胶囊、粉末和液体)中共同施用。粉末和/或液体可以在施用之前重构或稀释至希望的剂量。此外，这种施用还涵盖以顺次方式在大致相同的时间或在不同时间使用每种类型的治疗剂。在任一种情况先，治疗方案都将提供该药物联合在治疗本文所述病症或障碍中的有益作用。
联合治疗可以提供“协同作用”和证明“协同的”，即将活性成分一起使用时达到的效应大于分开使用化合物所产生的效应的总和。在活性成分满足以下时可获得协同效应：(1)以组合的单位剂量制剂共同配制并同时施用或递送；(2)像分开的制剂交替或平行递送；或(3)通过其他方案。在交替治疗中递送时，在例如通过分开的注射器中的不同注射顺次施用或递送化合物时可以获得协同效应。一般而言，在交替治疗期间，顺次(即系列)施用各活性成分的有效剂量，而在联合治疗中，两种或多种活性成分的有效剂量一起施用。
在一方面，本公开提供通过与免疫抑制剂治疗一起对有需要的个体施用抗体来治疗BKV或JCB感染的方法。抗VP1抗体将预防性地发挥作用来中和BKV或JCB原发感染或移植前或移植后的免疫抑制剂治疗引起的病毒复活。免疫抑制剂治疗的实例包括但不限于：单磷酸脱氢酶抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂。免疫抑制治疗剂的具体实例包括但不限于：麦考酚酸酯(MMF)、麦考酚酸钠、硫唑嘌呤、他克莫司、西罗莫司和环孢素。
药物组合物
为了制备包含抗VP1抗体的药物或无菌组合物，将本公开的抗体与可药用载体或赋形剂混合。该组合物可以附加地包含适合用于中和BKV或JCB感染的一种或多种其他治疗剂。
可以通过与生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，以例如冻干粉末、浆液、水溶液、洗液或悬液的形式制备治疗和诊断剂的制剂(参见例如Hardman等,Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等(编辑),Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；Lieberman等(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY,1990；Lieberman等(编辑)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,2000)。
在具体方面，该VP1抗体是小管中包含抗体的冻干物。该冻干物可以用水或适于注射的药用载体重构。对于后续静脉内施用，通常将把所获得的溶液进一步稀释在载体溶液中。
本文公开的抗体用于在组织移植患者中，中和BKV或JCV，该患者可以是免疫抑制，所以可以使用之前用于接受的骨髓移植患者的蔗糖和人白蛋白的药物载体(DeRienzo等Pharmacotherapy 2000；20:1175-8)。备选地，抗VP1抗体可以通过如针对WO2003/105894中所述的另一种抗病毒抗体所述的药物载体引入移植患者。在此公开中，药物载体包含组氨酸和/或甘氨酸、糖(例如蔗糖)和多元醇(例如聚山梨酯)。
选择治疗剂的施用方案依赖于若干因素，包括感染严重度、症状水平和生物基质中靶细胞的可接近性。在某些方面，施用方案最大化与可接受的副作用水平一致的递送至患者的治疗剂的量。因此，所递送的生物制品的量部分取决于具体实体和所治疗病症的严重度。可获得选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指南(参见例如Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编辑),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(编辑),Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in AutoimmuneDiseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等,New Engl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等,New Engl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等,New Engl.J.Med.344:783-792,2001；Beniaminovitz等,New Engl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等,NewEngl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等,New Engl.J.Med.343:1594-1602,2000).
适当剂量的确定由临床医生例如使用本领域已知或疑似影响治疗或预测影响治疗的参数或因素进行。通常，剂量以略小于最佳剂量的量开始，然后小增量提高，直至相对于任何负面副作用达到希望得到的或最佳的效果。重要诊断措施包括例如输注反应的症状的那些。
可以改变含有抗VP1抗体的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对针对具体患者、组合物和给药方式达到所希望的治疗反应有效而对患者无毒性的活性成分量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学参数，包括抗体的中和活性，给药途径，给药时间，抗体在患者中的半衰期，治疗持续时间，与所利用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和过往病史，及医学领域已知的类似因素。
包含抗体或其片段的组合物可以通过连续输注、或通过间隔例如一天、一周的剂量、或每周1-7次提供。剂量可以静脉内、皮下、局部、口服、通过鼻、通过直肠、肌内、脑内、或通过吸入施用。具体的剂量方案是涉及避免显著的不希望得到的副作用的最大剂量或剂量频率。
对于本文所述抗体，对患者施用的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可以在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。可以用按千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待施用剂量来计算抗体或其片段的剂量。
然后可以重复抗体的剂量，且施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
具体患者的有效量可以取决于诸如所治疗的病症、患者的总体健康、给药方法、途径和剂量及副作用严重度的因素而不同(参见例如Maynard等,A Handbook of SOPs forGood Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,1996；Dent,GoodLaboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,2001)。
给药途径可以是通过例如局部或皮肤应用，通过静脉内、腹腔内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或输注，或通过缓释系统或植入物(参见例如Sidman等,Biopolymers 22:547-556,1983；Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692,1985；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物还可以包含增溶剂或局部麻醉剂如利多卡因以缓解注射部位疼痛，或包含二者。此外，也可以利用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和含有雾化剂的制剂。参见例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078，及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，每个专利在此以其整体引入作为参考。
本公开的组合物也可以通过使用本领域已知的多种方法中的一种或多种的一种或多种给药途径施用。如本领域技术人员将理解，给药的途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。所选择的用于抗体的给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹腔内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。胃肠外施用可代表肠和局部施用之外的给药方式，通常通过注射，非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，本公开的组合物可以通过非胃肠外途径施用，如局部、表皮或黏膜给药途径，例如鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部。在一方面，本公开的抗体通过输注施用。在另一方面，该抗体皮下施用。
如果本公开的抗体以受控释放或缓释系统施用，则可以用泵来达到受控释放或缓释(参见Langer,上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14:20,1987；Buchwald等,Surgery 88:507,1980；Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。可以用聚合材料来达到抗体治疗剂的受控释放或缓释(参见例如Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.,1974；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York,1984；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；还参见Levy等,Science 228:190,1985；During等,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等,J.Neurosurg.71:105,1989；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；及PCT公开号WO 99/20253。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在一方面，在缓释制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的杂质、储存时稳定、无菌和可生物降解。受控或缓释系统可置于预防性或治疗性靶标的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如,Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,上文,第2卷,第115-138页,1984)。
在Langer,Science 249:1527-1533,1990的综述中讨论了受控释放系统。可用本领域技术人员已知的任意技术来产生包含本公开的一种或多种抗体的缓释制剂。参见例如美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等,Radiotherapy&Oncology 39:179-189,1996；Song等,PDAJournal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397,1995；Cleek等,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,1997,每篇文献在此以其整体引入作为参考。
如果局部施用本公开的抗体，则可将它们配制为软膏剂、霜、透皮贴剂、乳液、凝胶、喷雾、气雾剂、溶液、乳剂的形式，或本领域技术人员公知的其他形式。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical DosageForms,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对不可喷雾的局部剂型，通常使用黏性至半固体或固体形式，该形式包含与局部施用相容的载体或一种或多种赋形剂，并在某些情况下具有大于水的动态黏度。适宜的制剂非限制性地包括溶液、悬液、乳剂、霜、软膏剂、散剂、搽剂、药膏等等，如果希望，将该制剂灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合以影响多种特性，例如渗透压。其他适宜的局部剂型包括可喷雾的气雾剂，其中将活性成分(在某些情况下与固体或液体惰性载体组合)包装在具有加压挥发物(例如气体推进剂，例如氟利昂)的混合物中或塑料挤瓶中。如果希望，也可在药物组合物和剂型中加入保湿剂或湿润剂。此类附加成分的实例为本领域公知。
如果鼻内施用包含抗体的组合物，可将它配制为气雾剂形式、喷雾、薄雾或滴剂形式。尤其是，按照本公开使用的预防剂或治疗剂可方便地以加压包装或喷雾器样式的气雾喷雾形式递送，使用适宜的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适宜的气体)。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门来递送经计量的量来确定剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器的胶囊和盒(例如由明胶组成)，该胶囊和盒含有化合物和适宜散剂基料如乳糖或淀粉的散剂混合物。
与第二治疗剂(例如免疫抑制剂、细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或放射)共同施用或治疗的为本领域已知(参见例如Hardman等,(编辑)(2001)Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:APractical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编辑)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。
可与抗VP1抗体组合施用的附加治疗(例如预防剂或治疗剂)可以与本公开的抗VP1抗体相隔不到5分钟、相隔不到30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时或相隔96小时至120小时施用。可在同一次患者就诊内施用两种或多种治疗。
在某些方面，可配制抗VP1抗体，以确保在体内合适分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保抗VP1抗体跨过BBB(如果希望)，可将它们配制在例如脂质体中。有关制备脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运至特定细胞或器官的部分，从而增强靶向药物递送(参见例如Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等,(1995)FEBS Lett.357:140；Owais等,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p 120(Schreier等,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本公开提供对有需要的个体单独施用或与其他治疗组合施用包含抗体的药物组合物的方案。可对个体同时或顺次施用该联合治疗(例如预防剂或治疗剂)。也可循环施用该联合治疗的治疗(例如预防剂或治疗剂)。循环治疗涉及施用第一治疗(例如第一预防剂或治疗剂)一段时间，然后施用第二治疗(例如第二预防剂或治疗剂)一段时间，并重复此顺次施用(即循环)，以减少对治疗之一(例如药物)产生抗性，避免或减少治疗之一(例如药物)的副作用，和/或提高治疗的功效。
可对个体同时施用本公开的联合治疗的治疗(例如预防剂或治疗剂)。术语“同时”不限于在精确相同的时间施用治疗(例如预防剂或治疗剂)，而是指按顺序和在时间间隔内对个体施用包含本抗体或其片段的药物组合物，使得抗体可与其他治疗一起作用，以提供较之以其他方式施用它们提高的益处。例如，可在相同时间或在不同时间点以任意顺序顺次对个体施用各治疗；然而，如果不在相同时间施用，它们应在足够接近的时间内施用，以提供希望的治疗或预防效果。可以以任意适宜的形式和通过任意适宜的途径对个体分开施用各治疗。在多种方面，以不到15分钟、不到30分钟、相隔不到1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1周对个体施用治疗(例如预防剂或治疗剂)。在其他方面，在同一次患者就诊内施用两种或多种治疗(例如预防剂或治疗剂)。
可在同一药物组合物中对个体施用联合治疗的预防剂或治疗剂。备选地，可在分开的药物组合物中对个体同时施用联合治疗的预防剂或治疗剂。可通过相同或不同的给药途径对个体施用预防剂或治疗剂。
实施例
实施例1：抗VP1抗体的产生
裂解表达抗VP1抗体的B细胞，通过RT-PCR测序并分析VH(重)和VL(轻)链，以鉴定重要的翻译后稀释(PTM)位点。然后将VH和VL链的质粒在用于表达全长IgG1抗体的IgG1骨架载体中转染入CHO哺乳动物细胞系。
用杂交瘤技术产生单克隆抗体的方法为本领域已知(Antibody Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology第901卷,2012,第7章:117)。简言之，使用多种初免-加强(prime-boost)策略、免疫原剂量和佐剂(包括但不限于弗氏佐剂和MF59佐剂)，用来自BKV血清型I、血清型IV和JCV的VLP(单独或组合)免疫雌性Balb/c小鼠。通过ELISA针对抗VP1抗体的存在筛选成功融合(生长)的杂交瘤的上清，然后在中和测定中针对功能活性筛选。通过移植至人构架受体模板将来自所选择的鼠IgG的CDR人源化，克隆入哺乳动物IgG1骨架表达载体，并转染入CHO哺乳动物细胞系用于表达全长IgG1抗体。
用噬菌体展示技术产生单克隆抗体的方法为本领域已知(Antibody Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology第901卷,2012,第3章:33)。简言之，通过在严格性递增的3轮选择中用与生物素化BKV血清型IV VLP复合的链霉抗生物素蛋白偶联磁珠进行溶液淘选，针对抗VP1抗体筛选具有Vκ的scFv形式的人B细胞抗体文库。分离子(isolate)首先表达为scFv，并通过ELISA针对于BKV血清型IV VLP和五聚体二者的结合进行筛选。然后克隆所选择的分离子并表达为IgG1，通过ELISA针对与VP1(血清型I和IV)的结合重新分析，在中和测定中针对功能活性进行重新分析，并转染入CHO哺乳动物细胞系用于表达全长IgG1抗体。表3中提供抗VP1抗体总结。
表3：抗VP1抗体
实施例2：抗VP1抗体的亲和力成熟
通过易错PCR或CDR定向诱变在酵母中对抗VP1抗体进行亲和力成熟。在通过FACS分析进行的至多三轮选择中用来自四种BKV血清型中每一种的VP1蛋白质(如表4中所示)作为抗原。然后将通过FACS分析发现对VP1的结合亲和力增强的VH(重)和/或VL(轻)链克隆入哺乳动物IgG1骨架表达载体，并转染入CHO哺乳动物细胞系用于表达全长IgG1抗体。
表4
实施例3：BK病毒和病毒样颗粒(VLP)产生
BKV血清型I基因组克隆获自ATCC(pBR322-BKV MM,目录号45026；pBR322-BKVDunlop,目录号45025)。用于血清型II、III和IV的嵌合病毒感染性基因组克隆用之前所述的克隆策略产生(Broekema等,Virology 2010407:368-373)。简言之，用定位诱变在VP1-VP2-VP3编码区侧翼BKV血清型I基因组中引入独特限制位点(SacII、PmlI)。在来自血清型I分离株的VP2/VP3编码区的背景中合成来自血清型II分离株SB(GenBank检索号CAA79596.1)、血清型III分离株AS(GenBank检索号AAA46882.1)和血清型IV株系ITA-4(GenBank检索号BAF75132)的VP1编码区(Genewiz,La Jolla,CA)，使得所合成的片段涵盖SacII-PmlI区，以用于Broekema等,上文中所述的交换组合。然后用得到的嵌合基因组克隆按之前所述(Abend等,J.Virology 200781:272-279)在原代肾近肾小管上皮(RPTE)细胞(ATCC,目录号PCS-400-010)中产生高效价感染性病毒母液。
通过以下产生代表四种BKV血清型中的每一种的VLP，在Sf9昆虫细胞中表达VP1并通过微头超声处理(3x 45秒脉冲，脉冲之间冰上静置5分钟)从来自1L培养物的冷冻细胞沉淀提取，通过20％蔗糖缓冲沉淀VLP(116,000g，2.5小时)进行分离，通过5ml GE HiTrap QHP柱(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上的阴离子交换进行纯化，然后用10ml基于CaptoTMCore700(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)树脂的大小排阻柱纯化，最后在GESephacryl S500 26/60(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)大小排阻柱上纯化。所制备的VLP用于实施例6和7中的ELISA和基于SPR的结合测定。
实施例4：BKV VP1五聚体的纯化
将来自四种BKV血清型的VP1蛋白质(下文表5中所示序列)克隆为带有N端GST-6xHis-TEV序列，并亚克隆入pGEX目的载体(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)。在大肠杆菌中表达GST融合蛋白质，用微流化床(microfluidizer)(15,000PSI)从细胞沉淀提取，用20ml镍琼脂糖6Fast Flow柱(GE Healthcare,Pittsburg,PA)通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化。通过用TEV蛋白酶过夜孵育来切割GST-6xHis-TEV标记，用5ml His-TrapFast Flow柱(GE Heathcare,Pittsburg,PA)，然后用20026/60大小排阻柱(GE Heathcare,Pittsburg,PA)进行最终纯化。
表5
实施例5：抗VP1抗体的亲和力测量(SET测定)
用溶液平衡滴定(SET)测定来测定抗体与来自全部四种血清型的BKV VP1五聚体的相互作用亲和力(KD)。抗体按1pM浓度(恒定)测定，VP1五聚体从10nM起始浓度系列稀释。过夜孵育抗体:VP1五聚体溶液，然后用VP1五聚体包被的MSD阵列板(Meso ScaleDiscovery目录号L21XA,Rockville MD)测定未结合的抗体。通过用1:1拟合模型拟合曲线来测定KD(按照Piehler等J.Immunol.Methods.1997；201(2):189-206)。
在SET测定中，抗VP1抗体结合BKV血清型I五聚体的KD值相似，在从0.9至5.0pM范围内。P8D11和P8D11衍生物对于结合BKV血清型II、III和IV五聚体具有相当的KD值，在与其他抗体相比时，对血清型II五聚体具有高至少3.5倍的亲和力，对血清型IV五聚体具有高47倍的亲和力。这显示在图1A-1D中。此外，P8D11和P8D11衍生物对血清型III五聚体显示2.5至6.0pM范围的结合亲和力，而其他抗体在测试条件内没有可检测到的与血清型III五聚体的结合。这些抗VP1抗体的SET亲和力数据总结见图2中。
实施例6：抗VP1抗体与VP1五聚体和VLP的结合(ELISA)
通过ELISA分析了抗VP1抗体与VP1五聚体和VLP的结合。简言之，用100ng/孔BKVVLP或VP1五聚体过夜包被Immulon 2HB平板(VWR,62402-972)。抗体系列稀释在含0.5％BSA的PBS中，并使其结合抗原包被的平板2小时。用PBS洗涤平板，然后用1:6000稀释在含0.5％BSA的PBS中的二抗(HRP缀合兔抗人IgG,Southern Biotech#6140-05)孵育1小时。用PBS洗涤平板，用四甲基联苯胺(TMB)微孔过氧化物酶底物(KPL,52-00-03 1L)显色反应。
抗VP1抗体EBB-C1975-A3、A7、E7和B5显示相似的与来自BKV血清型IV的VLP(IC50在从0.044至0.1nM范围内)或VP1五聚体(IC50在从0.026至0.078nM范围内)的结合，但对血清型I VLP(IC50在从4.32至85.7nM范围内)的结合活性降低且更可变。此数据图示在图4-6中，并总结在图7中。相反，来自2081和2075系列的抗VP1抗体对血清型I VLP显示增强的结合活性，IC50在从0.046至0.267nM范围内，此数据显示在图8和9中。2077系列JCV特异性抗VP1抗体对JCV VLP显示从0.034至0.651nM范围内的结合活性，此数据提供在图10和11中。
实施例7：SPR测定抗VP1抗体与VP1五聚体和VLP的结合
通过表面等离振子共振(SPR)分析了抗VP1抗体与VP1五聚体和VLP的结合。简言之，将生物素化蛋白A固定在链霉抗生物素蛋白包被的SPR芯片表面，抗VP1抗体通过与蛋白A结合捕获在所得到的表面上。然后使BKV VP1五聚体或VLP流过表面，使其在结合期结合抗VP1抗体，然后在解离期进行缓冲液洗涤。
用SPR相对于阳性对照(P165E2)评价抗VP1抗体EBB-C1975-A3、A7、E7和B5与四种BKV血清型的结合。全部四种抗体对VP1五聚体具有非常相似的结合特征：对血清型I和II五聚体无结合，对血清型II五聚体的非典型结合(大批量迁移，未回到基线)，对血清型IV五聚体的结合类似于P165E2但亲和力更低(图3A、3C和3E)。对于VLP，EBB-C1975-A3、A7和E7具有相似的结合特征：对血清型I VLP的非典型结合，对血清型III VLP无结合。但是，EBB-C1975-B5结合特征不同，与血清型I和III VLP显著结合，证明结合VP1上的不同表位(图3B和3D)。
还通过扫描丙氨酸诱变用SPR表征了抗VP1抗体P165E2、NEG447、P7G11A和P8D11与VP1五聚体的结合(图13A-F和图14)。由于突变对VP1五聚体结构的总体影响，所有抗VP1抗体都显示与F66A和I145AVP1突变体的结合减少(图13B和13F)。此外，K69A和E82A影响P165E2、NEG447和P7G11A的结合(图13D和13E)。
实施例8：抗VP1抗体结合构象表位
为了确定抗VP1抗体是否结合构象表位，使用了SDS-PAGE变性蛋白质的Western印迹和天然构象蛋白质的斑点印迹。简言之，将BKV血清型I或IV VP1五聚体在SDS-PAGE上电泳并转移至硝酸纤维素膜上(Western印迹)或直接点在硝酸纤维素膜上(斑点印迹)。两张膜都用抗VP1抗体孵育，然后用缀合用于用Licor Odyssey系统检测的红外荧光染料的抗人IgG二抗孵育。
已知识别线性表位的市售阳性对照抗体(Abcam 53977)检测到变性和非变性VP1二者。但是，P165E2、P7G11和P8D11未能检测到Western印迹上的变性VP1，仅识别到斑点印迹上的天然VP1，表明这些抗体结合VP1的构象(非线性)表位(图12A和12B)。
为了进一步表征抗VP1抗体的表位，对已知暴露于病毒体表面并处于细胞表面受体的主要相互作用部位之内的残基(主要在VP1BC环中)进行了扫描丙氨酸诱变。在上文实施例7中所述的表面等离振子共振(SPR)研究中针对与P8D11和P7G11A的结合测定了这些突变体VP1五聚体。几个位置上的突变影响P7G11A(F66A、K69A、E82A、I145A)的结合(图13A-F和图14)。但是，仅两个位点的突变导致P8D11结合减少(F66A、I145A)(图14)。由于F66和I145处的突变导致测试的所有抗体的结合丧失，不受限于任何一种理论，可能这些突变导致VP1五聚体结构的一般性破坏。测试的所有其他具有BC环突变的VP1五聚体都保持P8D11结合。相反，氢氘交换研究鉴定出了结合P8D11Fab片段时VP1的EF环内受保护的区域。随后的扫描丙氨酸诱变研究确认，此区域内用于P8D11结合的关键接触残基包括Y169、R170和K172，D/E175、K181、N182、T184和Q186至M190是通过氢氘交换确定的重要残基((YRXKXX(D/E)XXXXXKNXTXQ)(SEQ ID NO:500))。实施例14至实施例17中进一步描述这一点。
实施例9：抗VP1抗体中和BK病毒
用纯化抗体预孵育感染性BKV血清型I及代表血清型II、III和IV的嵌合病毒1小时，以允许结合和中和。然后使原代肾近肾小管上皮(RPTE)细胞(ATCC,目录号PCS-400-010)暴露于病毒-抗体混合物4小时，更换新鲜培养基，孵育48小时，以允许病毒进入和基因表达。用4％多聚甲醛固定细胞并通过免疫荧光分析来检测TAg表达(Calbiochem DP02,pAb416小鼠抗SV40TAg抗体)。通过使用CellomicsVTI HCS Reader的高含量图像分析来分析免疫荧光，以定量BKV感染细胞(TAg阳性，DAP1阳性)的百分比，结果呈现为相对于未处理的对照孔的百分比感染抑制。
如图15-23中所示，抗VP1抗体中和BKV感染，包括中和全部四种BKV血清型(I-IV)感染的抗体亚组。这些抗VP1抗体尤其包括P8D11、P8D11的修饰和EBB-C1975-B5。
实施例10：抗VP1病毒抗体中和JC病毒
感染性JCV分离株Mad-1和Mad-4具有相同的VP1序列(GenBank检索号NP_043511)。用纯化抗体预孵育这些JCV分离株1小时，以允许结合和中和。然后使COS7细胞(表达SV40TAg的非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系,ATCC目录号CRL-1651)暴露于病毒-抗体混合物4小时，更换新鲜培养基，孵育72小时，以允许病毒进入和基因表达。用4％多聚甲醛固定细胞并通过免疫荧光分析来检测JCV VP1表达(Abcam 53977，兔多克隆抗SV40VP1抗体)。通过使用CellomicsVTI HCS Reader(Thermo Fisher,Waltham MA)的高含量图像分析来分析测定，以定量JCV感染细胞(VP1阳性，DAP1阳性)的百分比，结果呈现为相对于未处理的对照孔的百分比感染抑制。如图24-26中所示，一个抗VP1抗体亚组中和JCV感染，包括P8D11和2077系列抗体。
实施例11：病毒抗性
在BKV血清型I或血清型IV感染的肾近肾小管上皮(renal proximal tubularepithelial，RPTE)细胞培养物中进行了P8D11抗体的抗性选择实验。在血清型I研究中，含P8D11的培养物中未观察到病毒穿透出来至6代(84天)，因此未鉴定出抗性相关变体(RAV)。未进行此时间点后的进一步传代，因为检测不到病毒。相反，对于另一抗体，在第3代(第42天)检测到病毒穿透。来自这些培养物的BKV VP1的测序鉴定出在整个VP1中具有20个氨基酸改变的抗性相关变体(RAV)，没有改变簇聚在VP1序列中的特定氨基酸周围。此混合RAV病毒随后的表型表征显示与野生型病毒相比中和活性完全丧失(EC50变动>7,692倍)，但P8D11的EC50几乎不变(3.9倍)。此外，在用另一抗VP1抗体选择期间将VP1突变体E82K鉴定为RAV(参见实施例8)，克隆的E82K突变体病毒的表征显示，与野生型病毒相比，此变体赋予15,880倍的EC50变动，但未对P8D11显示交叉抗性。
类似地，在BKV血清型IV培养物中，6代(84天)后用P8D11未检测到抗性。同样，未进行此时间点后的进一步传代，因为检测不到病毒。但是，在早至第1代(第14天)就选择出了对不同抗BK抗体的抗性。将氨基酸L68R和E73K的改变鉴定为从参考改变的突变，其分别赋予600倍和227倍的EC50值变动，但未对P8D11显示交叉抗性。总之，P8D11具有高抗性屏障，保持对血清型I和IV二者的抗性变体的中和活性。
实施例12：毒性
由于VP1是不在细胞表面表达的外源、非人靶标，本文公开的抗VP1抗体在人中构成低毒性风险。TCR研究证明，P8D11在42种人组织和血涂片上无染色，支持抗VP1抗体缺乏与人蛋白质的交叉反应性。显示该抗VP1抗体在体外没有依赖抗体的细胞毒性(ADCC)，与VP1蛋白质不表达在宿主细胞表面的事实一致。
实施例13：P8D11对JCB VLP的SET亲和力测定
进行性多灶性白质脑病(PML)是罕见但常致死的JC病毒对免疫受损患者脑的感染。JC病毒的主要壳体蛋白质(VP1)涉及结合宿主细胞表面的唾液酸受体。VP1中的某些突变(如氨基酸L55和S269处)废除了唾液酸识别，在PML病理发生中发挥作用(Chen等,mAbs2015；7(4),681-692)。这两种突变常发生在PML患者中(Gorelik等,J.Infect.Dis.2011204:103-114和Reid等,J.Infect.Dis.2011；204:237-244)。测试了本公开的抗体来看它们是否结合在那些位置具有突变的突变JCV VLP。抗VP1抗体与这些VLP的结合可指示携带这些共同的VP1突变的JC病毒将对治疗无抗性。
在样品缓冲液中配制两个22倍系列稀释的VLP系列。加入两种恒定浓度的P8D11抗体。所使用的P8D11抗体浓度为9nM或1pM。JCV共有区的浓度范围为105μg/ml-72pg/ml。JCVL55F突变体的浓度范围为300μg/ml-143pg/ml。JCV S269F突变体的浓度范围为300μg/ml-143pg/ml。将体积60μl的每种VLP:抗体混合物一式两份加至384孔聚丙烯微量滴定板(PPMTP)。样品缓冲液作为阴性对照，不包含抗原的样品作为阳性对照(Bmax)。密封平板，室温(RT)孵育过夜(o/n)。用2和0.002μg/ml BKV-VP1血清型I五聚体蛋白质过夜包被MSD阵列平板。用50μl/孔洗涤缓冲液洗涤三次后，用50μl/孔封闭缓冲液RT封闭平板1小时。洗涤后，将体积30μl/孔的每种VLP:抗体混合物从PP MTP转移至包被的MSD平板，RT孵育20分钟。附加洗涤步骤后，向各孔加入样品缓冲液中的30μl检测抗体(1:2000稀释)，RT孵育30分钟。洗涤MSD平板，加入35μl/孔读板缓冲液，孵育5分钟。用MSD SECTOR Imager 6000测量ECL信号。
所用试剂是：牛血清白蛋白(BSA)(VWR目录号422351S)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)10x(Teknova目录号P0195)、MSD读板缓冲液T 4x(Meso Scale Discovery目录号R92TC-1)、Tris缓冲盐溶液(TBS)20x(Teknova目录号T1680)、Tween-20(VWR目录号437082Q)。所用缓冲液是：封闭缓冲液：1x PBS+5％(w/v)BSA；包被缓冲液：1x PBS；样品缓冲液：1x PBS+0.5％(w/v)BSA+0.02％(v/v)Tween-20；洗涤缓冲液：1x TBS+0.05％(v/v)Tween-20；读板缓冲液：1x MSD读板缓冲液。
按实施例5中所述用溶液平衡滴定(SET)测定来测定P8D11与JCV VLP的相互作用亲和力(KD)。P8D11抗体按9nM或1pM浓度(恒定)测定，JCV VLP系列稀释如下：共有VLP在105μg/ml-72pg/ml范围内，L55F和S269F突变体VLP都在300μg/ml-143pg/ml范围内。抗体:VP1五聚体溶液过夜孵育，然后用VP1五聚体包被的MSD阵列平板(Meso Scale Discovery,目录号L21XA,Rockville MD)测定未结合的抗体。通过用1:1拟合模型拟合曲线来测定KD(按照Piehler等J.Immunol.Methods.1997；201(2):189-206)。通过使用来自Sapidyne(BoiseID)的Pro和n-Curve Analysis软件来进行分析。
图27以表格形式显示SET测定的结果。此数据提供P8D11抗体对共有JCV VLP和包含通常与PML相关的VP1突变的VLP的亲和力测定(KD)。P8D11在低纳摩尔范围对所有JCVVLP显示结合亲和力。但是，对L55F突变体的结合亲和力比对野生型(共有)和S269F突变体VLP的亲和力低约2倍。因此，这表明P8D11抗体对野生型JC病毒或含有通常与PML相关的突变的JC病毒仍是有效治疗。
实施例14：用于表位定位的氘交换研究(P8D11Fab与BKV VP1五聚体复合)
氘交换质谱分析法(HDx-MS)测量蛋白质酰胺主链上的氘摄取。这些测量对酰胺的溶液可接近性及对主链酰胺氢键网络中的改变敏感。HDx-MS常用于比较处于两种不同状态(如apo和配体结合)的蛋白质，并与胃蛋白酶快速消化偶联。在这类实验中，可以定位在两种不同状态间显示差异氘摄取的通常为10至15个氨基酸的区域。受保护的区域直接涉及配体结合或受抗体与配体结合的别构作用影响。
在这些实验中，在缺乏和存在P8D11Fab片段的情况下测量BKV VP1蛋白质(SEQ IDNO:502)的氘摄取。VP1中在结合Fab片段时显示氘摄取减少的区域可能涉及表位；但是，由于测量的性质，也可能检测到远离直接结合部位的改变(别构效应)。通常，具有最高量保护的区域涉及直接结合。
在WatersG2HDx-MS平台上进行表位定位实验，该平台包括机器人系统、UPLC System和G2质谱仪。在此方法中，按以下进行一式三份的对照实验。将BKV血清型I VP1五聚体稀释在110μl 95％氘化PBS缓冲液(pH 7.4)中，在台式离心机上室温孵育25分钟(％D＝85.5％)。通过用冷的淬灭缓冲液(6M尿素和1M TCEP pH＝2.5)1:1稀释来在冰上淬灭氘交换5分钟。淬灭后，将管转移至LEAP系统(温控盒设为2℃)上，通过LEAP系统将淬灭样品注射至UPLC系统上进行分析。UPLC系统包含维持在12℃的固定化胃蛋白酶柱2.1mm x 30mm(Life Technologies 2-3131-00)。用8分钟的2至35％乙腈梯度和Waters UPLC CSH C18 1.0x 100mm柱进行分离。然后，用抗体进行一式三份的实验。用标准技术将P8D11Fab片段固定在蛋白G琼脂糖小球(ThermoScientific目录号22851)上。简言之，离心抗体以去除保存缓冲液。然后向固定化P8D11Fab片段加入200μl PBS缓冲液(pH 7.4)和一个浓度的VP1五聚体，并在室温孵育30分钟。孵育后，离心复合物，用200μl PBS缓冲液洗涤并再次离心。对于氘交换，向抗原-抗体复合物加入200μl氘化PBS，室温孵育25分钟(％D＝85.5％)。然后去除氘缓冲液，立即加入125μl冰冷的淬灭缓冲液。淬灭5分钟后，离心柱子，流穿转入预冷的HPLC小管。用与对照实验相同的在线胃蛋白酶消化/LC-MS设置分析样品。
这些测量的结果总结在图28中。图28显示对照和P8D11抗体结合样品之间除以测量标准差的基线校正差异。在此图中，更多的负值表示P8D11Fab片段与BKV血清型I VP1五聚体结合时给定区域中更大量的保护。我们在结合P8D11Fab片段时在VP1蛋白质的氨基酸168-190中观察到最显著量的保护。如表1中粗体且下划线的序列((NYRTKYPXGTXXPKNXTXQSQVM)(SEQ ID NO:501))可见，EF环的此区域在全部四种血清型的BK病毒和JC病毒间高度保守。
总之，氘定位数据表明，P8D11抗体结合BKV VP1的EF环内的表位。此区域在全部四种BKV血清型和JC病毒间高度保守，因此支持P8D11在全部四种BKV血清型和JC病毒中具有中和活性的结果。
实施例15：用于P8D11表位定位的靶向丙氨酸扫描和SPR
用Biacore表面等离振子共振(SPR)表征了抗VP1抗体与通过扫描丙氨酸诱变为表位定位产生的VP1五聚体的结合。实验25℃下在补充了0.005％Tween 20去垢剂(Calbiochem#655206)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行，并在Biacore T-200仪器(GEHealthcare Life Sciences)上运行。在S系列链霉抗生物素蛋白传感芯片上固定生物素化蛋白A(Sigma#P2165)至约1200响应单位(RU)，用生物素-PEG(Pierce EZ-Link#PI21346)封闭其余游离链霉抗生物素蛋白位点。以30μl/分钟流速注射4秒将抗体捕获在所制备的蛋白A传感芯片上。抗体按20-40RU固定在流动池2、3和4上，流动池1留作没有任何抗体的参考流动池。然后按100μl/分钟将VP1五聚体注射在芯片上200秒，然后注射缓冲液来监测解离。在每个五聚体和五聚体浓度之间，按30μl/分钟注射25mM NaOH 60秒再生传感芯片表面，以在重新捕获抗体在蛋白A表面进行下一循环之前去除抗体。在GE BiaEvaluation软件中进行数据分析，其中应用双参考扣除。通过将结合RU水平和结合曲线形状与野生型五聚体的结合RU水平和结合曲线形状相比较，来达到评估丙氨酸诱变对VP1五聚体结合的影响。
如之前所讨论，抗体P8D11和P7G11A的表位是构象和非连续表位(图12A-B)。在此，BKV VP1EF环中Y169、R170和K172处变为丙氨酸的单突变废除了P8D11结合(图29A和29B)。Y169和R170处的突变也废除了P7G11A抗体的结合，但是此抗体的结合不受BKV VP1EF环K172位处改变的影响(图29A和29C)。
实施例16：x射线晶体分析法表位定位
测定了结合于处于其五聚体形式的BKV主要壳体蛋白质VP1的抗体P8D11的scFv链的晶体结构。如下文详述，用scFv:BKV-VP1五聚体为5.5:1的溶液来产生由五个scFv链结合于每个五聚体组成的晶体学上适宜的复合物。然后用蛋白质晶体分析法产生原子分辨率结构并定义表位。
结晶和结构测定
将P8D11scFv/BKV-VP1复合物浓缩至5.2mg/ml，并针对结晶进行筛选。通过在18℃进行悬滴蒸气扩散来培养用于数据收集的晶体。通过将1.0μl复合物与1.0μl含25％(w/v)PEG3350、0.2M氯化镁和0.1M Bis-Tris pH 7.0的储液混合并对350μl相同储液平衡液滴来培养晶体。将晶体过夜培养，并继续培养几天。数据收集前，将晶体转移至75％储液加25％甘油中，并在液氮中快速冷却。
在内部的Rigaku FRE+铜源和R轴X射线检测器上收集衍射数据。数据用Autoproc(Global Phasing,LTD)处理和缩放。以细胞尺寸 α＝90°、β＝90°、γ＝90°在空间群P42212中将BKV-VP1的数据处理至通过以BKV-VP1五聚体作为搜索模型用Phaser(McCoy et al.,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)进行分子替换来解析复合物的结构。在COOT(Emsley&Cowtan(2004)Acta Cryst.D60:2126-2132)中建立最终模型，并用Buster(Global Phasing,LTD,Cambridge,UK)改进。Rwork和Rfree值分别为17.1％和21.4％；键长和键角的均方根(r.m.s)偏差值分别为和1.18°。
BKV-VP1-五聚体与P8D11scFv接触的残基、相互作用类型和埋藏表面积全都通过PISA(Krissinel等,(2007)J Mol Biol.372:774-97)鉴定并在下文表6中列出。发现VP1五聚体的每个单体包含P8D11抗体的单个分离的表位。因此，五个scFv结构域在五个化学上和空间上等同的位置上结合每个五聚体。每个表位上相互作用的细节基本一致，使得此处仅分析了一个scFv/VP1表位界面。
BKV-VP1上的P8D11-scFv表位
总体结构
每个多瘤病毒VP1五聚体结构的总体折叠在三级结构水平高度同质。一级序列非常保守，同一性为69-85％。每个五聚体由五个单体组成，每个单体由堆叠在另一五链β折叠上然后堆叠在四链β折叠上的三链β折叠组成。P8D11scFv是在VH和VL结构域之间具有20个氨基酸的接头的VH-VL融合蛋白质。如图30中所示，VH-VL融合蛋白质结合定位在BKV-VP1五聚体侧向外表面的表位。
P8D11的表位
用BKV-VP1/P8D11复合物的晶体结构来鉴定BKV-VP1上的P8D11表位。VP1上的P8D11-scFv相互作用表面由几个连续和不连续(即不相邻)的序列形成：即残基77-80、169-186和191-192，如表6中详述。这些残基形成P8D11-scFv识别的三位构象表位(图31A-B)。通过晶体分析法确定的此表位与通过氢氘交换质谱分析法(HDx-MS)确定的表位一致性良好，在氢氘交换质谱分析法中，P8D11-Fab实质性保护残基168-190(图28)。与对表位关键氨基酸进行的丙氨酸扫描的一致性也良好(图29A-C)，丙氨酸扫描显示TYR169、ARG170和LYS172是作为P8D11抗体表位的部分的接触残基。
BKV-VP1上的P8D11-scFv表位。通过PISA鉴定了在晶体结构中与P8D11-scFv接触的所有BKV-VP1残基，并按其被P8D11-scFv埋藏的表面积列出和分类。适用时，也列出了相互作用类型。
表6
*ASA：可接近表面积
*BSA：埋藏表面积
实施例18：制剂
本文所述抗VP1抗体是具有λ轻链的IgG1同种型单克隆抗体，且可以冻干。这些抗体在组氨酸-蔗糖缓冲液中可溶并稳定4周。此外，抗VP1抗体作为最低程度配制的药物物质(例如在缺乏稳定剂的组氨酸缓冲液中)溶解度>200mg/ml。
对于随后的静脉内施用，通常将所获得的溶液在载体溶液中进一步稀释为即用抗体溶液进行输注。
用于选择最稳定制剂的重要的指示稳定性的分析方法涵盖测定聚集水平的大小排阻色谱、不可见颗粒物测试和功效测试。
应理解，本文所述的实例和方面仅是为了说明性目的，在其教导下，将向本领域技术人员提示多种修改和改变，这些修改和改变将包括在本申请的精神和范围及所附权利要求书的范围之内。

Claims (47)

1.抗体，其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合VP1。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合BK病毒血清型I-血清型IV VP1。
3.权利要求1的抗体，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合表1的至少一种VP1。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段结合表1的两种或多种VP1血清型。
5.权利要求4的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段结合：
a)BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型II；
b)BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型III；
c)BKV VP1血清型I和BKV VP1血清型IV；
d)BKV VP1血清型II和BKV VP1血清型III；和
e)BKV VP1血清型I和JCV VP1。
6.权利要求1的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段以5.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型I，或以29.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型II，或以6.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型III，或以185.0pM或更小的结合亲和力结合BKV血清型IV，或以436pM或更小的结合亲和力结合JCV。
7.权利要求1的抗体，其中该抗体或抗原结合片段特异性结合VP1表位(SEQ ID NO:500或SEQ ID NO:501)。
8.抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(i)含有(a)SEQ ID NO:6的HCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:7的HCDR2、(c)SEQ ID NO:8的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:16的LCDR1、(e)SEQ ID NO:17的LCDR2和(f)SEQ ID NO:18的LCDR3的轻链可变区；
(ii)含有(a)SEQ ID NO:26的HCDR1、(b)SEQ ID NO:27的HCDR2、(c)SEQ ID NO:28的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:36的LCDR1、(e)SEQ ID NO:37的LCDR2和(f)SEQID NO:38的LCDR3的轻链可变区；
(iii)含有(a)SEQ ID NO:46的HCDR1、(b)SEQ ID NO:47的HCDR2、(c)SEQ ID NO:48的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:56的LCDR1、(e)SEQ ID NO:57的LCDR2和(f)SEQID NO:58的LCDR3的轻链可变区；
(iv)含有(a)SEQ ID NO:66的HCDR1、(b)SEQ ID NO:67的HCDR2、(c)SEQ ID NO:68的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:76的LCDR1、(e)SEQ ID NO:77的LCDR2和(f)SEQID NO:78的LCDR3的轻链可变区；
(v)含有(a)SEQ ID NO:86的HCDR1、(b)SEQ ID NO:87的HCDR2、(c)SEQ ID NO:88的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:96的LCDR1、(e)SEQ ID NO:97的LCDR2和(f)SEQID NO:98的LCDR3的轻链可变区；
(vi)含有(a)SEQ ID NO:106的HCDR1、(b)SEQ ID NO:107的HCDR2、(c)SEQ ID NO:108的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:116的LCDR1、(e)SEQ ID NO:117的LCDR2和(f)SEQ ID NO:118的LCDR3的轻链可变区；
(vii)含有(a)SEQ ID NO:126的HCDR1、(b)SEQ ID NO:127的HCDR2、(c)SEQ ID NO:128的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:136的LCDR1、(e)SEQ ID NO:137的LCDR2和(f)SEQ ID NO:138的LCDR3的轻链可变区；
(viii)含有(a)SEQ ID NO:146的HCDR1、(b)SEQ ID NO:147的HCDR2、(c)SEQ ID NO:148的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:156的LCDR1、(e)SEQ ID NO:157的LCDR2和(f)SEQ ID NO:158的LCDR3的轻链可变区；
(ix)含有(a)SEQ ID NO:166的HCDR1、(b)SEQ ID NO:167的HCDR2、(c)SEQ ID NO:168的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:176的LCDR1、(e)SEQ ID NO:177的LCDR2和(f)SEQ ID NO:178的LCDR3的轻链可变区；
(x)含有(a)SEQ ID NO:186的HCDR1、(b)SEQ ID NO:187的HCDR2、(c)SEQ ID NO:188的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:196的LCDR1、(e)SEQ ID NO:197的LCDR2和(f)SEQ ID NO:198的LCDR3的轻链可变区；
(xi)含有(a)SEQ ID NO:206的HCDR1、(b)SEQ ID NO:207的HCDR2、(c)SEQ ID NO:208的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:216的LCDR1、(e)SEQ ID NO:217的LCDR2和(f)SEQ ID NO:218的LCDR3的轻链可变区；
(xii)含有(a)SEQ ID NO:226的HCDR1、(b)SEQ ID NO:227的HCDR2、(c)SEQ ID NO:228的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:236的LCDR1、(e)SEQ ID NO:237的LCDR2和(f)SEQ ID NO:238的LCDR3的轻链可变区；
(xiii)含有(a)SEQ ID NO:246的HCDR1、(b)SEQ ID NO:247的HCDR2、(c)SEQ ID NO:248的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:256的LCDR1、(e)SEQ ID NO:257的LCDR2和(f)SEQ ID NO:258的LCDR3的轻链可变区；
(xiv)含有(a)SEQ ID NO:266的HCDR1、(b)SEQ ID NO:267的HCDR2、(c)SEQ ID NO:268的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:276的LCDR1、(e)SEQ ID NO:277的LCDR2和(f)SEQ ID NO:278的LCDR3的轻链可变区；
(xv)含有(a)SEQ ID NO:286的HCDR1、(b)SEQ ID NO:287的HCDR2、(c)SEQ ID NO:288的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:296的LCDR1、(e)SEQ ID NO:297的LCDR2和(f)SEQ ID NO:298的LCDR3的轻链可变区；
(xvi)含有(a)SEQ ID NO:306的HCDR1、(b)SEQ ID NO:307的HCDR2、(c)SEQ ID NO:308的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:314的LCDR1、(e)SEQ ID NO:315的LCDR2和(f)SEQ ID NO:316的LCDR3的轻链可变区；
(xvii)含有(a)SEQ ID NO:322的HCDR1、(b)SEQ ID NO:323的HCDR2、(c)SEQ ID NO:324的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:332的LCDR1、(e)SEQ ID NO:333的LCDR2和(f)SEQ ID NO:334的LCDR3的轻链可变区；
(xviii)含有(a)SEQ ID NO:342的HCDR1、(b)SEQ ID NO:343的HCDR2、(c)SEQ ID NO:344的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:349的LCDR1、(e)SEQ ID NO:350的LCDR2和(f)SEQ ID NO:351的LCDR3的轻链可变区；
(xix)含有(a)SEQ ID NO:356的HCDR1、(b)SEQ ID NO:357的HCDR2、(c)SEQ ID NO:358的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:363的LCDR1、(e)SEQ ID NO:364的LCDR2和(f)SEQ ID NO:365的LCDR3的轻链可变区；
(xx)含有(a)SEQ ID NO:370的HCDR1、(b)SEQ ID NO:371的HCDR2、(c)SEQ ID NO:372的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:377的LCDR1、(e)SEQ ID NO:378的LCDR2和(f)SEQ ID NO:379的LCDR3的轻链可变区；
(xxi)含有(a)SEQ ID NO:384的HCDR1、(b)SEQ ID NO:385的HCDR2、(c)SEQ ID NO:386的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:391的LCDR1、(e)SEQ ID NO:392的LCDR2和(f)SEQ ID NO:393的LCDR3的轻链可变区；
(xxii)含有(a)SEQ ID NO:398的HCDR1、(b)SEQ ID NO:399的HCDR2、(c)SEQ ID NO:400的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:405的LCDR1、(e)SEQ ID NO:406的LCDR2和(f)SEQ ID NO:407的LCDR3的轻链可变区；
(xxiii)含有(a)SEQ ID NO:412的HCDR1、(b)SEQ ID NO:413的HCDR2、(c)SEQ ID NO:414的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:419的LCDR1、(e)SEQ ID NO:420的LCDR2和(f)SEQ ID NO:421的LCDR3的轻链可变区；
(xxiv)含有(a)SEQ ID NO:426的HCDR1、(b)SEQ ID NO:427的HCDR2、(c)SEQ ID NO:428的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:433的LCDR1、(e)SEQ ID NO:434的LCDR2和(f)SEQ ID NO:435的LCDR3的轻链可变区；
(xxv)含有(a)SEQ ID NO:440的HCDR1、(b)SEQ ID NO:441的HCDR2、(c)SEQ ID NO:442的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:447的LCDR1、(e)SEQ ID NO:448的LCDR2和(f)SEQ ID NO:449的LCDR3的轻链可变区；
(xxvi)含有(a)SEQ ID NO:454的HCDR1、(b)SEQ ID NO:455的HCDR2、(c)SEQ ID NO:456的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:461的LCDR1、(e)SEQ ID NO:462的LCDR2和(f)SEQ ID NO:463的LCDR3的轻链可变区；
(xxvii)含有(a)SEQ ID NO:468的HCDR1、(b)SEQ ID NO:469的HCDR2、(c)SEQ ID NO:470的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:475的LCDR1、(e)SEQ ID NO:476的LCDR2和(f)SEQ ID NO:477的LCDR3的轻链可变区；
(xxviii)含有(a)SEQ ID NO:482的HCDR1、(b)SEQ ID NO:483的HCDR2、(c)SEQ ID NO:484的HCDR3的重链可变区，及含有(d)SEQ ID NO:489的LCDR1、(e)SEQ ID NO:490的LCDR2和(f)SEQ ID NO:491的LCDR3的轻链可变区。
9.权利要求8的抗体，其中用表2的另一抗VP1抗体的相应CDR的相应残基取代CDR内的至少一个氨基酸。
10.权利要求8的抗体，其中修饰、缺失或取代CDR内的一个或两个氨基酸。
11.权利要求8的抗体，其中抗体包含表3中的修饰。
12.权利要求8的抗体，其在可变重链区或可变轻链区内保持至少90％、9％1、92％、93％、94％、95％、96％、9％7、98％或99％同一性。
13.权利要求8的抗体，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人改造抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
14.权利要求1的抗体，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:12的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:22的轻链可变区(VL)；
(ii)含有SEQ ID NO:32的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的轻链可变区(VL)；
(iii)含有SEQ ID NO:52的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:62的轻链可变区(VL)；
(iv)含有SEQ ID NO:72的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:82的轻链可变区(VL)；
(v)含有SEQ ID NO:92的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:102的轻链可变区(VL)；
(vi)含有SEQ ID NO:112的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:122的轻链可变区(VL)；
(vii)含有SEQ ID NO:132的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:142的轻链可变区(VL)；
(viii)含有SEQ ID NO:152的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:162的轻链可变区(VL)；
(ix)含有SEQ ID NO:172的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:182的轻链可变区(VL)；
(x)含有SEQ ID NO:192的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:202的轻链可变区(VL)；
(xi)含有SEQ ID NO:212的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:222的轻链可变区(VL)；
(xii)含有SEQ ID NO:232的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:242的轻链可变区(VL)；
(xiii)含有SEQ ID NO:252的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:262的轻链可变区(VL)；
(xiv)含有SEQ ID NO:272的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:282的轻链可变区(VL)；
(xv)含有SEQ ID NO:292的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:302的轻链可变区(VL)；
(xvi)含有SEQ ID NO:312的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:320的轻链可变区(VL)；
(xvii)含有SEQ ID NO:328的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:338的轻链可变区(VL)；
(xviii)含有SEQ ID NO:348的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:355的轻链可变区(VL)；
(xix)含有SEQ ID NO:362的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:369的轻链可变区(VL)；
(xx)含有SEQ ID NO:376的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:383的轻链可变区(VL)；
(xxi)含有SEQ ID NO:390的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:397的轻链可变区(VL)；
(xxii)含有SEQ ID NO:404的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:411轻链可变区(VL)；
(xxiii)含有SEQ ID NO:418的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:425的轻链可变区(VL)；
(xxiv)含有SEQ ID NO:432的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:439的轻链可变区(VL)；
(xxv)含有SEQ ID NO:446的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:453的轻链可变区(VL)；
(xxvi)含有SEQ ID NO:460的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:467的轻链可变区(VL)；
(xxvii)含有SEQ ID NO:474的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:481的轻链可变区(VL)；或
(xxviii)含有SEQ ID NO:488的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:495的轻链可变区(VL)。
15.权利要求14的抗体或其片段，其在可变轻链区或可变重链区保持至少90％、9％1、92％、93％、94％、95％、96％、9％7、98％或99％同一性。
16.权利要求14的抗体，其中修饰、缺失或取代可变轻链区或可变重链区内的一个、两个、三个、四个或五个但少于10个氨基酸。
17.权利要求14的抗体，其中抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人改造抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
18.前述权利要求中任一项的抗体，其中抗体或其片段糖基化减少或无糖基化或低岩藻糖基化。
19.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的抗体或其片段，并进一步包含可药用载体。
20.权利要求19的药物组合物，其中可药用载体包含组氨酸或糖。
21.权利要求20的药物组合物，其中糖是蔗糖。
22.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的多种抗体或抗原结合片段，其中组合物中至少0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％或更多的抗体具有α2,3连接的唾液酸残基。
23.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的多种抗体或抗原结合片段，其中没有一种抗体包含等分GlcNAc。
24.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的抗体或其片段，其中将组合物制备为冻干物。
25.中和BK病毒或JC病毒感染的方法，其包括对有需要的患者通过注射或输注施用有效量的权利要求1或权利要求19的抗体或药物组合物。
26.权利要求25的方法，其中有需要的患者诊断患有BK病毒尿症或BK病毒血症。
27.治疗BK病毒或JC病毒相关障碍或降低BK病毒或JC病毒相关障碍的可能性的方法，其包括对有需要的患者通过注射或输注施用有效量的权利要求1或权利要求19的抗体或药物组合物，其中障碍是：肾病、BKVAN、出血性膀胱炎(HC)、进行性多灶性白质脑病(PML)、颗粒细胞神经元病(GCN)、间质性肾病、输尿管狭窄、脉管炎、结肠炎、视网膜炎、脑膜炎和免疫重建炎性综合征(IRIS)。
28.权利要求25或27的方法，其中在注射或输注之前重构抗体或组合物。
29.权利要求25或27的方法，其中将抗体或药物组合物与另一治疗剂组合施用。
30.权利要求29的方法，其中治疗剂是免疫抑制剂。
31.权利要求30的方法，其中免疫抑制剂是单磷酸脱氢酶抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂。
32.权利要求31的方法，其中免疫抑制剂是麦考酚酸酯(MMF)、麦考酚酸钠、硫唑嘌呤、他克莫司、西罗莫司或环孢素。
33.权利要求29的方法，其中治疗剂是另一抗VP1抗体。
34.权利要求1-18中任一项的抗体或其片段，其用作药物。
35.权利要求1的抗体或其片段，或权利要求19-24的药物组合物，其用于中和BK病毒或JC病毒感染。
36.权利要求1的抗体或其片段，或权利要求19-24的药物组合物，其用于治疗以下或降低以下的可能性：肾病、BKVAN、出血性膀胱炎(HC)、进行性多灶性白质脑病(PML)、颗粒细胞神经元病(GCN)、间质性肾病、输尿管狭窄、脉管炎、结肠炎、视网膜炎、脑膜炎和免疫重建炎性综合征(IRIS)。
37.权利要求35的抗体或其片段的用途，与另一治疗剂组合施用。
38.权利要求37的抗体或其片段的用途，其中治疗剂是免疫抑制剂。
39.权利要求38的抗体或其片段的用途，其中免疫抑制剂是单磷酸脱氢酶抑制剂、嘌呤合成抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂或mTOR抑制剂。
40.权利要求39的抗体或其片段的用途，其中免疫抑制剂是麦考酚酸酯(MMF)、麦考酚酸钠、硫唑嘌呤、他克莫司、西罗莫司或环孢素。
41.权利要求37的抗体或其片段的用途，其中治疗剂是另一抗VP1抗体。
42.核酸，其编码权利要求1的抗体或抗原结合片段。
43.载体，其包含权利要求42的核酸。
44.宿主细胞，其包含权利要求43的载体。
45.用于产生抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养宿主细胞，并从培养物回收抗体。
46.诊断试剂，其包含标记的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
47.权利要求46的诊断试剂，其中标记选自放射性标记、荧光团、生色团、显像剂和金属离子。
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