KR101298383B1 - Ｎｇｆ에 대한 특이적 결합 멤버 - Google Patents

Ｎｇｆ에 대한 특이적 결합 멤버 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NGF(신경 성장 인자; Nerve Growth Factor)에 대한 특이적 결합 멤버, 특히 항-NGF 항체 분자, 구체적으로 항-NGF 인간 항체 분자, 및 구체적으로 NGF 활성을 중화하는 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NGF 관련 질환, 예를 들어, 통증, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐 섬유증, 기타 기도 염증 질환, 당뇨병성 신경병증, 심부정맥, HIV, 관절염, 건선 및 암의 진단 또는 치료에 항-NGF 항체 분자를 사용하는 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

ＮＧＦ에 대한 특이적 결합 멤버{SPECIFIC BINDING MEMBERS FOR NGF}
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기술 분야
본 발명은 특이적 결합 멤버(binding member), 특히 항-NGF 항체 분자, 구체적으로 항-NGF 인간 항체 분자, 및 구체적으로 NGF(신경 성장 인자; Nerve Growth Factor) 활성을 중화하는 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NGF 관련 질환, 예를 들어, 통증, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐 섬유증, 다른 기도 염증 질환, 당뇨병성 신경병증, 심부정맥, HIV, 관절염, 건선 및 암의 진단 또는 치료에 항-NGF 항체 분자를 사용하는 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명은, 본원에 기술된 실험뿐만 아니라, 관련 기술 분야의 이론을 바탕으로 하여 규명된 바와 같이, NGF에 결합하여 이를 중화시킨다는 중요한 특성을 보유하고, 따라서 다양한 치료 방법 중 임의의 방법에 유용한 항체 분자를 제공한다.
신경 성장 인자(β-NGF, 일반적으로 NGF라 알려짐)는 신경계의 발달에 있어 서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있다. 그러나, 성인에 있어서 NGF는, 중추 뉴런 및 말초 뉴런 하위 세트의 생존과 유지에 도움을 주는 것과 같이, 보다 더 제한적인 역할을 한다(Huang & Reichardt, 2001). NGF는 또한 중추 뉴런 및 말초 뉴런의 작용 특성을 조정하기도 한다. 이와 같이, 뉴런의 작용 특성을 조정하는 것의 일환으로서, NGF는 통각수용기(nociceptor)의 감수성 또는 민감성을 증가시킨다(Priestley외 다수, 2002; Bennett, 2001). 이와 같은 말초 뉴런은 최종적으로 통증을 느끼게 하는 다양한 유해 자극을 감지하여 이를 중추 신경계로 전달한다(통각 수용; nociception). 그러므로, NGF 수준을 감소시키는 제제는 진통 치료제로서 사용될 수 있다.
통증을 제대로 치료하지 않았을 때 들어가는 사회 비용 역시 항-NGF 활성을 바탕으로 하는 진통제의 유용성을 한층 더 높일 수 있다. 다시 말해서, 다양한 진통제가 존재하고 또한 널리 사용되고 있지만, 새로운 진통제의 개발이 필요한 시점에 와 있다는 것이다. 통증은 약물의 도움이 필요하고 전문의의 진료를 받는 모든 환자들 중 절반 가량이 가장 많이 호소하는 증상 중 가장 흔한 증상의 하나이다. 통증으로 인하여 사회의 막대한 비용이 손실되고 있다는 사실은 조사 결과를 통하여 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국의 경우, 약 3천 4백만 명의 미국인들이 만성 통증에 시달리고 있다. 또한, 그로 인하여 매년 5천만일이나 되는 일실 손해가 초래되고 있다. 요통과 관절통 그리고 편두통에 들어가는 직접적 의료 비용만도 매년 4억 달러나 된다. 통증 관련 처방약 시장의 총 수익은 1년에 약 15억 달러나 된다(Pleuvry & Pleuvry).
위의 통계 자료에서 알 수 있는 바와 같이, 상당한 비율의 통증 환자들은 그들의 통증을 충분히 덜어내고 있지 못하고 있다. 결과적으로, 의료계에서는 작용 기작이 새로우며, 안전하고 효과적인 진통제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이와 같이, 조직 내 수준을 감소시키거나 또는 분비된 NGF의 효능을 억제하는 치료제는 신규 진통제가 될 수 있다. NGF 자체를 피하 주사하면 인간과 동물에 통증이 유발된다. 그러므로, 주사된 NGF는 급속하게 온도 통각 과민 현상을 유발시키고, 이 온도 통각 과민 현상은 지연되며 그 결과, 기계적 이질통을 일으키게 되는 것이다(Petty외 다수, 1994; McArthur외 다수, 2000). 이와 유사하게, 체내 분비된 NGF는 부-통각성(pro-nociceptive)이다. NGF의 조직-손상-유발성 방출 및 이의 추후 말초 신경에 있어서의 작용은 "말초 감작(peripheral sensitization)" 과정을 통하여 온도 통각 과민 현상을 유발시키는데에 주된 역할을 하고 있다(Mendell & Arvanian, 2002). 조직 손상은 부-통각성 사이토카인 및 부-염증성 사이토카인의 방출을 촉진하여, 각질 세포 및 섬유 아세포로부터 NGF를 방출시킨다. 이와 같이 방출된 NGF는 통각 수용기에 직접적으로 작용하여 유해 자극에 노출되고 나서 수 분 이내에 아픔을 느끼는 상태 즉, 통각 상태를 유발한다. 이러한 NGF는 또한 간접적으로 통각 상태/통증 상태를 유발 및 유지시키기도 한다. 이는 비만 세포의 탈과립을 촉진하여, 부-통각성 제제 예를 들어, 히스타민 및 세로토닌을 방출시키고, 더욱 중요한 점은 이 NGF가 교감 신경 말단을 자극하여 부-통각 신경 전달 물질 예를 들어, 노르아드레날린을 방출시킬 수도 있다는 점이다(Ma & Woolf, 1997).
CFA 및 카라기난을 동물에 주입할 경우 NGF의 조직 내 수준은 상승한다(Ma & Woolf, 1997; Amann & Schuligoi, 2000). 뿐만 아니라, NGF의 수준은 류마티즘성 관절염(Aloe & Tuveri, 1997) 또는 방광염(Lowe외 다수, 1997) 환자의 경우 상승하는 것으로 알려져 있다. 설치류의 경우, 말초 신경이 손상되면 대식 세포, 섬유 아세포 및 슈반 세포(Schwann cell) 내 NGF mRNA 발현량이 증가한다(Heumann외 다수, 1987). 트랜스제닉 마우스 내 NGF가 과발현되면, 신경 손상에 따른 신경 병증성 통증 거동이 야생형 마우스의 경우보다 더 증가된다(Ramer외 다수, 1998). 수 시간 및 수 일에 걸쳐, NGF 수준이 증가함으로 인하여 "중추 감작화"(즉, 척추의 통각 경로에 관여하는 시냅스에서의 신경 전달 강화)가 촉진된다. 중추 감작화는 지속적이고 만성적인 통각 과민 현상과 이질통을 초래한다. 이러한 과정은 NGF와 이의 고 친화성 수용체인 trkA(티로신 수용체 키나제 A)의 복합체의 내면화(internalization)가 관여하는 것으로 생각된다. 척추 신경절(DRG)에 있어서 이 복합체가 통각 수용 세포체로 역 운반될 경우, 척추의 척수 후각 내에서의 통각 수용성 신경 펩티드(예를 들어, 물질 P, CGRP) 분비, PKC 활성화 및 NMDA 수용체 활성화를 촉진하하는데(Sah외 다수,2003) - 이들 과정은 모두 통각 수용 경로의 감작화를 촉진하는 기능을 가진다. NGF는 또한 전압-의존성 및 리간드-게이트 이온 채널 예를 들어, 나트륨 채널 아형 및 캡사이신 수용체, VR1을 상승 조절 및 재분포시키는 역할을 하기도 한다(Mamet외 다수, 1999; Fjell외 다수, 1999; Priestley외 다수, 2002). 전달 물질, 수용체 및 이온 채널의 변형 활성 및/또는 발현은 신경병적 통증 상태와 관련된 통각 수용기의 감수성과 민감성을 증가시킨다.
NGF는 또한 교감 뉴런의 발아(sprouting) 및 통각 뉴런이 비정상적으로 신경 감응되는 것을 촉진할 수도 있다. 이와 같은 신경 감응은 만성 통각 수용 상태/통증 상태 예를 들어, 교감 신경에 의해 유지되는 통증 또는 복합적 국부 통증 증상을 유도 및 유지시키는 데에 기여하는 것으로 생각된다(Ramer외 다수, 1999).
NGF 유도성 통각 수용/통증은 고 친화성 NGF 수용체인 trkA(티로신 수용체 키나제 A)에 의해 매개 된다(Sah,외 다수, 2003). DRG내 약 40∼45%의 통각 수용 세포체가 trkA를 발현한다. 이는 지름이 작은 세포체 섬유 즉, C-섬유로서, 분비형 부-통각 수용 펩티드인 물질 P 및 CGRP를 발현한다. 이 섬유들은 이 섬유들이 말초 통각 수용기에 의해 감작된 유해 자극을 중추 신경계로 전달하는 곳인 후각(dorsal horn)의 제I 및 제 II 추궁판에서 종지된다. TrkA 유전자를 돌연 변이시키거나 또는 결실시키면, 인간(Indo, 2002) 및 trkA 녹-아웃(knock-out) 마우스 둘 다에서의 통증 감작 상실을 특징으로 하는 표현형이 발현된다(de Castro외 다수, 1998). 중요한 사실은, trkA 발현은 관절염 동물 모델(Pozza외 다수, 2000) 또는 방광염 통증 동물 모델(Qiao & Vizzard, 2002), 또는 완전 프로인트 애쥬반트(CFA) 또는 카라기난을 발에 주사하여 유발된 염증성 통증 동물 모델에 있어서 상향 조절된다는 사실이다(Cho외 다수, 1996).
NGF는 또한 p75 뉴로트로핀 수용체에 결합하기도 한다. p75 수용체의 역할은 이의 세포내 환경과, 부수적 기능 또는 보조 수용체 기능을 하는 것으로 생각되는 기타 수용체의 존부에 의존적이다. trkA 및 p75 수용체 사이의 상호 작용은 NGF에 대한 고 친화성 결합 부위를 형성한다. NGF-매개 통증 신호 전달에 있어서 이러한 수용체의 상호 작용에 관한 중요성은 규명되지 않았지만, 최근 연구에서는, 세포 내 과정에 p75 수용체가 관련되어 있을 수도 있음을 알아냈다. 그러나, p75 수용체 녹아웃 마우스의 유해 자극에 대한 역치 값이 상승하였음에 반해, 이 마우스의 NGF 통각 과민 효과에 대해서는 여전히 반응성인 것으로 보아, 이 trkA 수용체는 단독으로 이러한 효과들을 매개하는데에 충분함을 알 수 있다(Bergmann외 다수, 1998).
전술한 증거를 통하여, NGF-매개 과정은 급성 통증, 단기 통증, 지속적 통각 수용 통증, 그리고 지속성 또는 만성 신경 병증성 통증을 유발시킴을 알 수 있다. 따라서, 항-NGF 제제는 이와 같은 여러 형태의 통증 상태 중 임의의 것 또는 모두를 겪고 있는 환자들을 치료하는데에 효과적인 진통제로서 유용함을 알 수 있다.
이러한 항-NGF 제제의 하나인 trkA-Fc는 내인성 NGF에 결합하여 이를 불활성화시키는 미끼 또는 청소부의 역할을 한다. TrkA-Fc는 IgG 항체의 불변 도메인 단편(Fc)에 결합 되어 있는 trkA의 NGF 결합 부위로 이루어진 융합 단백질이다. TrkA-Fc는 정상인 동물에 있어서 통각 과민 형성을 일으키고, 통각 수용 반응을 감소시키며, 또한 미엘린이 없는 통증 감작 뉴런의 발아를 감소시킨다(Bennett외 다수, 1998).
NGF에 대해여 생성된 항혈청은 또한 국소 또는 전신 주사될 경우, NGF 수준을 감소시킬 수도 있다. 항-NGF 항혈청 및 trkA-Fc는 둘 다 래트에 있어서 카라기난 및 CFA-유발 염증성 발 통증(Koltzenberg외 다수, 1999) 및 방광 염증 반응(Jaggar외 다수, 1999)을 감소시킨다. 항-NGF 항혈청은 열 및 냉 통각 과민 현상, 역으로 확립된 열 통각 과민 현상을 차단하고, 신경 병증성 통증의 만성 수축 손상(CCI) 모델에 있어 부대 발아 현상을 막아준다(Woolf, 1996; Ro외 다수, 1999). trkA-NGF 상호 작용의 소 분자 억제제에 관하여도 보고된 바 있다. 래트에 있어서, NGF-trkA 억제제인 ALE-0540은 온도-유발 염증성 통증 모델 및 급성 및 지속성 통증의 포르말린 테스트에 있어서, 통각 과민 현상을 감소시킨다(Owolabi외 다수, 1999). ALE-0540은 또한 신경 병증성 통증의 좌골 신경 손상 모델에 있어서 기계적 이질통을 줄여준다(Owolabi외 다수, 1999).
일반적으로 치료용 항체는 밀접하게 관련되어 있는 수용체, 수용체 리간드, 채널 또는 효소 군 내에서 표적 선택 범위에 관한 예측 가능성(즉, 소 분자 약물을 통해서는 얻기 힘든 예측 가능성)을 제공한다. NGF 수준은 유해 자극에 반응하여 말초 혈액 내에서 증가하고, 항체는 혈뇌장벽 투과성이 낮기 때문에, NGF-매개성 통증은 항체를 이용하는 안전하고도 효과적인 치료 방법에 특히 적합하다. 폴리클로날 항체는 동물 통증 모델에 있어서 효과적인 것으로 판단되지만, 항-NGF 모노클로날 항체는 일관되고, 널리 규명되어 있으며, 화학적인 실체를 제조 및 특성 규명함에 있어서의 이점으로 인해 인간의 치료제로서 성공적으로 개발된 것으로 생각된다. 마우스 항-NGF 모노클로날 항체의 항-통각 수용 효과(Sammons외 다수, 2000)에 관하여는 보고된 바 있지만, 이러한 항체의 아미노산 서열은 제공되지 않았다.
최근 연구 결과에 따르면, NGF는 통증 이외에도 기타 병상을 유발한다고 한다. 그러므로, 항-NGF 항체는 기타 NGF-매개성 질병 예를 들어, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐 섬유증, 기타 기도 염증 질환(Hoyle, 2003; Lommatzch외 다수, 2003), 당뇨병성 신경병증(Yasuda외 다수, 2003), 심부정맥(WO 04/032852), HIV(Garaci외 다수, 2003), 관절염, 건선 및 암(Nakagawara, 2001)을 치료하는데에 있어서도 유 용성을 가질 수 있다.
WO 02/096458는 항-NGF 항체, 특히 마우스 모노클로날 항체 911과, 이러한 항체를 다양한 NGF-관련 질환 예를 들어, 통증, 천식, 관절염 및 건선의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다. 이에 따르면, 항체 911은 실험용 알레르기 마우스 모델의 면역계에 어떠한 악영향도 미치지 않았다고 기술되어 있다. 이러한 항체에 관하여는 또한 문헌[Hongo외 다수, 2000]에도 기술되어 있다.
WO 04/032870에는 수술 후 통증에 관한 실험 모델에 있어서 마우스 모노클로날 NGF 항체 mAb 911 및 인간화된 NGF 항체 E3의 통증-감소 효과에 관하여 기술되어 있다. E3은 인간 중쇄 감마 2a 불변부와 2개의 아미노산이 상이하다.
WO 04/032852에는 NGF 길항제를 사용하여 심장 돌연사를 예방하는 방법 및 심부정맥을 치료하는 방법에 관하여 기술되어 있다.
WO 01/78698에는 만성 내장 연관통을 치료하는데에 있어서 NGF에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하는 방법에 관하여 기술되어 있다.
본 발명은 NGF, 바람직하게는 인간 NGF에 대한 특이적 결합 멤버를 제공한다. 그러므로, 본 발명의 특이적 결합 멤버는 인간 NGF 또는 비인간 NGF(예를 들어, 인간을 제외한 영장류 NGF 및/또는 래트 NGF 및/또는 마우스 NGF)에 결합할 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 인간 NGF에 대한 항체, 특히 비인간 NGF, 예를 들어, 인간을 제외한 영장류 NGF 및/또는 마우스 NGF 및/또는 래트 NGF와 교차 반응을 할 수 있는 인간 항체일 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 NGF를 중화한다. 중화(neutralization)란, NGF의 생물 활성을 감소 또는 억제하는 것, 예를 들어 NGF가 이의 수용체(바람직하게는 TrkA) 중 하나 이상과 결합하는 것을 감소 또는 억제하는 것을 의미한다. 생물 활성의 감소는 부분적이거나 또는 완전한 것일 수 있다. 항체가 NGF를 중화하는 정도란, 이 항체의 중화 효능(neutralizing potency)을 의미하는 것이다. 효능은 당업자에게 공지된 하나 이상의 검정법을 이용하고/이용하거나, 예를 들어, 이하와 같이 본원에 기술 또는 언급된 바에 따라서 결정 또는 측정될 수 있다:
- "FLIPR" 칼슘 이동 검정법(본원의 실시예 2 참조)
- PC12 생존 검정법(본원의 실시예 5 참조)
- TF-1 증식 검정법(본원의 실시예 6 참조)
- 수용체 결합 억제 검정법(본원의 실시예 9 참조)
검정 및 효능에 관하여는 이하에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 중화 효능에 대해 최적화될 수 있다. 일반적으로 효능 최적화는 선택된 특이적 결합 멤버 서열(일반적으로 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연 변이시켜, 특이적 결합 멤버 라이브러리를 생성하고, 이후 효능에 대해 검정하여 보다 효능이 뛰어난 특이적 결합 멤버를 선택하는 단계를 포함한다. 그러므로, 선택된 "효능 최적화된" 특이적 결합 멤버는 라이브러리가 생산하는 특이적 결합 멤버보다 효능이 더 큰 경향이 있다. 그러나, 효능이 뛰어난 특이적 결합 멤버는 또한 최적화 과정 없이도 얻을 수 있는데, 예를 들어, 효능이 뛰어난 특이적 결합 멤버는 초기 스크리닝 방법, 예를 들어 생화학적 중화 검정법으로부터 직접적으로 얻을 수 있다. 본 발명은 효능 최적화 및 효능 비최적화된 특이적 결합 멤버 둘 다와, 선택된 특이적 결합 멤버를 효능 최적화하는 방법을 제공한다. 그러므로, 본 발명을 통하여 당업자는 효능이 뛰어난 특이적 결합 멤버를 생산할 수 있는 것이다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 항통각 과민 활성 및/또는 항이질통 활성을 나타내는데, 예를 들어, 카라기난 유발성 온도 통각 과민 현상을 억제한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 특이적 결합 멤버는 항체 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 특이적 결합 멤버는 비항체 분자 내 항원 결합 부위 예를 들어, 비항체 단백질 골격 내 CDR 세트(이하 부연 설명함)를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면 및 구체예에는 이하에 포함된 청구항의 표제어가 제공된다.
본 발명에 포함되는 바람직한 구체예는 항체 분자이다[여기서, 이 항체는 전체 항체(whole antibody)(예를 들어, IgG 예를 들어, IgG4) 또는 항체 단편(예를 들어, scFv, Fab, dAb)임]. 바람직하게, 본 발명의 항체 분자는 인간 항체 분자이다. 항체의 항원 결합 부위, 예를 들어, 항체 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 분자가 제공된다. VH 및 VL 도메인 내에는 상보성 결정 부위("CDR")와 골격구조 부위("FR")가 존재하며, 이 부위들은 VH 및 VL 도메인을 형성할 수 있다. 항체의 항원 결합 부위는 항체의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인으로 이루어질 수 있다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트 및 HCDR 세트, 그리고 LCDR 세트는 본 발명의 측면 및 구체예를 나타낸다. "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 그러므로, HCDR 세트란, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미하는 것이고, LCDR 세트란, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미하는 것이다. 달리 언급이 없으면, "CDR 세트"에는 HCDR 및 LCDR을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 VH 및 VL 도메인과 CDR의 예는 첨부된 서열 목록에 나열되어 있다.
다수의 항체 계통에 관하여는 본원에 경우에 따라 하나 이상 예를 들어, 1개 또는 2개, 또는 2개의 치환이 발생한 서열, 예를 들어, CDR 서열 세트를 참고로 하여 정의되어 있다. 바람직한 모(parent) 계통은 1021E5 계통이다. 상기 1021E5 계통은 바람직한 항체 분자인 1133C11 및 기타 "1133C11 계통" 항체 분자 예를 들어, 1252A5를 포함한다. 뿐만 아니라, 1021E5 모 계통 내에는 항체 분자인 1165D4, 1230H7 및 1152H5가 존재한다. 본 발명의 발명자들은 특히 중요한 NGF에 대한 인간 항체의 항원 결합 부위를 제공하는, 1021E5, 1083H4, 및 특히 1133C11 계통을 동정하였다.
상기 1133C11 계통은 다음과 같이 1133C11의 6개의 CDR 서열 세트를 참고로 하여 정의된다: HCDR1(서열 번호 193), HCDR2(서열 번호 194), HCDR3(서열 번호 195), LCDR1(서열 번호 198), LCDR2(서열 번호 199) 및 LCDR3(서열 번호 200). HCDR1이 서열 번호 193의 아미노산 서열을 가지고, HCDR2는 서열 번호 194의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3은 서열 번호 195의 아미노산 서열을 가지고, LCDR1은 서열 번호 198의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 199의 아미노산 서열을 가지고, LCDR3은 서열 번호 200의 아미노산 서열을 가지는 CDR 세트를 본원에서는 "CDR의 1133C11 세트"라 칭한다. CDR의 1133C11 세트 내 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 "HCDR의 1133C11 세트"라 칭하고, CDR의 1133C11 세트 내 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 "LCDR의 1133C11 세트"라 칭한다. CDR의 1133C11 세트, HCDR의 1133C11 세트 또는 LCDR의 1133C11 세트를 가지거나, 또는 이에 1개 또는 2개의 치환이 발생한 CDR 세트는 1133C11 계통에 해당한다.
기타 바람직한 CDR 계통 및 세트는 본원의 임의의 곳에 제시된 유사 CDR 예를 들어, 표 2a에 제시된 CDR 세트(바람직한 구체예)를 참고로 하여 정의된다[표 2b에는 서열 번호와 함께 제시됨]. 표 2a 및 표 2b는 클론 1021E5로부터 유래된 최적화 클론의 CDR 세트(HCDR 및 LCDR 세트)를 나타내는데, 이로써, 최적화된 클론의 CDR 서열이 1021E5의 CDR 서열과 어떻게 상이한지 알 수 있다. 표 2a/표 2b의 CDR 세트는 표에 제시된 임의의 클론(경우에 따라 1021E5 자체도 포함함)으로부터 유래하는 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트를 포함한다.
이와 같은 CDR 세트는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 개시 서열을 가지는 CDR 세트로서 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같이, 한정된 CDR 세트, HCDR 세트 또는 LCDR 세트와, 본원에 개시된 CDR 세트 내에 1개 또는 2개의 치환을 포함하는 CDR 세트를 포함하는 특이적 결합 멤버 및 항체 분자를 제공한다. CDR의 관련 세트는 이하에 기술된 바와 같이, 항체 골격구조 또는 기타 단백질 골격, 예를 들어, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 내에 제공된다[Koide외 다수, 1998; Nygren외 다수, 1997]. 항체 골격구조 부위를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트는 골격구조(예를 들어 인간 골격구조)에 이식되어, 항체 분자 또는 상이한 항체 분자를 만들 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 1021E5 계통 항체의 CDR과 인간 생식계열 유전자 분절 서열의 골격구조 부위를 포함할 수 있다. 같은 계통의 항체는 "생식계열화(germlining)"[즉, 하나 이상의 골격구조 내 잔기 들이 변형되어 가장 유사한 인간 생식계열 골격구조(예를 들어, VH1 군에서 유래하는 DP10) 또는 λ1 군의 골격구조 예를 들어, DPL5 내 동등한 위치에 있는 잔기들과 매치되는 과정]될 수 있는 골격구조 내의 CDR 세트로 제공될 수 있다. 그러므로, 항체 골격구조 부위는 생식계열 및/또는 인간의 것인 것이 바람직하다.
본 발명은 NGF에 대해 특이적이고, DP10을 포함하는 인간 생식계열 골격구조 내 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 가지는, 단리된 인간 항체를 제공한다. 보통, 특이적 결합 멤버는 바람직하게는 Vλ1을 포함하는 인간 생식계열 골격구조 예를 들어, DPL5 내의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 보유하기도 한다. 바람직하게, 상기 CDR은 본원에 개시된 CDR 세트이다.
"실질적으로 제시된 바와 같은"이란, 본 발명의 관련 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 본원에 제시된 서열의 특정 부위와 동일하거나 또는 매우 유사할 것이라는 의미이다. "매우 유사한"이란, 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개 예를 들어, 1∼3개, 또는 1개 또는 2개, 또는 3개 또는 4개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에 발생할 수 있음을 의미하는 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 NGF에 대한 특이적 결합 멤버를 제공하는데, 이 결합 멤버는 인간 항체의 VH 도메인과 인간 항체의 VL 도메인으로 이루어진 항체의 항원 결합 부위와, CDR 세트를 포함하며, 여기서, 상기 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 HCDR1은 서열 번호 193의 아미노산 서열을 가지고, HCDR2는 서열 번호 194의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3은 서열 번호 195의 아미노산 서열을 가지고, LCDR1은 서열 번호 198의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 199의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 200의 아미노산 서열을 가지거나; 또는 CDR 세트는 이 CDR 세트와 비교하였을 때 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
그러므로, 본 발명은 NGF에 대한 특이적 결합 멤버를 제공하는데, 이 결합 멤버는 인간 항체의 VH 도메인과 인간 항체의 VL 도메인으로 이루어져 있고 CDR 세트를 포함하는 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 여기서, 상기 CDR 세트는 CDR의 1133C11 세트 또는 본원에 개시된 기타 CDR 세트이거나, 또는 CDR의 1133C11 세트 또는 본원에 개시된 기타 세트와 비교하였을 때 1개 또는 2개의 치환을 포함하는 CDR 세트이다.
바람직한 구체예에서, 1개 또는 2개의 치환은 다음과 같은 VH 및/또는 VL 도메인의 CDR 내 존재하는 잔기들 중 1개 또는 2개에서 발생한다[카밧(Kabat)(1991)에 의한 표준 넘버링을 사용].
31번 및 34번 잔기(HCDR1),
51번, 55번, 56번, 57번, 58번 및 65번 잔기(HCDR2),
96번 잔기(HCDR3),
26번, 27번, 27A번, 27B번, 28번, 29번 및 30번 잔기(LCDR1),
56번 잔기(LCDR2),
90번 및 94번 잔기(LCDR3).
바람직한 구체예에서, 1개 또는 2개의 치환은, 동정된 가능한 치환 잔기의 군에 따라서 다음과 같은 CDR의 1133C11 세트 내 잔기들 중 1개 또는 2개의 잔기에서 발생한다:
치환 위치 다음과 같은 잔기로 구성된 군에서 선택된 치환 잔기
31(HCDR1) A
34(HCDR1) V
51(HCDR2) V
55(HCDR2) N
56(HCDR2) A
57(HCDR2) V
58(HCDR2) S
65(HCDR2) D
96(HCDR3) N
26(LCDR1) T
26(LCDR1) G
27(LCDR1) N
27(LCDR1) R
27A(LCDR1) T
27A(LCDR1) P
27B(LCDR1) D
28(LCDR1) T
29(LCDR1) E
30(LCDR1) D
56(LCDR2) T
90(LCDR3) A
94(LCDR3) G
LCDR1 내에 존재하는 29E번 잔기는 특히 바람직한 구체예이다.
바람직한 구체예는 CDR의 1133C11 또는 1252A5, 1152H5, 1165D4, 1230H7 또는 1021E5 세트를 가진다.
하나의 구체예에서, 단리된 특이적 결합 멤버는 HCDR3 내에 존재하는 아미노산 서열 LNPSLTA(서열 번호 531)이 아미노산 서열 FNSALIS(서열 번호 532) 또는 아미노산 서열 MISSLQP(서열 번호 533)로 치환되어 있는 CDR의 1133C11 세트를 포함하는 CDR 세트를 포함한다.
본원에 개시된 계통의 임의의 HCDR 세트는 특이적 결합 멤버 단독으로 사용되거나, 또는 VL 도메인과 함께 사용되는 VH 도메인에 제공된다. VH 도메인은 1133C11, 1021E5 또는 기타 계통의 항체의 HCDR 세트 예를 들어, 표 2a/표 2b에 제시된 HCDR 세트로 제공될 수 있으며, 만일 이러한 VH 도메인이 VL 도메인과 짝을 형성하면, VL 도메인은 1133C11, 1021E5 또는 기타 계통의 항체의 LCDR 세트 예를 들어, 표 2a/표 2b에 제시된 LCDR 세트로 제공될 수 있다. HCDR 세트와 LCDR 세트의 짝 형성에 관하여는 표 2a/표 2b에 나타내었으며, 이로써 표 2a/표 2b에 나타낸 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 항체의 항원 결합 부위를 제공한다.
VH 및 VL 도메인 골격구조는 생식계열 골격구조 부위일 수 있는(일반적으로는 인간의 생식계열인) 하나 이상의 골격구조 부위를 포함한다. VH 도메인 골격구조는 바람직하게는 인간의 중쇄 생식계열 골격구조이고, VL 도메인 골격구조는 바람직하게는 인간의 경쇄 생식계열 골격구조이다. 중쇄 도메인의 골격구조 부위는 VH-1 군에서 선택될 수 있으며, 바람직한 VH-1 골격구조는 DP-10 골격구조이다. 경쇄의 골격구조 부위는 λ1 군에서 선택될 수 있으며, 바람직한 골격구조는 DPL5이다.
하나 이상의 CDR은 1252A5 VH 또는 VL 도메인으로부터 분리되어 적당한 골격구조 내에 통합될 수 있다. 이에 관하여는 본원에 보다 상세히 기술되어 있다. 1252A5 HCDR1, 2 및 3은 각각 서열 번호 393, 394 및 395에 나타내었다. 1252A5 LCDR1, 2 및 3은 각각 서열 번호 398, 399 및 400에 나타내었다.
이는 본원에 개시된 기타 CDR 및 CDR 세트 특히, 1152H5, 1165D4 및 1230H7에 관하여도 동일하게 적용된다.
본 발명의 구체예는 1021E5 계통의 항체 분자 예를 들어, 항체 분자 1021E5의 항체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 이용한다. VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버는 또한 본 발명에 의하여 제공된다.
바람직한 구체예는 다음과 같다:
다음과 같은 것들의 VH 도메인, VL 도메인, HCDR 세트, LCDR 세트, 또는 CDR 세트: 1126F1(VH, 서열 번호 102; VL, 서열 번호 107), 1126G5(VH, 서열 번호 112; VL, 서열 번호 117), 1126H5(VH, 서열 번호 122; VL, 서열 번호 127), 1127D9(VH, 서열 번호 132; VL, 서열 번호 137), 1127F9(VH, 서열 번호 142; VL, 서열 번호 147), 1131D7(VH, 서열 번호 152; VL, 서열 번호 157), 1131H2(VH, 서열 번호 162; VL, 서열 번호 167), 1132A9(VH, 서열 번호 172; VL, 서열 번호 177), 1132H9(VH, 서열 번호 182; VL, 서열 번호 187), 1133C11(VH, 서열 번호 192; VL, 서열 번호 197), 1134D9(VH, 서열 번호 202; VL, 서열 번호 207), 1145D1(VH, 서열 번호 212; VL, 서열 번호 217), 1146D7(VH, 서열 번호 222; VL, 서열 번호 227), 1147D2(VH, 서열 번호 232; VL, 서열 번호 237), 1147G9(VH, 서열 번호 242; VL, 서열 번호 247), 1150F1(VH, 서열 번호 252; VL, 서열 번호 257), 1152H5(VH, 서열 번호 262; VL, 서열 번호 267), 1155H1(VH, 서열 번호 272; VL, 서열 번호 277), 1158A1(VH, 서열 번호 282; VL, 서열 번호 287), 1160E3(VH, 서열 번호 292; VL, 서열 번호 297), 1165D4(VH, 서열 번호 302; VL, 서열 번호 307), 1175H8(VH, 서열 번호 312; VL, 서열 번호 317), 1211GlO(VH, 서열 번호 322; VL, 서열 번호 327), 1214A1(VH, 서열 번호 332; VL, 서열 번호 337), 1214D10(VH, 서열 번호 342; VL, 서열 번호 347), 1218H5(VH, 서열 번호 352; VL, 서열 번호 357) 및 1230H7(VH, 서열 번호 362; VL, 서열 번호 367).
기타 추가의 바람직한 구체예로서는 1083H4(VH, 서열 번호 22; VL, 서열 번호 27), 1227H8(VH, 서열 번호 372; VL, 서열 번호 377) 및 1230D8(VH, 서열 번호 382; VL, 서열 번호 387)의 VH 도메인, VL 도메인, HCDR 세트, LCDR 세트 또는 CDR 세트가 있다.
매우 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 서열 번호 192의 아미노산 서열로 제공되는데, 이를 "1133C11 VH 도메인"이라 칭한다. 추가의 매우 바람직한 구체예에서, VL 도메인은 서열 번호 197의 아미노산 서열로 제공되는데, 이를 "1133C11 VL 도메인"이라 칭한다. 본 발명에 의하여 제공된 매우 바람직한 항체의 항원 결합 부위는 1133C11 VH 도메인(서열 번호 192)과 1133C11 VL 도메인(서열 번호 197)으로 이루어져 있다. 이러한 항체의 항원 결합 부위는 본원에 추가로 기술된 바와 같이 임의의 바람직한 항체 분자 형태 예를 들어, scFv, Fab, IgG 및 IgG4 등에 제공될 수 있다.
추가의 매우 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 서열 번호 392의 아미노산 서열로 제공되는데, 이를 "1252A5 VH 도메인"이라 칭한다. 추가의 매우 바람직한 구체예에서, VL 도메인은 서열 번호 397의 아미노산 서열로 제공되는데, 이를 "1252A5 VL 도메인"이라 칭한다. 본 발명에 따라서 제공되는 매우 바람직한 항체의 항원 결합 부위는 1252A5 VH 도메인(서열 번호 392)와, 1252A5 VL 도메인(서열 번호 397)로 이루어져 있다. 이러한 항체의 항원 결합 부위는 본원에 추가로 기술된 바와 같이 임의의 바람직한 항체 분자 형태 예를 들어, scFv, Fab, IgG 및 IgG4 등에 제공될 수 있다.
추가의 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명은 1252A5 VH 도메인(서열 번호 392) 및 1252A5 VL 도메인(서열 번호 397)을 포함하는 IgG4 항체 분자를 제공한다. 본원에서는 이를 "1252A5 IgG4"라 칭한다.
1252A5 VH 도메인(서열 번호 392) 및/또는 1252A2 VL 도메인(서열 번호 397)을 포함하는 기타 항체 분자 또는 기타 IgG는 본 발명에 의하여 제공되는 것으로서, 이는 항체의 VH 도메인 내 HCDR의 1252A2 세트(서열 번호 393, 394 및 395) 및/또는 항체의 VL 도메인 내 LCDR의 1252A5 세트(서열 번호 398, 399 및 400)를 포함하는 기타 항체 분자의 경우와 같다.
기술된 바와 같이, 본 발명은 인간의 NGF와 결합하고, 1252A5 VH 도메인(서열 번호 392) 및/또는 1252A5 VL 도메인(서열 번호 397)을 포함하는 특이적 결합 멤버를 제공한다. 이와 같이 특이적 결합 멤버의 특성은 본원에 기술되어 있다.
이하 VH 도메인은 단독으로 항원과 결합하는데에 사용될 수 있다고 기술되어 있지만, 일반적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여, 항체의 항원 결합 부위를 제공한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 1252A5 VH 도메인(서열 번호 392)은 1252A5 VL 도메인(서열 번호 397)과 쌍을 형성하며, 이로써 항체의 항원 결합 부위가 1252A5 VH 및 VL 도메인을 모두 포함하게 된다. 기타 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 구체예도 본원에 개시되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 1252A5 VH는 1252A5 VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄의 무작위적 특성(promiscuity)에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 뿐만 아니라, 기타 VH 및 VL 도메인에 관한 유사한 구체예도 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체 예를 들어, 아미노산 서열이 본원에 제시되어 있으며, NGF에 대한 특이적 결합 멤버에 사용될 수 있는 변이체는, 서열 변형 또는 돌연 변이 및 스크리닝 방법에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 방법은 또한 본 발명에 의하여 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 항원과의 결합에 대해서 임의의 특이적 결합 멤버와 경쟁하는 특이적 결합 멤버가 제공되는데, 여기서 상기 임의의 특이적 결합 멤버와, 이와 경쟁하는 특이적 결합 멤버는 둘 다 항원과 결합하고, 본원에 개시된 특이적 결합 멤버, VH 및/또는 VL 도메인, 또는 HCDR3, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체를 포함한다. 결합 멤버들 간 경쟁은 예를 들어, ELISA를 이용하고/이용하거나 특이적 수용체 분자를 하나의 결합 멤버(즉, 하나 이상의 기타 태깅되지 않은 결합 멤버의 존재 하에서 검출될 수 있는 결합 멤버)에 태깅함으로써, 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프와 결합하는 특이적 결합 멤버를 동정할 수 있게 만듦으로써, 시험관 내에서 쉽게 확인할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 추가의 측면은, NGF와의 결합에 대해서 항체 분자와 경쟁하는 인간 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버 예를 들어, 1252A5 또는 기타 바람직한 scFv 및/또는 IgG4를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 NGF와의 결합에 대해서 항체의 항원 결합 부위와 경쟁하는 인간 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 특이적 결합 멤버를 제공하는데, 여기서 상기 항체의 항원 결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어져 있으며, 상기 VH 및 VL 도메인은 본원에 개시된 1133C11, 1021E5, 1252A5 또는 기타 계통의 CDR 세트를 포함한다.
NGF와의 결합에 대해서 1252A5 또는 기타 항체 분자, 1252A5 또는 기타 CDR 세트를 보유하는 항체 분자, 또는 1252A5 CDR 세트 또는 기타 계통의 CDR 세트를 보유하는 항체 분자와 경쟁할 수 있는 NGF에 대한 항체를 얻는데에 다양한 방법이 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 항원과 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합 멤버를 얻는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 따른 특이적 결합 멤버 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키는 단계와, 상기 항원과 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 특이적 결합 멤버를 선별하는 단계를 포함한다.
라이브러리는 입자 또는 분자 복합체 예를 들어, 복제 가능한 유전 패키지 예를 들어, 효모, 박테리아 또는 박테리오파지(예를 들어, T7) 입자, 또는 공유 리보좀 또는 기타 시험관 내 디스플레이 계에 디스플레이될 수 있는데, 여기서, 상기 각각의 입자 또는 분자 복합체는 이것에 디스플레이되는 항체 VH 가변 도메인과, 경우에 따라 디스플레이된 VL 도메인(존재할 경우)을 코딩하는 핵산을 포함한다.
항원과 결합할 수 있으며, 박테리오파지 또는 기타 라이브러리 입자 또는 분자 복합체에 디스플레이되는 특이적 결합 멤버를 선택한 후, 핵산은 상기 선택된 특이적 결합 멤버를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 취하여질 수 있다. 이러한 핵산은 추후의 특이적 결합 멤버 또는 항체의 VH 또는 VL 가변 도메인을, 상기 선택된 특이적 결합 멤버를 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 취하여진 핵산 서열을 가지는 핵산을 발현시켜 생산하는데에 사용될 수 있다.
상기 선별된 특이적 결합 멤버의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 가지는 항체 VH 가변 도메인은 이러한 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 멤버와 같이 단리된 형태로서 제공될 수 있다.
NGF와 결합하는 능력 즉, 예를 들어, 1252A5(예를 들어, scFv 형 및/또는 IgG 형 예를 들어, IgG4 형태인 1252A5)와 NGF 결합에 대해 경쟁하는 능력도 시험 될 수 있다. NGF를 중화하는 능력은 이하, 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이 시험 될 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 1252A5 또는 기타 항체 분자 예를 들어, scFv, 또는 바람직하게는 1252A5 또는 기타 IgG4와 친화성이 있는 NGF, 또는 이보다 친화성이 더욱 큰 NGF에 결합할 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 1252A5 또는 기타 항체 분자 예를 들어, scFv, 또는 바람직하게는 1252A5 또는 기타 IgG4를 중화하는 효능을 가지는 NGF, 또는 이보다 중화 효능이 더욱 뛰어난 NGF를 중화할 수 있다.
상이한 특이적 결합 멤버의 결합 친화성 및 중화 효능은 적당한 조건 하에서 비교될 수 있다.
본 발명의 항체는 현재 시판되고 있는 항-NGF 항체에 비하여 여러 가지 이점들을 가진다. 예를 들어, 본 발명은 인간 또는 생식계열 항체를 제공하는 데, 이 항체는 인간에게 치료용 또는 진단용으로 장기 투여되거나 또는 반복적으로 투여될 경우 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 추측된다. 뿐만 아니라, 본 발명은 NGF의 보다 유효한 중화제인 항체를 제공하므로, 보다 적은 양의 항체를 사용할 경우에도 바람직한 치료 효과 또는 진단 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 하나의 구체예에서, NGF/TrkA 수용체간 상호 작용을 억제하는 효능은 NGF/p75 수용체간 상호 작용을 억제하는 경우에 관찰되는 효능보다 더욱 뛰어나다. 이러한 관점에서 기타 명백하게 비-선택성인 NGF 길항제 치료시의 경우보다 유리한 치료 효과의 성취 정도나 특성, 또는 바람직하지 않은 부작용을 감소시킨다는 이점을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 항-NGF 항체 분자를 포함하는 이종 제제를 제공한다. 예를 들어, 이러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신이 결여된 중쇄를 가지고, 글리코실화 정도가 다양하며/다양하거나, 유도체화 된 아미노산 예를 들어, N-말단의 글루탐산이 고리화되어 파이로 글루탐산 잔기로 형성되는 아미노산을 보유하는 항체 혼합물일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산과, 본 발명의 특이적 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 이 방법은 상기 특이적 결합 멤버, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 생산할 수 있는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키고, 발현된 핵산을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 항체 VH 가변 도메인 및/또는 VL 가변 도메인을 코딩하는 핵산(일반적으로 단리된 핵산)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 코딩하는 핵산(일반적으로 단리된 핵산)을 제공하는 것인데, 여기서 상기 VH CDR은 1133C11[VH CDR1(서열 번호 193), VH CDR2(서열 번호 194) 및 VH CDR3(서열 번호 195)], 1152H5[VH CDR1(서열 번호 263), VH CDR2(서열 번호 264) 및 VH CDR3(서열 번호 265)] 및 1252A5[VH CDR1(서열 번호 393), VH CDR2(서열 번호 394) 및 VH CDR3(서열 번호 395)]로 구성된 군에서 선택되고, 또는 상기 VL CDR은 1133C11[VL CDR1(서열 번호 198), VL CDR2(서열 번호 199) 및 VL CDR3(서열 번호 200)], 1152H5[VL CDR1(서열 번호 268), VL CDR2(서열 번호 269) 및 VL CDR3(서열 번호 270)] 및 1252A5[VL CDR1(서열 번호 398), VL CDR2(서열 번호 399) 및 VL CDR3(서열 번호 400)]로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 1252A5 VH CDR3(서열 번호 395)이다. CDR의 1252A5 세트를 코딩하는 핵산, HCDR의 1252A5 세트를 코딩하는 핵산 및 LCDR의 1252A5 세트를 코딩하는 핵산도 또한 본 발명에 의하여 제공되며, 1252A5, 1133C11 또는 1021E5 계통의 CDR, HCDR 및 LCDR과, HCDR, LCDR 및 CDR 세트도 동일하다.
추가의 측면은 본 발명의 핵산으로 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 측면은 항체의 VH 가변 도메인을 제조하는 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 코딩 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인을 생산하기 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인과 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 멤버를 생산하는 유사 방법이 본 발명의 추가의 측면으로서 제공된다.
제조 방법은 생성물을 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을 하나 이상의 부가 성분 예를 들어, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물 내로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 특이적 결합 멤버를 함유하는 조성물과, NGF를 억제 또는 중화시키는 방법 예를 들어, 인간 또는 동물의 치료 방법에 있어서의 이 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 인간 또는 동물의 치료 또는 진단 방법 예를 들어, 본 발명의 특이적 결합 멤버를 유효량 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간인 환자의 질병 또는 질환을 치료하는 방법(예방적 처치도 포함할 수 있음)에 사용될 수 있다. 본 발명에 의하여 치료 가능한 병상으로서는, NGF가 관여하는 임의의 병상을 포함하는데, 구체적으로 통증, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐 섬유증, 기타 기도 염증 질환, 당뇨병성 신경병증, HIV, 심부정맥, 관절염, 건선 및 암을 포함한다.
본 발명의 상기와 같은 측면들 및 기타 측면들은 이하에 더욱 상세히 기술되어 있다.
용어 설명
본원에 사용된 "및/또는"이란 용어는 2개의 특정 성질 또는 성분 각각을 독립적으로 또는 함께 구체적으로 명시하는 의미임을 짚고 넘어가는 것이 이해하기 쉬울 것이다. 예를 들어, "A 및/또는 B"란, 본원에 각각 제시되어 있는 바와 같이, (i) A, (ii) B와, (iii) A 및 B의 경우를 각각 구체적으로 명시하는 의미이다.
NGF
NGF(베타-NGF라고도 알려짐)는 신경 성장 인자이다. 본 발명의 내용 중 NGF는 보통 인간의 NGF이지만, 비인간 NGF(예를 들어, 인간을 제외한 영장류 NGF 및/또는 래트 NGF 및/또는 마우스 NGF)일 수도 있다. 본원에 있어서 NGF는 또한 "항원"을 의미하기도 한다.
본원에 기술된 검정법에 사용된 NGF는 일반적으로 인간, 래트 또는 마우스 NGF이지만, 기타 인간 이외의 동물로부터 유래된 NGF 예를 들어, 인간 이외의 영장류 NGF도 사용될 수 있다.
통증
이 용어는, 당 업계에 널리 알려져 있는 바와 같이, 통증의 감작을 의미하는 것으로서, 다음과 같은 것들 중 하나 이상, 또는 모두를 포함할 수 있다:
- 통각 과민 현상(보통의 통증 자극에 대해 과민한 통증 반응을 나타내는 경우);
- 이질통(보통의 경우에는 느낄 수 없는 통증 자극에 의해 유발되는 통증의 감작화);
- 눈에 띄는 외부 자극 없이도 임의의 기작에 의해 유발되는 통증의 자발적 감작화;
- 물리적 자극 예를 들어, 열, 온기, 차가움, 압력, 진동, 정적(static) 또는 동적(dynamic) 접촉, 또는 몸의 자세와 움직임에 의해 유발되는 통증;
- 임의의 기작 예를 들어, 외상, 감염, 염증, 대사 질환, 뇌졸중 또는 신경병에 의하여 유발되는 체성 및 장기 통증.
통증은 예를 들어, 급성 통증, 단기 통증, 지속성 통각 수용 통증, 또는 지속성 또는 만성 신경병성 통증일 수 있다.
특이적 결합 멤버
이 용어는 서로에 대해 결합 특이성을 가지는 분자 쌍의 멤버를 의미하는 것이다. 특이적 결합 쌍의 멤버는 천연에서 유도될 수 있거나, 또는 전체적으로나 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자 쌍의 멤버는 그 표면에 특이적 결합에 관여하는 일정 구역 또는 공동(cavity)을 보유하므로, 분자 쌍 중 다른 멤버의 특정 공간 조직(spatial organization) 및 요철 조직(polar organization)과 상보성이다. 그러므로, 상기 쌍의 멤버는 서로에 대해 특이적으로 결합하는 특성을 보유한다. 특이적 결합 쌍의 종류로서는 예를 들어, 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이 있다. 본 발명은 항원-항체 류 반응에 관한 것이다.
특이적 결합 멤버는 보통 항원 결합 부위를 가지는 분자를 포함한다. 예를 들어, 특이적 결합 멤버는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자이거나 항체 이외의 단백질일 수 있다. 항원 결합 부위는 항체 이외의 단백질 골격 예를 들어, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등에 CDR를 배치함으로써 제공될 수 있거나[Haan & Maggos, 2004 ; Koide외 다수, 1998 ; Nygren외 다수, 1997], 또는 단백질 골격 내에 존재하는 루프의 아미노산 잔기를 랜덤화하거나 돌연 변이시켜, 목적으로 하는 표적에 대해 결합 특이성을 부여함으로써 제공될 수 있다. 단백질 내 신규 결합 부위를 조작하기 위한 골격에 관하여는 문헌[Nygren외 다수, 1997]에 상세히 설명되어 있다. 항체의 모의체에 대한 단백질 골격에 관하여는 WO/0034784[하나 이상의 랜덤화된 루프를 가지는 피브로넥틴 제III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모의체)에 관하여 기술되어 있음]에 개시되어 있다. 하나 이상의 CDR 예를 들어, HCDR 세트를 결합시키기에 적당한 골격은 면역글로불린 유전자 상과 멤버들 중 임의의 도메인 멤버에 의해 제공될 수 있다. 골격은 인간의 단백질이거나 인간 이외의 것의 단백질일 수 있다.
비항체 단백질 골격의 이점은, 이것이 최소한 몇몇 항체 분자의 경우보다 작고/작거나 제조하기 쉬운 골격 분자 내에 항원 결합 부위를 제공할 수 있다는 점이다. 특이적 결합 멤버의 크기는 작기 때문에 유용한 생리적 특성 예를 들어, 세포내에 도입될 수 있는 특성, 조직 깊숙이 침투할 수 있는 특성 또는 다른 구조물 내에 존재하는 표적에도 도달할 수 있는 특성, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에서도 결합할 수 있는 특성을 가질 수 있다.
비항체 단백질 골격 내에 존재하는 항원 결합 부위를 사용하는 것에 관하여는 문헌[Wess, 2004]에 기술되어 있다. 안정한 구조를 띠고 있으며, 하나 이상의 가변 루프를 보유하는 단백질이 통상적으로 사용되는데, 여기서, 상기 루프(들)의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연 변이되어, 표적 항원에 관한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 단백질은 에스. 아우레우스(S. aureus)로부터 유래하는 단백질 A, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예를 들어, 제III형 피브로넥틴의 10번째 도메인) 및 리포칼린의 IgG 결합 도메인을 포함한다. 기타 방법은 시클로티드(cyclotide)[분자 내 이황화물 결합을 보유하는 작은 단백질]를 주성분으로 하는 합성 "미소체(microbody)"(Selecore GmbH)를 포함한다.
항체 서열 및/또는 항원 결합 부위 이외에, 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 예를 들어, 폴딩된 도메인을 이루는 기타 아미노산, 또는 분자에 항원과 결합하는 특성 이외에 다른 기능적 특성을 부여하는 기타 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 멤버는 검출 가능한 표지를 보유할 수 있거나, 또는 (펩티딜 결합 또는 링커에 의해) 독소나 표적화 부분 또는 효소에 컨쥬게이트화될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합 멤버는 촉매 위치(예를 들어, 효소 도메인 내)와, 항원과 결합하여 항원에 대한 촉매 위치를 표적화하는 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 촉매 위치는 예를 들어, 절단에 의하여 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.
전술한 바와 같이, CDR은 골격 예를 들어, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B에 의해 운반될 수 있지만[Haan & Maggos 2004; Koide외 다수, 1998; Nygren외 다수, 1997], 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 운반하기 위한 구조는 일반적으로 항체의 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 항체의 대부분에 존재할 것인데, 즉, CDR 또는 CDR 세트는 재정렬된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연 생성 VH 및 VL 항체 가면 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌[Kabat외 다수, 1987, 및 이의 신간으로서, 현재는 인터넷(http://immuno.bme.nwu.edu)에서 입수 가능(또는 임의의 검색 엔진을 이용해서 "Kabat"을 입력하면 검색 가능)]을 참고로 하여 결정될 수 있다.
항체 분자
이 용어는, 천연 생성된 것, 아니면 부분 또는 전체적으로 합성된 것인 면역글로불린을 의미하는 것이다. 상기 용어는 또한 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편으로서는 분자 예를 들어, Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; 및 다이아바디(diabody)가 있다.
원래 항체의 특이성을 보유하는 기타 항체 분자 또는 키메라 분자를 생산하기 위하여, 모노클로날 항체 및 기타 항체를 얻어, 재조합 DNA 기술과 같은 기술에 사용할 수 있다. 이러한 기술은 항체의 면역글로불린 가변부 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변부, 또는 불변부와 골격구조 부위에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 다수의 기타 문헌들을 참조하시오. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포는 생산된 항체의 결합 특이성을 변형시킬 수 있거나 또는 변형시킬 수 없는 유전자 돌연 변이 또는 기타 변형법에 의하여 변형될 수 있다.
항체는 다양한 방법으로 변형될 수 있기 때문에, "항체 분자"라는 용어는 필요한 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 부위를 가지는 임의의 특이적 결합 멤버 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 그러므로, 이 용어는, 천연 생성되었거나, 또는 전체적으로나 부분적으로 합성된, 항체 단편 및 유도체 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로, 다른 폴리펩티드에 융합되어 있는, 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 이의 등가물도 포함된다. 키메라 항체를 클로닝 및 발현하는 것에 관하여는 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 다수의 기타 문헌들을 참조하시오.
당 업계에서 사용 가능한 항체 조작에 관한 추가의 기술을 통하여, 인간 및 인간화된 항체를 분리할 수 있다. 예를 들어, 인간의 하이브리도마는 문헌[Kontermann & Dubel(2001)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특이적 결합 멤버를 생산하기 위한 기타 확립된 기술인 파지 디스플레이에 관하여는 예를 들어, 다수의 문헌[Kontermann & Dubel(2001) 및 WO92/01047; 이하 상세히 기술함]에 상세히 기술되어 있다. 마우스 항체 유전자가 불활성화되어 기능상 인간 항체 유전자를 대체함과 동시에, 마우스 면역계의 기타 성분들은 원상태로 유지시킨 트랜스제닉 마우스는 인간 항체를 분리하는데에 사용될 수 있다[Mendez외 다수, 1997].
합성 항체 분자는, 예를 들어, 문헌[Knappik외 다수(2000) 또는 Krebs외 다수(2001)]에 기술된 바와 같이, 적당한 발현 벡터 내에 조립 및 합성된 올리고뉴클레오티드에 의해 생산된 유전자를 발현시켜 생산될 수 있다.
전체 항체의 단편은 항원과 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 파악된다. 결합 단편의 예로서는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward, 1989; McCafferty외 다수, 1990; Holt외 다수, 2003); (v) 분리된 CDR 부위; (vi) F(ab')2 단편 즉, 2개의 Fab 단편이 결합 된 2가 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 2개의 도메인을 결합시켜 항원 결합 부위를 형성할 수 있게 만드는 펩티드 링커에 의해 결합 되어 있는 단일 사슬 Fv 분자(scFv)(Bird외 다수, 1988; Huston외 다수, 1988); (viii) 이중 특이적 단일 사슬 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) "다이아바디" 즉, 유전자 융합에 의하여 구성되는 다가 또는 다중 특이적 단편(WO94/13804 ; Holliger외 다수, 1993)이 있다. Fv, scFv 또는 다이아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 결합시키는 이황화물 결합을 통합하여 안정화될 수 있다(Reiter외 다수, 1996). scFv가 CH3 도메인에 결합 되어 있는 미니바디(minibody)도 제조될 수 있다(Hu외 다수, 1996).
dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원 결합 단편 즉, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변부이다[Holt외 다수, 2003]. VH dAb는 카멜리드(camelids)(예를 들어, 낙타 및 라마)에서 천연 생성되는 것으로서, 카멜리드를 표적 항원으로 면역화한 후, 항원 특이적 B 세포를 분리하여 각각의 B 세포에서 직접 dAb 유전자를 클로닝함으로써 생산될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양액에서도 생산될 수 있다. 이 VH dAb는 크기가 작고, 가용성 및 열 안정성이 우수하기 때문에, 특히 생리적으로 유용하고, 선택 및 친화성 성숙에 적당하다. 본 발명의 특이적 결합 멤버는 실질적으로 본원에 제시된 VH 또는 VL 도메인, 또는 실질적으로 본원에 제시된 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
이중 특이적 항체가 사용될 경우, 이 항체는 다양한 방법(Holliger & Winter, 1993) 예를 들어, 화학적으로 제조되거나 또는 혼성 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상의 이중 특이적 항체일 수 있거나, 또는 전술한 이중 특이적 항체 단편 중 임의의 것일 수 있다. 이중 특이적 항체의 예로서는, 특이성이 상이한 2개 항체의 결합 도메인을 사용하여 짧은 가요성 펩티드에 의해 직접 결합될 수 있는, 바이트(BiTE)™ 기술에 의해 생산된 것들을 포함한다. 이 기술은 짧은 단일 폴리펩티드 사슬에 2개의 항체들을 결합시킨다. 다이아바디 및 scFv는 Fc 부위 없이도 가변 도메인만으로도 구성될 수 있으며, 이로써 항-유전자형 반응의 효과를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
이중 특이적 전체 항체와는 대조적으로, 이중 특이적 다이아바디는 용이하게 구성되어 이.콜라이 내에서 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적당한 결합 특이성을 가지는 다이아바디(및 다수의 기타 폴리펩티드 예를 들어, 항체 단편)는 파지 디스플레이법(WO 94/13804)을 이용하여 라이브러리로부터 용이하게 선별될 수 있다. 만일, 다이아바디의 한쪽 팔이 예를 들어, NGF에 대하여 유도되는 특이성을 일정하게 유지한다면, 다른 쪽 팔은 다양한 라이브러리를 제조할 수 있으며, 이로써 적당한 특이성을 가지는 항체를 선별할 수 있다. 이중 특이적 전체 항체는 요철 조작법(knobs-into-holes engineering)에 의하여 제조될 수 있다[Ridgeway외 다수, 1996)].
항원 결합 부위
이 용어는, 표적 항원에 결합하고, 이 표적 항원의 전부 또는 일부에 상보적인 분자의 일부를 의미한다. 항체 분자에 있어서는 항체의 항원 결합 부위를 의미하는 것이며, 표적 항원의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합하고, 이 표적 항원의 전부 또는 일부에 상보적인 항체의 일부를 포함한다. 항원이 클 경우, 항체는 "에피토프"라고 하는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 항체의 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항체의 항원 결합 부위는 항체의 경쇄 가변부(VL)와 항체의 중쇄 가변부(VH)를 포함한다.
특이적
이 용어는, 특이적 결합 쌍을 이루는 멤버 중 하나가 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자와는 거의 결합 하지 않을 상태를 의미하는 데에 사용될 수 있다. 이 용어는 또한 예를 들어, 항원 결합 부위가 다수의 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 사용될 수 있으며, 그러한 경우, 항원 결합 부위를 보유하는 특이적 결합 멤버는 에피토프를 보유하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다.
단리된
이 용어는, 본 발명의 특이적 결합 멤버 또는 이러한 결합 멤버를 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 의한 것일 경우를 의미한다. 분리된 멤버 및 단리된 핵산은, 천연의 상태에서 이것들과 결합하고 있는 물질 예를 들어, 천연의 상태에서 발견되는 기타 폴리펩티드 또는 핵산, 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 환경(예를 들어, 세포 배양)에서 발견되는 기타 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 경우일 것이다. 멤버 및 핵산은 희석제 또는 애쥬반트와 함께 제형화될 수 있으며, 또한 실제 사용하기 위해서 분리될 수 있는데, 예를 들어, 상기 멤버는 면역 검정용 미세 역가 평판을 피복하는 데 사용될 경우 보통 젤라틴 또는 기타 담체와 혼합되거나, 아니면 진단 또는 치료에 사용될 경우에는 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 사용될 것이다. 특이적 결합 멤버는 천연의 상태에서, 또는 이종 진핵생물 세포(예를 들어, CHO 또는 NSO(ECACC 85110503) 세포) 계에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는(예를 들어, 원핵생물 세포 내에서 발현되어 생산되는 경우에는) 글리코실화되지 않을 수도 있다.
상세한 설명
전술한 바와 같이, 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 NGF를 중화하는 것이 바람직하다. 항체가 NGF를 중화하는 정도를 중화 효능(neutralizing potency)이라고 부른다.
달리 언급이 없는 한, 효능은 보통 IC50 수치(nM)으로 표시한다. IC50은 항체 분자 억제 농도의 중앙값이다. 작용 검정법에 있어서, IC50은 생물 반응 수준을 최대 수준의 50%까지 감소시키는 농도이다. 리간드 결합 연구에 있어서, IC50은 수용체의 결합 수준을 최대 특이적 결합 수준의 50%까지 감소시키는 농도이다.
IC50은 예를 들어, 생물 반응 %[예를 들어, FLIPR 검정법에서의 칼슘 이온 이동성, PC12 검정법에서의 생존율, 또는 TF-1 증식 검정법에서의 증식성으로써 대표됨] 또는 특이적 수용체 결합 %[특이적 결합 멤버 농도의 로그값에 관한 함수]를 이용하여 그래프를 작성하고, 소프트웨어 프로그램 예를 들어, 프리즘(Prism; GraphPad)을 이용하여 예를 들어, 본원의 실시예 2, 5, 6 또는 9에 기술된 바와 같이 데이터를 S자형 함수에 대입시켜 IC50 수치를 구해서 계산할 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는, TrkA 수용체를 발현하는 세포, 예를 들어, TrkA 유전자에 의해 재조합적으로 형질감염된 세포, 예를 들어, HEK 세포 내에서 인간 NGF 유발 세포 내 칼슘 이동을 억제하는 것이 바람직하다. 본원의 실시예 2에 기술된 "FLIPR" 칼슘 이동 검정법에 있어서, 본 발명에 따른 특이적 결합 멤버는 인간 NGF를 중화시키는 효능(IC50)이 바람직하게는 600nM 이하, 100nM 이하, 90nM 이하, 80nM 이하, 70nM 이하, 60nM 이하, 50nM 이하, 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하 또는 10nM 이하이다. 보통, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 효능은 5 nM 이하, 바람직하게는 2.5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하이다. 특히 바람직한 구체예에서, 효능은 0.5nM 이하 예를 들어, 0.4nM 이하; 0.3nM 이하; 0.2nM 이하; 또는 0.15nM 이하이다. 몇몇 구체예에서, 효능은 약 0.1nM일 수 있다.
효능은 0.1∼100nM, 0.2∼50nM, 0.1∼10nM, 또는 0.1∼1.0nM일 수 있다. 예를 들어, 효능은 0.1∼5.0nM, 0.2∼5.0nM, 0.3∼5.0nM 또는 0.3∼0.4nM일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 HEK 세포 검정법에 있어서 효능이 최적화되지 않은 특이적 결합 멤버의 중화 효능은, 인간 NGF에 대해서는 약 1.8∼560nM이고/이거나 래트 NGF에 대해서는 약 2.9∼620nM이다. 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 HEK 세포 검정법에 있어서 효능이 최적화된 결합 멤버의 중화 효능은, 인간 NGF에 대해서는 약 0.12∼120nM, 래트 NGF에 대해서는 약 0.11∼37nM이고, 마우스 NGF에 대해서는 약 0.11∼71nM이다. 그러나, 상기 효능은 예시적인 것에 불과하며, 보다 높은 효능을 얻을 수도 있다. 비록, 효능 최적화를 통하여 소정의 특이적 결합 멤버로부터 보다 높은 효능을 가지는 특이적 결합 멤버를 생산할 수 있지만, 높은 효능을 가지는 특이적 결합 멤버는 효능 최적화 없이도 얻어질 수 있음에 주목해야 할 것이다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 무혈청 NGF-유지 PC12 세포의 생존을 억제하는 것이 바람직하다. 본원의 실시예 5에 기술된 PC12 생존 검정법에 있어서, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 중화 효능은 인간 NGF에 대해서는 일반적으로 1500nM 이하이며, 바람직하게는 50nM 이하, 또는 10nM 이하이다. 전술한 바와 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 효능 최적화는 항-NGF 효능을 더 높게 만드는 데 사용될 수 있다. 특이적 결합 멤버의 효능은 5nM 이하, 4nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 1.5nM 이하, 1nM 이하 또는 0.5nM 이하인 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 효능은 약 0.1nM 이상, 0.2nM 이상이다. 그러므로, 효능은 0.1∼0.2nM 및 0.5, 1.5, 5 또는 50nM일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 PC12 검정법에 있어, 효능이 최적화된 특이적 결합 멤버의 중화 효능은, 인간 NGF에 대해서는 약 0.2∼670nM이고, 래트 NGF에 대해서는 약 0.2∼54nM이다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 NGF-촉진 TF-1 세포 증식을 억제하는 것이 바람직하다. 본원의 실시예 6에 기술된 바와 같이, TF-1 세포 증식 검정법에 있어서, 본 발명의 특이적 결합 멤버(보통, 효능이 최적화된 특이적 결합 멤버)의 인간 NGF에 대한 중화 효능은 일반적으로 5nM 이하, 바람직하게는 1nM 이하이다. 바람직하게, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 인간 NGF에 대한 효능은 0.7nM 이하, 0.6nM 이하, 0.5nM 이하, 0.45nM 이하, 0.4nM 이하, 0.3nM 이하, 0.2nM 이하 또는 0.1nM 이하이다. 예를 들어, 효능은 0.05∼0.1nM, 0.05∼0.2nM, 0.05∼0.3nM, 0.05∼0.4nM 또는 0.05∼0.5nM일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본원에 기술된 TF-1 증식 검정법에 있어서, 효능이 최적화된 특이적 결합 멤버의 중화 효능은, 인간 NGF에 대해서는 약 0.08∼0.7nM이고, 래트 NGF에 대해서는 약 0.07∼1.9nM이며, 마우스 NGF에 대해서는 약 0.07∼1.4nM이다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 TrkA 및/또는 p75 수용체, 바람직하게는 인간의 TrkA 및/또는 p75 수용체에 NGF가 결합하는 것을 억제하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 NGF가 TrkA 수용체에 결합하는 것을, NGF가 p75 수용체에 결합하는 것보다 우선적으로 억제하는 특이적 결합 멤버에까지 그 범위가 확대된다. 본원의 실시예 9에 기술된 바와 같이 TrkA 수용체 결합 검정법에 있어서, 본 발명의 특이적 결합 멤버(일반적으로는 효능이 최적화된 특이적 결합 멤버)의 중화 효능은 일반적으로 인간 NGF를 중화하는데에 있어서, 2.5nM 이하, 바람직하게는 1nM 이하이다. 바람직하게, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 효능은 인간 NGF와 TrkA의 결합을 중화하는데에 있어서, 0.5nM 이하, 0.4nM 이하, 0.3nM 이하, 0.2nM 이하, 0.1nM 이하 또는 0.075nM 이하이다. 예를 들어, 효능은 0.05∼0.1nM, 0.05∼0.2nM, 0.05∼0.3nM, 0.05∼0.4nM 또는 0.05∼0.5nM일 수 있다.
본원의 실시예 9에 기술된 바와 같이 p75 수용체 결합 검정법에 있어서, 본 발명의 특이적 결합 멤버(일반적으로는 효능이 최적화된 특이적 결합 멤버)의 중화 효능은 일반적으로 인간 NGF를 중화하는데에 있어서, 1.5nM 이하, 바람직하게는 1nM 이하이다. 본 발명의 특이적 결합 멤버의 효능은 인간 NGF가 p75와 결합하는 것을 중화하는데에 있어서, 0.9nM 이하, 0.8nM 이하, 0.7nM 이하, 0.6nM 이하, 0.5nM 이하, 0.4nM 이하, 0.3nM 이하, 0.2nM 이하 또는 0.1nM 이하인 것이 바람직하다. 예를 들어, 효능은 0.1∼0.2nM, 0.1∼0.3nM, 0.1∼0.4nM, 0.1∼0.5nM 또는 0.1∼0.6nM일 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버 중 몇몇 바람직한 것은 NGF(예를 들어, 인간 및/또는 래트 NGF)가 TrkA 수용체에 결합하는 것을, NGF가 p75 수용체에 결합하는 것보다 우선적으로 억제한다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 NGF(예를 들어, 인간 및/또는 래트의 NGF)와 TrkA의 결합 억제에 관한 결합 억제 상수(Ki)는, NGF와 p75의 결합에 관한 결합 멤버의 결합 억제 상수보다 작다. Ki는 실시예 9에 제시된 공식을 이용하여 계산할 수 있다. 대안적으로, 결합 억제 상수는 pKi로 표시될 수 있으며, 이 경우에는 -log10Ki로 계산될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 특이적 결합 멤버의 pKi 값은, p75와 NGF의 결합을 억제하는 경우보다 TrkA와 NGF의 결합을 억제하는 경우가 더 크다.
바람직하게, 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 인간 NGF 및/또는 래트 NGF와, 1nM 이하, 0.8nM 이하, 0.7nM 이하, 0.6nM 이하, 0.5nM 이하, 0.4nM 이하, 0.3nM 이하 또는 0.2nM 이하의 친화도로 결합한다. 예를 들어, 특이적 결합 멤버는 인간 NGF와는 약 0.25∼0.44nM의 친화도로 결합할 수 있고, 래트의 NGF와는 약 0.25∼0.70nM의 친화도로 결합할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 발명에 의해 생산되어 사용될 수 있다. 구조/특성-활성 상관 관계에 대한 다변수 데이터 분석 기술[Wold외 다수, 1984]을 적용함에 있어서 선진 컴퓨터 화학 기법에 의할 경우, 널리 공지된 산술적 기법 예를 들어, 통계학적 회귀법, 패턴 인식 및 분류법[Norman외 다수, 1998 ; Kandel & Backer, 1995 ; Krzanowski, 2000 ; Witten & Frank, 1999; Denison(Ed) , 2002 ; Ghose & Viswanadhan]을 사용하여 항체의 정량적 활성-특성 상관 관계를 유도할 수 있다. 항체의 특성은 항체 서열, 기능 및 3차원 구조에 관한 실험적 모델 및 이론적 모델[예를 들어, 결합할 수 있을 것 같은 잔기 또는 물리 화학적 특성을 분석하는 모델]로부터 얻어질 수 있으며, 그 특성은 단독으로, 그리고 다른 요소와 함께 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체의 항원 결합 부위는 6개의 폴리펩티드 루프로 구성되는데; 이 폴리펩티드 루프 중 3개는 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터 유래되는 것이고, 나머지 3개는 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터 유래 되는 것이다. 공지의 원자 구조를 가지는 항체를 분석함으로써, 항체 결합 부위의 3차원 구조와 서열 간의 상관 관계를 유추한바 있다[Chothia외 다수 1992 ; Al-Lazikani,외 다수 1997]. 이러한 상관 관계를 통하여, VH 도메인 중 세 번째 부위(루프)를 제외한 결합 부위 루프는 소수의 주 사슬 형태 중 어느 하나의 형태(정규 구조)를 가진다는 사실을 알 수 있다. 특정 루프 내에 형성된 이러한 정규 구조는 그것의 크기와, 루프 부위 및 골격구조 부위 둘 다에 존재하는 중요 위치에 임의의 잔기가 존재하는지 여부에 의해 결정되는 것으로 파악된다[Chothia외 다수 및 Al-Lazikani외 다수, 상동].
서열-구조 상관 관계에 관한 연구는, CDR 루프의 3차원 구조를 유지하는데에 중요한 잔기 즉, 서열은 공지되어 있으나 3차원 구조는 공지되어 있지 않은 항체 내 잔기를 예측하는데에 사용될 수 있으며, 그 결과 결합 특이성을 유지할 수 있다. 이와 같은 예측 결과는 주요 최적화 실험으로부터 산출된 결과에 대한 예측 결과와 비교하여 보강될 수 있다. 구조에 관한 연구에 있어서, 무료로 얻을 수 있거나 또는 시판되는 패키지 예를 들어, WAM(Whitelegg & Rees, 2000) 중 임의의 것을 이용하여 항체 분자 모델을 제작할 수 있다(Chothia,외 다수 1986). 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어 패키지 예를 들어, 인사이트 II(Insight II)(Accelerys, Inc.) 또는 딥 뷰(Deep View)(Guex & Peitsch, 1997)가 CDR 내 각각의 위치에서 일어날 수 있는 치환을 평가하는데에 사용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 활성에 대하여 최소 또는 유리한 효과를 나타낼 수 있을 것 같은 치환을 발생시키는데에 사용될 수 있다.
CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 특이적 결합 멤버의 아미노산 서열을 치환시키는데에 필요한 기술은 일반적으로 당 업계에 공지되어 있다. 활성에 대하여 최소 또는 유리한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예측될 수 있거나 또는 예측될 수 없는 치환이 발생한 변이 서열이 제조되어, NGF와 결합하고/결합하거나 이 NGF를 중화시키는 능력 및/또는 기타 목적으로 하는 특성에 대해 시험 될 수 있다.
전술한 바와 같이, 서열이 구체적으로 본원에 개시되어 있는 VH 및 VL 도메인 중 임의의 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상, 약 20개 이하, 약 15개 이하, 약 10개 이하 또는 약 5개 이하 예를 들어, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 서열 변형(아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 골격구조 부위 및/또는 하나 이상의 CDR이 변형될 수 있다.
이와 같은 변형은 기능을 상실시키지 않는 것이 바람직하므로, 이와 같이 변형된 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 멤버는 NGF와 결합하고/결합하거나 이 NGF를 중화시키는 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 상기 결합 멤버는 변형이 일어나지 않은 특이적 결합 멤버와 동일한 정량적 결합 능 및/또는 중화 능[예를 들어, 본원에 개시된 검정법에서 측정]을 보유하는 것이 더욱 바람직하다. 이와 같이 변형된 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 멤버는 NGF와 결합하는 능력 또는 이 NGF를 중화하는 능력이 개선된 것이 가장 바람직하다.
변형은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 생성 아미노산 또는 비-표준 아미노산과 치환시키는 단계, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 생성 또는 비-표준 형태로 변형시키는 단계, 또는 하나 이상의 비-천연 생성 아미노산 또는 비-표준 아미노산을 서열로 삽입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 서열 내에 발생하는 변형의 바람직한 수 및 위치에 관하여는 본원에 기술되어 있다. 천연 생성 아미노산은 20개의 "표준" L-아미노산[표준 단일-문자 암호로 표시하였을 때, G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 표시됨]을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩티드 주쇄에 통합될 수 있거나, 또는 기존의 아미노산 잔기를 변형시켜 얻을 수 있는 임의의 기타 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 천연 생성되거나 또는 비-천연 생성될 수 있다. 몇몇 천연 생성 비-표준 아미노산에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘 및 N-아세틸세린 등이 있다[Voet & Voet, 1995]. N-알파 위치에서 유도체화된 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N-말단에만 위치할 것이다. 본 발명에 있어서, 아미노산이라 함은 일반적으로 L-아미노산을 의미하고, 몇몇 구체예에서는 D-아미노산을 의미할 수도 있다. 그러므로, 변형은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변형시키는 단계, 또는 이를 D-아미노산으로 치환하는 단계를 포함할 수 있다. 메틸화된 아미노산 형, 아세틸화된 아미노산 형 및/또는 인산화된 아미노산 형에 관하여도 공지되어 있으며, 본 발명의 아미노산에는 이러한 변형이 가하여질 수 있다.
본 발명의 항체 도메인 및 특이적 결합 멤버에 존재하는 아미노산 서열은 전술한 비-천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 비-표준 아미노산(예를 들어, D-아미노산)은 합성 과정 중 아미노산 서열에 통합될 수 있는 한편, 기타 구체예에 있어서, 비-표준 아미노산은 아미노산 서열을 합성한 후 "원래의" 표준 아미노산을 변형 또는 치환하여 도입될 수 있다.
비-표준 및/또는 비-천연 생성 아미노산을 사용하면, 구조적 다양성 및 기능상 다양성을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 특이적 결합 멤버에 있어서, 목적으로 하는 NGF 결합 특성 및 중화 특성을 보유하게 될 가능성이 증가한다. 뿐만 아니라, 동물에 투여된 이후 L-아미노산을 가지는 폴리펩티드는 생체 내에서 분해되기 때문에, D-아미노산 및 유사체는 표준 L-아미노산과 비교하여 더 우수한 약물 동력학적 프로필을 가지는 것으로 파악된다.
전술한 바와 같이, 본원에 실질적으로 제시된 CDR 아미노산 서열은 인간 항체의 가변 도메인 또는 이의 대부분에 존재하는 CDR로서 운반되는 것이 바람직하다. 실질적으로 본원에 제시된 HCDR3 서열은 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내고, 이 서열은 각각 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 대부분에 존재하는 HCDR3로서 운반되는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식계열 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻을 수 있거나 또는 유도될 수 있으며, 또는 공지의 인간 가변 도메인의 공통 서열 또는 실제 서열을 바탕으로 하는 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 이용하여 CDR(예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인 레퍼토리 내에 도입될 수 있다.
예를 들어, 문헌[Marks외 다수(1992)]에는 항체의 가변 도메인 레퍼토리를 생산하는 방법에 관하여 기술되어 있는데, 여기서, 가변 도메인 영역의 5' 말단에 존재하거나 또는 이에 인접하여 존재하는 공통 프라이머는 인간 VH 유전자의 세 번째 골격구조 부위에 대한 공통 프라이머와 함께 사용되어, CDR3가 결여된 VH 가변 도메인 레퍼토리를 생산한다. 문헌[Marks외 다수]에는 또한, 이와 같은 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 어떻게 결합될 수 있는지에 관하여도 기술되어 있다. 유사한 기술을 이용하여, 본 발명의 CDR3-유도 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인 레퍼토리와 셔플링(shuffling) 될 수 있으며, 이와 같이 셔플링 된 완전 VH 또는 VL 도메인은 동 계열 VL 또는 VH 도메인과 결합되어, 본 발명의 특이적 결합 멤버를 형성할 수 있다. 이후, 상기 레퍼토리는 적당한 숙주 계 예를 들어, WO 92/01047 또는 기타 다수의 문헌 중 임의의 문헌 예를 들어, 문헌[Kay, Winter & McCafferty(1996)]에 개시된 파지 디스플레이 계에서 디스플레이될 수 있으며, 그 결과, 적당한 특이적 결합 멤버가 선택될 수 있다. 레퍼토리는 104개 이상의 멤버, 예를 들어, 106∼108개, 또는 1010개의 멤버 중 임의의 것으로 이루어질 수 있다. 기타 적당한 숙주 계는 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함한다.
유사한 셔플링 또는 병행 기술에 관하여도 문헌[Stemmer(1994)]에 기술되어 있는데, 이 문헌에는 β-락타마제 유전자와 관련된 기법에 관하여 기술되어 있으며, 또한 이러한 기법은 항체를 생산하는데에 사용될 수 있다고 기술되어 있다.
추가의 대안은, 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자를 무작위적으로 돌연 변이 유발시켜 전체 가변 도메인 내에 돌연 변이가 발생하도록 하여, 본 발명의 CDR-유래 서열을 보유하는 신규의 VH 또는 VL 부위를 만드는 것이다. 이러한 기술에 관하여는 문헌[Gram외 다수(1992); 오류-유발 PCR(error-prone PCR)을 이용]에 기술되어 있다. 바람직한 구체예에서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환은 HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에서 발생한다.
사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 부위에 돌연 변이를 유발시키는 것이다. 이러한 기술에 관하여는 문헌[Barbas외 다수(1994) 및Schier외 다수(1996)]에 개시되어 있다.
전술한 기술 모두는 당 업계에 공지되어 있으며, 당업자는 이러한 기술을 이용하여 당 업계에서 통상적으로 사용되고 있는 방법을 통해 본 발명의 특이적 결합 멤버를 제조할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 NGF 항원에 특이적인 항체의 항원 결합 부위를 제조하는 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 본원에 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하여, VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하고, 경우에 따라 이와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 결합시키는 단계, 그리고 VH 도메인 또는 VH/VL 조합체(들)를 시험하여, 경우에 따라 하나 이상의 바람직한 특성, 바람직하게는 NGF 활성을 중화하는 능력을 가지는, NGF 항원에 특이적인 항체의 항원 결합 부위 또는 특이적 결합 멤버를 동정하는 단계를 포함한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에 개시된 VL 도메인 중 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 결합시키는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 1252A5 VH 도메인(서열 번호 392)을 돌연 변이시켜, 경우에 따라 1252A5 VL(서열 번호 397)과 결합 된, 하나 이상의 VH 도메인 아미노산 서열 변이체를 생산할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 NGF 항원에 특이적인 특이적 결합 멤버를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:
(a) CDR3이 치환되어 있거나, 또는 CDR3 코딩 부위가 결여된, VH 도메인 코딩 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) 상기 레퍼토리와 본원에 실질적으로 제시된 VH CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 공여 핵산을 결합하여 상기 공여 핵산이 레퍼토리 내 CDR3 부위에 삽입되도록 만들어, VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) NGF에 특이적인 특이적 결합 멤버를 선택하는 단계; 및
(e) 상기 특이적 결합 멤버 또는 이를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계.
뿐만 아니라, CDR3이 치환되었거나 또는 CDR3 코딩 부위가 결여된, VL 도메인을 코딩하는 핵산 레퍼토리를 본 발명의 VL CDR3와 결합시키는 유사한 방법도 사용될 수 있다.
이와 유사하게, 하나 이상, 또는 3개의 CDR 모두를, 이후 NGF에 특이적인 특이적 결합 멤버(들)에 대해 스크리닝 될 VH 또는 VL 도메인 레퍼토리 내에 결합시킬 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 1252A5 HCDR1(서열 번호 393), HCDR2(서열 번호 394) 및 HCDR3(서열 번호 395), 또는 HCDR의 1252A5 세트 중 하나 이상을 사용할 수 있으며/있거나, 1252A5 LCDR1(서열 번호 398), LCDR2(서열 번호 399) 및 LCDR3(서열 번호 400) 또는 LCDR의 1252A5 세트 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
다른 유사 구체예에서는, 1152H5, 1165D4 또는 1230H7이 1252A5를 대신한다.
이와 유사하게, 본원에 개시된 기타 VH 및 VL 도메인, CDR의 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트를 사용할 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 대부분은, 간섭 골격구조 부위(intervening framework region)와 함께 3개 이상의 CDR 부위를 포함할 것이다. 바람직하게, 이러한 부분은 첫 번째 및 네 번째 골격구조 부위 중 어느 하나 또는 둘 다의 약 50% 이상을 포함할 것이다[여기서, 상기 50%라 함은, 첫 번째 골격구조 부위의 C-말단 50% 및 네 번째 골격구조 부위의 N-말단 50%를 의미함]. 가변 도메인의 대부분의 N-말단 또는 C-말단부에 존재하는 부가 잔기는 일반적으로 천연 생성 가변 도메인 부위와 결합 되지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 특이적 결합 멤버를 구성함으로써, 클로닝 단계 또는 기타 조작 단계에 도움이 되도록 도입된 링커에 의하여 코딩된 N-말단 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다. 기타 조작 단계는 본 발명의 가변 도메인을 결합시키는 링커를(예를 들어, 다이아바디 생산에 사용되는) 추가의 단백질 서열 예를 들어, 항체 불변부, 기타 가변부, 또는 본원에 보다 상세히 기술되어 있는 검출 가능한 표지/기능성 표지에 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, VH 및 VL 도메인 쌍을 포함하는 특이적 결합 멤버가 바람직하며, VH 도메인 서열 또는 VL 도메인 서열 중 어느 하나를 바탕으로 하는 단일 결합 도메인은 본 발명의 추가의 측면을 이룬다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히, VH 도메인은 특이한 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 사실이 알려져 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 관한 설명 부분을 참조하시오.
단일의 특이적 결합 멤버 중 어느 하나의 경우에 있어서, 이러한 도메인들은 NGF와 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 결합 멤버를 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는데에 사용될 수 있다.
이러한 스크리닝은 WO 92/01047에 개시된, 이른바 계층 이중 조합법(hierarchical dual combinatorial approach)을 이용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 이루어질 수 있는데, 이 방법에서는 H 또는 L 사슬 클론 중 어느 하나를 함유하는 각각의 콜로니를 사용하여 다른 사슬(L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완전 라이브러리를 감염시키고, 그 결과 2개의 사슬에 특이적인 결합 멤버는 상기 문헌에 개시된 파지 디스플레이 기술에 의해 선택된다. 이 기술은 또한 문헌[Mark외 다수, 상동]에도 개시되어 있다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 또한 항체의 불변부 또는 이의 일부, 바람직하게는 인간 항체의 불변부 또는 이의 일부를 포함할 수도 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C-말단에서 항체 경쇄의 불변 도메인 예를 들어, 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬, 바람직하게는 Cλ 사슬과 결합할 수 있다. 이와 유사하게, VH 도메인을 주 성분으로 하는 특이적 결합 멤버는 이의 C-말단에서 임의의 항체 아형 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM과, 아형의 하위 군, 구체적으로 IgG1 및 IgG4 중 임의의 것으로부터 유래하는 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부(예를 들어, CH1 도메인)와 결합할 수 있다. IgG4는 보체와 결합하지 않고, 효과기 기능을 나타내지 않으므로 바람직하다. 이와 같은 특성을 보유하고, 가변부를 안정화시키는 임의의 합성 또는 기타 불변부 변이체도 본 발명의 구체예에 사용하기에 바람직하다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 검출 가능한 표지 또는 기능성 표지로 표지화될 수 있다. 검출 가능한 표지로서는 항체 조영화 분야에 공지된 통상의 화학적 방법을 이용하여 본 발명의 항체에 결합 될 수 있는 방사성 표지 예를 들어, 131I 또는 99Tc를 포함한다. 표지는 또한 효소 표지 예를 들어, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제를 포함한다. 표지는 또한 특이 동 계열 검출 부분 예를 들어, 표지화된 아비딘에 결합함으로써 검출될 수 있는 화학적 부분 예를 들어, 바이오틴을 포함한다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 인간 또는 동물 개체, 바람직하게는 인간의 진단 또는 치료 방법에 사용되도록 디자인된다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 본 발명에 제공된 바와 같이, 특이적 결합 멤버를 포함하는 약학 조성물로서 특이적 결합 멤버를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법과, 투여용 약품을 제조하는 경우, 예를 들어, 특이적 결합 멤버와 약학적으로 허용되는 부형제를 제형화하는 단계를 포함하는, 약품 또는 약학 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 이 특이적 결합 멤버의 용도를 제공하는 것이다.
항-NGF 항체가 치료적 이점을 제공하는데에 사용될 수 있는 임상적 징후로서는, 통증, 천식, 만성 폐색성 폐질환, 폐 섬유증, 기타 기도 염증 질환, 당뇨병성 신경장해, 관절염, 건선, 심부정맥, HIV 및 암을 포함한다. 전술한 바와 같이, 항-NGF 치료법은 상기 질환들 모두에 대해서 적용된다.
항-NGF 치료법은 경구 투여에 의하여 이루어지거나, 주사(예를 들어, 피하 주사, 정맥 내 주사, 복막 내 주사 또는 근육 내 주사), 흡입, 복강 내 경로(방광으로의 침투), 또는 국소 투여(예를 들어, 안구 내, 비강 내, 직장, 상처, 피부)에 의하여 이루어질 수 있다. 투여 경로는 치료 방법의 물리 화학적 특성, 질병에 대한 특수 고려 사항 또는 효능을 최적화하거나 또는 부작용을 최소화하는데에 필요한 조건에 따라서 결정될 수 있다.
항-NGF 치료법은 진료소 내에서 투여 방법에 제약 없이 사용될 수 있다. 그러므로, 바늘이 없는 기구를 사용하여 피하 주사하는 것도 바람직하다.
상당한 상승 효과를 제공하기 위해 병행 치료법, 구체적으로 하나 이상의 기타 약물과 항-NGF 특이적 결합 멤버를 함께 투여하는 치료법이 행하여질 수 있다. 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버는 단기 작용성 또는 장기 작용성 진통제, 소염제, 알레르기 억제제, 천식 억제제, 섬유증 억제제, 항바이러스제, 화학 요법 제제 및 면역 치료제와 함께 또는 이에 부가하여 투여될 수 있다.
하나 이상의 단기 작용성 또는 장기 작용성 진통제 및/또는 소염제 예를 들어, 오피오이드 및 비-스테로이드 소염제(NSAID)를 함께 사용하는 병행 치료법은 통증 및/또는 염증을 수반하는 병상 예를 들어, 류마티즘성 관절염 또는 수술 후 통증을 치료하는데에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 천식 억제 치료제, 알레르기 억제 치료제 또는 섬유증 억제 치료제 예를 들어, 흡입 베타 아드레날린 수용성 작동제, 스테로이드, 사이토카인 길항제 또는 기타 신규의 치료 수단과 함께, 천식, 알레르기성 천식, 기타 알레르기성 병상 또는 비정상적 섬유증을 수반하는 임의의 병상의 치료에 사용될 수도 있다. 본 발명의 항체는 또한 감염 방지제 예를 들어, HIV 감염 치료를 위한 항바이러스제와 함께 사용될 수도 있다.
본 발명에 의하면, 본원에 제공된 조성물은 개체에 투여될 수 있다. 투여는 "치료학적 유효량" 즉, 환자에게 유리한 효과를 나타내는데에 충분한 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 상기 유리한 효과란, 하나 이상의 증상을 최소한 경감시킬 수 있는 경우일 수 있다. 실제 투여량 및 투여율, 그리고 경과는 치료받는 개체의 특성과 병의 중증도에 따라서 달라질 것이다. 치료에 관한 처방 예를 들어, 투여량의 결정은 보통의 전문의 및 기타 의사의 책임 하에 이루어지고, 또한 치료될 질병 증상의 중증도 및/또는 경과에 따라서 달라질 수 있다. 항체의 적정 투여량은 당 업계에 널리 공지되어 있다[Ledermann외 다수(1991) and Bagshawe(1991)]. 본원에 제시된 구체적 투여량, 또는 투여되는 약의 종류에 따라서 적절히 규정되어 있는 "의사 약제 편람(Physician's Desk Reference)(2003)"에 따른 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 멤버의 치료학적 유효량 또는 적당량은 이 결합 멤버의 시험관 내 활성 및 동물 모델 내에서의 생체 내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 기타 시험 동물에서의 유효량을 인간에게 적용시키는 보외법이 공지되어 있다.
정확한 투여량은 다수의 인자 예를 들어, 항체가 진단용인지 아니면 치료용인지 여부, 치료될 개체의 몸 크기 및 치료 부위의 위치, 항체(예를 들어, 전체 항체, 항체 단편 또는 다이아바디)의 정확한 성질, 그리고 항체에 결합 된 임의의 검출 표지 또는 기타 분자의 성질에 따라서 달라질 것이다. 통상의 항체 투여량은 전신 투여에 있어서는 100㎍∼1g일 것이고, 국소 투여에 있어서는 1㎍∼1㎎일 것이다. 통상적으로 항체는 전체 항체, 바람직하게는 IgG4 아형일 것이다. 이와 같은 투여량은 성인인 환자의 1회 치료시에 해당하는 투여량이며, 소아 및 유아에 대해서는 비례적으로 적용될 수 있고, 또한 다른 형태의 항체의 경우에는 이의 분자량에 비례하여 적용될 수 있을 것이다. 치료는 전문의에 판단에 따라서, 매일, 일주일에 두 번씩, 매주 또는 매달 반복 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 치료는 정기적으로 행하여질 수 있으며, 투여 간격은 약 2주 이상, 바람직하게는 약 3주 이상, 더욱 바람직하게는 약 4주 이상, 또는 약 한 달이다. 본 발명의 기타 바람직한 구체예에서, 치료는 수술 전 및/또는 수술 후에 행하여질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수술 치료가 행하여진 부위에 직접 투여 또는 도포 될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 일반적으로 약학 조성물의 형태로 투여될 것인데, 일반적으로는 특이적 결합 멤버 이외에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명에 의한 약학 조성물 및 본 발명에 의한 이 약학 조성물의 용도는, 활성 성분 이외에, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 기타 당업자에게 널리 알려진 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 경구 투여 또는 주사(예를 들어, 정맥 내 주사)에 의한 투여일 수 있는, 투여 경로에 따라서 달라질 것이다.
경구 투여용 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고형 담체 예를 들어, 젤라틴 또는 애쥬반트를 포함할 수 있다. 액체인 약학 조성물은 일반적으로 액상 담체 예를 들어, 물, 석유, 동물성 오일, 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로즈 또는 기타 당 용액 또는 글리콜 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥 내 주사하는 경우, 또는 발병 부위에 주사하는 경우, 활성 성분은 무 발열원성이고 적당한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비 경구 투여 가능한 수용액의 형태일 것이다. 당업자들은 예를 들어, 등장성 비이클(vehicle), 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락트산염 처리된 링거 주사액을 사용하여 적당한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 및/또는 기타 첨가제도 필요에 따라서 포함될 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 치료 방법 수행시(치료될 병상에 따라서 동시에 또는 연속적으로) 투여될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 멤버는 분자의 물리 화학적 특성과 전달 경로에 따라서 액체, 반고체 또는 고체의 형태로 제형화될 수 있다. 제형은 부형제, 또는 부형제의 혼합물 예를 들어, 설탕, 아미노산 및 계면활성제의 혼합물을 포함할 수 있다. 액체 제형은 다양한 범위의 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 동결 건조, 분무 건조 또는 초 임계 유체 기법에 의한 건조법을 통하여 제조될 수 있다. 항-NGF의 제형은 의도로 하는 전달 경로에 따라서 달라질 것인데, 예를 들어, 폐 내 전달용 제형은 흡입함에 따라서 폐의 깊은 곳까지 침투할 수 있는 물리적 특성을 갖는 입자로 이루어질 수 있고; 국소 투여용 제형은 약이 작용 위치에 잔류하는 시간을 연장하는 점도 개질제를 포함할 수 있다. 임의의 구체예에서, 특이적 결합 멤버는 이것이 급속하게 방출되는 것을 막아주는 담체를 사용하여 제형 예를 들어, 조절 방출형 제형 예를 들어, 임플란트, 경피 패취 및 미세 캡슐 전달계로서 제조될 수 있다. 생분해성이고 생체 혼화성인 중합체 예를 들어, 아세트산 에틸렌 비닐, 다가 무수 화합물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수도 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법 들은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Robinson, 1978]을 참조하시오.
본 발명은 본원에 제공된 특이적 결합 멤버를 NGF와 결합시키거나 또는 결합할 수 있도록 만드는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 이와 같은 결합은 생체 내에서 예를 들어, 특이적 결합 멤버 또는 특이적 결합 멤버를 코딩하는 핵산을 투여한 이후에 이루어질 수 있으며, 또는 시험관 내에서 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역 세포 화학적 방법, 면역 침전법, 친화성 크로마토그래피 또는 세포계 검정법 예를 들어, TF-1 검정법에서 이루어질 수 있다.
특이적 결합 멤버가 NGF에 결합하는 양을 측정할 수 있다. 정량은 진단용 시험 시료 내 존재하는 항원의 양과 관련될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면 또는 구체예에 따른 특이적 결합 멤버 또는 항체 분자를 포함하는 키트도 본 발명의 하나의 측면으로서 제공된다. 본 발명의 키트에 있어서, 특이적 결합 멤버 또는 항체 분자는 표지화되어 예를 들어, 이하에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 이들의 시료 중 활성이 측정될 수 있다. 키트 성분은 일반적으로 멸균되어, 밀봉 바이알 또는 기타 용기에 담겨있을 수 있다. 키트는 항체 분자가 유용하게 사용되는 진단 분석법 또는 기타 방법에 사용될 수 있다. 키트는 방법 예를 들어, 본 발명에 의한 방법에 사용되는 성분의 사용에 관한 지침을 포함할 수 있다. 이러한 방법을 보조하거나 또는 수행 가능하도록 만드는 보조 물질이 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.
시료 중 항체의 반응성은 임의의 적당한 방법에 의하여 측정될 수 있다. 방사성 면역 검정법(RIA)이 그 한 가지 방법이다. 이 방법에서는, 방사성 표지화된 항원과 비 표지화된 항원(시험 시료)를 혼합한 후, 항체에 결합시킨다. 결합 된 항원은 결합하지 않은 항원과 물리적으로 분리되고, 항체에 결합한 방사성 항원의 양을 측정하는 것이다. 시험 시료 중 항원의 양이 많을수록 항체에는 더욱 적은 양의 방사성 항원이 결합할 것이다. 경쟁적 결합 검정법은 또한 리포터 분자에 결합 된 항원 또는 유사체, 즉 비-방사성 항원을 사용할 수도 있다. 상기 리포터 분자는 스펙트럼에 따라서 구별되는 흡광 특성 또는 발광 특성을 갖는, 형광 색소, 인광 염료 또는 레이저 염료일 수 있다. 적당한 형광 염료로서는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드를 포함한다. 적당한 발색 염료로서는 디아미노벤지딘을 포함한다.
기타 리포터로서는 착색 가능하고 자성 또는 상자성인 거대 분자 콜로이드 입자 또는 입자상 물질 예를 들어, 라텍스 비드와, 눈으로 관찰 가능하고, 전자적으로 검출 또는 기록될 수 있는 검출 신호를 직간접적으로 발생시킬 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성 제제를 포함한다. 예를 들어, 진행 중인 반응을 촉매 하거나, 또는 색을 바꾸거나, 또는 전기적 특성을 바꾸는 분자는 효소일 수 있다. 이러한 분자는 분자 상 여기 가능하여, 에너지 상태 간 전자가 이동될 수 있으며, 그 결과 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출을 일으킬 수 있다. 또한 상기 분자는 바이오센서와 함께 사용되는 화학 물질을 포함할 수 있다. 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 인산염 검출계가 사용될 수 있다.
각각의 항체-리포터 컨쥬게이트에 의해 발생하는 신호는 시료(보통의 시료 및 시험 시료) 중 관련 항체 결합에 관한 상대적 데이터 또는 정량 가능한 완전 데이터를 구하는데에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이, 경쟁 검정법(competetion assay)에서 항원의 수준을 측정하기 위하여 특이적 결합 멤버를 사용하는 방법 즉, 경쟁 검정법에서 본 발명에 의하여 제공된 특이적 결합 멤버를 사용하여 시료 중 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공하기도 한다. 이 방법은 미결합 항원으로부터 결합 항원을 물리적으로 분리시키는 과정이 필요하지 않다. 특이적 결합 멤버에 리포터 분자를 결합시켜, 결합에 물리적 또는 광학적 변화를 유발시키는 것도 하나의 방법이 될 수 있다. 리포터 분자는 검출 가능한 신호, 바람직하게는 측정 가능한 신호를 직간접적으로 발생시킬 수 있다. 리포터 분자는 직간접적으로, 또는 예를 들어, 펩티드 결합을 통하여 공유적으로, 또는 비-공유적으로 결합 될 수 있다. 펩티드 결합을 통한 결합은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합체를 재조합적으로 발현시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 바이오센서 계에서 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버를 사용함으로써, 항원의 수준을 직접 측정하는 방법을 제공하기도 한다.
결합 여부를 측정하는 방법은 본 발명의 특징은 아니며, 당업자들은 그들의 선호도와 일반적인 지식에 따라서 적당한 방법을 선택할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 다양한 측면과 구체예에 있어서, 본 발명의 범위는, 본원에 정의된 임의의 특이적 결합 멤버 예를 들어, 1252A5 IgG4와 함께 NGF와의 결합에 대해 경쟁하는 특이적 결합 멤버까지 확장된다. 결합 멤버 간 경쟁은 시험관 내에서 용이하게 검정 될 수 있는데, 예를 들어, 특이적 리포터 분자를 하나의 결합 멤버(즉, 기타 태깅되지 않은 결합 멤버(들)의 존재 하에 검출될 수 있는 하나의 결합 멤버)에 태깅시켜, 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프와 결합하는 특이적 결합 멤버를 동정함으로써 검정 될 수 있다.
경쟁은 예를 들어, NGF가 평판에 고정되고, 처음에 태깅된 결합 멤버가 하나 이상의 기타 태깅되지 않은 결합 멤버와 함께 이 평판에 가하여지는, ELISA를 통하여 측정될 수 있다. 태깅된 결합 멤버와 경쟁하는, 태깅되지 않은 결합 멤버의 존재 여부는 태깅된 결합 멤버에 의해 발생하는 신호가 감소하는지 여부로써 판단된다.
경쟁 시험에 있어서, 항원의 펩티드 단편, 특히 목적으로 하는 에피토프를 포함하거나 또는 이를 필수적으로 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다. 양 말단 중 어느 한쪽 말단에 에피토프 서열과 하나 이상의 아미노산을 가지는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 의한 특이적 결합 멤버의 항원에 대한 결합 능은 소정의 서열을 가지거나 또는 포함하는 펩티드에 의하여 억제된다. 이에 관한 시험에 있어서, 어느 하나의 서열과 하나 이상의 아미노산을 가지는 펩티드가 사용될 수 있다.
특정 펩티드와 결합하는 특이적 결합 멤버는 예를 들어, 펩티드로 패닝(panning)하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 특이적 결합 멤버를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같이, 본 발명의 CDR이나 CDR 세트, 또는 VH 도메인이나 VL 도메인, 또는 항체의 항원 결합 부위나 항체 분자 예를 들어, scFv 또는 IgG4를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태인 구조물을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 하나 이상의 구조물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. CDR이나 CDR 세트, 또는 VH 도메인이나 VL 도메인, 또는 항체의 항원 결합 부위나 항체 분자 예를 들어, scFv 또는 IgG4를 코딩하는 핵산 자체는 본 발명의 하나의 측면을 이루며, 또한 코딩 핵산으로부터 발현시키는 단계를 포함하는, 코딩 생성물을 생산하는 방법도 마찬가지이다. 발현은 적당한 조건 하에서 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양하여 편리하게 이루어질 수 있다. VH 또는 VL 도메인을 발현시켜 생산한 다음, 임의의 적당한 기술을 이용하여 특이적 결합 멤버를 분리 및/또는 정제할 수 있으며, 이후 이 결합 멤버는 적당하게 사용될 수 있다.
본 발명에 의한 특이적 결합 멤버, VH 및/또는 VL 도메인, 그리고 코딩 핵산 분자 및 벡터는 예를 들어, 이것들이 존재하는 천연의 환경에서, 실질적으로 순수하거나 균일한 형태로 분리 및/또는 정제되어 제공될 수 있으며, 또한 핵산의 경우에는, 목적으로 하는 기능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외에 기원 유전자 또는 핵산이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 형태로 분리 및/또는 정제되어 제공될 수 있다. 본 발명에 의한 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 이는 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있다. 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열을 참고로 하였을 때, 달리 언급이 없는 한, 이 뉴클레오티드 서열은 특정 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하고, U가 T로 치환된 특정 서열을 가지는 RNA 분자를 포함한다.
다수의 상이한 숙주 세포 내 폴리펩티드를 클로닝 및 발현시키는 계에 관하여는 널리 공지되어 있다. 적당한 숙주 세포로서는, 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 계와 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 항체 및 항체 단편을 원핵생물 세포 내에서 발현시키는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pluckthun(1991)]을 참조하시오. 일반적으로, 박테리아 숙주로서는 이.콜라이(E.coli)가 바람직하다.
특이적 결합 멤버를 제조하는 하나의 방편으로서, 배양액 중 진핵생물 세포에서 발현시키는 방법이 당업자에게 널리 알려져 있다[예를 들어, Chadd & Chamow(2001), Andersen & Krummen(2002), Larrick & Thomas(2001)]. 당 업계에서 입수할 수 있는, 이종 폴리펩티드 발현용 포유동물 세포주로서는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 다수의 세포주를 포함한다.
적당한 벡터는 적당한 조절 서열 예를 들어, 프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적당한 서열을 함유하는 것으로 선택되거나 또는 이들을 함유하도록 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드 예를 들어, 파지미드, 또는 바이러스 예를 들어, 파지인 것이 바람직할 수 있다. 이에 관하여는 문헌[Sambrook & Russell(2001)]에 더욱 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 핵산 구조물 제조시 핵산을 조작하기 위한 다수의 공지 기술 및 프로토콜 예를 들어, 돌연 변이 유발법, 서열 결정법, DNA를 세포에 도입시켜 유전자를 발현시키는 방법, 그리고 단백질 분석법에 관하여는 문헌[Ausubel외 다수, 1988 및 Ausubel외 다수, 1999]에 상세히 기술되어 있다.
그러므로, 본 발명의 추가의 측면은 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 이러한 숙주 세포는 시험관 내에 즉, 배양액 중에 있을 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체 내에 있을 수 있다. 숙주 세포가 생체 내에 존재하는 경우에는 본 발명의 특이적 결합 멤버를 세포 내에서 "인트라바디(intrabody)" 또는 세포 내 항체로서 발현시킬 수 있다. 인트라바디는 유전자 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 도입 단계에서는 임의의 허용 가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵생물 세포에 있어서, 적당한 기술로서는 인산칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염 및 형질 도입(레트로바이러스 또는 기타 바이러스 예를 들어, 백시니아 바이러스 사용, 곤충 세포의 경우에는 배큘로바이러스 사용)을 포함할 수 있다. 숙주 세포 내에 핵산을 도입시키는 단계에서, 진핵생물 세포의 경우는 특히, 바이러스계 또는 플라스미드계를 사용할 수 있다. 플라스미드계는 에피좀의 형태로 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포나 인공 염색체 내에 통합될 수 있다. 통합 단계는 단일의 위치 또는 복수의 위치에 하나 이상의 복사체를 무작위적으로 통합시키거나 또는 의도적으로 통합시켜 이루어질 수 있다. 박테리아 세포에 적당한 기술로서는 염화칼슘 형질 전환법, 전기 천공법 및 박테리오파지를 이용하는 형질감염법을 포함할 수 있다.
도입 단계는 핵산을 발현시키거나 또는 발현 가능하도록 만듦으로써 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 유전자를 발현시키기 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 이루어질 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내에 통합된다. 통합 단계는 표준적인 기술에 의해서 게놈을 재조합하는 것을 돕는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 구조물을 발현계 내에서 사용하여 전술한 바와 같은 특이적 결합 멤버 또는 폴리펩티드를 발현시키는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 측면 및 구체예 들을 실시예를 통해 예시할 것이며, 이때 다음과 같은 실험 방법 및 첨부 도면을 참고로 할 것이다.
도 1a 및 도 1b는 인간 TrkA 수용체 칼슘 이동 검정법에 있어서, 인간 NGF(도 1a) 및 래트 NGF(도 1b)의 항체 중화에 관한 농도-억제율 곡선을 나타내는 것이다. 인간의 IgG4 NGF 항체는 1nM NGF에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 이동 억제 효능에 관하여 시판중인 NGF 항체 즉, G1131, Mab5260Z 및 MAB256과 비교되었다. 데이터 점들은 1회 실험을 통하여 얻어진 결과들을 나타내는 것으로서, 각 항체 농도는 3회 측정한 값의 평균 ± SD이다.
도 2a∼2c는 인간 TrkA 수용체를 재조합적으로 발현하는 HEK-293 세포 내에서의 세포 내 칼슘 이동 억제율을 나타내는 것이다. 효능이 최적화된 인간 IgG4 항체는 1nM의 인간 NGF(도 2a), 래트 NGF(도 2b) 및 마우스 NGF(도 2c)에 의해 유발된 반응 억제율에 관하여 평가되었다. 데이터 점들은 1회 실험을 통하여 얻어진 결과들을 나타내는 것으로서, 각 항체 농도는 3회 측정한 값의 평균 ± SD이다.
도 3a 및 도 3b는 PC12 세포 생존 검정법에 있어서, 인간 IgG4 NGF 항체의 억제 효능을 나타내는 것이다. 세포 생존율은 1nM의 인간 NGF(도 3a) 또는 래트 NGF(도 3b)가 존재할 경우 유지되었다. 데이터는 1회 실험을 통하여 3회 측정한 값의 평균 ± SD이다.
도 4a∼4c는 생식계열 및 비-생식계열 인간 IgG4 NGF 항체와 참고 NGF 항체, MAB256에 의한 NGF-매개 TF-1 세포 증식법에 있어서의 억제율을 나타내는 것이다. 세포는 200pM의 인간 NGF(도 4a), 래트의 NGF(도 4b) 또는 마우스 NGF(도 4c)로 자극하였다. 데이터는 1회 실험을 통하여 3회 측정한 값의 평균 ± SEM이다.
도 5는 인간 IgG4 NGF 항체인 1252A5가, 뉴로트로핀 BDNF, NT-3 및 NT-4와의 교차 반응성을 가지지 않음을 나타내는 것이다. 웰 당 100 ng의 뉴로트로핀을 흡착시켰다. 각각의 데이터 점들은 1회 실험을 통하여 3회 측정한 값의 평균 ± SD이다.
도 6a 및 도 6b는 인간 IgG4 NGF 항체 1252A5(도 6a) 및 G1152H5(도 6b)에 인간 125I-NGF를 결합시켰을 때의 포화 결합 곡선을 나타내는 것이다. Kd의 계산치는 각각 0.35nM 및 0.37nM이며, 데이터는 1회 실험을 통하여 얻어진 결과들이다.
도 7a 및 도 7b는 인간 IgG4 NGF 항체 1252A5(도 7a) 및 G1152H5(도 7b)에 래트 125I-NGF를 결합시켰을 때의 포화 결합 곡선을 나타내는 것이다. Kd의 계산치는 각각 0.44nM 및 0.50nM이며, 데이터는 1회 실험을 통하여 얻어진 결과들이다.
도 8a 및 도 8b는 TrkA 수용체 융합 단백질에 인간 125I-NGF(도 8a) 또는 래트 125I-NGF(도 8b)를 결합시켰을 때, 인간 IgG4 또는 참고 항체에 의한 농도-의존 억제율을 나타내는 것이다. 각 검정 웰 내에서 방사성 표지된 NGF의 농도는 약 150 pM이었다. 데이터는 1회 실험 결과를 나타낸다. 표 6 및 표 7도 참조하시오.
도 9a 및 도 9b는 p75 수용체 융합 단백질에 인간 125I-NGF(도 9a) 및 래트 125I-NGF(도 9b)를 결합시켰을 때, 인간 IgG4 또는 참고 항체에 의한 농도-의존 억제율을 나타내는 것이다. 각 검정 웰 내에서 방사성 표지된 NGF의 농도는 약 150 pM이었다. 데이터는 1회 실험 결과를 나타낸다. 표 8 및 표 9도 참조하시오.
도 10은 마우스 내 카라기난-유도 온도 통각 과민 현상에 관한 투여량-관련 억제 수치를 나타내는 것으로서, 이는 인간 IgG4 항-NGF, 1252A5를 전신 투여한 후 48시간 경과시의 결과이다.
실시예 1
항-NGF scFv의 분리
scFv 항체 레퍼토리
파지미드 벡터에 클로닝된 3개의 거대 단일 사슬 Fv(scFv) 인간 항체 라이브러리를 선별용으로 사용하였다. 상기 라이브러리는 (A) 비장 림프구(Hutchings, 2001), (B) 말초 혈액 림프구와 편도선 B 세포, 그리고 골수 B 세포의 조합체(Vaughan외 다수 , 1996), 및 (C) DP47 생식계열 중쇄 골격구조와 결합된 (A)의 경쇄 및 VH CDR3 부위로부터 유래하였다.
scFv의 선별
사용된 파지 선별 방법은 문헌[Hutchings, 상동]에 기술된 바와 본질적으로 동일하였다. NGF를 인지하는 scFv를 인간 및 래트 NGF에 대한 일련의 선별 주기 진행중인 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리하였다. 요약하면, 비 변형 항원을 넝크 맥시소브 튜브(Nunc Maxisorb tube)에 피복 시켰다. 1 시간 동안 총 부피 500 ㎕인 항원과 함께 파지를 항온 처리한 후, 결합하지 않은 파지를 제거하기 위해 세척하였다. 이후 결합 된 파지를 문헌[Vaughan외 다수, 상동]에 기술된 바와 같이 회수하고, 선별 과정을 반복 수행하였다. 인간/설치류 교차 반응성 scFv를 단리하는 것을 촉진하기 위하여, 선별 과정 중 대체적 라운드를 각 종류의 NGF 아형에 대해 수행하였다. 최대 4 라운드로 이루어진 선별 과정을 이 대체 아형 선별 기법을 이용하여 임의의 라이브러리로 수행하였다. 인간 또는 래트의 β-NGF를 첫번째 선별 라운드에 대한 초기 항원으로서 사용하였다.
단리된 NGF 특이적 클론 비율과 이 클론들의 서열 상동성을 바탕으로 하는 생화학적 스크리닝에 대해서 제 2∼제 4 라운드로부터 얻은 결과에 우선 순위를 매겼다. 각각의 경우, 파지 ELISA에 의해 NGF 특이적 클론의 비율을 측정하였다. 서열의 다양성은 DNA 서열 결정에 의해 측정하였다.
파지 ELISA 프로토콜
파지가 형질 도입된 박테리아 배양액을 1OO㎍/㎖ 암피실린 및 50㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 2 x TY 배지(1 ㎖) 중에 준비하였으며, 이때 이 배양액은 16시간 동안 30℃에서 진탕시켰다. 배양액을 원심 분리시켜(10분, 3000 rpm) 파지 상청액을 준비한 다음 이를 PBS 중 3% w/v 우유 분말로 1 시간 동안 블로킹(blocking)시켰다. 이후 블로킹한 파지를 미리 1㎍/㎖의 항원 또는 관련이 없는 항원으로 피복 시킨 평판에 가하였다. 각 단계 마다 평판을 PBS-Tween20(0.1 % v/v) 중에서 3회 헹군 다음, 다시 PBS 중에서 3회 헹구어 이 평판을 세척하였다. 결합 된 파지를 호오스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)/항-M13 컨쥬게이트(Amersham UK)(3 % w/v 우유 분말 PBS 중 1:5000배 희석)와 함께 1 시간 동안 항온 처리하고, 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(Sigma)과 함께 항온 처리하였다. 적당한 시간이 경과 한 후 0.5 M의 황산을 첨가하여 발색 반응을 종결시켰다. 450 ㎚에서의 흡광도를 계측하였다. 항 원에 특이적으로 결합한 클론들은 항원에 대한 신호가 관련이 없는 항원에 대한 신호보다 5배 이상으로 높은 것으로 확인되었다.
DNA 서열 결정
서열 결정용 이중 사슬 DNA 주형을, 프라이머 FDTETSEQ24(TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT, 서열 번호 534) 및 역PUC(PUCreverse)(AGCGGATAACAATTTCACACAGG, 서열 번호 535)를 이용하여 scFv를 PCR시켜 얻었다. 제조자의 지침에 따라서, 매커리-나겔 뉴클레오패스트 96 웰 PCR 평판(Macherey-Nagel Nucleofast 96 well PCR plates)(Millipore)을 이용하여 1차 PCR로부터 얻은 과량의 프라이머와 dNTP를 제거하였다. VH 유전자는 프라이머 Lseq(GATTACGCCAAGCTTTGGAGC, 서열 번호 536)을 이용하여 서열 결정하였다. VL 유전자는 프라이머 MYC Seq 10(CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG, 서열 번호 537)을 이용하여 서열 결정하였다. 각각의 반응 혼합물은 20∼40 ng의 DNA, 3∼20 pmol의 프라이머, 그리고 4㎕의 빅 다이 종결인자 v3.0(Big Dye Terminator V3.0)(Applied Biosystems, UK)을 함유하였다(부피 = 20 ㎕). 서열 결정 반응은, 96℃, 10초; 50℃, 5초; 60℃, 4분으로 구성되었다(25회 순환). 시료를 어플라이드 바이오시스템즈 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems 3700 DNA Analyser) 상에서 전개시켜 분석하였다. 존재가 불분명한 부분은 자체 개발한 연속성 소프트웨어(Continuity software)(Cambridge Antibody Technology, UK) 및 SeqEd DNA 서열 조작 소프트웨어(Applied Biosystems, UK)를 이용하여 직접 분석하였다.
NGF 중화 scFv에 대한 생화학적 스크리닝
파지 선별 과정으로부터 얻은 결과를 추가로 스크리닝하여, TrkA 수용체의 세포외 도메인 융합 단백질과 NGF의 결합이 억제된 클론을 확인하였다.
결합 검정법에서 평가하기 위해 선택된 파지로 형질감염된 이.콜라이 TG-1 박테리아의 세포질 주변 용해물로부터 미정제 scFv 시료를 얻었다. 넝크 맥시소브 96 웰 평판을 인간 TrkA 수용체의 세포외 도메인 융합 단백질(R&D Systems; 피복 농도; 인간 NGF 검정법 = 0.25nM; 래트 NGF 검정법 = 1nM)로 밤새 피복하였다. 검정 평판을 PBS/Tween 20으로 세척하고, 2 시간 동안 PBS중 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹한 다음, 다시 세척하였다. ScFv 시료를 30분 동안 1% BSA중 1nM 인간 또는 래트 재조합 β-NGF(R&D Systems)로 예비 항온 처리하였다. 시료를 부피 100 ㎕인 검정 평판으로 옮겨, 실온에서 60분 동안 항온 처리하였다. 평판을 세척한 다음, 평판에 결합 되어 있는 채로 잔류하는 NGF에 0.3 ㎍/㎖의 항-인간 NGF 바이오틴(Peprotech) 또는 항-래트 NGF 바이오틴(R&D Systems)(1% BSA 중 희석)으로 표지화한 다음, 이를 실온에서 60분 동안 항온 처리하였다. 바이오틴-표지화된 항-NGF를 DELFIA(Wallac) 시간-분석 형광도 검출 시스템(time-resolved fluorescence detection system)으로 검출하였다. 요약하면, 평판을 세척하고 100 ㎕의 스트렙타비딘 Eu3+(DELFIA 검정용 완충액 중 1/1000의 비율로 희석)를 각 웰에 가하였다. 평판을 실온에서 60분 더 항온 처리하고, DELFIA 세척 완충액으로 세척한 다음, 100 ㎕의 DELFIA 강화 용액을 각 웰에 가하였다. 평판은 월랙 빅터(Wallac Victor) 형광도 측정용 평판 판독기(여기 파장 = 314 ㎚; 발광 파장 = 615㎚)를 사용하여 판독하였다.
인간 및 래트의 NGF 결합 둘 다 억제된(즉, 세포질 주변 용해물 scFv 제제의 경우에 비하여 70% 이상 억제된) 클론을 결합 검정법에서 정제된 scFv로서 재평가하였다. 정제된 scFv 제제는 WO 01/66754의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 정제된 scFv 제제의 단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)을 이용하여 측정하였다. 재검정을 통하여, 인간 TrkA 수용체 세포외 도메인 융합 단백질과 인간 NGF 및 래트 NGF의 결합을 중화하는 잠재적 중화제인, 다음과 같은 scFv 항체들을 규명하였다:
1064F8(VH, 서열 번호 2; VL, 서열 번호 7),
1022E3(VH, 서열 번호 12; VL, 서열 번호 17),
1083H4(VH, 서열 번호 22; VL, 서열 번호 27),
1021E5(VH, 서열 번호 32; VL, 서열 번호 37),
1033G9(VH, 서열 번호 42; VL, 서열 번호 47),
1016A8(VH, 서열 번호 52; VL, 서열 번호 57),
1028F8(VH, 서열 번호 62; VL, 서열 번호 67),
1033B2(VH, 서열 번호 72; VL, 서열 번호 77),
1024C4(VH, 서열 번호 82; VL, 서열 번호 87), 및
1057F11(VH, 서열 번호 92; VL, 서열 번호 97).
실시예 2
인간 IgG4 항체의 발현 및 NGF 중화 효능의 시험관 내 기능 평가
NGF 중화 scFv 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, 1024C4 및 1057F11를 인간 IgG4 항체로 재구성하였으며, 이를 전체 세포 검정 시스템에서의 NGF 중화 효능에 대해 검정하였다.
IgG 전환
벡터를 가장 유효한 scFv 클론용으로 구성하여, 전 인간 항체 IgG4로서 재발현시켰다[Persic외 다수(1997)]. 컨디셔닝된 배지 중에 유지시킨 EBNA-293 세포에 중쇄 및 경쇄 도메인을 발현하는 구조물들을 공동 형질감염시켰다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Amersham Pharmacia)를 이용하여 배지로부터 전체 항체를 정제하였다. 정제된 항체의 제제를 멸균 여과한 다음 4℃의 인산염 완충 염수(PBS) 중에 보관한 다음, 시험관 내 효능 평가를 수행하였다. 단백질 농도는 문헌[Mach외 다수(1992)]에 따라서 분광학적 방법으로 측정하였다.
세포 내 칼슘 이동에 대한 FLIPR 검정법
세포계 형광성 칼슘-이동 검정법에 있어서, 항-인간 IgG가 NGF를 중화하는 효능 및 효과를 측정하였다. 인간 항체의 효능을 마우스 항-인간 NGF(MAB256; R&D Systems), 래트 항-마우스 NGF(G1131; Promega), 그리고 마우스 항-마우스 NGF(MAB5260Z; Chemicon)의 효능과 비교하였다. 항-NGF IgG를 재조합 인간 β-NGF(Calbiochem, 480275) 또는 재조합 래트 β-NGF(R&D Systems, 556-NG-100)와 공동 항온 처리하였다. 이후, 상기 복합체를 재조합 인간 TrkA 수용체(칼슘 감수성 염료인 Fluo-4를 로딩함)를 발현하는 HEK293 세포에 가하고, Ca2+-의존성 형광도를 관찰하였다.
재조합 인간 TrkA(M. Chao로부터 입수, Skirball Institute, NY)로 형질감염된 HEK 세포(피크-S, Edge Biosystems)를 둘베코 개질 이글 배지(MEM, Cellgro, MT10-017-CV)[10% 소 태아 혈청(Hyclone, SH30071.03), 1.5 ㎍/㎖의 퓨로마이신(Edge Biosystems, 80018) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 보강]에서 생육시켰다. 합류 상태의 세포를 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS)로 탈락시킨 다음, 6 μM Fluo-4(Molecular Probes)를 함유하는 로딩 완충액으로 37℃에서 1시간 30분 동안 음이온 운반 억제제(1% FBS/MEM 중 2.5 mM 프로베네시드) 존재하에서 로딩시켰다. 세포를 검정 완충액(0.1% BSA Hank's/HEPES 중 2.5 mM 프로베네시드)으로 1회 세척한 후, 세포를 폴리-D-리신으로 피복된, 투명 바닥 96-웰 평판(Costar #3904)에 약 60,000 세포/웰(120 ㎕)로 도말 하였다. 이 세포를 실온의 암실에서 30분 동안 항온 처리한 후, 상기 평판을 1,200 rpm(290 x g)에서 5분 동안 원심 분리하였다. 시험하기에 앞서, 상기 평판을 20분 동안 35℃로 미리 승온시켰다. 시험 IgG를 3개의 웰 중 7가지 경우의 농도에서 검정하였다. 35 ㎕의 10 × 항-NGF IgG와 동량의 10nM 인간-, 래트- 또는 마우스 2.5S NGF를 실온에서 약 1 시간 동안 예비 항온 처리하였다. 예비-복합체화 IgG를 함유하는 평판과 100 ㎕/웰의 검정 완충액을 함유하는 평판을 20분 동안 35℃로 미리 승온 시킨 다음, 형광도 측정 이미지화 평판 판독기(Fluorometric Imaging Plate Reader)(FLIPR; Molecular Devices)상에서 시험하였다. 세포 평판에 80㎕/웰의 검정 완충액을 첨가하고, 이를 35℃에서 5분 동안 항온 처리한 다음, 50 ㎕/웰의 희석 항-인간 IgG/NGF 복합체를 FLIPR 내 세포 평판에 가하고나서, Ca2+-의존성 형광도를 계속 관찰하였다. NGF-유도 형광도는, NGF를 가하기 직전의 기준 형광도 세기와, NGF를 가한 후 2분 경과시의 최대 형광도 세기 사이의 차이로서 계측하였다. 항체의 부재 하에서의 NGF-유도 형광도 수치(3개 수치의 평균)를 100% 칼슘 이동성으로 정의하였다. 항체가 존재할 경우, 3개의 NGF-유도 형광도 수치의 평균 ± SD를 대조구 칼슘 이동 비율로서 계산하였다. 대조구 칼슘 이동 수치의 %값을, IgG 농도의 로그 함수 그래프로 나타내었다. IC50 수치는 프리즘(Prism; GraphPad)을 이용하여 S-자형 투여량-반응성 함수(다양한 기울기를 갖는 함수)에 따라서 계산하였다.
시험된 모든 항체의 인간 NGF-유발 세포 내 칼슘 이동성은 농도와 관련하여 억제되었다. 인간 NGF의 중화에 대한 효능의 순서는 1064F8 > 1022E3 > 1083H4 ≥ 1033G9 > 1016A8 ≥ 1028F8 ≥ 1021E5 > 1033B2 ≫ 1024C4 ≫ 1057F11(표 1 참조)였다. 추가로 5개의 항체에 대해서도 래트 NGF를 기능상 중화시키는지에 관해 평가하였으며, 상기 두 종류의 아형에 대한 효능은 거의 동일하였다(도 1a 및 1b; 표 1 참조).
실시예 3
최적화된 인간 IgG4 NGF 항체의 분리
리보좀 디스플레이 scFv 효능 최적화
거대한 리보좀을 디스플레이하는 라이브러리를 제조하여 이를 재조합 인간 NGF(R&D Systems)를 특이적으로 인지하는 scFv에 대해 선별하였다[Hanes외 다수(2000)]. 우선, 주형이 추후 라이브러리 생산에 사용되는 경우, 클론 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2 및 1024C4를 리보좀 디스플레이 형태로 전환시켰다. 클론 1057F11은 효능 최적화용으로서 선택하지 않았으므로, 리보좀 디스플레이 주형은 본 항체에 대해 생성되지 않았다. DNA 수준에서, T7 프로모터를 5'-말단에 가하여 mRNA로 효율적으로 전사되도록 하였다. mRNA 수준에서, 구조물은 원핵 생물의 리보좀 결합 부위(샤인-달가노 서열)를 함유하였다. 단일 사슬의 3'말단에서, 종결 코돈을 제거하고 gIII의 일부를 가하여 스페이서로서 삼았다(Hanes외 다수, 상동).
scFv HCDR3을 돌연 변이시켜 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2 및 1024C4로부터 유래하는 리보좀 디스플레이 라이브러리를 만들었다. 교정 기능이 없는(non-proof reading) Taq 중합 효소를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 라이브러리와 함께 항온 처리함으로써 친화도를 바탕으로 하는 선별법을 수행하고, 바이오틴화된 인간 NGF를 스트렙타비딘-피복 상자성 비드(Dynal M280)와 커플링시켰다. 자성 분리법에 의하여 결합한 3중 복합체(mRNA-리보좀-scFv)를 회수하였으며, 이때 결합하지 않은 복합체는 씻어 버렸다. 이후, 결합 된 scFv를 코딩하는 mRNA를 문헌[Hanes외 다수, 상동]에 기술된 바와 같이 RT-PCR에 의해 회수하였으며, 선별 과정 중 존재하던 바이오틴화 인간 NGF의 농도를 낮추면서(5 라운드에 걸쳐, 100nM →10pM) 선별 과정을 반복 수행하였다.
또한 오류-유발 PCR을 이용하여 라이브러리 크기를 더 크게 만들었다. 선별 방법 수행중 오류 유발 비율은 1000 bp당 7.2개의 돌연 변이(Diversify™, Clontech)로 하였다. 오류-유발 PCR 반응을 수행한 후, 바이오틴화 인간 NGF를 사용하여 제3 라운드 및 제4 라운드에 선별 과정을 개시하였으며, 이때 바이오틴화 인간 NGF의 농도는 각각 1nM(제3 라운드) 및 0.1nM(제4 라운드)였다.
선별 과정 중 제3 라운드, 제4 라운드 및 제5 라운드에서 얻어진 각각의 비율의 scFv를 pCantabβ 벡터(Vaughan외 다수 , 1996) 내에 결찰시키고, 이를 이.콜라이의 TG1 변종에 클로닝하였다. 이와 같은 scFv 시료를 실시예 1에 기술된 바와 같이 DNA 서열 결정하여, NGF 중화 활성에 관한 시험관 내 스크리닝 실시 이전에 이 DNA 서열의 다양성을 확인하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, NGF/TrkA 수용체 세포 외 도메인 융합 단백질 결합 검정법에 있어서, 클론들을 미정제 scFv로서 스크리닝하였다. 이 검정법에 있어서, 세포질 주변 용해 scFv 제제의 농도는 최종 검정 부피의 0.5∼5%까지 감소하였으며, 인간 및 래트 NGF 결합 능을 95% 이상으로 억제하는 클론을 분리하여 추가로 연구하였다. 이러한 방식으로, 효능이 최적화된 패널 즉, 교차 반응성 NGF 중화 인자를 분리하였다. 놀라운 사실은, 가장 효능이 뛰어난 NGF 중화 인자는 모 클론인 1021E5 및 1083H4으로부터 유래된 것이었는데, 이 1021E5 및 1083H4 클론은 가장 효능이 뛰어난 모 항체가 아니었다는 점이다. 최적화된 클론들을 서열 결정하고, 정제 scFv처럼 재검정하여 효능을 확인한 후, 실시예 2에 기술된 바와 같이 인간 IgG4를 재구성하였다.
모 클론인 1021E5(VH, 서열 번호 32; VL, 서열 번호 37)로부터 유래 되어 인간 IgG4 형태로 전환된 항체는, 1126F1(VH, 서열 번호 102; VL, 서열 번호 107), 1126G5(VH, 서열 번호 112; VL, 서열 번호 117), 1126H5(VH, 서열 번호 122; VL, 서열 번호 127), 1127D9(VH, 서열 번호 132; VL, 서열 번호 137), 1127F9(VH, 서열 번호 142; VL, 서열 번호 147), 1131D7(VH, 서열 번호 152; VL, 서열 번호 157), 1131H2(VH, 서열 번호 162; VL, 서열 번호 167), 1132A9(VH, 서열 번호 172; VL, 서열 번호 177), 1132H9(VH, 서열 번호 182; VL, 서열 번호 187), 1133C11(VH, 서열 번호 192; VL, 서열 번호 197), 1134D9(VH, 서열 번호 202; VL, 서열 번호 207), 1145D1(VH, 서열 번호 212; VL, 서열 번호 217), 1146D7(VH, 서열 번호 222; VL, 서열 번호 227), 1147D2(VH, 서열 번호 232; VL, 서열 번호 237), 1147G9(VH, 서열 번호 242; VL, 서열 번호 247), 1150F1(VH, 서열 번호 252; VL, 서열 번호 257), 1152H5(VH, 서열 번호 262; VL, 서열 번호 267), 1155H1(VH, 서열 번호 272; VL, 서열 번호 277), 1158A1(VH, 서열 번호 282; VL, 서열 번호 287), 1160E3(VH, 서열 번호 292; VL, 서열 번호 297), 1165D4(VH, 서열 번호 302; VL, 서열 번호 307), 1175H8(VH, 서열 번호 312; VL, 서열 번호 317), 1211G10(VH, 서열 번호 322; VL, 서열 번호 327), 1214A1(VH, 서열 번호 332; VL, 서열 번호 337), 1214D10(VH, 서열 번호 342; VL, 서열 번호 347), 1218H5(VH, 서열 번호 352; VL, 서열 번호 357) 및 1230H7(VH, 서열 번호 362; VL, 서열 번호 367)이었다.
모 클론 1083H4(VH, 서열 번호 22; VL, 서열 번호 27)로부터 유래 되어 인간 IgG4 형태로 전환된 항체는 1227H8(VH, 서열 번호 372; VL, 서열 번호 377) 및 1230D8(VH, 서열 번호 382; VL, 서열 번호 387)이었다.
1252A5 및 기타 1021E5 변이체를 유도시키기 위한 1133C11의 골격구조 부위의 생식계열화
1021E5로부터 유래된 최적화 클론에 관한 VH 및 VL CDR 서열 정보를 검토한 결과, 항체들 대부분이 VH CDR3 내에 아미노산 서열 LNPSLTA (서열 번호 531)(즉, 카밧 넘버링 시스템에 따라서, 100A∼100G 아미노산)을 함유하고 있었음을 알 수 있었다. 이 클론들은 표 2a에 나타내었는데, 이 표를 통하여 이 클론에 있어서 VH 및 VL CDR 부위에 존재하는 아미노산 서열이 얼마나 다양한지를 알 수 있으며, 또한 정제 scFv로서 검정될 때 이 클론들이 NGF를 중화하는 효능의 추정치도 알 수 있다. 이 클론들 중, 1133C11은 CDR 부위가 1021E5와 상이하였다[즉, 전술한 7개의 연속 아미노산인 100A∼100G가 상이함]. 그러므로, 생식계열화용으로 1133C11을 선택하였으며, 이를 통하여 첫째, 변형 골격구조를 가지는 경우 효능이 유지되었음을 알 수 있었으며, 둘째, 동일 계통의 목적 항체의 생식계열을 얻기 위해서는, 원한다면 CDR 돌연 변이를 추후 도입시킬 수 있음을 알 수 있었다.
1133C11의 유도된 아미노산 VH 및 VL 서열을 VBASE 데이터베이스[Tomlinson (1997), MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK] 내 공지의 인간 생식계열 서열에 대해 정렬하고, 가장 가까운 생식계열을 동정하였다. 1133C11의 VH에 대한 가장 가까운 생식계열은 DP10(VH1 군의 멤버)인 것으로 확인되었다. 상기 1133C11 VH는 DP10 생식계열과 골격구조 부위 내 5개의 아미노산이 달랐다. 1133C11의 VL에 대한 가장 가까운 생식계열은 DPL5(Vλ1 군의 멤버)인 것으로 확인되었다. 상기 1133C11 VL은 상기 생식계열과 골격구조 부위 내 4개의 아미노산이 달랐다. 1133C11의 골격구조 부위는 scFv의 위치 지정 돌연 변이 유발법에 의해 생식계열로 바뀌어, scFv 1252A5(VH, 서열 번호 392; VL, 서열 번호 397)로 유도되었다. 이는 실시예 2에 기술된 바와 같이 인간 IgG4로 전환되었다. 1021E5-유래 클론의 기타 변이체의 생식계열화는 생식계열화된 1252A5 IgG4 골격에 CDR 돌연 변이를 도입함으로써 이루어졌다. 이러한 방법을 통하여, 생식계열화 항체 G1152H5(VH, 서열 번호 402; VL, 서열 번호 407), G1165D4(VH, 서열 번호 412; VL, 서열 번호 417) 및 G1230H7(VH, 서열 번호 422; VL, 서열 번호 427)이 생성되었다.
실시예 4
세포 내 칼슘 이동에 관한 FLIPR 검정법에 있어서 최적화된 인간 IgG4 항체의 평가
실시예 2에 기술된 바와 같이, 인간 TrkA 수용체를 재조합적으로 발현하는 세포 내에서 NGF-유발 세포 내 칼슘 이동에 관한 검정법을 통하여 최적화된 인간 IgG4 NGF 항체를 평가하였다. 항체를 인간, 래트 및 마우스 NGF에 대한 중화 활성에 대해 검정하였다(도 2a, 2b 및 2c; 표 3 참조).
1nM의 NGF에 의해 유발된 세포 내 칼슘 이동은 시험 된 모든 최적화 인간 항체에 의해 억제되었다. 최적화된 항체는 나노몰 이하의 IC50 수치를 나타내었으며, 대부분의 경우에서는 모 IgG에 비하여 NGF 중화 효능이 100배 이상 강화되었다(표 3). 인간, 래트 및 마우스 NGF 아형에 대해 생성된, 생식계열화 인간 IgG4 항체의 중화 효능(IC50)은 각각 다음과 같았다:
1252A5 - 0.33nM, 0.29nM 및 0.26nM;
G1152H5 - 0.22nM, 0.27nM 및 0.18nM;
G1165D4 - 0.32nM, 0.33nM 및 0.27nM;
G1230H7 - 0.31nM, 0.34nM 및 0.25nM
이러한 결과를 통하여, 항체 효능 최적화를 위한 리보좀 디스플레이 기술의 효능 및 가치를 알 수 있다. 항체 최적화에 관한 종래의 방법보다 더욱 편리한 방법을 통하여, 변이체 scFv 항체의 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다. 종래의 방법은 노동 집약적일 뿐만 아니라, 리보좀 디스플레이 방법보다도 시간이 많이 소요되는 과정으로서, 즉, 라이브러리를 구성하기 위해서는 출발 물질로서 단일의 모 scFv만을 사용하는 과정이다. 이 방법은 리보좀 디스플레이 라이브러리를 생산하는 방법보다 비교적 용이하기 때문에, 실시예 3에 기술된 바와 같이 다수의 scFv 부모를 동시에 최적화할 수 있으며, 이로써 최적화시 간과되었던 모 클론들로부터도 효능이 매우 뛰어난 항체를 분리할 수 있다.
실시예 5
PC12 세포 생존 검정법에 있어서, 최적화된 인간 IgG4 항체의 평가
본 PC12 검정법에 있어서, NGF는 2일 동안 원래의 TrkA 및 p75 수용체를 발현하는 혈청 제거 래트 P12 세포의 생명을 유지시켰다. 중화 NGF 항체는 알라마블루(AlamarBlue)로 측정된 세포 생존율을 감소시켰다.
래트의 크롬 친화성 세포종 PC12 세포를 RPMI 1640(Cellgro, 18040181)[5% 소 태아 혈청(JRH, 12103-78P), 10% 열-불활성화 공여 말 혈청(JRH, 12446-77P) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 보강] 내에서 생육시켰다. 세포를 적정시켜 수집한 다음, 무 혈청 RPMI 1640[0.01% BSA(Sigma, A7030) 함유]으로 2회 세척하였다. 세포 를 래트 꼬리 콜라겐(Biological Technology Institute, BT-274) -피복 96 웰 평판에 50,000 세포/웰(120 ㎕의 무 혈청 배지, 0.01% BSA 함유)로 도말 하였다. 무 혈청 배지를 사용하여 항-인간 NGF IgG를 5배 연속 희석시킨 후, 40 ㎕/웰의 농도로 세포 평판에 가하였다. 40 ㎕/웰의 0.5nM 인간 β-NGF (Calbiochem, 480275) 또는 래트의 재조합 NGF(R&D Systems, 556-NG-100)을 상기 평판에 가하고, 여기에 무 혈청 배지를 가하여 총 부피를 200 ㎕/웰로 만들었다. 최대 세포 사멸률은 3개의 웰 내 무 혈청 배지(80 ㎕/웰)에 의해 정의하였다. 100% 생존율은 3개의 웰 내 무 혈청 배지(40 ㎕/웰) 및 0.5nM NGF(40 ㎕/웰)에 의해 정의하였다. 이 평판들을 37℃ 및 5% CO2 하에서 48 시간 동안 항온 처리하였다.
세포 생존율을 측정하기 위하여, 22 ㎕/웰의 알라마 블루를 가하고, 이 평판들을 즉시 판독하여 각 웰에서의 백그라운드 형광도를 측정하였다(형광 광도 평판 판독기(BMG) 사용, 여기 파장 = 530㎚, 발광 파장 = 590 ㎚). 이를 37℃에서 6∼7 시간 동안 항온 처리한 다음, 상기 평판을 다시 판독하여 총 형광도를 측정하였다. 알라마 블루 형광도를 계산하였다[백그라운드 형광 강도와 총 형광 광도의 차이]. 항체가 존재하는 경우에는, 3회 형광도 측정값의 평균 + SD를, 3개의 100% 생존 형광도 수치의 평균 비율로서 계산하였다. 대조구 생존율 수치를 IgG 농도의 로그 함수 그래프로 나타내었다. IC50 수치는 프리즘(GraphPad)을 이용하여 S-자형 투여량-반응성 함수(다양한 기울기를 갖는 함수)에 따라서 계산하였다.
PC12 검정법을 통하여 얻어진 결과에 의해, 모 IgG에 비해 최적화된 인간 IgG4 NGF 항체의 효능이 더욱 증가하였음을 알 수 있었다. 항체는 농도-관련 방식으로 인간 및 래트 NGF-유지 PC12 세포 생존율을 억제하였다(도 3a 및 3b, 표 3 참조). 생식계열화는 시험 항체(특히, 래트 NGF 아형에 대한 항체)의 NGF 중화 효능을 감소시킴을 알 수 있었다. 예를 들어, 1nM 인간 또는 래트 NGF에 의해 매개되는 세포 생존 억제에 관한 생식계열 항체 G1152H5의 평균 IC50은 각각 1.1nM 및 7.3nM이었다. 이와는 반대로, 1nM 인간 또는 래트 NGF의 1152H5(즉, 비-생식계열 항체)에 의한 중화에 있어서 평균 IC50은 각각 0.4OnM 및 0.38nM이었다.
실시예 6
TF-1 세포 증식 검정법에 있어서 NGF 중화 활성
TF-1 세포주는 외인성 성장 인자 및 사이토카인에 의해 자극되어 증식할 수 있는 인간의 전구 골수성 세포주(premyeloid cell line)이다. TF-1 세포는 인간의 TrkA 수용체를 발현하며, NGF에 의한 활성화에 의해 증식한다. 상기 TF-1 세포 증식 검정법은 중화 인간 IgG4 NGF 항체의 시험관 내 기능에 관한 효능을 추가로 특성 규명하는데에 사용되었다.
TF-1 세포는 R&D 시스템즈로부터 입수하였으며, 공급 프로토콜에 따라서 보관하였다. 검정용 배지는 5% 소 태아 혈청(Hyclone) 및 1% 피루브산나트륨(Sigma)을 함유하는 GLUTAMAX I(Invitrogen)과 RPMI-1640으로 이루어졌다. 각각의 검정법을 수행하기 이전에, TF-1 세포는 300 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 펠렛을 형성시켰으며, 이 배지는 흡입에 의해 제거하였고 세포는 검정 배지에 재현탁하였다. 이 과정을 검정 배지 중에서 세포(최종 농도 105/㎖로 재현탁됨)를 사용하여 3회 반복 수행하였으며, 96 웰 편평 바닥 조직 배양 검정 평판의 각 웰에 100 ㎕씩 가하여 최종 세포 밀도가 웰 당 1 × 104이 되도록 만들었다. 항체 시험 용액(3개)을 희석시켜 검정 배지 중 최종 검정 농도가 1 ㎍/㎖가 되도록 하였으며, 이를 검정 평판 전체에 걸쳐 1:5로 적정하였다. NGF에 대해 유도되지 않은 비-관련 항체(CAT-OO1)를 네거티브 대조구로 사용하였다. 뿐만 아니라, 참고 모노클로날 항체 MAB256(R&D Systems)을 포지티브 대조구로 사용하였다. 이후, 시험 항체 50 ㎕를 각 웰에 가한 후, 50㎕의 정제된 원래 쥣과 동물 NGF(7S 형; Invitrogen), 래트 NGF(Sigma) 또는 인간 NGF(Sigma)를 희석하여, 최종 검정 농도가 20OpM이 되도록 만들었다. 검정용 평판을 가습실 내에서 5% CO2 하 37℃에서 68 시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 적정된 티미딘(5.0 μCi/ml, NEN) 20 ㎕를 각 검정용 웰에 가하고, 이 검정용 평판을 항온 처리기에서 5 시간 더 항온 처리하였다. 세포 수집기를 사용하여 세포를 96 웰 유리 섬유 필터 평판(Perkin Elmer)으로부터 수집하였다. 이후, 마이크로싱트(MicroScint) 20TM(50㎕들이)를 필터 평판의 각 웰에 가하고, 팩커드 톱카운트(Packard TopCount) 미세 역가 평판 액체 신틸레이션 계측기를 사용하여 [3H]-티미딘 통합 여부를 정량하였다. 항체의 존재 하에, 티미딘 통합 여부(분당 계수로서 정량)를, 분당 평균 백그라운드 계수(즉, NGF에 노출되지 않은 세포)와 평균 총 계수(즉, NGF로 자극된 세포)의 차이로서 계산하여, 이를 최대 증식 율로 나타내었다. 최대 증식율을 IgG 농도의 로그 함수 그래프로 나타내었다. IC50 수치는 프리즘(GraphPad)을 이용하여 S-자형 투여량-반응성 함수(다양한 기울기를 갖는 함수)에 따라서 계산하였다.
인간 IgG4 NGF 항체는 인간, 래트 및 마우스 NGF 아형에 의해 매개되는 TF-1 세포 증식의 유력한 억제 인자였다(도 4a∼4c). 이러한 결과를 통하여, 1021E5 계통으로부터 유래된 항체들은 시험관 내에서 원래 인간 NGF 수용체 활성화에 의해 매개되는 NGF 신호 전달 과정을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있다. PC12 세포 생존 검정법(실시예 5)에 있어서 인간 NGF 항체의 관찰된 활성에 따르면, 비-생식계열 항체는 TF-1 증식 검정법의 생식계열 항체보다 더욱 효능이 우수 하였음을 알 수 있었다. 평균 IC50 데이터를 바탕으로 하였을 때, 200pM의 인간 NGF에 의해 매개되는 증식의 억제에 대하여 시험 된 항체의 효능 순위는 1133C11 > 1152H5 > 1252A5 = G1152H5 ≫ MAB256이었다.
실시예 7
기타 뉴로트로핀과 항-NGF IgG의 교차 반응성
ELISA를 수행하여 기타 뉴로트로핀에 대한 항-NGF IgG의 교차 반응성을 측정하였다. ELISA는 100 ng/웰의 인간 NGF(R&D systems, 256-GF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF; R&D systems, 248-BD), 뉴로트로핀-3(NT-3; R&D systems, 257-N3) 또는 뉴로트로핀-4(NT4; R&D systems, 257-N4)으로 평판을 실온에서 5∼6 시간 동안 피복시킨 후, 이 평판을 4℃에서 밤새도록 0.25% HSA로 블로킹시키는 단계를 포함한다. 항-NGF IgG의 농도를 증가시키면서(0.03→10nM) 이 평판을 항온 처리하여(실온, 2시간), 각 뉴로트로핀에 결합시켰다. 바이오틴화된 항-인간 폴리클로날 항체(1:300)(Rockland 609-1602), 스트렙타비딘 결합 알칼리성 포스파타제(1:1000) 및 형광성 기질 A를 사용하여 항-NGF IgG를 검출하였다. 평판에 뉴로트로핀이 결합 된 포지티브 대조구는 시판중인 바이오틴화 항-인간 폴리클로날 항체들(R&D Systems 항-NGF BAF 256, 항-BDNF BAM 648, 항-NT-3 BAF 267, 항-NT-4 BAF 268)을 이용하였는데, 이 항체들은 스트렙타비딘 결합 알칼리성 포스파타제→기질 A를 사용하여 직접적으로 검출되었다. 비특이적 결합 여부는 뉴로트로핀 대신 BSA로 피복된 웰을 이용하여 관찰하였다. 기질 A를 가한 후 0∼60분에 걸쳐서 생성물을 생산시켰다. 항-NGF IgG 1064F8을 사용하여 검정법을 최적화하였다. 1064F8에 있어서, 15분 동안 생성물이 점점 많이 생산되었으며, 이후 다시 시간이 경과 함에 따라 그 수준이 감소하였는데, 이는 아마도 기질이 고갈되기 때문일 것으로 생각된다. 교차 반응성은, 모든 농도의 IgG와 NGF의 특이적 결합 능에 상대적인, 뉴로트로핀과 모든 농도의 IgG의 특이적 결합 능의 비율로서 측정하였다. 고 친화성 IgG 예를 들어, 1064F8에 있어서, 교차 반응%는 15분간의 생성물 생성 데이터를 사용하여 계산하였다. 저 친화성 IgG 예를 들어, 1016A8에 있어서, 교차 반응%는 60분간의 생성물 생성 데이터를 사용하여 계산하였다.
7개의 인간 IgG4 NGF 항체와 BDNF, NT-3 및 NT-4의 교차 반응성(NGF에 상대적)을 측정하였다. 시험 농도에서, 7개의 항체 모두는 무시할 수 있을 정도의 교차 반응성을 나타내었다(표 4). 예를 들어, NT-3, NT-4 및 BDNF를 사용하여 관찰한 최 고 수준의 교차 반응성(1252A5)은 각각 1.1%, 0.9% 및 1.4%였다(도 5).
실시예 8
인간 NGF 항체의 NGF 결합 친화도의 측정
방사성 리간드 결합 검정법을 이용하여 인간 IgG4 NGF 항체의 NGF 결합 친화도를 실온에서 측정하였다. 간단히 말하자면, 플래쉬 평판(Perkin Elmer SMP200)을 1 시간 동안 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 1OO㎕/웰의 염소 항-인간 IgG (Sigma-Aldrich, UK) 2.2 ㎍/㎖로 피복 하였다. 웰을 PBS로 세척한 다음, 1 시간 동안 200 ㎕/웰의 PBS[3% w/v 소 혈청 알부민(BSA; Sigma-Aldrich, UK) 함유]로 블로킹하였다. 웰을 PBS로 세척한 다음, 10 ng의 인간 NGF 항체를 각 웰에 가하였으며, 이때 PBS의 부피는 0.1 ㎖이었고, 0.5% w/v BSA를 함유하였다.
방사성 요드화된 인간 및 래트의 NGF를 애머샴 UK[인간 125I-NGF, Amersham cat.no. IM286; 래트 125I-NGF, 맞춤 표지화된 재조합 래트 β-NGF(R&D Systems로부터 구입, cat. no.556-GF-100)]로부터 얻었다. 각각의 125I-NGF 아형을 검정 완충액 (PBS, 0.5% w/v BSA 및 0.05% v/v Tween 20 함유) 중에서 연속적으로 희석하고, 100 ㎕ 시료 2개를 검정 평판에 가하여 2pM∼15nM의 농도에 걸친 "총 결합량"을 측정하였다. 각 125I-NGF 농도에서의 비 특이적 결합량(NSB)은, 과량의 비-방사성 표지화 NGF의 존재 하에서의 결합량으로 측정하였다. NSB 웰에는 125I-NGF(2pM-15nM)와 최종 농도 500nM의 비 표지화 인간 β-NGF(R&D Systems Cat.No. 256-GF-100) 또는 래트의 β-NGF(R&D Systems Cat.No. 556-GF-100)가 적절하게 혼합되어 존재하였다. 평판을 밤새도록 항온 처리하고, 1분 동안 감마 카운터(TopCount NXT, Perkin Elmer)를 사용하여 웰을 계수하였다. 특이적 결합량은 공식 즉, "특이적 결합량 = 총 결합량 - 비 특이적 결합량" 에 따라서 계산하였다. 결합 곡선을 그래프로 나타내었으며, 결합 매개 변수는 프리즘 소프트웨어(GraphPad Software Inc., USA)를 이용하는 단일 위치 포화 결합 모델(one-site saturation binding model)에 따라서 측정하였다.
인간 및 래트의 125I-NGF는 포화 가능하고 높은 친화성을 가지는 결합 능 즉, 인간 IgG4 NGF 항체인 1252A5 및 G1152H5에 대한 결합 능을 나타내었다(도 6 및 도 7). 인간 125I-NGF와의 결합 상호 작용에 대해 계산된 Kd 값은, 1252A5에 대해서는 0.35nM이었으며, G1152H5에 대해서는 0.37nM이었다. 래트 125I-NGF 결합에 대한 Kd 값은, 1252A5에 대해서는 0.44nM이었으며, G1152H5에 대해서는 0.5OnM이었다.
실시예 9
인간 TrkA 및 p75 수용체와 NGF의 결합 억제에 대한 Ki 값의 측정
항체 1252A5 및 G1152H5가 TrkA 및 p75 수용체와 NGF의 결합을 차등적으로 억제하는지 여부를 알아내기 위한 실험을 수행하였다. 결합 억제 상수(Ki) 값을 계산하기 위하여 경쟁 결합 실험을 실시하였다. 인간 TrkA- 또는 p75-수용체 융합 단백질과 방사성 표지화된 인간 또는 래트 NGF의 결합 억제(항체-매개 결합 억제)에 대한 IC50을 계산하였다. 이후, 쳉-프루소프 등식(Cheng-Prusoff equation)을 이용하여 Ki 값을 구하였다.
인간 TrkA 및 p75 수용체 융합 단백질(R&D Systems)을 둘베코 PBS(Gibco) 중에 최종 농도 각각 10nM 및 0.6nM이 되도록 희석하였다. 맥시소브 넝크 화이트 96 웰 미세 역가 평판(Nalge Nunc)을 4℃에서 희석 TrkA 또는 p75 수용체 용액(100 ㎕/웰)으로 밤새도록 피복 시켰다. 평판을 PBS Tween 20으로 3회 세척한 후, 200 ㎕/웰의 3% w/v 소 혈청 알부민(BSA)(PBS 중)으로 블로킹하였다. 실온에서 1시간 동안 항온 처리한 후 평판을 세척하였다. 시험 항체를 검정 완충액(PBS 중 0.5% w/v BSA 및 0.05% v/v Tween 20 함유) 중 원하는 농도로 희석시켰다. 관련 없는 항체 즉, NGF에 대하여 유도되지 않은 항체를 네거티브 대조구로 사용하였으며, 비-방사성 표지화된 NGF는 방사성 리간드 결합의 참고 억제 인자로서 사용하였다. 2개의 웰에 시험 시료를 각각 농도를 달리하여 넣었다. 인간 또는 래트 125I-NGF(Amersham Biosciences)를 검정 완충액으로 희석시켜, 검정 웰 내 최종 농도(시험 시료와 혼합되었을 때의 농도)가 총 검정 부피 100 ㎕ 중 15OpM이 되도록 만들었다. 검정 평판을 실온에서 2시간 동안 항온 처리한 다음, 이를 PBS/Tween 20으로 세척하여 미결합 125I-NGF를 제거하였다. 100 ㎕/웰의 마이크로싱트 20(Perkin Elmer)을 가한 후, 팩커드 톱 카운트 미세 역가 평판 액체 신틸레이션 카운터를 사용하여 결합 된 방사성 표지를 정량하였다. 얻어진 데이터를 그래프로 나타내고, 그래프패드 프리 즘 소프트웨어로 분석하여, 각 실험에 대한 IC50 수치를 계산하였고, 또한 다음과 같은 쳉-프루소프 등식에 따라서 해당 Ki를 구하였다;
Ki = IC50 / (1+D/Kd)
[식 중,
D는 검정법에 있어서의 NGF 농도(명목상으로는 15OpM이지만, 실제 검정 농도는 각각의 실험을 통하여 측정함)이고;
Kd는 동일한 검정 조건 하에서의 TrkA 또는 p75 수용체에 대한 NGF 친화도로서, 이는 개별 실험에 있어서의 TrkA 및 p75 수용체와 125I-NGF의 결합에 대한 포화 결합 분석법으로 측정됨]
인간 IgG4 대조구를 제외하고, 모든 항체들을 평가한 결과, 이 항체들은 인간 및 래트 125I-NGF와 인간 TrkA 및 p75 수용체의 결합을 억제함을 알 수 있었다(도 8 및 도 9, 표 5 참조). 표 6은 도 8a에 나타낸 데이터로부터 계산된 IC50 및 Ki 값을 나타내는 것이고; 표 7은 도 8b에 나타낸 데이터로부터 계산된 IC50 및 Ki 값을 나타내는 것이며; 표 8은 도 9a에 나타낸 데이터로부터 계산된 IC50 및 Ki 값을 나타내는 것이고; 표 9는 도 9b에 나타낸 데이터로부터 계산된 IC50 및 Ki 값을 나타내는 것이다. 모든 경우에 있어서, 항체 1252A5는 125I-NGF 결합 억제 효능이 가장 컸다. 흥미로운 사실은, TrkA 및 p75 수용체와 NGF 결합의 1252A5-매개 억제 에 대해 측정된 결합 억제 상수 값이 상당히 달랐다는 점이다. 그러므로, TrkA 및 p75 수용체와 인간 NGF 결합 억제에 대하여 계산된 평균 pKi는 각각 10.26 ± 0.08 및 9.85 ± 0.04였다(P<0.01, 스튜던트 T-검정; 두 경우 모두 n = 3). TrkA 및 p75 수용체와 래트 NGF 결합 억제에 대하여 계산된 평균 pKi는 각각 9.79 ± 0.04 및 9.55 ± 0.03이었다(P<0.05, 스튜던트 T-검정; 두 경우 모두 n = 3). 이러한 결과는 곧, 1252A5가 NGF 및 TrkA 수용체 간 상호 작용의 우선적 억제 인자라는 사실을 시사하는 것이며, 이는 해당 pKi 값 사이에 별 차이가 없었던, G1152H5에 의해 얻어진 결과들과는 대조적이었다(표 5).
실시예 10
인간 IgG4 NGF 항체의 항-통각 과민 활성
카라기난-유발 열 과민 반응에 관한 마우스 모델에서 NGF 항체의 항-통각 과민 활성을 평가하였다. 처음에 수컷 마우스(체중 20∼25g)를 시험 장치에서 2 시간 동안 적응시켰다. 다음날, 양쪽 뒷발에 열 자극을 주어 반응성에 관한 기준을 측정하였다. 문헌[Hargreaves외 다수, (1988)]에 기술된 바와 같이, 집중 열 공급원을 뒷발의 발바닥에 대어, 발을 빼는데에 걸리는 시간을 측정하였다. 각 발에 대하여 3회 실험을 실시하였을 때 얻어진 측정값(10분 간격으로 측정)의 평균을 내어 기준 값을 계산하였다. 이후, 마우스에 NGF 중화 인간 IgG4 항체 또는 대조구 아형-매칭 비활성 항체(인산염 완충 염수(PBS) 비이클 중)를 복막 내 주사하였다. 24시간 경과 후, 발바닥에 카라기난(2% w/v, PBS 중; 주사 부피 = 30 ㎕)을 주사하여 염증에 대한 통각 과민 반응을 유도해냈다. 24시간 더 경과 한 후, 다시 염증이 발생한 뒷발과 염증이 발생하지 않은 뒷발을 빼는데에 걸리는 시간을 측정하였다.
카라기난을 주사한 후 24시간 경과시 관찰한 열에 관한 통각 과민성은, 인간 IgG4 NGF 항체 1252A5로 마우스를 예비적으로 처리함에 따라서 투여량-의존적으로 억제되었다(도 10).
본원에 인용된 모든 문헌들은 다음과 같다.
참고 문헌
Figure 112007053769113-pct00001
Figure 112007053769113-pct00002
Figure 112007053769113-pct00003
Figure 112007053769113-pct00004
Figure 112007053769113-pct00005
Figure 112007053769113-pct00006
Figure 112007053769113-pct00007
Figure 112011005734296-pct00038
Figure 112011005734296-pct00039
Figure 112011005734296-pct00040
Figure 112011005734296-pct00041
Figure 112007053769113-pct00012
[상기 표 4에 있어서,
컬럼 내 데이터들은 계산된 항체 교차 반응성의 범위를 나타내는 것임.
수치들은 동일한 시험 항체 농도에서의 NGF 결합 신호와 관련하여, 각 뉴로트로핀에 대하여 관찰된 신호의 백분율로서 계산됨.
뉴로트로핀은 100 ng/웰의 농도로 검정 평판에 피복되었으며, 시험 항체의 결합 능은 0.03∼10nM의 농도 범위에서 측정하였음.
데이터는 1회 실험 결과를 나타냄]
Figure 112007053769113-pct00013
* P < 0.01 (인간 NGF/p75 상호 작용)
**P < 0.05 (래트 NGF/p75 상호 작용)
§N/S (p75)
스튜던트 비 대칭 T-검정(Student's unpaired T-test)
Figure 112007053769113-pct00014
Figure 112007053769113-pct00015
Figure 112007053769113-pct00016
Figure 112007053769113-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Cambridge Antibody Technology Limited <110> Elan Pharma International Limited <120> Specific Binding Members for NGF <130> SMW/CP6347033 <140> <141> <150> US 60/645,587 <151> 2005-01-24 <160> 537 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VH nucleotide sequence <400> 1 gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgctt acacctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcgtcccca tctttggttc aacaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag actcacgatt accgcggacg aattcacgag cacagcccat 240 atggagctga gcagcctgac atctgcggac acggccgtat attactgtgc gggaggcagt 300 gacttatatt gtagtggtgg taactgctac gggggcggtc actactacta ctacatggac 360 gtctgggggc aagggaccac ggtcaccgtc tcgagt 396 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VH amino acid sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Val Pro Ile Phe Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Phe Thr Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Ser Asp Leu Tyr Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Gly Gly 100 105 110 Gly His Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VH CDR1 amino acid sequence <400> 3 Ser Tyr Ala Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VH CDR2 amino acid sequence <400> 4 Gly Ile Val Pro Ile Phe Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VH CDR3 amino acid sequence <400> 5 Gly Ser Asp Leu Tyr Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Gly Gly Gly His 1 5 10 15 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 20 <210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VL nucleotide sequence <400> 6 tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acttgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccaggag cactcgagtt 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VL amino acid sequence <400> 7 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VL CDR1 amino acid sequence <400> 8 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VL CDR2 amino acid sequence <400> 9 Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1064F8 VL CDR3 amino acid sequence <400> 10 Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val 1 5 10 <210> 11 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VH nucleotide sequence <400> 11 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtt 60 tcctgcaagg catctggata cagcttcatc aactactcta tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gataggaata atcaatcctg gtggtgacag cacaaaatac 180 acacagaggt tccaggacag agtcaccatg acctgggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctca gcagcctgag atctgaggac acggccatct attactgtgc gagaggcctc 300 caccccatcc ctatgatgtt agcgactatt aacccaattt ttgcctactg gggccaggga 360 accctggtca ccgtctcgag t 381 <210> 12 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VH amino acid sequence <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Asn Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Gly Gly Asp Ser Thr Lys Tyr Thr Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu His Pro Ile Pro Met Met Leu Ala Thr Ile Asn Pro 100 105 110 Ile Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VH CDR1 amino acid sequence <400> 13 Asn Tyr Ser Met His 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VH CDR2 amino acid sequence <400> 14 Ile Ile Asn Pro Gly Gly Asp Ser Thr Lys Tyr Thr Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VH CDR3 amino acid sequence <400> 15 Gly Leu His Pro Ile Pro Met Met Leu Ala Thr Ile Asn Pro Ile Phe 1 5 10 15 Ala Tyr <210> 16 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VL nucleotide sequence <400> 16 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgta tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccgag gagacagcct ccgaaactat tatgcaaact ggtaccagca gaagccggga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatgatgaa aataagcggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccggctcagg gaacacagct tccttgacca tcaccggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actatttctg caactcccgg gacacctttg gttacgttcg cgatgtgtta 300 ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VL amino acid sequence <400> 17 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Ser Arg Asp Thr Phe Gly Tyr Val 85 90 95 Arg Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VL CDR1 amino acid sequence <400> 18 Arg Gly Asp Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VL CDR2 amino acid sequence <400> 19 Asp Glu Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1022E3 VL CDR3 amino acid sequence <400> 20 Asn Ser Arg Asp Thr Phe Gly Tyr Val Arg Asp Val Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VH nucleotide sequence <400> 21 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaaga ccgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcgcc taccactacc tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180 gcacagaggt tccaggacag agtcacgatt accgcggacg agtccaccag cacagcctac 240 atggagttga gcagtctgag atctgaggac acggccgtct attactgtgc gagtgctgat 300 tacgtttggg ggagttatcg tcccgactgg tacttcgatc tctggggcag agggacaatg 360 gtcaccgtct cgagt 375 <210> 22 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VH amino acid sequence <400> 22 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Tyr His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Asp Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Arg Pro Asp Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VH CDR1 amino acid sequence <400> 23 Tyr His Tyr Leu His 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VH CDR2 amino acid sequence <400> 24 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VH CDR3 amino acid sequence <400> 25 Ala Asp Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Arg Pro Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VL nucleotide sequence <400> 26 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggg agtaacactg taaactggta ccagcgactc 120 ccaggagcgg ccccccaact cctcatctac aataatgacc agcggccctc agggatccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcaggctccc tggtcatcag tgggctccag 240 tctgaagatg aggctgatta ctactgtgcg tcatgggatg acagtctgaa tggtcgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 27 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VL amino acid sequence <400> 27 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VL CDR1 amino acid sequence <400> 28 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VL CDR2 amino acid sequence <400> 29 Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1083H4 VL CDR3 amino acid sequence <400> 30 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val 1 5 10 <210> 31 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VH nucleotide sequence <400> 31 gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gataggaggg attattccta tctttgacac aggcaactct 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctacg actatgccgg gggtgaccac tactactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384 <210> 32 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VH amino acid sequence <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Tyr Ala Gly Gly Asp His Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VH CDR1 amino acid sequence <400> 33 Thr Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VH CDR2 amino acid sequence <400> 34 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VH CDR3 amino acid sequence <400> 35 Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Tyr Ala Gly Gly Asp His Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 36 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VL nucleotide sequence <400> 36 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctacgcccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 37 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VL amino acid sequence <400> 37 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VL CDR1 amino acid sequence <400> 38 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VL CDR2 amino acid sequence <400> 39 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1021E5 VL CDR3 amino acid sequence <400> 40 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 1 5 10 <210> 41 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VH nucleotide sequence <400> 41 gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctgggtcctc cgtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggaga cacctccacc ttgtattcta tcaactgggt gcgacaggtc 120 cctggacaag gacttgagtg gatgggagcg atcatcccta tctttggttt aacagactac 180 gcacaggagt tccagggcag actcacgatt accgcggacg aatccacgaa cacagcctac 240 atggagctga ccggcctgag gtctgaggac acggccatat attattgtgc gagaaatctc 300 tttacaactc tcagctactg gtacttcgat ctctggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagt 366 <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VH amino acid sequence <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Ser Thr Leu Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Ile Pro Ile Phe Gly Leu Thr Asp Tyr Ala Gln Glu Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Phe Thr Thr Leu Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VH CDR1 amino acid sequence <400> 43 Leu Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VH CDR2 amino acid sequence <400> 44 Ala Ile Ile Pro Ile Phe Gly Leu Thr Asp Tyr Ala Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VH CDR3 amino acid sequence <400> 45 Asn Leu Phe Thr 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Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VL CDR1 amino acid sequence <400> 48 Gln Gly Asp Arg Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VL CDR2 amino acid sequence <400> 49 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033G9 VL CDR3 amino acid sequence <400> 50 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val 1 5 10 <210> 51 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VH nucleotide sequence <400> 51 gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag ctgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata ccccttcacc agctactata tgcactgggt gcggcaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggactt gttgatcctg aagatggtga aacaatatac 180 gcagagaagt tccagggcag agtcaccata accgcggaca cgtctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attcctgtgc aacatccagt 300 cacaactatg ggaccgcgtc ctactaccac tacggcatgg acgtctgggg cagggggaca 360 atggtcaccg tctcttca 378 <210> 52 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VH amino acid sequence <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Thr Ser Ser His Asn Tyr Gly Thr Ala Ser Tyr Tyr His Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VH CDR1 amino acid sequence <400> 53 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VH CDR2 amino acid sequence <400> 54 Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VH CDR3 amino acid sequence <400> 55 Ser Ser His Asn Tyr Gly Thr Ala Ser Tyr Tyr His Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 56 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VL nucleotide sequence <400> 56 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggg agtaacactg taaactggta ccagcgactc 120 ccaggagcgg ccccccaact cctcatctac aataatgacc agcggccctc agggatccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcaggctccc tggtcatcag tgggctccag 240 tctgaagatg aggctgatta ctactgtgcg tcatgggatg acagtctgaa tggtcgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 57 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1016A8 VL amino acid sequence <400> 57 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 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gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccaggag cactcgagtt 300 tttggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 77 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033B2 VL amino acid sequence <400> 77 Gln Ser Val Leu Ile Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1033B2 VL CDR1 amino acid sequence <400> 78 Thr Gly Thr Ser Ser Asp 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gagagatgga 300 cagcagctgg ccaactacgc tatggacgtc tgggggcggg ggaccacggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 92 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1057F11 VH amino acid sequence <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala His Ala Trp Ser Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gln Gln Leu Ala Asn Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1057F11 VH CDR1 amino acid sequence <400> 93 Ser His Gly Met His 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1057F11 VH CDR2 amino acid sequence <400> 94 His Ala Trp 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gataggaggg attattccta tctttgacac aggcaactct 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctacg acgccaaccg ccaggccgtc ccctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc ctcag 385 <210> 102 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1126F1 VH amino acid sequence <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Gln Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Ala Val Pro Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 103 <211> 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tctttgacac aggcaactct 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcgagt 300 cgtatctacg acttgaaccc ctccctcact gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 232 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1147D2 VH amino acid sequence <400> 232 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 233 <211> 5 <212> PRT <213> Homo 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tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctatg acttcaactc cgccctcata tcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384 <210> 362 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1230H7 VH amino acid sequence <400> 362 Glu Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Asn Ser Ala Leu Ile Ser Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 363 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1230H7 VH CDR1 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ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatagggggg attattccta tctttgacac aggcagctct 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctacg acttgaaccc ctccctcact gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384 <210> 502 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1156G6 VH amino acid sequence <400> 502 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Ser Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala 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ttactgcgga acgtgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtc 327 <210> 507 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1156G6 VL amino acid sequence <400> 507 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 508 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1156G6 VL CDR1 amino acid sequence <400> 508 Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 509 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1156G6 VL CDR2 amino acid sequence <400> 509 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 510 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1156G6 VL CDR3 amino acid sequence <400> 510 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 1 5 10 <210> 511 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VH nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> n = a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (333)..(333) <223> n = a, c, g or t <400> 511 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gataggaggg attattccta tctttaacac aggcaactct 180 gcacagagct tccaaggcag agtcacgatt accgcggatg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctacg acttgaaccc ctccctcact gcntactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384 <210> 512 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VH amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Xaa is unknown <400> 512 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asn Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 513 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VH CDR1 amino acid sequence <400> 513 Thr Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 514 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VH CDR2 amino acid sequence <400> 514 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asn Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 515 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VH CDR3 amino acid sequence <400> 515 Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 516 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VL nucleotide sequence <400> 516 caggctgtgc tgacccagcc gtcctcagtg tctacgcccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcggctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtc 327 <210> 517 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VL amino acid sequence <400> 517 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 518 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VL CDR1 amino acid sequence <400> 518 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 519 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VL CDR2 amino acid sequence <400> 519 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 520 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1215A06 VL CDR3 amino acid sequence <400> 520 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 1 5 10 <210> 521 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VH nucleotide sequence <400> 521 gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gataggaggg attattccta tctttgacac aggcaactct 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggccgtat actattgtgc aagttcaagt 300 cgtatctacg acttgaaccc ctccctcact gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gggt 384 <210> 522 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VH amino acid sequence <400> 522 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Gly 115 120 125 <210> 523 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VH CDR1 amino acid sequence <400> 523 Thr Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 524 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VH CDR2 amino acid sequence <400> 524 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 525 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VH CDR3 amino acid sequence <400> 525 Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 526 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VL nucleotide sequence <400> 526 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagta tctacgcccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcaggtc caacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtc 327 <210> 527 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VL amino acid sequence <400> 527 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 528 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VL CDR1 amino acid sequence <400> 528 Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 529 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VL CDR2 amino acid sequence <400> 529 Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 530 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 1219D9 VL CDR3 amino acid sequence <400> 530 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 1 5 10 <210> 531 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 531 Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala 1 5 <210> 532 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 532 Phe Asn Ser Ala Leu Ile Ser 1 5 <210> 533 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 533 Met Ile Ser Ser Leu Gln Pro 1 5 <210> 534 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer FDTETSEQ24 <400> 534 tttgtcgtct ttccagacgt tagt 24 <210> 535 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer PUCreverse <400> 535 agcggataac aatttcacac agg 23 <210> 536 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer Lseq <400> 536 gattacgcca agctttggag c 21 <210> 537 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer MYC Seq 10 <400> 537 ctcttctgag atgagttttt g 21 1

Claims (72)

  1. 인간 항체 VH 도메인 및 인간 항체 VL 도메인으로 이루어지고 CDR 세트 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체의 항원 결합 부위를 포함하는, 신경 성장 인자(Nerve Growth Factor; NGF)에 대한 단리된 항체 분자로서, 상기 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 골격구조를 포함하고, 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, LCDR3 및 골격구조를 포함하며, 상기 CDR 세트는 이하의 것으로 구성된 군에서 선택되는 CDR 세트로 이루어지는 것인 단리된 항체 분자:
    HCDR1은 서열 번호 193의 아미노산 서열을 가지고, HCDR2는 서열 번호 194의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3은 서열 번호 195의 아미노산 서열을 가지고, LCDR1은 서열 번호 198의 아미노산 서열을 가지고, LCDR2는 서열 번호 199의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 200의 아미노산 서열을 가지는 것으로 정의되는 CDR의 1133C11 세트;
    HCDR3 내의 서열 번호 531의 아미노산 서열이 서열 번호 533의 아미노산 서열 또는 서열 번호 532의 아미노산 서열로 치환되어 있는 CDR의 1133C11 세트를 포함하는 CDR 세트; 및
    CDR의 1133C11 세트와 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 CDR 세트로서, 상기 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 카밧(Kabat)의 표준 넘버링을 이용할 때 각 위치에 대해 동정된 가능한 치환 잔기의 군 중 이하의 위치에서 발생하는 것인 CDR 세트:
    치환 위치 다음과 같은 잔기로 구성된 군에서 선택되는 치환 잔기 HCDR1 내의 31 번 A HCDR1 내의 34 번 V HCDR2 내의 51 번 V HCDR2 내의 55 번 N HCDR2 내의 56 번 A HCDR2 내의 57 번 V HCDR2 내의 58 번 S HCDR2 내의 65 번 D HCDR3 내의 96 번 N LCDR1 내의 26 번 T LCDR1 내의 26 번 G LCDR1 내의 27 번 N LCDR1 내의 27 번 R LCDR1 내의 27A 번 T LCDR1 내의 27A 번 P LCDR1 내의 27B 번 D LCDR1 내의 28 번 T LCDR1 내의 29 번 E LCDR1 내의 30 번 D LCDR2 내의 56 번 T LCDR3 내의 90 번 A LCDR3 내의 94 번 G
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, LCDR1 내의 29 번 잔기가 E인 항체 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    HCDR1이 서열 번호 163이고, HCDR2가 서열 번호 164이고, HCDR3이 서열 번호 165이고, LCDR1이 서열 번호 168이고, LCDR2가 서열 번호 169이고, LCDR3이 서열 번호 170이거나;
    HCDR1이 서열 번호 183이고, HCDR2가 서열 번호 184이고, HCDR3이 서열 번호 185이고, LCDR1이 서열 번호 188이고, LCDR2가 서열 번호 189이고, LCDR3이 서열 번호 190이거나;
    HCDR1이 서열 번호 193이고, HCDR2가 서열 번호 194이고, HCDR3이 서열 번호 195이고, LCDR1이 서열 번호 198이고, LCDR2가 서열 번호 199이고, LCDR3이 서열 번호 200이거나;
    HCDR1이 서열 번호 203이고, HCDR2가 서열 번호 204이고, HCDR3이 서열 번호 205이고, LCDR1이 서열 번호 208이고, LCDR2가 서열 번호 209이고, LCDR3이 서열 번호 210이거나;
    HCDR1이 서열 번호 223이고, HCDR2가 서열 번호 224이고, HCDR3이 서열 번호 225이고, LCDR1이 서열 번호 228이고, LCDR2가 서열 번호 229이고, LCDR3이 서열 번호 230이거나;
    HCDR1이 서열 번호 433이고, HCDR2가 서열 번호 434이고, HCDR3이 서열 번호 435이고, LCDR1이 서열 번호 438이고, LCDR2가 서열 번호 439이고, LCDR3이 서열 번호 440이거나;
    HCDR1이 서열 번호 233이고, HCDR2가 서열 번호 234이고, HCDR3이 서열 번호 235이고, LCDR1이 서열 번호 238이고, LCDR2가 서열 번호 239이고, LCDR3이 서열 번호 240이거나;
    HCDR1이 서열 번호 443이고, HCDR2가 서열 번호 444이고, HCDR3이 서열 번호 445이고, LCDR1이 서열 번호 448이고, LCDR2가 서열 번호 449이고, LCDR3이 서열 번호 450이거나;
    HCDR1이 서열 번호 243이고, HCDR2가 서열 번호 244이고, HCDR3이 서열 번호 245이고, LCDR1이 서열 번호 248이고, LCDR2가 서열 번호 249이고, LCDR3이 서열 번호 250이거나;
    HCDR1이 서열 번호 453이고, HCDR2가 서열 번호 454이고, HCDR3이 서열 번호 455이고, LCDR1이 서열 번호 458이고, LCDR2가 서열 번호 459이고, LCDR3이 서열 번호 460이거나;
    HCDR1이 서열 번호 463이고, HCDR2가 서열 번호 464이고, HCDR3이 서열 번호 465이고, LCDR1이 서열 번호 468이고, LCDR2가 서열 번호 469이고, LCDR3이 서열 번호 470이거나;
    HCDR1이 서열 번호 253이고, HCDR2가 서열 번호 254이고, HCDR3이 서열 번호 255이고, LCDR1이 서열 번호 258이고, LCDR2가 서열 번호 259이고, LCDR3이 서열 번호 260이거나;
    HCDR1이 서열 번호 473이고, HCDR2가 서열 번호 474이고, HCDR3이 서열 번호 475이고, LCDR1이 서열 번호 478이고, LCDR2가 서열 번호 479이고, LCDR3이 서열 번호 480이거나;
    HCDR1이 서열 번호 483이고, HCDR2가 서열 번호 484이고, HCDR3이 서열 번호 485이고, LCDR1이 서열 번호 488이고, LCDR2가 서열 번호 489이고, LCDR3이 서열 번호 490이거나;
    HCDR1이 서열 번호 493이고, HCDR2가 서열 번호 494이고, HCDR3이 서열 번호 495이고, LCDR1이 서열 번호 498이고, LCDR2가 서열 번호 499이고, LCDR3이 서열 번호 500이거나;
    HCDR1이 서열 번호 503이고, HCDR2가 서열 번호 504이고, HCDR3이 서열 번호 505이고, LCDR1이 서열 번호 508이고, LCDR2가 서열 번호 509이고, LCDR3이 서열 번호 510이거나;
    HCDR1이 서열 번호 293이고, HCDR2가 서열 번호 294이고, HCDR3이 서열 번호 295이고, LCDR1이 서열 번호 298이고, LCDR2가 서열 번호 299이고, LCDR3이 서열 번호 300이거나;
    HCDR1이 서열 번호 303이고, HCDR2가 서열 번호 304이고, HCDR3이 서열 번호 305이고, LCDR1이 서열 번호 308이고, LCDR2가 서열 번호 309이고, LCDR3이 서열 번호 310이거나;
    HCDR1이 서열 번호 513이고, HCDR2가 서열 번호 514이고, HCDR3이 서열 번호 515이고, LCDR1이 서열 번호 518이고, LCDR2가 서열 번호 519이고, LCDR3이 서열 번호 520이거나;
    HCDR1이 서열 번호 353이고, HCDR2가 서열 번호 354이고, HCDR3이 서열 번호 355이고, LCDR1이 서열 번호 358이고, LCDR2가 서열 번호 359이고, LCDR3이 서열 번호 360이거나;
    HCDR1이 서열 번호 523이고, HCDR2가 서열 번호 524이고, HCDR3이 서열 번호 525이고, LCDR1이 서열 번호 528이고, LCDR2가 서열 번호 529이고, LCDR3이 서열 번호 530인 항체 분자.
  5. 제1항에 있어서, HCDR3 내의 서열 번호 531의 아미노산 서열이 서열 번호 533의 아미노산 서열로 치환되어 있는 CDR의 1133C11 세트를 포함하는 CDR 세트를 포함하는 항체 분자.
  6. 제1항에 있어서, HCDR3 내의 서열 번호 531의 아미노산 서열이 서열 번호 532의 아미노산 서열로 치환되어 있는 CDR의 1133C11 세트를 포함하는 CDR 세트를 포함하는 항체 분자.
  7. 제1항에 있어서, CDR의 1133C11 세트를 포함하는 항체 분자.
  8. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 도메인 골격구조가 인간의 중쇄 생식계열 골격구조이거나, 상기 VL 도메인 골격구조가 인간의 경쇄 생식계열 골격구조이거나, 상기 VH 도메인 골격구조가 인간의 중쇄 생식계열 골격구조이고 상기 VL 도메인 골격구조가 인간의 경쇄 생식계열 골격구조인 항체 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 생식계열 골격구조가 VH1 DP10을 포함하는 것인 항체 분자.
  10. 제8항에 있어서, 상기 경쇄 생식계열 골격구조가 VL Vλ1을 포함하는 것인 항체 분자.
  11. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 래트 또는 마우스 NGF에 결합하는 항체 분자.
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서, 서열 번호 392의 아미노산 서열을 가지는 1252A5 VH 도메인을 포함하는 항체 분자.
  14. 제10항에 있어서, 서열 번호 397의 아미노산 서열을 가지는 1252A5 VL 도메인을 포함하는 항체 분자.
  15. 제9항에 있어서, 서열 번호 402의 아미노산 서열을 가지는 G1152H5 VH 도메인을 포함하는 항체 분자.
  16. 제10항에 있어서, 서열 번호 407의 아미노산 서열을 가지는 G1152H5 VL 도메인을 포함하는 항체 분자.
  17. 제9항에 있어서, 서열 번호 412의 아미노산 서열을 가지는 G1165D4 VH 도메인을 포함하는 항체 분자.
  18. 제10항에 있어서, 서열 번호 417의 아미노산 서열을 가지는 G1165D4 VL 도메인을 포함하는 항체 분자.
  19. 제9항에 있어서, 서열 번호 422의 아미노산 서열을 가지는 G1230H7 VH 도메인을 포함하는 항체 분자.
  20. 제10항에 있어서, 서열 번호 427의 아미노산 서열을 가지는 G1230H7 VL 도메인을 포함하는 항체 분자.
  21. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체 분자를 포함하는 항체 분자.
  22. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 불변부를 포함하는 항체 분자.
  23. 제22항에 있어서, 전체 항체(whole antibody)를 포함하는 항체 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 전체 항체가 IgG4인 항체 분자.
  25. 인간 NGF에 결합하고 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단리된 항체 분자로서, 상기 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 392이고, 상기 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 397인 단리된 항체 분자.
  26. 제25항에 있어서, IgG4인 단리된 항체 분자.
  27. 제1항, 제3항 내지 제7항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  28. 제27항에 따른 핵산에 의해 시험관내 형질전환된 숙주 세포.
  29. 제1항, 제3항 내지 제7항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 VH 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산; 및
    제1항, 제3항 내지 제7항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산
    에 의해 시험관내 형질전환된 숙주 세포.
  30. 항체 분자의 제조 방법으로서, 상기 항체 분자의 제조를 위한 조건 하에 제28항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체 분자를 단리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항체 분자를, 1종 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  33. 제1항, 제3항 내지 제7항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 인간 NGF 또는 인간 NGF의 단편에 결합시키는 단계를 포함하며, 상기 결합은 시험관내에서 이루어지는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, NGF 또는 NGF의 단편에 대한 항체의 결합량을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  35. NGF가 역할을 하는 질환의 치료를 위한 제1항, 제3항 내지 제7항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 질환이 통증인 약학 조성물.
  36. 삭제
  37. 제35항에 있어서, 1종 이상의 추가 성분을 포함하는 약학 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제, 비히클 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. 삭제
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