KR20240017006A - 조작된 이중 결합 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

IL-13 및 TSLP에 결합하는 조작된 이중 결합 항체 및 이의 용도가 본원에 기술된다. 용도는 알레르기성 및 호흡기 병태를 치료하는 것을 포함한다. 조작된 이중 결합 항체를 포함하는 라이브러리, 및 조작된 이중 결합 항체를 생산하는 방법, 및 항체의 기능적 및 생화학적 특성을 분석하는 방법이 또한 본원에 기술된다.

Description

조작된 이중 결합 항체 및 이의 용도
서열 목록에 대한 진술
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 2022년 5월 25일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 P-605548-PC.txt이고 크기는 14.8 킬로 바이트이다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 IL-13 및 TSLP에 결합하는 이중 결합 항체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 항체는 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
IL-13은 클래스 I 사이토카인의 12.3 kDa 단량체 단백질이다. IL-13은 클래스 I 짧은 나선형 사이토카인의 전형적인 4개의 알파 나선형 번들 코어 토폴로지를 가지며; 이는 낮은 서열 동일성을 공유하지만 높은 구조적 동일성을 공유하는 밀접하게 관련된 사이토카인 IL-4와 구조가 유사하다. IL-4와 함께, IL-13은 B 세포에서 면역글로불린 클래스가 IgE로 전환되는 것을 조절하는 것으로 나타났으며, 비만 세포 동원에 관여한다. IL-13은 CD4+ Th2 세포뿐만 아니라 2형 선천성 림프 세포 ILC2에 의해서도 분비된다. IL-13은 (TGF-β)의 생산을 촉발할 수 있고 기관지 상피 세포에서 MUC5AC의 유전자 발현 및 뮤신의 생산을 유도한다는 것이 입증되었다. IL-13은 기관지 평활근 세포에서 수축을 향상시킬 수도 있다. IL-13은 IL-4Ra /IL-13Ra1 이종이량체 복합체에 결합하고, 결합 후 JAK-신호 변환기 및 STAT6 의존적 신호 전달 연쇄반응을 유발하는데, 이는 궁극적으로 Th2 헬퍼 T 세포 분화, 대식세포의 “대안적으로 활성화된” 표현형인 M2로의 극성화, 상피 점액 생산, 평활근 수축, 및 케모카인 방출을 유발한다.
IL-13은 기생충으로부터 보호하는 것에 관여하는 것으로 나타났는데, IL-13 마우스 녹아웃 모델에서는, 브라질 노카르디아(N. brasiliensis)의 제거가 심각하게 지연된다는 것이 입증되었다. 또한, Th2-형 반응이 달리 온전함에도 불구하고 생쥐 편충(Trichuris muris)의 완전한 구축은 불가능해진다. 추가 연구는 IL-13이 양면성을 가지고 있다는 것(double-edged sword)을 입증하였는데, 한편으로 IL-13은 기생충에 대한 보호에 있어서 주요한 역할을 하지만, 면역 체계 조절에 장애가 있는 상황에서 IL-13의 기능도 알려져 있다.
천식 환자의 폐에서, 질환의 중증도와 상관이 있는 IL-13 mRNA 및 단백질의 수준 증가가 검출됨에 따라, IL-13은 인간 천식의 발병기전에 관여하는 것으로 여겨져 왔다. 또한, IL-13 수준 상승을 초래하고 천식 및 아토피와 연관된 인간 IL-13 유전적 다형성이 식별되었고, IL-13 수준 상승이 천식 환자의 폐에서 검출되었다.
IL-13와 IL-4는 유사한 수용체 및 신호 전달 경로를 공유하지만, IL-13은 천식에 있어서 뚜렷한 역할을 하며, 이는 IL-4와 무관하다. IL-13 단독 투여가 호산구 유래 염증 및 점액 세포 과형성을 유도하기에 충분하다는 것이 마우스 모델에서 나타났다. 또한, IL-4는 차단하지 않고 IL-13을 특이적으로 차단하면 마우스 모델에서 기도 과반응성 및 점액 생성을 충분히 역전시킬 수 있다. 또한, 인간 IL-13 유전자좌에서의 다형성은 천식에 대한 높은 감수성과 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, IL-13 신호전달의 특이적 억제는 천식 환자 또는 알려진 다른 알레르기성 또는 호흡기 병태를 가진 환자에게 긍정적인 치료 효과를 가질 수 있을 것이다.
흉선 기질 림포포포이에틴(TSLP)은 IL-7Rα 서브유닛 및 TSLP-R로 이루어진 이종이량체 수용체를 통해 신호를 전달하는 사이토카인으로서, 일반적인 γ-수용체-유사 사슬과 상동성을 갖는 독특한 성분이다. TSLP는 흉선, 폐, 피부, 장, 및 편도의 상피 세포뿐만 아니라 기도 평활근 세포, 폐 섬유아세포, 및 기질 세포에 의해서도 발현된다. 이들 세포는 전염증성 자극에 반응하여 TSLP를 생산하고, TSLP는 수지상 세포를 포함하여 다수의 선천적 면역 세포에 대한 활성을 통해 알레르기성 염증 반응을 유도한다. TSLP는 또한, 미접촉 T 세포의 증식을 촉진하고, 이들이 높은 수준의 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 발현하는 Th2 세포로 분화하는 것을 유도할 수 있다. 천식 폐 상피 세포 및 만성 아토피 피부염 병변에서 높은 수준의 TSLP 발현이 발견되었는데, 이는 알레르기성 염증에서 TSLP의 역할을 시사한다. 최근의 증거 또한 TSLP가 Th17 세포의 분화 및 Th17-유발성 염증 과정에 관련이 있음을 보여준다. 만성 알레르기성 (아토피성) 천식은 종종 Th2-형 염증을 특징으로 하는 반면, 비-알레르기성 천식성 염증은 주로 Th1 및 Th17 사이토카인 환경이 혼합된 호중구성이다. TSLP에 대한 길항제는 염증성 병태를 치료하는 데 유용할 것으로 예상된다.
따라서, IL-13 및 TSLP 활성화에 의해 유발되는 질환 및 병태, 예를 들어 천식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 알레르기 및 호흡기 병태(이에 한정되지는 않음)의 치료를 위한 조성물 및 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 남아 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하되, CDR은 서열번호 149~154의 서열을 갖는 단리된 이중 결합 항체를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 이중 결합 항체는 서열번호 155 및 156 또는 서열번호 157 및 158의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일 양태에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시된다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 상기 이중 결합 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하고, 상기 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 상보성 결정 영역(CDR) 세트를 포함하고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(서열번호 143)로서 제시되거나(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임); 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하고, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고 (여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 도메인인); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고 (여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCDR3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시되거나 (여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임); (a)와 (b)의 조합이다.
관련 양태에서, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 137로서 제시되고, 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 138로서 제시되고 , 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR1의 아미노산 서열은 139로서 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140으로서 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141로서 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단리된 이중 결합 항체의 추가의 관련 양태에서, HX1은 W이고, HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX12는 I 및 L의 군으로부터 선택되고, LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단리된 이중 결합 항체의 또 다른 관련 양태에서, 단리된 이중 결합 항체는 HX1이 W이고, HX2는 A이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX12는 I이고, LX4는 S이고, LX7은 G이거나; HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX12는 L이고, LX4는 S이고, LX7은 H이거나; HX1은 W이고, HX2는 S이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, X12는 L이고, LX4는 G이고, LX7은 G인 CDR을 포함한다.
단리된 이중 결합 항체의 또 다른 관련 양태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 조합(IMGT 위치 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 상기 VL 도메인은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하거나; (a)에 제시된 VH 도메인 및 (b)에 제시된 VL 도메인의 조합이고; 상기 VH 도메인, 상기 VL 도메인, 또는 상기 이들의 조합에서 변이체 위치의 총수는 적어도 2개이다.
추가의 관련 양태에서, 상기 VH 도메인 내의 상기 적어도 하나의 변이체 아미노산은 서열번호 1의 위치 106 (IMTG 위치 112)에서 변이체를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 VL 도메인 내의 상기 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 VL 도메인 내의 상기 변이체 아미노산은 서열번호 2의 위치 26, 27, 31, 또는 96 중 또는 이들의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 변이체를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 VL 도메인에는 적어도 2개의 변이체가 있고, 제2 변이체는 프레임워크 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 프레임워크 영역 내의 상기 변이체 아미노산은 서열번호 2의 위치 56 또는 77, 또는 이들의 조합(IMGT 위치: 70 또는 94, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 변이체를 포함한다.
또 다른 관련 양태에서, 상기 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 관련 양태에서, VH 도메인 - VL 도메인 쌍의 아미노산 서열은 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 및 서열번호 54 및 53에 제시된 쌍 서열로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 209 및 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 219 및 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 249 및 250의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 337 및 338의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 표 1 또는 표 10에 도시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 관련 양태에서, 이중 결합 항체는 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 포함한다. 추가의 관련 양태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG를 포함한다.
일 양태에서, 단리된 이중 결합 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.
일 양태에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 본원에 개시되며, 여기서 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하고, 상기 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(서열번호 143)로서 제시되거나(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임); 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하고, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고 (여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 도메인인); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고 (여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCDR3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시되거나 (여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임); (a)와 (b)의 조합이다.
핵산의 관련 양태에서, HCDR2의 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 137로서 제시되고, 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 138로서 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR1의 아미노산 서열은 139로서 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140으로서 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141로서 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
핵산의 관련 양태에서, HX1에 대한 암호화된 아미노산은 W이고, HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX12는 I 및 L의 군으로부터 선택되고, LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX5는 S이고, LX6은 S이고, 및 LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 관련 양태에서, HX1에 대한 암호화된 아미노산은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX12는 I이고, LX4는 S이고, LX7은 G이거나; HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX12는 L이고, LX4는 S이고, LX7은 H이거나; 또는 HX1은 W이고, HX2는 S이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX12는 L이고, LX4는 G이고, LX7은 G이다.
핵산 작제물의 관련 양태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 조합(IMGT 위치 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 상기 VL 도메인은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하거나; (a)에 제시된 VH 도메인 및 (b)에 제시된 VL 도메인의 조합이고; 암호화된 VH 도메인, 암호화된 VL 도메인, 또는 이들의 조합에서 변이체 위치의 총수는 적어도 2개이다. 추가의 관련 양태에서, 상기 서열은 2개의 핵산 서열을 포함하되, 하나는 변이체 이중 결합 항체 VH 도메인을 암호화하고, 다른 하나는 변이체 이중 결합 항체 VL 도메인을 암호화한다. 추가의 관련 양태에서, 상기 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 105, 및 107에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 추가의 관련 양태에서, 이중 항체 VH 도메인 - VL 도메인 쌍을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 57 및 58, 서열번호 59 및 60, 서열번호 61 및 62, 서열번호 63 및 64, 서열번호 65 및 66, 서열번호 67 및 68, 서열번호 69 및 70, 서열번호 71 및 72, 서열번호 73 및 74, 서열번호 75 및 76, 서열번호 77 및 78, 서열번호 79 및 80, 서열번호 81 및 82, 서열번호 83 및 84, 서열번호 85 및 86, 서열번호 87 및 88, 서열번호 89 및 90, 서열번호 91 및 92, 서열번호 93 및 94, 서열번호 95 및 96, 서열번호 97 및 98, 서열번호 99 및 100, 서열번호 101 및 102, 서열번호 103 및 104, 서열번호 105 및 106, 및 서열번호 107 및 108에 제시된 쌍 서열로부터 선택된다.
핵산 작제물의 관련 양태에서, 상기 항체는 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 포함한다. 추가의 관련 양태에서, 상기 IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG를 포함한다.
또 다른 관련 양태에서, 핵산 작제물은 상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터가 본원에 개시되며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함한다.
일 양태에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 개시되며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함한다.
일 양태에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 작제물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본원에 개시되며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함한다.
일 양태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하는 이중 결합 항체를 생산하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하는, 단계; 상기 벡터로부터 상기 핵산 작제물을 발현시키는 단계; 상기 이중 결합 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하는 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리가 본원에 개시되며, 여기서 상기 항체는 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(서열번호 143)로서 제시되거나(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임); 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하고, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고 (여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 도메인인); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고 (여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCDR3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시된다(여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임).
라이브러리의 관련 양태에서, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 137로서 제시되고, 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 138로서 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR1의 아미노산 서열은 139로서 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140으로서 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141로서 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
라이브러리의 추가의 관련 양태에서, HX1은 W이고, HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX12는 I 및 L의 군으로부터 선택되고, LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
라이브러리의 또 다른 추가의 관련 양태에서, HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX12는 I이고, LX4는 S이고, LX7은 G이거나; HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX12는 L이고, LX4는 S이고, LX7는 H이거나; HX1은 W이고, HX2는 S이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX12는 L이고, LX4는 G이고, LX7은 G이다. 라이브러리의 또 다른 추가의 관련 양태에서, 상기 VH 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 상기 VL 도메인은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하거나; (a)에 제시된 VH 도메인 및 (b)에 제시된 VL 도메인의 조합이고; 여기서 VH 도메인, VL 도메인, 또는 이들의 조합에서 변이체 위치의 총수는 적어도 2개이다.
라이브러리의 또 다른 관련 양태에서, 면역글로불린은 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 포함한다.
라이브러리의 또 다른 관련 양태에서, IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG를 포함한다.
일 양태에서, 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 포함하는 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
대상체를 치료하는 방법의 하나의 관련 양태에서, 상기 알레르기성 또는 호흡기 병태는 천식; 알레르기성 천식; 비알레르기성 천식; 중증 천식; 경증 천식; 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 호산구증가증, 섬유증, 및 과도한 점액 생성을 포함하는 기도 염증, 낭성 섬유증, 알레르기성 폐 질환, 기도 과민증, 배상 세포 화생, 점액 과다분비, 기도 개형(airway remodeling), 폐 섬유증을 포함하는 병태; 아토피 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 장위염, 및 알레르기성 비염을 포함하는 아토피성 장애; 또는 이들의 조합; 염증성 장 질환(IBD)을 포함하는 상기 염증성 및/또는 자가면역 병태 및 간경변증 또는 섬유증을 포함하는 간 병태; 또는 이들의 조합이다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 구비된 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청에 따라 필요한 수수료의 납부 후에 제공될 것이다.
조작된 이중 결합 항체의 주제는 본 명세서의 결론 부분에서 특히 언급되고 분명하게 청구된다. 그러나, 이들 이중 결합 항체는 이들의 그 목적, 특징, 및 이점과 함께, 이들의 생성 및 사용 방법 모두에 관하여, 첨부 도면과 함께 읽을 때, 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 참조함으로써 가장 잘 이해될 수 있으며, 도면 중:
도 1a 및 1b는 프레임워크(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR) 영역을 나타내는 템플릿 항체 중쇄(서열번호 1) 아미노산 서열(도 1a) 및 경쇄(서열번호 2) 아미노산 서열(도 1b)을 제시한다. 중쇄(H)의 경우, 상이한 영역은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4로 표지되어 있고, 일부 구현예에서는 HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3, HCDR3, 및 HFR4로서 지칭된다. 경쇄(L)의 경우, 상이한 영역은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4로 표지되고, 일부 구현예에서는 LFR1, LCDR1, LFR2, LCDR2, LFR3, LCDR3, 및 LFR4로서 지칭된다. 템플릿 아미노산 서열 아래에는 조작된 이중 결합 클론의 변이체 아미노산이 표시되어 있고 CDR 및 FR 영역 내에 정렬되어 있다.
도 2a 및 2b는 효모 상에 표시된 재-에피토프화된 항체가 재조합 인간 IL-13(rh-IL-13)(도 2a) 또는 재조합 인간 TSLP(rhTSLP)(도 2b)에 결합하는 것을 보여주는 막대 그래프를 제시한다. 도 2a는 효소 표면에 표시된 단리된 항-IL13 클론이 10 nM rh-IL-13에 결합하는 것을 보여준다. 도 2b는 효소 표면에 표시된 단리된 항-TSLP 클론이 10 nM rhTSLP에 결합하는 것을 보여준다. 각 클론의 효모 표면 발현 수준, 및 양성 대조군 효모 클론의 항-hIL-13 및 항-hTSLP 평균 형광 강도(MFI) 결합 신호에 대해 데이터를 정규화하였다.
도 3a~3f는 인간 표준 IgG1(도 3a), BDG33.003(도 3b), BDG33.004(도 3c), BDG33.005(도 3d), BDG33.023(도 3e), 및 BDG33.025(도 3f)의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔을 제시한다. PBS 완충액에서 정제된 IgG를 0.5 ml/분의 유속으로 GE Superdex®200 10/300 increase(컬럼 부피(CV) = 25 ml) 상에 흘렸다. 도 3b~3d에 도시된 항체 스캔에서, 선행 피크는 큰 응집체에 전형적인 (0.36CV)에 상응하고, 약 13.2ml가 유보된 두 번째 피크는 정상적인 인간 IgG에 전형적인 (0.528CV)에 상응한다. 곡선 아래 면적(AUC) 피크 비율은 IgG 분획의 경우 각각 약 23% 오접힘/77% 접힘이다. 도 3e~3f에 도시된 항체 스캔의 경우, 선행 피크는 직경이 큰 응집체에 전형적인 (0.36CV)에 상응하고, 약 13.8 ml가 유보된 두 번째 피크는 정상적인 인간 IgG에 전형적인 (0.55CV)에 상응한다. 곡선 아래 면적(AUC) 피크 비율은 BDG33.023(도 3e) 및 BDG33.025(도 3f)의 경우 각각 97.3% 접힘/2.8% 오접힘 및 98.5% 접힘/1.5% 오접힘이다.
도 4a 및 4b는 표시된 IgG BDG33.023(도 4a) 및 BDG33.025(도 4b)의 융점에 대한 시차 주사 형광측정(DSF) 분석을 제시한다. 위쪽 그래프의 연회색 파선은 T-onset을 나타내고, 굵은 회색 파선은 Tm1 및 Tm2를 나타낸다. 아래쪽 그래프는 측정의 제1 미분도이다. 도 4a: T-onset이 64.2℃이고 제1 전이점이 67.7℃인 BDG33.023의 DSF. 도 4b:T-onset이 56.4℃이고 제1 전이점이 60.9℃이고, 제2 전이점이 67.4℃인 BDG33.025의 DSF.
도 5a~5f는 인간 IL-13, Cyno IL-13, 및 인간 TSLP에 결합하는 항체의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 제시한다. IL-13에 결합하는 BDG33.003 및 BDG33.004의 대표적인 SPR 초음파도는 도 5a~5d에 제시되어 있다. 재조합 인간 IL-13(rh-IL-13)을 2배 희석하여 800nM에서 시험하였다(도 5a~5b). 재조합 cyno IL-13(rc-IL-13)을 2배 희석하여 200nM에서 시험하였다(도 5c~5d). 인간 TSLP(h-TSLP)에 결합하는 BDG33.003 및 BDG33.004의 대표적인 SPR 센서그램은 도 5e 및 도 5f에 제시되어 있다. hTSLP는 2배 희석하여 3.2 nM 내지 0.2 nM의 농도에서 분석물로서 사용하였다(도 5e-f). 인간 IL-13(h-IL-13)에 결합하는 BDG33.023 및 BDG33.025의 대표적인 SPR 센서그램은 도 5g 및 도 5h에 제시되어 있다. hIL-13은 2배 희석하여 20nM 내지 0.6 nM의 농도에서 분석물로서 사용하였다(도 5g~5h).
도 6a~6e는 인간 TSLP, 시토메갈리 원숭이(cyno) TSLP 또는 시토메갈리 원숭이(cyno) IL-13에 결합하는 BDG3333.023 및 BDG33.025의 ELISA EC50을 제시한다. 인간 TSLP에 대한 BDG33.023의 결합(채워진 원) 및 BDG33.025의 결합(채워진 사각형)(도 6a-인간 TSLP). cyno-TSLP에 대한 BDG33.023의 결합(도 6b-33.023 cyno TSLP). cyno-TSLP에 대한 BDG33.025의 결합(도 6c-33.025 cyno TSLP). cyno-IL-13에 대한 BDG33.023의 결합(도 6d-33.023 cyno IL-13). cyno-IL-13에 대한 BDG33.025의 결합(도 6e-33.025 cyno IL-13).
도 7a~7d는 hTSLP 또는 hIL-13에 대한 항체의 경쟁 결합 검정을 제시한다. 도 7a: 표시된 항체(항-TSLP-대조군; 항-IL-13 대조군; BDG33.023; BDG33.025)를 증가하는 수준의 hIL-13과 함께 사전 인큐베이션하고, hIL-13으로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트-결합된 hIL-13에 대한 BDG3333.023 및 BDG33.025의 결합은 가용성 hIL-13 농도가 증가함에 따라 억제되었다. 도 7b: 표시된 항체(항-TSLP-대조군; 항-IL-13 대조군; BDG33.023; BDG33.025)를 증가하는 수준의 hTSLP와 함께 사전 인큐베이션하고, hTSLP로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트-결합된 hTSLP에 대한 BDG33.023 및 BDG33.025의 결합은 가용성 hTSLP 농도가 증가함에 따라 억제되었다. 도 7c: 항체(항-TSLP-대조군; 항-IL-13 대조군; BDG33.023; BDG33.025)를 증가하는 수준의 hTSLP와 함께 사전 인큐베이션하고, hIL-13으로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였고, IL-13에 대한 BDG33.023의 결합은 가용성 hTSLP 농도가 증가함에 따라 억제되었다. 도 7d: 표시된 항체(항-TSLP-대조군; 항-IL-13 대조군; BDG33.023; BDG33.025)를 증가하는 수준의 hIL-13과 함께 사전 인큐베이션하고, hTSLP로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트-결합된 hTSLP에 대한 BDG33.023의 결합은 가용성 hIL-13 농도가 증가함에 따라 억제되었다. 항-TSLP 및 항-IL-13 대조군 항체는 오직 이들 각각의 리간드와 결합하고, 오직 이들 각각의 리간드와 경쟁한 것으로 나타났다.
도 8은 BDG330.23 및 BDG33.025의 비특이적 결합을 특이적 결합과 비교한 ELISA 특이성 시험의 결과를 제시한다. ELISA 플레이트를 hIL-13, hTSLP, 및 무관한 사이토카인 IL-2, IL-17, 및 IL-4로 코팅하였다. BSA 결합 신호는 검정 배경 수준에 상응한다.
도 9는 TSLP 수용체(TSLP-R)로 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 hTSLP의 결합을 IgG가 특이적으로 차단하는 것을 측정한 IC50 억제 검정의 결과를 제시한다. X축은 경쟁자의 농도를 나타낸다. 경쟁자: 생성된 IC50=3 nM인 TSLP-R(검은 원); 및 생성된 IC50=0.41 nM인 BGD33.023(검은 삼각형).
도 10은 HEK-Blue IL-13 시스템 하류 신호 전달의 개략도를 제시한다.
도 11a~11d는 hIL-13 pSTAT6 신호전달 억제 데이터를 제시한다. 결과는 재조합 rh-IL-13에 의한 HEK-Blue 세포의 IL-13 활성화 경로의 자극, 및 표시된 IgG에 의한 이러한 자극의 억제에 기초한다. HEK-Blue IL-13 세포(50,000개의 세포/웰)를 다양한 농도의(0 nM~8 nM) rh-IL-13과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 24시간차에, IL-13 하류 신호 전달을 QUANTI-Blue로 정량화하였다(도 11a). 조작된 이중 결합 항체에 의한 HEK-BLUE IL-13 세포에 대한 hIL-13 하류 억제를 다음과 같이 분석하였다. rh-IL-13(0.4 nM)을 0 nM~750 nM의 항체 농도 범위에서 표시된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 검정된 항체는 각각 BDG33.002(양성 대조군), BDG33.003(클론 C2), 및 BDG33.006(음성 대조군)이었다(도 11b). 클론 BDG33.023 및 BDG33.025를 0 nM~100 nM의 항체 농도 범위에서 검정하였다(도 11c 및 도 11d는 33.023 IL-13 pSTAT6 억제, 및 33.025 IL-13 pSTAT6 억제를 각각 보여준다). 인큐베이션 후, hIL-13/IgG 혼합물을 세포에 첨가하고, 인큐베이션 후 24시간차에 분비된 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP) 활성을 QUANTI-Blue로 정량화하였다. 표시된 데이터는 3회 실험의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 12a~12c는 TSLP 신호전달 경로 억제 데이터를 제시한다. TSLP 의존적 pSTAT5 신호전달 활성화 경로, 및 인간 백혈병 MUTZ5 세포에서 BDG 33.023에 의한 활성화 억제. 도 12a는 다음과 같이, MUTZ 5 CD127(IL-7a) 수용체 및 TSLP-R 수용체 발현의 유세포 분석을 보여준다. 미염색 세포(패널 a), CD127+에 대해 염색된 세포로서, 총 세포 집단의 약 36%가 표지된 세포(패널 b), TSLP-R+에 대해 염색된 세포로서, 총 세포 집단의 약 96%가 표지된 세포(패널 c), 및 TSLP-R+ 및 CD127+ 둘 다에 대해 염색된 세포로서, 총 세포 집단의 약 41%가 표지된 세포(패널 d)(도 12a). 도 12b는 MUTZ5 pSTAT5 활성화를 보여준다. MUTZ5 세포에서 hTSLP 인-STAT5(pSTAT5) 활성화의 EC50. 양성 세포의 백분율(%)은 pSTAT5 양성 세포를 부모 집단의 백분율로서 나타낸 것이다. 도 12c는 MUTZ5 pSTAT5 활성화의 억제를 보여준다. MUTZ5 세포에서 TSLP 의존성 pSTAT5 활성화의 BDG33.023에 의한 억제의 IC50. TSLP를 0.48 pM 내지 500 pM의 BDG33.023과 함께 30분 동안 사전 인큐베이션하고 MUTZ5 세포에 첨가하였다. 양성 세포는 pSTAT5 양성 집단을 부모 집단의 백분율로서 나타낸 것이다(도 12c).
도 13은 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부에 대한 머무름 시간 및 계산된 pI를 나타낸다. IgG 마커 머무름 시간은 4.77분이었다.
도 14a~14c는 TSLP에 대한 이중 결합 항체 중 일부 및 33.001(테제펠루맙)의 경쟁 ELISA를 보여준다. ELISA 플레이트를 50 ng/웰의 33.001로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이중 결합 항체를 2배 희석하고, 일정한 7 nM 농도의 TSLP-HIS와 함께 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 차단 및 세척 단계 후, 이중 결합 항체-TSLP 혼합물을 플레이트 상에 도포하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척한 후, 항-HIS와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 결과는 시험된 모든 이중 결합 항체가 유사한 IC50을 나타냈음을 보여준다.
도 15는 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부의 나노스케일 시차주사 형광측정(nanoDSF) 분석 결과를 나타낸다. 람다 사슬에 대한 Tm 임계값은 >65℃였고, T-onset은 >60℃였다.
도 16a~16f는 인간 IL-13 및 TSLP에 대해 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부에 대한 SPR(표면 플라스몬 공명) 분석 결과를 보여준다.
도 17a 및 17b는 항체 BDG38.074에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔(도 17a) 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석(도 17b)을 보여준다. 표시된 IgG의 융점에 대한 대표적인 분석은 2회 분석한 것이다. 연회색 파선은 T-onset을 나타내고, 굵은 회색 파선은 Tm1 및 Tm2를 나타낸다. 도 17b는 측정의 제1 미분도를 도시한다. DSF 값은 도 15에 요약되어 있다.
도 18a~18d는 대표적인 클론 BDG38.74의 결합 친화도를 보여준다. 도 18a는 인간 IL-13에 대한 항체 BDG38.074의 결합 친화도를 보여준다. 결과는 항체 BDG38.074가 수십 피코몰의 친화도로 인간 IL-13에 결합함을 보여준다. 도 18b는 인간 TSLP에 대한 항체 BDG38.074의 결합 친화도를 보여준다. 결과는 항체 BDG38.074가 수십 피코몰의 친화도로 인간 TSLP에 결합함을 보여준다. 도 18c는 cyno IL-13에 대한 항체 BDG38.074의 결합 친화도를 보여준다. 도 18d는 cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.074의 결합 친화도를 보여준다.
도 19a 및 19b는 항체 BDG38.079에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔(도 19a) 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석(도 19b)을 보여준다. 표시된 IgG의 융점에 대한 대표적인 DSF 분석이 도시되어 있다(2회 분석함). 연회색 파선은 T-onset을 나타내고, 굵은 회색 파선은 Tm1 및 Tm2를 나타낸다. 도 19b는 측정의 제1 미분 그래프이다. DSF 값은 도 15에 요약되어 있다.
도 20a~20d는 대표적인 클론 BDG38.079의 IL-13 및 TSLP에 대한 결합을 보여준다. 도 20a는 인간 IL-13에 대한 항체 BDG38.079의 결합 친화도를 보여준다. 결과는 항체 BDG38.079가 수십 피코몰의 친화도로 인간 IL-13에 결합함을 보여준다. 도 20b는 인간 TSLP에 대한 항체 BDG38.079의 결합 친화도를 보여준다. 결과는 항체 BDG38.079가 수 피코의 친화도로 인간 TSLP에 결합함을 보여준다. 도 20c는 cyno IL-13에 대한 항체 BDG38.079의 결합 친화도를 보여준다. 도 20d는 cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.079의 결합 친화도를 보여준다.
도 21a 및 21b는 인간 또는 cyno IL-13 또는 TSLP에 대한 항체 BDG38.074 및 BDG38.079의 SPR(표면 플라스몬 공명) 분석을 보여준다.
도 22는 HEK 리포터 세포주에서 항체 BDG38.074 및 BDG38.079가 수십 피코몰의 친화도로 IL-13 기능을 억제함을 보여준다. hIL-13 pSTAT6 신호전달 억제 데이터. 결과는 재조합 rh-IL-13에 의한 HEK-Blue 세포의 IL-13 활성화 경로의 자극 및 표시된 IgG에 의한 이러한 자극의 억제에 기초한다. rh-IL-13(0.4 nM)을 0 nM~100 nM의 항체 농도 범위에서 표시된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, hIL-13/IgG 혼합물을 세포에 첨가하고, 인큐베이션 후 24시간차에 분비된 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP) 활성을 QUANTI-Blue로 정량화하였다. 표시된 데이터는 3회 실험의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 검정된 항체는 각각 트랄로키누맙(Tralokinumab), BDG38.074, 및 BDG38.079였다.
도 23은 항체 BDG38.07BDG384 및 BDG38.079가 MUTZ-5 세포주에서 항-TSLP 벤치마크와 유사한 기능적 억제를 나타냄을 보여준다. MUTZ5 세포를 인간 TSLP(hTSLP)로 자극하고, 인산화된 STAT5(pSTAT5) 염색을 인-유세포 분석에 의해 평가하였다.
도 24a 및 24b는 대표적인 클론에 대한 억제 결과를 보여준다. 도 24a는 항체 BDG38.074 및 BDG38.079가 항-IL-13 벤치마크(트랄로키누맙)와 유사한 CD23 발현 억제를 나타냄을 보여준다. IL-13의 항체 억제의 IC50은 단핵구에서 CD23 발현 수준을 측정함으로써 결정하였다. 세포를 상이한 농도의 항체와 함께 48시간 인큐베이션한 후, 단핵구를 웰의 바닥으로부터 분리하고, CD3(Bio Legend, CAT: 300450), CD14(Bio Legend, CAT: 301814), CD19(Bio Legend, CAT: 302212), 및 CD23(Bio Legend, CAT: 338506) 항체로 염색하였다. CD14+ 집단의 CD23 백분율을 CytoFLEX 유세포 계측기(Beckman Coulter)를 사용하여 측정하였다. 도 24b는 항체 BDG38.074 및 BDG38.079가 항-TSLP 벤치마크(테제펠루맙)와 유사하게 TARC 발현을 억제함을 보여준다. hTSLP의 항체 억제의 IC50은 TARC 억제에 의해 결정하였다. TARC 수준은 TARC DUOSET ELISA 키트 DY364(R&D systems)를 키트 지침에 따라 사용하여 결정하였다. ELISA 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 표준 샘플 곡선을 사용하여 값을 분석하였다.
도 25a 및 25b는 항체 BDG38.094에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔(도 25a) 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석(도 25b)을 보여준다. 표시된 IgG의 융점에 대한 대표적인 DSF 분석이 도시되어 있다(2회 분석함). 위쪽 그래프의 연회색 파선은 T-onset을 나타내고, 굵은 회색 파선은 Tm1 및 Tm2를 나타낸다. 도 25b는 측정의 제1 미분도이다. DSF 값은 표 11에 요약되어 있다.
도 26a~26d는 대표적인 클론의 결합 친화도를 보여준다. 도 26a는 인간 IL-13에 대한 항체 BDG38.094의 결합 친화도를 보여준다. 도 26b는 인간 TSLP에 대한 항체 BDG38.094의 결합 친화도를 보여준다. 도 26c는 cyno IL-13에 대한 항체 BDG38.094의 결합 친화도를 보여준다. 도 26d는 cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.094의 결합 친화도를 보여준다.
도 27a 및 27b는 항체 BDG38.138에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔(도 27a) 및 융점의 나노-시차 주사 형광측정(DSF) 분석(도 27b)을 보여준다. 표시된 IgG의 융점에 대한 대표적인 DSF 분석이 도시되어 있다(2회 분석함). 위쪽 그래프의 연회색 파선은 T-onset을 나타내고, 굵은 회색 파선은 Tm1 및 Tm2를 나타낸다. 도 27b는 측정의 제1 미분도이다. DSF 값은 표 11에 요약되어 있다.
도 28a~28d는 대표적인 클론의 결합 친화도를 보여준다. 도 28a는 인간 IL-13에 대한 항체 BDG38.138의 결합 친화도를 보여준다. 도 28b는 인간 TSLP에 대한 항체 BDG38.138의 결합 친화도를 보여준다. 도 28c는 cyno IL-13에 대한 항체 BDG38.138의 결합 친화도를 보여준다. 도 28d는 cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.138의 결합 친화도를 보여준다.
다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 설명에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 설명을 포함하여, 본원에 개시된 조작된 이중 결합 항체의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부 사항이 제시된다 그러나, 당업자는 이중 결합 항체를 제조하고 사용하는 것이 일부 경우에 이들 특정 세부 사항 없이도 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에, 잘 알려진 방법, 절차 및 구성 요소는 본원에 제시된 개시를 모호하게 하지 않도록 상세히 설명되지 않았다.
항원 결합 서열은 통상적으로 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 내에 위치한다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역은, 소정의 경우에, 예를 들어 항체 또는 이의 단편을 생성하기 위해 상이한 항원 또는 상이한 항원의 에피토프에 결합하는 새로운 결합 부위를 생성하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 중쇄 가변 영역의 서열 또는 경쇄 가변 영역의 서열, 또는 둘 다를 조작하면 항체 기능을 유지하면서 에피토프에 대한 새로운 결합 부위가 생성된다. 일 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 21개의 특이적 부위가 식별되며, 여기서 이들 부위에서 변이체 아미노산이 존재하면, 소정의 구현예에서, 조작된 이중 결합 항체 또는 이의 단편이 생성된다. 일부 구현예에서, 21개의 잠재적 변이체 부위는 이중 결합 항체 또는 이의 단편을 조작하기 위한 고유한 플랫폼을 제공한다.
중쇄 가변 영역, 또는 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다가 변이체 아미노산을 포함하도록 돌연변이된, 조작된 이중 결합 항체 또는 이의 단편이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 이들 조작된 이중 결합 항체는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 영역, 또는 둘 모두 내의 특정 부위에서 변이체 아미노산 잔기를 포함하도록 생성된 라이브러리로부터 식별되고 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 조작된 이중 결합 항체는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 영역, 또는 둘 모두 내에서 표적 아미노산 부위를 특이적으로 돌연변이시킴으로써 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 조작된 이중 결합 항체는 알레르기성 또는 호흡기 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 치료 방법에 사용될 수 있다.
조작된 이중 결합 항체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “이중 결합 항체”는 2개의 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체는 IL-13 및 TSLP에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 제공한다(예를 들어 표 8 및 표 9 참조). 일부 구현예에서, CDR은 서열번호 149~154의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 서열번호 155 및 156 또는 서열번호 157 및 158의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서
HCDR1은 서열번호 349 또는 355의 아미노산 서열, 또는 서열번호 149 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하고;
HCDR2는 서열번호 350, 352, 354 및 356 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 150의 아미노산 서열, 또는 I HX1 Y D G S N K (서열번호 142)로서 제시된 서열을 포함하되, HX1은 임의의 아미노산이고;
HCDR3은 서열번호 351, 353, 357, 및 358 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 151의 아미노산 서열, 또는 A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12 (서열번호 143)로서 제시된 서열을 포함하되, HX2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산이고;
LCDR1은 서열번호 359, 362, 364, 366, 369, 및 375 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 152의 아미노산 서열, 또는 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시된 서열을 포함하되, LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 아미노산이고;
LCDR2는 서열번호 360 또는 367의 아미노산 서열, 또는 서열번호 153의 아미노산 서열 또는 D D LX4 (서열번호 145)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하되, LX4는 임의의 아미노산 이고;
LCDR3은 서열번호 361, 363, 365, 368, 370~374, 376~407 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 154의 아미노산 서열, 또는 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V(서열번호 146)로서 제시된 서열을 포함하되, LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산이다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 HX1은 W 또는 S이고; HX2는 A 또는 S이고; HX3은 P이고; HX4는 Q이고; HX5는 W이고; HX6은 E, Q, M, L, 또는 V이고; HX7은 L, W, 또는 Y이고; HX8은 V 또는 T이고; HX9는 H, A, 또는 S이고; HX10은 E이고; HX11은 A이고; HX12는 I, L, 또는 M이고;
여기서 LX1은 N, L, 또는 I이고; LX2는 L 또는 I이고; LX3은 S 또는 L이고; LX4는 S 또는 G이고; LX5는 S 또는 T이고; LX6은 S 또는 G이고; LX7은 H 또는 G이다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 HX1은 W이고, HX2는 A 또는 S이고, HX6은 E 또는 M이고, HX7은 L 또는 W이고, HX8은 V 또는 T이고, HX9는 H 또는 A이고, HX12는 I 또는 L이고, LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LX4는 S 또는 G이고, LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 또는 G이다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서
HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX12는 I이고, LX4는 S이고, LX7은 G이거나;
HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX12는 L이고, LX4는 S이고, LX7은 H이거나;
HX1은 W이고, HX2는 S이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX12는 L이고, LX4는 G이고, LX7은 G이다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 적어도 하나의 변이체가 임의의 위치에 포함된 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 적어도 하나의 변이체가 임의의 위치에 포함된 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 중쇄 가변 영역, 또는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내에 적어도 2개의 아미노산 변이체가 존재한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 적어도 2개의 변이체가 임의의 위치에 포함된 중쇄 가변 영역 및 임의의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 적어도 2개의 변이체가 임의의 위치에 포함된 경쇄 가변 영역 및 임의의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “중쇄 가변 영역”은 모든 동일한 의미 및 품질을 갖는 용어 “VH 도메인” 또는 용어 “VH”와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “경쇄 가변 영역”은 모든 동일한 의미 및 품질을 갖는 용어 “VL 도메인” 또는 용어 “VL”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 특이적 변이체 VH 및/또는 VL 도메인은 항원에 대한 친화도 증가와 같은 바람직한 특성을 갖는 VH/VL을 각각 식별하기 위해 상보적인 가변 영역의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 Portolano 등의 문헌[J. Immunol. (1993) 150:880-887]; Clarkson 등의 문헌[Nature (1991) 352:624-628], Fischer 등의 문헌[(2015) Exploiting light chains for the scalable generation and platform purification of native human bispecific IgG. Nature Communications Volume 6, Article number: 6113]에 기술되어 있다.
원하는 이중 결합 활성을 갖는 Fab 또는 F’(ab)2를 식별하기 위해 VH 및 VL 도메인을 혼합하고 매칭하는 데 다른 방법이 사용될 수도 있다. 예를 들어: Klimka 등의 문헌[British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260]에는 마우스 VH로부터 보유된 CDR3 및 FR4를 갖는 마우스 VL 및 인간 VH 라이브러리를 사용하는 스크리닝 프로세스가 기술되어 있다. 항체를 수득한 후, VH를 인간 VL 라이브러리에 대해 스크리닝하여 항원에 결합된 항체를 수득하였다. Beiboer 등의 문헌[J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849]에는 전체 마우스 중쇄 및 인간 경쇄 라이브러리를 사용하는 스크리닝 프로세스가 기술되어 있다. 항체를 수득한 후, 하나의 VL을 마우스의 CDR3이 보유된 인간 VH 라이브러리와 조합하였다. 항원에 결합할 수 있는 항체를 수득하였다. Rader 등의 문헌[PNAS (1998) 95:8910-8915]에는 상기 Beiboer 등의 문헌에 기술된 것과 유사한 프로세스가 기술되어 있다.
전술한 이들 기술은 그 자체로 그렇게 당업계에 알려져 있다. 그러나, 당업자는 이러한 기술을 사용함으로써, 당업계의 일상적인 방법론을 사용하여 본원에 기술된 본 개시의 여러 구현예에 따라 항체의 항원 결합 단편을 수득할 수 있을 것이다.
당업자는 이중 결합 항체가 가장 넓은 의미로, IL-13 및 TSLP의 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 항체를 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 IL-13 또는 TSLP에 결합하기 위한 특이성이, 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치 않는 또는 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 반영한다는 것을 이해할 것이다. 소정의 구현예에서, 이중 결합 항체는 항체 단편(들)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결정인자는 IL-13 또는 TSLP 에피토프를 포함한다. 용어 “에피토프”는 항-IL-13 또는 항-TSLP 결합 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 소정의 구현예에서는 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 결합된 항원의 영역이다. 일부 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 것과 같은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함한다.
소정의 구현예에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하며, 소정의 구현예에서 특이적 3차원 구조 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, 이중 결합 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 IL-13 또는 TSLP를 우선적으로 인식할 때, 이중 결합 합체는 IL-13 또는 TSLP 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다. 이중 결합 항체는 평형 해리 상수가 ≤ 10-5, 10-6, 또는 10-7 M일 때 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수는 ≤ 10-8 M 또는 10-9 M일 수 있다. 일부 추가 구현예에서, 평형 해리 상수는 ≤ 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M일 수 있다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수는 ≤ 10-5 M 내지 10-12 M의 범위일 수 있다.
항체 결합 도메인은 항체의 단편이거나 항체의 하나 이상의 단편의 유전적으로 조작된 산물일 수 있으며, 상기 단편은 항원과의 특이적 결합에 관여한다. “특이적 결합”이란, 결합이 관심 항원에 대해, 예를 들어 본원에 기술된 구현예의 IL-13 또는 TSLP에 대해 선택적이며, 원치 않는 또는 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “이중 결합 항체”는 소정의 구현예에서, 완전한 면역글로불린 구조, 이의 단편, 또는 이의 도메인을 포함할 수 있다.
항체 결합 도메인의 예는, 상보성 결정 영역(CDR), 가변 영역(Fv), VH 도메인, 경쇄 가변 영역(VL), 중쇄, 경쇄, 단쇄 가변 영역(scFv), 및 Fab 단편을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 당업자는 scFv가 실제로 항체의 단편이 아니라, 이 대신에, 예를 들어 10 내지 25개 아미노산으로 이루어진(이에 한정되지는 않음) 짧은 링커 펩티드에 의해 연결된 면역글로불린의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드라는 것을 이해할 것이다. 당업자는, 항체와 관련된 용어 “Fab”가 이황화 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 결합된 단일 경쇄(가변 영역 및 불변 영역 모두)로 이루어진 항체의 해당 부분을 일반적으로 포함한다는 것을 또한 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 및 다중특이적(예를 들어 이중특이적) 항체를 포함하여, 전체 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 결합 특이성을 보유한 항체 단편(들)을 포함하며, 여기에는 가변 중쇄(VH) 단편, 가변 경쇄(VL) 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다(예를 들어 Hudson 및 Souriau의 문헌[Nature Med. 9: 129-134 (2003)]을 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 또한, 인간화 항체, 영장류화 항체, 및 키메라 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 “항체”는 모든 동일한 품질 및 의미를 갖는 용어 “면역글로불린”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 “항체 또는 이의 단편”은 모든 동일한 품질 및 의미를 갖는 용어 “면역글로불린 또는 이의 단편”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 일부 구현예에서, “항체 또는 이의 단편”, 또는 “면역글로불린 또는 이의 단편”이 IgG 면역글로불린 또는 이의 단편(들)을 포함하는 구조를 포함할 수 있고, 여기에는 IgG, scFv 단편, Fab 단편, F(ab’)2 단편, Fv 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다는 것을 이해할 것이다.
당업자는 항체와 관련하여 “중쇄 가변 영역” 또는 “VH”가 프레임워크(FR) 영역으로 알려진 측면 신장부 사이에 개재된 3개의 CDR을 함유하는 중쇄의 단편을 포함하고, 이는 CDR보다 더 고도로 보존되고, CDR을 지지하기 위한 스캐폴드를 형성한다는 것을 인식할 것이다. 소정의 구현예에서, 용어 “중쇄 가변 영역” 또는 “VH”는 “VH 도메인”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
당업자는 항체와 관련하여 “경쇄 가변 영역” 또는 “VL”이 프레임워크(FR) 영역 사이에 개재된 3개의 CDR을 함유하는 경쇄의 단편을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 소정의 구현예에서, 용어 “경쇄 가변 영역” 또는 “VL”은 “VL 도메인”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
IL-13 및 TSLP에 결합하는 이중 결합 항체에 대한 VH 및 VL 영역뿐만 아니라 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3에 대한 다수의 아미노산 서열이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 대표적인 서열의 일부 구현예에 대한 논의가 아래에 제시되어 있다. 도 1a는 서열번호 1에 제시된 템플릿 VH 도메인 아미노산 서열, 및 3개의 중쇄(H) CDR 영역(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 4개의 FR 영역(HFR1, HFR2, HFR3, HFR4)의 위치를 제시하고, 도 1b는 서열번호 2에 제시된 템플릿 VL 도메인 아미노산 서열, 및 3개의 경쇄(L) CDR 영역(LCDR1, LCDR2, LCDR3) 및 4개의 FR 영역(LFR1, LFR2, LFR3, LFR4)의 위치를 제시한다. 재-에피토프화된(re-epitoped) 클론의 CDR 영역 각각과 FR 영역 각각에 존재하는 변이체 잔기를 포함하는 아미노산 잔기는 템플릿 VH 또는 템플릿 VL 서열의 선형 개략도를 아래에 제공된 넘버링 및 아미노산과 비교함으로써 명확하게 식별된다(도 1a 및 도 1b).
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하되, 상기 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하고, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은 I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12 (서열번호 143)로서 제시된다(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임). 당업자는 도 1a에 제시된 VH 도메인 내에서, 변이체 아미노산이 발견될 수 있는 12개의 고유한 부위를 인식할 것이며, 이들 부위는 본원에서 HX로서 식별되고, 소정의 구현예에서는 중쇄의 템플릿 서열 내의 변이체 아미노산의 존재를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VH 도메인은 HCDR1(서열번호 136), HCDR2(서열번호 142), 및 HCDR3(서열번호 143)을 포함하되, VH 도메인은 HX1, HX2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12 중 적어도 하나에서 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VH 도메인은 HCDR1(서열번호 136); HX1이 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2가 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6이 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7이 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8이 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9가 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12가 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3(서열번호 138)을 포함한다. 소정의 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 CDR1(서열번호 136); HX1이 W인 CDR2(서열번호 137); HX2가 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6이 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7이 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8이 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9가 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12가 I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되되는 CDR3(서열번호 138)을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2가 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하거나, HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2이 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하거나, HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2가 S이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같은 VH 도메인에 변이체를 갖는 조작된 항체 클론은 도 1a에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하며, 일부 구현예에서, 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고(여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 아미노산 임); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고(여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCDR3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시된다(여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임). 당업자는 도 1b에 제시된 VL 도메인 내에서, 변이체 아미노산이 CDR 내에서 발견될 수 있는 7개의 고유한 부위를 인식할 것이며, 이들 부위는 본원에서 LX로서 식별되고, 소정의 구현예에서는 경쇄의 템플릿 서열 내의 변이체 아미노산의 존재를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 경쇄 내의 변이체 아미노산은 프레임워크 영역 중 하나에 상주할 수 있다. 일부 구현예에서, VL 도메인 내의 변이체 아미노산은 LFR3 영역에 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VL 도메인은 LCDR을 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는, LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139); LX4가 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR2(서열번호 140); 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR3(서열번호 141)을 포함하는 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체는, LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 S인 LCDR2 (서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하거나; LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 S인 LCDR2(서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하거나; LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 G인 LCDR2(서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다.
전술한 바와 같은 VL 도메인에 변이체를 갖는 조작된 항체 클론은 도 1b에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 단리된 항체가 본원에 개시되며, 상기 VH 및 VL은 서열번호 209 및 210, 서열번호 219 및 220, 서열번호 249 및 250, 서열번호 337 및 338, 서열번호 155 및 156, 서열번호 157 및 158, 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 또는 서열번호 54 및 53의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 단리된 항체가 본원에 개시되며, 상기 항체는 서열번호 209 및 210, 서열번호 219 및 220, 서열번호 249 및 250, 서열번호 337 및 338, 서열번호 155 및 156, 서열번호 157 및 158, 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 또는 서열번호 54 및 53 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 (예를 들어 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 항체가 본원에 개시되며, 상기 항체는 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 단리된 항체가 본원에 개시되며, 상기 항체는 표 10 또는 표 1에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 단리된 항체가 본원에 개시되며, 여기서
상기 VH 도메인은 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 2개 이상에서 아미노산 변이체를 갖는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
상기 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96 중, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 2개 이상에서 아미노산 변이체를 갖는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 209 및 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 219 및 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 249 및 250의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 337 및 338의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 표 1 또는 표 10에 도시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체는 본원에 개시된 VH 및 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 및 VL 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 전술한 VH 도메인 HCDR 및 VL 도메인 LCDR의 조합을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함한다. 예를 들어(이에 한정되지는 않음), 소정의 구현예에서, VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(서열번호 143)로서 제시되며(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임); 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고 (여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 도메인인); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고 (여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCD3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시된다(여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임).
일부 구현예에서, VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, HCDR1으 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 137에 제시되고, 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 138에 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되며; VL 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 137에 제시되고, 서열 중 HX1은 W이고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 138에 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함하되, 각 CDR의 아미노산 서열은 도 1a 및 도 1b에 제시된 것과 같으며, 상기 도면에 제시된 클론의 경우는 예를 들어 다음과 같지만 이에 한정되지는 않는다:
클론 C2: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 S임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G임;
클론 C6: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 M이고, HX7은 V이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 S임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H임;
클론 C9: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 S이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 G임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G임.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 본원에 개시된 바와 같은 HCDR 세트, 및 임의의 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 본원에 개시된 바와 같은 LCDR 세트, 및 임의의 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 본원에 개시된 바와 같은 쌍을 형성한 HCDR - LCDR 세트를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 HCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 HCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 핵산 작제물에 의해 암호화될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 면역글로불린 라이브러리 내에 포함될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 면역글로불린 라이브러리 내에 포함될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 HCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 면역글로불린 라이브러리 내에 포함될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 HCDR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주 세포로부터 발현시키고, 항체를 단리함으로써 생산될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 LCDR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주 세포로부터 발현시키고, 항체를 단리함으로써 생산될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 HCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 HCDR 및 LCDR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주 세포로부터 발현시키고, 항체를 단리함으로써 생산될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 포함하는 질환 또는 병태를 앓는 대상체이다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 포함하는 질환 또는 병태를 앓는 대상체이다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기서 상기 대상체는 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 포함하는 질환 또는 병태를 앓는 대상체이다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 또는 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체는 IL-13 에피토프에 결합하지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 이전에 항체에 존재하지 않았던 결합 영역을 포함하도록 조작된다. 즉, 이중 결합 항체는 “재-에피토프화된(re-epitoped)” 항체를 포함한다. 전반적으로 사용되는 바와 같이, 용어 “조작된” 및 “재-에피토프화된”은 소정의 구현예에서, 모든 동일한 품질 및 의미를 갖도록 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, “재-에피토프화된” 항체는 이용 가능한 항체에 비해 개선된 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, “재-에피토프화된” 항체는 부모 항체와 비교하여 개선된 결합 및 해리 상수(Kon 및 Koff)를 포함한다. 일부 구현예에서, “재-에피토프화된” 항체는 부모 항체에 비해 개선된 안정성을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, VH 도메인 및 VL 도메인의 CDR 및 FR 내의 21개의 변이체 부위로 이루어진 고유 세트 중 적어도 2개에 변이체 아미노산 잔기를 통합하면, 부모 항체와 비교하여 개선된 특성을 포함하는 “재-에피토프화된” 이중 결합 항체가 생성된다. 이들 재-에피토프화된 항체는 유리한 특성을 제공할 수 있다.
당업자는 항체와 관련하여 “Fv”란, 완전한 항원 결합 부위를 지니기 위한 항체의 가장 작은 단편을 포괄한다는 것을 인식할 것이다. Fv 단편은 하나의 중쇄(VH)의 가변 영역에 결합된 하나의 경쇄(VL)의 가변 영역으로 이루어진다.
당업자는 항체와 관련하여 “단쇄 Fv 항체” 또는 “scFv”란, 직접 연결되거나 펩티드 링커 서열을 통해 연결된 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 조작된 항체를 포괄한다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 링커가, 일부 구현예에서 선형 아미노산 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 선형 아미노산 서열(“링커”)은 효소 절단 부위를 포함하며, 소정의 구현예에서 “절단성 링커” 또는 “링커” 또는 “절단성 펩티드”로서 불릴 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 절단성 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 비절단성일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 서열번호 147에 제시되어 있다 (GGGGSGGGGSGGGGS; 서열번호 147).
일부 구현예에서, 펩티드 링커 서열은, 예를 들어 Gly, Asn, 및/또는 Ser 잔기를 다양한 조합으로 함유한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 거의 중성인 아미노산도 링커 서열에 포함될 수 있다.
링커로서 유용하게 사용될 수 있는 다른 아미노산 서열은 Maratea 등의 문헌[Gene 40:39 46 (1985)]; Murphy 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986)]; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호; Chaudhary 등의 문헌[1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070]; Bird 등의 문헌[1988, Science 242:423-426]에 기술된 것들을 포함하며, 상기 문헌들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL 도메인의 코딩 서열은 임의의 접합부 아미노산 없이 직접 융합되거나, 구성된 가요성 폴리링커를 사용함으로써 융합될 수 있다.
펩티드 링커는, 소정의 구현예에서 단쇄 항체의 가변 영역을 형성하는 2개의 베타 시트 간의 올바른 상호작용이 가능하도록 설계된다. 임의의 적합한 링커가 간접 연결, 예컨대 펩티드 링커, 중합체 링커, 및 화학적 링커를 만드는 데 사용될 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 공유 연결은 펩티드 링커를 통한 간접 연결이다.
일부 구현예에서, 항체는 돌연변이된 면역글로불린을 포함한다. 돌연변이된 면역글로불린의 예는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 성분에 결합하지 않는 IgG를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. L234A/L235A(LALA) 돌연변이를 포함하는 IgG는 Fc 수용체에 결합할 수 없다(Xu D, Alegre ML, Varga SS, Rothermel AL, Collins AM, Pulito VL 등의 문헌[In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies. Cell Immunol. (2000) 200:16-26. 10.1006/cimm.2000.1617] 참조). 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 L234A/L235A(LALA) 돌연변이를 포함하는 IgG를 포함한다. 본원에서 넘버링된 것과 같은 돌연변이는 불변 영역에 사용되는 EU 넘버링 규칙에 기초한다(Xu D, Alegre ML, Varga SS, Rothermel AL, Collins AM, Pulito VL 등의 문헌[In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies. Cell Immunol. (2000) 200:16-26. 10.1006/cimm.2000.1617] 참조).
일부 구현예에서, 돌연변이된 IgG는 Fc 영역이 조작된 IgG1을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 IgG는 Fc 영역이 조작된 IgG2를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 IgG는 Fc 영역이 조작된 IgG3을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 IgG는 Fc 영역이 조작된 IgG4를 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체의 Fc 영역 내의 돌연변이는 항체의 면역 작동자 기능을 파괴한다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 IgG를 포함하고, 여기서 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 돌연변이된 IgG를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이체 IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 IgG 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린, IgG2 면역글로불린, IgG3 면역글로불린, 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG2 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG3 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 Fab 면역글로불린 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 F(ab’)2 면역글로불린 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 Fv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 scFv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 단쇄 Fv 단편을 포함하는 미니바디 면역글로불린 작제물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 디아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 디아바디 면역글로불린 작제물은 작은 펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 디아바디 면역글로불린 작제물은 2개의 scFv 단편이 서로 공유 연결된 단쇄(Fv)2를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 서로 공유 연결된 3개의 scFv 단편을 포함하는 디아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다. 당업계에서는 디아바디가 상응하는 scFv보다 최대 40배 더 낮은 해리 상수를 갖는 것으로 나타났는데, 이는 이들이 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 의미한다. 결과적으로, 후술하는 바와 같은 사용 방법에서 디아바디를 사용하면, 동일한 VH 및 VL 도메인을 포함하는 IgG보다 디아바디 또는 트리아바디의 투여량이 훨씬 더 적어질 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 결합 성분 사이에, 예를 들어 scFv, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 테트라바디 내의 VH와 VL 사이에(이에 한정되지는 않음) 링커(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 결합 성분 사이에, 예를 들어 scFv, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 또는 테트라바디 내의 VH와 VL 사이에(이에 한정되지는 않음) 링커(들)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 단일 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 당업계에 공지된 임의의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 서열번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
당업자는 용어 "변이체"가 구체적으로 인용된 폴리펩티드 서열, 예를 들어 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 1개 또는 여러 개의 아미노산 삽입, 결실, 및/또는 치환만큼 상이한 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본원에 개시된 항원 결합 분자의 변이체는, 항원 결합 분자의 항원 결합 친화도가 새롭게 생성되도록 아미노산 잔기 중 하나 또는 여러 개가 적어도 하나의 치환, 추가, 및/또는 결실에 의해 변형된 항원 결합 분자를 포함한다.
본원에 기술된 항체의 이중 결합 부분은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역(각각 VH 및 VL)을 포함하고, 여기서 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열은 VH 템플릿을 포함하고, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열은 VL 템플릿을 포함하고, 이중 결합 영역은 VH 템플릿 서열 내에서, 또는 VL 템플릿 서열 내에서, 또는 이들의 조합에서 적어도 2개의 변이체를 포함한다.
당업자는 “단리된 이중 결합 항체”가, 소정의 구현예에서 다음을 포함한다는 것을 이해할 것이다: (1) 일반적으로 자연에서 항체와 함께 발견되거나, 항체를 합성하는 동안 일반적으로 항체와 함께 발견되는 적어도 일부 다른 단백질이 없는 항체; (2) 동일한 공급원에서 유래된 동일하지 않은 다른 결합 항체가 본질적으로 없는 항체; (3) 세포에 의해 재조합적으로 발현될 수 있는 항체; (4) 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 합성 도중에 항체와 결합되는 다른 물질의 적어도 50%로부터 분리된 항체; 또는 (5) 자연에서 발생하지 않는 항체, 또는 이들의 조합. 이러한 단리된 항체는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 또는 다른 RNA에 의해 암호화될 수 있거나, 합성 기원이거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 소정의 구현예에서, 단리된 항체는 항체의 사용(치료, 진단, 예방, 연구, 또는 기타 사용)을 방해할 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다. 전반적으로 사용되는 바와 같이, 용어 “이중 항체” 및 “이중 결합 항체”는 모든 동일한 의미 및 품질을 갖도록 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역 변이체 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에 적어도 하나의 아미노산 변이체가 포함된 중쇄 가변 영역; 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 경쇄 가변 영역 변이체 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에 적어도 하나의 아미노산 변이체가 포함된 경쇄 가변 영역; 또는 변이체 중쇄 가변 영역과 변이체 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며; 여기서 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 이들의 조합에서 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
IMGT®는 the international ImMunoGeneTics information system®이다 (Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database 발행본):D413-22. doi: 10.1093/nar/gku1056. Epub 2014 Nov 5 무료 기사. PMID: 25378316 LIGM:441 및 Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77 참조). IMGT는 면역글로불린 및 T 세포 수용체 가변 도메인 및 Ig 상과 V-유사 도메인을 위한 고유한 넘버링 시스템이다(Lefranc MP1, Pommie C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G.의 문헌[Dev Comp Immunol 27: 55-77. (2003)]). IMGT®는 FR 및 CDR의 Kabat 정의, 구조 데이터, 및 초가변 루프의 Chothia의 특성 분석을 고려하고 조합함으로써, 5개 이상의 이상의 IG 및 TcR 가변 영역 서열을 정렬하는 것에 기초하여, 이들 IG 및 TcR 가변 도메인 서열에 대한 균일한 넘버링 시스템을 제공한다. IMGT는 당업계에 잘 알려진 항체에 대한 보편적인 넘버링 체계로 간주된다.
VH 및 VL 도메인에 존재하는 변이체 아미노산 위치를 기술함에 있어서, 일부 구현예에서, IMGT 넘버링이 사용된다. 일부 구현예에서, 변이체 아미노산 위치는 주어진 서열 내의 특정 위치로서, 예를 들어 서열번호 1 및 서열번호 2로서 제시되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 변이체 아미노산 위치는 주어진 서열번호 내의 특정 위치 및 IMGT 넘버링 시스템 둘 다에 의해 식별된다. 당업자는 서열번호에 대한 위치 번호에 의해 식별된 아미노산의 실제 아미노산 위치 번호가 IMGT 넘버링 시스템과 상이할 수 있지만, 식별된 잔기는 동일하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어(이에 한정되지는 않음), 서열번호 1의 위치 106에 있는 아미노산 잔기는 IMGT 넘버링 시스템에 의한 위치 112에서 식별된 것과 동일한 잔기이다. 당업자는 동일한 아미노산 잔기가 사용되는 시스템에 따라 상이한 위치를 갖는 것으로 식별될 수 있지만, 인접한 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기 위치 및 동일성이 명백하다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역 변이체 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 임의로 서열번호 2의 아미노산 서열은 적어도 하나의 변이체 아미노산을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 임의의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역 변이체 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 2개의 아미노산 변이체를 포함한다.
많은 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 그 자체가 당업계에 이와 같이 공지되어 있다. 당업자는 이러한 공지된 서열을 사용할 수 있고, 당업계에 잘 알려진 일상적인 방법론 및 기술(예를 들어 아래의 실시예 1 참조하되, 이에 한정되지는 않음)을 사용하여 이러한 공지된 서열을 본원에 기술된 중쇄 가변 영역과 함께 사용하여 이중 결합을 분석할 수 있다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 경쇄 가변 영역 변이체 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 임의로 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 적어도 하나의 변이체 아미노산을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역 및 임의의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 경쇄 가변 영역 변이체 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 2개의 아미노산 변이체를 포함한다.
많은 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 그 자체가 당업계에 이와 같이 공지되어 있다. 당업자는 이러한 공지된 서열을 사용할 수 있고, 당업계에 잘 알려진 일상적인 방법론 및 기술(예를 들어 아래의 실시예 1 참조하되, 이에 한정되지는 않음)을 사용하여 이러한 공지된 서열을 본원에 기술된 경쇄 가변 영역과 함께 사용하여 이중 결합을 분석할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 VH 도메인은 임의의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변이체가 포함된 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 임의의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 임의의 위치에서 적어도 1~10개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 임의의 위치에서 적어도 1~5개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 임의의 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 VL 도메인은 임의의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변이체가 포함된 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 임의의 위치에서 적어도 2개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 임의의 위치에서 적어도 1~10개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 임의의 위치에서 적어도 1~5개의 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 임의의 위치에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 본원에 기술된 VH 도메인 및 VL 도메인의 변이체 위치의 수는 합쳐서 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 본원에 기술된 VH 도메인 및 VL 도메인의 변이체 위치의 수는 합쳐서 2~20개이다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 본원에 기술된 VH 도메인 및 VL 도메인의 변이체 위치의 수는 합쳐서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개이다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 본원에 기술된 VH 도메인 및 VL 도메인의 변이체 위치의 수는 합쳐서 20개보다 많다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 이중 항체 결합 영역은 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 각각 포함하는데, 중쇄 및 경쇄 CDR 세트는 CDR에 대한 지지를 제공하고 CDR의 공간 관계를 서로에 대해 정의하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역(FR) 세트 사이에 개재된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “CDR 세트”는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 3개의 초가변 영역을 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작해서, 이들 영역은 “CDR1”, “CDR2”, 및 “CDR3”으로서 각각 표시된다. 따라서, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 광범위한 접촉을 형성하고, 여기서 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3과의 접촉임을 입증하였다. 따라서, CDR 영역은 항원 결합 부위의 특이성을 주로 담당한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “FR 세트”는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 CDR 세트의 CDR에 틀을 씌우는, 측면에 위치하는 4개의 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있지만; FR은 가변 영역을 항원 결합 부위, 특히 CDR에 바로 인접한 FR 잔기 내로 접는 것을 주로 담당한다. FR 내에서, 소정의 아미노 잔기 및 소정의 구조적 특징은 매우 고도로 보존된다. 이와 관련하여, 모든 가변 영역 서열은 약 90개의 아미노산 잔기로 이루어진 내부 이황화 루프를 함유한다. 가변 영역이 결합 부위 내로 접힐 때, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 돌출된 루프 모티프로서 나타난다. 일반적으로, CDR 루프가 정확한 CDR 아미노산 서열과 무관하게 소정의 “정준형(canonical)” 구조로 접히는 형상에 영향을 미치는 FR의 보존된 구조적 영역이 있는 것으로 인식된다. 또한, 특정 FR 잔기는 항체 중쇄와 경쇄의 상호작용을 안정화하는 비공유 도메인간 접촉에 참여하는 것으로 알려져 있다.
일부 구현예에서, 상기 VH 내의 적어도 하나의 변이체는 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VL 내의 적어도 하나의 변이체는 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VH 내의 적어도 하나의 변이체는 FR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VL 내의 적어도 하나의 변이체는 FR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VH 내의 적어도 2개의 변이체는 CDR 영역, FR 영역, 또는 둘 다에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VL 내의 적어도 2개의 변이체는 CDR 영역, FR 영역, 또는 둘 다에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 변이체 위치는 적어도 하나의 CDR 및 적어도 하나의 FR 영역에서 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 변이체 위치는 적어도 하나의 CDR 및 적어도 하나의 FR 영역에서 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH는 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역 변이체 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 52(IMGT 위치 57)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 99(IMGT 위치 107)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 100(IMGT 위치 108)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 101(IMGT 위치 109)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 102(IMGT 위치 110)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 103(IMGT 위치 111)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 104(IMGT 위치 111A)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 105(IMGT 위치 112A)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 106(IMGT 위치 112)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 107(IMGT 위치 113)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 108(IMGT 위치 114)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 111(IMGT 위치 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 52(IMGT 위치 57)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 99(IMGT 위치 107)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 100(IMGT 위치 108)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 101(IMGT 위치 109)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 102(IMGT 위치 110)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 103(IMGT 위치 111)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 104(IMGT 위치 111A)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 105(IMGT 위치 112A)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 106(IMGT 위치 112)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 107(IMGT 위치 113)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 108(IMGT 위치 114)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 111(IMGT 위치 117)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~3개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 105 및 106(IMGT 위치 112A 및 112)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 106 및 111(IMGT 위치 112 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 103 및 106(IMGT 위치 111 및 112)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 104 및 106(IMGT 위치 111A 및 112)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 104, 106, 및 111(IMGT 위치 111A, 112, 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 105, 106, 및 111(IMGT 위치 112A, 112, 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 103, 106, 및 111(IMGT 위치 111, 112, 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 99, 104, 및 111(IMGT 위치 107, 111A, 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인은 위치 52, 99, 104, 및 111(IMGT 위치 57, 107, 111A, 및 117)에서 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL은 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역 변이체 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26(IMGT 위치 27)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 27(IMGT 위치 28)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 31(IMGT 위치 38)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 51(IMGT 위치 65)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 56(IMGT 위치 70)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 77(IMGT 위치 94)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 92(IMGT 위치 109)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 93(IMGT 위치 110)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 96(IMGT 위치 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26(IMGT 위치 27)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 27(IMGT 위치 28)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 31(IMGT 위치 38)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 51(IMGT 위치 65)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 56(IMGT 위치 70)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 77(IMGT 위치 94)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 92(IMGT 위치 109)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 93(IMGT 위치 110)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 96(IMGT 위치 115)에서 아미노산 변이체를 포함하고 1~7개의 추가 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 92, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 109, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 31, 56, 및 77(IMGT 위치 27, 38, 70, 및 94)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 및 77(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 및 94)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 및 92(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 및 109)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 및 92(IMGT 위치 27, 28, 38, 65, 70, 94, 및 109)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 31, 56, 77, 92, 및 96(IMGT 위치 27, 38, 70, 94, 109, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 31, 77, 및 92(IMGT 위치 27, 38, 94, 및 109)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 및 93(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 및 110)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 93, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 110, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 51, 77, 93, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 65, 94, 110, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 56, 77, 93, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 70, 94, 110, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 27, 31, 56, 77, 및 96(IMGT 위치 28, 38, 70, 94, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 27, 31, 56, 77, 92, 및 96(IMGT 위치 28, 38, 70, 94, 109, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 51, 77, 및 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 65, 94, 및 115)에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 또는 96(IMGT 위치 27, 28, 38, 및 115), 또는 이들의 임의의 조합에서 아미노산 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인은 서열번호 2의 위치 56 또는 77 또는 이들의 조합(IMGT 위치 70 또는 94, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에 있는 프레임워크 영역 내 위치에서 아미노산 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL은 서열번호 2의 위치 56 또는 77 또는 이들의 조합(IMGT 위치 70 또는 94, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나의 프레임워크 내 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하며, 여기서 위치 56에 있는 변이체 아미노산은 류신, 알라닌, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글리신, 또는 글루탐산을 포함하고/하거나, 위치 77에 있는 변이체 아미노산은 발린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체가 본원에 개시되며, 상기 항체는: 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 (IMGT) 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합 중 어느 하나에 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 (IMGT) 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합 중 어느 하나에 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 이중 결합 항체 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 변이체 VH 또는 변이체 VL, 또는 이들의 조합을 포함하고, 중쇄 가변 영역 내의 (IMGT) 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117 이외의 위치 및/또는 경쇄 가변 영역 내의 (IMGT) 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115 이외의 위치에서 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR3에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 2개의 상이한 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR1 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR1 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR2 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역에서 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 내에 5개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, VL 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 하나의 아미노산 변이체는 CDR3에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 2개의 상이한 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 동일한 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 CDR1 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 CDR1 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 2개의 아미노산 변이체는 CDR2 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 3개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역 내의 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내의 적어도 4개의 아미노산 변이체는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역에서 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 5개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역에서 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 6개의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 하나의 CDR 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역에서 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 및 CDR2 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 내에 7개 이상의 아미노산 변이체가 있는 경우, 변이체 위치는 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역에서 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 아미노산 변이체는 하나의 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체는 비소수성 잔기의 소수성 잔기로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체는 하전된 잔기의 하전되지 않은 잔기로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체는 중성 치환을 포함하며, 여기서 치환되는 아미노산은 유사한 품질을 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체는 방향족 잔기의 비-방향족 잔기로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Trp, Tyr 및 Phe와 같은 천연 방향족 아미노산은 페닐글리신, TIC, 나프틸엘라닌(Nol), Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같은 합성 비-천연 산으로 치환된다. 일부 구현예에서, 변이체 치환은 변형된 아미노산 또는 비-아미노산 단량체(예를 들어 지방산, 복합 탄수화물 등)를 치환하는 것을 포함한다. 당업자는, 소정의 구현예에서, 각각의 변이체 위치에서 아미노산 잔기를 선택하는 것이 VH, VL, 및/또는 이들의 조합의 3D 구조에 영향을 미칠 수 있지만, 각각의 변이체 위치에서 아미노산 잔기를 선택하는 것은 독립적으로 간주된다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, “아미노산” 또는 “아미노산 잔기” 또는 “잔기”는 20개의 자연 발생, 암호화된 아미노산 잔기, 및 예를 들어 하이드록시프롤린, 포스포세린, 및 포스포트레오닌을 포함하여, 생체 내에서 전사 후 변형되는 아미노산들; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시리신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-류신, 및 오르니틴을 포함하되 이들로 한정되지 않는 기타 특이적 아미노산(unusual amino acid)을 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, “아미노산”은 D-아미노산과 L-아미노산 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체 치환은 D-아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변이체 치환은 L-아미노산이다. 일부 구현예에서, 변이체 잔기는 자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 잔기는 자연 발생하는 암호화된 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 잔기는 자연 발생하는 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 잔기는 비-자연 발생 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 잔기는 비-자연 발생, 비-단백질생성 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VH 도메인의 아미노산 서열은 표 1 또는 표 10에 제시된 것들 중 하나이다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 표 1 또는 표 10에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열은 표 1 또는 표 10에 제시된 것들 중 하나이다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 표 1 또는 표 10에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 가변 중쇄 영역을 포함한다.
당업자는, 알려진 아미노산 서열을 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 VL 또는 VH 도메인 각각과 쌍을 형성하여 항원 결합 영역을 포함시킬 때, 이러한 쌍 형성을 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, 본원의 개시 및 아래의 실시예 참조)을 사용하여 결합 특성에 대해 분석할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍의 아미노산 서열은 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 및 서열번호 54 및 53에 제시된 쌍 서열로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 4 및 3에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 6 및 5에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 8 및 7에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 10 및 9에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 12 및 11에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 14 및 13에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 16 및 15에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 18 및 17에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 20 및 19에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 22 및 21에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 24 및 23에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 26 및 25에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 28 및 27에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 30 및 29에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 32 및 31에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 34 및 33에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 36 및 35에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 38 및 37에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 40 및 39에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 42 및 41에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 44 및 43에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 46 및 45에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 48 및 47에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 50 및 49에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 52 및 51에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 이중 결합 항체는 서열번호 54 및 53에 제시된 쌍 서열로부터 선택된 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍의 아미노산 서열은 다음 중 어느 하나에 제시된 쌍 서열로부터 선택된다: 서열번호 209 및 210, 서열번호 211 및 212, 서열번호 213 및 214, 서열번호 215 및 216, 서열번호 217 및 218, 서열번호 219 및 220, 서열번호 221 및 222, 서열번호 223 및 224, 서열번호 225 및 226, 서열번호 227 및 228, 서열번호 229 및 230, 서열번호 231 및 232, 서열번호 233 및 234, 서열번호 235 및 236, 서열번호 237 및 238, 서열번호 239 및 240, 서열번호 241 및 242, 서열번호 243 및 244, 서열번호 245 및 246, 서열번호 247 및 248, 서열번호 249 및 250, 서열번호 251 및 252, 서열번호 253 및 254, 서열번호 255 및 256, 서열번호 257 및 258, 서열번호 259 및 260, 서열번호 261 및 262, 서열번호 263 및 264, 서열번호 265 및 266, 서열번호 267 및 268, 서열번호 269 및 270, 서열번호 271 및 272, 서열번호 273 및 274, 서열번호 275 및 276, 서열번호 277 및 278, 서열번호 279 및 280, 서열번호 281 및 282, 서열번호 283 및 284, 서열번호 285 및 286, 서열번호 287 및 288, 서열번호 289 및 290, 서열번호 291 및 292, 서열번호 293 및 294, 서열번호 295 및 296, 서열번호 297 및 298, 서열번호 299 및 300, 서열번호 301 및 302, 서열번호 303 및 304, 서열번호 305 및 306, 서열번호 307 및 308, 서열번호 309 및 310, 서열번호 311 및 312, 서열번호 313 및 314, 서열번호 315 및 316, 서열번호 317 및 318, 서열번호 319 및 320, 서열번호 321 및 322, 서열번호 323 및 324, 서열번호 325 및 326, 서열번호 327 및 328, 서열번호 329 및 330, 서열번호 331 및 332, 서열번호 333 및 334, 서열번호 335 및 336, 서열번호 337 및 338, 서열번호 339 및 340, 서열번호 341 및 342, 서열번호 343 및 344, 서열번호 345 및 346, 서열번호 347 및 348.
일부 구현예에서, scFv 단편의 아미노산 서열은 다음 쌍 중 어느 하나에 제시된 서열 쌍을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 및 서열번호 54 및 53.
조작된 “재-에피토트화된” VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 및 VL 도메인 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 이들 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포
본 개시는 서열번호 1 및 서열번호 2의 템플릿 VH 및 VL 서열 각각과 비교하여 변이체 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 및 VL 도메인 둘 다를 포함하는 이중 결합 항체를 제공한다. 위에서 상술한 것과 같이, 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하되, 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하며; 암호화된 중쇄 가변 영역, 암호화된 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하며, 상기 VH 도메인은 본원에 개시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하며, 상기 VH 도메인은 표 8 또는 표 4에 개시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12 (서열번호 143)로서 제시된다(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임).
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 이중 결합 항체의 VH 도메인을 암호화하고, 이중 결합 항체의 VH 도메인은 HCDR1(서열번호 136), HCDR2(서열번호 142), 및 HCDR3(서열번호 143)을 포함하되, VH 도메인은 HX1, HX2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12 중 적어도 하나에서 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 이중 결합 항체의 VH 도메인을 암호화하고, 이중 결합 항체의 VH 도메인은 HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137); 및 HCDR3(서열번호 138)을 포함하되, HCDR2의 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HCDR2 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 이중 결합 항체를 암호화하고, 이중 결합 항체는 HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137)를 포함하되, HCDR2의 서열 중 HX1은 W이고, HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 이중 결합 항체는 HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2가 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하거나, HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2이 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하거나, HCDR1(서열번호 136); HX1이 W인 HCDR2(서열번호 137); 및 HX2가 S이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L인 HCDR3(서열번호 138)을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하되, 일부 구현예에서, 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고(여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 아미노산 임); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고(여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCDR3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시된다(여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임).
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 LCDR을 포함하는 이중 결합 항체의 VL 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함하며, 상기 VL 도메인은 표 9 또는 표 5에 개시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 포함하고, 단리된 이중 결합 항체는, LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139); LX4가 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR2(서열번호 140); 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCDR3(서열번호 141)을 포함하는 변이체 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 이중 결합 항체를 암호화하고, 이중 결합 항체는, LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 S인 LCDR2 (서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하거나; LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 S인 LCDR2(서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하거나; LX1이 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L인 LCDR1(서열번호 139), LX4가 G인 LCDR2(서열번호 140), 및 LX5가 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G인 LCDR3(서열번호 141)을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 전술한 VH 도메인 HCDR 및 VL 도메인 LCDR의 조합을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 도메인 부위를 포함한다. 예를 들어(이에 한정되지는 않음), 소정의 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 VH 도메인을 포함하고, VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고; HCDR2의 아미노산 서열은: I HX1 Y D G S N K(서열번호 142)로서 제시되고 (여기서 HX1은 임의의 아미노산임); HCDR3의 아미노산 서열은: A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(서열번호 143)로서 제시되며(여기서 XH2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산 임); 상기 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시되고 (여기서 LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 도메인인); LCDR2의 아미노산 서열은 D D LX4(서열번호 145)로서 제시되고 (여기서 LX4는 임의의 아미노산임); LCD3의 아미노산 서열은 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(서열번호 146)로서 제시된다(여기서 LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산임).
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 VH 도메인을 포함하고, VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, HCDR1으 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 137에 제시되고, 서열 중 HX1은 W 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 138에 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E, Q, M, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L, W, 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H, A, S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I, L, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되며; VL 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 N, L, 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX2는 L 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX3은 S 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX6은 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 단리된 이중 결합 항체를 암호화하고, 단리된 이중 결합 항체는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 136에 제시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 137에 제시되고, 서열 중 HX1은 W이고, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 138에 제시되고, 서열 중 HX2는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX7은 L 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX8은 V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX9는 H 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 139에 제시되고, 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 140에 제시되고, 서열 중 LX4는 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 141에 제시되고, 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 재-에피토프화된 이중 결합 항체를 암호화하고, 재-에피토프화된 이중 결합 항체는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함하되, 각 CDR의 아미노산 서열은 도 1a 및 도 1b에 제시된 것과 같으며, 상기 도면에 제시된 클론의 경우는 예를 들어 다음과 같지만 이에 한정되지는 않는다:
클론 C2: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 I임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 S임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G임;
클론 C6: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 A이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 M이고, HX7은 V이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 S임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H임;
클론 C9: HCDR1(서열번호 136); HCDR2(서열번호 137), 서열 중 HX1은 W임; HCDR3(서열번호 138), 서열 중 HX2는 S이고, HX3은 P이고, HX4는 Q이고, HX5는 W이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX10은 E이고, HX11은 A이고, HX12는 L임; LCDR1(서열번호 139), 서열 중 LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L임; LCDR2(서열번호 140), 서열 중 LX4는 G임; 및 LCDR3(서열번호 141), 서열 중 LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 G임.
소정의 구현예에서, 핵산 작제물은 하나의 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 작제물은 2개의 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 작제물은 하나의 핵산 서열을 포함하고, VH 도메인 및 VL 도메인은 이 핵산 서열에 의해 암호화된다. 소정의 구현예에서, 핵산 작제물은 2개의 핵산 서열을 포함하고, VH 도메인은 이 중 하나의 핵산 서열에 의해 암호화되고, VL 도메인은 다른 하나의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 개시는 본원에 기술된 변이체 VH, VL, 또는 VH 및 VL 도메인 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 소정의 구현예에서, 템플릿 VH 도메인은 서열번호 55에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 템플릿 VL 도메인은 서열번호 56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 본원에 개시되며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하되, 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하며; 암호화된 중쇄 가변 영역, 암호화된 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 작제물 서열은 2개의 핵산 서열을 포함하되, 하나는 변이체 중쇄 가변 영역을 암호화하고, 다른 하나는 변이체 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(들)은 포유류 전사 및 번역에 맞게 최적화된다.
본 개시는, 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 서열을 암호화하는 단리된 핵산 작제물을 추가로 제공한다. 변이체 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 아래 표 2에 제공되어 있다. VL 도메인에 연결된 변이체 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 예시적인 핵산 작제물은 아래 표 3에 제공되어 있다.
핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 이들 및 관련 구현예는 본원에 기술된 바와 같은 이중 결합 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원, 또는 이들의 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 단리된 폴리뉴클레오티드는 이의 기원에 의해 (1) 자연에서 단리된 폴리뉴클레오티드가 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되지 않거나, (2) 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는다.
당업자는 용어 “폴리뉴클레오티드” 및 “핵산 서열”이 일부 구현예에서 모든 동일한 의미 및 품질을 갖도로록 상호 교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 단리된 핵산 서열은 본원 전반에 걸쳐 및 도 1a에 개시된 것과 같은 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인, 본원 전반에 걸쳐 및 도 1b에 개시된 것과 같은 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인, 본원 전반에 걸쳐 및 도 1a 및 도 1b에 개시된 것과 같은 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인, 또는 본원 전반에 걸쳐 상세하게 기술된 것과 같은 이중 결합 항체의 VH 및 VL 도메인을 암호화한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 중합체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘과 같은 염기 변형, 아라비노시드 및 2’,3’-디데옥시리보오스와 같은 리보오스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다. 용어 “폴리뉴클레오티드”는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 구체적으로 포함한다.
용어 “자연 발생 뉴클레오티드”는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 “변형된 뉴클레오티드”는 변형되거나 치환된 당기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 “올리고뉴클레오티드 연결”은 올리고뉴클레오티드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐레이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예를 들어, LaPlanche 등의 문헌[1986, Nucl. Acids Res., 14:9081]; Stec 등의 문헌[1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077]; Stein 등의 문헌[1988, Nucl. Acids Res., 16:3209]; Zon 등의 문헌[1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539]; Zon 등의 문헌[1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England]; Stec 등의 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann 및 Peyman의 문헌[1990, Chemical Reviews, 90:543]을 참조하고, 이들의 개시 내용은 임의의 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 혼성화를 검출할 수 있게 하는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
다른 관련 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 폴리뉴클레오티드 템플릿 서열과 실질적인 동일성을 가질 수 있지만, 템플릿 서열은 이중 결합 항체, 또는 이의 단편, 또는 이의 도메인을 암호화하지는 않는다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는, 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 결합 도메인의 결합 친화도가 본원에 구체적으로 제시된 것과 같은 변형되지 않은 템플릿에 비해 에피토프에 새롭게 결합하도록, 하나 이상의 치환, 추가, 결실, 및/또는 삽입을 함유하게 된다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 2개의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 서열번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 105, 및 107에 제시된 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 59에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 61에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 63에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 65에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 69에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 71에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 73에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 75에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 77에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 79에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 81에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 83에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 85에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 87에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 89에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 91에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 93에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 95에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 97에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 99에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 101에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 105에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 107에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 4에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 6에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 8에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 10에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 12에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 14에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 16에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 18에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 20에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 22에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 24에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 26에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 28에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 30에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 32에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 34에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 36에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 38에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 40에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 42에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 44에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 46에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 48에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 50에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 52에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 54에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 표 10 또는 표 1에 제시된 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고; 예를 들어 VH는 서열번호 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 및 347 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 핵산 작제물은 본원에 개시된 VH 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 VH를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108에 제시된 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 58에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 60에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 62에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 64에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 66에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 68에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 70에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 72에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 74에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 76에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 78에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 80에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 82에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 84에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 86에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 88에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 90에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 92에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 94에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 96에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 98에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 100에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 102에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 104에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 106에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 108에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 3에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 5에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 7에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 9에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 11에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 13에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 15에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 17에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 19에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 21에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 23에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 25에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 27에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 29에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 31에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 33에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 35에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 37에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 39에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 41에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 43에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 45에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 47에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 49에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 51에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 53에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 표 10 또는 표 1에 제시된 이중 결합 항체 경쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고; 예를 들어 VL은 서열번호 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 및 348 중 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 핵산 작제물은 본원에 개시된 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 VL을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 서열번호 57 및 58, 서열번호 59 및 60, 서열번호 61 및 62, 서열번호 63 및 64, 서열번호 65 및 66, 서열번호 67 및 68, 서열번호 69 및 70, 서열번호 71 및 72, 서열번호 73 및 74, 서열번호 75 및 76, 서열번호 77 및 78, 서열번호 79 및 80, 서열번호 81 및 82, 서열번호 83 및 84, 서열번호 85 및 86, 서열번호 87 및 88, 서열번호 89 및 90, 서열번호 91 및 92, 서열번호 93 및 94, 서열번호 95 및 96, 서열번호 97 및 98, 서열번호 99 및 100, 서열번호 101 및 102, 서열번호 103 및 104, 서열번호 105 및 106, 및 서열번호 107 및 108에 제시된 쌍 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 표 10 또는 표 1에 도시된 것과 같은 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고; 예를 들어 VH 및 VL 쌍은 다음 중 하나일 수 있다: 서열번호 209 및 210, 서열번호 211 및 212, 서열번호 213 및 214, 서열번호 215 및 216, 서열번호 217 및 218, 서열번호 219 및 220, 서열번호 221 및 222, 서열번호 223 및 224, 서열번호 225 및 226, 서열번호 227 및 228, 서열번호 229 및 230, 서열번호 231 및 232, 서열번호 233 및 234, 서열번호 235 및 236, 서열번호 237 및 238, 서열번호 239 및 240, 서열번호 241 및 242, 서열번호 243 및 244, 서열번호 245 및 246, 서열번호 247 및 248, 서열번호 249 및 250, 서열번호 251 및 252, 서열번호 253 및 254, 서열번호 255 및 256, 서열번호 257 및 258, 서열번호 259 및 260, 서열번호 261 및 262, 서열번호 263 및 264, 서열번호 265 및 266, 서열번호 267 및 268, 서열번호 269 및 270, 서열번호 271 및 272, 서열번호 273 및 274, 서열번호 275 및 276, 서열번호 277 및 278, 서열번호 279 및 280, 서열번호 281 및 282, 서열번호 283 및 284, 서열번호 285 및 286, 서열번호 287 및 288, 서열번호 289 및 290, 서열번호 291 및 292, 서열번호 293 및 294, 서열번호 295 및 296, 서열번호 297 및 298, 서열번호 299 및 300, 서열번호 301 및 302, 서열번호 303 및 304, 서열번호 305 및 306, 서열번호 307 및 308, 서열번호 309 및 310, 서열번호 311 및 312, 서열번호 313 및 314, 서열번호 315 및 316, 서열번호 317 및 318, 서열번호 319 및 320, 서열번호 321 및 322, 서열번호 323 및 324, 서열번호 325 및 326, 서열번호 327 및 328, 서열번호 329 및 330, 서열번호 331 및 332, 서열번호 333 및 334, 서열번호 335 및 336, 서열번호 337 및 338, 서열번호 339 및 340, 서열번호 341 및 342, 서열번호 343 및 344, 서열번호 345 및 346, 서열번호 347 및 348. 또 다른 구현예에서, VH 및 VL 쌍은 본원에 개시된 VH 및 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하다.
당업자는, 일부 구현예에서, VH 도메인을 암호화하는 서열 및 VL 도메인을 암호화하는 서열이 링커 서열을 암호화하는 서열에 의해 연결된다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 폴리펩티드 링커를 암호화한다. ggcggtggtggtagcggaggcggaggatcaggtggaggcggcagt (서열번호 148).
일부 구현예에서, 핵산 작제물은 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 scFv를 암호화하는 핵산 서열을 포함하되, 상기 핵산 서열은 서열번호 109~135에 제시된 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물은 IgG 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG1 면역글로불린, IgG2 면역글로불린, IgG3 면역글로불린, 또는 IgG4 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG1 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG2 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG3 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG4 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 IgG1 면역글로불린 또는 IgG4 면역글로불린을 암호화한다.
일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 Fab 면역글로불린 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 F(ab’)2 면역글로불린 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 Fv 면역글로불린을 작제물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 scFv 면역글로불린을 작제물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은, CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 단쇄 Fv 단편을 포함하는 미니바디 면역글로불린 작제물을 암호화한다.
일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 디아바디 면역글로불린을 작제물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 디아바디 면역글로불린 작제물은 작은 펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 디아바디 면역글로불린 작제물은 2개의 scFv 단편이 서로 공유 연결된 단쇄 (Fv)2를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 서로 공유 연결된 3개의 scFv 단편을 포함하는 디아바디 면역글로불린 작제물을 암호화한다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 작제물은 본원에 개시된 것과 같은 단리된 이중 결합 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 돌연변이된 면역글로불린을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이체 IgG를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이체 IgG1을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 L234A/L235A(LALA) 돌연변이를 포함하는 IgG를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 항체를 암호화하는 핵산 서열은 L234A/L235A(LALA) 돌연변이를 포함하는 IgG1을 암호화한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이, 부위 특이적 돌연변이 유발과 같은 돌연변이 유발 접근법이 변이체 VH, VL, 또는 VH 및 VL 아미노산 서열을 암호화하는 변이체 VH, VL, 또는 VH 및 VL 핵산 서열의 제조에 사용될 수 있다. 템플릿 VH 및 VL 핵산 서열인 서열번호 55 및 56 각각은 템플릿 아미노산 서열인 서열번호 1 및 서열번호 2를 각각 암호화한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 변이체 VH, VL, 또는 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 변이체 VH 도메인, 변이체 VL 도메인, 또는 둘 다를 포함하되, 상기 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 템플릿 서열인 서열번호 55 및 서열번호 56 각각의 부위 특이적 돌연변이 유발을 포함한다. 이러한 접근법에 의해, 폴리펩티드 서열에서의 특이적 변형은 이들을 암호화하는 기저 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발을 통해 이루어질 수 있다. 이들 기술은 서열 변이체를 제조하고 시험하기 위한 간단한 접근법, 예를 들어 위에서 자세히 기술한 것과 같이, 예를 들어(이에 한정되지는 않음), 원하는 아미노산 변이체 부위를 고려하여, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 폴리뉴클레오티드 내로 도입하는 간단한 접근법을 제공한다.
부위 특이적 돌연변이 유발은 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 충분한 수의 인접한 뉴클레오티드를 사용함으로써, 횡단되는 결실 접합부의 양 측면에 안정한 이중체를 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복잡도의 프라이머 서열을 제공하는 돌연변이체의 생산을 가능하게 한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오티드 자체의 특성을 개선, 변경, 감소, 변형, 또는 달리 변경하고/하거나 암호화된 폴리펩티드의 특성, 활성, 조성, 안정성, 또는 일차 서열을 변경하기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 생성된 항체가 이중 결합 친화도를 포함하도록, 암호화된 템플릿 VH 또는 VL 또는 둘 모두의 결합 특성을 변경하기 위해, 본원에 개시된 것과 같은 이중 결합 항체의 성분 부분(VH 도메인, VL 도메인, 또는 이들의 조합)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발이 고려된다. 부위 특이적 돌연변이 유발의 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 둘 다의 변이체를 생성하는 데 널리 사용된다. 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발은 DNA 분자의 특정 부분을 변경하는 데 종종 사용된다. 이러한 실시예에서, 통상적으로 약 14 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이를 포함하는 프라이머가 사용되며, 서열의 접합부의 양 측면 상에 약 5 내지 약 10개의 잔기가 변경된다.
당업자가 이해할 수 있듯이, 부위 특이적 돌연변이 유발 기술에는 단일 가닥와 이중 가닥 형태 모두로 존재하는 파지 벡터가 종종 사용되어 왔다. 부위 지향 돌연변이 유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파지는 상업적으로 쉽게 이용할 수 있으며, 이들의 사용은 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있다. 관심 유전자를 플라스미드로부터 파지로 전달하는 단계가 생략된 부위 지향 돌연변이 유발에는 이중-가닥 플라스미드도 일상적으로 사용된다.
일반적으로, 본원에 따른 부위 지향 돌연변이 유발은, 먼저 단일 가닥 벡터를 수득하거나, 원하는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 서열 내에 포함하는 이중 가닥 벡터의 2개의 가닥으로부터 용융시켜 분리함으로써 수행된다. 원하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성에 의해 제조된다. 그런 다음, 이 프라이머를 단일 가닥 벡터와 함께 어닐링하고, 돌연변이 보유 가닥의 합성을 완료하기 위해 대장균 중합효소 I Klenow 단편과 같은 DNA 중합 효소로 처리한다. 따라서, 하나의 가닥이 돌연변이되지 않은 원래 서열을 암호화하고 제2 가닥이 원하는 돌연변이를 갖는 이종이중체가 형성된다. 그런 다음, 이러한 이종이중체 벡터를 사용하여 대장균 세포와 같은 적절한 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
부위 지향 돌연변이 유발을 사용하여 선택된 펩티드-암호화 DNA 분절의 서열 변이체를 제조하는 것은 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단을 제공하지만, 이로 한정하는 것을 의미하지는 않는데, 펩티드의 서열 변이체 및 이를 암호화하는 DNA 서열이 수득될 수 있는 다른 방법이 있기 때문이다. 일부 구현예에서, 라이브러리를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 것들, 예를 들어 미국 특허 제9,889,423호에 기술된 방법을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 라이브러리 내에서 서열 변이체를 설계하는 방법은 컴퓨터 상에서 변이체 서열을 설계한 다음 서열을 합성하는 것을 포함하는데, 이는 화학적 및 생화학적 공정 둘 다를 포함하는 방법이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발 절차”는 특정 핵산 분자의 농도를 이의 초기 농도에 비해 증가시키거나, 증폭과 같이 검출 가능한 신호 농도를 증가시키는 템플릿 의존적 프로세스 및 벡터 매개 전파를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발 절차”는 프라이머 분자의 템플릿 의존적 연장을 포함하는 프로세스를 포함한다. 용어 “템플릿 의존적 프로세스”는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 포함하며, 여기서 새롭게 합성된 핵산 가닥의 서열은 상보적 염기 페어링의 잘 알려진 규칙에 의해 지시된다(예를 들어, Watson의 1987 문헌 참조). 일반적으로, 벡터 매개 방법론은 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터 내로 도입하는 것, 벡터의 클론 증폭, 및 증폭된 핵산 단편의 회수를 포함한다. 이러한 방법론의 예는 미국 특허 제4,237,224호에 제공되어 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합된다.
폴리펩티드 VH 및 VL 변이체의 생산을 위한 다른 접근법에서 미국 특허 제5,837,458호에 기술된 것과 같은 반복적 서열 재조합(recursive sequence recombination)이 사용될 수 있다. 이러한 접근법에서, 재조합과 스크리닝 또는 선택의 반복 사이클이 수행되어, 예를 들어 증가된 결합 친화도를 갖는 개별 폴리뉴클레오티드 변이체를 “진화”시킨다. 소정의 구현예는 또한, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다.
소정의 구현예에서, 전술한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 아미노산 VH, VL, 또는 VH와 VL 변이체를 암호화하는 VH, VL, 또는 VH와 VL 변이체 폴리뉴클레오티드, 단편, 및 혼성화 서열이 이중 결합 항체에 포함된다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은, 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다수의 클로닝 부위, 다른 코딩 분절 등과 같은 다른 DNA 서열과 조합될 수 있어서, 이들의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 총 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 길이 등인(모든 중간 길이 포함) 예시적인 폴리뉴클레오티드 분절이 유용한 것으로 고려된다.
소정의 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 벡터는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 단백질의 발현 및/또는 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 유발하도록 해당 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 공유적으로 삽입될 수 있는 비히클을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 벡터 내에 삽입될 수 있고, 예를 들어(이에 한정되지는 않음) 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 분해된 다음, 일치하는 제한 말단을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드와 연결될 수 있다.
적합한 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드; 코스미드; 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지; 및 동물 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스의 예시적인 범주는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어 단순 포진 바이러스), 수두바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 및 파포바바이러스(예를 들어 SV40)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
이중 항체 또는 이의 성분의 발현을 위해, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 숙주 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 발현 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택성 마커, 및 신호 서열을 포함하여, 발현을 조절하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 요소는 “조절” 요소로 간주될 수 있다.
당업자는 용어 “조절 서열”은, 코딩 서열에 연결되거나 작동 가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현, 가공, 또는 세포내 국소화에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 원핵생물에 대한 전사 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 진핵생물에 대한 전사 조절 서열은 전사 인자에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, “조절 서열”은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어(이에 한정되지는 않음) 프로모터 서열은 벡터에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 촉진하도록 선택될 수 있다. 적절한 프로모터 서열은 T7 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터, 베타-액틴 프로모터, EF1a 프로모터, CMV 프로모터, 및 SV40 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 인핸서 서열은 폴리뉴클레오티드의 전사를 강화하도록 선택될 수 있다. 선택성 마커는 벡터가 삽입된 숙주 세포를 벡터가 삽입되지 않은 것들로부터 선택하도록 선택될 수 있고, 예를 들어 선택성 마커는 항생제 내성을 부여하는 유전자일 수 있다. 신호 서열은 발현된 폴리펩티드가 숙주 세포 외부로 수송될 수 있도록 선택될 수 있다.
벡터는 벡터가 세포 내로 진입하는 데 도움을 주는 물질을 포함할 수도 있으며, 여기에는 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 발현 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체 또는 이의 성분, 예를 들어(이에 한정되지는 않음) 전술한 것과 같이 Fab 요소, F(ab′)2 요소, scFv, Fv, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디에 존재할 수 있는 VH 도메인, VL 도메인, 합쳐진 VH-VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 이중 결합 도메인 및 이의 성분은 위에서 상세히 기술되었다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 VH 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 2개의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 3개의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 VH 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 VH 및 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 IgG 항체 또는 이의 단편의 VH 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 IgG 항체 또는 이의 단편의 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 이중 항체의 IgG 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 scFv의 VH 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 scFv의 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 scFv의 VH 및 VL 도메인 성분을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 포함한다.
이중 결합 항체는 위에서 상세히 기술되었다. 당업자는, 당업계의 지식 및 본원에 새롭게 기술된 특정 세부 사항을 사용하여, 본원에 기술된 단리된 핵산에 의해 암호화될 수 있는 성분의 범위를 명백히 이해할 것이다.
폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해, 벡터는 숙주 세포(단리된 숙주 세포) 내로 도입되어 벡터 자체의 복제를 허용함으로써 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 카피를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로 복제 기점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선택성 마커를 포함하지만 이에 한정되지 않는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 자율 복제를 촉진하도록 선택될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 제공된 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드(들)의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 전술한 것과 같은 하나 이상의 작제물을 포함한다. 핵산은 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어(이에 한정되지는 않음) IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 산물의 생산 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 암호화 핵산 작제물로부터의 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현은 핵산 작제물을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 VH-VL 쌍, 또는 항체는 임의의 적절한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제된 다음, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 치료 방법에 적절히 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 이중 결합 항체, VH 및/또는 VL 도메인, 및 암호화 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제조되고 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키기 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포는 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 더 높은 차원의 진핵 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
이러한 목적에 맞는 적절한 원핵 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 유박테리아, 예를 들어 대장균속(예: 대장균)과 같은 장내세균과, 엔테로박터, 에르위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라(예: 살모넬라 티피무륨), 세라티아(예: 세라티아 마르세스칸), 및 시겔라뿐만 아니라, 고초균과 같은 간균, 녹농균과 같은 슈도모나스, 및 스트렙토미세스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
대장균과 같은 원핵 세포에서 항체 및 항원 결합 단편을 발현시키는 것은 당업계에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어 Pluckthun, A. 등의 문헌[Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다. 배양물 중 진핵 세포에서의 발현도, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 생산을 위한 옵션으로서 당업자가 이용할 수 있다. 최근 내용의 검토를 위해, 예를 들어 Ref, M. E.의 문헌[(1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576]; Trill J. J. 등의 문헌[(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560]을 참조한다.
이러한 목적에 적합한 진균 세포는 사상성 진균 및 효모를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 진균 세포의 예시적인 예는 다음을 포함한다: 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae); 일반적인 빵 효모; 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis (ATCC 12,424)), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus (ATCC 16,045)), K. 위커라미이(K. wickeramii (ATCC 24,178)), K. 왈티이(K. waltii (ATCC 56,500)), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum (ATCC 36,906)), K. 터모톨로란스(K. thermotolerans) 및 K. 막시아누스(K. marxianus)와 같은 클루이베로미세스 숙주(Kluyveromyces hosts); 야로위아(yarrowia (EP 402,226)); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris (EP 183,070)); 칸디다(Candida); 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 쉬반니오미세스(Schwanniomyces); 및 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라듐(Tolypocladium)과 같은 사상성 진균(filamentous fungi); 및 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)와 같은 아스페르길루스 숙주(Aspergillus hosts).
더 높은 차원의 진핵 세포, 특히 다세포 유기체로부터 유래된 것들이 본원에 제공된 것과 같은 당질화된 VH 및 VL 도메인의 발현에 사용될 수 있다. 적절한 더 높은 차원의 진핵 세포는 무척추동물 세포 및 곤충 세포, 및 척추동물 세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주와 변이체, 및 숙주 유래의 상응하는 임의의 곤충 숙주 세포, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda(애벌레)), 이집트 숲모기(Aedes aegypti(모기)), 흰줄 숲모기(Aedes albopictus(모기)), 노랑초파리(Drosophila melanogaster(초파리)), 및 누에나방(Bombyx mori)가 식별되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 캘리포르니카 NPV(Autographa californica NPV)의 K-1 변이체 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주를 공개적으로 이용할 수 있으며, 이러한 바이러스는 본원에 기술된 바와 같이 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있고, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물이 숙주로서 사용될 수도 있다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용할 수 있는 포유류 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 랫트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 등을 포함한다. 척추동물 세포의 비제한적인 예는 포유류 숙주 세포주, 예컨대 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝한 293 세포, Graham 등의 문헌[J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); ExpiCHO-S(TM) 세포(ThermoFisher Scientific cat. #A29133); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather의 문헌[Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRK-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather 등의 문헌[Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 본원에 기술된 핵산 작제물을 포함한다. 프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자, 및 경우에 따라 다른 서열을 포함하여, 적절한 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 조절 서열은 핵산 작제물 내에 포함된 핵산 서열(들)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예를 들어 경우에 따라 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가 세부 사항은, 예를 들어, Sambrook 및 Russell의 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, 세포 내로 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에 있어서 핵산의 조작을 위한 많은 알려진 기술 및 프로토콜은 Ausubel(편집) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, John Wiley & Sons, 1988], Ausubel(편집) 등의 문헌[Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999]에 상세하게 기술되어 있다. Sambrook 등의 개시 및 Ausubel 등의 개시 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
벡터는 다음을 포함하되 이에 한정되지 않는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법을 사용해 숙주 세포에 도입될 수 있다: DEAE-덱스트란 매개 전달, 인산칼슘 침강 방법, 양이온성 지질 매개 전달, 리포좀 매개 형질감염, 전기천공, 미세분사 충돌, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 의해 매개된 전달. 관심 벡터의 발현을 위해 세포를 형질감염 및 형질전환하기 위한 표준 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포는 시험관 내 또는 배양물 내의 숙주 세포일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체 내 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포가 생체 내에 존재하면, “인트라바디” 또는 세포내 항체로서 본원에 기술된 이중 항체의 세포내 발현이 가능할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 제1 폴리펩티드(예: VH 도메인)를 암호화하는 제1 벡터 및 제2 폴리펩티드(예: VL 도메인)를 암호화하는 제2 벡터를 포함한다. 소정의 구현예에서, 숙주 세포는 제1 폴리펩티드(예: VH 도메인) 및 제2 폴리펩티드(예: VL 도메인)를 암호화하는 벡터를 포함한다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 변이체 VH 도메인을 암호화하는 제1 벡터 및 변이체 VL 도메인을 암호화하는 제2 벡터를 포함한다. 소정의 구현예에서, 숙주 세포는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 암호화하는 하나의 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 세포는 본원에 개시된 것과 같은 단리된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 본원에 개시된 바와 같은 2개의 단리된 핵산 서열을 포함하되, 하나의 핵산은 변이체 VH 도메인을 암호화하고 다른 하나의 핵산은 변이체 VL 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 암호화하는 본원에 개시된 것과 같은 하나의 단리된 핵산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 동시에 도입되거나 동시에 도입되지 않을 수 있다. 소정의 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 숙주 세포 내로 함께 도입될 수 있다. 소정의 구현예에서, 제1 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 다음 제2 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 소정의 구현예에서, 제1 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 다음 제1 폴리펩티드를 발현하는 안정한 세포 내로 확립된 다음, 제2 벡터가 안정한 세포주 내로 도입될 수 있다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 이중 결합 항체 내에 포함된 적어도 하나의 변이체 VH 도메인 및 적어도 하나의 변이체 VL을 암호화하는 벡터를 포함한다.
도입 후, 예를 들어 유전자의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용할 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 제공된 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건 하에, 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예: 염색체) 내에 통합된다. 통합은 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 표준 기술에 따라 포함시킴으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 게놈 내에 통합되지 않고, 벡터는 에피솜이다.
일부 구현예에서, 전술한 것과 같은 이중 결합 항체 또는 이의 단편을 발현시키기 위해 발현 시스템에서 전술한 것과 같은 작제물을 사용하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건은 적합한 배지, 배양 배지 중 적절한 밀도의 숙주 세포, 필수 영양소의 존재, 보충 인자의 존재, 적절한 온도 및 습도, 및 미생물 오염물의 부재를 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 당업자는 발현의 목적에 적합한 조건을 적절히 선택할 수 있다.
조작된 “재-에피토프화된” 이중 항체를 합성하는 방법
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 생산하는 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 생산하는 방법이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 HCDR을 포함하는 VH 도메인 및 본원에 기술된 것과 같은 LCDR을 포함하는 VL 도메인을 이중 결합 항체를 생산하는 방법이 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 생산하는 방법으로서, 이중 결합 항체는 (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (c) (a)에 제시된 중쇄 가변 영역과 (b)에 제시된 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 이중 결합 항체의 상기 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이고, 상기 방법은 이중 결합 항체의 적어도 VH 및 VL을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포(들)을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 발현되고 단리되며; 상기 단리된 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 이종이량체를 형성한다. 본원에 상세히 개시된 바와 같이, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 암호화하는 단리된 핵산 서열은 벡터 내에 포함될 수 있으며, 여기서 동일한 벡터 또는 상이한 벡터가 사용된다. 일부 구현예에서, 각각의 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인은 상이한 숙주 세포로부터 발현될 수 있으며, 여기서 이량체화는 성분 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인의 단리 또는 정제 후에 발생한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인은 동일한 숙주 세포로부터 발현될 수 있으며, 여기서 이량체화는 성분 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인의 배양 중에 발생하거나 성분 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인의 단리 또는 정제 후에 발생한다.
당업자는 이중 결합 항체를 생산하는 단계가 VH 도메인, VL 도메인, 또는 둘 다를 포함하는 아미노산 폴리펩티드 성분을 합성하는 단계를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 합성은 본원에 상세히 기술된 바와 같은 핵산 작제물로부터 시작된다. 용어 “생산” 및 “합성”은, 일부 구현예에서, 모든 동일한 품질 및 의미를 갖도록 상호 교환적으로 본원에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 포함하는 IgG 중쇄를 합성하는 단계, 변이체 VL 도메인을 포함하는 IgG 경쇄를 합성하는 단계, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 포함하는 IgG 중쇄를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VL 도메인을 포함하는 IgG 경쇄를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 포함하는 IgG 중쇄 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 IgG 경쇄 둘 다를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 포함하는 IgG 중쇄의 단편 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 IgG 경쇄의 단편을 포함하는 Fab를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 포함하는 IgG 중쇄의 단편 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 IgG 경쇄의 단편을 포함하는 F(ab’)2를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 Fv를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 scFv를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 미니바디를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 디아바디를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인 및 변이체 VL 도메인을 포함하는 트리아바디를 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VH 도메인을 합성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 단계는 변이체 VL 도메인을 합성하는 단계를 포함한다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드는 이량체를 형성함으로써 이중 결합 항체 또는 이의 결합 성분을 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법은 이중 결합 VH 도메인을 포함할 수 있는 변이체 VH 도메인을 생성하기 위해, 이중 결합 VH 도메인을 포함하지 않는 템플릿 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법은 이중 결합 VL 도메인을 포함할 수 있는 변이체 VL 도메인을 생성하기 위해, 이중 결합 VH 도메인을 포함하지 않는 템플릿 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법은 이중 결합 VH 도메인을 포함할 수 있는 변이체 VH 도메인을 생성하기 위해, 이중 결합 VH 도메인을 포함하지 않는 템플릿 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계; 및 이중 결합 VL 도메인을 포함할 수 있는 변이체 VL 도메인을 생성하기 위해, 이중 결합 VL 도메인을 포함하지 않는 템플릿 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계를 포함하되, 상기 변이체 VH 및 VL 도메인은 항체의 이중 가변 영역을 포함한다. 핵산 서열을 돌연변이시키는 방법은 상기에서 상세히 기술되었으며, 아래 실시예에 예시되어 있다.
일부 구현예에서, 템플릿 중쇄 가변 영역을 암호화하는 템플릿 핵산 서열은 서열번호 55에 제시된다. 일부 구현예에서, 템플릿 경쇄 가변 영역을 암호화하는 템플릿 핵산 서열은 서열번호 56에 제시된다. 전체적으로 언급된 바와 같이, 템플릿 VH 및 VL 서열은 이중 결합 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법은 VH 및 VL 도메인 내에 적어도 2개의 변이체 부위를 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법은 VH 및 VL 도메인 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 변이체 부위를 도입하는 단계를 포함한다. 변이체 부위는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 분포될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VH 도메인의 CDR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VL 도메인의 CDR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VH 도메인의 FR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VL 도메인의 FR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VH 도메인의 CDR 및/또는 FR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VL 도메인의 CDR 및/또는 FR 영역 내에 있다. 일부 구현예에서, 변이체 부위는 VH 도메인의 CDR 및/또는 FR 영역 내, 및 VL 도메인의 CDR 및/또는 FR 영역 내에 있다.
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 복합체는 숙주 세포 내부에 형성될 수 있다. 예를 들어, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 이종이량체는 관련 효소 및/또는 보조인자의 도움을 받아 숙주 세포 내부에 형성될 수 있다. 소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 폴리펩티드 복합체는 세포 밖으로 분비될 수 있다. 소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 숙주 세포 밖으로 분비되어 숙주 세포 외부에서 이종이량체를 형성할 수 있다.
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 별도로 발현될 수 있고 적절한 조건 하에서 이량체화될 수 있다. 예를 들어, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 적절한 완충액에서 조합되어, 소수성 상호작용과 같은 적절한 상호작용을 통해 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인이 이량체화되도록 할 수 있다. 또 다른 예로, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인의 이량체화를 촉진할 수 있는 효소 및/또는 보조인자를 함유하는 적절한 완충액에서 조합될 수 있다. 또 다른 예로, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 적절한 비히클에서 조합되어, 적절한 시약 및/또는 촉매의 존재 하에 이들이 서로 반응하도록 할 수 한다.
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 더 긴 폴리펩티드 서열 내에 포함될 수 있으며, 여기에는 예를 들어 불변 영역, 힌지 영역, 링커 영역, Fc 영역, 또는 이황화 결합 영역, 또는 이들의 임의의 조합이 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 불변 도메인은 불변 영역의 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl)으로도 지칭되는 면역글로불린 분자의 불변 부분의 면역글로불린 접힘 단위이다. 일부 구현예에서, 더 긴 폴리펩티드는 예를 들어 이중 결합 항체가 디아바디 또는 트리아바디를 포함할 때(이에 한정되지는 않음) 변이체 VH 도메인, 변이체 VL 도메인, 또는 둘 모두의 다수의 카피를 포함할 수 있다.
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 DNA 합성 및 PCR, 및 이들의 생성된 뉴클레오티드 서열의 번역에 의해 생성된다. 소정의 구현예에서, 생성된 서열은 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 소정의 구현예에서, 생성된 서열은 2개의 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드이다. 소정의 구현예에서, 상기 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인은 IgG 템플릿 상에서 작제되고, 상기 IgG 템플릿은 이중 결합 능력을 갖지 않는다.
소정의 구현예에서, 일시적인 발현은 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 암호화하는 발현 벡터를 적절한 세포 내로 공동 형질감염시키거나, 둘 다를 암호화하는 발현 벡터를 적절한 세포 내로 형질감염시킴으로써 수행된다. 당업자는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 다수의 형질감염 방법 및 프로토콜이 있음을 이해할 것이다. 소정의 구현예에서, 형질감염 또는 공동 형질감염은 PEI 방법을 사용하여 실행된다.
변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 발현된 폴리펩티드는 임의의 적절한 방법을 사용하여 수집될 수 있다. 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체는 원형질막 주위 공간에서 세포 내 발현되거나, 세포의 외부에서 배지 내로 분비될 수 있다. 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드가 세포 내 발현되는 경우, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드를 함유하는 숙주 세포는 용해될 수 있고, 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체는 원심분리 또는 한외여과에 의해 원하지 않는 부스러기를 제거함으로써 용해물로부터 단리될 수 있다. 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드가 대장균의 원형질막 주위 공간 내로 분비되는 경우, 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 제제의 존재 하에 세포 덩어리(cell paste)를 약 30분에 걸쳐 해동할 수 있고, 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다(Carter 등의 문헌[BioTechnology 10:163-167 (1992)]). 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우, 세포 배양물의 상청액을 수집하여 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amincon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용해 농축시킬 수 있다. 단백질 분해 및/또는 오염된 미생물의 성장을 억제하기 위한 프로테아제 억제제 및/또는 항생제를 수집 및 농축 단계에 포함시킬 수 있다.
변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 발현된 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 이온 교환 컬럼을 이용한 이온 교환 분획화, 에탄올 침강, 역상 HPLC, 실리카를 이용한 크로마토그래피, 헤파린 세파로오스를 이용한 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼)를 이용한 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침강과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 적절한 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다(검토를 위해서 Bonner, P. L.의 문헌[Protein purification, published by Taylor & Francis, 2007]; Janson, J. C. 등의 문헌[Protein purification: principles, high resolution methods and applications, published by Wiley-VCH, 1998]을 참조함).
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 이량체 복합체를 포함하는 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 소정의 구현예에서, 항체 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인으로부터 유래된 성분을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체를 정제하는 데 단백질 A 크로마토그래피 또는 단백질 A/G(단백질 A 및 단백질 G의 융합 단백질) 크로마토그래피가 유용할 수 있다(Lindmark 등의 문헌[J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]; Zettlit, K. A.의 문헌[Antibody Engineering, Part V, 531-535, 2010]). 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체는 단백질 A에 결합하지 않는다. 소정의 구현예에서, IgGγ3 중쇄를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체의 정제에는 단백질 G 크로마토그래피가 유용할 수 있다(Guss 등의 문헌[EMBO J. 5:1567 1575 (1986)]). 소정의 구현예에서, K 경쇄를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체의 정제에는 단백질 L 크로마토그래피가 유용할 수 있다(Sudhir, P.의 문헌[Antigen engineering protocol, Chapter 26, published by Humana Press, 1995]; Nilson, B. H. K. 등의 문헌[J. Biol. Chem., 267, 2234-2239 (1992)]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스가 가장 흔히 아가로오스이지만, 다른 매트릭스가 이용 가능하다. 공극 조절식 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같이 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속으로 더 짧은 시간에 가공하는 것을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 이중 결합 항체 및 오염물이 포함된 혼합물을 대상으로 약 2.5~4.5의 pH의 용리 완충액을 사용해 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 바람직하게는 낮은 염 농도(예를 들어 약 0~0.25 M 염)에서 수행할 수 있다.
소정의 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인 및/또는 폴리펩티드 이량체 복합체를 포함하는 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 당업자는 이러한 목적을 적합한 다수의 방법 및 프로토콜이 있음을 이해할 것이다. 소정의 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 및 SEC에 의한 단백질 정제는 AKTA pure 기기(GE Lifesciences)를 사용하여 수행된다. 소정의 구현예에서, 이중 결합 항체의 친화도 포획은 수확된 상청액을 CaptureSelect™ CH1-XL 친화도 매트릭스(Thermo Scientific)의 컬럼에 통과시킴으로써 달성된다. PBS로 컬럼을 세척한 후, 0.1 M 글리신, pH 2.5로 단백질을 용리하고, 1/6 부피의 1M 트리스-HCl, pH 8.0으로 즉시 중화시킨다. 그런 다음, 친화도 정제된 단백질을 Amicon 30kD 농축기(Merck Millipore)를 사용하여 5~10 mg/ml로 농축시키고, PBS로 평형화된 Superdex®200 컬럼(GE Lifesciences)을 이용해 SEC 정제를 수행한다. 그런 다음, 단백질 분획을 수집하고 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC를 사용하여 분석한다.
합성된 이중 결합 면역글로불린의 에피토프에 대한 결합은 ELISA 분석, SPR 분석, DSF 분석, 및 세포 기반 결합 분석을 포함하여, 본원에 기술된 바와 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 합성하는 방법으로서, 상기 이중 결합 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 템플릿 아미노산 서열을 포함하되, 상기 템플릿은 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 템플릿 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이고; 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
템플릿 중쇄 가변 영역, 템플릿 경쇄 가변 영역, 또는 둘 다를 돌연변이시키는 단계로서,
상기 템플릿 중쇄 가변 사슬 영역을 돌연변이시키는 상기 단계는 서열번호 1에 제시된 템플릿 중쇄 가변 영역을 돌연변이시키는 단계를 포함하되, 상기 선택된 템플릿 가변 사슬은 이중 결합 영역을 포함하지 않고,
상기 템플릿 경쇄 가변 사슬 영역을 돌연변이시키는 상기 단계는 서열번호 2에 제시된 템플릿 경쇄 가변 영역을 돌연변이시키는 단계를 포함하되, 상기 선택된 템플릿 가변 사슬은 이중 결합 영역을 포함하지 않고,
상기 템플릿 중쇄 가변 영역 및 상기 템플릿 경쇄 가변 영역 둘 다를 돌연변이시키는 상기 단계는 서열번호 1에 제시된 템플릿 중쇄 가변 영역을 돌연변이시키고, 서열번호 2에 제시된 템플릿 경쇄 가변 영역을 돌연변이시키는 단계를 포함하되, 상기 선택된 템플릿 가변 사슬들 모두는 이중 결합 영역을 포함하지 않고, 상기 돌연변이시키는 단계는 상기 템플릿 중쇄 가변 영역, 상기 템플릿 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합에서 적어도 2개의 잔기 위치를 돌연변이시키는 단계를 포함하는, 단계;
돌연변이된 템플릿 변이체 중쇄 가변 사슬 및 돌연변이된 템플릿 변이체 경쇄 가변 사슬을 합성하는 단계;
상기 돌연변이된 템플릿 변이체 중쇄 가변 사슬 및 상기 돌연변이된 템플릿 변이체 경쇄 가변 사슬을 인간 항체 포맷으로 포매팅하는 단계; 및
이중 항원에 대한 결합에 대해 단계 (c)의 인간 항원을 스크리닝하여,
이중 결합 항체를 생산하는 단계.
본원에 기술되고 아래에 예시된 바와 같이, 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG1 면역글로불린, IgG2 면역글로불린, IgG3 면역글로불린, 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG1 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG2 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG3 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 IgG1 면역글로불린 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다.
일부 구현예에서, 합성된 항체는 Fab 면역글로불린 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 F(ab’)2 면역글로불린 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 Fv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 scFv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 단쇄 Fv 단편을 포함하는 미니바디 면역글로불린 작제물을 포함한다.
일부 구현예에서, 합성된 항체는 디아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 서로 공유 연결된 3개의 scFv 단편을 포함하는 디아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 트리아바디를 포함한다.
일부 구현예에서, 합성된 항체는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG를 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG1을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 항체는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG4를 포함한다.
면역글로불린 라이브러리
소정의 구현예에서, 본원에 상술된 것과 같은 변이체 VH 도메인, 변이체 VL 도메인, 또는 변이체 VH 및 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리가 본원에 개시된다(하기 실시예 참조). 변이체 VH 도메인, 변이체 VL 도메인, 또는 변이체 VH 및 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리는 일부 구현예에서, 이중 결합 항체, 이의 단편, 또는 이의 성분에 대해 스크리닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리는 가변 중쇄 도메인의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리는 가변 경쇄 도메인의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 또는 이의 단편의 라이브러리는 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인의 라이브러리를 포함한다.
일부 구현예에서, 에피토프에 대한 결합에 대해 스크리닝하기 위해 이중 항원 결합 면역글로불린 가변 중쇄 영역의 라이브러리를 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 서열번호 1에 제시된 VH 템플릿 항원 결합 분자를 선택하는 단계로서, 상기 선택된 템플릿은 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단계; (b) 상기 템플릿 서열번호 1에서 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합)으로부터 돌연변이시키기 위한 적어도 하나의 잔기 위치를 선택하는 단계; 및 (c) 상기 템플릿 VH의 복수의 변이체를 함유하는 라이브러리가 생성되도록, 단계 (b)에서 선택된 적어도 하나의 잔기 위치에서 치환할 적어도 하나의 변이체 잔기를 선택하는 단계. 일부 구현예에서, 에피토프에 대한 결합에 대해 스크리닝하기 위해 이중 항원 결합 면역글로불린 가변 경쇄 영역의 라이브러리를 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 서열번호 2에 제시된 VL 템플릿 항원 결합 분자를 선택하는 단계로서, 상기 선택된 템플릿은 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단계; (b) 상기 템플릿 서열번호 2 내의 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합)으로부터 돌연변이시키기 위한 적어도 하나의 잔기 위치를 선택하는 단계; 및 (c) 상기 템플릿 VL의 복수의 변이체를 함유하는 라이브러리가 생성되도록, 단계 (b)에서 선택된 적어도 하나의 잔기 위치에서 치환할 적어도 하나의 변이체 잔기를 선택하는 단계.
일부 구현예에서, 에피토프에 대한 결합에 대해 스크리닝하기 위해, 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 포함하는 이중 항원 결합 면역글로불린의 라이브러리를 생성하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 서열번호 1에 제시된 VH 템플릿 항원 결합 분자를 선택하는 단계로서, 상기 선택된 템플릿은 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단계; (b) 서열번호 2에 제시된 VL 템플릿 항원 결합 분자를 선택하는 단계로서, 상기 선택된 템플릿은 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단계; (c) 상기 템플릿 서열번호 1 내의 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합)으로부터, 돌연변이시킬 적어도 하나의 잔기 위치를 선택하는 단계; (d) 상기 템플릿 서열번호 2 내의 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합)으로부터, 돌연변이시킬 적어도 하나의 잔기 위치를 선택하는 단계; 및 (e) 각각의 잠재적 이중 결합 면역글로불린 내의 변이체 잔기의 총 수가 적어도 2개가 되도록, 단계 (c)에서 선택된 적어도 하나의 잔기 위치에서 치환시킬 적어도 하나의 변이체 잔기를 선택하거나 단계 (d)에서 선택된 적어도 하나의 잔기 위치에서 치환시킬 적어도 하나의 변이체 잔기를 선택함으로써, 상기 템플릿 VH의 복수의 변이체 및 상기 템플릿 VL의 변이체를 함유하는 라이브러리를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 라이브러리를 작제하는 방법은 실시예에서 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생성된 라이브러리는 이중 표적에 결합하는 면역글로불린을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생성된 라이브러리는 특이적 에피토프에 결합하는 면역글로불린을 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 상술된 것과 같은 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리를 사용해 이중 표적에 결합하는 면역글로불린을 식별하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 상술된 것과 같은 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리를 사용해 특이적 에피토프에 결합하는 면역글로불린을 식별하는 방법을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리는 항체 분자의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리는 IgG 분자의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG 분자는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이 IgG 분자이다.
일부 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리는 Fab 또는 F(ab’)2 분자의 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 면역글로불린을 포함하는 단백질 라이브러리는 Fv 분자, scFv 분자, 미니바디 분자, 디아바디 분자, 또는 트리아바디 분자의 라이브러리를 포함한다.
일부 구현예에서, 기존의 면역글로불린 VH 및 VL 템플릿은 상기 변이체 VH 및 VL 도메인에서 이중 항원 결합 부위를 생성하는 것을 목표로 특정 위치에 변이체 아미노산을 도입하도록 변경될 수 있으며, 여기서 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2개의 변이체 위치를 갖는 적어도 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 또는 1,000,000개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2개의 변이체 위치를 갖는 1,000 내지 1,000,000개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2개의 변이체 위치를 갖는 10,000 내지 1,000,000개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개, 또는 그 이상의 변이체 위치를 갖는 1,000 내지 1,000,000개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개, 또는 그 이상의 변이체 위치를 갖는 10,000 내지 1,000,000개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개, 또는 그 이상의 변이체 위치를 갖는 106 내지 1014개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 VH 및 VL 도메인의 단백질 라이브러리는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개, 또는 그 이상의 변이체 위치를 갖는 106 내지 1014개의 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 포함한다.
그런 다음, 라이브러리를 하나 이상의 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝한다. 원하는 특성에 대해 분자를 특성 분석한 후, 선택된 항체 도메인 또는 영역, 예를 들어 VH 또는 VL 도메인 또는 둘 모두(이에 한정되지는 않음)를 유전자 조작 기술에 의해 면역글로불린 분자 내로 클로닝하여 상응하는 영역을 대체한다. 대안적으로, VH, 또는 VL, 또는 둘 다를 코딩하거나 돌연변이된 아미노산을 코딩하는 DNA만을 교체하여 분자에 대한 추가 결합 부위를 갖는 면역글로불린을 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 영역을 클로닝할 면역글로불린 분자의 선택은 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab′)2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 일부 구현예에서, IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이체 IgG를 포함한다.
일부 구현예에서, 발현된 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCD3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3에 대해 전술한 바와 같으며, 여기서 특정 위치는 위에서 상술되었고 도 1a 및 1b에 나타낸 것과 같은 변이체 아미노산을 포함한다.
돌연변이를 위한 부위는 위에 기술되어 있고, 소정의 구현예에서는 상기 템플릿 서열번호 1의 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합), 및 템플릿 서열번호 2의 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 VH 템플릿 또는 상기 VL 템플릿 내의 추가 부위가 돌연변이될 수 있다.
소정의 구현예에서, 라이브러리를 생성하는 방법은 위에서 상세히 기술한 상기 핵산 작제물로부터 템플릿 변이체(VH, VL, 또는 VH 및 VL 둘 다)를 합성하여 라이브러리를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 것과 같은 라이브러리 생성의 결과물은 면역글로불린의 라이브러리를 포함하고, 상기 면역글로불린의 라이브러리는: (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (c) (a)에 제시된 중쇄 가변 영역 및 (b)에 제시된 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하되, 여기서 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변위체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
포유류 세포 발현 시스템을 위에서 기술하였다. 이들 발현 시스템은 잠재적 이중 결합 면역글로불린의 라이브러리를 생성하기 위한 치료 항체를 생성하는 데 있어서 많은 잠재적 이점을 제공하며, 여기에는 세포 표면 상에서 기능적 당질화된 IgG를 나타내면서, 높은 수준의 발현 및 안정성과 같은 주요 제조 관련 특성을 공동 선택하는 능력이 포함된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린의 라이브러리는 IgG 분자, Fab 분자, F(ab′)2 분자, FV 분자, VH 분자, VL 분자, scFv 분자, 디아바디, 미니바디, 또는 트리아바디를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG1은 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이된 IgG1을 포함한다.
일부 구현예에서, 원하는 특성(예: 결합 친화도, 안정성 등)을 갖는 이중 결합 분자를 선택하기 위해, 항원 분자 또는 이의 일부로 라이브러리를 스크리닝하는 것에 관한 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 항원의 일부는 적어도 하나의 IL-13 항원성 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 스크리닝 후에 라이브러리로부터 단리된 이중 결합 분자가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 이중 결합 분자에 대해, 기술된 것과 같은 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은: (a) 항원 분자 또는 이의 단편으로 라이브러리를 스크리닝하여 상기 관심 에피토프에 결합하는 이중 결합 분자를 식별하는 단계; (b) 단계 (a)에서 식별된 결합제를 시퀀싱하여 어느 잔기가 변이체이고 어느 변이체 잔기가 결합 면역글로불린에서 풍부한지를 결정하는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 정보를 사용하여 이중 결합제의 최적화된 변이체 라이브러리를 합성하는 단계; 및 (d) 최적화된 라이브러리를 사용하여 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 분자에 대해, 기술된 것과 같은 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은: (a) 관심 에피토프로 라이브러리를 스크리닝하여 상기 관심 에피토프에 결합하는 이중 결합 분자를 식별하는 단계; (b) 단계 (a)에서 식별된 결합제를 시퀀싱하여 어느 잔기가 변이체이고 어느 변이체 잔기가 결합 면역글로불린에서 풍부한지를 결정하는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 정보를 사용하여 이중 결합제의 최적화된 변이체 라이브러리를 합성하는 단계; 및 (d) 최적화된 라이브러리를 사용하여 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 항원 분자에 대한 변이체 면역글로불린의 특이적 결합은 면역학적 검정으로 이루어진 군으로부터 선택된 결합 검정에 의해 결정되며, 여기에는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 표면 플라스몬 공명 검정, 포화 전달 차이 핵 자기 공명 분광법, 전달 NOE(trNOE) 핵 자기 공명 분광법, 경쟁 검정, 조직 결합 검정, 활세포 결합 검정, 및 세포 추출물 검정이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
결합 검정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기에는 FRET(형광 공진 에너지 전달) 및 BRET(생물발광 공진 에너지 전달) 기반 검정, AlphaScreen™ (증폭된 발광 근접 균질 검정), 섬광 근접 검정, ELISA(효소-결합 면역흡착 검정), SPR(표면 플라스몬 공명, BIACORE®로도 알려짐), 등온 적정 열량측정, 시차주사 열량측정, 겔 전기영동, 및 크로마토그래피(겔 여과 포함)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 이들 및 다른 방법에는 일부 융합 파트너 또는 표지가 이용될 수 있다.
변이체 면역글로불린은, 일부 구현예에서, 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 착색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 금속 복합체, 금속, 콜로이드성 금, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 표지에 접합된다. 표지에 대한 접합은, 소정의 구현예에서, 예를 들어 결합 검정(예: ELISA) 및 결합 연구에서 상기 접합체의 간단한 검출을 가능하게 한다.
사용 조성물
일부 구현예에서, 본원에서 상술된 것과 같은 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 기술되며, 이는 치료제를 제공한다. 일부 구현예에서, 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는 돌연변이체 IgG를 포함하는 치료제를 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 알레르기성 또는 호흡기 병태에 대한 치료 특성을 갖는 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다. 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인, 및 이의 쌍의 아미노산 서열은 위에서 상세히 기술되었다(예를 들어, 표 1 참조하되 이에 한정되지는 않음).
소정의 구현예에서, 조성물은 본원에 개시된 단리된 이중 결합 항체 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 표 8 또는 표 4에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 표 9 또는 표 5에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 갖는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 209 및 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 219 및 220의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 249 및 250의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 서열번호 337 및 338의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 개시된 VH 및 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이중 결합 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물은 변이체 VH, 변이체 VL, 또는 변이체 VH 및 변이체 VL을 포함하는 본원에 기술된 임의의 이중 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (a)에 제시된 중쇄 가변 영역과 (b)에 제시된 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하되, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
당업자는 일부 구현예에서, 용어 “이중 결합 항체”가 모든 동일한 의미 및 품질을 갖는 용어 “약물” 또는 “제제”와 상호교환적으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 포함하는 약물은 약학적 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체를 포함하는 조성물, 및 다양한 치료 환경에서 이러한 조성물을 투여하는 것이 본원에 기술된다.
본원에 기술된 이중 결합 항체를 순수한 형태로 또는 적절한 약학적 조성물로 투여하는 것은 유사한 효용을 제공하는 제제의 허용된 투여 방식 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다. 약학적 조성물은 이중 결합 항체 또는 이중 결합 항체 함유 조성물을 적절한 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합함으로써 제조될 수 있고, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 미소구체, 및 에어로졸과 같은 고형분, 반고형분, 액체, 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 또한, 다른 약학적 활성 성분 및/또는 염, 완충액, 및 안정화제와 같은 적절한 부형제가 조성물 내에 존재할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 투여는 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 피내, 피하, 또는 국소를 포함하는 다양한 상이한 경로에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 방식은 치료 또는 예방 대상 병태의 성질에 따라 달라진다. 투여 후에는, 암의 진행 및/또는 전이를 감소, 억제, 예방, 또는 지연시키는 양이 효과적인 것으로 간주된다. 당업자는, 용어 “생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제”가 일부 구현예에서 모든 동일한 의미와 품질을 갖는 용어 “약학적으로 허용 가능한 담체”와 상호 교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 단일 선형 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 벡터 상에 존재하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상이한 벡터 상에 존재하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 변이체 VH 또는 변이체 VL 도메인 또는 이들의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 동일한 뉴클레오티드 서열이 변이체 VH 또는 변이체 VL 도메인 또는 이들의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 서열이 변이체 VH 또는 변이체 VL 도메인 또는 이들의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나의 뉴클레오티드 서열은 변이체 VH 도메인을 암호화하고 다른 뉴클레오티드 서열은 변이체 VL 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나의 뉴클레오티드 서열은 변이체 VH 도메인을 암호화하고, 또 다른 뉴클레오티드 서열은 이들 사이에 링커 서열을 갖는 변이체 VL 도메인을 암호화함으로써 Duperret EK 등의 문헌[Cancer Res, Oct. 4 ( doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-1429)]에 기술된 것과 같이 변이체 VH 및 변이체 VL 도메인을 이종이량체화할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 병태 또는 호흡기 병태 또는 이의 조합를 치료하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 변이체 VH 도메인; 및 (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 변이체 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을, 상기 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 병태 또는 호흡기 병태 또는 이의 조합를 치료하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 변이체 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을, 상기 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 병태 또는 호흡기 병태 또는 이의 조합를 치료하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 변이체 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을, 상기 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계.
사용 방법
일부 구현예에서, 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 것과 같은 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 알레르기성 또는 호흡기 병태, 염증성 또는 자가면역 병태, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 천식, 알레르기성 천식, 비알레르기성 천식, 중증 천식, 경증 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기도 염증을 포함하는 병태, 낭성 섬유증, 알러지성 폐 질환, 기도 과민증, 배상 세포 화생, 점액 과다분비, 기도 개형, 폐 섬유증, 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 장위염, 알레르기성 비염, 염증성 장 질환, 간경변증 또는 섬유증, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부 경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 다음 단계를 포함한다: HCDR(본원에서 상술된 것과 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3; 예를 들어 표 8 또는 표 4 참조)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부 경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 다음 단계를 포함한다: LCDR(본원에서 상술된 것과 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3; 예를 들어 표 9 또는 표 5 참조)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부 경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 다음 단계를 포함한다: HCDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 LCDR(본원에서 상술된 것과 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계.
소정의 구현예에서, 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 이중 결합 항체로서,
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 이중 결합 항체; 또는 서열번호149~154의 서열을 갖는 CDR을 포함하는 이중 결합 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 이중 결합 항체로서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 이중 결합 항체를 투여하는 단0계를 포함한다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 서열번호 209 및 210, 서열번호 219 및 220, 서열번호 249 및 250, 서열번호 337 및 338, 서열번호 155 및 156, 서열번호 157 및 158의 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함하는 이중 결합 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 서열을 갖는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 이중 결합 항체는 (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (a)에 제시된 중쇄 가변 영역과 (b)에 제시된 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 2개이고, 상기 방법은 상기 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해, 상기 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 이중 결합 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 내의 변이체 위치의 총 수는 2개이고, 상기 방법은 상기 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해, 상기 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 이중 결합 항체는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역 내의 변이체 위치의 총 수는 2개이고, 상기 방법은 상기 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해, 상기 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 방법은 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 이중 결합 항체는 (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 2개이고, 상기 방법은 상기 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물이 투여되지 않는 대상체와 비교해, 상기 대상체에서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료한다.
알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않는다. 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된, 그러나 이에 한정되지는 않는, 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 임의의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한(예를 들어 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VH 도메인은 서열 번호 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 및 347 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, VH 도메인은 본원에 개시된 VH 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하다.
당업자는, 서열 동일성 백분율을 다수의 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 애플리케이션 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어 (이에 한정되지는 않음) 국립 생명공학 정보 센터(National Center of Biotechnology Information, NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 기본 파라미터로 사용하여 결정할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다. 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된, 그러나 이에 한정되지는 않는, 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 임의의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53, 및 임의의 중쇄 가변 영역 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한) 서열을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체의 VL 도메인은 서열 번호 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 및 348 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, VL 도메인은 본원에 개시된 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하다.
알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 및 54 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않고; 변이체 경쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 및 53 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않는다. 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 쌍의 아미노산 서열은 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 및 서열번호 54 및 53에 제시된 쌍 서열로부터 선택되지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, VH-VL 쌍의 아미노산 서열은 다음 중 어느 하나에 제시된 쌍 서열로부터 선택된다: 서열번호 209 및 210, 서열번호 211 및 212, 서열번호 213 및 214, 서열번호 215 및 216, 서열번호 217 및 218, 서열번호 219 및 220, 서열번호 221 및 222, 서열번호 223 및 224, 서열번호 225 및 226, 서열번호 227 및 228, 서열번호 229 및 230, 서열번호 231 및 232, 서열번호 233 및 234, 서열번호 235 및 236, 서열번호 237 및 238, 서열번호 239 및 240, 서열번호 241 및 242, 서열번호 243 및 244, 서열번호 245 및 246, 서열번호 247 및 248, 서열번호 249 및 250, 서열번호 251 및 252, 서열번호 253 및 254, 서열번호 255 및 256, 서열번호 257 및 258, 서열번호 259 및 260, 서열번호 261 및 262, 서열번호 263 및 264, 서열번호 265 및 266, 서열번호 267 및 268, 서열번호 269 및 270, 서열번호 271 및 272, 서열번호 273 및 274, 서열번호 275 및 276, 서열번호 277 및 278, 서열번호 279 및 280, 서열번호 281 및 282, 서열번호 283 및 284, 서열번호 285 및 286, 서열번호 287 및 288, 서열번호 289 및 290, 서열번호 291 및 292, 서열번호 293 및 294, 서열번호 295 및 296, 서열번호 297 및 298, 서열번호 299 및 300, 서열번호 301 및 302, 서열번호 303 및 304, 서열번호 305 및 306, 서열번호 307 및 308, 서열번호 309 및 310, 서열번호 311 및 312, 서열번호 313 및 314, 서열번호 315 및 316, 서열번호 317 및 318, 서열번호 319 및 320, 서열번호 321 및 322, 서열번호 323 및 324, 서열번호 325 및 326, 서열번호 327 및 328, 서열번호 329 및 330, 서열번호 331 및 332, 서열번호 333 및 334, 서열번호 335 및 336, 서열번호 337 및 338, 서열번호 339 및 340, 서열번호 341 및 342, 서열번호 343 및 344, 서열번호 345 및 346, 서열번호 347 및 348.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 서열번호 149~154의 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 이중 결합 항체는 서열번호 155 및 156 또는 서열번호 157 및 158의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 서열번호 349, 350, 및 351에 제시된 서열을 각각 갖고, 서열번호 359, 360, 및 361에 제시된 서열을 각각 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 서열번호 349, 356, 및 351에 제시된 서열을 각각 갖고, 서열번호 364, 360, 및 371에 제시된 서열을 각각 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 서열번호 349, 350, 및 351에 제시된 서열을 각각 갖고, 서열번호 362, 360, 및 384에 제시된 서열을 각각 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 서열번호 349, 350, 및 351에 제시된 서열을 각각 갖고, 서열번호 364, 360, 및 384에 제시된 서열을 각각 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 CDR은 표 8 또는 표 4, 및 표 9 또는 표 5에 제시된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 서열번호 209 및 210의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 서열번호 219 및 220의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 서열번호 249 및 250의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 서열번호 337 및 338의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 이상의 병태를 치료하는 방법은, 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 본원에 개시된 VH 및 VL 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하다.
변이체 VH 및 VL 도메인은, 템플릿 서열을 재-에피토프화함으로써 이들 변이체 VH 및 VL 도메인을 생성하는 방법을 포함하여, 위에서 상세히 기술되었다. 상기 개시 내용은 그 전체가 본원에 통합되어 있으며, 여기서 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암을 치료하는 방법은 본원에 기술된 임의의 변이체 VH 또는 VL 도메인을 사용하는 것을 포함한다.
당업자는 용어 “치료(treating)” 및 이의 문법적 형태가, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 알레르기성 또는 호흡기 병태에 대한 치료적 치료 및 예방적(prophylatic 또는 preventive) 조치 둘 다를 포함할 수 있고, 그 목적은 알레르기성 또는 호흡기 병태, 또는 이의 증상, 또는 이들의 조합을 치료, 예방, 감소, 또는 완화시키는 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, 예를 들어 상기 질환 또는 장애가 알레르기성 또는 호흡기 병태를 포함하는 경우에, 치료는 질환, 장애, 또는 병태에 직접적으로 영향을 미치는 것, 또는 이를 치유하는 것, 저해하는 것, 억제하는 것, 예방하는 것, 이의 중증도를 감소시키는 것, 이의 발병을 지연시키는 것, 이와 연관된 증상을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, “치료”는 숙주 면역 세포가 세포내 병원균을 파괴하는 능력을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, “치료”는 IL-13 수용체/IL-4 수용체 신호 전달 캐스케이드를 방해하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, “치료”는 IL-13 활성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, “치료”는 IL-13 활성을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, “예방(preventing)”은 알레르기성 또는 호흡기 병태 또는 이의 증상의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, “저해(suppressing)” 또는 “억제(inhibiting)”는 증상의 중증도를 감소시키는 것, 급성 에피소드의 중증도를 감소시키는 것, 증상의 수를 감소시키는 것, 질환 관련 증상의 발생을 감소시키는 것, 증상의 잠복을 감소시키는 것, 증상을 완화시키는 것, 이차 증상을 감소시키는 것, 이차 감염을 감소시키는 것, 환자의 생존을 연장시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 IL-13 연관 장애을 앓고 있는 포유동물, 예를 들어 인간이고, 상기 장애에는 다음이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 호흡기 장애 또는 병태(예: 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식, 예를 들어 어린 아이들에게서 발생하는 예를 들어 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염으로 인한 천식, 그러나 이에 한정되지는 않음), 중증 천식, 경증 천식), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및 기도 염증을 포함하는 다른 병태, 호산구증가증, 섬유증 및 과도한 점액 생성(예: 낭성 섬유증 및 폐 섬유증); 아토피 장애(예: 아토피 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 장위염, 및 알레르기성 비염); 피부, 위장 기관(예: 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병), 및 간(예: 간경변, 섬유증)의 염증성 및/또는 자가면역 질환; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종과 같은 종양 또는 암.
일부 구현예에서, 치료 방법은 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 것, 감소시키는 것, 예방하는 것, 또는 완화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 천식의 증상은 천명, 호흡 곤란, 기관지 수축, 기도 과반응성, 폐 용량 감소, 섬유증, 기도 염증, 및 점액 생성을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 하나 이상의 증상을 치료(예를 들어 감소, 개선)하거나 예방하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이중 결합 항체는 치료적으로 또는 예방적으로 투여되거나 둘 다일 수 있다. 이중 결합 항체는 대상체에게 단독으로 또는 다른 치료 요법과 병용으로 투여될 수 있다.
정확한 투여량 및 치료 지속기간은 치료 중인 질환의 함수이며, 공지된 시험 프로토콜을 사용하여 경험적으로 결정되거나, 당업계에 공지된 모델 시스템에서 조성물을 시험하고 그 결과를 외삽함으로써 결정될 수 있다. 대조군 임상시험이 수행될 수도 있다. 투여량은 완화 대상 병태의 중증도에 따라 달라질 수도 있다. 약학적 조성물은 일반적으로 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 치료적으로 유용한 효과를 발휘하도록 제형화되고 투여된다. 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 다수의 더 작은 투여량으로 나누어져 일정 간격으로 투여될 수 있다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투여 요법은 개체의 필요에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 단독으로 투여되거나, 알레르기성 또는 호흡기 병태, 피부 또는 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 피부경화증; 또는 호지킨 림프종을 포함하는 종양 또는 암의 알려진 다른 치료제와 병용으로 투여될 수 있으며, 상기 이중 결합 항체는 (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (c) (a)에 제시된 중쇄 가변 영역 및 (b)에 제시된 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하고; 여기서 암호화된 중쇄 가변 영역, 암호화된 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
일부 구현예에서, 치료 방법은 HCDR(본원에 기술된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3; 예를 들어, 표 8 또는 표 4 참조)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 LCDR(본원에 기술된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3; 예를 들어, 표 9 또는 표 5 참조)을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 HCDR(본원에 기술된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 포함하는 VH 도메인 및 LCDR(본원에 기술된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중 결합 항체를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 단독으로 투여되거나, 알레르기성 또는 호흡기 병태의 다른 알려진 치료제와 병용으로 투여되며, 여기서 이중 결합 항체는: (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서 암호화된 중쇄 가변 영역 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 단독으로 투여되거나, 알레르기성 또는 호흡기 병태의 다른 알려진 치료제와 병용으로 투여되며, 여기서 이중 결합 항체는: 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서 암호화된 경쇄 가변 영역 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 단독으로 투여되거나, 알레르기성 또는 호흡기 병태의 다른 알려진 치료제와 병용으로 투여되며, 여기서 이중 결합 항체는: (a) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; (b) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하되, 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 여기서 암호화된 중쇄 가변 영역, 암호화된 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합 내의 변이체 위치의 총 수는 적어도 2개이다.
알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 작제물은 서열번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 105, 및 107 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 경쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 뉴클레오티드 작제물은 서열번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 변이체 VH 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 작제물은 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 105, 및 107 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택되고, 변이체 경쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 뉴클레오티드 작제물은 서열 번호 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나에 제시된 서열로부터 선택된다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체 중쇄 가변 영역 - 경쇄 가변 영역 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드 작제물은 서열번호 109~135에 제시된 서열로부터 선택된다.
변이체 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 템플릿 서열을 돌연변이시킴으로써 변이체 VH 및 VL 도메인을 생성하는 암호화하는 이들 뉴클레오티드 서열을 생성하는 방법을 포함하여, 위에서 상세히 기술되었다. 상기 개시 내용은 그 전체가 본원에 통합되어 있으며, 여기서 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법은 본원에 기술된 변이체 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 임의의 핵산 작제물을 사용하는 것을 포함한다.
알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중 결합 항체는 IgG 면역글로불린을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린, IgG2 면역글로불린, IgG3 면역글로불린, 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG2 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG3 면역글로불린을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG4 면역글로불린을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 IgG1 면역글로불린 또는 IgG4 면역글로불린을 포함한다.
알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 돌연변이된 IgG를 포함하고, 상기 돌연변이체 IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 돌연변이된 IgG1을 포함하고, 상기 돌연변이체 IgG1은 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 돌연변이된 IgG4를 포함하고, 상기 돌연변이체 IgG4는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없다.
알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 Fab 면역글로불린 단편을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 F(ab’)2 면역글로불린 단편을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 Fv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 scFv 면역글로불린 작제물을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 단쇄 Fv 단편을 포함하는 미니바디 면역글로불린 작제물을 포함한다.
알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 디아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다. 알레르기성 또는 호흡기 병태를 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 이중 결합 항체는 트리아바디 면역글로불린 작제물을 포함한다.
이들 및 관련된 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물을 투여하는 일반적인 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 구강, 직장, 질, 및 비강내를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본원에 기술된 소정의 구현예에 따른 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물은, 조성물이 환자에게 투여된 후 그 안에 함유된 활성 성분이 생체 이용가능하게 되도록 제형화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있으며, 여기서, 예를 들어 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본원에 기술된 이중 결합 항체의 용기에는 복수의 투여 단위가 담길 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이며; 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)를 참조한다. 투여될 이중 결합 항체 또는 이의 약학적 조성물은 알레르기성 또는 호흡기 병태의 치료를 위한 본 개시의 이중 결합 항체의 치료적 유효량을 어떻게든 함유할 것이다.
약학적 조성물은 고형분 또는 액체의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체(들)는 조성물이, 예를 들어 정제 또는 분말 형태가 되도록 미립자이다. 약학적으로 허용 가능한 담체(들)는 액체일 수 있고, 조성물은, 예를 들어 흡입 투여에 유용한, 예를 들어 경구 오일, 주사식 액체 또는 에어로졸일 수 있다. 경구 투여용으로 의도될 때, 약학적 조성물은 바람직하게는 고형분 또는 액체 형태이며, 여기서 반고형분, 반액체, 현탁액, 및 겔 형태가 고형분 또는 액체로서 본원에서 고려되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여용 고형분 조성물로서, 약학적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 씹는 검, 웨이퍼 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 고형분 조성물은 통상적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 가능한 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 것이다. 또한, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 검 트라가칸스, 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토오스, 또는 덱스트린과 같은 부형제; 알긴산, 알긴산 나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 스테아린산마그네슘 또는 스테로텍스(Sterotex)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향과 같은 와 같은 향미제; 및 착색제. 약학적 조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 약학적 조성물은 상기 유형의 물질에 추가하여 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 액체, 예를 들어 엘릭서, 시럽, 용액, 유화액, 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는, 2개의 예를 들면, 경구 투여용이거나 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도될 때, 바람직한 조성물은 본 화합물에 추가하여, 감미제, 보존제, 염료/착색제, 및 향미 증강제 중 하나 이상을 함유한다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충액, 안정화제, 및 등장제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
액체 약학적 조성물은, 이들이 용액, 현탁액, 또는 기타 유사한 형태인지 여부와 상관없이 다음 보조제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링커 용액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질의 역할을 할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기다 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 완충액, 예컨대 아세트산염, 구연산염 또는 인산염, 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 등장성 조절제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기, 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 생리식염수는 바람직한 보조제이다. 주사식 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이다.
비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 액체 약학적 조성물은 적절한 투여량이 수득되도록 본원에 개시된 것과 같은 이중 결합 항체의 양을 함유해야 한다.
약학적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 약학적으로 허용 가능한 담체는 용액, 유화액, 연고, 또는 겔 베이스를 적절히 포함할 수 있다. 베이스는, 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 벌 왁스, 광유, 물 및 알코올과 같은 희석제, 및 유화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여를 위한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도된 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온영동 장치(iontophoresis device)를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 직장 투여용으로, 예를 들어 직장 내에서 용융되어 약물을 방출하게 되는 좌제의 형태로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적절한 비자극성 부형제로서 유지성 베이스(oleaginous base)를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
약학적 조성물은 고형분 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 일반적으로 불활성이며, 예를 들어 당, 쉘락, 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분(이중 결합 항체)은 젤라틴 캡슐로 둘러 싸일 수 있다. 고형분 또는 액체 형태의 약학적 조성물은 본원에 개시된 것과 같은 항체에 결합하여 화합물의 전달을 보조하는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력을 발휘할 수 있는 적절한 제제는 다른 단클론 또는 다클론 항체, 하나 이상의 단백질, 또는 리포좀을 포함한다. 약학적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 본질적으로 이루어질 수 있다. 에어로졸이란 용어는 콜로이드성 성질의 시스템으로부터 가압된 패키지로 이루어진 시스템에 이르는 다양한 시스템을 나타내는 데 사용된다. 전달은 액화 가스 또는 압축 가스에 의해거나 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단상, 이상성, 또는 삼상성 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달에는 필요한 용기, 활성화제, 밸브, 하부 용기 등을 포함하며, 이들은 함께 키트를 형성할 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
약학적 조성물은 제약 분야에 잘 알려진 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되도록 의도된 약학적 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체 및 임의로 염, 완충액, 및/또는 안정화제 중 하나 이상을 포함하는 조성물을, 용역을 형성하도록 멸균 증류수와 조합함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는, 수성 전달 시스템에서 이중 결합 항체의 용해 또는 균질한 현탁을 용이하게 하기 위해 이중 결합 항체 조성물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.
조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있는데, 이는 다음을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다: 사용된 이중 결합 항체의 활성; 이중 결합 항체의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 및 식단; 투여 방식 및 시간; 배출 속도; 병용 약물; 특정 알레르기성 또는 호흡기 장애 또는 병태의 중증도; 및 치료 중인 대상체.
본 개시의 이중 결합 항체를 포함하거나 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에, 또는 투여 후에 투여될 수도 있다. 이러한 병용 요법은 본원에 개시된 것과 같은 이중 결합 항체 및 하나 이상의 추가 활성제를 함유하는 단일 약학적 투여량 제형을 투여하는 것 뿐만아니라, 본원에 개시된 것과 같은 이중 결합 항체를 포함하는 조성물, 및 각각의 활성제를 이들 고유의 별도 약학적 투여 제형으로 투여하는 것도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체, 또는 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 결합 항체, 및 다른 활성제가 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여 조성물로 함께 환자에게 투여되거나, 각각의 제제가 별도의 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체, 또는 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 결합 항체, 및 다른 활성제가 식염수 용액 또는 생리적으로 서용 가능한 용액과 같은 단일 비경구 투여 조성물로 함께 환자에게 투여되거나, 각각의 제제가 별도의 비경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도 투여 제형이 사용되는 경우, 이중 결합 항체를 포함하거나 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물, 및 하나 이상의 추가 활성제는 본질적으로 동일한 시간에, 즉 동시에 투여되거나, 시차를 두고 별도로, 즉 임의의 순서에 따라 순차적으로 투여될 수 있고; 병용 요법은 이들 요법 모두를 포함하는 것으로 이해된다.
따라서, 소정의 구현예에서, 본 개시의 이중 결합 항체 조성물, 또는 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 하나 이상의 다른 치료제와 병용으로 투여하는 것도 고려된다. 이러한 치료제는 알레르기성 또는 호흡기 병태와 같은, 본원에 기술된 특정 질환 상태에 대한 표준 치료제로서 당업계에 허용될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 반-액체, 또는 고형분일 수 있다. 비경구, 피내, 피하, 또는 국소 도포에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음을 포함할 수 있다: 예를 들어 멸균 희석제(예컨대, 물), 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제(예컨대 벤질 알코올 및 메틸 파라벤, 페놀 또는 크레졸, 수은제, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화 벤즈알코늄, 및 염화 벤즈에토늄); 항산화제(예컨대 아스코르브산 및 중아황산나트륨; 메티오닌, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라아제, 구연산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 및/또는 갈산프로필) 및 킬레이트제(예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)); 완충액(예컨대 아세트산염, 구연산염, 및 인산염). 정맥 내 투여되는 경우, 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 및 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액, 예컨대 포도당, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에 기술된 것과 같은 이중 결합 항체를 포함하는 조성물은, 신체로부터 이중 결합 항체가 신속하게 제거되지 않도록 보호하는 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 서방성 제형(time release formulations) 또는 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 조절 방출형 제형; 및 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산, 및 당업자에게 알려진 다른 것들과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 “면역글로불린” 또는 “적어도 하나의 면역글로불린”은 복수의 면역글로불린을 포함할 수 있고, 여기에는 이들의 혼합물이 포함된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 구현예가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식에서의 설명은 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 완강한 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
수치 범위가 본원에 표시될 때마다, 이는 표시된 범위 내에 임의의 인용된 숫자(분획 또는 통합)를 포함하는 것을 의미한다. 제1 표시 숫자와 제2 표시 숫자 사이의 “범위/사이의 범위” 및 제1 표시 숫자로부터 “범위/로부터 범위”라는 문구는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 제1 및 제2 표시 숫자와 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 실험 절차
목적: 고유한 이중 결합 항체를 생성하는 것.
라이브러리 설계 방법:
IL-13 및 TSLP에 결합하는 이중 결합 항체를 생성하기 위해, 기존 항체에 “재-에피토프화(re-epitoping)” 접근법을 적용하였다. 재-에피토프화 프로세스는 기존의 항체, 예를 들어 3차원 구조를 갖고 생화학적 및 생물물리적 특성이 잘 확립된 알려진 항체에게 새로운 특이성을 도입하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 재-에피토프화된 항체는 새로운 특이성 및 바람직한 발생가능한 특성 둘 다를 가질 가능성이 있다. 간략하게, 재-에피토프화는 새로운 에피토프, 가능하게는 원래 항체의 동족 항원과 무관한 새로운 항원 상에 있는 에피토프를 향해 기존 항체의 재유도하는 것을 가능하게 하는 조작 접근법이다. 재-에피토프화의 연산 프로세스는 두 단계를 필요로 한다: (i) 기존 항체와 새로운 에피토프 사이의 추정 접촉을 식별하는 임의의 연산 분석을 사용하는 단계, 및 (ii) 항체가 새로운 바람직한 에피토프에 결합하는 것을 향상시킬 것으로 예측되는 특이적 돌연변이를 항체 내로 도입하는 것을 제안할 수 있는 임의의 연산 분석 또는 도구를 적용하는 단계. 가능한 이러한 연산 프로세스의 일부 예가 참조 문헌에 제시되어 있다(Ofran Y 등의 US20180068055A1; Nimrod G, 등의 문헌[Cell Rep. 2018 Nov 20;25(8):2121-2131]). 특히, 출발점으로서 템플릿 항체의 가변 도메인의 서열(서열번호 1 - 템플릿 가변 중쇄 서열; 서열번호 2 - 템플릿 가변 경쇄 서열)을 사용해 2개의 라이브러리를 설계하였다.
템플릿 가변 중쇄: QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS (서열번호 1). 템플릿 가변 경쇄: SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL (서열번호 2).
각각의 라이브러리에는 템플릿 원래 서열에 대한 변형을 위해 선택된 21개의 위치가 포함되었다. 이들 위치는 CDR(H2, H3, L1, L2, 및 L3) 및 프레임워크 모두에 위치한다(도 1a~1b). 라이브러리를 변형시키기 위해 다음 위치를 선택하였다(IMGT® 넘버링 방식[the international ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org):
가변 H 사슬 (서열번호 1): 57(H2), 107(H3), 108(H3), 109(H3), 110(H3), 111(H3), 111A(H3), 112A(H3), 112(H3), 113(H3), 114(H3), 117(H3).
가변 L 사슬 (서열번호 2): 27(L1), 28(L1), 38 (FR2), 65(L2), 70(FR3), 94(FR3), 109(L3), 110(L3), 115(L3).
변이체 중쇄/변이체 경쇄 쌍을 포함하는 생성된 IL13/TSLP 결합 항체는 템플릿 시작 서열에 대해 8개의 돌연변이를 함유하는 클론(C2)을 포함하였다(도 1a 및 1b 참조).
라이브러리 작제 방법:
다양성 2*10^14를 암호화하는 축퇴 올리고뉴클레오티드와 연장 PCR을 중첩시켜 5J13 템플릿(PDB5J13) 상에 라이브러리를 작제하였다. 다양성을 도입하기 위한 PCR은 제조사 지침에 따라 Phusion 고충실도 DNA 중합효소(New England Biolabs USA, Cat: M0530)를 사용하여 3단계 반응(98℃에서 30초, 65℃에서 20초, 72℃에서 30초, 30 사이클)으로 수행하였다. PCR 산물을 겔 정제 키트에 의해 겔 정제하고, 프라이머가 없는 가운데, 전술한 바와 같이, 3단계 PCR 반응에서 등몰비로 조립하였다(각각으로부터 100 ng). 상기와 같이 전체 scFv 라이브러리를 PCR 증폭하기 위해 조립된 PCR 산물을 템플릿으로 재사용하고, 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 벡터 서열 5’ 및 3’를 scFv 라이브러리에 첨가하여, 효모 세포에서 상동성 재조합을 효율적으로 수행하였다.
라이브러리 형질전환은 공개된 것과 같이 수행하였다(Benatuil 등의 문헌[(2010) An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng. Des. Sel. 23, 155-159]). 0.2 cm 큐벳(cell projects) 당 400 μl의 효모 현탁액(EBY100, ATCC, USA)을 1:3 벡터 대 삽입물 비율로 4 μg의 선형화 벡터(pCTcon3) 및 12 μg의 DNA 삽입물(scFv Library)과 함께 전기천공하였다(BioRad, USA, GenePulser)(Chao, G. 등의 문헌[Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1, 755-768 (2006)]). 각 라이버러리의 형질전환체의 수는 형질전환된 세포의 연속 희석에 의해 약 1X108인 것으로 결정하였다(Benatuil 등의 전술한 (2010) 문헌).
효모 표면 디스플레이를 사용하여 스크리닝 및 선택하는 방법:
효모로 표시된 scFv 라이브러리를 SDCAA 선택 배지에서 성장시키고, 확립된 프로토콜(Chao 등의 전술한 (2006) 문헌)에 따라 2% w/v 갈락토오스로 30℃에서 밤새 발현을 유도하였다. 라이브러리를 마우스 항 Myc-FITC(Santa Cruze, USA) 및 염소 항 인간 Fc-APC(Jackson Immuno research, USA)를 사용하여 BioRad S3e 형광 활성화 세포 분류기를 이용해 rh-IL-13-Fc(Reprokine, 이스라엘)의 고친화도 결합제에 대해 스크리닝하였다. Zymoprep 키트(Zymo Research, USA)를 사용하여 효모 클론으로부터 플라스미드 DNA를 추출함으로써, 최종 분류에서 단리된 클론을 시퀀싱하고, DNA를 시퀀싱하였다. 선택된 클론을 10nM 재조합 인간 IL-13(rh-IL-13)-Fc 또는 10nM 재조합 인간 TSLP(hTSLP)-Fc와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 전술한 바와 같은 형광 표지된 이차 항체가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 0.1% BSA 완충액에 20분 동안 재현탁하고, 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 수득된 값을 발현 수준 및 양성 대조군(항-IL-13 또는 항 TSLP 결합 항체)에 대해 정규화하였다.
IgG 생산 방법 - 경쇄(LC) 및 중쇄(HC) 가변 영역을 포함하는 IgG의 생산:
선택된 클론의 서열을, pSF-CMV-HuIgG1_HC 및 pSF-CMV-HuLambda_LC (Oxford genetics, Oxford UK)의 클로닝 영역과 5’ 25 bp 영역이 상동인 GeneBlock(GB)으로서 합성하고, GB 코돈 사용을 포유류 발현에 대해 최적화하였다(integrated DNA Technologies. Coralville, Iowa USA). BseRI 및 NcoI를 사용해 pSF-CMV-HuIgG1_HC 및 pSF-CMV-HuLambda_LC를 분해하고, NEBuilder(NEB Ipswich, Massachusetts, USA)를 사용해 LC 및 HC 가변 영역 DNA 단편을 상응하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 제조사의 지침에 따라 발현 벡터를 형질감염시키고 ExpiCHO 발현 시스템(ThermoFisher Scientific, USA)에서 발현시켰다. 간략하게: 25 ml CHO 세포를 37℃에서 6*10^6 세포/ml의 밀도로 성장시키고, 25 μg 발현 벡터(1:2 HC/LC 비율)를 CHO 세포 내로 형질감염시키고, 형질감염 후 20시간차에 세포 성장 조건을 32℃로 변경하고, 120 rpm으로 10일 동안 진탕하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고, 단백질A 비드를 사용하여 상청액으로부터 IgG를 정제한 다음, 이동상의 역할을 하는 PBS를 이용해 Superdex® 200 10/300 증가 컬럼(GE) 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
인간 및 시노몰구스 원숭이 TSLP에 대한 IgG EC50 결합을 결정하는 방법
플레이트(Greiner Bio-One Cat:655081)를 45.5 ng/웰로 인간 또는 시노몰구스 원숭이(cyno) TSLP 항원으로 코팅한 다음, 0.05% tween이 포함된 PBS 중 3% 탈지유로 세척하고 차단하였다. 차단 후, 시험된 IgG를 1nM~1000nM의 농도 범위로 웰에 첨가하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, PBS 중 1:20000으로 희석된 염소 항-인간 Fc-HRP 접합된 이차 항체(Jackson cat:109-035-008)를 첨가하였다. TMB(Southern-Biotech cat:0410-01) 및 정지 용액(Southern-Biotech cat:0412-01)을 각각 사용하여 반응을 진행 및 정지시키고 450 nm에서 판독하였다.
IL-13과 TSLP 간의 IC50 경쟁을 결정하는 방법
1 ng/ul hTSLP로 플레이트를 코팅하고, TBS 0.05% tween(TBS-T)으로 세척하고, TBS-T 2% BSA로 차단하였다. 20nM의 시험된 IgG를 rhIL-13과 함께 0.78nM 내지 200nM의 농도 범위에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 혼합물을 플레이트 상에 10분 동안 로딩하고, 웰을 세척하고, 상기 ELISA EC50 실험에 대해 기술된 것과 같이 항-인간 Fc-HRP 접합체를 사용하여 결합된 IgG를 검출하였다. 이번에 웰에 IL-13을 코팅하였고, 동일한 농도 범위에서 TSLP가 유리 경쟁 리간드의 역할을 한 것을 제외하고는, 동일한 조건을 사용하여 상호 경쟁 실험을 수행하였다.
TSLP-R에 대한 TSLP의 결합을 차단하는 IgG IC50 억제 상수를 결정하는 방법:
150ng/웰의 TSLP-R-Fc 태그(ACRO biosystems TSR-H525a)를 0.015M NaHCO3, pH=9.5에서 희석한 다음, 이를 사용해 96웰 플레이트의 웰(Greiner Bio-One Cat:655081)을 코팅하였다. 그런 다음, 웰을 TBS 0.05% tween(TBS-T)으로 3회 세척하고, 2% BSA(w/v)가 포함된 TBS-T로 차단하였다. 0.11 nM 내지 300nM의 농도 범위의 경쟁자 IgG를 3nM hTSLP-His(ACRO biosystems cat: TSP-H52Hb)와 1시간 동안 혼합한 다음, 혼합물을 96웰 플레이트의 웰에 로딩하고, 10분 동안 인큐베이션한 다음, TBS-T로 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 1:200의 항-His-HRP 접합된 이차 항체를 첨가하였다(Santa Cruz Biothechnology cat SC-8036). TMB(Southern-Biotech cat:0410-01) 및 정지 용액(Southern-Biotech cat:0412-01)을 각각 사용하여 반응을 진행 및 정지시키고 450 nm에서 판독하였다.
ELISA에 의한 특이성 결정 방법
96웰 플레이트(Greiner Bio-One Cat:655081)를 총 250 ng 리간드로 코팅하고, 0.5%(w/v) BSA가 포함된 PBS-T로 차단하고, 100nM IgG와 함께 인큐베이션하였다. 본원에 기술된 TSLP EC50 실험에서와 동일한 시약 및 조건을 사용하여 플레이트를 개발하였다.
MUTZ5 TSLP 리포터 세포주의 교정 방법:
TSLP가 이의 동족 수용체에 결합하는 것을 차단하는 항-TSLP의 시험관 내 활성은 MUTZ5 인간 백혈병 세포주에서 인간 TSLP가 pSTAT5 활성화를 검출하는 것에 기초한다(Francis 등의 문헌[(2016) Hematopoiesis, 101(4):417-426]). MUTZ5 세포주의 hTSLP STAT5 활성화의 EC50 값을 결정하기 위해, 세포를 150 μl, 250x105 세포/웰의 총 부피로 접종하고, 96웰 플레이트에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. STAT5 그런 다음, 0.1 pg/mml 내지 1000 pg/ml의 농도 범위의 TSLP를 30분 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, Fc 차단제(BD bioscience FC Blocker-MIX cat#BD564220)로 차단하고, cytofix 고정 완충액(BD bioscience Cat# 554655)으로 고정시켰다. 90% 메탄올로 세포를 투과화시키고, 세척하고, 항-pSTAT5-PE(BD bioscience cat#562077)로 표지하였다. 처리된 MUTZ5 세포를 CytoFLEX S 유세포 분석기(Beckman) 상에서 pSTST5 활성화에 대해 분석하였다. 단일항 및 pSTAT5에 대해 게이팅된 세포를 pSTAT5 양성으로 표시하였다.
hTSLP에 의한 MUTZ5 pSTAT5 활성화의 IgG IC50 억제를 결정하는 방법
pSTAT5 활성화의 기능적 차단을 시험하기 위해, 0.48 pM 내지 500pM의 농도 범위의 IgG를 14pM hTSLP(ACROBiosystems, cat# TSP-H52Hb)와 혼합하고 30분 동안 인큐베이션한 다음, 추가로 60분 동안 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 고정하고, 표지하고, MUTZ5 세포의 교정에 대해 기술한 것과 같이 분석하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 방법
인간 IL-13에 대한 IgG 결합의 측정: CM5 칩 cat:br10005-30(GE)를 이용해 Biacore 200(GE) 상에서 SPR 분석을 수행하고, 8000RU를 목표로 칩을 일차 포획 Ab(Cat: br-1008-39 GE)와 가교결합시키고, 일차 Ab의 가교결합 후, 시험된 항체를 500RU를 목표로 일차 Ab 상에 고정시켰다. hIL-13(Peprotech) 분석물을 800nM 내지 1.6 nM 범위의 농도로 HEB-EP 완충액에서 스트리밍하여 2배 연속 희석하였다(한 농도에 한 사이클씩). 사이클이 끝난 후, 분석물과 시험된 항체를 칩으로부터 떼어내고, 새로운 시험된 Ab를 전술한 것과 같이 칩 상에 로딩하였다. KD는 정태 조건에서 결정하였다.
시노몰구스 원숭이 IL-13(cIL-13, Sino biological, USA) 및 인간 TSLP에 대한 결합의 측정
SPR 분석은 GLC 칩 cat:176-5011(BioRad)을 이용해 ProteOn™ XPR36(BioRad) 상에서 수행하였다. 5500RU를 목표로, 칩을 일차 포획 Ab(Cat: br-1008-39 GE)와 가교결합시켰다. 시험된 일차 Ab의 가교결합 후, 2000RU를 목표로 항체 33.003 및 33.004를 일차 Ab 상에 고정시켰다. cyno IL-13 분석물을 HEB-EP 완충액에서 200nM 내지 12.5 nM 범위의 농도로 스트리밍하여 2배 연속 희석하였다. KD는 정태 조건에서 결정하였다. hTSLP에 대한 결합 동역학의 측정을 위해, 동일한 조건을 사용하였지만, 3.2 nM 내지 0.2 nM 범위의 농도로 2배 연속 희석할 때는 TSLP이 분석물의 역할을 하였다.
동적 주사 형광(DSF) 방법: 동적 주사 형광은 Niedziela-Majka 등의 2015 문헌에 보고된 것과 같이 측정하되, 약간 변형하여 측정하였다. 간략하게: 아세트산나트륨 pH 5.5 완충액 중 0.3 mg/ml의 시험된 항체를 동일한 완충액 중 20xsypro orange(Thermo Fisher, USA cat#S6650)와 1:1로 혼합하였다. 25℃에서 100℃까지 0.5℃/분으로 설정된 Bio-Rad cfx96 광 사이클러를 이용해 형광의 변화를 측정하였다. Tm은 DSF 용융 곡선의 제1 도함수의 최대값에 상응하는 온도로서 결정하였다. 언급된 경우, 항체를 PBS에서 0.5 mg/ml로 희석하고, 1℃/분의 온도 증분으로 NanoDSF Prometheus NT.48(Nanotemper, Germany)을 사용하여 분석하였다.
세포 기반 검정 방법
HEK-Blue IL-4/IL-13 세포(Invivogen, France Catalog # hkb-il413)를 사용해 IL-13 억제를 결정하였다. HEK-Blue 세포를 DMEM, 4.5 g/l 포도당, 10%(v/v) 소태아 혈청(FBS), 50 U/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 100 mg/ml 노르모신, 2 mM L-글루타민, 10 μg/ml의 블라스티시딘, 및 100 μg/ml의 제오신이 포함된 성장 배지에서 배양하였다. HEK-Blue IL-4/IL-13 세포는 IL-4 및 IL-13에 의해 유도된 STAT6 경로의 활성화를 모니터링하도록 특이적으로 설계된 것이다. 이들 세포는 인간 STAT6 유전자를 HEK293 세포 내로 안정적으로 도입하여 완전히 활성인 STAT6 신호 전달 경로를 수득함으로써 생성하였다. 경로의 다른 유전자는 충분한 양으로 자연적으로 발현된다. HEK-BlueIL-4/이중 세포는 4개의 STAT6 결합 부위에 융합된 IFNβ 최소 프로모터의 조절 하에, 분비된 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP)인 리포터 유전자를 안정적으로 발현한다. HEK-Blue IL-4/IL-13 세포에서 STAT6 경로의 활성화는 리포터 유전자의 발현을 유도한다. 상청액에서 분비되는 SEAP는, SEAP가 존재할 때 자주색/청색으로 변하는 배지인 QUANTI-Blue를 사용하면 쉽게 검출할 수 있다.
HEK-Blue IL-4/IL-13 시스템의 교정 방법
HEK-Blue IL-4/IL-13 세포에서 rh-IL-13에 대한 EC50 값을 결정하기 위해, 37℃, 5% CO2에서 96웰 플레이트에서 50000개 세포(5*10^4 / ELISA 웰)를 rh-IL-13 항체(Peprotech, Israel)와 함께 24시간 동안 0 nM 내지 8.13 nM의 농도로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후, 20 ul의 세포 상청액을 180 μl의 QUANTI-Blue 시약(Invivogen, France)과 함께 2시간 동안 추가로 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 분광 광도계(Synergy Neo2, BioTek Instruments, Inc. USA)를 사용해 620~655nm에서의 흡광도를 측정하여 반응을 분석하였다. 표시된 데이터는 3회 실험의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
IL-13 하류 신호전달의 항체 억제의 IC 50 :
0.4 nM의 rh-IL-13을 다양한 농도의 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, rh-IL-13-항의 혼합물을 200 μl, 50,000 세포/웰의 총 부피로 첨가하고, 96웰 플레이트에서 37℃ 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후, 20 ul의 세포 상청액을 180 μl의 QUANTI-Blue 시약(Invivogen, France)과 함께 2시간 동안 추가로 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 분광 광도계를 사용해 620~655nm에서의 흡광도를 측정하여 반응을 분석하였다. 표시된 데이터는 3회 실험의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 2: 이중 결합 항체의 스크리닝 및 선택
목적: IL-13 및 TSLP에 대해 가장 높은 결합을 갖는 항체를 식별하기 위해 조작된 이중 결합 항체를 스크리닝하는 것.
결과: IL-13 및 TSLP 둘 다에 결합할 라이브러리를 스크리닝하고 선택한 후, 45개의 클론을 선택하고, 단리하고, 및 시퀀싱하여 26개의 고유 중쇄(VH) - 경쇄(VL) 쌍 가변 영역을 생성하였다. 중쇄 및 경쇄 쌍의 아미노산 서열은 표 1(항체 1~26)에 제시되어 있고, 항체 1~26에 대한 중쇄 및 경쇄 scFv의 뉴클레오티드 서열(암호화된 링커 서열 포함)은 표 2에 제시되어 있고, 항체 1~26에 대한 중쇄 및 경쇄 쌍의 핵산 서열은 표 3에 제시되어 있다. 항체 1~26에 대한 클론 ID 번호는 제공된 각각의 “명칭” 앞에 “C#”-로서 제공되는데, 예를 들어, 행 2에서, 클론 C2 가변 영역 쌍은 서열번호 3의 C2 VL 서열 및 서열번호 4의 C2 VH 서열을 포함한다.
이어서, 친화도 성숙 라이브러리를 스크리닝하고, hIL-13 및 hTSLP 둘 다에 YSD 긴밀한 결합을 나타낸 추가의 이중 결합 항체 클론을 식별하였다(Ab 클론 #: 33.023, 33.025, 38.014, 38.015. 38.018, 38.019, 38.021, 38.026, 38.040). 클론 33.023, 33.025, 38.014, 38.015. 38.018, 38.019, 38.021, 38.026, 38.040의 VH/VL 영역의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있고, VH/VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표 3에 제시되어 있다. Ab 클론 #: 33.023, 33.025, 38.014, 38.015. 38.018, 38.019, 38.021, 38.026, 38.040의 VH/VL 쌍의 CDR 영역은 아래 표 4 및 표 5에 제공되어 있다. 이들 클론을 IgG 생산을 위해 선택하였다.
조작된 이중 결합 항체: 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 아미노산 서열(도 1a 및 1b 참조)
Ab # 서열번호 명칭 VL 서열 서열번호 명칭 VH 서열
1 3 C2- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 4 C2- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTAEAFDIWGQGTMVTVSS
2 5 C27- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 6 C27- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
3 7 C19- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 8 C19- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWQLVAEAFDIWGQGTMVTVSS
4 9 C43- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSAIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 10 C43- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWQLVAEAFDIWGQGTMVTVSS
5 11 C5- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 12 C5- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
6 13 C8- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLLGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSAIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 14 C8- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDIWGQGTMVTVSS
7 15 C6- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 16 C6- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWMLVAEAFDLWGQGTMVTVSS
8 17 C3- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 18 C3- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWEWVAEAFDLWGQGTMVTVSS
9 19 C37- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 20 C37- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDMWGQGTMVTVSS
10 21 C32- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSKIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL 22 C32- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
11 23 C38- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSDIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVVFGGGTKLTVL 24 C38- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWEYVAEAFDLWGQGTMVTVSS
12 25 C26- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDGDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVVFGGGTKLTVL 26 C26- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTAEAFDLWGQGTMVTVSS
13 27 C13- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLLGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDGDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVVFGGGTKLTVL 28 C13- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
14 29 C23- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLLGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSEIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 30 C23- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTAEAFDIWGQGTMVTVSS
15 31 C39- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLLGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVVFGGGTKLTVL 32 C39- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTAEAFDLWGQGTMVTVSS
16 33 C17- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSAIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVVFGGGTKLTVL 34 C17- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTSEAFDLWGQGTMVTVSS
17 35 C45- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSEIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 36 C45- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELTSEAFDLWGQGTMVTVSS
18 37 C7- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVL 38 C7- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWLLVAEAFDLWGQGTMVTVSS
19 39 C31- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSDIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDGVVFGGGTKLTVL 40 C31- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
20 41 C15- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDGDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDGVVFGGGTKLTVL 42 C15- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
21 43 C35- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDGVVFGGGTKLTVL 44 C35- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWVLVSEAFDLWGQGTMVTVSS
22 45 C12 - VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSAIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 46 C12 - VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVAEAFDLWGQGTMVTVSS
23 47 C4- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 48 C4- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARSPQWEWVHEAFDMWGQGTMVTVSS
24 49 C41- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNILGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSEIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 50 C41- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARSPQWEWVHEAFDLWGQGTMVTVSS
25 51 C40- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDGVVFGGGTKLTVL 52 C40- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARSPQWEWVHEAFDLWGQGTMVTVSS
26 53 C9- VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDGDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 54 C9- VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARSPQWEWVHEAFDLWGQGTMVTVSS
156 33.023VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHVVFGGGTKLTVL 155 33.023
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
160 33.025VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSLIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDGVVFGGGTKLTVL 159 33.025
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVADIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWYLVAEPFDLWGQGTMVTVSS
170 38.014
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGAKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHVVFGGGTKLTVL 169 38.014
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
172 38.018
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHVVFGGGTKLTVL 171 38.018
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
174 38.019
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDYSSNHVVFGGGTKLTVL 173 38.019
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
176 38.021
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHYVFGGGTKLTVL 175 38.021
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTVYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
178 38.025
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHVVFGGGTKLTVL 177 38.025
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
180 38.026
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTATITCGGNLIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHSSDHVVFGGGTKLTVL 179 38.026
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS
182 38.040
VL		 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNLIGTKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNEDEVVFGGGTKLTVL 181 38.040
VH		 QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFDFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSITHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS
조작된 이중 결합 scFv를 암호화하는 뉴클레오티드 서열: 가변 중쇄 ( VH )-링커-가변 경쇄 ( VL )
Ab # 서열번호 명칭 VH-링커-VL 서열
109 템플릿
VH-L-VL		 CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCAGTTTATTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTACACGAAGCATTCGATATCTGGGGTCAGGGTACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACAATCTGGGCTCTAAGTCTGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATTCCGATCGTCCAAGCTGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGGGGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTTCTTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
1 110 C2-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACGGCGGAAGCATTCGATATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
2 111 C27-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTAGCGGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
3 112 C19-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGCAGTTAGTAGCGGAAGCATTCGATATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
4 113 C43-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGCAGTTAGTAGCCGAAGCATTCGATATATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGCTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
5 114 C5-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTGGCGGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGTGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
6 115 C8-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTGGTAGCCGAAGCATTCGATATCTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGCTGGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGCAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACCACGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
7 116 C6-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGATGTTAGTAGCGGAAGCATTCGATCTATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGGCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
8 117 C3-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATGGGTAGCCGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACCACGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
9 118 C37-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTAGCCGAGGCATTCGATATGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
10 119 C32-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTAGCCGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCAAAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
11 120 C38-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATACGTAGCGGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGATATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
12 121 C26-
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13 122 C13-
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14 123 C23-
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15 124 C39-
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16 125 C17-
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17 126 C45-
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18 127 C7-
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19 128 C31-
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20 129 C15-
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21 130


C35-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGTCTTAGTATCCGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCGGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
22 131 C12 -
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTAGCGGAGGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACATCATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGCAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
23 132 C4-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTCTTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTAGCCCACAGTGGGAATGGGTACACGAAGCATTCGATATGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACAACATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGGTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
24 133 C41-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTCTTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTTCGCCACAGTGGGAATGGGTACACGAAGCATTCGATCTCTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACATCCTGGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGAAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
25 134 C40-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTAGCCCACAGTGGGAATGGGTACACGAAGCATTCGATCTATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACAACATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
26 135 C9-
VH-L-VL 		CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTTCGCCACAGTGGGAATGGGTACACGAAGCATTCGATCTCTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGAGGCGGCAGTTCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATGGCGATCGTCCAAGCTGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
조작된 이중 결합 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열: 가변 경쇄 ( VL ) 및 가변 중쇄 ( VH ) 핵산 서열
Ab # 서열번호 명칭 VL 서열 서열번호 명칭 VH 서열
56 템플릿-VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACAATCTGGGCTCTAAGTCTGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATTCCGATCGTCCAAGCTGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGGGGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTTCTTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 55 템플릿-VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCAGTTTATTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTACACGAAGCATTCGATATCTGGGGTCAGGGTACTATGGTGACCGTTAGCTCT
1 58 C2- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 57 C2- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACGGCGGAAGCATTCGATATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
2 60 C27- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 59 C27- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTAT
GCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTAGCGGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
3 62 C19- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 61 C19- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGCAGTTAGTAGCGGAAGCATTCGATATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
4 64 C43- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGCTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 63 C43- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGCAGTTAGTAGCCGAAGCATTCGATATATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
5 66 C5- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 65 C5- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTGGCGGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
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7 70 C6- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGGCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 69 C6- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGATGTTAGTAGCGGAAGCATTCGATCTATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
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11 78 C38- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGATATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 77 C38- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATACGTAGCGGAAGCATTCGATCTGTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
12 80 C26- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACATCATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATGGCGATCGTCCAAGCGGTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACTAGCTCCGACCACGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 79 C26- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACGGCCGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
13 82 C13- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGCTGGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATGGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACTAGCTCCGACCACGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 81 C13- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAGTGGCGGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
14 84 C23- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGCTGGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGAAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 83 C23- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACGGCGGAAGCATTCGATATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
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16 88 C17- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGCAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACACCAGCTCCGACCACGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 87 C17- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACGTCGGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
17 90 C45- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCGAAATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 89 C45- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGGAATTAACCTCCGAAGCATTCGATCTTTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
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26 108 C9- VL TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATGGCGATCGTCCAAGCTGGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCCAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG 107 C9- VH CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTTCGCCACAGTGGGAATGGGTACACGAAGCATTCGATCTCTGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
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VL		 TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCGTATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACCACAGCTCCGACCATGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
 161 33.023
VH		 CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTGCGTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGTAATCTGGTATGATGGTAGCAATACCCACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGTACTTAAGCGCGGAAGCATTCGATCTATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
164 33.025
VL		 TCTTACGTGCTGACTCAACCACCATCAGTGTCTGTAGCACCAGGCCAGACCGCACGTATTACCTGTGGCGGTAACCTGATCGGCTCTAAGCTGGTTCACTGGTATCAGCAAAAACCAGGCCAGGCACCAGTACTGGTTGTGTACGATGATAGCGATCGTCCAAGCCTGATTCCAGAGCGTTTCAGCGGCTCTAATTCCGGCAACACCGCTACTCTGACTATTTCCCGTGTTGAAGCCGGCGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTCTGGGACTCTAGCTCCGACGGTGTAGTCTTTGGCGGGGGCACCAAACTGACCGTTTTG
 163 33.025
VH		 CAAATGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGTGGGGTAGTGCAACCAGGCCGTTCTCTGCGTCTTAGCTGCGCCGCATCTGGTTTTACCTTTCGTACCTACGGTATGCACTGGGTGCGTCAGGCACCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTCGCAGACATCTGGTATGATGGTAGCAATAAACACTATGCTGACTCAGTCAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGATAACAGCAAGAACACTCTTAACTTACAGATGAACTCTCTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTTTACTACTGTGCCCGTGCACCACAGTGGTACTTAGTAGCGGAACCGTTCGATCTATGGGGCCAGGGCACTATGGTGACCGTTAGCTCT
184 38.014
VL		 AGTTACGTGCTGACACAACCTCCAAGTGTTAGTGTCGCACCAGGACAAACAGCACGTATTACATGTGGAGGAAATCTTATCGGTGCCAAGCTGGTGCACTGGTACCAGCAGAAACCTGGTCAGGCCCCAGTACTGGTTGTGTATGATGACAGCGACCGTCCAAGCCGTATCCCAGAACGTTTTTCTGGGAGCAACTCAGGTAATACAGCCACTCTGACCATTTCACGTGTTGAGGCAGGAGATGAGGCCGATTATTATTGCCAAGTATGGGACCACAGCTCTGACCATGTTGTTTTTGGCGGAGGGACTAAGCTGACCGTGCTT
 183 38.014
VH		 CAGATGCAGTTGGTGGAGTCCGGAGGTGGAGTGGTGCAACCAGGGCGTTCCTTGCGTTTGTCTTGTGCTGCTTCCGGATTCGCCTTTCGTACATATGGCATGCATTGGGTGCGTCAAGCACCTGGTAAGGGCCTGGAGTGGGTTGCCGTTATTTGGTACGACGGCTCCAACACCCACTACGCAGATAGCGTGAAAGGACGTTTCACTATTACCCGTGATAACTCCAAGAATACCCTTAACCTGCAGATGAATAGCTTGCGTGCTGAGGACACAGCAGTATATTACTGCGTCCGTGCACCACAATGGTACCTGAGCGCCGAGGCCTTTGATCTGTGGGGGCAGGGCACAATGGTGACCGTTTCCTCA
186 38.018
VL		 TCCTATGTGCTGACACAGCCACCTAGCGTGAGCGTCGCCCCAGGTCAGACCGCTCGTATCACTTGTGGCGGGAACCTTATCGGCAGCAAGCTGGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCACCTGTGCTGGTCGTTTATGACGACTCTGACCGTCCATCCCGTATCCCAGAACGTTTCTCTGGCTCTAACTCTGGGAATACCGCTACCCTGACAATCTCACGTGTTGAAGCTGGCGACGAGGCAGATTATTATTGCCAAGTCTGGGATCACTCCAGCGATCACGTCGTGTTCGGAGGCGGAACAAAATTGACTGTCCTG
 185 38.018
VH		 CAGATGCAACTGGTGGAGTCAGGAGGCGGCGTGGTGCAGCCAGGACGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCAGCTTCCGGGTTCGCCTTTCGTACCTATGGGATGCATTGGGTGCGTCAGGCTCCAGGTAAGGGACTGGAGTGGGTCGCTGTTATTTGGGACGACGGAAGTAACACTCATTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGTTTCACAATTACCCGTGACAATTCCAAGAATACCTTGAACCTGCAGATGAACTCTCTTCGTGCTGAAGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCCGTGCTCCACAGTGGTATCTGTCAGCAGAGGCCTTCGACCTGTGGGGACAGGGAACAATGGTGACCGTATCTTCA
188 38.019
VL		 TCTTACGTGTTGACACAACCACCAAGTGTTAGTGTCGCACCTGGCCAAACCGCTCGTATCACCTGTGGTGGGAATCTTATTGGCTCTAAGCTGGTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGCCAGGCTCCAGTACTGGTGGTGTACGACGACTCTGACCGTCCAAGCCGTATCCCAGAGCGTTTCAGTGGCTCTAACTCCGGGAACACAGCAACTCTTACAATTTCACGTGTGGAGGCCGGTGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTTTGGGACTACAGTAGTAATCACGTGGTTTTCGGTGGTGGTACCAAGCTGACTGTGTTG
 187 38.019
VH		 CAAATGCAGCTGGTGGAATCCGGGGGTGGGGTCGTCCAGCCTGGCCGTAGTCTGCGTCTTTCCTGTGCCGCATCAGGCTTTGCTTTCCGTACCTACGGGATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCAGGAAAGGGACTTGAATGGGTGGCTGTCATCTGGTACGATGGTTCCAACACACACTATGCCGATTCAGTGAAAGGGCGTTTCACCATTACTCGTGACAATAGTAAGAATACTCTGAATCTGCAAATGAATTCACTGCGTGCTGAGGACACCGCTGTTTATTACTGTGTGCGTGCTCCTCAGTGGTACCTGAGTGCCGAAGCTTTCGATTTGTGGGGACAGGGCACAATGGTGACAGTCAGTTCT
190 38.021
VL		 AGCTATGTTCTGACTCAACCACCTAGTGTGAGTGTGGCCCCTGGTCAGACTGCACGTATTACCTGTGGCGGAAACCTTATCGGCAGTAAGCTGGTTCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAGTGCTGGTCGTTTACGACGATAGTGACCGTCCATCACGTATCCCAGAGCGTTTTAGCGGGTCCAATTCCGGAAATACAGCAACCTTGACCATTAGCCGTGTGGAAGCCGGCGATGAAGCTGATTATTACTGCCAGGTATGGGACCATTCCTCCGACCACTACGTTTTTGGTGGCGGAACTAAGCTGACAGTCTTG
 189 38.021
VH		 CAGATGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGTGTGGTCCAGCCTGGTCGTAGCCTGCGTCTGTCCTGTGCTGCAAGCGGATTTGCCTTTGACACCTATGGGATGCACTGGGTACGTCAGGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCAGTTATCTGGTATGATGGTTCTAATACCGTGTATGCCGACTCCGTTAAAGGCCGTTTCACTATCACCCGTGATAATAGTAAAAACACACTGAACCTGCAGATGAATAGCTTGCGTGCTGAGGACACCGCAGTGTACTACTGTGCCCGTGCTCCTCAGTGGTATCTGTCAGCAGAGGCCTTCGATCTGTGGGGCCAAGGGACAATGGTGACCGTGTCTTCC
192 38.025
VL		 TCTTACGTGCTTACTCAGCCTCCTAGCGTCTCAGTGGCCCCAGGCGAGACAGCAACCATTACATGCGGGGGTAATTTGATCGGTAGCAAGCTGGTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCAGTGCTGGTTGTATATGACGATAGTGATCGTCCAAGTCGTATCCCTGAGCGTTTTAGCGGATCTAACTCCGGCAACACAGCCACATTGACAATCAGCCGTGTGGAGGCAGGCGATGAGGCCGACTACTACTGCCAAGTTTGGGACCACTCCTCTGACCACGTGGTATTTGGCGGAGGAACAAAGCTTACAGTTTTG
 191 38.025
VH		 CAGATGCAGCTTGTTGAGAGCGGCGGAGGCGTGGTGCAACCAGGCCGTTCATTGCGTCTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTTTGCTTTTCGTACATACGGCATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGCAAGGGGCTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTATGACGGTAGTAACACCCATTATGCTGATTCCGTCAAGGGACGTTTCACTATCACCCGTGACAATAGCAAAAATACACTGAATCTGCAAATGAATTCATTGCGTGCCGAAGACACCGCCGTATATTACTGTGTCCGTGCCCCACAGTGGTACCTGAGCGCTGAGGCCTTCGATCTGTGGGGTCAGGGGACTATGGTGACCGTATCATCC
194 38.026
VL		 TCTTATGTTTTGACCCAACCTCCATCCGTTAGCGTGGCTCCAGGTCAAACAGCTACCATCACATGTGGCGGTAACCTTATTGGCTCAAAGCTGGTTCATTGGTATCAACAGAAACCAGGCCAAGCCCCAGTGCTGGTGGTGTATGACGACAGTGACCGTCCTTCTCGTATTCCTGAGCGTTTTTCCGGCTCTAATATTGGCAACACTGCCACCCTGACCATTTCTCGTGTGGAAGCAGGAGATGAGGCAGACTATTATTGTCAGGTTTGGGATCACTCCAGCGATCATGTGGTATTCGGAGGTGGGACAAAACTTACTGTTCTT
 193 38.026
VH		 CAGATGCAGCTGGTGGAGAGTGGAGGTGGTGTGGTGCAACCTGGGCGTAGCCTGCGTTTGAGCTGCGCTGCCTCTGGATTTGCCTTCCGTACCTATGGCATGCACTGGGTGCGTCAGGCTCCAGGAAAGGGGTTGGAATGGGTGGCTGTGATTTGGTACGACGGGAGCGCCACACATTACGCAGACAGCGTTAAGGGCCGTTTCACAATTACCCGTGACAATAGCAAAAATACATTGAACCTGCAGATGAATTCCCTGCGTGCAGAGGATACTGCAGTGTACTATTGCGTCCGTGCCCCACAGTGGTATCTGTCAGCCGAAGCCTTCGATCTGTGGGGGCAGGGTACTATGGTCACCGTAAGTTCC
196 38.040
VL		 AGCTACGTGCTTACCCAGCCACCATCAGTCAGTGTGGCTCCAGGCCAAACTGCCCGTATCACCTGCGGCGGCAATTTGATTGGCACCAAGCTTGTGCACTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTGTGCTGGTTGTCTACGACGATAGTGATCGTCCTTCCCGTATTCCTGAACGTTTCTCTGGAAGCAATTCCGGAAACACAGCCACACTTACCATTTCTCGTGTTGAGGCTGGGGATGAAGCCGACTACTATTGCCAGGTTTGGGACCACAATGAAGACGAAGTTGTTTTTGGAGGAGGAACTAAGCTGACAGTTCTG
 195 38.040
VH		 CAGATGCAGCTGGTGGAAAGTGGTGGGGGAGTCGTGCAACCAGGACGTTCCTTGCGTCTGTCATGCGCTGCTTCAGGTTTCGACTTTCGTACCTACGGCATGCATTGGGTGCGTCAGGCTCCAGGTAAAGGACTTGAGTGGGTCGCAGTGATCTGGTACGACGGATCAATTACTCACTACGCCGATAGCGTGAAAGGCCGTTTCACCATCACCCGTGACAACTCCAAGAACACCCTGAACTTGCAGATGAACAGTCTGCGTGCAGAAGACACTGCAGTATATTATTGTGTCCGTGCCCCACAGTGGTACTTGACCGCCGAGGCTTTTGATCTGTGGGGACAGGGCACAATGGTGACCGTATCTAGC
항체 클론 #별 중쇄 CDR 영역의 아미노산 서열. 33.023, 33.025, 38.014, 38.015. 38.018, 38.019, 38.021, 38.026, 38.040
클론 HCDR1 서열번호 HCDR2 서열번호 HCDR3 서열번호
BDG33_023_VH GFAFRTYG 149 IWYDGSNT 150 ARAPQWYLSAEAFDL 151
BDG33_025_VH GFTFRTYG 165 IWYDGSNK 166 ARAPQWYLVAEPFDL 167
BDG38_014_VH GFAFRTYG 149 IWYDGSNT 150 VRAPQWYLSAEAFDL 201
BDG38_018_VH GFAFRTYG 149 IWDDGSNT 208 ARAPQWYLSAEAFDL 151
BDG38_019_VH GFAFRTYG 149 IWYDGSNT 150 VRAPQWYLSAEAFDL 201
BDG38_021_VH GFAFDTYG 197 IWYDGSNT 150 ARAPQWYLSAEAFDL 151
BDG38_025_VH GFAFRTYG 149 IWYDGSNT 150 VRAPQWYLSAEAFDL 201
BDG38_026_VH GFAFRTYG 149 IWYDGSAT 199 VRAPQWYLSAEAFDL 201
BDG38_040_VH GFDFRTYG 198 IWYDGSIT 200 VRAPQWYLTAEAFDL 202
항체 클론 #별 경쇄 CDR 영역의 아미노산 서열. 33.023, 33.025, 38.014, 38.015. 38.018, 38.019, 38.021, 38.026, 38.040
클론 LCDR1 서열 LCDR2 서열 LCDR3 서열
BDG33_023_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDHSSDHVV 154
BDG33_025_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDSSSDGVV 168
BDG38_014_VL LIGAKL 203 DDS 153 QVWDHSSDHVV 154
BDG38_018_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDHSSDHVV 154
BDG38_019_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDYSSNHVV 205
BDG38_021_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDHSSDHYV 206
BDG38_025_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDHSSDHVV 154
BDG38_026_VL LIGSKL 152 DDS 153 QVWDHSSDHVV 154
BDG38_040_VL LIGTKL 204 DDS 153 QVWDHNEDEVV 207
클론을 효모 scFv 포맷의 10nM rh-IL-13에 대한 이들의 결합에 대해 시험하고, 효모 상에 표시된 양성 rh-IL-13 결합제와도 비교하였다. 양성 대조군의 평균 형광 값(정규화된 MFI)에 기초하여 친화도를 정규화하였다. 단리된 클론의 rh-IL-13에 대한 상대 친화도는 양성 대조군에 의해 표시된 친화도의 3% 내지 30%였다(도 2a). rh-IL-13에 대해 20%를 초과하는 친화도를 나타내고 YSD에서 10nM TSLP에 결합하는 것으로 나타난 C2, C6, C9, 및 C40 클론을 인간 IgG1로서 발현시키기 위해 선택하였다(도 2b).
실시예 3: Ab 생산 및 생화학적 특성 분석
목적: 선택된 클론을 인간 IgG1 포맷으로 재포맷팅하고 IL-13 및 TSLP 이중 결합에 대해 IgG1 항체를 분석하는 것.
결과: 실시예 2에 기술된 효모 표면 디스플레이 포맷의 특성 분석에 이어서, 실시예 1(방법)에 기술된 것과 같이 가변 도메인을 2개의 별도의 발현 벡터, pSF-CMV-HuIgG1_HC 및 pSF-CMV-HuLambda_LC로 서브클로닝함으로써 선택된 클론 C2, C6, 및 C9를 인간 IgG1으로 재포맷팅하였다.
클론 BDG 33.003, BDG 33.004, 및 BDG 33.005(각각 클론 C2, C6, 및 C9)를 실시예 1(방법 )에 기술된 것과 같이 발현시켜 정제하였는데, 단백질 A 정제 후, IgG는 SDS PAGE 분석(데이터 미도시)으로부터 분명히 알 수 있듯이 >95% 순도였다. Superdex®200 10/300을 이용한 BDG 33.003(클론 C2), BDG 33.004(클론 C6), 및 BDG 33.005(클론 C9)에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 결과, 큰 응집체의 전형인, 머무름 시간이 9.2 ml(0.36CV)인 제1 피크; 및 일반적인 인간 IgG1(hIgG1)의 전형인, 머무름 시간이 약 13.2 ml(0.528CV)인 제2 피크의 2개의 주요 피크가 나타났다. 이들 2개의 피크의 통합 곡선 아래 면적은 각각 22% 및 78%의 비율을 나타냈다(도 3a~3d).
Superdex®200 10/300 상에서 BDG3333.0023 및 BDG33.025 둘 다 이동하였는데, 앞의 작은 피크는 직경이 큰 응집체에 전형인 (0.36CV)에 상응하고, 제2 피크는 머무름 시간이 약 13.8ml(0.55CV)이고, 이는 일반적인 인간 IgG의 전형이다. 곡선 아래 면적(AUC) 피크 비율은 BDG33.023 및 BDG33.025 각각에 대해 97.3% 접힘/2.8% 오접힘 및 98.5% 접힘/1.5% 오접힘이다(도 3e~3f).
클론 BDG 33.003, BDG 30.004, 및 BDG 30.005의 열안정성을 시험하기 위해, 실시예 1에 기술된 바와 같이 시차 주사 형광(DSF)에 의해 클론의 열 용융을 모니터링하였다. 형광 열 이동 그래프의 제1 도함수로부터 분명히 알 수 있듯이, BDG 33.004는 62℃ 지점에서 하나의 구별되는 전이를 가졌는데, 이는 가능하게는 Tm1 및 Tm2 둘 당에 상응할 수 있다. (데이터 미도시). BDG 33.003 및 BDG 33.005는 각각 2개의 전이점을 가졌는데, 하나의 주요 전이점은 각각 62℃(BDG 33.003) 및 64.5℃(BDG 33.005)에 있고, 하나는 작은 전이점은 각각 73℃(BDG 33.003) 및 74.5℃(BDG 33.005)에 있다.
NanoDSF Prometheus NT.48(NanoTemper Technologies, Germany)을 사용하여 BDG 33.023 및 BDG 33.025를 시험하였다. BDG33.0023의 경우 T-onset은 64.2℃였고, 제1 전이점은 67.7℃였으며, BDG33.0025의 경우 T-onset은 56.4℃였고, 제1 전이점은 60.9℃, 제2 전이점은 67.4℃였다(도 4a~4b).
인간 TSLP, 인간 IL-13, 및 시노몰구스 원숭이 IL-13에 대한 IgG의 친화도를 시험하였다. BDG33.023 및 BDG33.025에 대한 hIL-13의 결합 동역학을 본원에 기술된 바와 같이 BIAcoreT200을 이용해 시험하였다(도 5g~h). GE 포획 항체 키트를 사용해, BiacoreT200 및 ProteOn™ XPR36을 이용해 SPR 분석에 BDG33.003 및 BDG33.004 클론을 각각 시험하였다. 인간 IL-13에 결합하기 위한 동역학 파라미터를 수득하는 것은 불가능했지만, 정태 결합 측정을 통해 BDG33.003 및 BDG33.004에 대해 21.6 nM 및 57.4 nM의 겉보기 KD를 각각 얻었다(도 5a~5b). BDG33 BDG33.003, BDG 33.004, BDG33.023, 및 BDG33.025의 다른 모든 측정치의 경우, hTSLP 및 hIL-13에 대한 결합 동역학은 표 6a 및 6b, 및 도 5e 및 5h에 제시되어 있다.
도 5c~5d에서 알 수 있듯이, 인간 IL-13과 85% 동일성 및 88% 상동성을 공유하는 재조합 시노몰구스 원숭이 IL-13(rc-IL-13)의 결합에 대해서도 항체를 시험하였다. 분석물로서 cIL-13을 주입하자 강한 투여량 의존적 반응이 나타났는데, 이는 BDG33.003 및 BDG33.004가 rc-IL-13에 결합함을 나타낸다. rc-IL-13에 대한 동역학을 얻을 수는 없었지만, 결합 및 해리 기울기는 rh-IL-13 및 rc-IL-13에 대해 프로파일이 유사하였는데, 이는 재조합 h-IL-13 및 rc-IL-13에 대한 결합 방식이 유사할 가능성이 있음을 시사한다(인간 IL-13은 도 5a~5b, cyno IL-13은 도 5c~5d 참조).
인간 TSLP, 시노몰구스 원숭이 TSLP, 및 시노몰구스 원숭이 IL-13에 대한 IgG 친화도를 추가로 시험하기 위해, 본원에 기술된 것과 같이 ELISA EC50 실험을 수행하였다. 간략하게, 웰을 각각의 리간드로 코팅한 다음, 1nM 내지 1000nM의 농도 범위의 클론 BDG33.003, BDG33.004, BDG33.023, 또는 BDG33.025와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, HRP 접합된 이차 항체를 사용하여 발달시켰다. EC50 값은 표 7에 제시되어 있다. 상기 섹션에서 언급된 IgG는 대칭 IgG이고, 이들 동일한 IgG는 hIL-13 및 hTSLP 둘 다에 결합하기 때문에, 이 데이터는, 경쇄 가변 도메인이 하나의 표적에 결합하고 중쇄가 다른 표적에 결합하는 이중특이적 항체와 대조적으로, BGD33.0BGD3303, BGD33.004, BGD33.023, 및 BGD33.025 항체가 동일한 표준 IgG CDR로부터의 2개의 무관한 표적인 TSLP 및/또는 IL-13에 결합한다는 것을 입증한다(도 6a~6e).
IgG가, 파라토프가 중첩되는 IL-13 및 TSLP에 결합하는지 여부를 시험하기 위해, 본원에 기술된 것과 같이 경쟁 검정을 수행하였다. 간략하게, BDG 33.023 또는 BDG33.025를 0.78 nM 내지 200nM의 농도 범위의 hIL-13 또는 hTSLP와 함께 인큐베이션한 다음, ELISA 플레이트 상에 미리 코팅된 IL-13 또는 TSLP에 대한 결합에 대해 시험하였다. 도 7a~7d에서 알 수 있듯이, IL-13은 BDG33.023이 IL-13 코팅된 웰에 결합하는 것을 차단하고, TSLP는 BDG33.023 및 BDG33.025가 TSLP 코팅된 웰에 결합하는 것을 차단한다(도 7a~7b). 또한, IL-13은 BDG33.023이 TSLP 코팅된 웰에 결합하는 것을 차단하였고, 반복해서 TSLP는 BDG33.023이 IL-13 코팅된 웰에 결합하는 것을 차단하였다(도 7c~7d). 이 실험은 IL-13 및 TSLP 각각이 BDG33.023 결합 파라토프를 적어도 부분적으로 공유함을 나타낸다.
IL-13 및 TSLP는 서열 및 구조적으로 무관하다. BDG33.023 및 BDG33.025에 의한 이들 리간드에 대한 결합이 특이적이고, 비특이적 결합 또는 “점착”의 결과는 아닌지 여부를 시험하기 위해, IL-4, IL-2, IL-17, BSA IL-13, 및 TSLP에 대한 BGD33.0023 및 BGD33.025 결합을 본원에 기술된 것과 같이 ELISA에 의해 시험하였다. 도 8에서 알 수 있듯이, BDG33.025는 IL-13, TSLP, 및 IL-4에 대해 강한 결합을 나타내지만, IL-2 및 IL-17에 대해서는 그렇지 않다. BDG33.023은 TSLP 및 IL-13에 강력하게 결합하지만, 다른 리간드에 대한 결합을 나타내지 않는데, 이는 IL-13 및 TSLP에 대한 이의 결합이 특이적임을 나타낸다.
BDG33.023이 기능적 에피토프에서 TSLP에 결합하는지 여부를 시험하기 위해, TSLP 수용체에 대한 TSLP의 결합을 교차 차단하는 BDG33.023의 능력을 시험하였다. 간략하게, TSLP-R을 ELISA 플레이트 웰 상에 코팅하고, 0nM 내지 500nM의 BDG33.023이 존재하는 가운데 hTSLP에 결합하는 이의 능력을 시험하였다. 도 9에서 알 수 있듯이, BDG 33.023은 TSLP-R에 대한 TSLP의 결합을 0.41 nM의 IC 50으로 교차 차단할 수 있으며, 이는 BDG33.023이 생물학적으로 기능적인 부위에서 TSLP에 밀접하게 결합함을 나타낸다.
실시예 4: 억제제 항체 BDG33.003(클론 C2)에 대한 세포 기반 검정
목적: IL-13 활성을 억제하는 능력에 대해 IgG1 항체를 분석하는 것.
결과: rh-IL-13을 억제하는 항체의 능력을 평가하기 위해, HEK-Blue IL-4/IL-13 시스템을 사용하였다. 시스템은, 4개의 STAT6 결합 부위에 융합된 IFNβ 최소 프로모터의 조절 하에 인간 STAT6 유전자 및 리포터 유전자 분비 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP)로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 사용한다(실시예 1(방법), 및 도 10). rh-IL-13을 세포에 도입하고 이어지는 세포 신호 전달 캐스케이드를 통해 rh-IL-13에 의해 IL-13R(IL-13 수용체)를 활성화함으로써 시스템을 먼저 시험하였다. 결과는 IL-13이 세포에 대해 약 0.12 nM의 EC50을 가졌음을 보여주었다(도 11). 다음으로, 조작된 BDG33.003(클론 C2), BDG33.023 및 BDG33.025 항체를 시험하여 이들이 세포의 신호 전달 캐스케이드의 IL-13 매개 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 결정하였다. IL-13R을 포화 수준의 약 70%까지 활성화시키는 것으로 나타난 0.4nM rh-IL-13와 함께 항체를 인큐베이션하고, IgG/IL-13 혼합물을 24시간 동안 세포에 도입하였다. 수득된 결과는, 항체가 IL-13R/IL-4R 수용체 복합체에 대한 IL-13의 결합을 억제함으로써 신호전달 캐스케이드를 방해할 수 있음을 보여주었다. BDG33.003의 경우, 정확한 IC50 값을 결정하기 어려웠지만, BDG33.003이 IL-13 신호 전달 캐스케이드를 억제하고 있음은 명백하다. 또한, BDG33.023 및 BDG33.025는 각각 1.3 nM 및 25 nM의 IC50으로 IL-13 신호 전달 캐스케이드를 억제하였는데, 이는 IgG가 생물학적으로 관련된 환경에서 IL-13을 기능적으로 차단하고 있음을 나타낸다. (도 11b~11d).
세포에서 인간 TSLP를 억제하는 항체의 능력을 평가하기 위해, Francis OL 등의 문헌[Hematopoiesis 2016]에 의해 보고된 것과 유사한 방식으로 MUTZ5 세포를 사용하여 pSTAT5 TSLP 의존적 활성화를 시험하였다. TSLP 유도된 인-STAT5(pSTAT5) 세포 활성화 캐스케이드에는 IL-7 수용체 및 TSLP-R 수용체가 기능하는 것이 필요한데, 도 12a에서 알 수 있듯이, 이들 모두는 MUTZ5 세포주 표면에서 발현되므로, 이는 이들 세포가 이러한 검정에 필요한 수용체를 가지고 있음을 나타낸다. TSLP 세포에 대한 세포 반응을 확립하기 위해, 세포를 0.0001 내지 1000pg/ml의 농도 범위의 TSLP와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석법에 의해 이들의 pSTAT5 활성화 수준을 결정하였다. 도 12b에서 알 수 있듯이, TSLP로 MUTZ 5 세포를 치료하면 pSTAT5가 투여량 의존적 방식으로 활성화되는데, 이는 이들 세포가 pSTAT5 경로를 통해 TSLP에 반응함을 나타낸다. 도 12c에서 보이는 것과 같이, TSLP 의존성 STAT5 활성화의 BDG33.023 억제를 시험하기 위해, 14pM 농도의 TSLP를 0.48 pM 내지 500pM의 BDG33.023과 혼합하고 MUTZ 세포와 함께 인큐베이션하였다. BDG33.023은 13pM의 IC50 값으로 TSLP pSTAT5 활성화를 억제한다. 이들 실험은 BDG33.023이 생물학적으로 관련된 세포 기반 환경에서 TSLP를 기능적으로 차단하고 있음을 입증한다.
요약: “재-에피토핑화딘” 조작된 BDG33.003(클론 2), BDG33.023, 및 BDG33.025 항체는 TSLP 및 IL-13 둘 다에 결합하는 것으로 나타났다. 각각의 Fv가 단일 항원에 대한 특이성을 갖는 이중특이적 항체 포맷과 대조적으로, 이들 3개의 항체는 표준 IgG 포맷이고, 각각의 Fv는 IL-13 및 TSLP 둘 다에 대해 특이성을 갖는다. 또한, IL-13 및 TSLP에 대한 BDG33.023의 파라토프는 적어도 부분적으로 중첩되는 것으로 나타났다. 3개의 IgG 모두는 IL-13R/IL4R 및 TSLPR/IL-7R 신호전달 캐스케이드를 방해한다. 이러한 항체는, 예를 들어 중증 천식, 아토피 피부염, 및 다른 알레르기성 및 호흡기 병태(이에 한정되지는 않음)의 치료적 치료의 성분으로서 사용될 수 있다.
개시된 조작된 이중 항체의 특정 특징이 본원에서 예시되고 기술되었지면, 많은 수정, 치환, 변경, 및 등가물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본원에 기술된 것의 진정한 사상 내에 있는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
실시예 5: 이중 결합 항체의 생화학적 특성 분석
목적: 이중 결합 항체 BDG38.074 내지 BDG38.143의 생화학적 및 기능적 특성을 조사하는 것.
방법:
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(Cell Generation, CAT:101061021)를 사용하여 IL-13 및 hTLSP 억제를 결정하였다. PBMC를 해동하고 RPMI - 1640, 10% FBS, 1% Glutamax, 1% 피루브산 나트륨, 0.1% 2-ME, 1% Pen-Strep, 및 1% 비필수 AA가 포함된 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 96- 웰 플레이트에 5x105 세포/웰로 시딩하였다. 15 ng/mL hTSLP 및 1.25 ng/mL IL-13을 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 총 200uL가 되도록 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
IL-13이 존재할 때, CD23은 인간 단핵구에서 상향조절된다(RD May 등의 2011 문헌). IL-13의 항체 억제의 IC50은 단핵구에서 CD23 발현 수준을 측정함으로써 결정하였다. 세포를 상이한 농도의 항체와 함께 48시간 인큐베이션한 후, 차가운 PBS를 사용하고 긁어서 웰의 바닥으로부터 단핵구를 분리하였다. CD3(Bio Legend, CAT: 300450), CD14(Bio Legend, CAT: 301814), CD19(Bio Legend, CAT: 302212), 및 CD23(Bio Legend, CAT: 338506) 항체를 사용하여 세포를 표시하였다. CD14+ 집단의 CD23 백분율을 CytoFLEX 유세포 계측기(Beckman Coulter)를 사용하여 측정하였다.
hTSLP의 항체 억제의 IC50은 TARC 억제에 의해 결정하였다. TARC 수준은 TARC DUOSET ELISA 키트 DY364(R&D systems)를 키트 지침에 따라 사용하여 결정하였다. 간략하게, ELISA 고결합 단백질 플레이트에 PBSX1에서 희석한 (비오틴화되지 않은) 포획 항체를 도말하였다. 플레이트를 밀봉하고 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 플레이트를 세척하고, PBST 2%BSA를 사용해 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 차단하였다. PBMC 플레이트의 상청액을 웰로 옮겼다. PBS 1% BSA 중 키트의 검출 항체(비오티닐화됨) 및 PBST 2% BSA 중 스트렙트아비딘-HRP를 사용하여 검출을 수행하였다. TMB 정지 용액을 첨가한 후, ELISA 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 표준 샘플 곡선을 사용하여 값을 분석하였다.
본 실시예에 기술되고 제시된 결과를 제공하는 데 사용되는 다른 방법은 상기 실시예 1에 기술되었다.
결과: 아래 표는 항체 BDG38.074 내지 BDG38.143에 대한 아미노산 서열을 제시한다. VH 및 VL 서열은 표 10에 나타나 있고, 중쇄 및 경쇄 CDR은 표 8 및 표 9에 각각 나타나 있다.
항체 BDG38.074 내지 BDG38.143에 대한 중쇄 CDR 영역의 아미노산 서열.
항체 HCDR1 서열번호 HCDR2 서열번호 HCDR3 서열번호
BDG38_074_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_079_VH GFAFRTYG 349 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_094_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_138_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_075_VH GFAFRTYG 349 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLSAEAFDL 353
BDG38_076_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSAT 354 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_077_VH GFAFRTYG 349 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_078_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_080_VH GFAFRTYG 349 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLSAEAFDL 353
BDG38_081_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_082_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_083_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_084_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_085_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_086_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_087_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_088_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_089_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_090_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_091_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_092_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_093_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_095_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_096_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_097_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_098_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_099_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_100_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_101_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_102_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_103_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_104_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_105_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_106_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_107_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_108_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_109_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_110_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_111_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSAT 354 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_112_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_113_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_114_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_115_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_116_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_117_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_118_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_119_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_120_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_121_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_122_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_123_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_124_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_125_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_126_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_127_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSAT 352 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_128_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_129_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_130_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_131_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_132_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_133_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_134_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYNSAEAFDL 358
BDG38_135_VH GFAFRTYG 349 IWYDGSNT 356 VRAPQWYNSAEAFDL 358
BDG38_136_VH GFEFRTYG 355 IWYDGSNT 356 VRAPQWYNSAEAFDL 358
BDG38_137_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_139_VH GFAFRTYG 349 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLSAEAFDL 353
BDG38_140_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 ARAPQWYLTAEAFDL 357
BDG38_141_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_142_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSNT 350 VRAPQWYLTAEAFDL 351
BDG38_143_VH GFEFRTYG 355 IWDDGSAT 354 VRAPQWYLTAEAFDL 351
항체 BDG38.074 내지 BDG38.143에 대한 경쇄 CDR 영역의 아미노산 서열.
항체 LCDR1 서열번호 LCDR2 서열번호 LCDR3 서열번호
BDG38_074_VL MIGAYL 359 DDV 360 QVWDHNTDKMV 361
BDG38_079_VL MIGGYL 364 DDV 360 QVWDHDSNTMV 371
BDG38_094_VL LIGAYL 362 DDV 360 QVWDHNSNHMV 384
BDG38_138_VL MIGGYL 364 DDV 360 QVWDHNSNHMV 384
BDG38_075_VL LIGAYL 362 DDV 360 QVWDHDTNTMV 363
BDG38_076_VL MIGGYL 364 DDV 360 QVWDHDTNHMV 365
BDG38_077_VL LIGSRL 366 DDS 367 QVWDHSSNTYV 368
BDG38_078_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDHMV 370
BDG38_080_VL LIGAYL 362 DDS 367 QVWDHNTNHMV 372
BDG38_081_VL MIGAYL 359 DDV 360 QVWDHNTQQMV 373
BDG38_082_VL MIGGYL 364 DDV 360 QVWDHDTNQVV 374
BDG38_083_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSDTMV 376
BDG38_084_VL LIGAYL 362 DDV 360 QVWDHSTNTMV 377
BDG38_085_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNSYV 378
BDG38_086_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_087_VL MIGAYL 359 DDV 360 QVWDHNSNQMV 380
BDG38_088_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_089_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDHSSNHYV 381
BDG38_090_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDHMV 370
BDG38_091_VL LIGSRL 366 DDS 367 QVWDHYSNHYV 382
BDG38_092_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDHMV 370
BDG38_093_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSADSYV 383
BDG38_095_VL LIGSRL 366 DDS 367 QVWDYYSDSYV 385
BDG38_096_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSMV 386
BDG38_097_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDHYV 387
BDG38_098_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSMV 386
BDG38_099_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSYV 388
BDG38_100_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSNSYV 389
BDG38_101_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_102_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_103_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSNSYV 389
BDG38_104_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDSYV 390
BDG38_105_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSNSYV 389
BDG38_106_VL LIGSRL 366 DDS 367 QVWDHYSDHMV 391
BDG38_107_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSYV 388
BDG38_108_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSNSYV 389
BDG38_109_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNSYV 378
BDG38_110_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSNHMV 392
BDG38_111_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYANSYV 393
BDG38_112_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDTYV 394
BDG38_113_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSYV 388
BDG38_114_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSANSYV 395
BDG38_115_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_116_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYYSDTMV 396
BDG38_117_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSDTMV 376
BDG38_118_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDHYV 397
BDG38_119_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_120_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDHMV 398
BDG38_121_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
BDG38_122_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDSYV 388
BDG38_123_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDTYV 394
BDG38_124_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDTYV 394
BDG38_125_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDHMV 398
BDG38_126_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSDHMV 398
BDG38_127_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYYSDTYV 399
BDG38_128_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYYADTMV 400
BDG38_129_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSDHMV 398
BDG38_130_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNSYV 378
BDG38_131_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYYSNTMV 401
BDG38_132_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDHMV 398
BDG38_133_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSDTYV 394
BDG38_134_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSADTMV 402
BDG38_135_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDHSADTMV 403
BDG38_136_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSSDTMV 376
BDG38_137_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSADTMV 402
BDG38_139_VL MIGAYL 359 DDV 360 QVWDHNSDHMV 404
BDG38_140_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYSANHMV 405
BDG38_141_VL LIGSRL 366 DDS 367 QVWDYYSNHMV 406
BDG38_142_VL LIGAKL 375 DDS 367 QVWDYYSHTMV 407
BDG38_143_VL LIGARL 369 DDS 367 QVWDYSSNTYV 379
항체 BDG38 .074 내지 BDG38 .143에 대한 VH 및 VL CDR 영역의 아미노산 서열.
항체 아미노산 서열 서열번호
BDG38_074_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 209
BDG38_074_VL SYVLTQPPSVSVAPGQTATITCGGNMIGAYLVHWYQQKPGQAPLLVVYDDVDRPNRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNTDKMVFGGGTKLTVL 210
BDG38_079_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 219
BDG38_079_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNMIGGYLVHWYQQKPGQAPLLVIYDDVDRPDRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHDSNTMVFGGGTKLTVL 220
BDG38_094_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 249
BDG38_094_VL SYVLTQPPSVSVAPGETASITCGGNLIGAYLVHWYQQKPGQAPLLVIYDDVDRPARIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNSNHMVFGGGTKLTVL 250
BDG38_138_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 337
BDG38_138_VL SYVLTQPPSVSVAPGETASITCGGNMIGGYLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDVDRPSRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNSNHMVFGGGTKLTVL 338
BDG38_075_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS 211
BDG38_075_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGAYLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDVDRPARIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHDTNTMVFGGGTKLTVL 212
BDG38_076_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 213
BDG38_076_VL SYVLTQPPSVSVAPGETASITCGGNMIGGYLVHWYQQKPGQAPLLVIYDDVDRPARIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHDTNHMVFGGGTKLTVL 214
BDG38_077_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLTLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVGVIWYDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 215
BDG38_077_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGALIGSRLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTISDVEAGDEADYYCQVWDHSSNTYVFGGGTKLTVL 216
BDG38_078_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWLGVIWYDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRVEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 217
BDG38_078_VL SYILTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGARLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTIERVEAGDEADYYCQVWDYYSDHMVFGGGTKLTVL 218
BDG38_080_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS 221
BDG38_080_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGAYLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPDRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNTNHMVFGGGTKLTVL 222
BDG38_081_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 223
BDG38_081_VL SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNMIGAYLVHWYQQKPGQAPLLVIYDDVDRPDRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNTQQMVFGGGTKLTVL 224
BDG38_082_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 225
BDG38_082_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNMIGGYLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDVDRPDRIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHDTNQVVFGGGTKLTVL 226
BDG38_083_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLTLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVGVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 227
BDG38_083_VL SYILTQPPSVSVAPGQTATITCGGNLIGAKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTISDVEEGDEADYYCQVWDYSSDTMVFGGGTKLTVL 228
BDG38_084_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 229
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BDG38_137_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGARLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSHIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDYSADTMVFGGGTKLTVL 336
BDG38_139_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLSAEAFDLWGQGTMVTVSS 339
BDG38_139_VL SYVLTQPPSVSVAPGETATITCGGNMIGAYLVHWYQQKPGQAPLLVIYDDVDRPARIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDHNSDHMVFGGGTKLTVL 340
BDG38_140_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLTLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVGVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRVEDTAVYYCARAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 341
BDG38_140_VL SYILTQPPSVSVAPGETATITCGGNLIGAKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTIEDVEAGDEADYYCQVWDYSANHMVFGGGTKLTVL 342
BDG38_141_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 343
BDG38_141_VL SYILTQPPSVSVAPGETATITCGGALIGSRLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTISDVEEGDEADYYCQVWDYYSNHMVFGGGTKLTVL 344
BDG38_142_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLTLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNTHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 345
BDG38_142_VL SYILTQPPSVSVAPGQTATITCGGNLIGAKLVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTIERVEEGDEADYYCQVWDYYSHTMVFGGGTKLTVL 346
BDG38_143_VH QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFEFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVGVIWDDGSATHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRVEDTAVYYCVRAPQWYLTAEAFDLWGQGTMVTVSS 347
BDG38_143_VL SYILTQPPSVSVAPGQTATITCGGALIGARLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDSDRPSRIPERFSGSNIGNTATLTISRVEEGDEADYYCQVWDYSSNTYVFGGGTKLTVL 348
아래에 제시된 데이터는 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부에 대한 생화학적 및 기능적 특성을 입증한다. 도 13은 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부에 대한 머무름 시간 및 계산된 pI를 도시하며, 이는 BDG 항체가 단분산되고 고도로 동질적임을 나타낸다.
도 14a~14c는 이중 결합 항체 중 일부 및 테제펠루맙과 TSLP와의 경쟁 ELISA를 보여준다. ELISA 플레이트를 50 ng/웰의 테제펠루맙으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. BDG 항체를 2배 희석하고, 일정한 7 nM 농도의 TSLP-HIS와 함께 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 차단 및 세척 단계 후, BDG 항체-TSLP 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척한 후, 항-HIS와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. BDG 항체는 유사한 IC50 값을 나타냈고 TSLP 에피토프에서 테제펠루맙과의 완전한 경쟁을 나타냈다.
도 15는 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부의 나노스케일 시차주사 형광측정(nanoDSF) 분석을 보여준다. 모든 BDG 항체를 분석하여 nanoDSF를 사용했을 때의 다양한 열 변화에 대해 안정성을 시험하였다(아래 표 11 참조). 추가의 특성 분석을 위해 Tm > 60℃인 항체를 선택하였다.
SEC 및 DSF 요약 표 . SEC 열은 단분산된 BDG 항체 분획의 곡선 아래 면적( AUC ) 피크 비율을 나타낸다. DSF 열은 상이한 BDG 항체의 T-onset 및 Tm 값을 제시한다.
DSF 제1 반복 DSF 제2 반복
항체# SEC (%) T-onset Tm-1 T-onset Tm-1
BDG38.074 100 60.3 62.2
BDG38.075 88.65 61 65.5 60.7 65.4
BDG38.076 91.98
BDG38.077 97.43 66.4 70.4 66 70.3
BDG38.078 89.12 64.3 67.4 64.4 67.4
BDG38.079 96.28 61.4 64.2 61.7 64.3
BDG38.080 97.4 63.7 66.8 63.8 66.8
BDG38.081 97.54 63.3 65.9 63.4 65.9
BDG38.082 99.35 65.6 69.3 65.4 69.3
BDG38.083 92.88 66.6 70.1 66.8 70.2
BDG38.084 96.7 20.0℃ 49.6℃ 23.7℃ 48.4℃
BDG38.085 90 51.1℃ 51.5℃
BDG38.086 68 51.3℃ 51.1℃
BDG38.087
BDG38.088 84.3 65.2℃ 71.5℃ 51.6℃
BDG38.089 92.34 61.0℃ 71.2℃ 60.8℃ 71.3℃
BDG38.090 96.6 63.5℃ 69.7℃ 63.5℃ 69.7℃
BDG38.091 86.78 57.6℃ 72.0℃ 58.0℃ 72.1℃
BDG38.092 95.8 64.5℃ 68.4℃ 63.9℃ 68.2℃
BDG38.093 82.33 49.6℃ 49.6℃
BDG38.094 96.15 21.4℃ 49.7℃ 62.4℃ 65.3℃
BDG38.095 98.01 64.6℃ 68.2℃ 53.0℃ 53.5℃
BDG38.096 97 63.5℃ 66.9℃ 64.2℃ 67.0℃
BDG38.097 68 65.0℃ 68.5℃ 64.7℃ 68.5℃
BDG38.098 95.8 63.4℃ 66.1℃ 62.8℃ 66.2℃
BDG38.099 75.2 49.4℃ 58.3℃
BDG38.100 84 50.8℃ 51.2℃
BDG38.101 97 63.6℃ 70.6℃ 64.5℃ 70.5℃
BDG38.102 70.6 58.9℃ 65.4℃ 68.8℃
BDG38.103 78.26 51.0℃ 51.2℃ 65.5℃ 69.2℃
BDG38.104 76.36 65.0℃ 69.3℃ 65.4℃ 69.3℃
BDG38.105 74.87 51.8℃ 64.7℃ 71.2℃
BDG38.106 96.8 63.9℃ 67.5℃ 64.3℃ 67.6℃
BDG38.107 69.19 49.3℃ 49.1℃ 49.2℃
BDG38.108 75.47 42.2℃ 42.9℃ 51.5℃
BDG38.109 56 51.2℃ 51.4℃
BDG38.110 77.15 27.7℃ 56.8℃ 26.0℃ 57.2℃
BDG38.111 92 23.4℃ 55.4℃ 43.9℃ 54.9℃
BDG38.112 71.97 49.5℃ 49.3℃
BDG38.113 71 49.6℃ 50.0℃
BDG38.114 67.9 59.1℃ 52.0℃
BDG38.115 72.41 56.8℃ 57.4℃ 71.5℃
BDG38.116 88 63.8℃ 67.6℃ 64.3℃ 67.9℃
BDG38.117 96 64.6℃ 69.7℃ 63.9℃ 69.7℃
BDG38.118 90.5 64.5℃ 69.6℃ 64.8℃ 69.7℃
BDG38.119 63.19 51.7℃ 59.9℃
BDG38.120 82 28.3℃ 55.8℃ 62.9℃ 66.8℃
BDG38.121 51 49.9℃ 50.1℃
BDG38.122 67 58.5℃ 58.9℃ 59.0℃
BDG38.123 59 50.6℃ 50.5℃
BDG38.124 69 57.5℃ 58.5℃ 56.2℃ 58.3℃
BDG38.125 85.47 63.9℃ 67.2℃ 63.6℃ 67.1℃
BDG38.126 93 63.9℃ 67.3℃ 64.0℃ 67.3℃
BDG38.127 89 62.9℃ 69.3℃ 62.8℃ 69.3℃
BDG38.128 81 63.4℃ 67.4℃ 63.2℃ 67.4℃
BDG38.129 95.98 63.8℃ 70.1℃ 63.4℃ 70.1℃
BDG38.130 38.5 60.2℃ 60.5℃
BDG38.131 71.5 64.2℃ 68.8℃ 64.4℃ 68.8℃
BDG38.132 94.35 63.3℃ 67.1℃ 63.6℃ 67.1℃
BDG38.133 61.3 50.8℃ 50.4℃
BDG38.134 93.57 63.5℃ 67.4℃ 63.6℃ 67.4℃
BDG38.135 92.78 62.6℃ 65.6℃ 62.6℃ 65.6℃
BDG38.136 93.38 63.8℃ 67.3℃ 63.6℃ 67.3℃
BDG38.137 77.8 63.4℃ 67.9℃ 62.7℃ 67.8℃
BDG38.138 94.8 20.0℃ 50.4℃ 62.8℃ 66.0℃
BDG38.139 90 61.6℃ 64.8℃ 62.0℃ 64.8℃
BDG38.140 82.2 63.6℃ 70.6℃ 20.0℃ 50.9℃
BDG38.141 73.25 20.0℃ 55.2℃ 20.0℃ 56.1℃
BDG38.142 80 63.8℃ 67.8℃ 63.8℃ 67.7℃
BDG38.143 74 21.3℃ 57.5℃ 56.9℃
도 16a~16f는 인간/cyno IL-13 및 TSLP에 대해 본원에 개시된 이중 결합 항체 중 일부에 대한 SPR(표면 플라스몬 공명) 분석 결과를 보여준다. SPR 분석을 수행하여 TSLP 및 IL-13에 결합하는 BDG 항체의 동역학을 평가하였다. SPR 데이터는 IL-13 및 TSLP에 결합하는 BDG 항체에 대한 수십 pM의 해리 상수를 나타낸다.
표 12는 단핵구 상에서 CD23 발현의 IC50 억제 값 및 PBMC에 의한 TARC 분비의 IC50 억제 값을 제시한다. 이 데이터는 각각의 BDG 이중 항체가 인간 PBMC에서 IL-13 및 TSLP 둘 다의 기능을 억제할 수 있음을 입증한다.
PBMC 기능 검정 요약 표.
항체# PBMC 기능 검정
IC50 CD23 [nM] IC50 TARC [nM]
BDG38.074 0.1578 2.771
BDG38.075 0.09752 4.168
BDG38.076 0.3078 3.206
BDG38.077 0.01245 2.466
BDG38.078 0.1252 6.516
BDG38.079 0.07179 1.961
BDG38.080 0.2011 0.7904
BDG38.081 0.03386 5.929
BDG38.082 0.03908 1.577
BDG38.083 0.02146 11.37
BDG38.090 0.006556 0.007555
BDG38.092 0.06747 5.876
BDG38.094 0.1724 0.3556
BDG38.096 0.2504 23.41
BDG38.106 0.1616 NaN
BDG38.112 0.05937 0.1039
BDG38.116 0.08366 59.36
BDG38.117 0.1207 5.40E+15
BDG38.125 0.0527 NaN
BDG38.126 0.0868 2.575
BDG38.128 0.01492 NaN
BDG38.129 0.029 NaN
BDG38.131 0.07 NaN
BDG38.132 0.43 22.39
BDG38.135 0.4075 0.8042
BDG38.137 0.3728 0.8233
BDG38.138 0.1638 2.358
BDG38.139 0.012 -
BDG38.140 0.146 -
*NaN은 결정할 수 없는 값을 나타낸다.
표 13은 테제펠루맙과의 경쟁 ELISA로부터 얻은 IC50 값을 제시한다. 데이터는 BDG 이중 항체가 TSLP 결합을 위해 테제펠루맙과 경쟁한다는 것을 입증한다.
IC50 경쟁 ELISA 값 요약 표.
항체# IC50(nM) 대 항-TSLP 벤치마크
BDG38.074 3.66
BDG38.075 3.94
BDG38.076 5.382
BDG38.077 8.47
BDG38.078 4.3
BDG38.079 3.63
BDG38.080 3.27
BDG38.081 2.2
BDG38.082 2.7
BDG38.083 3.33
BDG38.090 7.31
BDG38.092 7.382
BDG38.096 5.871
BDG38.106 10.09
BDG38.112 29.14
BDG38.116 5.123
BDG38.117 6.137
BDG38.125 8.442
BDG38.126 5.953
BDG38.128 5.378
BDG38.129 5.494
BDG38.132 9.203
BDG38.137 10.89
BDG38.139 9.571
BDG38.140 5.628
표 14는 MUTZ5 세포(인간 B 세포 전구체 백혈병 세포)를 사용한 TSLP 기능 억제 검정의 데이터를 제시한다. STAT5 인산화 억제의 IC50 값은 pM으로 제시되어 있고, R2 열은 적합도 값의 양호함을 나타낸다. 이들 결과는 BDG 이중 항체가 고유 TSLP-수용체 이종복합체(TLSP-R 및 IL-7R)를 발현하는 MUTZ5 세포주에서 TSLP 기능을 억제할 수 있음을 입증한다.
MUTZ5 세포주에서 TSLP 기능 억제 검정.
항체# IC50 [pM] R2
BDG38.074 46.74 0.925
BDG38.075 43.86 0.9919
BDG38.076 30.14 0.9322
BDG38.077 304.1 0.7798
BDG38.078 337.5 0.9148
BDG38.079 21.84 0.8359
BDG38.080 34.33 0.9534
BDG38.081 38.74 0.9556
BDG38.086 830.1 0.01605
BDG38.090 43.35 0.2951
BDG38.091 0.5069 0.43
BDG38.092 33.05 0.5048
BDG38.094 27.16 0.9719
BDG38.096 5.44E-05 0.6063
BDG38.098 68.84 0.07219
BDG38.107 0.5081 0.3199
BDG38.110 0.2951 0.8273
BDG38.112 11383 0.05737
BDG38.115 300.3 0.1132
BDG38.117 0.3628 0.5132
BDG38.118 0.6884 0.4463
BDG38.120 0.2315 0.7447
BDG38.125 8.74E-05 0.7192
BDG38.126 0.04215 0.7997
BDG38.127 0.1433 0.5647
BDG38.128 0.004796 0.639
BDG38.129 0.6765 0.5382
BDG38.132 0.3858 0.737
BDG38.134 32.04 0.7965
BDG38.137 1.855 0.08069
BDG38.138 45.24 0.9313
BDG38.139 88.95 0.8952
BDG38.140 2.211 0.5831
표 15는 IL-4/IL-13 리포터 HEK 293 세포에서의 기능 억제 검정의 결과를 보여준다. STAT6 인산화 억제의 IC50 값은 nM 단위로 제시되어 있다. 이 데이터는 BDG 이중 항체가 IL-13-수용체 이종이량체(IL-13Rα1 및 IL-4Rα)를 발현하는 리포터 HEK 세포주 세포에서 IL-13 기능을 억제할 수 있음을 입증하였다.
IL-4/IL-13 리포터 HEK 293 세포주에서 IL-13 기능 억제 검정.
항체# HEK-IL-13 [nM]
BDG38.074 0.02407
BDG38.075 0.06912
BDG38.076 0.04938
BDG38.077 0.05055
BDG38.078 0.05079
BDG38.079 0.0253
BDG38.080 0.05923
BDG38.081 0.04828
BDG38.082 0.04295
BDG38.083 0.04194
BDG38.084 0.0419
BDG38.085 0.02355
BDG38.086 0.0174
BDG38.087 -------
BDG38.088 0.04861
BDG38.089 0.07497
BDG38.090 0.1035
BDG38.091 0.08321
BDG38.092 0.1197
BDG38.093 0.04018
BDG38.094 0.04873
BDG38.095 0.08224
BDG38.096 0.1505
BDG38.097 0.04645
BDG38.098 0.08838
BDG38.099 0.06009
BDG38.100 0.08009
BDG38.101 0.04035
BDG38.102 0.04211
BDG38.103 0.084
BDG38.104 0.03805
BDG38.105 0.1341
BDG38.106 0.01134
BDG38.107 0.09427
BDG38.108 0.06595
BDG38.109 0.06295
BDG38.110 0.02988
BDG38.111 0.05454
BDG38.112 0.03665
BDG38.113 0.02843
BDG38.114 0.09887
BDG38.115 0.06638
BDG38.116 0.1799
BDG38.117 0.08006
BDG38.118 0.08044
BDG38.119 0.06617
BDG38.120 0.2649
BDG38.121 0.05618
BDG38.122 0.07895
BDG38.123 0.04405
BDG38.124 0.05233
BDG38.125 0.05618
BDG38.126 0.07895
BDG38.127 0.04405
BDG38.128 0.05233
BDG38.129 0.07253
BDG38.130 0.06463
BDG38.131 0.0443
BDG38.132 0.08986
BDG38.133 0.02895
BDG38.134 0.2711
BDG38.135 0.4058
BDG38.136 0.1509
BDG38.137 0.1951
BDG38.138 0.02862
BDG38.139 0.04644
BDG38.140 0.04303
BDG38.141 0.08244
BDG38.142 0.05843
BDG38.143 0.04382
항체 BDG38.074
항체 BDG38.074에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석은 도 17a 및 17b에 도시되어 있다. 이동상으로서의 PBS 중에서 BioResolve SEC mAb 컬럼(200Å, 2.5 μm, 4.6 x 300 mm, 0.5 ml/분)을 사용하여 SEC 분석(도 17a)을 수행하고, 280 nm에서 분석하였다. BDG38.074는 우세한 단분산 피크를 보여주고, 응집체는 검출할 수 없었다. DSF 분석(도 17b)은 20~95℃에서 1℃/분으로 nanoDSF를 사용하여 수행하였다.
NanoDSF는 350 및 330 nm에서의 고유한 형광 변화에 따라 BDG38.074의 열적 펼쳐짐을 모니터링하는 것이다. 도 17b의 그래프의 상단 절반은 350 nm/330 nm의 형광 비율을 온도의 함수로서 나타내고, 하단 절반은 제1 미분을 온도의 함수로서 나타낸다. BDG38.074를 PBS 중 0.5 mg/ml에서 분석하자 T-onset이 60.3℃이고 Tm은 62.2℃인 것으로 나타났는데, 이는 접힘이 비교적 안정함을 시사한다.
인간/cyno IL-13 및 인간/cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.074의 결합 친화도는 도 18a~18d에 도시되어 있다. 인간 IL-13(도 18a), 인간 TSLP(도 18b), cyno IL-13(도 18c), 및 cyno TSLP(도 18d)에 결합하는 BDG38.074에 대해 BiacoreT200을 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. CM5 칩을 인간 항체 포획 키트로 코팅하여 3000~5000 RU를 수득하고, 포획 역할을 한 항체를 10 ul/ml의 유속으로 주입하여 250~350 RU를 수득하였다. 인간/cynoTSLP 및 인간/cynoIL-13은 30~0.153 nM의 농도 범위에서 분석물의 역할을 하였다. 30 ul/분의 유속, 접촉 시간 300초, 및 해리 시간 600초에서, BDG38.074는 다음의 KD 값으로 모든 시험된 사이토카인에 대해 높은 친화도를 나타낸다: hIL-13의 경우: 2.95E-11M, hTSLP의 경우: 3.34E-12 M, cyno IL-13의 경우: 7.33E-10 M, 및 cyno TSLP의 경우: 4.16E-12 M.
인간 또는 cyno IL-13 또는 TSLP에 대한 항체 BDG38.074의 SPR(표면 플라스몬 공명) 분석 결과는 도 21a 및 21b에 도시되어 있다. SPR 분석에 기초하면, 인간 및 시노몰구스 IL-13에 대한 BDG 38.074의 친화도는 각각 수십 내지 수백 피코몰이고, 인간 및 시노몰구스 TSLP에 대한 친화도는 수 피코몰이다.
도 22a는 항체 BDG38.074가 항-IL-13 벤치마크(Tralokinumab)와 유사하게 CD23 발현을 억제함을 보여준다. 도 22b는 항체 BDG38.074가 항-TSLP 벤치마크(테제펠루맙)와 유사하게 TARC 발현을 억제함을 보여준다. 이들 데이터는 항-TSLP 벤치마크가 단핵구에서 CD23 발현을 억제하는 데 있어서 제한된 효과만을 갖고, 항-IL-13 벤치마크가 TARC 수준을 억제하는 데 있어서 제한된 효과만을 갖지만, BDG38.074는 CD23 및 TARC 발현을 모두 억제함을 나타내는데, 이는 단일 표준 IgG1(LALALA PG) 항체로서의 2개의 구별되는 기능을 발휘하는 BDG 이중 항체의 고유한 능력을 입증한다.
도 23은 항체 BDG38.074가 MUTZ-5 세포주에서 항-TSLP 벤치마크와 유사한 기능적 억제를 나타낸다는 것을 보여주는데, 이는 고유 TSLP 수용체 서브유닛을 발현하는 세포에서 BDG38.074가 약 35pM의 IC50으로 TSLP 기능을 억제함을 입증한다.
도 24는 항체 BDG38.074가 HEK 리포터 세포주에서 수십 피코몰의 친화도로 IL-13 기능을 억제함을 보여주는데, 이는 IL-13 수용체 이종복합체 IL-4Rα 및 IL-13Rα1을 발현하는 세포에서 BDG 38.074가 IL-13 기능을 억제함을 입증한다.
항체 BDG38.079
항체 BDG38.074에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석은 도 19a 및 19b에 도시되어 있다.
이동상으로서의 PBS 중에서 BioResolve SEC mAb 컬럼(200Å, 2.5 μm, 4.6 x 300 mm, 0.5 ml/분)을 사용하여 SEC 분석(도 19a)을 수행하고, 280 nm에서 분석하였다. BDG38.079는 우세한 단분산 피크를 나타내고, 응집체 백분율은 적다(1.34%). DSF 분석(도 19b)은 20~95℃에서 1℃/분으로 nanoDSF를 사용하여 수행하였다. NanoDSF는 350 및 330 nm에서의 고유한 형광 변화에 따라 BDG38.079의 열적 펼쳐짐을 모니터링하는 것이다. 그래프의 상단 절반은 350 nm/330 nm의 형광 비율을 온도의 함수로서 나타내고, 하단 절반은 제1 도함수를 온도의 함수로서 나타낸다. BDG38.079를 PBS 중 0.5 mg/ml에서 분석하자 T-onset이 61.4℃이고 Tm은 64.2℃인 것으로 나타났는데, 이는 접힘이 비교적 안정함을 시사한다.
인간/cyno IL-13 및 인간/cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.079의 결합 친화도는 도 20a~20d에 도시되어 있다. 인간 IL-13(도 20a), 인간 TSLP(도 20b), cyno IL-13(도 20c), 및 cyno TSLP(도 20d)에 결합하는 BDG38.079에 대해 BiacoreT200을 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. CM5 칩을 인간 항체 포획 키트로 코팅하여 3000~5000 RU를 수득하고, 포획 역할을 한 항체를 10 ul/ml의 유속으로 주입하여 250~350 RU를 수득하였다. 인간/cynoTSLP 및 인간/cynoIL-13은 30~0.153 nM의 농도 범위에서 분석물의 역할을 하였다. 30 ul/분의 유속, 접촉 시간 300초, 및 해리 시간 600초에서, BDG38.079는 다음의 KD 값으로 모든 시험된 사이토카인에 대해 높은 친화도를 나타낸다: hIL-13의 경우: 3.17E-11 M, hTSLP의 경우: 2.21E-12 M, IL-13의 경우: 9.01E-10 M, 및 cyno TSLP의 경우: 3.97E-12M.
인간 또는 cyno IL-13 또는 TSLP에 대한 항체 BDG38.079의 SPR(표면 플라스몬 공명) 분석 결과는 도 21에 도시되어 있다. SPR 분석에서, 인간 및 시노몰구스 IL-13에 대한 BDG 38.079의 친화도는 각각 수십 내지 수백 피코몰이고, 인간 및 시노몰구스 TSLP에 대한 친화도는 수 피코몰이다.
도 22는 항체 BDG38.079가 HEK 리포터 세포주에서 수십 피코몰의 친화도로 IL-13 기능을 억제함을 보여주는데, 이는 IL-13 수용체 이종복합체 IL-4Rα 및 IL-13Rα1을 발현하는 세포에서 BDG 38.079가 IL-13 기능을 억제함을 입증한다.
도 23은 항체 BDG38.079가 MUTZ-5 세포주에서 항-TSLP 벤치마크와 유사한 기능적 억제를 나타낸다는 것을 보여주는데, 이는 고유 TSLP 수용체 서브유닛을 발현하는 세포에서 BDG38.079가 약 13pM의 IC50으로 TSLP 기능을 억제함을 입증한다.
도 24a는 항체 BDG38.079가 항-IL-13 벤치마크(Tralokinumab)와 유사하게 CD23 발현을 억제함을 보여준다. 도 24b는 항체 BDG38.079가 항-TSLP 벤치마크(테제펠루맙)와 유사하게 TARC 발현을 억제함을 보여준다.
이들 데이터는 항-TSLP 벤치마크가 단핵구에서 CD23 발현을 억제하는 데 있어서 제한된 효과만을 갖고, 항-IL-13 벤치마크가 TARC 수준을 억제하는 데 있어서 제한된 효과만을 갖지만, BDG38.079는 CD23 및 TARC 발현을 모두 억제함을 나타내는데, 이는 단일 표준 IgG1(LALALA PG) 항체로서의 2개의 구별되는 기능을 발휘하는 BDG 이중 항체의 고유한 능력을 입증한다.
항체 BDG38.094
항체 BDG38.094에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석은 도 25a 및 25b에 도시되어 있다.
항체 BDG38.094에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석은 도 25a 및 25b에 도시되어 있다. 이동상으로서의 PBS 중에서 BioResolve SEC mAb 컬럼(200Å, 2.5 μm, 4.6 x 300 mm, 0.4 ml/분)을 사용하여 SEC 분석(도 25a)을 수행하고, 280 nm에서 분석하였다. BDG38.094는 우세한 단분산 피크를 보여주고, 응집체는 검출할 수 없었다. DSF 분석(도 25b)은 20~95℃에서 1℃/분으로 nanoDSF를 사용하여 수행하였다. NanoDSF는 350 및 330 nm에서의 고유한 형광 변화에 따라 BDG38.094의 열적 펼쳐짐을 모니터링하는 것이다. 그래프의 상단 절반은 350 nm/330 nm의 형광 비율을 온도의 함수로서 나타내고, 하단 절반은 제1 도함수를 온도의 함수로서 나타낸다. BDG38.094를 PBS 중 0.5 mg/ml에서 분석하자 T-onset이 62.4℃이고 Tm은 65.3℃인 것으로 나타났는데, 이는 접힘이 비교적 안정함을 시사한다.
인간/cyno IL-13 및 인간/cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.094의 결합 친화도는 도 26a~26d에 도시되어 있다. 인간 IL-13(도 26a), 인간 TSLP(도 26b), cyno IL-13(도 26c), 및 cyno TSLP(도 26d)에 결합하는 BDG38.094에 대해 BiacoreT200을 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. CM5 칩을 인간 항체 포획 키트로 코팅하여 3000~5000 RU를 수득하고, 포획 역할을 한 항체를 10 ul/ml의 유속으로 주입하여 250~350 RU를 수득하였다. 인간/cyno TSLP 및 인간/cyno IL-13은 30~0.153 nM의 농도 범위에서 분석물의 역할을 하였다. 30 ul/분의 유속에서 접촉 시간은 300초였고 해리 시간은 600초였다(cyno IL-13 해리 시간은 200초 였음). BDG38.074는 다음의 KD 값으로 모든 시험된 사이토카인에 대해 높은 친화도를 나타낸다: hIL-13의 경우: 1.38E-11 M, hTSLP의 경우: <1E-12 M (검출 한계 미만), IL-13의 경우: 2.70E-10 M, 및 cyno TSLP의 경우: 2.75E-12 M.
항체 BDG38.138
항체 BDG38.138에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스캔 및 융점의 나노-시차주사 형광측정(DSF) 분석은 도 27a 및 27b에 도시되어 있다.
이동상으로서의 PBS 중에서 BioResolve SEC mAb 컬럼(200Å, 2.5 μm, 4.6 x 300 mm, 0.4 ml/분)을 사용하여 SEC를 수행하고, 280 nm에서 분석하였다. BDG38.138은 우세한 단분산 피크를 보여주고, 응집체는 0.8%였다. DSF 분석은 20~95℃에서 1℃/분으로 nanoDSF를 사용하여 수행하였다. NanoDSF는 350 및 330 nm에서의 고유한 형광 변화에 따라 BDG38.138의 열적 펼쳐짐을 모니터링하는 것이다. 그래프의 상단 절반은 350 nm/330 nm의 형광 비율을 온도의 함수로서 나타내고, 하단 절반은 제1 도함수를 온도의 함수로서 나타낸다. BDG38.138을 PBS 중 0.5 mg/ml에서 분석하자 T-onset이 62.8℃이고 Tm은 66℃인 것으로 나타났는데, 이는 접힘이 비교적 안정함을 시사한다.
인간/cyno IL-13 및 인간/cyno TSLP에 대한 항체 BDG38.138의 결합 친화도는 도 28a~28d에 도시되어 있다. BiacoreT200을 사용한, 인간 IL-13(도 28a), 인간 TSLP(도 28b), cyno IL-13(도 28c), 및 cyno TSLP(도 28d)에 결합하는 BDG38.138에 대한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. CM5 칩을 인간 항체 포획 키트로 코팅하여 3000~5000 RU를 수득하고, 포획 역할을 한 항체를 10 ul/ml의 유속으로 주입하여 250~350 RU를 수득하였다. 인간/cyno TSLP 및 h/cyno IL-13은 30~0.153 nM의 농도 범위에서 분석물의 역할을 하였다. 30 ul/분의 유속에서 접촉 시간은 300초였고 해리 시간은 600초였다(cyno IL-13의 경우 해리 시간은 200초였음). BDG38.138은 다음의 KD 값으로 모든 사이토카인에 대해 높은 친화도를 나타낸다: hIL-13의 경우: 1.34E-11 M, hTSLP의 경우: 2.85E-12 M, cynoIL-13의 경우: 8.49E-10 M, 및 cyno TSLP의 경우: 1.35E-12 M.
요약:
제시된 데이터는 BDG 이중 항체가 고도로 단량체적이고 안정한 분자임을 입증한다(표 11). 이들 항체는 피코몰의 친화도로 인간 IL-13, 시노몰구스 IL-13, 인간 TSLP, 및 시노몰구스 TSLP에 결합할 수 있다(도 16a~16f). 다른 이중 특이적 항체와 달리, 특허에 언급된 각각의 BDG 이중 항체는 전술한 항원에 결합할 수 있는 표준 IgG1(LALA, PG)이다.
항체의 결합 중 일부가 검출 한계를 초과했기 때문에, 테제펠루맙에 대한 IC50 경쟁 ELISA를 수행하였다(표 13, 도 14a~14c). 이 데이터는 SPR 분석을 뒷받침하고 BDG 이중 항체가 TSLP에 결합하기 위해 테제펠루맙과 경쟁할 수 있음을 입증한다.
BDG 항체는 STAT6을 통한 IL-13의 신호전달을 차단함으로써 HEK 리포터 세포에서 IL-13 신호전달을 기능적으로 억제하였음을 입증하였다(표 15, 도 22). 유사하게, BDG 항체는 TSLP-R 및 IL-7Rα를 포함하는 천연 TSLP-수용체 이종복합체를 발현하는 MUTZ 세포에서 TSLP 매개 STAT5 인산화를 억제하였다.
이중 항체의 효과를 시험하기 위해, 증가하는 농도의 BDG 항체 또는 벤치마크 항체가 존재하는 가운데 hPBMC를 hTSLP 및 hIL-13 둘 다로 48시간 동안 처리하였다(표 12, 도 24a 및 24b). 이러한 설정에서, TSLP 치료는 TARC 수준의 증가로 이어졌고, Il-13 치료는 CD23 수준의 증가로 이어졌다. BDG 이중 항체는 항-IL-13 벤치마크(트랄로키누맙)와 유사하게 CD23 발현을 억제하였지만, 항-TSLP 벤치마크의 효과는 미미하였다. 유사하게, BDG 이중 항체는 테제펠루맙과 유사하게 TARC 분비를 억제하였지만, 항-IL-13 벤치마크는 TARC 수준에 미미한 영향만을 미쳤다. 이는 BDG 이중 항체가 TSLP 및 IL-13 모두의 기능을 갖는 단일 IgG1 분자로서 억제함을 입증한다.
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Synthetic polypeptide <400> 14 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val Ala Glu Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 18 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 20 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val Ala Glu Ala Phe Asp Met Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Lys Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 26 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Leu Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser Leu Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Leu Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 32 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Ala Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 36 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 38 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Leu Leu Val Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Ile Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 44 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Val Leu Val Ser Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Ile Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Ala Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 47 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Synthetic polypeptide <400> 50 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Gln Trp Glu Trp Val His Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 54 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcctgat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 59 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtgggaat tagtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat 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tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtggcagt tagtagccga agcattcgat atatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 64 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcgctat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacactagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 65 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtgggaat tagtggcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 66 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccttat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacaccagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 67 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtggatgt tagtagcgga agcattcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 70 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggg 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgaccatgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 71 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtgggaat gggtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 72 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg 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ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgaccatgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 75 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtgggaat tagtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 76 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacatcat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat ggcgatcgtc caagcggtat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacactagct ccgaccacgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 81 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtgggaat tagtggcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 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polynucleotide <400> 91 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300 cagtggctgt tagtagcgga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 92 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 92 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacatcat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcggtat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctggct ccgaccacgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 93 <211> 366 <212> DNA 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caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacatcat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcgcaat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 101 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 101 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctcttatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtagccca 300 cagtgggaat gggtacacga agcattcgat atgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 102 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 102 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacaacat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcggtat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 103 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 103 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctcttatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgttcgcca 300 cagtgggaat gggtacacga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctct 366 <210> 104 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 104 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacatcct gggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcgaaat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacaccagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 105 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60 agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120 ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtagccca 300 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ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180 gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240 ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgttcgcca 300 cagtgggaat gggtacacga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360 agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420 ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480 ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540 gtactggttg tgtacgatga tggcgatcgt ccaagctgga ttccagagcg tttcagcggc 600 tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660 gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720 aaactgaccg ttttg 735 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 136 Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Trp or Ser <400> 137 Ile Xaa Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 138 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Glu, Gln, Met, Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Leu, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> His, Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ile, Leu or Met <400> 138 Ala Arg Xaa Pro Gln Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ala Phe Asp Xaa 1 5 10 15 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Asn, Leu or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Leu or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Leu <400> 139 Xaa Xaa Gly Ser Lys Xaa Val 1 5 <210> 140 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 156 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 157 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr 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polynucleotide <400> 164 tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60 acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120 caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcctgat tccagagcgt 180 ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240 gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300 gggggcacca aactgaccgt tttg 324 <210> 165 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly 1 5 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 167 Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Val Ala Glu Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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ggcctttgat ctgtgggggc agggcacaat ggtgaccgtt 360 tcctca 366 <210> 184 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 184 agttacgtgc tgacacaacc tccaagtgtt agtgtcgcac caggacaaac agcacgtatt 60 acatgtggag gaaatcttat cggtgccaag ctggtgcact ggtaccagca gaaacctggt 120 caggccccag tactggttgt gtatgatgac agcgaccgtc caagccgtat cccagaacgt 180 ttttctggga gcaactcagg taatacagcc actctgacca tttcacgtgt tgaggcagga 240 gatgaggccg attattattg ccaagtatgg gaccacagct ctgaccatgt tgtttttggc 300 ggagggacta agctgaccgt gctt 324 <210> 185 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 185 cagatgcaac tggtggagtc aggaggcggc gtggtgcagc caggacgttc tctgcgtctg 60 tcttgcgcag cttccgggtt cgcctttcgt acctatggga tgcattgggt gcgtcaggct 120 ccaggtaagg gactggagtg ggtcgctgtt atttgggacg acggaagtaa cactcattac 180 gccgacagcg tgaagggccg tttcacaatt acccgtgaca attccaagaa taccttgaac 240 ctgcagatga actctcttcg tgctgaagat accgccgtgt actattgcgc ccgtgctcca 300 cagtggtatc tgtcagcaga ggccttcgac ctgtggggac agggaacaat ggtgaccgta 360 tcttca 366 <210> 186 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 186 tcctatgtgc tgacacagcc acctagcgtg agcgtcgccc caggtcagac cgctcgtatc 60 acttgtggcg ggaaccttat cggcagcaag ctggtgcact ggtaccagca gaagcctggc 120 caagcacctg tgctggtcgt ttatgacgac tctgaccgtc catcccgtat cccagaacgt 180 ttctctggct ctaactctgg gaataccgct accctgacaa tctcacgtgt tgaagctggc 240 gacgaggcag attattattg ccaagtctgg gatcactcca gcgatcacgt cgtgttcgga 300 ggcggaacaa aattgactgt cctg 324 <210> 187 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 187 caaatgcagc tggtggaatc cgggggtggg gtcgtccagc ctggccgtag tctgcgtctt 60 tcctgtgccg catcaggctt tgctttccgt acctacggga tgcactgggt gcgtcaggcc 120 ccaggaaagg gacttgaatg ggtggctgtc atctggtacg atggttccaa cacacactat 180 gccgattcag tgaaagggcg tttcaccatt actcgtgaca atagtaagaa tactctgaat 240 ctgcaaatga attcactgcg tgctgaggac accgctgttt attactgtgt gcgtgctcct 300 cagtggtacc tgagtgccga agctttcgat ttgtggggac agggcacaat ggtgacagtc 360 agttct 366 <210> 188 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 188 tcttacgtgt tgacacaacc accaagtgtt agtgtcgcac ctggccaaac cgctcgtatc 60 acctgtggtg ggaatcttat tggctctaag ctggtgcact ggtatcagca gaaaccaggc 120 caggctccag tactggtggt gtacgacgac tctgaccgtc caagccgtat cccagagcgt 180 ttcagtggct ctaactccgg gaacacagca actcttacaa tttcacgtgt ggaggccggt 240 gatgaagccg actactattg ccaggtttgg gactacagta gtaatcacgt ggttttcggt 300 ggtggtacca agctgactgt gttg 324 <210> 189 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 189 cagatgcagc tggttgaatc tggcggcggt gtggtccagc ctggtcgtag cctgcgtctg 60 tcctgtgctg caagcggatt tgcctttgac acctatggga tgcactgggt acgtcaggcc 120 ccaggaaagg gcctggaatg ggtggcagtt atctggtatg atggttctaa taccgtgtat 180 gccgactccg ttaaaggccg tttcactatc acccgtgata atagtaaaaa cacactgaac 240 ctgcagatga atagcttgcg tgctgaggac accgcagtgt actactgtgc ccgtgctcct 300 cagtggtatc tgtcagcaga ggccttcgat ctgtggggcc aagggacaat ggtgaccgtg 360 tcttcc 366 <210> 190 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 190 agctatgttc tgactcaacc acctagtgtg agtgtggccc ctggtcagac tgcacgtatt 60 acctgtggcg gaaaccttat cggcagtaag ctggttcatt ggtatcagca gaagccagga 120 caggcaccag tgctggtcgt ttacgacgat agtgaccgtc catcacgtat cccagagcgt 180 tttagcgggt ccaattccgg aaatacagca accttgacca ttagccgtgt ggaagccggc 240 gatgaagctg attattactg ccaggtatgg gaccattcct ccgaccacta cgtttttggt 300 ggcggaacta agctgacagt cttg 324 <210> 191 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 191 cagatgcagc ttgttgagag cggcggaggc gtggtgcaac caggccgttc attgcgtctg 60 tcctgcgccg ccagcggctt tgcttttcgt acatacggca tgcactgggt gcgtcaggcc 120 cctggcaagg ggctggaatg ggtcgccgtg atttggtatg acggtagtaa cacccattat 180 gctgattccg tcaagggacg tttcactatc acccgtgaca atagcaaaaa tacactgaat 240 ctgcaaatga attcattgcg tgccgaagac accgccgtat attactgtgt ccgtgcccca 300 cagtggtacc tgagcgctga ggccttcgat ctgtggggtc aggggactat ggtgaccgta 360 tcatcc 366 <210> 192 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 192 tcttacgtgc ttactcagcc tcctagcgtc tcagtggccc caggcgagac agcaaccatt 60 acatgcgggg gtaatttgat cggtagcaag ctggtgcatt ggtatcagca gaagcctggc 120 caggccccag tgctggttgt atatgacgat agtgatcgtc caagtcgtat ccctgagcgt 180 tttagcggat ctaactccgg caacacagcc acattgacaa tcagccgtgt ggaggcaggc 240 gatgaggccg actactactg ccaagtttgg gaccactcct ctgaccacgt ggtatttggc 300 ggaggaacaa agcttacagt tttg 324 <210> 193 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 193 cagatgcagc tggtggagag tggaggtggt gtggtgcaac ctgggcgtag cctgcgtttg 60 agctgcgctg cctctggatt tgccttccgt acctatggca tgcactgggt gcgtcaggct 120 ccaggaaagg ggttggaatg ggtggctgtg atttggtacg acgggagcgc cacacattac 180 gcagacagcg ttaagggccg tttcacaatt acccgtgaca atagcaaaaa tacattgaac 240 ctgcagatga attccctgcg tgcagaggat actgcagtgt actattgcgt ccgtgcccca 300 cagtggtatc tgtcagccga agccttcgat ctgtgggggc agggtactat ggtcaccgta 360 agttcc 366 <210> 194 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 194 tcttatgttt tgacccaacc tccatccgtt agcgtggctc caggtcaaac agctaccatc 60 acatgtggcg gtaaccttat tggctcaaag ctggttcatt ggtatcaaca gaaaccaggc 120 caagccccag tgctggtggt gtatgacgac agtgaccgtc cttctcgtat tcctgagcgt 180 ttttccggct ctaatattgg caacactgcc accctgacca tttctcgtgt ggaagcagga 240 gatgaggcag actattattg tcaggtttgg gatcactcca gcgatcatgt 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peptide <400> 207 Gln Val Trp Asp His Asn Glu Asp Glu Val Val 1 5 10 <210> 208 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 208 Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 209 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 210 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Ala Tyr Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Val Asp Arg Pro Asn Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asn Thr Asp Lys 85 90 95 Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 211 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 214 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Gly Tyr Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Val Asp Arg Pro Ala Arg Ile 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 216 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Ala Leu Ile Gly Ser Arg Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ile Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 217 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 219 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 220 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Gly Tyr Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Val Asp Arg Pro 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Asp Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asn Thr Asn His 85 90 95 Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 223 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr His 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 226 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 226 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Gly Tyr Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 231 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 232 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 232 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Arg Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 237 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 238 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 238 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Arg Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 243 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 244 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 244 Ser Tyr Ile Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Arg Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 350 Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 351 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 351 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 352 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 352 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr 1 5 <210> 353 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 353 Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 354 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 354 Ile Trp Asp Asp Gly Ser Ala Thr 1 5 <210> 355 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 355 Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr Gly 1 5 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 373 Gln Val Trp Asp His Asn Thr Gln Gln Met Val 1 5 10 <210> 374 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 374 Gln Val Trp Asp His Asp Thr Asn Gln Val Val 1 5 10 <210> 375 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 375 Leu Ile Gly Ala Lys Leu 1 5 <210> 376 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 376 Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp Thr Met Val 1 5 10 <210> 377 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 377 Gln Val Trp Asp His Ser Thr Asn Thr Met Val 1 5 10 <210> 378 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 378 Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 379 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 395 Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 396 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 396 Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Thr Met Val 1 5 10 <210> 397 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 397 Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp His Tyr Val 1 5 10 <210> 398 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 398 Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp His Met Val 1 5 10 <210> 399 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 399 Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 400 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 400 Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ala Asp Thr Met 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 406 Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asn His Met Val 1 5 10 <210> 407 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 407 Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser His Thr Met Val 1 5 10 ">서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

  1. 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하는 단리된 이중 결합 항체로서,
    (i) HCDR1은 서열번호 349 또는 355의 아미노산 서열, 또는 서열번호 149 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) HCDR2는 서열번호 350, 352, 354 및 356 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 150의 아미노산 서열, 또는 I HX1 Y D G S N K (서열번호 142)로서 제시된 서열을 포함하되, HX1은 임의의 아미노산이고;
    (iii) HCDR3은 서열번호 351, 353, 357, 및 358 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 151의 아미노산 서열, 또는 A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12 (서열번호 143)로서 제시된 서열을 포함하되, HX2, HX3, HX4, HX5, HX6, HX7, HX8, HX9, HX10, HX11, 및 HX12는 임의의 아미노산이고;
    (iv) LCDR1은 서열번호 359, 362, 364, 366, 369, 및 375 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 152의 아미노산 서열, 또는 LX1, LX2, G S K LX3 V(서열번호 144)로서 제시된 서열을 포함하되, LX1, LX2, 및 LX3은 임의의 아미노산이고;
    (v) LCDR2는 서열번호 360 또는 367의 아미노산 서열, 또는 서열번호 153의 아미노산 서열 또는 D D LX4 (서열번호 145)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하되, LX4는 임의의 아미노산이고;
    (vi) LCDR3은 서열번호 361, 363, 365, 368, 370~374, 376~407 중 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 154의 아미노산 서열, 또는 Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V(서열번호 146)로서 제시된 서열을 포함하되, LX5, LX6, 및 LX7은 임의의 아미노산인, 단리된 이중 결합 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  3. 제1항에 있어서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    HX1은 W 또는 S이고; HX2는 A 또는 S이고; HX3은 P이고; HX4는 Q이고; HX5는 W이고; HX6은 E, Q, M, L, 또는 V이고; HX7은 L, W, 또는 Y이고; HX8은 V 또는 T이고; HX9는 H, A, 또는 S이고; HX10은 E이고; HX11은 A이고; HX12는 I, L, 또는 M이고;
    LX1은 N, L, 또는 I이고; LX2는 L 또는 I이고; LX3은 S 또는 L이고; LX4는 S 또는 G이고; LX5는 S 또는 T이고; LX6은 S 또는 G이고; LX7은 H 또는 G인, 단리된 이중 결합 항체.
  5. 제4항에 있어서, HX1은 W이고, HX2는 A 또는 S이고, HX6은 E 또는 M이고, HX7은 L 또는 W이고, HX8은 V 또는 T이고, HX9는 H 또는 A이고, HX12는 I 또는 L이고, LX1은 L이고, LX2는 I이고, LX3은 L이고, LX4는 S 또는 G이고, LX5는 S이고, LX6은 S이고, LX7은 H 또는 G인, 단리된 이중 결합 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    a. HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 E이고, HX7은 L이고, HX8은 T이고, HX9는 A이고, HX12는 I이고, LX4는 S이고, LX7은 G이거나;
    b. HX1은 W이고, HX2는 A이고, HX6은 M이고, HX7은 L이고, HX8은 V이고, HX9는 A이고, HX12는 L이고, LX4는 S이고, LX7은 H이거나;
    c. HX1은 W이고, HX2는 S이고, HX6은 E이고, HX7은 W이고, HX8은 V이고, HX9는 H이고, HX12는 L이고, LX4는 G이고, LX7은 G인, 단리된 이중 결합 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 상기 상기 VH 및 VL은 서열번호 209 및 210, 서열번호 219 및 220, 서열번호 249 및 250, 서열번호 337 및 338, 서열번호 155 및 156, 서열번호 157 및 158, 서열번호 4 및 3, 서열번호 6 및 5, 서열번호 8 및 7, 서열번호 10 및 9, 서열번호 12 및 11, 서열번호 14 및 13, 서열번호 16 및 15, 서열번호 18 및 17, 서열번호 20 및 19, 서열번호 22 및 21, 서열번호 24 및 23, 서열번호 26 및 25, 서열번호 28 및 27, 서열번호 30 및 29, 서열번호 32 및 31, 서열번호 34 및 33, 서열번호 36 및 35, 서열번호 38 및 37, 서열번호 40 및 39, 서열번호 42 및 41, 서열번호 44 및 43, 서열번호 46 및 45, 서열번호 48 및 47, 서열번호 50 및 49, 서열번호 52 및 51, 또는 서열번호 54 및 53의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 상기 VH 및 VL은 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  9. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하되,
    (c) 상기 VH 도메인은 위치 52, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 111, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 57, 107, 108, 109, 110, 111, 111A, 112A, 112, 113, 114, 또는 117, 또는 이들의 조합) 중 2개 이상에서 아미노산 변이체를 갖는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) 상기 VL 도메인은 위치 26, 27, 31, 51, 56, 77, 92, 93, 또는 96 중, 또는 이들의 임의의 조합(IMGT 위치: 27, 28, 38, 65, 70, 94, 109, 110, 또는 115, 또는 이들의 조합) 중 2개 이상에서 아미노산 변이체를 갖는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fv, scFv, Fab, F(ab')2, 미니바디, 디아바디, 또는 트리아바디를 포함하는, 단리된 이중 결합 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인, 단리된 이중 결합 항체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 IgG는 돌연변이된 IgG를 포함하고, 상기 돌연변이체 IgG는 항체 의존적 세포 세포독성 성분에 결합할 수 없는, 단리된 이중 결합 항체.
  13. 제1항의 단리된 이중 결합 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  14. 제1항의 단리된 이중 결합 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 작제물.
  15. 제14항의 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항의 단리된 이중 결합 항체를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 알레르기성 또는 호흡기 병태, 염증성 또는 자가면역 병태, 또는 종양 또는 암인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 천식, 알레르기성 천식, 비알레르기성 천식, 중증 천식, 경증 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기도 염증을 포함하는 병태, 낭성 섬유증, 알러지성 폐 질환, 기도 과민증, 배상 세포 화생, 점액 과다분비, 기도 개형, 폐 섬유증, 아토피성 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 장위염, 알레르기성 비염, 염증성 장 질환, 간경변증 또는 섬유증, 또는 이들의 조합인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 이중 결합 항체는 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)을 포함하고 경쇄 상에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하되,
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 359, 360, 및 361의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 356, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 371의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 362, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 서열번호 349, 350, 및 351의 아미노산 서열을 각각 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 서열번호 364, 360, 및 384의 아미노산 서열을 각각 포함하거나;
    서열번호 149~154의 서열을 갖는 CDR을 포함하는, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 이중 결합 항체는 중쇄 상에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 경쇄 상의 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함하되, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 표 8 또는 표 4에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 표 9 또는 표 5에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 이중 결합 항체는 서열번호 209 및 210, 서열번호 219 및 220, 서열번호 249 및 250, 서열번호 337 및 338, 서열번호 155 및 156, 서열번호 157 및 158의 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 이중 결합 항체는 표 10 또는 표 1에 표시된 것과 같은 서열을 갖는 VH 및 VL을 포함하는, 방법.
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