JP2016047843A - Il−13に対するヒト抗体分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特異的結合メンバー、特にヒト抗IL-13抗体分子、及び特にIL-13活性を中和するものを提供することによる。
【選択図】なし
Description
本発明は、IL-13の結合と中和において特に価値のある抗体分子と、本明細書の及び支持する技術文献中に記載される種々の治療のいずれかにおいて有用な抗体分子とを提供する。
HCDR1中の31: Q、D、L、G、E
HCDR1中の32: T
HCDR1中の34: V、I、F
HCDR2中の52: D、N、A、R、G、E
HCDR2中の52A: D、G、T、P、N、Y
HCDR2中の53: D、L、A、P、T、S、I、R
HCDR2中の54: S、T、D、G、K、I
HCDR2中の56: T、E、Q、L、Y、N、V、A、M、G
HCDR2中の58: I、L、Q、S、M、H、D、K
HCDR2中の60: R
HCDR2中の61: R
HCDR2中の62: K、G
HCDR2中の64: R
HCDR2中の65: K
HCDR3中の96: R、D
HCDR3中の97: N、D、T、P
HCDR3中の98: R
HCDR3中の99: S、A、I、R、P、K
HCDR3中の101: Y
LCDR1中の26: D、S
LCDR1中の27: I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H、G
LCDR1中の28: V
LCDR1中の30: G
LCDR1中の31: R
LCDR2中の56: T
LCDR3中の95A: N
LCDR3中の97: I
に従って、BAK278D6のCDRセット内の上記残基の1つ又は2つでなされる:
抗IL-13 scFvの単離
scFv抗体レパートリー
20人のドナーの脾臓リンパ球から得られ、ファジミドベクターにクローン化した大きな1本鎖Fv(scFv)ヒト抗体ライブラリーを、選択に使用した[66]。
基本的に[67]に記載されるとおりに、組換え細菌由来のヒト又はネズミIL-13(Peprotech)についての一連の繰り返し選択サイクルによりファージディスプレイライブラリーからIL-13を認識するscFvを単離した。簡単に説明すると、ライブラリーを用いてインキュベーション後、常磁性ビーズにあらかじめ結合させた固定化抗原と結合ファージとを磁性分離により回収し、非結合ファージを洗い流した。次に結合ファージをVaughanら[67]が記載したように回収し、選択プロセスを繰り返した。異なる固体表面及び捕捉法を、異なるラウンドの選択で使用して非特異結合を低下させた。抗原をビーズ(ダイナビーズ(Dynabeads)M-270カルボン酸)に共有結合させたか、又は製造業者(ダイナル(Dynal))のプロトコールに従ってビオチン化により修飾し、その後ストレプトアビジン被覆ビーズ(ダイナビーズ(Dynabeads)M-280)により2次捕捉した。Vaughanら[67]とOsbournら[70]が記載したように、選択ラウンドの出力からのクローンの代表的な一部をDNA配列決定した。IL-13依存性細胞増殖アッセイにおいて、IL-13を精製scFv調製物として中和する能力について、固有クローンを評価した。
IL-13依存性TF-1細胞増殖アッセイにおける抗IL-13 scFvの中和力価
ヒト及びネズミIL-13生物活性に対する精製scFv調製物の中和力価を、TF-1細胞増殖アッセイを使用して評価した。精製scFv調製物は、WO01/66754の実施例3に記載のように調製した。精製scFv調製物のタンパク質濃度は、BCA法(ピアス(Pierce))を使用して測定した。TF-1は、赤白血病患者から樹立したヒト前骨髄性細胞株である[68]。TF-1細胞株は生存と増殖について因子依存性である。この点でTF-1細胞はヒト又はネズミIL-13に応答し[69]、ヒトGM-CSF(4ng/ml、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems))を含有する培地中で維持された。IL-13依存性増殖の阻害は、分裂細胞の新たに合成されたDNA中へのトリチウム化チミジンの取り込みの低下を測定することにより決定された。
TF-1細胞を、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、5%胎児牛血清(ジェイアールエィチ(JRH))と1%ピルビン酸ナトリウム(シグマ(Sigma))とを含有するグルタマックス(GLUTAMAX)I(インビトロゲン(Invitrogen))を有するRPMI1640を含んだ。各アッセイの前に、300×gで5分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞をアッセイ培地に再懸濁した。この操作を、1mlのアッセイ培地中105細胞の最終濃度で再懸濁された細胞を用いて2回繰り返した。抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL-13に無関係の抗体を陰性対照として使用した。組換細菌由来のヒト又はネズミIL-13(Peprotech)を、96ウェルアッセイプレート中で100μl/ウェルの総量中の適切な試験抗体と混合した時50ng/mlの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用したIL-13の濃度を、最終アッセイ濃度で約80%の最大増殖応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で30分間インキュベートした。次に100μlの再懸濁細胞を各アッセイ点に加えて、総アッセイ容量200μl/ウェルを得た。アッセイプレートを37℃で5% CO2下で72時間インキュベートした。次に25μlのトリチウム化チミジン(10μCi/ml、NEN)を各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに4時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート(パーキンエルマー(Perkin Elmer))上で採取した。パッカードトップカウント(Packard TopCount)マイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
ヒトとネズミ抗原との交互の選択サイクルにもかかわらず、交差反応性の中和抗体は得られなかった。選択により、2つの明確な抗ヒト及び1つの抗ネズミIL-13中和scFvが得られた。BAK278D6(VH 配列番号13;VL 配列番号14)とBAK167A11(VH 配列番号23;VL 配列番号24)はヒトIL-13を認識し、BAK209B11(VH 配列番号25;VL 配列番号26)はネズミIL-13を認識した。scFvとしてのBAK278D6(図2)とBAK167A11(図1)は、それぞれ44nMと111nMのIC50で、25ng/mlヒトIL-13を中和した。scFvとしてのBAK209B11(図3)は、185nMのIC50で25ng/mlネズミIL-13を中和した。
IL-13依存性TF-1細胞増殖アッセイにおける親クローンの重鎖CDR3の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
Osbournら[70]は、重鎖CDR3中の残基の標的化突然変異誘発が、抗体の親和性を顕著に改善することを証明した。scFvレパートリーについて選択は実施例1に記載のように行い、ここでBAK278D6(配列番号6)とBAK167A11(配列番号57)の重鎖CDR3内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例2に記載のようにDNA配列決定とTF-1細胞増殖アッセイにおけるscFvとして測定した中和力価により同定した。
両方の系統で力価の大きな上昇が達成された。BAK167A11系統からの最も高力価のクローンはBAK615E3、BAK612B5、及びBAK582F7であり、これらはTF-1細胞増殖アッセイにおいて25ng/mlのヒトIL-13に対して、scFvとしてそれぞれ3nM(図1)、6.6nM、6.65nMのIC50を有した。BAK278D6系統では、最も高力価のクローンはBAK502G9であり、これはTF-1細胞増殖アッセイにおいてscFvとして25ng/mlのヒトIL-13に対して8nMのIC50を有した(図2)。
TF-1因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息と関連する非ヒト霊長類IL-13とIL-13変種に対するBAK167A11とBAK278D6系統の中和力価
BAK167A11とBAK278D6ヒトIL-13中和系統のいずれも、ネズミ交差反応性はなかった。従って本発明者は、さらなる最適化と臨床的進展のために選択した系統について以下の基準を決定した:好ましくは非ヒト霊長類IL-13と交差反応性であること、IL-13の変種を認識すること(当該変種では、アミノ酸位置130のアルギニンがグルタミンにより置換されている(Q130R))。この変種は、遺伝的に喘息と他のアレルギー性疾患に関連している[37,38,41,71]。交差反応性は、表面プラズモン共鳴(ビアコア(BIAcore))分析により、精製scFv調製物が非ヒト霊長類IL-13とIL-13変種とに結合する能力により測定した。機能活性は、TF-1細胞増殖アッセイを使用して測定した。
野生型ヒトIL-13のcDNAをインビトロゲン(Invitrogen)から得て、部位特異的突然変異誘発(ストラタジーン(Stratagene)クイックチェンジ(Quikchange)(商標)キット)により修飾して、変種IL-13をコードするcDNAを得た。アカゲザル(rhesus monkey)とカニクイザル(cynomolgus monkey)IL-13のコード配列を、ヒトIL-13配列に基づく縮重プライマーを使用してゲノムDNA鋳型のPCRにより得た。非ヒト霊長類(アカゲザルとカニクイザル)配列は互いに同じであるが、ヒトIL-13とは7つのアミノ酸が異なった(図19)。次に、バキュロウイルス発現系(インビトロゲン(Invitrogen))を使用して、組換え野生型、変種、及び非ヒト霊長類IL-13を発現させた。発現構築体は、発現されたタンパク質にカルボキシル末端親和性タグを付与し、これは昆虫細胞調整培地からほぼ均一になるまで精製することを可能にした。
非ヒト霊長類、変種及び野生型IL-13に対する精製scFv調製物の結合親和性を、Karlssonら[72]が記載したようにビアコア(BIAcore)2000バイオセンサー(ビアコアエービー(BIAcore AB))を使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約200Ruの表面密度で、アミンカップリングキット(ビアコア(BIAcore))を使用してIL-13をCM5センサーチップに結合させ、そして試験scFvの3の濃度(約350nM、175nM、及び88nM)を含むHHBS-EP緩衝液をセンサーチプ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをビーアイエー(BIA)評価3.1ソフトウェアを使用して評価して、相対結合データを得た。
このアッセイは以下の修飾を加えて基本的に実施例2に記載されたように行った:非ヒト霊長類IL-13、ヒト変種IL-13(Q130R)、及び野生型ヒトIL-13を、それぞれ50ng/ml、25ng/ml、及び25ng/mlの濃度で使用した。
ビアコア(BIAcore)結合アッセイデータは、BAK167A11系統ではなくBAK278D6が、さらなる治療薬開発に必要な交差反応性プロフィールを有することを示唆した(表2)。この知見は、BAK278D6(図4)とBAK502G9(図6)がTF-1細胞増殖アッセイでほぼ同等の力価でヒトIL-13、ヒトIL-13(Q130R)変種、及び非ヒト霊長類IL-13を中和できることを示すバイオアッセイデータにより支持された。これに対して、BAK615E3(VH 配列番号33;VL 配列番号34)は、TF-1細胞増殖アッセイにおいて、その親BAK167A11(VH 配列番号23;VL 配列番号24)に対するヒトIL-13に対して有意に高い力価を有した(図1)が、いずれのクローンもビアコア(BIAcore)結合アッセイで非ヒト霊長類又は変種IL-13に結合しなかった。
得られたBAK278D6 VH(配列番号13)とVL(配列番号14)のアミノ酸配列を、VBASEデータ[73]中の既知のヒト生殖細胞系列の配列と配列比較し、配列類似性により最も近い生殖細胞系列を同定した。BAK278D6のVHドメイン(配列番号14)及びその誘導体に最も近い生殖細胞系列は、VH1ファミリーメンバーであるDP14として同定された。BAK278D6 VHは、DP14生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で、9つの変化を有する。BAK278D6のVLの最も近い生殖細胞系列は、Vλ3 3hとして同定された。BAK278D6 VLドメイン(配列番号14)は、生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で5つの変化を有する。BAK278D6とその誘導体のフレームワーク領域を部位特異的突然変異誘発(ストラタジーン(Stratagene)クイックチェンジ(Quikchange)キット)により生殖細胞系列に戻して、未変性のヒト抗体と完全に一致させた。
ヒトIL-13依存性TF-1細胞増殖アッセイにおけるBAK502G9の重鎖CDR1と重鎖CDR2配列の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
BAK502G9配列を使用して鋳型として生殖細胞系列化フレームワーク領域を用いて、第2相の最適化を行った。選択は基本的に実施例1に記載のように行い、ここでBAK502G9の重鎖CDR1又は重鎖CDR2内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例2に記載のようにDNA配列決定とTF-1細胞増殖アッセイにおいて精製scFv調製物として測定した中和力価により同定した。Persicら(1997 Gene 187:9-18)が記載した方法を若干改変して、全ヒトIgG4抗体としての再発現を可能にするために、最も高力価のscFvクローンにベクターを構築した。ベクター中にoriP断片を含めて、HEK-EBNA 293細胞との使用を容易にし、エピソーム複製を可能にした。VH可変ドメインを、発現ベクターpEU8.1(+)の分泌リーダー配列とヒトガンマ4定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローニングした。VL可変ドメインを、発現ベクターpEU4.1(-)の分泌リーダー配列とヒトラムダ定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローン化した。
図5に示すように、市販の抗体B-B13(マウスIgG1-ユーロクローン5(Euroclone5))は、ヒトIL-13に対して市販のJES10-5A2(ラットIgG1-バイオソース(Biosource))より有意に高力価であることが示された(それぞれIC50は1021pMと471pMである)。BAK502G9由来(従って「BAK502G9系統」)の8つのクローン、すなわちBAK1111D10、BAK1166G02、BAK1167F02、BAK1167F04、BAK1183H4、BAK1184C8、BAK1185E1、BAK1185F8(ここで、重鎖CDR1又はCDR2が標的されている)は、scFvとして市販の抗体に対して改善された力価を示した。これらの改善は、全抗体ヒトIgG4に変換された際に維持された。これらのVH及びVLドメインは、それぞれ及びこれらの請求項に係る物の各ペアにおいて、本発明の態様又は実施態様を表し、それは、これらの1以上を含むIL-13に対する特異的結合メンバー、BAK502G9系統クローンからの1つ以上のCDRを含む特異的結合メンバー、好ましくはBAK502G9系統のHCDRセットを含むVHドメイン、及び/又はBAK502G9系統のLCDRセットを含むVLドメインと同様である。これらは、本明細書に開示のように本発明の任意のかつすべての態様で使用されうる。全抗体(IgG4)としてのBAK502G9の誘導体は、244pM〜283pMの範囲のIC50を有した。全抗体IgG4としてのBAK502G9は、384pMのIC50を有した。要約すると、BAK502G9の重鎖CDR1(配列番号7)又はCDR2(配列番号8)を標的化することにより、力価の大きな改善が得られるであろう。ANOVA後にダネット(Dunnett’s)後検定解析(インスタット(InStat)ソフトウェア)により、B-B13に対する統計的比較を行った。
BAK278D6系統由来の選択された抗ヒト抗体をさらに特徴解析して、その特異性を測定した。これらには、BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)とその誘導体であるBAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)及びBAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)があり、これらは、BAK502G9のそれぞれ重鎖CDR1と重鎖CDR2に対する修飾を有するクローンの代表例である。
TF-1因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息に関連する非ヒト霊長類IL-13とIL-13変種に対するBAK502G9の重鎖CDR1と重鎖CDR2の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
抗ヒトIL-13抗体の交差反応性を、実施例4に記載のように非ヒト霊長類IL-13及びIL-13変種介在TF-1細胞増殖を阻害する能力により測定した。
最適化した抗ヒトIL-13抗体BAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)とBAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)は、その親BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)の特異性を維持した(図6)。野生型IL-13に対する力価の上昇は、実質的に同等の力価で非ヒト霊長類IL-13及びIL-13変種を中和する能力に反映された。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL-13に対するBAK502G9のIC50は、それぞれ1.4nM、1.9nM、及び2.0nMであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL-13に対するBAK1167F2のIC50は、それぞれ1.0nM、1.1nM、及び1.3nMであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL-13に対するBAK1183H4のIC50は、それぞれ0.9nM、1.0nM、及び1.6nMであった。これらのクローンは治療的用途に適していた。
HDLM-2細胞増殖アッセイにおける未変性のヒトIL-13に対するリード抗ヒトIL-13抗体の中和力価
ヒトIL-13配列は4つのN-グリコシル化部位候補を有する。本発明者は、細菌又はバキュロウイルス発現系で発現される組換えIL-13を中和するBAK278D6とその誘導体の能力を証明した。哺乳動物系で知られている多くのプロセシングイベントは昆虫でも起きる証拠があるが、タンパク質グリコシル化、特にN-グリコシル化において大きな差がある[74]。
HDLM-2細胞をドイツ微生物と細胞培養物保管施設(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、20%胎児牛血清を含有するグルタマックス(Glutamax)I(インビトロゲン)を有するRPMI1640で構成された。各アッセイの前に、細胞を300×gで5分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。この操作を3回繰り返し、細胞を最終的に1mlのアッセイ培地中2×105細胞の最終濃度で再懸濁した。50μlの再懸濁細胞を96ウェルアッセイプレートの各アッセイ点に加えた。抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL-13に反応しない無関係のアアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。ウェル当たり総量50μlの適切な試験抗体を細胞に加え、各アッセイ点は総アッセイ容量100μl/ウェルを与えた。アッセイプレートを37℃で5% CO2下で72時間インキュベートした。次に25μlのトリチウム化チミジン(10μCi/ml、(NEN))を各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに4時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート(パーキンエルマー(Perkin Elmer))上で採取した。パッカードトップカウント(Packard TopCount)マイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
図7に示すように、BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)、及びその誘導体であるBAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)とBAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)は、他のバイオアッセイで観察されたものと同様の相対的力価で、細胞増殖の用量依存性阻害を引き起こすことができた。ヒトIgG4としてのBAK502G9、BAK1183H4、BAK1167F2のIC50は、それぞれ4.6nM、3.5nM、及び1.1nMであった。市販の抗体JES10-5A2とB-B13のIC50は、それぞれ10.7nMと16.7nMであった。
疾患関連初代細胞におけるIL-13依存性応答に対するリード抗ヒトIL-13抗体の中和力価
初代細胞及び気道疾患により関連のある読み出し情報を使用して、2次バイオアッセイを行った。これらは、正常ヒト肺繊維芽細胞(NHLF)からのエオタキシン放出、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の表面上における血管細胞接着分子1(VCAM-1)の上方制御であった。両方のIL-13依存性応答が、喘息症状の特徴である好酸球のリクルート[92]に寄与した。
IL-13は、肺繊維芽細胞からエオタキシン放出を引き起こすことが示されている[77][78][79]。NHLFからの因子依存性エオタキシン放出をELISAにより測定した。
BAK278D6系統クローンは、NHLFからのIL-13依存性エオタキシン放出を阻害することができた。相対的力価は、TF-1細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった(図8)。BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)、BAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)、BAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)は、10ng/mlのヒトIL-13に対してIC50がそれぞれ207pM、118pM、及び69pMであった。市販の抗体であるJES10-5A2とB-B13はIC50がそれぞれ623pMと219pMであった。
IL-13は、HUVECの細胞表面上のVCAM-1の発現を上昇させることが証明されている[80,81]。因子依存性VCAM-1発現を、時間分解蛍光読み出しを使用してVCAM-1受容体細胞発現のアップレギュレーションの検出により測定した。
BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)、BAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)、BAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)の全抗体ヒトIgG4としての典型的なデータを図9に示す。相対的力価はTF-1細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった。BAK502G9、BAK1183H4、及びBAK1167F2のIC50は、10ng/mlのヒトIL-13に対してそれぞれ235pM、58pM、及び55pMであった。
IL-1βとIL-4依存性VCAM-1アップレギュレーションに対する抗IL-13抗体の中和力価 BAK278D6系統のクローンの特異性をHUVECバイオアッセイを修飾して評価した。IL-13とともにIL-4とIL-1βの両方が、HUVECの細胞表面上のVCAM-1の発現をアップレギュレートすることが証明されている[80,81]。
BAK278D6系統からの評価したクローンのいずれも、ヒトIL-1βとIL-4に応答してVCAM-1アップレギュレーションを中和せず、従ってIL-13に対する特異性を示さなかった(図10)。IL-4はIL-13と最も密接に関連し、アミノ酸レベルで30%の配列同一性を共有する[82]。
ネズミIL-13依存性ネズミB9細胞増殖アッセイにおけるヒトIgG4としてのBAK209B11の中和力価
B9細胞は、動物細胞培養物のヨーロッパコレクション(European Collection of Animal Cell culture)(ECACC)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイは以下の変更を加えて基本的に実施例2でTF-1アッセイについて記載したように行った。アッセイ培地は、5%胎児牛血清(ハイクローン(Hyclone))と50μM 2-メルカプトエタノールとを含有するグルタマックスI(インビトロゲン)を含むRPMI1640で構成された。組換え細菌由来のネズミIL-13(ペプロテク)は、ヒトIL-13を最終濃度1ng/mlで置換した。
ヒトIgG4としてのBAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)は、B9アッセイにおいて1ng/mlのネズミIL-13を776pMのIC50で中和した(図11)。従ってBAK209B11は、疾患のネズミモデルにおいてIL-13の役割を研究するための有用な手段である。これは明らかに実施例12で証明され、これは急性肺炎症のネズミモデルでBAK209B11の効力を証明している。
ビアコア分析による抗IL-13抗体の親和性測定
ヒトIgG4としての、BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)、BAK1167F2(VH配列番号35;VL配列番号36)、及びBAK1183H4(VH配列番号37;VL配列番号38)のヒトIL-13に対する親和性とBAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)のネズミIL-13に対する親和性を、基本的に[72]に記載のようにビアコア2000バイオセンサー(ビアコアエービー(BIAcore AB))を使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約500Ruの表面密度で、アミン結合キット(ビアコア)を使用して、抗体をセンサーチップに結合させ、そしてHBS-EP緩衝液中にIL-13を連続希釈(50nM〜0.78nM)した液を、センサーチップ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをBIA評価3.1ソフトウェアを使用して評価して、動力学データを得た。
BAK502G9、BAK1167F2、及びBAK1183H4のIgG4は、それぞれ178pM、136pM及び81pMのKdの高親和性でヒトIL-13に結合し、細胞に基づいたアッセイにおける相対効力に一致した。BAK209B11はネズミIL-13に5.1nMの親和性で結合した(表3)。
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルにおけるBAK209B11の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル BAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)、つまり抗ネズミIL−13中和ヒトIgG4抗体の効力は、急性アレルギー性肺炎において調べられた。このモデルは、基本的にRiffo-Vasquezら[84]に記載されたように行い、その終点において、気管支肺胞洗浄液(BAL)IL-13の上昇(図12)、肺とBALへの細胞浸潤(図13)、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
メスのBalb/cマウス(チャールズリバー(Charles River)、英国)を抗ネズミIL-13抗体BAK209B11(12、36、119、又は357μgの用量)又はアアイソタイプ一致対照抗体(357μg用量)で処理した。0日と7日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒(アジュバントとして2% Al2O3(レヒドラゲル(Rehydragel))を含有する生理食塩水)中の10μgのオボアルブミン(Ova)の腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。14、15、及び16日目にマウスにオボアルブミンで抗原刺激した。オボアルブミンは、滅菌生理食塩水中に1%(w/v)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、1時間の間隔で分わけた20分間の一連の3回の暴露でデビルビスウルトラネブ(deVilbiss Ultraneb)2000ネブライザー(サンライズメディカル(Sunrise Medical))を使用してエアゾル化した。
感作マウスのオボアルブミン抗原刺激は、非感作であるが抗原刺激した動物よりも、総BAL細胞動員の有意な(p<0.05)上昇を引き起こした。当該リクルートはBAK209B11により用量依存性に阻害された;有意な(p<0.05)阻害は、36μg以上のBAK209B11で見られたが、対照抗体ではみられなかった(図13)。同様の作用が好酸球(図14)と好中球(図15)についてみられ、BAK209B11の最小用量36μgで細胞流入の有意な(p<0.05)阻害が見られた。この阻害は対照抗体では見られなかった。リンパ球は抗原刺激された際に、感作マウスでは誘導されたが、非感作マウスでは誘導されなかった。この誘導はBAK209B11により用量依存性に阻害され、36μgのBAK209B11により最大の阻害が見られた。対照抗体は何の作用もなかった(図16)。非感作動物と比較した時、感作動物では単球/マクロファージは誘導されなかったが、バックグランドレベルは36μg以上のBAK209B11により抑制され、対照抗体では抑制されなかった(図17)。血清IgEレベルは、抗原刺激後の非感作動物と比較すると感作動物では有意に上昇した(p<0.05)。この上昇は、36μgのBAK209B11を用いる処理後に低下したが、対照抗体によっては低下しなかった。
急性肺炎症のロイド(Lloyd)ネズミモデルにおけるBAK209B11の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル ネズミIL-13中和抗体であるBAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第2のネズミモデルで研究した。このモデルは、基本的にMcMillanら[85]が記載したように行い、その終点でBAL及び肺組織IL-13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
メスのBalb/Cマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミIL-13抗体BAK209B11又はアイソタイプ一致対照抗体を以下のように投与した。0日と12日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒(アジュバント[実施例12に記載のように計算される]として2mgのAl(OH)3を含有する生理食塩水)中10μgのオボアルブミン(Ova)の腹腔内注射により感作(SN)した。別の対照群の非感作マウス(NS)には、等量の溶媒を投与した。19、20、21、22、23、及び24日目にマウスにオボアルブミンを20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5%(w/v)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。18、19、20、21、22、23、及び24日目にマウスに種々の腹腔内用量(237μg、23.7μg、又は2.37μg;図21でH、M、及びLとして示す)の抗ネズミIL-13抗体であるBAK209B11 muIgG1又はアイソタイプ一致対照抗体(237μg)を投与した。0日と25日目にメタコリン抗原刺激を増加し、意識下体積変動(conscious plethysmography)(ブクスコ(Buxco))を追跡して、気道機能を評価した。個々のマウスについて0日と25日目にメタコリン用量応答曲線の4パラメータ非固定カーブフィッティングから、PC50(ベースラインPenHを50%上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を推定した。
0日(処理前)と25日(抗原刺激後)に個々の動物の肺機能を評価し、PC50値(ベースラインPenHを50%上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を計算して定量した(図21A)。個々の気道過剰応答(AHR)を、25日目のlog PC50の0日からの変化(log 25日PC50-log 0日PC50)により測定した。このlog PC50の変化量は試験の1次終点であった;PC50データは終点ANOVAの必要性のためにlog変換した。個々の変化を群内で平均して、群平均のlog PC50の変化量を得た(図21Bに示す)。
急性肺炎症のゲラード(Gerad)ネズミモデルにおけるBAK209B11の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル 抗ネズミIL-13中和ヒトIgG4抗体であるBAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第3のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にHumblesら[86]が記載したように行い、その終点でBAL及び肺組織IL-13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
メスのBalb/Cマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミIL-13抗体 BAK209B11 又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。0、7、及び14日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒(アジュバント[実施例12に記載のように計算される]として1.125mgのAl(OH)3を含有する生理食塩水)中10μgのオボアルブミン(Ova)の腹腔内注射により感作(SN)した。別の対照群の非感作マウス(NS)には、等量の溶媒を投与した。21、22、23、及び24日目にマウスにオボアルブミンを20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5%(w/v)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。
肺炎症のロイド(Lloyd)慢性モデルにおけるBAK209B11の効力
慢性アレルギー性肺炎症のネズミモデル 抗ネズミIL-13中和ヒトIgG4抗体であるBAK209B11(VH配列番号25;VL配列番号26)の効果を、慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら[87]が記載したように行い、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
メスのBalb/Cマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミIL-13抗体BAK209B11又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。0、及び11日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒(アジュバント[実施例12に記載のように計算される]として2mgのAl(OH)3を含有する生理食塩水)中10μgのオボアルブミン(Ova)の腹腔内注射により感作(SN)した。別の対照群の非感作マウス(NS)には、等量の溶媒を投与した。18、19、20、21、22、23、28、30、32、35、37、39、42、44、46、49、及び51日目にマウスをオボアルブミンで20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5%(w/v)に希釈した後、噴霧した。全ての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。
ネズミ空気嚢(air pouch)モデルに投与した外来性ヒトIL-13に対する抗ヒトIL-13抗体の効力
ヒトIL-13の炎症促進作用に対する抗ヒトIL-13抗体の効果を、基本的なネズミモデルで調べた。このモデルは基本的にEdwardsら[93]が記載したように行い、その終点で空気嚢への細胞浸潤により解析した。
0日目に2.5mlの無菌空気を皮下注射して、メスのBalb/cマウスの背中に空気嚢を作成した。3日目にさらに2.5mlの無菌空気を用いて空気嚢を再度膨らませた。6日目に0.75% CMC中の2μgのhuIL-13を直接嚢内に注入した。24時間後マウスを屠殺し、空気嚢を1mlのヘパリン化食塩水で洗浄した。抗体処理は、(嚢内で)huIL-13を用いて又は全身で行った。
溶媒(生理食塩水中0.75%のカルボキシメチルセルロース(CMC)、腹腔内)処理マウスに対して抗原刺激後24時間では、空気嚢に注射(腹腔内)したヒトIL-13は総白血球(p<0.01)と好酸球(p<0.01)の浸潤の有意な上昇を引き起こした。
肺アレルギー性炎症モデルにおける抗ヒトIL-13抗体の効力を評価するためのヒトIL-13ノックイン/ネズミIL-13ノックアウトトランスジェニックマウスの作成
本発明者は、遺伝子ターゲティングにより、ネズミではなくヒトIL-13を発現するマウスを作成した。マウスIL-13遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでヒトIL-13遺伝子の関連部分で置換されている。このマウス種は、内因性IL-13プロモーターとIL-13 pAテイルが変化していないため、野生型マウスと同じ刺激に応答してマウスIL-13ではなくヒトIL-13を発現する。ヒトIL-13はマウスIL-13受容体に結合しこれを介してシグナル伝達して、マウスIL-13受容体に結合するマウスIL-13により引き起こされるシグナル伝達と同じ生理学的結果を生成できることが証明されている。例えば外因性ヒトIL-13は、ネズミ空気嚢への炎症性細胞のリクルートを引き起こした(図18)。これらのトランスジェニック動物は、樹立された疾患のネズミモデルで非ネズミ交差反応性抗ヒトIL-13抗体を評価することを可能にする。
急性肺炎症におけるhuIL-13トランスジェニックロイドネズミモデルにおける抗ヒトIL-13抗体の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル 抗ヒトIL-13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にMcMillanら[85]が記載したようにかつ実施例13に記載したように行った。このモデルは、その終点でBAL及び肺組織IL-13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
このモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL-13抗体を投与した以外は実施例13と同じである。
抗ヒトIL-13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症の別のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にHumblesら[86]が記載したようにかつ実施例14に記載したように行った。このモデルは、その終点でBAL及び肺組織IL-13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
このモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL-13抗体を投与した以外は実施例14と同じである。
肺炎症におけるhuIL-13トランスジェニックロイド(Lloyd)ネズミモデルにおける抗ヒトIL-13抗体の効力
抗ヒトIL-13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら[87]が記載したようにかつ実施例15に記載したように行った。このモデルは、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答(AHR)により解析される。
このモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL-13抗体を投与した以外は実施例15と同じである。
アスカリス・スウム(Ascaris.suum)アレルギー性カニクイザル(cynomolgus monkey)における抗ヒトIL-13抗体の薬物動態と薬力学
502G9の薬物動態と薬力学を、10mg/kgの単回静脈内大量投与後の4匹のアレルギー性であるが非抗原刺激カニクイザル(cynomolgus)霊長類(オス2匹/メス2匹)で評価した。実験は29日間行った。血清-薬剤濃度曲線の幾何平均から抗体の薬物動態パラメータを決定し、これを以下の表4に示す。 同じ試験で、ヒトIgE ELISAキット(ベチルラボラトリーズ(Bethyl Laboratories)、米国)を使用して血清IgE濃度も追跡した。
血清IgE濃度はBAK502G9の10mg/kgの単回静脈内大量投与後に、100%対照レベル(投与前)から、投与の4日間後と5日間後に対照値の66±10%まで有意に低下した(p<0.05)。血清IgE濃度の低下は、22日目までに対照レベルの88±8%まで回復した(図20を参照)。再度これらのデータは、各動物の血清IgE濃度を投与前レベルに対して標準化(投与前濃度を100%とする)し、次に試験した4匹の動物からの曲線を平均して得られた。
皮膚アレルギーのカニクイザル(cynomolgus monkey)モデルにおける抗ヒIL-13抗体の効力
抗ヒトIL-13中和ヒトIgG4抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、ヒトIL-13とアスカリス・スウム抗原とをカニクイザル(cynomolgus monkey)に皮内注射することにより行った。24〜96時間後、皮膚生検試料と血清試料とを取った。このモデルを、その終点で皮膚への細胞浸潤により解析した。
肺アレルギーのカニクイザル(cynomolgus)モデルにおける抗ヒトIL-13抗体の効力
抗ヒトIL-13中和ヒトIgG4抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、アスカリス・スウム(A. suum)アレルギー性カニクイザル(cynomolgus monkey)霊長類に霧状にしたアスカリス・スウム(A. suum)抗原を暴露し、こうしてアレルギー反応を生成させることにより行った。このアレルギーは、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。
RL AUCにより測定すると、BAK502G9はAHRを有意に阻害した(p<0.05)(図26A;表7)。PC30により測定するとAHRに対するBAK502G9の阻害作用が観察されたが、統計的有意性には達しなかった(図26B;表7)。BAK502G9はまた、抗原プライミング(p<0.01)(図26C;表7)とBAL炎症とを有意に阻害した。BAK502G9は、BALへの総細胞(p<0.01)と好酸球(p<0.05)流入とを有意に阻害したが、マクロファージ、リンパ球又は肥満細胞の流入は阻害しなかった(図26D;表7)。
ヒトIL-13をマウス肺に投与する際に、発症する喘息症状に対する抗ヒトIL-13抗体の効力 気道過剰応答のネズミモデル
マウス肺へのヒトIL-13の投与後の気道過剰応答(AHR)の発症に対する抗ヒトIL-13中和抗体BAK502G9の効力を調べた。このモデルは、ネズミIL-13の代わりにヒトIL-13を使用した以外は基本的にYangら[119]により記載されたように行った。
症状を出現させるために、48時間の間隔でオスのBalb/cマウスを2用量のヒトIL-13に暴露した。簡単に説明するとマウスを、100μlのサファン(saffan)溶液(水で1:4希釈)の静脈内注射により麻酔した。マウスに22ゲージのカテーテル針を挿管し、ここからヒト組換えIL-13(20μlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に溶解した25μg)又は溶媒対照(PBS)を点滴注入した。IL-13の最後の投与の24時間後にメタコリン抗原刺激を上昇させて、意識下プレスチモグラフィー(ブクスコ(Buxco))を追跡して、気道機能を評価した。メタコリン用量応答曲線の4パラメータ非固定曲線適合から、PC200(ベースラインPenHを200%上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を測定した。各IL-13投与の24時間前に、腹腔内注射により抗体処理を行った。
投薬経験の無い野生型マウスへヒトIL-13を気管内注入することは、PC200メタコリン濃度により測定すると、対照動物に対して有意な(p<0.05)気道過剰応答がもたらされた。全身に投与されたBAK502G9(1mg/kg)はAHRの出現を有意に(p<0.01)阻害し、一方ゼロ対照抗体は何の作用もなかった(図23)。
ヒトB細胞からのヒトIL-13依存性IgE放出に対するヒトIgG4としてのBAK502G9の中和力価
B細胞スイッチングアッセイプロトコール IL-13は、インビトロでヒトB細胞中のIgE合成を誘導することが証明されている[120]。ヒトB細胞からの因子依存性IgE放出をELISAにより測定した。ヒトIgG4としてのBAK502G9の中和力価を、ヒトB細胞からのIL-13依存性IgE放出に対して評価した。
図24に示すように、BAK502G9(VH配列番号15;VL配列番号16)は、ヒトB細胞によるヒトIL-13依存性IgE産生を阻害することができた。ヒトIgG4としてのBAK502G9は、30ng/mlのヒトIL-13に対して1.8nMのIC50を有した。
初代ヒト気管支平滑筋細胞におけるヒスタミン誘導Ca2+シグナル伝達のIL-13介在強化に対するBAK502G9の効力
IL-13は、気道平滑筋の収縮を直接調節することが示されている[121,122]。細胞内カルシウム動員は平滑筋収縮の必須要件である。最近の研究は平滑筋収縮性を改変するIL-13の能力が、一部は収縮性アゴニスト誘導Ca2+シグナル伝達の調節により仲介されることを証明した[123,124]。
ヒト初代BSMC、平滑筋増殖培地-2(SmGM-2)と平滑筋基礎培地(SmBM)をバイオウィッタカーから得た。BSMCは、販売業者の薦めに従ってSmGM-2中で維持した。BSMCを96ウェルマイクロタイター細胞培養プレートに2×104細胞/ウェルで撒き、24時間付着させ、次に再供給し、さらに24時間インキュベートした。Ca2+シグナル伝達実験の前に、BSMCを最終濃度50ng/mlのIL-13(ペプロテク(Peprotech))で抗体有り又は無しで刺激し、18〜24時間インキュベートした。BAK502G9とイソタイプ一致した無関係の対照モノクローナル抗体CAT-0001を、最終濃度10μg/mlで評価した。ヒスタミン(カルビオケム(Calbiochem))に応答した細胞にCa2+濃度(20μMから力価測定)を、Ca2+感受性色素Fluo-4(モレキュラープローブズ(Molecular Probes))と96ウェル蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)(モレキュラーデバイシーズ(Molecular Devices))を用いる標準方法を使用して測定した。ヒスタミンに応答したCa2+シグナル伝達応答の曲線下の面積(AUC)を、各前処理結合体について測定した。グラフパッドプリズム・ウィンドウズ(登録商標)用バージョン4(GraphPad Software)を使用してデータ解析を行った。
IL-13を用いるBSMCのプレインキュベーションは、ヒスタミンに応答したCa2+シグナル伝達を有意に増強した。IL-13によるBAK502G9のプレインキュベーションはヒスタミンに応答したCa2+シグナル伝達の強化を有意に阻害した(しかしIL-13を用いる無関係の対照抗体(図25A)は阻害しなかった)(図25)。
ヒトIL-13依存性PBMC CD23発現アッセイにおける抗IL-13抗体の中和力価
代表的IL-13抗体の力価をヒトILー13依存性末梢血単核細胞(PBMC)CD23発現アッセイで評価した。CD23の細胞表面発現を上昇させることにより、PBMCはIL-13とIL-4の両方に反応する[120]。CD23(FceRII)はIgEについての低親和性受容体であり、種々の炎症性細胞(単核細胞を含む)で発現される。ヒトIL-13依存性CD23発現アップレギュレーションの阻害を、PBMCへの蛍光標識CD23モノクローナル抗体の結合の低下をフローサイトメトリーにより計測することにより測定した。
輸血サービス(Blood Transfusion Service)からヒト血液を得て、40分間のデキストラン-T500(ファルマシア(Pharmacia))沈降(最終濃度0.6%)により赤血球を取り除いた。次に白血球と血小板リッチな画分を、3mlの64%と5mlの80%(100%は9部のパーコル(Percoll)と1部の10×PBSである)の不連続パーコル勾配上で20分間1137gで遠心することにより分離した。64%層の上部からPBMCを採取し、アッセイ緩衝液(インビトロゲン(Invitrogen)RPMI1640、10% FCS、200IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミン)に再懸濁した。アッセイは、2×106細胞、±80pM組換えヒトIL-13(ペプロテク)又は21pM 組換えヒトIL-4(アールアンドディーシステムズ)、±BAK502G9又は無関係のIgG4を最終容量500mcl中に含有する24ウェルプレート中で行った。細胞を37℃で48時間培養した後採取し、CD23-PE(ビーディーファーミンゲン)で4℃で20分間染色した。最後に、細胞をフローサイトメーター上で読んだ。CD23発現を、CD23「スコア」により測定した;CD23陽性細胞のパーセントに染色の「明るさ」を掛けた(幾何平均蛍光)。刺激物質の無いCD23「スコア」を引き、データをIL-13単独に対する応答(100%)のパーセントとして示した。データは、4〜6人の個々のドナーからの細胞を使用して各点を三重測定で行い、4〜6回の異なる実験から得られた平均±SEMとして表した。
PBMCと80pMのIL-13又は21pMのIL-4との48時間のインキュベーションにより、明らかにCD23が発現された(図27と図28)。BAK502G9は用量依存性にIL-13誘導CD23発現を阻害し、幾何平均は120.2pMであった(図27)。これに対してBAK502G9は、21.4pMのIL-4(個々のドナーからn=4、図28)により誘導されるCD23発現は阻害できなかった。無関係のIgG4は、PBMC上のIL-13又はIL-4依存性CD23発現を阻害しなかった(図27と図28)。80pMのIL-13と21.4pMのIL-4によるPBMCの同時刺激は、付加的CD23発現を引き起こした。BAK502G9(CAT-001ではない)は、CD23発現レベルをIL-4刺激単独で見られるレベルまで低下させた(図28)。
ヒトIL-13依存性好酸球形態変化アッセイにおけるヒトIL-13抗体の中和力価
本試験の目的は、IL-13[125,126]、TNF-α[127]、TGF-β1[128]のような喘息患者の肺に存在する因子で刺激後に、NHLFから放出されるメディエーターにより誘導される好酸球形態変化に対するIL-13抗体の効果を評価することであった。IL-13はTNF-α[129]又はTGF-β1[130]と相乗作用して、エオタキシン-1を産生するように繊維芽細胞を誘導し、次にこれは直接好酸球を化学誘引するように作用することができる。白血球形態変化応答は細胞骨格の再配置により仲介され、微小循環から炎症部位への白血球遊走プロセスに必須である。NHLFによるIL-13依存性形態変化誘導因子放出の阻害は、ELISAによりエオタキシン-1分泌の低下とフローサイトメトリーにより好酸球の形態変化を減少を測定することにより測定した。
NHLF細胞を、培地単独又は刺激物質[9.6nMのIL-13、285.7pMのTNF-α(アールアンドディーシステムズ(R & D Systems))及び160pMのTGF-β1(アールアンドディーシステムズ(R & D Systems))]を含有する培地とともに、BAK502G9(濃度範囲875nM〜6.84nM)の非存在下又は存在下で同時培養した。次に細胞を37℃でさらに48時間培養後、得られた調整培地を吸引し、-80℃で保存した。調整培地中のエオタキシン-1の濃度は、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)ヂュオセット(Duoset)ELISA系(アールアンドディーシステムズ(R & D Systems))を使用して評価した。
NHLF細胞を9.6nMのIL-13、285.7pMのTNF-α及び160pMのTGF-β1で同時刺激し48時間培養すると、9.6nMのエオタキシン-1を培地中に分泌した。これに対して維持培地のみで培養したNHLF細胞は、培地中に0.1nMのエオタキシン-1を分泌したのみである。IL-13/TNF-α/TGF-β1で同時刺激したNHLF細胞エオタキシン-1産生は、BAK502G9によりIC50が32.4nMで用量依存性に阻害された(図29A)ため、このエオタキシン-1産生はIL-13依存性であった。
ヒトIL-13上の抗IL-13抗体のマッピング
代表的なIL-13抗体BAK502G9のエピトープマッピングを、分子的アプローチと標準的ペプチド切断を使用して行った。
ヒトIL-13配列の一部がネズミ配列で置換されたIL-13キメラを作成した。これらのキメラは、特定のエピトープの同定を助けるために代表的IL-13抗体との結合試験で使用した。
BAK502G9への結合について、キメラ構築体IL13-へリックスD(表5)はビオチン化ヒトIL-13に対する最も弱い競合物質であり、IL-13分子内のへリックスDがBAK502G9エピトープ結合に関与していることを示す(表5)。親配列の残基40、41、及び33、34がそれぞれ変化している40、41と33、34変異体について活性の低下が見られ、BAK502G9の認識におけるヘリックスAの関与の可能性を示している。ループ3はヒト分子と比較してこの変異体中のアミノ酸の数が減少しており、タンパク質の全体構造を変化させる可能性があるため、このループの活性低下は無視した。キメラIL-13分子がBAK502G9結合について競合する能力の他の低下は、かかるアミノ酸の変化には重要であると考えられなかった。
またBAK502G9のエピトープマッピングを標準的ペプチド切断法を使用して行った。ここでIgGは固相に固定化され、IL-13リガンドを捕捉するようにされる。形成された複合体は次に、特異的タンパク質分解的消化を受け、この間アクセス可能なペプチド結合が切断されるが、IgG:リガンド界面により防御されるものは無傷のままである。すなわちエピトープを含有するペプチドはIgGに結合する。次にこれが脱着され、採取され、質量スペクトル(ms)により同定される。
この実験シリーズは一貫して、各消化について単一のIL-13特異的ペプチドを与えた。LCQイオン捕捉装置からのデータは、トリプシン断片が3258Da(MH+)のモノアイソトピック質量を有し、キモトリプシン断片が3937Da(MH+)のモノアイソトピック断片を有することを明らかにした。
Claims (91)
- ヒトIL-13に対する単離された特異的結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメイン及びヒト抗体VLドメインから構成され、かつCDRのセット、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体抗原結合部位を含み、ここで当該VHドメインが、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、当該VLドメインがLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該CDRのセットが、以下の:
BAK278D6のCDRのセット、ここでHCDR1は配列番号1のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号3のアミノ酸配列を有し、LCDR1は配列番号4のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を有する;
BAK278D6のCDRのセットと比較して1又は2のアミノ酸置換を含むCDRセット、及び
表1の個々のクローンについて示されるCDRの各セット、
からなる群から選択されるCDRセットからなる、前記メンバー。 - 前記1又は2の置換が、カバトの標準的番号付けを使用して、CDR内の以下の残基:
HCDR1中の31、32、34
HCDR2中の52、52A、53、54、56、58、60、61、62、64、65
HCDR3中の96、97、98、99、101
LCDR1中の26、27、28、30、31
LCDR2中の56
LCDR3中の95A、97
の1又は2の位置にある、請求項1に記載の単離された特異的結合メンバー。 - 前記1又は2の置換が、下記の位置:
置換の位置 以下からなる群から選択される置換残基
HCDR1中の31: Q、D、L、G、及びE
HCDR1中の32: T
HCDR1中の34: V、I、及びF
HCDR2中の52: D、N、A、R、G、及びE
HCDR2中の52A D、G、T、P、N、及びY
HCDR2中の53: D、L、A、P、T、S、I、及びR
HCDR2中の54: S、T、D、G、K、及びI
HCDR2中の56: T、E、Q、L、Y、N、V、A、M、及びG
HCDR2中の58: I、L、Q、S、M、H、D、及びK
HCDR2中の60: R
HCDR2中の61: R
HCDR2中の62: K及びG
HCDR2中の64: R
HCDR2中の65: K
HCDR3中の96: R及びD
HCDR3中の97: N、D、T、及びP
HCDR3中の98: R
HCDR3中の99: S、A、I、R、P、及びK
HCDR3中の101: Y
LCDR1中の26: D、S
LCDR1中の27: I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H、及びG
LCDR1中の28: V
LCDR1中の30: G
LCDR1中の31: R
LCDR2中の56: T
LCDR3中の95A: N
LCDR3中の97: I
で、各位置についての可能な置換残基の同定された群の中からなされる、請求項2に記載の単離された特異的結合メンバー。 - BAK278D6のCDRセットと比較して、HCDR3の残基99とLCDR1の残基27で2の置換が存在する、請求項3に記載の単離された特異的結合メンバー。
- S、A、I、R、P及びKからなる群から選択されるHCDR3の残基99での置換、及び/又は、I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H及びGからなる群から選択されるLCDR1残基27での置換を有する、請求項4に記載の単離された特異的結合メンバー。
- HCDR3の残基99にてNがSに置換され及び/又はLCDR1の残基27にてNがIに置換される前記BAK278D6のCDRセットを含む、請求項4に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 前記VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3が生殖細胞系列フレームワーク内にあり、及び/又はVLドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3が生殖細胞系列フレームワーク内にある、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 前記VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3が生殖細胞系列フレームワークVH1 DP14内にある、請求項7に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 前記VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3が生殖細胞系フレームワークVL vλ3h内にある、請求項7又は請求項8の単離された特異的結合メンバー。
- 130位のアルギニンがグルタミンにより置換されているヒトIL-13変種に結合する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 非ヒト霊長類IL-13に結合する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 前記非ヒト霊長類IL-13が、アカゲザル(rhesus)又はカニクイザル(cynomolgus)である、請求項11に記載の単離された特異的結合メンバー。
- BAK502G9 VHドメイン(配列番号15)を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- BAK502G9 VLドメイン(配列番号16)を含む、請求項8〜13のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- BAK502G9 VHドメイン(配列番号15)とBAK502G9 VLドメイン(配列番号16)により形成されるIL-13抗原結合部位の親和性と同等か又はそれより優れた親和性でIL-13に結合する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーであって、ここで特異的結合メンバーの親和性と抗原結合部位の親和性は同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。
- ヒトIL-13を中和する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- BAK502G9 VHドメイン(配列番号15)とBAK502G9 VLドメイン(配列番号16)により形成されるIL-13抗原結合部位の力価と同等か又はそれより優れた力価でヒトIL-13を中和する、請求項16の特異的結合メンバーであって、ここで当該特異的結合メンバーの力価と当該抗原結合部位の力価は同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。
- scFv抗体分子を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- 抗体定常領域を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- 全抗体を含む、請求項19の特異的結合メンバー。
- 前記全抗体がIgG4である、請求項20の特異的結合メンバー。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VHドメイン。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VLドメイン。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー、抗体VHドメイン又はVLドメインと、少なくとも1つの追加の成分とを含む組成物。
- 医薬として許容される賦形剤、溶媒、又は担体を含む、請求項24の組成物。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー又は特異的結合メンバーの抗体VHドメイン若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 請求項26の核酸でインビトロで形質転換された宿主細胞。
- 請求項27の宿主細胞を、特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生のための条件下で培養することを含む、該特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生方法。
- 特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製することをさらに含む、請求項28の方法。
- 特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に中に調製することをさらに含む、請求項28又は請求項29の方法。
- ヒトIL-13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを産生する方法であって、 HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む親VHドメイン[ここで親VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3はBAK278D6のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号1のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号3のアミノ酸配列を有する)であるか、又はBAK502G9のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号7のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号8のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号9のアミノ酸配列を有する)である]のアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、親VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを提供し、場合によりこうして提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せて1つ以上のVH/VL組合せを得て;そして 親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメイン又はVH/VL組合せを試験して、ヒトIL-13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを同定する、ことを含む、前記方法。
- 前記親VHドメインアミノ酸配列は配列番号13と配列番号15からなる群から選択される、請求項31の方法。
- 前記1以上のVLドメインは、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む親VLドメイン[ここで親VLドメインのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3はBAK278D6のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号4のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を有する)であるか、又はBAK502G9のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号10のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号11のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号12のアミノ酸配列を有する)である]のアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、その各々が親VLドメインのアミノ酸配列変種である1つ以上のVLドメインを産生することにより提供される、請求項31又は請求項32に記載の方法。
- 前記親VLドメインアミノ酸配列が、配列番号14と配列番号16からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- ヒトIL-13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを産生する方法であって、 HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む親VHドメイン[ここで親VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3は、BAK167A11のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号55のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号56のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号57のアミノ酸配列を有する)であるか、BAK615E3のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号153のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号154のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号155のアミノ酸配列を有する)であるか、BAK582F7のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号141のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号142のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号143のアミノ酸配列を有する)であるか、又はBAK612B5のHCDRのセット(ここで、HCDR1は配列番号147のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号148のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号149のアミノ酸配列を有する)である]のアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、親VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを提供し、場合によりこうして提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せて1つ以上のVH/VL組合せを得て;そして
親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメイン又はVH/VL組合せを試験して、ヒトIL-13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを同定する、ことを含む、前記方法。 - 親VHドメインアミノ酸配列は配列番号55と配列番号33からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記1つ以上のVLドメインが、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む親VLドメイン[ここで親VLドメインのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3は、BAK167A11のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号58のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号59のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号60のアミノ酸配列を有する)であるか、BAK615E3のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号156のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号157のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号158のアミノ酸配列を有する)であるか、BAK582F7のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号144のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号145のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号146のアミノ酸配列を有する)であるか、又はBAK612B5のLCDRのセット(ここで、LCDR1は配列番号150のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号151のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号152のアミノ酸配列を有する)である]のアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、その各々が親VLドメインのアミノ酸配列変種である1つ以上のVLドメインを産生することにより提供される、請求項35又は請求項36に記載の方法。
- 前記親VLドメインアミノ酸配列は、配列番号24と配列番号34からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメインアミノ酸配列がCDR突然変異誘発により提供される、請求項31〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメインアミノ酸配列がCDR突然変異誘発により提供される、請求項35〜38のいずれか1項に記載の方法。
- IgG、scFv、又はFab抗体分子内に抗体の抗原結合部位をさらに提供することを含む、請求項31〜40のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトIL-13に結合する特異的結合メンバーを産生する方法であって、
VHドメインをコードする出発核酸又はそれぞれがVHドメインをコードする核酸の出発レパートリー(ここでVHドメインは、置換されるHCDR1、HCDR2、及び/又はHCDR3を含むか、又はHCDR1、HCDR2、及び/又はHCDR3をコードする領域が欠失する)を提供し;
該出発核酸又は出発レパートリーを、HCDR1(配列番号1)又はHCDR1(配列番号7)、HCDR2(配列番号2)又はHCDR2(配列番号8)、及び/又はHCDR3(配列番号3)又はHCDR3(配列番号9)をコードするか又はこの変異により産生されるドナー核酸と組合せて、該ドナー核酸を出発核酸又は出発レパートリー中のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域中に挿入し、そしてVHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し;
該生成物レパートリーの核酸を発現させて生成物VHドメインを産生させ;
場合により、該生成物VHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せ;
ヒトIL-13に特異的な特異的結合メンバーを選択し(該特異的結合メンバーは生成物VHドメインと、場合によりVLドメインとを含む);そして
該特異的結合メンバー又はこれをコードする核酸を回収する、
ことを含む前記方法。 - 前記ドナー核酸は該HCDR1及び/又はHCDR2の変異により産生される、請求項42に記載の方法。
- ドナー核酸はHCDR3の変異により産生される、請求項42に記載の方法。
- HCDR3(配列番号3)又はHCDR3(配列番号9)のアミノ酸配列をコードする核酸の変異によりドナー核酸を提供することを含む、請求項44に記載の方法。
- 核酸のランダム変異により前記ドナー核酸を提供することを含む、請求項42に記載の方法。
- 回収された特異的結合メンバー内に含まれる生成物VHドメインを抗体定常領域に結合させることを含む、請求項42〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 生成物VHドメインとVLドメインとを含むIgG、scFv又はFab抗体を提供することを含む、請求項42〜46のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトIL-13に結合する抗体の抗原結合ドメイン又は特異的結合メンバーを、ヒトIL-13を中和する能力について試験することをさらに含む、請求項31〜48のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトIL-13に結合しかつ中和する抗体断片を含む特異的結合メンバーが得られる、請求項49に記載の方法。
- 前記抗体断片がscFv抗体分子である、請求項50に記載の方法。
- 前記抗体断片がFab抗体分子である、請求項50の方法。
- 全抗体中に抗体断片のVHドメイン及び/又はVLドメインを提供することをさらに含む、請求項51又は請求項52に記載の方法。
- IL-13に結合する特異的結合メンバー、抗体の抗原結合部位、又はIL-13に結合する抗体の抗原結合部位若しくは特異的結合メンバーの抗体のVH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に調製することをさらに含む、請求項31〜53のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトIL-13に結合する特異的結合メンバーをIL-13又はIL-13の断片に結合させることをさらに含む、請求項31〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれか1項に記載のIL-13に結合する特異的結合メンバーを、ヒトIL-13又はヒトIL-13の断片に結合させることを含む方法。
- 前記結合がインビトロで起きる、請求項55又は請求項56の方法。
- IL-13又はIL-13の断片への特異的結合メンバーの結合量を測定することを含む、請求項55〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における前記特異的結合メンバーの使用をさらに含む、請求項31〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における、請求項1〜21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの使用。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療方法であって、請求項1〜21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーを、当該疾患又は障害を有するか又は発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。
- ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインから構成され、そしてCDRのセット、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体の抗原結合ドメイン部位を含む、ヒトIL-13の単離された特異的結合メンバーであって、ここで当該VHドメインはHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、当該VLドメインはLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、
ここでHCDR1は、以下の式:
HX1 HX2 G HX3 S
(式中、
HX1は、N、Q、D、L、G、及びEからなる群から選択され、
HX2は、Y及びTからなる群から選択され、
HX3は、V、I、F、及びLからなる群から選択される)
を有するアミノ酸配列であり、
HCDR2は、以下の式:
W I HX4 HX5 HX6 HX7 G HX8 T HX9 Y HX10 HX11 HX12 F HX13 HX14
(式中、
HX4は、S、D、N、A、R、G、及びEからなる群から選択され、
HX5は、A、D、G、T、P、N、及びYからなる群から選択され、
HX6は、N、D、L、A、P、T、S、I、及びRからなる群から選択され、
HX7は、N、S、T、D、G、K、及びIからなる群から選択され、
HX8は、D、T、E、Q、L、Y、N、V、A、M、及びGからなる群から選択され、
HX9は、N、I、L、Q、S、M、H、D、及びKからなる群から選択され、
HX10は、G及びRからなる群から選択され、
HX11は、Q及びRからなる群から選択され、
HX12は、E、K、及びGからなる群から選択され、
HX13は、Q及びRからなる群から選択され、
HX14は、G及びKからなる群から選択される)
を有するアミノ酸配列であり、
HCDR3は、以下の式:
D HX15 HX16 HX17 HX18 W A R W HX19 F HX20 L
(式中、
HX15は、S、R、及びDからなる群から選択され、
HX16は、S、N、D、T、及びPからなる群から選択され、
HX17は、S及びRからなる群から選択され、
HX18は、S、N、A、I、R、P、及びKからなる群から選択され、
HX19は、F及びYからなる群から選択され、
HX20は、D及びYからなる群から選択される)
を有するアミノ酸配列であり、
LCDR1は、以下の式:
G G LX1 LX2 LX3 G LX4 LX5 L V H
(式中、
LX1は、N、D、及びSからなる群から選択され、
LX2は、N、I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H、及びGからなる群から選択され、
LX3は、I及びVからなる群から選択され、
LX4は、S及びGからなる群から選択され、
LX5は、K及びRからなる群から選択され)
を有するアミノ酸配列であり、
LCDR2は、以下の式:
D D G D R P LX6
(式中、
LX6は、S及びTからなる群から選択される)
を有するアミノ酸配列であり、
LCDR3は、以下の式:
Q V W D T G S LX7 P V LX8
(式中、
LX7は、D及びNからなる群から選択され、
LX8は、V及びIからなる群から選択される)
を有するアミノ酸配列である、前記メンバー。 - HX1は、D及びNからなる群から選択され、
HX2は、Yであり、
HX3は、Lであり、
HX4は、S及びGからなる群から選択され、
HX5は、T及びAからなる群から選択され、
HX6は、Nであり、
HX7は、N及びIからなる群から選択され、
HX8は、でDあり、
HX9は、N、D、及びKからなる群から選択され、
HX10は、Gであり、
HX12は、E及びGからなる群から選択され、
HX13は、Qであり、
HX19は、Fであり、
LX1は、N及びSからなる群から選択され、
LX2は、N、Y、T、S、及びIからなる群から選択され、
LX6はS、であり、
LX7はDである、請求項62の単離された特異的結合メンバー。 - HX1は、N及びDからなる群から選択され、
HX2は、Yであり、
HX3は、Lであり、
HX4は、S及びGからなる群から選択され、
HX5は、A及びTからなる群から選択され、
HX6は、Nであり、
HX7は、Nであり、
HX8は、D及びGからなる群から選択され、
HX9は、I、S、N、及びDからなる群から選択され、
HX11は、Qであり、
HX12は、E及びKであり、
HX14は、Gであり、
HX15は、Sであり、
HX16は、S及びNからなる群から選択され、
HX17は、Sであり、
HX18は、S及びNからなる群から選択され、
HX19は、Fであり、
HX20は、Dであり、
LX1は、N及びDからなる群から選択され、
LX2は、Iであり、
LX8はVである、
請求項62の単離された特異的結合メンバー。 - HX7は、N、S、T、D、G、及びKからなる群から選択され、
HX8は、D、T、E、Q、L、Y、N、V、A、Mからなる群から選択され、
HX9は、N、I、L、Q、S、M、及びHからなる群から選択され、
HX10は、Gであり、
HX11は、Qであり、
HX12は、Fであり、
HX13は、Qであり、
HX14は、Gであり、
HX15は、Sであり、
HX16は、N及びSからなる群から選択され、
HX17は、Sであり、
HX18は、N及びSからなる群から選択され、
HX19は、Fであり、
HX20は、Dであり、
LX1は、Nであり
LX2は、N及びIからなる群から選択され、
LX3は、Iであり、
LX4は、Sであり、
LX5は、Kであり、
LX6は、Sであり、
LX7は、Dであり、そして
LX8は、Vである、
請求項62に記載の単離された特異的結合メンバー。 - HX1は、N、Q、及びDからなる群から選択され、
HX3は、L、V、及びIからなる群から選択され、
HX4は、S、N、A、及びRからなる群から選択され、
HX5は、A、D、T、G、N、及びYからなる群から選択され、
HX6は、N、A、P、S、D、及びIからなる群から選択され、
HX7は、N、T、D、及びGからなる群から選択され、
HX8は、D、Q、Y、及びNからなる群から選択され、
HX9は、N、Q、S、及びIからなる群から選択される、請求項65に記載の単離された特異的結合メンバー。 - ヒトIL-13を中和する、請求項62〜66のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- BAK502G9 VHドメイン(配列番号15)とBAK502G9 VLドメイン(配列番号16)により形成されるIL-13抗原結合部位の力価と同等か又はそれより優れた力価でヒトIL-13を中和する、請求項67の特異的結合メンバーであって、ここで特異的結合メンバーの力価と抗原結合部位の力価が同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。
- scFv抗体分子を含む請求項62〜68のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- 抗体定常領域を含む請求項62〜68のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。
- 全抗体を含む、請求項70に記載の特異的結合メンバー。
- 前記全抗体がIgG4である、請求項71に記載の特異的結合メンバー。
- 130位のアルギニンがグルタミンにより置換されている、ヒトIL-13変種に結合する請求項62〜72のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 非ヒト霊長類IL-13に結合する、請求項62〜72のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 前記非ヒト霊長類IL-13はアカゲザル(rhesus)又はカニクイザル(cynomolgus)である、請求項74に記載の単離された特異的結合メンバー。
- 請求項62〜75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VHドメイン。
- 請求項62〜75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VLドメイン。
- 請求項62〜77のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー、抗体VHドメイン又はVLドメイン、及び少なくとも1つの追加の成分を含む組成物。
- 医薬として許容される賦形剤、溶媒、又は担体を含む、請求項78の組成物。
- 請求項62〜77のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー又は特異的結合メンバーの抗体VHドメイン若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 請求項80に記載の核酸でインビトロにおいて形質転換された宿主細胞。
- 特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生方法であって、請求項81の宿主細胞を前記特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生のための条件下で培養することを含む前記方法。
- 前記特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製することをさらに含む、請求項82に記載の方法。
- 特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に剤形することをさらに含む、請求項82又は請求項83に記載の方法。
- ヒトIL-13に結合する特異的結合メンバーを、IL-13又はIL-13の断片に結合させることをさらに含む、請求項82〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項62〜75のいずれか1項に記載のIL-13に結合する特異的結合メンバーを、ヒトIL-13又はヒトIL-13の断片に結合させることを含む方法。
- 前記結合はインビトロで起きる、請求項85又は請求項86に記載の方法。
- IL-13又はIL-13の断片への特異的結合メンバーの結合量を測定することを含む、請求項85〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における特異的結合メンバーの使用をさらに含む、請求項82〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための医薬の製造における、請求項62〜75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの使用。
- 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療方法であって、請求項62〜75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーを当該疾患又は障害を有するか又は発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。
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