CN116209680A - 与人CD3ε结合的新型人抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供对人CD3ε特异性的新型全人抗体和抗体片段。

Description

与人CD3ε结合的新型人抗体
技术领域
本公开涉及与人CD3ε结合的全人抗体及其改进的变体。本公开还提供包含这种人CD3特异性抗体和抗体片段的多特异性抗体形式。本公开还涉及能够表达这种抗体的核酸、载体和宿主细胞，包含所述抗体的药物组合物以及所述抗体和药物组合物用于治疗特定疾病的用途。
背景技术
CD3是T细胞上表达的与T细胞受体复合物(TCR)相关的同二聚体或异二聚体抗原，是T细胞活化所必需的。CD3由四种不同链中的两种的二聚缔合形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚排列包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。
与CD3结合的抗体已被证明能在T细胞上聚集CD3，从而导致T细胞活化，其方式类似于T细胞受体(TCR)被载肽MHC分子结合。CD3特异性抗体已被提出用于涉及T细胞活化的治疗。因此，已经开发出与CD3和一种以上癌症相关抗原(CAA)共接合的双特异性或多特异性抗体形式，以将T细胞重定向到攻击和裂解癌细胞。尽管CD3靶向方法已显示出相当大的前景，但本领域中描述的这种多特异性抗体形式的治疗用途具有一些共同的缺点。首先，缺乏特异性肿瘤抗原。事实上，通常被靶向的癌症相关抗原通常由肿瘤和非恶性细胞共有。其次，多特异性抗体形式依赖于使用CD3特异性抗体片段(例如单链可变片段(scFv))的主要问题是这些片段活化T细胞的固有能力，而与目标抗原(例如癌症相关抗原)的结合无关。事实上，在基于CD3的抗体治疗中观察到的许多副作用似乎与T细胞功能异常有关(例如可能导致毒性细胞因子释放综合征的相关细胞因子的产生)。
WO2013/104804[JULIUS-MAXIMILIANS-
Figure BDA0004140269250000011
Figure BDA0004140269250000012
中描述了一种多特异性抗体形式的新方法，参见“DUAL ANTIGEN-INDUCED BIPARTITE FUNCTIONALCOMPLEMENTATION”，该方法克服了上述基于抗体的治疗方法中共接合CD3和癌症相关抗原的缺点。这种方法或多特异性抗体形式在本文中称为/>
Figure BDA0004140269250000021
(肿瘤处细胞毒性细胞活化(Cytotoxic cell activation at tumour))。
作为上述方法的一部分，设计了两种多肽，每种多肽由与活化T细胞的抗CD3抗体的可变轻链(VL)结构域或互补的可变重链(VH)结构域融合的靶向部分(例如单链可变片段(scFv)或抗体Fab片段)组成。这种分开或分裂的Fv结构域在本文中称为“分裂效应器结构域”，而重新组装的Fv结构域反映了“效应器结构域”。
未配对的VH或VL结构域(例如分裂的CD3 VH结构域和分裂的CD3 VL结构域)不能单独与CD3结合。然而，一旦上述两种多肽通过其靶向部分与细胞表面上的靶抗原结合，CD3特异性抗体的互补VL和VH结构域就非常接近并相互作用以重建原始CD3抗体(例如，CD3特异性抗体Fv结构域)。因此，在靶细胞上形成的三特异性异二聚体分子(例如常规的三价双或三特异性抗体形式)接合并刺激T细胞以破坏癌细胞。
上述方法的关键方面之一在于鉴定合适的CD3特异性抗体。这种抗体不仅必须满足常规双特异性抗体形式在物种交叉反应性、亲和力、效力、安全性(例如治疗窗)和免疫原性方面的要求，而且还必须满足CyCAT形式的特定要求。
如上所述，在CyCAT方法中，所采用的CD3特异性Fv结构域必须是可分裂的或可分开的。该特征意味着对CD3抗体的若干特定要求。
首先，分裂的Fv结构域的VH和VL结构域必须能够以CyCAT形式(例如作为未配对的CyCAT多肽)以可接受的纯度、可接受的产率以及可接受的单体含量生产。这尤其具有挑战性，因为未配对的VH或VL结构域在生产后往往形成强聚集体。这种聚集倾向(除其他以外)取决于特定的抗体序列，对于携带未配对VH结构域的多肽来说似乎更为关键。事实上，本发明所要求保护的新型CD3特异性抗体的发明人发现，即使是源自一种亲本抗体的抗体变体的CDR序列中的轻微变化，也显示出CyCAT形式的可生产性的强烈差异。
其次，一旦CyCAT多肽组中存在的未配对的CD3特异性VH和VL结构域配对，CD3特异性抗体(例如Fv结构域)必须在活化T细胞和/或将T细胞杀伤重定向到癌细胞方面保持其功能活性。
第三，未配对的CD3特异性VH或VL结构域或包含其的相应的未配对CyCAT多肽不应单独与CD3结合。
第四，未配对的CD3特异性VH或VL结构域或包含其的相应的未配对CyCAT多肽不应单独活化T细胞和/或介导重定向的T细胞杀伤。
最后，在两种多肽与靶细胞上其各自的癌症相关抗原结合之前，未配对的CD3特异性VH或VL结构域或包含其的相应的未配对CyCAT多肽不应配对。在单独施用两种多肽(例如作为两种药物组合物的一部分)之后，或者当两种多肽都是一种药物组合物中的一部分时，这种不需要的预配对(或异种缔合)可能发生在患者血清中。不需要的预配对被认为是(除其他以外)浓度依赖性的，并且依赖于分裂的VH和VL结构域彼此的亲和力。
本领域中描述了大量与CD3结合的抗体。然而，这些具有预期治疗用途的抗体中的大多数是从1980年代和1990年代早期发现的一小组啮齿动物抗CD3抗体中获得的(例如人源化的)。其中，SP34(Yoshino N.等人，Exp.Anim 49:97-110,2000；Conrad ML.等人,Cytometry71A:925-33,2007)可能是人源化方法中使用最多的抗体，因为它是少数与食蟹猴CD3(食蟹猴CD3或cyno CD3)具有交叉反应性的CD3特异性抗体之一，因此既可以用于灵长类动物的安全性、活性和/或药代动力学特征的临床前评估，也可以以相同的形式用于人类药物。SP34识别人CD3ε胞外结构域的N-末端1-27氨基酸残基多肽片段。然而，本发明的发明人发现，至少三种现有技术的抗体(其中两种来自SP34)不适合用于所讨论的CyCAT形式，因为其不利的生产性质和/或功能活性。
有趣的是，在体外从头(de novo)生成与CD3结合的完全人抗体，其识别人CD3ε的N端胞外区并从而对食蟹猴CD3交叉反应，这似乎具有挑战性，至少就本发明人所知，迄今为止尚未报道。
因此，本公开提供了对CD3ε特异性的新抗体和抗体片段，其优于本领域中报道的CD3特异性抗体。
特别是，根据本公开的对CD3ε特异性的抗体或抗体片段是完全人抗体，其也与食蟹类CD3以良好的亲和力交叉反应，并结合了以前从未观察到的理想的可生产性、功能性和安全性性质。
这些特征使得本公开的抗体和抗体片段对于多特异性抗体形式，特别是本文所述的CyCAT形式的治疗用途非常理想。
发明内容
本公开的表2-10和表17-18中总结了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段以及抗体可变结构域及其各自CDR以及包含其的CyCAT多肽。
表4中总结了根据本公开的优选的改进的可变重链(VH)及其HCDR 1-3。表5中总结了根据本公开的优选的改进的可变轻链(VL)及其LCDR 1-3。
表10中总结了根据本公开的对人CD3ε特异性的优选的分离的人抗体或抗体片段。表10中总结了对人CD3ε特异性的改进的可变重链(VH)和改进的可变轻链(VL)的优选组合。表17中总结了根据本公开的对人CD3ε特异性的最优选的分离的人抗体或抗体片段。表17中总结了对人CD3ε特异性的改进的可变重链(VH)和改进的可变轻链(VL)的最优选组合。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表2和表3中公开的6个CDR。在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表2或表3中公开的抗体的6个CDR。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表4中公开的可变重链(VH)的3个HCDR和本公开的表5中公开的抗体轻链(VL)的3个LCDR。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表4中公开的任何一种抗体或可变结构域的HCDR和本公开的表5中公开的任何一种抗体或可变结构域的LCDR。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含如本公开的表2或表3和表8-10中所公开的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的组合。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CDSε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表2、3和表8-10中公开的任何一种抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)。在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表4中公开的可变重链(VH)和本公开的表5中公开的可变轻链(VL)。在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表4中公开的可变重链(VH)和本公开的表5中公开的可变轻链(VL)的组合。在一个实施方式中，本公开提供了本公开的表10中公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。在一个实施方式中，本公开提供了本公开的表17中公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其包含本公开的表10中公开的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的组合。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFX1SX2X3MX4的氨基酸序列，其中X1是S、K或R；X2是Y或H；X3是W或Y；且X4是S或T(SEQ ID NO:90)；
b)HCDR2区，其包含NIX1X2X3X4X5X6X7YYX8X9SVKG的氨基酸序列，其中X1是K或D；X2是Q或Y；X3是D、Q或E；X4是S或G；X5是S、Q或T；X6是E、H或R；X7是K、A或T；X8是V或A；且X9是D或E(SEQ ID NO:91)；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGX1X2YVY的氨基酸序列，其中X1是S、I、A、K或Q；且X2是N或T(SEQ ID NO:92)；
e)LCDR2区，其包含RNX1X2RPS的氨基酸序列，其中X1是N、K、S、H、T或Y；且X2是Q、I或K(SEQ ID NO:93)；和
f)LCDR3区，其包含AX1WDX2X3X4X5GAV的氨基酸序列，其中X1是A或G；X2是H或R；X3是H或R；X4是R、S或L；且X5是S或H(SEQ ID NO:94)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFSSYWMS(SEQ ID NO:40)、GFTFKSYYMS(SEQ ID NO:41)或GFTFRSHYMT(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:43)、NIDYQSQHAYYAESVKG(SEQID NO:44)或NIDYEGTRTYYAESVKG(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO:46)、SGSSSNIGINYVY(SEQ ID NO:47)、SGSSSNIGANYVY(SEQ ID NO:48)、SGSSSNIGQTYVY(SEQ ID NO:49)或SGSSSNIGKNYVY(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含RNNQRPS(SEQ ID NO:51)、RNNIRPS(SEQ ID NO:52)、RNNKRPS(SEQ ID NO:53)、RNKKRPS(SEQ ID NO:54)、RNKQRPS(SEQ ID NO:55)、RNSQRPS(SEQ ID NO:56)、RNHIRPS(SEQ ID NO:57)、RNTQRPS(SEQ ID NO:58)或RNYQRPS(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含AAWDHHRSGAV(SEQ ID NO:60)、AAWDRHSHGAV(SEQ ID NO:61)或AGWDRRLHGAV(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，所述可变重链包含SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包含选自SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括选自以下的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
g)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
h)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
j)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
k)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
l)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
m)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
n)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
o)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
p)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
q)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
r)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
s)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
t)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
u)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
v)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
w)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
x)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，
y)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL，
z)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
aa)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
bb)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
cc)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
dd)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
ee)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
ff)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
gg)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
hh)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
jj)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
kk)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
ll)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
mm)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
nn)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
oo)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
pp)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
qq)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
rr)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
ss)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
tt)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，和
uu)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段与食蟹猴CD3ε交叉反应性结合。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段可与食蟹猴CD3ε交叉反应。
在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是选自Fab、Fv和scFv的抗体片段。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是Fab片段。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是单链Fv(scFv)片段。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的抗体或抗体片段是Fv结构域。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是IgG。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是全长IgG。在一个实施方式中，根据本公开的所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的全长IgG。
在一个实施方式中，根据本公开的所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段是包含Fc区的IgG，所述Fc区相对于野生型Fc受体具有降低的效应器功能。本文中使用的“效应器功能”是指可归因于抗体Fc区的生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞活化。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包含Fc区，其中在与人IgG1重链中的位置L234、L235、D237、N330、P331相对应的位置中的至少5个氨基酸中，分别突变为A、E、A、S和S。在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包含Fc区，其中在与人IgG1重链中的位置L234、L235、G237、N330、P331相对应的位置中的至少5个氨基酸中，分别突变为A、E、A、S和S。
在一个实施方式中，本公开提供了一种多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。在本公开的一个实施方式中，所述多特异性抗体还特异性结合癌症相关抗原。
在一个实施方式中，本公开提供了多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段和与根据本公开的对人CD3ε特异性的抗体或抗体片段相比结合不同抗原的第二抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述第二抗体片段结合细胞表面靶抗原。在一个实施方式中，所述细胞表面靶抗原是肿瘤抗原。在一个实施方式中，所述第二抗体片段结合癌细胞上的癌症相关抗原。在一个实施方式中，本公开提供了一种多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段的第一抗体片段和与所述第一抗体片段相比结合不同抗原的第二抗体片段。在一个实施方式中，所述多特异性抗体包含与所述第一和第二抗体片段相比结合不同抗原的第三抗体片段。在一个实施方式中，所述多特异性抗体包含与所述第二抗体片段相比结合相同抗原的第三抗体片段。在一个实施方式中，所述第二和第三抗体片段结合细胞表面靶抗原。在一个实施方式中，所述细胞表面靶抗原是肿瘤抗原。在一个实施方式中，所述第二和第三抗体片段结合癌细胞上的癌症相关抗原。
在一个实施方式中，本公开提供了包含编码根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段或根据本公开的多特异性抗体的核酸序列或多个核酸序列的核酸组合物。在一个实施方式中，本公开提供了包含载体或多个载体的载体组合物，所述载体包含根据本公开的核酸序列或多个核酸序列。在一个实施方式中，本公开提供了包含根据本公开的载体组合物的宿主细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方式中，本公开提供了生产根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段的方法。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段或根据本公开的多特异性抗体，用作药物。在进一步的实施方式中，本公开提供了根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，用于治疗需要其的受试者。
在一个实施方式中，本公开还提供了通过向患者施用有效量的根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段来治疗患有疾病(例如增殖性疾病)的所述患者的方法。在一个实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，其包含根据本公开的对CD3ε特异性的人抗体或抗体片段或根据本公开的多特异性抗体和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方式中，本公开提供了将T细胞的细胞毒活性重定向到癌细胞的方法，其包括在T细胞存在的情况下将根据本公开的多特异性抗体接触所述癌细胞。
所要求保护的抗体或抗体片段具有实用性。此外，所要求保护的生成这种抗体或抗体片段的方法具有实用性。所要求保护的抗体或抗体片段的用途是靶向表达CD3的T细胞，并用于刺激T细胞活化，例如在T细胞介导的杀伤是有益的或期望的情况下。特别是，所要求保护的抗体或抗体片段用于治疗用途，例如治疗癌症。
附图说明
图1：哺乳动物产生的CD3特异性MAB-1IgG的细胞结合。图1A显示了通过流式细胞术在表达人CD3的人源PBMC上测定的作为IgG浓度函数的结合。作为阴性对照，包括针对鸡蛋溶菌酶的IgG。图1B与图1A所示相同，不同之处在于显示了在表达食蟹猴CD3的食蟹猴源PBMC上的结合。
图2：CyCAT形式的原理图：设计了一组多肽，每种多肽由与活化T细胞的抗CD3抗体的可变轻链(VL)结构域或互补的可变重链(VH)结构域融合的靶向部分(例如抗体Fab片段)组成。未配对的VH或VL结构域不能与CD3结合。一旦上述两种多肽通过其靶向部分与细胞表面上的抗原结合，互补的VL和VH结构域就非常接近并相互作用，以重建原始的CD3抗体片段(例如CD3特异性Fv结构域)。因此在靶细胞上形成的三特异性异二聚体分子接合并刺激T细胞以破坏肿瘤细胞，例如常规的三价双或三特异性抗体形式。
具体实施方式
定义
术语“CD3”是指作为多分子T细胞受体(TCR)的一部分在T细胞上表达的抗原，其由四个受体链中的两个(CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ)缔合形成的同二聚体或异二聚体组成。
包括信号序列(下划线)的人CD3ε具有UniProt P07766的氨基酸序列：
Figure BDA0004140269250000141
包括信号序列(下划线)的食蟹猴CD3ε具有UniProt Q95LI5的氨基酸序列：
Figure BDA0004140269250000142
本文使用的术语“抗原”或“靶抗原”是指可以被根据本公开的抗原结合分子中存在的结合位点之一结合的任何目的分子。通常，抗原是肽、蛋白质或任何其他蛋白性分子。或者，抗原可以是任何其他有机或无机分子，如碳水化合物、脂肪酸、脂类、染料或荧光团。
本文使用的术语“抗原结合分子”，在其最广泛的意义上是指特异性结合至少一种抗原的蛋白性分子。抗原结合分子可以由一个以上多肽组成。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物和/或其片段。根据本公开的抗原结合分子可以基于规则的免疫球蛋白(例如IgG)，特别是半IgG分子。本文所公开的抗原结合分子由至少一个靶向部分(例如抗体Fab片段)和抗体Fv结构域的另外的VH或VL结构域组成，其中VH或VL结构域都不能单独与其抗原结合。相应地，根据本公开的抗原结合分子包含半Fv结构域(1/2Fv结构域)或半结合位点和全结合位点，因此也可以表示为1+1/2或11/2抗原结合分子。
本文使用的术语“抗体”是指与抗原相互作用的包含由二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白质。每个重链均由重链可变区或结构域(这里简称为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域即CH1、CH2和CH3组成。每个轻链均由轻链可变区或结构域(这里简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域即CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布着更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL都由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端依次排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体和嵌合抗体。抗体可以是任何同型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。轻链和重链都分为结构和功能同源的区域。
本文使用的术语“抗体片段”是指抗体的一个或多个部分，其保留与抗原(例如，通过结合、空间位阻、稳定空间分布)特异性相互作用的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段：一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段：一种包括在铰链区由二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段(或Fv结构域)；dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段(或Fv结构域)的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但它们可以通过使用重组方法通过合成的接头连接起来，使它们成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语“抗体片段”之内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式出于实用性来筛选这些片段。抗体片段也可以合并到单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、内抗体(intrabody)、双体(diabody)、三聚体(triabody)、四聚体(tetrabody)、v-NAR和双-scfv中(见Hollinger和Hudson,(2005)Nature Biotechnology23:1126-1136)。抗体片段可以被嫁接到基于多肽的支架上，如纤维连接蛋白III型(Fn3)(见美国专利号6,703,199，描述纤维连接蛋白多肽单体)。抗体片段可以合并到包括一对串联Fv段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该单链分子与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合位点(Zapata等人,(1995)Protein Eng.8:1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
本文使用的“人抗体”或“人抗体片段”包括具有可变区的抗体和抗体片段，其中框架区和CDR区均源自人源序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也衍生自这样的序列。人类来源包括例如人类生殖系序列或突变版本的人类生殖系序列或者包含源自人类框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,(2000)J Mol Biol296:57-86)中所述。因此，所述人抗体可从技术平台获得，该技术平台包括源自人类生殖系基因的抗体，这些抗体可以通过PCR扩增从B细胞分离的VHA/L库产生，也可以合成产生。技术平台包括基于文库的方法，其包括展示在噬菌体、核糖体或酵母上的人免疫球蛋白基因。各自的展示技术是科学界的标准。此外，对携带人免疫球蛋白库的转基因小鼠进行免疫是产生针对目的抗原的人抗体的另一种方法。选自基于MorphoSys
Figure BDA0004140269250000161
概念(Knappik等人,(2000)JMol Biol296:57-86)的抗体库以及选自MorphoSys/>
Figure BDA0004140269250000162
库(Tiller等人mAbs 5:3,1–26；五月/六月(2013)和美国专利号8,728,981)的抗体或其片段被认为是完全人的。
“人源化抗体”或“人源化抗体片段”在本文中定义为如下的抗体或抗体片段，其具有源自人类来源的序列的恒定抗体区，且可变抗体区或其部分或仅CDR源自另一物种。例如，人源化抗体可为CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人类来源，而可变结构域中的一个或多个框架域是人类来源的，且恒定域(如果有的话)是人类来源的。
免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置可以使用众所周知的编号方案来定义，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案或Kabat和Chothia的组合(参见，例如，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health andHuman Services(1991),Kabat等人编著；Lazikani等人,(1997)J.Mol.Bio.273:927-948)；Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication no.91-3242U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature 342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948。
术语“分离的”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体或抗体片段的化合物，其可以是例如抗体或抗体片段。因此，在某些方面，提供的抗体是从具有不同特异性的抗体中分离出来的分离抗体。分离的抗体可以是单克隆抗体。分离的抗体可以是重组单克隆抗体。然而，特异性结合靶的表位、同种型或变体的分离抗体可能对其他相关抗原(例如来自其他物种(例如物种同源物))具有交叉反应性。
本文使用的术语“重组抗体”包括通过自然界中不存在的方式制备、表达、产生或分离的所有抗体。例如，从转化为表达抗体的宿主细胞分离的抗体、从重组组合人抗体库中选择和分离的抗体，以及通过任何其他包括将人免疫球蛋白基因、序列的全部或一部分剪接到其他DNA序列中的手段而制备、表达、产生或分离的抗体，或从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体动物(例如小鼠)或从其中生产的杂交瘤中分离的抗体。优选地，这种重组抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人类生殖系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，这样的重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来源于人类生殖系VH和VH序列并与之相关的序列，但在体内可能不自然存在于人类抗体生殖系库中。重组抗体可以是单克隆抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是其产生方法。本文公开的单克隆抗体可以通过例如Kohler等人；Nature,256:495(1975)所述的杂交瘤方法制备，或可使用例如本文所述的技术从噬菌体库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法在本领域是公知的(例如，参见Short Protocols in Molecular Biology,(2002)5th Ed.,Ausubel等人,编著.,JohnWiley and Sons,New York中第11章)。在本文的实施例中提供了生产其他单克隆抗体的其他示例性方法。
如本文所用，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的，如果一种抗体能够把一种抗原和一种或多种参考抗原区别开，则这种抗体“特异性结合于”、“特异性结合”、“特异性于/针对”或“特异性识别”这种抗原。例如，可以进行标准ELISA测定。可通过标准显色法(例如二级抗体与辣根过氧化物和四甲基联苯胺与过氧化氢)进行评分。某些孔中的反应通过例如450nm处的光密度来评分。典型的背景(＝负反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这意味着正/负差异可能超过10倍。通常，结合特异性的测定不是通过使用单种参考抗原，而是通过使用一组约三至五种不相关的抗原(例如奶粉、BSA、转铁蛋白等)来进行。
如本文所用，“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”或者“CD3特异性抗体”包括特异性识别一个以上CD3受体链(或亚基)(例如，ε、δ、γ或ζ)的抗体和抗体片段，以及特异性识别两个CD3受体链的二聚体复合物(例如γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3二聚体)的抗体和抗体片段。本公开的抗体和抗体片段可结合可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3。可溶性CD3包括天然CD3蛋白以及重组CD3蛋白变体，例如缺乏跨膜结构域或与细胞膜不相关的单体和二聚体CD3构建体。本文中使用术语“结合CD3的抗体”或“抗CD3抗体”或“CD3特异性抗体”旨在包括单特异性抗体以及双特异性或多特异性抗体。
“细胞表面表达的CD3”包括包含在细胞膜上功能性T细胞受体范围内的CD3蛋白。表达“细胞表面表达的CD3”还包括CD3蛋白，其作为细胞表面同二聚体或异二聚体的一部分表达(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζCD3受体链二聚体)。表达“细胞表面表达的CD3”还包括自身在细胞表面表达而无其他CD3链类型的CD3受体链(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ或CD3-ζ)。“细胞表面表达的CD3”可包括在正常表达CD3蛋白的细胞表面上表达的CD3蛋白或由其组成。或者，“细胞表面表达的CD3”可以包括在如下细胞表面上表达的CD3蛋白或由其组成，该细胞通常不在其表面上表达人CD3，但已被人工工程化以在其表面上表达CD3。
术语“交叉反应性结合”或术语“交叉反应的”在本文中可互换使用，并指具有特异性结合一种以上抗原的能力的抗体。例如，在本公开中，抗体交叉反应性结合食蟹猴CD3或食蟹猴CD3ε。
如本文所用，术语“亲和力”是指多肽与其靶在单个位点处的相互作用强度。在每个位点内，多肽的结合区通过弱的非共价力与其靶在许多位点相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文所用，术语“KD”是指解离常数，其由Kd与Ka的比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗原结合部分(如单克隆抗体)的KD值可以使用本领域中已建立好的方法来确定。用于测定抗原结合部分如单克隆抗体的KD的方法是SET(可溶性平衡滴定)或使用生物传感器系统(如
Figure BDA0004140269250000191
系统)的表面等离子体共振。在本公开中，人CD3ε多肽特异性抗体的解离速率常数(KD)(koff/kon)通常小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10-3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10- 7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10- 11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10- 14M、小于5x10-15M或小于10-15M或更低。
本公开的组合物可用于治疗或预防应用。因此，本公开包括包含本文所公开的抗体(或功能性抗体片段)及其药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在相关方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法。这种方法包含向需要的受试者施用有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物含有本文所述的抗体(或功能性抗体片段)。
本公开提供了治疗方法，包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所公开的CD3特异性人抗体或抗体片段。本文所用的“治疗有效量”或“有效量”是指引发所需生物反应所需的CD3特异性抗体的量。根据本公开，治疗有效量是治疗和/或预防疾病所需的CD3特异性抗体或抗体片段的量。
术语“细胞增殖性疾病”和“增殖性疾病”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的疾病。在一个实施方式中，细胞增殖性疾病是癌症。在一个实施方式中，细胞增殖性疾病是肿瘤。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征是细胞生长不受调控。
如本文所用，疾病的“延缓进展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延迟疾病的发展(例如，细胞增殖性疾病，例如癌症)。这种推迟可能会有不同的时间长度，这取决于病史和/或正在接受治疗的个体。正如本领域技术人员显而易见的那样，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，因为该个体不会发病。例如，晚期癌症，如发生转移，可能会延迟。
如本文所用，术语“IC50”是指在测定中其抑制最大响应和基线之间的一半响应的抑制剂(例如抗体或抗体片段)的浓度。它表示将给定响应降低50％的抗体浓度。
术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”、“减少(reduction)”或“减少(reduce)”、“中和(neutralization)”或“中和(neutralize)”是指任何表型特征(如结合、生物活性或功能)的减少或停止，或该特征发生率、程度或可能性的减少或终止。“抑制”，“减少”或“中和”不需要是完全的，只要使用适当的测定可以检测到。在一些实施方式中，“减少”或者“抑制”是指能够导致20％以上的减少。在另一个实施方式中，“减少”和“抑制”是指能够导致50％以上减少。在又一个实施方式中，“减少”或“抑制”是指能够导致75％、85％、90％、95％以上的总体减少。
“施用”或“给药”包括但不限于以注射形式递送药物，例如静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径或粘膜途径，例如作为鼻喷雾剂或气雾剂吸入或作为可摄入溶液、胶囊或片剂。优选地，以注射形式给药。
如本文所使用的，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”等指的是试图改变被治疗对象疾病的自然病程的临床干预，并且可以为预防或在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展率、改善或缓和疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“多特异性”是指抗体能够特异性结合两种以上不同的抗原。通常，多特异性抗原结合分子包括两个以上抗原结合位点，每个抗原结合位点对不同的抗原或表位具有特异性。
术语“双特异性”是指抗体能够特异性结合两种不同的抗原。典型地，双特异性抗原结合分子包括两个抗原结合位点，每个位点对不同的抗原或表位具有特异性。
如本文所用，关于Fab和/或Fv区等的术语“第一”和“第二”用于在每种类型的组分存在一种以上时进行区分。除非明确说明，否则这些术语的使用不旨在赋予特定的顺序或方向。
如本文所用，“氨基酸残基”或“氨基酸”将通过其全名或根据标准的三个字母或一个字母的氨基酸代码表示。“天然氨基酸”指以下氨基酸：
表1：天然氨基酸
Figure BDA0004140269250000211
本文中使用的术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物，而不是指特定长度的产品。该术语适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。除非另有说明，多肽的特定氨基酸序列也隐含地包含其保守修饰的变体(例如，通过用具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸残基替换氨基酸残基)。多肽可以来源于天然生物源或通过重组技术生产，但不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括化学合成。多肽可以包括一个或多个二硫键或被化学修饰。
如本文所用，术语“结构域”是指包括整个多肽或部分多肽的氨基酸序列的氨基酸线性分子链。
如本文在根据本公开的CyCAT分子的上下文中所使用的术语“功能性结构域”是指能够实现特定功能的结构域，所述特定功能例如与特定结合伴侣或抗原的特异性结合、特定受体的特异性激活、毒性作用的介导或在用适当波长的光激发时的荧光。
如本文在根据本公开的CyCAT分子的上下文中所使用的术语“结构域片段”或“功能性结构域片段”是指对应于结构域的一部分而不是整个结构域或功能性结构域的氨基酸线性分子链。
如本文在根据本公开的CyCAT分子的上下文中所使用的术语“部分”是指包括整个多肽或部分多肽的氨基酸序列的氨基酸线性分子链其。“靶向部分”用于指与抗原特异性结合的部分。靶向部分的非限制性实例是抗体、抗体片段、抗原的天然配体、这种配体的突变体或模拟物(如果这种配体，
在根据本公开的CyCAT分子的上下文中，“未缔合”是指在以下方面未功能性缔合：就功能性结构域的功能而言，即不允许所述功能结构域的第一片段和所述功能结构域的第二片段形成所述功能性结构域；或者就Fv结构域的功能而言，即不允许VH和VL形成功能性Fv结构域。
如本文所用，“非共价缔合”是指不涉及原子间键的分子相互作用。例如，非共价相互作用涉及例如，离子键、氢键、疏水相互作用和范德华力。
如本文所用，“共价键”是指以电子共享为特征的原子间键。
实施方式
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFX1SX2X3MX4的氨基酸序列，其中X1是S、K或R；X2是Y或H；X3是W或Y；且X4是S或T(SEQ ID NO:90)；
b)HCDR2区，其包含NIX1X2X3X4X5X6X7YYX8X9SVKG的氨基酸序列，其中X1是K或D；X2是Q或Y；X3是D、Q或E；X4是S或G；X5是S、Q或T；X6是E、H或R；X7是K、A或T；X8是V或A；且X9是D或E(SEQ ID NO:91)；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGX1X2YVY的氨基酸序列，其中X1是S、I、A、K或Q；且X2是N或T(SEQ ID NO:92)；
e)LCDR2区，其包含RNX1X2RPS的氨基酸序列，其中X1是N、K、S、H、T或Y；且X2是Q、I或K(SEQ ID NO:93)；和
f)LCDR3区，其包含AX1WDX2X3X4X5GAV的氨基酸序列，其中X1是A或G；X2是H或R；X3是H或R；X4是R、S或L；且X5是S或H(SEQ ID NO:94)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFSSYWMS(SEQ ID NO:40)、GFTFKSYYMS(SEQ ID NO:41)或GFTFRSHYMT(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:43)、NIDYQSQHAYYAESVKG(SEQID NO:44)或NIDYEGTRTYYAESVKG(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO:46)、SGSSSNIGINYVY(SEQ ID NO:47)、SGSSSNIGANYVY(SEQ ID NO:48)、SGSSSNIGQTYVY(SEQ ID NO:49)或SGSSSNIGKNYVY(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含RNNQRPS(SEQ ID NO:51)、RNNIRPS(SEQ ID NO:52)、RNNKRPS(SEQ ID NO:53)、RNKKRPS(SEQ ID NO:54)、RNKQRPS(SEQ ID NO:55)、RNSQRPS(SEQ ID NO:56)、RNHIRPS(SEQ ID NO:57)、RNTQRPS(SEQ ID NO:58)或RNYQRPS(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含AAWDHHRSGAV(SEQ ID NO:60)、AAWDRHSHGAV(SEQ ID NO:61)或AGWDRRLHGAV(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，所述可变重链包含SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，所述可变重链包含SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，所述可变重链包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，所述可变重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包含选自SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25和SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括选自以下的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
g)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
h)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
j)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
k)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
l)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
m)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
n)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
o)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
p)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
q)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
r)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
s)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
t)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
u)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
v)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
w)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
x)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，
y)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL，
z)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
aa)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
bb)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
cc)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
dd)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
ee)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
ff)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
gg)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
hh)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
jj)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
kk)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
ll)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
mm)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
nn)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
oo)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
pp)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
qq)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
rr)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
ss)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
tt)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，和
uu)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括选自以下的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
f)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
g)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
h)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
j)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
k)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
l)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，和
m)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括选自以下的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，和
f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变重链(VH)和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的可变轻链(VL)。
特异性
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段对人CD3具有特异性。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段对食蟹猴CD3具有特异性。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段对人和食蟹猴CD3具有特异性。
在一个实施方式中，根据本公开的对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段对人CD3ε具有特异性。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3特异性的根据本公开的分离的人抗体或抗体片段对食蟹猴CD3ε具有特异性。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段对人和食蟹猴CD3ε具有特异性。在一个实施方式中，根据本公开的分离的人抗体或抗体片段对人和食蟹猴CD3ε具有特异性。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与食蟹猴CD3交叉反应性结合。在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与食蟹猴CD3ε交叉反应性结合。
在一个实施方式中，本公开提供了对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段特异性结合人CD3ε。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合人和食蟹猴CD3ε。
在一个实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述人CD3ε包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
在一个实施方式中，本公开提供了对食蟹猴CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述食蟹猴CD3ε包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。
在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的人CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的人CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的人CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7和8的任何氨基酸序列的人CD3ε多肽。
在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合人CD3ε的胞外区。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合人和食蟹猴CD3ε的胞外区。
在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的食蟹猴CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的食蟹猴CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的食蟹猴CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的食蟹猴CD3ε多肽。在一个实施方式中，根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段特异性结合包含选自SEQ ID NO:2、4、6和104的任何氨基酸序列的食蟹猴CD3ε多肽。
在一个实施方式中，本公开涉及对由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:8编码的多肽特异性的分离的人抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，本公开涉及对由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:8编码的多肽特异性的分离的人抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的分离的人抗体或抗体片段，其特异性结合由SEQ ID NO:1、3、5、7或8编码的多肽和由SEQ ID NO:2、4、6或104编码的多肽。
在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体或抗体片段与食蟹猴CD3ε交叉反应。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体或抗体片段与食蟹猴CD3ε交叉反应性结合。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的人CD3ε肽具有单价亲和力，KD为10nM以下，例如8nM以下、7nM以下、6nM以下、5nM以下、4nM以下、3nM以下、2nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.2nM、或小于0.1nM。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的人CD3ε肽具有单价亲和力，KD在0.1nM和10nM之间。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:104的食蟹猴CD3ε肽具有单价亲和力，KD为10nM以下，例如8nM以下、7nM以下、6nM以下、5nM以下、4nM以下、3nM以下、2nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.2nM、或小于0.1nM。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:104的食蟹猴CD3ε肽具有单价亲和力，KD在0.1nM和10nM之间。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的人CD3ε肽和包含SEQ ID NO:104的食蟹猴CD3ε肽具有单价亲和力，KD在0.1nM和10nM之间。
在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含SEQ ID NO:8的人CD3ε肽具有单价亲和力，KD在0.1nM和5nM之间，并且对包含SEQ ID NO:104的食蟹猴CD3ε肽具有单价亲和力，KD在0.1nM和1nM之间。
在某些实施方式中，以抗体Fv或Fab形式测定所述单价亲和力。在一个实施方式中，如本文实施例10或实施例13所述测定所述单价亲和力。
在替代实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段特异性结合人和/或食蟹猴衍生的PBMC，EC50浓度在1nM和10nM之间，如在实施例14中所述的FACS测定中所测定。在一个实施方式中，以Fab形式测定所述EC50浓度。在一个实施方式中，所述抗体片段是Fab。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
治疗方法
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，用作药物。
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，用于刺激T细胞活化。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，用于增强具有细胞增殖性疾病的受试者的免疫功能。在一个实施方式中，本公开提供了治疗或延缓有需要的受试者的细胞增殖性疾病进展的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段可用于治疗或延缓有需要的受试者的细胞增殖性疾病的进展。在一个实施方式中，所述细胞增殖性疾病是癌症。
在一个实施方式中，癌症选自：食管癌、胃癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤、生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LL)、Waldenstrom巨球蛋白血症(WM)、中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B细胞前淋巴细胞白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、脾淋巴瘤/白血病，不可分类、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变体、Waldenstrom巨球蛋白血症、浆细胞性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结节性边缘区淋巴瘤、儿童淋巴结边缘区淋巴瘤、儿童滤泡淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、CNS原发性DLBCL、原发皮肤DLBCL，腿型、老年人EBV阳性DLBCL、慢性炎症相关性DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、起自HHV8相关多中心性Castleman病的大B细胞淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤：特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间的不可分类的B细胞淋巴瘤，和特征介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤之间的不可分类的B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段可以用作药物。在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，用于医药。在一个实施方式中，本公开涉及根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段用于制备药物。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段在制备药物中的用途。
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段在制备用于治疗或延缓细胞增殖性疾病进展的药物中的用途。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的人抗体或人CD3ε特异性抗体片段在制备用于增强具有细胞增殖性疾病的受试者的免疫功能的药物中的用途。
在一个实施方式中，本公开提供了用根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段治疗有需要的受试者的方法。
在实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段或包含所述抗体或抗体片段的药物组合物通过皮下、静脉、肌肉、局部、口服、经皮、腹腔、眶内、植入、吸入、鞘内、脑室或鼻内给药。在一个实施方式中，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段或根据本公开的药物组合物经静脉给药。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
安全性
在某些实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其不活化T细胞。在某些实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其不诱导CD4阳性和/或CD8阳性T细胞上CD69表达的上调。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
组合物
在一个实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。这种载体在本领域中是公知的，本领域技术人员将找到最适合于用根据本公开的抗体或抗体片段治疗受试者的制剂和给药途径。
在一个实施方式中，本公开涉及所述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述药物组合物包含根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。在一个实施方式中，本公开涉及所述药物组合物用于治疗疾病的用途。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗受试者的细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段与第二治疗剂的组合。在一个实施方式中，所述第二治疗剂是有利地与所述根据本公开对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段组合的任何试剂。
本公开提供了使用根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段激活T细胞活化的治疗方法，其中所述治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含所述根据本公开的对CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。
本公开还提供了使用根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段将T细胞杀伤重定向到癌性细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据本公开的所述抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
多特异性抗体
根据本公开的人CD3ε特异性人抗体或抗体片段优选用于多特异性抗体形式，以靶向表达CD3的T细胞并刺激T细胞活化，例如在T细胞介导对肿瘤细胞等特定细胞类型的杀伤是有益或可取的情况下。
根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段可以与另一种功能分子，如另一种肽或蛋白质，连接或共同表达。例如，抗体或抗体片段可以与一种以上其他分子实体例如另一抗体或抗体片段(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)功能性地连接在一起，以产生具有例如第二或第三结合特异性的双特异性或多特异性抗体。能够结合两种以上抗原的双特异性或多特异性抗体对治疗应用有很大的价值，因为它们可以同时结合和灭活两种以上的靶抗原，因此代表了传统组合疗法的替代方法。
因此，在某些实施方式中，本公开提供了对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是单特异性、双特异性或多特异性的抗体或抗体片段。
多特异性抗体可含有对同一靶抗原上不同表位特异性的抗体片段，也可含有对超过一种靶抗原特异性的抗体片段。根据本公开在双特异性或多特异性抗体的背景下，细胞表面靶抗原可以是癌症相关抗原(CAA)。癌症相关抗原的非限制性实例包括，例如，在肿瘤或癌性细胞表面表达的抗原。
可用于本公开上下文中的示例性多特异性抗体形式包括但不限于，例如基于scFv或双体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、杵臼结构(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有杵臼结构的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(参见，例如，Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11)。优选地，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段以WO 2020/115115中所述的形式使用。最优选地，根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段以本文或WO 2013/104804中所述的CyCAT形式使用。
在一个实施方式中，本公开提供了双特异性或多特异性抗体，其包含对人CD3ε特异性的第一抗体片段和与所述第一抗体片段相比结合不同抗原的第二抗体片段，其中所述对CD3特异性的第一抗体片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的抗体或抗体片段中的任何一种。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的第一抗体片段包括表10中列出的对人CD3ε特异性的抗体或抗体片段中的任何一种。
在一个实施方式中，本公开提供了多特异性抗体，其包含对人CD3ε特异性的第一抗体片段和与所述第一抗体片段相比结合不同抗原的第二抗体片段，其中所述对人CD3ε特异性的第一抗体片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段中的任何一种。在一个实施方式中，所述对CD3特异性的第一抗体片段包括表10中列出的对人CD3ε特异性的抗体或抗体片段中的任何一种。
在一个实施方式中，所述第二抗体片段特异性结合细胞表面抗原。在一个实施方式中，所述第一抗体片段结合存在于免疫效应细胞上的CD3。在一个实施方式中，细胞表面靶抗原是癌症相关抗原。在一个实施方式中，所述免疫效应细胞是T细胞。在一个实施方式中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
在一个实施方式中，本公开提供了一种多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段，其中多特异性抗体介导重定向的对靶抗原表达细胞的T细胞杀伤。在某些实施方式中，所述靶细胞杀伤可通过本文实施例11中所述的方法来确定。在一个实施方式中，根据本公开的多特异性抗体特异性结合a)T细胞上表达的CD3和b)T细胞以外的靶细胞上存在的第二抗原。在某些实施方式中，所述多特异性抗体在与(a)和(b)结合后活化T细胞。在一些实施方式中，活化的T细胞能够对靶细胞发挥细胞毒性效应和/或凋亡效应。
在一个实施方式中，本公开提供了如本文所公开的多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段，其中所述多特异性抗体在没有细胞表面抗原表达细胞的情况下不诱导CD4阳性和CD8阳性T细胞上CD69表达的上调。在实施方式中，本公开提供了多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段，其中所述多特异性抗体在细胞表面靶抗原表达细胞存在下诱导人T细胞增殖。在实施方式中，本公开提供了如本文所公开的多特异性抗体，其包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段，其中所述多特异性抗体在缺乏细胞表面抗原表达细胞的情况下不活化T细胞。
在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段包括
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
Figure BDA0004140269250000581
根据本公开的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段可用于本文所述或WO2013/104804(其全部并入本文)中所述的CyCAT方法。
作为上述方法的一部分，设计了两种多肽，每种多肽由与活化T细胞的抗CD3抗体的可变轻链(VL)结构域或互补的可变重链(VH)结构域融合的抗体部分(例如，单链可变片段(scFv)或抗体Fab片段)组成。单独的未配对VH或VL结构域不能与CD3结合，因此没有功能。然而，一旦两种CyCAT多肽结合到细胞表面上他们各自的抗原上，互补的VL和VH结构域就非常接近并相互作用，以重建原始的CD3抗体片段(例如Fv结构域)并具有功能性。因此在靶细胞上形成的三特异性异二聚体接合并如常规的多特异性抗体那样刺激T细胞以破坏肿瘤细胞。
因此，本公开提供了包含根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段的CyCAT形式。
因此，在一个实施方式中，本公开提供了一组多肽，其包括：
a)第一多肽，其包含：
(i)第一靶向部分，其中所述第一靶向部分特异性结合第一抗原，和
(ii)功能性结构域的第一片段，
其中就所述功能性结构域的功能而言，所述功能性结构域的第一片段自身和所述第一多肽自身都不具有功能性，
和
b)第二多肽，其包含
(i)第二靶向部分，
其中所述第二靶向部分特异性结合第二抗原，和
(ii)所述功能性结构域的第二片段，
其中就所述功能性结构域的功能而言，所述功能性结构域的所述第二片段自身和所述第二多肽自身都不具有功能性，
其中所述第一多肽和所述第二多肽在不存在在其细胞表面同时具有所述第一和第二抗原两者的细胞的情况下彼此未缔合，
其中，当所述第一多肽的所述第一片段与所述第二多肽的所述第二片段二聚时，所得到的二聚体就所述功能性结构域的功能而言具有功能性，
并且其中所述功能性结构域的所述第一片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段的VL，并且所述功能性结构域的所述第二片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的同一人抗体或抗体片段的VH；
或者其中所述功能性结构域的所述第一片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段的VH，并且所述功能性结构域的所述第二片段包括根据本公开的对人CD3ε特异性的同一人抗体或抗体片段的VL，
其中所述功能性结构域是Fv结构域或包括Fv结构域。
在一个实施方式中，所述功能性结构域是Fv结构域。
在一个实施方式中，在其细胞表面同时携带第一和第二抗原两者的细胞诱导所述第一多肽的所述功能性结构域的第一片段与所述第二多肽的所述功能性结构域的第二片段二聚，未在其细胞表面携带第一和第二抗原两者的细胞不诱导所述第一多肽的所述功能性结构域的第一片段与所述第二多肽的所述功能性结构域的第二片段二聚。
在替代实施方式中，本公开提供了一组多肽，其包括：
a)第一多肽，其包含：
(i)第一靶向部分，其中所述第一靶向部分特异性结合第一抗原，和
(ii)Fv结构域的VH或VL，
其中就所述Fv结构域的功能而言，所述Fv结构域的所述VH或VL自身以及所述第一多肽自身都不具有功能性，
和
b)第二多肽，其包含
(i)第二靶向部分，其中所述第二靶向部分特异性结合第二抗原，和
(ii)所述Fv结构域的互补VH或VL，
其中就所述Fv结构域的功能而言，所述Fv结构域的所述互补VH或VL自身和所述第二多肽自身都不具有功能性，
其中所述第一多肽和所述第二多肽在不存在在其细胞表面具有所述第一抗原和所述第二抗原的细胞的情况下彼此未缔合，
其中，当所述第一多肽的所述VL与所述第二多肽的所述VH二聚时，所得到的二聚体就所述Fv结构域的功能而言具有功能性，
其中，当所述第一多肽的所述VH与所述第二多肽的所述VL二聚时，所得到的二聚体就所述Fv结构域的功能而言具有功能性，
并且其中所述VL包括根据本公开的对人CD3ε特异性的人抗体或抗体片段的VL，并且所述VH结构域包括根据本公开的对人CD3ε特异性的同一人抗体或抗体片段的VH结构域。
在一个实施方式中，在其细胞表面携带第一和第二抗原两者的细胞诱导所述第一多肽的VH与所述第二多肽的VL二聚，而未在其细胞表面携带第一和第二抗原两者的细胞不诱导所述第一多肽的VH与所述第二多肽的VL二聚，或者
其中，在其细胞表面携带第一和第二抗原两者的细胞诱导所述第一多肽的VL与所述第二多肽的VH二聚，而未在其细胞表面携带第一和第二抗原两者的细胞不诱导所述第一多肽的VL与所述第二多肽的VH二聚。
在一个实施方式中，所述Fv包括选自以下的VH和VL：
a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
g)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
h)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
j)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
k)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
l)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
m)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
n)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
o)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
p)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
q)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
r)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
s)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
t)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
u)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
v)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
w)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
x)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，
y)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL，
z)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
aa)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
bb)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
cc)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
dd)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
ee)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
ff)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
gg)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
hh)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
jj)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
kk)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
ll)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
mm)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
nn)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
oo)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
pp)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
qq)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
rr)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
ss)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
tt)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，和
uu)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，所述VH选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。在一个实施方式中，所述VL选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:38。在一个实施方式中，所述VH选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，所述VL选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:38。
在一个实施方式中，所述VH选自SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15，所述VL选自SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29。
在一个实施方式中，所述第一抗原和/或所述第二抗原是在肿瘤细胞表面上或肿瘤祖细胞/前体细胞表面上表达的抗原。在一个实施方式中，所述第一抗原和/或所述第二抗原是在肿瘤细胞表面上或肿瘤祖细胞/前体细胞表面上表达的癌症相关抗原。
在一个实施方式中，所述第一抗原和所述第二抗原是相同的抗原。在一个实施方式中，所述第一抗原和所述抗原是不同的抗原。在一个实施方式中，第一抗原和第二抗原的组合仅存在于癌性细胞上，而不存在于非癌性细胞上。在一个实施方式中，第一抗原和第二抗原的组合对特定类型癌症的癌性细胞是特异性的。
在一个实施方式中，所述第一靶向部分和/或所述第二靶向部分包括scFv、Fab、抗体的F(ab’)2片段或VHH抗体。
在一个实施方式中，根据本公开的多肽组用于治疗患有癌症的患者或用于诊断患有癌症的患者。
在一个实施方式中，本公开提供了包含根据本公开的多肽组的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方式中，本公开提供了两种药物组合物，它们各自包含根据本公开的多肽组的两种多肽中的一种，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，本公开提供了包含根据本公开的多肽组的试剂盒。根据本公开的多肽组可用于预防和治疗疾病，所述疾病由涉及靶抗原的生物途径介导。
在一个实施方式中，本公开提供了诱导癌细胞裂解的方法，包括在细胞毒性T细胞存在的情况下，将表达所述第一和第二抗原的所述癌症靶细胞与根据本公开的多肽组接触。
在一个实施方式中，本公开提供了抑制癌细胞增殖的方法，包括在细胞毒性T细胞存在的情况下，将表达所述第一和第二抗原的所述癌细胞与根据本公开的多肽组接触。
在一个实施方式中，本公开提供了杀灭癌细胞的方法，包括在细胞毒性T细胞存在的情况下，将表达所述第一和第二抗原的所述癌细胞与根据本公开的多肽组接触。
在一个实施方式中，本公开提供了在细胞毒性T细胞中诱导细胞响应的方法，包括在表达所述第一和第二抗原的癌细胞存在的情况下，将所述细胞毒性T细胞与根据本公开的多肽组接触。在一个实施方式中，所述细胞响应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标记物的表达。
在一个实施方式中，本公开提供了在癌细胞存在的情况下诱导T细胞增殖的方法，包括在T细胞存在时，将表达所述第一和第二抗原的所述癌细胞与根据本公开的一组多肽接触。在一个实施方式中，本公开提供了在存在癌细胞时刺激初级T细胞响应的方法，包括在存在所述T细胞时，将表达所述第一和第二抗原的所述癌细胞与根据本公开的一组多肽接触。在一个实施方式中，本公开提供了将T细胞的细胞毒活性重新定向到癌细胞的方法，包括在所述T细胞存在时，将表达所述第一和第二抗原的所述癌细胞与根据本公开的一组多肽接触。
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的一组多肽用于在受试者中治疗包括表达所述第一和第二癌症相关抗原的癌细胞的癌症的用途，所述用途包括：
(a)选择患有癌症的受试者，
(b)收集来自所述受试者的一个或多个生物样品，
(c)在一个或多个样品中鉴定表达所述第一和第二癌症相关抗原的癌细胞；和
(d)向受试者施用有效量的根据本公开的一组多肽。
本文还提供了第一抗原结合分子和第二抗原结合分子的组合或组，其中这两种抗原结合分子中的每一种由与对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的未配对VL或VH结构域融合的具有靶抗原特异性的靶向部分组成，并且其中这两种抗原结合分子不通过共价键相连。
在一个实施方式中，本公开涉及抗原结合分子，其从其N端到C端由以下组成
a)对第一抗原特异性的靶向部分，
b)肽接头，和
c)或是选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域，或是选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域，
其中靶向部分通过肽接头与对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH或VL结构域的N端融合。
在一个实施方式中，靶向部分通过肽接头与对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域的N端融合。在一个实施方式中，靶向部分通过肽接头与对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域的N端融合。
在一个实施方式中，靶向部分是抗体或抗体片段。在一个实施方式中，靶向部分选自Fab、scFab、Fab’、scFv、dsFv和VHH。在一个实施方式中，靶向部分是Fab。
在本公开的一个实施方式中，根据本公开的抗原结合分子由两种多肽组成，其中
a)第一多肽由Fab的轻链组成，且
b)第二多肽从其N端至C端由以下组成，
I.Fab的重链
II.肽接头，和
III.或是选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域，或是选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域。
在一个实施方式中，本公开涉及一组抗原结合分子，其由以下组成
a)第一抗原结合分子，其从其N端至其C端由以下组成，
i.对第一抗原特异性的第一靶向部分，
ii.第一肽接头，和
iii.或是选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域，或是选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域，
其中所述第一靶向部分通过所述第一肽接头与所述第一抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH或VL结构域的N端融合，和
b)第二抗原结合分子，其从其N端至其C端由以下组成，
I.对第二抗原特异性的第二靶向部分，
II.第二肽接头，和
III.或是选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域(如果第一抗原结合分子包括对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域)，或是选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域(如果第一抗原结合分子包括对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域)，
其中第二靶向部分通过第二肽接头与第二抗原结合分子的人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL或VH结构域的N端融合。
在一个实施方式中，第一靶向部分通过第一肽接头与第一抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域的N端融合。在一个实施方式中，第一靶向部分通过第一肽接头与第一抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域的N端融合。
在一个实施方式中，第二靶向部分通过第二肽接头与第二抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH结构域的N端融合。在一个实施方式中，第二靶向部分通过第二肽接头与第二抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VL结构域的N端融合。
在一个实施方式中，靶向部分是抗体或抗体片段。在一个实施方式中，靶向部分选自Fab、scFab、Fab′、scFv、dsFv和VHH。在一个实施方式中，靶向部分是Fab。
在一个实施方式中，用于根据本公开的抗原结合分子的肽接头具有5至20个氨基酸残基的长度。在一个实施方式中，用于根据本公开的抗原结合分子的肽接头具有5个氨基酸残基的长度。在一个实施方式中，肽接头包含GQPSG(SEQ ID NO:105)的氨基酸序列。在一个实施方式中，肽接头由GQPSG(SEQ ID NO:105)的氨基酸序列组成。
在本公开的一个实施方式中，在根据本公开的抗原结合分子的组中，第一抗原结合分子和第二抗原结合分子不通过共价键连接。在一个实施方式中，根据本公开的第一抗原结合分子和第二抗原结合分子能够形成异聚体分子。在一个实施方式中，在存在表达第一抗原和第二抗原的细胞的条件下形成的异聚体分子的量高于在不存在细胞或存在表达第一或第二抗原细胞的条件下形成的异聚体分子的量。
在本公开的一个实施方式中，对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH和VL结构域能够非共价缔合，从而形成对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域。在一个实施方式中，所述对人CD3ε特异性的VH和VL结构域的非共价缔合导致形成对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域。在一个实施方式中，对人CD3ε特异性的VH和VL结构域的非共价缔合使第一和第二抗原结合分子二聚。在一个实施方式中，所述非共价缔合使第一和第二抗原结合分子二聚，导致三特异性异聚抗体的形成。在一个实施方式中，所述三特异性异聚抗体的形成发生在细胞上。在一个实施方式中，所述三特异性异聚抗体的形成发生在体内。在一个实施方式中，所述三特异性异聚抗体分子的形成发生在体外。在本公开的一个实施方式中，第一抗原结合分子的对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域的VH或VL结构域和第二抗原结合分子的对人CD3ε特异性的互补VH或VH结构域能够非共价缔合，从而形成对人CD3ε特异性的抗体Fv结构域。在本公开的一个实施方式中，当存在表达第一抗原和第二抗原的细胞时，对人CD3ε特异性的VH和VL结构域的非共价缔合优先发生。在一个实施方式中，当存在表达第一抗原和第二抗原的细胞并且当两种抗原结合分子均结合到细胞上的抗原时，对人CD3ε特异性的VH和VL结构域的所述非共价结合优先发生。
在一个实施方式中，所述细胞上形成的三特异性异二聚体抗体具有与第一抗原的单价结合、与第二抗原的单价结合和与人CD3ε的单价结合。在本公开的一个实施方式中，细胞上形成的三特异性异二聚体抗体能够接合和刺激细胞毒性T细胞以破坏靶细胞。
在本公开的实施方式中，第一抗原和第二抗原存在于同一细胞上。在一个实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。在一个实施方式中，第一抗原和第二抗原是肿瘤相关抗原。
根据本公开的一组抗原结合分子可用于预防和治疗疾病，所述疾病由涉及靶抗原的生物途径介导。这可以优选通过招募细胞毒性免疫细胞(例如T细胞)到表达靶抗原(优选CAA)的细胞来实现。在一个实施方式中，本公开提供了用于诱导靶细胞(例如肿瘤细胞)裂解的方法，包括在细胞毒性T细胞存在下使所述细胞与根据本公开的一组抗原结合分子接触。
在一个实施方式中，本公开提供了用于抑制靶细胞(例如肿瘤细胞)中信号传导的方法，包括在细胞毒性T细胞存在下使所述细胞与根据本公开的一组抗原结合分子接触。在一个实施方式中，本公开提供了用于抑制靶细胞(例如肿瘤细胞)增殖的方法，包括在细胞毒性T细胞存在下使所述细胞与一组根据本公开的抗原结合分子接触。在一个实施方式中，本公开提供了用于诱导细胞毒性T细胞中的细胞响应的方法，包括在靶细胞(例如肿瘤细胞)存在下使所述细胞毒性T淋巴细胞与一组根据本公开的抗原结合分子接触。在一个实施方式中，所述细胞响应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标记物的表达。
在一个实施方式中，本公开提供了在靶细胞(例如肿瘤细胞)存在下诱导人T细胞增殖的方法，包括在T细胞存在下使所述细胞与一组根据本公开的抗原结合分子接触。在一个实施方式中，本公开提供了在靶细胞(例如肿瘤细胞)存在下刺激初级T细胞响应的方法，包括在所述T细胞存在下将所述细胞与一组根据本公开的抗原结合分子接触。在一个实施方式中，本公开提供了将T细胞的细胞毒活性重新定向到靶细胞(例如肿瘤细胞)的方法，包括在所述T细胞存在下将所述癌细胞与一组根据本公开的抗原结合分子接触。
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的一组抗原结合分子用于治疗受试者中至少两种癌症相关抗原(CAA)呈阳性的癌症的用途，包括：
(a)选择患有癌症的受试者，
(b)收集来自所述受试者的一个或多个生物样品，
(c)在一个或多个样品中鉴定表达至少两种肿瘤相关抗原的癌细胞，和
(d)向受试者施用有效量的根据本公开的一组抗原结合分子。
在一个实施方式中，所述癌细胞表达第一和第二CAA。在优选实施方式中，所述第一和第二CAA不同。在一个实施方式中，在根据本公开的一组抗原结合分子中，第一抗原结合分子结合第一CAA，第二抗原结合分子结合第二CAA。
序列
表2：亲本CD3特异性抗体MAB-1的抗体可变结构域和CDR序列(CDR以Kabat+Chothia组合注释提供)
Figure BDA0004140269250000711
表3：具有MAB-1的改进的可变结构域的亲和力成熟变体(CDR以Kabat+Chothia组合注释提供)
Figure BDA0004140269250000721
表4：MAB-1的改进的VH结构域和CDR序列(CDR以Kabat+Chothia组合注释提供)
Figure BDA0004140269250000722
表5：MAB-1的改进的VL结构域和CDR序列(CDR以Kabat+Chothia组合注释提供)
Figure BDA0004140269250000731
/>
Figure BDA0004140269250000741
/>
Figure BDA0004140269250000751
/>
Figure BDA0004140269250000761
表6：携带MAB-1的改进的VL结构域的CyCAT多肽序列(根据表5)
Figure BDA0004140269250000762
/>
Figure BDA0004140269250000771
/>
Figure BDA0004140269250000781
/>
Figure BDA0004140269250000791
/>
Figure BDA0004140269250000801
表7：携带MAB-1的改进的VH结构域的CyCAT多肽序列(根据表4)
Figure BDA0004140269250000802
表8：并入到CyCAT多肽中的改进的CD3特异性VH和VL结构域的组合(CyCAT多肽未显示曲妥珠单抗的Fab轻链)
Figure BDA0004140269250000811
表9：合并到CyCAT多肽中的进一步改进的CD3特异性VH和VL结构域的其他组合
Figure BDA0004140269250000812
/>
Figure BDA0004140269250000821
表10：根据本发明的新改进的人CD3特异性人抗体
Figure BDA0004140269250000822
/>
Figure BDA0004140269250000831
/>
Figure BDA0004140269250000841
/>
Figure BDA0004140269250000851
工作实施例
实施例1：抗原生成和质量控制
人CD3ε和食蟹猴CD3ε的氨基酸序列从公开来源(例如Uniprot)检索，由内部或外部服务提供商验证和生产。
抗原
我们使用了覆盖人和食蟹猴CD3ε的N端胞外区的线性肽以及人CD3ε和人CD3δ的融合蛋白，作为初始挑选和筛选以及随后结合研究的抗原。肽要么是化学合成的，要么是重组生产的。化学合成的肽合成带有生物素标签，经RP-HPLC纯化并作为冻干材料递送。冻干肽储存在-80℃。
重组抗原
细胞系
HEK293-6E细胞系由加拿大国家研究委员会(NRC)开发。HEK293-6E细胞保存在37℃和6％ CO2的加湿CO2培养箱中的Freestyle F17培养基(Thermo Scientific)中。HKB11(亲本克隆：美国专利6136599。J.Biomed.Sci.2002；9:631-638)是由HEK293人胚胎肾和2B8伯基特淋巴瘤细胞融合产生的人杂交细胞系。HKB11#52细胞保存在37℃和6％ CO2的加湿CO2培养箱中的含有1％ FCS的MAC1.0培养基中。
重组抗原生产
HKB11#52或HEK293-6E细胞在接种后一天根据制造商的说明用市售转染试剂瞬时转染。将细胞培养3天，通过离心，然后进行无菌过滤(0.22μm过滤器)，收集条件细胞培养上清液。通过转染细胞，然后用800μg/mL G418(Thermo Scientific)进行选择，产生稳定转染的HKB11#52池。接种后4天进行稳定池中抗原的表达。
CD3 FLAG-chLys-Avi-标签化抗原
将编码人或食蟹猴CD3ε的N端胞外区(ECD)或CD3εECD与CD3δECD的融合蛋白(包括天然前导序列)的DNA与C端FLAG-chLys-Avi-tag一起克隆到pMAX表达载体中，该表达载体是基于pcDNA3.1(Thermo Fisher)修饰后的表达载体。用自制MOR003207柱通过抗体亲和层析纯化抗原。结合和洗涤后，用0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱蛋白质。所有亲和层析步骤均使用
Figure BDA0004140269250000861
Express(GE Healthcare)色谱系统进行。随后将样品中和(用3M Tris pH 8)，使用PD10柱(GE Healthcare)将缓冲液交换为PBS，并无菌过滤(0.2μm孔径)。
CD3 Fc-标签化抗原
将编码人或食蟹猴CD3ε的N端序列(包括天然前导序列)的DNA与C端人IgG Fc-tag一起框内克隆到pMAX表达载体中，该表达载体是基于pcDNA3.1(Thermo Fisher)修饰后的表达载体。使用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)通过蛋白A色谱纯化抗原。结合和洗涤后，用pH 3.0的100mM甘氨酸洗脱蛋白质。所有亲和层析步骤均使用
Figure BDA0004140269250000862
Express(GE Healthcare)色谱系统进行。随后将样品中和(用3M Tris pH 8)，使用PD10柱(GEHealthcare)将缓冲液交换为PBS，并无菌过滤(0.2μm孔径)。CD3抗原的生物素化通过使用BirA试剂盒(Avidity)进行生物素化，然后使用Superdex 200柱(GE Healthcare)进行制备型SEC。通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度。通过变性、还原性或非还原性SDS-PAGE、链亲和素转移测定、HP-SEC和DLS分析样品的质量。
表11：生产或合成的CD3抗原序列(无信号序列)
Figure BDA0004140269250000863
/>
Figure BDA0004140269250000871
/>
Figure BDA0004140269250000881
实施例2：从MorphoSys
Figure BDA0004140269250000882
文库中产生与人和食蟹猴CD3ε结合的全人抗体
为了产生抗体，使用MorphoSys
Figure BDA0004140269250000883
文库选择针对人和食蟹猴CD3的Fab片段。MorphoSys/>
Figure BDA0004140269250000884
文库(Tiller等人mAbs 5:3,1–26；(2013)五月/六月和美国专利号8,728,981)是市售的噬菌体文库，并采用/>
Figure BDA0004140269250000885
技术在噬菌体表面展示Fab(Lohning等人，WO2001/05950)。
为了鉴定人/食蟹猴CD3交叉反应抗体，进行了各种筛选策略。因此，使用了代表CD3εN端胞外区的不同合成和重组人和食蟹猴CD3ε抗原。该区与人/食蟹猴CD3ε交叉反应性的现有技术抗体SP34识别的结合区对齐。为了鉴定CD3特异性抗体，如上所述，使用人和食蟹猴CD3抗原材料进行基于溶液和半溶液的筛选策略，以选择物种交叉反应性抗体。每次进行的筛选包括至少3轮单独的选择。
鉴定人/食蟹猴CD3交叉反应性抗体是非常具有挑战性的，亲本抗体MAB-1是唯一一个显示与重组人和食蟹猴的CD3ε特异性结合以及与人和食蟹猴PBMC细胞结合的克隆(见图2)。令人惊讶的是，发现MAB-1适合用于本文所述的多特异性CyCAT形式。
使用如上所述的可溶性CD3ε抗原和/或具有人CD3内源性表达的Jurkat细胞，对MAB-1进行可变重链(VH)的HCDR1+2亲和力成熟化和可变轻链(VL)的LCDR3亲和力成熟化，以进一步增加对人和食蟹猴CD3的亲和力和特异性并改善功能活性。
因此，对几百个克隆进行了亲和力筛选。在体外试验中严格测试了功能性，包括例如
·HER2 x CD3双特异性抗体构建体中，与人T细胞和内源性表达CD3的Jurkat细胞和无CD3表达的J.RT-T3.5细胞的结合。
·HER2 x CD3双特异性抗体构建体中的功能性NFAT报告基因测定。
·HER2 x CD3双特异性构建体中的功能性细胞毒性试验。
在这些研究中，7个最有前途的MAB-1亲和力成熟化变体在其是否适合于CyCAT形式方面被进一步表征。
实施例3：鉴定适用于CyCAT形式的改进的全人CD3特异性抗体
为了确定新鉴定的亲和力成熟化的CD3特异性人抗体用于CyCAT形式中的适用性，将亲本MAB-1的VH和VL结构域或其亲和力成熟化的变体以及某些CD3特异性参考现有技术抗体克隆到CyCAT形式的多肽组中。
如本文所示，CyCAT形式的两个多肽组中的每一个多肽由对癌症靶标HER2具有特异性的抗体Fab片段和目的抗CD3抗体的VL或VH结构域组成。Fab部分与VL或VH结构域之间的融合分别通过Fab重链的C端和CD3特异性VH或VL结构域的N端之间的短肽接头实现。
对于HER2结合，使用了Baselga等人1998,Cancer Res 58(13):2825-2831)所述的编码“曲妥珠单抗(Trastuzumab)”
Figure BDA0004140269250000891
VH和VL结构域的核苷酸序列。曲妥珠单抗及其制备方法描述于US 5821337中。
根据本文所述的实施例生产的携带改进的CD3特异性VH或VL结构域的所产生的CyCAT多肽的蛋白质序列的总结列于表6-7中。
基因合成
所有核酸序列或所需的基因片段要么通过PCR使用合适的模板生成，要么作为具有合适侧翼区域(例如合适的限制性酶识别位点、接头序列)的线性DNA片段在内部或由外部提供者进行基因合成。使用标准的分子生物学方法，将侧翼带有单一限制性内切酶切割位点的核酸序列或基因片段克隆到各自的哺乳动物表达载体中。当打算用于哺乳动物表达载体时，所有构建体都设计有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽将蛋白指向为在真核细胞中分泌。亚克隆基因片段的DNA序列通过双链测序通过DNA确认。
实施例4:CyCAT多肽的重组生产
为了表达CyCAT多肽，用编码CyCAT多肽的所有组分的哺乳动物表达载体转染指数生长的真核细胞HEK293-6E细胞，得到多肽的1∶1异二聚体，所述多肽分别包含与目的CD3抗体的VH或VL结构域融合的曲妥珠单抗Fab重链和曲妥珠单抗的Fab轻链。
转染后第6天收获细胞培养上清液，并进行抗CH1亲和层析(Capture Select IgG-CH1 or CH1-XL│ThermoFisher Scientific)。用1x Dulbcecco的PBS(pH 7.2│Invitrogen)进行缓冲液交换，并对样品进行无菌过滤(0.2μm孔径)。通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并使用CE-SDS(LabChip GX Touch│Perkin Elmer│USA)在变性、还原和非还原条件下分析构建体的纯度。进行UHP-SEC以分析天然状态下单个未配对的CyCAT多肽制剂。
结果：
3种CD3特异性现有技术抗体(Ref-MAB-1、Ref-MAB-2、Ref-MAB-3)的VH和VL结构域作为CyCAT多肽产生。Ref-MAB-2、Ref-MAB-3是基于SP34的现有技术抗体并且与食蟹猴CD3交叉反应。Ref-MAB-2在WO2008/119567中首次描述，Ref-MAB-2在WO2019/034580中首次描述。Ref-MAB-1结合CD3中的一个独特的表位，并且不与食蟹猴CD3交叉反应。
此外，新鉴定的亲本全人抗体MAB-1的VH和VL结构域以及7个亲和力成熟化的MAB-1可变结构域被产生作为CyCAT多肽。
哺乳动物产生的CyCAT多肽的质量控制结果汇总在表12中。该数据揭示了CyCAT多肽较强的CD3特异性抗体可变结构域依赖性生产能力。通常，与携带(未配对)CD3特异性VL结构域的多肽相比，携带未配对CD3特异性VH结构域的多肽似乎易于聚集。
总体而言，携带现有技术参考抗体(Ref-MAB-1、Ref-MAB-2、Ref-MAB-3)的CD3特异性VH结构域的CyCAT多肽在单体含量和纯度方面显示出较差的可生产性。令人惊讶的是，新鉴定的亲本CD3特异性人抗体MAB-1的两个可变结构域都可以以可接受的产率(数据未显示)、单体含量和纯度(见表12)作为未配对的CyCAT多肽产生。然而，各自携带MAB-1的亲和力成熟的VH结构域(MAB-2的VH和MAB-3的VH)的两种产生的多肽未能产生，但可以以可接受的方式产生5种携带其他MAB-1的亲和力成熟的VH结构域(MAB-4、MAB-5、MAB-6和MAB-1_25的VH)或MAB-1的亲和力成熟的VL结构域(MAB-1_2的VL)的多肽。
这些结果表明，很难找到能够以CyCAT形式实际产生的合适的CD3特异性可变结构域对。
表12：生产后质量控制汇总：生产的CyCAT多肽的单体含量和杂质
Figure BDA0004140269250000911
*VH亲和力成熟后代与亲本抗体MAB-1具有相同的VL
**VL亲和力成熟后代与亲本抗体MAB-1具有相同的VH
nep＝无法进行评估。
然后，通过将携带CD3特异性抗体的VH的CyCAT多肽与携带CD3特异性抗体的VL的CyCAT多肽组合，进一步表征所生产的携带源自MAB-1的优化的CD3特异性可变结构域的CyCAT多肽在细胞毒性测定中的亲和力和功能活性，如本文在实施例10和实施例11中所述。
在这些研究中，鉴定了一种名为MAB-7的新的改进的人CD3特异性抗体，其包含MAB-1_25的亲和力成熟VH结构域(MAB-1_25_VH(SEQ ID NO:14))和MAB-1_2的亲和力成熟VL结构域(MAB-1_2_VL(SEQ ID NO:17))。
表15(第一行)显示了MAB-7抗体(CyCAT-7)的功能特性概述，并揭示了MAB-7以5nM的KD与人CD3ε结合，当以双特异性CyCAT形式进行测试时，其以在个位数nM范围的IC50值介导对表达HER-2的SW-480结肠癌细胞的高效T细胞杀伤。
实施例5：进一步改进的CD3特异性人抗体的鉴定。
为了在CyCAT形式的亲和力、效力和可生产性方面鉴定进一步改进的MAB-1和MAB-7的人CD3特异性可变结构域，采用了各种策略：
1.使用人和食蟹猴CD3抗原以及表达天然CD3的Jurkat细胞，对MAB-7(MAB-1_2_VL)的可变轻链进行额外的LCDR1+2亲和力成熟。
2.基于下一代测序(NGS)，通过分析实施例2中所述的第一次亲和力成熟活动的完全LCDR3亲和力成熟输出，鉴定亲本抗体MAB-1的新LCDR3变体。
3.基于实施例2中所述的第一次亲和力成熟活动的完全亲和力成熟输出的NGS分析，鉴定亲本MAB-1的新HCDR1+2变体。
在这些研究中，81个在其例如亲和力方面最有希望的克隆作为未配对的CyCAT多肽产生，如实施例4中所述。
实施例6：生产携带实施例5的改进的CD3特异性可变结构域的未配对CyCAT多肽。
在实施例5的81个克隆中，57个亲和力成熟抗体的可变结构域可以成功地作为未配对的CyCAT多肽产生，至少与携带MAB-7的VH结构域(MAB-1_25_VH；(SEQ ID NO:14)或MAB-7的VL结构域(MAB-1_2_VL；(SEQ ID NO:17))的未配对CyCAT多肽一样好。这包括仅8个新鉴定的亲和力成熟VH结构域中的6个。
结果：
总的来说，生产数据表明，CD3特异性可变结构域的CDR中更多量的酸性氨基酸与CyCAT多肽的更好的生产能力相关。表13中显示了所生产的携带亲本MAB-1的13个改进的CD3特异性VL结构域(MAB-1_3_VL至MAB-1_15_VL)和1个改进的VH结构域(MAB-1_24_VH)的CyCAT多肽的质量控制总结。
这些多肽可以高产率生产(数据未显示)，并显示出优异的单体含量和纯度。
特别是，携带MAB-1_24的亲和力成熟VH结构域(MAB-1_24_VH；SEQ ID NO:15)的CyCAT多肽可以以～90％的高单体含量生产，与之前测定的亲代抗体MAB-1的单体含量(仅在80％的范围内)相比，该单体含量显著增加(见表12)。
MAB-1_24_VH通过一种新的合理设计方法独立鉴定，并且是基于H-CDR1+2成熟后100个独特的亲和力筛选命中序列。通过下一代测序分析亲和力成熟的HCDR1+2序列的每个位置的氨基酸频率。对于每个位置，选择与成熟模块设计相比表现出最佳富集的氨基酸残基。如果类似地富集了两种以上氨基酸，则优选酸性氨基酸。
表13：所生产的携带进一步改进的CD3特异性可变结构域的CyCAT多肽的质量控制总结。显示了产生的CyCAT多肽的单体含量和杂质。
Figure BDA0004140269250000931
Figure BDA0004140269250000941
实施例7：表征携带实施例5和6的改进的CD3特异性可变结构域的配对的CyCAT多肽。
通过将52个成功生产的实施例6的CyCAT多肽与携带MAB-7的VH(MAB-1_25_VH(SEQID NO:14))或MAB-7的VL(MAB-1_2_VL(SEQ ID NO:17))的CyCAT多肽组合，进行实施例10所述的亲和力测定和实施例11中所述的功能测试。
这些研究结果鉴定了源自实施例6的MAB-1或MAB-7的13个改进的和最优选的CD3特异性VL结构域和1个CD3特异性VH结构域(如表13所总结)。
表15总结了CD3特异性VL和VH结构域优选组合的功能特征概述，并揭示了根据本公开新鉴定的CD3特异性抗体以5nM以下的KD与人CD3ε结合，并以CyCAT形式以主要在次纳摩尔范围的IC50值介导对SW-480结肠癌细胞的高效T细胞杀伤。
在这些VH/VL组合中，选择MAB-7、MAB-8、MAB-9、MAB-12、MAB-13和MAB-16作为CD3特异性前导抗体，用于T细胞结合的多特异性抗体形式。
实施例8：生产携带MAB-1或MAB-7的进一步改进的CD3特异性可变结构域的未配对CyCAT多肽。
作为优化的最后一步，通过将MAB-7的最佳LCDR1+2亲和力成熟变体的LCDR1+2序列(见表13)与MAB-1_14_VL的LCDR3序列(SEQ ID NO:29)组合，产生了8个交叉克隆。与所使用的亲和成熟模块的设计相比，MAB-1_14_VL如实施例5中所述被鉴定为(编号列表的选项2)中描述的基于LCDR3中特定氨基酸残基的富集的一致序列。然后如实施例4所述制备CyCAT多肽。
结果
表14中显示了所生产的携带8个交叉克隆的进一步改进的CD3特异性VL结构域的CyCAT多肽的质量控制总结。当与携带表15的改进的CD3特异性可变结构域的多肽相比时，这些生产的多肽显示出总体上不太有利的单体含量和生产后更高程度的高分子量杂质。因此，对多肽进行制备型尺寸排阻色谱(Prep-SEC)。Prep-SEC制剂导致CyCAT多肽的单体含量非常高，如表14所示。
表14：制备型尺寸排阻色谱前后，所生产的携带进一步改进的交叉克隆CD3特异性可变轻链结构域的CyCAT多肽的质量控制总结。显示了所生产的CyCAT多肽的单体含量和杂质。
Figure BDA0004140269250000951
nep*＝无法进行评估
实施例9：表征携带实施例8的改进的交叉克隆CD3特异性可变轻链结构域的配对的CyCAT多肽。
通过将实施例8生产的CyCAT多肽与携带MAB-7的VH结构域(MAB-1_25_VH(SEQ IDNO:14))或新鉴定的优化的MAB-1_24的VH结构域(MAB_24_VH(SEQ ID NO:15))的CyCAT多肽组合，进行实施例10所述的亲和力测定和实施例11中所述的功能测试。
表16总结了进一步改进的CD3特异性VL和VH结构域的功能特征概述。该数据表明，包含进一步改进的CD3特异性VL结构域的配对的CyCAT多肽以低于1nM的KD与人CD3ε结合。然而，在CyCAT形式中，没有观察到进一步改善T细胞介导的SW-480结肠癌细胞的杀伤作用(数据未显示)。
实施例10:CyCAT形式的配对的CD3 VH/VL结构域对人CD3ε的亲和力测定
将生产的携带根据本公开的CD3特异性抗体的VH或VL结构域的未配对CyCAT多肽组合，以允许形成配对的和功能性的CD3特异性Fv结构域。一旦两种CyCAT多肽中的每一种通过Fab部分结合到其靶抗原上并且两种多肽非常接近，就会发生CD3特异性VH和VL结构域的功能互补。
方法
在27℃在Octet HTX(FortéBIO,Sartorius AG)仪器上测定配对的VH和VL结构域的KD。
在固定化缓冲液(DPBS，0.05％(v/v)Tween 20)中用纯化的和生物素化的人HER2_his_Avi_bio(ACROBiosystems，HE2-H82E2)装载链霉亲和素涂层的生物传感器(FortéBIO,Sartorius AG)，得到高密度的人HER2传感器表面。然后，将CyCAT多肽在Octet缓冲液(DPBS，0.05％(v/v)Tween-20，0.1％(w/v)BSA)中稀释，并依次注射，直到CyCAT_VH_CD3和CyCAT_VL_CD3分别达到约0.5nm的负载阈值。使用3种不同的人CD3ε(CD3e(1-118)_FLAG_chLys_AVI-bio(MorphoSys AG)(SEQ ID NO:8)浓度(4倍连续稀释，在Octet缓冲液中由120至7.5nM)，300秒缔合时间和720秒解离时间进行动力学测量。在每个解离步骤后，再生传感器以去除结合的CyCAT分子(2x30 s Gly/HCI，pH 1.5)。
所有数据均参考在Octet缓冲液中而非含分析物缓冲液中培养的装载有人HER2_his_Avi_bio的链霉亲和素涂层生物传感器。使用Octet数据分析软件10.0(FortéBIO,Sartorius AG)拟合传感器图，以确定kon和koff速率常数(使用1:1结合模型)，用于计算KD。
结果
表15和表16中提供了测定的优选VH和VL对的对人CD3ε亲和力的总结，并揭示了在一位数纳摩尔至三位数皮摩尔范围内的根据本公开的新鉴定的CD3特异性抗体对人CD3ε的单价亲和力。
正如预期的那样，对浓度高达500nM的CyCAT_MAB-1_24_VH、CyCAT_MAB-1_3_VL、CyCAT_MAB-1_14_VL和CyCAT_MAB-1_16_VL至CyCAT_MAB-1_23_VL的未配对未结合的CyCAT多肽的测试显示，由于缺乏功能性CD3特异性Fv结合片段的形成，未与CD3ε结合。
实施例11：配对CyCAT多肽诱导T细胞介导的癌细胞杀伤
将生产的未配对的CyCAT多肽组合以允许形成包含新形成的CD3特异性Fv结合结构域的CyCAT分子。一旦两种CyCAT多肽中的每一种通过其Fab部分与癌细胞上的靶抗原结合，并且这两种多肽非常接近，CD3特异性VH和VL结构域就会发生功能互补。通过免疫细胞对癌细胞的重定向杀伤是通过新形成的CD3特异性抗体Fv结构域与T细胞的结合介导的。
方法
人T细胞的分离
从健康供体采集人全血，例如在装有Li-肝素的S-Monovette容器(Sarstedt)中。将20mL血液转移到50mL锥形管中，与1mL RosetteSep人CD8+Enrichment Cocktail(Stemcell Technologies，#15063)混合，并在室温下孵育20分钟。将含有RosetteSep人CD8+Enrichment Cocktail的血液用等体积的含有2％胎牛血清(Sigma，#F7524)和2mM EDTA的PBS稀释。将稀释后的血液转移到含有15mL Lymphoprep密度梯度培养基(StemcellTechnologies，#07811)的SepMate-50管(Stemcell Technologies，#85450)中，并在室温下以1200x g离心20分钟。将上清液转移到50mL锥形管中，用含有2％胎牛血清和2mM EDTA的PBS稀释至45mL，并在800x g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮在含有2％胎牛血清的1mL PBS中。将细胞悬浮液合并并转移到50mL管中，并稀释到含有2％胎牛血清的30mL PBS中。通过在800x g下离心5分钟将细胞沉淀。将细胞沉淀重新悬浮在2mL 1x PharmLyse Red Blood Cell裂解缓冲液(BD，#555899)中，并在4℃下孵育10分钟。添加含有2％胎牛血清的PBS至15mL的最终体积。将细胞在120x g下沉淀10分钟，倾析上清液。用含有2％胎牛血清的PBS洗涤细胞两次并计数(CASY TT装置，Beckmann Coulter)。
测定方法
将75000个表达HER-2的SW-480结肠癌细胞(
Figure BDA0004140269250000971
CCL-228TM)悬浮在添加有10％ FCS的培养基中，接种在黑色96孔测定板(Corning)中，并在37℃和5％ CO2和湿度下培养过夜。
CellToxGreen染料(Promega，#G8731)、连续稀释的CyCAT多肽(最终浓度：0.00001-100nM)和纯化的人T细胞(E:T比1:10)或人PBMC(1:30的E:T比)，所有这些都在包含RPMI 1640w/o酚红(Gibco，#32404-14)、GlutaMAX(Gibco 35050-038)和10％胎牛血清的测定培养基中稀释，并添加到细胞中，在37℃、5％ CO2和湿度下孵育48或72小时。
通过使用Tecan Infinite F500装置在485nm激发和535nm发射下测量掺入的CellToxGreen荧光来评估细胞毒活性。
结果
表15总结了携带根据本公开的CD3特异性抗体的新鉴定的可变结构域的所选CyCAT多肽的实验结果。
T细胞与对HER-2和CD3具有特异性的CyCAT多肽的组合的共培养以剂量依赖的方式诱导HER-2阳性SW-480靶细胞的杀伤。正如预期的那样，CyCAT多肽的阴性对照组合没有诱导杀伤活性(数据未显示)。与具有HER-2和CD3特异性的未配对和未结合的CyCAT多肽共培养的T细胞没有诱导HER-2阳性SW480靶细胞的杀伤。在HER-2阴性细胞的存在下，CyCAT多肽的测试HER-2特异性组合均未诱导细胞毒活性(数据未显示)。
这些结果清楚地表明，一旦两种CyCAT多肽通过其Fab部分与癌细胞上的目标抗原结合，并且这两种多肽非常接近，则包含在每个未配对CyCAT多肽中的CD3特异性VH和VL结构域补充到功能性CD3特异性抗体Fv结构域。因此，根据本公开的新鉴定的CD3特异性人抗体可用于各种方法，以有效地将T细胞重定向以杀灭肿瘤表达细胞。
总结根据本公开的新的CD3特异性抗体的亲和力和功能活性。
表15：CD3特异性抗体的亲和力概要(根据实施例5至7)以及对HER2和CD3具有特异性的相应CyCAT分子对癌细胞的重定向T细胞杀伤。
Figure BDA0004140269250000991
/>
Figure BDA0004140269250001001
表16：根据实施例8的具有交叉克隆的可变轻链结构域的CD3特异性抗体的亲和力汇总。
Figure BDA0004140269250001002
*KD限制；解离达到测定极限
实施例12：将新鉴定和优化的CD3特异性VH/VL对重新转化和生产为常规Fab和IgG抗体骨架。
为了确定新鉴定和优化的CD3特异性VH/VL对在常规抗体形式中的适用性，将最优选的VH/VL对(见表17)分别克隆到哺乳动物lgG1f-AEASS(效应子沉默(effector silent))或用于IgG或Fab生产的FabCys表达载体中。
所有核酸序列或期望的基因片段通过PCR使用合适的模板生成，或由内部或外部提供者以具有用于Gibson Assembly的合适侧翼区域(例如合适的限制性酶识别位点和21bp重叠序列)的线性DNA片段的形式进行基因合成。将核酸序列克隆到各自的
Figure BDA0004140269250001011
FabCys哺乳动物表达载体中。
对于IgG表达，编码FabCys载体的抗体可变结构域被酶消化，所得插入物与
Figure BDA0004140269250001012
哺乳动物表达盒连接，并进一步亚克隆到相应的哺乳动物人沉默IgG载体中。
表17：所选优化的CD3特异性人抗体从CyCAT重新转化为Fab-Cys和人IgG1-AEASS形式。
Figure BDA0004140269250001013
表18：根据本公开生产的CD3特异性抗体的人FabCys和人IgG1f-AEASS氨基酸序列。
Figure BDA0004140269250001014
/>
Figure BDA0004140269250001021
/>
Figure BDA0004140269250001031
/>
Figure BDA0004140269250001041
/>
Figure BDA0004140269250001051
IgG的探索性规模生产
用编码IgG重链和轻链的哺乳动物表达载体DNA转染真核HEK293细胞。转染后第3天收获细胞培养上清液，并进行标准蛋白A亲和层析(MabSelect SURE|GE Healthcare)。如果未另行说明，则用1x Dulbcecco的PBS(pH 7.2|Invitrogen)进行缓冲液交换，并对样品进行无菌过滤(0.2μm孔径)。
通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并使用CE-SDS(LabChip GXII|PerkinElmer|USA)在变性、还原和非还原条件下分析IgG的纯度。进行HP-SEC分析天然状态下的IgG制剂。
Taqless FabCys的探索性规模生产
用编码二硫桥FabCys的重链和轻链的哺乳动物表达载体DNA转染真核HEK293细胞。转染后第3天收获细胞培养上清液，并进行CH1亲和层析(Capture Select CH1-XL|Thermo Scientific)。如果未另行说明，则用1x Dulbecco的PBS(pH 7.2|Invitrogen)进行缓冲液交换，并对样品进行无菌过滤(0.2μm孔径)。
通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并使用CE-SDS(LabChip GXII|PerkinElmer|USA)在变性、还原和非还原条件下分析FabCys的纯度。进行HP-SEC分析天然状态下的FabCys制剂。
生产结果：
表19-21总结了哺乳动物产生的FabCys和人lgG1的质量控制。
这些数据表明，抗体可以以可接受的产率、单体含量和纯度生产。对于3个IgG，单体含量测定在85％至90％的范围内。对所有产生的IgG进行制备型尺寸排阻色谱(Prep-SEC)。制备型SEC制剂导致所有产生的IgG的单体含量大于93％，如表21所示。
表19：以单价人FabCys形式生产所选的本公开CD3特异性抗体的生产结果。
Figure BDA0004140269250001061
表20：在制备型尺寸排阻色谱之前，以沉默的二价人lgG1_AEASS形式产生所选的本公开CD3特异性抗体的生产结果。
Figure BDA0004140269250001062
表21：在制备型尺寸排除色谱后，以沉默的人lgG1-AEASS形式产生所选的本公开CD3特异性抗体的生产结果
Figure BDA0004140269250001071
实施例13：通过生物层干涉法(BLI)在人和食蟹猴CD3ε上测定KD
对于KD测定，使用抗体蛋白的单体部分(Fab-Cys)(通过分析型SEC分析，单体含量至少为90％)。在Octet HTX(FortéBIO,Sartorius AG)仪器上通过测定动力学速率常数进行亲和性测定，如下所述。
将在测定缓冲液(D-PBS，0.05％(v/v)PS 20，0.1％(w/v)BSA)中稀释的不同Fab-Cys样品捕获到具有约0.5nm的负载水平的Fab特异性BLI传感器上。为了进行分析，用测定缓冲液将人CD3ε抗原hCD3e(1-118)_F-chLys_avi(SEQ ID NO:7)和食蟹猴CD3ε抗原cyCD3e(1-109)_F-chLys_avi(SEQ ID NO:104)稀释至1.56nM-100nM的浓度。包括一个带有测定缓冲液的空白样品用于参考，即校正捕获抗体的解离。记录300秒的缔合相，随后是900秒的解离相。每个循环后，用pH 1.7的10mM甘氨酸HCl再生生物传感器两次，以去除结合的配体/抗体复合物，同时保持捕获表面的完整性。在再生步骤之间，用测定缓冲液洗涤生物传感器20秒。
使用Octet数据分析软件10.0(FortéBIO,Sartorius AG)拟合传感器图，以确定用于计算KD的kon和koff速率常数(使用1:1结合模型)。
KD测定结果汇总在表22中。新鉴定的CD3特异性抗体在可比范围内表现出与重组人和食蟹猴CD3ε抗原结合的KD值。
表22：哺乳动物产生的FabCys在人和食蟹猴CD3ε抗原上测定的KD值。
Figure BDA0004140269250001072
Figure BDA0004140269250001081
*解离接近捕获设置的测定极限。将低于5E-05 1/s的速率常数设置为该值(即，对于这些样品，解离速率最大为5E-05 1/s)。因此，KD值的形式为灰色斜体，应视为精度较低，但仍可以作为良好的估计值。
实施例14：CD3特异性抗体与人和食蟹猴衍生的PBMC的细胞结合
人和食蟹猴PBMC的分离
健康供体(内部)的人全血和食蟹猴的全血(取自德国汉堡LPT药理学与毒理学实验室)收集在装有Li肝素的S-Monovette容器(Sarstedt)中。将血液转移到50ml锥形管中，并与含有2％胎牛血清(Sigma，#F7524)和2mM EDTA的等体积PBS混合。将稀释的血液转移到含有15ml Biocoll溶液(Biochrom，#L6115)的SepMate-50管(StemCell Technologies，#86450)中，并以1200xg离心10分钟。将上清液转移到50ml锥形管中，用PBS稀释至45ml，并以300xg离心8分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀重新悬浮在1ml PBS中，并使用Neubauer室计数细胞。
细胞结合分析
通过FACS测试根据本公开的CD3特异性FabCys分子和现有技术抗CD3抗体UCHT-1(已知不与食蟹猴CD3交叉反应)的内部制备的FabCys与人和食蟹猴衍生的PBMC结合的能力。
200000个纯化的人或食蟹猴PBMC(分别用内部生产的重组人Fc2-H和山羊抗人IgG(Jackson Immuno Research，#109-005-097)或重组食蟹猴IgG1(R&D Systems，#9315-HG)和小鼠抗猴IgG(Southern Biotech，SB108a)预先阻断)与在含有3％胎牛血清(Sigma，#F7524)的D-PBS(Gibco)中连续稀释的抗体(最终浓度：0.012nM-200nM)混合，并在冰上孵育1小时。使用山羊抗人IgG-AF647(Jackson Immuno Research，#109-606-097)检测结合的抗体。
使用多式流式细胞仪(NovoCyte，Agilent Technologies)测量抗体染色，并使用NovoExpress软件(1.5.0版)进行分析。通过前向和侧向散射的形态学门控来识别淋巴细胞。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.，8.4.3版)中的4参数非线性回归分析计算EC50值。
实验结果如表23所示，并显示新鉴定的CD3特异性抗体与人和食蟹猴PBMC表现出类似的结合。正如预期的，在200nM的浓度下，UCHT-1的对照Fab显示与人结合，但与食蟹猴PBMC没有结合。
表23：CD3特异性FabCys抗体与表达CD3的人和食蟹猴PBMC的细胞结合。所示为EC50值。在200nM的单一浓度下测试对照FabCys UCHT-1。
Figure BDA0004140269250001091
/>
序列表
<110> 莫佛塞斯公司
<120> 与人CD3 ε结合的新型人抗体
<130> MS319/PCT
<140> EP 20197975.4
<141> 2020-09-24
<160> 105
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 207
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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Arg His Ser
85 90 95
His Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asp Tyr Gln Ser Gln His Ala Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Ala Glu Phe Ala His Arg Ser Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asp Tyr Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Ala Glu Phe Ala His Arg Ser Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser
325 330 335
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asp Tyr Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Ala Glu Phe Ala His Arg Ser Gly Leu Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Arg His Ser
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His Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
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Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
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Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
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Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
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Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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<400> 101
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn
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Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Arg His Ser
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Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
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Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
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Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
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Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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<212> PRT
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<400> 102
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Arg His Ser
85 90 95
His Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 103
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 103
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
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Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
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Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
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Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 104
<211> 252
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 104
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
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Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Val Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
85 90 95
Asp Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Ala Met Lys Arg His Gly Leu Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser
115 120 125
Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr
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Gln Ala Thr Asn Arg Asn Thr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Leu
145 150 155 160
Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp Cys Asn Asp Gly Arg Thr Pro Gly Ser
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Thr Ala Ser Val Asn Cys Ala Lys Lys Ile Val Ser Asp Gly Asn Gly
195 200 205
Met Asn Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Lys Gly Thr Asp Val
210 215 220
Gln Ala Trp Ile Arg Gly Cys Arg Leu Val Asn Ser Arg Gly Leu Asn
225 230 235 240
Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
245 250
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 105
Gly Gln Pro Ser Gly
1 5

Claims (15)

1.一种对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFX1SX2X3MX4的氨基酸序列，其中X1是S、K或R；X2是Y或H；X3是W或Y；且X4是S或T(SEQ ID NO:90)；
b)HCDR2区，其包含NIX1X2X3X4X5X6X7YYX8X9SVKG的氨基酸序列，其中X1是K或D；X2是Q或Y；X3是D、Q或E；X4是S或G；X5是S、Q或T；X6是E、H或R；X7是K、A或T；X8是V或A；且X9是D或E(SEQ IDNO:91)；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGX1X2YVY的氨基酸序列，其中X1是S、I、A、K或Q；且X2是N或T(SEQ ID NO:92)；
e)LCDR2区，其包含RNX1X2RPS的氨基酸序列，其中X1是N、K、S、H、T或Y；且X2是Q、I或K(SEQID NO:93)；和
f)LCDR3区，其包含AX1WDX2X3X4X5GAV的氨基酸序列，其中X1是A或G；X2是H或R；X3是H或R；X4是R、S或L；且X5是S或H(SEQ ID NO:94)。
2.根据权利要求1所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)HCDR1区，其包含GFTFSSYWMS(SEQ ID NO:40)、GFTFKSYYMS(SEQ ID NO:41)或GFTFRSHYMT(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列；
b)HCDR2区，其包含NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:43)、NIDYQSQHAYYAESVKG(SEQ IDNO:44)或NIDYEGTRTYYAESVKG(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列；
c)HCDR3区，其包含GYSAEFAHRSGLDV(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列；
d)LCDR1区，其包含SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO:46)、SGSSSNIGINYVY(SEQ ID NO:47)、SGSSSNIGANYVY(SEQ ID NO:48)、SGSSSNIGQTYVY(SEQ ID NO:49)或SGSSSNIGKNYVY(SEQ IDNO:50)的氨基酸序列；
e)LCDR2区，其包含RNNQRPS(SEQ ID NO:51)、RNNIRPS(SEQ ID NO:52)、RNNKRPS(SEQID NO:53)、RNKKRPS(SEQ ID NO:54)、RNKQRPS(SEQ ID NO:55)、RNSQRPS(SEQ ID NO:56)、RNHIRPS(SEQ ID NO:57)、RNTQRPS(SEQ ID NO:58)或RNYQRPS(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列；和
f)LCDR3区，其包含AAWDHHRSGAV(SEQ ID NO:60)、AAWDRHSHGAV(SEQ ID NO:61)或AGWDRRLHGAV(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括：
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和
b)可变轻链(VL)，其包含选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述可变重链和可变轻链选自：
a)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL，
c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
e)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
f)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
g)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
h)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
j)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
k)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
l)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
m)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
n)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
o)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
p)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
q)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
r)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL，
s)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
t)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
u)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
v)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
w)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
x)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，
y)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL，
z)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL，
aa)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL，
bb)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL，
cc)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL，
dd)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL，
ee)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL，
ff)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL，
gg)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL，
hh)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL，
ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，
jj)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL，
kk)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL，
ll)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VL，
mm)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL，
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oo)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL，
pp)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL，
qq)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL，
rr)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL，
ss)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL，
tt)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL，和
uu)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。
7.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段与食蟹猴CD3ε交叉反应性结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。
9.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。
10.根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fv和scFv。
11.根据权利要求1～9所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段，其中所述抗体是IgG。
12.一种多特异性抗体，其包含根据前述权利要求中任一项所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段。
13.根据权利要求12所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体还特异性结合癌症相关抗原。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1～11所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段或根据权利要求12～13所述的多特异性抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.根据权利要求1～11所述的对人CD3ε特异性的分离的人抗体或抗体片段、根据权利要求12～13所述的多特异性抗体或根据权利要求13所述的药物组合物用作药物。
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