CN117616043A

CN117616043A - 经工程化的双重结合抗体及其用途

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Publication number: CN117616043A
Application number: CN202280050233.5A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·德米什坦; 什穆埃尔·伯恩斯坦; 托莫·施莱姆科维奇; 阿耶莱特·陈; 耶赫兹克尔·萨松; 马雷克·斯特拉布尔; 伊泰·莱文; 莎伦·费奇曼; 亚奈·奥弗兰; 盖伊·尼姆罗德; 阿列克谢·施奈德; 哈达尔·加泰尼奥; 尼科尔·马尔琴科; 奥尔加·布卢夫施泰因耶莫雷耶夫; 诺姆·格罗斯曼; 利龙·丹尼尔普尔; 伊扎克·梅尔; 莫亚·伊夫拉齐; 列乌特·巴拉克福克斯; 迈克尔·哲宁
Original assignee: Bayer Rojic Design Co ltd
Current assignee: Bayer Rojic Design Co ltd
Priority date: 2021-05-30
Filing date: 2022-05-29
Publication date: 2024-02-27

Abstract

本文描述了经工程化的双重结合抗体及其用途，所述经工程化的双重结合抗体结合至IL‑13和TSLP。用途包括治疗过敏性和呼吸系统病症。本文还描述了包含经工程化的双重结合抗体的文库，以及产生经工程化的双重结合抗体的方法以及所述抗体的功能和生物化学表征。

Description

经工程化的双重结合抗体及其用途

序列表声明

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2022年5月25日，名称为P-605548-PC.txt，大小为14.8千字节。

技术领域

本公开整体涉及结合至IL-13和TSLP的双重结合抗体。在一个实施方案中，所述抗体可以用于治疗过敏性或呼吸系统病症。

背景技术

IL-13是I类细胞因子的12.3kDa单体蛋白。IL-13具有I类短螺旋细胞因子典型的4α螺旋束核心拓扑结构；它在结构上与其密切相关的细胞因子IL-4相似，序列同一性较低，但结构同一性较高。据显示，IL-13与IL-4一起在B细胞中控制免疫球蛋白类别向IgE的转变，并且涉及肥大细胞募集。IL-13由CD4⁺Th2细胞，以及2型先天淋巴样细胞ILC2分泌。已经表明，IL-13可以触发(TGF-β)的产生，并且在支气管上皮细胞中诱导TGF-β的基因表达MUC5AC和粘蛋白的产生。IL-13还可以增强支气管平滑肌细胞的收缩。IL-13结合IL-4Ra/IL-13Ra1异源二聚体复合物，并且在结合后触发JAK信号转导物和STAT6依赖性信号传导级联，继而触发Th2辅助T细胞分化、巨噬细胞向M2“交替活化”表型的极化、上皮粘液产生、平滑肌收缩和趋化因子释放。

据显示，IL-13涉及寄生虫预防，其中已经表明，在敲除IL-13小鼠模型中，巴西日圆线虫(N.brasiliensis)的清除严重延迟。另外，尽管对于鼠鞭虫(Trichuris muris)能够产生完整的Th2型反应，但是其排除也被完全消除。进一步研究表明，IL-13是一把双刃剑，一方面它在寄生虫预防方面发挥着重要作用，然而IL-13在免疫系统失调情况下的功能也是熟知的。

IL-13与人类哮喘的发病机理有关，因为在哮喘患者的肺部检测到IL-13mRNA和蛋白质水平的升高，这与疾病的严重度相关。此外，人IL-13遗传多态性已得以鉴定，与哮喘和特应性相关，该遗传多态性导致IL-13水平升高，并且在哮喘患者的肺中检测到IL-13水平的升高。

虽然IL-13和IL-4具有相似的受体和信号传导通路，但是IL-13在哮喘中具有独特的作用，这与IL-4无关。据显示，在小鼠模型中，IL-13的单独施用足以诱导嗜酸性粒细胞源性炎症和粘液细胞增生。此外，IL-13而不是IL-4的特异性阻断足以逆转小鼠模型中的气道高反应性和粘液产生。此外，已知人IL-13基因座的多态性与哮喘的高易感性相关。

因此，IL-13信号传导的特异性抑制可以对哮喘患者或者患有其他已知过敏性或呼吸系统病症的患者产生积极的治疗效果。

胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是一种通过由IL-7Rα亚基和TSLP-R组成的异源二聚体受体来进行信号传导的细胞因子，TSLP-R是与常见γ受体样链同源的独特组分。TSLP由胸腺、肺、皮肤、肠和扁桃体的上皮细胞以及气道平滑肌细胞、肺成纤维细胞和基质细胞表达。这些细胞响应于促炎性刺激而产生TSLP，TSLP通过其对许多先天免疫细胞(包括树突细胞)的活性来驱动过敏性炎症反应。TSLP还可以促进初始T细胞的增殖，并且驱动初始T细胞至表达高水平IL-4、IL-5和IL-13的Th2细胞的分化。据发现，在哮喘肺上皮细胞和慢性特应性皮炎病变中存在高水平的TSLP表达，这表明TSLP在过敏性炎症中发挥作用。最近的证据还表明，TSLP参与Th17细胞的分化和Th17驱动的炎性过程。慢性过敏性(特应性)哮喘通常以Th2型炎症为特征，而非过敏性哮喘炎症主要是中性粒细胞炎症伴混合性Th1和Th17细胞因子环境。预期TSLP的拮抗剂可用于治疗炎性病症。

因此，对于治疗由IL-13和TSLP活化触发的疾病和病症(例如但不限于过敏性和呼吸系统病症，包括但不限于哮喘)的组合物和方法仍然存在未满足的需要。

发明内容

在一个实施方案中，本公开提供了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中所述CDR具有SEQ ID NO:149-154的序列。在另一个实施方案中，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL具有SEQ ID NO:155和156，或者SEQ ID NO:157和158的氨基酸序列。

在一个方面，本文公开了一种分离的双重结合抗体，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ IDNO:359、360和361的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、356和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和371的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:362、360和384的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和384的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，HCDR1、HCDR2和HCDR3包含如表8或表4中所示的氨基酸序列，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3包含如表9或表5中所示的氨基酸序列。

在一个方面，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含一组互补决定区(CDR)，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示；其中所述HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F DHX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；或者其中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中所述LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中所述LCDR3的氨基酸序列如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 V V(SEQ ID NO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸；或者(a)和(b)的组合。

在一个相关方面，其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1选自W和S；其中HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M；其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。

在分离的双重结合抗体的另一个相关方面，HX1为W，HX2选自A和S，HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX12选自群组I和L，LX1为L，LX2为I，LX3为L，LX4选自S和G，LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在分离的双重结合抗体的又一个相关方面，分离的双重结合抗体包含CDR，其中HX1为W，HX2为A，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX12为I，LX4为S，并且LX7为G；或者HX1为W，HX2为A，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX12为L，LX4为S，并且LX7为H；或者HX1为W，HX2为S，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX12为L，LX4为G，并且LX7为G。

在分离的双重结合抗体的另一个相关方面，所述VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；或者(a)中所示的VH结构域和(b)中所示的VL结构域的组合；其中所述双重结合抗体的所述VH结构域、所述VL结构域或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在一个进一步相关的方面，所述VH结构域中的所述至少一个变体氨基酸包含SEQID NO:1的106位处的变体(IMTG 112位)。在另一个进一步相关的方面，所述VH结构域的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中所示的序列。在又一个进一步相关的方面，所述VL结构域中的所述至少一个氨基酸变体包含CDR区中的变体氨基酸。在又一个进一步相关的方面，所述VL结构域中的所述变体氨基酸包含SEQ ID NO:2的26位、27位、31位或96位中的任一个，或者它们的组合(IMGT：27位、28位、38位或115位，或者它们的组合)处的变体。在另一个进一步相关的方面，所述VL结构域中存在至少两个变体，并且第二变体包含框架区中的变体氨基酸。在又一个进一步相关的方面，框架区中的所述变体氨基酸包含SEQ ID NO:2的56位或77位，或者它们的组合(IMGT：70位或94位，或者它们的组合)处的变体。

在另一个相关方面，所述VL结构域的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中所示的序列。在另一个相关方面，VH结构域-VL结构域对的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ ID NO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ ID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ ID NO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ ID NO:32和31、SEQ IDNO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ ID NO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ ID NO:50和49、SEQ IDNO:52和51和SEQ ID NO:54和53中所示的序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含SEQ ID NO:209和210的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含SEQ ID NO:219和220的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含SEQ ID NO:249和250的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含SEQ ID NO:337和338的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含如表1或表10中所示的氨基酸序列。

在另一个相关的方面，所述双重结合抗体包括IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。在进一步相关的方面，所述IgG包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在又一个相关的方面，所述IgG包括不能结合至抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG。

在一个方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含所述分离的双重结合抗体和药学上可接受的载剂。

在一个方面，本文公开了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示；其中所述HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10HX11 F D HX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；或者其中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中所述LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中所述LCDR3的氨基酸序列如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 V V(SEQ IDNO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸；或者(a)和(b)的组合。

在核酸的一个相关方面，HCDR2的编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1选自W和S；其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M；其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。

在核酸的一个相关方面，针对HX1的编码的氨基酸序列为W，HX2选自A和S，HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX12选自群组I和L，LX1为L，LX2为I，LX3为L，LX4选自S和G，LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。另一个相关方面，其中针对HX1的编码的氨基酸序列为W，HX2为A，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX12为I，LX4为S，并且LX7为G；或HX1为W，HX2为A，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX12为L，LX4为S，并且LX7为H；或HX1为W，HX2为S，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX12为L，LX4为G，并且LX7为G。

在核酸构建体的一个相关的方面，所述VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；或者(a)中所示的VH结构域和(b)中所示的VL结构域的组合；其中编码的VH结构域、编码的VL结构域或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。在进一步相关的方面，所述序列包含两个核酸序列，一个编码变体双重结合抗体VH结构域，另一个编码变体双重结合抗体VL结构域。在进一步的相关方面，编码所述VH结构域的核酸序列选自SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105和107中所示的序列。在另一个相关方面，编码所述VL结构域的核酸序列选自SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106和108中所示的序列。在另一个进一步相关的方面，编码双抗体VH结构域-VL结构域对的核酸序列选自SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、SEQ ID NO:61和62、SEQ ID NO:63和64、SEQ ID NO:65和66、SEQID NO:67和68、SEQ ID NO:69和70、SEQ ID NO:71和72、SEQ ID NO:73和74、SEQ ID NO:75和76、SEQ ID NO:77和78、SEQ ID NO:79和80、SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQID NO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ ID NO:89和90、SEQ ID NO:91和92、SEQ ID NO:93和94、SEQ ID NO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQ ID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106和SEQ ID NO:107和108中所示的序列。

在核酸构建体的一个相关的方面，所述抗体包括IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。在进一步相关的方面，所述IgG包括不能结合至抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG。

在另一个相关的方面，所述核酸构建体还包含可操作地连接至所述核酸序列的调控序列。

在一个方面，本文公开了一种表达载体，所述表达载体包含编码双重结合抗体的核酸构建体，所述抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域。

在一个方面，本文公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述表达载体，所述表达载体包含编码双重结合抗体的核酸构建体，所述抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域。

在一个方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含编码双重结合抗体的核酸构建体和药学上可接受的载剂，所述抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域。

在一个方面，本文公开了一种产生双重结合抗体的方法，所述双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，所述方法包括培养所述宿主细胞，所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码双重结合抗体的核酸构建体，所述抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域；从所述载体表达所述核酸构建体；分离所述双重结合抗体。

在一个方面，本文公开了一种免疫球蛋白或其片段的文库，所述免疫球蛋白或其片段包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示；其中所述HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(SEQID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；或者其中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中所述LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中所述LCDR3的氨基酸序列如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 V V(SEQ ID NO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

在文库的一个相关方面，HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1选自W和S；其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M；其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。

在文库的另一个相关方面，HX1为W，HX2选自A和S，HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX12选自群组I和L，LX1为L，LX2为I，LX3为L，LX4选自S和G，LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在文库的又一个进一步相关的方面，HX1为W，HX2为A，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX12为I，LX4为S，并且LX7为G；HX1为W，HX2为A，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX12为L，LX4为S，并且LX7为H；或者HX1为W，HX2为S，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX12为L，LX4为G，并且LX7为G。在文库的又一个进一步相关的方面，所述VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；或者(a)中所示的VH结构域和(b)中所示的VL结构域的组合；其中所述VH结构域、所述VL结构域或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在文库的另一个相关的方面，所述免疫球蛋白包括IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。

在文库的另一个相关的方面，所述IgG包括不能结合至抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG。

在一个方面，本文公开了一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述疾病或病症包括过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症，包括霍奇金淋巴瘤，所述方法包括将本文公开的分离的双重结合抗体施用于所述受试者。

在所述治疗受试者的方法的一个相关的方面，所述过敏性或呼吸系统病症是哮喘；过敏性哮喘；非过敏性哮喘；重度哮喘；轻度哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；涉及气道炎症的病症，包括嗜酸性粒细胞增多、纤维化和粘液产生过量、囊性纤维化、过敏性肺部疾病、气道高反应性、杯状细胞化生、粘液分泌过多、气道重塑、肺纤维化；特应性障碍，包括特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性肠胃炎和过敏性鼻炎；或者它们的组合；或者所述炎性和/或自身免疫病症，包括炎性肠病(IBD)和肝脏病症，包括肝硬化或纤维化；或者它们的组合。

附图说明

专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将由专利局在请求并支付必要的费用后提供。

在说明书的结论部分特别指出和明确要求保护经工程化的双重结合抗体的主题。然而，当结合附图阅读时，参考以下具体实施方式，就产生和使用方法而言，可以最好地理解这些双重结合抗体以及它们的目的、特征和优点，其中：

图1A和1B分别提供了模板抗体重链(SEQ ID NO:1)(图1A)和模板抗体轻链(SEQID NO:2)氨基酸序列(图1B)，图中指示了框架(FR)和互补决定区(CDR)区域。对于重(H)链，不同的区域被标记为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，并且在一些实施方案中被称为HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3和HFR4。对于轻(L)链，不同的区域被标记为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，并且在一些实施方案中被称为LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3和LFR4。在模板氨基酸序列下方，展示了经工程化的双重结合克隆的变体氨基酸，并且在CDR和FR区域内对这些变体氨基酸进行了比对。

图2A和2B提供了柱状图，这些柱状图显示了酵母上展示的重表位化的抗体与重组人IL-13(rh-IL-13)(图2A)或重组人TSLP(rhTSLP)(图2B)的结合。图2A显示了分离的酵母表面展示抗IL13克隆与10nM rh-IL-13的结合。图2B显示了分离的酵母表面展示抗TSLP克隆与10nM rhTSLP的结合。数据被归一化为每个克隆的酵母表面表达水平以及阳性对照酵母克隆的抗hIL-13和抗hTSLP平均荧光强度(MFI)结合信号。

图3A-3F提供了人标准IgG1(图3A)、BDG33.003(图3B)、BDG33.004(图3C)、BDG33.005(图3D)、BDG33.023(图3E)和BDG33.025(图3F)的尺寸排阻色谱(SEC)扫描。纯化的IgG在PBS缓冲液中以0.5ml/min的速度在GE200 10/300增量(柱体积(CV)＝25ml)上运行。在图3B-3D中所示的抗体扫描中，前导峰对应于大聚集体的典型柱体积(0.36CV)，第二峰的保留量为普通人IgG的典型柱体积大约13.2ml(0.528CV)。曲线下面积(AUC)峰比率分别为大约23％错误折叠/77％折叠的IgG分数。对于图3E-3F中所示的抗体扫描，前导峰对应于(0.36CV)，是典型的大直径聚集体，第二峰的保留量为大约13.8ml(0.55CV)，是典型的普通人IgG。对于BDG33.023(图3E)和BDG33.025(图3F)，曲线下面积(AUC)峰比率分别为97.3％折叠/2.8％错误折叠和98.5％折叠/1.5％错误折叠。

图4A和4B提供了指定的IgG BDG33.023(图4A)和BDG33.025(图4B)的熔点的差示扫描荧光(DSF)分析。上图中的浅灰色虚线代表T-起始，粗灰色虚线代表Tm1和Tm2。下图是测量的1阶导数。图4A：BDG33.023的DSF，T-起始为64.2℃和第一转变点为67.7℃。图4B：BDG33.025的DSF，T-起始为56.4℃，第一转变点为60.9℃，第二转变点为67.4℃。

图5A-5F提供了抗体与人IL-13、食蟹猕猴IL-13和人TSLP的结合的表面等离子共振(SPR)分析。BDG33.003和BDG33.004与IL-13的结合的代表性SPR超声图提供于图5A-5D中。重组人IL-13(rh-IL-13)在800nM处使用2倍稀释进行测试(图5A-5B)。重组食蟹猕猴IL-13(rc-IL-13)在200nM处使用2倍稀释进行测试(图5C-5D)。BDG33.003和BDG33.004与人TSLP(h-TSLP)的结合的代表性SPR传感图提供于图5E和5F中。hTSLP作为分析物，浓度为3.2nM至0.2nM，稀释倍数为两倍(图5E-F)。BDG33.023和BDG33.025与人IL-13(h-IL-13)的结合的代表性SPR传感图提供于图5G和5H中。hIL-13作为分析物，浓度为20nM至0.6nM，稀释倍数为两倍(图5G-5H)。

图6A-6E提供了BDG33.023和BDG33.025与人TSLP、食蟹猕猴(cyno)TSLP或食蟹猕猴(cyno)IL-13的结合的ELISA EC50。BDG33.023(实心圆形)和BDG33.025(实心正方形)与人TSLP的结合(图6A-人TSLP)。BDG33.023与cyno-TSLP的结合(图6B-33.023食蟹猕猴TSLP)。BDG33.025与cyno-TSLP的结合(图6C-33.025食蟹猕猴TSLP)。BDG33.023与cyno-IL-13的结合(图6D-33.023食蟹猕猴IL-13)。BDG33.025与cyno-IL-13的结合(图6E-33.025食蟹猕猴IL-13)。

图7A-7D提供了抗体与hTSLP或hIL-13的竞争性结合测定法。图7A：将指定抗体(抗TSLP对照；抗IL-13对照；BDG33.023；BDG33.025)与水平逐渐增加的hIL-13一起预温育，并且添加至预涂覆有hIL-13的平板中。随着可溶性hIL-13浓度的增加，BDG33.023和BDG33.025与平板结合的hIL-13的结合受到抑制。图7B：将指定抗体(抗TSLP对照；抗IL-13对照；BDG33.023；BDG33.025)与水平逐渐增加的hTSLP一起预温育，并且添加至预涂覆有hTSLP的平板中。随着可溶性hTSLP浓度的增加，BDG33.023和BDG33.025与平板结合的hTSLP的结合受到抑制。图7C：将抗体(抗TSLP对照；抗IL-13对照；BDG33.023；BDG33.025)与水平逐渐增加的hTSLP一起预温育，并且添加至预涂覆有hIL-13的平板中，随着可溶性hTSLP浓度的增加，BDG33.023与IL-13的结合受到抑制。图7D：将指定抗体(抗TSLP对照；抗IL-13对照；BDG33.023；BDG33.025)与水平逐渐增加的hIL-13一起预温育，并且添加至预涂覆有hTSLP的平板中。随着可溶性hIL-13浓度的增加，BDG33.023与平板结合的hTSLP的结合受到抑制。抗TSLP和抗IL-13对照抗体仅显示出与它们各自的配体的结合，并且仅与它们各自的配体竞争。

图8提供了ELISA特异性测试的结果，该测试将BDG330.23和BDG33.025的非特异性结合与特异性结合进行比较。ELISA板涂覆有hIL-13、hTSLP以及非相关性细胞因子IL-2、IL-17和IL-4。BSA结合信号对应于测定法背景水平。

图9提供了IC50抑制测定法的结果，该测定法测量hTSLP与涂覆有TSLP受体(TSLP-R)的ELISA板的结合的IgG特异性阻断。X-轴代表竞争物的浓度。竞争物：TSLP-R(黑色圆形)，所得的IC50＝3nM；BGD33.023(黑色三角形)，所得的IC50＝0.41nM。

图10提供了HEK-Blue IL-13系统下游信号传导的示意图。

图11A-11D提供了hIL-13pSTAT6信号传导抑制数据。结果基于由重组rh-IL-13进行的HEK-Blue细胞的IL-13活化途径的刺激以及由指定IgG进行的对这种刺激的抑制。将HEK-Blue IL-13细胞(50,000个细胞/孔)与一定浓度范围(0nM-8nM)的rh-IL-13一起温育。在温育后24小时，使用QUANTI-Blue对IL-13下游信号传导进行定量(图11A)。由经工程化的双重结合抗体进行的hIL-13对HEK-BLUE IL-13细胞的下游抑制如下所述进行分析。将rh-IL-13(0.4nM)与抗体浓度范围为0nM-750nM的指定抗体一起温育。所测定的抗体分别为BDG33.002(阳性对照)、BDG33.003(克隆C2)和BDG33.006(阴性对照)(图11B)。克隆BDG33.023和BDG33.025以0nM-100nM的抗体浓度范围进行测定(图11C和11D分别显示了33.023IL-13pSTAT6抑制和33.025IL-13pSTAT6抑制)。在温育后，将hIL-13/IgG混合物添加至细胞中，在温育后24小时，使用QUANTI-Blue对分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性进行定量。显示的数据是三次实验的平均值，误差棒代表标准偏差。

图12A-12C提供了TSLP信号传导通路抑制数据。在人白血病MUTZ5细胞中，TSLP依赖性pSTAT5信号传导活化途径，以及活化的抑制由BDG 33.023进行。图12A显示了MUTZ5CD127(IL-7a)受体和TSLP-R受体表达的流式细胞分析，如下文所述。未染色的细胞(图a)，针对CD127+染色的细胞，其中总细胞群的大约36％被标记(图b)，针对TSLP-R+染色的细胞，其中总细胞群的大约96％被标记(图c)，针对TSLP-R+和CD127+两者染色的细胞，其中总细胞群的大约41％被标记(图d)(图12A)。图12B显示了MUTZ5 pSTAT5活化。MUTZ5细胞中的hTSLP磷酸化-STAT5(pSTAT5)活化的EC50。阳性细胞百分比(％)表示pSTAT5阳性细胞占亲本群体的百分比。图12C显示了MUTZ5pSTAT5活化的抑制。MUTZ5细胞中的TSLP依赖性pSTAT5活化的BDG33.023抑制的IC50。将TSLP与0.48pM至500pM的BDG33.023一起预温育30分钟，并且添加至MUTZ5细胞。阳性细胞代表pSTAT5阳性群体占亲本群体的百分比(图12C)。

图13显示了本文公开的一些双重结合抗体的保留时间和计算pI。IgG标志物保留时间为4.77分钟。

图14A-14C显示了一些双重结合抗体和33.001(特泽佩鲁单抗)相对于TSLP的竞争性ELISA。用50ng/孔的33.001在4℃处对ELISA板进行涂覆过夜。对双重结合抗体进行双倍稀释，并且将双重结合抗体与7nM恒定浓度的TSLP-HIS一起在室温处预温育1小时。在封闭和洗涤步骤后，将双重结合抗体-TSLP混合物放置于平板上，温育10分钟并且再次洗涤，然后与抗HIS一起温育30分钟。结果显示所有测试双重结合抗体均呈现出相似的IC50。

图15显示了本文公开的一些双重结合抗体的纳米级差示扫描荧光(nanoDSF)分析的结果。λ链的Tm阈值>65℃，T-起始>60℃。

图16A-16F显示了本文公开的一些双重结合抗体针对人IL-13和TSLP的SPR (表面等离子共振)分析的结果。

图17A和B显示了抗体BDG38.074的尺寸排阻色谱(SEC)扫描(图17A)，以及熔点的纳米级差示扫描荧光(DSF)分析(图17B)。指定IgG的熔点的代表性分析进行两次。浅灰色虚线代表T-起始，粗灰色虚线代表Tm1和Tm2。图17B显示了测量的1阶导数。DSF值汇总于图15中。

图18A-18D显示了代表性克隆BDG38.74的结合亲和力。图18A显示了抗体BDG38.074与IL-13的结合亲和力。结果显示抗体BDG38.074以两位数皮摩尔的亲和力结合人IL-13。图18B显示了抗体BDG38.074与人TSLP的结合亲和力。结果显示抗体BDG38.074以两位数皮摩尔的亲和力结合人TSLP。图18C显示了抗体BDG38.074与食蟹猕猴IL-13的结合亲和力。图18D显示了抗体BDG38.074与食蟹猕猴TSLP的结合亲和力。

图19A和19B显示了抗体BDG38.079的尺寸排阻色谱(SEC)扫描(图19A)，以及熔点的纳米级差示扫描荧光(DSF)分析(图19B)。图中显示了指定IgG的熔点的代表性DSF分析(重复分析)。浅灰色虚线代表T-起始，粗灰色虚线代表Tm1和Tm2。图19B是测量的1阶导数的图。DSF值汇总于图15中。

图20A-20D显示了代表性克隆BDG38.079的IL-13和TSLP结合。图20A显示了抗体BDG38.079与人IL-13的结合亲和力。结果显示抗体BDG38.079以两位数皮摩尔的亲和力结合人IL-13。图20B显示了抗体BDG38.079与人TSLP的结合亲和力。结果显示抗体BDG38.079以一位数皮摩尔的亲和力结合人TSLP。图20C显示了抗体BDG38.079与食蟹猕猴IL-13的结合亲和力。图20D显示了抗体BDG38.079与食蟹猕猴TSLP的结合亲和力。

图21A和21B显示了抗体BDG38.074和BDG38.079针对人或食蟹猕猴IL-13或TSLP的SPR (表面等离子共振)分析。

图22显示，抗体BDG38.074和BDG38.079以两位数皮摩尔的亲和力抑制HEK报告细胞系中的IL-13功能。hIL-13pSTAT6信号传导抑制数据。结果基于由重组rh-IL-13进行的HEK-Blue细胞的IL-13活化途径的刺激以及由指定IgG进行的对这种刺激的抑制。将rh-IL-13(0.4nM)与抗体浓度范围为0nM-100nM的指定抗体一起温育。在温育后，将hIL-13/IgG混合物添加至细胞中，在温育后24小时，使用QUANTI-Blue对分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性进行定量。显示的数据是三次实验的平均值，误差棒代表标准偏差。所测定的抗体分别是曲罗芦单抗、BDG38.074和BDG38.079。

图23显示，抗体BDG38.074和BDG38.079在MUTZ-5细胞系中表现出与抗TSLP基准物相似的功能抑制。用人TSLP(hTSLP)来刺激MUTZ5细胞，并且通过磷酸流式细胞术来评估磷酸化STAT5(pSTAT5)染色。

图24A和24B显示了代表性克隆的抑制结果，图24A显示，抗体BDG38.074和BDG38.079表现出与抗IL-13基准物(曲罗芦单抗)相似的CD23表达的抑制。抗体对IL-13的抑制的IC₅₀通过测量单核细胞中的CD23表达水平来确定。在细胞与不同浓度的抗体的48小时温育结束时，使单核细胞从孔底脱壁并且用CD3(Bio Legend,CAT:300450)、CD14(BioLegend,CAT:301814)、CD19(Bio Legend,CAT:302212)和CD23(Bio Legend,CAT:338506)抗体进行染色。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)来测量CD14+群体的CD23百分比。图24B显示，抗体BDG38.074和BDG38.079与抗TSLP基准物(特泽佩鲁单抗)相似，抑制TARC表达。抗体对hTSLP的抑制的IC₅₀通过TARC抑制来测定。根据试剂盒说明，使用TARCDUOSET ELISA试剂盒DY364(R&D systems)来测定TARC水平。ELISA板在450nM处读取。数值使用标准样品曲线进行分析。

图25A和25B显示了抗体BDG38.094的尺寸排阻色谱(SEC)扫描(图25A)，以及熔点的纳米级差示扫描荧光(DSF)分析(图25B)。图中显示了指定IgG的熔点的代表性DSF分析(重复分析)。上图中的浅灰色虚线代表T-起始，粗灰色虚线代表Tm1和Tm2。图25B是测量的1阶导数。DSF值汇总于表11中

图26A-26D显示了代表性克隆的结合亲和力。图26A显示了抗体BDG38.094与人IL-13的结合亲和力。图26B显示了抗体BDG38.094与人TSLP的结合亲和力。图26C显示了抗体BDG38.094与食蟹猕猴IL-13的结合亲和力。图26B显示了抗体BDG38.094与食蟹猕猴TSLP的结合亲和力。

图27A和27B显示了抗体BDG38.138的尺寸排阻色谱(SEC)扫描(图27A)，以及熔点的纳米级差示扫描荧光(DSF)分析(图27B)。图中显示了指定IgG的熔点的代表性DSF分析(重复分析)。上图中的浅灰色虚线代表T-起始，粗灰色虚线代表Tm1和Tm2。图27B是测量的1阶导数。DSF值汇总于表11中。

图28A-28D显示了代表性克隆的结合亲和力。图28A显示了抗体BDG38.138与人IL-13的结合亲和力。图28B显示了抗体BDG38.138与人TSLP的结合亲和力。图28C显示了抗体BDG38.138与食蟹猕猴IL-13的结合亲和力。图28D显示了抗体BDG38.138与食蟹猕猴TSLP的结合亲和力。

具体实施方式

在以下具体实施方式中，阐述了许多具体细节以提供对本文公开的经工程化的双重结合抗体的透彻理解，包括它们的重链可变区和轻链可变区的描述。然而，本领域的技术人员将理解，在某些情况下，可以在不提供这些具体细节的情况下实践双重结合抗体的制备和使用。在其他情况下，不对熟知的方法、程序和组分进行详细描述，以免混淆本文提供的公开内容。

抗原结合序列通常定位于抗体的重链可变区和轻链可变区序列内。在某些情况下，可以操纵这些重链可变区和轻链可变区以产生新的结合位点，例如产生结合至不同的抗原或其不同的抗原的表位的抗体或其片段。在一些实施方案中，如本文所述，对重链可变区的序列或轻链可变区的序列或它们两者的操纵，产生新的表位结合位点，同时维持抗体功能性。在一个实施方案中，鉴定出重链可变区和轻链可变区内的二十一个特定位点，其中在某些实施方案中，这些位点处的变体氨基酸的存在产生经工程化的双重结合抗体或其片段。在一些实施方案中，21个潜在的变体位点提供了对双重结合抗体或其片段进行工程化的独特平台。

本文公开了经工程化的双重结合抗体或其片段，其中重链可变区或轻链可变区或它们两者已经被突变为包含变体氨基酸。在一些实施方案中，可以从所产生的文库中鉴定和选择这些经工程化的双重结合抗体，以在可变重链区或可变轻链区或它们两者内的特定位点处包含变体氨基酸残基。在一些实施方案中，这些经工程化的双重结合抗体可以通过对可变重链区或可变轻链区或它们两者内的靶标氨基酸位点进行特异性突变来产生。在一些实施方案中，这些经工程化的双重结合抗体可以用于治疗患有过敏性或呼吸系统病症的受试者的治疗方法。

经工程化的双重结合抗体

如本文所用，术语“双重结合抗体”是指具有两种结合特异性的抗体。在某些实施方案中，本文公开的双重结合抗体结合至IL-13和TSLP。

在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)(参见例如表8和表9)。在一些实施方案中，所述CDR具有SEQ ID NO:149-154的序列。在一些实施方案中，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL具有SEQ ID NO:155和156，或者SEQ ID NO:157和158的氨基酸序列。

在一个实施方案中，HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:359、360和361的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中

(i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:349或355的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:149或SEQID NO:136的氨基酸序列；

(ii)所述HCDR2包含SEQ ID NO:350、352、354和356中的一者的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:150的氨基酸序列，或者如下所示的序列：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；

(iii)所述HCDR3包含SEQ ID NO:351、353、357和358中的一者的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:151的氨基酸序列，或者如下所示的序列：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8HX9 HX10 HX11 F D HX12(SEQ ID NO:143)，其中HX2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；

(iv)所述LCDR1包含SEQ ID NO:359、362、364、366、369和375中的一者的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:152的氨基酸序列，或者如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示的序列，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；

(v)所述LCDR2包含SEQ ID NO:360或367的氨基酸序列，或者氨基酸序列SEQ IDNO:153的氨基酸序列，或者如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示的序列，其中LX4是任何氨基酸；并且

(vi)所述LCDR3包含SEQ ID NO:361、363、365、368、370-374、376-407中的一者的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:154的氨基酸序列，或者如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 V V(SEQID NO:146)所示的序列，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，其中

所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含SEQ ID NO:359、360和361的氨基酸序列；或者

所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、356和351的氨基酸序列，并且所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和371的氨基酸序列；或者

所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含SEQ ID NO:362、360和384的氨基酸序列；或者

所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和384的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，其中所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3包含如表8或表4中所示的氨基酸序列，其中所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含如表9或表5中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，其中HX1为W或S；HX2为A或S；HX3为P；HX4为Q；HX5为W；HX6为E、Q、M、L或V；HX7为L、W或Y；HX8为V或T；HX9为H、A或S；HX10为E；HX11为A；HX12为I、L或M；

其中LX1为N、L或I；LX2为L或I；LX3为S或L；LX4为S或G；LX5为S或T；LX6为S或G；LX7为H或G。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，其中HX1为W，HX2为A或S，HX6为E或M，HX7为L或W，HX8为V或T，HX9为H或A，HX12为I或L，LX1为L，LX2为I，LX3为L，LX4为S或G，LX5为S，LX6为S，LX7为H或G。

(a)HX1为W，HX2为A，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX12为I，LX4为S，并且LX7为G；或者

(b)HX1为W，HX2为A，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX12为L，LX4为S，并且LX7为H；或者

(c)HX1为W，HX2为S，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX12为L，LX4为G，并且LX7为G。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少一个氨基酸变体，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少一个氨基酸变体，或者它们的组合，其中所述重链可变区、所述轻链可变区或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中在重链可变区或轻链可变区或它们的组合内存在至少两个氨基酸变体。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少两个氨基酸变体。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何重链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少两个氨基酸变体。

如本文所用，术语“重链可变区”可以与术语“VH结构域”或术语“VH”互换使用，具有完全相同的含义和性质。如本文所用，术语“轻链可变区”可以与术语“VL结构域”或术语“VL”互换使用，具有完全相同的含义和性质。

在某些实施方案中，本文所述的特定变体VH和/或VL结构域可以用于筛选互补可变区的文库，以分别鉴定具有所期望的性质(诸如增加的对抗原的亲和力)的VH/VL。这些方法例如在Portolano等人,J.Immunol.(1993)150:880-887；Clarkson等人,Nature(1991)352:624-628.Fischer等人,(2015)Exploiting light chains for the scalablegeneration and platform purification of native human bispecific IgG.NatureCommunications第6卷,文章编号：6113中有所描述。

还可以使用其他方法来混合和匹配VH和VL结构域，以鉴定具有所期望的双重结合活性的Fab或F'(ab)₂。例如：Klimka等人,British Journal of Cancer(2000)83:252-260描述了使用小鼠VL和人VH文库的筛选过程，其中CDR3和FR4保留自小鼠VH。在获得抗体后，针对人VL文库筛选VH，以获得抗原结合的抗体。Beiboer等人,J.Mol.Biol.(2000)296:833-849描述了使用整个小鼠重链和人轻链文库的筛选过程。在获得抗体后，将一个VL与人VH文库组合，其中小鼠的CDR3得以保留。获得了能够结合抗原的抗体。Rader等人,PNAS(1998)95:8910-8915描述了与上述Beiboer等人类似的过程。

这些上文描述的技术，就它们本身而言，在本领域中是已知的。然而，技术人员将能够通过本领域的常规方法，使用此类技术来获得根据本文所述的公开内容的若干实施方案的抗体的抗原结合片段。

技术人员将理解，双重结合抗体在其最广泛的意义上涵盖特异性结合IL-13和TSLP的抗原决定簇的抗体。技术人员将理解，与IL-13或TSLP的结合的特异性反映了该结合对于抗原具有选择性，并且可以与不期望的或非特异性相互作用区分开。在某些实施方案中，双重结合抗体包含一个或多个抗体片段。

在一些实施方案中，抗原决定簇包括IL-13或TSLP表位。术语“表位”包括能够特异性结合至抗IL-13或抗TSLP结合结构域的任何决定簇，在某些实施方案中是多肽决定簇。表位是抗体或其抗原结合片段结合的抗原的区域。在一些实施方案中，抗体的抗原结合片段包含如本文所述的重链可变区、轻链可变区或它们的组合。

在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当双重结合抗体优先地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的IL-13或TSLP时，被认为特异性结合IL-13或TSLP表位。当平衡解离常数≤10^-5、10^-6或10^-7M时，双重结合抗体被认为特异性结合表位。在一些实施方案中，平衡解离常数可以≤10^-8M或10^-9M。在一些另外的实施方案中，平衡解离常数可以≤10^-10M、10^-11M或10^-12M。在一些实施方案中，平衡解离常数可以在≤10^-5M至10^-12M的范围内。

抗体结合结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，该片段参与与抗原的特异性结合。所谓“特异性结合”意指该结合对于所关注的抗原，例如在本文所述的实施方案中对于IL-13或TSLP具有选择性，并且可以与不期望的或非特异性相互作用区分开。如本文所用，术语“双重结合抗体”在某些实施方案中可以涵盖完整的免疫球蛋白结构、它们的片段或它们的结构域。

抗体结合结构域的实例包括但不限于互补决定区(CDR)、可变区(Fv)、VH结构域、轻链可变区(VL)、重链、轻链、单链可变区(scFv)和Fab片段。技术人员将理解，scFv实际上不是抗体的片段，而是包含免疫球蛋白的可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的融合多肽，所述可变重链区和所述可变轻链区通过例如但不限于十至约25个氨基酸的短接头肽连接。技术人员还将理解，关于抗体的术语“Fab”通常涵盖由结合至可变区的单个轻链(可变区和恒定区两者)和通过二硫键连接的单个重链的第一恒定区组成的抗体的一部分。

在一些实施方案中，抗体涵盖完整抗体分子，包括单克隆、多克隆和多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，抗体涵盖保留结合特异性的一个或多个抗体片段，包括但不限于可变重链(VH)片段、可变轻链(VL)片段、Fab片段、F(ab')₂片段、scFv片段、Fv片段、微抗体、双抗体、三抗体和四价抗体(参见，例如，Hudson和Souriau,Nature Med.9:129-134(2003)(据此以引用的方式整体并入))。还涵盖人源化、灵长类源化和嵌合抗体。

如本文所用，在一些实施方案中，术语“抗体”可以与具有完全相同性质和含义的术语“免疫球蛋白”互换使用。类似地，如本文所用，在一些实施方案中，术语“抗体或其片段”可以与具有完全相同的性质和含义的术语“免疫球蛋白或其片段”互换使用。因此，技术人员将理解，在一些实施方案中，“抗体或其片段”或者“免疫球蛋白或其片段”可以涵盖IgG免疫球蛋白或其片段或包含其片段的结构，包括但不限于IgG、scFv片段、Fab片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、微抗体、双抗体、三抗体和四价抗体。

技术人员将认识到，关于抗体的“重链可变区”或“VH”涵盖含有在称为框架(FR)区的侧翼序列段之间插入的三个CDR的重链的片段，所述框架区比CDR更加高度保守，并且形成支撑CDR的支架。在某些实施方案中，术语“重链可变区”或“VH”可以与“VH结构域”互换使用。

技术人员将认识到，关于抗体的“轻链可变区”或“VL”涵盖含有在框架(FR)区之间插入的三个CDR的轻链的片段。在某些实施方案中，术语“轻链可变区”或“VL”可以与“VL结构域”互换使用。

本文公开了HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及结合至IL-13和TSLP的双重结合抗体的VH区和VL区的多个氨基酸序列。下文提供了本文公开的代表性序列的一些实施方案的讨论。图1A提供了如SEQ ID NO:1中所示的模板VH结构域氨基酸序列，以及三个重链(H)CDR区(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和四个FR区(HFR1、HFR2、HFR3、HFR4)的位置，而图1B提供了如SEQ ID NO:2中所示的模板VL结构域氨基酸序列，以及三个轻链(L)CDR区(LCDR1、LCDR2、LCDR3)和四个FR区(LFR1、LFR2、LFR3、LFR4)的位置。通过将模板VH或模板VL序列的线性示意图与下文提供的编号和氨基进行比较，可以清晰地鉴定出重表位化的克隆的CDR区中的每个和FR区中的每个中存在的氨基酸残基(包括变体残基)(图1A和1B)。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示；其中HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F DHX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸。技术人员将认识到图1A中提供的VH结构域内的12个独特位点，其中可以存在变体氨基酸，所述变体氨基酸在本文中被鉴定为HX，并且在某些实施方案中可以涵盖重链的模板序列内的存在的变体氨基酸。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:142)和HCDR3(SEQ ID NO:143)，其中VH结构域包含在HX1、HX2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12中的至少一者处的变体氨基酸。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)，其中HX1选自W和S；和HCDR3(SEQ ID NO:138)，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M。在某些实施方案中，分离的双重结合抗体包含变体氨基酸，该变体氨基酸包含CDR1(SEQ ID NO:136)、CDR2(SEQ ID NO:137)，其中HX1为W，CDR3(SEQ ID NO:138)，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W、HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX10为E，HX11为A，并且HX12选自群组I和L。

在一些实施方案中，双重结合抗体可以具有VH结构域，所述VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX10为E，HX11为A，并且HX12为I)；或者HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX10为E，HX11为A，并且HX12为L)；或者HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为S，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX10为E，HX11为A，并且HX12为L)。

具有如上文所述的VH结构域中的变体的经工程化的抗体克隆提供于图1A中。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中在一些实施方案中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中LCDR3的氨基酸序列如Q V W DLX5 LX6 SD LX7 V V(SEQ ID NO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。技术人员将认识到图1B中提供的VL结构域内的7个独特位点，其中CDR内可以存在变体氨基酸，所述变体氨基酸在本文中被鉴定为LX，并且在某些实施方案中可以涵盖轻链的模板序列内的存在的变体氨基酸。

在一些实施方案中，轻链内的变体氨基酸可以驻留在框架区中的一者中。在一些实施方案中，VL结构域内的变体氨基酸在LFR3区中。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VL结构域包含LCDR，其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；并且其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。在某些实施方案中，分离的双重结合抗体包含变体氨基酸，其中LCDR1(SEQ ID NO:139)，其中LX1为L，LX2为I，LX3为L，LCDR2(SEQ ID NO:140)，其中LX4选自S和G，和LCDR3(SEQ IDNO:141)，其中LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在一些实施方案中，双重结合抗体可以具有VL结构域，所述VL结构域包含LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)；或者LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S、LX6为S，并且LX7为H)，或者LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为G)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)。

具有如上文所述的VL结构域中的变体的经工程化的抗体克隆提供于图1B

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL包含以下各项的氨基酸序列：SEQ IDNO:209和210、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:337和338、SEQ IDNO:155和156、SEQ ID NO:157和158、SEQ ID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ ID NO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ ID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ ID NO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ ID NO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ IDNO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ ID NO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ ID NO:50和49、SEQ ID NO:52和51或者SEQID NO:54和53。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述抗体包含与以下中的任一者所示的序列具有至少80％同一性(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的序列：SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158、SEQ ID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ IDNO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ ID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ IDNO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ ID NO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ IDNO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ ID NO:50和49、SEQ ID NO:52和51或者SEQ ID NO:54和53。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的抗体，其中所述分离的抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL包含如表10或表1中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述抗体包含与如表10或表1中所示的序列具有至少80％同一性(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的序列。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的抗体，所述分离的抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中

(a)所述VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的两者或更多者，或者它们的任何组合(IMGT：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有氨基酸变体；并且

(b)所述VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的两者或更多者，或者它们的任何组合(IMGT：27位、28位、38位、65位、70位位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有氨基酸变体。

在一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包含SEQ ID NO:209和210的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文公开的分离的双重结合抗体包含与本文公开的VH和VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的VH和VL序列。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和所述VL结构域包含上文所述的VH结构域HCDR和VL结构域LCDR的组合。例如但不限于，在某些实施方案中，VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示；其中HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8HX9 HX10 HX11 F D HX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；并且其中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中所述LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中所述LCD3的氨基酸序列如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 VV(SEQ ID NO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

在一些实施方案中，VH结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:136中示出，其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1选自W和S；其中HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M；并且VL结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。

在某些实施方案中，分离的双重结合抗体包含：VH结构域，该VH结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:136中示出，其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1为W，其中HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，HX3为P、HX4为Q、HX5为W、HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX10为E、HX11为A、HX12选自群组I和L，并且包含：VL结构域，该VL结构域包含一组CDR、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1为L，LX2为I，LX3为L，其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G，其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在一些实施方案中，双重结合抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中每个CDR的氨基酸序列对于其中所示的克隆如图1A和1B中所示，例如但不限于：

克隆C2：HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)、HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX10为E，HX11为A，HX12为I)、LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L、LX2为I、LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)；

克隆C6：HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)、HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX10为E，HX11为A，HX12为L)、LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L、LX2为I、LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为H)；或者

克隆C9：HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)、HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为S，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX10为E，HX11为A，HX12为L)、LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L、LX2为I、LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为G)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)。

在一些实施方案中，双重结合抗体包含如本文公开的一组HCDR和任何VL结构域。在一些实施方案中，双重结合抗体包含如本文公开的一组LCDR和任何VH结构域。在一些实施方案中，双重结合抗体包含一组HCDR-LCDR对，如本文所公开。

在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域的双重结合抗体可以由核酸构建体编码。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含LCDR的VL结构域的双重结合抗体可以由核酸构建体编码。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域和包含HCDR的VL结构域的双重结合抗体可以由核酸构建体编码。

在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域的双重结合抗体可以包含在免疫球蛋白的文库内。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含LCDR的VL结构域的双重结合抗体可以包含在免疫球蛋白的文库内。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域和包含HCDR的VL结构域的双重结合抗体可以包含在免疫球蛋白的文库内。

在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域的双重结合抗体可以通过以下方式来产生：从宿主细胞表达包含编码HCDR的核酸序列的核酸构建体，并且分离抗体。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含LCDR的VL结构域的双重结合抗体可以通过以下方式来产生：从宿主细胞表达包含编码LCDR的核酸序列的核酸构建体，并且分离抗体。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域和包含HCDR的VL结构域的双重结合抗体可以通过以下方式来产生：从宿主细胞表达包含编码HCDR和LCDR的核酸序列的核酸构建体，并且分离抗体。

在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域的双重结合抗体可以在治疗有需要的受试者的方法中施用，其中所述受试者患有疾病或病症，所述疾病或病症包括过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症，包括霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含LCDR的VL结构域的双重结合抗体可以在治疗有需要的受试者的方法中施用，其中所述受试者患有疾病或病症，所述疾病或病症包括过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症，包括霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中，如本文所述的包括包含HCDR的VH结构域和包含LCDR的VL结构域的双重结合抗体可以在治疗有需要的受试者的方法中施用，其中所述受试者患有疾病或病症，所述疾病或病症包括过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症，包括霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1中所示的重链可变区氨基酸序列或如SEQID NO:2中所示的轻链可变区氨基酸序列或它们的组合的抗体不结合IL-13表位。因此，本文所述的双重结合抗体被工程化为包含此前不存在于抗体中的结合区。换句话说，双重结合抗体包括“重表位化的”抗体。如通篇所用，术语“经工程化的”和“重表位化的”在某些实施方案中可以互换使用，具有完全相同的性质和含义。在一些实施方案中，“重表位化的”抗体包含与现有的抗体相比改善的结合。在一些实施方案中，“重表位化的”抗体包含与亲本抗体相比改善的缔合常数和解离常数(K_on和K_off)。在一些实施方案中，“重表位化的”抗体包含与亲本抗体相比改善的稳定性。在某些实施方案中，如本文所述，将变体氨基酸残基掺入VH结构域和VL结构域的CDR和FR内的21个变体位点的独特组中的至少两个中，产生“重表位化的”双重结合抗体，所述双重结合抗体包含与亲本抗体相比改善的特征。这些重表位化的抗体可以提供有利的特征。

技术人员将认识到，关于抗体的“Fv”涵盖具有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由单个重链可变区(VH)与单个轻链可变区(VL)结合而组成。

技术人员将认识到，关于抗体的“单链Fv抗体”或“scFv”涵盖由直接或通过肽接头序列彼此连接的VL结构域和VH结构域组成的经工程化的抗体。技术人员将理解，在一些实施方案中，接头可以包含线性氨基酸序列。在一些实施方案中，线性氨基酸序列(“接头”)包含酶切割位点，并且在某些实施方案中，酶切割位点可以称为“可切割的接头”或“接头”或“可切割的肽”。在一些实施方案中，接头可以是可切割的接头。在一些实施方案中，接头可以是不可切割的。在一些实施方案中，接头序列如SEQ ID NO:147中所示(GGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO:147)。

在一些实施方案中，肽接头序列含有例如各种组合的Gly、Asn和或Ser残基。其他近中性氨基酸，诸如Thr和Ala，也可以包含在接头序列中。

可以有效地用作接头的其他氨基酸序列包括以下公开的那些：Maratea等人,Gene40:39 46(1985)；Murphy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258 8262(1986)；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180；Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070；Bird等人,1988,Science 242:423-426，这些文献和专利整体并入本文。

在一些实施方案中，双重结合抗体或其片段的VH结构域和VL结构域的编码序列可以直接融合而无需任何连接氨基酸或通过使用组成的柔性多接头。

在某些实施方案中，肽接头被设计成能够实现形成单链抗体的可变区的两个β-折叠之间的正确相互作用。任何合适的接头均可用于制备间接连接，诸如但不限于肽接头、聚合物接头和化学接头。在某些实施方案中，共价连接是通过肽接头进行的间接连接。

在一些实施方案中，抗体包含突变的免疫球蛋白。突变的免疫球蛋白的实例包括但不限于不结合抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)组分的IgG。包含L₂₃₄A/L₂₃₅A(LALA)突变IgG不能结合Fc受体(参见，Xu D,Alegre ML,Varga SS,Rothermel AL,Collins AM,PulitoVL等人.In vitro characterization of five humanized OKT3 effector functionvariant antibodies.Cell Immunol.(2000)200:16–26.10.1006/cimm.2000.1617)。在一些实施方案中，双重抗体包括包含L₂₃₄A/L₂₃₅A(LALA)突变IgG。在本文中编号的突变基于恒定区所用的EU编号惯例(参见,Xu D,Alegre ML,Varga SS,Rothermel AL,Collins AM,Pulito VL等人.In vitro characterization of five humanized OKT3 effectorfunction variant antibodies.Cell Immunol.(2000)200:16–26.10.1006/cimm.2000.1617)。

在一些实施方案中，突变IgG包括IgG1，其中Fc区是经工程化的。在一些实施方案中，突变IgG包括IgG2，其中Fc区是经工程化的。在一些实施方案中，突变IgG包括IgG3，其中Fc区是经工程化的。在一些实施方案中，突变IgG包括IgG4，其中Fc区是经工程化的。在某些实施方案中，抗体的Fc区内的突变消除了抗体的免疫效应子功能。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包括IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')2、微抗体、双抗体或三抗体。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包括IgG，其中所述IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包括突变IgG，其中所述突变IgG不能结合至抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白、IgG2免疫球蛋白、IgG3免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG2免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG3免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。

在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括Fab免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括F(ab')₂免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括Fv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括scFv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括微抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含经由CH3结构域连接的一对单链Fv片段。

在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括双抗体免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，双抗体免疫球蛋白构建体包含通过小肽接头连接的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，双抗体免疫球蛋白构建体包含单链(Fv)₂，其中两个scFv片段彼此共价连接。在一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括双抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含彼此共价连接的三个scFv片段。本领域已经显示，双抗体具有的解离常数比相应的scFv小至多40倍，这意味着它们具有更高的与靶标的亲和力。因此，在如下文所述的使用方法中使用双抗体可以产生比包含相同的VH结构域和VL结构域的IgG低得多的双抗体或三抗体剂量。

在一些实施方案中，双重结合抗体包含在结合组分之间，例如但不限于在scFv、微抗体、双抗体、三抗体或四价抗体中的VH和VL之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，双重结合抗体不包含在结合组分之间，例如但不限于在scFv、微抗体、双抗体、三抗体或四价抗体中的VH和VL之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，接头可以包含单个氨基酸。在一些实施方案中，接头包括本领域中任何已知的接头。在一些实施方案中，接头包含如SEQ ID NO:147中所示的氨基酸序列。

技术人员将理解，术语“变体”涵盖通过单个或多个氨基酸插入、缺失和/或置换(使用例如重组DNA技术来产生)而不同于具体列举的多肽序列(例如如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2中所示的氨基酸序列)的多肽。本文公开的抗原结合分子的变体包括抗原结合分子，其中一个或数个氨基酸残基通过最后一个置换、添加和/或缺失来修饰，从而在抗原结合分子中新产生抗原结合亲和力。

本文所述的抗体的双重结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区(分别为VH和VL)，其中如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列包含VH模板，并且如SEQID NO:2中所示的氨基酸序列包含VL模板，并且双重结合区包含在VH模板序列、或VL模板序列或它们的组合中的至少两个变体。

技术人员将理解，在某些实施方案中，“分离的双重结合抗体”涵盖这样的抗体：(1)不含至少一些通常与其一起在自然界中存在的或通常在其合成期间与其一起存在的其他蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源的其他不相同的结合抗体，(3)可以通过细胞重组表达，(4)已经与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在合成期间与其缔合的其他材料分离，或者(5)在自然界中不存在，或者它们的组合。这种分离的抗体可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA编码，可以是合成来源的，或者它们的任何组合。在某些实施方案中，分离的抗体基本上不含干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究等等)的蛋白质或多肽或其他污染物。如通篇所用，术语“双重抗体”和“双重结合抗体”可以互换使用，具有完全相同的含义和性质。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区、轻链可变区或者变体重链可变区和变体轻链可变区的组合，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(重链可变区变体位置的IMGT编号：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(轻链可变区变体位置的IMGT编号：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中所述重链可变区、所述轻链可变区或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

是国际ImMunoGeneTics(参见，Nucleic Acids Res.2015年1月；43(数据库专刊):D413-22.doi:10.1093/nar/gku1056.Epub 2014年11月5日免费文章.PMID:25378316LIGM:441和Dev Comp Immunol.2003年1月；27(1):55-77)。IMGT是免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的独特编号系统(Lefranc MP1,PommiéC,Ruiz M,Giudicelli V,Foulquier E,Truong L,Thouvenin-Contet V,Lefranc G.DevComp Immunol 27:55-77.(2003))。基于5个或更多个000IG和TcR可变区序列的比对，考虑和组合FR和CDR的Kabat定义、结构数据以及Chothia的高变环表征，提供了这些IG和TcR可变结构域序列的统一编号系统。IMGT被认为是本领域熟知的抗体的通用编号方案。

在描述VH结构域和VL结构域中存在的变体氨基酸位置时，在一些实施方案中使用IMGT编号。在一些实施方案中，变体氨基酸位置呈现为给定序列内的特定位置，例如但不限于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，变体氨基酸位置通过给定SEQ ID NO序列内的特定位置和IMGT编号系统两者来鉴定。技术人员将认识到，通过相对于SEQ ID NO的位置编号鉴定的氨基酸的实际氨基酸位置编号可以与IMGT编号系统不同，但是所鉴定的残基是相同的。例如但不限于SEQ ID NO:1的106位处的氨基酸残基与IMGT编号系统在112位处鉴定的残基相同。技术人员将认识到，虽然根据所用的系统，相同的氨基酸残基可以被鉴定为具有不同的位置，但是连续氨基酸序列内的氨基酸残基位置和同一性是清楚的。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(重链可变区变体位置的IMGT编号：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其中任选地所述氨基酸序列SEQ ID NO:2包含至少一个变体氨基酸，其中所述重链可变区、所述轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(重链可变区变体位置的IMGT编号：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少两个氨基酸变体。

很多轻链可变区的氨基酸序列，就它们本身而言，在本领域中是已知的。技术人员将能够使用此类已知的序列，并且结合本文所述的重链可变区，使用本领域熟知的常规方法和技术来分析双重结合(参见例如但不限于下文的实施例1)。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(轻链可变区变体位置的IMGT编号：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，其中任选地所述氨基酸序列SEQ ID NO:1包含至少一个变体氨基酸，其中所述重链可变区、所述轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何重链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(轻链可变区变体位置的IMGT编号：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少两个氨基酸变体。

很多重链可变区的氨基酸序列，就它们本身而言，在本领域中是已知的。技术人员将能够使用此类已知的序列，并且结合本文所述的轻链可变区，使用本领域熟知的常规方法和技术来分析双重结合(参见例如但不限于下文的实施例1)。

在一些实施方案中，本文所述的VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少一个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH包含在任何位置处的至少两个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH包含在任何位置处的至少1-10个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH包含在任何位置处的1-5个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VH包含在任何位置处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸变体。

在一些实施方案中，本文所述的VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在任何位置处具有至少一个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL包含在任何位置处的至少两个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL包含在任何位置处的至少1-10个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL包含在任何位置处的1-5个氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL包含在任何位置处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸变体。

在一些实施方案中，本文所述的包含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VH结构域和VL结构域分别具有的变体位置的组合数量为至少2。在一些实施方案中，本文所述的包含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VH结构域和VL结构域分别具有的变体位置的组合数量在2-20之间。在一些实施方案中，本文所述的包含如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VH结构域和VL结构域分别具有的变体位置的组合数量为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，本文所述的包含如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VH结构域和VL结构域分别具有的变体位置的组合数量大于20。

在某些实施方案中，如本文所述的双重抗体结合区包含分别在重链框架区和轻链框架区(FR)组之间插入的重链CDR组和轻链CDR组，所述FR组为CDR提供支持并且限定CDR彼此的空间关系。如本文所用，术语“CDR组”是指重链可变区或轻链可变区的三个高变区。从重链或轻链多肽的N-末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，这些CDR包含来自重链可变区和轻链可变区中的每个的CDR组。很多抗原-抗体复合物的晶体分析已经表明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的接触。因此，CDR区主要负责抗原结合位点的特异性。

如本文所用，术语“FR组”是指构成重链可变区或轻链可变区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将可变区折叠成抗原结合位点，尤其是与CDR直接相邻的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征部是高度保守的。就此而言，所有可变区序列均含有约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当可变区折叠成结合位点时，CDR显示为突出的环基序，该基序形成抗原结合表面。一般认为，FR存在保守的结构区域，这些区域影响CDR环折叠成某些“规范”结构的形状——无论精确CDR氨基酸序列如何。此外，已知某些FR残基参与非共价结构域间接触，该接触稳定抗体重链和轻链的相互作用。

在一些实施方案中，所述VH中的至少一种变体包含CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，所述VL中的至少一种变体包含CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，所述VH中的至少一种变体包含FR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，所述VL中的至少一种变体包含FR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，所述VH中的至少两个变体包含CDR区、FR区或两者中的变体氨基酸。在一些实施方案中，所述VL中的至少两个变体包含CDR区、FR区或两者中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的变体位置包括至少一个CDR和至少一个FR区中的变体。在一些实施方案中，VL中的变体位置包括至少一个CDR和至少一个FR区中的变体。

在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(重链可变区变体位置的IMGT编号：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在52位(IMGT 57位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在99位(IMGT 107位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在100位(IMGT108位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在101位(IMGT 109位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在102位(IMGT 110位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在103位(IMGT 111位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在104位(IMGT 111A位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在105位(IMGT 112A位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在106位(IMGT 112位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在107位(IMGT 113位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在108位(IMGT 114位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在111位(IMGT 117位)处包含氨基酸变体。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在52位(IMGT 57位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在99位(IMGT 107位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在100位(IMGT 108位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在101位(IMGT 109位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在102位(IMGT 110位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在103位(IMGT 111位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在104位(IMGT 111A位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在105位(IMGT 112A位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在106位(IMGT 112位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在107位(IMGT113位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在108位(IMGT 114位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在111位(IMGT 117位)处包含氨基酸变体和1-3个额外的变体氨基酸。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在105位和106位(IMGT 112A位和112位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在106位和111位(IMGT 112位和117位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在103位和106位(IMGT 111位和112位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在104位和106位(IMGT 111A位和112位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在104位、106位和111位(IMGT 111A位、112位和117位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在105位、106位和111位(IMGT112A位、112位和117位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在103位、106位和111位(IMGT 111位、112位和117位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在99位、104位和111位(IMGT107位、111A位和117位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的VH在52位、99位、104位和111位(IMGT 57位、107位、111A和117位)处包含氨基酸变体。

在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(轻链可变区变体位置的IMGT编号：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位(IMGT 27位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在27位(IMGT 28位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在31位(IMGT 38位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQID NO:2中所示氨基酸序列的VL在51位(IMGT 65位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在56位(IMGT 70位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在77位(IMGT 94位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在92位(IMGT 109位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在93位(IMGT 110位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在96位(IMGT 115位)处包含氨基酸变体。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位(IMGT 27位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在27位(IMGT 28位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在31位(IMGT 38位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在51位(IMGT 65位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在56位(IMGT 70位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在77位(IMGT 94位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQID NO:2中所示氨基酸序列的VL在92位(IMGT 109位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在93位(IMGT 110位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在96位(IMGT 115位)处包含氨基酸变体和1-7个额外的变体氨基酸。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位和96位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位、92位和96位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位、109位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、31位、56位和77位(IMGT 27位、38位、70位和94位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位和77位(IMGT 27位、28位、38位、70位和94位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位和92位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位和109位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、51位、56位、77位和92位(IMGT 27位、28位、38位、65位、70位、94位和109位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、31位、56位、77位、92位和96位(IMGT27位、38位、70位、94位、109位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ IDNO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、31位、77位和92位(IMGT 27位、38位、94位和109位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位和93位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位和110位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位、93位和96位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位、110位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、51位、77位、93位和96位(IMGT 27位、28位、38位、65位、94位、110位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、56位、77位、93位和96位(IMGT 27位、28位、38位、70位、94位、110位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在27位、31位、56位、77位和96位(IMGT 28位、38位、70位、94位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ IDNO:2中所示氨基酸序列的VL在27位、31位、56位、77位、92位和96位(IMGT 28位、38位、70位、94位、109位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31位、51位、77位和96位(IMGT 27位、28位、38位、65位、94位和115位)处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的VL在26位、27位、31或96位(IMGT 27位、28位、38位和115位)或其任意组合处包含氨基酸变体。

在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL在SEQ ID NO:2的56位或77位中的任一个或者它们的组合(IMGT：70位或94位，或者它们的组合)处的框架区中的位置处包含氨基酸变体。在一些实施方案中，包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL在SEQ ID NO:2的56位或77位中的任一个或者它们的组合(IMGT：70位或94位，或者它们的组合)处的框架区内的位置处包含至少一个氨基酸变体，其中56位处的变体氨基酸包括亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸或谷氨酸，和或77位处的变体氨基酸包括缬氨酸。

在一些实施方案中，本文公开了一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在(IMGT)57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位中的任一个，或者它们的组合处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在(IMGT)27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位中的任一个，或者它们的组合处具有至少一个氨基酸变体；其中所述双重结合抗体中的变体位置的总数为至少2。

在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含变体VH或变体VL或者它们的组合，在重链可变区中除(IMGT)57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位之外的位置，和或轻链可变区中的(IMGT)27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位处具有变体氨基酸。

在一些实施方案中，VH中的至少一个氨基酸变体包含CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少一个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少一个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少一个氨基酸变体包含CDR3中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含两个不同CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少两个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含单一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含单一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VH中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含单个CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区中的氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VH中存在5个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。

在一些实施方案中，VL中的至少一个氨基酸变体包含CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少一个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少一个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少一个氨基酸变体包含CDR3中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含两个不同CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含同一CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少两个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含单一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少三个氨基酸变体包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含单一CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，VL中的至少4个氨基酸变体包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含单个CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区中的氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在5个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含单个CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区中的氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在6个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含单个CDR区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区中的氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR2区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。在一些实施方案中，当VL中存在7个或更多个氨基酸变体时，变体位置包含CDR1区、CDR2区和CDR3区中的变体氨基酸。

在一些实施方案中，氨基酸变体包含一个氨基酸残基对另一个氨基酸残基的置换。在一些实施方案中，氨基酸变体包含疏水性残基对非疏水性残基的置换。在一些实施方案中，氨基酸变体包含带电残基对不带电残基的置换。在一些实施方案中，氨基酸变体包含中性置换，其中被置换的氨基酸具有相似的性质。在一些实施方案中，氨基酸变体包含芳族残基对非芳族残基的置换。在一些实施方案中，天然芳族氨基酸(诸如Trp、Tyr和Phe)被合成非天然酸(诸如苯甘氨酸、TIC、萘丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe或邻甲基-Tyr的卤化衍生物)置换。在一些实施方案中，变体置换包括置换经修饰的氨基酸或非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。技术人员将理解，虽然在某些实施方案中每个变体位置处的氨基酸残基的选择可以影响VH、VL和/或它们的组合的3D结构，但是每个变体位置处的氨基酸残基的选择被单独考虑。

在一些实施方案中，“氨基酸”或“氨基酸残基”或“残基”被理解为包括20种天然存在的编码的氨基酸残基，以及通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其他异常氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一些实施方案中，“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。在一些实施方案中，氨基酸变体置换是D-氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸变体置换是L-氨基酸。在一些实施方案中，变体残基包括天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，变体残基包括天然存在的编码的氨基酸残基。在一些实施方案中，变体残基包括天然存在的非编码的氨基酸残基。在一些实施方案中，变体残基包括非天然存在的氨基酸。

在一些实施方案中，变体残基包括非天然存在的非蛋白质氨基酸。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VH结构域的氨基酸序列选自但不限于如SEQID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VH结构域的氨基酸序列是表1或表10中列出的那些序列中的一者。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含表1或表10中列出的氨基酸序列中的一者。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VL结构域的氨基酸序列选自但不限于如SEQID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:15中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:19中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:23中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:27中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:31中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:35中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:39中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:43中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:47中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:51中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双重结合抗体的VL结构域的氨基酸序列是表1或表10中列出的那些序列中的一。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述重链可变区包含表1或表10中列出的氨基酸序列中的一者。

技术人员将认识到，当将包含已知的氨基酸序列的VH结构域或VL结构域分别与VL结构域或VH结构域配对以包含抗原结合区时，可以使用本领域熟知的方法来分析这种配对的结合性质(参见例如本文的公开内容和下文的实施例)。

在一些实施方案中，重链可变区-轻链可变区对的氨基酸序列选自但不限于SEQID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ ID NO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ ID NO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQID NO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ ID NO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQID NO:50和49、SEQ ID NO:52和51和SEQ ID NO:54和53中所示的序列。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:4和3中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:6和5中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:8和7中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:10和9中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:12和11中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:14和13中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:16和15中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:18和17中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:20和19中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ IDNO:22和21中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:24和23中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:26和25中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:28和27中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:30和29中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:32和31中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:34和33中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:36和35中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:38和37中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:40和39中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ IDNO:42和41中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:44和43中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:46和45中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:48和47中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:50和49中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:52和51中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。在一些实施方案中，分离的双重结合抗体包含选自SEQ ID NO:54和53中所示的序列对的重链可变区-轻链可变区对。

在一些实施方案中，重链可变区–轻链可变区对的氨基酸序列选自如以下中的任一者所示的对序列：SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:211和212、SEQ ID NO:213和214、SEQID NO:215和216、SEQ ID NO:217和218、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:221和222、SEQID NO:223和224、SEQ ID NO:225和226、SEQ ID NO:227和228、SEQ ID NO:229和230、SEQID NO:231和232、SEQ ID NO:233和234、SEQ ID NO:235和236、SEQ ID NO:237和238、SEQID NO:239和240、SEQ ID NO:241和242、SEQ ID NO:243和244、SEQ ID NO:245和246、SEQID NO:247和248、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:251和252、SEQ ID NO:253和254、SEQID NO:255和256、SEQ ID NO:257和258、SEQ ID NO:259和260、SEQ ID NO:261和262、SEQID NO:263和264、SEQ ID NO:265和266、SEQ ID NO:267和268、SEQ ID NO:269和270、SEQID NO:271和272、SEQ ID NO:273和274、SEQ ID NO:275和276、SEQ ID NO:277和278、SEQID NO:279和280、SEQ ID NO:281和282、SEQ ID NO:283和284、SEQ ID NO:285和286、SEQID NO:287和288、SEQ ID NO:289和290、SEQ ID NO:291和292、SEQ ID NO:293和294、SEQID NO:295和296、SEQ ID NO:297和298、SEQ ID NO:299和300、SEQ ID NO:301和302、SEQID NO:303和304、SEQ ID NO:305和306、SEQ ID NO:307和308、SEQ ID NO:309和310、SEQID NO:311和312、SEQ ID NO:313和314、SEQ ID NO:315和316、SEQ ID NO:317和318、SEQID NO:319和320、SEQ ID NO:321和322、SEQ ID NO:323和324、SEQ ID NO:325和326、SEQID NO:327和328、SEQ ID NO:329和330、SEQ ID NO:331和332、SEQ ID NO:333和334、SEQID NO:335和336、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:339和340、SEQ ID NO:341和342、SEQID NO:343和344、SEQ ID NO:345和346、SEQ ID NO:347和348。

在一些实施方案中，scFv片段的氨基酸序列包含如以下对中的任一者所示的序列对，但不限于如以下对中的任一者所示的序列对：SEQ ID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQID NO:8和7、SEQ ID NO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ ID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ IDNO:26和25、SEQ ID NO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ ID NO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ IDNO:44和43、SEQ ID NO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ ID NO:50和49、SEQ ID NO:52和51以及SEQ ID NO:54和53。

编码经工程化的“重表位化的”VH结构域、VL结构域或者VH结构域和VL结构域两者的核苷酸序列，以及包含这些核苷酸序列的载体和宿主细胞

本公开提供了双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH结构域、VL结构域或者VH结构域和VL结构域两者，与模板VH序列和模板VL序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相比，所述VH结构域和所述VL结构域分别包含变体氨基酸序列。如上文所详细描述，在一些实施方案中，双重结合抗体包含重链可变区、轻链可变区或者(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的重链可变区、编码的轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含如本文公开的一组CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中所述VH结构域包含如包含如表8或表4中公开的一组CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:136中所示；其中HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 FD HX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码双重结合抗体的VH结构域，所述VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:142)和HCDR3(SEQ ID NO:143)，其中VH结构域包含在HX1、HX2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12中的至少一者处的变体氨基酸。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码双重结合抗体的VH结构域，该VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)，其中HX1选自W和S；和HCDR3(SEQ ID NO:138)，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M。在某些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码双重结合抗体，该双重结合抗体包含变体氨基酸，该变体氨基酸包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)，其中HX1为W，HX2选自A和S，HX3为P、HX4为Q、HX5为W、HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX10为E、HX11为A和HX12选自群组I和L。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX10为E，HX11为A，并且HX12为I)；或者HCDR1(SEQ ID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为A，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX10为E，HX11为A，并且HX12为L)；或者HCDR1(SEQID NO:136)、HCDR2(SEQ ID NO:137)(其中HX1为W)和HCDR3(SEQ ID NO:138)(其中HX2为S，HX3为P，HX4为Q，HX5为W，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX10为E，HX11为A，并且HX12为L)。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中在一些实施方案中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中LCDR3的氨基酸序列如Q V W D LX5 LX6 S D LX7 V V(SEQ IDNO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码包含LCDR的双重结合抗体的VL结构域。在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，其中所述VL结构域包含如包含如表9或表5中公开的一组CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；并且其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。在某些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，该分离的双重结合抗体包含变体氨基酸，其中LCDR1(SEQ ID NO:139)LX1为L，LX2为I，LX3为L，LCDR2(SEQ ID NO:140)，其中LX4选自S和G，LCDR3(SEQ ID NO:141)，其中LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)；或者LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ ID NO:140)(其中LX4为S)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S、LX6为S，并且LX7为H)，或者LCDR1(SEQ ID NO:139)(其中LX1为L，LX2为I，并且LX3为L)、LCDR2(SEQ IDNO:140)(其中LX4为G)和LCDR3(SEQ ID NO:141)(其中LX5为S，LX6为S，并且LX7为G)。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含抗体抗原结合结构域位点，所述抗体抗原结合结构域位点包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和所述VL结构域包含上文所述的VH结构域HCDR和VL结构域LCDR的组合。例如但不限于，在某些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码VH结构域，所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:136所示；其中HCDR2的氨基酸序列如下所示：I HX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；并且其中所述HCDR3的氨基酸序列如下所示：A R HX2 HX3 HX4 HX5HX6 HX7 HX8 HX9 HX10 HX11 F D HX12(SEQ ID NO:143)，其中XH2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；并且其中所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如LX1、LX2、G S K LX3 V(SEQ ID NO:144)所示，其中LX1、LX2和LX3是任何氨基酸；其中所述LCDR2的氨基酸序列如D D LX4(SEQID NO:145)所示，其中LX4是任何氨基酸；并且其中所述LCD3的氨基酸序列如Q V W D LX5LX6 SD LX7 V V(SEQ ID NO:146)所示，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码VH结构域，该VH结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:136中示出，其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1选自W和S；其中HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，其中HX3为P，其中HX4为Q，其中HX5为W，其中HX6选自E、Q、M、L和V，其中HX7选自L、W和Y，其中HX8选自V和T，其中HX9选自H、A、S，其中HX10为E，其中HX11为A，其中HX12选自I、L和M；并且VL结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1选自N、L和I，其中LX2选自L和I，其中LX3选自S和L；其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G；其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5选自S和T，其中LX6选自S和G并且其中LX7选自H和G。

在某些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码分离的双重结合抗体，该分离的双重结合抗体包含VH结构域，该VH结构域包含一组CDR、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:136中示出，其中HCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中示出，其中HX1为W，其中HCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中示出，其中HX2选自A和S，HX3为P、HX4为Q、HX5为W、HX6选自E和M，HX7选自L和W，HX8选自V和T，HX9选自H和A，HX10为E、HX11为A、HX12选自群组I和L，并且包含VL结构域，该VL结构域包含一组CDR、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中示出，其中LX1为L，LX2为I，LX3为L，其中LCDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中示出，其中LX4选自S和G，其中LCDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中示出，其中LX5为S，LX6为S，并且LX7选自H和G。

在一些实施方案中，包含核酸序列的核酸构建体编码重表位化的双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含一组CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL结构域包含一组CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中每个CDR的氨基酸序列对于其中所示的克隆如图1A和1B中所示，例如但不限于：

在某些实施方案中，核酸构建体包含单个核酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含两个核酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含单个核酸序列，其中VH结构域和VL结构域由该核酸序列编码。在某些实施方案中，核酸构建体包含两个核酸序列，其中VH结构域由一个核酸序列编码，并且VL结构域由另一个核酸序列编码。

如本文所述，本公开提供了多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码本文所述的变体VH结构域、变体VL结构域或变体VH和VL结构域两者。在某些实施方案中，模板VH结构域由如SEQ ID NO:55中所示的核苷酸序列编码，并且模板VL结构域由如SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，本文公开了核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述抗体包含：重链可变区、轻链可变区或者(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的重链可变区、编码的轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在一些实施方案中，核苷酸构建体序列包括两个核酸序列，一个编码变体重链可变区，一个编码变体轻链可变区。在一些实施方案中，编码双重结合抗体重链可变区、轻链可变区或两者的一个或多个核苷酸序列针对哺乳动物转录和翻译进行优化。

在某些实施方案中，本公开还提供了一种分离的核酸构建体，所述核酸构建体编码如本文所述的核酸序列。下表2中提供了编码变体VH和VL结构域的示例性多核苷酸序列。下表3中提供了示例性核酸构建体，所述核酸构建体包含编码连接至VL结构域的变体VH结构域的核酸序列。

核酸包括DNA和RNA。这些和相关的实施方案可以包括编码如本文所述的双重结合抗体的多核苷酸。如本文所用，术语“分离的多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或者它们的某种组合，所述分离的多核苷酸根据其来源(1)不与多核苷酸的全部或一部分缔合，其中分离的多核苷酸存在于自然界中，(2)连接至在自然界中不连接的多核苷酸，或者(3)在自然界中不作为较大序列的一部分存在。

技术人员将理解，术语“多核苷酸”和“核酸序列”在一些实施方案中可以互换使用，具有完全相同的含义和性质。

在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸序列编码如全文和图1A中所公开包含一组HCDR的VH结构域，如全文和图1B中所公开包含一组LCDR的VL结构域，如全文和图1A和1B中所公开包含一组HCDR的VH结构域和包含一组LCDR的VL结构域，如本文全文所详细描述双重结合抗体的VL结构域或VL结构域或者VH结构域和VL结构域。

如本文所用，术语“多核苷酸”涵盖单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰的形式。所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷、核糖修饰，诸如阿拉伯糖苷和2',3'-二脱氧核糖和核苷酸间键修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。

术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“经修饰的核苷酸”包括具有修饰的或置换的糖基团等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯、氨基磷酸酯等等。参见，例如，LaPlanche等人,1986,Nucl.Acids Res.,14:9081；Stec等人,1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077；Stein等人,1988,Nucl.Acids Res.,16:3209；Zon等人,1991,Anti-Cancer Drug Design,6:539；Zon等人,1991,OLIGONUCLEOTIDES ANDANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH,第87-108页(F.Eckstein编),Oxford UniversityPress,Oxford England；Stec等人，美国专利5,151,510；Uhlmann和Peyman,1990,ChemicalReviews,90:543，这些文献和专利的公开内容据此以引用的方式并入用于任何目的。寡核苷酸可以包括可检测标记，所述可检测标记使寡核苷酸或其杂交的检测成为可能。

在其他相关的实施方案中，多核苷酸变体可以与多核苷酸模板序列具有大致同一性，但是模板序列不编码双重结合抗体或其片段或其结构域。

在一些实施方案中，多核苷酸变体将含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，以使得相对于未经修饰的模板而言，由变体多核苷酸编码的结合结构域的结合亲和力能够新结合至表位，如本文所具体阐述。

在一些实施方案中，核酸序列编码重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体。在一些实施方案中，核酸序列编码重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少两个氨基酸变体。在一些实施方案中，核酸序列编码重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变体。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码重链可变区的核酸序列，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105和107中所示的序列的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:57中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:59中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQID NO:61中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:63中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:65中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:67中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:69中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:71中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:73中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:75中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:77中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:79中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:81中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:83中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQID NO:85中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:87中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:89中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:91中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:93中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:95中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:97中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:99中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:101中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:105中所示的序列。在一些实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:107中所示的序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体重链可变区序列的核酸序列，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:4中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:6中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:8中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:10中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:12中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:14中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:16中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:18中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:20中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:22中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:24中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:26中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:28中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:30中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:32中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:34中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:36中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:38中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:40中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:42中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:44中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:46中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:48中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:50中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:52中所示的双重结合抗体重链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:54中所示的双重结合抗体重链可变区序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体重链可变区序列的核酸序列，所述重链可变区序列如表10或表1中所示；例如，VH可以包含SEQ ID NO:209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345和347中的任一者。在另一个实施方案中，核酸构建体包含编码VH的核酸序列，所述VH与本文公开的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

在一些实施方案中，核酸序列编码轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体。在一些实施方案中，核酸序列编码轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体。在一些实施方案中，核酸序列编码轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106和108中所示的序列的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:58中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:60中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:62中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQID NO:64中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:66中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:68中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:70中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:72中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:74中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:76中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:78中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:80中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:82中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:84中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:86中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQID NO:88中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:90中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:92中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:94中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:96中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:98中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:100中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:102中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:104中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:106中所示的序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含SEQ ID NO:108中所示的序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体轻链可变区序列的核酸序列，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQID NO:3中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:5中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:7中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:9中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:11中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:13中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:15中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:17中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:19中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:21中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:23中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:25中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:27中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:29中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:31中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:33中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:35中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:37中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:39中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:41中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:43中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:45中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:47中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:49中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:51中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ IDNO:53中所示的双重结合抗体轻链可变区序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体轻链可变区序列的核酸序列，所述轻链可变区序列如表10或表1中所示；例如，VL可以包含SEQ ID NO:210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346和348中的一者。在另一个实施方案中，核酸构建体包含编码VL的核酸序列，所述VL与本文公开的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体重链可变区-轻链可变区对的核酸序列，所述核酸序列选自SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、SEQ ID NO:61和62、SEQ ID NO:63和64、SEQ ID NO:65和66、SEQ ID NO:67和68、SEQ ID NO:69和70、SEQ IDNO:71和72、SEQ ID NO:73和74、SEQ ID NO:75和76、SEQ ID NO:77和78、SEQ ID NO:79和80、SEQ ID NO:81和82、SEQ ID NO:83和84、SEQ ID NO:85和86、SEQ ID NO:87和88、SEQ IDNO:89和90、SEQ ID NO:91和92、SEQ ID NO:93和94、SEQ ID NO:95和96、SEQ ID NO:97和98、SEQ ID NO:99和100、SEQ ID NO:101和102、SEQ ID NO:103和104、SEQ ID NO:105和106和SEQ ID NO:107和108中所示的成对序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体重链可变区–轻链可变区对的核酸序列，所述重链可变区–轻链可变区对如表10或表1中所示；例如，VH和VL对可以是以下中的一者：SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:211和212、SEQ ID NO:213和214、SEQ IDNO:215和216、SEQ ID NO:217和218、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:221和222、SEQ IDNO:223和224、SEQ ID NO:225和226、SEQ ID NO:227和228、SEQ ID NO:229和230、SEQ IDNO:231和232、SEQ ID NO:233和234、SEQ ID NO:235和236、SEQ ID NO:237和238、SEQ IDNO:239和240、SEQ ID NO:241和242、SEQ ID NO:243和244、SEQ ID NO:245和246、SEQ IDNO:247和248、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:251和252、SEQ ID NO:253和254、SEQ IDNO:255和256、SEQ ID NO:257和258、SEQ ID NO:259和260、SEQ ID NO:261和262、SEQ IDNO:263和264、SEQ ID NO:265和266、SEQ ID NO:267和268、SEQ ID NO:269和270、SEQ IDNO:271和272、SEQ ID NO:273和274、SEQ ID NO:275和276、SEQ ID NO:277和278、SEQ IDNO:279和280、SEQ ID NO:281和282、SEQ ID NO:283和284、SEQ ID NO:285和286、SEQ IDNO:287和288、SEQ ID NO:289和290、SEQ ID NO:291和292、SEQ ID NO:293和294、SEQ IDNO:295和296、SEQ ID NO:297和298、SEQ ID NO:299和300、SEQ ID NO:301和302、SEQ IDNO:303和304、SEQ ID NO:305和306、SEQ ID NO:307和308、SEQ ID NO:309和310、SEQ IDNO:311和312、SEQ ID NO:313和314、SEQ ID NO:315和316、SEQ ID NO:317和318、SEQ IDNO:319和320、SEQ ID NO:321和322、SEQ ID NO:323和324、SEQ ID NO:325和326、SEQ IDNO:327和328、SEQ ID NO:329和330、SEQ ID NO:331和332、SEQ ID NO:333和334、SEQ IDNO:335和336、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:339和340、SEQ ID NO:341和342、SEQ IDNO:343和344、SEQ ID NO:345和346、SEQ ID NO:347和348。在另一个实施方案中，VH和VL对与本文公开的VH和VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

技术人员将理解，在一些实施方案中，编码VH结构域的序列和编码VL结构域的序列通过编码接头序列的序列连接。在一些实施方案中，核酸序列编码多肽接头。ggcggtggtggtagcggaggcggaggatcaggtggaggcggcagt(SEQ ID NO:148)。

在一些实施方案中，核酸构建体包含编码双重结合抗体重链可变区-轻链可变区scFv的核酸序列，所述核酸序列选自SEQ ID NO:109-135中所示的序列。

在一些实施方案中，包含编码本文所述的双重抗体的核酸序列的核酸构建体编码IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG1免疫球蛋白、IgG2免疫球蛋白、IgG3免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG1免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG2免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG3免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码IgG1免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。

在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码Fab免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码F(ab')2免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码Fv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码scFv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码微抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含经由CH3结构域连接的一对单链Fv片段。

在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码双抗体免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，双抗体免疫球蛋白构建体包含通过小肽接头连接的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，双抗体免疫球蛋白构建体包含单链(Fv)₂，其中两个scFv片段彼此共价连接。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码双抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含彼此共价连接的三个scFv片段。

在一些实施方案中，分离的多核苷酸构建体编码分离的双重结合抗体，如本文所公开。

在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码突变的免疫球蛋白。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码突变IgG，所述突变IgG不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码突变IgG1，所述突变IgG1不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码包含L₂₃₄A/L₂₃₅A(LALA)突变IgG。在一些实施方案中，编码双重抗体的核酸序列编码包含L₂₃₄A/L₂₃₅A(LALA)突变IgG1。

在一些实施方案中，如本文所公开，诱变方法(诸如定点诱变)可以用于制备编码变体VH、VL或者VH和VL氨基酸序列的变体VH、VL或者VH和VL核酸序列。模板VH和VL核酸序列SEQ ID NO:55和56分别编码模板氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，双重结合抗体包含由变体VH、VL或者VH和VL核苷酸序列编码的变体VH结构域、变体VL结构域或两者，其中所述核苷酸序列包含分别地核苷酸模板序列SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的定点诱变。通过这种方法，可以通过编码多肽序列的基础多核苷酸的诱变来对多肽序列进行特定修饰。这些技术提供了一种制备和测试序列变体的直接方法，例如但不限于，考虑到所期望的氨基酸变体位点，将一个或多个核苷酸序列改变引入多核苷酸中，如上文所详细描述。

定点诱变允许通过使用编码所期望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻的核苷酸来产生突变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在所贯穿的缺失连接两侧上形成稳定的双链体。可以在选定的多核苷酸序列中采用突变，以改善、改变、减少、修饰或者变更多核苷酸本身的性质，和/或改变编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。

在某些实施方案中，考虑对编码双重结合抗体的组成部分(VH结构域、VL结构域或它们的组合，如本文所公开)的多核苷酸序列进行诱变，以改变编码的模板VH或VL或两者的结合性质，以使得所得的抗体包含双重结合亲和力。定点诱变技术是本领域熟知的，并且被广泛用于产生多肽和多核苷酸两者的变体。例如，定点诱变通常被用于改变DNA分子的特定部分。在这些实施方案中，采用通常包含长度为约14至约25个核苷酸左右的引物，并且在所改变的序列的连接两侧上具有约5至约10个残基。

如本领域的技术人员所理解，定点诱变技术通常采用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于商购获得，并且它们的用途通常是本领域的技术人员熟知的。双链质粒也常用于定点诱变，从而消除将所关注的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。

一般而言，根据本文的定点诱变通过首先获得单链载体或者使双链载体的两条链解链来进行，所述双链载体在其序列内包含编码所期望的肽的DNA序列。通常通过合成来制备具有所期望的突变的序列的寡核苷酸引物。然后使该引物与单链载体退火，并且进行DNA聚合酶处理，所述DNA聚合酶诸如大肠杆菌(E.coli)聚合酶I Klenow片段，以完成具有突变的链的合成。因此，异源双链体得以形成，其中一条链编码原始非突变的序列，第二条链具有所期望的突变。然后将该异源双链体载体用于转化适当的细胞，诸如大肠杆菌细胞，并且选择包含具有突变的序列布置的重组载体的克隆。

使用定点诱变来制备选定的肽编码的DNA区段的序列变体提供了产生潜在有用的种类的方法，并且并不意味着进行限制，因为存在可以获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列的其他方式。在一些实施方案中，制备文库的方法包括本领域已知的那些方法，例如但不限于美国专利9,889,423中描述的方法，该专利整体包含于本文中。在一些实施方案中，用于设计文库内的序列变体的方法包括在计算机上设计变体序列，然后合成该序列，该方法涉及化学和生物化学过程。

如本文所用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”涵盖模板依赖性过程和载体介导的复制，这使特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加，或者使可检测信号的浓度增加，诸如扩增。如本文所用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”涵盖涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语“模板依赖性过程”涵盖RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列由熟知的互补碱基配对规则决定(参见，例如，Watson,1987)。通常，载体介导的方法涉及将核酸片段引入DNA或RNA载体、克隆扩增载体以及回收扩增的核酸片段。此类方法的实例由美国专利4,237,224提供，该专利明确地以引用的方式整体并入本文。

在用于产生多肽VH和VL变体的另一种方法中，可以采用递归序列重组，如美国专利5,837,458所述。在该方法中，进行重组和筛选或选择的迭代循环，以“进化”具有例如增加的结合亲和力的单独的多核苷酸变体。某些实施方案还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，该构建体包含至少一种如本文所述的多核苷酸。

在某些实施方案中，编码氨基酸VH、VL或者VH和VL变体的上文所述的多核苷酸，例如VH、VL或者VH和VL变体多核苷酸、片段和杂交序列被包含在双重结合抗体中。

本文所述的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，均可以与其他DNA序列(诸如启动子、多腺苷酸化信号、附加限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等等)组合，以使得它们的总长度可以具有很大差异。因此预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受到制备的容易性和在预期的重组DNA方案中使用的限制。例如，总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等等(包括所有中间长度)的示例性多核苷酸区段被认为是有用的。

在某些实施方案中，将分离的多核苷酸插入载体中。在一些实施方案中，载体包括包含本文公开的多核苷酸构建体的表达载体。

如本文所用，术语“载体”涵盖其中可以共价插入编码蛋白质的多核苷酸中以引起该蛋白质的表达和/或多核苷酸的克隆的媒介物。可以使用本领域已知的任何合适的方法将分离的多核苷酸插入载体中，例如但不限于，可以使用适当的限制性酶来消化载体，然后可以将载体与具有匹配限制性末端的分离的多核苷酸连接。

合适载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC))、噬菌体(诸如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。可用作载体的动物病毒种类的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。

对于双重抗体或其组分的表达，可以将载体引入宿主细胞中，以允许多肽在宿主细胞内表达。表达载体可以含有多种用于控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择性标记和信号序列。本领域的普通技术人员可以适当地选择这些元件。在一些实施方案中，这些元件可以被认为是“控制”元件。

技术人员将理解，术语“控制序列”可以涵盖可影响所连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或胞内定位的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可以取决于宿主生物体。在特定实施方案中，原核生物的转录控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其他特定实施方案中，真核生物的转录控制序列可以包括包含转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列和多腺苷酸化序列。在某些实施方案中，“控制序列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。

在一些实施方案中，例如但不限于，可以选择启动子序列以促进多核苷酸在载体中的转录。合适的启动子序列包括但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-肌动蛋白启动子、EF1a启动子、CMV启动子和SV40启动子。可以选择增强子序列以增强多核苷酸的转录。可以选择选择性标记以允许从未插入载体的宿主细胞中选择已插入载体的宿主细胞，例如，选择性标记可以是赋予抗生素抗性的基因。可以选择信号序列以允许表达的多肽转运到宿主细胞外。

载体还可以包括协助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质涂层。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文公开的表达载体。

在一些实施方案中，表达载体包含编码双重抗体或其组分的分离的核酸序列，例如但不限于VH结构域、VL结构域、组合的VH-VL结构域，它们可以存在于Fab元件、F(ab')2元件、scFv、Fv、微抗体、双抗体或三抗体中，如上文所述。双重结合结构域及其组分已经在上文详细描述。

在一些实施方案中，表达载体包含编码VH结构域的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码VL结构域的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码VH和VL结构域的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码两个VH和VL结构域的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码三个VH和VL结构域的分离的核酸序列。

在一些实施方案中，表达载体包含编码双重抗体的VH结构域组分的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码双重抗体的VL结构域组分的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码双重抗体的VH和VL结构域组分的分离的核酸序列。

在一些实施方案中，表达载体包含编码双重IgG抗体的VH结构域组分或其片段的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码双重IgG抗体的VL结构域组分或其片段的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码双重IgG抗体的VH和VL结构域组分或其片段的分离的核酸序列。

在一些实施方案中，表达载体包含编码scFv的VH结构域组分的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码scFv的VL结构域组分的分离的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体包含编码scFv的VH和VL结构域组分的分离的核酸序列。

双重结合抗体已经在上文详细描述。使用本领域的知识和本文新描述的具体细节，技术人员将明确地理解可以由本文所述的分离的核酸编码的组分的范围。

对于多核苷酸的克隆，可以将载体引入宿主细胞(分离的宿主细胞)中，以允许载体本身复制并且由此扩增其中包含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可以含有序列组分，该序列组分一般包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和选择性标记。本领域的普通技术人员可以适当地选择这些元件。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在某些实施方案中，本公开提供了含有本文提供的载体的分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可以用于表达或克隆载体中含有的多核苷酸。

在一些实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种如上文所述的构建体。编码任何CDR或一组CDR或者VH结构域或VL结构域或者抗体抗原结合位点或抗体分子的核酸，例如但不限于IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。在一些实施方案中，本文公开了一种产生编码的产物的方法，该方法包括从编码核酸构建体进行表达。在一些实施方案中，表达可以通过在适当的条件下培养含有核酸构建体的重组宿主细胞来实现。在通过表达产生VH结构域或VL结构域、或VH-VL对、或抗体后，可以使用任何合适的技术来分离和/或纯化，然后适当用于例如如本文所述的处理方法。

在一些实施方案中，可以以基本上纯的或同质的形式来制备和分离和/或纯化根据本发明的双重结合抗体、VH和/或VL结构域以及编码核酸分子和载体。

在一些实施方案中，用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞可以包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞(诸如昆虫细胞或哺乳动物细胞)。

用于该目的的合适的原核细胞包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。

原核细胞(诸如大肠杆菌)中的抗体和抗原结合片段的表达在本领域中是成熟的。有关综述，参见例如Pluckthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。本领域的技术人员还可以利用培养物中的真核细胞中的表达作为产生抗体或其抗原结合片段的选项，参见最近综述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576；Trill J.J.等人(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560。

Suitable fungal cells for this purpose include,without limitation,filamentous fungi and yeast。真菌细胞的示例性实例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、普通面包酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如，脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

高等真核细胞，尤其是衍生自多细胞生物体的那些，可以用于表达糖基化的VH和VL结构域，如本文所提供。合适的高等真核细胞包括但不限于无脊椎动物细胞和昆虫细胞以及脊椎动物细胞。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒毒株和变种以及相应的来自宿主的许可性昆虫宿主细胞，所述宿主诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。许多用于转染的病毒毒株是可公开获得的，例如，加州苜蓿夜蛾(Autographacalifornica)NPV的K-1变体和家蚕NPV的Bm-5毒株，并且此类病毒可以用作如本文所述的病毒，尤其可用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。在本领域中可用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞等等。脊椎动物细胞的非限制性实例包括SV40转化的哺乳动物宿主细胞系，诸如猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾细胞系(被亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；ExpiCHO-S(TM)细胞(ThermoFisherScientific产品目录#A29133)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRK-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。

在一些实施方案中，表达载体包括本文所述的核酸构建体。可以选择或构建合适的载体，该载体含有合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。调控序列可以可操作地连接至核酸构建体内包含的核酸序列。载体可以适当地为质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒。有关其他细节，参见，例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第3版,Sambrook和Russell,2001,ColdSpring Harbor Laboratory Press。用于操纵核酸，例如用于制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析的很多已知的技术和方案在CurrentProtocols in Molecular Biology,第二版,Ausubel等人编,John Wiley&Sons,1988,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等人便,John Wiley&Sons,第4版1999中有所详细描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容(均)以引用的方式并入本文。

可以使用本领域已知的任何合适的方法将载体引入宿主细胞中，包括但不限于DEAE-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、微粒轰击、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于转染和转化细胞以表达所关注的载体的标准方法是本领域熟知的。

在一些实施方案中，本文提供了含有本文公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以是体外的，并且可以存在于培养物中。这种宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在可以允许本文所述的双重结合抗体作为“内抗体”或胞内抗体在细胞内表达。内抗体可以用于基因疗法。

在某些实施方案中，宿主细胞包含编码第一多肽(例如，VH结构域)的第一载体和编码第二多肽(例如，VL结构域)的第二载体。在某些实施方案中，宿主细胞包含编码第一多肽(例如，VH结构域)和第二多肽(例如，VL结构域)的载体。

在某些实施方案中，宿主细胞包含编码变体VH结构域的第一载体和编码变体VL结构域的第二载体。在某些实施方案中，宿主细胞包含编码变体VH结构域和变体VL结构域的单一载体。

在一些实施方案中，分离的细胞包含分离的核酸序列，如本文所公开。在一些实施方案中，分离的细胞包含两种如本文所公开的分离的核酸序列，其中一种核酸编码变体VH结构域，另一种核酸编码变体VL结构域。在一些实施方案中，分离的细胞包含如本文所公开的单个分离的核酸序列，该序列编码变体VH结构域和变体VL结构域。

在某些实施方案中，第一载体和第二载体可以同时或不同时引入。在某些实施方案中，第一载体和第二载体可以一起引入宿主细胞中。在某些实施方案中，可以首先将第一载体引入宿主细胞中，然后可以将第二载体引入宿主细胞中。在某些实施方案中，可以将第一载体引入宿主细胞中，然后将宿主细胞建立成表达第一多肽的稳定细胞系，然后可以将第二载体引入稳定细胞系中。

在某些实施方案中，宿主细胞包含编码双重结合抗体内包含的至少一个变体VH结构域和至少一个变体VL的载体。

在引入之后可以引起或允许从核酸进行的表达，例如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。在某些实施方案中，本公开提供了表达本文提供的多肽的方法，该方法包括在载体中插入的多核苷酸得以表达的条件下培养含有载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，核酸被整合进宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，整合可以通过包含促进与基因组重组的序列来促进。在一些实施方案中，核酸构建体未整合进基因组中，并且载体是附加型的。

在一些实施方案中，本文公开了一种方法，该方法包括在表达系统中使用如上文所述的构建体，以表达如上文所述的双重结合抗体或其片段。

用于表达多核苷酸的合适的条件可以包括但不限于合适的培养基、培养基中具有合适的宿主细胞密度、存在必需营养物、存在补充因子、合适的温度和湿度以及不存在微生物污染物。本领域的普通技术人员可以根据表达的目的来适当选择合适的条件。

合成经工程化的“重表位化的”双重抗体的方法

在一些实施方案中，本文描述了一种产生双重结合抗体的方法，所述双重结合抗体包括包含如本文所述的HCDR的VH结构域。在一些实施方案中，本文描述了一种产生双重结合抗体的方法，所述双重结合抗体包括包含如本文所述的LCDR的VL结构域。在一些实施方案中，本文描述了一种产生双重结合抗体的方法，所述双重结合抗体包括包含如本文所述的HCDR的VH结构域和包含如本文所述的LCDR的VL结构域。

在一些实施方案中，产生双重结合抗体的方法包括培养包含编码至少双重结合抗体的VH和VL的核酸序列的一个或多个细胞的步骤，所述双重结合抗体包含(a)重链可变区、(b)轻链可变区或者(c)(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中所述双重结合抗体的所述重链可变区、所述轻链可变区或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2；其中包含变体VH和变体VL结构域的多肽被表达和分离，并且其中所述分离的变体VH和变体VL结构域形成异源二聚体。如本文所详细公开，编码变体VH和变体VL结构域的分离的核酸序列可以被包含在载体内，其中使用相同的载体或不同的载体。在一些实施方案中，每个变体VH结构域和变体VL结构域可以从不同的宿主细胞表达，其中二聚化在组分变体VH和变体VL结构域的分离或纯化后进行。在一些实施方案中，变体VH和变体VL结构域可以从相同的宿主细胞表达，其中二聚化在培养物中或者在组分变体VH和变体VL结构域的分离或纯化后进行。

技术人员将理解，产生双重结合抗体包括合成氨基酸多肽组分，该组分包含VH结构域、VL结构域或两者。在一些实施方案中，所述合成从如本文详细描述的核酸构建体开始。在一些实施方案中，术语“产生”和“合成”可以在本文中互换使用，具有完全相同的性质和含义。

在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成IgG重链，合成IgG轻链，或者合成两者，所述IgG重链包含变体VH结构域，所述IgG轻链包含变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成IgG重链，所述IgG重链包含变体VH结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成IgG轻链，所述IgG轻链包含变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成IgG重链和IgG轻链两者，所述IgG重链包含变体VH结构域，所述IgG轻链包含变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成Fab，所述Fab包括包含变体VH结构域的IgG重链的片段和包含变体VL结构域的IgG轻链的片段。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成F(ab')₂，所述F(ab')2包括包含变体VH结构域的IgG重链的片段和包含变体VL结构域的IgG轻链的片段。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成Fv，所述Fv包含变体VH结构域和变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成scFv，所述scFv包含变体VH结构域和变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成微抗体，所述微抗体包含变体VH结构域和变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成双抗体，所述双抗体包含变体VH结构域和变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成三抗体，所述三抗体包含变体VH结构域和变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成变体VH结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体包括合成变体VL结构域。

在某些实施方案中，在宿主细胞中表达的多肽可以形成二聚体，从而产生双重结合抗体或其结合组分。

在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括使编码不包含双重结合VH结构域的模板重链可变区的核酸序列突变的步骤，以产生可以包括双重结合VH结构域的变体VH结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括使编码不包含双重结合VL结构域的模板轻链可变区的核酸序列突变的步骤，以产生可以包括双重结合VL结构域的变体VL结构域。在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括使编码不包含双重结合VH结构域的模板重链可变区的核酸序列突变的步骤，以产生可以包含双重结合VH结构域的变体VH结构域，以及使编码不包含双重结合VL结构域的模板轻链可变区的核酸序列突变的步骤，以产生可以包含双重结合VL结构域的变体VL结构域，其中变体VH和VL结构域包含抗体的双重可变区。使核酸序列突变的方法已经在上文详细描述并且在下文的实施例中示例。

在一些实施方案中，编码模板重链可变区的模板核酸序列如SEQ ID NO:55中所示。在一些实施方案中，编码模板轻链可变区的模板核酸序列如SEQ ID NO:56中所示。如全文所述，模板VH和VL序列不包含双重结合区。

在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括在VH结构域和VL结构域内引入至少2个变体位点。在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括在VH结构域和VL结构域内引入至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个变体位点。变体位点可以分布在VH结构域和VL结构域之间。在一些实施方案中，变体位点在VH结构域的CDR区内。在一些实施方案中，变体位点在VL结构域的CDR区内。在一些实施方案中，变体位点在VH结构域的FR区内。在一些实施方案中，变体位点在VL结构域的FR区内。在一些实施方案中，变体位点在VH结构域的CDR区和/或FR区内。在一些实施方案中，变体位点在VL结构域的CDR区和/或FR区内。在一些实施方案中，变体位点在VH结构域的CDR区和/或FR区内，以及VL结构域的CDR区和/或FR区内。

在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域复合物可以在宿主细胞内形成。例如，变体VH和变体VL结构域异源二聚体可以在相关酶和/或辅因子的协助下在宿主细胞内形成。在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域多肽复合物可以分泌到细胞外。在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域可以分泌到宿主细胞外并且在宿主细胞外形成异源二聚体。

在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域可以单独表达并且允许在合适的条件下二聚化。例如，变体VH和变体VL结构域可以在合适的缓冲液中组合，并且允许变体VH和变体VL结构域通过适当的相互作用(诸如疏水性相互作用)二聚化。又如，变体VH和变体VL结构域可以在含有酶和/或辅因子的合适的缓冲液中组合，所述酶和/或辅因子可以促进变体VH和变体VL结构域的二聚化。又如，变体VH和变体VL结构域可以在合适的媒介物中组合，并且允许它们在存在合适的试剂和/或催化剂的情况下彼此反应。

在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域可以包含在更长的多肽序列内，它们可以包含例如但不限于恒定区、铰链区、接头区、Fc区或二硫键结合区或它们的任何组合。恒定结构域是免疫球蛋白分子的恒定部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为恒定区的结构域(例如，CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl)。在一些实施方案中，较长的多肽可以包含变体VH结构域、变体VL结构域或两者的多个拷贝，例如但不限于当双重结合抗体包括双抗体或三抗体时。

在某些实施方案中，变体VH和变体VL结构域通过DNA合成和PCR以及它们产生的核苷酸序列的翻译来产生。在某些实施方案中，所产生的序列可以被亚克隆至表达载体中。在某些实施方案中，所产生的序列可以被亚克隆至两个表达载体中。在某些实施方案中，所述表达载体是质粒。在某些实施方案中，所述变体VH和变体VL结构域构建于IgG模板上，其中所述IgG模板不具有双重结合能力。

在某些实施方案中，通过共转染编码变体VH和变体VL结构域的表达载体或者通过将编码两者的表达载体转染至合适的细胞中来进行瞬时表达。技术人员将理解，有多种转染方法和方案可以用于此目的。在某些实施方案中，使用PEI方法来进行转染或共转染。

可以使用任何合适的方法来收集所表达的包含变体VH和变体VL结构域和/或多肽复合物的多肽。变体VH和变体VL结构域和/或多肽复合物可以在细胞内、周质空间中表达或分泌到细胞外的培养基中。如果包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽复合物在细胞内表达，则可以裂解含有包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽复合物的宿主细胞，并且可以通过离心或超滤除去不期望的碎片来从裂解物中分离多肽和/或多肽复合物。如果包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽复合物分泌到大肠杆菌的周质空间中，则细胞浆可以在存在以下试剂的情况下解冻约30分钟，所述试剂诸如乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)，并且可以通过离心来除去细胞碎片(Carter等人,BioTechnology 10:163-167(1992))。如果包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽复合物分泌到培养基中，则可以使用商购获得蛋白质浓缩过滤器(例如，Amincon或MilliporePellicon超滤单元)来收集和浓缩细胞培养物的上清液。蛋白酶抑制剂和/或抗生素可以包括在收集和浓缩步骤中，以抑制蛋白质降解和/或受污染的微生物的生长。

所表达的包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽复合物可以通过合适的方法来进一步纯化，所述方法诸如但不限于亲和色谱、羟基磷灰石色谱、尺寸排阻色谱、凝胶电泳、透析、在离子交换柱上进行的离子交换分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素琼脂糖色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸色谱柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀(参见，综述，Bonner,P.L.,Protein purification,Taylor&Francis出版,2007；Janson,J.C.等人,Protein purification:principles,highresolution methods and applications,Wiley-VCH出版,1998)。

在某些实施方案中，包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽二聚体复合物可以通过亲和色谱来纯化。在某些实施方案中，蛋白A色谱或蛋白A/G(蛋白A和蛋白G的融合蛋白)色谱可以用于纯化包含衍生自抗体CH2结构域和/或CH3结构域的组分的多肽和/或多肽复合物(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))；Zettlit,K.A.,AntibodyEngineering,第V部分,531-535,2010)。在某些实施方案中，本文公开的双重结合抗体不结合至蛋白A。在某些实施方案中，蛋白G色谱可以用于纯化包含IgGγ3重链的多肽和/或多肽复合物(Guss等人,EMBO J.5:1567 1575(1986))。在某些实施方案中，蛋白L色谱可以用于纯化包含K轻链的多肽和/或多肽复合物(Sudhir,P.,Antigen engineering protocols,第26章,Humana Press出版,1995；Nilson,B.H.K.等人,J.Biol.Chem.,267,2234-2239(1992))。亲和力配体附接的基质通常是琼脂糖，但是也可以使用其他基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质(诸如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)可以实现更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，可以使用Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)来进行纯化。

在任何初步纯化步骤后，可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液来对包含双重结合抗体和污染物的混合物进行低pH疏水性相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)处进行。

在某些实施方案中，包含变体VH和变体VL结构域的多肽和/或多肽二聚体复合物可以通过亲和色谱和尺寸排阻色谱(SEC)来纯化。技术人员将理解，有多种方法和方案适用于此目的。在某些实施方案中，使用AKTA纯仪器(GE Lifesciences)通过亲和色谱和SEC来进行蛋白质纯化。在某些实施方案中，通过使收获的上清液通过CaptureSelect^TMCH1-XL亲和力基质(Thermo Scientific)色谱柱来实现双重结合抗体的亲和力捕获。在用PBS洗色谱柱后，用0.1M甘氨酸pH 2.5来洗脱蛋白质，并且立即用1/6体积的1M Tris-HCl pH8.0中和。然后使用Amicon 30kD浓缩器(Merck Millipore)将亲和力纯化的蛋白质浓缩至5-10mg/ml，并且在用PBS平衡的200色谱柱(GE Lifesciences)上进行SEC纯化。然后收集蛋白质级分并且使用SDS-PAGE和HPLC-SEC对蛋白质级分进行分析。

与合成的双重结合免疫球蛋白的表位的结合可以使用本领域熟知的方法来分析，如本文所述，所述方法包括ELISA分析、SPR分析、DSF分析和基于细胞的结合测定法。

在一些实施方案中，合成双重结合抗体的方法包括以下步骤，所述双重结合抗体包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的模板氨基酸序列，其中所述模板在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处包含至少一个氨基酸变体，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的模板氨基酸序列，其中所述模板在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处包含至少一个氨基酸变体，其中所述重链可变区、所述轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2：

(a)使模板重链可变区、模板轻链可变区或两者突变，

(i)其中使所述模板重可链变区突变包括使如SEQ ID NO:1中所示的模板重链可变区突变，其中选定的模板可变链不包含双重结合区，

(ii)其中使所述模板轻链可变区突变包括使如SEQ ID NO:2中所示的模板轻链可变区突变，其中选定的模板可变链不包含双重结合区；

(iii)其中使所述模板重链可变区和所述模板轻链可变区突变包括使如SEQ IDNO:1所示的模板重链可变区突变以及使如SEQ ID NO:2所示的模板轻链可变区突变，其中选定的模板可变链共同不包含双重结合区，并且其中所述突变包括使所述模板重链可变区、所述模板轻链可变区或它们的组合中的至少两个残基位置突变；

(b)合成突变的模板变体重链可变链和突变的模板变体轻链可变链；

(c)使所述突变的模板变体重链可变链和所述突变的模板变体轻链可变链格式化为人抗体格式；以及

(d)针对与双重抗原的结合筛选(c)的人抗体；

从而产生双重结合抗体。

如本文所述和下文所示例，在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG1免疫球蛋白、IgG2免疫球蛋白、IgG3免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG1免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG2免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG3免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，合成的抗体包括IgG1免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。

在一些实施方案中，合成的抗体包括Fab免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，合成的抗体包括F(ab')₂免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，合成的抗体包括Fv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，合成的抗体包括scFv免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，合成的抗体包括微抗体免疫球蛋白构建体，该构建体包含经由CH3结构域连接的一对单链Fv片段。

在一些实施方案中，合成的抗体包括双抗体免疫球蛋白构建体。在一些实施方案中，合成的抗体包括双抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含彼此共价连接的三个scFv片段。在一些实施方案中，合成的抗体包括三抗体。

在一些实施方案中，合成的抗体包括不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG。在一些实施方案中，合成的抗体包括不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG1。在一些实施方案中，合成的抗体包括不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分的突变IgG4。

免疫球蛋白文库

在某些实施方案中，本文公开了一种免疫球蛋白或其片段的文库，所述免疫球蛋白包含变体VH结构域、变体VL结构域或者变体VH和VL结构域，如本文所详细描述(参见，以下实施例)。在一些实施方案中，可以针对双重结合抗体、其片段或其组分来筛选包含变体VH结构域、变体VL结构域或者变体VH和VL结构域的免疫球蛋白或其片段的文库。

在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段的文库包括可变重链结构域的文库。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段的文库包括可变轻链结构域的文库。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段的文库包括可变重链结构域和可变轻链结构域的文库。

在一些实施方案中，用于产生双重抗原结合免疫球蛋白可变重链区的文库以筛选与表位的结合的方法包括：(a)选择如SEQ ID NO:1中所示的VH模板抗原结合分子，其中所述选择的模板不特异性结合表位；(b)从所述模板SEQ ID NO:1中的52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)选择至少一个残基位置来进行突变；以及(c)选择至少一个变体残基来置换在(b)中选择的至少一个残基位置；以产生含有所述模板VH的多个变体的文库。在一些实施方案中，用于产生双重抗原结合免疫球蛋白可变轻链区的文库以筛选与表位的结合的方法包括：(a)选择如SEQ ID NO:2中所示的VL模板抗原结合分子，其中所述选择的模板不特异性结合表位；(b)从所述模板SEQ ID NO:2中的26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)选择至少一个残基位置来进行突变；以及(c)选择至少一个变体残基来置换在(b)中选择的至少一个残基位置；以产生含有所述模板VL的多个变体的文库。

在一些实施方案中，用于产生包含可变重链区和可变轻链区的双重抗原结合免疫球蛋白的文库以筛选与表位的结合的方法包括：(a)选择如SEQ ID NO:1中所示的VH模板抗原结合分子，其中所述选择的模板不特异性结合表位；(b)选择如SEQ ID NO:2中所示的VL模板抗原结合分子，其中所述选择的模板不特异性结合表位；(c)从所述模板SEQ ID NO:1中的52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位，109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或它们的组合)选择至少一个残基位置来突变；(d)从所述模板SEQ ID NO:2中的26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)选择至少一个残基位置来突变；(e)选择至少一个变体残基来置换在(c)中选择的至少一个残基位置，或者选择至少一个变体残基来置换在(d)中选择的至少一个残基位置，以使得每个潜在的双重结合免疫球蛋白中的变体残基的总数为至少2，并且产生含有所述模板VH的多个变体和所述模板VL的变体的文库。

在一些实施方案中，用于构建文库的方法可以存在于实施例中。在一些实施方案中，如本文所述产生的文库可以用于鉴定与双重靶标结合的免疫球蛋白。在一些实施方案中，如本文所述产生的文库可以用于鉴定与特定表位结合的免疫球蛋白。

在一些实施方案中，包含免疫球蛋白的蛋白质文库的使用提供了鉴定免疫球蛋白与双重靶标的结合的方法，所述免疫球蛋白包含如本文详细描述的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL。在一些实施方案中，包含免疫球蛋白的蛋白质文库的使用提供了鉴定与特定表位结合的免疫球蛋白的方法，所述免疫球蛋白包含如本文详细描述的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL。

在一些实施方案中，蛋白质文库包括抗体分子的文库，所述蛋白质文库包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含变体VH和变体VL。在一些实施方案中，蛋白质文库包括IgG分子的文库，所述蛋白质文库包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含变体VH和变体VL。在一些实施方案中，蛋白质文库包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的文库，所述蛋白质文库包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含变体VH和变体VL。在一些实施方案中，IgG分子是突变IgG分子，所述突变IgG分子不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

在一些实施方案中，蛋白质文库包括Fab或F(ab')₂分子的文库，所述蛋白质文库包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含变体VH和变体VL。在一些实施方案中，蛋白质文库包括Fv分子、scFv分子、微抗体分子、双抗体分子或三抗体分子的文库，所述蛋白质文库包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含变体VH和变体VL。

在一些实施方案中，可以改变现有的免疫球蛋白VH和VL模板，以在特定位置引入变体氨基酸，目的是在所述变体VH和VL结构域中产生双重抗原结合位点，其中变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含至少10；100；1,000；10,000；100,000；或1,000,000个具有至少两个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含1,000至1,000,000个具有至少两个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含10,000至1,000,000个具有至少两个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。

在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含1,000至1,000,000个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含10,000至1,000,000个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。

在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含10⁶至10¹⁴个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。在一些实施方案中，变体VH和VL结构域的蛋白质文库包含10⁶至10¹⁴个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个变体位置的变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL结构域。

然后针对与一种或多种抗原的结合对文库进行筛选。在对所期望的性质进行分子表征后，通过基因工程技术将选定的抗体结构域或区域(例如但不限于VH或VL结构域或两者)克隆至免疫球蛋白分子，使得替换相应的区域。或者，可以仅交换编码VH、或VL、或两个区域，或者编码突变的氨基酸的DNA，以获得具有附加分子结合位点的免疫球蛋白。在一些实施方案中，克隆有变体区的免疫球蛋白分子的选择可以选自IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。在一些实施方案中，IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，IgG包括突变IgG，所述突变IgG不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

在一些实施方案中，表达的CDR如上文针对HCDR1、HCDR2、HCD3、LCDR1、LCDR2和LCDR3所述，其中某些位置包含变体氨基酸，如上文所详细描述和图1A和1B所示。

突变的位点如上文所述，并且在某些实施方案中包括所述模板SEQ ID NO:1中的52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)，以及所述模板SEQ ID NO:2中的26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)。在一些实施方案中，所述VH模板或所述VL模板内的另外的位点可以是突变的。

在某些实施方案中，产生文库的方法还包括从上文详细描述的所述核酸构建体合成模板变体(VH、VL或者VH和VL两者)，以形成文库。

如上文所述产生文库的结果包括免疫球蛋白的文库，所述免疫球蛋白包含：(a)重链可变区、(b)轻链可变区或者(c)(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中重链可变区、轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

上文已经描述了哺乳动物细胞表达系统。这些表达系统为治疗性抗体产生提供了很多潜在优点，可产生潜在的双重结合免疫球蛋白的文库，包括共同选择关键制备相关性质(诸如高水平表达和稳定性)，同时在细胞表面上展示功能性糖基化的IgG的能力。

在一些实施方案中，免疫球蛋白的文库包含IgG分子、Fab分子、F(ab')₂分子、FV分子、VH分子、VL分子、scFv分子、双抗体、微抗体或三抗体。在一些实施方案中，IgG分子包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，IgG包括突变IgG，所述突变IgG不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在一些实施方案中，IgG1包括突变IgG1，所述突变IgG1不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

在一些实施方案中，本文公开了涉及用抗原分子或其部分来筛选文库，以选择具有所期望的性质(例如，结合亲和力、稳定性等)的双重结合分子的方法。在一些实施方案中，抗原的一部分包括至少一种IL-13抗原表位。在一些实施方案中，本文公开了在所述筛选后从文库分离的双重结合分子。

在一些实施方案中，本文公开了一种用于筛选所述免疫球蛋白的文库中的双重结合分子的方法，所述方法包括：(a)用抗原分子或其片段来筛选文库，以鉴定结合所关注的所述表位的双重结合分子；(b)对步骤(a)中鉴定的结合物进行测序，以确定哪些残基是变体以及哪些变体残基富集在结合免疫球蛋白中；(c)使用来自步骤(b)的信息来合成双重结合物的变体的优化的文库；以及(d)使用优化的文库来重复步骤(a)-(c)。在一些实施方案中，本文公开了一种用于筛选所述免疫球蛋白的文库中的双重结合分子的方法，所述方法包括：(a)用所关注的表位来筛选文库，以鉴定结合所关注的所述表位的双重结合分子；(b)对步骤(a)中鉴定的结合物进行测序，以确定哪些残基是变体以及哪些变体残基富集在结合免疫球蛋白中；(c)使用来自步骤(b)的信息来合成双重结合物的变体的优化的文库；以及(d)使用优化的文库来重复步骤(a)-(c)。

根据一些实施方案，变体免疫球蛋白与抗原分子的特异性结合通过结合测定法来测定，所述结合测定法选自由以下各项组成的组：免疫测定法，包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离子共振测定法、饱和转移差异核磁共振波谱法、转移NOE(trNOE)核磁共振波谱法、竞争性测定法、组织结合测定法、活细胞结合测定法和细胞提取物测定法。

结合测定法可以使用本领域已知的多种方法来进行，所述方法包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的测定法、AlphaScreen.TM(放大发光邻近均相测定法)、闪烁临近测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、SPR(表面等离子共振，也称为)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳和色谱法(包括凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用一些融合配偶体或标记。

在一些实施方案中，变体免疫球蛋白缀合至标记，所述标记选自由以下各项组成的组：有机分子、酶标记、放射性标记、颜色标记、荧光标记、生色标记、发光标记、半抗原、地高辛配基、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物。在某些实施方案中，与标记的缀合可以允许在例如结合测定法(例如ELISA)和结合研究中进行所述缀合物的简单检测。

组合物的使用

在一些实施方案中，本文描述了包含双重结合抗体的药物组合物，如本文所详细描述，所述双重结合抗体提供治疗剂。在一些实施方案中，本文描述了包含双重结合抗体的药物组合物，所述双重结合抗体包括治疗剂，所述治疗剂包含突变IgG，所述突变IgG不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在一些实施方案中，本文描述了包含双重结合抗体的药物组合物，所述双重结合抗体具有针对过敏性或呼吸系统病症的治疗性质。

在一些实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体和药学上可接受的载剂，所述双重结合抗体包含变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL。变体VH和变体VL结构域以及它们的对的氨基酸序列已经在上文有所详细描述(参见例如但不限于表1)。

在某些实施方案中，组合物包含本文公开的分离的双重结合抗体中的任一者和药学上可接受的载剂。

在一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体具有HCDR1、HCDR2和HCDR3(分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列)，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(分别包含SEQ ID NO:359、360和361的氨基酸序列)。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体具有HCDR1、HCDR2和HCDR3(分别包含SEQ ID NO:349、356和351的氨基酸序列)，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(分别包含SEQ ID NO:364、360和371的氨基酸序列)。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体具有HCDR1、HCDR2和HCDR3(分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列)，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(分别包含SEQ ID NO:362、360和384的氨基酸序列)。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体具有HCDR1、HCDR2和HCDR3(分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列)，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(分别包含SEQ ID NO:364、360和384的氨基酸序列)。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体具有HCDR1、HCDR2和HCDR3(包含如表8或表4中所示的氨基酸序列)，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3(包含如表9或表5中所示的氨基酸序列)。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含SEQ ID NO:209和210的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含SEQ ID NO:219和220的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含SEQ ID NO:249和250的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含SEQ ID NO:337和338的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含如表10或表1中所示的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL与本文公开的VH和VL序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

在一些实施方案中，包含双重结合抗体的药物组合物包括本文所述的任何双重抗体，所述双重抗体包含变体VH、变体VL或者变体VH和变体VL。在一些实施方案中，包含双重结合抗体的药物组合物包含重链可变区、轻链可变区或者(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中重链可变区、轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

技术人员将认识到，在一些实施方案中，术语“双重结合抗体”可以与术语“药物”或“药剂”互换使用，具有完全相同的含义和性质。在一些实施方案中，包含双重结合抗体的药物包括药物组合物。

在一些实施方案中，本文描述了包含如本文所述的双重结合抗体的组合物以及此类组合物在多种治疗环境中的施用。

本文所述的双重结合抗体以纯净形式或在适当的药物组合物中的施用可以通过用于提供类似效用的可接受的药剂施用模式中的任一者来进行。药物组合物可以通过将双重结合抗体或含有双重结合抗体的组合物与适当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制备物，诸如片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球剂和气雾剂。此外，其他药物活性成分和/或合适的赋形剂(诸如盐、缓冲剂和稳定剂)可以但不必存在于组合物内。施用可以通过多种不同的途径来实现，所述途径包括口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、皮下或局部途径。在一些实施方案中，施用方式取决于待治疗或预防的病症的性质。在施用后减少、抑制、预防或延迟癌症的进展和/或转移的量被认为是有效的。技术人员将理解，术语“生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”在一些实施方案中可以与术语“药学上可接受的载剂”互换使用，具有完全相同的含义和性质。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含编码双重结合抗体的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文公开的双重结合抗体的核苷酸序列包括单个线性核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文公开的双重结合抗体的核苷酸序列包括两个核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文公开的双重结合抗体的核苷酸序列包括存在于相同的载体上的两个核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文公开的双重结合抗体的核苷酸序列包括存在于不同的载体上的两个核苷酸序列。

在一些实施方案中，核苷酸序列编码变体VH或变体VL结构域或者它们的组合。在一些实施方案中，相同的核苷酸序列编码变体VH或变体VL结构域或者它们的组合。在一些实施方案中，不同的核苷酸序列编码变体VH或变体VL结构域或者它们的组合。在一些实施方案中，一个核苷酸序列编码变体VH结构域，另一个核苷酸序列编码变体VL结构域。在一些实施方案中，一个核苷酸序列编码变体VH结构域，另一个核苷酸序列编码变体VL结构域，它们之间具有接头序列，因此允许变体VH和变体VL结构域发生异源二聚化，如Duperret EK等人,Cancer Res,10月4日(doi:10.1158/0008-5472.CAN-18-1429)所述。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含(a)变体VH结构域和(b)变体VL结构域，所述变体VH结构域包含如SEQID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体，所述变体VL结构域包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体，其中与未施用所述药物组合物的受试者相比，所述方法治疗过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含变体VH结构域，所述变体VH结构域包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体，其中与未施用所述药物组合物的受试者相比，所述方法治疗过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含变体VL结构域，所述变体VL结构域包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体，其中与未施用所述药物组合物的受试者相比，所述方法治疗过敏性或呼吸系统病症或者它们的组合。

使用方法

在一些实施方案中，本文公开了一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括将包含如本文公开的分离的双重结合抗体的组合物施用于所述受试者。在一些实施方案中，疾病或病症是过敏性或呼吸系统病症、炎性或自身免疫病症，或者肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、重度哮喘、轻度哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、涉及气道炎症的病症、囊性纤维化、过敏性肺部疾病、气道高反应性、杯状细胞化生、粘液分泌过多、气道重塑、肺纤维化、特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性肠胃炎、过敏性鼻炎、炎性肠病、肝硬化或纤维化或者它们的组合。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或它们的药物组合物，所述双重结合抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3，如本文所详细描述；例如，参见表8或表4)。在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或它们的药物组合物，所述双重结合抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3，如本文所详细描述；例如，参见表9或表5)。在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或其药物组合物，所述双重结合抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和LCDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3，如本文所详细描述)。

在某些实施方案中，治疗患有疾病或病症的受试者的方法包括施用双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中

HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:359、360和361的氨基酸序列；或者HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、356和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和371的氨基酸序列；或者HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ IDNO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:362、360和384的氨基酸序列；或者HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和384的氨基酸序列；或者CDR具有SEQ ID NO:149-154的序列。

在一些实施方案中，治疗患有疾病或病症的受试者的方法包括施用双重结合抗体，所述双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3包含如表8或表4中所示的氨基酸序列，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3包含如表9或表5中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗患有疾病或病症的受试者的方法包括施用双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH和VL，所述VH和所述VL具有SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158的序列。在一些实施方案中，治疗患有疾病或病症的受试者的方法包括施用双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH和VL结构域，所述VH和VL结构域具有如表10或表1中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或其药物组合物，所述双重结合抗体包含(a)重链可变区、(b)轻链可变区或者(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中所述重链可变区、所述轻链可变区或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2，其中与未施用所述双重结合抗体或其药物组合物的受试者相比，所述方法治疗所述受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或其药物组合物，所述双重结合抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体，其中所述重链可变区中的变体位置的总数为至少2，其中与未施用所述双重结合抗体或其药物组合物的受试者相比，所述方法治疗所述受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或其药物组合物，所述双重结合抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中所述轻链可变区中的变体位置的总数为至少2，其中与未施用所述双重结合抗体或其药物组合物的受试者相比，所述方法治疗所述受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)。

在一些实施方案中，治疗受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的方法包括将药物组合物施用于有需要的受试者的步骤，所述药物组合物包括双重结合抗体或其药物组合物，所述双重结合抗体包含(a)重链可变区和(b)轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中所述重链可变区、所述轻链可变区或所述它们的组合中的变体位置的总数为至少2，其中与未施用所述双重结合抗体或其药物组合物的受试者相比，所述方法治疗所述受试者的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)。

在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，变体VH结构域的氨基酸序列选自但不限于SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包含重链可变区和任何可变轻链区，所述重链可变区包含但不限于如SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的氨基酸序列。在本文公开的方法的一些实施方案中，变体VH结构域的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的序列具有至少80％同一性(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的序列。

在本文公开的方法的一些实施方案中，双重结合抗体的VH结构域选自SEQ ID NO:209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345和347中的任一者中所示的序列。在另一个实施方案中，VH结构域与本文公开的VH序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

本领域的技术人员将理解，序列同一性百分比可以使用多种可公开获得的软件应用程序中的任何一种来确定，例如但不限于使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件通过默认参数来确定。

在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，变体轻链可变区(VL)的氨基酸序列选自但不限于SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包含轻链可变区和任何可变重链区，所述重链可变区包含但不限于如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的氨基酸序列。在本文公开的方法的一些实施方案中，变体VH结构域的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的序列具有至少80％同一性(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的序列和任何可变重链区。

在本文公开的方法的一些实施方案中，双重结合抗体的VL结构域选自SEQ ID NO:210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346和348中的任一者中所示的序列。在另一个实施方案中，VL结构域与本文公开的VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，变体VH结构域的氨基酸序列选自但不限于SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54中的任一个所示的序列；并且变体轻链可变区(VH)的氨基酸序列选自但不限于SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法的一些实施方案中，重链可变区–轻链可变区对的氨基酸序列选自但不限于SEQ IDNO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ ID NO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ IDNO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ ID NO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ IDNO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ ID NO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ IDNO:50和49、SEQ ID NO:52和51和SEQ ID NO:54和53中所示的对序列。在一些实施方案中，VH-VL对的氨基酸序列选自如以下中的任一者所示的对序列：SEQ ID NO:209和210、SEQ IDNO:211和212、SEQ ID NO:213和214、SEQ ID NO:215和216、SEQ ID NO:217和218、SEQ IDNO:219和220、SEQ ID NO:221和222、SEQ ID NO:223和224、SEQ ID NO:225和226、SEQ IDNO:227和228、SEQ ID NO:229和230、SEQ ID NO:231和232、SEQ ID NO:233和234、SEQ IDNO:235和236、SEQ ID NO:237和238、SEQ ID NO:239和240、SEQ ID NO:241和242、SEQ IDNO:243和244、SEQ ID NO:245和246、SEQ ID NO:247和248、SEQ ID NO:249和250、SEQ IDNO:251和252、SEQ ID NO:253和254、SEQ ID NO:255和256、SEQ ID NO:257和258、SEQ IDNO:259和260、SEQ ID NO:261和262、SEQ ID NO:263和264、SEQ ID NO:265和266、SEQ IDNO:267和268、SEQ ID NO:269和270、SEQ ID NO:271和272、SEQ ID NO:273和274、SEQ IDNO:275和276、SEQ ID NO:277和278、SEQ ID NO:279和280、SEQ ID NO:281和282、SEQ IDNO:283和284、SEQ ID NO:285和286、SEQ ID NO:287和288、SEQ ID NO:289和290、SEQ IDNO:291和292、SEQ ID NO:293和294、SEQ ID NO:295和296、SEQ ID NO:297和298、SEQ IDNO:299和300、SEQ ID NO:301和302、SEQ ID NO:303和304、SEQ ID NO:305和306、SEQ IDNO:307和308、SEQ ID NO:309和310、SEQ ID NO:311和312、SEQ ID NO:313和314、SEQ IDNO:315和316、SEQ ID NO:317和318、SEQ ID NO:319和320、SEQ ID NO:321和322、SEQ IDNO:323和324、SEQ ID NO:325和326、SEQ ID NO:327和328、SEQ ID NO:329和330、SEQ IDNO:331和332、SEQ ID NO:333和334、SEQ ID NO:335和336、SEQ ID NO:337和338、SEQ IDNO:339和340、SEQ ID NO:341和342、SEQ ID NO:343和344、SEQ ID NO:345和346、SEQ IDNO:347和348。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有SEQ ID NO:149-154的序列。在另一个实施方案中，所述双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL具有SEQ IDNO:155和156，或者SEQ ID NO:157和158的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有分别如SEQ ID NO:349、350和351中所示的序列，以及分别如SEQ ID NO:359、360和361中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有分别如SEQ ID NO:349、356和351中所示的序列，以及分别如SEQ ID NO:364、360和371中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有分别如SEQ ID NO:349、350和351中所示的序列，以及分别如SEQ ID NO:362、360和384中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有分别如SEQ ID NO:349、350和351中所示的序列，以及分别如SEQ ID NO:364、360和384中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中CDR具有如表8或表4以及表9或表5中所示的序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL包含SEQ ID NO:209和210的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含SEQ ID NO:219和220的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含SEQ ID NO:249和250的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含SEQ ID NO:337和338的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含如表10或表1中所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，治疗如本文所述的受试者的一种或多种病症的方法包括施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含分离的双重结合抗体，其中VH和VL与本文公开的VH和VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

上文已经详细描述了变体VH和VL结构域，包括通过使模板序列重表位化来产生这些变体VH和VL结构域的方法。该公开内容整体并入本文，其中治疗过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)的方法包括使用本文所述的任何变体VH或VL结构域。

技术人员将理解，术语“治疗”及其语法形式在一些实施方案中可以涵盖针对过敏性或呼吸系统病症的治疗性治疗以及预防性或防止性措施两者，如本文所述，其中目的是治疗、预防、减少或减轻过敏性或呼吸系统病症或其症状或者它们的组合。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，治疗可以包括直接影响或治愈、压制、抑制、预防、降低疾病、障碍或病症的严重性，延迟疾病、障碍或病症的发作，减少与疾病、障碍或病症相关的症状，或者它们的组合；例如，当所述疾病或障碍包括过敏性或呼吸系统病症时。在一些实施方案中，“治疗”涵盖增强宿主免疫细胞破坏胞内病原体的能力。在一些实施方案中，“治疗”涵盖干扰IL-13受体/IL-4受体信号传导级联。在一些实施方案中，“治疗”涵盖抑制IL-13活性。在一些实施方案中，“治疗”涵盖减少IL-13活性。

在一些实施方案中，“预防”涵盖延迟症状或过敏性或呼吸系统病症的发作。在一些实施方案中，“压制”或“抑制”涵盖减少症状的严重性、减少急性发作的严重性、减少症状的数量、减少疾病相关症状的发生、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期或者它们的组合。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，患有一种或多种IL-13相关障碍的人，所述障碍包括但不限于呼吸系统障碍或病症(例如，哮喘(例如，过敏性和非过敏性哮喘，例如但不限于由于感染例如呼吸道合胞病毒(RSV)(例如，在年幼儿童中)而导致的哮喘)、严重哮喘、轻度哮喘)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)以及涉及气道炎症、嗜酸性粒细胞增多、纤维化和粘液产生过量的其他病症(例如，囊性纤维化和肺纤维化)；特应性障碍(例如，特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性肠胃炎和过敏性鼻炎)；皮肤、胃肠道器官(例如，炎性肠病(IBD)，诸如溃疡性结肠炎和/或克罗恩病)和肝脏(例如，肝硬化、纤维化)的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症，例如霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，治疗的方法包括治疗、减少、预防或改善过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包括霍奇金淋巴瘤)或者它们的任何组合的症状。例如，哮喘的症状可以包括但不限于喘鸣、呼吸急促、支气管收缩、气道高反应性、肺活量减少、纤维化、气道炎症和粘液产生。该方法包括以足以治疗(例如，减少、改善)或预防一种或多种症状的量将如本文所述的双重结合抗体或其药物组合物施用于受试者。双重结合抗体可以治疗性或预防性施用，或者同时以治疗性和预防性目的施用。双重结合抗体可以单独或与其他治疗方式组合施用于受试者。

治疗的精确剂量和持续时间根据所治疗的疾病而变化，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物以及由此推断来确定。还可以进行对照临床试验。剂量也可以根据要减轻的病症的严重度而变化。通常配制和施用药物组合物以发挥治疗上有用的效果，同时使不期望的副作用最小化。组合物可以一次性施用或者可以分成多个较小的剂量以间隔时间施用。对于任何特定受试者，可以根据个体需要随时间推移调整具体剂量方案。

在一些实施方案中，组合物可以单独或与其他已知的过敏性或呼吸系统病症、皮肤或胃肠道器官的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；或者肿瘤或癌症(包含霍奇金淋巴瘤)治疗组合施用，所述组合物包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述双重结合抗体包含：(a)重链可变区、(b)轻链可变区或者(c)(a)中所示的重链可变区和(b)中所示的轻链可变区的组合；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的重链可变区、编码的轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在一些实施方案中，治疗的方法包括施用包含核酸构建体的组合物，所述核酸构建体包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含HCDR(如本文所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3；例如，参见表8或表4)。在一些实施方案中，治疗的方法包括施用包含核酸构建体的组合物，所述核酸构建体包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VL结构域，所述VH结构域包含LCDR(如本文所述的LCDR1、LCDR2、LCDR3；例如，参见表9或表5)。在一些实施方案中，治疗的方法包括施用包含核酸构建体的组合物，所述核酸构建体包含双重结合抗体，所述双重结合抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含HCDR(如本文所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3)，所述VL结构域包含LCDR(如本文所述的LCDR1、LCDR2、LCDR3)。

在一些实施方案中，组合物可以单独或与其他已知的过敏性或呼吸系统病症治疗组合施用，所述组合物包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述双重结合抗体包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的重链可变区中的变体位置的总数为至少2。在一些实施方案中，组合物可以单独或与其他已知的过敏性或呼吸系统病症治疗组合施用，所述组合物包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述双重结合抗体包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的轻链可变区中的变体位置的总数为至少2。在一些实施方案中，组合物可以单独或与其他已知的过敏性或呼吸系统病症治疗组合施用，所述组合物包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码双重结合抗体的核酸序列，所述双重结合抗体包含：(a)重链可变区和(b)轻链可变区；所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的任一个，或者它们的任何组合(IMGT位置：27位、28位、38位、65位、70位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有至少一个氨基酸变体；其中编码的重链可变区、编码的轻链可变区或它们的组合中的变体位置的总数为至少2。

在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，编码变体VH结构域的核苷酸构建体选自如SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105和107中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，编码变体轻链可变区(VH)的核苷酸构建体选自如SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106和108中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，编码变体VH结构域的核苷酸构建体选自如SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105和107中的任一个所示的序列；并且，编码变体轻链可变区(VH)的核苷酸构建体选自如SEQ ID NO:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106和108中的任一个所示的序列。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，编码双重结合抗体重链可变区–轻链可变区scFv的核苷酸构建体选自如SEQ ID NO:109-135中所示的序列。

上文已经详细描述了编码变体VH和VL结构域的核苷酸序列，包括通过使模板序列突变来产生这些编码变体VH和VL结构域的核苷酸序列的方法。该公开内容整体并入本文，其中治疗过敏性或呼吸系统病症的方法包括使用编码本文所述的变体VH或VL结构域的任何核酸构建体。

在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，本文所述的双重结合抗体包括IgG免疫球蛋白。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白、IgG2免疫球蛋白、IgG3免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG2免疫球蛋白。在一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG3免疫球蛋白。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG4免疫球蛋白。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括IgG1免疫球蛋白或IgG4免疫球蛋白。

在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括突变IgG，所述突变IgG不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括突变IgG1，所述突变IgG1不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括突变IgG4，所述突变IgG4不能结合抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括Fab免疫球蛋白片段。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括F(ab')₂免疫球蛋白片段。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括Fv免疫球蛋白构建体。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括scFv免疫球蛋白构建体。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括微抗体免疫球蛋白构建体，所述构建体包含经由CH3结构域连接的一对单链Fv片段。

在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括双抗体免疫球蛋白构建体。在治疗过敏性或呼吸系统病症的方法的一些实施方案中，双重结合抗体包括三抗体免疫球蛋白构建体。

施用这些和相关的双重结合抗体或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、含服、直肠、阴道和鼻内途径。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。根据如本文所述的某些实施方案，双重结合抗体或其药物组合物被配制为允许其中含有的活性成分在将组合物施用于患者时具有生物利用性。将施用于受试者或患者的双重结合抗体或其药物组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单位，并且气雾剂形式的本文所述的双重结合抗体的容器可以容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法是本领域的技术人员已知或了解的；例如，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。在任何情况下，待施用的双重结合抗体或其药物组合物将含有治疗有效量的本公开的双重结合抗体，以用于治疗过敏性或呼吸系统病症。

药物组合物可以是固体或液体形式。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂是颗粒状的，以使得组合物呈例如片状或粉末形式。药学上可接受的载剂可以是液体，其中组合物是例如口服油状物、注射液或气雾剂，所述气雾剂可用于例如吸入施用。当预期用于口服施用时，药物组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式内。

作为口服施用的固体组合物，药物组合物可以配制成粉末剂、颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊剂、口香糖剂、薄片剂等等。这种固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食用的药学上可接受的载剂。此外，可以存在以下中的一种或多种：粘结剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，诸如藻酸、藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等等；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂；以及着色剂。当药物组合物呈胶囊形式，例如明胶胶囊时，除了上述类型的材料之外，还可以含有液体状的药学上可接受的载剂，诸如聚乙二醇或油状物。

药物组合物可以呈液体形式，例如酏剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。作为两个实例，液体可以用于口服施用或用于注射递送。当预期用于口服施用时，除了本发明的化合物之外，优选的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和调味增强剂中的一者或多者。在预期通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一者或多者。

液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液还是其他类似形式，可以包含以下佐剂中的一者或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选地生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发性油状物(诸如可以作为溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制备剂可以包封于由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。注射用药物组合物优选地是无菌的。

预期用于肠胃外或口服施用的液体药物组合物应含有一定量的如本文所公开的双重结合抗体，以获得合适的剂量。

药物组合物可以预期用于局部施用，在这种情况下，药学上可接受的载剂可以适当地包括溶液、乳液、软膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一者或多者：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(诸如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果预期用于透皮施用，则组合物可以包括透皮贴剂或离子电渗装置。药物组合物可以预期用于直肠施用，呈例如栓剂形式，所述栓剂将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有作为合适的无刺激性赋形剂的油性基质。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。

药物组合物可以包含改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其他肠溶包衣剂。或者，可以将活性成分(双重结合抗体)包裹入明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含结合至如本文所公开的抗体的试剂，从而有助于化合物的递送。可以以这种能力发挥作用的合适试剂包括其他单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。药物组合物可以基本上由可以作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示多种体系，从胶体性质的体系到由加压包装组成的体系。递送可以通过液化或压缩气体或者通过分配活性成分的合适的泵系统来进行。气雾剂可以以单相、双相或三相体系递送，以递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、驱动器、阀、子容器等等，它们一起可以形成套件。本领域的普通技术人员无需进行过多实验即可确定优选的气雾剂。

药物组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，预期通过注射施用的药物组合物可以通过将包含如本文所述的双重结合抗体和任选地盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一者或多者的组合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与双重结合抗体组合物非共价相互作用以促进双重结合抗体在水性递送系统中溶解或均匀悬浮的化合物。

组合物可以以治疗有效量施用，该量将根据多种因素而变化，这些因素包括所采用的双重结合抗体的活性；双重结合抗体的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式和时间；排泄率；药物组合；特定过敏性或呼吸系统障碍或病症的严重度；以及正在接受疗法的受试者。

包含本公开的双重结合抗体或包含编码双重结合抗体的核苷酸序列的组合物还可以与一种或多种其他治疗剂的施用同时、之前或之后施用。这种组合疗法可以包括施用含有如本文公开的双重结合抗体和一种或多种另外活性剂的单一药物剂量制剂，以及施用包含如本文公开的双重结合抗体和在各自单独的药物剂量制剂中的活性剂的组合物。例如，如本文所述的双重结合抗体或包含编码双重结合抗体的核苷酸序列以及另一种活性剂可以以单一口服剂量组合物(诸如片剂或胶囊剂)一起施用于患者，或者每种药剂以单独的口服剂量制剂施用。类似地，如本文所述的双重结合抗体或包含编码双重结合抗体的核苷酸序列以及另一种活性剂可以以单一肠胃外剂量组合物(诸如盐水溶液或其他生理学上可接受的溶液)一起施用于患者，或者每种药剂以单独的肠胃外剂量制剂施用。当使用单独的剂量制剂时，包含双重结合抗体或包含编码双重结合抗体的核苷酸序列以及一种或多种另外的活性剂的组合物可以基本上同时(即同步)或以单独交错的时间(即，依次和任何顺序)施用；组合疗法被理解为包括所有这些方案。

因此，在某些实施方案中，还考虑了本公开的双重结合抗体组合物或包含编码双重结合抗体的核苷酸序列与一种或多种其他治疗剂组合施用。此类治疗剂在本领域中可以被接受为用于如本文所述的特定疾病状态(诸如过敏性或呼吸系统病症)的标准治疗。

在一些实施方案中，药学上可接受的载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液剂或混悬剂可以包括例如无菌稀释剂(诸如水)、盐水溶液、不挥发性油状物、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗微生物剂(诸如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯、酚或甲酚、汞制剂、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵)；抗氧化剂(诸如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；甲硫氨酸、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯)和螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(诸如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用，则合适的药学上可接受的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及它们的混合物)的溶液。

包含如本文所述的双重结合抗体的组合物可以用药学上可接受的载剂来制备，所述载剂保护双重结合抗体免于从体内快速消除，诸如限时释放制剂或包衣。此类药学上可接受的载剂包括控制释放制剂，诸如但不限于植入物和微胶囊化的递送系统，以及生物可降解、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸，以及本领域的普通技术人员已知的其他载剂。

如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。例如，术语“免疫球蛋白”或“至少一种免疫球蛋白”可以包括多种免疫球蛋白，包括它们的混合物。

在本申请全文中，各种实施方案可以以范围格式提供。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被理解为对本发明的范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经明确公开诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多大，这都适用。

每当本文指示数值范围时，旨在包括指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一指示数和第二指示数“之间的范围”以及“从”第一指示数“至”第二指示数“的范围”在本文中可互换使用，并且旨在包括第一指示数和第二指示数以及其间的所有小数和整数数值。

实施例

实施例1：实验程序

目的产生独特的双重结合抗体。

文库设计方法：

为了产生结合IL-13和TSLP的双重结合抗体，对现有抗体施加“重表位化”方法。重表位化过程允许将新特异性引入现有抗体中，例如具有3维结构和明确的生物化学和生物物理学性质的已知抗体。因此，重表位化的抗体可能具有新特异性和所期望的可开发性性质。简而言之，重表位化是一种工程化方法，允许将现有抗体重定向到新表位，可能是与原始抗体的同源抗原无关的新抗原。重表位化的计算过程需要两个步骤：(i)使用任何计算分析来标识现有抗体和新表位之间的推定接触，以及(ii)应用任何计算分析或工具，所述分析或工具可以建议被预测为可增强现有抗体与新的所期望的表位结合的特定突变向抗体的引入。在(Ref:Ofran Y等人,US20180068055A1；Nimrod G等人,Cell Rep.2018年11月20日；25(8):2121-2131)中，提出了可能的这种计算过程的一些实例。具体而言，使用模板抗体的可变结构域的序列(SEQ ID NO:1-模板可变重链序列；SEQ ID NO:2-模板可变轻链序列)作为起点来设计两个文库。

模板可变重链：QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ IDNO:1)。模板可变轻链：SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:2)。

每个文库含有21个位置，这些位置被选择用于相对于模板原始序列的变异。这些位置定位于CDR(H2、H3、L1、L2和L3)和框架(图1A-1B)处。选择以下位置来进行文库中的变异(编号方案[国际ImMunoGeneTics http://www.imgt.org)：

可变H链(SEQ ID NO:1)：57(H2)、107(H3)、108(H3)、109(H3)、110(H3)、111(H3)、111A(H3)、112A(H3)、112(H3)、113(H3)、114(H3)、117(H3)。

可变L链(SEQ ID NO:2)：27(L1)、28(L1)、38(FR2)、65(L2)、70(FR3)、94(FR3)、109(L3)、110(L3)、115(L3)。

所得的包含变体重链/变体轻链对的IL13/TSLP结合抗体包括相对于模板起始序列含有8个突变的克隆(C2)(参见，图1A和1B)。

文库构建方法：

通过使用编码多样性2*10^14的简并寡核苷酸进行重叠延伸PCR，针对5J13模板(PDB5J13)构建文库。使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs USA,产品目录号：M0530)根据制造商说明以3步反应(98℃ 30秒、65℃ 20秒、72℃ 30秒，30个循环)来进行引入多样性至PCR。PCR产物通过凝胶纯化试剂盒进行凝胶纯化，并且在不存在引物的情况下以3步PCR反应以等摩尔比组装(各100ng)，如上文所述。组装的PCR产物被重新用作完整scFv文库的PCR扩增的模板，如上文所述，使用正向和反向引物将载体序列5'和3'添加至scFv文库，以在酵母细胞中有效地进行同源重组。

文库转化按根据发表的文献进行(Benatuil等人,(2010)An improved yeasttransformation method for the generation of very large human antibodylibraries.Protein Eng.Des.Sel.23,155–159)。将每0.2cm比色杯(Cell Projects)中的400μl酵母悬浮液(EBY100,ATCC,USA)与4μg线性化载体(pCTcon3)和12μg DNA插入片段(scFv文库)以1:3的载体:插入片段比率进行电穿孔(BioRad,USA,GenePulser)(Chao,G.等人Isolating and engineering human antibodies using yeast surfacedisplay.Nat.Protoc.1,755–768(2006))。通过转化细胞的连续稀释将每个文库的转化子数量被确定为约1×10⁸(Benatuil等人(2010)同上)。

使用酵母表面展示来进行筛选和选择的方法：

使酵母展示的scFv文库在SDCAA选择性培养基中生长，并且根据既定方案在30℃处用2％w/v半乳糖诱导表达过夜(Chao等人,(2006)同上)，使用小鼠抗Myc-FITC(SantaCruze,USA)和山羊抗人Fc-APC(Jackson Immuno research,USA)在BioRad S3e荧光活化细胞分选仪上筛选文库中的rh-IL-13-Fc(Reprokine,Israel)的高亲和力结合物。通过使用Zymoprep试剂盒(Zymo Research,USA)从酵母克隆中提取质粒DNA，对来自最终分选的分离的克隆进行测序，并且对DNA进行测序。将选定的克隆与10nM重组人IL-13(rh-IL-13)-Fc或10nM重组人TSLP(hTSLP)-Fc一起在室温处温育1小时。洗涤细胞并将细胞重悬于含有如上文所述的荧光标记二抗的冰冷的PBS 0.1％BSA缓冲液中20分钟，并使用流式细胞仪进行分析。将所得的值归一化为表达水平和阳性对照(抗IL-13或抗TSLP结合抗体)。

IgG产生的方法-包含轻链(LC)和重链(HC)可变区的IgG的产生：

将所选的克隆的序列合成为GeneBlock(GB)，其5'25bp区域与pSF-CMV-HuIgG1_HC和pSF-CMV-HuLambda_LC(Oxford genetics,Oxford UK)的克隆区同源，GB密码子使用针对哺乳动物表达进行了优化(integrated DNA Technologies.Coralville,Iowa USA)。使用BseRI和NcoI来消化pSF-CMV-HuIgG1_HC和pSF-CMV-HuLambda_LC，并使用NEBuilder(NEBIpswich,Massachusetts,USA)将LC和HC可变区DNA片段克隆至表达对应的载体中。根据制造商的说明，使表达载体转染并在ExpiCHO表达系统(ThermoFisher Scientific,USA)中表达。简而言之：使25ml CHO细胞在37℃处生长至密度为6*10^6个细胞/ml，将25μg表达载体以1:2HC/LC比率转染至CHO细胞，在转染后20小时将细胞生长条件改为32℃，120rpm振荡10天。随后将细胞离心，并使用蛋白A珠粒从上清液纯化IgG，然后使用PBS作为流动相在200 10/300增量色谱柱(GE)上进行尺寸排阻色谱。

与人和食蟹猕猴TSLP结合的IgG EC50的测定方法

用45.5ng/孔人或食蟹猕猴(cyno)TSLP抗原涂覆平板(Greiner Bio-One产品目录号：655081)，然后在含有0.05％Tween的PBS中用3％脱脂奶洗涤和封闭平板。在封闭后，将测试IgG以1nM-1000nM的浓度范围添加至孔中，并在室温(RT)处温育1小时。洗涤平板并添加在PBS中以1:20000稀释的山羊抗人Fc-HRP缀合的二抗(Jackson产品目录号：109-035-008)。分别使用TMB(Southern-Biotech产品目录号：0410-01)和终止溶液(Southern-Biotech产品目录号：0412-01)对反应进行显色和终止，并在450nM处读取。

IL-13与TSLP之间的IC50竞争的测定方法

将平板用1ng/μl hTSLP涂覆，用TBS 0.05％tween(TBS-T)洗涤，并用TBS-T 2％BSA封闭。将20nM测试IgG与rhIL-13一起在0.78nM至200nM的温度范围处温育1小时，然后将混合物加载到平板上10分钟，洗涤孔并使用抗人Fc-HRP缀合物来检测结合的IgG，如上文ELISA EC50实验所述。使用相同的条件进行相互竞争实验，不同之处在于这次将IL-13涂覆于孔上，并且将TSLP作为相同浓度范围的自由竞争配体。

阻断TSLP与TSLP-R结合的IgG IC50抑制常数的测定方法：

将150ng/孔的TSLP-R-Fc标签(ACRO biosystems TSR-H525a)在0.015M NaHCO₃,pH＝9.5中稀释，然后用于涂覆96孔板(Greiner Bio-One产品目录号：655081)的孔。然后用TBS 0.05％tween(TBS-T)洗涤孔三次，并用含有2％BSA(w/v)的TBS-T封闭孔。将浓度范围为0.11nM至300nM的竞争物IgG与3nM hTSLP-His(ACRO biosystems产品目录号：TSP-H52Hb)混合一小时，然后将混合物加载到96孔板的孔中，温育10分钟，然后用TBS-T洗涤平板三次。随后添加1:200抗His-HRP缀合的二抗(Santa Cruz Biothechnology产品目录号SC-8036)。分别使用TMB(Southern-Biotech产品目录号：0410-01)和终止溶液(Southern-Biotech产品目录号：0412-01)对反应进行显色和终止，并在450nM处读取。

通过ELISA进行的特异性测定的方法

将96孔板(Greiner Bio-One产品目录号：655081)用总共250ng配体涂覆，用含有0.5％(w/v)BSA的PBS-T封闭，并与100nM IgG一起温育。使用与本文所述的TSLP EC50实验相同的试剂和条件对平板显色。

MUTZ5 TSLP报告细胞系的校准方法：

TSLP与其同源受体的结合的抗TSLP阻断的体外活性基于在MUTZ5人白血病细胞系中进行的人TSLP的pSTAT5活化的检测(Francis等人,(2016)Hematopoiesis,101(4):417-426)。为了确定MUTZ5细胞系的hTSLP STAT5活化的EC50值，将细胞以总体积150μl、250×10⁵个细胞/孔接种，并且在96孔板中在37℃ 5％CO₂处温育1小时。然后添加浓度范围为0.1pg/mml至1000pg/ml的TSLP持续30分钟。随后将细胞洗涤，用Fc封闭剂(BD bioscienceFC Blocker-MIX产品目录#BD564220)封闭，并用细胞固定缓冲液(BD bioscience产品目录#554655)固定。将细胞用90％甲醇透化、洗涤并用抗pSTAT5-PE(BD bioscience产品目录#562077)标记。在CytoFLEX S流式细胞仪(Beckman)上对处理的MUTZ5细胞进行pSTST5活化分析。将门控为单细胞和pSTAT5细胞被标记为pSTAT5阳性。

通过hTSLP进行的MUTZ5 pSTAT5活化的IgG IC50抑制的测定方法

为了测试pSTAT5活化的功能阻断，将浓度范围为0.48pM至500pM的IgG与14pMhTSLP(ACROBiosystems,产品目录#TSP-H52Hb)混合并温育30分钟，然后添加至细胞中再放置60分钟。随后根据MUTZ5细胞校准所述对细胞进行洗涤、固定、标记和分析。

表面等离子共振(SPR)分析的方法

IgG与人IL-13的结合的测量：SPR分析在CM5芯片(产品目录号：br10005-30(GE))上的Biacore 200(GE)上进行，该芯片与捕获一抗(产品目录号：br-1008-39GE)交联达到8000RU靶标，在一抗的交联后，将测试抗体固定于一抗上达到500RU靶标。使hIL-13(Peprotech)分析物在浓度范围为800nM至1.6nM、一系列两倍稀释的HEB-EP缓冲液中流动，每个循环一个浓度。在一个循环之后，将分析物和测试抗体从芯片上剥离，并将新测试抗体加载到芯片上，如上文所述。KD在稳态条件下测定。

与食蟹猕猴IL-13(cIL-13,Sino biological,USA)和人TSLP的结合的测量

SPR分析在GLC芯片(产品目录号：176-5011(BioRad))上的ProteOn^TMXPR36(BioRad)上进行。该芯片与捕获一抗(产品目录号：br-1008-39GE)交联达到5500RU靶标。在测试一抗交联后，将抗体33.003和33.004固定在一抗上达到2000RU靶标。使食蟹猕猴IL-13分析物在浓度范围为200nM至12.5nM、一系列两倍稀释的HEB-EP缓冲液中流动。KD在稳态条件下测定。为了测量与hTSLP的结合动力学，使用相同的条件，但是以TSLP作为分析物，浓度范围为3.2nM至0.2nM，并进行一系列两倍稀释。

动态扫描荧光法(DSF)动态扫描荧光的测量如报道所述进行(Niedziela-Majka等人,2015)，并稍加修改。简而言之：将溶于乙酸钠pH 5.5缓冲液的0.3mg/ml测试抗体在相同缓冲液中与20xsypro橙(Thermo Fisher,USA产品目录#S6650)1:1混合。在Bio-Rad cfx96光循环仪上监测荧光的变化，设置为25℃-100℃，0.5℃/分钟。Tm被确定为对应于DSF解链曲线的一阶导数的最大值的温度。如报道所述，将抗体在PBS中稀释至0.5mg/ml，并使用NanoDSF Prometheus NT.48(Nanotemper,Germany)以1℃/分钟的升温速率进行分析。

基于细胞的测定方法

将HEK-Blue IL-4/IL-13细胞(Invivogen,France产品目录#hkb-il413)用于测定IL-13抑制。将HEK-Blue细胞在含有DMEM、4.5g/l葡萄糖、10％(v/v)胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素、100mg/ml Normocin、2mM L-谷氨酰胺、10μg/ml杀稻瘟素和100μg/ml Zeocin的生长培养基中培养。HEK-Blue IL-4/IL-13细胞专门设计用于监测IL-4和IL-13诱导的STAT6通路的活化。这些细胞通过将人STAT6基因稳定引入HEK293细胞而产生，以获得完全活性的STAT6信号传导通路。该途径的其他基因以足够的量自然表达。HEK-BlueIL-4/双重细胞在与四个STAT6结合位点融合的IFNβ最小启动子的控制下稳定表达报告基因，即分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。HEK-Blue IL-4/IL-13细胞中的STAT6途径的活化诱导报告基因的表达。当使用QUANTI-Blue(在存在SEAP的情况下变成紫色/蓝色的介质)时，可以轻松检测到分泌在上清液中的SEAP。

HEK-Blue IL-4/IL-13系统的校准方法

为了确定HEK-Blue IL-4/IL-13细胞上rh-IL-13的EC₅₀值，将50000个细胞(5*10^4个/ELISA孔)与浓度为0nM至8.13nM的rh-IL-13抗体(Peprotech,Israel)一起在96孔板中在37℃、5％CO₂处温育24小时。在温育结束时，将20μl细胞上清液与180μl QUANTI-Blue试剂(Invivogen,France)一起再温育2小时，并使用读板分光光度计(Synergy Neo2,BioTekInstruments,Inc.USA)通过测量620-655nm处的吸光度来分析反应。显示的数据是三次实验的平均值，误差棒代表标准偏差。

IL-13下游信号传导的抗体抑制的IC₅₀：

将0.4nM rh-IL-13与一定浓度范围的抗体在室温处温育1小时。在温育后，添加rh-IL-13-抗体的混合物达到总体积200μl，50,000个细胞/孔，并在96孔板中在37℃ 5％CO₂处温育24小时。在温育结束时，将20μl细胞上清液与180μl QUANTI-Blue试剂一起再温育2小时，并使用读板分光光度计通过测量620-655nm处的吸光度来分析反应。显示的数据是三次实验的平均值，误差棒代表标准偏差。

实施例2：双重结合抗体的筛选和选择

目的筛选经工程化的双重结合抗体，以鉴定与IL-13和TSLP结合最高的抗体。

结果：在对文库进行IL-13和TSLP结合的筛选和选择后，对45个克隆进行选择、分离和测序，获得26个独特的重链(VH)–轻链(VL)对可变区，其中重链和轻链对的氨基酸序列提供于表1中(抗体1-26)，抗体1-26的重链和轻链scFv的核苷酸序列，包括编码的接头序列，提供于表2中，抗体1-26的重链和轻链对的核酸序列提供于表3中。抗体1-26的克隆ID号以每个“名称”的“C#”提供，例如在第2行中提供，克隆C2可变区对包含C2 VL序列SEQ IDNO:3和C2 VH序列SEQ ID NO:4。

随后，筛选亲和力成熟文库并鉴定出其他双重结合抗体克隆，这些克隆显示YSD与hIL-13和hTSLP紧密结合(抗体克隆#：33.023、33.025、38.014、38.015、38.018、38.019、38.021、38.026、38.040)。克隆33.023、33.025、38.014、38.015、38.018、38.019、38.021、38.026、38.040的VH/VL区的氨基酸序列提供于表1中，并且编码VH/VL区的核苷酸序列提供于表3中。来自Ab克隆#：33.023、33.025、38.014、38.015、38.018、38.019、38.021、38.026、38.040的VH/VL对的CDR区提供于下表4和表5中。选择这些克隆来进行IgG产生。

表1：经工程化的双重结合抗体：可变轻链(VL)和可变重链(VH)氨基酸序列(另外参见图1A和1B)

表2：编码经工程化的双重结合scFv的核苷酸序列：可变重链(VH)-接头-可变轻链(VL)

表3：编码经工程化的双重结合抗体的核苷酸序列：可变轻链(VL)和可变重链(VH)核酸序列

表4：重链CDR区的氨基酸序列：抗体克隆#33.023,33.025,38.014,38.015.38.018,38.019,38.021,38.026,38.040

表5：轻链CDR区的氨基酸序列：抗体克隆#33.023,33.025,38.014,38.015.38.018，38.019，38.021，38.026，38.040

克隆

LCDR1

SEQ ID

LCDR2

SEQ ID

LCDR3

SEQ ID

BDG33_023_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDHSSDHVV

154

BDG33_025_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDSSSDGVV

168

BDG38_014_VL

LIGAKL

203

DDS

153

QVWDHSSDHVV

154

BDG38_018_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDHSSDHVV

154

BDG38_019_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDYSSNHVV

205

BDG38_021_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDHSSDHYV

206

BDG38_025_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDHSSDHVV

154

BDG38_026_VL

LIGSKL

152

DDS

153

QVWDHSSDHVV

154

BDG38_040_VL

LIGTKL

204

DDS

153

QVWDHNEDEVV

207

测试克隆与酵母scFv格式的10nM rh-IL-13的结合，另外将克隆与在酵母上展示的阳性rh-IL-13结合物进行比较。根据阳性对照的平均荧光值(归一化的MFI)对亲和力进行归一化。分离的克隆对rh-IL-13的相对亲和力在阳性对照展示的亲和力的3％至30％之间(图2A)。C2、C6、C9和C40克隆表现出针对rh-IL-13的相对亲和力大于20％，并且在YSD中显示出结合10nM TSLP(图2B)，选择这些克隆以人IgG1进行表达。

实施例3：抗体产生和生物化学表征

目的将选定的克隆重新格式化为人IgG1格式，并且分析IgG1抗体的IL-13和TSLP双重结合。

结果：在以实施例2中所述的酵母表面展示格式表征后，通过将可变结构域亚克隆至两个单独的表达载体pSF-CMV-HuIgG1_HC和pSF-CMV-HuLambda_LC，将选定的克隆C2、C6和C9重新格式化为人IgG1，如实施例1(方法)中所述。

克隆BDG 33.003、BDG 33.004和BDG 33.005(分别为克隆C2、C6和C9)如实施例1(方法)中所述进行表达和纯化，在蛋白A纯化后，从SDS PAGE分析可以看出，IgG的纯度>95％(数据未示出)。BDG 33.003(克隆C2)、BDG 33.004(克隆C6)和BDG 33.005(克隆C9)在200 10/300上的尺寸排阻色谱显示处两个主峰，第一峰的保留时间为9.2ml(0.36CV)，是典型的大聚集体，第二峰的保留量为大约13.2ml(0.528CV)，是典型的普通人IgG1(hIgG1)。这两个峰显示出曲线下积分面积的比率分别为22％和78％(图3A-3D)。

BDG33.0023和BDG33.025均在200 10/300上迁移，小前导峰对应于(0.36CV)，是典型的大直径聚集体，第二峰的保留量为大约13.8ml(0.55CV)，是典型的普通人IgG。BDG33.023和BDG33.025的曲线下面积(AUC)峰比率分别为97.3％折叠/2.8％错误折叠和98.5％折叠/1.5％错误折叠(图3E-3F)。

为了测试克隆BDG 33.003、BDG 30.004和BDG 30.005的热稳定性，如实施例1中所述通过差示扫描荧光(DSF)来监测克隆的热解链。从荧光热位移图的一阶导数可以明显看出，BDG 33.004在62℃处有一个明显的转变点，这可能对应于Tm1和Tm2。(数据未示出)。BDG33.003和BDG33.005各自具有两个转变点，一个主要转变点分别在62℃(BDG 33.003)和64.5℃(BDG 33.005)处，另一个次要转变点分别在73℃(BDG 33.003)和74.5℃(BDG33.005)处。

BDG 33.023和BDG33.025使用NanoDSF Prometheus NT.48(NanoTemperTechnologies,Germany)来进行测试。BDG33.0023的T-起始为64.2℃，第一转变点为67.7℃，BDG33.0025的T-起始为56.4℃，第一转变点为60.9℃，第二转变点为67.4℃(图4A-4B)

测试了IgG对人TSLP、人IL-13和食蟹猕猴IL-13的亲和力。如本文所述在BIAcoreT200上测试hIL-13与BDG33.023和BDG33.025的结合动力学，(图5G-H)。使用GE捕获抗体试剂盒，分别在BiacoreT200和ProteOn^TMXPR36上通过SPR分析来测试BDG33.003和BDG33.004克隆。虽然无法获得结合人IL-13的动力学参数，但是稳态结合测量结果显示BDG33.003和BDG33.004的表观KD分别为21.6nM和57.4nM(图5A-5B)。对于BDG33.003、BDG33.004、BDG33.023和BDG33.025的所有其他测量，与hTSLP和hIL-13结合的动力学提供于表6A和6B以及图5E和5H中。

还测试了抗体与重组食蟹猕猴IL-13(rc-IL-13)(与人IL-13具有85％同一性和88％同源性)的结合，如图5C-5D所示，cIL-13作为分析物注射产生强烈的剂量依赖性反应，这表明BDG33.003和BDG33.004结合至rc-IL-13。虽然无法获得rc-IL-13的动力学，但是rh-IL-13和rc-IL-13的结合和解离斜率具有相似的特征，这表明重组h-IL-13和rc-IL-13的结合模式可能相似(图5A-5B针对人IL-13，图5C-5D针对食蟹猕猴IL-13)。

为了进一步测试IgG对人TSLP、食蟹猕猴TSLP和食蟹猕猴IL-13的亲和力，如本文所述进行ELISA EC50实验。简而言之，用各自的配体来涂覆孔，然后与浓度范围为1nM至1000nM的克隆BDG33.003、BDG33.004、BDG33.023或BDG33.025一起温育，使用HRP缀合的二抗来洗涤和显色。EC50值提供于表7中。由于上述部分中提及的IgG是对称IgG，并且由于这些相同的IgG结合hIL-13和hTSLP，因此该数据表明BGD33.003、BGD33.004、BGD33.023和BGD33.025抗体结合两个不相关的靶标-即来自相同的标准IgG CDR的TSLP和/或IL-13，与双特异性抗体相反，其中轻链可变域结合一个靶标，重链可变域结合另一个靶标(图6A-6E)。

为了测试IgG是否结合具有重叠互补位的IL-13和TSLP，如本文所述进行竞争测定法。简而言之，将BDG 33.023或BDG33.025与浓度范围为0.78nM至200nM的hIL-13或hTSLP一起温育，然后测试与预先涂覆于ELISA板上的IL-13或TSLP的结合。如图7A-7D所示，IL-13阻断BDG33.023与IL-13涂覆的孔的结合，TSLP阻断BDG33.023和BDG33.025与TSLP涂覆的孔的结合(图7A-7B)。此外，IL-13阻断BDG33.023与TSLP涂覆的孔的结合，而TSLP阻断BDG33.023与IL-13涂覆的孔的结合(图7C-7D)。该实验表明IL-13和TSLP各自共有至少部分BDG33.023结合互补位。

IL-13和TSLP的序列和结构无关。为了测试BDG33.023和BDG33.025与这些配体的结合是否具有特异性，而不是非特异性结合或“粘合”的结果，如本文所述通过ELISA来测试BGD33.0023和BGD33.025与IL-4、IL-2、IL-17、BSA IL-13和TSLP的结合。如图8所示，虽然BDG33.025显示出与IL-13、TSLP和IL-4强结合，但是不与IL-2和IL-17结合。BDG33.023与TSLP和IL-13强结合，但是显示出不与其他配体结合，这表明它与IL-13和TSLP的结合具有特异性。

为了测试BDG33.023是否在功能性表位处结合TSLP，测试BDG33.023交叉阻断TSLP与TSLP受体结合的能力。简而言之，将TSLP-R涂覆于ELISA板孔上，并测试其在存在0nM至500nM BDG33.023的情况下结合hTSLP的能力。如图9所示，BDG 33.023可以交叉阻断TSLP与TSLP-R的结合，IC50为0.41nM，这表明BDG33.023在生物功能位点处紧密结合TSLP。

表6A：人IL-13和TSLP的抗体克隆的KD值

表6B：人IL-13和TSLP的抗体克隆的KD值

表7.人和食蟹猕猴TSLP以及食蟹猕猴IL-13的EC50值

实施例4：针对抑制剂抗体BDG33.003(克隆C2)的基于细胞的测定法

目的：分析IgG1抗体抑制IL-13活性的能力。

结果：为了评估抗体抑制rh-IL-13的能力，使用HEK-Blue IL-4/IL-13系统。该系统使用HEK293细胞，该细胞稳定转染有人STAT6基因，并且报告基因在融合至四个STAT6结合位点的IFNβ最小启动子的控制下分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)(实施例1(方法)和图10)。该系统的最初测试通过以下方式进行：将rh-IL-13引入细胞并跟踪细胞信号传导级联，该级联导致rh-IL-13活化IL-13R(IL-13受体)。结果显示，IL-13对细胞的EC50为约0.12nM(图11)。然后，测试经工程化的BDG33.003(克隆C2)、BDG33.023和BDG33.025抗体，以确定它们是否可以抑制IL-13介导的细胞信号传导级联的活化。将抗体与0.4nM rh-IL-13(显示出可使IL-13R活化至饱和水平的约70％)一起温育，并将IgG/IL-13混合物引入细胞中24小时。所得的结果表明，抗体能够抑制IL-13与IL-13R/IL-4R受体复合物的结合，从而干扰信号传导级联。虽然对于BDG33.003而言，确切的IC50值很难确定，但是很明显BDG33.003正在抑制IL-13信号级联。此外，BDG33.023和BDG33.025抑制IL-13信号传导级联，IC50分别为1.3nM和25nM，这表明IgG在生物学相关环境中功能性阻断IL-13。(图11B-11D)。

为了评估抗体抑制细胞中的人TSLP的能力，使用MUTZ5细胞以类似的方式测试pSTAT5 TSLP依赖性活化，如Francis OL等人(Hematopoiesis 2016)所报道。TSLP诱导的磷酸-STAT5(pSTAT5)细胞活化级联需要IL-7受体和TSLP-R受体才能发挥功能，如图12A所示，两者均在MUTZ5细胞系表面表达，这表明这些细胞具有该测定法的必要的受体。为了建立对TSLP的细胞反应，将细胞与浓度范围为0.0001至1000pg/ml的TSLP一起温育，并通过流式细胞术来测定它们的pSTAT5活化水平。如图12B所示，用TSLP对MUTZ 5细胞进行处理以剂量依赖性方式活化pSTAT5，这表明这些细胞经由pSTAT5途径对TSLP作出反应。为了测试BDG33.023对TSLP依赖性STAT5活化的抑制，将浓度为14pM的TSLP与0.48pM至500pMBDG33.023混合并与MUTZ细胞一起温育，如图12C所示。BDG33.023抑制TSLP pSTAT5活化，IC50值为13pM。这些实验表明，BDG33.023在生物相关的基于细胞的环境中功能性阻断TSLP。

概述：“重表位化的”经工程化的BDG33.003(克隆2)、BDG33.023和BDG33.025抗体显示出结合TSLP和IL-13，与双特异性抗体格式相反，其中每个Fv对单个抗原具有特异性，这三种抗体是标准IgG格式，并且每个Fv对IL-13和TSLP均具有特异性。此外，BDG33.023针对IL-13和TSLP的互补位显示出至少部分重叠。全部三种IgG都可干扰IL-13R/IL4R和TSLPR/IL-7R信号传导级联。此类抗体可用作治疗性治疗的组分，例如但不限于，重度哮喘、特应性皮炎以及其他过敏性和呼吸系统病症。

虽然本文已经展示和描述了所公开的经工程化的双重抗体的某些特征，但是本领域的普通技术人员现在将想到很多修改、替换、变化和等同物。因此，应当理解，所附权利要求旨在覆盖落入本文所述的内容的真实精神内的所有此类修改和改变。

实施例5：双重结合抗体的生物化学表征

目的：研究双重结合抗体BDG38.074至BDG38.143的生物化学和功能性质。

方法：

将外周血单个核细胞(PBMC)(Cell Generation,产品目录号：101061021)用于测定IL-13和hTLSP抑制。使PBMC解冻并在含有RPMI–1640、10％FBS、1％Glutamax、1％丙酮酸钠、0.1％2-ME、1％Pen-Strep和1％非必需氨基酸的生长培养基中培养。将细胞以5×10⁵个细胞/孔接种于96孔板中。将15ng/mL hTSLP和1.25ng/mL IL-13与抗体一起在37℃中温育半小时，然后添加至细胞中，达到总量200μL。将细胞在37℃、5％CO₂处温育48小时。

在存在IL-13的情况下，人单核细胞中的CD23上调(RD May等人,2011)。抗体对IL-13的抑制的IC₅₀通过测量单核细胞中的CD23表达水平来确定。在细胞与不同浓度的抗体的48小时温育结束时，通过冷PBS和刮擦使单核细胞从孔底分离。使用CD3(Bio Legend,产品目录号：300450)、CD14(Bio Legend,产品目录号：301814)、CD19(Bio Legend,产品目录号：302212)和CD23(Bio Legend,产品目录号：338506)抗体来标记细胞。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)来测量CD14+群体的CD23百分比。

抗体对hTSLP的抑制的IC₅₀通过TARC抑制来测定。根据试剂盒说明，使用TARCDUOSET ELISA试剂盒DY364(R&D systems)来测定TARC水平。简而言之，用捕获(非生物素酰化)抗体对ELISA高结合蛋白质平板进行铺板，并在PBSX1中稀释。使平板密封并温育过夜。第二天，用PBST 2％BSA在室温处振荡两小时，以洗涤和封闭平板。将PBMC平板的上清液转移至孔中。使用试剂盒的检测抗体(生物素酰化)(溶于PBS1％BSA)和链霉亲和素-HRP(溶于PBST 2％BSA)来进行检测。在添加TMB终止溶液后，在450nM处读取ELISA板。数值使用标准样品曲线进行分析。

用于提供本实施例中描述和提供的结果的其他方法已经在上文实施例1中有所描述。

结果：下表提供了抗体BDG38.074至BDG38.143的氨基酸序列。VH和VL序列显示于表10中，而重链和轻链CDR分别显示于表8和9中。

表8：抗体BDG38.074至BDG38.143的重链CDR区的氨基酸序列

表9：抗体BDG38.074至BDG38.143的轻链CDR区的氨基酸序列

表10：抗体BDG38.074至BDG38.143的VH和VL区的氨基酸序列

下文提供的数据展示了本文公开的一些双重结合抗体的生物化学和功能性质。图13显示了本文公开的一些双重结合抗体的保留时间和计算pI，图中展示了BDG抗体是单分散的和高度同质的。

图14A-14C显示了一些双重结合抗体和特泽佩鲁单抗与TSLP的竞争性ELISA。用50ng/孔特泽佩鲁单抗在4℃处对ELISA板进行涂覆过夜。对BDG抗体进行双倍稀释，并且将该抗体与7nM恒定浓度的TSLP-His一起在室温处预温育1小时。在封闭和洗涤步骤后，将BDG抗体-TSLP混合物添加至平板中，温育10分钟并且再次洗涤，然后与抗HIS一起温育30分钟。BDG抗体表现出相似的IC50值，并且在TSLP表位处与特泽佩鲁单抗完全竞争。

图15显示了本文公开的一些双重结合抗体的纳米级差示扫描荧光(nanoDSF)分析。使用nanoDSF来分析全部BDG抗体，以测试一系列热变化的稳定性(参见，下表11)。选择Tm>60℃的抗体来进一步表征。

表11：SEC和DSF汇总表。SEC色谱柱提供了单分散的BDG抗体级分的曲线下面积(AUC)峰比率。DSF色谱柱提供了不同的BDG抗体的T-起始和Tm值。

图16A-16F显示了本文公开的一些双重结合抗体针对人/食蟹猕猴IL-13和TSLP的SPR(表面等离子共振)分析的结果。进行SPR分析以评估BDG抗体与TSLP和IL-13的结合的动力学。SPR数据表明BDG抗体与IL-13和TSLP的结合的解离常数为两位数pM。

表12提供了单核细胞上的CD23表达的IC50抑制值和PBMC分泌TARC的IC50抑制值。该数据表明，每种BDG双重抗体均可抑制人PBMC中的IL-13和TSLP功能。

表12：PBMC功能测定法汇总表。

*NaN-代表无法确定的值。

表13提供了从特泽佩鲁单抗的竞争性ELISA获得的IC50值。数据表明，BDG双重抗体与特泽佩鲁单抗竞争TSLP结合。

表13：IC50竞争ELISA值汇总表。

表14提供了来自使用MUTZ5细胞(人B细胞前体白血病细胞)的TSLP功能抑制测定法的数据。STAT5磷酸化抑制的IC50值以pM提供，R2列提供了拟合优度值。这些结果表明，BDG双重抗体可以抑制表达天然TSLP受体异质复合物(TLSP-R和IL-7R)的MUTZ5细胞系中的TSLP功能。

表14：MUTZ5细胞系中的TSLP功能抑制测定法。

表15显示了IL-4/IL-13报告HEK 293细胞中的功能抑制测定法的结果。STAT6磷酸化抑制的IC50值以nM提供。该数据表明，BDG双重抗体可以抑制表达IL-13受体异质复合物(IL-13Rα1和IL-4Rα)的报告HEK细胞系细胞中的IL-13功能。

表15：IL-4/IL-13报告HEK293细胞系中的IL-13功能抑制测定法。

抗体BDG38.074

抗体BDG38.074的熔点的尺寸排阻色谱(SEC)扫描和纳米级差示扫描荧光(DSF)分析显示于图17A和17B中。SEC分析(图17A)使用BioResolve SEC mAb色谱柱，2.5μm，4.6×300mm，以PBS作为流动相，以0.5ml/min的流速进行，并且在280nM处进行分析。BDG38.074显示出一个主要单分散峰，是不可检测的聚集体。DSF分析(图17B)使用nanoDSF在20-95℃处以1℃/min进行。

NanoDSF根据在350和330nM处的固有荧光变化来监测BDG38.074的热解折叠。图17B中的上半部分显示了350nM/330nM的荧光比率随温度而变化的函数，下半部分显示了作为温度函数的一阶导数。对溶于PBS的0.5mg/ml的BDG38.074进行分析，结果显示T-起始为60.3℃，Tm为62.2℃，这表明折叠相对稳定。

抗体BDG38.074与人/食蟹猕猴IL-13和人/食蟹猕猴TSLP的结合亲和力显示于图18A-18D中。使用BiacoreT200来进行BDG38.074与人IL-13(图18A)、人TSLP(图18B)、食蟹猕猴IL-13(图18C)和食蟹猕猴TSLP(图18D)的结合的表面等离子共振(SPR)分析。用人抗体捕获试剂盒来涂覆CM5芯片，得到3000-5000RU，以10μl/ml的流速注射抗体(作为捕获)，得到250-350RU。人/食蟹猕猴TSLP和人/食蟹猕猴IL-13作为浓度范围为30-0.153nM的分析物。接触时间为300秒，解离时间为600秒，流速为30μl/min。BDG38.074对所有细胞因子均显示出高亲和力，K_D值为：对于hIL-13：2.95E-11M，对于hTSLP：3.34E-12M，对于食蟹猕猴IL-13：7.33E-10M，以及对于食蟹猕猴TSLP：4.16E-12M。

抗体BDG38.074对人或食蟹猕猴IL-13或TSLP的SPR(表面等离子共振)分析的结果显示于图21A和21B中。基于SPR分析，BDG 38.074与人和食蟹猕猴IL-13的亲和力分别为两位数和三位数皮摩尔，与人和食蟹猕猴TSLP的亲和力为一位数皮摩尔。

图22A显示抗体BDG38.074表现出与抗IL-13基准物(曲罗芦单抗)相似的CD23表达的抑制。图22B显示抗体BDG38.074与抗TSLP基准物(特泽佩鲁单抗)相似，抑制TARC表达。这些数据表明，虽然抗TSLP基准物在抑制单核细胞中的CD23表达方面仅具有有限的效果，并且抗IL-13基准物在抑制TARC水平方面仅具有有限的效果，但是BDG38.074抑制CD23和TARC两者的表达，这表明BDG双重抗体与单一标准IgG1(LALA PG)抗体一样，具有发挥两种不同的功能的独特能力。

图23显示，抗体BDG38.074在MUTZ-5细胞系中表现出与抗TSLP基准物相似的功能抑制，这表明BDG38.074在表达天然TSLP受体亚基的细胞中抑制TSLP功能，IC50为约35pM。

图24显示，抗体BDG38.074以两位数皮摩尔亲和力抑制HEK报告细胞系中的IL-13功能，这表明BDG38.074在表达IL-13受体异质复合物IL-4Rα和IL-13Rα1的细胞中抑制IL-13功能。

抗体BDG38.079

抗体BDG38.074的熔点的尺寸排阻色谱(SEC)扫描和纳米级差示扫描荧光(DSF)分析显示于图19A和19B中。

SEC分析(图19A)使用BioResolve SEC mAb色谱柱，2.5μm，4.6×300mm，以PBS作为流动相，以0.5ml/min的流速进行，并且在280nM处进行分析。BDG38.079显示出一个主要单分散峰，是少量聚集体(1.34％)。DSF分析(图19B)使用nanoDSF在20-95℃处以1℃/min进行。NanoDSF根据在350和330nM处的固有荧光变化来监测BDG38.079的热解折叠。图的上半部分显示了350nM/330nM的荧光比率随温度而变化的函数，下半部分显示了作为温度函数的一阶导数。对溶于PBS的0.5mg/ml的BDG38.079进行分析，结果显示T-起始为61.4℃，Tm为64.2℃，这表明折叠相对稳定。

抗体BDG38.079与人/食蟹猕猴IL-13和人/食蟹猕猴TSLP的结合亲和力显示于图20A-20D中。使用BiacoreT200来进行BDG38.079与人IL-13(图20A)、人TSLP(图20B)、食蟹猕猴IL-13(图20C)和食蟹猕猴TSLP(图20D)的结合的表面等离子共振(SPR)分析。用人抗体捕获试剂盒来涂覆CM5芯片，得到3000-5000RU，以10μl/ml的流速注射抗体(作为捕获)，得到250-350RU。人/食蟹猕猴TSLP和人/食蟹猕猴IL-13作为浓度范围为30-0.153nM的分析物。接触时间为300秒，解离时间为600秒，流速为30μl/min。BDG38.079对所有测试细胞因子均表现出高亲和力结合，K_D值为：对于hIL-13：3.17E-11M，对于hTSLP：2.21E-12M，对于食蟹猕猴IL-：139.01E-10M，以及对于食蟹猕猴TSLP：3.97E-12M。

抗体BDG38.079对人或食蟹猕猴IL-13或TSLP的SPR(表面等离子共振)分析的结果显示于图21中。根据SPR分析，BDG 38.079与人和食蟹猕猴IL-13的亲和力分别为两位数和三位数皮摩尔，与人和食蟹猕猴TSLP的亲和力为一位数皮摩尔。

图22显示，抗体BDG38.079以两位数皮摩尔亲和力抑制HEK报告细胞系中的IL-13功能，这表明BDG38.079在表达IL-13受体异质复合物IL-4Rα和IL-13Rα1的细胞中抑制IL-13功能。

图23显示，抗体BDG38.079在MUTZ-5细胞系中表现出与抗TSLP基准物相似的功能抑制，这表明BDG38.079在表达天然TSLP受体亚基的细胞中抑制TSLP功能，IC50为约13pM。

图24A显示抗体BDG38.079表现出与抗IL-13基准物(曲罗芦单抗)相似的CD23表达的抑制。图24B显示抗体BDG38.079与抗TSLP基准物(特泽佩鲁单抗)相似，抑制TARC表达。

这些数据表明，虽然抗TSLP基准物在抑制单核细胞中的CD23表达方面仅具有有限的效果，并且抗IL-13基准物在抑制TARC水平方面仅具有有限的效果，但是BDG38.079抑制CD23和TARC两者的表达，这表明BDG双重抗体与单一标准IgG1(LALA PG)抗体一样，具有发挥两种不同的功能的独特能力。

抗体BDG38.094

抗体BDG38.09的熔点的尺寸排阻色谱(SEC)扫描和纳米级差示扫描荧光(DSF)分析显示图25A和25B中。

抗体BDG38.094的熔点的尺寸排阻色谱(SEC)扫描和纳米级差示扫描荧光(DSF)分析显示于图25A和25B中。SEC分析(图25A)使用BioResolve SEC mAb色谱柱，2.5μm，4.6×300mm，以PBS作为流动相，以0.4ml/min的流速进行，并且在280nM处进行分析。BDG38.094显示出一个主要单分散峰，是不可检测的聚集体。DSF分析(图25B)使用nanoDSF在20-95℃处以1℃/min进行。NanoDSF根据在350和330nM处的固有荧光变化来监测BDG38.094的热解折叠。图的上半部分显示了350nM/330nM的荧光比率随温度而变化的函数，下半部分显示了作为温度函数的一阶导数。对溶于PBS的0.5mg/ml的BDG38.094进行分析，结果显示T-起始为62.4℃，Tm为65.3℃，这表明折叠相对稳定。

抗体BDG38.094与人/食蟹猕猴IL-13和人/食蟹猕猴TSLP的结合亲和力显示于图26A-26D中。使用BiacoreT200来进行BDG38.094与人IL-13(图26A)、人TSLP(图26B)、食蟹猕猴IL-13(图26C)和食蟹猕猴TSLP(图26D)的结合的表面等离子共振(SPR)分析。用人抗体捕获试剂盒来涂覆CM5芯片，得到3000-5000RU，以10μl/ml的流速注射抗体(作为捕获)，得到250-350RU。人/食蟹猕猴TSLP和人/食蟹猕猴IL-13作为浓度范围为30-0.153nM的分析物。接触时间为300秒，解离时间为600秒(对于食蟹猕猴IL-13，解离时间为200秒)，流速为30μl/min。BDG38.094对所有细胞因子均显示出高亲和力，K_D值为：对于hIL-13：1.38E-11M，对于hTSLP：<1E-12M(低于检出限)，对于食蟹猕猴IL-13：2.70E-10M，以及对于食蟹猕猴TSLP：2.75E-12M。

抗体BDG38.138

抗体BDG38.138的熔点的尺寸排阻色谱(SEC)扫描和纳米级差示扫描荧光(DSF)分析显示于图27A和27B中。

SEC使用BioResolve SEC mAb色谱柱，2.5μm，4.6×300mm，以PBS作为流动相，以0.4ml/min的流速进行，并且在280nM处进行分析。BDG38.138显示出一个主要单分散峰，是0.8％聚集体。DSF分析使用nanoDSF在20-95℃处以1℃/min进行。NanoDSF根据在350和330nM处的固有荧光变化来监测BDG38.138的热解折叠。图的上半部分显示了350nM/330nM的荧光比率随温度而变化的函数，下半部分显示了作为温度函数的一阶导数。对溶于PBS的0.5mg/ml的BDG38.138进行分析，结果显示T-起始为62.8℃，Tm为66℃，这表明折叠相对稳定。

抗体BDG38.138与人/食蟹猕猴IL-13和人/食蟹猕猴TSLP的结合亲和力显示于图28A-28D中。使用BiacoreT200来进行BDG38.138与人IL-13(图28A)、人TSLP(图28B)、食蟹猕猴IL-13(图28C)和食蟹猕猴TSLP(图28D)的结合的表面等离子共振(SPR)分析。用人抗体捕获试剂盒来涂覆CM5芯片，得到3000-5000RU，以10μl/ml的流速注射抗体(作为捕获)，得到250-350RU。人/食蟹猕猴TSLP和人/食蟹猕猴IL-13作为浓度范围为30-0.153nM的分析物。接触时间为300秒，解离时间为600秒(对于食蟹猕猴IL-13，解离时间为200秒)，流速为30μl/min。BDG38.138对所有细胞因子均显示出高亲和力，K_D值为：对于hIL-13：1.34E-11M，对于hTSLP：2.85E-12M，对于食蟹猕猴IL-13：8.49E-10M，以及对于食蟹猕猴TSLP：1.35E-12M。

概述：

所提供的数据表明BDG双重抗体是高度单体且稳定的分子(表11)。这些抗体均可以以皮摩尔亲和力结合人IL-13、食蟹猕猴IL-13、人TSLP和食蟹猕猴TSLP(图16A-16F)。与不同的双特异性抗体不同的是，专利中提及的每种BDG双重抗体都是标准IgG1(LALA,PG)，可以结合上述抗原。

由于一些抗体的结合高于检出限，因此进行针对特泽佩鲁单抗的IC50竞争ELISA(表13，图14A-14C)。该数据支持SPR分析，并且表明BDG双重抗体可以与特泽佩鲁单抗竞争与TSLP的结合。

BDG抗体展示出通过阻断IL-13通过STAT6的信号转导来对HEK报告细胞中的IL-13信号传导进行功能抑制(表15，图22)。类似地，BDG抗体抑制MUTZ细胞中TSLP介导的STAT5磷酸化，表达包含TSLP-R和IL-7Rα的天然TSLP受体异质复合物。

为了测试双重抗体的效果，在存在浓度升高的BDG抗体或基准物抗体的情况下，用hTSLP和hIL-13两者来处理hPBMC 48小时(表12，图24A和24B)。在该设置中，TSLP处理引起TARC水平增加，而Il-13处理引起CD23水平增加。虽然BDG双重抗体抑制CD23表达的效果类似于抗IL-13基准物(曲罗芦单抗)，但是抗TSLP基准物仅具有较小的效果。类似地，虽然BDG双重抗体抑制TARC分泌的效果类似于特泽佩鲁单抗，但是抗IL-13基准物仅对TARC的水平具有较小的效果。这表明BDG双重抗体作为具有TSLP和IL-13两种功能的单一IgG1分子发挥抑制作用。

序列表

<110> 拜欧罗吉克设计有限公司

<120> 经工程化的双重结合抗体及其用途

<130> P-605548-PC

<150> 63/195,021

<151> 2021-05-30

<150> 63/295,905

<151> 2022-01-02

<150> PCT/IL2022/050087

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 22

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 23

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 24

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 25

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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多肽

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<220>

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多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

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多肽

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<220>

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多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 33

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<220>

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多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 40

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 41

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 42

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 43

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<210> 44

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 44

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<210> 45

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 45

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 46

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<210> 47

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 47

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<210> 48

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 48

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<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 49

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50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 50

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 50

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gln Trp Glu Trp Val His Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 51

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 52

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 52

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gln Trp Glu Trp Val His Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 53

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 54

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 54

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gln Trp Glu Trp Val His Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 55

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgcagttt attactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtacacga agcattcgat atctggggtc agggtactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 56

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 56

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacaatct gggctctaag tctgttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat tccgatcgtc caagctggat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgg ggaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactcttctt ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 57

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 57

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacggcgga agcattcgat atttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 58

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 58

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcctgat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 59

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 59

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 60

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 60

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcctgat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 61

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 61

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggcagt tagtagcgga agcattcgat atttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 62

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 62

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

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gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacaccagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 63

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 63

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

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agctct 366

<210> 64

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 64

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcgctat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacactagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 65

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 65

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtggcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 66

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 66

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

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gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacaccagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 67

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 67

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

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cagtgggaat tggtagccga agcattcgat atctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 68

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 68

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

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ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgaccacgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 69

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 69

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggatgt tagtagcgga agcattcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 70

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 70

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggg 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 71

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 71

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat gggtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 72

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 72

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgaccacgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 73

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 73

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

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cagtgggaat tagtagccga ggcattcgat atgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 74

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 74

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 75

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 75

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 76

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 76

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcaaaat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 77

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 77

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat acgtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 78

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 78

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcgatat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gacaccagct ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 79

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 79

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

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agctct 366

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

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gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 81

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 81

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 82

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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多核苷酸

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多核苷酸

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多核苷酸

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多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 89

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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多核苷酸

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<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 93

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<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 94

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 95

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agctct 366

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<211> 324

<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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多核苷酸

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 99

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

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多核苷酸

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agctct 366

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 102

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caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcggtat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 103

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 103

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agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

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gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 104

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

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<210> 105

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 105

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<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 106

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acctgtggcg gtaacaacat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccggat tccagagcgt 180

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<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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多核苷酸

<400> 107

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agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

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agctct 366

<210> 108

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 108

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat ggcgatcgtc caagctggat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactccagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 109

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 109

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgcagttt attactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtacacga agcattcgat atctggggtc agggtactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacaatc tgggctctaa gtctgttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga ttccgatcgt ccaagctgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg gggaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactcttct tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 110

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 110

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacggcgga agcattcgat atttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

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tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 111

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 111

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

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gactactatt gccaggtctg ggactctagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 112

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 112

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

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gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 113

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 113

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

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aaactgaccg ttttg 735

<210> 114

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 114

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtggcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggtg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcctta ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 115

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 115

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tggtagccga agcattcgat atctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctgc tgggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgcaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctagc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 116

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 116

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggatgt tagtagcgga agcattcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg gcaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagccgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 117

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 117

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat gggtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagccgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 118

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 118

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagccga ggcattcgat atgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagccgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctagc tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 119

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 119

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagccga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcaaaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 120

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 120

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat acgtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgata ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 121

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 121

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacggccga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacatca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tggcgatcgt ccaagcggta ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacactagc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 122

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 122

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtggcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctgc tgggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tggcgatcgt ccaagcctga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacactagc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 123

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 123

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacggcgga agcattcgat atttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctgc tgggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgaaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 124

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 124

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacggccga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctgc tgggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagctgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacactagc tccgaccatg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 125

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 125

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacgtcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgcaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 126

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 126

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat taacctccga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgaaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 127

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 127

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggctgt tagtagcgga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacatca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcggta ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctggc tccgaccacg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 128

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 128

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagcgga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacatca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgata ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccggc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 129

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 129

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagcgga agcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tggcgatcgt ccaagctgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctggc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 130

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 130

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggtct tagtatccga agcattcgat ctttggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagccgta ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccggc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 131

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 131

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtgggaat tagtagcgga ggcattcgat ctgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacatca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgcaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 132

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 132

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctcttatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtagccca 300

cagtgggaat gggtacacga agcattcgat atgtggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacaaca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcggta ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactctagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 133

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 133

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctcttatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgttcgcca 300

cagtgggaat gggtacacga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacatcc tgggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagcgaaa ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacaccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 134

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 134

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtagccca 300

cagtgggaat gggtacacga agcattcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacaaca tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tagcgatcgt ccaagccgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggacactagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 135

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 135

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgttcgcca 300

cagtgggaat gggtacacga agcattcgat ctctggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctctggcg gtggtggtag cggaggcgga ggatcaggtg gaggcggcag ttcttacgtg 420

ctgactcaac caccatcagt gtctgtagca ccaggccaga ccgcacgtat tacctgtggc 480

ggtaacctga tcggctctaa gctggttcac tggtatcagc aaaaaccagg ccaggcacca 540

gtactggttg tgtacgatga tggcgatcgt ccaagctgga ttccagagcg tttcagcggc 600

tctaattccg gcaacaccgc tactctgact atttcccgtg ttgaagccgg cgatgaagcc 660

gactactatt gccaggtctg ggactccagc tccgacggtg tagtctttgg cgggggcacc 720

aaactgaccg ttttg 735

<210> 136

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 136

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly

1 5

<210> 137

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Trp或Ser

<400> 137

Ile Xaa Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 138

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ala或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Glu、Gln、Met、Leu或Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Leu、Trp或Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Val或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> His、Ala或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> Ile、Leu或Met

<400> 138

Ala Arg Xaa Pro Gln Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ala Phe Asp Xaa

1 5 10 15

<210> 139

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Asn、Leu或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Leu或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser或Leu

<400> 139

Xaa Xaa Gly Ser Lys Xaa Val

1 5

<210> 140

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ser或Gly

<400> 140

Asp Asp Xaa

1

<210> 141

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Ser或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser或Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> His或Gly

<400> 141

Gln Val Trp Asp Xaa Xaa Ser Asp Xaa Val Val

1 5 10

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任何氨基酸

<400> 142

Ile Xaa Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 143

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(12)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> 任何氨基酸

<400> 143

Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa

1 5 10 15

<210> 144

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(2)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> 任何氨基酸

<400> 144

Xaa Xaa Gly Ser Lys Xaa Val

1 5

<210> 145

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 任何氨基酸

<400> 145

Asp Asp Xaa

1

<210> 146

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(6)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任何氨基酸

<400> 146

Gln Val Trp Asp Xaa Xaa Ser Asp Xaa Val Val

1 5 10

<210> 147

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 147

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 148

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

寡核苷酸

<400> 148

ggcggtggtg gtagcggagg cggaggatca ggtggaggcg gcagt 45

<210> 149

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 149

Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr Gly

1 5

<210> 150

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 150

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 151

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 151

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu

1 5 10 15

<210> 152

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 152

Leu Ile Gly Ser Lys Leu

1 5

<210> 153

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 153

Asp Asp Ser

1

<210> 154

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 154

Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His Val Val

1 5 10

<210> 155

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 155

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 156

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 156

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 157

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 157

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 158

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 158

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 159

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 159

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Val Ala Glu Pro Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 160

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 160

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Leu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 161

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 161

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tgcgtttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagta atctggtatg atggtagcaa tacccactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggtact taagcgcgga agcattcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 162

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 162

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagccgtat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gaccacagct ccgaccatgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 163

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 163

caaatgcagc tggtcgagtc tggcggtggg gtagtgcaac caggccgttc tctgcgtctt 60

agctgcgccg catctggttt tacctttcgt acctacggta tgcactgggt gcgtcaggca 120

ccaggcaaag gtctggaatg ggtcgcagac atctggtatg atggtagcaa taaacactat 180

gctgactcag tcaaaggccg tttcaccatc acccgtgata acagcaagaa cactcttaac 240

ttacagatga actctctgcg tgccgaagac accgccgttt actactgtgc ccgtgcacca 300

cagtggtact tagtagcgga accgttcgat ctatggggcc agggcactat ggtgaccgtt 360

agctct 366

<210> 164

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 164

tcttacgtgc tgactcaacc accatcagtg tctgtagcac caggccagac cgcacgtatt 60

acctgtggcg gtaacctgat cggctctaag ctggttcact ggtatcagca aaaaccaggc 120

caggcaccag tactggttgt gtacgatgat agcgatcgtc caagcctgat tccagagcgt 180

ttcagcggct ctaattccgg caacaccgct actctgacta tttcccgtgt tgaagccggc 240

gatgaagccg actactattg ccaggtctgg gactctagct ccgacggtgt agtctttggc 300

gggggcacca aactgaccgt tttg 324

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 165

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly

1 5

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 166

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 167

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 167

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Val Ala Glu Pro Phe Asp Leu

1 5 10 15

<210> 168

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 168

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gly Val Val

1 5 10

<210> 169

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 169

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 170

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 170

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 171

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 171

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 172

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 172

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 173

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 173

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 174

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 174

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 175

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 175

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asp Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 176

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 176

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

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Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 177

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 177

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

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Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 178

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 178

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

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Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 179

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 179

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 180

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 180

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ile Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 181

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 181

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 182

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 182

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Thr Lys Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asn Glu Asp Glu

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 183

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 183

cagatgcagt tggtggagtc cggaggtgga gtggtgcaac cagggcgttc cttgcgtttg 60

tcttgtgctg cttccggatt cgcctttcgt acatatggca tgcattgggt gcgtcaagca 120

cctggtaagg gcctggagtg ggttgccgtt atttggtacg acggctccaa cacccactac 180

gcagatagcg tgaaaggacg tttcactatt acccgtgata actccaagaa tacccttaac 240

ctgcagatga atagcttgcg tgctgaggac acagcagtat attactgcgt ccgtgcacca 300

caatggtacc tgagcgccga ggcctttgat ctgtgggggc agggcacaat ggtgaccgtt 360

tcctca 366

<210> 184

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 184

agttacgtgc tgacacaacc tccaagtgtt agtgtcgcac caggacaaac agcacgtatt 60

acatgtggag gaaatcttat cggtgccaag ctggtgcact ggtaccagca gaaacctggt 120

caggccccag tactggttgt gtatgatgac agcgaccgtc caagccgtat cccagaacgt 180

ttttctggga gcaactcagg taatacagcc actctgacca tttcacgtgt tgaggcagga 240

gatgaggccg attattattg ccaagtatgg gaccacagct ctgaccatgt tgtttttggc 300

ggagggacta agctgaccgt gctt 324

<210> 185

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 185

cagatgcaac tggtggagtc aggaggcggc gtggtgcagc caggacgttc tctgcgtctg 60

tcttgcgcag cttccgggtt cgcctttcgt acctatggga tgcattgggt gcgtcaggct 120

ccaggtaagg gactggagtg ggtcgctgtt atttgggacg acggaagtaa cactcattac 180

gccgacagcg tgaagggccg tttcacaatt acccgtgaca attccaagaa taccttgaac 240

ctgcagatga actctcttcg tgctgaagat accgccgtgt actattgcgc ccgtgctcca 300

cagtggtatc tgtcagcaga ggccttcgac ctgtggggac agggaacaat ggtgaccgta 360

tcttca 366

<210> 186

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 186

tcctatgtgc tgacacagcc acctagcgtg agcgtcgccc caggtcagac cgctcgtatc 60

acttgtggcg ggaaccttat cggcagcaag ctggtgcact ggtaccagca gaagcctggc 120

caagcacctg tgctggtcgt ttatgacgac tctgaccgtc catcccgtat cccagaacgt 180

ttctctggct ctaactctgg gaataccgct accctgacaa tctcacgtgt tgaagctggc 240

gacgaggcag attattattg ccaagtctgg gatcactcca gcgatcacgt cgtgttcgga 300

ggcggaacaa aattgactgt cctg 324

<210> 187

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 187

caaatgcagc tggtggaatc cgggggtggg gtcgtccagc ctggccgtag tctgcgtctt 60

tcctgtgccg catcaggctt tgctttccgt acctacggga tgcactgggt gcgtcaggcc 120

ccaggaaagg gacttgaatg ggtggctgtc atctggtacg atggttccaa cacacactat 180

gccgattcag tgaaagggcg tttcaccatt actcgtgaca atagtaagaa tactctgaat 240

ctgcaaatga attcactgcg tgctgaggac accgctgttt attactgtgt gcgtgctcct 300

cagtggtacc tgagtgccga agctttcgat ttgtggggac agggcacaat ggtgacagtc 360

agttct 366

<210> 188

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 188

tcttacgtgt tgacacaacc accaagtgtt agtgtcgcac ctggccaaac cgctcgtatc 60

acctgtggtg ggaatcttat tggctctaag ctggtgcact ggtatcagca gaaaccaggc 120

caggctccag tactggtggt gtacgacgac tctgaccgtc caagccgtat cccagagcgt 180

ttcagtggct ctaactccgg gaacacagca actcttacaa tttcacgtgt ggaggccggt 240

gatgaagccg actactattg ccaggtttgg gactacagta gtaatcacgt ggttttcggt 300

ggtggtacca agctgactgt gttg 324

<210> 189

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 189

cagatgcagc tggttgaatc tggcggcggt gtggtccagc ctggtcgtag cctgcgtctg 60

tcctgtgctg caagcggatt tgcctttgac acctatggga tgcactgggt acgtcaggcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggcagtt atctggtatg atggttctaa taccgtgtat 180

gccgactccg ttaaaggccg tttcactatc acccgtgata atagtaaaaa cacactgaac 240

ctgcagatga atagcttgcg tgctgaggac accgcagtgt actactgtgc ccgtgctcct 300

cagtggtatc tgtcagcaga ggccttcgat ctgtggggcc aagggacaat ggtgaccgtg 360

tcttcc 366

<210> 190

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 190

agctatgttc tgactcaacc acctagtgtg agtgtggccc ctggtcagac tgcacgtatt 60

acctgtggcg gaaaccttat cggcagtaag ctggttcatt ggtatcagca gaagccagga 120

caggcaccag tgctggtcgt ttacgacgat agtgaccgtc catcacgtat cccagagcgt 180

tttagcgggt ccaattccgg aaatacagca accttgacca ttagccgtgt ggaagccggc 240

gatgaagctg attattactg ccaggtatgg gaccattcct ccgaccacta cgtttttggt 300

ggcggaacta agctgacagt cttg 324

<210> 191

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 191

cagatgcagc ttgttgagag cggcggaggc gtggtgcaac caggccgttc attgcgtctg 60

tcctgcgccg ccagcggctt tgcttttcgt acatacggca tgcactgggt gcgtcaggcc 120

cctggcaagg ggctggaatg ggtcgccgtg atttggtatg acggtagtaa cacccattat 180

gctgattccg tcaagggacg tttcactatc acccgtgaca atagcaaaaa tacactgaat 240

ctgcaaatga attcattgcg tgccgaagac accgccgtat attactgtgt ccgtgcccca 300

cagtggtacc tgagcgctga ggccttcgat ctgtggggtc aggggactat ggtgaccgta 360

tcatcc 366

<210> 192

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 192

tcttacgtgc ttactcagcc tcctagcgtc tcagtggccc caggcgagac agcaaccatt 60

acatgcgggg gtaatttgat cggtagcaag ctggtgcatt ggtatcagca gaagcctggc 120

caggccccag tgctggttgt atatgacgat agtgatcgtc caagtcgtat ccctgagcgt 180

tttagcggat ctaactccgg caacacagcc acattgacaa tcagccgtgt ggaggcaggc 240

gatgaggccg actactactg ccaagtttgg gaccactcct ctgaccacgt ggtatttggc 300

ggaggaacaa agcttacagt tttg 324

<210> 193

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 193

cagatgcagc tggtggagag tggaggtggt gtggtgcaac ctgggcgtag cctgcgtttg 60

agctgcgctg cctctggatt tgccttccgt acctatggca tgcactgggt gcgtcaggct 120

ccaggaaagg ggttggaatg ggtggctgtg atttggtacg acgggagcgc cacacattac 180

gcagacagcg ttaagggccg tttcacaatt acccgtgaca atagcaaaaa tacattgaac 240

ctgcagatga attccctgcg tgcagaggat actgcagtgt actattgcgt ccgtgcccca 300

cagtggtatc tgtcagccga agccttcgat ctgtgggggc agggtactat ggtcaccgta 360

agttcc 366

<210> 194

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 194

tcttatgttt tgacccaacc tccatccgtt agcgtggctc caggtcaaac agctaccatc 60

acatgtggcg gtaaccttat tggctcaaag ctggttcatt ggtatcaaca gaaaccaggc 120

caagccccag tgctggtggt gtatgacgac agtgaccgtc cttctcgtat tcctgagcgt 180

ttttccggct ctaatattgg caacactgcc accctgacca tttctcgtgt ggaagcagga 240

gatgaggcag actattattg tcaggtttgg gatcactcca gcgatcatgt ggtattcgga 300

ggtgggacaa aacttactgt tctt 324

<210> 195

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 195

cagatgcagc tggtggaaag tggtggggga gtcgtgcaac caggacgttc cttgcgtctg 60

tcatgcgctg cttcaggttt cgactttcgt acctacggca tgcattgggt gcgtcaggct 120

ccaggtaaag gacttgagtg ggtcgcagtg atctggtacg acggatcaat tactcactac 180

gccgatagcg tgaaaggccg tttcaccatc acccgtgaca actccaagaa caccctgaac 240

ttgcagatga acagtctgcg tgcagaagac actgcagtat attattgtgt ccgtgcccca 300

cagtggtact tgaccgccga ggcttttgat ctgtggggac agggcacaat ggtgaccgta 360

tctagc 366

<210> 196

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多核苷酸

<400> 196

agctacgtgc ttacccagcc accatcagtc agtgtggctc caggccaaac tgcccgtatc 60

acctgcggcg gcaatttgat tggcaccaag cttgtgcact ggtaccaaca gaagccaggg 120

caggcccctg tgctggttgt ctacgacgat agtgatcgtc cttcccgtat tcctgaacgt 180

ttctctggaa gcaattccgg aaacacagcc acacttacca tttctcgtgt tgaggctggg 240

gatgaagccg actactattg ccaggtttgg gaccacaatg aagacgaagt tgtttttgga 300

ggaggaacta agctgacagt tctg 324

<210> 197

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 197

Gly Phe Ala Phe Asp Thr Tyr Gly

1 5

<210> 198

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 198

Gly Phe Asp Phe Arg Thr Tyr Gly

1 5

<210> 199

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 199

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr

1 5

<210> 200

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 200

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Thr

1 5

<210> 201

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 201

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu

1 5 10 15

<210> 202

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 202

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu

1 5 10 15

<210> 203

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 203

Leu Ile Gly Ala Lys Leu

1 5

<210> 204

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 204

Leu Ile Gly Thr Lys Leu

1 5

<210> 205

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 205

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn His Val Val

1 5 10

<210> 206

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 206

Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asp His Tyr Val

1 5 10

<210> 207

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 207

Gln Val Trp Asp His Asn Glu Asp Glu Val Val

1 5 10

<210> 208

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 208

Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr

1 5

<210> 209

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 209

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 210

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 210

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Ala Tyr Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Val Asp Arg Pro Asn Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asn Thr Asp Lys

85 90 95

Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 211

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 211

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 212

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 212

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Tyr Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Val Asp Arg Pro Ala Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asp Thr Asn Thr

85 90 95

Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 213

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 213

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 214

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 214

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Gly Tyr Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Val Asp Arg Pro Ala Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asp Thr Asn His

85 90 95

Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 215

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 215

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ala Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 216

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 216

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Ala Leu Ile Gly Ser Arg Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ile Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asn Thr

85 90 95

Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 217

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 217

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 218

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 218

Ser Tyr Ile Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Arg Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ile Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Glu Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp His

85 90 95

Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 219

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 219

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Leu Thr Ala Glu Ala Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 220

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 220

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Met Ile Gly Gly Tyr Leu Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Val Asp Arg Pro Asp Arg Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp His Asp Ser Asn Thr

85 90 95

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 221

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 222

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 223

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 224

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 225

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 231

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 232

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 233

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 234

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 235

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 236

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 237

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 238

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 239

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 240

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 241

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1 5 10 15

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 242

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<210> 243

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 243

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<210> 244

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 244

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1 5 10 15

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<210> 245

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 245

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 246

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<210> 247

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 247

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<210> 248

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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多肽

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多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

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多肽

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多肽

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多肽

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多肽

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多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

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多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 263

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 264

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<220>

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多肽

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多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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多肽

<400> 267

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多肽

<400> 268

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 269

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 270

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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多肽

<400> 271

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 272

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 273

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<211> 108

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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多肽

<400> 274

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 275

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多肽

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多肽

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多肽

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多肽

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多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 295

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多肽

<400> 296

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 297

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 298

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 299

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 300

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 301

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<211> 108

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 302

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<210> 303

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 303

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 304

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 305

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 306

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 308

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 311

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 313

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 314

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 315

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 316

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 317

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 318

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 319

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 320

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 321

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 322

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 323

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 324

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<210> 325

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 325

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1 5 10 15

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<210> 326

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 326

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<210> 327

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 327

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<210> 328

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 328

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<210> 329

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 329

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115 120

<210> 330

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 330

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ala Arg Leu Val

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 331

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 332

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 333

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 334

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 338

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

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<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 340

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 341

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 342

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 343

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 344

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 345

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 346

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 347

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

多肽

<400> 348

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 349

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 351

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 352

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 353

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 354

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 355

Gly Phe Glu Phe Arg Thr Tyr Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 356

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 357

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<210> 358

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 358

Val Arg Ala Pro Gln Trp Tyr Asn Ser Ala Glu Ala Phe Asp Leu

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 359

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 360

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 361

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 362

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 363

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 364

Met Ile Gly Gly Tyr Leu

1 5

<210> 365

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 365

Gln Val Trp Asp His Asp Thr Asn His Met Val

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 366

Leu Ile Gly Ser Arg Leu

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<210> 367

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 367

Asp Asp Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 368

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 369

Leu Ile Gly Ala Arg Leu

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 370

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 371

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 372

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<210> 373

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 373

Gln Val Trp Asp His Asn Thr Gln Gln Met Val

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 374

Gln Val Trp Asp His Asp Thr Asn Gln Val Val

1 5 10

<210> 375

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 375

Leu Ile Gly Ala Lys Leu

1 5

<210> 376

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 376

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp Thr Met Val

1 5 10

<210> 377

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 377

Gln Val Trp Asp His Ser Thr Asn Thr Met Val

1 5 10

<210> 378

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 378

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 379

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 379

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 380

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 380

Gln Val Trp Asp His Asn Ser Asn Gln Met Val

1 5 10

<210> 381

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 381

Gln Val Trp Asp His Ser Ser Asn His Tyr Val

1 5 10

<210> 382

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 382

Gln Val Trp Asp His Tyr Ser Asn His Tyr Val

1 5 10

<210> 383

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 383

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ala Asp Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 384

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 384

Gln Val Trp Asp His Asn Ser Asn His Met Val

1 5 10

<210> 385

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 385

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 386

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 386

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Met Val

1 5 10

<210> 387

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 387

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp His Tyr Val

1 5 10

<210> 388

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 388

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 389

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 389

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 390

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 390

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 391

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 391

Gln Val Trp Asp His Tyr Ser Asp His Met Val

1 5 10

<210> 392

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 392

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asn His Met Val

1 5 10

<210> 393

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 393

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ala Asn Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 394

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 394

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 395

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 395

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 396

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 396

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Thr Met Val

1 5 10

<210> 397

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 397

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp His Tyr Val

1 5 10

<210> 398

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 398

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ser Asp His Met Val

1 5 10

<210> 399

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 399

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asp Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 400

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 400

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ala Asp Thr Met Val

1 5 10

<210> 401

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 401

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asn Thr Met Val

1 5 10

<210> 402

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 402

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Met Val

1 5 10

<210> 403

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 403

Gln Val Trp Asp His Ser Ala Asp Thr Met Val

1 5 10

<210> 404

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 404

Gln Val Trp Asp His Asn Ser Asp His Met Val

1 5 10

<210> 405

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 405

Gln Val Trp Asp Tyr Ser Ala Asn His Met Val

1 5 10

<210> 406

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 406

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser Asn His Met Val

1 5 10

<210> 407

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成

肽

<400> 407

Gln Val Trp Asp Tyr Tyr Ser His Thr Met Val

1 5 10

Claims

1.一种分离的双重结合抗体，所述分离的双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中

(i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:349或355的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:149或SEQ IDNO:136的氨基酸序列；

(ii)所述HCDR2包含SEQ ID NO:350、352、354和356中的一者的氨基酸序列，或者SEQID NO:150的氨基酸序列，或者如下所示的序列：IHX1 Y D G S N K(SEQ ID NO:142)，其中HX1是任何氨基酸；

(iii)所述HCDR3包含SEQ ID NO:351、353、357和358中的一者的氨基酸序列，或者SEQID NO:151的氨基酸序列，或者如下所示的序列：AR HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 HX7 HX8 HX9HX10 HX11 F D HX12(SEQ ID NO:143)，其中HX2、HX3、HX4、HX5、HX6、HX7、HX8、HX9、HX10、HX11和HX12是任何氨基酸；

(v)所述LCDR2包含SEQ ID NO:360或367的氨基酸序列，或者氨基酸序列SEQ ID NO:153的氨基酸序列，或者如D D LX4(SEQ ID NO:145)所示的序列，其中LX4是任何氨基酸；并且

(vi)所述LCDR3包含SEQ ID NO:361、363、365、368、370-374、376-407中的一者的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:154的氨基酸序列，或者如Q V W D LX5 LX6 SD LX7 V V(SEQ IDNO:146)所示的序列，其中LX5、LX6和LX7是任何氨基酸。

2.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，其中

3.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，其中所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3包含如表8或表4中所示的氨基酸序列，其中所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含如表9或表5中所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，

其中HX1为W或S；HX2为A或S；HX3为P；HX4为Q；HX5为W；HX6为E、Q、M、L或V；HX7为L、W或Y；HX8为V或T；HX9为H、A或S；HX10为E；HX11为A；HX12为I、L或M；

5.如权利要求4所述的分离的双重结合抗体，其中HX1为W，HX2为A或S，HX6为E或M，HX7为L或W，HX8为V或T，HX9为H或A，HX12为I或L，LX1为L，LX2为I，LX3为L，LX4为S或G，LX5为S，LX6为S，LX7为H或G。

6.如权利要求5所述的分离的双重结合抗体，其中

a.HX1为W，HX2为A，HX6为E，HX7为L，HX8为T，HX9为A，HX12为I，LX4为S，并且LX7为G；或者

b.HX1为W，HX2为A，HX6为M，HX7为L，HX8为V，HX9为A，HX12为L，LX4为S，并且LX7为H；或者

c.HX1为W，HX2为S，HX6为E，HX7为W，HX8为V，HX9为H，HX12为L，LX4为G，并且LX7为G。

7.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL包含以下各项的氨基酸序列：SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158、SEQ ID NO:4和3、SEQ ID NO:6和5、SEQ ID NO:8和7、SEQ IDNO:10和9、SEQ ID NO:12和11、SEQ ID NO:14和13、SEQ ID NO:16和15、SEQ ID NO:18和17、SEQ ID NO:20和19、SEQ ID NO:22和21、SEQ ID NO:24和23、SEQ ID NO:26和25、SEQ IDNO:28和27、SEQ ID NO:30和29、SEQ ID NO:32和31、SEQ ID NO:34和33、SEQ ID NO:36和35、SEQ ID NO:38和37、SEQ ID NO:40和39、SEQ ID NO:42和41、SEQ ID NO:44和43、SEQ IDNO:46和45、SEQ ID NO:48和47、SEQ ID NO:50和49、SEQ ID NO:52和51或者SEQ ID NO:54和53。

8.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，其中所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述VH和所述VL包含如表10或表1中所示的氨基酸序列。

9.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中

(c)所述VH结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，在52位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位或111位中的两者或更多者，或者它们的任何组合(IMGT：57位、107位、108位、109位、110位、111位、111A位、112A位、112位、113位、114位或117位，或者它们的组合)处具有氨基酸变体；并且

(d)所述VL结构域包含如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在26位、27位、31位、51位、56位、77位、92位、93位或96位中的两者或更多者，或者它们的任何组合(IMGT：27位、28位、38位、65位、70位位、94位、109位、110位或115位，或者它们的组合)处具有氨基酸变体。

10.如权利要求1所述的分离的双重结合抗体，其中所述抗体包括IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂、微抗体、双抗体或三抗体。

11.如权利要求10所述的分离的双重结合抗体，其中所述IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

12.如权利要求10所述的分离的双重结合抗体，其中所述IgG包括突变IgG，所述突变IgG不能结合至抗体依赖性细胞的细胞毒性组分。

13.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的分离的双重结合抗体和药学上可接受的载剂。

14.一种分离的多核苷酸构建体，所述分离的多核苷酸构建体编码如权利要求1所述的分离的双重结合抗体。

15.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求14所述的多核苷酸构建体。

16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求15所述的表达载体。

17.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括将包含如权利要求1所述的分离的双重结合抗体的组合物施用于所述受试者。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述疾病或病症是过敏性或呼吸系统病症、炎性或自身免疫病症，或者肿瘤或癌症。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述疾病或病症是哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、重度哮喘、轻度哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、涉及气道炎症的病症、囊性纤维化、过敏性肺部疾病、气道高反应性、杯状细胞化生、粘液分泌过多、气道重塑、肺纤维化、特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性肠胃炎、过敏性鼻炎、炎性肠病、肝硬化或纤维化或者它们的组合。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中

所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3分别包含SEQ ID NO:349、350和351的氨基酸序列，并且所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3分别包含SEQ ID NO:364、360和384的氨基酸序列；或者

所述CDR具有SEQ ID NO:149-154的序列。

21.如权利要求17所述的方法，其中所述双重结合抗体包含重链上的三个互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链上的三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3包含如表8或表4中所示的氨基酸序列，其中所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3包含如表9或表5中所示的氨基酸序列。

22.如权利要求17所述的方法，其中所述双重结合抗体包含VH和VL，所述VH和所述VL具有SEQ ID NO:209和210、SEQ ID NO:219和220、SEQ ID NO:249和250、SEQ ID NO:337和338、SEQ ID NO:155和156、SEQ ID NO:157和158的序列。

23.如权利要求17所述的方法，其中所述双重结合抗体包含VH和VL，所述VH和所述VL具有如表10或表1中所示的序列。