KR20060054312A - Ｉｌ-13에 대한 인간 항체 분자 - Google Patents

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Abstract

특이적 결합 구성원, 구체적으로 인간 항-IL-13 항체 분자 및 특히 IL-13 활성을 중화하는 것들이 제공된다. 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 잘 질병 및 호지킨 림프종을 비롯한, IL-13 관련 질병의 진단 또는 치료에서 항-IL-13 항체 분자를 이용하는 방법이 제공된다.
IL-13, 항-IL-13 항체

Description

ＩＬ-13에 대한 인간 항체 분자{HUMAN ANTIBODY MOLECULES FOR IL-13}
본 발명은 특이적 결합 구성원, 구체적으로 인간 항-IL-13 항체 분자 및 특히 IL-13 활성을 중화시키는 것들에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질환 및 호지킨 림프종을 비롯한, IL-13 관련 질환의 진단 또는 치료에서 항-IL-13 항체 분자를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 여기서 BAK502G9로 불리는 항체 분자 및 BAK502G9 계통 및 BAK278D6 계통의 다른 항체 분자의 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 이용한다. 추가의 바람직한 구체예는 BAK278D6 계통, 및 바람직하게는 BAK502G9의 상보성 결정 영역(CDR), 특히 VH CDR3를 다른 항체 골격 영역에서 이용한다. 본 발명의 추가 태양은 본 발명의 특이적 결합 구성원을 함유하는 조성물, 및 치료에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법을 비롯한, IL-13을 억제하거나 중화하는 방법에서 그들의 용도를 제공한다.
본 발명은 IL-13에 결합하고 중화하는데 있어서 특히 가치있는 항체 분자를 제공하며, 따라서 여기서 개시된 실험에 의해 나타나고 지지하는 기술 문헌에 의해 추가로 나타내지는, 다양한 치료적 처리에서의 용도를 제공한다.
인터루킨(IL)-13은 대약 12 kDa의 비변형 분자 질량을 갖는 114 아미노산 사이토카인이다[1,2]. IL-13은 IL-4와 가장 밀접하게 관련되어 아미노산 수준에서 30% 서열 유사성을 공유한다. 인간 IL-13 유전자는 IL-4 유전자에 이웃하여 염색체 5q31상에 위치한다[1][2]. 염색체 5q의 이 영역은 IL-4와 함께 그 수준이 천식 및 알레르기 염증의 설치류 모델에서 질병 심각성과 상관되는 것으로 나타난 GM-CSF 및 IL-5를 비롯한 다른 Th2 림프구 유래 사이토카인을 위한 유전자 서열을 함유한다 [3][4][5][6][7][8].
처음에 Th2 CD4+ 림프구 유래 사이토카인으로 확인되었음에도 불구하고, IL-13은 또한 Th1 CD4+ T-세포, CD8+ T 림프구 NK 세포, 및 비만 세포, 호염기구, 호산구, 대식세포, 단핵구 및 기도 평활근 세포와 같은 비-T-세포 집단에 의해 생산된다.
IL-13은 자체는 IL-4에는 결합할 수 있으나 IL-13에는 결합할 수 없는 IL-4 수용체 α쇄(IL-4Rα), 및 적어도 두 개의 다른 세포 표면 단백질, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2를 포함하는 수용체 시스템을 통해 그 효과를 매개하는 것으로 보고된다[9][10]. IL-13Rα1은 낮은 친화성으로 IL-13에 결합하여 IL-4Rα를 보충하여, 신호를 보내는 고 친화성 기능적 수용체를 형성한다[11][12]. 젠뱅크 데이터베이스는 IL-13Rα1의 아미노산 서열과 핵산 서열을 각각 NP_001551 및 Y10659로 열거한다. STAT6(시그널 전달자 및 전사 활성자 6)-결핍 마우스에서의 연구 결과, IL-13은 IL-4와 유사한 방식으로, JAK-STAT6 경로를 이용하여 신호를 보냄이 밝혀졌다[13][14]. IL-13Rα2는 아미노산 수준에서 IL-13Rα1과 37% 서열 동일성을 가지며 높은 친화성으로 IL-13에 결합한다[15][16]. 하지만, IL-13Rα2는 공지의 시그널링 모티프가 없는 보다 짧은 세포질 꼬리를 갖는다. IL-13Rα2를 발현하는 세포는 IL-4Rα의 존재하에서도 IL-13에 반응하지 않는다[17]. 따라서, IL-13Rα2는 IL-13의 기능을 조절하지만 IL-4 기능을 조절하지 않는 미끼 수용체로 작용하는 것으로 추정된다. 이것은 그 표현형이 IL-13에 대한 반응성 증가와 일치하는 IL-13Rα2 결핍 마우스에서의 연구에 의해 지지된다[18][19]. 젠뱅크 데이터베이스는 IL-13Rα2의 아미노산 서열과 핵산 서열을 각각 NP_000631 및 Y08768로 열거한다.
시그널링 IL-13Rα1/IL-4Rα 수용체 복합체는 인간 B-세포, 비만 세포, 단핵구/대식 세포, 가지돌기 세포, 호산구, 호염기구, 섬유모세포, 내피 세포, 기도 상피 세포 및 기도 평활근 세포에서 발현된다.
기관지 천식은 기도 과민반응성, 점액 과다생산, 섬유증 및 혈청 IgE 수준 증가를 특징으로 하는 폐의 일반적인 지속성 염증 질병이다. 기도 과민 반응(AHR)은 차가운 공기와 같은 비특이적 자극에 대한 기도의 지나친 수축이다. AHR 및 점액 과다생산 둘다 천식 공격의 특징인 짧은 호흡을 야기하며 이 질병과 관련된 사망율(영국에서 2000명 사망/일년)에 책임이 있는 가변성 기도 폐쇄를 야기하는 것으로 생각된다.
다른 알레르기성 질병과 함께, 천식의 발생은 최근에 크게 증가하였다[20][21]. 예를 들어, 현재, 영국 인구의 약 10%가 천식으로 진단받았다.
커런트 브리티시 토라식 소사이어티(BTS)와 글로벌 이니셔티브 포 아스마(GINA) 가이드라인은 천식의 치료에 대한 단계적 접근을 제안한다[22][23]. 약하거 나 온건한 천식은 대개 베타-아고니스트 또는 류코트리엔 억제제와 조합하여 흡입된 코르티코스테로이드를 사용하여 조절할 수 있다. 하지만, 코르티코스테로이드의 알려진 부작용으로 인해, 환자들은 치료 요법에 순응 하지 않는 경향이 있어 치료의 효과를 감소시킨다[24-26].
천식 가이드라인에 의해 추천된 보다 높은 투여량의 흡입되거나 경구의 코르티코스테로이드로부터 종종 매우 제한된 효과만 얻는, 보다 심각한 병을 가진 환자를 위해 새로운 치료가 필요함이 명백하다. 경구 코르티코스테로이드를 이용한 장기 치료는 골다공증, 소아에서의 성장 지연, 당뇨병 및 경구 칸디다증과 같은 부작용을 일으킨다[88]. 코르티코스테로이드의 유익한 효과 및 부작용 둘다 동일한 수용체를 통해 매개되므로, 치료는 안전성과 효율 사이의 조화이다. 심각한 악화로 인한, 영국 천식 집단의 약 6%를 나타내는 이들 환자의 입원은 건강보호 기관에의 천식의 상당한 경제적 부담의 대부분을 차지한다.
천식의 병리학은 무해한 항원에 대한 면역 시스템의 부적절한 반응에서 생기는 진행성 Th2 림프구 매개 염증에 의해 야기된다. 확립된 기도 질병의 병인학에서 핵심 매개자로서, 고전적인 Th2 유래 사이토카인 IL-4보다는 IL-13을 나타내는 증거가 축적되었다.
병에 걸리지 않은 비감작된 설치류의 기도에 재조합 IL-13을 투여하면 기도 염증, 점액 생산 및 AHR을 비롯한 천식 표현형의 많은 양태를 야기하였다[27][28][29][30]. 유사한 표현형은 IL-13이 폐에서 특이적으로 과다발현된 형질전환 마우스에서 관찰되었다. 이 모델에서는 IL-13에 대한 더욱 만성인 노출은 또한 섬유증을 야기하였다[31].
또한, 알레르기성 질병의 설치류 모델에서 천식 표현형의 많은 양상이 IL-13과 관련되었다. 가용성 쥐 IL-13Rα2, 잠재적 IL-13 중화자는 AHR, 점액 과다분비 및 이 설치류 모델의 특징인 염증 세포의 유입을 억제하는 것으로 나타났다[27][28][30]. 상보적 연구에서, IL-13 유전자가 결실된 마우스는 알러겐-유도된 AHR을 일으키지 못하였다. AHR은 재조합 IL-13의 투여에 의해 이들 IL-13 결핍 마우스에서 회복될 수 있다. 대조적으로, IL-4 결핍 마우스는 이 모델에서 기도 질병을 일으켰다[32][33].
장기 알러겐-유도된 폐 염증 모델을 이용하여, Taube et al.은 확립된 기도 질병에 대한 가용성 쥐 IL-13Rα2의 효능을 입증하였다[34]. 가용성 쥐 IL-13Rα2는 AHR, 점액 과다생산을 억제하고 덜한 정도로 기도 염증을 억제하였다. 대조적으로, IL-4를 결합하고 길항하는 가용성 IL-4Rα는 이 시스템에서 AHR 또는 기도 염증에 대해 거의 효과를 갖지 않았다[35]. 이들 발견은 IL-4가 아닌 IL-13에 대한 폴리클로날 항체가 점액 과다생산, AHR 및 상피밑층 섬유증을 감소시킬 수 있는 천식의 만성 진균 모델을 개발한 Blease et al.에 의해 지지되었다[36].
IL-13 유전자에서의 많은 유전적 다형성은 또한 알레르기성 질병에 연관되었다. 특히, 아미노산 130의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된 IL-13 유전자 변이체(Q130R)는 기관지 천식, 아토피성 피부병 및 혈청 IgE 수준 상승과 관련되었다[37][38][39][40]. 이 특정 IL-13 변이체는 또한 아미노산 수로부터 20 아미노산 시그널 서열을 제외하는 일부 그룹에 의해 Q110R 변이체로 불린다(아미노산 110에 서의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환됨). Arima et al,[41]는 이 변이체가 혈청에서 IL-13 수준의 상승과 관련됨을 보고한다. IL-13 변이체(Q130R)와 이 변이체에 대한 항체는 WO 01/62933에 개시된다. IL-13 생산을 변화시키는 IL-13 프로모터 다형성 또한 알레르기 천식과 관련된다[42].
IL-13의 수준 증가는 또한 천식, 아토피성 비염(고초열), 알레르기 피부염(습진) 및 만성 동염을 가진 인간 환자에서 측정되었다. 예를 들어, IL-13 의 수준은 대조구 개체와 비교할 때 천식환자로부터의 기관지 생검, 가래 및 기관지폐포 세척(BAL) 세포에서 더 높은 것으로 발견되었다[43][44][45][46]. 또한, BAL 샘플에서 IL-13 수준은 알러겐으로 공격시 천식 개인에서 증가하였다[47][48]. CD4(+) T 세포의 IL1-13 생산 능력은 추가로 신생아에서 알레르기 질병의 후속 발생 위험의 유용한 지표로 나타났다[49].
Li et al[114]은 천식의 만성 마우스 모델에서 항-마우스 IL-13 항체를 중화시키는 효과를 최근에 보고하였다. 만성 천식형 반응(AHR, 심각한 기도 염증, 과 점액 생산)을 OVA 감작된 마우스에서 유도하였다. Li et al은 각 OVA 공격 시에 IL-13 항체의 투여는 AHR, 호산구 침윤, 혈청 IgE 수준, 프로염증성 사이토카인/케모카인 수준 및 기도 리모델링을 억제함을 보고한다[14].
요약하면, 이들 데이터는 IL-4가 아닌 IL-13이 인간 알레르기성 질병의 치료를 위한 보다 매력적인 표적이라는 지표를 제공한다.
IL-13은 염증성 장 질병의 발병에서 역할을 할 수 있다. Heller et al.[116]은 가용성 IL-13Rα2의 투여에 의한 IL-13의 중화가 인간 궤양성 결장염의 쥐 모델 에서 결장 염증을 완화시킴을 보고한다[116]. 이와 상응하여, IL-13 발현은 대조구에 비교할 때 궤양성 결장염 환자로부터의 직장 생검 자료에서 더 높았다[117].
천식외에, IL-13은 다른 섬유증 상태와 관련되었다. IL-4보다 최대 1000 배 더 높은, IL-13의 수준 증가가 전신성 경화증을 가진 환자의 혈청에서[50] 그리고 다른 형태의 폐 섬유증을 앓고 있는 환자로부터의 BAL 샘플에서[51] 측정되었다. 상응하게, 마우스 폐에서 IL-4가 아닌 IL-13의 과다발현은 섬유증을 악화시켰다[52][53]. 폐 이외의 조직에서 섬유증에의 IL-13의 기여는 기생충-유도된 간 섬유증의 마우스 모델에서 널리 연구되었다. 가용성 IL-13Rα2의 투여에 의한 IL-13의 특이적 억제 또는 IL-13 유전자 파괴(IL-4 생산의 절제는 아님)는 간에서 섬유발생을 방지하였다[54][55][56].
만성 폐쇄 폐 질환(COPD)은 다양한 정도의 만성 기관지염, 소 기도 질병 및 폐 기관종을 가진 환자 집단을 포함하며 현재의 천식계 치료에 잘 반응하지 않는 진행성 비가역적 폐 기능 쇠퇴를 특징으로 한다[90]. COPD의 발생은 최근 급격하게 증가하여 세계적으로 4번째의 사망 원인이 되었다(세계 보건 기구). 따라서 COPD는 충족되지 못한 의학적 요구를 나타낸다.
COPD의 원인은 여전히 잘 밝혀지지 않고 있다. "더치 가설"은 COPD와 천식에 대한 공통된 민감성이 있으며 따라서 유사한 기작이 두 질병의 발병에 기여할 수 있다고 제안한다[57].
Zheng et al[58]은 마우스 폐에서 IL-13의 과다발현이 폐공기종, 점액 생산 증가 및 염증을 야기하여, 인간 COPD의 양상을 반영함을 입증하였다. 더욱이, 알레 르기성 염증의 쥐 모델에서 IL-13 의존성 반응인 AHR은 흡연자에서 폐 기능 쇠퇴를 예측하는 것으로 나타났다[59]. 연관성은 또한 IL-13 프로모터 다형성과 COPD를 일으킬 민감성 사이에서 확립되었다[60].
따라서 신호는 IL-13이 COPD의 발병에서, 특히 AHR 및 호산구증가증을 비롯한 천식형 특징을 가진 환자에서 역할을 한다는 것이다. IL-13의 mRNA 수준은 보고된 폐 질병이 없는 개체로부터의 폐 샘플과 비교할 때 COPD의 전력을 가진 개체로부터의 생검 조직 샘플에서 더 높은 것으로 나타났다(J.Elias, Oral communication at American Thoracic Society Annual Meeting 2002). 다른 연구에서는, IL-13의 수준 상승은 COPD 환자로부터의 주변 폐 절편에서의 면역조직화학에 의해 입증되었다[91].
호지킨 병은 미국에서 대략 해마다 7500 건을 차지하는 일반적인 타입의 림프종이다. 호지킨 병은 종종 B-세포에서 유래하는 종양성 리드-스테른버그 세포가 임상적으로 검출가능한 덩어리의 작은 부분만을 이룬다는 점에서 종양중에서 특이하다. 호지킨 병-유래 세포주 및 일차 리드-스테른버그 세포는 종종 IL-13 및 그 수용체를 발현한다[61]. IL-13이 정상 B-세포에서 세포 생존 및 증식을 촉진하므로, IL-13이 리드-스테른버그 세포를 위한 성장 인자로서 작용할 수 있음이 제안되었다. Skinnider et al.은 IL-13에 대한 중화 항체가 시험관내에서 호지킨 병-유래 세포주의 성장을 억제할 수 있음을 입증하였다[62]. 이 발견은 리드-스테른버그 세포가 IL-13 자가분비 및 이웃분비 사이토카인 루프에 의해 그들 자신의 생존을 증가시킬 수 있음을 제안하였다. 이 가설과 일치하여, IL-13의 수준 상승이 정상 대 조구와 비교할 때 일부 호지킨 병 환자의 혈청에서 검출되었다[63]. IL-13 억제제는 따라서 악성 리드-스테른버그 세포의 증식을 억제하여 질병 진전을 방지할 수도 있다.
많은 인간 암 세포는 면역원성 종양 특이적 항원을 발현한다. 하지만, 많은 종양은 자발적으로 퇴행함에도 불구하고, 다수는 T-세포 매개 면역을 억제하여 면역 시스템(면역감시)을 피한다. Terabe et al.[64]는 종양이 초기 성장 후 자발적으로 퇴행하고 다시 재발하는 마우스 모델에서 면역억제에서 IL-13의 역할을 입증하였다. 가용성 IL-13Rα2를 이용한, IL-13의 특이적 억제는 이들 마우스를 종양 재발로부터 보호하였다. Terabe et al[64]은 IL-13이 항-종양 면역 반응을 매개하는 종양 특이적 CD8+ 세포독성 림프구의 분화를 억제함을 보여주기 위해 계속하였다.
IL-13 억제제는 따라서 종양 재발 또는 전이를 방지하기 위해 치료적으로 이용될 수도 있다. IL-13의 억제는 동물 모델에서 항바이러스 백신을 증강시키는 것으로 나타났으며 HIV 및 다른 감염성 질병의 치료에 유익할 수도 있다[65].
일반적으로 여기서 인터루킨-13 즉 IL-13에 대한 언급은, 내용이 다른 것을 나타내는 경우를 제외하고는, 인간 IL-13을 의미하는 것이다. 이것은 또한 "항원"으로 불리기도 한다. 본 발명은 사이노몰거스 및 레서스 원숭이 IL-13을 비롯한, 비-인간 영장류 IL-13과 교차반응성인, 인간 IL-13에 대한 항체, 특히 인간 항체를 제공한다. 본 발명의 일부 구체예에 따른 항체는 아미노산 위치 130의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된 IL-13의 변이체를 인식한다. 다른 태양 및 구체예에서 본 발명은 쥐 IL-13, 특히 마우스 IL-13에 대한 특이적 결합 구성원을 제공한다.
도 1은 TF-1 세포 증식 분석에서 25 ng/ml 인간 IL-13에 대한 scFv로서 BAK167A11(검은 사각형) 및 그 유도체 BAK615E3(흰 사각형)의 중화 능력(% 억제)을 보여준다. 삼각형은 무관한 scFv를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내에서 세번 측정의 표준 오차 바(bar)를 가진 평균을 나타낸다.
도 2는 TF-1 세포 증식 분석에서 25 ng/ml 인간 IL-13에 대한 scFv로서 BAK278D6(검은 사각형) 및 그 유도체 BAK502G9(흰 사각형)의 중화 능력(% 억제)을 보여준다. 삼각형은 무관한 scFv를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내에서 세번 측정의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 3은 TF-1 세포 증식 분석에서 25 ng/ml 쥐 IL-13에 대한 scFv로서 BAK209B11(검은 사각형)의 중화 능력(% 억제)을 보여준다. 삼각형은 무관한 scFv를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내에서 세번 측정의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 4는 TF-1 세포 증식 분석에서 IL-13에 대한 scFv로서 BAK278D6(검은 사각형)의 중화 능력(% 억제)을 보여준다. 삼각형은 무관한 scFv를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내에서 세번 측정의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 4A는 25 ng/ml 인간 IL-13에 대한 성능을 보여준다.
도 4B는 25 ng/ml 인간 변이체 IL-13에 대한 성능을 보여준다.
도 4C는 50 ng/ml 비인간 영장류 IL-13에 대한 성능을 보여준다.
도 5는 TF-1 증식 분석에서 항-인간 IL-13 항체의 성능의 비교를 보여준다. 데이터는 25 ng/ml 인간 IL-13에 대한 5-7회 실험에 대한 표준 오차 바를 가진 평균 중화 성능을 나타낸다. 시판 항체 B-B13에 비한 성능은 던네트 시험을 이용한 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. B-B13에 비교하여 * P<0.05, ** P<0.01.
도 6은 TF-1 세포 증식 분석에서 태그된 IL-13에 대한 인간 IgG4로서 BAK502G9(검은 사각형), BAK1167F2(검은 삼각형) 및 BAK1183H4(검은 역삼각형)의 중화 성능(% 억제)를 나타낸다. 흰 삼각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 세 개의 별도 실험의 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 6A는 25 ng/ml 인간 IL-13에 대한 성능을 나타낸다.
도 6B는 25 ng/ml 인간 변이체 IL-13에 대한 성능을 나타낸다.
도 6C는 50 ng/ml 비-인간 영장류 IL-13에 대한 성능을 나타낸다.
도 7은 천연 IL-13 의존성 HDLM-2 세포 증식 분석에서 인간 IgG4로서 BAK502G9(검은 사각형), BAK1167F2(검은 삼각형) 및 BAK1183H4(검은 역삼각형) 및 시판 항-인간 IL-13 항체(B-B13 - 흰 사각형; JES10-5A2 - 흰 역삼각형)의 중화 성능(% 억제)를 나타낸다. 흰 삼각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내에서 세번 측정의 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 8은 NHLF 분석에서 항-인간 IL-13 항체의 성능의 비교를 나타낸다. 데이터는 NHLF 에오탁신 방출 분석에서 10 ng/ml 인간 IL-13에 대한 4-5회 실험에 대한 표준 오차 바를 갖는 평균 중화 성능(IC50 pM)을 나타낸다. 시판 항체 B-B13에 비한 성능은 던네트 시험을 이용한 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. B-B13에 비교하여 * P<0.05, ** P<0.01.
도 9는 10 ng/ml 인간 IL-13에 대한 반응으로 HUVEC의 표면에서의 VCAM-1 상향조절에 대한 인간 IgG4로서 BAK502G9(검은 사각형), BAK1167F2(검은 삼각형) 및 BAK1183H4(검은 역삼각형)의 중화 성능(% 억제)를 나타낸다. 흰 삼각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내의 3회 측정의 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 10은 1 ng/ml 인간 IL-4(도 10A) 또는 0.5 ng/ml 인간 IL-1β(도 10B)에 대한 반응으로 HUVEC의 표면에서의 VCAM-1 상향조절로부터 에오탁신 방출에 대한 인간 IgG4로서 BAK502G9(검은 사각형), BAK1167F2(검은 삼각형) 및 BAK1183H4(검은 역삼각형)의 중화 성능(% 억제)를 나타낸다. 흰 삼각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내의 세번의 측정의 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 11은 인자 의존성 B9 세포 증식 분석에서 1 ng/ml 쥐 IL-13에 대한 인간 IgG4로서 BAK209B11(사각형)의 중화 성능(% 억제)를 나타낸다. 흰 삼각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 동일한 실험내의 세번의 측정의 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 12는 급성 폐 알레르기 염증의 쥐 모델에서 공격 후 감작된(s)(우측 막대) 마우스 및 비감작된(ns)(좌측 막대) 마우스로부터의 폐 균질물에서 IL-13의 상대적인 수준을 보여준다. 감작의 효과는 IL-13 데이터의 양을 이용하여 스튜던트 t-테스트를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 비감작된 대조구 동물(n=5-6 마우 스)에 비하여 *＜0.05 **＜0.01. 데이터는 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 13은 난백알부민 감작된 마우스에서 난백알부민 유도된 백혈구의 폐로의 보충에 대한, 아이소타입 매치된 IgG4 무관 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK209B11의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 백혈구의 수가 나타난다(x 104). 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 공격된 PBS 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=5 - 8 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 14는 난백알부민 감작된 마우스에서 난백알부민 유도된 호산구의 폐로의 보충에 대한, 아이소타입 IgG4 무관 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK209B11의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 호산구의 수가 나타난다(x 104). 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 공격된 PBS 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=5 - 8 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 15는 난백알부민 감작된 마우스에서 난백알부민 유도된 호중구의 폐로의 보충에 대한, 아이소타입 매치된 IgG4 무관 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK209B11의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 호중구의 수가 나타난다(x 104). 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일 방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 공격된 PBS 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=5 - 8 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 16은 난백알부민 감작된 마우스에서 난백알부민 유도된 림프구의 폐로의 보충에 대한, 아이소타입 매치된 IgG4 무관 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK209B11의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 림프구의 유도는 3 ㎍/ml의 BAK209B11에서 최대 억제를 가지면서 BAK209B11에 의해 투여량 의존적으로 억제되었다. 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 공격된 PBS 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=5 - 8 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 17은 난백알부민 감작된 마우스에서 난백알부민 유도된 단핵구/대식세포의 폐로의 보충에 대한, 아이소타입 매치된 IgG4 무관 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK209B11의 정맥내 투여의 효과를 예시한다. 대조 동물과 비교할 때 감작된 동물의 단핵구/대식세포의 수준에서 큰 증가는 없었다. 하지만, 이들 세포의 그러한 배경 수준은 감작된 동물에서 ≥36 ㎍/ml BAK209B11에 의해 억제되었다. 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 공격된 PBS 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=5 - 8 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 18은 박테리아 유래된 재조합 인간 IL-13의 투여에 의해 유도된 쥐 공기주머니내로의 세포의 유입(백혈구의 수가 나타남 (x 104))에 대한 시판 항-IL-13 중화 항체 JES10-5A2의 효과를 나타낸다. 항체 처리의 효과는 차등적 세포 계수 데이터를 이용하여 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. CMC 대조 동물에 비하여 *<0.05. **<0.01(=0% 억제; n=11 - 13 마리 마우스). 데이터는 표준 오차 바를 갖는 평균을 나타낸다.
도 19는 인간 IL-13 아미노산 서열에 대한 사이노몰거스 IL-13의 서열 배열을 보여준다. 인간과 사이노몰거스 IL-13 사이에 상이한 7개의 아미노산 잔기는 음영으로 처리된다. 레서스 및 사이노몰거스 IL-13은 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
도 20은 29일에 걸쳐 4 마리의 알레르기성이지만 공격받지 않은 사이노몰거스 영장류(2 웅성/2 자성)에서 혈청 IgE 수준에 대한 인간 IgG4로서 BAK502G9의 단일 10 mg/kg 정맥내 환괴 투여량의 효과를 예시한다. 혈청 IgE 농도는 투여 후 4 일 및 5일에 100%(투여전)에서 대조값의 66±10%로 크게 감소된다(p<0.05). 이러한 혈청 IgE 농도의 저하는 22일에 대조값의 88±8%로 회복된다. 투여전 IgE 수준과 비교할 때 * = p<0.05, ANOVA 및 이어서 던네트 다중 비교 시험(n=4 동물)을 반복 측정함.
도 20B는 BAK502G9의 단일 10 mg/kg 정맥내 투여 후 시간에 대한 웅성 및 자성 사이노몰거스 영장류의 상대적인 혈청 IgE 수준을 보여준다. 상대적인 혈청 IgE 데이터는 수학적 평균 ± 기준값의 SEM 퍼센티지로 표현된다.
도 21은 난백알부민 감작되고 공격된 마우스의 폐 기능에 대한, 아이소타입 매치된 IgG1 무관한 대조 항체와 비교한 상이한 양의 BAK209B11(H = 237 ㎍/일, M = 23.7 ㎍/일 및 L = 2.37 ㎍/일)의 복강내 투여의 효과를 예시한다. 도 21A에서 폐 기능은 임의의 처리 전(0 일) 및 감작, 공격 및 약물 처리 후(25일)에 log PC50s(기준 PenH를 50% 증가시키는 데 필요한 메타콜린 농도의 로그값)에 의해 나타내진다. 도 21A는 도 21B에 나타난 대로, 연구 종말점을 계산하기 위해 이용된 기본 데이터를 보여준다(델타 log PC50). 데이터는 n=8의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 21B에서는 개별 마우스의 log PC50에서의 변화(델타 log PC50)에 의해 폐 기능 변화가 나타난다. 델타 log PC50은 25일 대 0일에 log PC50에서의 개별 변화로 정의된다. 데이터는 표준 오차 바를 갖는 그룹 평균 델타 log PC50(처리 그룹 내에서 평균된 개별 변화)를 나타낸다. 항체 처리의 효과는 델타 log PC50 데이터를 이용한 던네트 시험으로 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 난백알부민 감작되고 공격된 대조 동물에 비하여 ** p<0.01( n= 8 마리 마우스).
도 22는 BALB/c 마우스의 공기주머니 내로의 전체 백혈구 보충(도 22A) 및 호산구 보충(도 22B)에 대한, 아이소타입 매치된 IgG4 무관한 대조 항체와 비교한 상이한 양의 인간 IgG4로서 BAK502G9의 국소(복강내) 및 전신성(정맥내) 투여의 효과를 예시한다. 데이터는 n=10의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다. 항체 처리 의 효과는 로그-변환된 데이터를 이용하는 던네트 시험을 이용한 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. huIL-13 공격된 마우스에 비교한 *p＜0.05, ** p<0.01(n=10).
도 23은 마우스의 기도에 인간 IL-13을 기관내 투여한 후 AHR의 발생에 대한 아이소타입 매치된 IgG4 무관한 대조 항체와 비교한 인간 IgG4로서 BAK502G9의 복강내 투여의 효과를 예시한다. 항체 처리의 효과는 PC200 메타콜린 데이터를 이용하는 던네트 시험을 이용한 일방 ANOVA를 실시하여 통계적으로 평가하였다. 인간 IL-13 양성 대조 그룹(n=6-8 마우스)에 비교한 *p＜0.05, ** p<0.01. 데이터는 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 24는 인간 B 세포 IgE 생산 분석에서 30 ng/ml IL-13에 대한 IgG4로서 BAK502G9(검은색 사각형)의 중화 성능(% 최대 반응)을 보여준다. 흰색 사각형은 무관한 IgG4를 나타낸다. 데이터는 별도의 실험들로부터의 여섯 개의 공여체의 표준 오차 바를 가진 평균을 나타낸다.
도 25는 기관지 평활근 세포에서 아고니스트 유도된 Ca2 + 시그널링의 IL-13 유도된 강화에 대한 BAK502G9의 효과를 보여준다. 히스타민에 대한 Ca2 + 시그널링 반응의 곡선 아래 면적(AUC)을 각 항체 +/- IL-13 처리전 상태에 대해 결정하였다. 세 개의 독립 실험으로부터의 합쳐진 데이터가 퍼센티지 차이 대 미처리 세포의 AUC±SD로서 무관한 항체 CAT-001(a) 및 BAK502G9(b)에 대해 나타난다(ns= 크지 않음(p>0.05), *p＜0.05, ** p<0.01). 결과는 본페로니의 시험후 다중 비교를 이용한 분산의 일방 분석(ANOVA)을 이용하여 통계적으로 평가하였다.
도 26은 단계 Ⅱ 투여된 BAK502G9의 효과를 보여준다. 도 26A는 히스타민 투여량 반응 곡선하의 면적의 변화에 의해 측정한 AHR에 대한 효과를 보여준다(n=14).
도 26B는 PC30에서의 변화에 의해 측정된 AHR에 대한 효과를 보여준다(n=18).
도 26C는 항원 프라이밍에 대한 효과를 보여준다(n=20).
도 26D는 BAL 염증에 대한 효과를 보여준다(n=21).
도 27은 IL-13-유도된 CD23 발현에 대한 BAK502G9의 효과를 보여준다. 데이터는 IL-13 단독(100%)에 대한 반응의 퍼센티지로 제시되며 6개의 개별 공여체로부터의 6개의 별도 실험(세벌씩 실시됨)의 평균 ± SEM % 대조구로 표현된다.
도 28은 IL-13 및/또는 IL-4 유도된 PBMC CD23 발현에 대한 BAK502G9 및 무관한 IgG4의 효과를 보여준다. 데이터는 IL-4 단독(100%)에 대한 반응의 퍼센티지로 제시되고 4개의 개별 공여체로부터의 4개의 별도 실험(세벌씩 실시됨)의 평균 ± SEM % 대조구로 표현된다.
도 29A는 IL-13/TNF-α/TGF-β1 함유 배지를 이용한 48시간 배양에 의해 유도된 NHLF 에오탁신-1 생산에 대한 BAK502G9의 효과를 보여준다. 데이터는 백혈구 모양 변화를 유도하기 위하여 이 연구에서 사용된 배지의 3회 측정으로부터의 수학적 평균 ± SEM으로 나타난다.
도 29B는 조절된 배지의 1:16 희석에 의해 유도된 인간 호산구의 모양 변화 에 대한 BAK502G9의 효과를 보여준다. 나타난 데이터 점은 4개의 개별 공여체로부터의 별도 실험으로부터의 평균 ± SEM % 블랭크 배지 모양 변화이다.
도 30은 IL-13 키메라의 첫번째 패널을 생산하기 위해 인간 IL-13내로 도입된 돌연변이를 강조하는, 쥐 IL13에 대한 인간 IL-13의 배열을 보여준다. 4개의 알파 헬릭스가 박스로 강조되며 루프 1 및 루프 3은 표지된다. 헬릭스 B, C 및 D, 그리고 루프 1 및 루프 3이 쥐 서열로 대체된 5개의 키메라 단백질을 생산하였다. 4개의 추가의 키메라 단백질을 생산하고 인간 프리-단백질에서의 아미노산에 따라(다중 배열의 넘버링에 따른 것이 아님) 번호를 붙였으며 이때 잔기 30의 아르기닌(상기 위치 34)가 돌연변이되며, 잔기 33 및 34(상기에서 위치 37 및 38)가 돌연변이되며, 잔기 37 및 38(VH)이 돌연변이되며(상기 위치 41 및 42), 그리고 잔기 40 및 41(TQ)이 돌연변이된다(위치 44 및 45).
도 31은 IL-13 키메라의 두 번째 패널을 생산하기 위해 인간 IL-13내로 도입된 돌연변이를 강조하는, 쥐 IL-13에 대한 인간 IL-13의 배열을 보여준다. 인간 잔기가 쥐 잔기로 치환된 6개의 키메라를 생산하였다. 4개의 추가의 키메라 단백질을 생산하였으며(넘버링은 인간 프리-단백질에서의 아미노산에 따름) 이때 잔기 58의 루이신(상기 도면에서 62)가 돌연변이되며, 잔기 119의 루이신(상기에서 잔기 123)이 돌연변이되며, 위치 123의 라이신이 돌연변이되며(상기 잔기 127), 그리고 잔기 127의 아르기닌(상기 잔기 132)이 돌연변이된다.
도 32는 인간 IL-13에 만들어진 돌연변이를 보여준다. 진한 회색의 돌연변이는 BAK502G9에의 결합을 감소시켰으며, 연한 회색의 돌연변이는 결합을 바꾸지 않 았다. 돌연변이된 잔기를 가진 프리-인간 IL-13의 선형 서열이 표시된다.
본 발명의 다양한 태양 및 구체예에는 하기에 포함된 청구범위의 대상이 제공된다.
본 발명은 IL-13, 특히 인간 및/또는 영장류 IL-13 및/또는 변이체 IL-13(Q130R), 및 쥐 IL-13에 대한 특이적 결합 구성원을 제공한다. 본 발명 내의 바람직한 구체예는 전체 항체(예, IgG4와 같은 IgG)이건 또는 항체 단편이건(예, scFv, Fab, dAb), 항체 분자이다. 항체 VH와 VL 도메인과 같은 항체 항원 결합 영역이 제공된다. VH와 VL 도메인내에는 상보성 결정 영역, CDR이 제공되며, 이는 VH 또는 VL 도메인을 형성하기 위하여 상이한 골격 영역, FR내에 제공될 수 있다. 항원 결합 부위는 항체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인으로 구성될 수 있다.
항원 결합 부위는 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등과 같은 비-항체 단백질 스캐폴드상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다[115,116]. 단백질에서 신규 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 Nygren et al.에 의해 상세하게 검토되었다[116]. 항체 모방체를 위한 단백질 스캐폴드는 WO/0034784에 개시되며 여기서 발명자들은 하나 이상의 임의화된 루프를 갖는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 개시한다. 하나 이상의 CDR, 예, HCDR 세트를 이식하기 위한 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 여기서 "BAK278D6 계통"으로 불리는 것이다. 이것은 하기와 같이 BAK278D6의 여섯개의 CDR 서열의 세트를 참고하여 정의된다: HCDR1(서열 번호 1), HCDR2(서열 번호 2), HCDR3(서열 번호 3), LCDR1(서열 번호 4), LCDR2(서열 번호 5) 및 LCDR3(서열 번호 6). 한 양태에서, 본 발명은 인간 항체 VH 도메인과 인간 항체 VL 도메인으로 구성되며 한 세트의 CDR을 포함하는 항체 항원-결합 부위를 포함하는, 인간 IL-13에 대한 특이적 결합 구성원을 제공하며, 이때 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하며 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하며, 이때 HCDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지며, LCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지며, 또는 상기에서 CDR 세트는 CDR 세트와 비교하여 하나 또는 두개의 아미노산 치환을 함유하며, 이때 HCDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지며, LCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가진다.
HCDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지며, LCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CDR 세트는 여기서 "CDR의 BAK278D6 세트"로 불린다. CDR의 BAK278D6 세트내의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 "HCDR의 BAK278D6 세트"로 불리며 CDR의 BAK278D6 세트내의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 "LCDR의 BAK278D6 세트"로 불린다. CDR의 BAK278D6 세트, HCDR의 BAK278D6 세트 또는 BAK278D6 LCDR을 갖는 CDR 세트, 또는 그 안의 하나 또는 두개의 치환은 BAK278D6 계통인 것으로 말한다.
정의된 대로, 한 양태에서 본 발명은 인간 항체 VH 도메인과 인간 항체 VL 도메인으로 구성되며 CDR 세트를 포함하는 항체 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 IL-13에 대한 특이적 결합 구성원을 제공하며, 이때 CDR 세트는 CDR의 BAK278D6 세트 또는 CDR의 BAK278D6 세트와 비교하여 하나 또는 두개의 치환을 함유한 CDR 세트이다.
바람직한 구체예에서, 하나 또는 두개의 치환은 카바트의 표준 넘버링을 이용하여, VH 및/또는 VL 도메인의 CDR내의 하기 잔기 중 하나 또는 둘에 있다.
HCDR1의 31, 32, 34
HCDR2의 52, 52A, 53, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65
HCDR3의 96, 97, 98, 99, 101
LCDR1의 26, 27, 28, 30, 31
LCDR2의 56
LCDR3의 95A, 97
바람직한 구체예는 CDR의 BAK278D6 세트와 비교할 때 HCDR3 잔기 99 및 LCDR1 잔기 27에서 두 치환을 갖는다. 이들 구체예에서, 바람직한 구체예는 HCDR3 잔기 99에서 N 대신 S 및/또는 LCDR1 잔기 27에서 N 대신 I를 갖는다. 또 다른 구체예는 S, A, I, R, P 및 K로 구성된 군에서 선택된 HCDR3 잔기 99에서의 치환 및/또는 I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H 및 G로 구성된 군에서 선택된 LCDR1 잔기 27에서의 치환을 갖는다.
바람직한 구체예에서 하나 또는 두개의 치환은 가능한 치환 잔기의 확인된 그룹에 따라 CDR의 BAK278D6 세트내의 하기 잔기 중 하나 또는 둘에서 만들어진다:
치환의 위치 하기로 구성된 군에서 선택된 치환 잔기
HCDR1의 31: Q, D, L, G 및 E
HCDR1의 32: T
HCDR1의 34: V, I 및 F
HCDR2의 52: D, N, A, R, G 및 E
HCDR2의 52A: D, G, T, P, N 및 Y
HCDR2의 53: D, L, A, P, T, S, I 및 R
HCDR2의 54: S, T, D, G, K 및 I
HCDR2의 56: T, E, Q, L, Y, N, V, A, M 및 G
HCDR2의 58: I, L, Q, S, M, H, D 및 K
HCDR2의 60: R
HCDR2의 61 : R
HCDR2의 62 : K 및 G
HCDR2의 64 : R
HCDR2의 65 : K
HCDR3의 96: R 및 D
HCDR3의 97: N, D, T 및 P
HCDR3의 98: R
HCDR3의 99: S, A, I, R, P 및 K
HCDR3의 101: Y
LCDR1의 26: D 및 S
LCDR1의 27: I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H 및 G
LCDR1의 28: V
LCDR1의 30: G
LCDR1의 31 : R
LCDR2의 56: T
LCDR3의 95A: N
LCDR3의 97: I
바람직한 구체예는 HCDR3내의 잔기 99에서 N 대신 S 치환 및 LCDR1내의 잔기 27에서 N 대신 I를 갖는 CDR의 BAK278D6 세트를 갖는다. 이렇게 정의된 CDR 세트는 하기와 같다: HCDR1-서열 번호 7 ; HCDR2-서열 번호 8, HCDR3- 서열 번호 9; LCDR1-서열 번호 10, LCDR2-서열 번호 11; LCDR3-서열 번호 12. 이 CDR 세트는 여기서 "CDR의 BAK502G9 세트"로 불린다.
추가의 바람직한 구체예는 HCDR3내의 잔기 99에서의 N 대신 S의 치환 및 LCDR1내의 잔기 27에서의 N 대신 I의 치환 쌍이 배제된다면, CDR내의 하나 또는 두개의 치환을 갖는 CDR의 BAK278D6 세트를 갖는다.
다른 바람직한 구체예는 하기와 같다: BAK 1166G2: HCDR1-서열 번호 67, HCDR2-서열 번호 68, HCDR3-서열 번호 69, LCDR1-서열 번호 70, LCDR2-서열 번호 71; LCDR3-서열 번호 72.
BAK1167F2 HCDR1-서열 번호 61, HCDR2-서열 번호 62, HCDR3 서열 번호 63, LCDR1-서열 번호 64, LCDR2-서열 번호 65 ; LCDR3-서열 번호 66.
BAK1184C8: HCDR1-서열 번호 73, HCDR2: 서열 번호 74, HCDR3- 서열 번호 75. LCDR1-서열 번호 76, LCDR2-서열 번호 77; LCDR3-서열 번호 78.
BAK1185E1 : HCDR1-서열 번호 79, HCDR2-서열 번호 80, HCDR3- 서열 번호 81. LCDR1-서열 번호 82, LCDR2-서열 번호 83 ; LCDR3-서열 번호 84.
BAK1167F4: HCDR1-서열 번호 85, HCDR2-서열 번호 86, HCDR3- 서열 번호 87. LCDR1-서열 번호 88,LCDR2-서열 번호 89 ; LCDR3-서열 번호 90.
BAK1111D10 : HCDR1-서열 번호 91, HCDR2-서열 번호 92, HCDR3- 서열 번호 93. LCDR1-서열 번호 94, LCDR2-서열 번호 95; LCDR3-서열 번호 96.
BAK1183H4: HCDR1-서열 번호 97, HCDR2-서열 번호 98, HCDR3- 서열 번호 99. LCDR1-서열 번호 100, LCDR2-서열 번호 101; LCDR3-서열 번호 102.
BAK1185F8: HCDR1-서열 번호 103, HCDR2-서열 번호 104, HCDR3-서열 번호 105. LCDR1-서열 번호 106, LCDR2-서열 번호 107; LCDR3-서열 번호 108. 이들 모두는 중쇄 CDR1 및 CDR2 임의화에 의해 BAK502G9로부터 유래되었으며 따라서 BAK502G9 계통이다.
임의의 클론의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인이 표 1에 나타난다. 표 1은 또한 표 1에 나타난 클론의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 제공한다. 바람직하게는 그러한 VH 도메인은 그러한 VL 도메인과 짝을 이루며, 가장 바람직하게는 VH 및 VL 도메인 쌍은 표 1에 개시된 클론에서와 동일하다.
HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 VH 도메인이 본 발명에 의해 추가로 제공되며 이때 CDR 세트는 하나 또는 두개의 아미노산 치환을 갖는, 표 1에 나타난 임의의 클론을 위한 세트에 해당한다.
그러한 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원은 또한 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명자들은 특히 중요한, IL-13에 대한 인간 항체 항원-결합 도메인을 제공하는 BAK278D6 계통을 확인하였다. 그 계통내에서, BAK502G9는 특히 중요한 것으로 확인되었다. CDR의 BAK278D6 및 BAK502G9 세트는 이미 상기에서 확인되었다.
구조/특성-활성 관계에 다변수 데이터 분석 기법을 적용하는 데 있어서 컴퓨터 화학의 선도에 이어[94], 항체의 정량적 활성-특성 관계는 통계 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 공지의 수학적 기법을 이용하여 유도될 수 있다[95-100]. 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 및 삼차원 구조의 실험적 및 이론적 모델(예, 가능한 접촉 잔기의 분석 또는 계산된 물리화학적 특성)로부터 유래될 수 있으며 이들 특성은 단독으로 및 조합하여 고려될 수 있다.
VH 도메인과 VL 도메인으로 구성된 항체 항원-결합 부위는 6개의 폴리펩티드 루프에 의해 형성된다: 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터의 세 개 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터의 세 개. 공지의 원자 구조의 항체의 분석은 서열과 항체 조합 부위의 삼차원 구조 사이의 관계를 밝혔다[101,102]. 이들 관계는 VH 도메인에서 세번째 영역(루프)을 제외하고, 결합 부위 루프가 소수의 주쇄 형태 중 하나를 가짐을 의미한다: 공인 구조. 특정 루프에서 형성된 공인 구조는 그 크기 및 루프와 골격 영역 모두의 핵심 부위에서 일부 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 나타났다[101, 102].
서열-구조 관계의 이 연구는 서열이 알려져 있으나 삼차원 구조는 알려져 있지 않은 항체에서 이들 잔기의 예측에 이용할 수 있으며, 이들 잔기는 그 CDR 루프의 삼차원 구조를 유지하고 따라서 결합 특이성을 유지하는 데 있어서 중요하다. 이들 예측은 그 예측을 선도 최적화 실험으로부터의 결과와 비교하여 뒷받침될 수 있다.
구조적인 접근에서는, WAM[104]과 같은 자유롭게 이용가능하거나 시판되는 패키지를 이용하여 항체 분자의 모델을 만들 수 있다[103]. Insight II[105] 또는 Deep View[106]과 같은 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지를 이어서 이용하여 CDR에서 각 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이 정보를 이용하여 활성에 최소 또는 유익한 효과를 가질 치환을 만들 수 있다.
본 발명자들은 CDR 세트가 표 1에 나타난 클론 패널의 서열 데이터를 분석하였다.
상기 분석은 제시된 scFv 변이체 세트로부터의 CDR에서의 열거된 아미노산 변화의 임의의 2원 조합이 모 scFv BAK278D6의 개시 성능을 적어도 갖는 scFv 변이체를 야기한다는 가설을 시험하였다.
표 1에 나타난 패널의 모든 scFv 변이체는 개선된 친화성에 대해 선택되었으며 더 높은 성능을 나타내는 것을 확인하였다.
관찰된 아미노산 변이는 44 nM의 TF-1 분석에서 scFv BAK278D6의 개시 성능에 대한 그들의 효과에 있어서 우호적이거나, 비우호적이거나 중성일 수 있다.
임의의 두 아미노산 변이 사이에서 연관성이 관찰되지 않아 임의의 두개의 선택된 아미노산 변이 사이에는, "양성"이건 "음성"이건, 상승효과가 없음을 확인하였다.
그러한 2원 조합이 상기 가설을 만족할 4개의 시나리오가 있으며 가설이 타당하지 않을 3개의 시나리오가 있다. 연관성이 관찰되지 않으므로 상승적 아미노산 변이는 고려되지 않는다.
하기의 경우에 가설이 타당하다:
A1: 돌연변이 1은 우호적이고 돌연변이 2는 우호적임
A2: 돌연변이 1은 우호적이고 돌연변이 2는 중성임
A3: 돌연변이 1은 중성이고 돌연변이 2는 중성임.
A4: 돌연변이 1은 우호적이고 돌연변이 2는 비우호적임(1의 효과가 2의 효과보다 큼).
가설은 하기의 경우에 타당하지 않다:
B1: 돌연변이 1은 비우호적이고 돌연변이 2는 중성임
B2: 돌연변이 1은 비우호적이고 돌연변이 2는 비우호적임
B3: 돌연변이 1은 우호적이고 돌연변이 2는 비우호적임(2의 효과가 1의 효과보다 큼).
A4가 가능하기 위해서는, 돌연변이 1은 성능에 대한 돌연변이 2의 부정적 효과를 카운터밸런스하기 위해 매우 우호적이어야 한다. 그러한 매우 우호적인 돌연변이는 선별에 이용되는 변이체의 라이브러리에 존재하기 때문에, 그에 대해 선택될 것이며 따라서 변이체 패널에 자주 나타날 것이다. 상승적 효과가 배제될 수 있으므로, 그러한 돌연변이는 임의의 종류의 서열 내용에서 유익할 것이며 그리고 따라서 다른 scFv 변이체에서 다시 나타날 것이다. 그러한 빈번한 아미노산 변화의 예는 경쇄 CDR1 Asn27Ile의 변화이다. 하지만, (클론 BAK531E2에서) 이 돌연변이는 단독으로 성능에 대해 단지 온건한 2-배 효과를 갖는다(23.2 nM의 최종 IC50). 단독으로 이 돌연변이는 매우 우호적인 돌연변이가 아니므로, A4에서 묘사된 시나리오를 허용하지 않을 것이다. 이것은 하나 이상의 추가 돌연변이와 함께 경쇄 CDR1 Asn27Ile 변화를 갖는 IL-13 결합 클론의 제시된 세트(표 1)내의 모든 클론이 단일 경쇄 CDR1 Asn27Ile 돌연변이를 갖는 변이체와 적어도 동일하게 강력함을 제안한다. 다른 돌연변이는 중성이거나 양성이지만 음성이거나 해로운 효과를 갖지는 않는다.
추가의 예는 중쇄 CDR3 Asn99Ser에 있다(표 1 참고). 이 특정 단일 아미노산 변이를 보유한 클론이 관찰되지 않으므로, 그러한 클론의 성능은 하기 논리에 의해 약 12.0 nM일 것으로 추정되었다:
BAK278D6 성능은 44 nM이다. VL CDR1 N27I + VH CDR3 N99S의 교대에 의해 8 nM의 성능, 즉 5.5배 개선을 갖는 BAK502G9를 야기한다.
BAK278D6 성능은 44 nM이다. VL CDR1 N27I의 교대에 의해 23 nM의 성능을 갖는, 즉 9배 개선된 BAK531E2가 얻어진다.
BAK278D6 성능은 44 nM 이다. VH CDR3 N99S의 교대에 의해 12.2 nM의 성능, 즉 2.9배 개선(5.5/1.9=2.9)을 갖는 가능한 클론이 제공된다.
중쇄 CDR3 Asn99Ser과 경쇄 CDR1 Asn27Ile의 2원 조합은 8 nM의 성능을 갖는 scFv BAK0502G9를 제공한다. 상승효과가 배제되므로, BAK502G9에서 중쇄 CDR3 Asn99Ser 변화의 기여는 따라서 첨가적이다.
따라서 하나 이상의 추가 돌연변이와 함께 중쇄 CDR3 AsnH99Ser 변화를 갖는 IL-13 결합 클론의 제시된 세트(표 1)에서 모든 클론은 n=1-2에 대해 2.5배의 허용성 분석 윈도우내에서, 적어도 12 nM 이상의 성능을 가질 것이다.
따라서, 본 발명자들은 우선적으로 선택될 매우 우호적인 아미노산 변화가 관찰되지 않음을 주목한다. 전술한 대로, scFv 변이체의 표 1에 주로 나타난 두 변이를 더 자세하게 분석하였다.하나 이상의 추가 돌연변이와 함께 이들 돌연변이 중 어느 것을 가진 표 1의 임의의 scFv 변이체는 모 BAK278D6에서 이들 두 단일 아미노산 변이 중 어느 하나를 함유하는 클론만큼 적어도 개선된 성능을 나타내었다. 따라서 시나리오 A4를 허용할 매우 우호적인 아미노산 변이가 패널에 존재한다는 증거가 없다.
이 관찰은 발명자들이 이 scFv 변이체 세트에 비우호적인 돌연변이가 존재하지 않는 것으로 결론내도록 유도하였다. 이것은 시나리오 A4 및 B1 내지 B3가 무관하며 가설이 타당함을 의미한다.
따라서, 이미 언급된 바처럼, 본 발명은 CDR의 정의된 세트, 구체적으로 BAK278D6의 CDR 세트, 및 CDR 세트, 예, CDR의 BAK502G9 세트내에 하나 또는 두개의 치환을 갖는 BAK278D6 계통의 CDR 세트를, 포함하는 특이적 결합 구성원을 제공한다.
관련 CDR 세트는 항체 골격 영역 또는 다른 단백질 스캐폴드, 예, 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B내에 제공된다[115,116]. 바람직하게는 항체 골격 영역이 이용되며, 이들이 이용되는 경우 이들은 바람직하게는 생식선이며, 더욱 바람직하게는 중쇄를 위한 항체 골격 영역은 VH1 패밀리로부터의 DP14일 수 있다. 경쇄를 위한 바람직한 골격 영역은 λ3-3H일 수 있다. CDR의 BAK502G9 세트의 경우, 항체 골격 영역이 VH FR1를 위해서는 서열 번호 27, VH FR2를 위해서는 서열 번호 28, VH FR3를 위해서는 서열 번호 29, 경쇄 FR1을 위해서는 서열 번호 30, 경쇄 FR2를 위해서는 서열 번호 31, 경쇄 FR3를 위해서는 서열 번호 32이다. 매우 바람직한 구체예에서는, VH 도메인은 서열 번호 15의 아미노산 서열이 제공되며, 이것은 "BAK502G9 VH 도메인"으로 불린다. 추가의 매우 바람직한 구체예에서, VL 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열이 제공되며, 이것은 "BAK502G9 VL 도메인"으로 불린다. 본 발명에 따라 제공되는 매우 바람직한 항체 항원-결합 부위는 BAK502G9 VH 도메인, 서열 번호 15 및 BAK502G9 VL 도메인 서열 번호 16으로 구성된다. 이 항체 항원-결합 부위는 임의의 원하는 항체 분자 포맷, 예, scFv, Fab, IgG, IgG4, dAb 등내에 제공될 수 있다.
추가의 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명은 BAK502G9 VH 도메인, 서열 번호 15와 BAK502G9 VL 도메인, 서열 번호 16을 포함하는 IgG4 항체 분자를 제공한다. 이것은 여기서 "BAK502G9 IgG4"로 불린다.
BAK502G9 VH 도메인, 서열 번호 15 및/또는 BAK502G9 VL 도메인, 서열 번호 16을 포함하는 다른 IgG4 또는 다른 항체 분자는, 항체 VH 도메인내의 HCDR의 BAK502G9 세트(서열 번호 7,8 및 9), 및/또는 항체 VL 도메인내의 LCDR의 BAK502G9 세트(서열 번호 10,11 및 12)를 포함하는 다른 항체 분자와 마찬가지로, 본 발명에 의해 제공된다.
여기서 사용되는 경우 "및/또는"은 두 가지 특정된 특징 또는 성분의 각각을 다른 하나와 함께 또는 단독으로 구체적으로 개시하는 것을 나타내는 것이다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 여기서 개시된 것과 마찬가지로, (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 각각의 구체적인 개시로 간주되어야 한다.
언급한 것처럼, 본 발명은 인간 IL-13에 결합하며 BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15) 및/또는 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)을 포함하는 특이적 결합 구성원을 제공한다.
일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원 결합 부위를 제공하지만, 하기에 개시하는 바처럼 VH 도메인 단독이 항원 결합에 이용될 수도 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)은 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)과 쌍을 이루어 BAK502G9 VH 및 VL 도메인 둘다를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 다른 구체예에서, BAK502G9 VH는 BAK502G9 VL외의 VL 도메인과 쌍을 이룬다. 경쇄 혼란은 당분야에서 잘 확립되어 있다.
유사하게, BAK278D6 계통의 HCDR의 임의 세트는 특이적 결합 구성원 단독으로 또는 VL 도메인과 조합되어 사용되는 VH 도메인에 제공될 수 있다. VH 도메인은 예를 들어 표 1에 나타난 BAK278D6 계통 항체의 HCDR 세트가 제공될 수 있으며, 만일 그러한 VH 도메인이 VL 도메인과 쌍을 이루면, VL 도메인은 예를 들어 표 1에 나타난 BAK278D6 계통 항체의 LCDR 세트가 제공될 수 있다. HCDR 세트와 LCDR 세트의 쌍은 표 1에 나타난 대로 일 수 있으며, 표 1에 나타난 CDR 세트를 포함하는 항체 항원 결합 부위를 제공한다. VH 및/또는 VL 도메인의 골격 영역은 생식선 골격일 수 있다. 중쇄 도메인의 골격 영역은 VH-1 패밀리로부터 선택될 수 있으며, 바람직한 VH-1 골격은 DP-14 골격이다. 경쇄의 골격 영역은 λ3 패밀리로부터 선택될 수 있으며, 바람직한 그러한 골격은 λ3 3H이다.
하나 이상의 CDR은 BAK502G9 VH 또는 VL 도메인으로부터 취해져 적합한 골격내로 포함될 수도 있다. 이것은 여기서 추가로 개시된다. BAK502G9 HCDR 1,2 및 3이 각각 서열 번호 7,8 및 9에 나타난다. BAK502G9 LCDR 1,2 및 3은 각각 서열 번호 10,11 및 12에 나타난다.
동일한 것이 표 1에 나타난 다른 BAK278D6 계통 CDR 및 CDR 세트에 적용된다.
본 발명의 추가 구체예는 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원, 또는 167A11(VH: 서열 번호 23 및 VL: 서열 번호 24) 및 그 유도체 615E3(VH: 서열 번호 33 및 VL: 서열 번호 34) BAK582F7(VH CDR 서열 번호 141-143) 및 BAK612B5(VH CDR 서열 번호 147-149)로서 여기서 개시된 항체 분자의 VH 및/또는 VL 도메인의 CDR을 포함하는 항원 결합 부위에 관한 것이다. 이들은 인간 IL-13을 인식한다. VH CDR3 임의화로부터의 167A11의 유도체는 강력한 scFv 분자이다(5-6 nM). 167A11 계통은 다른 분자를 위해 여기서 개시된 대로 본 발명의 임의의 태양 및 구체예에서 이용될 수 있으며, 예를 들어, 돌연변이 방법 및 개선된 성능을 가진 항원 결합 부위의 선택에 이용될 수 있다.
아미노산 서열이 여기서 개시되고 IL-13에 대한 특이적 결합 구성원에 이용될 수 있는 것을 비롯한, 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 또는 돌연 변이 및 스크리닝의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 그러한 방법은 또한 본 발명에 의해 제공된다.
그 서열이 구체적으로 여기서 개시된 VH 및 VL 도메인 중 임의의 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 개시된 대로 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 구체적인 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변화(아미노산 잔기의 첨가, 결실, 치환 및/또는 삽입)는 약 20 변화 미만, 약 15 변화 미만, 약 10 변화 미만 또는 약 5 변화 미만, 4,3,2, 또는 1일 수 있다. 변화는 하나 이상의 골격 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 만들어질 수 있다.
본 발명의 추가 태양에 따라, 항원에 결합하며 특이적 결합 구성원, 여기서 개시된 VH 및/또는 VL 도메인, 또는 여기서 개시된 HCDR3, 또는 이들 중 임의의 것의 변이체를 포함하는 임의의 특이적 결합 구성원과 항원에의 결합을 위해 경쟁하는 특이적 결합 구성원이 제공된다. 결합 구성원들 사이의 경쟁은 예를 들어 ELISA를 이용하거나 및/또는 다른 태그되지 않은 결합 구성원의 존재하에서 검출될 수 있는 특이적 리포터 분자를 하나의 결합 구성원에 태그시킴으로써 동일한 에피토프 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 특이적 결합 구성원의 확인을 가능하게 하여 시험관내에서 쉽게 분석될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 태양은 IL-13에의 결합을 위해, BAK502G9 항체 분자, 구체적으로 BAK502G9 scFv 및/또는 IgG4와 경쟁하는 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는 특이적 결합 구성원을 제공한다. 추가 양태에서, 본 발명은 IL-13에의 결합을 위해 항체 항원-결합 부위와 경쟁하는 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는 특이적 결합 구성원을 제공하며, 이때 항체 항원-결합 부위는 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성되며, 이때 VH 및 VL 도메인은 BAK278D6 계통의 CDR 세트를 포함한다.
IL-13에의 결합을 위해, BAK502G9 항체 분자, BAK502G9 CDR 세트를 가진 항체 분자, 또는 BAK278D6 계통의 CDR 세트를 가진 항체 분자와 경쟁할 수 있는, IL-13에 대한 항체를 얻는 다양한 방법이 공지되어 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합 구성원을 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 특이적 결합 구성원의 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키고, 상기 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 특이적 결합 구성원 하나 이상을 선별하는 것을 포함한다.
상기 라이브러리는 박테리오파아지 입자의 표면상에 디스플레이되며, 각 입자는 그 표면상에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의로 존재하면 디스플레이된 VL 도메인을 암호화하는 핵산을 함유한다.
항원에 결합할 수 있으며 박테리오파아지 입자상에 디스플레이된 특이적 결합 구성원의 선택 후, 상기 선택된 특이적 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파아지 입자로부터 핵산을 취할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선택된 특이적 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파아지 입자로부터 얻은 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터의 발현에 의해 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 가변 도메인(임의로 항체 VL 가변 도메인)의 후속 생산에 이용될 수 있다.
상기 선택된 특이적 결합 구성원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 단리된 형태로 제공될 수 있으며, 그러한 VH 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원도 단리된 형태로 제공될 수 있다. IL-13에 결합하는 능력은 추가로 시험될 수 있으며, 또한 IL-13에의 결합을 위해 BAK502G9와 경쟁하는 능력도 시험될 수 있다(예, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷에서, 예, IgG4). IL-13을 중화시키는 능력은 후술하는 바대로 시험될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 BAK502G9 항체 분자, 예, scFv, 또는 바람직하게는 BAK502G9 IgG4의 친화성으로, 또는 더 나은 친화성으로 IL-13에 결합할 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 BAK502G9 항체 분자, 예, scFv, 또는 바람직하게는 BAK502G9 IgG4의 성능으로, 또는 더 나은 성능으로 IL-13을 중화시킬 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 BAK502G9 항체 분자, 예, scFv, 또는 바람직하게는 BAK502G9 IgG4의 성능으로, 또는 더 나은 성능으로 자연 발생 IL-13을 중화시킬 수 있다.
상이한 특이적 결합 구성원의 결합 친화성 및 중화 성능을 적절한 조건하에서 비교할 수 있다.
본 발명의 항체는 기존의 시판되는 항-IL-13 항체에 비하여, 특히 세 가지 시판되는 설치류 항-인간 IL-13 항체, 즉, JES10-5A2(BioSource), B-B13(Euroclone) 및 클론 321166(R&D Systems)에 비하여 많은 이점을 갖는다. 본 발명의 항체의 성능을 시판 항체 JES10-A2 및 B-B13과 비교하였다. 클론 321166은 이전 실험 결과 이 클론이 다른 공지의 시판 항체보다 상당히 덜 강력한 것으로 밝혀졌으므로 평가하지 않았다.
인간에서 설치류 시판 IL-13 항체의 효능 및 용도는 그들이 면역원성 반응을 유도하고 따라서 신체로부터 더 신속하게 소거될 가능성이 크므로 제한되기 쉽다. 비-인간 영장류에서 본 발명의 항체의 동적 분석은 이들 항체가 다른 공지의 인간 또는 인간화된 항체의 소거율과 유사한 소거율을 가짐을 제안한다.
본 발명의 다양한 구체예에 의해 제공되는 항체는 레서스 및 사이노몰거스 IL-13을 비롯하여 비-인간 영장류 IL-13을 인식한다. 비-인간 영장류에서 항체의 효능 및 안전성 프로파일을 결정하는 것은 인간에서 항체의 안전성, 약동학 및 약역학 프로파일을 예측하는 수단을 제공하므로 매우 중요하다.
더욱이, 본 발명의 다양한 구체예의 항체는 추가로 천식과 관련된 인간 IL-13 변이체, Q130R을 인식한다. 변이체 IL-13과의 교차 반응성은 본 발명의 항체 및 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 야생형 및 변이체 IL-13을 가진 환자의 치료에 이용되도록 한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15) 및 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)에 의해 형성된 IL-13 항원-결합 부위의 성능과 동일하거나 더 나은 성능을 갖는 자연 발생 IL-13을 중화시키는 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명자들은 BAK502G9, 1167F2 및 1183H4와 같은 대표적인 클론들이 공지의 시판 항체보다 자연 발생 IL-13에 대해 더욱 강력함을 입증하였다(도 7).
항체 서열에 더하여, 본 발명의 특이적 결합 구성원은 접힌 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하거나 또는 항원에 결합하는 능력에 더하여 다른 기능적 특성을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 구성원은 검출가능한 라벨을 보유하거나, 또는 독소 또는 표적화 부분 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통하여) 접합될 수도 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 특이적 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 본 발명의 특이적 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 특이적 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 생산을 야기하는 조건하에서 상기 핵산을 발현하고 이를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 본 발명의 특이적 결합 구성원의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 질병 또는 질환의 치료 방법(예방적 치료를 포함할 수 있음)과 같은, 인간 또는 동물 신체의 치료 또는 진단 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 상태는 IL-13이 역할을 하는 임의의 상태, 특히, 천식, 아토피성 피부병, 알레르기 비염, 섬유증, 만성 폐쇄 폐 질병, 피부경화증, 염증성 장 질환 및 호지킨 림프종을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 또한 IL-13 매개 면역억제를 억제할 것이므로 종양 및 바이러스 감염 치료에 이용될 수도 있다[64,65].
본 발명의 추가 태양은 여기서 개시된 항체 VH 가변 도메인 및/또는 VL 가변 도메인을 암호화하는, 일반적으로 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 태양은 여기서 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열, 특히 서열 번호 7,8 및 9에서 선택된 VH CDR 또는 서열 번호 10,11 및 12에서 선택된 VL CDR, 가장 바람직하게는 BAK502G9 VH CDR3(서열 번호 9)를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. CDR의 BAK502G9 세트를 암호화하는 핵산, HCDR의 BAK502G9 세트를 암호화하는 핵산 및 LCDR의 BAK502G9 세트를 암호화하는 핵산 또한 본 발명에 의해 제공되며, BAK278D6 계통의 개별 CDR, HCDR, LCDR 및 CDR, HCDR, LCDR의 세트를 암호화하는 핵산이 제공된다.
추가의 태양은 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 태양은 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 암호 핵산으로부터의 발현을 야기하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원의 생산 방법이 본 발명의 추가 태양으로서 제공된다.
생산 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
생산 방법은 생성물을 약학적 허용 부형제와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 조제하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 태양은 하기에 상세히 개시된다.
용어
특이적 결합 구성원
이것은 서로에 대해 결합 특이성을 갖는 분자쌍의 구성원을 설명한다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 자연적으로 유래되거나 또는 전적으로 또는 부분적으로 합성 생산될 수 있다. 분자 쌍 중 한 구성원은 분자 쌍의 다른 구성원의 구체적인 공간적 및 극성 조직에 특이적으로 결합하며 따라서 그에 상보적인 그 표면상의 영역, 즉 동공을 가진다. 따라서 그 쌍의 구성원은 서로 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 특이적 결합 쌍의 타입의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 항원-항체 타입 반응에 관심을 가진다.
항체 분자
이것은 천연이거나 또는 부분적 또는 전적으로 합성 생산된 면역글로불린을 말한다. 이 용어는 또한 항체 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 및 디아바디와 같은 분자이다.
모노클로날 및 다른 항체를 취하고 재조합 DNA 기법을 이용하여 원래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산하는 것이 가능하다. 그러한 기법은 항체의 면역글로불린 가변 영역, 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 DNA를 다른 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 및 골격 영역에 도입하는 것에 관련될 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400 및 많은 후속 문헌을 참고한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전적 돌연변이 또는 다른 변화에 노출될 수 있으며, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다.
항체가 많은 방식으로 변형될 수 있으므로, 용어 "항체 분자"는 필요한 특이성을 갖는 항체 항원-결합 도메인을 갖는 임의의 특이적 결합 구성원 또는 물질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연 또는 전적으로 또는 부분적으로 합성인, 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한, 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 다른 폴리펩티드에 융합된, 면역글로불린 결합 도메인 또는 그 등가물을 포함하는 키메라 분자가 따라서 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 많은 후속 논문에 개시된다.
항체 조작의 추가 공지 기법은 인간 및 인간화 항체의 단리를 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 Kontermann et al[107]에 의해 개시된 대로 만들어질 수 있다. 특이적 결합 구성원을 생성하기 위한 다른 확립된 기법인 파아지 디스플레이는 Kontermann et al[107] 및 WO92/01047과 같은 많은 문헌에서 상세히 개시되었다(이하에서 추가로 개시됨). 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체되는 한편 마우스 면역 시스템의 다른 성분은 그대로 남겨진 트랜스제닉 마우스를 이용하여 인간 항원에 대한 인간 항체를 단리할 수 있다[108].
합성 항체 분자는 예를 들어 Knappik et al. J.Mol.Biol.(2000) 296,57-86 또는 Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84에 의해 개시된 것과 같은, 합성되고 적절한 발현 벡터내로 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있음이 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH , CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward, E. S. et al., Nature 341,544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348,552-554); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 두 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되어 두 도메인이 연합하여 항원 결합 부위를 형성하는 단일 쇄 Fv 분자(scFv)(Bird et al, Science, 242,423-426,1988 ; Huston et al, PNAS USA, 85,5879- 5883,1988); (viii) 이특이적 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다특이적 단편인 "디아바디"(W094/13804 ; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,1993)이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 결합의 포함에 의해 안정화될 수 있다((Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245,1996). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 만들어질 수 있다(S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061,1996).
이특이적 항체가 이용될 경우, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는(Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4,446-449 (1993) ), 예를 들어, 화학적으로 제조되거나 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조되는 종래의 이특이적 항체이거나, 또는 전술한 이특이적 항체 단편 중 어느 것일 수 있다. 이특이적 항체의 예는 상이한 특이성을 갖는 두 항체의 결합 도메인이 이용될 수 있으며 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결되는 BiTETM 기법의 것을 포함한다. 이것은 짧은 단일 폴리펩티드 쇄상에서 두 항체를 결합한다. 디아바디 및 scFv는 단지 가변 도메인만을 이용하여 잠재적으로 항-이디오타입 반응의 효과를 감소시키면서, Fc 영역없이 구성될 수 있다.
이특이적 전체 항체와 반대로, 이특이적 디아바디는 또한 이들이 쉽게 구성되고 대장균에서 발현될 수 있으므로 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 파아지 디스플레이(WO94/13804)를 이용하여 라이브러리로부터 쉽게 선택될 수 있다. 만일 디아바디의 한 아암(arm)이 예를 들어, IL-13에 대해 형성된 특이성을 가지고 일정하게 유지되면, 다른 아암이 변화되는 라이브러리를 만들 수 있으며 적절한 선택성의 항체가 선택될 수 있다. 이특이적 전체 항체는 놉스-인투-홀(knobs-into-holes) 조작에 의해 만들어질 수 있다(J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng. , 9,616-621, 1996).
항원-결합 도메인
이것은 항원의 일부 또는 모두에 특이적으로 결합하며 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체 분자의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항체는 에피토프로 불리는, 항원의 특정 부분에만 결합할 수도 있다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다(예, VH 도메인으로 구성되는 소위 Fd 항체 단편). 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
특이적
이것은 특이적 결합 쌍의 한 구성원이 그 특이적 결합 파트너외의 분자에게 큰 결합을 나타내지 않는 상황을 말한다. 이 용어는 또한 예를 들어 항원 결합 도메인이 많은 항원에 의해 보유된 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 적용되며, 이 경우 항원 결합 도메인을 보유한 특이적 결합 구성원은 에피토프를 보유한 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다.
포함하다
이것은 일반적으로 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용함을 말하기 위해 포함하는 의미로 이용된다.
단리된
이것은 본 발명의 특이적 결합 구성원 또는 그러한 결합 구성원을 암호화하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따르게 될 상태를 말한다. 단리된 구성원 및 단리된 핵산은 그들이 그들의 자연 환경 또는 그들이 시험관내 또는 생체내에서 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 때 그들이 제조되는 환경(예, 세포 배양물)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산과 같은 자연적으로 연합되는 물질이 없거나 실질적으로 없을 것이다. 구성원 및 핵산은 희석물 또는 아쥬반트와 조제될 수 있으며 실질적인 목적을 위하여 단리될 수 있다- 예를 들어 구성원은 면역분석에 사용하기 위한 미세적정 플레이트를 코팅하기 위해 이용되면 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 것이며, 또는 진단 또는 치료에서 사용될 때는 약학적 허용 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 특이적 결합 구성원은 자연적으로 또는 이종성 진핵 세포 시스템(예, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503) 세포)에 의해 당화되거나, 또는 그들은 (예를 들어, 원핵 세포에서의 발현에 의해 생산되면) 당화되지 않을 수도 있다.
자연 발생 IL-13
이것은 일반적으로 IL-13 단백질 또는 그 단편이 발생할 수 있는 상태를 말한다. 자연 발생 IL-13은 재조합 기술을 이용하여 암호 핵산의 도입없이, 세포에 의해 자연적으로 제조되는 IL-13 단백질을 의미한다. 따라서, 자연 발생 IL-13은 예를 들어 CD4+ T 세포에 의해 자연적으로 생산되거나 및/또는 포유류, 예, 인간, 비-인간 영장류, 쥐 또는 마우스와 같은 설치류로부터 단리될 수 있다.
재조합 IL-13
이것은 IL-13 단백질 또는 그 단편이 발생할 수 있는 상태를 말한다. 재조합 IL-13은 이종성 숙주에서 재조합 DNA에 의해 생산된 IL-13 단백질 또는 그 단편을 의미한다. 재조합 IL-13은 당화에 의해 자연 발생 IL-13과 상이할 수도 있다.
원핵 박테리아 발현 시스템에서 발현된 재조합 단백질은 당화되지 않는 한편 포유류 또는 곤충 세포와 같은 진핵 세포에서 발현된 것들은 당화된다. 하지만 곤충 세포에서 발현된 단백질은 포유류 세포에서 발현된 단백질과 당화에 있어서 상이하다.
"개시된 것과 실질적으로"는 본 발명의 관련 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 그 서열이 여기서 개시된 특정 영역과 동일하거나 매우 유사할 것임을 의미한다. "매우 유사한"은 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3 또는 1 또는 2, 또는 3 또는 4와 같은 1 내지 4 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에서 만들어질 수 있음을 의미한다.
본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 보유하기 위한 구조는 일반적으로 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호된 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 해당하는 위치에 위치한 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 상당 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, 및 인터넷(http://immuno. bme. nwu. edu orfind"Kabat"using any search engine)에서 이용가능한 그 후속편을 참고하여 결정할 수 있다.
CDR은 또한 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B와 같은 다른 스캐폴드에 의해 보유될 수 있다[115,116].
바람직하게는, 실질적으로 여기서 개시된 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 그 상당 부분에서 CDR로 보유된다. 실질적으로 여기서 개시된 HCDR3 서열은 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내며 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그 상당 부분에서 HCDR3로 보유된다.
본 발명에 이용된 가변 도메인은 임의의 생식선 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻어지거나, 또는 공지의 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예, CDR3)은 재조합 DNA 기법을 이용하여, CDR이 없는 가변 도메인의 레퍼토리(예, CDR3)내로 도입될 수 있다.
예를 들어, Marks et al(Bio/Technology,1992, 10: 779-783)은 가변 도메인 영역의 5' 말단 또는 그 근처에서 지시된 컨센서스 프라이머가 인간 VH 유전자의 세번째 골격 영역에의 컨센서스 프라이머와 함께 이용되어 CDR3가 없는 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 개시한다. Marks et al.은 추가로 이 레퍼토리가 어떻게 특정 항체의 CDR3와 조합될 수 있는지를 개시한다. 유사한 기법을 이용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열이 CDR3가 없는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플될 수 있으며, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 짝 VL 또는 VH 도메인과 배합되어 본 발명의 특이적 결합 구성원을 제공한다. 이어서 상기 레퍼토리는 WO92/01047 또는 Kay, B. K. , Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press를 비롯한 많은 후속 문헌 중 어느 것의 파아지 디스플레이 시스템과 같은 적절한 숙주 시스템에서 디스플레이되어, 적절한 특이적 결합 구성원이 선택될 수 있다. 레퍼토리는 104 개별 구성원 이상으로부터, 예를 들어 106 내지 108 또는 1010 구성원으로부터의 임의의 것으로부터 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등을 포함한다. 리보솜 디스플레이를 위해서는 Lowe D and Jermutus L, 2004, Curr. Pharm, Biotech, 517-27, 및 W092/01047를 참고한다.
유사한 셔플링 또는 조합 기법은 또한 Stemmer (Nature, 1994,370 :389-391)에 개시되며, 이 문헌은 β-락타마제 유전자에 관련된 기법을 개시하지만 이 접근법이 항체의 생산을 위해 이용될 수도 있음을 관찰한다.
추가의 대안은 전체 가변 도메인내에서 돌연변이를 생성하기 위하여 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 이용하여 본 발명의 CDR-유래 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성하는 것이다. 그러한 기법은 에러-프론 PCR을 이용한 Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3576-3580)에 의해 개시된다. 바람직한 구체예에서 하나 또는 두개의 아미노산 치환이 HCDR 및/또는 LCDR 세트내에서 만들어진다.
이용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 돌연변이유발을 일으키는 것이다. 그러한 기법은 Barbas et al,(1994, Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 91: 3809- 3813) 및 Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263: 551-567)에 의해 개시된다.
모든 전술한 기법은 당분야에서 공지되어 있으며 그 자체는 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 당업자는 당분야의 일상적인 방법을 이용하여 본 발명의 특이적 결합 구성원을 제공하기 위하여 그러한 기법을 이용할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가 태양은 IL-13 항원에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 얻는 방법을 제공하며, 상기 방법은 여기서 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하며, 임의로 그렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하며, 그리고 특이적 결합 구성원 또는 IL-13 항원에 특이적이며 임의로 하나 이상의 바람직한 특성, 바람직하게는 IL-13을 중화시키는 능력을 갖는 항체 항원 결합 도메인을 확인하기 위하여 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하는 것을 포함한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 여기서 개시된 아미노산 서열을 갖는다.
여기서 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법을 이용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)은 돌연변이에 노출되어 하나 이상의 VH 도메인 아미노산 서열 변이체 및/또는 BAK502G9 VL(서열 번호 16)을 제공할 수 있다.
본 발명의 추가 태양은 IL-13 항원에 특이적인 특이적 결합 구성원을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(a) 치환될 CDR3를 포함하거나 CDR3 암호화 영역이 없는 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) VH CDR3를 위해 실질적으로 여기 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 공여체 핵산과 상기 레퍼토리를 조합하여 상기 공여체 핵산이 레퍼토리에서 CDR3 영역내로 삽입되도록 하여 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) IL-13에 특이적인 특이적 결합 구성원을 선택하는 단계; 및
(e) 상기 특이적 결합 구성원 또는 그것을 암호화하는 핵산을 회수하는 단계.
다시, 본 발명의 VL CDR3를, 치환될 CDR3를 포함하거나 CDR3 암호화 영역이 없는 VL 도메인을 암호화하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법을 이용할 수 있다.
유사하게, 하나 이상, 또는 모든 세개의 CDR이 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리내로 이식되고 이어서 IL-13에 특이적인 특이적 결합 구성원 또는 특이적 결합 구성원들에 대해 스크린된다.
바람직한 구체예에서, BAK502G9 HCDR1 (서열 번호 7), HCDR2 (서열 번호 8) 및 HCDR3 (서열 번호 9)중 하나 이상, 또는 HCDR의 BAK502G9 세트를 이용하거나, 및/또는 BAK502G9 LCDR1 (서열 번호 10), LCDR2 (서열 번호 11) 중 하나 이상 또는 LCDR의 BAK502G9 세트를 이용할 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 상당 부분은 그들의 간섭 골격 영역과 함께 적어도 세 개의 CDR 영역을 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 부분은 또한 첫번째 및 네번째 골격 영역 중 어느 하나 또는 둘다의 적어도 약 50%를 포함할 것이며, 상기 50%는 첫번째 골격 영역의 C-말단 50% 및 네번째 골격 영역의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 상당 부분의 N-말단 또는 C-말단의 추가 잔기는 정상적으로는 자연 발생 가변 도메인 영역과 연합되지 않는 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 만들어진 본 발명의 특이적 결합 구성원의 구성은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 촉진하기 위하여 도입된 링커에 의해 암호된 N- 또는 C- 말단 잔기의 도입을 야기할 수 있다. 다른 조작 단계는 본 발명의 가변 도메인을 면역글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인(예, 디아바디의 생산에서) 또는 여기서 보다 상세히 개시되는 단백질 라벨을 비롯한 추가 단백질 서열에 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에서 VH 및 VL 도메인 쌍을 포함하는 특이적 결합 구성원이 바람직하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가 태양을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있음이 알려져 있다.
단일 특이적 결합 도메인의 경우에, 이들 도메인은 IL-13에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크린하는 데 이용될 수 있다.
이것은 WO92/01047에 개시된 소위 서열적 이중 조합 접근법을 이용하는 파아지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서는 H 또는 L 쇄 클론을 함유한 개별 콜로니를 이용하여 다른 쇄(L 또는 H)를 암호화하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고 생성된 2쇄 특이적 결합 구성원을 상기 문헌에 개시된 것과 같은 파아지 디스플레이 기법에 따라 선택한다. 이 기법은 또한 Marks et al.에 개시된다.
본 발명의 특이적인 결합 구성원은 추가로 항체 불변 영역 또는 그 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그 C-말단에서, 인간 Cκ 또는 Cλ쇄, 바람직하게는 Cλ쇄를 비롯한 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 특이적 결합 구성원은 임의의 항체 아이소타입, 예, IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 아이소타입 서브-클래스, 구체적으로 IgG1 및 IgG4 중 어느 것으로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 모두 또는 일부(예, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. IgG4가 바람직하다. IgG4는 보체에 결합하지 않으며 효과인자 기능을 생성하지 않으므로 바람직하다. 이들 특성을 가지며 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 영역 변이체가 또한 본 발명의 구체예에 사용하기에 바람직하다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 검출가능하거나 기능성인 라벨로 표지될 수 있다. 검출가능한 라벨은 131I 또는 99Tc와 같은 방사성라벨을 포함하며, 이들은 공지의 화학 또는 항체 영상화를 이용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다. 라벨은 또한 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소 라벨을 포함한다. 라벨은 추가로 특이적 짝 검출성 부분, 예, 표지된 아비딘에의 결합을 통하여 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 부분을 포함한다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 인간 또는 동물 개체, 바람직하게는 인간에서의 진단 또는 치료 방법에 사용되도록 고안된다.
따라서, 본 발명의 추가 태양은 제공된 특이적 결합 구성원의 투여를 포함하는 치료 방법, 그러한 특이적 결합 구성원을 포함하는 약학 조성물, 및 예를 들어 특이적 결합 구성원을 약학적 허용 부형제와 조제하는 것을 포함하는 의약 또는 약학 조성물의 제조 방법과 같은 투여를 위한 의약의 제조에서 그러한 특이적 결합 구성원의 용도를 제공한다.
항-IL-13 항체를 이용하여 치료적 효과를 제공할 수 있는 임상적 징후는 천식, 아토피성 피부병, 알레르기 비염, 섬유증, 만성 폐쇄 폐 질병, 염증성 장 질병, 피부경화증 및 호지킨 림프종을 포함한다. 이미 설명한 대로, 항-IL-13 치료는 모든 이들 질병에 효과적이다.
항-IL-13 치료는 경구로, 주사에 의해(예, 피하, 정맥내, 복강내 또는 근육내), 흡입에 의해, 또는 국소로(예, 안구내, 비강내, 직장, 상처내, 피부상에) 주어질 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특성에 의해, 질병을 위한 특별한 고려사항에 의해 또는 효능을 최적화하거나 부작용을 최소화하기 위한 요건에 의해 결정될 수 있다.
항-IL-13 치료는 병원에서의 사용에 제한되지 않을 것이다. 따라서, 주사바늘없는 장치를 이용한 피하 주사 또한 바람직하다.
조합 치료를 이용하여 상당한 상승적 효과를 제공할 수 있으며, 특히 항-IL-13 특이적 결합 구성원과 하나 이상의 다른 약물과의 조합이 그러하다. 본 발명의 특이적 결합 구성원은 단기 또는 장기 작용성 베타 아고니스트, 코르티코스테로이드, 크로모글리케이트, 루코트리엔(수용체) 안타고니스트, 메틸 잔틴 및 그 유도체, IL-4 억제제, 무스카린 수용체 안타고니스트, IgE 억제제, 히스타민 억제제, IL-5 억제제, 에오탁신/CCR3 억제제, PDE4 억제제, TGF-베타 안타고니스트, 인터페론-감마, 페르페니돈, 화학요법제 및 면역치료제와 조합되거나 이들에 더하여 제공될 수 있다.
하나 이상의 단기 또는 장기 작용성 베타 아고니스트, 코르티코스테로이드, 크로모글리케이트, 루코트리엔(수용체) 안타고니스트, 잔틴, IgE 억제제, IL-4 억제제, IL-5 억제제, 에오탁신/CCR3 억제제, PDE4 억제제와의 조합 치료는 천식 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 섬유증의 치료를 위하여 코르티코스테로이드, 항-대사물, TGF-베타 및 그 하류 시그날링 경로의 안타고니스트와 조합되어 이용될 수 있다. 이들 항체와 PDE4 억제제, 잔틴 및 그 유도체, 무스카린 수용체 안타고니스트, 단기 및 장기 베타 안타고니스트의 조합 치료는 만성 폐쇄 폐 질병 치료에 유용할 수 있다. 유사한 조합이 아토피성 피부병, 알레르기 비염, 만성 폐쇄 폐 질병, 염증성 장 질환, 피부경화증 및 호지킨 림프종을 위한 항-IL-13 치료의 사용에 적용된다.
본 발명에 따라, 제공된 조성물은 개인에게 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 "치료적 유효량"으로 이루어지며 이것은 환자에게 효과를 나타내기에 충분한 양이다. 그러한 효과는 적어도 한 가지 증상을 적어도 완화시키는 것일 수 있다. 실제 투여되는 양, 및 투여 속도 및 시간과정은 치료되고 있는 것의 특성 및 심각성에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예, 투여량에 대한 결정 등은 일반적인 실시자 및 다른 의사의 책임범위 이내이다. 적절한 항체 투여량은 당업계에 공지되어 있다: Ledermann J. A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K. D. et al. (1991) Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915- 922를 참고한다.
정확한 투여량은 항체가 진단용인지 치료용인지 여부, 치료될 영역의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성(예, 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 라벨 또는 다른 분자의 특성을 비롯한 많은 인자에 의존할 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 용례를 위해서는 100 ㎍ 내지 1 gm 범위이며 국소 용례를 위해서는 1 ㎍ 내지 1 mg 범위일 것이다. 일반적으로, 항체는 전체 항체이며, 바람직하게는 IgG4 아이소타입일 것이다. 이것은 성인 환자의 단일 치료를 위한 투여양이며, 이것은 소아 및 유아를 위해 비례적으로 조절될 수 있으며, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷을 위해 조절될 수 있다. 치료는 의사의 판단에 따라 매일, 1주일에 2회, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 치료는 주기적이며, 투여 사이의 주기는 약 2주 이상이며, 바람직하게는 약 3주 이상, 더욱 바람직하게는 약 4주 이상, 또는 약 1달에 한번이다.
본 발명의 특이적인 결합 구성원은 대개 특이적 결합 구성원에 더하여 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물 형태로 투여될 것이다.
따라서 본 발명에 따른, 그리고 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 활성 성분에 더하여, 약학적 허용 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업계에 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 경구 또는 예, 정맥내 주사일 수 있는 투여 경로에 의존할 것이다.
경구 투여를 위한 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 아쥬반트와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리학적 염수용액, 덱스트로스 또는 다른 당 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사, 또는 아픈 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은 발열물질이 없으며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 관련 분야의 당업자는 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 이용하여 적절한 용액을 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
조성물은 단독으로, 또는 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라 액체 또는 고체 형태로 조제될 수 있다. 제제는 부형제, 또는 부형제의 조합, 예를 들어, 자당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범위한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 동결건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기법에 의한 건조에 의해 생산될 수 있다. 항-IL-13의 제제는 의도하는 전달 경로에 의존할 것이다: 예를 들어, 폐 전달을 위한 제제는 흡입 시 깊은 폐내로의 침투를 보장하는 물리적 특성을 가진 입자로 구성될 수 있으며, 국소 제제는 약물이 작용 부위에서 머무르는 시간을 연장하는 점도 개질제를 포함할 수 있다.
본 발명은 여기서 제공된 특이적 결합 구성원의 IL-13에의 결합을 야기하거나 허용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 언급한 대로, 그러한 결합은 예를 들어, 특이적 결합 구성원 또는 특이적 결합 구성원을 암호화하는 핵산의 투여 후 생체내에서 일어나거나, 또는 시험관내에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학, 면역침전, 친화성 크로마토그래피, 또는 TF-1 분석과 같은 세포계 분석에서 일어날 수 있다.
IL-13에의 특이적 결합 구성원의 결합의 양은 결정될 수 있다. 정량화는 진단 대상일 수 있는 시험 샘플에서 항원의 양에 관련될 수 있다.
특이적 결합 구성원 또는 본 발명의 어느 태양 또는 구체예에 따른 항체 분자를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 한 태양으로서 제공된다. 본 발명의 키트에서, 특이적 결합 구성원 또는 항체 분자는 예를 들어 하기에서 개시되는 바대로, 결정될 샘플에서의 그 반응성을 허용하기 위해 표지될 수도 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균성이며 밀봉된 바이알 또는 다른 용기에 함유된다. 키트는 진단 분석 또는 항체 분자가 유용한 다른 방법에서 이용될 수 있다. 키트는 예를 들어 본 발명에 따른 방법과 같은 방법에서 성분의 사용을 위한 안내서를 함유할 수 있다. 그러한 방법을 보조하거나 실시하도록 하는 보조 물질이 본 발명의 키트내에 포함될 수 있다.
샘플내의 항체의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 결정될 수 있다. 방사성면역분석(RIA)은 한 가지 가능성이다. 방사성 표지된 항원은 비표지 항원(시험 샘플)과 혼합되어 항체에 결합하도록 허용된다. 결합된 항원은 미결합 항원과 물리적으로 단리되며 항체에 결합된 방사성 항원의 양이 결정된다. 시험 샘플에 항원이 많을 수록 더 적은 방사성 항원이 항체에 결합할 것이다. 경쟁적 결합 분석은 또한 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 이용하여, 비방사성 항원과 이용될 수도 있다. 리포터 분자는 형광색소, 인광체 또는 스펙트럼적으로 단리된 흡수 또는 방출 특성을 갖는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광색소는 플루오르세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스레드를 포함한다. 적합한 발색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터는 거대분자성 콜로이드 입자 또는 착색되거나 자기성이거나 상자기성인 라텍스 비드와 같은 입자성 물질, 및 검출가능한 시그널이 시각적으로 관찰되거나, 전자적으로 검출되거나 다르게 기록되도록 직접 또는 간접적으로 야기할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성 제제를 포함한다. 이들 분자는 색상을 발생하거나 변화시키거나 또는 전기적 특성의 변화를 야기하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기성이어서 에너지 상태 사이의 전자적 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출을 야기할 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 이용되는 화학적 실체를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알카라인 포스파타제 검출 시스템을 이용할 수 있다.
개별 항체-리포터 접합체에 의해 생성된 시그널을 이용하여 샘플(정상 및 시험)에서 관련 항체 결합의 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이터를 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 전술한 특이적 결합 구성원의 용도를 제공하며, 즉 경쟁 분석에서 본 발명에 의해 제공되는 특이적 결합 구성원을 이용하여 샘플내의 항원 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 결합 항원을 미결합 항원으로부터 물리적으로 단리하는 것이 필요하지 않은 경우일 수 있다. 특이적 결합 구성원에 리포터 분자를 연결하여 물리적 또는 광학적 변화가 결합시에 일어나는 것이 한 가지 가능성이다. 리포터 분자는 검출가능한, 바람직하게는 측정가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접적 또는 간접적이거나, 예를 들어 펩티드 결합을 통해 공유적이거나 또는 비공유적일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 암호화하는 유전자 융합체의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들어, 바이오센서 시스템에서 본 발명에 따른 특이적 결합 구성원을 이용하여, 직접 항원 수준을 측정하는 것을 제공한다.
결합을 결정하는 모드는 본 발명의 특징이 아니며 당업자는 그들의 선호 및 일반 지식에 따라 적합한 모드를 선택할 수 있다.
언급된 대로, 다양한 태양 및 구체예에서, 본 발명은 여기서 정의된 임의의 특이적 결합 구성원, 예, BAK502G9 IgG4와 IL-13에 대한 결합에 대해 경쟁하는 특이적 결합 구성원으로 확대된다. 결합 구성원 간의 경쟁은 예를 들어 다른 태그되지 않은 결합 구성원의 존재하에서 검출될 수 있는 특이적 리포터 분자를 하나의 결합 구성원에 태그시켜 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 특이적 결합 구성원의 확인을 가능하게 함으로써, 시험관내에서 쉽게 분석될 수 있다.
경쟁은 예를 들어, IL-13이 플레이트에 고정되고 하나 이상의 다른 미태그 결합 구성원과 함께 첫번째 태그된 결합 구성원이 플레이트에 추가되는 ELISA를 이용하여 결정될 수 있다. 태그된 결합 구성원과 경쟁하는 미태그 결합 구성원의 존재는 태그된 결합 구성원에 의해 방출되는 시그널의 감소에 의해 관찰된다.
경쟁을 위한 시험에서는 항원의 펩티드 단편, 특히 대상 에피토프를 포함하는 펩티드를 이용할 수 있다. 에피토프 서열 및 어느 한 말단에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드를 이용할 수 있다. 그러한 펩티드는 특정 서열로 "본질적으로 구성"된다고 말할 수 있다. 본 발명에 따른 특이적 결합 구성원은 항원에 대한 그들의 결합이 주어진 서열을 갖거나 포함하는 펩티드에 의해 억제되는 것일 수 있다. 이것을 위한 시험에서는, 어느 한 서열 및 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드를 이용할 수 있다.
특이적 펩티드에 결합하는 특이적 결합 구성원은 예를 들어 펩티드를 이용한 패닝에 의해 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 특이적 결합 구성원을 암호화하는 단리된 핵산을 추가로 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수도 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 전술한 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예, scFv 또는 IgG4를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 적어도 하나를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구조체를 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 구조체 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 제공된 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예, scFv 또는 IgG4를 암호화하는 핵산 자체가 본 발명의 태양을 형성하며, 암호 핵산으로부터의 발현을 포함하는, 암호된 생성물의 생산 방법도 본 발명의 태양을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 편리하게 이루어질 수 있다. 발현에 의한 생산 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 구성원은 임의의 적합한 기법을 이용하여 단리되고/되거나 정제되고, 이어서 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, 및 암호 핵산 분자 및 벡터는 예를 들어, 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 그들의 자연 환경으로부터 단리되고/되거나 정제되어 제공되거나, 또는 핵산의 경우, 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 서열외의 핵산 또는 유전자 기원이 없거나 실질적으로 없이 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며 전적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 여기서 개시된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자, 및 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함하며 이때 U는 문맥이 달리 정의하지 않으면 T를 대신한다.
다양한 상이한 숙주에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 공지되어 있다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 식물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위한 당업계에서 이용가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 기타 다수를 포함한다. 일반적이고 바람직한 박테리아 숙주는 대장균이다.
대장균와 같은 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 확립되어 있다. 리뷰를 위해서는, 예를 들어, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)를 참고한다. 배양 진핵 세포에서의 발현 또한 특이적 결합 구성원의 생산을 위한 옵션으로서 당업자가 이용가능하며 예를 들어, Chadd HE and Chamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194, Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117, Larrick JW and Thomas DW (2001) Current opinion in Biotechnology 12: 411-418를 참고한다.
프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 함유한 적합한 벡터를 선택하거나 구성할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, '파아지 또는 파아지미드일 수 있다. 추가 상세 사항을 위해, 예를 들어, Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고한다. 예를 들어, 핵산 구조체의 제조, 돌연변이유발, 서열결정, 세포내로 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산의 조작을 위한 많은 공지 기법 및 프로토콜이 Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. , John Wiley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. , John Wiley & Sons,4th edition 1999에 상세히 개시된다. Sambrook et al. 및 Ausubel et al.(둘다)은 참고로 본원에 포함된다.
따라서, 본 발명의 추가 태양은 여기서 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 그러한 숙주 세포는 시험관내일 수 있으며 배양 상태일 수 있다. 그러한 숙주 세포는 생체내 일 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 발명의 특이적 결합 구성원의 세포내 발현을 "인트라바디" 또는 세포내 항체로서 허용할 수 있다. 인트라바디는 유전자 치료에 이용될 수 있다[112].
다른 추가의 태양은 숙주 세포내로 그러한 핵산을 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 도입은 임의의 이용가능한 기법을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예, 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우 바큘로바이러스를 이용한 형질도입을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포에서 핵산의 도입은 바이러스 또는 플라스미드 계 시스템을 이용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지되거나 또는 숙주 세포내로 또는 인공 염색체내로 통합될 수 있다[110,111]. 통합은 단일 또는 다수 위치에서 하나 이상의 카피의 임의 또는 표적화된 통합일 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기법은 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기천공 및 박테리오파아지를 이용한 형질감염을 포함할 수 있다.
상기 도입은 예를 들어, 유전자의 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함에 의해, 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용하는 것이 후속될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈내로(예, 염색체) 통합된다. 통합은 표준 기법에 따라, 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시켜 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 특이적 결합 구성원 또는 폴리펩티드를 발현하기 위하여 발현 시스템에서 전술한 구조체를 이용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 태양 및 구체예는 이제 하기 실험을 참고로 한 실시예에 의해 예시될 것이다.
실시예 1
항-IL-13 scFv 의 단리
scFv 항체 레퍼토리
20 공여체로부터의 비장 림프구로부터 유래되고 파지미드 벡터내로 클로닝된 큰 단일쇄 Fv(scFv) 인간 항체 라이브러리를 선택을 위하여 이용하였다[66].
scFv 의 선택
본질적으로 [67]에 개시된 재조합 박테리아 유래 인간 또는 쥐 IL-13(Peprotech)에서 반복된 선택 사이클의 시리즈로 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 IL-13을 인식하는 scFv를 단리하였다. 요약하면, 라이브러리와 함께 항온처 리 한 후, 상자성 비드에 미리결합된 고정 항원 및 결합 파아지를 자기성 단리에 의해 회수하고 미결합 파아지는 세척 제거하였다. 이어서 결합 파아지를 Vaughan et al[67]에 의해 개시된 대로 구하고 선택 과정을 반복하였다. 상이한 고체 표면 및 포획 방법을 다른 선택 라운드에서 사용하여 비특이적 결합을 감소시켰다. 항원은 제조자의 프로토콜(Dynal)에 따라 스트렙타비딘-코팅된 비드(Dynabeads M-280)에 의한 2차 포획에 앞서 비드(Dynabeads M-270 카르복실산)에 공유적으로 결합되거나 비오틴화에 의해 변형되었다. 선택 라운드의 결과로부터의 대표적인 클론의 부분을 Vaughan et al[67] 및 Osbourn et al[70]에서 개시된 대로 DNA 서열결정에 노출시켰다. 독특한 클론을 IL-13 의존성 세포 증식 분석에서 정제된 scFv 제제로서 IL-13을 중화시키는 그들의 능력에 대해 평가하였다.
리보솜 디스플레이 라이브러리를 생성하고 Hanes et al[113]에 본질적으로 개시된 대로, 재조합 박테리아 유래 인간 또는 쥐 IL-13(Peprotech)을 특이적으로 인식하는 scFv를 스크린하였다. 먼저 초기 선택으로부터의 BAK278D6 리드 클론을 리보솜 디스플레이 포맷으로 전환시키고, 이 주형을 라이브러리 생성을 위하여 이용하였다. DNA 수준에서, mRNA로의 충분한 전사를 위하여 T7 프로모터를 5'에서 첨가하였다. mRNA 수준에서, 구조체는 원핵 리보솜-결합 부위(샤인-달가노 서열)를 함유하였다. 단일쇄의 3' 말단에서, 정지 코돈을 제거하고 gIII의 일부(유전자 III)를 스페이서로 작용하도록 추가하였다[113].
BAK278D6으로부터 유래한 리보솜 디스플레이 라이브러리는 항체 상보성 결정 영역의 돌연변이유발에 의해 생성하였으며 이때 PCR 반응은 프루프리딩하지 않는 Taq 폴리머라제로 실시하였다. 친화성계 선택을 실시하고 이에 의해, 라이브러리와의 항온처리 후, 비오틴화된 인간-IL-13은 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(Dynal M280)에 의해 포획되었으며 결합된 삼원 복합체(mRNA-리보솜-scFv-IL-13)은 자기 단리에 의해 회수하고 미결합 복합체는 세척하여 제거하였다. 결합 scFv를 암호화하는 mRNA를 이어서 Hanes et al[113]에 개시된 대로 RT-PCR에 의해 회수하고 선택동안 존재하는 비오틴화된 인간 IL-13의 농도를 감소시키면서(5회동안 100 nM - 100 pM) 선택 과정을 반복하였다.
에러-프론 PCR을 또한 이용하여 라이브러리 크기를 추가로 증가시켰다. 세 가지 강도의 에러를 선택 체제동안 이용하였다(제조자의 프로토콜(Clontech)에서 개시된 대로, 표준 PCR 반응 후 1000 bp 당 2.0, 3.5 및 7.2 돌연변이). 초기 에러 프론 PCR 반응은 100 nM에서 실시된 1회 선택 전에 일어났다. 에러 프론 PCR의 후속 라운드는 10 nM 비오틴화된 인간-IL-13에서의 3회 선택 이전에 실시하였다. 전술한 대로, 선택 라운드의 결과물로부터의 클론의 대표적인 부분을 Vaughan et al[67] 및 Osbourn et al[70]에 개시된 대로 DNA 서열결정에 노출시켰다. 독특한 클론을 IL-13 의존성 세포 증식 분석에서 정제된 scFv 제제로서 IL-13을 중화하는 그들의 능력에 대해 평가하였다.
실시예 2
IL-13 의존성 TF -1 세포 증식 분석에서 항-IL-13 scFv 의 중화 성능
인간 및 쥐 IL-13 생물활성에 대한 정제된 scFv 제제의 중화 성능을 TF-1 세포 증식 분석을 이용하여 평가하였다. 정제된 scFv 제제를 WO01/66754의 실시예 3 에 개시된 대로 제조하였다. 정제된 scFv 제제의 단백질 농도를 BCA 방법(Pierce)을 이용하여 결정하였다. TF-1은 적백혈병 환자로부터 수립된 인간 프리골수 세포주이다[68]. TF-1 세포주는 생존 및 증식에 대해 인자 의존성이다. 이 면에서 TF-1 세포는 인간 또는 쥐 IL-13[69]에 반응하였으며 인간 GM-CSF(4 ng/ml, R&D Systems)을 함유하는 배지에서 유지되었다. IL-13 의존성 증식의 억제는 분열 세포의 새로 합성된 DNA내로 삼중수소화된 티미딘의 통합에서의 감소를 측정하여 결정하였다.
TF -1 세포 분석 프로토콜
R&D Systems으로부터 TF-1 세포를 얻고 공급된 프로토콜에 따라 유지하였다. 분석 배지는 5% 태아 소 혈청(JRH) 및 1% 소듐 피루베이트(Sigma)를 함유하는 GLUTAMAX I(Invitrogen)을 가진 RPMI-1640을 포함하였다. 각 분석에 앞서, TF-1 세포를 5분동안 300 x g에서 원심단리에 의해 침전시키고, 배지를 흡입에 의해 제거하고 세포를 분석 배지에 재현탁시켰다. 이 과정을 두번 반복하고 세포를 105 세포/ml의 최종 농도로 분석 배지에 재현탁시켰다. 항체의 시험 용액(세벌)을 분석 배지에서 원하는 농도로 희석하였다. IL-13에 대한 것이 아닌 무관한 항체를 음성 대조구로 이용하였다. 재조합 박테리아 유래 인간 또는 쥐 IL-13(Peprotech)를 96 웰 분석 플레이트에서 100 ㎕/웰의 전체 부피로 적절한 시험 항체와 혼합할 때 50 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이 분석에 사용된 IL-13의 농도를, 최종 분석 농도에서 최대 증식 반응의 약 80%를 제공하는 투여량으로 선택하였다. 모든 샘플을 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 이어서 100 ㎕의 재현탁된 세포를 각 분석 점 에 첨가하여 200 ㎕/웰의 최종 분석 부피를 얻었다. 분석 플레이트를 5% CO2하에서 37 ℃에서 72시간동안 항온처리하였다. 삼중수소화 티미딘 25 ㎕(10 μCi/ml, NEN)를 각 분석 점에 첨가하고 분석 플레이트를 추가 4시간동안 항온기에 두었다. 세포 수집기를 이용하여 유리 섬유 필터 플레이트(Perkin Elmer)에서 세포를 수집하였다. 패커드 톱카운트 미세플레이트 액체 신틸레이션 계수기를 이용하여 티미딘 통합을 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
인간과 쥐 항원 사이에서 교번하는 선택 사이클에도 불구하고, 교차반응성 중화 항체가 얻어지지 않았다. 두 가지 구별되는 항-인간 및 하나의 항-쥐 IL-13 중화 scFv를 선택으로부터 얻었다. BAK278D6 (VH 서열 번호 13 ; VL 서열 번호 14) 및 BAK167A11 (VH 서열 번호 23 ; VL 서열 번호 24)는 인간 IL-13을 인식하는 한편 BAK209B11 (VH 서열 번호 25 ; VL 서열 번호 26)는 쥐 IL-13을 인식하였다. scFv로서 BAK278D6(도 2) 및 BAK167A11(도 1)은 각각 44 nM 및 111 nM의 IC50으로 25 ng/ml 인간 IL-13을 중화하였다. scFv로서 BAK209B11(도 3)은 185 nM의 IC50으로 25 ng/ml 쥐 IL-13을 중화하였다.
실시예 3
IL -13 의존성 TF -1 세포 증식 분석에서 모 클론의 중쇄 CDR3 의 표적화된 최적화로부터의 리드 클론의 중화 성능
Osbourn et al.[70]은 중쇄 CDR3내의 잔기의 표적화된 돌연변이유발이 항체 의 친화성을 상당히 개선할 수 있음을 입증하였다. 선택은 BAK278D6(서열 번호 6) BAK167A11(서열 번호 58)의 중쇄 CDR3내의 잔기가 돌연변이유발에 의해 임의화된 scFv 레퍼토리에서, 실시예 1에 개시된 대로 실시하였다. 선택 결과물로부터의 독특한 클론은 DNA 서열결정에 의해 확인되었으며 그들의 중화 성능은 실시예 2에 개시된 대로 TF-1 세포 증식 분석에서 scFv로 평가하였다.
결과
성능에서 상당한 이득이 두 계통 모두에서 얻어졌다. BAK167A11 계통으로부터의 가장 강력한 클론은 BAK615E3, BAK612B5 및 BAK582F7이었으며 이것은 TF-1 세포 증식 분석에서 25 ng/ml 인간 IL-13에 대해 각각 3 nM(도 1), 6.6 nM, 6.65 nM의 IC50을 가졌다. BAK278D6 계통으로부터, 가장 강력한 클론은 BAK502G9였으며, 이것은 scFv로서 TF-1 세포 증식 분석에서 25 ng/ml 인간 IL-13에 대해 8 nM의 IC50을 가졌다(도 2).
실시예 4
TF -1 인자 의존성 세포 증식 분석에서 천식과 관련된 비-인간 영장류 IL -13 및 IL-13 변이체에 대한 BAK167A11 및 BAK278D6 계통의 중화 성능
BAK167A11 및 BAK278D6 인간 IL-13 중화 계통 중 어느 것도 쥐 교차반응성이 아니었다. 따라서 발명자들은 추가의 최적화 및 임상적 개발을 위해 선택된 계통을 위해 하기 기준으로 결정하였다: 바람직하게는 비인간 영장류 IL-13과 교차반응성이어야 하며 위치 130의 아미노산 아르기닌이 글루타민에 의해 치환된(Q130R) IL- 13의 변이체를 인식해야 한다. 이 변이체는 천식 및 다른 알레르기성 질병과 유전적으로 관련되어 왔다[37,39,41,71]. 교차반응성은 표면 플라스몬 공명(BIAcore) 분석에 의해, 정제된 scFv 제제가 비인간 영장류 IL-13 및 IL-13 변이체에 결합하는 능력에 의해 결정하였다. 기능적 활성은 TF-1 세포 증식 분석을 이용하여 결정하였다.
야생형, 변이체 및 비인간 영장류 IL-13의 생산
야생형 인간 IL-13에 대한 cDNA를 InvivoGen사로부터 얻고 부위 지시된 돌연변이유발(Stratagene Quikchange® 키트)에 의해 변형시켜 변이체 IL-13을 암호화하는 cDNA를 얻었다. 레서스 및 사이노몰거스 원숭이 IL-13에 대한 암호 서열을 인간 IL-13 서열에 기초한 축퇴 프라이머를 이용하여 게놈 DNA 주형에서의 PCR에 의해 얻었다. 비인간 영장류(레서스 및 사이노몰거스) 서열 모두 서로 동일하였으나 인간 IL-13과는 7 아미노산이 상이하였다(도 19). 재조합 야생형, 변이체 및 비인간 영장류 IL-13을 바큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen)을 이용하여 발현시켰다. 발현 구조체는 곤충 세포 조절된 배지로부터 거의 균질하도록 정제를 허용하는 카르복시 말단 친화성 태그를 발현된 단백질에 첨가하였다.
BIAcore 를 이용하는 정성적 결합 분석
정제된 scFv 제제의 비인간 영장류, 변이체 및 야생형 IL-13에 대한 결합 친화성을 Karlsson et al[72]에 개시된 대로 BIAcore 2000 Biosensor(BIAcore AB)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 결정하였다. 요약하면, 약 200 Ru의 표면 밀도에서 아민 커플링 키트(BIAcore)를 이용하여 IL-13을 CM5 센서칩에 결합시 키고 HBS-EP 완충액중의 세 가지 농도의 시험 scFv(약 350 nM, 175 nM 및 88 nM)를 센서 칩 표면을 통과시켰다. 얻어진 센서그램을 BIA 평가 3.1 소프트웨어를 이용하여 평가하여 상대적인 결합 데이터를 제공하였다.
TF -1 분석 프로토콜
상기 분석은 하기의 변형을 가지고 실시예 2에서 개시된 대로 본질적으로 실시하였다: 비인간 영장류 IL-13, 인간 변이체 IL-13(Q130R) 및 야생형 인간 IL-13을 각각 50 ng/ml, 25 ng/ml 및 25 ng/ml의 농도에서 이용하였다.
결과
BIAcore 결합 분석 데이터는 BAK278D6 계통은 추가의 치료적 개발을 위해 필요한 교차반응성 프로파일을 가지지만 BAK167A11 계통은 그렇지 않음을 제안하였다(표 2). 이 발견은 BAK278D6(도 4) 및 BAK502G9(도 6)가 TF-1 세포 증식 분석에서 거의 등가의 성능으로 인간 IL-13, 인간 IL-13(Q130R) 변이체 및 비인간 영장류 IL-13을 중화시킬 수 있음을 입증하는 생물분석 데이터에 의해 지지되었다. 대조적으로, BAK615E3(VH 서열 번호 33; VL 서열 번호 34)는 TF-1 세포 증식 분석에서(도 1) 그것의 모 BAK167A11(VH 서열 번호 23; VL 서열 번호 24)에 비하여 인간 IL-13에 대해 상당히 증가된 성능을 가졌으나, 어느 클론도 BIAcore 결합 분석에서 비인간 영장류 또는 변이체 IL-13에 결합하지 않았다.
BAK278D6 및 BAK502G9 의 생식선 골격 영역
BAK278D6 VH(서열 번호 13) 및 VL(서열 번호 14)의 유래 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스[73]의 공지의 인간 생식선 서열에 배열하고 서열 유사성에 의 해 가장 가까운 생식선을 확인하였다. BAK278D6의 VH 도메인(서열 번호 14) 및 그 유도체에 대해 가장 밀접한 생식선은 VH1 패밀리의 구성원인 DP14로 확인되었다. BAK278D6 VH는 골격 영역내에서 DP14 생식선과 9개가 상이하였다. BAK278D6의 VL에 대한 가장 밀접한 생식선은 Vλ3 3h로 확인되었다. BAK278D6 VL 도메인(서열 번호 14)는 골격 영역내에서 생식선과 단지 5개가 상이하였다. BAK278D6 및 그 유도체의 골격 영역을 부위 지시된 돌연변이유발(Stratagene Quikchange kit)에 의해 생식선로 되돌려 천연 인간 항체와 동일하게 매치되도록 하였다.
실시예 5
인간 IL-13 의존성 TF -1 세포 증식 분석에서 BAK502G9 의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2 서열의 표적화된 최적화로부터의 리드 클론의 중화 성능
최적화의 두번째 단계를 주형으로서, 생식선 골격 영역으로, BAK502G9 서열을 이용하여 실시하였다. BAK502G9의 중쇄 CDR1 또는 중쇄 CDR2내의 잔기가 돌연변이유발에 의해 임의화된 scFv 레퍼토리에서 실시예 1에 개시된 대로 선택을 실시하였다. 선택 결과로부터의 독특한 클론을 DNA 서열결정에 의해 확인하고 실시예 2에 개시된 대로 TF-1 세포 증식 분석에서 정제된 scFv 제제로서 그들의 중화 성능을 평가하였다. 가장 강력한 scFv 클론에 대해 벡터를 구성하여, 몇몇 변형을 가지고 Persic et al. (1997 Gene 187; 9-18)에 의해 개시된 대로 전체 인간 IgG4 항체로서 재발현을 허용하였다. oriP 단편을 벡터에 포함시켜 HEK-EBNA 293 세포의 사용을 촉진하고 에피좀 복제를 허용하였다. VH 가변 도메인을 발현 벡터 pEU8.1(+)상의 분비 리더 서열과 인간 감마 4 불변 도메인 사이에서 폴리링커내로 클로닝하였 다. VL 가변 도메인을 발현 벡터 pEU4.1(-)상의 분비 리더 서열과 인간 람다 불변 도메인 사이에서 폴리링커내로 클로닝하였다.
전체 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해(Amersham Pharmacia), 중쇄 및 경쇄를 발현하는 구조체로 동시형질감염된 EBNA-293 세포로부터의 조절 배지로부터 정제하였다. 정제된 항체 제제를 멸균 여과하고, 평가에 앞서 인산염 완충된 염수(PBS)에서 4℃에서 저장하였다. BCA 방법(Pierce)을 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하였다. 다시포맷된 인간 IgG4 전체 항체를 실시예 2에 개시된 TF-1 증식 분석에서 시판되는 항-인간 IL-13 항체와 비교하였다.
결과
도 5에서 입증되는 대로, 시판 항체 B-B13(마우스 IgG1 - Euroclone 5)은 각각 1021pM 및 471pM의 IC50으로 시판 항체 JES10-5A2(쥐 IgG1 - Biosource)보다 인간 IL-13에 대해 상당히 더 강력한 것으로 나타났다. 중쇄 CDR1 또는 CDR2가 표적화된, BAK502G9로부터 유래된 8개의 클론, 즉, BAK1111D10, BAK1166G02, BAK1167F02, BAK1167F04, BAK1183H4, BAK1184C8, BAK1185E1, BAK1185F8("BAK502G9 계통")은 시판 항체에 비하여 scFv로서 개선된 성능을 나타냈다. 이들 개선은 전체 항체 인간 IgG4로 전환시에 유지되었다. 이들 VH 및 VL 도메인의 각각은 개별적으로 그리고 이들 도메인의 각 쌍으로 본 발명의 태양 또는 구체예를 나타내며, 그들 중 하나 이상을 포함하는, IL-13에 대한 특이적 결합 구성원, 및 BAK502G9 계통 클론으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 특이적 결합 구성원, 바람직하게는 HCDR 의 BAK502G9 계통 세트를 포함하는 VH 도메인 및/또는 LCDR의 BAK502G9 계통 세트를 포함하는 VL 도메인도 그러하다. 이들은 여기서 개시된 본 발명의 임의의 및 모든 양태에서 이용될 수 있다. 전체 항체(IgG4)로서 BAK502G9의 유도체는 244 pM 내지 283 pM 범위의 IC50을 가졌다. 전체 항체 IgG4로서 BAK502G9는 384 pM의 IC50을 가졌다. 요약하면, 성능의 주요 개선은 BAK502G9의 중쇄 CDR1(서열 번호 7) 또는 CDR2(서열 번호 8)를 표적화함으로써 얻어질 수 있다. B-B13에의 통계적 비교는 ANOVA 및 후속하여 던네트의 시험 후 분석을 이용하여 이루어졌다(InStat software).
추가의 특성규명
BAK278D6 계통으로부터 선택된 항-인간 항체를 추가로 특성을 규명하여 그들의 특이성을 결정하였다. 이들은 BAK502G9 (VH 서열 번호 15; VL 서열 번호 16) 및 그 유도체 BAK1167F2 (VH 서열 번호 35 ; VL 서열 번호 36) 및 BAK1183H4 (VH 서열 번호 37 ; VL 서열 번호 38)를 포함하였으며, 이들은 BAK502G9의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2에 대한 변형을 각각 갖는 클론의 대표적인 예이다.
실시예 6
TF -1 인자 의존성 세포 증식 분석에서 비인간 영장류 IL -13 및 천식과 관련된 IL -13 변이체에 대한 BAK502G9 의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2 서열의 표적화된 최적화로부터의 리드 클론의 중화 성능
항-인간 IL-13 항체의 교차반응성은 실시예 4에 개시된 대로 그들이 비인간 영장류 IL-13 및 IL-13 변이체 매개 TF-1 세포 증식을 억제하는 능력에 의해 결정 하였다.
결과
최적화된 항-인간 IL-13 항체 BAK1167F2 (VH 서열 번호 35 ; VL 서열 번호 36) 및 BAK1183H4 (VH 서열 번호 37 ; VL 서열 번호 38)는 그들의 모 BAK502G9 (VH 서열 번호 15 ; VL 서열 번호 16) (도 6)의 특이성을 유지하였다. 야생형 IL-13에 대한 성능 이득은 실질적으로 등가의 성능으로 비인간 영장류 IL-13 및 IL-13 변이체를 중화하는 그들의 능력에서 반영되었다. 인간, 인간 변이체 및 비인간 영장류 IL-13에 대한 BAK502G9를 위한 IC50은 각각 1.4 nM, 1.9nM 및 2.0 nM이었다. 인간, 인간 변이체 및 비인간 영장류 IL-13에 대한 BAK167F2를 위한 IC50은 각각 1.0 nM, 1.1 nM 및 1.3 nM이었다. 인간, 인간 변이체 및 비인간 영장류 IL-13에 대한 BAK1183H4를 위한 IC50은 각각 0.9 nM, 1.0nM 및 1.6 nM이었다. 이들 클론은 치료 용도에 적합하다.
실시예 7
HDLM -2 세포 증식 분석에서 천연 인간 IL -13에 대한 리드 항-인간 IL -13 항체의 중화 성능
인간 IL-13 서열은 4개의 잠재적인 N-당화 부위를 갖는다. 본 발명자들은 BAK278D6 및 그 유도체가 박테리아 또는 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현된 재조합 IL-13을 중화시키는 능력을 입증하였다. 포유류 시스템에서 알려진 많은 프로세싱 사건들이 또한 곤충에서 발생한다는 증거가 있음에도 불구하고 단백질 당 화, 특히 N-당화에는 핵심 차이가 있다[74].
본 발명자들은 BAK278D6 유도체가 인간 세포로부터 방출된 천연 IL-13을 중화시키는 능력을 조사하였다.
HDLM-2 세포를 호지킨 질병 환자로부터 Drexler et al[75]에 의해 단리하였다. Skinnider et al[76]은 HDLM-2 세포 증식이 부분적으로 IL-13의 자가분비 및 이웃분비에 의존함을 입증하였다. 리드 항-인간 IL-13 항체를 그들이 천연(또는 자연 발생) IL-13의 방출에 의해 매개된 HDLM-2 세포 증식을 억제하는 능력에 대해 평가하였다.
HDLM -2 세포 분석 프로토콜
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)로부터 HDLM-2 세포를 얻고 공급된 프로토콜에 따라 유지하였다. 분석 배지는 20% 태아 소 혈청을 함유하는 Glutamax I(Invitrogen)을 가진 RPI-1640을 포함하였다. 각 분석에 앞서, 세포를 5분동안 300 x g에서 원심단리에 의해 침전시키고, 배지를 흡입에 의해 제거하고 세포를 새로운 배지에 재현탁시켰다. 이 과정을 세 번 반복하고 세포를 2 X 105 세포/ml의 최종 농도로 분석 배지에 재현탁시켰다. 50 ㎕의 재현탁된 세포를 96웰 분석 플레이트에서 각 분석점에 첨가하였다. 항체의 시험 용액(세벌)을 분석 배지에 원하는 농도로 희석하였다. IL-13에 대해 생성되지 않은 무관한 아이소타입 항체를 음성 대조구로 이용하였다. 총부피 50 ㎕/웰의 적절한 시험 항체를 세포에 첨가하였으며, 각 분석점은 100 ㎕/웰의 전체 분석 부피를 제공하였다. 분석 플레이트를 5% CO2하에서 37℃에서 72시간동안 항온처리하였다. 이어서 25 ㎕의 삼중수소화된 티미딘(10 μCi/ml, NEN)을 각 분석점에 첨가하고 분석 플레이트를 추가 4시간동안 항온기에 두었다. 세포 수집기를 이용하여 유리 섬유 필터 플레이트(Perkin Elmer)에서 세포를 수집하였다. 패커드 톱카운트 미세플레이트 액체 신틸레이션 계수기를 이용하여 티미딘 통합을 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
도 7에서 입증된 것처럼, BAK502G9 (VH 서열 번호 15 ; VL 서열 번호 16), 및 그 유도체 BAK1183H4 (VH 서열 번호 37; VL 서열 번호 38) 및 BAK1167F2 (VH 서열 번호 35; VL 서열 번호 36)는 다른 생물분석에서 관찰된 것과 유사한 상대적인 성능으로 세포 증식의 투여량 의존적 억제를 야기할 수 있었다. 인간 IgG4로서 BAK502G9, BAK1183H4, BAK1167F2를 위한 IC50은 각각 4.6nM, 3.5nM 및 1.1 nM이었다. 시판 항체 JES10-5A2 및 B-B13의 IC50은 각각 10.7 nM 및 16.7 nM이었다.
실시예 8
질병 관련 일차 세포에서 IL -13 의존성 반응에 대한 리드 항-인간 IL -13 항체의 중화 성능
일차 세포 및 기도 질병에 더욱 유관한 판독정보를 이용하여 이차 생물분석을 실시하였다. 이들은 정상 인간 폐 섬유모세포(NHLF)로부터의 에오탁신 방출 및 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)의 표면에서의 혈관 부착 분자 1(VCAM-1) 상향조 절을 포함하였다. IL-13 의존성 반응은 천식 표현형의 특징인 호산구 보충에 기여할 수 있다[92].
NHLF 분석 프로토콜
IL-13은 폐 섬유모세포로부터 에오탁신 방출을 야기하는 것으로 나타났다[77][78][79]. NHLF로부터의 인자 의존성 에오탁신 방출은 ELISA에 의해 결정하였다.
NHLF는 바이오위타커사(Biowhittaker)로부터 얻었으며 공급된 프로토콜에 따라 유지하였다. 분석 배지는 FGM-2였다(Biowhittaker).
항체의 시험 용액(세벌)을 분석 배지에서 원하는 농도로 희석시켰다. IL-13에 대한 것이 아닌 무관한 항체를 음성 대조구로 이용하였다. 재조합 박테리아 유래 인간 IL-13(Peprotech)를 200 ㎕의 전체 부피로 적절한 시험 항체와 혼합할 때 10 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이 분석에 사용된 IL-13의 농도를, 최대 반응의 약 80%를 제공하는 투여량으로 선택하였다. 모든 샘플을 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 이어서 분석 샘플을 96-웰 분석 플레이트에서 웰 당 1X 104 세포의 밀도로 예비접종된 NHLF에 첨가하였다. 분석 플레이트를 5% CO2 하에서 37 ℃에서 16-24시간동안 항온처리하였다. 분석 플레이트를 5분동안 300 X g에서 원심단리하여 떨어진 세포를 침전시켰다. 상등액에서 에오탁신 수준은 제조자(R&D Systems)에 의해 개시된 시약과 방법을 이용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
BAK278D6 계통 클론은 NHLF로부터 인간 IL-13 의존성 에오탁신 방출을 억제할 수 있었다. 상대적인 성능은 TF-1 세포 증식 분석에서 관찰된 것과 유사하였다(도 8). BAK502G9 (VH 서열 번호 15 ; VL 서열 번호 16), BAK1183H4 (VH 서열 번호 37 ; VL 서열 번호 38), BAK1167F2 (VH 서열 번호 35 ; VL 서열 번호 36)은 10 ng/ml 인간 IL-13에 대해 각각 207 pM, 118 pM 및 69 pM의 IC50을 가졌다. 시판 항체 JES10-5A2 및 B-B13의 IC50은 각각 623 pM 및 219 pM이었다.
HUVEC 분석 프로토콜
IL-13은 HUVEC의 세포 표면에서 VCAM-1의 발현을 상향조절하는 것으로 나타났다[80,81]. 인자 의존성 VCAM-1 발현은 시간에 따른 형광 판독을 이용하여 VCAM-1 수용체 세포 발현의 상향조절을 검출함으로써 결정하였다.
HUVEC은 바이오위타커사(Biowhittaker)로부터 얻었으며 공급된 프로토콜에 따라 유지하였다. 분석 배지는 EGM-2였다(Biowhittaker).
항체의 시험 용액(세벌)을 분석 배지에서 원하는 농도로 희석시켰다. IL-13에 대한 것이 아닌 무관한 항체를 음성 대조구로 이용하였다. 재조합 박테리아 유래 인간 IL-13(Peprotech)를 200 ㎕의 전체 부피로 적절한 시험 항체와 혼합할 때 10 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이 분석에 사용된 IL-13의 농도를, 최대 반응의 약 80%를 제공하는 투여량으로 선택하였다. 모든 샘플을 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 이어서 분석 샘플을 96-웰 분석 플레이트에서 웰 당 4 X 104 세포 의 밀도로 예비접종된 HUVEC에 첨가하였다. 분석 플레이트를 5% CO2 하에서 37 ℃에서 16-20시간동안 항온처리하였다. 이어서 분석 배지를 흡입에 의해 제거하고 차단 용액(4% 건조 Marvel® 우유 분말을 함유하는 PBS)으로 대체하였다. 분석 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 비오틴화된 항-VCAM-1 항체(Serotec) 100 ㎕를(PBST/1% Marvel®에서 1:500 희석) 각 웰에 첨가하기 전에 PBST Tween으로 웰을 3회 세척하였다. 분석 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 100 ㎕의 유로피움-표지된 스트렙타비딘 또는 항-쥐 IgG1(델피아 분석 완충액에서 1:1000 희석, Perkin Elmer)을 각 웰에 첨가하기 전에 델피아 세척 완충액(Perkin Elmer)으로 웰을 3회 세척하였다. 이어서 분석 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 델피아 세척 완충액(Perkin Elmer)으로 웰을 7회 세척하였다. 마지막으로, 100 ㎕의 증강 용액(Perkin Elmer)을 각 웰에 첨가하고 Wallac 1420 VICTOR2 플레이트 판독기(표준 유로피움 프로토콜)을 이용하여 형광 강도를 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
전체 항체 인간 IgG4로서 BAK502G9 (VH 서열 번호 15; VL 서열 번호 16), BAK1183H4 (VH 서열 번호 37; VL 서열 번호 38), BAK1167F2 (VH 서열 번호 35; VL 서열 번호 36)의 일반적인 데이터가 도 9에 나타난다. 상대적인 성능은 TF-1 세포 증식 분석에서 관찰된 것과 유사하였다. BAK502G9, BAK1183H4 및 BAK1167F2를 위한 IC50은 10 ng/ml 인간 IL-13에 대해 각각 235 pM, 58 pM 및 55 pM이었다.
실시예 9
IL-1β 및 IL-4 의존성 VCAM -1 상향조절에 대한 항-IL-13 항체의 중화 성능
클론의 BAK278D6 계통의 특이성을 HUVEC 생물분석의 변형에서 평가하였다. IL-13과 함께, IL-4 및 IL-1β 모두 HUVEC의 세포 표면에서 VCAM-1의 발현을 상향조절하는 것으로 나타났다[80,81].
HUVEC 분석 프로토콜
이 분석은 하기 변형을 가지고 본질적으로 실시예 5에 개시된 대로 실시하였다. 재조합 인간 IL-1β 및 IL-4(R&D System)를 각각 0.5 ng/ml 및 1 ng/ml로 인간 IL-13 대신 사용하였으며 최대 반응의 약 80%를 제공하는 투여량을 나타냈다.
결과
BAK278D6 계통으로부터 평가된 클론 중 어느 것도 인간 IL-1β 또는 IL-4에 대한 반응으로 VCAM-1 상향조절을 중화시키지 않았으며 따라서 IL-13에 대한 특이성을 입증하였다(도 10). IL-4는 아미노산 수준에서 30% 서열 동일성을 공유하여, IL-13에 가장 밀접하게 관련된다[82].
실시예 10
쥐 IL-13 의존성 쥐 B9 세포 증식 분석에서 인간 IgG4 로서 BAK209B11 의 중화 성능
실시예 1에 개시된 대로 scFv로서 항-쥐 IL-13 중화 클론으로 확인된 BAK209B11을 실시예 5에 개시된 대로 전체 항체 인간 IgG4로서 재포맷하고 그 성능을 쥐 IL-13 의존성 B9 세포 증식 분석에서 평가하였다. B9는 쥐 B-세포 하이브리 도마 세포주이다[83]. B9는 생존 및 증식을 위해 인자 의존성이다. 이 점에서 B 세포는 쥐 IL-13에 반응하며 인간 IL-6(50 pg/ml, R&D Systems)를 함유한 배지에서 유지된다. 쥐 IL-13 의존성 증식의 억제는 분열 세포의 새로 합성된 DNA로 삼중수소화 티미딘의 통합의 감소를 측정하여 결정하였다.
B9 세포 분석 프로토콜
B9 세포를 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)로부터 얻고 공급된 프로토콜에 따라 유지하였다. 분석은 하기 변형을 가지고 실시예 2의 TF-1 분석을 위해 개시된 대로 실시하였다. 분석 배지는 5% 태아 소 혈청(Hyclone) 및 50 μM 2-머캡토에탄올(Invitrogen)을 함유하는 GLUTAMAX I(Invitrogen)을 가진 RPMI-1640을 포함하였다. 재조합 박테리아 유래 쥐 IL-13(Peprotech)이 1 ng/ml의 최종 분석 농도로 인간 IL-13을 대신하였다.
결과
인간 IgG4로서 BAK209B11(VH 서열 번호 25; VL 서열 번호 26)은 B9 분석에서 776 pM의 IC50으로 1 ng/ml 쥐 IL-13을 중화시켰다(도 11). 따라서 BAK209B11은 질병의 쥐 모델에서 IL-13의 역할을 조사하기 위한 유용한 도구를 나타낸다. 이것은 급성 폐렴의 쥐 모델에서 BAK209B11의 효능을 입증하는 실시예 12에서 명확하게 입증된다.
실시예 11
BIAcore 분석에 의한 항-IL-13 항체의 친화성 결정
인간 IgG4로서 인간 IL-13에 대한 BAK502G9 (VH 서열 번호 15; VL 서열 번 호 16), BAK1167F2 (VH 서열 번호 35 ; VL 서열 번호 36) 및 BAK1183H4 (VH 서열 번호 37; VL 서열 번호 38) 및 쥐 IL-13에 대한 BAK209B11 (VH 서열 번호 25 ; VL 서열 번호 26)의 친화성은 [72]에 개시된 대로 BIAcore 2000 바이오센서(BIAcore AB)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 결정하였다. 요약하면, 약 500 Ru의 표면 밀도에서 아민 커플링 키트(BIAcore)를 이용하여 항체를 CM5 센서칩에 결합시키고 HBS-EP 완충액내의 IL-13의 연속 희석물(50 nM 내지 0.78 nM 사이)을 센서칩 표면에 통과시켰다. 얻어진 센서그램을 BIA 평가 3.1 소프트웨어를 이용하여 평가하여 동적 데이터를 얻었다.
결과
BAK502G9, BAK1167F2 및 BAK1183H4 IgG4는 세포계 분석에서 그들의 상대적 성능에 각각 해당하는 178 pM, 136 pM 및 81 pM의 Kd의 높은 친화성으로 인간 IL-13에 결합하였다. BAK209B11은 5.1 nM의 친화성으로 쥐 IL-13에 결합하였다(표 3).
실시예 12
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델에서 BAK209B11 의 효능
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
항-쥐 IL-13 중화 인간 IgG4 항체인 BAK209B11(VH 서열 번호 25, VL 서열 번호 26)의 효과를 급성 알레르기성 폐렴의 쥐에서 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Riffo-Vasquez et al [84]에 의해 개시된 대로 실시되었으며 증가된 기관지 꽈리 세척(BAL) IL-13(도 12), 폐 및 BAL내로의 세포 침윤(도 13), 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
자성 Balb/C 마우스(영국 찰스강)를 항-쥐 IL-13 항체 BAK209B11(12, 36, 119 또는 357 ㎍ 투여량) 또는 아이소타입 매치된 대조구 항체(357 ㎍ 투여량)로 처리하였다. 0 및 7일에, 비히클(아쥬반트로서 2% Al2O3(리하이드라젤)을 함유하는 염수) 0.2 ml내의 10 ㎍ 난백알부민(Ova)의 복강내 주사에 의해 각 그룹의 마우스를 감작시켰다. 비감작된 마우스의 별도의 대조군은 동일한 부피의 비히클이 주어졌다. 14, 15 및 16일에 난백알부민으로 마우스를 공격하였다. 난백알부민을 분사화에 앞서 멸균 염수에 1%(w/v)로 희석하였다. 모든 흡입 공격은 플렉시글라스 노출 챔버에서 투여되었다. 1시간 간격으로 20분씩 세번 노출로 deVilbiss Ultraneb 2000 분무기(Sunrise Medical)을 이용하여 Ova를 에어로졸화시켰다.
BAK209B11 또는 무관한 인간 IgG4를 첫번째 공격 1일 전에 정맥내로 그리고 이어서 각 후속 공격(총 4회 투여) 2시간 전에 정맥내로 투여하였다. 상기 모델은 17일에, 최종 공격 후 24시간에 사망시켰다. 혈액(혈청) 및 BAL을 수집하였다. 전체 IgE에 대하여 혈청을 분석하였다. 염수 3 분액을(0.3 ml, 0.3 ml 및 0.4 ml) 주사하고 샘플을 모아 BAL을 얻었다. 전체 백혈구 및 차등 세포 계수를 BAL 세포로부터 얻었다.
결과
감작된 마우스의 난백알부민 공격은 감작되지 않았지만 공격받은 동물에 비하여 전체 BAL 세포 보충에서 상당한(p<0.05) 증가를 야기하였다. 이 보충은 투여량 의존적으로 BAK209B11에 의해 억제되었으며, 상당한(p<0.05) 억제가 36 ㎍ 이상 의 BAK209B11에서 나타났으나 대조구 항체에서는 나타나지 않았다(도 13). 36 ㎍의 최소 BAK209B11 투여량에서 세포 유입의 상당한(p<0.05) 억제를 가지고 호산구(도 14) 및 호중구(도 15)에서 유사한 효과가 나타났다. 이러한 억제는 대조구 항체에서는 나타나지 않았다. 림프구는 또한 공격시 감작된 마우스에서는 유도되었지만 비감작된 마우스에서는 유도되지 않았다. 이러한 유도는 BAK209B11에 의해 투여량 의존적으로 억제되었으며 36 ㎍ BAK209B11에서 최대 억제가 나타났다. 대조구 항체는 효과가 없었다(도 16). 비감작 동물에 비교할 때 단핵구/대식세포가 감작된 동물에서 유도되지 않았지만, 배경 수준은 36 ㎍ 이상의 BAK209B11에 의해 억제되었으나 대조구 항체에 의해서는 억제되지 않았다(도 17). 혈청 IgE 수준은 공격 후 비감작된 동물에 비교할 때 감작된 동물에서 상당히 증가되었다(p<0.05). 이러한 증가는 36 ㎍ BAK209B11을 이용한 처리후에는 감소되었으나 대조구 항체에 의해서는 감소되지 않았다.
요약하면, 쥐 IL-13 중화 항체인 BAK209B11의 전신성 투여는 알레르기성 염증의 쥐 모델에서 감작 및 후속 난백알부민의 공격에 의해 야기된 염증 세포 유입 및 혈청 IgE 수준의 상향조절을 억제하였으나 대조구 항체는 억제하지 않았다.
실시예 13 내지 20은 예언적인 것이다.
실시예 13
급성 폐렴의 로이드 쥐 모델에서 BAK209B11 의 효능
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
항-쥐 IL-13 중화 항체인 BAK209B11(VH 서열 번호 25, VL 서열 번호 26)의 효과를 급성 알레르기성 폐렴의 두번째 쥐 모델에서 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 McMillan et al [85]에 의해 개시된 대로 실시되었으며 증가된 BAL 및 폐 조직 IL-13, 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
자성 Balb/C 마우스(영국 찰스강)를 하기와 같이 다양한 투여량의 항-쥐 IL-13 항체 BAK209B11 또는 아이소타입 매치된 대조구 항체로 투여하였다. 0 및 12일에, 비히클(아쥬반트로서 2mg Al(OH)3을 함유하는 염수[실시예 12에 개시된 대로 계산]) 0.2 ml내의 10 ㎍ 난백알부민(Ova)의 복강내 주사에 의해 각 그룹의 마우스를 감작시켰다(SN). 비감작된 마우스의 별도의 대조군(NS)은 동일한 부피의 비히클이 주어졌다. 19, 20, 21, 22, 23 및 24일에 난백알부민으로 20분동안 마우스를 공격하였다. 난백알부민을 분사화에 앞서 염수에 5%(w/v)로 희석하였다. 모든 흡입 공격은 플렉시글라스 노출 챔버에서 투여되었다. deVilbiss Ultraneb 2000 분무기(Sunrise Medical)을 이용하여 Ova를 에어로졸화시켰다. 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24일에 다양한 복강내 투여량의(237 ㎍, 23.7 ㎍ 또는 2.37 ㎍; H, M 및 L에 의해 도 21에서 표시됨)의 항-쥐 IL-13 항체 BAK209B11 muIgG1 또는 아이소타입 매치된 대조구 항체(237 ㎍)을 투여하였다. 메타콜린 공격을 증가시켜 기도 기능을 0일 및 25일에 평가하고 의식적 체적변동기록(Buxco)을 이용하여 모니터하였다. 메타콜린 투여량-반응 곡선의 4 파라미터 미고정 곡선 피팅으로부터 0일 및 25일에 개별 마우스에 대하여 PC50(기준 PenH를 50% 증가시키는 데 필요한 메타콜린의 농도)을 추정하였다.
25일에, 최종 공격 후 24시간에 모델을 사망시켰다. 혈액, 혈청, BAL 및 폐 조직을 수집하였다.
결과
0일(처리 전) 및 25일(공격 후)에 개별 동물에 대해 폐 기능을 평가하고 PC50(기준 PenH를 50% 증가시키는 데 필요한 메타콜린의 농도) 값을 계산하여 정량하였다(도 21A). 25일 대 0일에 log PC50의 변화(log 25일 PC50 - log 0일 PC50)에 의해 개별 기도 과민반응성(AHR)을 결정하였다. 이러한 델타 log PC50은 연구의 일차 종말점이었으며; 종말점 ANOVA의 필요사항 때문에 PC50 데이터를 로그-변환하였다. 개별 변화를 그룹내에서 평균하여 그룹 평균 델타 log PC50을 생성하였다(도 21B에 나타남).
감작된 마우스의 난백알부민 공격은 비감작되고 공격된 마우스에 비하여 상당한 AHR을 야기하였다(p<0.01). BAK209B11은 AHR에서 명확하고 투여량의존적인 감소를 야기한 반면 대조구 항체는 효과가 없었다.
실시예 14
급성 폐렴의 게라르드 쥐 모델에서 BAK209B11 의 효능
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
항-쥐 IL-13 중화 인간 IgG4 항체인 BAK209B11(VH 서열 번호 25, VL 서열 번호 26)의 효과를 급성 알레르기성 폐렴의 세번째 쥐 모델에서 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Humbles et al [86]에 의해 개시된 대로 실시되었으며 증가된 BAL 및 폐 조직 IL-13, 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
자성 Balb/C 마우스(영국 찰스강)를 다양한 투여량의 항-쥐 IL-13 항체 BAK209B11 또는 아이소타입 매치된 대조구 항체로 투여하였다. 0, 7 및 14일에, 비히클(아쥬반트로서 1.125 mg Al(OH)3을 함유하는 염수[실시예 12에 개시된 대로 계산]) 0.2 ml내의 10 ㎍ 난백알부민(Ova)의 복강내 주사에 의해 각 그룹의 마우스를 감작시켰다(SN). 비감작된 마우스의 별도의 대조군(NS)은 동일한 부피의 비히클이 주어졌다. 21, 22, 23 및 24일에 난백알부민으로 20분동안 마우스를 공격하였다. 난백알부민을 분사화에 앞서 염수에 5%(w/v)로 희석하였다. 모든 흡입 공격은 플렉시글라스 노출 챔버에서 투여되었다. deVilbiss Ultraneb 2000 분무기(Sunrise Medical)을 이용하여 Ova를 에어로졸화시켰다.
25일, 공격 후 24시간에 모델을 사망시켰다. 혈액, 혈청, BAL 및 폐 조직을 수집하였다.
실시예 15
폐렴의 로이드 만성 모델에서 BAK209B11 의 효능
만성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
항-쥐 IL-13 중화 인간 IgG4 항체인 BAK209B11(VH 서열 번호 25, VL 서열 번호 26)의 효과를 만성 알레르기성 폐렴의 모델에서 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Temelkovski et al [87]에 의해 개시된 대로 실시되었으며 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
자성 Balb/C 마우스(영국 찰스강)를 다양한 투여량의 항-쥐 IL-13 항체 BAK209B11 또는 아이소타입 매치된 대조구 항체로 투여하였다. 0, 및 11일에, 비히클(아쥬반트로서 2 mg Al(OH)3을 함유하는 염수[실시예 12에 개시된 대로 계산]) 0.2 ml내의 10 ㎍ 난백알부민(Ova)의 복강내 주사에 의해 각 그룹의 마우스를 감작시켰다(SN). 비감작된 마우스의 별도의 대조군(NS)은 동일한 부피의 비히클이 주어졌다. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 30, 32, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 및 51일에 난백알부민으로 20분동안 마우스를 공격하였다. 난백알부민을 분사화에 앞서 염수에 5%(w/v)로 희석하였다. 모든 흡입 공격은 플렉시글라스 노출 챔버에서 투여되었다. deVilbiss Ultraneb 2000 분무기(Sunrise Medical)을 이용하여 Ova를 에어로졸화시켰다.
52일, 공격 후 24시간에 모델을 사망시켰다. 혈액, 혈청, BAL 및 폐 조직을 수집하였다.
실시예 16
쥐 공기주머니 모델에 투여된 외인성 인간 IL -13에 대한 항-인간 IL -13 항체 의 효능
인간 IL-13의 프로-염증 작용에 대한 항-인간 IL-13의 효과를 기본 쥐 모델에서 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Edwards et al[93]에 의해 개시된 대로 실시하였으며 공기주머니내로의 세포 침윤에 의한 그 종말점으로 특징으로 하였다.
모델 프로토콜
0일에 2.5 ml의 멸균 공기를 피하 주사하여 자성 Balb/C 마우스의 등에서 공기 주머니를 생성시켰다. 3일에 다시 2.5 ml 멸균 공기로 공기 주머니를 재팽창시켰다. 0.75% CMC내의 2 ㎍ huIL-13을 6일에 직접 주머니내로 주사하였다. 24시간 후에 마우스를 죽이고 공기 주머니를 1 ml 헤파린화된 염수로 세척하였다. huIL-13을 (주머니내로) 제공하거나 전신 제공하여 항체 처리하였다.
결과
공기주머니내로 주사된(복강내) 인간 IL-13은 비히클(염수내의 0.75% 카르복시메틸 셀룰로스(CMC)) 처리된 마우스에 비하여 공격 후 24시간에 전체 백혈구(p<0.01) 및 호산구(p<0.01)의 침윤을 상당히 증가시켰다.
국소 투여된 BAK502G9(200 mg, 20 mg 또는 2 mg 주머니내)는 0.75% CMC내의 2 ㎍ huIL-13에 의해 야기된 공기 주머니내로의 전체 백혈구(p<0.01) 및 호산구(p<0.01) 침윤을 상당히 그리고 투여량 의존적으로 억제하였다.
전신성으로 투여된 BAK209B11(30 mg/kg, 10 mg/kg 및 1 mg/kg)는 0.75% CMC내의 2 ㎍ huIL-13에 의해 야기된 공기 주머니내로의 전체 백혈구(p<0.01) 및 호산구(p<0.01) 침윤을 상당히 그리고 투여량 의존적으로 억제하였다.
실시예 17
폐 알레르기성 염증의 모델에서 항-인간 IL -13 항체의 효능을 평가할 목적을 위한 인간 IL-13 넉인/쥐 IL-13 넉아웃 트랜스제닉 마우스의 생성
본 발명자들은 유전자 표적화에 의해 쥐 IL-13이 아닌 인간 IL-13을 발현하는 마우스를 생성하였다. 마우스 IL-13 유전자를 개시 코돈부터 종결 코돈까지 인간 IL-13 유전자의 관련 부분으로 대체하였다. 이 마우스는 야생형 마우스에서와 동일한 자극에 대한 반응으로, 내인성 IL-13 프로모터와 IL-13 pA 꼬리는 변하지 않고 그대로 있는 상태로, 마우스 IL-13 이 아닌 인간 IL-13을 발현한다. 인간 IL-13은 마우스 IL-13 수용체에 결합하고 시그널을 전달하여 마우스 IL-13 수용체에 연결되는 마우스 IL-13에 의해 야기된 시그널링과 동일한 생리학적 결과를 생성할 수 있다. 예를 들어, 외인성 인간 IL-13은 쥐 공기 주머니내로 염증성 세포가 보충되도록 하였다(도 18). 이들 트랜스제닉 동물은 질병의 확립된 쥐 모델에서 비-쥐 교차반응성 항-인간 IL-13 항체를 평가할 수 있게 한다.
이 마우스는 급성 알레르기성 기도 염증 모델(실시예 18 및 19에 개시됨) 및 만성 알레르기성 기도 염증 모델(실시예 20에 개시됨)에 사용되어 알레르기성 기도 질병에서 항-인간 IL-13 항체 약리학의 평가를 가능하게 하였다.
실시예 18
급성 폐렴의 huIL -13- 트랜스제닉 로이드 쥐 모델에서 항-인간 IL-13 항체의 효능
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
실시예 17에서 생성된 트랜스제닉 마우스를 이용하여 급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델에서 항 인간 IL-13 중화 인간 IgG4 항체의 효과를 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 McMillan et al [85] 및 실시예 13에 의해 개시된 대로 실시되었다. 이 모델은 증가된 BAL 및 폐 조직 IL-13, 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
이 모델을 위한 프로토콜은 BAK209B11 대신 항-인간 IL-13 항체가 투여된 것을 제외하고는 실시예 13에서 개시된 대로였다.
실시예 19
급성 폐렴의 huIL -13- 트랜스제닉 게라르드 쥐 모델에서 항-인간 IL -13 항체의 효능
급성 알레르기성 폐렴의 쥐 모델
실시예 17에서 생성된 트랜스제닉 마우스를 이용하여 급성 알레르기성 폐렴의 다른 쥐 모델에서 항 인간 IL-13 중화 인간 IgG4 항체의 효과를 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Humbles et al [86] 및 실시예 14에 의해 개시된 대로 실시되었다. 이 모델은 증가된 BAL 및 폐 조직 IL-13, 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
이 모델을 위한 프로토콜은 BAK209B11 대신 항-인간 IL-13 항체가 투여된 것을 제외하고는 실시예 14에서 개시된 대로였다.
실시예 20
폐렴의 huIL -13- 트랜스제닉 로이드 만성 모델에서 항-인간 IL-13 항체의 효능
실시예 17에서 생성된 트랜스제닉 마우스를 이용하여 만성 알레르기성 폐렴의 모델에서 항 인간 IL-13 중화 인간 IgG4 항체의 효과를 조사하였다. 이 모델은 본질적으로 Temelkovski et al [87] 및 실시예 15에서 개시된 대로 실시되었으며,폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응(AHR)에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
모델 프로토콜
이 모델을 위한 프로토콜은 BAK209B11 대신 항-인간 IL-13 항체가 투여된 것을 제외하고는 실시예 15에서 개시된 대로였다.
실시예 21
아스카리스 .섬( Ascaris . suum )-알레르기성 사이노몰거스 원숭이에서 항-인간 IL-13 항체의 약역학 및 약동학
502G9의 약역학 및 약동학을 4 마리의 알레르기성이지만 감작되지 않은 사이노몰거스 영장류(2 웅성/2 자성)에서 단일 10 mg/kg 정맥내 환괴 투여 후 평가하였다. 실험을 29일동안 실시하였다. 항체의 약역학 파라미터는 기하평균 평균 혈청-약물 농도 곡선으로부터 결정하였으며 하기 표 4에 자세히 나타난다.
동일 연구에서 혈청 IgE 농도 또한 인간 IgE ELISA 키트(Bethyl laboratories, USA)를 이용하여 따랐다.
결과
혈청 IgE 농도는 단일 10 mg/kg의 BAK502G9의 정맥내 환괴 투여 후 4일 및 5일에, 100% 대조구 수준(투여전)에서 대조구 값의 66±10%(p<0.05)로, 상당히 감소되었다. 이러한 혈청 IgE 농도의 강하는 22일에 대조구 수준의 88 ±8%로 회복되었다(도 20). 다시 이들 데이터는 각 동물 혈청 IgE 농도를 투여전 수준으로 정상화하고(이때 투여전 농도는 100%) 이어서 시험된 동물 4마리로부터의 곡선을 평균화하여 유도하였다.
2 마리의 웅성 원숭이는 상대적으로 낮은 투여전 총 혈청 IgE(60 ng/ml 및 67 ng/ml)을 가졌다. 이들 IgE 수준은 BAK502G9를 이용한 치료 후 경향을 제안하는 방식으로 변하지 않았다(도 20B). 2 마리 자성 원숭이는 상대적으로 높은 투여전 전체 혈청 IgE(1209 ng/ml 및 449 ng/ml)을 가졌다. 이들 IgE 수준은 BAK502G9를 이용한 치료 후 감소하여 7일에 최대 60% 감소하였으며, 투여 후 28일에 대략 투여전 수준으로 돌아갔다(도 20B). 이들 데이터는 BAK502G9가 상대적으로 높은 순환 IgE를 가진 동물에서 혈청 IgE 농도를 낮춤을 나타낸다.
실시예 22
피부 알레르기의 사이노몰거스 모델에서 항-인간 IL-13 항체의 효능
항-인간 IL-13 중화 인간 IgG4 항체의 효과를 급성 알레르기성 피부 염증의 영장류 모델에서 조사하였다. 이 모델은 인간 IL-13 및 에이.섬 항원을 사이노몰거스 원숭이에게 피부내로 주사하여 실시하였다. 24-96 시간 후, 피부 생검과 혈청 샘플을 취하였다. 상기 모델은 피부내로의 세포 침윤에 의한 그 종말점을 특징으로 하였다.
실시예 23
폐 알레르기의 사이노몰거스 모델에서 항-인간 IL-13 항체의 효능
항-인간 IL-13 중화 인간 IgG4 항체의 효과를 급성 알레르기성 피부 염증의 영장류 모델에서 조사하였다. 이 모델은 에이.섬-알레르기성 사이노몰거스 영장류를 분무화된 에이.섬 항원에 노출시켜 알레르기 반응을 생성시켜 실시하였다. 이 알레르기는 폐 및 BAL내로의 세포 침윤, 증가된 혈청 IgE 수준 및 기도 과민반응성에 의한 그 종말점을 특징으로 한다.
유동 혈구계산 방법을 이용하여 약동학을 체외에서 추가로 평가하였다. CD23은 고 친화성 IgE 수용체이며 말초 인간 혈액 단핵구 세포에서 발현될 수 있다. CD23 발현은 IL-13 및 IL-4 둘다에 의해, CD23을 발현하는 세포의 수 및 각 세포가 얼마나 많은 CD23을 발현하는 지의 면에서, 유도될 수 있다. IL-4가 아닌 IL-13 매개 반응은 항-인간 IL-13 항체에 의해 억제될 수 있다.
동물은 분무된 항원(아스카리스 섬 추출물) 공격 후 앞서 확립된 AHR을 기초로 한 이 2-상 연구를 위해 예비선택되었다. 단계 I에서 1일 및 11일에 정맥내 히스타민 공격동안 기도 기능을 평가하였다. 기준 위에서 폐 저항(RL)에서 30% 증가를 생성하기 위해 필요한 히스타민 투여량인 PC30은 각 히스타민 투여량-반응 곡선으로부터 결정하였다. 9일 및 10일에, RL에서의 40% 증가 및 동적 순응(CDYN)에서 35% 감소를 생성하는 것으로 이전에 나타난 분무된 항원의 개별적으로 맞춰진 투여량으로 동물을 공격하였다. 역사적으로 이 모델에서, 첫번째보다 주어진 알러젠 투여량으로의 두번째 공격 후 더 큰 RL이 관찰되었으며, 이것이 항원 프라이밍이다. 히스타민 투여량-반응 곡선 아래 면적 증가 및/또는 PC30의 하락, 및 BAL, 및 1일에 비교한 11일의 호산증에 의해 측정할 때, 두 항원 공격은 AHR을 야기하였다. AHR-표현형을 나타내는 동물을 II 단계로 들어가기 위해 선택하였다.
II 단계는 모든 동물이 1, 5 및 9일에 30 mg/kg BAK502G9 주입을 받은 것을 제외하고는 I 단계와 동일하게 실시하였다. BAK502G9의 효과를 II 단계에서 나타난 변화와 I 단계에서 나타난 변화를 각 동물에 대해 비교함으로써 평가하였다.
혈액, 혈청, BAL 및 폐 조직을 수집하였다. 혈청 IgE 수준을 ELISA에 의해 모니터하였다. BAK502G9 처리된 사이노몰거스 원숭이로부터의 혈청은 IL-4가 아닌 IL-13에 의해 유도된 인간 말초 혈액 단핵구 세포에서의 CD23의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이 억제의 정도는 PK ELISA에 의해 예측된 혈청 BAK502G9 수준과 일치하였다.
결과
RL AUC(p<0.05)에 의해 측정할 때 BAK502G9는 AHR을 상당히 억제하였다(도 26A; 표 7). PC30에 의해 측정할 때, AHR에 대한 BAK502G9의 억제 효과가 관찰되었으나 통계적으로 유의한 값에 도달하지는 않았다(도 26B; 표 7). BAK502G9는 또한 항원 프라이밍(p<0.01)(도 26C; 표 7) 및 BAL 염증 둘다를 상당히 억제하였다. BAK502G9는 전체 세포(p<0.05) 및 호산구(p<0.05)의 BAL내로의 유입을 상당히 억제 하였으나, 대식세포, 림프구 또는 비만세포 유입을 억제하지 않았다(도 26D; 표 7).
실시예 24
인간 IL -13이 마우스 폐로 투여될 때 발생하는 천식성 표현형에 대한 항-인간 IL-13 항체의 효능
기도 과민반응성의 쥐 모델
마우스 폐에 인간 IL-13을 투여한 후 기도 과민반응성(AHR)의 발생에 대한, 항-인간 IL-13 중화 항체 BAK502G9의 효능을 조사하였다. 이 모델은 쥐 IL-13 대신 인간 IL-13이 이용된 것을 제외하고는 Yang et al[119]에 의해 개시된 대로 실시되었다.
모델 프로토콜
표현형을 발생시키기 위하여, 웅성 BALB/c 마우스를 48시간 간격으로 인간 IL-13 의 2회 투여에 노출시켰다. 요약하면, 100 ㎕ 사판 용액(물에 1:4 희석됨)을 정맥 주사하여 마우스를 마취시켰다. 마우스를 22-게이지 카테터 주사바늘로 삽관하고, 이를 통해 인간 재조합 IL-13(20 ㎕ 인산염-완충된 염수(PBS)에 용해된 25 ㎍) 또는 비히클 대조구(PBS)를 주입하였다. 기도 기능을 메타콜린 공격을 증가시켜 마지막 IL-13 투여 후 24시간에 평가하고 의식적 혈류검사기(Buxco)를 이용하여 모니터하였다. PC200(기준 penH를 200% 증가시키는 데 필요한 메타콜린의 농도)을 메타콜린 투여량-반응 곡선의 4 파라미터 미고정 곡선 피팅으로부터 결정하였다. IL-13의 각 투여 24 시간전에 복강내 주사에 의해 항체를 투여하였다.
결과
천연 야생형 마우스내로 인간 IL-13을 기관내 주입한 결과, PC200 메타콜린 농도에 의해 결정할 때 대조구 동물에 비하여 상당한(p<0.05) 기도 과민반응성이 발생하였다. 전신성으로 투여된 BAK502G9(1 mg/kg)은 AHR의 발생을 상당히(p<0.01) 억제하는 반면 대조구 항체는 효과가 없었다(도 23).
실시예 25
인간 B 세포로부터의 인간 IL -13 의존성 IgE 방출에 대한 인간 IgG4 로서 BAK502G9의 중화 성능
B 세포 스위칭 분석 프로토콜
IL-13은 시험관내에서 인간 B 세포에서 IgE 합성을 유도하는 것으로 나타났다[120]. 인간 B 세포로부터 인자 의존성 IgE 방출은 ELISA에 의해 결정하였다. 인간 IgG4로서 BAK502G9의 중화 성능을 인간 B 세포로부터의 인간 IL-13 의존성 IgE 방출에 대해 평가하였다.
1.077 g/L 밀도 구배에 대한 원심단리에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 인간 담황막(Blood Transfusion Service)로부터 정제하였다. 제조자에 의해 개시된 방법과 시약을 이용하여, B 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)으로 PBMC로부터 B 세포를 정제하였다. 분석 배지는 10% 태아 소 혈청 및 20 ㎍/ml 인간 트랜스페린(Serologicals Proteins Inc.)을 함유하는 Iscoves 개질 둘베코 배지(Life Technologies)를 포함하였다. 정제 후, B 세포를 분석 배지에 106/ml의 최종 농도로 재현탁하였다. 재현탁 세포 50 ㎕를 96웰 분석 플레이트에서 각 분석 점에 첨가하였다. 항-CD40 항체 EA5(Biosource) 4 ㎍/ml 50 ㎕를 적절하게 분석 웰에 첨가하였다. 시험 항체 용액(6벌)을 분석 배지에서 원하는 농도로 희석하였다. IL-13에 대해 형성되지 않은 무관한 항체를 음성 대조구로 이용하였다. 50 ㎕/웰의 적절한 시험 항체를 세포에 첨가하였다. 재조합 박테리아 유래 인간 IL-13(Peprotech)을 30 ng/ml의 최종 농도로 첨가하여 전체 분석 부피가 200 ㎕/웰이 되도록 하였다. 분석에 사용된 IL-13의 농도는 최대 반응을 제공하도록 선택되었다. 분석 플레이트를 5% CO2 하에서 37 ℃에서 14일동안 항온처리하였다. 상등액에서 IgE 수준을 제조자(BD Biosciences, Bethyl Laboratories)에 의해 공급된 시약 및 프로토콜을 이용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과
도 24에 나타난 대로, BAK502G9(VH 서열 번호 15; VL 서열 번호 16)는 인간 B 세포에 의한 인간 IL-13 의존성 IgE 생산을 억제할 수 있었다. 인간 IgG4로서 BAK502G9는 30 ng/ml 인간 IL-13에 대하여 1.8 nM의 IC50을 가졌다.
실시예 26
일차 인간 기관지 평활근 세포에서 히스타민 유도된 Ca 2 + 시그널링의 IL -13 매개 강화에 대한 BAK502G9 의 효능
IL-13은 기도 평활근의 수축성을 직접 조절하는 것으로 나타났다[121,122]. 세포내 칼슘 이동은 평활근 수축의 선결조건이다. 최근의 연구는 IL-13이 평활근 수축성을 바꾸는 능력이 부분적으로 수축 아고니스트 유도된 Ca2 + 시그널링의 조절을 통해 매개됨을 보여주었다[123,124].
수축 아고니스트인 히스타민에 대한 일차 인간 기관지 평활근 세포(BSMC) 시그널링 반응에서의 IL-13 매개된 변화에 대한, IgG4로 포맷된 항-인간 IL-13 항체인 BAK502G9의 효능을 Ca2 + 시그널링 분석에서 조사하였다.
BSMC Ca 2 + 시그널링 분석 프로토콜
인간 일차 BSMC, 평활근 성장 배지-2(SmGM-2) 및 평활근 기본 배지(SmBM)를 바이오 위타커사로부터 구입하였다. 공급자의 추천에 따라 BSMC를 SmGM-2에서 유지하였다. BSMC를 96-웰 미세적정 세포 배양 플레이트에 2 X 104 세포/웰로 도말하고 24시간동안 부착시킨 후, 재공급하고 추가로 24시간동안 항온처리하였다. Ca2 + 시그널링 실험에 앞서, 항체가 있거나 없이 50 ng/ml 최종 농도의 IL-13(Peprotech)으로 BSMC를 자극하고 18-24 시간동안 항온처리하였다. BAK502G9 및 아이소타입 매치된 무관한 대조구 모노클로날 항체 CAT-001을 10 ㎍/ml의 최종 농도에서 평가하였다. 20 μM로부터 적정된, 히스타민(Calbiochem)에 대한 반응에서 세포내 Ca2 + 농도의 변화를, Ca2 + 민감성 염료 Fluo-4(Molecular Probes) 및 96-웰 형광 영상화 플레이트 판독기(FLIPR)(Molecular Devices)를 이용하여 표준 기법으로 측정하였다. 히 스타민에 대한 Ca2 + 시그널링 반응의 곡선 아래 면적(AUC)을 각 세포 처리전 상태에 대하여 결정하였다. 데이터 분석은 윈도우용 그래프패드 프리즘 버젼 4(GraphPad Software)를 이용하여 실시하였다.
결과
IL-13과 함께 BSMC를 예비항온처리한 결과 히스타민에 대한 반응으로 Ca2 + 시그널링이 상당히 증가되었다. IL-13과 함께 BAK502G9를 예비항온처리한 결과(도 25B)(무관한 아이소타입 대조구 항체(도 25A)는 아님) 히스타민에 대한 반응으로 Ca2+ 시그널링의 강화를 상당히 억제하였다(도 25).
실시예 27
인간 IL-13 의존성 PBMC CD23 발현 분석에서 항-IL-13 항체의 중화 성능
대표적인 IL-13 항체의 성능을 인간 IL-13 의존성 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) CD23 발현 분석에서 평가하였다. PBMC는 CD23의 세포 표면 발현을 증가시킴으로써 IL-13 및 IL-4 둘다에 반응한다[120]. CD23(FceRII)은 IgE를 위한 저친화성 수용체이며 단핵구를 비롯한 다양한 염증 세포에서 발현된다. 인간 IL-13 의존성 CD23 발현 상향조절의 억제는 유동 혈구계산에 의해 형광 표지된 CD23 모노클로날 항체의 PBMC에의 결합 감소를 측정함으로써 결정되었다.
분석 프로토콜
인간 혈액을 수혈 서비스로부터 구입하고 40분 덱스트란-T500(Pharmacia) 침강(0.6% 최종 농도)에 의해 적혈구를 고갈시켰다. 백혈구 및 혈소판 풍부 분획을 이어서 3 ml 64% 및 5 ml 80%(100%는 9 부 퍼콜 및 1 부 10x PBS였다)의 불연속 퍼콜 구배에 대해 20 분 1137g 원심단리에 의해 단리하였다. 64% 층의 상부로부터 PBMC를 수집하고, 세척하고 분석 완충액(Invitrogen RPMI 1640, 10% FCS, 200IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민)에 재현탁하였다. 500 mcL의 최종 부피에 2 X 106 세포, ±80pM 재조합 인간 IL-13(Peprotech) 또는 21 pM 재조합 인간 IL-4(R&D Systems), ± BAK502G9 또는 무관한 IgG4를 갖는 24 웰 플레이트에서 분석을 실시하였다. 수집하기 전에 37 ℃에서 48시간동안 세포를 배양하고 4 ℃에서 20분동안 CD23-PE(BD Pharmingen)으로 염색하였다. 마지막으로, 유동 혈구측정계에서 세포를 판독하였다. CD23 '스코어'에 의해 CD23 발현을 결정하였으며; CD23 양성 세포의 퍼센트를 염색의 '밝기'에 의해 곱하였다(기하평균 형광). 자극성 CD23 '스코어'를 감하지 않았으며 데이터는 IL-13 단독에 대한 반응의 퍼센티지로 제시되었다(100%). 데이터는 각 점을 위해 세벌로 실시된, 4-6 개별 공여체로부터의 세포를 이용하는 4-6 별도 실험으로부터 취한 평균 ± SEM으로 표현되었다.
결과
48시간동안 80 pM IL-13 또는 21 pM IL-4와 PBMC를 항온처리한 결과 명확한 CD23 발현이 일어났다(도 27 및 도 28). BAK502G9는 120.2 pM의 기하 평균으로 IL-13 유도된 CD23 발현을 투여량 의존적으로 억제하였다(도 27). 대조적으로, BAK502G9는 21.4 pM IL-4에 의해 유도된 CD23 발현을 억제할 수 없었다(개별 공여체로부터 n=4, 도 28). 무관한 IgG4는 PBMC에서 IL-13 또는 IL-4 의존적 CD23 발현 을 억제하지 않았다(도 27 및 도 28). 80 pM IL-13 및 21.4 pM IL-4와 PBMC의 동시자극은 첨가적인 CD23 반응을 생산하였다. BAK502G9는 CD23 발현 수준을 IL-4 단독 자극에서 나타난 수준으로 감소시켰지만 CAT001는 감소시키지 못했다(도 28).
실시예 28
인간 IL-13 의존성 호산구 모양 변화 분석에서 인간 IL-13 항체의 중화 성능
이 연구의 목적은 IL-13[125,126], TNF-α[127], TGF-β1[128]과 같은 천식증의 폐에서 발견된 인자들로 자극한 후 NHLF로부터 방출된 매개자들에 의해 유도된 호산구 모양 변화에 대한 IL-13 항체의 효과를 평가하는 것이었다. IL-13은 TNF-α[129], 또는 TGF-β1[130]과 상승작용하여 섬유모세포가 에오탁신-1을 생산하도록 하며, 이것은 다시 호산구를 직접 화학적으로 유인하기 위해 작용한다. 백혈구 모양 변화 반응은 세포의 세포골격의 재배열을 통해 매개되며 미세순환으로부터 백혈구가 염증 부위내로 이동하는 과정에 필수적이다. NHLF에 의한 IL-13-의존성 모양 변화 유도 인자 방출의 억제는 ELISA에 의한 에오탁신-1 분비에서의 감소 및 유동 혈구측정계에 의한 호산구 모양 변화의 감소를 측정하여 결정하였다.
분석 프로토콜
BAK502G9의 부재 또는 존재하에서(농도 범위 875 nM-6.84 nM) 배지 단독 또는 자극제(9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-α(R&D Systems) 및 160 pM TGF-β1(R&D Systems))를 함유한 배지와 NHLF 세포를 동시배양하였다. 이어서 세포를 37 ℃에서 추가 48시간동안 배양하고 생성된 조절 배지를 흡입시키고 -80 ℃에서 저장하였다. 조절된 배지에서 에오탁신-1의 농도를 R&D Systems Duoset ELISA 시스템(R&D Systems)을 이용하여 평가하였다.
인간 혈액을 수혈 서비스로부터 구입하고 40분 덱스트란-T500(Pharmacia) 침강(0.6% 최종 농도)에 의해 적혈구를 고갈시켰다. 백혈구 및 혈소판 풍부 분획을 이어서 3 ml 64% 및 5 ml 80%(100%는 9 부 퍼콜 및 1 부 10x PBS였다)의 불연속 퍼콜 구배에 대해 20 분 1137g 원심단리에 의해 단리하였다. 64% :80% 계면으로부터 과립구를 수집하고, 세척하고 분석 완충액(Sigma PBS, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM D-글루코스, 0.1% Sigma BSA, pH 7.3)에 재현탁하였다. 400 ㎕의 최종 부피에 5 X 106 세포, ±3 nM 재조합 인간 에오탁신-1(R&D Systems) 또는 조절된 배지를 갖는 FACS 튜브에서 분석을 실시하였다. 세포를 37 ℃에서 8.5분동안 항온처리하고 4 ℃로 옮기고 고정제(CellFix, BD Biosciences)로 고정시키고 마지막으로 유동 혈구계산기에서 판독하였다. 호산구를 그들의 FL-2 자가형광에 의해 확인하고 전방 산란(FSC) 파라미터를 판독한다. 호산구 FSC는 에오탁신-1 및 조절된 배지 둘다에 대한 반응으로 변하여 모양 변화의 측정값을 제공하였다. 높은 유속에서 튜브를 샘플을 취하고 1000 호산구 사건 또는 1분 중 빠른 것 후에 획득을 중단하였다. 모양 변화 완충액 단독(100% 블랭크 모양 변화)에 의해 야기된 FSC의 퍼센티지로서 모양 변화를 계산하였다. 데이터를 4 개의 별도 실험으로부터 얻은 평균 % 블랭크 모양 변화 ± SEM으로 표현하였다. 각 실험은 각 지점을 위해 두벌로 실시된, 개별 담황막(및 따라서 개별 공여체)로부터의 세포를 이용하였다.
결과
9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-α 및 160 pM TGF-β1로 동시자극되고 48시간동 안 배양된 NHLF 세포는 9.6 nM 에오탁신-1을 배양 배지내로 분비하였다. 대조적으로, 단지 유지 배지만으로 배양된 NHLF 세포는 0.1 nM 에오탁신-1을 배양 배지내로 분비하였다. 이 에오탁신-1 생산은 IL-13/TNF-α/TGF-β1 동시자극된 NHLF 세포 에오탁신-1 생산이 32.4 nM의 IC50으로 BAK502G9에 의해 투여량 의존적으로 억제되었으므로 IL-13 의존성이었다(도 29A).
이 연구의 이 부분의 일차 목표는 호산구 모양 변화를 검사하는 것이었다. 3 nM 에오탁신(양성 대조구)에 대한 반응에서 호산구 모양 변화의 양은 122.2±2.1%(n=4)였다. 에오탁신-1 유도된 모양 변화는 항-에오탁신 항체 CAT-213 100 nM에 의해 완전히 억제되었으며, 평균 모양 변화는 101.0±1.0%(n=4)였다.
9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-α 및 160 pM TGF-β1로 동시자극되고 48시간동안 배양된 NHLF 세포로부터의 배지(조절된 배지)는 명확한 호산구 및 모양 변화를 유도하였다(도 29B). 대조적으로, NHLF 유지 배지 단독에서 48시간동안 배양된 NHLF로부터의 배지는 호산구 모양 변화를 유도하지 않았다(도 29B).
NHLF 배양에 앞서 동시자극된 배지에 항-IL-13 항체 BAK502G9를 첨가한 결과 오한구 모양 변화가 투여량 의존적으로 억제되었으며 1:16 희석으로 분석시 16.8 nM의 기하 평균 IC50이었다(도 29B).
NHLF 세포와 배양되지 않은 자극인자(IL-13, TNF-α 및 TGF-β1)이 호산구 및 호중구 모양 변화를 유도하는 능력 또한 조사하였다. 9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-α 및 160 pM TGF-β1은 명확한 호산구 모양 변화를 유도하지 않았다. 이것은 조절된 배지의 호산구 모양 변화 능력이 자극인자와 NHLF 세포 배양동안 발생하며, 어느 자극인자 단독 또는 조합에 기인한 것이 아님을 제안한다(도 29B).
실시예 29
인간 IL-13에서 항-IL-13 항체의 맵핑
대표적인 IL-13 항체 BAK502G9의 에피토프 맵핑을 분자적 방법 및 표준 펩티드 절단을 이용하여 실시하였다.
분자적 방법
IL-13 키메라를 조작하였으며, 이때 인간 IL-13 서열의 일부는 쥐 서열로 대체되었다. 이들 키메라를 대표적인 IL-13 항체를 이용한 결합 연구에 이용하여 특이적 에피토프를 확인하였다.
IL-13 키메라의 두 패널을 생산하였다. 첫번째 패널은 9개 키메라를 함유하였으며(도 30) 에피토프의 일반적인 위치를 찾기 위하여 이용하였다. 두번째 패널은 10개 키메라를 함유하였으며(도 31) 에피토프를 미세 맵핑하기 위해 이용하였다.
키메라 IL-13 서열을 PCR을 이용하여 조립하고 Gateway® 엔트리 벡터내로 클로닝하고, 이어서 이를 목적지 벡터 pDEST8(재조합 단백질의 C-말단에서 검출 및 친화성 태그를 암호하도록 변형됨)과 재조합하였다. 이들 발현 벡터를 이용하여 DH10BacTM 화학적 컴피턴트 이 콜리를 형질전환시켜 태그된 키메라 IL-13이 바큘로바이러스 셔틀 벡터(백미드(bacmid))내로 부위 특이적으로 전위하도록 하였다. 재조합 백미드 DNA를 각 IL-13 키메라에 대해 단리하고 Cellfectin® 시약을 이용하 여 Sf9(스포도프테라 프루기페르다) 곤충 세포내로 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간에 재조합 바큘로바이러스를 수집하고 두번 더 Sf9 곤충 세포를 통해 계대시켰다.
곤충 2000-500 ml 배양물 상등액을 친화성 컬럼에서 정제하고 용출된 물질을 16 ml에서 1 ml로 농축시키고 최종 세척과 완충액 교환을 위해 크기 배제 수퍼덱스 200 HR10/300GL 컬럼에 로딩하였다.
비오틴화된 인간 IL-13, 스트렙타비딘-안토피오시네이트 및 유로피움 표지된 BAK502G9를 이용한 균질한 경쟁 분석을 개발하였다. 분석은 하기와 같다: Eu-BAK502G9는 비오틴화된 인간 IL-13에 결합하며, 이어서 상기 복합체는 스트렙타비딘 APC 접합체에 의해 인식되고 섬광이 적용될 때 에너지는 APC 라벨에서 유로피움으로 이전되고, 시간에 따른 형광을 측정할 수 있다. 이 결합에 대한 경쟁은 미표지 인간 IL-13(대조구로서) 및 키메라 구조체에 의해 도입된다. 이 경쟁은 IL-13 항체에 대한 IL-13 돌연변이의 상대적 친화성을 계산하기 위하여 정량되어 결합을 바꾸는 돌연변이가 확인될 수 있도록 한다.
결과
키메라 구조체 IL-13-헬릭스 D(표 5)가 BAK502G9에의 결합에 대하여 비오틴화된 인간 IL-13에 대한 가장 약한 경쟁자로 밝혀져, IL-13 분자내의 헬릭스 D가 BAK502G9 에피토프 결합에 관여함을 나타낸다(표 5). 감소된 활성은 또한 모 서열의 잔기 40, 41, 및 33, 34가 각각 변화된 4041 및 3334 돌연변이에 대해 나타나 BAK502G9의 인식에서 헬릭스A의 잠재적인 관련성을 나타낸다. 루프3의 활성 감소는 덜 고려되었으며 이는 이 루프가 인간 분자에 비하여 돌연변이에서 감소된 아미노산 수를 가지며 단백질의 전체 구조를 바꾸기 쉽기 때문이다. 키메라 IL-13 분자가 BAK502G9 결합을 위해 경쟁하는 능력의 다른 감소는 그러한 아미노산 변화를 위해 중요한 것으로 고려되지 않았다.
헬릭스 D 이내의 더욱 표적화된 돌연변이 세트(도 26)를 이어서 시험하였다. 얻어진 결과는 표 6에 제시되며 하기와 같다:
결과는 키메라 구조체 116117TK(위치 116의 라이신이 트레오닌으로 대체되고 위치 117의 아스파테이트가 라이신으로 대체됨), 123KA(위치 123의 라이신이 대체됨), 및 127RA(위치 127의 아르기닌이 대체됨)이 BAK502G9에의 결합을 위해 가장 적게 경쟁할 수 있음을 나타낸다(123KA와 127RA는 1 μM에서는 경쟁하지 않음). 경쟁 분석에서 그들의 감소된 효과로 인해 BAK502G9에의 결합에 함축된 다른 잔기는 헬릭스 D 잔기 124Q(라이신이 글루타민으로 대체됨) 및 120121SY(루이신 히스티딘 쌍이 세린 티로신 쌍으로 변함)를 포함한다. 위치 58L에서 루이신의 돌연변이는 또한 결합을 감소시키며 3차원 구조의 분석 결과 이 잔기가 헬릭스D에 대해 접히며 직접 BAK502G9와 접촉하거나 헬릭스D의 배열에 영향을 줄 수 있음을 밝혔다.
이들 실험은 헬릭스 D 내의 잔기가 IL-13에의 BAK502G9의 결합에 중요함을 증명한다. 구체적으로 위치 123의 라이신 및 위치127의 아르기닌은 이들 잔기 중 어느 것의 돌연변이가 BAK502G9의 결합을 파괴하므로 이 결합에 중요하다.
에피토프 절단
표준 펩티드 절단 과정을 이용하여 BAK502G9의 에피토프 맵핑을 실시하였다. 여기서 IgG는 고체상위에 고정되어 IL-13 리간드를 포획하였다. 이어서 형성된 복합체를 특이적 단백질분해에 노출시키고, 이동안 접근가능한 펩티드 결합은 절단되지만, IgG:리간드 계면에 의해 보호되는 것들은 그대로 남아 있게 된다. 따라서, 에피토프를 함유한 펩티드는 IgG에 결합한 채 남는다. 이어서 이것을 탈착시키고, 수집하고 질량 분광법(ms)으로 확인한다.
두 가지 상보성 기법을 이용하였으며, 첫번째는 사이퍼젠 단백질칩 판독기 MALDI-TOF 질량 분광계를 이용하였으며, 이경우 IgG를 질량 분광계 칩에 공유적으로 연결시키고 분해 및 추출을 그자리에서 실시하는 것이 가능하였다. 두번째 기법은 스트렙타비딘 코팅된 비드에 연결된 비오틴화된 BAK502G9를 이용하였으며 탠덤 질량 분광법(ms/ms)에 의한 서열 확인을 위해 충분한 펩티드의 수집을 가능하게 하였다.
절대적인 상세사항과 규모가 상이함에도 불구하고 두 과정은 본질적으로 동일한 단계, IgG의 커플링, 미반응 결합 부위의 차단, 세척, 리간드 포획, 미결합 리간드의 제거, 분해 및 최종 세척 단계에 관여된다.
MALDI-TOF ms 방법은 PBS중의 1-2 mg/ml의 IgG가 4℃에서 밤새 결합된 자유 일차 아민기에 공유적으로 결합하는 카르보닐디이미다졸로 활성화된 독점 ms 칩을 사용하였다. 상기 칩을 후속하여 실온에서 1시간동안 에탄올아민 용액으로 차단하고 이어서 PBS 또는 HBS 와 적합한 계면활성제로 완전히 세척한다. 이어서 1 피코몰 분액의 IL-13을 PBS 또는 HBS중의 칩에 가하고 실온에서 2시간동안 화학적으로 고정된 IgG에 결합시킨다. 이어서 계면활성제가 있거나 없는 PBS 또는 HBS에서 추 가 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 IL-13을 제거하였다. PBS 또는 HBS중의 200 내지 3.1 ㎍/ml 범위의 트립신 용액을 IgG:리간드 복합체에 가하고 실온에서 30분동안 분해를 진행시킨 후 PBS 또는 HBS 및 계면활성제, PBS 또는 HBS 및 마지막으로 물에서 칩을 세척하였다. 적합한 MALDI-TOF ms 매트릭스의 적용 후 칩을 직접 질량 분광계에 놓고 분석하였다.
비드계 방법은 1 IgG 대 4 비오틴 분자의 몰비로, NHS 비오틴 화합물을 이용하여, IgG의 비오틴화로 시작하였다. 이어서 젤 여과를 이용하여 미결합 비오틴 및 반응 부산물을 제거하였다. 이어서 비오틴화된 IgG를 뉴트라비딘 코팅된 아가로즈 비드에 결합시켰으며 이는 IgG 포획을 최대화시키기 위해 시도되었다. IgG 코팅된 비드의 분액을 농축기 스핀 컬럼내로 분배하고 둘베코 PBS + 0.05% Tween 20으로 세척하고 이어서 둘베코 PBS + 0.05% Tween 20에 재현탁시켰다. IL-13의 펄스를 재현탁된 IgG 비드에 가하고 10분동안 결합을 진행시키고 그 후 원심단리에 의해 액체상을 제거하고 둘베코 PBS + 0.05% Tween 20로 비드를 세척하고 둘베코 PBS + 0.05% Tween 20에 재현탁시켰다.
이어서 비드:IgG:리간드 복합체를 실온 또는 37 ℃에서 항온처리하여 트립신 또는 키모트립신으로 단백질분해시켰다. 그 후 비드를 다시 둘베코 PBS + 0.05% Tween 20에서 세척하고 계면활성제 없는 둘베코 PBS에서 추가 세척하였다. 이어서 비드를 물, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산 혼합물에 재현탁하고 상등액을 회수하였다. 이것을 이어서 ThermoQuest LCQ ESI 이온-트랩 질량 분광계를 이용한 탠덤 (ms/ms) 단편화를 비롯한, MALDI-TOF ms에 의해 또는 역상 HPLC 질량 분광법에 의해 다양하게 분석하였다. 이어서 얻어진 단편화 패턴을 인간 IL-13 서열 및 BAK502G9 IgG의 별도의 중쇄 및 경쇄 서열에 매치시켰다.
실험 순서동안 많은 대조구, 주로 블랭크 표면, IgG 단독 및 아이소타입 대조구를 이용하여 확인된 펩티드가 IgG 포획된 IL-13으로부터 특이적으로 유래되었으며 BAK502G9 또는 비특이적으로 결합된 IL-13 분해에 의한 것이 아님을 입증하였다.
결과
연속적인 실험들은 각 분해에 대해 일치되게 단일 IL-13 특이적 펩티드를 제공하였다. LCQ 이온 트랩 기구로부터의 데이터는 트립신 분해 단편이 3258 Da(MH+)의 단일등방성 질량을 가지며 키모트립신 단편은 3937 Da(MH+)의 단일등방성 질량을 가짐을 밝혔다.
인간 IL-13의 적절한 인실리코(in silico) 분해에 대한 이들 질량의 조사 결과 분자의 C-말단 부분에서 관련 펩티드의 밀접한 매치를 제공하였다.
트립신 펩티드 질량을 위한 매치: 3258 Da
1000 ppm의 허용에서, 3258 Da은 위치 106에서의 아스파르트산에서 위치 132의 C-말단 아스파라긴까지의 서열에 매치한다. 이 허용에서 다른 매치는 없다. 이 영역은 하기의 인간 IL-13의 전구체 형태의 서열상에서 진하게 표시된다.
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키모트립신 펩티드 질량을 위한 매치: 3937 Da
1000 ppm의 허용에서, 3937 Da은 위치 99에서의 세린에서 위치 132의 C-말단 아스파라긴까지의 서열에 매치한다. 이 영역은 하기의 인간 IL-13의 전구체 형태의 서열상에서 진하게 표시된다.
Figure 112006002673211-PCT00002
이들 두 매치 모두 BAK502G9 IgG가 항체:리간드 복합체의 단백질분해동안 IL-13 분자의 C-말단 부분을 보유함을 보여준다.
두 펩티드의 실체는 ms/ms에 의해 성공적으로 확인되었으며, 둘 중 어느 것도 BAK502G9와 큰 서열 병행성을 나타내지 않았다. Y 또는 B 이온을 확인하기 위해 맞춰진 ms/ms 단편 맵은 트립신 펩티드를 위한 1 전하 상태에서 104개의 가능한 이온 중 26개 그리고 키모트립신 펩티드를 위해 가능한 128개 이온 중 19개에 매치되었다. 모든 전하 상태의 검토는 트립신 단편을 위한 27 아미노산 잔기 중 23개 및 키모트립신 단편을 위한 33 잔기 중 29의 확인을 보여준다. 이것은 실체를 확인하기에 충분하다.
전체적인 실험 순서는 인간 IL-13상의 BAK502G9 에피토프의 일부가 27개의 C-말단 아미노산 잔기내에 놓임을 확인하였다. 이들 발견은 전술한 분자적 방법의 발견을 견고하게 한다.
참고문헌
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[표 2]
항-인간 IL-13 항체의 결합 특이성
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[표 3a]
항-인간 IL-13 항체의 동적 분석
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[표 3b]
항-쥐 IL-13 항체의 동적 분석
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[표 4]
29일동안 단일 10mg/kg 정맥 환괴 투여 후 4 마리의 알레르기성이지만 공격되지 않은 사이노몰거스 영장류(2 웅성/2 자성)에서 BAK502G9의 약동학. 혈청에서 BAK502G9 수준은 ELISA에 의해 측정하였다(평균 데이터).
Figure 112006002673211-PCT00017
Vdinf = 시간에 따른 분포 부피, 0 - 무한, 외삽된 AUC로부터 계산됨.
Clinf_ = 시간에 따른 소거 0 - 무한, 외삽된 AUC로부터 계산됨.
AUCinf = 시간에 따른 곡선 아래 면적(전체 약물 노출의 측정) 0 - 무한, 제거 속도 상수(k) 및 마지막 관찰된 혈청 약물 농도를 기초로 한 외삽된 개념 포함.
AUCext = 외삽되는 전체 AUC의 퍼센티지.
T0 .5 = 말단 제거 단계에서 약물 반감기.
[표 5]
첫번째 키메라 구조체 세트
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[표 6]
두번째 키메라 구조체 세트
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[표 7]
다양한 미리정의된 종말점에 대한 BAK502G9의 효과
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단계 I에서 AHR(PC30)을 나타내는 21마리 동물 및 항원 프라이밍 표현형을 갖는 추가의 동물을 단계 II에서의 시험에 이용하였다(총 22마리). AUC 및 PC30 둘다에 의해 측정할 때 모든 동물이 AHR을 가지지는 않았다. 단계 I에서 AHR을 나타냈으며 단계 I 및 II 모두에서 그 AHR이 평가된 동물만을 AHR 결과에 포함시켰다. 통계적 시험은 InStat를 이용하여 실시하였다. 시험은 종말점이 수 0을 포함하는 널 가설(즉, 단계 I에 비하여 단계 II에서 변화가 없음)에 대한 2-방식 스튜던트 t-테스트였다; * p<0.05, ** p<0.01. 데이터는 수학적 평균 ± SEM(n=14-21)로 나타난다.
a 동물 5마리는 단계 I에서 AHR을 나타내지 않았으므로(증가된 AUC) AUC 분석에서 제외시켰다.
추가의 동물 3 마리를 단계 II 기도 기능 데이터 수집에서 기술적 실패로 인해 제외시켰다.
b 동물 3 마리를 단계 II 기도 기능 데이터 수집에서 기술적 실패로 인해 PC30 분석에서 제외시켰다.(a에서와 동일한 동물). 항원 프라이밍 표현형을 갖는 추가의 동물이 단계 I에서 PC30 AHR을 나타내지 않았으므로 제외시켰다.
c 단계 I 기도 기능 데이터 수집에서 기술적 실패로 인해 동물 2마리를 항원 프라이밍 분석에서 제외시켰다.
d 연구 시작에서 표시된 BAL 염증으로 인해 BAL 분석에서 동물 1 마리를 제외시켰다.
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SEQUENCE LISTING <110> Cambridge Antibody Technology Limited Monk, Phillip D Jermutus, Lutz Minter, Ralph R Shorrock, Celia P <120> Human Antibody Molecules for IL-13 <130> SMWCP6234918 <140> PCT/GB2004/003059 <141> 2004-07-15 <150> US 60/487,512 <151> 2003-07-15 <150> US 60/558,216 <151> 2004-03-31 <150> GB 0407315.1 <151> 2004-03-31 <150> US 60/573,791 <151> 2004-05-24 <160> 249 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Tyr Gly Leu Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ser Ser Ser Asn Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Val 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asn Tyr Gly Leu Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ser Ser Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Gly Asn Ile Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Val 1 5 10 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe 50 55 60 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100 105 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Ile Thr Met Thr Thr Glu Thr Ser Thr Asn Thr Ala His Met Glu 1 5 10 15 Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Pro Cys 20 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 1 5 10 15 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Ile Asp Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ala Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser 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<400> 99 Asp Ser Ser Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gly Gly Asn Ile Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Val 1 5 10 <210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Asp Tyr Gly Leu Ser 1 5 <210> 104 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Trp Arg Ile Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Tyr Gly Gln Glu Phe Gln Gly 1 5 10 15 <210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Asp Ser Ser Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Gly Gly Asn Ile Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Val 1 5 10 <210> 109 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcta ataatggcga cacaaattat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcaact gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 110 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggtaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 111 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcta ataatggcga cacaaattat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 112 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 113 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atctccggct tgaacggcga gacattgtat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 114 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 115 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgcaaccc cagacggcca gacaagctat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 aacagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 116 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 117 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 caagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttgag cagaccggcg tctcctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcta ataatggcga cacaaattat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 118 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 119 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttatc gacaccgggg tctcctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcta ataatggcga cacaaattat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 120 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 121 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaactacg acggcggcaa cacacagtat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 122 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 123 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcggga gcaacggcta cacatcttat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata cgtccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 124 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 125 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgacg ccaccggcga cacacagtat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 126 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 127 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca gattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctagagtg gatgggatgg atccgcaaca tcgacggcta cacaatttat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 128 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 129 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttaca aattatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgacgacg acagcggcac gacaatatat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggcc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 130 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 131 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 caagtgcagt tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttgcg aacaccggga tctcgtgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcta ataatggcga cacaaattat 180 ggacaggaat tccagggcag agtcaccatg accacagata catccacgag cacagcctac 240 atggagttga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagactcc 300 agcagcagct gggcccgctg gtttttcgat ctctggggtc gggggacact ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 132 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacatcat tggaagtaaa cttgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gatactggta gtgatcccgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 133 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Glu Thr Pro Thr Asn Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Ser Ser Ser Asn Trp Ala Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 134 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Pro Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ile Asp Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Asn Tyr Gly Leu Ser 1 5 <210> 136 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 137 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Asp Ser Ser Ser Asn Trp Ala Arg Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Val 1 5 10 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 142 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Val Gly Ala Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 144 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Glu 1 5 10 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Val 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 148 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 149 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Val Gly Arg Ala Thr Thr Asp Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 150 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Val 1 5 <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 154 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Val Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gly Tyr Tyr 1 5 10 <210> 156 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Val 1 5 <210> 159 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 159 aattatggtc tcagc 15 <210> 160 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 tggatcagcg ctaataatgg cgacacaaat tatggacagg aattccaggg c 51 <210> 161 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 gactccagca gcaactgggc ccgctggttt ttcgatctc 39 <210> 162 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 gggggaaaca acattggaag taaacttgta cac 33 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 gatgatggcg accggccctc a 21 <210> 164 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 caggtgtggg atactggtag tgatcccgtg gta 33 <210> 165 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165 aattatggtc tcagc 15 <210> 166 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 tggatcagcg ctaataatgg cgacacaaat tatggacagg aattccaggg c 51 <210> 167 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 gactccagca gcagctgggc ccgctggttt ttcgatctc 39 <210> 168 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 gggggaaaca tcattggaag taaacttgta cac 33 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 gatgatggcg accggccctc a 21 <210> 170 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 caggtgtggg atactggtag tgatcccgtg gta 33 <210> 171 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 172 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 173 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Arg Phe Asn 130 <210> 174 <211> 132 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 174 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Val Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Asn Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu Arg Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Gln Phe Asn 130 <210> 175 <211> 131 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 175 Met Ala Leu Trp Val Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Pro Gly Pro Val Pro Arg Ser Val Ser Leu Pro Leu Thr 20 25 30 Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln Asp Gln Thr 35 40 45 Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly 50 55 60 Gly Phe Cys Val Ala Leu Asp Ser Leu Thr Asn Ile Ser Asn Cys Asn 65 70 75 80 Ala Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Ile Leu His Gly Leu Cys Asn Arg Lys 85 90 95 Ala Pro Thr Thr Val Ser Ser Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 His Phe Ile Thr Lys Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Gln Leu Phe Arg His 115 120 125 Gly Pro Phe 130 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR1 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Gln, Asp, Leu, Gly and Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from the group consisting of Tyr and Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is selected from the group consisting of Val, Ile, Phe and Le u <400> 176 Xaa Xaa Gly Xaa Ser 1 5 <210> 177 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR2 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Asp, Asn, Ala, Arg, Gly and Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ala, Asp, Gly, Thr, Pro, Asn and Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Asp, Leu, Ala, Pro, Thr, Ser, Ile and Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Ser, Thr, Asp, Gly, Lys and Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asp, Thr, Glu, Gln, Leu, Tyr, Asn, Val, Ala, Met and Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Ile, Leu, Gln, Ser, Met, His, Asp and Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is selected from the group consisting of Gly and Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is selected from the group consisting of Gln and Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is selected from the group consisting of Glu, Lys and Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is selected from the group consisting of Gln and Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is selected from the group consisting of Gly and Lys <400> 177 Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 178 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR3 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Arg and Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Asn, Asp, Thr a nd Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser and Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Asn, Ala, Ile, Arg, Pro and Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from the group consisting of Phe and Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asp and Tyr <400> 178 Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ala Arg Trp Xaa Phe Xaa Leu 1 5 10 <210> 179 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Asp and Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asn, Ile, Leu, Met, Cys, Val, Lys, Tyr, Phe, Arg, Thr, Ser, Ala, His and Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ile and Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser and Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from the group consisting of Lys and Arg <400> 179 Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Leu Val His 1 5 10 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser and Thr <400> 180 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Xaa 1 5 <210> 181 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from the group consisting of Asp and Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from the group consisting of Val and Ile <400> 181 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Xaa Pro Val Xaa 1 5 10 <210> 182 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Leu Thr Gly Val Ser 1 5 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Gly Thr Gly Val Ser 1 5 <210> 184 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Glu Thr Gly Ile Ser 1 5 <210> 185 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Asp Thr Gly Ile Ser 1 5 <210> 186 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Gly Thr Gly Ile Ser 1 5 <210> 187 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Asn Tyr Gly Phe Ser 1 5 <210> 188 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Trp Ile Arg Pro Thr Asp Gly Leu Thr Met Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 189 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Trp Ile Asp Asp Arg Thr Gly Thr Thr Gln Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 190 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Trp Ile Arg Ala Ser Asp Gly Gln Thr Ile Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 191 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Trp Ile Ser Gly Ile Asp Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 192 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Trp Ile Arg Ala Ala Asp Gly Glu Thr His Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 193 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Trp Ile Gly Asn Asn Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 194 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Trp Ile Gly Pro Ser Lys Gly Glu Thr Ser Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 195 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Trp Ile Arg Pro Arg Asp Gly Thr Thr His Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 196 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Trp Ile Ser Gly Arg Ser Gly Ala Thr Leu Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 197 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Trp Ile Glu Gly Ser Thr Gly Asn Thr Ile Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 198 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Trp Ile Gly Pro Ile Asn Gly Met Thr His Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 199 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 200 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 201 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 202 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Arg Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 203 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Trp Ile Gly Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 204 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 205 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 206 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Trp Ile Ser Thr Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 207 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Arg Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 208 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 209 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 210 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Trp Ile Gly Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 211 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Trp Ile Ser Ala Asn Ile Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 212 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Gly Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 213 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Trp Ile Ser Thr Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Arg Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 214 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Trp Ile Ser Ala Asn Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Gly Gln Glu Phe Gln 1 5 10 15 Lys <210> 215 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Asp Ser Asp Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 216 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Asp Ser Thr Ser Ala Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 217 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Asp Ser Asn Ser Ala Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Asp Ser Ser Ser Ile Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 219 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Asp Ser Thr Ser Arg Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 220 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Asp Asp Pro Arg Pro Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 221 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Asp Ser Ser Ser Lys Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 222 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Asp Ser Asn Ser Asn Trp Ala Arg Trp Phe Phe Tyr Leu 1 5 10 <210> 223 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Asp Ser Asn Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 224 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Asp Arg Asp Ser Ser Trp Ala Arg Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 225 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Gly Gly Asn Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 226 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Gly Gly Asn Met Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 227 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Gly Gly Asn Cys Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 228 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Gly Gly Asn Val Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 229 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Gly Gly Asn Lys Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 230 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Gly Gly Asn Tyr Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 231 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Gly Gly Asn Phe Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 232 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Gly Gly Asn Arg Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 233 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Gly Gly Asn Thr Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 234 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 235 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Arg Leu Val His 1 5 10 <210> 236 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 237 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Gly Gly Asn Ser Ile Gly Gly Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 238 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Gly Gly Asn Ala Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 239 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 240 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 Gly Gly Asn His Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 241 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241 Gly Gly Asn Gly Ile Gly Ser Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 242 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Gly Gly Ser Asn Ile Gly Gly Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 243 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Gly Gly Asn Asn Val Gly Gly Lys Leu Val His 1 5 10 <210> 244 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Arg Leu Val His 1 5 10 <210> 245 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Thr 1 5 <210> 246 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asn Pro Val Val 1 5 10 <210> 247 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Gln Val Trp Asp Thr Gly Ser Asp Pro Val Ile 1 5 10 <210> 248 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus between human IL-3 and Cynomolgus IL-3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21, 30, 62, 87, 103, 120, 130) <223> Xaa = no consensus <400> 248 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Xaa Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Xaa Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Xaa Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Xaa Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu Xaa Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Xaa His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Xaa Phe Asn 130 <210> 249 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus between human IL-3 and murine IL-3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4, 5, 7, 9, 12, 17, 19, 25, 27..32, 34, 41, 46, 48) <223> Xaa = no consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49, 60, 61, 63, 66, 67, 69, 72, 75, 77, 79, 81, 84) <223> Xaa = no consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85, 89, 91, 93, 95, 96, 98..103, 107..109, 117) <223> Xaa = no consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119..121, 124..126, 128, 132, 134, 136) <223> Xaa = no consensus <400> 249 Met Ala Leu Xaa Xaa Thr Xaa Val Xaa Ala Leu Xaa Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Pro Gly Pro Val Pro Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Leu Xaa Glu Leu Ile Glu Glu Leu Xaa Asn Ile Thr Gln Xaa Gln Xaa 35 40 45 Xaa Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ala 50 55 60 Gly Xaa Xaa Cys Xaa Ala Leu Xaa Ser Leu Xaa Asn Xaa Ser Xaa Cys 65 70 75 80 Xaa Ala Ile Xaa Xaa Thr Gln Arg Xaa Leu Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa 85 90 95 Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys 100 105 110 Ile Glu Val Ala Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Lys Xaa 115 120 125 Leu Phe Arg Xaa Gly Xaa Phe Xaa 130 135 73

Claims (91)

  1. 인간 항체 VH 도메인 및 인간 항체 VL 도메인으로 구성되며 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 항원-결합 부위를 포함하며, 이때 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3를 포함하며 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3를 포함하며, 이때 CDR 세트는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 CDR 세트로 구성되는, 인간 IL-13에 대한 단리된 특이적 결합 구성원:
    HCDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지며, LCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CDR의 BAK278D6 세트;
    CDR의 BAK278D6 세트와 비교하여 하나 또는 두개의 아미노산 치환을 함유하는 CDR 세트; 및
    표 1에 나타난 개별 클론에 대해 나타난 각 CDR 세트.
  2. 제1항에 있어서, 하나 또는 두개의 치환이 카바트(Kabat)의 표준 넘버링을 이용하여, CDR내의 하기 잔기 중 하나 또는 둘에 존재하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원:
    HCDR1의 31, 32, 34
    HCDR2의 52, 52A, 53, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65
    HCDR3의 96, 97, 98, 99, 101
    LCDR1의 26, 27, 28, 30, 31
    LCDR2의 56
    LCDR3의 95A, 97
  3. 제2항에 있어서, 하나 또는 두개의 치환이 각 위치에 대해 가능한 치환 잔기의 확인된 군으로부터 하기 위치에서 만들어지는 것인 단리된 특이적 결합 구성원:
    치환의 위치 하기로 구성된 군에서 선택된 치환 잔기
    HCDR1의 31: Q, D, L, G 및 E
    HCDR1의 32: T
    HCDR1의 34: V, I 및 F
    HCDR2의 52: D, N, A, R, G 및 E
    HCDR2의 52A: D, G, T, P, N 및 Y
    HCDR2의 53: D, L, A, P, T, S, I 및 R
    HCDR2의 54: S, T, D, G, K 및 I
    HCDR2의 56: T, E, Q, L, Y, N, V, A, M 및 G
    HCDR2의 58: I, L, Q, S, M, H, D 및 K
    HCDR2의 60: R
    HCDR2의 61 : R
    HCDR2의 62 : K 및 G
    HCDR2의 64 : R
    HCDR2의 65 : K
    HCDR3의 96: R 및 D
    HCDR3의 97: N, D, T 및 P
    HCDR3의 98: R
    HCDR3의 99: S, A, I, R, P 및 K
    HCDR3의 101: Y
    LCDR1의 26: D 및 S
    LCDR1의 27: I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H 및 G
    LCDR1의 28: V
    LCDR1의 30: G
    LCDR1의 31 : R
    LCDR2의 56: T
    LCDR3의 95A: N
    LCDR3의 97: I
  4. 제3항에 있어서, CDR의 BAK278D6 세트와 비교할 때 HCDR3 잔기 99 및 LCDR1 잔기 27에서 두 치환이 존재하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  5. 제4항에 있어서, S, A, I, R, P 및 K로 구성된 군에서 선택된 HCDR3 잔기 99 에서의 치환 및/또는 I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H 및 G로 구성된 군에서 선택된 LCDR1 잔기 27에서의 치환을 갖는 CDR의 BAK278D6 세트를 포함하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  6. 제4항에 있어서, HCDR3 잔기 99에서 N 대신 S 및/또는 LCDR1 잔기 27에서 N 대신 I를 갖는 CDR의 BAK278D6 세트를 포함하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3가 생식선 골격내에 있고/있거나 VL 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3가 생식선 골격내에 존재하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  8. 제7항에 있어서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3가 생식선 골격 VH1 DP14내에 존재하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3가 생식선 골격 VL Vλ3 3h내에 존재하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 130의 아르기닌이 글루타민에 의해 치환된 인간 IL-13 변이체에 결합하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 영장류 IL-13에 결합하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  12. 제11항에 있어서, 비인간 영장류 IL-13이 레서스(rhesus) 또는 사이노몰거스(cynomolgus)인 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)을 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)을 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합 구성원의 친화성 및 항원-결합 부위의 친화성을 동일한 조건하에서 결정시 특이적 결합 구성원이, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)과 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)에 의해 형성된 IL-13 항원-결합 부위의 친화성과 동등하거나 더 나은 친화성으로 IL-13에 결합하는 것인, 특이적 결합 구성원.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-13을 중화하는 것인 특이적 결합 구성원.
  17. 제16항에 있어서, 특이적 결합 구성원의 성능 및 항원-결합 부위의 성능을 동일한 조건하에서 결정시 특이적 결합 구성원이, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)과 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)에 의해 형성된 IL-13 항원-결합 부위의 성능과 동등하거나 더 나은 성능으로 인간 IL-13을 중화하는 것인, 특이적 결합 구성원.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체 분자를 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  20. 제19항에 있어서, 전체 항체를 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  21. 제20항에 있어서, 전체 항체가 IgG4인 것인 특이적 결합 구성원.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 구성원의 단리된 항체 VH 도메인.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 구성원의 단리된 항체 VL 도메인.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 구성원, 항체 VH 도메인 또는 항체 VL 도메인 및 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 약학적 허용 부형제, 비히클 또는 담체를 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원, 또는 특이적 결합 구성원의 항체 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  27. 제26항의 핵산으로 시험관내 형질전환된 숙주 세포.
  28. 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산을 위한 조건하에서 제27항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 도메인을 생산하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메 인을 단리 및/또는 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 조제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 하기를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적인 항체 항원-결합 도메인을 생산하는 방법:
    HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 모 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하며, 이때 모 VH 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 HCDR1은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK278D6 세트이거나, 또는 HCDR1은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK502G9 세트이며, 임의로 그렇게 얻어진 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합을 제공하는 단계; 및
    모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하여 인간 IL-13에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 확인하는 단계.
  32. 제31항에 있어서, 모 VH 도메인 아미노산 서열이 서열 번호 13과 서열 번호 15로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 VL 도메인이 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 모 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공되어 각각이 모 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VL 도메인을 생성하며, 이때 모 VL 도메인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 LCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK278D6 세트이거나, 또는 LCDR1은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK502G9 세트인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 모 VL 도메인 아미노산 서열이 서열 번호 14 및 서열 번호 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 하기를 포함하는, 인간 IL-13에 특이적인 항체 항원-결합 도메인을 생산하는 방법:
    HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 모 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하며, 이때 모 VH 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 HCDR1은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK167A11 세트, HCDR1은 서열 번호 153의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 154의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 155의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK615E3 세트, HCDR1은 서열 번호 141의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 142의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 143의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK582F7 세트, 또는 HCDR1은 서열 번호 147의 아미노산 서열을 가지며, HCDR2는 서열 번호 148의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3는 서열 번호 149의 아미노산 서열을 가지는 HCDR의 BAK612B5 세트이며, 임의로 그렇게 얻어진 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합을 제공하는 단계; 및
    모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하여 인간 IL-13에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 확인하는 단계.
  36. 제35항에 있어서, 모 VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 55 및 서열 번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 하나 이상의 VL 도메인이 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 모 VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 추가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공되어 각각이 모 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VL 도메인을 생성하며, 이때 모 VL 도메인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 LCDR1은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK167A11 세트, LCDR1은 서열 번호 156의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 157의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 158의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK615E3 세트, LCDR1은 서열 번호 144의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 145의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 146의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK582F7 세트, 또는 LCDR1은 서열 번호 150의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열 번호 151의 아미노산 서열을 가지며, LCDR3는 서열 번호 152의 아미노산 서열을 가지는 LCDR의 BAK612B5 세트인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 모 VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 24 및 서열 번호 34로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인이 CDR 돌연변이유발에 의해 제공되는 것인 방법.
  40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인이 CDR 돌연변이유발에 의해 제공되는 것인 방법.
  41. 제31항 내지 제40항에 있어서, IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자내에 항체 항원 결합 부위를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  42. 하기를 포함하는, 인간 IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원을 생산하는 방법:
    VH 도메인을 암호화하는 출발 핵산 또는 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하며, 이때 VH 도메인 또는 VH 도메인들은 치환될 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3를 포함하거나 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 암호화 영역이 결핍되는 단계;
    상기 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리를 HCDR1(서열 번호 1) 또는 HCDR1(서열 번호 7), HCDR2(서열 번호 2) 또는 HCDR2(서열 번호 8) 및/또는 HCDR3(서열 번호 3) 또는 HCDR3(서열 번호 9)의 아미노산 서열을 암호하거나 이의 돌연변이에 의해 생산된 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들과 조합하여 상기 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들이 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리내의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역내로 삽입되도록 하여 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
    상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시켜 생성물 VH 도메인을 생산하는 단계;
    임의로 상기 생성물 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계;
    생성물 VH 도메인 및 임의로 VL 도메인을 포함하는, 인간 IL-13에 특이적인 특이적 결합 구성원을 선택하는 단계; 및
    상기 특이적 결합 구성원 또는 그것을 암호화하는 핵산을 회수하는 단계.
  43. 제42항에 있어서, 공여체 핵산이 상기 HCDR1 및/또는 HCDR2의 돌연변이에 의해 제조되는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 공여체 핵산이 HCDR3의 돌연변이에 의해 제조되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, HCDR3(서열 번호 3) 또는 HCDR3(서열 번호 9)의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 돌연변이에 의해 공여체 핵산을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 핵산의 무작위 돌연변이에 의해 공여체 핵산을 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 특이적 결합 구성원내에 포함된 생성물 VH 도메인을 항체 불변 영역에 부착하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  48. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-13을 중화하는 능력에 대해 인간 IL-13에 결합하는 항체 항원-결합 도메인 또는 특이적 결합 구성원을 시험하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 인간 IL-13에 결합하고 이를 중화하는 항체 단편을 포함하는 특이적 결합 구성원이 얻어지는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 항체 단편이 scFv 항체 분자인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 항체 단편이 Fab 항체 분자인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 전체 항체에서 항체 단편의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  54. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원, 특이적 결합 구성원의 항체 항원-결합 부위 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인 또는 IL-13에 결합하는 항체 항원-결합 부위를 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 조제하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원을 IL-13 또는 IL-13의 단편에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원을 인간 IL-13 또는 인간 IL-13의 단편에 결합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 결합이 시험관내에서 일어나는 것인 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 또는 IL-13의 단편에의 특이적 결합 구성원의 결합의 양을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  59. 제31항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택 된 질병 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 특이적 결합 구성원의 사용을 추가로 포함하는 것인 방법.
  60. 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원의 용도.
  61. 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원을 상기 질병 또는 질환을 가진 환자 또는 상기 질병 또는 질환을 일으킬 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 인간 항체 VH 도메인 및 인간 항체 VL 도메인으로 구성되며 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하며 이때 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2, HCDR3를 포함하고 VL 도메인은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3를 포함하며,
    이때 HCDR1은 식 HX1 HX2 G HX3 S을 갖는 아미노산 서열이며,
    이때 HX1은 N,Q,D,L,G 및 E로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    HX2는 Y 및 T로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    HX3은 V,I,F 및 L로 구성되는 군으로부터 선택되며,
    HCDR2는 식 W I HX4 HX5 HX6 HX7 G HX8 T HX9 Y HX10 HX11 HX12 F HX13 HX14를 갖는 아미노산 서열이며
    이때 HX4는 S, D, N, A, R, G 및 E로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX5는 A, D, G, T, P, N 및 Y로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX6는 N, D, L, A, P, T, S, I 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX7는 N, S, T, D, G, K 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX8은 D, T, E, Q, L, Y, N, V, A, M 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX9는 N, I, L, Q, S, M, H, D 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX10은 G 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX11은 Q 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX12는 E, K 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX13은 Q 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX14는 G 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HCDR3는 식 D HX15 HX16 HX17 HX18 W A R W HX19 F HX20 L을 갖는 아미노산 서열 이며, 이때
    HX15는 S, R 및 D로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX16는 S, N, D, T 및 P로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX17는 S 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX18은 S, N, A, I, R, P 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX19는 F 및 Y로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX20은 D 및 Y로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LCDR1은 식 G G LX1 LX2 LX3 G LX4 LX5 L V H를 갖는 아미노산 서열이며, 이때
    LX1은 N, D 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX2는 N, I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX3은 I 및 V로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX4는 S 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX5는 K 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LCDR2는 식 D D G D R P LX6을 갖는 아미노산 서열이며, 이때
    LX6은 S 및 T로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LCDR3은 식 Q V W D T G S LX7 P V LX8을 갖는 아미노산 서열이며, 이때
    LX7은 D 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX8은 V 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 인간 IL-13에 대한 단리된 특이적 결합 구성원.
  63. 제62항에 있어서,
    HX1은 D 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX2는 Y이며,
    HX3은 L이며,
    HX4는 S 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX5는 T 및 A로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX6은 N이며,
    HX7은 N 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX8은 D이며,
    HX9는 N, D 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX10은 G이며,
    HX12는 E 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX13은 Q이며,
    HX19는 F이며,
    LX1은 N 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX2는 N, Y, T, S, 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX6은 S이며,
    LX7은 D인 단리된 특이적 결합 구성원.
  64. 제62항에 있어서,
    HX1은 N 및 D로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX2는 Y이며,
    HX3은 L이며,
    HX4는 S 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX5는 A 및 T로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX6는 N이며,
    HX7은 N이며,
    HX8은 D 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX9는 I, S, N 및 D로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX11은 Q이며,
    HX12는 E 및 K이며,
    HX14는 G이며,
    HX15는 S이며,
    HX16은 S 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX17은 S이며,
    HX18은 S 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX19는 F이며,
    HX20은 D이며,
    LX1은 N 및 D로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX3은 I이며,
    LX8은 V인 것인, 단리된 특이적 결합 구성원.
  65. 제62항에 있어서,
    HX7은 N, S, T, D, G 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX8은 D, T, E, Q, L, Y, N, V, A, M으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX9는 N, I, L, Q, S, M 및 H로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX10은 G이며,
    HX11은 Q이며,
    HX12는 F이며,
    HX13은 Q이며,
    HX14는 G이며,
    HX15는 S이며,
    HX16은 N 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX17은 S이며,
    HX18은 N 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX19는 F이며,
    HX20은 D이며,
    LX1은 N이며,
    LX2는 N 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    LX3은 I이며,
    LX4는 S이며,
    LX5는 K이며,
    LX6는 S이며,
    LX7은 D이며,
    LX8은 V인 것인, 단리된 특이적 결합 구성원.
  66. 제65항에 있어서,
    HX1은 N, Q 및 D로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX3은 L, V 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX4는 S, N, A 및 R로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX5는 A, D, T, G, N 및 Y로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX6은 N, A, P, S, D 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX7은 N, T, D 및 G로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX8은 D, Q, Y 및 N으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    HX9는 N, Q, S 및 I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 특이적 결합 구성원.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-13을 중화하는 것인 특이적 결합 구성원.
  68. 제67항에 있어서, 특이적 결합 구성원의 성능 및 항원-결합 부위의 성능이 동일한 조건하에서 결정시 특이적 결합 구성원이, BAK502G9 VH 도메인(서열 번호 15)와 BAK502G9 VL 도메인(서열 번호 16)에 의해 형성된 IL-13 항원-결합 부위의 성능과 동등하거나 더 나은 성능으로 인간 IL-13을 중화하는 것인, 특이적 결합 구성원.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 항체 분자를 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  70. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  71. 제70항에 있어서, 전체 항체를 포함하는 것인 특이적 결합 구성원.
  72. 제71항에 있어서, 전체 항체는 IgG4인 것인 특이적 결합 구성원.
  73. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 130의 아르기닌이 글루타민으로 치환된 인간 IL-13 변이체에 결합하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  74. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 영장류 IL-13에 결합하는 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  75. 제74항에 있어서, 비인간 영장류 IL-13이 레서스 또는 사이노몰거스인 것인 단리된 특이적 결합 구성원.
  76. 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원의 단리된 항체 VH 도메인.
  77. 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원의 단리된 항체 VL 도메인.
  78. 제62항 내지 제77항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원, 항체 VH 도메인 또는 항체 VL 도메인 및 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 것인 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 약학적 허용 부형제, 비히클 또는 담체를 포함하는 것인 조성물.
  80. 제62항 내지 제77항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원 또는 특이적 결합 구성원의 항체 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  81. 제80항의 핵산으로 시험관내 형질전환된 숙주 세포.
  82. 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 도메인의 생산을 위한 조건하에서 제81항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 도메인을 생산하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 단리 및/또는 정제하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 특이적 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 조제하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원을 IL-13 또는 IL-13의 단편에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  86. 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항의 IL-13에 결합하는 특이적 결합 구성원을 인간 IL-13 또는 인간 IL-13의 단편에 결합시키는 것을 포함하는 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 결합이 시험관내에서 일어나는 것인 방법.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 또는 IL-13의 단편에의 특이적 결합 구성원의 결합의 양을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  89. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 특이적 결합 구성원의 사용을 추가로 포함하는 것인 방법.
  90. 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원의 용도.
  91. 천식, 아토피성 피부병, 알레르기비염, 섬유증, 염증성 장 질병 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 질환의 치료 방법으로서, 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성원을 상기 질병 또는 질환을 가진 환자 또는 상기 질병 또는 질환을 일으킬 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
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