PT1846451E - Membros de ligação específica para ngf - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANOS CONTRA NGF HUMANO" A presente invenção refere-se a membros de ligação especifica, em particular moléculas de anticorpo anti-NGF, especialmente moléculas de anticorpo humano, e especialmente aquelas que neutralizam a atividade de NGF (Fator de Crescimento Neuronal). Além disso refere-se a métodos para utilizar moléculas de anticorpo anti-NGF no diagnóstico ou tratamento de distúrbios relacionados com NGF, incluindo dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das vias respiratórias, neuropatia diabética, arritmias cardíacas, HIV, artrite, psoriase e cancro. A presente invenção põe à disposição moléculas de anticorpo de particular importância na ligação e neutralização de NGF, e assim para utilização numa variedade de tratamentos terapêuticos, como indicado pelas experiências contidas aqui e também pela literatura técnica de apoio. 0 fator de crescimento neuronal (β-NGF), geralmente conhecido como NGF) tem um papel bem conhecido essencial no desenvolvimento do sistema nervoso. No adulto, no entanto, NGF tem um papel mais restrito, em que promove a saúde e a sobrevivência de um subgrupo de neurónios centrais e periféricos (Huang & Reichardt, 2001). NGF também contribui para a modulação das caraterísticas funcionais destes neurónios. No âmbito deste último processo, NGF exerce controlo tónico sobre a sensitividade, ou excitabilidade, de nociceptores (Priestley et al., 2002; Bennett, 2001). Estes neurónios periféricos percecionam e transmitem ao sistema nervoso central os vários estímulos nocivos que dão 2 origem às perceções de dor (nocicepção). Assim, agentes que reduzem os niveis de NGF podem ter utilidade como terapêutica analgésica. 0 custo na sociedade de dor tratada inadequadamente além disso comprova a utilidade potencial de analgésicos baseados na atividade anti-NGF. Isto é, apesar da existência e larga utilização de numerosas medicações para a dor, existe uma clara necessidade de novos analgésicos. A dor é um dos sintomas mais comuns para o qual é procurada assistência médica e é a principal queixa de metade de todos os doentes que vão ao médico. 0 elevado custo da dor na sociedade está bem documentado. Nos EUA, por exemplo, a dor crónica afeta alguns 34 milhões de americanos. A dor resulta em 50 milhões de dias de trabalho perdidos por ano. Custos médicos diretos atribuídos à dor de costas, dor da artrite, e enxaquecas, ascendem aos $40 mil milhões anualmente, por si só. O mercado total da medicação prescrita para a dor é aproximadamente $15 mil milhões por ano (Pleuvry & Pleuvry).

Como é implícito destas estatísticas, uma percentagem substancial de sofredores de dor não recebem adequado alívio da dor. Como consequência, continua a existir uma grande necessidade médica de analgésicos seguros e efetivos com um novo mecanismo de ação (Pleuvry & Pleuvry).

Agentes terapêuticos que reduzem os níveis no tecido ou inibem os efeitos de NGF secretado, têm o potencial de serem justamente tais novos analgésicos. Injeções subcutâneas de NGF por si só produzem dor em humanos e animais. Assim NGF injetado causa uma rápida hiperalgesia térmica, seguida por hiperalgesia térmica tardia e alodinia mecânica (Petty et al., 1994; McArthur et al., 2000). NGF secretado endogenamente é de forma similar pró-nociceptivo. 3 A libertação de NGF induzida por lesão tecidual e a sua ação subsequente na periferia tem um papel importante na indução de hiperalgesia térmica através do processo de "sensibilização periférica" (Mendell & Arvanian, 2002) . A lesão tecidual promove a libertação de citoquinas pró-nociceptivas e pró-inflamatórias, as quais por seu lado induzem a libertação de NGF de queratinócitos e fibroblastos. Este NGF libertado age diretamente nos nociceptores induzindo estados dolorosos ou nociceptivos no espaço de minutos da lesão nociva. Este NGF também age indiretamente induzindo e mantendo estados nociceptivos/dolorosos. Ele despoleta a desgranulação de mastócitos, libertando agentes pró-nociceptivos tais como histamina e serotonina e, mais importante, mais NGF, e pode também estimular os terminais nervosos simpáticos para libertarem neurotransmissores pró-nociceptivos, tais como noradrenalina (Ma & Woolf, 1997).

Os niveis teciduais de NGF estão elevados em animais injetados com CFA e carragenina (Ma & Woolf, 1997; Amann & Schuligoi, 2000). Além disso, têm sido documentados niveis aumentados de NGF em doentes com artrite reumatóide (Aloe & Tuveri, 1997) ou cistite (Lowe et al., 1997). Em roedores, a lesão nervosa periférica aumenta a expressão de mRNA NGF em macrófagos, fibroblastos, e células de Schwann (Heumann et al., 1987). A superexpressão de NGF em ratinhos transgénicos resulta em comportamento de dor neuropática aumentada a seguir a lesão nervosa maior do que em ratinhos do tipo selvagem (Ramer et al., 1998) . Ao longo de horas e dias, niveis de NGF elevados têm um papel na promoção de 'sensibilização central' - a intensificação da neurotransmissão nas sinapses nas vias nociceptivas da espinal medula. A sensibilização central resulta em hiperalgesia e alodinia persistente e crónica. Pensa-se que este processo envolva a internalização de complexos NGF e o 4 seu recetor de alta afinidade, trkA (recetor tirosina quinase A) . 0 transporte retrógrado destes complexos para os corpos celulares nociceptores nos gânglios das raizes dorsais (DRG) potência a secreção dos neuropeptideos nociceptivos (p.ex., substância P, CGRP), ativação de PKC, e ativação do recetor NMDA no corno dorsal da espinal medula (Sah et al., 2003) - todos processos que promovem a sensibilização das vias nociceptivas. NGF também tem um papel na regulação positiva e redistribuição de canais de iões dependentes de voltagem e regulados por ligante, incluindo os subtipos dos canais de sódio e o recetor da capsaicina, VRl (Mamet et al., 1999; Fjell et al., 1999; Priestley et al., 2002). As atividades alteradas e/ou expressão de transmissores, recetores, e canais de iões estão subjacentes à sensitividade e excitabilidade aumentada de nociceptores associados com estados de dor neuropática. NGF também pode promover o aumento de ramificações de neurónios simpáticos e a formação de inervação aberrante de neurónios nociceptivos. Pensa-se que esta inervação contribui para a indução e manutenção de estados nociceptivos/dolorosos crónicos, tais como dor mantida pelo sistema simpático, ou sindrome doloroso regional complexo (Ramer et al., 1999). A nocicepção/dor induzida por NGF é mediada pelo recetor de NGF de alta afinidade, trkA (recetor tirosina quinase A) (Sah, et al., 2003). Cerca de 40 - 45% dos corpos celulares nociceptores em DRGs expressam trkA. Estes são os corpos celulares das fibras de pequeno diâmetro, ou fibras C, que também expressam os peptídeos pró-nociceptivos secretados, substância P e CGRP. Estas fibras terminam na lâmina I e II do corno dorsal, onde elas transferem para o sistema 5 nervoso central o estímulo nocivo percecionado pelos nociceptores periféricos. Mutações ou deleções no gene trkA produzem um fenótipo caraterizado pela falta de sensação de dor tanto em humanos (Indo, 2002) como em ratinhos com o gene trkA inativado (de Castro et al., 1998). De maneira significativa, a expressão de trkA é regulada positivamente em animais sujeitos a modelos de dor da artrite (Pozza et al., 2000) ou dor da cistite (Qiao & Vizzard, 2002), ou a dor inflamatória induzida pela injeção de adjuvante completo de Freund(CFA) ou carragenina na pata (Cho et al., 1996). NGF também se liga ao recetor das neurotrof inas p7 5. O papel do recetor p75 é dependente do seu meio celular e da presença de outros recetores com os quais se crê que tem uma função acessória ou de coreceptor. A interação entre os recetores trkA e p75 resulta na formação de locais de ligação de alta afinidade para NGF. A importância de tais interações de recetores na sinalização da dor mediada por NGF não é clara, mas estudos recentes implicaram o recetor p75 em processos celulares que podem ser relevantes (Zhang & Nicol, 2004). No entanto, enquanto o ratinho com o gene do recetor p75 inativado apresenta limiares elevados para estímulos nocivos, eles permanecem reativos aos efeitos hiperalgésicos de NGF, sugerindo que os recetores trkA por si só são suficientes para mediar estes efeitos (Bergmann et al., 1998). indicados como A evidência citada anteriormente indica que os processos mediados por NGF são responsáveis pela indução de dor aguda, dor a curto prazo, dor nociceptiva persistente, e dor neuropática persistente ou crónica. Assim, agentes anti-NGF são indicados como tendo utilidade como 6 analgésicos efetivos para tratar sofredores de qualquer ou de todos estes variados estados de dor.

Um tal agente anti-NGF é trkA-Fc, que age como um engodo ou sequestrante da ligação, e desta forma inativa, NGF endógeno. TrkA-Fc é uma proteína de fusão consistindo na região de ligação ao NGF de trkA ligado a um fragmento com domínio constante (Fc) de um anticorpo IgG. TrkA-Fc produz hipoalgesia em animais sem tratamento prévio, diminui as respostas nociceptoras, e diminui o aumento de ramificações de neurónios que percecionam a dor sem mielina (Bennett et al., 1998).

Antissoro criado contra NGF também pode reduzir os níveis de NGF quando injetado localmente ou sistemicamente. Tanto o antissoro anti-NGF como o trkA-Fc atenuam a dor inflamatória da pata induzida por carragenina - ou CFA (Koltzenberg et al., 1999) e respostas da bexiga inflamada em ratos (Jaggar et al., 1999). 0 antissoro anti-NGF bloqueia a hiperalgesia provocada por calor e frio, reverte a hiperalgesia térmica instalada, e previne o aumento de ramificações colaterais no modelo de lesão por constrição crónica (CCI) de dor neuropática (Woolf, 1996; Ro et al., 1999). Também têm sido reportadas pequenas moléculas inibidoras da interação trkA-NGF. Em ratos, o inibidor de NGF-trkA ALE-0540 reduz a hiperalgesia num modelo de dor inflamatória induzida termicamente e no teste formalina de dor aguda e persistente (Owolabi et al., 1999). ALE-0540 também reduz a alodinia mecânica no modelo de lesão do nervo ciático de dor neuropática (Owolabi et al., 1999).

Anticorpos terapêuticos em geral representam a promessa de um grau de seletividade do alvo dentro de uma família de recetores estreitamente relacionados entre si, ligantes de 7 recetores, canais, ou enzimas que é raramente obtido com fármacos de pequenas moléculas. A dor mediada por NGF é particularmente apropriada para tratamento seguro e efetivo com anticorpos porque os niveis de NGF aumentam na periferia em resposta ao estimulo nocivo e os anticorpos têm uma baixa permeabilidade na barreira hematoencefálica. Apesar de se ter verificado que os anticorpos policlonais são efetivos em modelos de dor em animais, os anticorpos monoclonais anti-NGF são mais prováveis de serem desenvolvidos com êxito como terapêutica humana devido às vantagens no fabrico e na caraterização de uma entidade quimica, consistente, bem definida. Foram reportados efeitos anti-nociceptivos de anticorpos monoclonais anti-NGF de ratinhos (Sammons et al., 2000), mas as sequências de aminoácidos destes anticorpos não foram providenciadas.

Evidência recente sugere que NGF promove outras patologias além da dor. Assim, anticorpos anti-NGF podem também ter utilidade no tratamento de outras doenças mediadas por NGF, incluindo, mas não limitado a asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das vias aéreas (Hoyle, 2003; Lommatzch et ai., 2003), neuropatia diabética (Yasuda et al., 2003), arritmias cardíacas (WO04/032852), HIV (Garaci et ai., 2003), artrite, psoríase e cancro (Nakagawara, 2001). A WO02/096458 refere-se a anticorpos anti-NGF, em particular o anticorpo monoclonal de ratinho 911, e a utilização de tais anticorpos no tratamento de vários distúrbios relacionados com NGF, incluindo dor, asma, artrite e psoríase. Ela afirma que o anticorpo 911 não teve nenhum efeito adverso no sistema imunitário num modelo de ratinho experimental de alergia. Estes anticorpos também foram descritos por Hongo et al., 2000. 8 W004/032870 descreve o efeito de redução de dor do anticorpo monoclonal de ratinho para NGF mab 911 e do anticorpo humanizado para NGF E3 em modelos experimentais de dor pós-cirúrgica. E3 difere da região constante gamma2a da cadeia pesada humana em 2 aminoácidos. WO04/03285 descreve métodos para prevenir morte súbita cardíaca e para o tratamento de arritmias cardíacas utilizando antagonistas NGF. WO 01/78698 descreve a utilização de antissoro policlonal para NGF para tratar dor visceral crónica. A presente invenção põe à disposição membros de ligação específica de NGF, de acordo com as reivindicações anexadas. Um membro de ligação específica, da invenção, pode ligar-se a NGF humano ou a NGF não humano (p.ex. NGF primata não humano e/ou NGF de rato e/ou NGF de ratinho).

Membros de ligação específica, da invenção, podem ser anticorpos para NGF humano, especialmente anticorpos humanos, que podem ter reatividade cruzada com NGF não humano, incluindo NGF primata não humano e/ou NGF de ratinho e/ou NGF de rato.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção preferivelmente neutraliza NGF. Neutralização significa redução ou inibição da atividade biológica de NGF, p.ex. reduzindo ou inibindo a ligação de NGF a um ou mais dos seus recetores (preferivelmente TrkA). A redução da atividade biológica pode ser parcial ou total. O grau com que um anticorpo neutraliza NGF é referido como a sua potência de neutralização. A potência pode ser determinada ou medida utilizando um ou mais ensaios conhecidos pelo perito e/ou como descrito ou referido aqui, por exemplo: 9 - ensaio de mobilização de cálcio "FLIPR" (ver Exemplo 2 aqui referido) ensaio de sobrevivência PC12 (ver Exemplo 5 aqui referido) - ensaio de proliferação TF-1 (ver Exemplo 6 aqui referido) - Ensaio de inibição da ligação ao recetor (ver Exemplo 9 aqui referido). Ensaios e potências são descritos em mais detalhe aqui noutra parte.

Membros de ligação especifica, da presente invenção, podem ser otimizados relativamente à sua potência de neutralização. Em geral a otimização da potência envolve fazer a mutação da sequência de um membro de ligação especifica selecionado (normalmente a sequência do domínio variável de um anticorpo) para gerar uma biblioteca de membros de ligação específica, os quais são então submetidos a ensaios para determinar a potência e os membros de ligação específica mais potentes são selecionados. Assim os membros de ligação específica com "potência-otimizada" selecionados tendem a ter uma potência mais elevada do que o membro de ligação específica a partir do qual foi gerada a biblioteca. No entanto, membros de ligação específica com elevada potência também podem ser obtidos sem otimização, por exemplo um membro de ligação específica de elevada potência pode ser obtido diretamente de um rastreio inicial p.ex. um ensaio de neutralização bioquímico. A presente invenção põe à disposição ambos os membros de ligação específica com potência-otimizada e não otimizada, assim como métodos para otimização da potência de um membro de ligação específica selecionado. A presente invenção permite assim ao perito gerar membros de ligação específica com elevada potência. 10

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção preferivelmente exibe atividade antihiperalgésica e/ou antialodinia, p.ex. inibe a hiperalgesia térmica induzida por carragenina.

Em algumas formas de realização, um membro de ligação específica, da invenção, compreende uma molécula de anticorpo. em vários aspetos e formas de o objeto das reivindicações

Está posto à disposição realização da invenção incluídas abaixo.

Formas de realização da presente invenção são moléculas de anticorpo, seja anticorpo completo (p.ex. IgG, tal como IgG4) ou fragmentos de anticorpo (p.ex. scFv, Fab) . Preferivelmente, uma molécula de anticorpo da invenção é uma molécula de anticorpo humana. São providenciadas moléculas de anticorpo compreendendo locais de ligação no anticorpo aos antigénios, como domínios VH e VL no anticorpo. Nos domínios VH e VL são providenciadas regiões determinantes da complementariedade, ("CDRs"), e regiões de framework, ("FRs"), para formar domínios VH ou VL conforme o caso. Um local de ligação no anticorpo aos antigénios pode consistir num domínio VH e/ou num domínio VL no anticorpo. Todas as sequências VH e VL, sequências CDR, grupos de CDRs e grupos de HCDRs e grupos de LCDRs divulgados aqui representam aspetos e formas de realização da invenção. Um "grupo de CDRs" compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Assim, um grupo de HCDRs significa HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e um grupo de LCDRs significa LCDR1, LCDR2 e LCDR3. A não ser que indicado de outra forma, um "grupo de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs. 11

Exemplos de domínios VH e VL no anticorpo e CDRs de acordo com a presente invenção são como os listados na listagem de sequências em apêndice. São divulgados aqui um número de linhagens de anticorpos, definidos com referência às sequências, p.ex. um grupo de sequências CDR, opcionalmente com uma ou mais, p.ex. uma ou duas, ou duas substituições. A linhagem parental preferida é a linhagem 1021E5. A linhagem 1021E5 inclui a molécula de anticorpo preferida 1133C11 e outras moléculas de anticorpo da "linhagem 1133C11", incluindo 1252A5. Também na linhagem parental 1021E5 estão as moléculas de anticorpo 1165D4, 1230H7 e 1152H5. Os presentes inventores identificaram as linhagens 1021E5, 1083H4 e especialmente a 1133C11 como providenciando locais de ligação no anticorpo humano aos antigénios contra NGF que são de particular importância. A linhagem 1133C11 é definida com referência a um grupo de seis sequências CDR de 1133C11 com se segue: HCDR1 SEQ ID N°: 193, HCDR2 SEQ ID N°: 194, HCDR3 SEQ ID N°: 195, LCDR1 SEQ ID N° : 198, LCDR2 SEQ ID N° : 199, e LCDR3 SEQ ID N° : 200. 0 grupo de CDRs em que 0 HCDR1 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 193, o HCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 194, 0 HCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 195, 0 LCDR1 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 198, 0 LCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 199, e o LCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 200, é aqui referido como o "1133C11 grupo de CDRs". O HCDR1, HCDR2 e HCDR3 no 1133C11 grupo de CDRs são referidos como o "1133C11 grupo de HCDRs" e o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 no 1133C11 grupo de CDRs são referidos como "1133C11 grupo de LCDRs". Um grupo de CDRs com o 1133C11 grupo de CDRs, 1133C11 grupo de HCDRs ou 1133C11 LCDRs, ou uma ou duas substituições nelas, é referido como sendo da linhagem 1133C11. 12

Outras linhagens preferidas e grupos de CDRs são definidos com referência aos CDRs análogos como definido aqui noutra parte, incluindo como formas de execução os grupos de CDRs divulgados na Tabela 2a (com SEQ ID N°s como definido na tabela 2b). A tabela 2a e a tabela 2b apresentam grupos de CDRs (HCDRs e LCDRs) de clones otimizados derivados do clone 1021E5, ilustrando como as sequências de CDR dos clones otimizados diferem daqueles de 1021E5. Um grupo de CDRs da Tabela 2a/2b inclui um grupo de HCDRs e/ou um grupo de LCDRs de qualquer clone ilustrado na Tabela, opcionalmente incluindo o próprio 1021E5. São providenciados grupos de CDRs destes, como indicado, assim como são grupos de CDRs com as sequências divulgadas contendo uma ou duas substituições de aminoácidos. A presente invenção também providencia membros de ligação especifica e moléculas de anticorpo compreendendo os definidos grupos de CDRs, grupos de HCDRs ou grupos de LCDRs, como divulgado aqui, e grupos de CDRs com uma ou duas substituições dentro do grupo divulgado de CDRs. 0 grupo de CDRs relevante é providenciado dentro de um framework de anticorpo. Por exemplo, um ou mais CDRs ou um grupo de CDRs de um anticorpo pode ser enxertado num framework (p.ex. framework humano) para providenciar uma molécula de anticorpo ou diferentes moléculas de anticorpo. Por exemplo, uma molécula de anticorpo pode compreender CDRs de um anticorpo da linhagem 1021E5 e regiões framework de sequências de segmento do gene da linha germinal humana. Um anticorpo de uma linhagem pode ser providenciado com um grupo de CDRs dentro de um framework que pode ser sujeito a "germlining", em que um ou mais residuos dentro do framework são alterados para coincidir com os residuos na posição equivalente no framework humano da linha germinal mais similar (p.ex. DP10 da familia VH1) ou um framework da 13 família λΐ p.ex. DPL5. Assim, regiões do framework do anticorpo são preferivelmente da linha germinal e/ou humanas. A invenção providencia um anticorpo humano isolado específico para NGF, com um domínio VH compreendendo um grupo de HCDRs num framework humano da linha germinal compreendendo DP10. 0 membro de ligação específica tem também um domínio VL compreendendo um grupo de LCDRs, preferivelmente num framework humano da linha germinal compreendendo um VXl, p.ex. DPL5. Preferivelmente, os CDRs são um grupo de CDRs divulgado aqui.

Por "substancialmente como definido" significa que o CDR relevante ou domínio VH ou VL da invenção irá ser ou idêntico ou altamente similar às regiões especificadas, das quais as sequências são definidas aqui. Por "altamente similar" é contemplado que 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 tal como 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos podem ser feitas no CDR e/ou domínio VH ou VL.

Num aspeto, a presente invenção providencia um membro de ligação específica para NGF, compreendendo um local de ligação no anticorpo ao antigénio que é composto por um domínio VH do anticorpo humano e um domínio VL do anticorpo humano e que compreende um grupo de CDRs, em que o domínio VH compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e 0 domínio VL compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 , em que 0 HCDRl tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 193, 0 HCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 194, 0 HCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 195, 0 LCDR1 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 198, o LCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 199, e o LCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 200; ou em que o grupo de CDRs contém uma ou duas substituições de aminoácidos em 14 comparação com este grupo de CDRs, em que a uma ou duas substituições de aminoácidos são um ou dois dos seguintes resíduos dentro dos CDRs dos domínios VH e/ou VL, utilizando a numeração padrão de Kabat (1991). 31, 34 em HCDR1 51, 55, 56, 57, 58, 65 em HCDR2 96 em HCDR3 26, 27, 27A, 27B, 28, 29, 30 em LCDR1 56 em LCDR2 90, 94 em LCDR3.

Em formas de realização preferidas são feitas uma ou duas substituições em um ou dois dos seguintes resíduos dentro do 1133C11 grupo de CDRs de acordo com os grupos identificados de possíveis resíduos substitutos:

Posição da substituição Resíduo substituto selecionado do grupo constituído por 31 em HCDR1: A 34 em HCDR1: V 51 em HCDR2: V 55 em HCDR2: N 56 em HCDR2: A 57 em HCDR2: V 58 em HCDR2: S 65 em HCDR2: D 96 em HCDR3: N 26 em LCDR1: T 26 em LCDR1: G 27 em LCDR1: N 27 em LCDR1: R 27A em LCDR1: T 27A em LCDRl: P 15 27B em LCDR1: D 28 em LCDR1: T 29 em LCDR1: E 30 em LCDR1: D 56 em LCDR2: T 90 em LCDR3: A 94 em LCDR3: G. 0 resíduo 29Ε dentro do LCDR1 é uma forma de realização particularmente preferida.

Formas de realização preferidas têm 1133C11 ou 1252A5, 1152H5, 1165D4, ou 1230H7 grupo de CDRs.

Numa forma de execução um membro de ligação específica isolado compreende um grupo de CDRs que contém o 1133C11 grupo de CDRs com a sequência de aminoácidos FNSALIS (SEQ ID N°: 532) ou a sequência de aminoácidos MISSLQP (SEQ ID N°: 533), substituída pela sequência de aminoácidos LNPSLTA (SEQ ID N°: 531) dentro do HCDR3.

Um domínio VH pode ser providenciado com um grupo de HCDRs como ilustrado na Tabela 2a/2b. 0 domínio VH é emparelhado com um domínio VL, o domínio VL pode ser providenciado com um grupo de LCDRs como ilustrado na Tabela 2a/2b. Um emparelhamento de um grupo de HCDRs e um grupo de LCDRs pode ser como apresentado na Tabela 2a/2b, providenciando um local de ligação no anticorpo ao antigénio compreendendo um grupo de CDRs como apresentado na Tabela 2a/2b.

Os frameworks do domínio VH e VL compreendem regiões de framework, uma ou mais das quais podem ser uma região framework de uma linha germinal, normalmente linha germinal humana. 0 framework do domínio VH é preferivelmente o framework da linha germinal de cadeia pesada humana e o 16 framework do domínio VL é preferivelmente o framework da linha germinal de cadeia leve humana. Regiões do framework do domínio da cadeia pesada podem ser selecionadas da família VH-1, e um framework VH-1 preferido é um DP-10 framework. Regiões do framework da cadeia leve podem ser selecionadas da família λΐ, e um framework preferido é DPL5.

Um ou mais CDRs podem ser tirados do domínio 1252A5 VH ou VL e incorporados num framework apropriado. Isto ainda é mais discutido aqui. 1252A5 HCDRs 1, 2 e 3 são apresentadas nas SEQ ID N° : 393, 394, 395 respetivamente. 1252A5 LCDRs 1, 2 e 3 são apresentadas nas SEQ ID N°: 398, 399, 400, respetivamente.

Isto tudo aplica-se da mesma forma para outros CDRs e grupos de CDRs como divulgado aqui, especialmente para 1152H5, 1165D4 e 1230H7.

As sequências de anticorpo divulgadas aqui incluem o seguinte:

Um domínio VH, domínio VL, grupo de HCDRs, grupo de LCDRs, ou grupo de CDRs de : 1126F1 (VH SEQ ID N°: 102; VL SEQ ID N° : 107), 1126G5 (VH SEQ ID N° : 112; VL SEQ ID N° : 117), 1126H5 (VH SEQ ID N° : 122; VL SEQ ID N° : 127), 1127D9 (VH SEQ ID N° : 132; VL SEQ ID N° : 137), 1127F9 (VH SEQ ID N° : 142; VL SEQ ID N°: 147), 1131D7 (VH SEQ ID N°: 152; VL SEQ ID N° : 157), 1131H2 (VH SEQ ID N°: 162; VL SEQ ID N°: 167), 1132A9 (VH SEQ ID N° : 172; VL SEQ ID N° : 177), 1132H9 (VH SEQ ID N°: 182; VL SEQ ID N°: 187), 1133C11 (VH SEQ ID N°; 192; VL SEQ ID N°: 197), 1134D9 (VH SEQ ID N°; 202; VL SEQ ID N° : 207), 1145D1 (VH SEQ ID N°: 212; VL SEQ ID N°: 217), 1146D7 (VH SEQ ID N° : 222; VL SEQ ID N° : 227), 1147D2 (VH SEQ ID N° : 232; VL SEQ ID N°: 237), 1147G9 (VH SEQ ID N° : 17 242; VL SEQ ID N°: 247), 1150F1 (VH SEQ ID N° : 252; VL SEQ ID N° : 257), 1152H5 (VH SEQ ID N°: 262; VL SEQ ID N°: 267), 1155H1 (VH SEQ ID N° : 272; VL SEQ ID N°: 277), 1158A1 (VH SEQ ID N°: 282; VL SEQ ID N°: 287), 1160E3 (VH SEQ ID N° : 292; VL SEQ ID N°: 297), 1165D4 (VH SEQ ID N° : 302; VL SEQ ID N°: 307), 1175H8 (VH SEQ ID N° : 312; VL SEQ ID N°: 317), 1211G10 (VH SEQ ID N°: 322; VL SEQ ID N°: 327), 1214A1 (VH SEQ ID N°: 332; VL SEQ ID N°: 337), 1214D10 (VH SEQ ID N°: 342; VL SEQ ID N°: 347), 1218H5 (VH SEQ ID N°: 352; VL SEQ ID N° : 357), 1230H7 (VH SEQ ID N°: 362; VL SEQ ID N°: 367), 1083H4 (VH SEQ ID N°: 22; VL SEQ ID N°: 27), 1227H8 (VH SEQ ID N°: 372; VL SEQ ID N°: 377) e 1230D8 (VH SEQ ID N°: 382; VL SEQ ID N°: 387).

Numa forma de realização altamente preferida, um dominio VH é providenciado com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 192, sendo isto denominado "1133C11 domínio VH". Numa outra forma de realização altamente preferida, um domínio VL é providenciado com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 197, sendo isto denominado "1133C11 domínio VL ". Um local de ligação no anticorpo ao antigénio altamente preferido providenciado de acordo com a presente invenção é composto pelo 1133C11 domínio VH, SEQ ID N°: 192, e o 1133C11 domínio VL, SEQ ID N°: 197. Este local de ligação no anticorpo ao antigénio pode ser providenciado dentro de qualquer formato de molécula de anticorpo, p.ex. scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como é mais discutido noutra parte aqui.

Numa outra forma de realização altamente preferida, um domínio VH é providenciado com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 392, sendo isto denominado "1252A5 domínio VH". Numa outra forma de realização altamente preferida, um domínio VL é providenciado com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 397, sendo isto denominado "1252A5 domínio VL ". Um local de ligação no anticorpo ao antigénio altamente 18 preferido providenciado de acordo com a presente invenção é composto pelo 1252A5 domínio VH, SEQ ID N°: 392, e ο 1252A5 domínio VL, SEQ ID N°: 397. Este local de ligação no anticorpo ao antigénio pode ser providenciado dentro de qualquer formato de molécula de anticorpo, p.ex. scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como é mais discutido noutra parte aqui.

Numa outra forma de realização altamente preferida, a presente invenção providencia uma molécula de anticorpo IgG4 compreendendo ο 1252A5 domínio VH, SEQ ID N°: 392, e o 1252A5 domínio VL, SEQ ID N°: 397. Isto é denominado aqui "1252A5 IgG4".

Outros IgG ou outras moléculas de anticorpo compreendendo o 1252A5 domínio VH, SEQ ID N°: 392, e/ou ο 1252A5 domínio VL, SEQ ID N°: 397, são providenciados pela presente invenção, assim como outras moléculas de anticorpo compreendendo ο 1252A5 grupo de HCDRs (SEQ ID N°s: 393, 394 e 395) dentro de um domínio VH no anticorpo, e/ou ο 1252A5 grupo de LCDRs (SEQ ID N°s: 398, 399 e 400) dentro de um domínio VL no anticorpo.

Como referido, a presente invenção providencia um membro de ligação específica que se liga ao NGF humano e que compreende ο 1252A5 domínio VH (SEQ ID N°: 392) e/ou o 1252A5 domínio VL (SEQ ID N°: 397). As propriedades de tal membro de ligação específica são divulgadas aqui.

Geralmente, um domínio VH é emparelhado com um domínio VL para providenciar um local de ligação no anticorpo ao antigénio. Numa forma de realização preferida, ο 1252A5 domínio VH (SEQ ID N°: 392) é emparelhado com ο 1252A5 domínio VL (SEQ ID N°: 397), de forma que é formado um local de ligação no anticorpo ao antigénio compreendendo ambos os 1252A5 domínios VH e VL. Formas de realização 19 análogas são providenciadas para os outros dominios VH e VL divulgados aqui. Em outras formas de realização, ο 1252A5 VH é emparelhado com um outro dominio VL que não ο 1252A5 VL. A promiscuidade da cadeia leve está bem estabelecida na técnica. Mais uma vez, formas de realização análogas são providenciadas pela invenção para os outros dominios VH e VL divulgados aqui.

Estão disponíveis vários métodos na técnica para obter anticorpos contra NGF e que podem competir com um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, uma molécula de anticorpo com um 1252A5 ou outro grupo de CDRs, ou uma molécula de anticorpo com um grupo de CDRs de 1252A5 ou outras linhagens, pela ligação a NGF.

Um método para obter um ou mais membros de ligação específica capazes de se ligar ao antigénio pode incluir pôr em contato uma biblioteca de membros de ligação específica de acordo com a invenção e o dito antigénio, e selecionar um ou mais membros de ligação específica da biblioteca capaz de se ligar ao dito antigénio. A biblioteca pode ser revelada em partículas ou complexos moleculares, p.ex. pacotes genéticos replicáveis tais como levedura, partículas bacterianas ou bacteriófagos (p.ex. T7), ou sistemas de revelação in vitro covalentes, ribossomais, ou outros, cada partícula ou complexo molecular contendo ácido nucleico que codifica o domínio variável VH do anticorpo revelado nele, e opcionalmente também um domínio VL revelado se presente. A seguir à seleção dos membros de ligação específica capazes de se ligar ao antigénio e revelado em bacteriófagos ou outras partículas da biblioteca ou complexos moleculares, pode ser retirado ácido nucleico do 20 bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que revela o dito membro de ligação específica selecionado. Tal ácido nucleico pode ser utilizado na produção subsequente de um membro de ligação específica ou um domínio variável VH ou VL do anticorpo por expressão do ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico retirado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular que revela o dito membro de ligação específica selecionado. A capacidade de se ligar ao NGF pode ainda ser mais testada, e também a capacidade de competir com p.ex. 1252A5 (p.ex. em formato scFv e/ou formato IgG, p.ex. IgG4) pela ligação ao NGF. A capacidade de neutralizar o NGF pode ser testada, como discutido mais adiante.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção pode ligar-se ao NGF com a afinidade de um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, p.ex. scFv, ou preferivelmente 1252A5 ou outro IgG4, ou com uma afinidade que é melhor.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção pode neutralizar o NGF com a potência de um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, p.ex. scFv, ou preferivelmente 1252A5 ou outro IgG4, ou com uma potência que é melhor. A afinidade de ligação e a potência de neutralização de diferentes membros de ligação específica pode ser comparada sob condições apropriadas.

Os anticorpos da presente invenção têm um número de vantagens sobre os anticorpos anti-NGF existentes comercialmente. Por exemplo, a presente invenção providencia anticorpos humanos ou da linha germinal, que é 21 esperado que apresentem um menor grau de imunogenicidade quando administrados cronicamente ou repetidamente a humanos para utilização terapêutica ou de diagnóstico. Além disso, a presente invenção providencia anticorpos que são neutralizadores mais potentes de NGF e por isso pode ser alcançado um efeito terapêutico ou diagnóstico utilizando menos material anticorpo. Adicionalmente, numa forma de realização da invenção, a potência para inibição da interação NGF/recetor TrKA é maior que a observada para inibição da interação NGF/recetor p75. Isto pode conferir vantagens sobre outros tratamentos com antagonistas NGF aparentemente não seletivos neste sentido, ou na magnitude ou na natureza do efeito terapêutico alcançado, ou na redução de efeitos secundários indesejáveis. A invenção também providencia preparações heterógenas compreendendo moléculas de anticorpo anti-NGF. Por exemplo, tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de comprimento inteiro e cadeias pesadas em que falta a lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, tal como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um residuo ácido piroglutâmico.

Em outros aspetos, a invenção providencia um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um membro de ligação especifica de acordo com a presente invenção, e métodos para preparação de um membro de ligação específica, da invenção, que compreende o expressar do dito ácido nucleico sob condições para dar origem à produção do dito membro de ligação específica, e a sua recuperação.

Descrito aqui é o ácido nucleico, geralmente isolado, que codifica um domínio variável VH do anticorpo e/ou domínio variável VL divulgado aqui. 22

Também descrito aqui é ácido nucleico, geralmente isolado, que codifica uma sequência VH CDR ou VL CDR divulgado aqui, especialmente um VH CDR selecionado de: 1133C11 (VH CDR1 SEQ ID N° : 193, VH CDR2 SEQ ID N° : 194, e VH CDR3 SEQ ID N° : 195), 1152H5 (VH CDR1 SEQ ID N° : 263, VH CDR2 SEQ ID N°: 264, e VH CDR3 SEQ ID N°: 265), e 1252A5 (VH CDR1 SEQ ID N° : 393, VH CDR2 SEQ ID N° : 394, e VH CDR3 SEQ ID N° : 395), ou um VL CDR selecionada de: 1133C11 (VL CDR1 SEQ ID N°: 198, VL CDR2 SEQ ID N°: 199, e VL CDR3 SEQ ID N° : 200), 1152H5 (VL CDR1 SEQ ID N°: 268, VL CDR2 SEQ ID N°: 269, e VL CDR3 SEQ ID N°: 270), e 1252A5 (VL CDR1 SEQ ID N°: 398, VL CDR2 SEQ ID N° : 399, e VL CDR3 SEQ ID N°: 400), mais preferivelmente 1252A5 VH CDR3 (SEQ ID N°: 395) . O ácido nucleico que codifica ο 1252A5 grupo de CDRs, o ácido nucleico que codifica ο 1252A5 grupo de HCDRs e o ácido nucleico que codifica ο 1252A5 grupo de LCDRs são também divulgados, assim como os ácidos nucleicos que codificam CDRs, HCDRs, LCDRs individuais e grupos de CDRs, HCDRs, LCDRs da linhagem 1252A5, 1133C11 ou 1021E5.

Um outro aspeto providencia uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico da invenção.

Ainda um outro aspeto providencia um método de produção de membros de ligação especifica, o método incluindo o causar a expressão de ácido nucleico codificante. Tal método pode compreender cultivar as células hospedeiras sob condições para produção dos ditos membros de ligação.

Um método de produção pode compreender um passo de isolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção pode compreender formular o produto numa composição incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável. 23

Descrito aqui são composições contendo membros de ligação especifica, da invenção, e o seu uso em métodos de inibição ou neutralização de NGF, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

Os membros de ligação especifica de acordo com a invenção podem ser utilizados num método de tratamento ou de diagnóstico do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio de um doente humano que compreende a administração ao dito doente de uma quantidade efetiva de um membro de ligação especifica, da invenção. Condições tratáveis de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma em que o NGF tem um papel, especialmente dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das vias aéreas, neuropatia diabética, HIV, arritmias cardíacas, artrite, psoríase e cancro.

Estes e outros aspetos da invenção são descritos em mais detalhe mais adiante.

TERMINOLOGIA É conveniente salientar aqui que "e/ou" onde for referido aqui é para ser tomado como a divulgação específica de cada uma das duas caraterísticas ou componentes especificadas com ou sem a outra. Por exemplo "A e/ou B" é para ser tomado como a divulgação específica de cada uma de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, tal como se cada uma fosse definida individualmente aqui. 24

NGF NGF (também conhecido como beta-NGF) é o fator de crescimento neuronal. No contexto da presente invenção, NGF é normalmente NGF humano, embora possa ser NGF não humano (p.ex. NGF de primata não humano e/ou NGF de rato e/ou NGF de ratinho). NGF é também referido em certos sitios como "o antigénio". 0 NGF utilizado num ensaio descrito aqui é normalmente NGF humano, de rato ou de ratinho, mas pode ser utilizado NGF de outro animal não humano, p.ex. NGF primata não humano.

Dor

Isto descreve, como é bem conhecido na técnica, a sensação de dor, e pode abranger um ou mais, ou todos, dos seguintes: - hiperalgesia (resposta de dor exagerada a um estimulo doloroso normal); - alodinia (sensação de dor causado por um estimulo que normalmente não é doloroso); - sensação espontânea de dor causada por qualquer outro mecanismo na ausência de qualquer influência externa aparente; dor evocada por estimulo fisico, tal como calor, aquecimento, frio, pressão, vibração, toque estático ou dinâmico, ou postura e movimento corporal; - dor somática e visceral causada por qualquer mecanismo, por exemplo, trauma, infeção, inflamação, doença metabólica, acidente vascular cerebral ou doença neurológica. 25 A dor pode ser por exemplo dor aguda, dor a curto prazo, dor nociceptiva persistente, ou dor neuropática persistente ou crónica.

Membro de ligação específica

Isto descreve um membro de uma par de moléculas que têm especificidade de ligação uma para a outra. Os membros de um par de ligação especifica podem ser derivados naturalmente ou produzidos sinteticamente na sua totalidade ou parcialmente. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especificamente a, e é por isso complementar a, uma organização espacial e polar do outro membro do par de moléculas. Assim os membros do par têm a propriedade de se ligar especificamente um ao outro. Exemplos de tipos de pares de ligação específica são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-recetor da hormona, recetor-ligante, enzima-substrato. A presente invenção refere-se a reações do tipo antigénio-anticorpo.

Um membro de ligação específica normalmente compreende uma molécula com um local de ligação ao antigénio. Por exemplo, um membro de ligação específica pode ser uma molécula de anticorpo.

Adicionalmente às sequências do anticorpo e/ou um local de ligação ao antigénio, um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, p.ex. formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra caraterística funcional adicionalmente à capacidade de se ligar ao antigénio. Membros de ligação específica, da invenção, podem ter um marcador detetável, ou podem ser conjugados com uma toxina ou uma fração-alvo ou enzima 26 (p.ex. via uma ligação peptidil ou adaptador). Por exemplo, um membro de ligação especifica pode compreender um local catalítico (p.ex. num domínio de uma enzima) assim como um local de ligação ao antigénio, em que o local de ligação ao antigénio se liga ao antigénio e assim tem como alvo o local catalítico para o antigénio. 0 local catalítico pode inibir a função biológica do antigénio, p.ex. por clivagem. A estrutura para tem um CDR ou um grupo de CDRs da invenção irá ser geralmente uma sequência da cadeia pesada ou leve do anticorpo ou uma porção substancial deste em que o CDR ou o grupo de CDRs está localizado num local correspondente ao CDR ou grupo de CDRs de domínios variáveis VH e VL do anticorpo que ocorrem naturalmente codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis da imunoglobulina podem ser determinadas por referência a Kabat, et ai., 1987, e atualizações deste, agora disponível na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou procurar "Kabat" utilizando qualquer motor de procura).

Molécula de anticorpo

Isto descreve uma imunoglobulina produzida quer naturalmente ou parcialmente ou na sua totalidade de forma sintética. 0 termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína que compreende um local de ligação no anticorpo ao antigénio. Fragmentos de anticorpo que compreendem um local de ligação no anticorpo ao antigénio são moléculas tais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diabodies. É possível pegar em anticorpos monoclonais ou outros e utilizar técnicas da tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas 27 podem envolver introduzir DNA que codifica para regiões variáveis de imunoglobulina, ou os CDRs, nas regiões constantes do anticorpo, ou regiões constantes mais regiões do framework, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e uma vasta literatura subsequente. Um hibridoma ou outra célula que produz um anticorpo pode ser sujeito a mutação genética ou outras alterações, que podem ou não podem alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

Como os anticorpos podem ser modificados numa série de formas, o termo "molécula de anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo qualquer membro de ligação especifica ou substância com um local de ligação no anticorpo ao antigénio com a especificidade requerida. Assim, este termo cobre fragmentos de anticorpo e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo que compreende um local de ligação no anticorpo ao antigénio, quer natural quer na sua totalidade ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas que compreendem um local de ligação no anticorpo ao antigénio, ou equivalente, fundidas com qualquer outro polipeptídeo são por isso incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos estão descritas na EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e numa vasta literatura subsequente.

Outras técnicas disponíveis na técnica da engenharia de anticorpos tornaram possível isolar anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, podem ser produzidos hibridomas humanos como descrito por Kontermann & Dubel (2001). Phage display, outra técnica demonstrada para gerar membros de ligação específica foi descrita em detalhes em muitas publicações tal como Kontermann & Dubel (2001) e W092/01047 (discutido mais adiante). Ratinhos transgénicos, nos quais os genes dos anticorpos do ratinho foram inativados e substituídos funcionalmente por genes de anticorpos humanos 28 enquanto que se deixou intato outros componentes do sistema imunitário do ratinho, podem ser utilizados para isolar anticorpos humanos (Mendez et al., 1997).

Moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas por expressão de genes gerados por meio de oligonucleótidos sintetizados e montadas dentro de vetores de expressão apropriados, por exemplo como descrito por Knappik et al. (2000) ou Krebs et al. (2001).

Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de se ligar aos antigénios. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab constituído por domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003), que consiste num domínio VH ou VL; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab unidos (vii) moléculas de cadeia única Fv (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão unidos por um linker de peptídeos que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigénio (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988); (viii) dímeros de cadeia única biespecíficos Fv (PCT/US92/09965) e (ix) "diabodies", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO94/1380; Holliger et al., 1993). Fv, scFv ou moléculas diabody podem ser estabilizados pela incorporação de pontes dissulfídicas unindo os domínios VH e VL (Reiter et al., 1996). Podem também ser feitos minibodies compreendendo um scFv ligado a um domínio CH3 (Hu et al., 1996). 29

Quando é para se utilizar anticorpos biespecificos, estes podem ser anticorpos biespecificos convencionais, que podem ser fabricados numa variedade de formas (Holliger & Winter, 1993), p.ex. preparados quimicamente ou de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer dos fragmentos de anticorpos biespecificos mencionados anteriormente. Exemplos de anticorpos biespecificos incluem aqueles da tecnologia BiTE™ na qual podem ser utilizados os domínios de ligação de dois anticorpos com diferentes especificidades e unidos diretamente por meio de peptídeos curtos flexíveis. Isto combina dois anticorpos numa cadeia polipeptídica única, curta. Diabodies e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reação anti-idiotípicas.

Diabodies biespecificos, em oposição a anticorpos inteiros biespecificos, também podem ser particularmente úteis porque eles podem ser prontamente construídos e expressos em E.coli. Diabodies (e muitos outros polipeptídeos tais como fragmentos de anticorpos) com especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados utilizando phage display (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diabody é para ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra NGF, então pode ser feita uma biblioteca em que o outro braço varia e é selecionado um anticorpo de especificidade apropriada. Anticorpos inteiros biespecificos podem ser feitos por engenharia knobs-into-holes (Ridgeway et al., 1996).

Local de ligação ao antigénio

Isto descreve a parte de uma molécula que se liga a, e é complementar a, todo ou parte do antigénio alvo. Numa molécula de anticorpo, é referido como o local de ligação 30 no anticorpo ao antigénio, e compreende a parte do anticorpo que especificamente se liga a, e é complementar a, todo ou parte de antigénio alvo. Quando um antigénio é grande, um anticorpo só se pode ligar a uma parte particular do antigénio, sendo esta parte denominada de epítopo. Um local de ligação no anticorpo ao antigénio pode ser providenciado por um ou mais dominios variáveis do anticorpo. Preferivelmente, um local de ligação no anticorpo ao antigénio compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH).

Específico

Isto pode ser utilizado para se referir à situação na qual um membro de um par de ligação especifica não irá apresentar qualquer ligação significativa a outras moléculas que não o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação especifica. 0 termo também é aplicável quando p.ex. um local de ligação ao antigénio é especifico para um epítopo particular que existe num número de antigénios, sendo que neste caso o membro de ligação específica que tem o local de ligação ao antigénio será capaz de se ligar a vários antigénios que têm o epítopo.

Isolado

Isto refere-se ao estado no qual os membros de ligação específica, da invenção, ou ácidos nucleicos que codificam tais membros de ligação, irão em geral estar de acordo com a presente invenção. Os membros isolados e o ácido nucleico isolado estarão livres ou substancialmente livres de material com o qual eles estão naturalmente associados, tal como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais eles são encontrados no seu meio natural, ou no meio no 31 qual eles são preparados (p.ex. cultura celular) quando tal preparação é por tecnologia de DNA recombinante realizada in vitro ou in vivo. Os membros e o ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e apesar de isso ser isolado em termos práticos - por exemplo os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros agentes de transporte se utilizados para revestir placas de microtitulação para utilização em immunoensaios, ou serão misturados com agentes de transporte ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados para diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação especifica podem ser glicosilados, ou naturalmente ou através de sistemas de células eucariotas heterólogas (p.ex. células CHO ou NSO (ECACC 85110503), ou podem ser (por exemplo se produzido por expressão numa célula procariótica) não glicosilados.

Descrição detalhada

Como referido anteriormente, um membro de ligação especifica de acordo com a presente invenção preferencialmente neutraliza NGF. 0 grau com o qual um anticorpo neutraliza NGF é referido como a sua potência de neutralização. A potência é normalmente expressa num valor IC50, em nM a não ser que indicado de outra forma. IC50 é a concentração inibitória média de uma molécula de anticorpo. Em ensaios funcionais, IC50 é a concentração que reduz uma resposta biológica em 50 % do seu máximo. Em estudos de ligação ao ligante, IC50 é a concentração que reduz a ligação ao recetor em 50 % do nivel máximo de ligação especifica. IC50 pode ser calculado traçando a % respostas biológicas (representadas p.ex. por mobilização do ião de cálcio num 32 ensaio FLIPR, por sobrevivência num ensaio PC12, ou por proliferação num ensaio de proliferação TF-1) ou a % ligação especifica ao recetor como função do log da concentração do membro de ligação especifica, e utilizando um programa de software tal como Prism (GraphPad) para ajustar uma função sigmoide aos dados para gerar valores IC50, por exemplo como descrito no Exemplo 2, 5, 6 ou 9 aqui referido.

Um membro de ligação especifica de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a mobilização de cálcio intracelular evocada por NGF humano, em células que expressam o recetor TrkA, p.e. células transfetadas recombinantemente com um gene TrkA, por exemplo células HEK. Num ensaio de mobilização de cálcio "FLIPR" como descrito no Exemplo 2 aqui referido, um membro de ligação especifica de acordo com a invenção preferivelmente tem uma potência (IC50) para neutralizar NGF humano de, ou menos que, 600, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nM. Normalmente, um membro de ligação especifica, da invenção, tem uma potência de 5 nM ou menos, preferivelmente 2,5 nM ou menos, mais preferivelmente 1 nM ou menos. Em formas de realização particularmente preferidas, a potência é de 0,5 nM ou menos, p.ex. 0,4 nM ou menos; 0,3 nM ou menos; 0,2 nM ou menos; ou 0,15 nM ou menos. Em algumas formas de realização, a potência pode ser cerca de 0,1 nM. A potência pode ser entre 0,1-100 nM, 0,1-50 nM, 0,1-10 nM, ou 0,1-1,0 nM. Por exemplo, a potência pode ser 0,1-5,0 nM, 0,2-5,0 nM, 0,3-5,0 nM, ou 0,3-0,4 nM.

Em algumas formas de realização da invenção, a potência de neutralização de um membro de ligação especifica não-potência-otimizada num ensaio celular HEK como descrito aqui é cerca de 1,8 a 560 nM para NGF humano e/ou cerca de 33 2,9 a 620 nM para NGF de rato. Em algumas formas de realização, a potência de neutralização de membros de ligação específica com potência-otimizada em ensaios celulares HEK como descrito aqui são cerca de 0,12 a 120nM para NGF humano, cerca de 0,11 a 37 nM para NGF de rato e cerca de 0,11 a 71 nM para NGF de ratinho. No entanto, estes são apenas exemplos e podem ser alcançadas potências mais elevadas. Embora a otimização da potência possa ser utilizada para gerar membros de ligação específica com maior potência a partir de um dado membro de ligação específica, importa também referir que membros de ligação específica com elevada potência podem ser obtidos mesmo sem otimização da potência.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a sobrevivência celular PC12 privada de soro, mantida por NGF. A potência de neutralização de um membro de ligação específica da presente invenção num ensaio de sobrevivência PC12 para NGF humano como descrito aqui no Exemplo 5 é geralmente 1500 nM ou menos, e é preferivelmente 50 nM ou menos, ou 10 nM ou menos. Como explicado anteriormente e como demonstrado aqui, a otimização da potência pode ser utilizada para alcançar potências mais elevadas anti-NGF. Preferivelmente, um membro de ligação específica tem uma potência de, ou menos de, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM ou 0,5 nM. Em algumas formas de realização, a potência é cerca de 0,1 nM ou mais, 0,2 nM ou mais. Assim, a potência pode ser entre 0,1 ou 0,2 nM e 0,5, 1,5, 5 ou 50 nM.

Em algumas formas da invenção, a potência de neutralização de um membro de ligação específica com potência-otimizada num ensaio de sobrevivência PC12 como descrito aqui é cerca de 0,2 a 670nM para NGF humano e é cerca de 0,2 a 54 nM para NGF de rato. 34

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a proliferação celular TF-1 estimulada por NGF. A potência de neutralização de um membro de ligação específica (normalmente um membro de ligação específica com potência-otimizada) da presente invenção num ensaio de proliferação TF-1 para NGF humano como descrito aqui no Exemplo 6 é geralmente 5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos. Preferivelmente, um membro de ligação específica, da invenção, tem uma potência de, ou menos de, 0,7, 0,6, 0,5, 0,45, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 nM para NGF humano. Por exemplo, a potência pode ser entre 0,05 -0,1 nm, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, ou 0,05 - 0,5 nM.

Em algumas formas da invenção, a potência de neutralização de um membro de ligação específica com potência-otimizada num ensaio de proliferação TF-1 como descrito aqui é cerca de 0,08 a 0,7 nM para NGF humano, cerca de 0,07 a 1,9 nM para NGF de rato e cerca de 0,07 a l,4nM para NGF de ratinho.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a ligação de NGF a um recetor TrkA e/ou p75, preferivelmente um recetor TrkA e/ou p75 humano. A invenção também abrange mais globalmente um membro de ligação específica que preferivelmente bloqueia a ligação de NGF a um recetor TrkA em preferência à ligação de NGF a um recetor p75. A potência de neutralização de um membro de ligação específica (normalmente um membro de ligação específica com potência-otimizada) da presente invenção num ensaio de ligação ao recetor TrkA como descrito aqui no Exemplo 9 é geralmente 2,5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos para neutralização de NGF humano. Preferivelmente, um membro de ligação específica, da invenção, tem uma potência de ou menos de 0,5, 0,4, 0,3, 35 0,2, 0,1 ou 0,075 nM para neutralizar a ligação de NGF humano ao TrkA. Por exemplo, a potência pode ser entre 0,05 - 0,1 nM, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, ou 0,05 - 0,5 nM. A potência de neutralização de um membro de ligação especifica (normalmente um membro de ligação especifica com potência-otimizada) da presente invenção num ensaio de ligação ao recetor p75 como descrito aqui no Exemplo 9 é geralmente 1,5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos para neutralizar NGF humano. Preferivelmente, um membro de ligação especifica, da invenção, tem uma potência de ou menos de 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 nM para neutralizar a ligação de NGF humano ao p75. Por exemplo, a potência pode ser entre 0,1 - 0,2 nM, 0,1 - 0,3 nM, 0,1 - 0,4 nM, 0,1 - 0,5 nM, ou 0,1-0,6 nM.

Alguns membros de ligação especifica preferidos de acordo com a presente invenção inibem a ligação de NGF (p.ex. humano e/ou NGF de rato) ao recetor TrkA preferivelmente em preferência à ligação de NGF ao recetor p75. Portanto, em algumas formas de realização um membro de ligação especifica, da invenção, tem uma constante de inibição da ligação mais baixa, Ki, para a inibição da ligação de NGF (p.ex. humano e/ou NGF de rato) ao TrkA do que para a ligação de NGF ao p75. O Ki pode ser calculado utilizando a fórmula definida no Exemplo 9. Alternativamente, as constantes da inibição da ligação podem ser expressas como pKi, que pode ser calculada como -logi0Ki. Assim, um membro de ligação especifica, da invenção, preferivelmente tem um valor pKi mais elevado para a inibição da ligação de NGF ao TrkA do que para o p75.

Preferencialmente, um membro de ligação especifica de acordo com a invenção liga-se ao NGF humano e/ou NGF de 36 rato com uma afinidade de ou menos de 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 ou 0,2 nM. Por exemplo, um membro de ligação específica pode ligar-se ao NGF humano com uma afinidade de cerca de 0,25-0,44 nM e ao NGF de rato com uma afinidade de cerca de 0,25-0,70 nM.

Como referido anteriormente, podem ser produzidas variantes das moléculas de anticorpo divulgadas aqui e utilizadas na presente invenção. Seguindo o exemplo da química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariados à estrutura/relações propriedades-atividade (Wold, et al. 1984) podem ser derivadas relações de atividade-propriedades quantitativas de anticorpos utilizando técnicas matemáticas bem conhecidas tal como regressão matemática, reconhecimento e classificação de padrões (Norman et al. 1998; Kandel & Backer, 1995; Krzanowski, 2000; Witten & Frank, 1999; Denison (Ed), 2002; Ghose & Viswanadhan). As propriedades dos anticorpos podem ser derivadas de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de prováveis resíduos de contato ou propriedades físico-químicas calculadas) da sequência de anticorpos, estruturas funcionais e tridimensionais e estas propriedades podem ser consideradas individualmente e em combinação.

Um local de ligação no anticorpo ao antigénio composto por um domínio VH e um domínio VL é formado por seis anéis de polipeptídeos: três do domínio variável da cadeia leve (VL) e três do domínio variável da cadeia pesada (VH). A análise de anticorpos de estrutura atómica conhecida elucidou as relações entre a sequência e a estrutura tridimensional de locais combinados do anticorpo (Chothia et al. 1992; Al-Lazikani, et al. 1997). Estas relações implicam que, exceto para a terceira região (anel) em domínios VH, os anéis de locais de ligação têm uma conformação com um pequeno número 37 de cadeias principais: estruturas canónica. Foi verificado que a estrutura canónica formada num anel particular é determinada pelo seu tamanho e a presença de certos resíduos em locais chave em ambas as regiões do anel e do framework (Chothia et al. e Al-Lazikani et al., supracitado).

Este estudo da relação sequência-estrutura pode ser utilizado para predizer daqueles resíduos de um anticorpo de sequência conhecida, mas de estrutura tridimensional desconhecida, quais são importantes para manter a estrutura tridimensional dos seus anéis CDR e portanto manter a especificidade de ligação. Estas predições podem ser confirmadas comparando as predições para o resultado de experiências de vanguarda de otimização. Numa abordagem estrutural, pode ser criado um modelo de uma molécula de anticorpo (Chothia, et al. 1986) utilizando qualquer pacote disponível livremente ou comercial tal como WAM (Whitelegg & Rees, 2000). Um pacote de software de visualização e análise de proteínas tal como Insight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View (Guex & Peitsch, 1997) pode então ser utilizado para avaliar possíveis substituições em cada posição do CDR. Esta informação pode então ser utilizada para fazer substituições que provavelmente tenham um efeito mínimo ou benéfico na atividade.

As técnicas necessárias para fazer substituições dentro das sequências de aminoácidos de CDRs, domínios VH ou VL do anticorpo e membro de ligação específica geralmente estão disponíveis na técnica. Podem ser feitas sequências variantes, com substituições que se podem ou não se podem predizer terem um efeito mínimo ou benéfico na atividade, e testadas relativamente à capacidade de se ligarem e/ou neutralizarem o NGF e/ou relativamente a qualquer propriedade desejada. 38

Variantes da sequência de aminoácidos do dominio variável de qualquer dos dominios VH e VL cujas sequências são especificamente divulgados aqui podem ser empregues de acordo com a presente invenção, como discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações da sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de resíduo de aminoácido) , pode ser menos de cerca de 20 alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos de cerca de 10 alterações ou menos de cerca de 5 alterações, talvez 5, 4, 3, 2 ou 1. As alterações podem ser feitas numa ou mais regiões framework e/ou um ou mais CDRs.

Preferencialmente as alterações não resultam em perda de função, assim um membro de ligação específica compreendendo uma assim alterada sequência de aminoácidos preferencialmente retém a capacidade de se ligar e/ou neutralizar NGF. Mais preferencialmente, retém a mesma ligação quantitativa e/ou capacidade de neutralização que um membro de ligação específica no qual não foi feita uma alteração, p.ex. como medido por um ensaio descrito aqui. Mais preferivelmente, o membro de ligação específica que compreende uma assim alterada sequência de aminoácidos tem uma capacidade melhorada de se ligar ou neutralizar NGF. A alteração pode compreender substituir um ou mais resíduos de aminoácidos por um aminoácido que não ocorre naturalmente ou não padrão, modificando um ou mais resíduos de aminoácidos para uma forma que não ocorre naturalmente ou não padrão, ou inserindo um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou não padrão na sequência. Números e locais preferidos das alterações nas sequências da invenção são descritos noutra parte aqui. Aminoácidos que ocorrem naturalmente incluem os 20 L-aminoácidos "padrão" identificados como G, A, V, L, I, Μ, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E pelos seus códigos padrão de uma única 39 letra. Aminoácidos não padrão incluem qualquer outro resíduo que possa ser incorporado numa estrutura base polipeptídica ou que resulta de uma modificação de um resíduo aminoácido existente. Aminoácidos não padrão podem ocorrer naturalmente ou não ocorrer naturalmente. Vários aminoácidos não padrão que ocorrem naturalmente são conhecidos na técnica, tal como 4-hidroxiprolina, 5-hydroxilisina, 3-metilhistidina, N-acetilserina, etc. (Voet & Voet, 1995) . Tais resíduos de aminoácidos que são derivados na sua posição N-alfa estarão apenas localizados no N-terminal de uma sequência de aminoácidos. Normalmente na presente invenção um aminoácido é um L-aminoácido, mas em algumas formas de realização pode ser um D-aminoácido. As alterações podem por isso compreender modificar um L-aminoácido num, ou substituindo-o por um, D-aminoácido. São também conhecidas formas metiladas, acetiladas e/ou fosforiladas de aminoácidos, e os aminoácidos na presente invenção podem ser sujeitos a tal modificação.

As sequências de aminoácidos em domínios de anticorpo e membros de ligação específica, da invenção, podem compreender aminoácidos não naturais ou não padrão descritos anteriormente. Em algumas formas de realização podem ser incorporados aminoácidos não padrão (p.ex. D-aminoácidos) numa sequência de aminoácidos durante a síntese, enquanto que em outras formas de realização os aminoácidos não padrão podem ser introduzidos por modificação ou substituição dos aminoácidos padrão "originais" após a síntese da sequência de aminoácidos. A utilização de aminoácidos não padrão e/ou que não ocorrem naturalmente aumenta a diversidade estrutural e funcional, e pode assim aumentar o potencial para alcançar as propriedades desejadas de ligação e de neutralização do NGF num membro de ligação especifica, da invenção. 40

Adicionalmente, foi verificado que D-aminoácidos e análogos têm melhores perfis farmacocinéticos em comparação com os L-aminoácidos padrão, devendo-se à degradação in vivo de polipeptideos com L-aminoácidos após a administração a um animal.

Como referido anteriormente, uma sequência de aminoácidos CDR substancialmente como definido aqui é preferivelmente existente como um CDR num dominio variável de um anticorpo humano ou uma porção substancial deste. As sequências de HCDR3 substancialmente como definido aqui representam formas de realização preferidas da presente invenção e é preferido que cada um deles seja existente como um HCDR3 num dominio variável de uma cadeia pesada humana ou uma porção deste.

Dominios variáveis empregues na invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer dominio variável humano da linha germinal ou reorganizado, ou pode ser um dominio variável sintético baseado em consenso ou sequências atuais de dominios variáveis humanos conhecidos. Uma sequência CDR da invenção (p.ex. CDR3) pode ser introduzida num repertório de dominios variáveis com falta de um CDR (p.ex. CDR3), utilizando a tecnologia de DNA recombinante.

Por exemplo, Marks et al. (1992) descreve métodos de produção de repertórios de dominios variáveis de anticorpo, nos quais os iniciadores de consenso dirigidos a, ou adjacentes à extremidade 5' da área do dominio variável são utilizados conjuntamente com iniciadores de consenso da terceira região framework dos genes VH humanos para providenciar um repertório de dominios variáveis VH com falta de um CDR3. Marks et al. descrevem além disso como este repertório pode ser combinado com um CDR3 de um anticorpo particular. Utilizando técnicas análogas, as 41 sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser misturadas com repertórios de domínios VH ou VL com falta de um CDR3, e os domínios VH ou VL completos, misturados, podem ser combinados com um domínio VL ou VH cognata para providenciar membros de ligação específica, da invenção. 0 repertório pode então ser revelado num sistema de hospedeiro apropriado tal como o sistema de phage display de W092/01047 ou qualquer de uma subsequente vasta literatura, incluindo Kay, Winter & McCafferty (1996), de forma que membros de ligação específica apropriados possam ser selecionados. Um repertório pode ser constituído por quaisquer valores acima dos 104 membros individuais, por exemplo de 106 a 108 ou IO10 membros. Outros sistemas de hospedeiros apropriados incluem yeast display, bacterial display, T7 display, ribosome display e covalent display. A mistura análoga ou técnicas combinatórias são também divulgadas por Stemmer (1994), que descreve a técnica em relação a um gene β-lactamase mas observa que a abordagem pode ser utilizada para a geração de anticorpos.

Uma outra alternativa é gerar regiões VH ou VL novas portadoras de sequências derivadas de CDR da invenção utilizando mutagénese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al. (1992), que utilizou PCR propenso a erros. Em formas de realização preferidas são feitas uma ou duas substituições de aminoácidos dentro de um grupo de HCDRs e/ou LCDRs.

Outro método que pode ser utilizado é dirigir a mutagénese para regiões CDR de genes VH ou VL. Tais técnicas são divulgadas por Barbas et al. (1994) e Schier et al. (1996). 42

Todas as técnicas acima descritas são conhecidas como tal na técnica e o perito será capaz de utilizar tais técnicas para providenciar membros de ligação especifica, da invenção, utilizando metodologia rotineira na técnica.

Um local de ligação no anticorpo ao antigénio específico para antigénio NGF, pode ser obtido pelo método que compreende providenciar por via de adição, deleção, substituição ou inserção um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos de um domínio VH definido aqui, um domínio VH que é uma variante da sequência de aminoácidos do domínio VH, combinando o domínio VH assim providenciado como um ou mais domínios VL, e testando a combinação ou combinações VH/VL para identificar um membro de ligação específica ou um local de ligação no anticorpo ao antigénio específico para antigénio NGF e opcionalmente para uma ou mais propriedades preferidas, preferivelmente a capacidade de neutralizar a atividade NGF. 0 dito domínio VL pode ter uma sequência de aminoácidos que é substancialmente como definido aqui.

Pode ser empregue um método análogo no qual uma ou mais variantes da sequência de um domínio VL divulgado aqui são combinadas com um ou mais domínios VH.

Numa forma de realização preferida, ο 1252A5 domínio VH (SEQ ID N°: 392) pode ser sujeito a mutação para providenciar uma ou mais variantes da sequência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmente combinadas com 1252A5 VL (SEQ ID N°: 397).

Uma porção substancial de um domínio variável da imunoglobulina irá compreender pelo menos as três regiões CDR, juntamente com as suas regiões framework intervenientes. Preferivelmente, a porção irá também 43 incluir pelo menos cerca de 50% de uma ou outra ou ambas a primeira e quarta região framework, o 50% sendo o C-terminal 50% da primeira região framework e o N-terminal 50% da quarta região framework. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles que não estão normalmente associados com regiões de domínios variáveis que ocorrem naturalmente. Por exemplo, a construção de membros de ligação específica, da presente invenção, feita por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminal codificados por linkers introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Outros passos de manipulação incluem a introdução de linkers para unir domínios variáveis da invenção a outras sequências de proteína incluindo regiões constantes do anticorpo, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diabodies) ou marcadores detetáveis/funcionais como discutido em mais detalhe noutra parte aqui.

Os membros de ligação especifica, da presente invenção, podem além disso compreender regiões constantes do anticorpo ou partes destas, preferivelmente regiões constantes do anticorpo humanas ou partes destas. Por exemplo, um domínio VL pode estar ligado pela sua extremidade C-terminal aos dominios constantes da cadeia leve do anticorpo incluindo cadeias Ck ou CX humanas, preferivelmente cadeias CX. De forma similar, um membro de ligação especifica baseado num domínio VH pode estar ligado pela sua extremidade C-terminal a toda, ou parte de (p.ex. um domínio CHI), uma cadeia pesada da imunoglobulina derivado de qualquer isotipo de anticorpo, p.ex. IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer das subclasses dos isotipos, particularmente IgGl e IgG4. É preferido IgG4. IgG4 é preferido porque não se liga ao complemento e não cria 44 funções efetoras. Qualquer variante da região constante sintética ou outras que tem estas propriedades e estabiliza regiões variáveis é também preferida para utilização em formas de realização da presente invenção.

Os membros de ligação especifica, da invenção, podem ser marcados com um marcador detetável ou funcional. Marcadores detetáveis incluem radiomarcadores tais como 131I ou 99Tc, que podem ser ligados a anticorpos da invenção utilizando quimica convencional conhecida na técnica da formação de imagem de anticorpos. Os marcadores também incluem marcadores enzimáticos tal como peroxidase de rábano. Os marcadores além disso incluem frações químicas tal como biotina que pode ser detetada através da ligação a uma fração específica, cognata, detetável, p.ex. marcada com avidina.

Os membros de ligação específica, da presente invenção, estão desenhados para serem utilizados em métodos de diagnóstico ou tratamento de sujeitos humanos ou animais, preferivelmente humanos.

Em conformidade, outros aspetos da invenção providenciam composições farmacêuticas que compreendem um tal membro de ligação específica, e utilização de um tal membro de ligação específica no fabrico de um medicamento para administração, por exemplo num método para produção de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação do membro de ligação específica com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As indicações clínicas para as quais os anticorpos anti-NGF podem ser utilizados para providenciar benefício terapêutico incluem dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das 45 vias aéreas, neuropatia diabética, artrite, psoríase, arritmias cardiacas, HIV e cancro. Como já explicado, o tratamento anti-NGF está indicado para todas estas doenças. 0 tratamento anti-NGF pode ser dado oralmente, por injeção (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal ou intramuscular), por inalação, por via intravesicular (instilação na bexiga urinária), ou topicamente (por exemplo intraocular, intranasal, retal, em feridas, na pele) . A via de administração pode ser determinada pelas caraterísticas fisico-quimicas do tratamento, por considerações especiais da doença ou pelo requisito de optimizar a eficácia ou minimizar os efeitos secundários. É previsto que o tratamento anti-NGF não seja restringido à administração por profissionais. Por isso, também é preferido a injeção subcutânea utilizando um dispositivo sem agulha.

Podem ser utilizados tratamentos combinados para providenciar efeitos sinergisticos significativos, particularmente a combinação de um membro de ligação especifica anti-NGF com um ou mais outros fármacos. Um membro de ligação especifica de acordo com a presente invenção pode ser providenciado em combinação ou adicionalmente a analgésicos de curta ou longa duração, anti-inflamatórios, antialérgicos, antiasmáticos, anti-fibróticos, antivirais, agentes quimioterapêuticos e agentes imunoterapêuticos. 0 tratamento combinado com um ou mais analgésicos de curta ou longa duração e/ou agentes anti-inflamatórios, tais como opióides e fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs), pode ser empregue para tratamento de condições caraterizadas por dor e/ou inflamação por exemplo artrite 46 reumatóide ou dor pós-cirúrgica. Os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados em combinação com terapias antiasmáticas, antialérgicas, ou anti-fibróticas, tal como agonistas beta-adrenocetor inalados, esteróides, antagonistas das citoquinas, ou outras abordagens terapêuticas novas para tratamento da asma, asma alérgica, outras condições alérgicas, ou qualquer condição caraterizada por fibrose anómala. Os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados em combinação com agentes anti-infeciosos, por exemplo agentes antivirais para o tratamento da infeção HIV.

De acordo com a presente invenção, as composições providenciadas podem ser administradas a individuos. A administração é preferencialmente numa "quantidade efectiva terapeuticamente", sendo esta suficiente para apresentar benefícios num doente. Tais benefícios podem ser pelo menos melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, a taxa e decurso ao longo do tempo da administração, irá depender da natureza e gravidade do que está a ser tratado. A prescrição do tratamento, p.ex. decisões sobre a dosagem etc, está dentro da responsabilidade de médicos gerais e outros médicos, e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou progressão da doença a ser tratada. As doses apropriadas do anticorpo são bem conhecidas na técnica; ver Ledermann et al. (1991) e Bagshawe (1991). Podem ser utilizadas dosagens específicas indicadas aqui, ou no "Physician's Desk Reference" (2003) como apropriado para o tipo de medicamento a ser administrado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva ou dose apropriada de um membro de ligação específica, da invenção, pode ser determinada comparando a sua atividade in vitro e a atividade in vivo num modelo animal. São conhecidos métodos para extrapolação de doses efetivas em ratinhos e outros animais teste para humanos. 47 A dose precisa irá depender de um número de fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e localização da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (p.ex. anticorpo inteiro, fragmento ou diabody), e a natureza de qualquer marcador detetável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo tipica irá ser no dominio de lOOyg a lg para administrações sistémicas, e lyg a lmg para aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, preferivelmente o isotipo IgG4. Isto é uma dose para um único tratamento num doente adulto, que pode ser proporcionalmente ajustada a crianças e bebés, e também ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção com o peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais, à discrição do médico. Em formas de realização preferidas da presente invenção, o tratamento é periódico, e o periodo entre administrações é cerca de duas semanas ou mais, preferivelmente cerca de três semanas ou mais, mais preferencialmente quatro semanas ou mais, ou cerca de uma vez por mês. Noutra forma de realização preferida da invenção, o tratamento pode ser dado antes, e/ou após cirurgia, e mais preferivelmente, pode ser administrado ou aplicado diretamente no local anatómico do tratamento cirúrgico.

Os membros de ligação especifica, da presente invenção, irão ser usualmente administrados sob a forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação especifica. farmaceuticamente

Assim as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para utilização de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do principio ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, agente de 48 transporte, tampão, estabilizante ou outro material bem conhecido daqueles peritos na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do principio ativo. A natureza precisa do agente de transporte ou outro material irá depender da via de administração, que pode ser oral, ou por injeção, p.ex. intravenosa.

As composições farmacêuticas para administração oral podem estar sob a forma de comprimido, cápsula, pó, liquido ou semissólido. Um comprimido pode compreender um agente de transporte sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições liquidas farmacêuticas geralmente compreendem um agente de transporte liquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Pode ser incluida uma solução de soro fisiológico, dextrose ou outra solução de sacáridos ou glicóis tal como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietileneoglicol.

Para injeção intravenosa, ou injeção na zona afetada, o principio ativo irá estar sob a forma de uma solução aquosa parentalmente aceitável que não contém pirogénios e tem um pH, isotonicidade e estabilidade apropriados. Os peritos na técnica são bem capazes de preparar soluções apropriadas utilizando, por exemplo, veiculos isotónicos tal como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactato. Podem ser incluídos conservantes, estabilizante, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário.

Uma composição pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, ou simultaneamente ou sequencialmente dependendo da condição a ser tratada.

Os membros de ligação especifica, da presente invenção, podem ser formulados em formas liquidas, semissólidas ou 49 sólidas dependendo das propriedades físico-químicas da molécula e da via de administração. As formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e agentes tensioativos. As formulações líquidas podem incluir uma vasta gama de concentrações de anticorpos e pH. As formulações sólidas podem ser produzidas por liofilisação, secagem por atomização, ou secagem por tecnologia de fluído supercrítico, por exemplo. As formulações de anti-NGF irão depender da via de administração pretendida: por exemplo, formulações para administração pulmonar podem consistir em partículas com propriedades físicas que asseguram a penetração profunda no pulmão depois da inalação; formulações tópicas podem incluir agentes modificadores da viscosidade, que prolongam o tempo durante o qual o fármaco permanece no local de ação. Em certas formas de realização, o membro de ligação específica pode ser preparado com um agente de transporte que irá proteger o membro de ligação específica contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas microencapsulados de administração. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tal como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p.ex., Robinson, 1978. A presente invenção põe à disposição um método que compreende o causar ou permitir a ligação de um membro de ligação específica como providenciado aqui ao NGF, in vitro, por exemplo no ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, immuno-precipitação, cromatografia de afinidade, ou ensaios baseados em células tal como o ensaio TF-1. 50

Pode ser determinada a quantidade de ligação do membro de ligação especifica ao NGF. A quantificação pode estar relacionada com a quantidade do antigénio numa amostra teste, que pode ter interesse diagnóstico.

Um membro de ligação especifica ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer aspeto ou forma de realização da presente invenção providenciado num kit. Num tal kit, o membro de ligação especifica ou molécula de anticorpo pode ser marcada para permitir determinar a sua reatividade numa amostra, p.ex. como descrito mais abaixo. Os componentes de um kit são geralmente estéreis e em frascos ou outros recipientes selados. Os kits podem ser empregues em análise de diagnóstico ou outros métodos para os quais as moléculas de anticorpo são úteis. Um kit pode conter instruções de utilização dos componentes num método, p.ex. um método de acordo com a presente invenção. Materiais acessórios para assistir ou para permitir a realização de um tal método podem estar incluídos dentro de um kit.

As reatividades de anticorpos numa amostra podem ser determinadas através de meios apropriados. 0 radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. O antigénio marcado radioativamente é misturado com antigénio não marcado (a amostra teste) e é permitido que se ligue ao anticorpo. O antigénio ligado é separado fisicamente do antigénio não ligado e é determinado a quantidade de antigénio radioativo ligado ao anticorpo. Quanto mais antigénio existir na amostra teste, tanto menos antigénio radioativo irá se ligar ao anticorpo. Um ensaio de ligação competitiva pode também ser utilizado com antigénio não radioativo, utilizando antigénio ou um análogo unido a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, fósforo ou laser de coloração com absorção espetralmente isolada ou características de emissão. 51 fluorocromos apropriados incluem fluoresceina, rodamina, ficoeritrina e Texas Red. Corantes cromogéneos apropriados incluem diaminobenzidina.

Outros repórteres incluem partículas colóides macromoleculares ou material em partículas tal como contas de latex que são coloridos, magnéticos ou paramagnéticos, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que podem causar diretamente ou indiretamente sinais detetáveis para serem visualmente observados, detetados eletronicamente ou registados de outra forma. Estas moléculas podem ser enzimas, que catalisam reações que desenvolvem, ou alteram cores ou causam alterações de propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser molecularmente excitáveis, de tal forma que transições eletrónicas entre estados de energia resultam em absorções ou emissões espetrais características. Elas podem incluir entidades quimicas utilizadas conjuntamente com biossensores. Podem ser empregues sistemas de deteção biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina.

Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórter individuais podem ser utilizados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação do anticorpo relevante em amostras (normal e teste). A presente invenção também põe à disposição a utilização de um membro de ligação especifica como anteriormente referido para medir os niveis de antigénio num ensaio de competição, ou seja um método de medição do nivel de antigénio numa amostra utilizando um membro de ligação especifica como providenciado pela presente invenção num ensaio de competição. Isto pode ser onde não é necessário a separação fisica do antigénio ligado do não ligado. A união de uma molécula repórter a um membro de ligação especifica de 52 forma que ocorra uma alteração física ou ótica quando a ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar diretamente ou indiretamente sinais detetáveis, e preferencialmente mensuráveis. A união de moléculas repórter pode ser diretamente ou indiretamente de forma covalente, p.ex. por meio de uma ligação peptídica ou não covalente. Uma união por meio de uma ligação peptídica pode ser como resultado da expressão recombinante de uma fusão de genes que codifica o anticorpo e a molécula repórter. A presente invenção também providencia a medição de níveis de antigénio diretamente, ao empregar um membro de ligação específica de acordo com a invenção por exemplo num sistema biossensor. 0 modo da determinação da ligação não é uma caraterística da presente invenção e os peritos na técnica são capazes de escolher um modo apropriado de acordo com as suas preferências e conhecimento geral. A competição entre membros de ligação pode ser feita facilmente em ensaio in vitro, por exemplo ao marcar uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detetado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não marcado(s), para permitir a identificação de membros de ligação específica que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto. A competição pode ser determinada por exemplo utilizando ELISA no qual NGF é imobilizado numa placa e é adicionado à placa um primeiro membro de ligação marcado juntamente com um ou mais membros de ligação não marcados. A presença de um membro de ligação não marcado que compete com o membro de ligação marcado é observada por uma diminuição do sinal emitido pelo membro de ligação marcado. 53

Ao testar para competição pode ser utilizado um fragmento peptidico do antigénio, especialmente um peptideo incluindo ou consistindo essencialmente num epítopo de interesse. Pode ser utilizado um peptideo contendo uma sequência do epitopo mais um ou mais aminoácidos em qualquer das extremidades. Os membros de ligação especifica de acordo com a presente invenção podem ser tal que a sua ligação ao antigénio é inibida por um peptideo com ou incluindo a sequência dada. Ao testar para isto, pode ser utilizado um peptideo com qualquer uma das sequências, mais um ou mais aminoácidos.

Os membros de ligação especifica que se ligam a um peptideo específico podem ser isolados por exemplo de uma biblioteca phage display através de panning com os peptideo(s). A presente invenção além disso põe à disposição um ácido nucleico isolado que codifica um membro de ligação específica da presente invenção. 0 ácido nucleico pode incluir DNA e/ou RNA. Num aspeto preferido, a presente invenção providencia um ácido nucleico que codifica um CDR ou um grupo de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou local de ligação no anticorpo ao antigénio ou molécula de anticorpo, p.ex. scFv ou IgG4, da invenção como definido anteriormente. A presente invenção também providencia construções sob a forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou de expressão que compreendem pelo menos um polinucleótideo como mencionado anteriormente. A presente invenção também providencia uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como mencionado anteriormente. Um ácido nucleico que codifica qualquer CDR ou grupo de CDRs ou 54 domínio VH ou domínio VL ou local de ligação no anticorpo ao antigénio ou molécula de anticorpo, p.ex. scFv ou IgG4 como providenciado, por si só forma um aspeto da presente invenção, assim como um método de produção do produto codificado, cujo método compreende a expressão do ácido nucleico codificante para este. A expressão pode convenientemente ser alcançada ao cultivar sob condições apropriadas células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. A seguir à produção por expressão de um domínio VH ou VL, ou membro de ligação específica pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica apropriada, depois utilizado como apropriado.

Os membros de ligação específica, domínios VH e/ou VL, e moléculas de ácido nucleico codificantes e vetores de acordo com a presente invenção podem ser providenciados isoladamente e/ou purificados, p.ex. do seu meio natural, sob a forma substancialmente pura ou homogénea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de outra origem que não a sequência que codifica um polipeptídeo com a função requerida. 0 ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser na sua totalidade ou parcialmente sintético. Referência a uma sequência de nucleótido como definido aqui abrange uma molécula de DNA com a sequência especificada, e abrange uma molécula de RNA com a sequência especificada na qual U está substituído por T, a não ser que o contexto requeira de outra forma. São bem conhecidos sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo numa variedade de células hospedeiras diferentes. Células hospedeiras apropriadas incluem bactérias, células de mamíferos, células vegetais, leveduras e sistemas baculovirus e plantas e animais transgénicos. A expressão de anticorpos e fragmentos de 55 anticorpos em células procariotas está bem demonstrada na técnica. Para uma revisão, ver por exemplo Pliickthun (1991) . Um hospedeiro bacteriano comum, preferido é E. coli. A expressão em células eucariotas em cultura está também disponível para os peritos na técnica como uma opção para a produção de um membro de ligação específica por exemplo Chadd & Chamow (2001), Andersen & Krummen (2002), Larrick & Thomas (2001). As linhas celulares de mamíferos disponíveis na técnica para a expressão de polipeptídeos heterólogos incluem células do ovário do hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim do hamster bebé, células do melanoma do ratinho NS0, células do mieloma do rato YB2/0, células embrionárias humanas do rim, células embrionárias humanas da retina e muitas outras.

Vetores apropriados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências regulatórias apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências de estimulação, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos p.ex. phagemid, ou virais p.ex. fago, como apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Sambrook & Russell (2001) . Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de DNA em células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em detalhe em Ausubel et al., 1988 e Ausubel et al., 1999.

Assim, um outro aspeto da presente invenção providencia uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como divulgado aqui. Uma tal célula hospedeira pode estar in vitro e pode 56 estar em cultura. Uma tal célula hospedeira pode estar in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação especifica, da presente invenção, como "intrabodies" ou anticorpos intracelulares. Intrabodies podem ser utilizados para terapia genética.

Ainda um outro aspeto providencia um método compreendendo a introdução de tal ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucariotas, técnicas apropriadas podem incluir transfeção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, transfeção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovírus ou outro vírus, p.ex. vírus vaccinia ou, para células de inseto, baculovirus. Para a introdução de ácido nucleico na célula hospedeira, em particular numa célula eucariótica, pode ser utilizado um sistema virai ou baseado num plasmídeo. 0 sistema plasmídeo pode ser mantido de forma epissomal ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou num cromossoma artificial. A incorporação pode ser ou por integração aleatória ou dirigida de uma ou mais cópias em lócus únicos ou múltiplos. Para células bacterianas, as técnicas apropriadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfeção utilizando um bacteriófago. A introdução pode ser prosseguida ao causar ou permitir a expressão de ácido nucleico, p.ex. cultivando as células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

Numa forma de realização, o ácido nucleico da invenção é integrado no genoma (p.ex. cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de 57 sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com as técnicas padrão. A presente invenção também providencia um método que compreende uma construção como referido anteriormente num sistema de expressão de forma a expressar um membro de ligação especifica ou polipeptídeo como referido anteriormente.

Aspetos e formas de realização da presente invenção serão agora ilustradas, por meio de exemplos, com referência às experiências seguintes e as imagens em anexo, nos quais: A Figura 1 apresenta as curvas de concentração-inibição para neutralização com anticorpos de NGF humano (Figura IA) e de rato (Figura 1B) no ensaio de mobilização de cálcio do recetor TrkA humano. Os anticorpos IgG4 NGF humanos foram comparados com os anticorpos comerciais G1131, Mab5260Z, e MAB256 para NGF para inibição da mobilização do cálcio intracelular evocada por lnM NGF. Os pontos referentes aos dados indicam os resultados de uma única experiência e são a média ± sd de determinações triplicadas para cada concentração de anticorpo. A Figura 2 apresenta a inibição da mobilização do cálcio intracelular em células HEK-293 que expressam de forma recombinante o recetor TrkA humano. Foram avaliados os anticorpos IgG4 humanos com potência-otimizada relativamente à inibição de respostas evocadas por lnM NGF humano (Figura 2A) , de rato (Figura 2B) , e de ratinho (Figura 2C) . Os pontos referentes aos dados indicam os resultados de uma única experiência e são a média ± sd de determinações triplicadas para cada concentração de anticorpo. 58 A Figura 3 apresenta o efeito inibitório de anticorpos IgG4 NGF humanos no ensaio de sobrevivência celular PC12. A sobrevivência celular foi mantida pela presença de lnM NGF humano (Figura 3A) ou NGF de rato (Figura 3B) . Os dados indicam a média ± sd para determinações triplicadas de uma única experiência. A Figura 4 apresenta a inibição da proliferação celular TF-1 mediada por NGF por anticorpos IgG4 NGF humanos da linha germinal e da linha não-germinal, e o anticorpo NGF de referência, MAB256. As células foram estimuladas com 200pM NGF humano (Figura 4A) , NGF de rato (Figura 4B), ou NGF de ratinho (Figura 4C). Os dados representam a média ± sem de determinações triplicadas de uma única experiência. A Figura 5 apresenta a falta de reatividade cruzada do anticorpo IgG4 NGF humano 1252A5 com as neurotrofinas BDNF, NT-3 e NT-4. Foi adsorvido lOOng neurotrofina por poço. Cada ponto referente aos dados representa a média ± sd de determinações triplicadas de uma única experiência. A Figura 6 apresenta as curvas de saturação da ligação para o 125I-NGF humano que se liga aos anticorpos IgG4 NGF humanos 1252A5 (Figura 6A) e G1152H5 (Figura 6B). Os valores Kd calculados são 0,35nM e 0,37nM, respetivamente, e são o resultado de uma única experiência. A Figura 7 apresenta as curvas de saturação da ligação para o 125I-NGF de rato que se liga aos anticorpos IgG4 NGF humanos 1252A5 (Figura 7A) e G1152H5 (Figura 7B). Os valores calculados Kd são 0,44nM e 0,50nM, respetivamente, e são o resultado de uma única experiência. A Figura 8 apresenta a inibição dependente da concentração da ligação de 125I-NGF humano (Figura 8A) ou de rato (Figura 59

8Β) à proteína de fusão do recetor TrkA, por IgG4 humano ou anticorpos de referência. A concentração de NGF radiomarcado em cada poço de ensaio foi aproximadamente 150pM. Os dados indicam o resultado de uma única experiência. Ver também Tabelas 6 e 7.

A Figura 9 apresenta a inibição dependente da concentração da ligação de 125I-NGF humano (Figura 9A) ou de rato (Figura 9B) à proteína de fusão do recetor p75, por IgG4 humano ou anticorpos de referência. A concentração de NGF radiomarcado em cada poço de ensaio era aproximadamente 150pM. Os dados indicam o resultado de uma única experiência. Ver também Tabelas 8 e 9. A Figura 10 apresenta a inibição relacionada com a dose da hiperalgesia térmica induzida por carragenina no ratinho, 48h após administração sistémica do IgG4 anti-NGF humano, 1252A5. EXEMPLO 1

Isolamento de scFv anti-NGF Repertório do anticorpo ScFv

Foram utilizadas para as seleções três grandes bibliotecas do anticorpo humano de cadeia única Fv (scFv) clonadas num vetor phagemid. As bibliotecas foram derivadas de (A) linfócitos do baço (Hutchings, 2001), (B) uma combinação de linfócitos do sangue periférico, células das amígdalas B e células da medula espinal B (Vaughan et ai., 1996) e (C) as cadeias leves e regiões VH CDR3 de A combinado com o framework da cadeia pesada da linha germinal DP47. 60

Seleção de scFv O procedimento de seleção de fago utilizado foi essencialmente descrito em Hutchings, supracitado. Foi isolado ScFv que reconhecia NGF de bibliotecas de phage display numa série de ciclos de seleção em NGF humano e de rato. Brevemente, o antigénio não modificado foi fixado a tubos Nunc Maxisorb. Os fagos foram incubados no antigénio num volume total de 500yL durante lh antes de lavar para remover fagos não ligados. Os fagos ligados foram então resgatados como descrito por Vaughan et al., supracitado, e o processo de seleção foi repetido. Para auxiliar no isolamento de scFv de reatividade cruzada humano/roedor, foram realizados ciclos alternados de seleção nas respetivas espécies de isoformas de NGF. Foi realizado um máximo de quatro ciclos de seleção com qualquer biblioteca utilizando esta estratégia de seleção da isoforma alternada. Não foram utilizados nem β-NGF humano nem de rato como o antigénio inicial para o primeiro ciclo de seleção.

Os resultados dos ciclos 2-4 foram prioritarizados para rastreio bioquímico baseado na percentagem de clones especificos-NGF isolados e na diversidade da sequência destes clones. A percentagem de clones especificos-NGF foi determinada em cada caso por fago ELISA. A diversidade de sequência foi determinada por sequenciação de DNA.

Protocolo de fago ELISA

Foram preparadas culturas de bactérias transduzidas com fagos em lmL meio 2xTY contendo 100pg/mL ampicilina e 50yg/mL canamicina com agitação a 30°C durante 16h. O sobrenadante com fagos foi preparado por centrifugação da cultura (10 min a 3000rpm) e bloqueio com 3% p/v leite em 61 pó em PBS durante lh. Os fagos bloqueados foram então adicionados a placas previamente revestidas com (lyg/mL) antigénio ou antigénio irrelevante. As placas foram lavadas entre cada passo com três lavagens em PBS-Tween 20 (0,1% v/v) seguido de três lavagens em PBS. Os fagos ligados foram detetados por incubação com peroxidase de rábano (HRP)/conjugados anti-M13 (Amersham UK) diluido 1:5000 em 3% p/v leite em pó PBS durante lh, e desenvolvidos por incubação com substrato tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma). A reação colorimétricas foi parada após um período apropriado adicionando 0,5M ácido sulfúrico. As leituras de absorvância foram feitas a 450nm. Os clones que se ligam especificamente ao antigénio foram identificados como tendo um sinal no antigénio maior que ou igual a 5x do que o no antigénio irrelevante.

Sequenciação de DNA O modelo de DNA de cadeia dupla para sequenciação foi obtido por PCR de scFv utilizando os iniciadores FDTETSEQ24 (TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT - SEQ ID N° : 534) e PUCreverse (AGCGGATAACAATTTCACACAGG - SEQ ID N° : 535). Foi removido o iniciador e dNTPs em excesso do primeiro PCR utilizando placas de PCR de 96 poços Macherey-Nagel Nucleofast (Millipore) de acordo com as recomendações do fabricante. Os genes VH foram sequenciados com iniciador Lseq (GATTACGCCAAGCTTTGGAGC SEQ ID N° : 536). Os genes VL foram sequenciados com iniciador MYC Seq 10 (CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG SEQ ID N°: 537). Cada mistura reacional continha 20-40ng DNA, 3 - 20pmol iniciador e 4yL Big Dye Terminator V3,0 (Applied Biosystems, UK) num volume de 20yL. As reações de sequenciação consistiram em 25 ciclos de 96°C lOs; 50°C, 5s; 60°C, 4min. As amostras foram corridas e analisadas num analisador de DNA Applied Biosystems 3700. As áreas de ambiguidade foram analisadas 62 manualmente utilizando o Continuity software desenvolvido internamente (Cambridge Antibody Technology, UK) e o software de manipulação da sequência de DNA SeqEd (Applied Biosystems, UK).

Rastreio bioquímico de scFv que neutraliza NGF 0 resultado do processo de seleção de fagos foi mais rastreado para identificar clones que inibiam a ligação de NGF à proteína de fusão do domínio extracelular do recetor TrkA.

Foram preparadas amostras grosseiras de scFv de lisados periplasmáticos de bactéria E.coli TG-1 transfetada com fagos selecionados para avaliação no ensaio de ligação. Foram revestidas placas de 96 poços Nunc Maxisorb durante a noite com a proteína de fusão do domínio extracelular do recetor TrkA humano (R&D Systems; concentração de revestimento; ensaio NGF humano, 0,25nM; ensaio NGF de rato, lnM) . As placas de ensaio foram lavadas com PBS / Tween 20, bloqueadas durante 2h utilizando 1% seroalbumina bovina (BSA) em PBS, e lavadas outra vez. As amostras ScFv foram pré-incubadas durante 30min com lnM β-NGF recombinante humano ou de rato (R&D Systems) em 1% BSA. As amostras foram transferidas num volume de 100pL para placas de ensaio e incubadas durante 60min a temperatura ambiente. As placas foram lavadas e o NGF que permaneceu ligado às placas foi marcado utilizando 0,3yg/mL de qualquer uma de biotina NGF anti-humano (Peprotech) ou biotina NGF anti-rato (R&D Systems) diluído em 1% BSA, seguido por incubação durante 60min a temperatura ambiente. O anti-NGF marcado com biotina foi detetado utilizando o sistema de deteção de fluorescência de resolução temporal DELFIA (Wallac). Brevemente, as placas foram lavadas e foi adicionado 100yL estreptavidina Eu3+ a cada poço, diluído 1/1000 em tampão 63 de ensaio DELFIA. As placas foram incubadas durante mais 60 min a temperatura ambiente e lavadas com tampão de lavagem DELFIA, seguido por adição de 100pL solução de aumento DELFIA a cada poço. Foi feita a leitura das placas utilizando um Wallac Victor leitor de placas por fluorimetria (comprimento de onda de excitação 314nm; comprimento de onda de emissão 615nm).

Os clones que inibiram ambas as ligações de NGF humano e de rato em mais de 70% como preparações de lisados periplasmáticos scFv foram reavaliados como scFv purificado no ensaio de ligação. As preparações de scFv purificadas foram preparadas como descrito no Exemplo 3 de WOOl/66754. As concentrações de proteina de preparações de scFv purificadas foram determinadas utilizando o método BCA (Pierce). O reensaio destacou os seguintes anticorpos scFv que eram potentes neutralizadores da ligação de NGF humano e de rato à proteina de fusão do domínio extracelular do recetor TrkA humano: (VH SEQ ID N° : 2; VL SEQ I D N° : 7) , (VH SEQ ID N° : 12; VL SEQ ID N° : 17) (VH SEQ ID N° : 22; VL SEQ ID N° : 27) (VH SEQ ID N° : 32; VL SEQ ID N° : 37) (VH SEQ ID N° : 42; VL SEQ ID N° : 47) (VH SEQ ID N° : 52; VL SEQ ID N° : 57) (VH SEQ ID N° : 62; VL SEQ ID N° : 67) (VH SEQ ID N° : 72; VL SEQ ID N° : 77) (VH SEQ ID N° : 82; VL SEQ ID N° : 87) (VH SEQ ID N° : 92 ; VL SEQ 1—1 U 3 0 : 97 1064F8 1022E3 1083H4 1021E5 1033G9 1016A8 1028F8 1033B2 1024C4 1057F11 EXEMPLO 2

Expressão de anticorpos IgG4 humanos e avaliação funcional in vitro da potência de neutralização de NGF 64

Os scFv 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, 1024C4, e 1057F11 que neutralizam NGF foram reformatados como anticorpos IgG4 humanos e submetidos a ensaio relativamente à potência de neutralização de NGF num sistema de ensaio de célula inteira.

Conversão de IgG

Foram construídos vetores para os clones scFv mais potentes para permitir a re-expressão como anticorpo inteiro humano IgG4, essencialmente como descrito por Persic et al. (1997). As células EBNA-293 mantidas em meio condicionado foram co-transfetadas com construções que expressam domínios de cadeia pesada e leve. Foi purificado o anticorpo inteiro do meio utilizando a cromatografia de afinidade proteína A (Amersham Pharmacia). As preparações de anticorpo purificadas foram filtradas esterilmente e armazenadas a 4°C em sistema tampão fosfatado (PBS) antes da avaliação da potência in vitro. As concentrações de proteína foram determinadas espetrofotometricamente de acordo com Mach et al. (1992).

Ensaio de mobilização de cálcio intracelular FLIPR A potência e eficácia de IgGs anti-humano para neutralizar NGF foi determinada num ensaio de mobilização de cálcio fluorescente baseado na célula. A potência de anticorpos humanos foi comparada com o NGF anti-humano de rato (MAB256; R&D Systems), NGF anti-ratinho de rato (G1131; Promega), e NGF anti-ratinho de ratinho (MAB5260Z;

Chemicon). IgGs anti-NGF foram co-incubados com β-NGF recombinante humano (Calbiochem, 480275) ou β-NGF recombinante de rato (R&D Systems, 556-NG-100). O complexo foi então adicionado a células HEK293 que expressam 65 recetores TrkA recombinantes humanos carregado com o corante sensível a cálcio, Fluo-4, e depois foi monitorizada a fluorescência dependente de Ca2+.

Células HEK (peak-S, Edge Biosystems) transfetadas com TrkA recombinante humano (obtido de M. Chao, Skirball Institute, NY) cresceram em Dulbecco's Modified Eagle's Médium (MEM, Cellgro, MT10-017-CV) suplementado com 10% soro fetal bovino (Hyclone, SH30071.03), 1.5 yg/mL puromicina (Edge Biosystems, 80018) e 1% penicilina-estreptomicina. Foram colhidas as células confluentes deslocando as células com Dulbecco's sistema tampão fosfatado (DPBS), e depois carregado com tampão de carregamento contendo 6 μΜ Fluo-4 (Molecular Probes) a 37°C durante l,5h na presença de um inibidor de transporte de aniões (2,5 mM probenecida em 1% FBS/MEM) . Após lavagem das células uma vez com tampão de ensaio (2,5 mM probenecida em 0,1% BSA Hank's / HEPES), as células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas por poli-D-lisine, de fundo transparente (Costar #3904) a aproximadamente 60.000 células/poço em 120 yL. As células foram incubadas no escuro durante 30 min a temperatura ambiente, e as placas foram então centrifugadas a 1.200 rpm (290 x g) durante 5min. Antes de testar, as placas foram pré-aquecidas a 35°C durante 20 min. Foram feitos ensaios de IgGs teste em 7 concentrações em poços triplicados. Trinta e cinco microlitros de 10X IgG anti-NGF e quantidades iquais de 10 nM 2,55 NGF humano, de rato ou de ratinho foram pré-incubados a temperatura ambiente durante aproximadamente lh. As placas contendo os IgGs pré-complexados e as placas contendo 100 yL/poço de tampão de ensaio foram pré-aquecidas a 35°C durante 20min antes de testar no Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR; Molecular Devices). A seguir à adição de 80yL/poço de tampão ensaio à placa para células e incubação durante 5 min a 35°C, foi adicionado à placa para células no FLIPR 66 50yL/poço de complexo IgG / NGF anti-humano diluído com monitorização contínua da fluorescência dependente de Ca2+. A fluorescência induzida por NGF foi calculada como a diferença entre a intensidade da fluorescência de base de referência mesmo antes da adição de NGF e a intensidade da fluorescência mais elevada obtida 2 minutos a seguir à adição de NGF. A média dos valores triplicados de fluorescência induzida por NGF na ausência de anticorpo foi definida como 100% mobilização de cálcio. Na presença do anticorpo, a média ± SD dos valores triplicados de fluorescência induzida por NGF foi calculada como a percentagem da mobilização de cálcio controlo. Os valores de percentagem da mobilização de cálcio controlo foram traçados como função do log da concentração de IgG. Os valores IC50 foram calculados ajustando a função sigmoide da resposta à dose (declive variável) utilizando Prism (GraphPad).

Todos os anticorpos testados apresentaram inibição relacionada com a concentração, da mobilização do cálcio intracelular evocada por NGF humano. A ordem hierárquica da potência da neutralização do NGF humano foi 1064F8 > 1022E3 > 1083H4 > 1033G9 > 1016A8 > 1028F8 > 1021E5 > 1033B2 » 1024C4 >> 1057F11 (Tabela 1) . Foram avaliados ainda cinco anticorpos relativamente à neutralização funcional de NGF de rato, e estes eram aproximadamente equipotentes relativamente a ambas as espécies de isoformas (Figuras IA e 1B; Tabela 1). EXEMPLO 3

Isolamento de anticorpos IgG4 NGF humanos otimizados Otimização da potência de ribosome display scFv 67

Foram criadas grandes bibliotecas de ribosome display e selecionado para scFv que especificamente reconheceram NGF recombinante humano (R&D Systems), essencialmente como descrito em Hanes et ai. (2000). Inicialmente, os clones 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, e 1024C4 foram convertidos para formato ribosome display, onde os modelos foram subsequentemente utilizados para criação de biblioteca. O clone 1057F11 não foi escolhido para a otimização da potência, e por isso não foi feito um modelo ribosome display para este anticorpo. Ao nivel do DNA, foi adicionado um promotor T7 na extremidade 5' para transcrição eficiente para mRNA. Ao nivel do mRNA, a construção continha um local de ligação ao ribossoma procariota (sequência Shine-Dalgarno). Na extremidade 3' da cadeia única, o codão stop foi removido e foi adicionado uma porção de glll para agir como espaçador (Hanes et al., supracitado).

As bibliotecas de ribosome display derivadas de 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, e 1024C4 foram criadas por mutagénese do scFv HCDR3. Foram realizadas reações PCR com leitura non-proof Taq polimerase. As seleções baseadas na afinidade foram realizadas em que, a seguir à incubação com a biblioteca, foi conjugado NGF biotinilado humano a contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal M280). Foram recuperados complexos terciários de ligação (mRNA-ribosoma-scFv) através de separação magnética enquanto os complexos não ligados foram retirados por lavagem. O mRNA que codifica o scFv bound foi então resgatado por RT-PCR como descrito em Hanes et al., (supracitado) e o processo de seleção foi repetido com concentrações decrescentes (100 nM - 10 pM ao longo de cinco ciclos) de NGF biotinilado humano presente durante a seleção. 68 PCR propenso a erros foi também utilizado para aumentar mais o tamanho da biblioteca. Foi empregue uma taxa de erro de 7,2 mutações por 1.000 bp (Diversify™, Clontech) durante o regime de seleção. Foram realizadas reações PCR propenso a erros antes de as seleções começarem nos ciclos três e quatro utilizando concentrações de NGF biotinilado humano de 1 nM e 0,1 nM, respetivamente.

Uma proporção representativa de scFv do resultado dos ciclos de seleção três, quatro e cinco foram ligados no vetor pCantabô (Vaughan et al., 1996) e clonados na estirpe TGl de E.coli. Foi feita a sequenciação de DNA de uma amostra destes scFv como descrito no Exemplo 1 para confirmar a diversidade de sequência do resultado antes do rastreio da atividade de neutralização do NGF in vitro. Os clones foram rastreados como scFv não purificado nos ensaios de ligação de NGF / proteína de fusão do domínio extracelular do recetor TrkA, como descrito no Exemplo 1. A concentração das preparações de lisado periplasmático scFv nos ensaios foi reduzida para 0,5% - 5% do volume de ensaio final, e os clones que inibiam ambas as ligações de NGF humano e de rato >95% foram isolados para mais estudo. Desta forma foi isolado um painel de neutralizadores de NGF potência-optimizada, com reatividade cruzada. Surpreendentemente, os neutralizadores de NGF mais potentes foram derivados dos clones parentais 1021E5 e 1083H4, que não eram os mais potentes dos anticorpos parentais. Os clones otimizados foram sequenciados e re-submetidos a ensaio como scFv purificado para confirmar a potência antes de reformatar para IgG4 humano como descrito no Exemplo 2.

Os anticorpos derivados do clone parental 1021E5 (VH SEQ ID N°: 32; VL SEQ ID N°: 37) e convertidos para o formato IgG4 eram 1126F1 (VH SEQ ID N°: 102; VL SEQ ID N°: 107), 1126G5 (VH SEQ ID N° : 112; VL SEQ ID N° : 117), 1126H5 (VH SEQ ID 69 Ν°: 122; VL SEQ ID N°: 127), 1127D9 (VH SEQ ID N°: 132; VL SEQ ID N° : 137), 1127F9 (VH SEQ ID N° : 142; VL SEQ ID N° : 147), 1131D7 (VH SEQ ID N°: 152; VL SEQ ID N°: 157), 1131H2 (VH SEQ ID N°: 162; VL SEQ ID N°: 167), 1132A9 (VH SEQ ID N°: 172; VL SEQ ID N°: 177), 1132H9 (VH SEQ ID N°: 182; VL SEQ ID N°: 187), 1133C11 (VH SEQ ID N°: 192; VL SEQ ID N°: 197), 1134D9 (VH SEQ ID N°: 202; VL SEQ ID N°: 207), 1145D1 (VH SEQ ID N° : 212; VL SEQ ID N° : 217), 1146D7 (VH SEQ ID N°: 222; VL SEQ ID N°: 227), 1147D2 (VH SEQ ID N°: 232; VL SEQ ID N° : 237), 1147G9 (VH SEQ ID N° : 242; VL SEQ ID N° : 247), 1150F1 (VH SEQ ID N°: 252; VL SEQ ID N°: 257), 1152H5 (VH SEQ ID N°: 262; VL SEQ ID N°: 267), 1155H1 (VH SEQ ID N°: 272; VL SEQ ID N°: 277), 1158A1 (VH SEQ ID N°: 282; VL SEQ ID N° : 287), 1160E3 (VH SEQ ID N° : 292; VL SEQ ID N° : 297), 1165D4 (VH SEQ ID N°: 302; VL SEQ ID N°: 307), 1175H8 (VH SEQ ID N°: 312; VL SEQ ID N°: 317), 1211G10 (VH SEQ ID N°: 322; VL SEQ ID N°: 327), 1214A1 (VH SEQ ID N°: 332; VL SEQ ID N°: 337), 1214D10 (VH SEQ ID N°: 342; VL SEQ ID N°: 347), 1218H5 (VH SEQ ID N°: 352; VL SEQ ID N°: 357), e 1230H7 (VH SEQ ID N°: 362; VL SEQ ID N°: 367).

Os anticorpos derivados do clone parental 1083H4 (VH SEQ ID N°: 22; VL SEQ ID NO: 27) e convertidos para o formato IgG4 humano eram 1227H8 (VH SEQ ID N°: 372; VL SEQ ID N°: 377) e 1230D8 (VH SEQ ID N°: 382; VL SEQ ID N°: 387).

Regiões framework de linha germinal de 1133C11 para derivar 1252A5 e outras variantes 1021E5 A observação da informação da sequência de VH e VL CDR de clones otimizados derivados de 1021E5 destacou que uma larga proporção destes anticorpos continha a sequência de aminoácidos LNPSLTA (SEQ ID N° : 531) no VH CDR3 (i.e. aminoácidos 100A a 100G de acordo com o sistema de numeração de Kabat). Estes clones são mostrados na Tabela 70 2a, destacando como eles variam na sequência de aminoácidos nas regiões VH e VL CDR, juntamente com uma estimativa das suas potências de neutralização de NGF quando submetidos a ensaio como scFv purificado. Destes clones, 1133C11 diferiu nas regiões CDR de 1021E5 apenas nos 7 aminoácidos consecutivos 100A a 100G como descrito. Por isso, foi escolhido 1133C11 para germlining, primeiro para confirmar que a potência era mantida com o framework modificado, e segundo para permitir que mutações CDR subsequentes fossem introduzidas, se desejado, de forma a gerar mais anticorpos de linha germinal de interesse da mesma linhagem.

As sequências de aminoácidos derivados VH e VL de 1133C11 foram alinhadas com as sequências de linha germinal humanas conhecidas na base de dados VBASE (Tomlinson [1997], MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) e identificado a linha germinal mais próximo. A linha germinal mais próximo do VH de 1133C11 foi identificada como DP10, um membro da familia VH1. O 1133C11 VH tem 5 alterações de aminoácidos do DP10 de linha germinal dentro das regiões framework. A linha germinal mais próximo para o VL de 1133C11 foi identificado como DPL5, um membro da familia VÀl. O 1133C11 VL tem apenas 4 alterações da linha germinal dentro das regiões framework. As regiões framework de 1133C11 foram retornadas à linha germinal por mutagénese direcionada para o local do scFv para derivar o scFv 1252A5 (VH SEQ ID N°: 392; VL SEQ ID N°: 397). Isto foi convertido para IgG4 humano como descrito no Exemplo 2. Germlining de outras variantes de clones derivados de 1021E5 foi alcançado por introdução de mutações CDR na estrutura base germlined 1252A5 IgG4. Este método resultou na geração de anticorpos germlined G1152H5 (VH SEQ ID N°: 402; VL SEQ ID N° : 407), G1165D4 (VH SEQ ID N°: 412; VL SEQ ID N°: 417) e G1230H7 (VH SEQ ID N°: 422; VL SEQ ID N°: 427). 71 EXEMPLO 4

Avaliação de anticorpos IgG4 humanos otimizados no ensaio de mobilização de cálcio intracelular FLIPR

Anticorpos IgG4 NGF humanos otimizados foram avaliados num ensaio de mobilização de cálcio intracelular evocada por NGF em células que expressam de forma recombinante o recetor TrkA humano, como descrito no Exemplo 2. Os anticorpos foram submetidos a ensaio relativamente à atividade de neutralização de NGF humano, de rato, e de ratinho (Figuras 2A, 2B, e 2C; Tabela 3). A mobilização de cálcio intracelular evocada por lnM NGF foi inibida por todos os anticorpos humanos otimizados testados. Os anticorpos otimizados apresentaram valores IC50 subnanomolares, na maioria dos casos representando um aumento em mais de cem vezes que a potência de neutralização de NGF dos IgGs parentais (Tabela 3) . As potências neutralizadoras (IC50) de anticorpos IgG4 germlined humanos contra as isoformas de NGF humano, de rato e de ratinho foi respetivamente: 1252A5 - 0,33nM, 0,29nM, e 0,26nM; G1152H5 - 0,22nM, 0,27nM, e 0,18nM; G1165D4 - 0,32nM, 0,33nM, e 0,27nM; G1230H7 - 0,31nM, 0,34nM, e 0,25nM.

Estes resultados destacaram a eficiência e valor da técnica de ribosome display para a otimização da potência do anticorpo. Uma abordagem mais convencional para otimização do anticorpo no passado foi gerar bibliotecas phage display de variantes de anticorpos scFv. Este processo é trabalhoso e mais lento que o método de ribosome display, o que frequentemente significa que apenas um único scFv parental 72 é utilizado como ponto de partida para a construção da biblioteca. A relativa facilidade de gerar bibliotecas de ribosome display permite múltiplos scFv parentais serem otimizados simultaneamente e, como demonstrado no Exemplo 3, isto pode levar ao isolamento de anticorpos altamente potentes derivados de clones parentais que de outra forma seriam negligenciados para a otimização. EXEMPLO 5

Avaliação de anticorpos IgG4 humanos otimizados num ensaio de sobrevivência celular PC12

No ensaio PC12, NGF mantém a sobrevivência de células de rato PC12 privadas de soro que expressam os recetores TrkA e p75 nativos durante dois dias. Os anticorpos que neutralizam NGF reduzem a sobrevivência celular medido com AlamarBlue.

As células feocromocitoma de rato PC12 cresceram em RPMI 1640 (Cellgro, 18040181) suplementado com 5% soro fetal bovino (JRH, 12103-78P), 10% soro de cavalo doador inativado por calor (JRH, 12446-77P), e 1% penicilina-estreptomicina. As células foram colhidas por trituração, e depois lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro contendo 0,01% BSA (Sigma, A7030) . As células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas de colagénio de cauda de rato (Biological Technology Institute, BT-274) a 50.000 células/poço em 120 pL meio sem soro com 0,01% BSA. Foram feitas diluições seriadas de 5X NGF IgGs anti-humano utilizando meio sem soro e foi adicionado 40 pL/poço á placa para células. Foi adicionado 40pL/poço 0,5 nM β-NGF humano (Calbiochem, 480275) ou NGF recombinante de rato (R&D Systems, 556-NG-100) à placa, e o volume total foi aumentado até 200 pL/poço com meio sem soro. A morte 73 celular máxima foi definida por 80 yL/poço de meio sem soro em poços triplicados. 100% sobrevivência foi definido como 40pL/poço meio sem soro e 40pL/poço 0,5nM NGF em poços triplicados. As placas foram incubadas a 37°C em 5% CO2 durante 48h. Para medir a viabilidade celular, foi adicionado 22 pL/poço AlamarBlue e foi feita imediatamente a leitura das placas para determinar a fluorescência de fundo em cada poço com um leitor de placas por fluorimetria (BMG) a 530 nm comprimento de onda de excitação e 590 nm comprimento de onda de emissão. A seguir à incubação durante 6-7h a 37°C, foi refeita a leitura da placa para determinar a fluorescência total. A fluorescência Alamar blue foi calculada como a diferença das intensidades de fundo e total. Na presença de anticorpo, foi calculada a média ± SD de valores de fluorescência triplicada como a percentagem da média dos valores de fluorescência de sobrevivência 100% em triplicado. A percentagem de valores de sobrevivência de controlo foi traçada como função do log da concentração de IgG. Foram calculados os valores IC50 ajustando a função sigmoide de resposta à dose (declive variável) utilizando Prism (GraphPad).

Os resultados do ensaio PC12 confirmaram ainda a potência aumentada de anticorpos IgG4 NGF humanos otimizados em comparação com os seus IgGs parentais. Os anticorpos inibiram a sobrevivência celular PC12 mantida por NGF humano e de rato de uma forma relacionada com a concentração (Figuras 3A e 3B; Tabela 3). Germlining pareceu reduzir a potência da neutralização de NGF dos anticorpos teste, particularmente contra a isoforma NGF de rato. Por exemplo, a média IC50 do anticorpo da linha germinal G1152H5 para a inibição da sobrevivência celular mediada por lnM NGF humano ou de rato foi de Ι,ΙηΜ e 7,3nM, respetivamente. Em contraste, a média IC50 para a neutralização de lnM NGF humano ou de rato por 1152H5 (i.e. 74 anticorpo da linha não-germinal) foi de 0,40nM e 0,38nM, respetivamente. EXEMPLO 6

Atividade de neutralização de NGF num ensaio de proliferação celular TF-1 A linha celular TF-1 é uma linha celular pré-mielóide humana que pode ser estimulada a proliferar por fatores de crescimento e citoquinas exógenos. As células TF-1 expressam o recetor TrkA humano, e proliferam em resposta à ativação com NGF. 0 ensaio de proliferação celular TF-1 foi utilizado para caracterizar ainda mais a potência funcional in vitro dos anticorpos de neutralização IgG4 NGF humanos.

Foram obtidas células TF-1 do R&D Systems e mantidas de acordo com os protocolos fornecidos. 0 meio do ensaio compreendido por RPMI-1640 com GLUTAMAX I (Invitrogen) contendo 5% soro fetal bovino (Hyclone) e 1% piruvato de sódio (Sigma). Antes de cada ensaio, as células TF-1 foram peletizadas por centrifugação a 300 x g durante 5 minutos, o meio foi removido por aspiração e as células re-suspensas em meio de ensaio. Este processo foi repetido três vezes com células re-suspensas numa concentração final de 105 /mL em meio de ensaio e foi adicionado 100yL a cada poço de uma placa de ensaio de cultura de tecido com fundo liso de 96 poços de forma a ter uma densidade celular final de lxl04/poço. As soluções teste de anticorpos (em triplicado) foram diluidas de forma a ter uma concentração de ensaio final de lyg/mL em meio de ensaio e titulado 1:5 de lado a lado da placa de ensaio. Um anticorpo irrelevante (CAT-001) que não é direcionado a NGF, foi utilizado como controlo negativo. Além disso, foi utilizado um anticorpo monoclonal de referência MAB256 (R&D Systems) como controlo positivo. 75

Foi então adicionado cinquenta microlitros de anticorpos teste a cada poço seguido de 50yL de NGF nativo purificado murino (forma 7S; Invitrogen), de rato (Sigma) ou humano (Sigma) diluido de forma a dar uma concentração de ensaio final de 200pM. As placas de ensaio foram incubadas durante 68h a 37°C em 5% CO2 numa câmara humidificada. Foi então adicionado vinte microlitros de timidina tritiada (5,0 yCi/mL, NEN) a cada poço de ensaio e as placas de ensaio foram devolvidas à incubadora por mais 5h. As células foram colhidas em placas de filtro de fibra de vidro de 96 poços (Perkin Elmer) utilizando um aparelho de recolha de células. Foi então adicionado MicroScint 20TM (50μ1) a cada poço da placa de filtro e a incorporação de [3H]-timidina foi quantificada utilizando um contador de microplaca de cintilação liquida Packard TopCount. Na presença de anticorpo, a incorporação de timidina (quantificada como contagens por minuto) foi calculada como a diferença entre as médias das contagens por minuto de fundo (i.e. células não expostas a NGF) e total (i.e. células estimuladas com NGF) e expressa como a percentagem de proliferação máxima. A percentagem de proliferação máxima foi traçada como função do log da concentração de IgG. Foram calculados os valores IC50 ajustando a função sigmoide dose (declive variável) utilizando GraphPad prism.

Os anticorpos IgG4 NGF humanos eram inibidores potentes da proliferação celular TF-1 mediada por isoformas de NGF humano, de rato e de ratinho (Figuras 4A, 4B, e 4C) . Estes resultados demonstram que os anticorpos derivados da linhagem 1021E5 podem interromper a sinalização NGF mediada pela ativação dos recetores NGF nativos humanos in vitro. De acordo com a atividade observada de anticorpos NGF humanos no ensaio de sobrevivência PC12 (Exemplo 5) , os anticorpos de linha não-germinal eram mais potentes que os seus homólogos de linha germinal no ensaio de proliferação 76 TF-1 (Tabela 3) . Baseado na média dos dados IC50, a ordem hierárquica da potência dos anticorpos testados relativamente à inibição da proliferação mediada por 200pM NGF humano foi 1133C11 > 1152H5 > 1252A5 = G1152H5 » MAB256. EXEMPLO 7

Reatividade cruzada de IgGs anti-NGF com outras neurotrofinas

Foram realizados ELISAs para determinar a reatividade cruzada de IgGs anti-NGF com outras neurotrofinas. Os ELISAs consistiram em placas revestidas com 100 ng/poço NGF humano (R&D Systems, 256-GF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; R&D Systems, 248-BD), neurotrofina-3 (NT-3; R&D Systems, 257-N3), ou neurotrofina-4 (NT4; R&D Systems, 257-N4) a temperatura ambiente durante 5-6 h, seguido de bloqueio das placas com 0,25% HSA a 4°C durante a noite. Foram incubadas concentrações crescentes de IgG anti-NGF, num intervalo de 0,03 - 10 nM, a temperatura ambiente durante 2 h para permitir a ligação a cada neurotrofina. Foram detetados IgGs anti-NGF com um anticorpo policlonal biotinilado anti-humano (1:300) (Rockland 609-1602), fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina (1:1000), e Substrato A fluorescente. Nos controlos positivos demonstrando a ligação de neurotrofina à placa foram utilizados anticorpos policlonais biotinilados anti-humano comerciais (R&D Systems anti-NGF BAF 256, ant i -BDNF BAM 648, anti-NT-3 BAF 267, anti-NT-4 BAF 268), que foram detetados diretamente utilizando fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina e adição subsequente de Substrato A. Foi determinada a ligação não especifica utilizando poços revestidos com BSA em vez de neurotrofina. O desenvolvimento do produto foi seguido ao 77 longo do tempo de 0 - 60 min após adição do Substrato A. Foi utilizado IgG anti-NGF 1064F8 para otimizar o ensaio. Para 1064F8, houve desenvolvimento do produto linear durante 15 min, que depois estabilizou com o tempo, provavelmente devido à depleção de substrato. Foram calculadas as reatividades cruzadas como percentagem da ligação especifica a neurotrofina relativamente a NGF para todas as concentrações de IgG. Para IgGs de elevada afinidade tal como 1064F8, a percentagem de reatividade cruzada foi calculada utilizando os dados do desenvolvimento do produto de 15 min. Para IgGs de baixa afinidade tal como 1016A8, a percentagem de reatividade cruzada foi calculada utilizando os dados do desenvolvimento do produto de 60 min.

Foram determinadas as reatividades cruzadas de sete anticorpos IgG4 NGF humanos com BDNF, NT-3, e NT-4 relativamente a NGF. Nas concentrações testadas, todos os sete anticorpos apresentaram reatividade cruzada negligenciável (Tabela 4). Por exemplo, com 1252A5 os niveis mais elevados de reatividade cruzada observados com NT-3, NT-4 e BDNF foram 1,1%, 0,9% e 1,4%, respetivamente (Figura 5). EXEMPLO 8

Determinação da afinidade de ligação ao NGF de anticorpos NGF humanos

As afinidades de ligação ao NGF de anticorpos IgG4 NGF humanos foram determinadas utilizando um formato de ensaio de ligação a radioligante, realizado a temperatura ambiente. Brevemente, flashplates (Perkin Elmer SMP200) foram revestidas com 100yL/poço de 2,2yg/ml IgG caprina anti-humana (Sigma-Aldrich, UK) em sistema tampão fosfatado 78 (PBS) durante lh. Os poços foram lavados eom PBS e depois bloqueados durante lh com 200yL/poço PBS contendo 3% p/v seroalbumina bovina (BSA; Sigma-Aldrich, UK). Os poços foram lavados com PBS e foi adicionado 10 ng de anticorpo NGF humano a cada poço num volume de 0,lml PBS contendo 0,5% p/v BSA. A seguir à incubação durante lh as placas foram lavadas com PBS.

Foi obtido NGF radioiodado humano e de rato de Amersham UK (125I-NGF humano, Amersham cat. n°. IM286; 125I-NGF de rato, β-NGF recombinante de rato marcado de forma personalizada adquirido de R&D Systems, cat. n°. 556-GF-100). Cada isoforma 125I-NGF foi serialmente diluída em tampão de ensaio (PBS contendo 0,5% p/v BSA e 0,05% v/v Tween 20) e foram adicionadas amostras 100yL duplicadas às placas de ensaio para dar uma medida de 'ligação total' ao longo de um intervalo de concentração 2pM-15nM. Foi determinada a ligação não especifica (NSB) em cada concentração 125I-NGF medindo a ligação na presença de um largo excesso de NGF não- radiomarcado. Os poços NSB continham 125I-NGF (2pM-15nM) juntamente com uma concentração final de 500 nM β-NGF não-marcado humano (R&D Systems Cat. n°. 256-GF-100) ou β-NGF de rato (R&D Systems Cat. n°. 556-GF-100), conforme apropriado. As placas foram incubadas durante a noite, e os poços foram contados durante lmin num contador gama (TopCount NXT, Perkin Elmer). A ligação especifica foi calculada de acordo com a fórmula 'ligação especifica = ligação total - ligação não específica'. As curvas de ligação foram traçadas e os parâmetros de ligação foram determinados de acordo com um modelo saturação da ligação a um local utilizando Prism software (GraphPad Software Inc., USA) .

Os 125I-NGF humanos e de rato apresentaram uma ligação saturável, de elevada afinidade aos anticorpos IgG4 NGF 79 humanos, 1252A5 e G1152H5 (Figuras 6 e 7). Os valores Kd

12 S calculados para a interação de ligação com I-NGF humano foram de 0,35nM para 1252A5, e 0,37nM para G1152H5. Os valores Kd para a ligação de 125I-NGF de rato foram de 0,44nM para 1252A5 e 0,50nM para G1152H5. EXEMPLO 9

Determinação dos valores Ki da inibição da ligação de NGF aos recetores TrkA e p75 humanos

As experiências foram realizadas para determinar se os anticorpos 1252A5 e G1152H5 apresentavam inibição diferencial da ligação de NGF aos recetores TrkA e p75. As experiências de ligação competitiva foram desenhadas de forma a calcular os valores da constante de inibição da ligação (Ki). Foram calculados os IC50S da inibição mediada por anticorpo da ligação de NGF radiomarcado humano ou de rato às proteinas de fusão do recetor TrkA ou p75 humano. Os valores Ki foram então derivados utilizando a equação de Cheng-Prusoff.

As proteinas de fusão dos recetores TrkA e p75 humanos (R&D Systems) foram diluidos em Dulbecco's PBS (Gibco) para concentrações finais de lOnM e 0,6nM, respetivamente. As placas de microtitulo brancas de 96 poços Maxisorp Nunc (Nalge Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com 100yL/poço da solução do recetor TrkA ou p75 diluida. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20, e depois bloqueadas com 200yL/poço 3% p/v seroalbumina bovina (BSA) em PBS. As placas foram lavadas após lh incubação a temperatura ambiente. Os anticorpos teste foram diluidos até às concentrações desejadas no tampão de ensaio (0,5% p/v BSA e 0,05% v/v Tween 20 em PBS). Um anticorpo irrelevante, não direcionado contra NGF, foi utilizado como 80 controlo negativo enquanto que NGF não-radiomarcado foi utilizado como inibidor de referência da ligação radioligante. Foram preparados poços duplicados para cada concentração de amostra teste. 125I-NGF humano ou de rato (Amersham Biosciences) foi diluido com tampão de ensaio de forma que a concentração final nos poços de ensaio, quando misturado com as amostras teste, era de 150pM num volume de ensaio total de 100yL. As placas de ensaio foram incubadas a temperatura ambiente durante 2h antes de lavar com PBS/Tween 20 para remover 125I-NGF não ligado. Os radiomarcados ligados foram quantificados por adição de 100yL/poço Microscint 20 (Perkin Elmer) seguido de contagem utilizando um contador de microplaca de cintilação liquida Packard TopCount. Os dados foram traçados e analisados utilizando Graphpad Prism software para calcular os valores IC50 para cada experiência, e para derivar o Ki correspondente de acordo com a equação Cheng-Prusoff;

Ki = IC50 / (1 + D / Kd)

Em que: D = a concentração de NGF no ensaio (nominalmente 150pM, mas as concentrações reais do ensaio foram determinadas para cada experiência)

Kd = a afinidade de NGF para o recetor TrkA ou p75 sob condições de ensaio idênticas. Isto foi determinado por análise da ligação de saturação da ligação de 125I-NGF aos recetores TrkA e p75 em experiências separadas.

Todos os anticorpos avaliados, exceto o controlo IgG4 humano, inibiram a ligação de 125I-NGF humano e de rato aos recetores TrkA e p75 humanos (Figuras 8 e 9; Tabela 5) . A Tabela 6 apresenta os valores IC50 e Ki calculados dos 81 dados apresentados na Figura 8A; a Tabela 7 apresenta os valores IC50 e Ki calculados dos dados apresentados na Figura 8B; a Tabela 8 apresenta os valores IC50 e Ki calculados dos dados apresentados na Figura 9A; Tabela 9 apresenta os valores IC50 e Ki calculados dos dados apresentados na Figura 9B. Os anticorpos 1252A5 consistentemente apresentaram a maior potência da inibição da ligação do 125I-NGF. É interessante verificar que, os valores da constante da inibição da ligação determinados para a inibição mediada por 1252A5 da ligação de NGF aos recetores TrkA e p75 eram significativamente diferentes. Assim, as médias calculadas pKi da inibição da ligação de NGF humano ao TrkA e p75 era de 10,26 ± 0,08 e 9,85 ± 0,04, respetivamente (P<0,01, teste t de Student; ambos n=3) . A média calculada pKi para a inibição do NGF de rato aos recetores TrkA e p75 era de 9,79 ± 0,04 e 9,55 ± 0,03, respetivamente (P<0,05, teste t de Student; ambos n=3) . Este resultado sugere que 1252A5 é um inibidor preferencial da interação entre NGF e o recetor TrkA, e inesperadamente contrasta com os resultados obtidos com G1152H5 para o qual não havia diferença significativa entre os valores pKi correspondentes (Tabela 5). EXEMPLO 10

A atividade antihiperalgésica de anticorpos IgG4 NGF humanos A atividade antihiperalgésica de anticorpos NGF foi avaliada num modelo de ratinho de hipersensibilidade térmica induzida por carragenina. Ratinhos machos (20-25g peso corporal) foram inicialmente ambientados ao aparelho teste durante 2h. No dia seguinte, foram determinadas as medições de base de referência da reatividade à estimulação térmica em ambas as patas traseiras. Foi aplicada uma fonte 82 de calor focalizado na superfície plantar da pata traseira, e foi registada a latência de retirada, de acordo com o método de Hargreaves et al. (1988) . Os valores de base de referência foram calculados como a média de determinações triplicadas para cada pata, registado 10 min entre eles. Os ratinhos receberam então uma injeção intraperitoneal de anticorpo neutralizador IgG4 NGF humano ou anticorpo controlo não compatível com o isotipo em veículo de sistema tampão fosfatado (PBS). Vinte e quatro horas mais tarde, foi induzida a hiperalgesia inflamatória através de injeção subplantar de carragenina (2% p/v em PBS; 30yL volume de injeção). Após um outro período de 24h, foram determinadas outra vez as latências de retirada para as patas traseira inflamadas e não inflamadas. A hiperalgesia térmica observada 24h após injeção de carragenina era inibida dependente da dose com o pré-tratamento de ratinhos com os anticorpos IgG4 NGF humanos 1252A5 (Figura 10).

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Tabela 1

Potência de neutralização dos anticorpos IgG4 NGF humanos no ensaio de mobilização de cálcio Anticorpo NGF humano IC50 (nM) NGF de rato IC50 (nM) Mab256 0,76 ± 0,15 a 0,79 ± 0,08° 1064F8 2,5 ± 0,6° 5, 5 1022E3 O +1 00 \—1 14 1083H4 30 61e 1021E5 76 75e 1033G9 55 ± 20° 26 1016A8 65 ± 12b 14 1028F8 73 ND 1033B2 85 ND 1024C4 410 ± 120*c 565* 1057F11 3700* ND Os dados indicam a média de duas determinações separadas, exceto an = 14, bn=12, °n=3, II d T5 (média ± sem) e en=l. *Valores determinados por extrapolação. ND = não determinado.

Tabela 2a CDRs de clones otimizados derivados de 1021E5 contendo a sequência HCDR3 LNPSLTA (SEQ ID N°: 531) 88

1: Numeração de Kabat 2 : Linker 3: Atividade IC50 no ensaio de ligação de NGF humano (nM) 4 : Atividade IC5 0 no ensaio de ligação de NGF de rato (nM) 89

As colunas do lado direito da tabela mostram uma estimativa das potências de neutralização de NGF (IC50) para cada clone. Foram submetidos a ensaio scFv purificados num ensaio de ligação de NGF como descrito no Exemplo 3.

Tabela 2b SEQ ID N°S correspondendo às sequências CDR de clones apresentados na Tabela 2a HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 LOT1021E05 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : 33 N° : 34 N° : 35 N° : 38 N° : 39 N° : 40 LOT1131H02 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 163 164 165 168 169 170 LOT1132H09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 183 184 185 188 189 190 LOT1133C11 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 193 194 195 198 199 200 LOT1134D09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 203 204 205 208 209 210 LOT1146D07 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 223 224 225 228 229 230 LOT1147A03 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 433 434 435 438 439 440 LOT1147D02 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 233 234 235 238 239 240 90 LOT1147F02 SEQ N° : 443 ID SEQ N° : 444 ID SEQ N° : 445 ID SEQ N° : 448 ID SEQ N° : 449 ID SEQ N° : 450 ID LOT1147G09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 243 244 245 248 249 250 LOT1149D09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 453 454 455 458 459 460 LOT1150D09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 463 464 465 468 469 470 LOT1150F01 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 253 254 255 258 259 260 LOT1150G08 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 473 474 475 478 479 480 LOT1152D05 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 483 484 485 488 489 490 LOT1152G10 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 493 494 495 498 499 500 LOT1156G06 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 503 504 505 508 509 510 LOT1160E03 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 293 294 295 298 299 300 LOT1165D04 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 303 304 305 308 309 310 91 LOT1215A06 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 513 514 515 518 519 520 LOT1218H05 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 353 354 355 358 359 360 L0T1219D09 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID N° : N° : N° : N° : N° : N° : 523 524 525 528 529 530

Tabela 3

Potências de neutralização de NGF de anticorpos IgG4 otimizados humanos em três ensaios da função de NGF em células inteiras

IgG Mobilização de cálcio FLIPR IC50 (nM) Sobrevivência celular PC12 IC50 (nM) Proliferação celular TF-1 IC50 (nM) Clone Parental NGF NGF NGF de NGF NGF NGF NGF NGF de humano de ratinho humano de humano de ratinho rato rato rato 1021E5 - 76 a 75 47 13003 1083H4 - 30a 61 54 1100j 1126F1 1021E5 0,35 0,15 0,22 2,9 1126G5 1021E5 0,23 0,16 0,16 1,50 1126H5 1021E5 0,38 0,15 0,23 8,7 1127D9 1021E5 0,40 0,22 0,21 0,57 1127F9 1021E5 0,36 0,14 0,20 0,59 1131D7 1021E5 117 37 71 670 1131H2 1021E5 0,27 0,11 0,12 0,58 1132A9 1021E5 0,39 0,25 0,33 0,90 1132H9 1021E5 0,35 0,13 0,16 0,55 1133C11 1021E5 0,45a 0,30a 0,28a 0,53 ± 0,42 0,10 + 0,12 0,10 ± 0.13b ± 001d ± 0,02d 0,07b 0,02d 1134D9 1021E5 0,31a 0,14a 0,16a 0,54 1145D1 1021E5 0,36 0,17 0,24 0,66 1146D7 1021E5 0,38 0,33 0,31 0,48 1147D2 1021E5 0,36 0,21 0,24 0,51 92 1147G9 1021E5 0,30 ± 0,21 0,23 ± 0,76 ± 0,55 0,04b ± 0,02b 0,06b ± 0,02b 0,02b 1150F1 1021E5 0,32 0,15 0,19 0,47 IgG Mobilização de cálcio Sobrevivência Proliferação celular FLIPS celular PC12 TF-1 IC50 (nM) ic50 (nM) IC50 (nM) Clone Parental NGF NGF NGF de NGF NGF NGF NGF NGF de humano de ratinho humano de humano de ratinho rato rato rato 1152H5 1021E5 0,22 ± 0,21 0,14 ± 0,40 ± 0,38 0,26 ± 0,08 0,07 ± 0,05b ± 0,01b 0,04e ± 0,25d ± 0,0d 0,05b 0,04® 0,0d 1155H1 1021E5 0,35 0,18 0,18 0,59 G1152H5 1152H5 0,22 0,27 0,18 1,1 ± 7,3 ± 0,44 1,44 0,99 ± 0, lb 0,9b ± ± 0,29d 0,17d 0,27d 1158A1 1021E5 0,34 0,12 0,11 0,48 1160E3 1021E5 0,33 0,13 0,12 0,40 1165D4 1021E5 0,26 ± 0,15 0,16 ± 0,41 ± 0,41 0,02b ± 0,04b 0,08e ± 0,01b 0,06® G1165D4 1165D4 0,32a 0,33a 0,27a 0,86 ± 2,63 0,04b ± 0,03b 1175H8 1021E5 0,37 0,15 0,16 1,1 1211G10 1021E5 0,37 0,16 0,15 0,58 1214A1 1021E5 0,26a 0,16a 0,14a 0,52 ± 0,43 0,07b ± 0,07b 1214D10 1021E5 0,29 0,14 0,13 0,35 1218H5 1021E5 0,33 0,13 0,15 0,47 1227H8 1083H4 0,44a 0,43a 0,48a 0,70 35 ± ± 10b 0, 15b IgG Mobilização de cálcio Sobrevivência Proliferação celular FLIPS celular PC12 TF-1 IC50 (nM) IC50 (nM) IC50 (nM) Clone Parental NGF NGF NGF de NGF NGF NGF NGF NGF de humano de ratinho humano de humano de ratinho rato rato rato 1230D8 1083H4 0,31a 0,29a 0,37a 0,71 ± 37 ± 93 0,14b 4D 1230H7 1021E5 0,27 ± 0,18 0,15 ± 0,42 ± 0,32 0,04b ± 0,02b 0,10c ± 0,03b 0,05c G1230H7 1230H7 0,31a 0,34a 0,25a 2,5 ± 7,5 ± 0,2b 0,4b 1252A5 1133C11 0,33 ± 0,29 0,26 ± 0,94 ± 2,7 ± 0,42 ± 0,72 0,55 ± 0,03c ± 0,01c 0,13f 0, 6f 0, 15d ± 0,32d 0,06c 0,40d Mab 256 - 0,76 ± 0,79 1,4 ± 23 ± 44 ± 6 ± 4d 5 ± 7 ± 3d 0, 15h ± 0,21 l1 7f 3d 0,08g

Dados são n=l excepto; an=2; bn=3; cn=4; an=5; en=6; tn=l; 9n=12; nn=14; 1n=15; jextrapolado

Tabela 4

Reatividade cruzada de anticorpos IgG4 NGF otimizados humanos com outras neurotrofinas

IgG BDNF, % NT-3, % NT-4, % 1133C11 0,7-3,1 0,9-1,8 0-1,7 1147G9 0-1,3 0, 1-0,9 0-1,3 1152H5 0-1,5 0-0,5 0,2-1,2 1165D4 0-1,3 0-0,7 0-1,5 1214A1 0-1,4 0-1,0 0-1,0 1230H7 0-1,1 0-0,8 0-0,7 1252A5 0-1,4 0-1,1 0-0, 9 Os dados nas colunas apresentam o intervalo de reatividades cruzadas do anticorpo calculado. Os valores são calculados como percentagem do sinal observado contra cada neurotrofina, relativamente ao sinal de ligação NGF com a mesma concentração de anticorpo. As neurotrofinas revestiram placas de ensaio numa concentração de lOOng/poço, e a ligação de anticorpos teste foi medido num intervalo de concentração 0,03 lOnM. Os dados representam o resultado de uma única experiência. 94

Tabela 5

Sumário das determinações da constante de inibição da ligação para 1252A5 and G1152H5. Os dados representam a média ± s.e.m. de três experiências independentes.

IgG pKi vs NGF humano pKi vs NGF de rato TrkA p7 5 TrkA p7 5 1252A5 10,26 ± 9, 85 ± 9,79 ± 9,55 ± 0,08* 0,04 0,04** 0,03 G1152H5 9,59 ± 9,56 ± 9, 18 ± 9,24 ± 0, 08§ 0,04 0, 08§ 0,05 * PC0.01 c .f. interação NGF humano / p7 5 ** P<0.05 c.f. interação NGF de rato / p75 § N/S c.f. p7 5 Teste t de Student para dados não emparelhados

Tabela 6 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 2,4 2,1 1252A5 0,068 0,061 G1152H5 0,204 0,184 MAB256 1, 94 1,76 MAB5260Z 0,368 0,333

Tabela 7 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 1,3 1,2 1252A5 0,151 0,140 G1152H5 0,538 0,499 MAB256 1,48 1,38 MAB5260Z 0,310 0,288 95

Tabela 8

IgG IC50 (nM) Ski (nM) NGF 0, 686 0,568 1252A5 0,188 0,155 G1152H5 0,348 0,288 MAB256 0,304 0,252 MAB5260Z 0,570 0,472

Tabela 9 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 0,783 0,710 1252A5 0,302 0,274 G1152H5 0,781 0,708 MAB256 2, 94 2, 67 MAB5260Z 0,587 0,532

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Cambridge Antibody Technology Limited <110> Elan Pharma International Limited <120> Membros de ligação específica para NGF <130> SMW/CP6347033 <140> <141> <150> US 60/645,587 <151> 2005-01-24 <160> 537 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 396

<212> DNA <213> Homo sapiens 96 <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1064F8 VH <400> 1 gaggfegeagc tçgtgssgte tggggcfcgag gfcgaagaage nfcgggteefce ggfcgaaggte 60 tcctgoeagg cttctggagg caccttcagc agcfcafcgcfcfc acacctgggt gjegseaggsc 120 cctggacaag ggcttgagtg gafcgggaggg atcgtrcccs fcctttggtta «aeaaaefcac 180 gaacagààgt tecsgggçMsg a<&eaegatfc agçggggacg aattiffiSMsgag eacagcccat. 240 sfcggsgetga geagcetgac! atorgcggac aeggecgtafc attaetgtgc gggaggcagfc 800 gaattatatt gfcagtggfcgg fcaacfcgcfcac gggggeggte aetactacta. ctacafcggac 360 gtctgggggc aegffÃecac ggtcaccgtc fcogagfc 386 <210> 2 <211> 132

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VH <400> 2

Gin vai Gin lea Vai Gin Ser Gly Ala Gla Vai Lya Lys Pro Sly Ser 1 S 10 15

Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Crly Gly Tfor Pfoa Ser Sár fyir 20 25 30

Glu Trp M®fc

Ala *yr Thr ϊ*ρ vai Arg Gin Ala Pxq Gly Gin 8ly tam 3S 40· 45 97

Sly Cly II# Vai pre Xl* Pb» ely Ser Sf*r M» Sy*· Ma Gla X.ys Phe 50 5S 6©

Sia 61f Ar$ :1.9¾ Thr 2 Xe Vhr Ala Asp fila Phé Thr Ser Vhr Ma Sis OS 70 75 IÓ M&fc <51 a Leti Ser Ser teu Vhr Ser Ma Asp Xíhr Ala Vai Xyr Xyr Çy« 85 ®© 95

Ma eiy Sly Ser Asp Leu Sfyr Cyr Ser fily eiy Asa Cy* ®y« <53,y Siy 100 105 1X0

Gly Sis 5yr Tyr Vyr tyr Met Asp Vai Trp Sly Gin GXy Tfer Thr Vai 115 120 125 thr vai Ser Ser 110

<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VH CDRl <400> 3

Ser fyr Alá Syr íhjf 1 5

<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VH CDR2 <400> 4

Gly Ile Vai Pro XIe Pite Gly Ser Vhr Asa Tyr Ala Gin ly* Phe Gin 1 5 10 15 <210> 5 <211> 23 98

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VH CDR3 <400> 5

Sly Sesr Asp teu Tyr Cya Sér Sly ©ly Asm Cys Tyr ©ly ©ly ©ly Sis 1 S 19 IS

Tyw *ysc Tyr Tyr Àsp Vai 30

<210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1064F8 VL <400> 6 tegtefcgage tgaefceaggst eeefcgetgfeg fcgggaeagae agfecaggatc 60

acttgaaetg gaaccagaag fcgaagfctggt ggfctat.aact atgtctçctg gfcaccaacaa ISO eacçeaggea aaggeeeeaa actaatgatt fcafegaggeca gtaageggee ctcaggggtt 180 tetaafcegct: fcctctggetc caagtstgge a.acscggcet scetgaaaafc ctetgggetc 249 eaggcfcgagg aegmggsfcga fefc&tefe&cfcgc agcfccatata caaeeagg&g cactcgsgtfc 300 tfce.ggegga.f ggaecãagct gaccgtccta 330

<210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VL <400> 7 99

99 Ser S«r Gin leu Thr Gin 1 S

P» Ala Vai Ser Vai Ala leu Gly Gin 10 IS fhr Vai Arg Ile T&r Cys Ifh* Gly TAr Ser Ser Aap Vai Gly Gly Vy* ao 2S 30

Asn fyr Vãl Ser Trp Tyr Gin Gin Bíjs Pr© Gly Lys Ala Pro I»ys leu 35 40 45

Hat Hô Yyr Glv Gly Ser tys Arg Fr<a Ser Gly Vai Ser Asa Arg p&e 50 55 60 S®r Gly Ser Lys Ser Gly As» Thr Ala Ser Leu Vhr Ile Ser Gly leu 65 70 75 80

Gl» Ala Glu Asp Glu Ma Asp Tyx Tyr Cys Ser Ser tyr Thr 7*hr Arg 85 50 S5

Ser Tftr Arg Vai Phe Gly Gly Gly Thx lya Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VL CDR1 <400> 8

Thr Gly Tfer Ser Ser Asp Vai Gly Gly Tyr Aa» Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VL CDR2 <400> 9

Glu Gly Ser Lys Arg Fro Ser 1 3 <210> 10 100

<211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1064F8 VL CDR3 <400> 10

Ser Sar fyr Thr Uhr Arg Thr Arg Vai % % XÚ <210> 11 <211> 381

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1022E3 VH <4 0 0> 11 caggtgcagc tggtgcagte tggggctgag gtg-aaga&gc etefçrçpgcctc agtg&a.agtt. ¢0 tfictgçsagg eatctggata cagcttsatc aacfcastcta tgsaetgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gaettgsgfcg gataggaata ateaatectg gtggfcgaeag eaaaaa&tac 190 aeacagaggt teeafÇâcag agteaeeatg acctgggaca cgtceaefag easagtetae 240 atggaaotca gcagcctgag afccfcgaggac acggcçafcefc afcfcsafc.gt.gc gagaggccfcc 300 eaeeeeafceo etatgatgtt agegactatt. aacceaafctt tfcgeetaefcg gggeeaggga 360 aecetggtca ccgtctcgag t 381

<210> 12 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VH <400> 12 101

Gin Vai Gin iea Vai Gin Ses? Gly Ma Glu Vai Lys lys Pro Gly Ma 1 5 16 15 S«r Vai Xys Vai Sar Cya Ays Ma Sar Gly Tyr Ser F&« 11« Jkaa Tyr 20 2S 30 Sãr Mãt Hia Trp Vai Arg Gin Ala Pr® Gly Gin Gly lau Gin Trp lie 35 40 45

Gly lie 11« Asa Pr® Gly Gly Aap Ser Tfcr Ay» Tyr TAr Gin Arg P&*> 50 55 60

Gin Asp Arg Vai Thr Het Vhr *fx|> Asp Tfcr Sar Tkr Ser Thr Vai Tyr 65 10 15 60

Met. Aap Len S«r Sair L«u Arg Sar Glu Asp Thr Ma 11« Tyr Tyr Cys ©5 90 35

Ala Arg Gly His Pr® Ha Pr o Met Met leu Ala TAr 11« Aan Pr® 100 105 110

11· Pb# Ma *y* Trp Gly Gin Gly **»* 1*« Vai fJwr Vai Sar S®r 115 120 12S

<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VH CDR1 <4 0 0> 13

Asa Tyr Ser Mat HA» 1 5

<210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VH CDR2 <4 0 0> 14 102 ti* lie As« tire Gly Gly Asp Set Tht I*ys Tyr ÍChr Gin Atg Phe Gin % 5 10 15

Asp

<210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VH CDR3 <4 0 0> 15

Gly leu Hls Pr© 11« Pr o Met Met leu Ma Tkr lie Asrs Pro He Ptia l 5 10 15

Ala Tyt <210> 16 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1022E3 VL <400> 16 tettcfcgage tgaetcagga eeefcgctgta tctgtçfgcct fcgggacagac agtcaggatc 00 jacatgcegag gagaeagect eeçaaaetar tatgcaaact ggtaccagc* gaagocggga 120

caggeccetg t&cttgfccat efcstgatgaá aataágcgge ecfcesgggat. eccagaccga ISO fcfcefcctgget ccçgeteagg gaacaeagçt tc*t.t.gacca fccaceggggc tcaggeggaa 249 gatgagfctg actattretg caactcccgg gacsectfctg gttaegtteg egatgfcgtta 309 fcfccgçcggag gçacçaaggt cacegtgcfca 339

<210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VL <400> 17 103

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Aep Pre Ala vai Ser vai .Ala Leu Gly 61a I. s 10 15

Thr Vai Arg 11« Thr Cys Arg Gly Aap Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 2S 30

Asa Trp Tyr Gl» Gl» hy® Fr o Gly Sln Ala frçt Vai Léu Vai n« Tyr 35 40 45

Asp <31u Aan Lya Arg Fro Ser Gly lie Pro Asp Arg Fhe Ser Gly Ser m $5 m

Gly Ser Gly Aen Thr Ala Ser Leu Thr Xle Thr Gly Ala Gin Ala Ôlu «5 70 75 00

Asp Gl» Ala Asp Tyr Phe Cys Asu Ser Arg Asp Thr Phe Gly Tyr VAI S5 50' 95

Arg Asp val Leu Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VL CDR1 <4 0 0> 18

Arg Gly A«p Ser Leu Arg A&ti Tyr Tyr Ala Asn

1 5 IQ

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022E3 VL CDR2 <4 0 0> 19

Asp Glu As» Lys Arg Pro Ser 1 5 104

<210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1022Ε3 VL CDR3 <400> 20

Asa Sar Acg Asf» thc Ph© <*ly Tfs Vai Arg Asp Vai 1 5 10 <210> 21 <211> 375

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1083H4 VH <400> 21 m 120 ISO 240 300 3£0 375 eag&tgeaÉfe tggfcgcagtc trggggctgag gfcgaagaaçja ccggtjteefcc «gtgaaggtt fceçtgcaagg cttceggata csccttegea taceaetacç tacaatççgfc gcgacaggcc eetgg&caag ggcttgagtg gatgggaggg atc&teeeta tctttggtac aacaaactac goaoagaggt tcoaggaeag agtcacgatt «ccgcggacg agtccaca&g eacagcctac atggagfetga feagtgfegsg atctg&ggae acgçrecgtet attactgtgc gagtegsfcgat taegfcfcfcggg ggsgttatcg teecgactgg taettcgatc tctggggeag agggaeaatg çrec&eegtct çgagt

<210> 22 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VH <400> 22 105 <31 n Mfet Gin 1¾¾ Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai X»y* Ay» Vhr Sly Ser 1 S 10 15

Ser Vai lys Vai Ser Cys Aya Ala Ser Sly £yr Thr Phe Ala fyr Kis 20 35 30 <3Fyr Aev His Trp vai Arg Gin Ala Ere Sly Gla Sly x»au Glu Trp Msfc 3S 40: 45

Gly Gly lie 11« Pro xle the Sly ®5r Thr Asn. Tye Ala Sl« Arg Phe 50 55 «0

Sln Aep Arg Vai fhr Ile Thr Ala Asp Gltt Ser fhr Ser £hr Ala fyr 05 70 75 00

Het Glu leu Ser Ser £«u Arg Se* GIv Aap xíir Ala vai Tyr Tyr Cys S5 50 95

Ala Ser Ma Asp fyr Vai frp Gly Se* fyr Arg JPre Aap **p ífyr Hm 100 105 110 h&p leu Trp Gly Arg Gly fhr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VH CDR1 <400> 23

Tyr Sis Tyr Leu Sis 1 5

<210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VH CDR2 <400> 24 106

Gly liô lis Fr O He Pfe® Gly Xhr Âsn Ψ\?τ Ma Glft Arg p&* Gin I 5 1Q IS

Asp

<210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VH CDR3 <400> 25

Ala Asp Tyr ¥&1 Trp Gly Ser Tyr Arg Fr® Âsp Trp Tyr Fh« Aap La« 1 5 10 15 <210> 26 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1083H4 VL <400> 26 eagtcfcgtgt tgaegcagee gcccteaçog fcetgggaee® engggesgag ggteaeeate 60 iefctgttefcg gaagcagete eaacatcggg agtaaeactg taaaetggta ecágcgactc 120

ccagçagcgg çeeoeeaaefe eeteatetae aataatgaec ageggeeefce agggafeecet ISO gsccgattct ctggcteeaa gfcctggcaee teiaggctcec tggtcatcag tgggçtccag 240 tctgaagstg aggctç&fcfea ataetftgeg teatgggatg acagtetgaa tcjgtcgggtg 300 ttcggcçga-g ggáeeááget gacegtecfea 330

<210> 27 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VL <400> 27 107 107 Gin 1 ¥@3. Lett Th* 5 Gin Pre Pxo Se* Ala. 10 Ser Gly Thr P*o Gly 15 31a A*g Vai Th* 1.1« Ser Cys Se* Gly Ser Ser Ser As*. Ile Gly Se* ASK 20 25 30 Thr Val Asn T*f> Tyr Gin A*g Lee Pro Gly Ala Ala P*o Glrs lee leu 3S 40 45 u« Ty* Astn Asm Aep Gin A*g Pxo Ser Gly lie Pro Asp Arg Phet Ser 50 55 50 «Jy Ser fcy» Se* Glf Th* Ser Gly Se* beu ¥al n« Ser Gly L-SU Gin €5 70 7.5 30 Ss* Gltt A.sp Glu Ala ASf> Tf* Ty* Cy« Ale Se* Trp ASp Asp Se* leu M 90 95 ASÍi eiy Arg V«1 Phe Gly Gly Gly Th* &ys t*u Thr Val Lew 300 105 1.10

<210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1083Η4 VL CDR1 <400> 28

Ser Gly Se* Se* Se* hs-n Ile Gly **** 1 5

<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1083H4 VL CDR2 <400> 29

Asn Aan Áap Gin A*gr Pro Set l 5 30 <210> 108

<211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1083Η4 VL CDR3 <400> 30

Ais Ser Trp Asp» Asp Ser leu Asrs Gly Arg Vai 1 5 10 <210> 31 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de nucleótidos 1021E5 VH <400> 31 gsaçrtgcsgc tggtgcagtc tgçggetgag gtgaagaage ctgggtcctc ggfcçaaggta 60 tc.ctgcaa.gg cttefcggagg cacct.tfia.ge: acctatggta tctcsfcgggt gcgaeaggcc 120

cctggacaag gacfct.gagtg gataggaggg attattccta tctttgacac aggea&otcfc ISO gcacagagct tccagggcag agfcaaegatt accgegg&cg aatccaegag caeageetac 240 atgg&ggtga gcagecigag «tcfegaagar aeggeegtat afcfcattgtgc a.agttcaagfc 300 «gtafcctacg actatgccgg gggtgaccac fcactactaeg atjstggafcgt ctggggceag 360 gggacaatgg tcaccgtetc gagt 334

<210> 32 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VH <400> 32

Glu Vai Qlft Leu Vai ®1» Sar Gly Ala Slv Vai lys Lye Vro GXy Ser 1 $ 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cvs Lya Ala Ser Gly «ly Tfcr fhe Ser The Tyr 20 25 30 109

Gly XI® Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pre Gly Gin Gly leu GIu Trp Ile 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro XI* Phe Asp Th* Gly Aan Ser Ala Sln Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr 11« Thr Ala Asp Gle Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Hat Gle Vai Ser Ser leu Arg Ser Asp A«p fiar Ala v»l Tyr Tyr Cys

65 60 SS

Ala Ser Ser Ser Arg lie Tyr Asp Tyr Ala Gly Gly Asp 61a Tyr Tyr 100 105 110

Tyr Asp «et Asp Vai Txp Gly Gin Gly Thr tfefe Vai Thr Vai Ser Ser 115 ISO 125

<210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VH CDR1 <400> 33

Thr Tyr Gly Xle Ser 1 5

<210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VH CDR2 <400> 34

Gly lie ile pre ile PAe Asp Thr Gly Asa Ser Ala Gla Ser Ph® Gla 15 10 15

Gly <210> 35 <211> 19 110

<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VH CDR3 <400> 35 8*r Ser Arg Xle Tyr Asp Ala Gly Gly Aap ais íyr Çyr Tyr Aap t I 10 15 mt Asp Vai <210> 36 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1021E5 VL <400> 36

eaggcfcgtgc tgaefeeagcc gteGfceagfcg tcfcsegeeee caggaçagaa ggtcaecatc 6P tcctgctctg gaagcagcfcc caacattggg aataafcfcatg tatcgtgçpta ccagcagckç 120

cç.agga.acsg ceccc&aaet cctcatttat gacaataata agcgaccctc aggg&ttect ISO gaccg&ttct ctggctecaa gtctggcaeg tcagccacce tgggcafccac eggactccag 240 actggggacg aggccgatfea tfcactgegga aeatgggata geageefcgag tgGfctgggtg 300 ttcgg-cggag ggaccaagct gaçcgtcota 330

<210> 37 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VL <400> 37 111

Gin Ala Vai Leu Thx Gin Pr o Ser Ser Vai Ser ?hr Pro Pr© Gly Gin 15 10 13

Lys Vai fh* Tle Ser Cya Ser Gly Ser Se* Se* Aan lie Gly As» Aar» 20 25 30 fyr V&l Ser frp Tyr Gin Gin leu Pr© Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Ti® Tyr A«p A»n As« Lya Arg Pro Ser Gly Ile Pr© Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lya Ser Gly Vhr Ser Ala thr leu Gly He Tfcr Gly Leu Gin «5 10 ?5 50

Thr Gly Asp Slu Ala Asp Tyr Ty* Cya Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 SO 55

Ser Ala trp Vai Phe Gly Gly Gly fhr Lya Leu Ih.r Vai Leu 100 10S HO

<210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VL CDR1 <400> 38

Ser Gly Ser Ser S»r Asn lie Gly As« Asn Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VL CDR2 <400> 39

Asp Aan Aan Lya Arfif Pr© Ser 1 5 <210> 40 <211> 11 112

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1021E5 VL CDR3 <400> 40

Siy Tíir Urp Aap Sm« Ser S«*r Ala Trp V»1 1 S 10 <210> 41 <211> 366

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<210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1024C4 VL CDR3 <400> 90

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<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1057F11 VL CDR3 <4 0 0> 100

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<210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1126G5 VL CDR2 <4 0 0> 119

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<210> 122 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1126H5 VH <4 0 0> 122 145

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<210> 127 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1126H5 VL 147 <400> 127

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<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1126H5 VL CDR1 <400> 128

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<210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1126H5 VL CDR2 <400> 129

Asp Asa Asn tys Arg Pr© Ser 1 5 148

<210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1126Η5 VL CDR3 <400> 130

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<210> 131 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1127D9 VH <4 0 0> 131 60 120 ISO 240 300 360 378 gaggtgesge tsggtgcagtc tçgggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggte tcctgcaagg çttctggágg caacfctc&ge acctatggfca tcfceafcgggt gcgac&ggcc ectggasaag gactfcgagfcg gataggagga attattccta tatttgaca« aggcaactct, gcacaçagct tecagggcag agtcacgafct accgcgçaeg aatcaacg&g caeagcctac atggaggfcga gcagc-ctgag afcetgaegac acggce-gtat attacfcgtge tagtfceaagfc agtatctacg actaccacac çatagcetac fcaçgatatgg atgfcctgggg çç&ggggaea atggteaccg tctcctca.

<210> 132 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1127D9 VH <400> 132 149

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<223> Sequência de aminoácidos 1134D9 VL 179 <4Ο0> 207

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<210> 217 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Aaa. Asa Tyr VAI. Ser 1 S 10

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<210> 221 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1146D7 VH <400> 221

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<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1230H7 VH <400> 361 60 120 180 240 300 360 384 gagafcgcagc tggtgcag-tc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tccfcgcaagg ettctggagg caccttoagt acctatggta tetcatgggt gogaeaggcc eetgg&caag gacfcfcgagtg gafc&ggaggg attattccta fccfcfcfcgacac aggcaacfcct gcacagagct tccagggeag agfccacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctae atggaggtga gcagcctgag atetgacgac acggccgtat afcfcatfcgtgc aagttcaagt cgtatctatg acttcaactc cgccctcata fcccfcactacg atatggatgt ctggggccag gggac&atgg tcaccgtctc gagt <210> 362 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VH <400> 362 241 01¾ Met Gin L®u Vai Gin Ser Gly Ala. Glu Vai Lye lya Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai I*ys Vai Ser Cys lys Ala Ser Gly Gly Tfer Fhe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lee Gin Trp Xle 35 40 45

Gly Gly Xle Xle Pro 11« Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Fbe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Xle Thr Ala Aep Gin Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Ket Gin Vai Ser Ser Leu Axg Ser Aap Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 35 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg Xle Tyr Asp Fhe Asn Ser Ala Leu Xle Ser Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Aep Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 363 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VH CDR1 <400> 363 thr tyr Gly II# Sêr 1 5

<210> 364 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VH CDR2 <400> 364 242 GIv XI© Xle Ê>ro 11« Phe Asp Thr Gly Asa Ser Ala Gin Ser PA® Gla 1 S 10 15

Gly

<210> 365 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VH CDR3 <400> 365

Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Asa Ser Ala Leu Xle Ser Tyr Tyr Aep 1 5 10 15

Met Asp Vai

<210> 366 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de nucleótidos 1230H7 VL <400> 366

caagctgfcgc fcgactcjagcç; gfcgctcagtg fccfcacgcccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctetg gaagcágcfce caacattggg aafcaattatg tatcgtggt» ccageagctc t20 ccaggaacag cccccaaact cctcatttafc gacaataata agcgaccctc agggattcct ISO gaccgafctet. etggcteeaa gtcfcggcacg teageeacec fcgggcatcac cggactccag 240 aetggggaeg aggcogatta ttactgegga acatgçgata gcagcctgag fcgctfcgggfcg 300 ttcggcggag ggaecaagct gaccgfcc 12?

<210> 367 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VL 243 <4Ο0> 367

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pm Ser Ser Vai Ser Thr Pr* Peo Gly Gin 1 5 10 15

Lya Vai Thr Ile Ser Cya Ser Gly Ser Ser Ser Aan XI* Gly Asn As» 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pr* Gly Thr Ala Pr* Lya Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Asp As» Ãaá Lys Arg Pr* Ser Gly XI* Pr* Asp Arg Pfcte Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Trp Vai Fhe Gly Gly Gly Thr lye Leu Thr Vai 100 105

<210> 368 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VL CDR1 <400> 368

Ser Gly Ser Ser Ser Aa» Xle Gly Asn Asn Tyr* Vai Ser 1 S 10

<210> 369 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VL CDR2 <400> 369 244 b&p Jtsn Asm Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 370 <211> 11

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230H7 VL CDR3 <400> 370

Sly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Vai

15 IO <210> 371 <211> 375

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1227H8 VH <400> 371 60 120 160 240 300 360 375

cagatgeagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaaga ccgggtccte agtgaaggtt tcctgcaagg cttccggaca caccttcgrcc tsccaclacc tacactgggrfc gegacaggcc ectggacagg ggcfctgagfcg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac geacagaggt tecaggac&ç agtcacgatt aeagcgçacg agtccactag eacagectae atggagttga gcagtetgag atctgaggac acggeegtct attactgtgc gagtgctgat tacgcttggg agagttacca gcegccceag atcaacggtg t.gtggggcag agggacaatg gtcaccgtct cctca <210> 372 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VH <400> 372 245

Gin Met Gin Leu Vai Gin Sair Gly Ala Glu Vai Lys Lye Thr Gly Ser 1 5 10 IS

Ser Vai Lya Vai Ser Cya Lya Ala Ser Gly Hig Thr Phe Ala Tyr Hig 20 25 30

Tyx Leu His Trp Vai Arg Gin Ma Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Lia lie Pro Xle Phe Gly Thr Thr Aan Tyr Ala Gin Arg Phe 50 55 60

Gin Asp Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr «5 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyx Cys 85 50 55

Ala Ser Ala Asp Tyr Ala Trp Glu Ser Tyr Gin Pro Pro Gin lie Asn 100 105 110

Gly Vai Trp Gly Arg Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 373 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VH CDR1 <400> 373

Tyx Mis Tyx I*su Mis 1 5

<210> 374 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VH CDR2 246 <400> 374

Gin

Gly 11ο Xle Ρχό 11« Ph& Gly VHx Thx? Asn Tyr Ala Cln Airg FJa« 1 5 10 15

Asp

<210> 375 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VH CDR3 <400> 375

Vai

Ala Asp Tyr Ala Trp Glu Sair Tyx Gin Fro Fro Gin Ile Aan Gly 15 10 15

<210> 376 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1227H8 VL <400> 376 60 120 180 240 300 330 eagtctgtge tg&egcagec gceefccagtg fcetgeggece cagg&eagaa ggteaeeatt acctgcfcetg gaagcaecfcc caaaafctggg aataaetatg tctcetggt,a ccaaeageac ecaggcaaag oeegcaaact catgatfcfcat gatgfcòagta agcggeeetc aggggtccct gacegattct ctggctecaa gtctggcaac tcagcctcec tggaeatcag tgggctccag fcetgaggatg aggctgafcta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tgaatttttc tfccggaacfcg ggaacaagc-t gaccgtceta

<210> 377 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VL <400> 377 247

Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15

Lys Vai Thr Ile Thr Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn He Gly Asn Aan 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 35 40 45

He Tyr Asp Vai Ser Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Lee Asp Ile Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80

Ser Glu Aap Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Ala Alá Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95

Ser Glu Phe Phe Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 378 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VL CDR1 <400> 378

Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asa Asa Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 379 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227H8 VL CDR2 <400> 379

Asp Vai Ser Lys Arg Pro Ser 1 B 248

<210> 380 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1227Η8 VL CDR3 <400> 380

Ala Ala Trp Asp Asp Sair Leu Ser Glu Phe Phe 1 S 10 <210> 381 <211> 375

<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Sequência de nucleótidos 1230D8 VH <400> 381 €0 120 ISO 240 300 360 375 cag&fcgcagc tggtgeagtc tggggctgag gtgaagaaga ccgggtccfcc agtgaaggtt fccctgcaagg cttccggata oacetteccc taccacfcacc tacactgggt gcgacaggcc cctggacsag ggcfctgagtg gatgggaggg afccatcccta tctfctggtac aacaaactac gcacagaggt teesggacag agtcacgatt accgcggacg agtccacçag cacagcctac atggagttta gcagtetgag atctgaggac acggccgtct attacfcgtge gagtgetgat tacgtttggg agagfcfcatca cccggccacg tccttgagtc tcrtggggcag agggacaatg gteaccgtet ectca <210> 382 <211> 125

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VH <400> 382 249

Gin Met Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ma Glu Vai Lya lys Thr Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr Sis ao 25 30

Tyr leu His Trp Val Itf Gin Ala Pro Gly Gin Gly leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly He He Pro He Phe Gly Thr Thr Aan Tyr Ma Gin Arg Phe 50 55 «0

Gin Asp Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 SO

Met Glu Phe Ser Ser leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Ma Asp Tyr Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Ma Thr Ser leu 100 105 110

Ser Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 383 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VH CDR1 <400> 383

Tyr His Tyr Lsu Mis 1 S

<210> 384 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VH CDR2 <400> 384 250 <3ly Xle 11« Pro Slô Phe Gly Thr Thr Asa Tyr Ala Gin Axq ph« Gin 1 5 10 15

Asp

<210> 385 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VH CDR3 <400> 385

Ala Asp Tyr Vai Trp <Slu Ser Tyr His Pro Ala Thr Ser leu Ser leu 1 5 10 15 <210> 386 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1230D8 VL <400> 386 cagtctgtgc tgacgcagcc gcucteagfcg tetgcggccc caggaeagaa ggtcaecatt €0 tcctgccctg gaagcacctc caacattggg aataactatg tctcctggta ccaacagcgc 120 ccaggeaaag ceaccaaaat cafcgatfcfcat gafcgt.cagta agcggccctc aggggtcecfc 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggeaac tcagcctccc tggaoafccag tgagetecag 240 tctgaggafcg aggetgstta t-tacfcgtgca gaatgggatg acagecfcgag tgaatfctctc 300 fcfccggaactg ggaecaagct gaccgtccfca 330

<210> 387 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VL <400> 387 251

Gin Ser Vai leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 S 10 15 lys Vai Thr Ile Ser Cys Pro Gly Ser Thr Ser Asn He Gly Asn Asn ao 25 ao

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys leu Met 35 40 45

Zle Tyr Asp Vai Ser Lys Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asja Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser 65

Asn Ser Ala Ser Leu Asp lie Ser Glu leu Gin 70 7S S0

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser leu 05 90 95

Ser Glu Phe leu Phe Gly Thr Gly Thr lys leu Thr Vai leu 100 105 110

<210> 388 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VL CDR1 <400> 388

Pro Gly Sor ^Ixr Ser Asn He Gly Asn Aon $yr Vai Ser 1 5 10

<210> 389 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VL CDR2 <400> 389 252

Asp Vai Ser Lys Arg Pro Ser 1 5

<210> 390 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1230D8 VL CDR3 <400> 390

Ala Ala Trp Asp Aap Ser Leu Ser íSIis PHe L«ra l S 10 <210> 391 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1252A5 VH <400> 391 60 120 186 240 300 360 304 caggtgcage tggtgcagte tggggetgag gtgaagaagc cfcgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cttctgg&gg caccttcagc acctafcggta tctcatgggt gcgacaggcc cetggacaag gacttg&g-fcg gatgggaggg attattccta tcfcttgacac agçcaactct. geacagagct tccagggeag agtcacgatfc accgcggacg aatccacgag cacagcctac atggagcitga gcagcctgag atefcgaagae acggeegfc&t attattgtge aegtfccaagt cgtatotaeg acCtgaâCcc gtCCCtgace gectaetacg afcatggatgt ctggggccag gggacaatgg toaocgtctc gagt

<210> 392 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VH <400> 392 253

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Gin Vai Lyt Lys Pro Gly Ser l 5 10 1$

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Ly* Ala Ser Gly Gly Thr Pha Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gin Trp Hat 35 40 45

Gly Gly lie Ila Pro lie Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 30 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr 11a Thr Ala Asp Gin Ser Thr Sar Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Sar Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 8S 90 95

Ala Arg ser Ser Arg lia Tyr Asp Leu Asn Pro Sar Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 393

<211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VH CDR1 <400> 393

Thr Tyr Gly 11« S«r 1 5

<210> 394 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VH CDR2 <400> 394 254

Glv II* II* Pro 11« Phe Asp Ihr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe Gin t $ 10 15

Gly

<210> 395 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VH CDR3 <400> 395

Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala fyr Tyr Asp 15 10 15

Met Asp Vai <210> 396 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1252A5 VL <400> 396 cagtctgtgc tgactcagcc gccgfccagtg tctgcggcec caggacagaa ggteaccate 60 tcctgctctg gaageagcte eaacattggg aataattatg tategtggta ceagcagçtc 120 ccaggaacag ccccaaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaecgattct ctggctcesa gtctggcacg tcagccaccc tgggeatcaç cggactecag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga ac&tgggata gcagcctgag tgefcfcgggtg 300 tfccggcggag ggaccaagcfc gaecgtecfca 330

<210> 397 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VL 255 <400> 397

Gin Ser Vai Leu Thr Gin. Pro Pro Ser Vai Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Ãrg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 00

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 398 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VL CDR1 <400> 398

Ser Gly Ser Ser Ser Arn Ile Gly Asm, Asn Tyr Vel Ser IS 10

<210> 399 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VL CDR2 <400> 399 256

Asp &&n Asft Lys Asrg Pro S«£ l 5

<210> 400 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1252A5 VL CDR3 <400> 400 fíly Th*: Tep Asp Ser L&u Ala. Tep Vai 15 li <210> 401 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos G1152H5 VH <400> 401 caggtgcagc 'tggfc.gcagtc fcggggcfcgag gtgaagaagc ctgggfcccfcc ggtgaaggtc £0 tcctgrcaagg cttctggagg caccttcagc acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacrttgagtg gafcgggaggg attattccta tcttfcgacac aggcaaetct. 180 gcacagaget. taoagggcag agtoaog&ftfc aeegeggacg aafcecacgag cacagccfeac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggccgtat attattgfcgç aagttcaagt 300 cgtafcctacg acatgatcte gtccttgcaa ccctactacg atatggatgt ctggggcoag 360 gggacaatgg tcacegtctc etea 304

<210> 402 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VH <400> 402 257

Gin Vai GlA Leu Vai Gin Ser Gly Ais Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 S 1Ô IS

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lye Ala Ser Gly Gly Thr The Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Ar? Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gin Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Ar? Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 SÓ

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ale Vai Tyr Tyr Çya Í5 30 »5

Ala Arg Ser Ser Arg ile Tyr Asp Met ile Ser Ser Leu Gin Pro Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vel Ser Ser 115 120 125

<210> 403 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VH CDR1 <400> 403

Thz fyr C31y lie Ser 1 S

<210> 404 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VH CDR2

258 <4Ο0> 404 Gly Xle ΧΧβ Pro Ile Phe Asp fhr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe Gin15 10 IS

Gly <210> 405 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VH CDR3 <400> 405 Ser Ser Arg lie Tyr Asp Met lie Ser Ser Lee Gin Pro Tyr Tyr Asp1 S 10 15

Met Asp Vai <210> 406 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de <400> 406 nucleótidos

G1152H5 VL eagtctgtgc tgactcagec gccgtcagtg tetgcggccc tccfcgctetg gaagcagctc caacattggg aataafctafcg eeaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata gaccgattct ctggcfcccaa gtetggcacg tcagccaccc actggggacg aggccgatta ttaefegcgga acafcgggata caggacagaa ggtcaccato tatcgtggta ccagcagcfcc agcgaccctc agggafcfccct tgggcatcac cggactccag geagcctgag tgcttgggtg 60 120 ISO 240 300 ttcggcggag ggaceaaget gaccgtccta <210> 407 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> 330 259 <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VL <400> 407

Gls Ser VaX te» Thr Gin Pr© Pr© Ser Vai Ser Ala Ala Pr© Gly Gin 1 5 10 15

Lys Vai Thr Ile Ser Cye Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly As» Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lau Pr© Gly Thr Ala Pr© Lys Leu leu 35 40 45

Ile Tyr Aap Asn Asn Lys Arg Pr© Ser Gly ile Pro Asp Arg Phe Ser §0 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin SS 70 75 80

Thr Gly Asp Ôlu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 30 55

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vál Leu 100 105 110

<210> 408 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VL CDR1 <400> 408

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asa Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 409 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos G1152H5 VL CDR2 <400> 409 260 260 1 5 <210> 410 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoác <4 0 0> 410 Sly Thr Trp A&p Sar Sar 1 5 <210> 411 <211> 385 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleót <400> 411 caggtgcage tggtgcagtc tggggctgag fcçefcgça&gg cilcfcggagg caecttcagc cctggacaag gaçfctgagtg gatgggaggg gcacagagct tccagggcag agtcacgatt atggagctga gcagcctgag atctgaagac cgtatetacg acctgaaccc gfcccctgacc gggacaatgg tcaeegtefcc gagtg

Sar _dos G1152H5 VL CDR3

Lan Sar Ala frp ¥al Ϊ0

.dos G1165D4 VH gtgaagaagc ctgggtectc ggtgaaggtc acctatggta tctcatgggt gcgacaggoc attattccta fcctttgacac aggcaactct agcgcggacg aatccacgag cacagcctac acggccgrtat attattgtgc acgttcaagt gcctactacg atatggatgt ctggggccag 60 120 180 240 300 360 385

<210> 412 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VH <400> 412 261

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Set Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 $ 10 IS

Ser Vai Lys Vai Ser Cye Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 50 «la Gly Arg Vai Thr XI· Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 55 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys S5 90 55

Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu ASU Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 413 <211> 5

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VH CDR1 <400> 413

Thr Tyr Gly II® Ser 1 5

<210> 414 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VH CDR2 <400> 414 262

Sly Ile Ilô Pro Ila Fhe Aap Vhx Gly Asn Ser Ala Gin Ser Fhe Gin i a ίο is

Sly

<210> 415 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VH CDR3 <400> 415

Ser Arg Ile Tyr Asp &sm Pr o Ser Latt Thr Ala fyar Tyr Asp Met 15 ig 15

Asp Vai <210> 416 <211> 330

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos G1165D4 VL <400> 416 caçtctgtgc tgactcagcc gcagrfcçagtg tctgcggccc caggatcagaa ggt.caccat.ci 60 tectgctctg gaagcagctc caacattgag aataattatg fcafccgtggta eeagcagctc 120 caagg&acag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcet 180 gaccgsttct ctggctccaa gtctggcacg tcagecaccc tgggcatcac cggactccag 248 actggggacg aggecgatta ttaetgcgga acatgggata geagcetg&g tgcttgggtg 306 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 417 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VL <400> 417 263

Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pr o Pro Sar Vai Ser Mi Ala Pr© Gly Gin 1 5 16 15

Ile Glu Asn Aan 30

Lys Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Aan 20 2S

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pr© Gly Thr Ala Pr© Lys Lee. Leu 35 40 45

Ile Tyr Aap Asn Asn Lya Arg Pro Ser Gly 11« Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 SO

Thr Gly Asp Glu Ala Aap Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 8$ 90 95

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lya Leu Thr Vai 100 105

<210> 418 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VL CDR1 <400> 418

Ser <*ly Ser Ser Ser Asn lie Caiu Asn Asn Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 419 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VL CDR2 <400> 419

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 3. S 264

<210> 420 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1165D4 VL CDR3 <400> 420

Gly Tfer Asp Ser Ser Lee Ser Ala ^rp Vai 1 5 X0 <210> 421 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos G1230H7 VH <400> 421 caggtgcage tggtgcagtc fcggggctgag gtgaagaagc ctgggtectc ggfcgaaggtc £0 tcctgeaagg effcctggagg caccttcagc aeetatggta tctcatgggt gçgaçaggec 120

cctggaeaag gaettgagtg gatgggaggg attattccta fcctttgacac aggcaactet ISO gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag caeagcctac 240 atggagctga gcãgcct-gag atctgaagac acggccgtat afctattgtgc acgttcaagt 300 cgtatctatg acttcaactc cgccctcata tccfcactacg atatggatgt ctggggccag 360 ggaacaatgg tcaccgtcte cfcca 334

<210> 422 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VH <400> 422 265

Gin Va.1 Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Set 1 5 10 15

Set Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly 11« Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Τερ Met 35 40 45

Gly Gly 11« 11« Pro Ile Phe Asp Thr Gly Aan Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr SS 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 80 55

Ala Arg Ser Ser Arg lie Tyr Asp Phe Asn Ser Ala Leu Ϊ1© Ser Tyr 100 105 110

Tyr Aap Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 423 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VH CDR1 <400> 423

Tlsx Tyr Gly lie Ser 1 5

<210> 424 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VH CDR2 <400> 424 266

Gly Ilfô Xla Pro lia Ph© Asp Thr Giy Asn Sar Ala Gin S®r Ph© Gin 1 5 10 15

Gly

<210> 425 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VH CDR3 <400> 425

Ser Ser Argr lie Tyr Asp Ph® Asn Ser Ala Leu 11© Ser Tyx Tyr Asp 1 S 10 15

West Asp Vai

<210> 426 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos G1230H7 VL <400> 426 «agtctgtgc fcgacfccagcc gccgtcagtg tctgcggccc caggacagaa ggfccaccafcc 60 tcctgctctg gaagcagctc eaacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccecaaact cetcatttat gacaataata agcgaecctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccacce tgggcatcac cggactceag 240 actggggacg aggccgatta fctactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 427 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VL 267 <400> 427

Gin Ser Vai Leu Thr sln Pro Pr© Ser Vai Ser Ma Alã Pre Gly Gin 1 5 10 15

Lys Vai Thr 11« Ser Cya Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Aan Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Prõ Gly Thr Ala Pro Lys Leu Léu 35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pm Asp Arg Phe Ser 50 55 «0

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Aep Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 50 55

Ser Ala Trp Vai Pha Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 428 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VL CDR1 <400> 428

Ser Gly Ser Sor Ser Aan ile Cly Asn Asn "Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 429 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VL CDR2 <400> 429 268

Asp Asn Asn Lys Arg Pre Ser 1 5

<210> 430 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos G1230H7 VL CDR3 <400> 430

Giy Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Vai 1 5 10' <210> 431 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de <400> 431 nucleótidos

1147A3 VH 60 120 ISO 240 300 360 384 gaagtgaaga tggtgçagtc tggggctgag tcctgcaagg cttctggaçpg caccttcagc ccfcggacaag gacttgagtg g&tagggggg gcacagagefc fcccagggcag agtcacgatt atggaggtga geagectgag atctgacgac cçtatctacg aettgaacec ctccctcact gggaeaatga tcaocgtctc gagt gtgaagaagc ctgggtccfcc ggtgaaggtc aeetafcggta tctcatgggt gcgacaggcc attattecfea tctttgacgc aggcaectct; accgcggacg aatccacgag cacagcctac acggcegtat attattgrtgc aagttcaagt gcctactacg atatggatgt ctggggccag

<210> 432 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VH <400> 432 269

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lya Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser çys Lya Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45

Gly Gly He 11® Pr o lia Pha Asp Ma Gly Asm Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 «0

Gin Gly Arg Vai Thr He Thr Ala Aap Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr β5 70 75 S0

Met Glu Vai Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys SB 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg He Tyr Asp Leu Asm Pr© Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 HO

Tyr Aap Met Aap Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met He Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 433 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VH CDR1 <400> 433

Thr Tyr <31y 3Cle Ser 1 5 <210> 434 <211> 17

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VH CDR2 <400> 434 270

Gly 11« lis Pro 11« Phe> Asp Ala Gly Aan Ser Ala Gin Ser Phe Glsi 1 5 10 15

Gly

<210> 435 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VH CDR3 <400> 435

Ser Ser Arg 11« Tyr Asp leu Asn Pro Ser leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 5 10 1$

Met Asp Vai <210> 436 <211> 327

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1147A3 VL <400> 436 eaggctgtgc fcgacccagcc gtccfccagtg fcetacgccee eaggaeagaa. ggfccaccatc 60 fccctgctcfcg gaggcagcte eaacafct.ggg aafcaafctafcg tafccgtggta ccggeagcte 120 ccaggaac&g cecccaaact, ectoatfctat gacaataata agcgaeaeto agggatfcecfc 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcgcg tcagccaccc tgggcatcac cggactecag 240

acfcggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgottgggtg S0Q ttcggcggag ggaccaagot gaccgfcc 321

<210> 437 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VL <400> 437 271

Gin Ala Vai Leu 'Th*· Gin Fro Ser Ser Vai Ser Thr Pro Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr lie Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Asn Aan 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Arg Gin Leu Fr o Gly Thr Ala Fro Lys Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Fro Ser Gly Ile Fro Asp Arg Fha Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 7S 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Lea 65 90 95

Ser Ala Trp Vai Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 438 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VL CDR1 <400> 438

Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ha Gly Aan Asa Tyr Vai Ser 1 5 IS

<210> 439 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147A3 VL CDR2 <400> 439

Asp Asn Asn Lys Arg* Wxo Ser l B 272

<210> 440 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147Α3 VL CDR3 <400> 440

Gly Tlir Trp Asp Ser Ser Leu Ser Alâ. Vai 1 S 10

<210> 441 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1147F2 VH <400> 441 m 120 180 240 300 360 334 gaagtgcage tggtgçagtc tggggotgag gtgaagaagç çfcgggfcectc ggtgaaggte tcctgcaagg cttatggagg caecfcfccagc aecfcatggea tctcatgggt gagaeaggcc cct.ggacaag gacfctgagtg gáfcaggãggg gfctattccta tctttgacac «ggtaactct gcacagagct teeaggggag agteacgatfc accgcggacg aatccacgag cacagoctac atggaggtga gcagcctgag atctgatgac acggccgtat attatfcgfegc «agtfceaaat egt&tcfcaeg aottgaaccc ctcoetcact gcefcactacg atatggacgt ctggggceag gggacaatgg tcaccgtctc gagt

<210> 442 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VH <400> 442 273

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Bar Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Çyg Lys Ala Ser Gly Gly Thr PA© Ser Tbx Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala ?n> Gly Gin Gly teu Glu Trp XI© 3S 40 45

Gly Gly Vai II© Pr© 11© Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Ph© 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr li© Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Vai Ser Ser leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 50 55

Ala Ser Ser Asn Arg Xle Tyr Asp leu Asn Pro Ser leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr «et Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 443 <211> 5

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VH CDR1 <400> 443 S*hr Tyu Sly Ik Ser 1 s

<210> 444 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VH CDR2 <400> 444 274

Glv Vai Ile Pr o lie Phe As» Thr Glv Asn Ser Ala 61« Ser Ph© Gin 1 S 10 15

Gly

<210> 445 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VH CDR3 <400> 445

Ser Asn Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 S 10 15

Mst Asp val

<210> 446 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de nucleótidos 1147F2 VL <400> 446 caggctgtgc tgacteagcc gtcetcagtg tctacgccec caggacagaa ggteaccatc $0 tcctgetctg gaagcagote caacattggg aafcaattatg tatcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaacfc cctcatttat. gacaataafca agcgaccctc agggat-tcet 180 gaccgattct ctggetccaa gtctggcacg teageeacec tggaeafccac eggaçtccag 240

actggggacg aggccgatta ttacfcgcgga acafcgggata gcagectgag cgcttggg-ta SOO ttcggcggag ggaccaagct gaccgfcc 327

<210> 447 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VL <400> 447 275

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pr© Ser Ser Vai Ser Thr Pr© Pr© Gly Gin 1 S 10 15

Lys Vai Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Asa Asa 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gla Gin Leu Pr© Gly Thr Ala Pr© Lys Leu Leu 35 40 45 tle Tyr Asp Asn Asa Lys Ar$ Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asp II© Thr Gly Leu Gla 65 70 75 89

Thr Gly Aap Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 448 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VL CDR1 <400> 448

Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn Tyr Vai Ser 15 10

<210> 449 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VL CDR2 <400> 449 276

Asp Asm Asm Lya Acg Prô Ser 1 5

<210> 450 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1147F2 VL CDR3 <400> 450

Gly Thr £rp Asp Ser Ser Leu Ser Ala frp 1 S 10 <210> 451 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1149D9 VH <400> 451 60 120 180 240 300 360 384 gaagtgcagc tggtgaagtc tggggctgag gtgaaaaagc ctgggfcccfce ggtgaaggte toctgoaagg cfctctggagg caccttcagc acctatggta tetcatgggt gegacagaec cctggacaag gacfctgagtg gat.agggggg attattccta tcttfcgacaa aggcaactcc gcacagagct tccagggcag agtcaegatt accgcggacg aatccacgag eacageetae átggaggtgá gcagcctgag atctgacgac acggccgtat attattgtgc aagttcaagt cgtatetacg acfctgaaeee ctcccfccact gcctactacg atatggatgt ctggggecag gggacaatgg fccacogtctc gag-t

<210> 452 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VH <400> 452 277

Glu Vai Gin Leti Vai Gin Ser Gly Ala 61¾ Vai Lys Lys Pr© Gly Ser I 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lya Ala Ser Gly Gly Thr Pha Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Tbr Pr© Gly Gin Gly Leu Glu Trp II® 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pr© Ile Phe Asp Thr Gly Aan Ser Ala Gin Ser Pb® 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Vai Ser Ser Leu Axg Ser Asp Aap Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pr o Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 453 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VH CDR1 <400> 453

Thr Tyr SXy Ile Ser 1 S

<210> 454 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VH CDR2 <400> 454 278

Gly 11« 11« Pro 11« Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin S«r Ph« Gin 1 5 10 15

Gly

<210> 455 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VH CDR3 <400> 455

Ser Ser Arg 11« Tyr Aap Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 S 10 15

Mefc Asp Vai <210> 456 <211> 327

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1149D9 VL <400> 456 caggctgtgc tgaetcagcc gtcctcagtg tctaegccce caggacagaa ggtcaccatc 60 tcetgctctg gaageagctc caacattggg aataattafcg tatcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttac gacaataata agegaccctc agggafctcefc 180 gaecgattet ccggctccaa gtetggcacg tcagccacce tgggcateae cggactecag 240 acfcggggaeg aggccgafcfca ttactgcgga gcatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 tfccggcggag ggaccaagct. gaccgte 327

<210> 457 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VL 279 <400> 457

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Thr Pro Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser S#r Ser Asn II# Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ph# Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Aap Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu 05 50 05

Ser Ala Trp Vai phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 458 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VL CDR1 <400> 458

Ser Gly Ser Sar Ser Asn lie Gly Asm Asn Tyr Vai Sar 1 5 10

<210> 459 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VL CDR2 <400> 459 280

Asp Ajsíi Aen Lys Arg Pr© Ser 1 5

<210> 460 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1149D9 VL CDR3 <400> 460

Gly Ala Aep Ser Ser Leu Ser Ala frp Vai 1 5 10

<210> 461 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1150D9 VH <400> 461 gtgáágáagc otgggtcctc gçffcgeaggtG 60 acctatggta tctcatgggt gcgacaggcc 120 attattecta tctttgacac aggcaaotot 130 accgeggaeg aatccacgag cacagcctac 240 açggccgtat attattgtge aagfctcaagt 300 gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 384 gaagtgeage tggtgeagte tggggctgag tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc cctggacaag gacfctgagtg gatagggggg gcacagagct tccagggcag agfccacgatt atggaggtga gcagcctgag atctgacgac egtatcfeacg acttgaaccc ctccctcact gggacaaegg teaccgtcfcc gagt

<210> 462 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VH <400> 462 281

Gle Vai Gin Leu, Vai Gin Ser Gly Ala Gin Vai Lys Lys Pr© Gly Ser 1 3 10 15

Ser Vai lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 2© 2S 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Slu Trp Ile 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pr© Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 $0

Gin Gly Arg Vai Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Ê3 10 75 80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 35

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pr© Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 463 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VH CDR1 <400> 463

Thr Tyr Gly Ile Ser 1 S

<210> 464 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VH CDR2 <400> 464 282 81y XI* He Pre XI· 1 5 Fhe Asp Thr Gly Asn Ser 10 Ala Gin Ser Phs Gin 15 Gly <210> 465 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VH CDR3 <4 0 0> 465 Sãs Jkxg Σ1® Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ale Tyr Tyr Asp Mefc 1 5 10 15

Asp Vai

<210> 466 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1150D9 VL <400> 466 çaggçtgtgç tgactcagcc gteetcagtg ccaacgcccc caggaeagaa ggtcacearc 60 teefcgetcfcg gaagcagcfcc csacattggg gataattatg fcategtggfca ecagcagctc 120 çcaggaaçag ceeccaaacfc ccfccatfcfcafc gacaataata agcgaccctc agggatfccet 100 gacegattct ctggctccaa gtcfcggcacg teageeaccc fcgggeatcac cggactcaag 240 actggggacg aggccgatta ttaetgegga acatgggata gcageefcgag tgcttgggfcg 300 ttcggcggag ggaccaagefc gaccgtc 32? <210> 467

<211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VL 283 <400> 467

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pr O Ser Ser Vai Pto Thr Fro Fro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn ile Gly Asp Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Prõ Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pre Asp Arg Phe Ser 50 55 €0

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 30 95

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105 <210> 468 <211> 13

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VL CDR1 <400> 468

Ser Gly Ser Ser Ser Aen lie Gly Asp Asn Tyr Vai Ser 1 5 10

<210> 469 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VL CDR2 <400> 469 284

Asp Asn Asn Lys Arg Pro S©r 1 S

<210> 470 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1150D9 VL CDR3 <400> 470

Sly Thx Trp Asp Ssx Sex Leu Ser Ala Trp Vai 1 5 10

<210> 471 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1150G8 VH <400> 471 68 120 160 240 380 360 384 gaagtgcagc tggtgcagtc t.ggggetgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggcgaaggtc fcectgcaagg cttetggagg caccttcagc accfcatggta tcfccatgggt gcg&eaggee ectggaeaag gacttgagtg gafcagggggg attafctccta tctttgaeac aggcaactct gcacagagct teeagggcag agteaegatt accgcggaeg agtceacgag cacagcctac atggaggtga geagectgag atetgacgac acggccgtat attattgtgo a&gttcaagt cgtafcctacg acfctgaacce cfcccctcact gcetactacg atafcggatgt ctggggccag gggacaatgg tcaccgtetc gagt

<210> 472 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VH <400> 472 285

Glu Vai Gin Le» Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai lys Lys ?ro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Ala Lya Vai Ser Cy» X.ys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Xle Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gla Trp Ile 35 40 45

Gly Gly Ile Xle Pre Xle Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Xle Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Vai Ser Ser x.eu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 SS

Ala Ser Ser Ser Arg Xle Tyr Asp leu Asn J?ro Ser leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Mefc Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 473 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VH CDR1 <4 0 0> 473 $hx: Tyr Gly ile Se* X 5

<210> 474 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VH CDR2 <400> 474 286

Gly He Xl«t Pro Ile Phe Asp Tbr Gly As» Ser Ala Gl» Ser Phe Gin

1 5 10 IS

Gly

<210> 475 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VH CDR3 <400> 475

Ser Ser Arg II© lyr Asp Asn Pre Ser L^u Thr Ata Tyr Tyr Asp 1 5 10 15

Met Asp Vai <210> 476 <211> 327

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1150G8 VL <400> 476 eaggçtgtgc tgactcagce gtcctcagtg tctaegeccc caggacagaa ggtcaccatc €0 tcctgctcfcg gaggcagcte caacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120

«csggaacag eccccaaact cctcatttat gacaataata agcgacecte agggattcct ISO gaccgattct etggctccaa gtccggcacg fccagccaccc tgggcatcae cggactccag 240 acfcggggaeg aggccgatta ttattgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttçggcggag ggaccaagct gaccgtc 327

<210> 477 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VL 287 <400> 477

Gin ΑΧ a VaX Leu Thr Gin ?eo Ser Ser Vai Ser The Pr© Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr Xis Ser Cya Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Aen Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lya Leu leu 15 40 45 XI® Tyr Asp Asm Asn Lys Arg Pro Ser Gly Xle Pro Asp Arg Phe Sor 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Gly Thr Trp Aap Ser Ser Leu 85 50 55

Ser Ala Trp Vai phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 478 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VL CDR1 <400> 478

Ser Gly Gly Ser Ser As» Ile Gly Asm As» Tyr Vel Ser 1 S 10

<210> 479 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VL CDR2 <400> 479 288

Asp Asn Asm l*ym Axg £ro Ser 1 5

<210> 480 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1150G8 VL CDR3 <400> 480

Giy Thr Trp Asp Ser ser Ser Ala τχρ vai l $ 10

<210> 481 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1152D5 VH <400> 481 60 120 130 240 300 360 384 ga&gtgcagc tggtgcagtc cggggctgag gtgaagaagc etgggteetc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctctggagg cacettcagc acctatggta tcrtcatgggt gcgacaggec cctggacaag aacttgagtg gataggaggg attatteeta tctttgacac aggdaactct gcacagagct tceagggeag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac atggaggtga gaagoctgag atctgacgac acggccgtat attattgtge aagttcaagt cgtatctacg acttgaaccc cfcccefceaet gccfcactacg atatggatgt ctggggçcag gggacaatgg tcaccgtctc gagt

<210> 482 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VH <400> 482 289

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lya Lys Pro Gly Ser 15 10 IS

Ser Vai Lys V«1 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ue Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Glu Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 50

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 00

Met Glu Vai Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys S5 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 tos 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 113 120 125

<210> 483 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VH CDR1 <400> 483

Thr Tyr Gly Ile Ser l 5

<210> 484 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VH CDR2 <400> 484 290 290 Gin

Gly Ilo lie Pro 11« Phe Aap Thr Gly As« Ser Ala Gin Ser Phô

1 S 10 IS <31 y

<210> 485 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

aminoácidos 1152D5 VH CDR3 Α*ρ Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ale Tyr Tyr 10 IS <223> Sequência de <400> 485

Asp

Ser Ser Axq 11« Tyr 1 5

Mefc Asp Vai <210> 486 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1152D5 VL <400> 486 60 120 100 240 300 e&ggcfcgtgg tgactcagcc gtcctcagtg tctacgccco caggacagaa ggtcaccatc tcctgctctg gaagcagetc caacactggg aataattatg tatcgtggta ceageagctc çeaggagcag cçcccaaset cctcatttat gaeaataata agcgaccctc agggaticct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagecaeac tgggcatcad cggactcaag actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg ttcggcggag ggaccaagot. gaccgte

<210> 487 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VL 327 291 <4Ο0> 487

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Fr© Ser Ser Vai Ser Thr Pro Pro Gly Gin 1 S 10 15

LyS Vai Thr 11® Ser Cya Ser Gly Ser Ser Ser Aan Thr Gly Asn A«n 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin heu Oro Gly Ala Ala Pro Lys Leu teu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn X.ys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser I*eu 85 90 95

Ser Ala Trp Vai Fhe Gly Gly Gly Thr hys heu Thr Vai 100 105

<210> 488 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VL CDR1 <400> 488

Ser Gly Ser Ser Ser Asn thr Gly Asn Asn tyr Vai Ser 15 10

<210> 489 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VL CDR2 <400> 489 292 A.sp Asa Asn Lys Arg Fr© Ser

1 S

<210> 490 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152D5 VL CDR3 <400> 490 81y Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ale Trp Vel I S 10 <210> 491 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1152G10 VH <400> 491 60 120 180 240 300 360 384 caagageage feggtgeagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggfce tcctgcaagç cttctggagg caccttcagc acctatggta tcteafcgggt gcgacaggcc cctggacaag gaattg&gtg gat&ggaggg aftsttccfca tctttgacac agtcaactct gcacagaget iccagggcag agfccacgatt áccgcggacg aatccacgag cacagcctac atggaggfcga gcagcctgag atctgacgae «cggccgtat attattgtgc aagttcaagt cgtstctacg acttgaaccc ctccctcact gcctactacg atafcggatgt ctggggccag gggacaafcgsg fccaccgtctc gagt <210> 492

<211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VH <400> 492 293

Gin Glu Gin Leu Vai Gin Sair Gly Ala Glu Vai Lys Lye Pro Gly Sair 15 10 IS

Ser Vai Lys Vai Ser Cys lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser frp Vai Arg Gin Ala Fr o GXy Gin Gly leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Gly lie He Pr© Ile Phe A$p Thr Vai Aen Ser Ala Ôln Ser Phe 50 55 ÊQ

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr ®S 70 75 80

Met Glu Vai Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 35 PO PS

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Aan Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 493 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VH CDR1 <400> 493 £hr Tyr Gly Ile Ser 1 5

<210> 494 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VH CDR2 <400> 494 294

Gly 11# He Paro 1.1 e Ph© Asp Thr Vai As» Ser Ala Gin Sãs Ph© Gin 1 S 10 15

Gly

<210> 495 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VH CDR3 <400> 495

Ser Ser Arg lie fyr Aap Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 S 10 15

Met Aap Vai <210> 496 <211> 327

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1152G10 VL <400> 496 60 120 180 240 300 caggetgtge tgacicagcc grtceteagtg tefcacgccce caggacaçaa ggtoaccafce ieetgetetg gaagcagcce eaacattggg aalaatfcatg tatcgtggta ceageagefce ccaggaacag çççccagact cctcatfctat gaoaataata agcgaccctc aggggtcect gaccgattct etggGtccaa gtcfcggeacg tcagceaecc tgggcatcac cgg&cfcGcag aetggggacg aggccgatfca fcfcacfcgcgga acatgggata gcagcctgag fcgcctgggtg ttcggcggag ggaccaagcfc gaecgfce <210> 497 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VL 321 295 <4Ο0> 497

Gin Ala Vai L©u Thr Oln Pr© Ser Ser Vai Ser Thr Pr© Pr© Oly Oln 15 10 15 I*ys Vai Thr lie Ser Cys Ser Oly Ser Ser Pr© Asa 11© Oly Asn Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Oln Oln Leu Pro Oly Thr Ala Pr© Arg leu Leu 35 40 45 11© Tyr Asp Asn Asn Lye Arg Pro Ser Oly Vai Pr© Asp Arg Pfe© Ser 50 55 eo

Oly Ser Lys Ser Oly Thr Ser Ala Th* leu Oly He Th* Oly leu Oln €5 70 ?S 80

Thr Oly Asp fílu Ala Asp Tyr Tyr Cys Oly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 99

Ser Ala Trp Vai Phe Oly Oly Oly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 498 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VL CDR1 <400> 498

Ser £*Iy Ser Ser Pro Aon Sle <*Iy .Asn Asn fyr V&X Ser 1 S 1Q

<210> 499 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VL CDR2 <400> 499 296

Asp As η Asu Lys Arg Pro Ser I 5

<210> 500 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1152G10 VL CDR3 <400> 500

Gly Tiir Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ma Trp Vai 1 5 10 <210> 501 <211> 384

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1156G6 VH <400> 501 gaagfcgcagc fcggfcgeagfce fcggggotgagr gfcgaagaage etgggfceefce ggfcgaaggfce 60 tcetge&agg cttcfcggagg ca.ccfct.cagc accfcatggfca tctcatgggt; gcgacaggcc 120 ccfcggacaag gacfctgagtg gatagggggg attattccta tctttgacac aggcagctet 160 gcaeagagcfc tccagggcag agfccacgafcfc accgcggacg aatecacgag cacagcctac 240 atggaggtga gcagcctgag afccfcgaegac acggccgtat atfcattgtgc aagttcaagt 300 çgtafccfcacg acfcfcgaaçee cfccccfccacfc gccfcacfcacg atafcggatgt cfcggggccag 360 gggacaafcgg fcçaccgtctc gagt 304

<210> 502 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VIZ <400> 502 297

Glu Vai Gin. Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lya Pro Gly Ser 1 s 10 15 S*r Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Xle 35 40 45

Gly Gly Ile lie Pro Ile Phe Aap Thr Gly Ser Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Vai Ser Ser Leu Arg Ser Asp Aap Thr Ala Vai Tyr Tyr Cya 85 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg He Tyr Aap Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Mst Asp vai Trp Gly Gin Gly Thr Mefc Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 503 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VH CDR1 <400> 503

Thr Tyr Gly «e Ser 1 5

<210> 504 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VH CDR2 <400> 504 298

Ciy Xics Ha Ρϊο Ile Pfee Aop Thur Gly SfSjr Sos- Ala Gin S»r Pfcte Cl** 15 10 15 Êly

<210> 505 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VH CDR3 <400> 505

Set Ser Arg Xle Tyr Asp Leu Aan J?ro Ser Leu Thr Ale Tyr Tyr Asp 15 10 15

Mefc Asp Vai <210> 506 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de nucleótidos 1156G6 VL <400> 506 caggctgtgc tgactcagcc gfccctcagtg tctacgcccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcaactc caacattggg aataattatg tatcgtggta acagcagctc 120 ccaggaacag ccccoaaact cctcatttat gaeaataata agcgaccctc agggafcfccefc 180 gaccgafctct ctggcfcccaa gtetggeaeg tcagccaccc tgggcafccac cggacfcccag 240 actggggacg aggeegatta ttactgcgga acgfcgggafca gcagcctgag tgcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagcfc gaccgtc 327

<210> 507 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VL <400> 507 299

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Thr Pro Pro Gly Gin 15 10 15

Lys Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Xle Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 11« Tyr Aap Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Xle Pro Aap Arg Pbe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly 11© Thr Gly Leu Sln 65 70 75 SD

Thr Gly Aap Giu Ala Aap Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Aap Ser Ser Leu 85 §0 S5

Ser Ala Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105 <210> 508

<211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VL CDR1 <400> 508

Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly A»n Asn Tyr Vai Ser l 5 10

<210> 509 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VL CDR2 <400> 509 300

Aap Asn Asn X.ya Arg Pro Ser I 5

<210> 510 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1156G6 VL CDR3 <400> 510 ôly íhr Trp Asp Ser Ser leu Ser Ale Trp Vai 15 10

<210> 511 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1215A06 VH <22 0> <221> caraterísticas miscelâneas <222> (1) .. (28) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> caraterísticas miscelâneas <222> (333)..(333) <223> n = a, c, g ou t <400> 511 60 120 ISO 240 300 360 nnnnima&nn nmtmmiumn gtgaagaagc gfcgggtcctc ggtgaaggtc tccfcgcaagg ettcfcggagg cacettcagc accfcafcggta tctcatgggfc gcgacaggcc cctggacaag gaçttgagtg gataggaggg atfcafcfcccta tctfctaaeac aggcaactct gcacagagct tccaaggcag agtcaogatt accgcggatg aatceacgag cacagcctae atggaggtga gcagcctgag atctgacgac acggcagtat attafcfcgtgc aagtteaagt cgtatetacg acttgaaccc ctccctcact gcivtactacg atatggatgt ctggggecag gggacaatgg teacegtctc gagt 384 301

<210> 512 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1215Α06 VH <220> <221> CARATERÍSTICAS MISCELÂNEAS <222> (1) .. (10) <223> Xaa é desconhecido <400> 512

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Vai Lye Lys Pro Gly Ser

1 S XO IS

Ser Val Lys Vai Ser Cys Lya Ma Ser Gly Gly Thr Ph® Ser fhr Tyr 20 25 30

Gly Xle Ser Trp Val Arg Gin Ma Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp xle 33 40 45

Gly Gly II® II® Pro Ile Ph® Asn thr Gly Asn Ser Ma Gin Ser Ph® 50 55 00

Gin Gly Arg Val Thr Xle thr Ma Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ma tyr €5 70 75 80

Mefc Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp thr Ma Val tyr Tyr Cya BS 90 95

Ma Ser Ser Ser Arg Xle Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ma Tyr 100 105 110 tyr Asp Met Asp Val trp Gly Gin Gly thr Mefc Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 513 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VH CDR1 302 <400> 513

Th* Tyr Gly 11« Ser 1 5

<210> 514 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VH CDR2 <400> 514 ©ly 11$ lie Pro Xle phe JVart Thr Gly hsn Ser Ala Gin Ser Phe Gin 1 S 10 IS Giy <210> 515 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VH CDR3 <4 0 0> 515 Ser Ser Ar Cf Ile fyr Aap Leu Aart pro Ser &su Thr Ala Tyr Tyr Aap 1 5 10 IS Mefc Asp Vai <210> 516 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1215A06 VL <4 0 0> 516 303 caggcfcgtgc tccfcgcfcctg «caggaacag gaccgattct aetggggaeg tteggcggag tgaeccagcc gaageagcte cecceaaact ctggctccaa aggeegatta ggaccaagct gtcctcagfcg caacatt-ggg cctcatttat gtctggeacg ttacfcgeggs gaccgte fcctacgcecc aataatta«g gac&staata tcagccaocc aeatgggata caggaeaçaa ggfccacoatc «o fcategfcggta ccagcggcte 120 agcgaccctc agggattcct 180 tgggcafccac cgg&ctccag 240 gcagectgag fcgcttgggtg 300 327

<210> 517 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> aminoácidos

1215A06 VL <223> Sequência de <400> 517

Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pró Ser Ser Vai Ser Thr Pm Pr* Gly Gin 1 5 10 15

Lys Vai Thr ile Ser Cya Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Aan Aan 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 10 45 ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Pbe Ser 50 55 €0

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin £5 70 75 80

Thr Gly Asp

Gly »0

Gin Ala Asp Tyr Tyr Cya 85

Thr Trp Asp Ser Ser Leu 95

Ser Ala Tzp Vai 100

Phe Gly Gly Gly Thr Lys 105

Leu Thr Vai

<210> 518 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 304 <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VL CDR1 <400> 518

Ser Gly Ser Ser Sar Asm Xle Gly As** 1?yr Vai Ser 1 5 10 <210> 519 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VL CDR2 <4 0 0> 519 Asp 1 Aaii Asn X,ys Arg Pró Ser 5 <210> 520 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1215A06 VL CDR3 <4 0 0> 520 Gly 1 T&r Trp Asp Ser Ser l*ee 5 Ser Ala frp Vai 10 <210> 521 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de nucleótidos 1219D9 VH <4 0 0> 521 305 gaagtgcage tggtgcagte tggggctgag gtgaagaage ctgggtccte ggtgaaggtc €0 tcctgcaegg cttctggagg caccttcagc aecfcafcggta tctcafcgggt gcgacaggcc 120 cctggaeaaç gacttgagtg gataggaggg atfcattccta fcctfctgacae aggcaactct 180 çcacagagct tccagggcag agtcacgafct accgeggacg aatccacgag cacagcetac 240 átggággtga gcagcctgag atcrgacgac acggccgtat actattgtge aagttcaagt 300 cgfcatctasg acttgaacce etcccfccact gcetacfcacg atatggatgt ctggggccag 360 gggaçaatgg tcaccgtctc gggfc 334

<210> 522 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VH <400> 522

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cya Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Paro Gly Gin Gly Leu Gla Trp lie 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Mefc Glu Vai Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys S5 90 95

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu As» Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110

Tyr Asp Met. Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Gly 115 120 125 <210> 523 <211> 5 306 <212> PRT <213> <22 0> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VH CDR1 <4 0 0> 523

Thx Tyr <31y 11¾ Ser 1 s <210> 524 <211> 17 <212> PRT <213> <22 0> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VH CDR2 <4 0 0> 524 Ôly Ilô Xis Fro Ile Fhe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gin Ser Pha Gin 1 5 10 15 Gly <210> 525 <211> 19 <212> PRT <213> <22 0> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VH CDR3 <4 0 0> 525

Ser Ser Axg Ila Tyr Aetp Leu Aen Fro Ser Lee Thr Ala Tyr Tyr Asp l 5 10 15

Met Asp Vai

<210> 526 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <22 0>

<223> Sequência de nucleótidos 1219D9 VL 307 <400> 526 60 120 180 240 300 eaggctgtgc tgactcagcc gt-cctcagta tctaeçoccc c&gg&cagaa ggteaGsafce tccfcgetctg gaageaggfcc c&aeaitggg aafca&fcfcatg tafcegtggta ccagcagcfcc ccaggaacag cceacaaact ccteatttat gacaataata agcgacectc agggattccfc gacegattct ctggctccaa gtctggcacg teagccacec tgggcatcac eggactccag acfcggggaeg aggccgatta ttaetgcgga acatgggata gcagccrtgag tgcttgggtg ttcggcggag ggaeeaagct gaccgtc 327 <210> 527 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VL <4 0 0> 527 Gin Ala Vai Leu Thr Gin Pro Ser Ser Vai Ser Thr Pre Pro Gly Gin 1 5 10 15

Lys Vai Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn II® Gly Asn Asn 20 25 30

Tyr Vai Ser Trp Tyr <31n Gin Leu Pre Gly Thr Ala Pro Lys leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg phe Ser 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 S0

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser leu 05 SC 95

Ser Ala Trp Vai phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 100 105

<210> 528 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens 308 <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VL CDR1 <400> 528

Sar Gly Sar Arg Sar Asa lia Qly Asrt Asn Tyr Vai Sar 15 10

<210> 529 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VL CDR2 <400> 529

Astp Asrt Asrt Lys Arg Pro Sar 1 S

<210> 530 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de aminoácidos 1219D9 VL CDR3 <400> 530

Gly "Fhr Trp Asp Sar Sar Leu Sar Ala Trp vai 1 5 16

<210> 531 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 531

Leu Asií Pro Sar Leu Thr Ala 1 5

<210> 532 <211> 7 <212> PRT 309 <213> Homo sapiens <4 0 0> 532 Ph© , Asn Ser Ala Leu 11© Ser 1 S <210> 533 <211 > 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 533 M©t 11© Ser Ser Leu Gin n o 1 5 <210> 534 <211 > 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador FDTETSEQ24 <4 0 0> 534 tttgtcgtct ttccagacgt tagt 24 <210> 535 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador PUCreverse <4 0 0> 535 agcggataac aatttcacac agg 23 <210> 536 <211 > 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Lseq <4 0 0> 536 310

gattacgcca agctttggag c 21 <210> 537 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador MYC Seq 10 <400> 537 ctcttctgag atgagttttt g 21

Lisboa, 14 de Agosto de 2013

Claims (38)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um membro de ligação específica isolado para fator de crescimento neuronal (NGF), compreendendo um local de ligação no anticorpo aos antigénios que é composto por um domínio VH no anticorpo humano e um domínio VL no anticorpo humano e que compreende um grupo de CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o domínio VH compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3 e um framework e o domínio VL compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e um framework, em que o grupo de CDRs consiste num grupo de CDRs selecionado do grupo constituído por: 0 1133C11 grupo de CDRs, definido por o HCDR1 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 193, o HCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 194, o HCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 195, 0 LCDR1 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 198, o LCDR2 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N° : 199, e o LCDR3 tem a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 200; um grupo de CDRs que contém o 1133C11 grupo de CDRs com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 533 ou a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 532 substituído pela sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 531 dentro de HCDR3; e um grupo de CDRs que contém uma ou duas substituições de aminoácidos em comparação com o 1133C11 grupo de CDRs, em que a uma ou duas substituições são feitas nas seguintes posições de entre os grupos identificados de possíveis resíduos substitutos para cada posição, utilizando a numeração padrão de Kabat: 2 Posição da substituição Resíduo substituto selecionado do grupo constituído por 31 em HCDR1: A 34 em HCDR1: V 51 em HCDR2: V 55 em HCDR2: N 56 em HCDR2: A 57 em HCDR2: V 58 em HCDR2: S 65 em HCDR2: D 96 em HCDR3: N 26 em LCDR1: T 26 em LCDR1: G 27 em LCDR1: N 27 em LCDR1: R 27A em LCDR1: T 27A em LCDR1: P 27B em LCDR1: D 28 em LCDR1: T 29 em LCDR1: E 30 em LCDR1: D 56 em LCDR2: T 90 em LCDR3: A 94 em LCDR3: G.

2. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 1 em que o resíduo 29 dentro do LCDR1 é E.

3. Um membro de ligação específica, de acordo com a reivindicação 1, em que HCDR1 é SEQ ID N°: 163, HCDR2 é SEQ ID N°: 164, HCDR3 é SEQ ID N°: 165, LCDR1 é SEQ ID N°: 168, LCDR2 é SEQ ID N° : 169 e LCDR3 é SEQ ID N°: 170; 3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 185, ID N°: 189 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 195, ID N°: 199 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 205, ID N°: 209 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 225, ID N°: 229 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 435, ID N°: 439 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 235, ID N°: 239 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 445, ID N°: 449 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 245, ID N°: 249 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 455, ID N°: 459 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 465, ID N°: 469 e LCDR3 HCDR1 é SEQ ID N°: é SEQ ID N°: 255, ID N°: 259 e LCDR3

183, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ ID N° : 190 193, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ ID N° : 200 203, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ ID N° : 210 223, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ ID N° : 230 433, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 440 233, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 240 443, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 450 243, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 250 453, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 460 463, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 470 253, HCDR2 é SEQ LCDR1 é SEQ 1—1 U 3 0 é SEQ 1—1 U 3 0 : 260 1—1 U 3 0 : 184, HCDR3 188, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 194, HCDR3 198, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 204, HCDR3 208, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 224, HCDR3 228, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 434, HCDR3 438, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 234, HCDR3 238, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 : 444, HCDR3 448, LCDR2 é SEQ ID N° : 244, HCDR3 248, LCDR2 é SEQ ID N° : 454, HCDR3 458, LCDR2 é SEQ ID N° : 464, HCDR3 468, LCDR2 é SEQ ID N° : 254, HCDR3 258, LCDR2 é SEQ 4 HCDR1 é SEQ ID N°: 473, HCDR2 é SEQ ID N° : 474, HCDR3 é SEQ ID N°: 475, LCDR1 é SEQ ID N°: 478, LCDR2 é SEQ ID N° : 479 e LCDR3 é SEQ ID N° : 480 HCDR1 é SEQ ID N°: 483, HCDR2 é SEQ ID N° : 484, HCDR3 é SEQ ID N°: 485, LCDR1 é SEQ ID N°: 488, LCDR2 é SEQ ID N° : 489 e LCDR3 é SEQ ID N° : 490 HCDR1 é SEQ ID N°: 493, HCDR2 é SEQ ID N° : 494, HCDR3 é SEQ ID N°: 495, LCDR1 é SEQ ID N°: 498, LCDR2 é SEQ ID N° : 499 e LCDR3 é SEQ ID N° : 500 HCDR1 é SEQ ID N°: 503, HCDR2 é SEQ ID N° : 504, HCDR3 é SEQ ID N°: 505, LCDR1 é SEQ ID N°: 508, LCDR2 é SEQ ID N° : 509 e LCDR3 é SEQ ID N° : 510 HCDR1 é SEQ ID N°: 293, HCDR2 é SEQ ID N° : 294, HCDR3 é SEQ ID N°: 295, LCDR1 é SEQ ID N°: 298, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 299 e LCDR3 é SEQ 1—1 U 3 0 : 300 HCDR1 é SEQ ID N°: 303, HCDR2 é SEQ ID N° : 304, HCDR3 é SEQ ID N°: 305, LCDR1 é SEQ ID N°: 308, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 309 e LCDR3 é SEQ 1—1 U 3 0 : 310 HCDR1 é SEQ ID N°: 513, HCDR2 é SEQ ID N° : 514, HCDR3 é SEQ ID N°: 515, LCDR1 é SEQ ID N°: 518, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 519 e LCDR3 é SEQ 1—1 U 3 0 : 520 HCDR1 é SEQ ID N°: 353, HCDR2 é SEQ ID N° : 354, HCDR3 é SEQ ID N: 355, LCDR1 é SEQ ID N°: 358, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 359 e LCDR3 é SEQ 1—1 U 3 0 : 360; ou HCDR1 é SEQ ID N°: 523, HCDR2 é SEQ ID N° : 524, HCDR3 é SEQ ID N°: 525, LCDR1 é SEQ ID N°: 528, LCDR2 é SEQ 1—1 U 3 0 529 e LCDR3 é SEQ 1—1 U 3 0 : 530.

4. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um grupo de CDRs que contém o 1133C11 grupo de CDRs com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 533 substituída pela sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 531 dentro do HCDR3. 5

5. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um grupo de CDRs que contém o 1133C11 grupo de CDRs com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 532 substituída pela sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 531 dentro do HCDR3.

6. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o 1133C11 grupo de CDRs.

7. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o framework do domínio VH é um framework da linha germinal da cadeia pesada humana e/ou o framework do domínio VL é um framework da linha germinal da cadeia leve humana.

8. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 7, em que o framework da linha germinal da cadeia pesada compreende VH1 DP10.

9. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que o framework da linha germinal da cadeia leve compreende VL VÀl.

10. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, que se liga ao NGF de rato ou de ratinho.

11. Um membro de ligação específica isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, que preferencialmente bloqueia a ligação de NGF ao recetor TrkA em preferência à ligação de NGF ao recetor p75. 6

12. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, compreendendo ο 1252A5 domínio VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 392.

13. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, compreendendo ο 1252A5 domínio VL com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 397.

14. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo o G1152H5 domínio VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 402.

15. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 ou reivindicação 14, compreendendo o G1152H5 domínio VL com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 407.

16. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo o G1165D4 domínio VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 412.

17. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 ou reivindicação 16, compreendendo o G1165D4 domínio VL com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 417.

18. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo o G1230H7 domínio VH com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 422.

19. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 ou 7 reivindicação 18, compreendendo o G1230H7 domínio VL com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 427.

20. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, que compreende uma molécula de anticorpo scFv.

21. Um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, que compreende uma região constante do anticorpo.

22. Um membro de ligação específica, de acordo com a reivindicação 21, que compreende um anticorpo inteiro.

23. Um membro de ligação específica, de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo inteiro é IgG4.

24. Uma molécula de anticorpo isolada que se liga ao NGF humano, em que a molécula de anticorpo compreende um domínio VH e um domínio VL, e em que a sequência de aminoácidos do domínio VH é SEQ ID N°: 392 e a sequência de aminoácidos do domínio VL é SEQ ID N°: 397.

25. Uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24, em que a molécula de anticorpo é IgG4.

26. Uma composição compreendendo um membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou 25, e pelo menos um componente adicional.

27. Uma composição de acordo com a reivindicação 26 compreendendo um excipiente, veículo ou agente de transporte farmaceuticamente aceitável. 8

28. Um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos que codificam um membro de ligação especifica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou 25.

29. Uma célula hospedeira transformada in vitro com ácido nucleico de acordo com a reivindicação 28.

30. Uma célula hospedeira transformada in vitro com um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica o domínio VH do membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou que codifica o domínio VH de uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25 e um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica o domínio VL do membro de ligação específica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou que codifica o domínio VL de uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25

31. Um método para produção de um membro de ligação específica ou molécula de anticorpo, o método compreendendo a cultura das células hospedeiras de acordo com a reivindicação 29 ou reivindicação 30 sob condições para a produção do dito membro de ligação específica ou molécula de anticorpo.

32. Um método de acordo com a reivindicação 31 compreendendo além disso o isolamento e/ou purificação do dito membro de ligação específica ou molécula de anticorpo. 9

33. Um método de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32 compreendendo além disso a formulação do membro de ligação especifica ou molécula de anticorpo numa composição incluindo pelo menos um componente adicional.

34. Um método compreendendo a ligação de um membro de ligação específica ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 a NGF humano ou um fragmento de NGF humano, em que a dita ligação ocorre in vitro.

35. Um método de acordo com a reivindicação 35 compreendendo a determinação da quantidade de ligação do membro de ligação especifica ou anticorpo ao NGF ou a um fragmento de NGF.

36. Utilização de um membro de ligação especifico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou de uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma condição na qual o NGF tem um papel, em que a condição é selecionada do grupo constituído por dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das vias aéreas, neuropatia diabética, arritmias cardíacas, HIV, artrite, psoríase e cancro.

37. Um membro de ligação específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou uma molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, para utilização no tratamento de uma condição na qual o NGF tem um papel, em que a condição é selecionada do grupo constituído por dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, outras doenças inflamatórias das vias 1 aéreas, neuropatia diabética, arritmias cardiacas, HIV, artrite, psoriase e cancro.

38. Utilização de acordo com a reivindicação 36, ou um membro de ligação especifica ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 37, em que o dito tratamento é da dor. Lisboa, 14 de Agosto de 2013