JP4891074B2 - Ｉｌ−１３に対するヒト抗体分子 - Google Patents

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Description

本発明は、特異的結合メンバー、特にヒト抗ＩＬ-１３抗体分子、及び特にＩＬ-１３活性を中和するものに関する。本発明はさらに、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫を含むＩＬ-１３関連疾患の診断又は治療における抗ＩＬ-１３抗体分子の使用法に関する。
本発明の好適な実施態様は、本明細書でＢＡＫ５０２Ｇ９と名付けた抗体分子、並びに本明細書中で定義されるＢＡＫ５０２Ｇ９系統及びＢＡＫ２７８Ｄ６系統の他の抗体分子の抗体ＶＨ及び／又はＶＬドメインを使用する。さらに好適な実施態様は、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統及び好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９の相補性決定領域(ＣＤＲ)、特に他の抗体フレームワーク領域中のＶＨ ＣＤＲ３を使用する。本発明のさらなる態様は、本発明の特異的結合メンバーを含有する組成物、ＩＬ-１３を阻害又は中和する方法(人体若しくは動物体の治療方法を含む)における当該組成物の使用を提供する。
本発明は、ＩＬ-１３の結合と中和において特に価値のある抗体分子と、本明細書の及び支持する技術文献中に記載される種々の治療のいずれかにおいて有用な抗体分子とを提供する。
インターロイキン(ＩＬ)-１３は、１１４アミノ酸のサイトカインであり、約１２ｋＤａの非修飾分子量を有する[1,2]。ＩＬ-１３はＩＬ-４に最も密接に関連し、アミノ酸レベルで３０％の配列類似性を共有する。ヒトＩＬ-１３遺伝子は、ＩＬ-４遺伝子に隣接して染色体５ｑ３１上に位置する[1][2]。染色体５ｑのこの領域は、ＧＭ-ＣＳＦやＩＬ-５を含む他のＴｈ２リンパ球由来のサイトカインの遺伝子配列を含有し、そのレベルは喘息やアレルギー性炎症のげっ歯類モデルにおいて、ＩＬ-４とともに疾患重症度と相関することが証明されている[3][4][5][6][7][8]。
ＩＬ-１３は最初はＴｈ２ ＣＤ４＋リンパ球由来のサイトカインとして同定されたが、ＩＬ-１３はまた、Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔリンパ球ＮＫ細胞、及び非Ｔ細胞集団(例えば、肥満細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージ、単球、及び気道平滑筋細胞)によっても産生される。
ＩＬ-１３は、ＩＬ-４受容体α鎖(ＩＬ-４Ｒα)(これ自体はＩＬ-４に結合するがＩＬ-１３には結合しない)及び少なくとも２つの他の細胞表面タンパク質(ＩＬ-１３Ｒα１とＩＬ-１３Ｒα２)を含む受容体システムを介してその作用を仲介すると報告されている[9][10]。ＩＬ-１３Ｒα１は低親和性でＩＬ-１３に結合することができ、次にＩＬ-４Ｒａを動員して、シグナルを伝達する高親和性機能性受容体を形成する[11][12]。ジーンバンク(ＧｅｎＢａｎｋ)データベースは、ＩＬ-１３Ｒα１のアミノ酸配列と核酸配列をそれぞれＮＰ＿００１５５１とＹ１０６５９として記載する。ＳＴＡＴ６(転写のシグナルトランスデューサーとアクチベーター６)欠損マウスでの研究は、ＩＬ-１３は哺乳類においてＩＬ-４と同様に、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ６経路を利用してシグナル伝達することを証明した[13][14]。ＩＬ-１３Ｒα２はアミノ酸レベルでＩＬ-１３Ｒα１と３７％の配列同一性を共有し、高親和性でＩＬ-１３に結合する[15][16]。しかしＩＬ-１３Ｒα２は、既知のシグナル伝達モチーフが欠如したより短い細胞質テールを有する。ＩＬ-１３Ｒα２を発現する細胞は、ＩＬ-４Ｒαの存在下でもＩＬ-１３に応答しない[17]。従ってＩＬ-１３Ｒα２は、ＩＬ-１３機能を制御するがＩＬ-４機能を制御しないおとり受容体として作用すると考えられている。これは、その表現型がＩＬ-１３に対する応答の上昇に一致するＩＬ-１３Ｒα２欠損マウスでの研究により支持される[18][19]。ジーンバンク(ＧｅｎＢａｎｋ)データベースは、ＩＬ-１３Ｒα２のアミノ酸配列と核酸配列をそれぞれＮＰ＿０００６３１とＹ０８７６８として記載する。
シグナル伝達ＩＬ-１３Ｒα１／ＩＬ-４Ｒα受容体複合体は、ヒトＢ細胞、肥満細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、繊維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞、及び気道平滑筋細胞上で発現される。
気管支喘息は、肺の一般的な持続性炎症疾患であり、気道の高応答性、粘液過剰産生、繊維症、及び血清ＩｇＥ高レベルを特徴とする。気道過剰応答(ＡＨＲ)は、冷気のような非特異的刺激に対する気道の過度の収縮である。ＡＨＲと粘液過剰産生の両方とも、喘息発作の特徴である息切れ(悪化)を引き起こす気道閉塞の原因であると考えられ、これは、この疾患による死亡率(英国では年間約２０００の死亡例)の原因である。
近年、喘息の発症率は他のアレルギー性疾患とともに顕著に増加している[20][21]。例えば現在英国の人口の約１０％は喘息持ちであると診断されている。
現代英国胸部学会(Current British Thoracic Society)(ＢＴＳ)と喘息に関する国際治療指針(Global Initiative for Asthma)(ＧＩＮＡ)ガイドラインは、喘息の治療に対する段階的アプローチを示唆している[22,23]。弱〜中程度の喘息は通常、吸入コルチコステロイドをベータアゴニスト又はロイコトリエンインヒビターと組合せて使用することにより制御することができる。しかしコルチコステロイドの記載された副作用のために、患者は治療を守らない傾向があり、これが治療の有効性を低下させている[24-26]。
喘息ガイドラインの推奨する高用量の吸入又は経口コルチコステロイドがあまり有効ではないより重症の疾患を有する被験体についての、新しい治療法に対する明らかなニーズが存在する。経口コルチコステロイドを用いる長期の治療は、骨粗鬆症、小児の成長の遅れ、糖尿病、及び経口カンジダ症を引き起こす[88]。コルチコステロイドの有益な作用及び有害な作用とも同じ受容体により仲介されるため、治療は安全性と有効性のバランスとなる。重症の悪化の結果としてのこれらの患者の入院(英国の喘息人口の約６％である)は、医療当局に対する喘息の大きな経済的負担の大半を占める[89]。
喘息の病態は、無害な抗原に対する免疫系の不適切な応答により生じる継続しているＴｈ２リンパ球介在炎症により引き起こされると考えられる。確立された気道疾患の病因の主要なメディエーターとして、古典的なＴｈ２由来サイトカインＩＬ-４ではなくＩＬ-１３が関与していることを示す証拠が蓄積している。
投薬経験の無い非感作げっ歯動物の気道への組換えＩＬ-１３の投与は、喘息の症状の多くの面(気道炎症、粘液産生、及びＡＨＲを含む)を引き起こした[27][28][29][30]。肺にＩＬ-１３が特異的に過剰発現されたトランスジェニックマウスで、同様の症状が観察された。このモデルでは、ＩＬ-１３に対するより慢性の暴露も繊維症を引き起こした[31]。
さらにアレルギー疾患のげっ歯動物モデルでは、喘息症状の多くの面がＩＬ-１３と関連した。可溶性マウスＩＬ-１３Ｒα２(強力なＩＬ-１３中和物質)は、ＡＨＲ、粘液過剰分泌、及び炎症性細胞の流入(これはこのげっ歯動物モデルに特徴的である)を阻害することが証明されている[27][28][30]。補完的な研究において、ＩＬ-１３遺伝子が欠失しているマウスはアレルゲン誘導性ＡＨＲを発症しなかった。これらのＩＬ-１３欠損マウスでは、組換えＩＬ-１３の投与によりＡＨＲが再発する。これに対してＩＬ-４欠損マウスは、このモデルで気道疾患を引き起こした[32][33]。
より長期のアレルゲン誘導性肺炎症モデルを使用して、Ｔａｕｂｅらは確立された気道疾患に対する可溶性マウスＩＬ-１３Ｒα２の有効性を証明した[34]。可溶性マウスＩＬ-１３Ｒα２は、ＡＨＲ、粘液過剰分泌を阻害し、程度は小さいが気道炎症を阻害した。これに対して、ＩＬ-４に結合しこれと拮抗する可溶性ＩＬ-４Ｒαは、この系でＡＨＲ又は気道炎症にほとんど効果が無かった[35]。これらの知見は、Ｂｌｅａｓｅらにより支持され、彼らは喘息の慢性真菌モデルを作成し、ここでＩＬ-４ではなくＩＬ-１３に対するポリクローナル抗体が、粘液過剰分泌、ＡＨＲ、及び上皮下繊維症を低下させることができた[36]。
ＩＬ-１３の多くの遺伝的多型もまた、アレルギー性疾患に関連付けられている。特にアミノ酸１３０のアルギニン残基がグルタミンで置換されている(Ｒ１３０Ｑ)ＩＬ-１３遺伝子の変種は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、及び血清ＩｇＥ高レベルに関連している[37][38][39][40]。この具体的なＩＬ-１３変種はまた、アミノ酸の数から２０個のアミノ酸シグナル配列を排除する一部のグループにより、Ｒ１１０Ｑ(アミノ酸１１０のアルギニン残基がグルタミンにより置換される)とも呼ばれる。Ａｒｉｍａら[41]は、この変種が血清中の高レベルのＩＬ-１３に関連していると報告している。ＩＬ-１３変種(Ｒ１３０Ｑ)及びこの変種に対する抗体は、ＷＯ ０１／６２９３３で考察されている。ＩＬ-１３プロモーター多型(これはＩＬ-１３産生を変化させる)もまた、アレルギー性喘息に関連している[42]。
ＩＬ-１３の高値はまた、喘息、アトピー性鼻炎(枯草熱)、アレルギー皮膚炎(湿疹)、及び慢性副鼻腔炎で測定されている。例えばＩＬ-１３レベルは、対照被験体と比較して喘息患者の気管支生検、喀痰、及び気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)細胞で高かった[43][44][45][46]。さらにＢＡＬ試料中のＩＬ-１３のレベルは、喘息患者をアレルゲンで抗原刺激することにより上昇した[47][48]。さらに、ＣＤ４(＋) Ｔ細胞のＩＬ-１３産生能力は、新生児のアレルギー性疾患の以後の発症リスクの有用なマーカーであることが証明されている[49]。
Ｌｉら[1１4]は最近、喘息の慢性マウスモデルで抗マウスＩＬ-１３抗体を中和する作用を報告した。慢性喘息様応答(例えば、ＡＨＲ、重症の気道炎症、過剰粘液産生)が、ＯＶＡ感作マウスで誘導された。Ｌｉらは、各ＯＶＡ抗原刺激時のＩＬ-１３抗体の投与が、ＡＨＲ、好酸球浸潤、血清ＩｇＥレベル、炎症促進性サイトカイン／ケモカインレベル、及び気道リモデリングを抑制することを報告している[14]。
要約するとこれらのデータは、ＩＬ-４ではなくＩＬ-１３がヒトアレルギー性疾患の治療のためのより魅力的な標的であることを示す。
ＩＬ-１３は、炎症性腸疾患の発症において役割を果たす。Ｈｅｌｌｅｒら[116]は、可溶性ＩＬ-１３Ｒα２の投与によるＩＬ-１３の中和が、ヒト潰瘍性大腸炎のマウスモデルの大腸の炎症を緩和することを報告している[1１6]。これに対応して、潰瘍性大腸炎患者の直腸生検試料では対照よりＩＬ-１３発現が高かった[1１7]。
ＩＬ-１３は、喘息以外の他の繊維症症状に関連している。全身性硬化症患者の血清[50]及び他の型の肺繊維症患者からのＢＡＬ試料[51]中で、ＩＬ-１３レベルの上昇(ＩＬ-４より最大１０００倍高い)が測定されている。対応して、マウス肺中のＩＬ-１３(ＩＬ-４ではない)の過剰発現は顕著な繊維症を引き起こした[52][53]。肺以外の組織の繊維症へのＩＬ-１３の寄与は、寄生体誘導性の肝臓繊維症のマウスモデルで広範に研究されている。可溶性ＩＬ-１３Ｒα２の投与又はＩＬ-１３遺伝子破壊によるＩＬ-１３の特異的阻害は、肝臓中の線維形成を阻止したが、ＩＬ-４産生の低下ではこれを阻止しなかった[54][55][56]。
慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)は、種々の程度の慢性気管支炎、小気道疾患、及び肺気腫を有する患者集団を含み、現在の喘息ベースの治療にあまり応答しない進行性不可逆的肺機能低下を特徴とする[90]。近年ＣＯＰＤの発症率は劇的に上昇して、全世界の死因の第４番目になった(世界保健機構(Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ)。従ってＣＯＰＤは、未解決の大きな医学的ニーズである。
ＣＯＰＤの原因はよくわかっていない。「ダッチ(Ｄｕｔｃｈ)仮説」は、ＣＯＰＤと喘息に対する共通の感受性があり、両方の障害の病理発生に同様の機構が寄与していると提唱している[57]。
Ｚｈｅｎｇら[58]は、マウス肺中のＩＬ-１３の過剰発現が、肺気腫、高粘液産生、及び炎症を引き起こしており、ヒトＣＯＰＤの側面を反映していることを示した。さらに、アレルギー性炎症のマウスモデルでのＩＬ-１３依存性応答であるＡＨＲは、喫煙者の肺機能の低下を予測できることが示されてきている[59]。ＩＬ-１３プロモーター多型とＣＯＰＤの発症のし易さとの関連も確立されている[60]。
従ってＩＬ-１３は、特にＡＨＲと好酸球増加症を含む喘息様特徴を有する患者において、ＣＯＰＤの病理発生に重要な役割を果たす兆候がある。肺疾患が報告されていない被験体からの肺試料と比較して、ＣＯＰＤの病歴のある被験体からの剖検組織試料では、ＩＬ-１３のｍＲＮＡレベルが高いことが証明されている(J. Elias, 2002年アメリカ胸部学会年会(American Thoracic Society Annual Meeting)での口頭通信)。別の研究では、ＣＯＰＤ患者の末梢肺切片の免疫組織化学試験により、高レベルのＩＬ-１３が示された[91]。
ホジキン病は一般的なタイプのリンパ腫であり、これは米国で年間約７,５００症例がある。新生物性リードスターンバーグ(Ｒｅｅｄ-Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ)細胞(しばしばＢ細胞から得られる)は、臨床的に検出される塊りのほんの一部を占めるのみであるため、ホジキン病は悪性腫瘍の中では珍しい。ホジキン病由来細胞株及び原発性リードスターンバーグ(Ｒｅｅｄ-Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ)細胞は、しばしばＩＬ-１３及びその受容体を発現する[61]。ＩＬ-１３は正常なＢ細胞中の細胞生存と増殖を促進するため、ＩＬ-１３がリードスターンバーグ(Ｒｅｅｄ-Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ)細胞の増殖因子として作用する可能性が提唱された。Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒらは、ＩＬ-１３に対する中和抗体がホジキン病由来細胞株の増殖をインビトロで阻害し得ることを証明した[62]。この知見は、リードスターンバーグ細胞がＩＬ-１３の自己分泌及びパラクリン・サイトカインループによりその生存を増強することを示唆した。この仮説に一致して、正常対照と比較した時、一部のホジキン病患者の血清で高レベルのＩＬ-１３が検出されている[63]。従ってＩＬ-１３インヒビターは、悪性のリードスターンバーグ細胞の増殖を阻害することにより、疾患の拡散を予防するかも知れない。
多くのヒト癌細胞は、免疫原性腫瘍特異的抗原を発現する。しかし多くの腫瘍は自然に退縮するが、いくつかはＴ細胞性免疫を抑制することにより免疫系(免疫監視)をすり抜ける。Terabeら[64]は、初期の増殖後に腫瘍が自然に退縮し次に再発したマウスモデルで、免疫抑制におけるＩＬ-１３の役割を示した。可溶性ＩＬ-１３Ｒα２によるＩＬ-１３の特異的阻害は、これらのマウスを腫瘍再発から防御した。Ｔｅｒａｂｅら[64]は続けてＩＬ-１３が、抗腫瘍免疫応答を仲介する腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球の分化を抑制することを証明した。
従ってＩＬ-１３インヒビターは、腫瘍再発又は転移を予防するために治療的に使用できるであろう。ＩＬ-１３の阻害は動物モデルで抗ウイルスワクチンを増強することが示されており、ＨＩＶ及び他の感染性疾患の治療に有益かも知れない[65]。
本明細書において一般にインターロイキン-１３すなわちＩＬ-１３に言及する時は、特に明記しない場合はヒトＩＬ-１３を示すことに注意されたい。これはまた、代わりに「抗原」とも呼ばれる。本発明は、ヒトＩＬ-１３に対する抗体、特にヒト抗体であって、非ヒト霊長類ＩＬ-１３、例えばカニクイザル(cynomolgus)やアカゲザル(rhesus monkey)のＩＬ-１３と交差反応する抗体を提供する。本発明のいくつかの実施態様における抗体は、アミノ酸位置１３０のアルギニン残基がグルタミンに置換されたＩＬ-１３の変種を認識する。他の態様及び実施態様において本発明は、ネズミ（murine）ＩＬ-１３、特にマウスＩＬ-１３、に対する特異的結合メンバーを提供する。
本発明の種々の態様と実施態様において、添付の特許請求の範囲の主題が提供される。
本発明は、ＩＬ-１３、特にヒト及び／又は霊長類のＩＬ-１３及び／又はＩＬ-１３の変種(Ｒ１３０Ｑ)、並びにマウスＩＬ-１３に対する特異的結合メンバーを提供する。本発明の好適な実施態様は抗体分子であり、全抗体(例えば、ＩｇＧ４などのＩｇＧ)又は抗体断片(例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｄＡｂ)でもよい。抗体ＶＨとＶＬドメインのように、抗体の抗原結合領域が提供される。ＶＨとＶＬドメイン内で、相補性決定領域(ＣＤＲ)が提供され、これは、異なるフレームワーク領域(ＦＲ)内に提供されて、場合に応じてＶＨ又はＶＬドメインを形成する。抗原結合部位は、抗体ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインからなることもある。
抗原結合部位は、フィブロネクチン又はチトクロームＢなどの非抗体タンパク質骨格上のＣＤＲの整列により提供される[115,116]。タンパク質内の新規結合部位を作成するための骨格は、Ｎｙｇｒｅｎら[1１6]に詳細に総説される。抗体模倣物のタンパク質骨格はＷＯ／００３４７８４に開示されており、発明者らは、少なくとも１のランダム化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質(抗体模倣物)を記載する。１つ以上のＣＤＲ(例えばＨＣＤＲのセット)を入れ込むための適当な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供される。
本発明の好適な実施態様は、本明細書において「ＢＡＫ２７８Ｄ６系統」と呼ぶものである。これは以下のようにＢＡＫ２７８Ｄ６の６つのＣＤＲ配列のセット：ＨＣＤＲ１(配列番号１)、ＨＣＤＲ２(配列番号２)、ＨＣＤＲ３(配列番号３)、ＬＣＤＲ１(配列番号４)、ＬＣＤＲ２(配列番号５)、及びＬＣＤＲ３(配列番号６) について定義される。１の態様では、本発明はヒトＩＬ-１３に対する特異的結合メンバーであって、ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインから構成され、かつＣＤＲのセットを含む抗体抗原結合部位を含む、上記特異的結合メンバーを提供し、ここで当該ＶＨドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、並びに当該ＶＬドメインはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む（ここで、当該ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、当該ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、当該ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し、当該ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、当該ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、当該ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する）か；或いは、ＣＤＲのセットが、上記ＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、そしてＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する）と比較して１つ又は２つのアミノ酸置換を含む。
ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１が配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲのセットは、本明細書において「ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット」と呼ぶ。ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット内のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、「ＢＡＫ２７８Ｄ６のＨＣＤＲセット」と呼び、ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット内のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、「ＢＡＫ２７８Ｄ６のＬＣＤＲセット」と呼ぶ。ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット、ＢＡＫ２７８Ｄ６のＨＣＤＲセット、又はＢＡＫ２７８Ｄ６のＬＣＤＲセット、或いはそれらの中の１又は２個の置換を有するＣＤＲのセットは、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統であると言われる。
前記のように、ある態様において本発明は、ヒト抗体ＶＨドメインとヒト抗体ＶＬドメインで構成され、かつＣＤＲのセットを含む抗体の抗原結合部位を含む、ヒトＩＬ-１３に対する特異的結合メンバーを提供し、ここで当該ＣＤＲのセットは、ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット、又はＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットと比較して１つ又は２つの置換を含むＣＤＲのセットである。
好適な実施態様において１つ又は２つの置換は、カバト(Ｋａｂａｔ)の標準的番号付け[107]を使用して、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ内の以下の残基の１つ又は２つにある。
ＨＣＤＲ１中の３１、３２、３４
ＨＣＤＲ２中の５２、５２Ａ、５３、５４、５６、５８、６０、６１、６２、６４、６５
ＨＣＤＲ３中の９６、９７、９８、９９、１０１
ＬＣＤＲ１中の２６、２７、２８、３０、３１
ＬＣＤＲ２中の５６
ＬＣＤＲ３中の９５Ａ、９７。
好適な実施態様は、ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットと比較して、ＨＣＤＲ３残基９９とＬＣＤＲ１残基２７にて２つの置換を有する。これらの実施態様のうち好適な実施態様は、ＨＣＤＲ３残基９９でＮがＳに置換され、ＬＣＤＲ１残基２７でＮがＩに置換される。さらに好適な実施態様は、Ｓ、Ａ、Ｉ、Ｒ、Ｐ及びＫからなる群から選ばれるＨＣＤＲ３残基９９での置換と、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｈ及びＧからなる群から選ばれるＬＣＤＲ１残基２７での置換とを有する。
好適な実施態様において１つ又は２つの置換が、以下の可能な置換残基の特定された基：
置換の位置 以下からなる群から選択される置換残基
ＨＣＤＲ１中の３１： Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｅ
ＨＣＤＲ１中の３２： Ｔ
ＨＣＤＲ１中の３４： Ｖ、Ｉ、Ｆ
ＨＣＤＲ２中の５２： Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｒ、Ｇ、Ｅ
ＨＣＤＲ２中の５２Ａ： Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、Ｙ
ＨＣＤＲ２中の５３： Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｓ、Ｉ、Ｒ
ＨＣＤＲ２中の５４： Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｇ、Ｋ、Ｉ
ＨＣＤＲ２中の５６： Ｔ、Ｅ、Ｑ、Ｌ、Ｙ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｍ、Ｇ
ＨＣＤＲ２中の５８： Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｍ、Ｈ、Ｄ、Ｋ
ＨＣＤＲ２中の６０： Ｒ
ＨＣＤＲ２中の６１： Ｒ
ＨＣＤＲ２中の６２： Ｋ、Ｇ
ＨＣＤＲ２中の６４： Ｒ
ＨＣＤＲ２中の６５： Ｋ
ＨＣＤＲ３中の９６： Ｒ、Ｄ
ＨＣＤＲ３中の９７： Ｎ、Ｄ、Ｔ、Ｐ
ＨＣＤＲ３中の９８： Ｒ
ＨＣＤＲ３中の９９： Ｓ、Ａ、Ｉ、Ｒ、Ｐ、Ｋ
ＨＣＤＲ３中の１０１： Ｙ
ＬＣＤＲ１中の２６： Ｄ、Ｓ
ＬＣＤＲ１中の２７： Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｇ
ＬＣＤＲ１中の２８： Ｖ
ＬＣＤＲ１中の３０： Ｇ
ＬＣＤＲ１中の３１： Ｒ
ＬＣＤＲ２中の５６： Ｔ
ＬＣＤＲ３中の９５Ａ： Ｎ
ＬＣＤＲ３中の９７： Ｉ
に従って、ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセット内の上記残基の１つ又は２つでなされる：
好適な実施態様は、ＨＣＤＲ３の残基９９でＮがＳに置換され、ＬＣＤＲ１の残基２７でＮがＩに置換されたＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットを有する。こうして定義されたＣＤＲのセットは以下の通りである：ＨＣＤＲ１-配列番号７；ＨＣＤＲ２-配列番号８、ＨＣＤＲ３-配列番号９；ＬＣＤＲ１-配列番号１０、ＬＣＤＲ２-配列番号１１、ＬＣＤＲ３-配列番号１２。このＣＤＲのセットは本明細書において「ＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲのセット」と呼ぶ。
さらなる好適な実施態様は、ＣＤＲ内に１つ又は２つの置換を有するＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットを有するが、ただし、ＨＣＤＲ３の残基９９のＮのＳによる置換とＬＣＤＲ１の残基２７のＮのＩによる置換の対は含まれない。
他の好適な実施態様は以下の通りである：ＢＡＫ１１６６Ｇ２：ＨＣＤＲ１-配列番号６７、ＨＣＤＲ２ -配列番号６８、ＨＣＤＲ３-配列番号６９、ＬＣＤＲ１-配列番号７０、ＬＣＤＲ２-配列番号７１、ＬＣＤＲ３-配列番号７２。
ＢＡＫ１１６７Ｆ２： ＨＣＤＲ１-配列番号６１、ＨＣＤＲ２-配列番号６２、ＨＣＤＲ３-配列番号６３、ＬＣＤＲ１-配列番号６４、ＬＣＤＲ２-配列番号６５、ＬＣＤＲ３-配列番号６６。
ＢＡＫ１１８４Ｃ８： ＨＣＤＲ１-配列番号７３、ＨＣＤＲ２-配列番号７４、ＨＣＤＲ３-配列番号７５、ＬＣＤＲ１-配列番号７６、ＬＣＤＲ２-配列番号７７、ＬＣＤＲ３-配列番号７８。
ＢＡＫ１１８５Ｅ１： ＨＣＤＲ１-配列番号７９、ＨＣＤＲ２-配列番号８０、ＨＣＤＲ３-配列番号８１、ＬＣＤＲ１-配列番号８２、ＬＣＤＲ２-配列番号８３、ＬＣＤＲ３-配列番号８４。
ＢＡＫ１１６７Ｆ４： ＨＣＤＲ１-配列番号８５、ＨＣＤＲ２-配列番号８６、ＨＣＤＲ３-配列番号８７、ＬＣＤＲ１-配列番号８８、ＬＣＤＲ２-配列番号８９、ＬＣＤＲ３-配列番号９０。
ＢＡＫ１１１１Ｄ１０： ＨＣＤＲ１-配列番号９１、ＨＣＤＲ２-配列番号９２、ＨＣＤＲ３-配列番号９３、ＬＣＤＲ１-配列番号９４、ＬＣＤＲ２-配列番号９５、ＬＣＤＲ３-配列番号９６。
ＢＡＫ１１８３Ｈ４： ＨＣＤＲ１-配列番号９７、ＨＣＤＲ２-配列番号９８、ＨＣＤＲ３-配列番号９９、ＬＣＤＲ１-配列番号１００、ＬＣＤＲ２-配列番号１０１、ＬＣＤＲ３-配列番号１０２。
ＢＡＫ１１８５Ｆ８： ＨＣＤＲ１-配列番号１０３、ＨＣＤＲ２-配列番号１０４、ＨＣＤＲ３-配列番号１０５、ＬＣＤＲ１-配列番号１０６、ＬＣＤＲ２-配列番号１０７、ＬＣＤＲ３-配列番号１０８。これらのすべては、重鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ２のランダム化によりＢＡＫ５０２Ｇ９から得られ、従ってＢＡＫ５０２Ｇ９系統である。
任意のクローンのＣＤＲのセット(ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３)を含むＶＨドメインを表１に示す。別に、表１に示すクローンのＣＤＲのセット(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３)を含むＶＬドメインも本発明により表１に示される。好ましくはかかるＶＨドメインはかかるＶＬドメインと対になっており、最も好ましくはＶＨとＶＬドメインの対は、表１に示すクローンと同じである。
さらに本発明により、ＣＤＲのセットが、１つ又は２つのアミノ酸置換を有する表１に示す任意のクローンのものに対応する、ＣＤＲのセット(ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３)を含むＶＨドメインが提供される。
さらに本発明により、ＣＤＲのセットが、１つ又は２つのアミノ酸置換を有する表１に示す任意のクローンのものに対応する、ＣＤＲのセット(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３)を含むＶＬドメインが提供される。
ＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む抗体の抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーもまた、本発明により提供される。
本発明者は、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統を、ＩＬ-１３に対するヒト抗体の抗原結合ドメインを提供する系統であるとして同定し、これは特に価値がある。この系統内で、ＢＡＫ５０２Ｇ９が特に有用であると特定される。ＢＡＫ２７８Ｄ６とＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲのセットは、すでに上記で同定されている。
構造／性質-活性相関に多変量データ解析技術を適用するコンピューター化学の進歩に従って[94]、抗体の統計的活性-性質相関、パターン認識と分類のような公知の数学的方法を使用して、抗体の定量的活性-性質相関を得ることができる[95〜100]。抗体の性質は、抗体配列の経験的及び理論的モデル(例えば、類似の接触残基の分析又は計算された物理化学的性質の解析)、機能的及び３次元構造から得ることができ、これらの性質は単独及び組合せで考慮することができる。
ＶＨドメインとＶＬドメインからなる抗体の抗原結合部位が、ポリペプチドの６つのループ(３つが軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)から、そして３つが重鎖可変ドメイン(ＶＨ)から)により形成される。既知の原子構造の抗体の分析により、抗体結合部位の配列と３次元構造の関係が明らかにされた[101,102]。これらの関係は、ＶＨドメイン中の第３の領域(ループ)を除くと、結合部位ループは少数の主鎖コンフォメーションの１つ(標準構造)を有することを示唆する。特定のループで形成される標準構造は、ループとフレームワーク領域の両方でそのサイズといくつかの残基の存在により決定されることが証明された[101,102]。
配列-構造相関のこの研究は、既知の配列の抗体の残基の予測に使用することができるが、未知の３次元構造については予測できず、これはそのＣＤＲループの３次元構造を維持し、従って結合特異性を維持するのに重要である。これらの予測は、リード最適化実験からの出力についての予測の比較により支持することができる。
構造アプローチでは、自由に入手できるか又は市販のパッケージ(例えばＷＡＭ[104])を使用して抗体分子[103]についてモデルを作成することができる。例えばインサイト(Ｉｎｓｉｇｈｔ)ＩＩ[105]又はディープビュー(Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ)[106]のようなタンパク質の視覚化と分析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲ中の各位置の可能な置換を評価することができる。次にこの情報を使用して、活性への影響が最小であるか又は有益な置換が作成される。
本発明者は、そのＣＤＲのセットを表１に示すクローンのパネルの配列データを分析した。
この分析は、ｓｃＦｖ変種の記載のセットからのＣＤＲ中の記載のアミノ酸の変化の２成分の組合せは、少なくとも親ｓｃＦｖ ＢＡＫ２７８Ｄ６の出発力価を有するｓｃＦｖ変種を与えるという仮説を検定した。
全てのｓｃＦｖ変種は、改良された親和性について選別され、そしてより高い力価を示すことが確認されている。
観察されたアミノ酸の変化は、ＴＦ-１アッセイにおいてｓｃＦｖ ＢＡＫ２７８Ｄ６の出発力価の４４ｎＭに対してのその作用が、好ましいか、好ましくないか、又はどちらでもない。
任意の２つのアミノ酸の変化の間で関連は観察されず、任意の２つの選択されたアミノ酸の変化の間に「正」又は「負」の相乗作用が無いことが確認された。
かかる２つの組合せが仮説を満足する４つのシナリオと、仮説が有効ではない３つのシナリオがある。関連は観察されなかったため、相乗作用的アミノ酸の変化は考慮していない。
仮説は以下の場合
Ａ１：変異１が好ましく、かつ変異２が好ましい
Ａ２：変異１が好ましく、かつ変異２がどちらでもない
Ａ３：変異１がどちらでもなく、かつ変異２がどちらでもない
Ａ４：変異１が好ましく、かつ変異２が好ましくない(１の作用が２の作用より強い)
に有効である：。
仮説は以下の場合：
Ｂ１：変異１が好ましくなく、かつ変異２がどちらでもない
Ｂ２：変異１が好ましくなく、かつ変異２が好ましくない
Ｂ３：変異１が好ましく、かつ変異２が好ましくない(２の作用が１の作用より強い)
に有効ではない。
Ａ４が可能であるためには、変異１は、力価についての変異２の負の作用を相殺できるほど極めて好ましいものでなければならない。かかる極めて好ましい変異は、選択に使用される変化のライブラリーには存在しないため、これは変種のパネルについて選択され、従ってそこにしばしば現れるであろう。相乗作用は排除することができるため、かかる変異は任意の種類の配列で有効であり、従って異なるｓｃＦｖ変種中に再出現するはずである。かかる高頻度のアミノ酸変化の例は、軽鎖ＣＤＲ１の変化Ａｓｎ２７Ｉｌｅの変化である。しかし(クローンＢＡＫ５３１Ｅ２中の)この変異自体は、力価に対してわずかに２倍の作用しか有さない(最終ＩＣ50は２３．２ｎＭ)。それ自体でこれは極めて好ましい変異ではないため、Ａ４に示すシナリオは不可能であろう。これは、１つ以上のさらなる変異とともに軽鎖ＣＤＲ１のＡｓｎ２７Ｉｌｅ変化を有する記載のＩＬ-１３結合クローンセット中の各クローン(表１)は、１本鎖の軽鎖ＣＤＲ１ Ａｓｎ２７Ｉｌｅ変異を有する変種と少なくとも同等の力価であることを示唆する。他の変異はどちらでもないか又は正であるが、負若しくは有害な作用は無い。
さらなる例は、重鎖ＣＤＲ３のＡｓｎ９９Ｓｅｒである(表１を参照)。この単一のアミノ酸変化を有するクローンは観察されていないため、かかるクローンの力価は、以下の理論により約１２．０ｎＭであると推定されている：
ＢＡＫ２７８Ｄ６力価は４４ｎＭである。ＶＬ ＣＤＲ１ Ｎ２７Ｉ ＋ ＶＨ ＣＤＲ３ Ｎ９９Ｓの変化は、力価８ｎＭのＢＡＫ５０２Ｇ９を与え、すなわち５．５倍の改良である。
ＢＡＫ２７８Ｄ６力価は４４ｎＭである。ＶＬ ＣＤＲ１ Ｎ２７Ｉの変化は、力価２３ｎＭのＢＡＫ５３１Ｅ２を与え、すなわち１．９倍の改良である。
ＢＡＫ２７８Ｄ６力価は４４ｎＭである。ＶＨ ＣＤＲ３ Ｎ９９Ｓの変化は、力価１２．２ｎＭの可能なクローンを与え、すなわち２．９倍の改良である(５．５／１．９＝２．９)。
重鎖ＣＤＲ３ Ａｓｎ９９Ｓｅｒと軽鎖ＣＤＲ１ Ａｓｎ２７Ｉｌｅとの２成分の組合せは、力価が８ｎＭのｓｃＦｖ ＢＡＫ０５０２Ｇ９を与える。相乗作用が除外されているため、ＢＡＫ５０２Ｇ９中の重鎖ＣＤＲ３ Ａｓｎ９９Ｓｅｒの変化の寄与は付加的である。
従って１つ以上のさらなる変異とともに重鎖ＣＤＲ３のＡｓｎ９９Ｓｅｒ変化を有するＩＬ-１３結合クローン(表１)の記載のセット中のすべてのクローンは、ｎ＝１〜２について許容アッセイウィンドウ２．５倍内で少なくとも１２ｎＭ又はそれ以上の力価を有するであろう。
すなわち本発明者は、優先的に選択される極めて好ましいアミノ酸の変化は観察されないと考えている。上記したように、主にｓｃＦｖ変種の表１中に示した２つの変化を詳細に分析した。１つ以上のさらなる変異とともにこれらの変異のいずれかを有する表１のｓｃＦｖ変種は、親ＢＡＫ２７８Ｄ６中のこれらの２つの単一のアミノ酸変化の任意の１つを含有するクローンのように少なくとも改善していた。従ってシナリオＡ４を可能にするであろう極めて好ましいアミノ酸変化がこのパネル中に存在するという証拠は無い。
この観察結果により本発明者は、このｓｃＦｖ変種のセットには好ましくない変異は存在しないと結論した。これは、シナリオＡ４及びＢ１〜Ｂ３が関係なく、この仮説が有効であることを意味する。
従ってすでに記載したように本発明は、定義されたＣＤＲのセット、特にＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットと、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統のＣＤＲセットを、ＣＤＲのセット(例えばＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲセット)内の１つ又は２つの置換とともに含む特異的結合メンバーを提供する。
関連するＣＤＲのセットが、抗体フレームワーク領域内又は他のタンパク質骨格(例えば、フィブロネクチン又はチトクロームＢ)に提供される[115,116]。好ましくは抗体フレームワーク領域が使用され、これらが使用される場合、これらは好ましくは生殖細胞系であり、さらに好ましくは重鎖の抗体フレームワーク領域は、ＶＨ１ファミリー由来のＤＰ１４でもよい。軽鎖の好適なフレームワーク領域はλ３-３Ｈでもよい。ＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲセットでは、抗体フレームワーク領域が、ＶＨ ＦＲ１については配列番号２７、ＶＨ ＦＲ２については配列番号２８、ＶＨ ＦＲ３については配列番号２９、軽鎖ＦＲ１については配列番号３０、軽鎖ＦＲ２については配列番号３１、軽鎖ＦＲ３については配列番号３２であることが好ましい。極めて好適な実施態様において、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインが提供され、これは「ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン」と呼ぶ。さらに極めて好適な実施態様において、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬドメインが提供され、これは「ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン」と呼ぶ。本発明で提供される極めて好適な抗体の抗原結合部位は、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン配列番号１５と、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン配列番号１６で構成される。この抗体の抗原結合部位は、本明細書の別のところでさらに考察されるように、任意の所望の抗体分子フォーマット、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＩｇＧ、ＩｇＧ４、ｄＡｂなどの中に提供されうる。
さらに極めて好適な実施態様において本発明は、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン配列番号１５とＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン配列番号１６とを含むＩｇＧ４抗体分子を提供する。これを本明細書において「ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧ４」と呼ぶ。
抗体ＶＨドメイン内にＢＡＫ５０２Ｇ９のＨＣＤＲセット(配列番号７、８、９)及び／又は抗体ＶＬドメイン内にＢＡＫ５０２Ｇ９のＬＣＤＲセット(配列番号１０、１１、１２)を含む他の抗体分子のように、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン(配列番号１５)及び／又はＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン(配列番号１６)を含むＩｇＧ４若しくは他の抗体分子が本発明により提供される。
本明細書で使用される「及び／又は」は、他のものを含むか又は含まない２つの特定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示であると理解されることをここで指摘することが便利である。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが個々に記載されるように、(ｉ) Ａ、(ｉｉ) Ｂ、及び(ｉｉｉ) ＡとＢ、のそれぞれの具体的な開示であると理解されたい。
前記したように本発明は、ヒトＩＬ-１３に結合し、かつＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン(配列番号１５)及び／又はＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン(配列番号１６)を含む、特異的結合メンバーを提供する。
一般に、ＶＨドメインはＶＬドメインと対になって抗体の抗原結合部位を提供するが、後述のように、抗原に結合するためにＶＨドメイン単独が使用されることがある。ある好適な実施態様においてＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン(配列番号１５)はＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン(配列番号１６)と対になり、その結果、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨとＶＬドメインの両方を含む抗体の抗原結合部位が形成される。他の実施態様においてＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨはＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬ以外のＶＬドメインと対になる。軽鎖の無差別結合は当該分野において確立されている。
同様に、単独で又はＶＬドメインと組合せて特異的結合メンバーとして使用されるＶＨドメイン中に、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統の任意のＨＣＤＲセットを提供することができる。例えば表１に示すように、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統の抗体のＨＣＤＲセットを有するＶＨドメインが提供され、かかるＶＨドメインがＶＬドメインと対になると、例えば表１に示すＢＡＫ２７８Ｄ６系統の抗体のＬＣＤＲセットを有するＶＬドメインが提供される。ＨＣＤＲセットとＬＣＤＲセットとの対形成を表１に示し、表１に示すようにＣＤＲのセットを含む抗体の抗原結合部位を提供する。ＶＨ及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域は生殖細胞系フレームワークでもよい。重鎖ドメインのフレームワーク領域はＶＨ-１ファミリーから選択され、好適なＶＨ-１フレームワークはＤＰ-１４フレームワークである。軽鎖のフレームワーク領域はλ３ファミリーから選択され、好適なかかるフレームワークはλ３ ３Ｈである。
ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨ又はＶＬドメインから１つ以上のＣＤＲが取られ、適当なフレームワークに取り込まれる。これは本明細書でさらに説明される。ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＨＣＤＲの１、２、及び３は、それぞれ配列番号７、８、及び９に示される。ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＬＣＤＲの１、２、及び３は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２に示される。
他のＢＡＫ２７８Ｄ６系統のＣＤＲについても、表１に示すＣＤＲのセットと同じことが適用される。
本発明のさらなる実施態様は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む特異的結合メンバー、又は１６７Ａ１１(ＶＨ：配列番号２３、及びＶＬ：配列番号２４)として示される抗体分子、及びその誘導体６１５Ｅ３(ＶＨ：配列番号３３、及びＶＬ：配列番号３４)、ＢＡＫ５８２Ｆ７(ＶＨ ＣＤＲの配列番号１４１〜１４３)、及びＢＡＫ６１２Ｂ５(ＶＨ ＣＤＲの配列番号１４７〜１４９)のＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲを含む抗原結合部位に関する。これらはヒトＩＬ-１３を認識する。ＶＨ ＣＤＲ３ランダム化からの１６７Ａ１１の誘導体は、力価の高いｓｃＦｖ分子である(５〜６ｎＭ)。１６７Ａ１１系統は、他の分子について本明細書に開示されたように本発明の任意の態様及び実施態様で使用され、例えば改良された力価を有する抗原結合部位の変異と選択方法に使用される。
本明細書にそのアミノ酸配列が記載され、ＩＬ-１３に対する特異的結合メンバーに使用することができるものを含む、本発明のＶＨ及びＶＬドメイン並びにＣＤＲの変種は、配列改変又は変異法及びスクリーニングにより得ることができる。かかる方法もまた、本発明により提供される。
その配列が本明細書に具体的に開示されるＶＨ及びＶＬドメインの任意の可変ドメインアミノ酸配列変種は、記載のように本発明に従って利用される。具体的な変種は１つ以上のアミノ酸配列改変(アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び/又は挿入)を含み、約２０未満の改変、約１５未満の改変、約１０未満の改変、又は約５未満の改変、４、３、２、或いは１の改変を含む。改変は、１つ以上のフレームワーク領域及び／又は１つ以上のＣＤＲ中に作成される。
本発明のさらなる態様において、抗原に結合することについて、任意の特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー（ここで、両方が抗原に結合する）、本明細書に開示のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、又は本明細書に開示のＨＣＤＲ３、又はこれらの任意の変種が提供される。結合メンバー間の競合はインビトロで、例えばＥＬＩＳＡを使用して、及び／又は他の非標識結合メンバーの存在下で検出できる１の結合メンバーに対して特異的なレポーター分子を標識することにより、容易に測定でき、同じエピトープ若しくは重複するエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。
すなわち本発明のさらなる態様は、ＩＬ-１３への結合について、ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体分子、特にＢＡＫ５０２Ｇ９ ｓｃＦｖ及び／又はＩｇＧ４と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。さらなる態様において本発明は、ＩＬ-１３への結合について、抗体の抗原結合部位と競合するヒト抗体の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、抗体の抗原結合部位はＶＨドメインとＶＬドメインから構成され、かつＶＨ及びＶＬドメインはＢＡＫ２７８Ｄ６系統のＣＤＲセットを含む、上記特異的結合メンバーを提供する。
ＩＬ-１３に対する抗体であり、ＩＬ-１３への結合についてＢＡＫ５０２Ｇ９抗体分子、ＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲセットを有する抗体分子、又はＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲセットを有する抗体分子と競合する抗体を得るために、種々の方法が当該分野で利用できる。
さらなる態様において本発明は、抗原に結合することができる１つ以上の特異的結合メンバーを得るための方法であって、本発明の特異的結合メンバーのライブラリーと該抗原とを接触させ、該抗原に結合することができるライブラリーの１つ以上の特異的結合メンバーを選択することを含む方法を提供する。
ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面上に表示され、各粒子はその表面に表示される抗体ＶＨ可変ドメイン、及び場合によって存在するなら表示されるＶＬドメインをコードする核酸を含有する。
抗原に結合することができ、バクテリオファージ粒子上に表示される特異的結合メンバーの選択後に、該選択された特異的結合メンバーを表示するバクテリオファージ粒子から核酸が採取される。かかる核酸は、該選択された特異的結合メンバーを表示するバクテリオファージ粒子から採取される核酸の配列を有する核酸から発現させることによる、特異的結合メンバー又は抗体ＶＨ可変ドメイン(場合により抗体ＶＬ可変ドメイン)の以後の産生に使用される。
該選択された特異的結合メンバーの抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、かかるＶＨドメインを含む特異的結合メンバーのように、単離された型で提供される。さらにＩＬ-１３に結合する能力、またＩＬ-１３への結合についてＢＡＫ５０２Ｇ９(例えば、ｓｃＦｖフォーマット及び／又はＩｇＧフォーマット、例えばＩｇＧ４で)と競合する能力もまた試験される。さらに後述されるように、ＩＬ-１３を中和する能力が試験される。
本発明の特異的結合メンバーは、ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体分子(例えば、ｓｃＦｖ又は好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９ＩｇＧ４)の親和性で、又はそれより強い親和性でＩＬ-１３に結合する。
本発明の特異的結合メンバーは、ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体分子(例えば、ｓｃＦｖ又は好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧ４)の力価で、又はそれより優れた力価でＩＬ-１３を中和する。
本発明の特異的結合メンバーは、ＢＡＫ５０２Ｇ９抗体分子(例えば、ｓｃＦｖ又は好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧ４)の力価で、又はそれより優れた力価で、天然に存在するＩＬ-１３を中和する。
異なる特異的結合メンバーの結合親和性と中和力価は、適切な条件下で比較することができる。
本発明の抗体は、既存の市販のげっ歯類抗ヒトＩＬ-１３抗体、すなわちＪＥＳ１０-５Ａ２(バイオソース(Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ))、Ｂ-Ｂ１３(ユーロクローン(Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ))、及びクローン３２１１６６(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))に対して、多くの利点を有する。本発明の抗体の力価を、市販のＪＥＳ１０-Ａ２及びＢ-Ｂ１３と比較した。クローン３２１１６６は以前の実験で、既知の市販の抗体より著しく力価が低いことが明らかだったため、評価しなかった。
げっ歯動物の市販のＩＬ-１３抗体は、免疫原性応答を誘導する可能性が高く、従って体内からより速くクリアランスされるため、この抗体のヒトでの効力と使用は限定されるようである。非ヒト霊長類での本発明の抗体の動力学的解析は、これらの抗体が他の既知のヒト又はヒト化抗体と同等のクリアランス速度を有することを示唆する。
本発明の種々の実施態様で提供される抗体は、非ヒト霊長類ＩＬ-１３(アカゲザル(ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ)及びカニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)ＩＬ-１３を含む)を認識する。非ヒト霊長類で抗体の効力と安全性プロフィールを測定することは、ヒトでの抗体の安全性、薬物動態、及び薬力学的プロフィールを予測する手段を提供するため、極めて有用である。
さらに本発明の種々の実施態様の抗体はさらに、喘息に関連するヒトＩＬ-１３変種(Ｒ１３０Ｑ)を認識する。変種ＩＬ-１３との交差反応性は、本発明の抗体及び本発明の抗体を含む組成物を、野生型と変種ＩＬ-１３を用いる患者の治療に使用することを可能にする。
本発明の好適な実施態様は、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン(配列番号１５)とＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン(配列番号１６)により形成されるＩＬ-１３抗原結合部位の力価と同等か又はこれより優れた力価で、天然に存在するＩＬ-１３を中和する抗体を含む。例えば本発明者は、ＢＡＫ５０２Ｇ９、１１６７Ｆ２、及び１１８３Ｈ４のような代表的クローンが、既知の市販の抗体より天然に存在するＩＬ-１３に対してはるかに強力であることを示した。
抗体配列以外に本発明の特異的結合メンバーは、他のアミノ酸を含み、例えばペプチド又はポリペプチド(例えば折り畳みドメイン)を形成するか、又は抗原に結合する能力以外に他の機能的特徴を分子に付与する。本発明の特異的結合メンバーは、検出できる標識物を有するか、又は毒素若しくは標的化成分若しくは酵素に、(例えば、ペプチド結合又はリンカーを通して)結合してもよい。
さらなる態様において本発明は、本発明の特異的結合メンバー、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸と、本発明の特異的結合メンバー、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを調製する方法(これは、該特異的結合メンバー、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの産生を引き起こす条件下で該核酸を発現させ、これを回収することを含む)とを提供する。
本発明の特異的結合メンバーは、本発明の特異的結合メンバーの有効量を患者に投与することを含む、ヒト又は動物の体の治療又は診断法、例えばヒト患者の疾患又は障害の治療法(予防的治療を含んでもよい)で使用される。本発明で治療される症状には、ＩＬ-１３が関与する任意の症状、特に喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、慢性閉塞性肺疾患、硬皮症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫がある。さらに本発明の抗体はまた、ＩＬ-１３介在免疫抑制を阻害する[6４,６5]ため、腫瘍やウイルス感染症を治療するのに使用される。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示のＶＨ可変ドメイン及び／又はＶＬ可変ドメインをコードする、一般に単離された核酸を提供する。
本発明の別の態様は、本明細書に開示のＶＨ ＣＤＲ又はＶＬ ＣＤＲ配列、特に配列番号７、８及び９から選択されるＶＨ ＣＤＲ、又は配列番号１０、１１及び１２から選択されるＶＬ ＣＤＲ、最も好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨ ＣＤＲ３(配列番号９)をコードする、一般に単離された核酸を提供する。ＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲセットをコードする核酸、ＢＡＫ５０２Ｇ９のＨＣＤＲセットをコードする核酸、及びＢＡＫ５０２Ｇ９のＬＣＤＲセットをコードする核酸もまた、ＢＡＫ２７８Ｄ６系統の個々のＣＤＲ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、及びＣＤＲ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲのセットをコードする核酸のように、本発明により提供される。
さらなる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
さらなる態様は、コード核酸からの発現を引き起こすことを含む、抗体ＶＨ可変ドメインの産生法を提供する。かかる方法は、該抗体ＶＨ可変ドメインの産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含む。
ＶＬ可変ドメイン、及びＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む特異的結合メンバーの産生のための類似の方法は、本発明のさらなる態様として提供される。
産生法は、生成物の単離及び／又は精製工程を含有してもよい。
産生法は、生成物を少なくとも１つの追加の成分、例えば薬剤学的に許容される賦形剤、を含む組成物中に製剤化することを含む。
本発明のこれら及び他の態様は、以下に詳述される。
用語
特異的結合メンバー
「特異的結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーを説明する。特異的結合対のメンバーは、天然に得られるか、又はすべて若しくは一部が合成されるものでもよい。分子対の１つのメンバーはその表面又は空洞に、分子対の他のメンバーの特定の空間的及び極性構成に特異的に結合し、従ってこれに相補的な領域を有する。すなわち対のメンバーは、互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合対のタイプの例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。本発明は、抗原-抗体型の反応に関する。
抗体分子
「抗体分子」は、天然の又は部分的若しくは完全に合成された免疫グロブリンを記載する。この用語はまた、抗体結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を包含する。抗原結合ドメインを含む抗体断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄのような分子、及びダイアボディ(ｄｉａｂｏｄｉｅｓ)である。
モノクローナル抗体及び他の抗体を取り、組換えＤＮＡ技術を使用して、元々の抗体の特異性を保持する他の自己抗体又はキメラ分子を産生することは可能である。かかる技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含む。例えばＥＰ-Ａ-１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ又はＥＰ-Ａ-２３９４００、及び多くの以後の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の抗体は遺伝的変異又は他の変化を受け、これは産生される抗体の結合特異性を変化させることも変化させないこともある。
抗体は多くの方法で修飾することができるため、用語「抗体分子」は、必要な特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを鵜鵜する特異的結合メンバー又は物質を包含するものと理解されたい。すなわちこの用語は、天然の又は完全に若しくは部分的に合成された免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドを含む、抗体断片及び誘導体を包含する。従って、他のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現は、ＥＰ-Ａ-０１２０６９４及びＥＰ-Ａ-０１２５０２３、及び多くの以後の文献に記載されている。
抗体工学の分野で利用できるさらなる方法が、ヒト及びヒト化抗体を単離することを可能にした。例えばヒトハイブリドーマはＫｏｎｔｅｒｍａｎｎらが記載したように作成することができる[1０7]。特異的結合メンバーを作成するための別の確立された技術であるファージディスプレイ法が、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら[1０7]やＷＯ９２／０１０４７(後述)のような多くの刊行物で詳述されている。マウス免疫系の他の成分を無傷のまま残して、マウス抗体遺伝子が不活性化されヒト抗体で機能的に置換されたトランスジェニックマウスを、ヒト抗原に対するヒト抗体を単離するために使用することができる[1０8]。
例えばKnappikら、J. Mol. Biol. (2000) 296、57-86、又はKrebsら、J. Immunol. Meth. 254 2001 67-84に記載されているように、適当な発現ベクター内で合成され組み立てられたオリゴヌクレオチドを使用して作成された遺伝子から発現させて、合成抗体分子を作成してもよい。
全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たすことができることが示されている。結合断片の例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；(ｉｉ)ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；(ｉｉｉ)１本鎖抗体のＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片；(ｉｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward, E.S.ら、Nature 341, 544-546 (1989)、McCaffertyら (1990) Nature, 348, 552-554)；(ｖ)単離されたＣＤＲ領域；(ｖｉ)２つの連結したＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ(ａｂ’)２断片；(ｖｉｉ)１本鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)、ここでＶＨドメインとＶＬドメインは、２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーにより結合される(Birdら、Science, 242, 423-426, 1988;Hustonら、PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)；(ｖｉｉｉ)二重特異的１本鎖Ｆｖダイマー(ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５)、及び(ｉｘ)「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築される多価又は多重特異的断片(ＷＯ９４／１３８０４；P. Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993)。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するジスルフィド結合の取り込みにより安定化される(Y. Reiterら、Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996)。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディを作成することもできる(S. Huら、Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996)。
二重特異的抗体が使用される場合、これらは従来の二重特異的抗体でもよく、これらは種々の方法で製造することができ(Holliger, P.とWinter G.、Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))、例えば化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから調製されるか、又は上記の任意の二重特異的抗体断片でもよい。二重特異的抗体の例にはＢｉＴＥ(商標)技術のものがあり、これは、異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインを使用することができ、短い柔軟性のあるペプチドを介して連結される。これは、短い１本鎖ポリペプチド上で２つの抗体を組合せる。ダイアボディとｓｃＦｖは可変ドメインのみを使用してＦｃ領域無しで構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を低減する可能性がある。
二重特異的全抗体に対して二重特異的ダイアボディはまた、容易に構築することができ大腸菌(Ｅ． ｃｏｌｉ)中で発現できるため、特に有用である。適切な結合特異性のダイアボディ(及び、抗体断片のような他の多くのポリペプチド)は、ライブラリーからファージディスプレイ(ＷＯ９４／１３８０４)を使用して容易に選択することができる。例えばＩＬ-１３に対する特異性を用いて、ダイアボディの１つのアームを一定に維持するなら、他のアームが変化したライブラリーを作成することができ、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異的全抗体は、「ノブズ・インツウ・ホールズ(ｋｎｏｂｓ-ｉｎｔｏ-ｈｏｌｅｓ)」法により作成してもよい(J.B.B. Ridgewayら、Protein Eng., 9, 616-621, 1996)。
抗原結合ドメイン
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又はすべてに特異的に結合しかつこれに相補的な領域を含む抗体分子の一部を説明する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し、この部分はエピトープと呼ばれる。１つ以上の抗体可変ドメインにより抗原結合ドメインが提供される(例えば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体断片)。好ましくは抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)と抗体重鎖可変領域(ＶＨ)とを含む。
特異的
「特異的」は、特異的結合対の１つのメンバーがその特異的結合対以外の分子に顕著な結合を示さない状況指すために使用される。この用語はまた、例えば抗原結合ドメインが、多くの抗原に運搬される特定のエピトープに特異的な場合にも適用され、この場合抗原結合ドメインを有する特異的結合メンバーは、エピトープを有する種々の抗原に結合することができる。
含む
「含む」は、一般に含むと言う意味、すなわち１つ以上の特徴又は要素の存在を許容するという意味で使用される。
単離された
「単離された」は、本発明の特異的結合メンバー又はかかる結合メンバーをコードする核酸が、一般に本発明に従っている状態を意味する。単離されたメンバー及び単離された核酸は、そうした調製が、インビトロ又はインビボで行われる組換えＤＮＡ技術によル場合、それらが元々関連している物質、例えば天然環境、又は当該メンバー及び核酸が調製される環境（例えば、細胞培養）において見られる他のポリペプチド又は核酸が存在しないか、又は実質的に存在しない状況である。メンバーと核酸は、希釈剤又はアジュバントを用いて剤形され、さらに実用のため単離されており、例えばメンバーは、イムノアッセイで使用されるマイクロタイタープレートを被覆するために使用されるなら、通常ゼラチン又は他の担体と混合されるか、又は診断又は治療で使用される時、医薬として許容される担体又は希釈剤と混合されるであろう。特異的結合メンバーは、天然状態で又は異種真核細胞(例えばＣＨＯ細胞又はＮＳＯ(ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３)細胞)系によってグリコシル化されることもあるし、又は(例えば原核細胞中での発現により産生されるなら)グリコシル化されないこともある。
天然ＩＬ-１３
天然ＩＬ-１３は一般に、ＩＬ-１３タンパク質又はその断片が存在する状態を意味する。天然ＩＬ-１３は、コードする核酸を組換え技術を使用してあらかじめ導入することなく、細胞により自然に産生されるＩＬ-１３タンパク質を意味する。すなわち天然に存在するＩＬ-１３は、例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞により天然に産生されるか、及び／又は哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯動物(例えばラット又はマウス))から単離されうる。
組換えＩＬ-１３
「組換えＩＬ-１３」は、ＩＬ-１３タンパク質又はその断片が生じる状態を意味する。組換えＩＬ-１３は、異種宿主中で組換えＤＮＡにより産生されるＩＬ-１３タンパク質又はその断片を意味する。組換えＩＬ-１３は、天然ＩＬ-１３とはグリコシル化の点で異なる。
原核生物の細菌発現系により発現される組換えタンパク質はグリコシル化されず、一方真核生物系(例えば哺乳動物又は昆虫細胞)で発現されるものはグリコシル化される。しかし昆虫細胞中で発現されるタンパク質は、哺乳動物細胞で発現されるタンパク質とはグリコシル化が異なる。
「実質的に記載されたように」とは、本発明の関連するＣＤＲ又はＶＨ若しくはＶＬドメインが、配列が本明細書に記載された特定の領域と同一であるか又は極めて類似していることを意味する。「極めて類似している」とは、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１若しくは２、或いは３若しくは４個のアミノ酸置換が、ＣＤＲ及び／又はＶＨ若しくはＶＬドメイン中に作成されていると考える。
本発明のＣＤＲ又はＣＤＲのセットを運搬するための構造は一般に、抗体重鎖又は軽鎖配列又はその十分な部分であり、その中にはＣＤＲ又はＣＤＲセットが、再構成免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然ＶＨ及び／又はＶＬ抗体の可変ドメインのＣＤＲ又はＣＤＲセットに対応する位置に位置している。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Kabat, E.A.ら、「免疫学的興味のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第4版、米国保健社会福祉省(US Department of Health and Human Services)、1987、及びこの更新版に記載されており、現在はインターネットで利用できる(http://immuno.bme.nwu.eduか又は任意のサーチエンジンを使用して「Ｋabat」により見つけられる)。
ＣＤＲはまた、フィブロネクチン又はチトクロームＢのような他の骨格により保持される[115,116]。
好ましくは、実質的に本明細書に記載のＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト可変ドメイン又はその実質的な部分の中のＣＤＲとして保持される。実質的に本明細書に記載されるＨＣＤＲ３配列は本発明の好適な実施態様であり、これらの各々は、ヒト重鎖可変ドメイン又はその実質的な部分にＨＣＤＲ３として保持されることが好ましい。
本発明で使用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系列又は再構成ヒト可変ドメインから得られるか、又は既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインでもよい。本発明のＣＤＲ配列(例えばＣＤＲ３)は、組換えＤＮＡ技術を使用してＣＤＲ(例えばＣＤＲ３)が欠如した可変ドメインのレパートリーに導入してもよい。
例えばＭａｒｋｓら(Bio/Technology, 1992, 10:779-783)は、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法であって、当該可変ドメイン内で、可変ドメイン領域の５’末端に向けられるか又はこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用して、ＣＤＲ３を欠如するＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する方法を記載する。Ｍａｒｋｓらはさらに、このレパートリーがいかに特定の抗体のＣＤＲ３と組合わされるかを説明する。類似の方法を使用して本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３が欠如したＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーとシャッフリングし、シャッフリングした完全なＶＨ又はＶＬドメインは同種のＶＬ又はＶＨドメインと一緒になり、本発明の特異的結合メンバーを提供する。次にレパートリーは、適当な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７又は以後の多くの文献(Kay, B.K., Winter, J.及びMcCafferty, J. (1996)、「ペプチドとタンパク質のファージディスプレイ：実験室マニュアル(Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual)」、サンジエゴ：アカデミックプレス(Academic Press))に記載のファージディスプレイ系で表示され、その結果特異的結合メンバーが選択される。レパートリーは、１０4以上の個々のメンバー、例えば１０6〜１０8又は１０10のメンバーからなる。他の適当な宿主系は、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、リボゾームディスプレイなどである。リボゾームディスプレイの総説については、Lowe DとJermutus L, 2004, Curr. Pharm. Biotech., 517-27、及びWO92/01047を参照されたい。
類似のシャフリング又はコンビナトリアル法がまた、Stemmer(Nature, 1994, 370:389-391)により開示され、彼らは、β-ラクタマーゼに関連してこの技術を説明するが、このアプローチが抗体の作成に使用されることを観察している。
別の方法は、１つ以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して本発明のＣＤＲ由来配列を有する新規ＶＨ又はＶＬ領域を作成して、全可変ドメイン内に変異を作成することである。かかる方法は、Ｇｒａｍら(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580)により記載され、彼らはエラーの多いＰＣＲを使用した。好適な実施態様において、ＨＣＤＲ及び／又はＬＣＤＲのセット内に１つ又は２つのアミノ酸置換が作成される。
使用される別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異誘発を誘発誘発することである。かかる方法はＢａｒｂａｓら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813)及びＳｃｈｉｅｒら(1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)により開示されている。
上記のすべての技術は当該分野で公知であり、本発明の一部を構成するものではない。当業者はかかる技術を使用して、当該分野のルーチン的方法を使用して本発明の特異的結合メンバーを提供することができるであろう。
本発明のさらなる態様は、ＩＬ-１３抗原に特異的な抗体の抗原結合ドメインを得る方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＶＨドメインのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、ＶＨドメインのアミノ酸配列変種であるＶＨドメインを提供し、場合によりこうして提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組合せ、そしてＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬ組合せを試験して、特異的結合メンバー、又はＩＬ-１３抗原に特異的なかつ場合により１つ以上の好適な性質、好ましくはＩＬ-１３活性を中和する能力を有する抗体の抗原結合ドメインを同定することを含む。該ＶＬドメインは、実質的に本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に開示のＶＬドメインの１つ以上の配列変種を１つ以上のＶＨドメインと組合せる類似の方法が使用される。
好適な実施態様においてＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン(配列番号１５)は変異を受けて、１つ以上のＶＨドメインアミノ酸配列変種、及び／又はＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬ(配列番号１６)を提供する。
本発明のさらなる態様は、ＩＬ-１３抗原に特異的な特異的結合メンバーを調製する方法であって、当該方法が以下の：
(ａ)置換されるＣＤＲ３を含むか又はＣＤＲ３をコードする領域が欠如したＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し；
(ｂ)該レパートリーを、ＶＨ ＣＤＲ３について実質的に本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組合せて、該ドナー核酸をレパートリー中のＣＤＲ３領域中に挿入し、そしてＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し；
(ｃ)該生成物レパートリーの核酸を発現させ；
(ｄ)ＩＬ-１３に特異的な特異的結合メンバーを選択し；そして
(ｅ)該特異的結合メンバー又はこれをコードする核酸を回収する、
ことを含む方法を提供する。
再度、類似の方法であって、当該方法において本発明のＶＬ ＣＤＲ３が、置換されるＣＤＲ３を含むか又はＣＤＲ３をコードする領域を欠如するＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組合わされる、前記方法が使用される。
同様に、１つ以上の、又はすべての３つのＣＤＲがＶＨ又はＶＬドメインのレパートリー中に移植され、これは次に、特異的結合メンバー又はＩＬ-１３に特異的な特異的結合メンバーについてスクリーニングされる。
好適な実施態様において１つ以上のＢＡＫ５０２Ｇ９ ＨＣＤＲ１(配列番号７)、ＨＣＤＲ２（配列番号８)、及びＨＣＤＲ３(配列番号９)、又はＢＡＫ５０２Ｇ９のＨＣＤＲセットが使用され、及び／又は１つ以上のＢＡＫ５０２Ｇ９ ＬＣＤＲ１(配列番号１０)、ＬＣＤＲ２(配列番号１１)、又はＢＡＫ５０２Ｇ９のＬＣＤＲセットが使用される。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、その介在フレームワーク領域とともに少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む。好ましくはこの部分はまた、第１及び第４のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％を含み、この５０％は第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％と第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端又はＣ末端の追加の残基は、通常は天然に存在する可変ドメイン領域に結合していないものでもよい。例えば組換えＤＮＡ技術により作成された本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニング又は他の操作工程を容易にするために導入されたリンカーによりコードされるＮ末端又はＣ末端残基の導入をもたらしうる。他の操作工程は、本発明の種々のドメインをさらなるタンパク質配列（例えば免疫グロブリン重鎖、（例えばダイアボディの産生における）他の可変ドメイン、又は本明細書中のいたるところでより詳細に記載されるタンパク質標識）に繋げるために、リンカーの導入を含む。
本発明の好適な態様において一対のＶＨとＶＬドメインを含む特異的結合メンバーが好ましいが、ＶＨ又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは本発明の他の態様を構成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインが特異的に標的抗原に結合できることは公知である。
いずれかの単一の特異的結合ドメインの場合、これらのドメインは、ＩＬ-１３に結合できる２ドメイン特異的結合メンバーを形成することができる相補的なドメインをスクリーニングするのに使用される。
これは、ＷＯ９２／０１０４７に開示されているように、いわゆる階層的な２重コンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング法により行われる。ここで、鎖(Ｌ又はＨ)をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させるためにＨ又はＬ鎖クローンを含む個々のコロニーが使用され、そして得られた２鎖特異的結合メンバーが、文献に記載のようなファージディスプレイ法に従って選択される。この方法はまた、Ｍａｒｋｓら(既出)にも開示されている。
本発明の特異的結合メンバーはさらに、抗体定常領域又はその一部を含む。例えばＶＬドメインがそのＣ末端で、ヒトＣκ又はＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖、を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合される。同様にＶＨドメインに基づく特異的結合メンバーはそのＣ末端で、任意の抗体イソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ、及び任意のイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１とＩｇＧ４)から得られる免疫グロブリン重鎖のすべて又は一部(例えばＣＨ１ドメイン)に結合される。ＩｇＧ４は補体に結合せず、エフェクター機能を生成しないため好ましい。これらの性質を有し可変領域を安定化させる合成又は他の定常領域変種はまた、本発明の実施態様での使用に好適である。
本発明の特異的結合メンバーは、検出可能な又は機能的標識物で標識してもよい。検出可能な標識物には、放射線標識(例えば131Ｉ又は99Ｔｃ)があり、これらは、抗体イメージングの分野で公知の一般的化学を使用して、本発明の抗体に結合される。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識を含む。標識はさらにビオチンなどの化学成分を含み、これは特異的な同種の検出できる成分(例えば標識されたアビジン)への結合を介して検出される。
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物対象(好ましくはヒト)の診断又は治療法で使用できるように設計される。
従って本発明のさらなる態様は、提供された特異的結合メンバーの投与を含む治療法、かかる特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与される医薬の製造(例えば特異的結合メンバーと医薬として許容される賦形剤と配合することを含む医薬又は医薬組成物の製造方法)におけるかかる特異的結合メンバーの使用を提供する。
治療効果を与えるために抗ＩＬ-１３抗体が使用される臨床的適応症には、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、硬皮症、及びホジキンリンパ腫がある。すでに説明したように、抗ＩＬ-１３治療はこれらのすべての疾患に有効である。
抗ＩＬ-１３治療は、経口、注射(例えば、皮下、静脈内、腹腔内、又は筋肉内)、吸入、又は局所的(例えば、眼内、鼻内、直腸内、創傷内、皮膚上)に投与される。投与経路は、治療の物理化学的特性、疾患についての特殊な考慮事項、又は効力を最適化し副作用を最小にするための要件により決定することができる。
抗ＩＬ-１３治療は、診療の場での使用に限定されない。すなわち、針を使用しない器具を使用する皮下注射も好適である。
併用療法を使用して、特に抗ＩＬ-１３特異的結合メンバーを１つ以上の他の薬剤と組合せて、大きな相乗作用を得ることができる。本発明の特異的結合メンバーは、短期又は長期作用性ベータアゴニスト、コルチコステロイド、クロモグリク酸、ロイコトリエン(受容体)アンタゴニスト、メチルキサンチンとその誘導体、ＩＬ-４インヒビター、ムスカリン受容体アンタゴニスト、ＩｇＥインヒビター、ヒスタミンインヒビター、ＩＬ-５インヒビター、エオタキシン／ＣＣＲ３インヒビター、ＰＤＥ４インヒビター、ＴＧＦ-ベータアンタゴニスト、インターフェロン-ガンマ、ペルフェニドン(ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ)、化学療法剤、及び免疫治療剤と組合せて提供してもよい。
１つ以上の短期又は長期作用性ベータアゴニスト、コルチコステロイド、クロモグリク酸、ロイコトリエン(受容体)アンタゴニスト、キサンチン、ＩｇＥインヒビター、ＩＬ-４インヒビター、ＩＬ-５インヒビター、エオタキシン／ＣＣＲ３インヒビター、ＰＤＥ４インヒビターとの併用療法は、喘息の治療に使用される。本発明の抗体はまた、コルチコステロイド、代謝拮抗物質、ＴＧＦ-βとその下流のシグナル伝達経路のアンタゴニストと組合せて、繊維症の治療に使用することもできる。これらの抗体とＰＤＥ４インヒビター、キサンチンとその誘導体、ムスカリン受容体アンタゴニスト、短い及び長いベータアンタゴニストとの併用療法は、慢性閉塞性肺疾患を治療するのに有用である。同様の組合せが、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、硬皮症、及びホジキンリンパ腫の治療のための抗ＩＬ-１３の使用に適用される。
本発明において提供された組成物は、個人に投与される。投与は好ましくは「治療有効量」で行われ、これは患者に利益を示すのに充分な量である。かかる利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善である。投与される実際の量、投与の速度と経時変化は、治療される疾患の性質と重症度に依存する。治療処方(例えば投与量の決定など)は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は当該分野で公知である；Ledermann J.A.ら、(1991) Int. J. Cancer 47:659-664; Bagshawe K.D.ら (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radipharmaceuticals 4:915-922を参照されたい。
正確な用量は、例えば抗体が診断用であるか又は治療用であるか、治療される部位の大きさと位置、抗体の正確な性質(例えば、全抗体、断片又はダイアボディ)、及び検出可能な標識又は抗体に結合される他の分子の性質などの多くの因子に依存する。典型的な抗体用量は、全身性応用には１００μｇ〜１ｇの範囲であり、局所的適用には１μｇ〜１ｍｇである。典型的には抗体は全抗体であり、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプである。これは、成人患者の単回治療の投与量であり、子供と幼児は比例して調整され、また抗体フォーマットについては分子量に比例して調整される。治療は医師の判断により、毎日、週に２回、週に１回、又は月に１回の間隔で繰り返される。本発明の好適な実施態様において、治療は定期的であり、投与間の期間は約２週間又はそれ以上、好ましくは約３週間又はそれ以上、さらに好ましくは約４週間又はそれ以上、又は月に約１回である。
本発明の特異的結合メンバーは、通常医薬組成物の形で投与され、これは特異的結合メンバー以外に少なくとも１つの成分を含む。
すなわち本発明の及び本発明で使用される医薬組成物は、活性成分以外に、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に公知の他の物質を含む。かかる物質は非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害してはならない。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し、これは経口又は注射(例えば静脈内注射)でもよい。
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末又は液体形態、又は液剤型でもよい。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含む。液体の医薬組成物は一般に、液体担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、ミネラル油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース、又は他の糖溶液又はグリコール(例えば、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、又はポリエチレン・グリコール)を含有してもよい。
静脈内注射又は患部への注射用に、活性成分は、発熱性物質を含まず、適当なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形である。当業者は、例えば注射用塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸加リンゲル液のような等張溶媒を使用して、適当な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が含まれる。
組成物は、単独で又は他の治療とともに、治療される症状に応じて同時に若しくは逐次的に投与される。
本発明の特異的結合メンバーは、分子の物理化学的性質やデリバリー経路に応じて液体又は固体型で調製される。製剤は、賦形剤、又は賦形剤の組合せ、例えば：糖、アミノ酸、及び界面活性剤を含有してもよい。液体製剤は、広範囲の抗体濃度とｐＨを含む。固体製剤は、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥、又は超臨界液技術による乾燥により製造してもよい。抗ＩＬ-１３の製剤は、目的のデリバリー経路に依存する：例えば肺デリバリー用の製剤は、吸入により肺深部までの浸透を確実にする物性を有する粒子からなる；局所的製剤は、薬剤が作用部位に留まる時間を延長する粘度改変物質を含む。
本発明は、本明細書に記載のようにＩＬ-１３への特異的結合メンバーの結合を引き起こすか又はこれを可能にする方法を提供する。上記したようにかかる結合は、インビボで例えば特異的結合メンバー若しくは特異的結合メンバーをコードする核酸の投与後に起きるか、又はインビトロで例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、又は細胞ベースのアッセイ(例えばＴＦ-１アッセイ)で起きる。
ＩＬ-１３への特異的結合メンバーの結合量は測定できる。定量は試験試料中の抗原の量に関連し、これは診断的に関心が高い。
本発明の任意の態様又は実施態様の特異的結合メンバー又は抗体分子を含むキットはまた、本発明の態様として提供される。本発明のキットにおいて特異的結合メンバー又は抗体分子は標識されて、試料中での反応性の測定(後述)を可能にする。キットの成分は一般に無菌であり、密封バイアル又は他の容器に入れられる。キットは、診断分析又は抗体分子が有用な他の方法で使用される。キットは、方法、例えば本発明の方法中の成分の使用についての説明書を含有してもよい。かかる方法を補助するか又は実施することを可能にする付属の材料を、本発明のキット内に含めてもよい。
試料中の抗体の反応性は、任意の適切な手段により測定される。放射免疫定量法(ＲＩＡ)は１つの可能性である。放射能標識した抗原が非標識抗原(試験試料)と混合され、抗体に結合させられる。結合抗原は非結合抗原から物理的に分離され、抗体に結合した放射活性抗原の量が測定される。試験試料中により多くの抗原が存在するなら、抗原に結合する放射活性抗原は少なくなる。レポーター分子に結合した抗原又は類似体を使用して、非放射活性抗原による競合的結合アッセイを使用してもよい。レポーター分子は、スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を有する蛍光色素、蛍光体又はレーザー色素でもよい。適当な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドがある。適当な発色性色素にはジアミノベンジジンがある。
他のレポーターには、巨大分子コロイド粒子又は粒状物質(例えば着色しているか、磁性又は常磁性のラテックスビーズ)、及び検出できるシグナルを視覚的に観察するか、電子的に検出するか、又は他の方法で記録することを直接又は間接に可能にする生物学的若しくは化学的に活性な物質がある。分子は、例えば発色するか若しくは色を変化させるか、又は電気的性質の変化を引き起こす反応を触媒する酵素でもよい。これらは、エネルギー状態の電子的遷移により特徴的なスペクトル吸収又は発光が起きるように、分子が励起可能なものでもよい。これらには、バイオセンサーとともに使用される化学物質がある。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。
個々の抗体-レポーター結合体により生成されるシグナルを使用して、試料(正常な試料又は試験試料)中の関連する抗体結合の定量可能な絶対若しくは相対データを得てもよい。
本発明はまた、競合的アッセイにおける抗原レベルを測定するための上記の特異的結合メンバーの使用を提供し、すなわち競合的アッセイにおいて本発明により提供される特異的結合メンバーを使用して試料中の抗原レベルを測定する方法が提供される。これは、結合抗原を非結合抗原から分離する必要が無い場合でありうる。結合により物理的又は光学的変化が起きるように、レポーター分子を特異的結合メンバーに連結することは、１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接又は間接に生成する。レポーター分子の結合は、直接又は間接に、共有結合的(例えばペプチド結合)又は非共有結合的でもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果でもよい。
本発明はまた、例えばバイオセンサー系で本発明の特異的結合メンバーを使用して、直接に抗原のレベルを測定することを提供する。
結合を測定するモードは本発明の特徴ではなく、当業者はその好みと一般的知識に従って適当なモードを選択することができる。
上記したように種々の態様と実施態様において本発明は、ＩＬ-１３への結合について、本明細書で定義される特異的結合メンバー(例えばＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧ４)と競合する特異的結合メンバーを包含する。結合メンバー間の競合は、例えば特異的レポーター分子をある結合メンバーに標識し、これは非標識結合メンバーの存在下で検出することができ、同じエピトープ又は重複エピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にすることにより、インビトロで容易に測定することができる。
競合は、例えばＩＬ-１３をプレートに固定化し、第１の標識結合メンバーを１つ以上の非標識結合メンバーとともにプレートに加えるＥＬＩＳＡを使用して測定してもよい。標識結合メンバーと競合する非標識結合メンバーの存在は、標識結合メンバーが出すシグナルの低下により観察される。
競合を試験するには抗原のペプチド断片が使用され、特に目的のエピトープを含むペプチドが使用される。エピトープ配列＋いずれかの末端の１つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用してもよい。かかるペプチドは、特定の配列から「基本的になる」。本発明の特異的結合メンバーは、その抗原への結合が、与えられる配列を有するか又は含むペプチドにより阻害されるようなものである。これを試験するには、いずれかの配列＋１つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用してもよい。
特異的ペプチドに結合する特異的結合メンバーは、例えばペプチドとのパニングによりファージディスプレイライブラリーから単離される。
本発明はさらに、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。好適な態様において本発明は、上記した本発明のＣＤＲ又はＣＤＲセット又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又は抗体の抗原結合部位又は抗体分子、例えばｓｃＦｖ若しくはＩｇＧ４をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写若しくは発現カセットの形態の構築体を提供する。
本発明はまた、上記の１つ以上の構築体を含む組換え宿主細胞を提供する。提供される上記のＣＤＲ又はＣＤＲセット又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又は抗体の抗原結合部位又は抗体分子、例えばｓｃＦｖ若しくはＩｇＧ４をコードする核酸自体は、コードされる生成物の産生法(この方法はこれをコードする核酸からの発現を含む)のように本発明の態様を構成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより便利に行われる。発現による産生後に、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又は特異的結合メンバーは、任意の適当な方法を使用して単離及び／又は精製され、次に適宜使用される。
本発明の特異的結合メンバー、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、及びコードする核酸分子とベクターは、例えばその自然の環境から単離及び／又は精製されて、実質的に純粋な又は均一な型で、又は核酸の場合は、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まずに提供される。本発明の核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含み、完全に又は部分的に合成される。本明細書のヌクレオチド配列への参照は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する(ここで特に明記しない場合は、Ｔの代わりにＵが使用される)。
種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングと発現のための系は公知である。適当な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、及びバキュロウイルス系、及びトランスジェニック植物と動物がある。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用できる哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎細胞、ヒト胚網膜細胞、及び他の多くの細胞がある。一般的な好適な細菌宿主は大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)である。
原核細胞(例えば大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ))中の抗体及び抗体断片の発現は、当該分野で確立されている。総説については、Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991)を参照されたい。培養真核細胞中の発現もまた、特異的結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に公知である。例えばChadd HEとChamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12:188-194, Andersen DCとKrummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:117, Larrick JWとThomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418を参照のこと。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び適宜他の配列を含む適切な制御配列を含む適当なベクターを選択し構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば適切なものとしてファージ、又はファジミドでもよい。さらなる詳細については、例えば「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第3版、SambrookとRussell, 2001, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。核酸の操作のための多くの公知の技術及びプロトコール(例えば核酸構築体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析)は、「分子生物学の現代のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、第２版、Ausubelら編、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and Sons)、１９８８、「分子生物学の簡単なプロトコール：分子生物学の現代のプロトコールからの方法の概要(Short Protocols in Molecular Biology: A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology)」、Ausubelら編、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and Sons)、第４版、１９９９に詳述されている。SambrookらとAusubelら(両方)の開示内容は、本明細書中に援用される。
すなわち本発明のさらなる態様は、本明細書に開示の核酸を含有する宿主細胞を提供する。かかる宿主細胞はインビトロでも培養細胞でもよい。かかる宿主細胞はインビボでもよい。宿主細胞のインビボの存在は、本発明の特異的結合メンバーの「イントラボディ(ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ)」又は細胞内抗体としての細胞内発現を可能にする。イントラボディ(ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ)は、遺伝子治療で使用される[1１2]。
さらに別の態様は、かかる核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は任意の利用可能な方法を使用してもよい。真核細胞については適当な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ-デキストラン、電気穿孔法、リポソーム介在トランスフェクション、及びレトロウイルス若しくは他のウイルス(例えばワクシニア、又は昆虫細胞についてはバキュロウイルス)を使用する導入がある。宿主細胞、特に真核細胞への核酸の導入は、ウイルス又はプラスミドベースの系を使用する。プラスミド系はエピソームで維持されるか、又は宿主細胞中に若しくは人工的染色体に取り込まれる[1１０,１１1]。取り込みは、単一又は複数の遺伝子座での１つ以上のコピーのランダム又は標的化組み込みである。細菌細胞については適当な技術には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションがある。
導入の後に、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を含有することにより、核酸からの発現を引き起こすか又はこれを可能にする。
ある実施態様において本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム(例えば染色体)中に組み込まれる。組み込みは、標準的技術に従ってゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより促進される。
本発明はまた、上記の特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現するために、発現系で上記の構築体を使用することを含む方法を提供する。
本発明の態様及び実施態様を、以下の実験を参照して例示する。
実施例１
抗ＩＬ-１３ ｓｃＦｖの単離
ｓｃＦｖ抗体レパートリー
２０人のドナーの脾臓リンパ球から得られ、ファジミドベクターにクローン化した大きな１本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ヒト抗体ライブラリーを、選択に使用した[66]。
ｓｃＦｖの選択
基本的に[67]に記載されるとおりに、組換え細菌由来のヒト又はネズミＩＬ-１３(Peprotech)についての一連の繰り返し選択サイクルによりファージディスプレイライブラリーからＩＬ-１３を認識するｓｃＦｖを単離した。簡単に説明すると、ライブラリーを用いてインキュベーション後、常磁性ビーズにあらかじめ結合させた固定化抗原と結合ファージとを磁性分離により回収し、非結合ファージを洗い流した。次に結合ファージをＶａｕｇｈａｎら[67]が記載したように回収し、選択プロセスを繰り返した。異なる固体表面及び捕捉法を、異なるラウンドの選択で使用して非特異結合を低下させた。抗原をビーズ(ダイナビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ)Ｍ-２７０カルボン酸)に共有結合させたか、又は製造業者(ダイナル(Ｄｙｎａｌ))のプロトコールに従ってビオチン化により修飾し、その後ストレプトアビジン被覆ビーズ(ダイナビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ)Ｍ-２８０)により２次捕捉した。Ｖａｕｇｈａｎら[67]とＯｓｂｏｕｒｎら[70]が記載したように、選択ラウンドの出力からのクローンの代表的な一部をＤＮＡ配列決定した。ＩＬ-１３依存性細胞増殖アッセイにおいて、ＩＬ-１３を精製ｓｃＦｖ調製物として中和する能力について、固有クローンを評価した。
リボソームディスプレイライブラリーを作成し、基本的にHanesら[113]に記載されるとおりに、組換え細菌由来のヒト又はネズミＩＬ-１３(Peprotech)を特異的に認識するｓｃＦｖについてスクリーニングした。まず初期選択からのＢＡＫ２７８Ｄ６リードクローンをリボソームディスプレイフォーマットに変換し、この鋳型をグリコシル化ライブラリー作成のための使用した。ＤＮＡレベルでは、ｍＲＮＡへの効率的な転写のために５’末端にＴ７プロモーターを付加した。ｍＲＮＡレベルでは、構築体は原核細胞リボゾーム結合部位(シャイン‐ダルガルノ配列)を含有した。１本鎖の３’末端で停止コドンを除去し、ｇＩＩＩの部分(遺伝子ＩＩＩ)を、スペーサーとして作用するように付加した[1１3]。
抗体相補性決定領域(ＣＤＲ)の突然変異誘発によりリボソームディスプレイライブラリーを作成し、ここでＰＣＲ反応は非プルーフリーディングＴａｑポリメラーゼを用いて行った。親和性ベースの選択を行い、ライブラリーとインキュベーション後、ビオチン化ヒトＩＬ-１３をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(ダイナル(Ｄｙｎａｌ)Ｍ２８０)により捕捉し、結合した３成分複合体(ｍＲＮＡ-リボゾーム-ｓｃＦｖ-ＩＬ-１３)を磁性分離により回収し、結合しない複合体を洗い流した。結合性ｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡを、Ｈａｎｅｓら[1１3]が記載したようにＲＴ-ＰＣＲにより回収し、選択する間に存在するビオチン化ヒトＩＬ-１３の低い濃度(５ラウンドで１００ｎＭ〜１００ｐＭ)を用いて選択プロセスを繰り返した。
誤りが出やすいＰＣＲはまた、ライブラリーサイズをさらに拡大するために使用した。選択操作において、３種の間違い頻度 (製造業者(Clontech)のプロトコールに記載のように、標準的ＰＣＲ反応後に１,０００ｂｐ毎に２．０、３．５、及び７．２の変異) を使用した。最初の誤りを起こしやすいＰＣＲ反応を、１００ｎＭで開始される第１ラウンドの選択の前に行った。誤りを起こしやすいＰＣＲの以後のラウンドは、１０ｎＭのビオチン化ヒトＩＬ-１３で第３ラウンドの選択前に行った。上記したように、選択ラウンドの出力からのクローンの代表的な一部を、Ｖａｕｇｈａｎら[67]とＯｓｂｏｕｒｎら[70]が記載したようにＤＮＡ配列決定にかけた。ＩＬ-１３依存性細胞増殖アッセイにおいて、ＩＬ-１３を精製ｓｃＦｖ調製物として中和する能力について、固有クローンを評価した。
実施例２
ＩＬ-１３依存性ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける抗ＩＬ-１３ ｓｃＦｖの中和力価
ヒト及びネズミＩＬ-１３生物活性に対する精製ｓｃＦｖ調製物の中和力価を、ＴＦ-１細胞増殖アッセイを使用して評価した。精製ｓｃＦｖ調製物は、ＷＯ０１／６６７５４の実施例３に記載のように調製した。精製ｓｃＦｖ調製物のタンパク質濃度は、ＢＣＡ法(ピアス(Ｐｉｅｒｃｅ))を使用して測定した。ＴＦ-１は、赤白血病患者から樹立したヒト前骨髄性細胞株である[68]。ＴＦ-１細胞株は生存と増殖について因子依存性である。この点でＴＦ-１細胞はヒト又はネズミＩＬ-１３に応答し[69]、ヒトＧＭ-ＣＳＦ(４ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))を含有する培地中で維持された。ＩＬ-１３依存性増殖の阻害は、分裂細胞の新たに合成されたＤＮＡ中へのトリチウム化チミジンの取り込みの低下を測定することにより決定された。
ＴＦ-１細胞アッセイプロトコール
ＴＦ-１細胞を、アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、５％胎児牛血清(ジェイアールエィチ(ＪＲＨ))と１％ピルビン酸ナトリウム(シグマ(Ｓｉｇｍａ))とを含有するグルタマックス(ＧＬＵＴＡＭＡＸ)Ｉ(インビトロゲン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ))を有するＲＰＭＩ１６４０を含んだ。各アッセイの前に、３００×ｇで５分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞をアッセイ培地に再懸濁した。この操作を、１ｍｌのアッセイ培地中１０5細胞の最終濃度で再懸濁された細胞を用いて２回繰り返した。抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。ＩＬ-１３に無関係の抗体を陰性対照として使用した。組換細菌由来のヒト又はネズミＩＬ-１３(Peprotech)を、９６ウェルアッセイプレート中で１００μｌ／ウェルの総量中の適切な試験抗体と混合した時５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用したＩＬ-１３の濃度を、最終アッセイ濃度で約８０％の最大増殖応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で３０分間インキュベートした。次に１００μｌの再懸濁細胞を各アッセイ点に加えて、総アッセイ容量２００μｌ／ウェルを得た。アッセイプレートを３７℃で５％ ＣＯ2下で７２時間インキュベートした。次に２５μｌのトリチウム化チミジン(１０μＣｉ／ｍｌ、ＮＥＮ)を各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに４時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート(パーキンエルマー(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ))上で採取した。パッカードトップカウント(Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ)マイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズム(Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
ヒトとネズミ抗原との交互の選択サイクルにもかかわらず、交差反応性の中和抗体は得られなかった。選択により、２つの明確な抗ヒト及び１つの抗ネズミＩＬ-１３中和ｓｃＦｖが得られた。ＢＡＫ２７８Ｄ６(ＶＨ 配列番号１３；ＶＬ 配列番号１４)とＢＡＫ１６７Ａ１１(ＶＨ 配列番号２３；ＶＬ 配列番号２４)はヒトＩＬ-１３を認識し、ＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ 配列番号２５；ＶＬ 配列番号２６)はネズミＩＬ-１３を認識した。ｓｃＦｖとしてのＢＡＫ２７８Ｄ６(図２)とＢＡＫ１６７Ａ１１(図１)は、それぞれ４４ｎＭと１１１ｎＭのＩＣ50で、２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３を中和した。ｓｃＦｖとしてのＢＡＫ２０９Ｂ１１(図３)は、１８５ｎＭのＩＣ50で２５ｎｇ／ｍｌネズミＩＬ-１３を中和した。
実施例３
ＩＬ-１３依存性ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける親クローンの重鎖ＣＤＲ３の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
Ｏｓｂｏｕｒｎら[70]は、重鎖ＣＤＲ３中の残基の標的化突然変異誘発が、抗体の親和性を顕著に改善することを証明した。ｓｃＦｖレパートリーについて選択は実施例１に記載のように行い、ここでＢＡＫ２７８Ｄ６(配列番号６)とＢＡＫ１６７Ａ１１(配列番号５７)の重鎖ＣＤＲ３内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例２に記載のようにＤＮＡ配列決定とＴＦ-１細胞増殖アッセイにおけるｓｃＦｖとして測定した中和力価により同定した。
結果
両方の系統で力価の大きな上昇が達成された。ＢＡＫ１６７Ａ１１系統からの最も高力価のクローンはＢＡＫ６１５Ｅ３、ＢＡＫ６１２Ｂ５、及びＢＡＫ５８２Ｆ７であり、これらはＴＦ-１細胞増殖アッセイにおいて２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-１３に対して、ｓｃＦｖとしてそれぞれ３ｎＭ(図１)、６．６ｎＭ、６．６５ｎＭのＩＣ50を有した。ＢＡＫ２７８Ｄ６系統では、最も高力価のクローンはＢＡＫ５０２Ｇ９であり、これはＴＦ-１細胞増殖アッセイにおいてｓｃＦｖとして２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-１３に対して８ｎＭのＩＣ50を有した(図２)。
実施例４
ＴＦ-１因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息と関連する非ヒト霊長類ＩＬ-１３とＩＬ-１３変種に対するＢＡＫ１６７Ａ１１とＢＡＫ２７８Ｄ６系統の中和力価
ＢＡＫ１６７Ａ１１とＢＡＫ２７８Ｄ６ヒトＩＬ-１３中和系統のいずれも、ネズミ交差反応性はなかった。従って本発明者は、さらなる最適化と臨床的進展のために選択した系統について以下の基準を決定した：好ましくは非ヒト霊長類ＩＬ-１３と交差反応性であること、ＩＬ-１３の変種を認識すること(当該変種では、アミノ酸位置１３０のアルギニンがグルタミンにより置換されている(Ｒ１３０Ｑ))。この変種は、遺伝的に喘息と他のアレルギー性疾患に関連している[37,38,41,71]。交差反応性は、表面プラズモン共鳴(ビアコア(ＢＩＡｃｏｒｅ))分析により、精製ｓｃＦｖ調製物が非ヒト霊長類ＩＬ-１３とＩＬ-１３変種とに結合する能力により測定した。機能活性は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイを使用して測定した。
野生型、変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３の産生
野生型ヒトＩＬ-１３のｃＤＮＡをインビトロゲン(Invitrogen)から得て、部位特異的突然変異誘発(ストラタジーン(Stratagene)クイックチェンジ(Quikchange)(商標)キット)により修飾して、変種ＩＬ-１３をコードするｃＤＮＡを得た。アカゲザル(rhesus monkey)とカニクイザル(cynomolgus monkey)ＩＬ-１３のコード配列を、ヒトＩＬ-１３配列に基づく縮重プライマーを使用してゲノムＤＮＡ鋳型のＰＣＲにより得た。非ヒト霊長類(アカゲザルとカニクイザル)配列は互いに同じであるが、ヒトＩＬ-１３とは７つのアミノ酸が異なった(図１９)。次に、バキュロウイルス発現系(インビトロゲン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ))を使用して、組換え野生型、変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３を発現させた。発現構築体は、発現されたタンパク質にカルボキシル末端親和性タグを付与し、これは昆虫細胞調整培地からほぼ均一になるまで精製することを可能にした。
ビアコアを使用する定性的結合アッセイ
非ヒト霊長類、変種及び野生型ＩＬ-１３に対する精製ｓｃＦｖ調製物の結合親和性を、Ｋａｒｌｓｓｏｎら[72]が記載したようにビアコア(ＢＩＡｃｏｒｅ)２０００バイオセンサー(ビアコアエービー(ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ))を使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約２００Ｒｕの表面密度で、アミンカップリングキット(ビアコア(ＢＩＡｃｏｒｅ))を使用してＩＬ-１３をＣＭ５センサーチップに結合させ、そして試験ｓｃＦｖの３の濃度（約３５０ｎＭ、１７５ｎＭ、及び８８ｎＭ）を含むＨＨＢＳ-ＥＰ緩衝液をセンサーチプ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをビーアイエー(ＢＩＡ)評価３．１ソフトウェアを使用して評価して、相対結合データを得た。
ＴＦ-１アッセイプロトコール
このアッセイは以下の修飾を加えて基本的に実施例２に記載されたように行った：非ヒト霊長類ＩＬ-１３、ヒト変種ＩＬ-１３(Ｒ１３０Ｑ)、及び野生型ヒトＩＬ-１３を、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、及び２５ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。
結果
ビアコア(ＢＩＡｃｏｒｅ)結合アッセイデータは、ＢＡＫ１６７Ａ１１系統ではなくＢＡＫ２７８Ｄ６が、さらなる治療薬開発に必要な交差反応性プロフィールを有することを示唆した(表２)。この知見は、ＢＡＫ２７８Ｄ６(図４)とＢＡＫ５０２Ｇ９(図６)がＴＦ-１細胞増殖アッセイでほぼ同等の力価でヒトＩＬ-１３、ヒトＩＬ-１３(Ｒ１３０Ｑ)変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３を中和できることを示すバイオアッセイデータにより支持された。これに対して、ＢＡＫ６１５Ｅ３(ＶＨ 配列番号３３；ＶＬ 配列番号３４)は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおいて、その親ＢＡＫ１６７Ａ１１(ＶＨ 配列番号２３；ＶＬ 配列番号２４)に対するヒトＩＬ-１３に対して有意に高い力価を有した(図１)が、いずれのクローンもビアコア(ＢＩＡｃｏｒｅ)結合アッセイで非ヒト霊長類又は変種ＩＬ-１３に結合しなかった。
ＢＡＫ２７８Ｄ６とＢＡＫ５０２Ｇ９のフレームワーク領域の生殖細胞系列化（Germlining)
得られたＢＡＫ２７８Ｄ６ ＶＨ(配列番号１３)とＶＬ(配列番号１４)のアミノ酸配列を、ＶＢＡＳＥデータ[73]中の既知のヒト生殖細胞系列の配列と配列比較し、配列類似性により最も近い生殖細胞系列を同定した。ＢＡＫ２７８Ｄ６のＶＨドメイン(配列番号１４)及びその誘導体に最も近い生殖細胞系列は、ＶＨ１ファミリーメンバーであるＤＰ１４として同定された。ＢＡＫ２７８Ｄ６ ＶＨは、ＤＰ１４生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で、９つの変化を有する。ＢＡＫ２７８Ｄ６のＶＬの最も近い生殖細胞系列は、Ｖλ３ ３ｈとして同定された。ＢＡＫ２７８Ｄ６ ＶＬドメイン(配列番号１４)は、生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で５つの変化を有する。ＢＡＫ２７８Ｄ６とその誘導体のフレームワーク領域を部位特異的突然変異誘発(ストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)クイックチェンジ(Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ)キット)により生殖細胞系列に戻して、未変性のヒト抗体と完全に一致させた。
実施例５
ヒトＩＬ-１３依存性ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおけるＢＡＫ５０２Ｇ９の重鎖ＣＤＲ１と重鎖ＣＤＲ２配列の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
ＢＡＫ５０２Ｇ９配列を使用して鋳型として生殖細胞系列化フレームワーク領域を用いて、第２相の最適化を行った。選択は基本的に実施例１に記載のように行い、ここでＢＡＫ５０２Ｇ９の重鎖ＣＤＲ１又は重鎖ＣＤＲ２内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例２に記載のようにＤＮＡ配列決定とＴＦ-１細胞増殖アッセイにおいて精製ｓｃＦｖ調製物として測定した中和力価により同定した。Ｐｅｒｓｉｃら(１９９７ Ｇｅｎｅ １８７：９-１８)が記載した方法を若干改変して、全ヒトＩｇＧ４抗体としての再発現を可能にするために、最も高力価のｓｃＦｖクローンにベクターを構築した。ベクター中にｏｒｉＰ断片を含めて、ＨＥＫ-ＥＢＮＡ ２９３細胞との使用を容易にし、エピソーム複製を可能にした。ＶＨ可変ドメインを、発現ベクターｐＥＵ８．１(＋)の分泌リーダー配列とヒトガンマ４定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローニングした。ＶＬ可変ドメインを、発現ベクターｐＥＵ４．１(-)の分泌リーダー配列とヒトラムダ定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローン化した。
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー(アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia))により、重鎖と軽鎖とを発現する構築体を用いてコトランスフェクトしたＥＢＮＡ２９３細胞からの調整培地から、全抗体を精製した。精製した抗体分画を無菌ろ過し、４℃でリン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)中に保存し、その後評価した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法(ピアス(Pierce))を使用して２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。実施例２に記載のＴＦ-１増殖アッセイにおいて、再フォーマット化ヒトＩｇＧ４全抗体を市販の抗ヒトＩＬ-１３抗体と比較した。
結果
図５に示すように、市販の抗体Ｂ-Ｂ１３(マウスＩｇＧ１-ユーロクローン５(Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ５))は、ヒトＩＬ-１３に対して市販のＪＥＳ１０-５Ａ２(ラットＩｇＧ１-バイオソース(Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ))より有意に高力価であることが示された(それぞれＩＣ50は１０２１ｐＭと４７１ｐＭである)。ＢＡＫ５０２Ｇ９由来(従って「ＢＡＫ５０２Ｇ９系統」)の８つのクローン、すなわちＢＡＫ１１１１Ｄ１０、ＢＡＫ１１６６Ｇ０２、ＢＡＫ１１６７Ｆ０２、ＢＡＫ１１６７Ｆ０４、ＢＡＫ１１８３Ｈ４、ＢＡＫ１１８４Ｃ８、ＢＡＫ１１８５Ｅ１、ＢＡＫ１１８５Ｆ８(ここで、重鎖ＣＤＲ１又はＣＤＲ２が標的されている)は、ｓｃＦｖとして市販の抗体に対して改善された力価を示した。これらの改善は、全抗体ヒトＩｇＧ４に変換された際に維持された。これらのＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれ及びこれらの請求項に係る物の各ペアにおいて、本発明の態様又は実施態様を表し、それは、これらの１以上を含むＩＬ-１３に対する特異的結合メンバー、ＢＡＫ５０２Ｇ９系統クローンからの１つ以上のＣＤＲを含む特異的結合メンバー、好ましくはＢＡＫ５０２Ｇ９系統のＨＣＤＲセットを含むＶＨドメイン、及び／又はＢＡＫ５０２Ｇ９系統のＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインと同様である。これらは、本明細書に開示のように本発明の任意のかつすべての態様で使用されうる。全抗体(ＩｇＧ４)としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の誘導体は、２４４ｐＭ〜２８３ｐＭの範囲のＩＣ50を有した。全抗体ＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９は、３８４ｐＭのＩＣ50を有した。要約すると、ＢＡＫ５０２Ｇ９の重鎖ＣＤＲ１(配列番号７)又はＣＤＲ２(配列番号８)を標的化することにより、力価の大きな改善が得られるであろう。ＡＮＯＶＡ後にダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)後検定解析(インスタット(ＩｎＳｔａｔ)ソフトウェア)により、Ｂ-Ｂ１３に対する統計的比較を行った。
さらなる特徴解析
ＢＡＫ２７８Ｄ６系統由来の選択された抗ヒト抗体をさらに特徴解析して、その特異性を測定した。これらには、ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)とその誘導体であるＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)及びＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)があり、これらは、ＢＡＫ５０２Ｇ９のそれぞれ重鎖ＣＤＲ１と重鎖ＣＤＲ２に対する修飾を有するクローンの代表例である。
実施例６
ＴＦ-１因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息に関連する非ヒト霊長類ＩＬ-１３とＩＬ-１３変種に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の重鎖ＣＤＲ１と重鎖ＣＤＲ２の標的化最適化からのリードクローンの中和力価
抗ヒトＩＬ-１３抗体の交差反応性を、実施例４に記載のように非ヒト霊長類ＩＬ-１３及びＩＬ-１３変種介在ＴＦ-１細胞増殖を阻害する能力により測定した。
結果
最適化した抗ヒトＩＬ-１３抗体ＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)とＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)は、その親ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)の特異性を維持した(図６)。野生型ＩＬ-１３に対する力価の上昇は、実質的に同等の力価で非ヒト霊長類ＩＬ-１３及びＩＬ-１３変種を中和する能力に反映された。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３に対するＢＡＫ５０２Ｇ９のＩＣ50は、それぞれ１．４ｎＭ、１．９ｎＭ、及び２．０ｎＭであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３に対するＢＡＫ１１６７Ｆ２のＩＣ50は、それぞれ１．０ｎＭ、１．１ｎＭ、及び１．３ｎＭであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類ＩＬ-１３に対するＢＡＫ１１８３Ｈ４のＩＣ50は、それぞれ０．９ｎＭ、１．０ｎＭ、及び１．６ｎＭであった。これらのクローンは治療的用途に適していた。
実施例７
ＨＤＬＭ-２細胞増殖アッセイにおける未変性のヒトＩＬ-１３に対するリード抗ヒトＩＬ-１３抗体の中和力価
ヒトＩＬ-１３配列は４つのＮ-グリコシル化部位候補を有する。本発明者は、細菌又はバキュロウイルス発現系で発現される組換えＩＬ-１３を中和するＢＡＫ２７８Ｄ６とその誘導体の能力を証明した。哺乳動物系で知られている多くのプロセシングイベントは昆虫でも起きる証拠があるが、タンパク質グリコシル化、特にＮ-グリコシル化において大きな差がある[74]。
本発明者は、ＢＡＫ２７８Ｄ６誘導体がヒト細胞から放出された未変性のＩＬ-１３を中和する能力を調べた。
Drexlerら[75]は、ＨＤＬＭ-２細胞をホジキン病患者から単離した。Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒら[76]は、ＨＤＬＭ-２細胞増殖が一部はＩＬ-１３の自己分泌及びパラ分泌性放出に依存性であることを証明した。リード抗ヒトＩＬ-１３抗体を、未変性の(又は天然に存在する)ＩＬ-１３の放出により仲介されるＨＤＬＭ-２細胞増殖を阻害する能力について評価した。
ＨＤＬＭ-２細胞アッセイプロトコール
ＨＤＬＭ-２細胞をドイツ微生物と細胞培養物保管施設(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、２０％胎児牛血清を含有するグルタマックス(Ｇｌｕｔａｍａｘ)Ｉ(インビトロゲン)を有するＲＰＭＩ１６４０で構成された。各アッセイの前に、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。この操作を３回繰り返し、細胞を最終的に１ｍｌのアッセイ培地中２×１０5細胞の最終濃度で再懸濁した。５０μｌの再懸濁細胞を９６ウェルアッセイプレートの各アッセイ点に加えた。抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。ＩＬ-１３に反応しない無関係のアアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。ウェル当たり総量５０μｌの適切な試験抗体を細胞に加え、各アッセイ点は総アッセイ容量１００μｌ／ウェルを与えた。アッセイプレートを３７℃で５％ ＣＯ２下で７２時間インキュベートした。次に２５μｌのトリチウム化チミジン(１０μＣｉ／ｍｌ、(NEN))を各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに４時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート(パーキンエルマー(Perkin Elmer))上で採取した。パッカードトップカウント(Packard TopCount)マイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
図７に示すように、ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)、及びその誘導体であるＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)とＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)は、他のバイオアッセイで観察されたものと同様の相対的力価で、細胞増殖の用量依存性阻害を引き起こすことができた。ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９、ＢＡＫ１１８３Ｈ４、ＢＡＫ１１６７Ｆ２のＩＣ50は、それぞれ４．６ｎＭ、３．５ｎＭ、及び１．１ｎＭであった。市販の抗体ＪＥＳ１０-５Ａ２とＢ-Ｂ１３のＩＣ50は、それぞれ１０．７ｎＭと１６．７ｎＭであった。
実施例８
疾患関連初代細胞におけるＩＬ-１３依存性応答に対するリード抗ヒトＩＬ-１３抗体の中和力価
初代細胞及び気道疾患により関連のある読み出し情報を使用して、２次バイオアッセイを行った。これらは、正常ヒト肺繊維芽細胞(ＮＨＬＦ)からのエオタキシン放出、ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)の表面上における血管細胞接着分子１(ＶＣＡＭ-１)の上方制御であった。両方のＩＬ-１３依存性応答が、喘息症状の特徴である好酸球のリクルート[92]に寄与した。
ＮＨＬＦアッセイプロトコール
ＩＬ-１３は、肺繊維芽細胞からエオタキシン放出を引き起こすことが示されている[77][78][79]。ＮＨＬＦからの因子依存性エオタキシン放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
ＮＨＬＦはバイオウィッタカー(Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地はＦＧＭ-２(バイオウィッタカー)であった。
抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。ＩＬ-１３に反応しない無関係の抗体を陰性対照として使用した。次に、組換え細菌由来のヒトＩＬ-１３(ペプロテク)を、２００μｌの総量中の適切な試験抗体と混合した際に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用されるＩＬ-１３の濃度を、約８０％の最大応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で３０分間インキュベートした。次に９６ウェルアッセイプレート中でウェル当たり１×１０4細胞の密度であらかじめ撒いておいたＮＨＬＦにアッセイ試料を加えた。アッセイプレートを３７℃で５％ ＣＯ2下で１６〜２４時間インキュベートした。アッセイプレートを３００×ｇで５分間遠心分離して、剥がれた細胞をペレット化した。上清中のエオタキシンレベルを、製造業者(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))により提供された試薬と方法とを使用して、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。グラフパッドプリズム(Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
ＢＡＫ２７８Ｄ６系統クローンは、ＮＨＬＦからのＩＬ-１３依存性エオタキシン放出を阻害することができた。相対的力価は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった(図８)。ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)、ＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)は、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-１３に対してＩＣ50がそれぞれ２０７ｐＭ、１１８ｐＭ、及び６９ｐＭであった。市販の抗体であるＪＥＳ１０-５Ａ２とＢ-Ｂ１３はＩＣ50がそれぞれ６２３ｐＭと２１９ｐＭであった。
ＨＵＶＥＣアッセイプロトコール
ＩＬ-１３は、ＨＵＶＥＣの細胞表面上のＶＣＡＭ-１の発現を上昇させることが証明されている[8０,８1]。因子依存性ＶＣＡＭ-１発現を、時間分解蛍光読み出しを使用してＶＣＡＭ-１受容体細胞発現のアップレギュレーションの検出により測定した。
ＨＵＶＥＣをバイオウィッタカーから得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地はＥＧＭ-２(バイオウィッタカー)であった。抗体の試験溶液(三重測定)をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。ＩＬ-１３に反応しない無関係の抗体を陰性対照として使用した。次に、組換え細菌由来のヒトＩＬ-１３(ペプロテク)を、２００μｌの総量中の適切な試験抗体と混合した際に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用したＩＬ-１３の濃度を、約８０％の最大応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で３０分間インキュベートした。次に９６ウェルアッセイプレート中でウェル当たり４×１０4細胞の密度であらかじめ撒いてあったＨＵＶＥＣにアッセイ試料を加えた。アッセイプレートを３７℃で５％ ＣＯ2下で１６〜２０時間インキュベートした。次にアッセイ培地を吸引して除去し、ブロッキング溶液(４％の乾燥マーベル(Ｍａｒｖｅｌ)(商標)ミルク粉末を含有するＰＢＳ)で置換した。アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ・Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、１００μｌ(ＰＢＳＴ／１％マーベル(商標)中に１：５００希釈)のビオチン化抗ＶＣＡＭ-１抗体(セロテック(Ｓｅｒｏｔｅｃ))を各ウェルに加えた。アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルをデルフィア(Ｄｅｌｆｉａ)洗浄緩衝液(パーキンエルマー)で３回洗浄後、１００μｌのユーロピウム標識ストレプトアビジン又は抗ネズミＩｇＧ１(デルフィア(Ｄｅｌｆｉａ)洗浄緩衝液(パーキンエルマー(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)で１：１０００希釈)を各ウェルに加えた。次にアッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルをデルフィア(Ｄｅｌｆｉａ)洗浄緩衝液(パーキンエルマー(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ))で７回洗浄した。最後に１００μｌの増強溶液(パーキンエルマー)を各ウェルに加え、ワラック(Wallac)１４２０ビクター２(VICTOR２)プレートリーダー(標準的ユーロピウムプロトコール)を使用して、蛍光強度を測定した。グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)、ＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)の全抗体ヒトＩｇＧ４としての典型的なデータを図９に示す。相対的力価はＴＦ-１細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった。ＢＡＫ５０２Ｇ９、ＢＡＫ１１８３Ｈ４、及びＢＡＫ１１６７Ｆ２のＩＣ50は、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-１３に対してそれぞれ２３５ｐＭ、５８ｐＭ、及び５５ｐＭであった。
実施例９
ＩＬ-１βとＩＬ-４依存性ＶＣＡＭ-１アップレギュレーションに対する抗ＩＬ-１３抗体の中和力価
ＢＡＫ２７８Ｄ６系統のクローンの特異性をＨＵＶＥＣバイオアッセイを修飾して評価した。ＩＬ-１３とともにＩＬ-４とＩＬ-１βの両方が、ＨＵＶＥＣの細胞表面上のＶＣＡＭ-１の発現をアップレギュレートすることが証明されている[8０,８1]。
ＨＵＶＥＣアッセイプロトコール
アッセイは、以下の変更を加えて基本的に実施例５に記載したように行った。ヒトＩＬ-１３の代わりに組換えヒトＩＬ-１βとＩＬ-４(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))をそれぞれ０．５ｎｇ／ｍｌと１ｎｇ／ｍｌで使用し、最大応答の約８０％を与える用量であった。
結果
ＢＡＫ２７８Ｄ６系統からの評価したクローンのいずれも、ヒトＩＬ-１βとＩＬ-４に応答してＶＣＡＭ-１アップレギュレーションを中和せず、従ってＩＬ-１３に対する特異性を示さなかった(図１０)。ＩＬ-４はＩＬ-１３と最も密接に関連し、アミノ酸レベルで３０％の配列同一性を共有する[82]。
実施例１０
ネズミＩＬ-１３依存性ネズミＢ９細胞増殖アッセイにおけるヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の中和力価
実施例１に記載したようにｓｃＦｖとして抗ネズミＩＬ-１３中和クローンとして同定されたＢＡＫ２０９Ｂ１１を、実施例５に記載したように全抗体ヒトＩｇＧ４として再フォーマット化し、その力価をネズミＩＬ-１３依存性Ｂ９細胞増殖アッセイにおいて評価した。Ｂ９はネズミＢ細胞ハイブリドーマ細胞株である[83]。Ｂ９は生存と増殖について因子依存性である。この点でＢ９細胞はネズミＩＬ-１３に応答し、ヒトＩＬ-６(５０ｐｇ／ｍｌ、アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))を含有する培地中で維持される。ネズミＩＬ-１３依存性増殖の阻害を、分裂細胞の新たに合成されたＤＮＡへのトリチウム化チミジンの取り込みの低下を測定することにより測定した。
Ｂ９細胞アッセイプロトコール
Ｂ９細胞は、動物細胞培養物のヨーロッパコレクション(Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ)(ＥＣＡＣＣ)から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイは以下の変更を加えて基本的に実施例２でＴＦ-１アッセイについて記載したように行った。アッセイ培地は、５％胎児牛血清(ハイクローン(Ｈｙｃｌｏｎｅ))と５０μＭ ２-メルカプトエタノールとを含有するグルタマックスＩ(インビトロゲン)を含むＲＰＭＩ１６４０で構成された。組換え細菌由来のネズミＩＬ-１３(ペプロテク)は、ヒトＩＬ-１３を最終濃度１ｎｇ／ｍｌで置換した。
結果
ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６)は、Ｂ９アッセイにおいて１ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ-１３を７７６ｐＭのＩＣ50で中和した(図１１)。従ってＢＡＫ２０９Ｂ１１は、疾患のネズミモデルにおいてＩＬ-１３の役割を研究するための有用な手段である。これは明らかに実施例１２で証明され、これは急性肺炎症のネズミモデルでＢＡＫ２０９Ｂ１１の効力を証明している。
実施例１１
ビアコア分析による抗ＩＬ-１３抗体の親和性測定
ヒトＩｇＧ４としての、ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(ＶＨ配列番号３５；ＶＬ配列番号３６)、及びＢＡＫ１１８３Ｈ４(ＶＨ配列番号３７；ＶＬ配列番号３８)のヒトＩＬ-１３に対する親和性とＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６)のネズミＩＬ-１３に対する親和性を、基本的に[72]に記載のようにビアコア２０００バイオセンサー(ビアコアエービー(ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ))を使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約５００Ｒｕの表面密度で、アミン結合キット（ビアコア）を使用して、抗体をセンサーチップに結合させ、そしてＨＢＳ-ＥＰ緩衝液中にＩＬ-１３を連続希釈（５０ｎＭ〜０．７８ｎＭ）した液を、センサーチップ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをＢＩＡ評価３．１ソフトウェアを使用して評価して、動力学データを得た。
結果
ＢＡＫ５０２Ｇ９、ＢＡＫ１１６７Ｆ２、及びＢＡＫ１１８３Ｈ４のＩｇＧ４は、それぞれ１７８ｐＭ、１３６ｐＭ及び８１ｐＭのＫｄの高親和性でヒトＩＬ-１３に結合し、細胞に基づいたアッセイにおける相対効力に一致した。ＢＡＫ２０９Ｂ１１はネズミＩＬ-１３に５．１ｎＭの親和性で結合した(表３)。
実施例１２
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルにおけるＢＡＫ２０９Ｂ１１の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
ＢＡＫ２０９Ｂ１１（ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６）、つまり抗ネズミＩＬ−１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効力は、急性アレルギー性肺炎において調べられた。このモデルは、基本的にＲｉｆｆｏ-Ｖａｓｑｕｅｚら[84]に記載されたように行い、その終点において、気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)ＩＬ-１３の上昇(図１２)、肺とＢＡＬへの細胞浸潤(図１３)、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
メスのＢａｌｂ／ｃマウス(チャールズリバー(Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ)、英国)を抗ネズミＩＬ-１３抗体ＢＡＫ２０９Ｂ１１(１２、３６、１１９、又は３５７μｇの用量)又はアアイソタイプ一致対照抗体(３５７μｇ用量)で処理した。０日と７日目に各群のマウスを、０．２ｍｌの溶媒(アジュバントとして２％ Ａｌ2Ｏ3(レヒドラゲル(Rehydragel))を含有する生理食塩水)中の１０μｇのオボアルブミン(Ｏｖａ)の腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。１４、１５、及び１６日目にマウスにオボアルブミンで抗原刺激した。オボアルブミンは、滅菌生理食塩水中に１％(ｗ／ｖ)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ｏｖａを、１時間の間隔で分わけた２０分間の一連の３回の暴露でデビルビスウルトラネブ(deVilbiss Ultraneb)２０００ネブライザー(サンライズメディカル(Sunrise Medical))を使用してエアゾル化した。
ＢＡＫ２０９Ｂ１１又は無関係のヒトＩｇＧ４を、最初の抗原刺激の１日前と以後の各抗原刺激(全部で４回投与)の２時間前に静脈内投与した。このモデルは、１７日目に最後の抗原刺激の２４時間後に終了した。血液(血清)とＢＡＬを採取した。総ＩｇＥについて血清を測定した。３回一定量の生理食塩水(０．３ｍｌ、０．３ｍｌと０．４ｍｌ)を注射することによりＢＡＬを得て試料をプールした。ＢＡＬ細胞から総白血球と白血球百分率を得た。
結果
感作マウスのオボアルブミン抗原刺激は、非感作であるが抗原刺激した動物よりも、総ＢＡＬ細胞動員の有意な(ｐ＜０．０５)上昇を引き起こした。当該リクルートはＢＡＫ２０９Ｂ１１により用量依存性に阻害された；有意な(ｐ＜０．０５)阻害は、３６μｇ以上のＢＡＫ２０９Ｂ１１で見られたが、対照抗体ではみられなかった(図１３)。同様の作用が好酸球(図１４)と好中球(図１５)についてみられ、ＢＡＫ２０９Ｂ１１の最小用量３６μｇで細胞流入の有意な(ｐ＜０．０５)阻害が見られた。この阻害は対照抗体では見られなかった。リンパ球は抗原刺激された際に、感作マウスでは誘導されたが、非感作マウスでは誘導されなかった。この誘導はＢＡＫ２０９Ｂ１１により用量依存性に阻害され、３６μｇのＢＡＫ２０９Ｂ１１により最大の阻害が見られた。対照抗体は何の作用もなかった(図１６)。非感作動物と比較した時、感作動物では単球／マクロファージは誘導されなかったが、バックグランドレベルは３６μｇ以上のＢＡＫ２０９Ｂ１１により抑制され、対照抗体では抑制されなかった(図１７)。血清ＩｇＥレベルは、抗原刺激後の非感作動物と比較すると感作動物では有意に上昇した(ｐ＜０．０５)。この上昇は、３６μｇのＢＡＫ２０９Ｂ１１を用いる処理後に低下したが、対照抗体によっては低下しなかった。
要約するとネズミＩＬ-１３中和抗体であるＢＡＫ２０９Ｂ１１の全身性投与は、炎症性細胞流入を阻害し、アレルギー性炎症のネズミモデルでオボアルブミンによる感作と以後の抗原刺激により引き起こされる血清ＩｇＥレベルのアップレギュレーションを阻害した(対照抗体は阻害作用はなかった)。
実施例１３〜２０は予測である。
実施例１３
急性肺炎症のロイド(Ｌｌｏｙｄ)ネズミモデルにおけるＢＡＫ２０９Ｂ１１の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
ネズミＩＬ-１３中和抗体であるＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６)の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第２のネズミモデルで研究した。このモデルは、基本的にMcMillanら[85]が記載したように行い、その終点でＢＡＬ及び肺組織ＩＬ-１３の上昇、肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
メスのＢａｌｂ／Ｃマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミＩＬ-１３抗体ＢＡＫ２０９Ｂ１１又はアイソタイプ一致対照抗体を以下のように投与した。０日と１２日目に各群のマウスを、０．２ｍｌの溶媒(アジュバント［実施例１２に記載のように計算される]として２ｍｇのＡｌ(ＯＨ)3を含有する生理食塩水)中１０μｇのオボアルブミン(Ｏｖａ)の腹腔内注射により感作(ＳＮ)した。別の対照群の非感作マウス(ＮＳ)には、等量の溶媒を投与した。１９、２０、２１、２２、２３、及び２４日目にマウスにオボアルブミンを２０分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に５％(ｗ／ｖ)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ｏｖａを、デビルビスウルトラネブ２０００ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。１８、１９、２０、２１、２２、２３、及び２４日目にマウスに種々の腹腔内用量(２３７μｇ、２３．７μｇ、又は２．３７μｇ；図２１でＨ、Ｍ、及びＬとして示す)の抗ネズミＩＬ-１３抗体であるＢＡＫ２０９Ｂ１１ ｍｕＩｇＧ１又はアイソタイプ一致対照抗体(２３７μｇ)を投与した。０日と２５日目にメタコリン抗原刺激を増加し、意識下体積変動(ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙ)(ブクスコ(Ｂｕｘｃｏ))を追跡して、気道機能を評価した。個々のマウスについて０日と２５日目にメタコリン用量応答曲線の４パラメータ非固定カーブフィッティングから、ＰＣ50(ベースラインＰｅｎＨを５０％上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を推定した。
このモデルは、２５日目に最後の抗原刺激の２４時間後に終了した。血液、血清、ＢＡＬ、及び肺組織を採取した。
結果
０日(処理前)と２５日(抗原刺激後)に個々の動物の肺機能を評価し、ＰＣ５０値(ベースラインＰｅｎＨを５０％上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を計算して定量した(図２１Ａ)。個々の気道過剰応答(ＡＨＲ)を、２５日目のｌｏｇ ＰＣ50の０日からの変化(ｌｏｇ ２５日ＰＣ50-ｌｏｇ ０日ＰＣ50)により測定した。このｌｏｇ ＰＣ５０の変化量は試験の１次終点であった；ＰＣ50データは終点ＡＮＯＶＡの必要性のためにｌｏｇ変換した。個々の変化を群内で平均して、群平均のｌｏｇ ＰＣ50の変化量を得た(図２１Ｂに示す)。
感作マウスのオボアルブミン抗原刺激は、非感作の抗原刺激マウスと比較して有意なＡＨＲを引き起こした(ｐ＜０．０１)。ＢＡＫ２０９Ｂ１１はＡＨＲの明確で用量依存性の低下を引き起こしたが、対照抗体は何の作用も無かった。
実施例１４
急性肺炎症のゲラード(Ｇｅｒａｄ)ネズミモデルにおけるＢＡＫ２０９Ｂ１１の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
抗ネズミＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体であるＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６)の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第３のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にＨｕｍｂｌｅｓら[86]が記載したように行い、その終点でＢＡＬ及び肺組織ＩＬ-１３の上昇、肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
メスのＢａｌｂ／Ｃマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミＩＬ-１３抗体 ＢＡＫ２０９Ｂ１１ 又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。０、７、及び１４日目に各群のマウスを、０．２ｍｌの溶媒(アジュバント［実施例１２に記載のように計算される]として１．１２５ｍｇのＡｌ(ＯＨ)3を含有する生理食塩水)中１０μｇのオボアルブミン(Ｏｖａ)の腹腔内注射により感作(ＳＮ)した。別の対照群の非感作マウス(ＮＳ)には、等量の溶媒を投与した。２１、２２、２３、及び２４日目にマウスにオボアルブミンを２０分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に５％(ｗ／ｖ)に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ｏｖａを、デビルビスウルトラネブ２０００ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。
このモデルは、２５日目に抗原刺激の２４時間後に終了した。血液、血清、ＢＡＬ、及び肺組織を採取した。
実施例１５
肺炎症のロイド(Ｌｌｏｙｄ)慢性モデルにおけるＢＡＫ２０９Ｂ１１の効力
慢性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
抗ネズミＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体であるＢＡＫ２０９Ｂ１１(ＶＨ配列番号２５；ＶＬ配列番号２６)の効果を、慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら[87]が記載したように行い、その終点で肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
メスのＢａｌｂ／Ｃマウス(チャールズリバー、英国)に種々の用量の抗ネズミＩＬ-１３抗体ＢＡＫ２０９Ｂ１１又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。０、及び１１日目に各群のマウスを、０．２ｍｌの溶媒(アジュバント［実施例１２に記載のように計算される]として２ｍｇのＡｌ(ＯＨ)3を含有する生理食塩水)中１０μｇのオボアルブミン(Ｏｖａ)の腹腔内注射により感作(ＳＮ)した。別の対照群の非感作マウス(ＮＳ)には、等量の溶媒を投与した。１８、１９、２０、２１、２２、２３、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４９、及び５１日目にマウスをオボアルブミンで２０分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に５％(ｗ／ｖ)に希釈した後、噴霧した。全ての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ｏｖａを、デビルビスウルトラネブ２０００ネブライザー(サンライズメディカル)を使用してエアゾル化した。
このモデルは、５２日目に抗原刺激の２４時間後に終了した。血液、血清、ＢＡＬ、及び肺組織を採取した。
実施例１６
ネズミ空気嚢（air pouch）モデルに投与した外来性ヒトＩＬ-１３に対する抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
ヒトＩＬ-１３の炎症促進作用に対する抗ヒトＩＬ-１３抗体の効果を、基本的なネズミモデルで調べた。このモデルは基本的にEdwardsら[93]が記載したように行い、その終点で空気嚢への細胞浸潤により解析した。
モデルプロトコール
０日目に２．５ｍｌの無菌空気を皮下注射して、メスのＢａｌｂ／ｃマウスの背中に空気嚢を作成した。３日目にさらに２．５ｍｌの無菌空気を用いて空気嚢を再度膨らませた。６日目に０．７５％ ＣＭＣ中の２μｇのｈｕＩＬ-１３を直接嚢内に注入した。２４時間後マウスを屠殺し、空気嚢を１ｍｌのヘパリン化食塩水で洗浄した。抗体処理は、（嚢内で）ｈｕＩＬ-１３を用いて又は全身で行った。
結果
溶媒(生理食塩水中０．７５％のカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)、腹腔内)処理マウスに対して抗原刺激後２４時間では、空気嚢に注射(腹腔内)したヒトＩＬ-１３は総白血球(ｐ＜０．０１)と好酸球(ｐ＜０．０１)の浸潤の有意な上昇を引き起こした。
局所投与されたＢＡＫ５０２Ｇ９(嚢内に２００ｍｇ、２０ｍｇ、又は２ｍｇ)は、０．７５％ ＣＭＣ中２μｇのｈｕＩＬ-１３により誘導された空気嚢への総白血球(ｐ＜０．０１)と好酸球(ｐ＜０．０１)浸潤とを有意にかつ用量依存性に阻害した。
全身性に投与したＢＡＫ２０９Ｂ１１(３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇ)もまた、０．７５％ ＣＭＣ中２μｇのｈｕＩＬ-１３により発生した空気嚢への総白血球(ｐ＜０．０１)と好酸球(ｐ＜０．０１)浸潤とを有意にかつ用量依存性に阻害した。
実施例１７
肺アレルギー性炎症モデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力を評価するためのヒトＩＬ-１３ノックイン／ネズミＩＬ-１３ノックアウトトランスジェニックマウスの作成
本発明者は、遺伝子ターゲティングにより、ネズミではなくヒトＩＬ-１３を発現するマウスを作成した。マウスＩＬ-１３遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでヒトＩＬ-１３遺伝子の関連部分で置換されている。このマウス種は、内因性ＩＬ-１３プロモーターとＩＬ-１３ ｐＡテイルが変化していないため、野生型マウスと同じ刺激に応答してマウスＩＬ-１３ではなくヒトＩＬ-１３を発現する。ヒトＩＬ-１３はマウスＩＬ-１３受容体に結合しこれを介してシグナル伝達して、マウスＩＬ-１３受容体に結合するマウスＩＬ-１３により引き起こされるシグナル伝達と同じ生理学的結果を生成できることが証明されている。例えば外因性ヒトＩＬ-１３は、ネズミ空気嚢への炎症性細胞のリクルートを引き起こした(図１８)。これらのトランスジェニック動物は、樹立された疾患のネズミモデルで非ネズミ交差反応性抗ヒトＩＬ-１３抗体を評価することを可能にする。
このマウスは、急性アレルギー性気道炎症モデル(実施例１８と１９に記載)や慢性アレルギー性気道炎症モデル(実施例２０に記載)で使用されており、アレルギー性気道疾患における抗ヒトＩＬ-１３抗体の薬理を評価することを可能にする。
実施例１８
急性肺炎症におけるｈｕＩＬ-１３トランスジェニックロイドネズミモデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
抗ヒトＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効果を、実施例１７で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にMcMillanら[85]が記載したようにかつ実施例１３に記載したように行った。このモデルは、その終点でＢＡＬ及び肺組織ＩＬ-１３の上昇、肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
このモデルのプロトコールは、ＢＡＫ２０９Ｂ１１の代わりに抗ヒトＩＬ-１３抗体を投与した以外は実施例１３と同じである。
実施例１９
急性肺炎症におけるｈｕＩＬ-１３トランスジェニックゲラード(Ｇｅｒａｄ)ネズミモデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル
抗ヒトＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効果を、実施例１７で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症の別のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にＨｕｍｂｌｅｓら[86]が記載したようにかつ実施例１４に記載したように行った。このモデルは、その終点でＢＡＬ及び肺組織ＩＬ-１３の上昇、肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
このモデルのプロトコールは、ＢＡＫ２０９Ｂ１１の代わりに抗ヒトＩＬ-１３抗体を投与した以外は実施例１４と同じである。
実施例２０
肺炎症におけるｈｕＩＬ-１３トランスジェニックロイド(Ｌｌｏｙｄ)ネズミモデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
抗ヒトＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効果を、実施例１７で作成したトランスジェニックマウスを使用して慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら[87]が記載したようにかつ実施例１５に記載したように行った。このモデルは、その終点で肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答(ＡＨＲ)により解析される。
モデルプロトコール
このモデルのプロトコールは、ＢＡＫ２０９Ｂ１１の代わりに抗ヒトＩＬ-１３抗体を投与した以外は実施例１５と同じである。
実施例２１
アスカリス・スウム(Ascaris．suum)アレルギー性カニクイザル(cynomolgus monkey)における抗ヒトＩＬ-１３抗体の薬物動態と薬力学
５０２Ｇ９の薬物動態と薬力学を、１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内大量投与後の４匹のアレルギー性であるが非抗原刺激カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)霊長類(オス２匹／メス２匹)で評価した。実験は２９日間行った。血清-薬剤濃度曲線の幾何平均から抗体の薬物動態パラメータを決定し、これを以下の表４に示す。
同じ試験で、ヒトＩｇＥ ＥＬＩＳＡキット(ベチルラボラトリーズ(Bethyl Laboratories)、米国)を使用して血清ＩｇＥ濃度も追跡した。
結果
血清ＩｇＥ濃度はＢＡＫ５０２Ｇ９の１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内大量投与後に、１００％対照レベル(投与前)から、投与の４日間後と５日間後に対照値の６６±１０％まで有意に低下した(ｐ＜０．０５)。血清ＩｇＥ濃度の低下は、２２日目までに対照レベルの８８±８％まで回復した(図２０を参照)。再度これらのデータは、各動物の血清ＩｇＥ濃度を投与前レベルに対して標準化(投与前濃度を１００％とする)し、次に試験した４匹の動物からの曲線を平均して得られた。
２匹のオスのサルは比較的低い投与前総血清ＩｇＥを有した(６０ｎｇ／ｍｌと６７ｎｇ／ｍｌ)。これらのＩｇＥレベルは、ＢＡＫ５０２Ｇ９による治療後の傾向を示唆するようには変化しなかった(図２０Ｂ)。２匹のメスのサルは比較的高い投与前総血清ＩｇＥを有した(１２０９ｎｇ／ｍｌと４４９ｎｇ／ｍｌ)。これらのＩｇＥレベルは、ＢＡＫ５０２Ｇ９による治療後に低下し、７日目に最大６０％まで低下し、投与後２８日目までにほぼ投与前レベルまで回復した(図２０Ｂ)。これらのデータはＢＡＫ５０２Ｇ９が、ＩｇＥの比較的高い循環ＩｇＥを有する動物の血清ＩｇＥ濃度を低下させることを示す。
実施例２２
皮膚アレルギーのカニクイザル(cynomolgus monkey)モデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
抗ヒトＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、ヒトＩＬ-１３とアスカリス・スウム抗原とをカニクイザル(cynomolgus monkey)に皮内注射することにより行った。２４〜９６時間後、皮膚生検試料と血清試料とを取った。このモデルを、その終点で皮膚への細胞浸潤により解析した。
実施例２３
肺アレルギーのカニクイザル(cynomolgus)モデルにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
抗ヒトＩＬ-１３中和ヒトＩｇＧ４抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、アスカリス・スウム(Ａ． ｓｕｕｍ)アレルギー性カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ)霊長類に霧状にしたアスカリス・スウム(Ａ． ｓｕｕｍ)抗原を暴露し、こうしてアレルギー反応を生成させることにより行った。このアレルギーは、その終点で肺とＢＡＬへの細胞浸潤、血清ＩｇＥレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。
さらにフローサイトメトリー法を使用して薬力学をエクスビボで評価した。ＣＤ２３は高親和性ＩｇＥ受容体であり、ヒト末梢血の単核細胞上で発現することができる。ＣＤ２３発現は、ＣＤ２３を発現する細胞の数と各細胞がどれだけ多くのＣＤ２３を発現するかという点で、ＩＬ-１３とＩＬ-４の両方により誘導することができる。ＩＬ-１３(ＩＬ-４ではない)介在応答は、抗ヒトＩＬ-１３抗体により阻害されうる。
この２相試験に参加させるための動物を、霧状にした抗原(アスカリス・スウム(Ａ． ｓｕｕｍ)抽出物)の抗原刺激後のあらかじめ樹立したＡＨＲに基づいて選択した。第Ｉ相気道機能は、１日目と１１日目に静脈内ヒスタミン抗原刺激中に評価した。ＰＣ30(ベースラインを超える肺抵抗性(ＲL)の３０％の上昇を引き起こすのに必要なヒスタミン用量)を、各ヒスタミン用量応答曲線から決定した。９日目と１０日目に動物に、ＲLの４０％上昇と動的コンプライアンス(ＣDYN)の３５％の低下を引き起こすことがすでに証明されている霧状にした抗原の個々に調整した用量で抗原刺激した。このモデルでは従来、第１回より第２回のアレルゲン投与より、より大きいＲLが観察され、これは抗原プライミングである。２回の抗原刺激は、１日目に比較して１１日目にヒスタミン用量応答曲線下の面積の上昇と、ＰＣ30、ＢＡＬ、並びに好酸球の低下により測定されるように、ＡＨＲを引き起こした。ＡＨＲ症状を示す動物を選択して第ＩＩ相に入れた。
第ＩＩ相は、すべての動物に１日目、５日目、及び９日目に３０ｍｇ／ｋｇのＢＡＫ５０２Ｇ９を注入した以外は、第Ｉ相と全く同様に行った。ＢＡＫ５０２Ｇ９の効果は、個々の動物について第ＩＩ相で見られた変化を第Ｉ相で見られた変化と比較して評価した。
血液、血清、ＢＡＬ、及び肺組織を採取した。血清ＩｇＥレベルはＥＬＩＳＡにより追跡した。ＢＡＫ５０２Ｇ９処理したカニクイザルの血清は、ＩＬ-１３(ＩＬ-４ではない)により誘導されるヒト末梢血単核細胞上のＣＤ２３の発現を阻害することが証明された。この阻害の大きさは、ＰＫ ＥＬＩＳＡにより予測された血清ＢＡＫ５０２Ｇ９レベルと一致した。
結果
ＲL ＡＵＣにより測定すると、ＢＡＫ５０２Ｇ９はＡＨＲを有意に阻害した(ｐ＜０．０５)(図２６Ａ；表７)。ＰＣ30により測定するとＡＨＲに対するＢＡＫ５０２Ｇ９の阻害作用が観察されたが、統計的有意性には達しなかった(図２６Ｂ；表７)。ＢＡＫ５０２Ｇ９はまた、抗原プライミング(ｐ＜０．０１)(図２６Ｃ；表７)とＢＡＬ炎症とを有意に阻害した。ＢＡＫ５０２Ｇ９は、ＢＡＬへの総細胞(ｐ＜０．０１)と好酸球(ｐ＜０．０５)流入とを有意に阻害したが、マクロファージ、リンパ球又は肥満細胞の流入は阻害しなかった(図２６Ｄ；表７)。
実施例２４
ヒトＩＬ-１３をマウス肺に投与する際に、発症する喘息症状に対する抗ヒトＩＬ-１３抗体の効力
気道過剰応答のネズミモデル
マウス肺へのヒトＩＬ-１３の投与後の気道過剰応答(ＡＨＲ)の発症に対する抗ヒトＩＬ-１３中和抗体ＢＡＫ５０２Ｇ９の効力を調べた。このモデルは、ネズミＩＬ-１３の代わりにヒトＩＬ-１３を使用した以外は基本的にYangら[1１9]により記載されたように行った。
モデルプロトコール
症状を出現させるために、４８時間の間隔でオスのＢａｌｂ／ｃマウスを２用量のヒトＩＬ-１３に暴露した。簡単に説明するとマウスを、１００μｌのサファン(ｓａｆｆａｎ)溶液(水で１：４希釈)の静脈内注射により麻酔した。マウスに２２ゲージのカテーテル針を挿管し、ここからヒト組換えＩＬ-１３(２０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)に溶解した２５μｇ)又は溶媒対照(ＰＢＳ)を点滴注入した。ＩＬ-１３の最後の投与の２４時間後にメタコリン抗原刺激を上昇させて、意識下プレスチモグラフィー(ブクスコ(Buxco))を追跡して、気道機能を評価した。メタコリン用量応答曲線の４パラメータ非固定曲線適合から、ＰＣ200(ベースラインＰｅｎＨを２００％上昇させるのに必要なメタコリン濃度)を測定した。各ＩＬ-１３投与の２４時間前に、腹腔内注射により抗体処理を行った。
結果
投薬経験の無い野生型マウスへヒトＩＬ-１３を気管内注入することは、ＰＣ200メタコリン濃度により測定すると、対照動物に対して有意な(ｐ＜０．０５)気道過剰応答がもたらされた。全身に投与されたＢＡＫ５０２Ｇ９(１ｍｇ／ｋｇ)はＡＨＲの出現を有意に(ｐ＜０．０１)阻害し、一方ゼロ対照抗体は何の作用もなかった(図２３)。
実施例２５
ヒトＢ細胞からのヒトＩＬ-１３依存性ＩｇＥ放出に対するヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の中和力価
Ｂ細胞スイッチングアッセイプロトコール
ＩＬ-１３は、インビトロでヒトＢ細胞中のＩｇＥ合成を誘導することが証明されている[1２0]。ヒトＢ細胞からの因子依存性ＩｇＥ放出をＥＬＩＳＡにより測定した。ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の中和力価を、ヒトＢ細胞からのＩＬ-１３依存性ＩｇＥ放出に対して評価した。
１．０７７ｇ／Ｌの密度勾配遠心分離によりヒト・バフィーコート(輸血サービス(Blood Transfusion Service))から末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を精製した。Ｂ細胞はＢ細胞単離キットＩＩ(ミルテニビオテク(Miltenyi Biotec))を用いて製造業者が記載する試薬と方法とを使用してＰＢＭＣから精製した。アッセイ培地は、１０％胎児牛血清と２０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン(セロロジカルズプロテインズ社(Serologicals Proteins Inc．))を含むイスコブ改変ダルベッコー培地(ライフテクノロジーズ(Life Technologies))で構成された。精製後、Ｂ細胞をアッセイ培地に最終濃度１０6／ｍｌで再懸濁した。５０μｌの再懸濁細胞を９６ウェルアッセイプレートの各アッセイ点に加えた。５０μｌの４μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４０抗体ＥＡ５(バイオソース(Biosource))を適宜アッセイウェルに加えた。抗体の試験溶液(６重測定)をアッセイ培地中に所望の濃度に希釈した。ＩＬ-１３と反応しない無関係な抗体を陰性対照として使用した。５０μｌ／ウェルの適切な試験抗体を細胞に加えた。次に、組換え細菌由来のヒトＩＬ-１３(ペプロテク(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ))を加えて最終濃度３０ｎｇ／ｍｌにして総アッセイ容量２００μｌ／ウェルを得た。アッセイで使用したＩＬ-１３の濃度を最大応答を得るように選択した。アッセイプレートを３７℃で５％ＣＯ2下で１４日間インキュベートした。上清中のＩｇＥレベルを、製造業者(ビーディーバイオサイエンシーズ(ＢＤ Biosciences)、ベチルラボラトリーズ(Bethyl Laboratories))が提供する試薬とプロトコールを使用してＥＬＩＳＡにより測定した。グラフパッドプリズム(Graphpad Prism)ソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
図２４に示すように、ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＶＨ配列番号１５；ＶＬ配列番号１６)は、ヒトＢ細胞によるヒトＩＬ-１３依存性ＩｇＥ産生を阻害することができた。ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９は、３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-１３に対して１．８ｎＭのＩＣ50を有した。
実施例２６
初代ヒト気管支平滑筋細胞におけるヒスタミン誘導Ｃａ2+シグナル伝達のＩＬ-１３介在強化に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の効力
ＩＬ-１３は、気道平滑筋の収縮を直接調節することが示されている[121，122]。細胞内カルシウム動員は平滑筋収縮の必須要件である。最近の研究は平滑筋収縮性を改変するＩＬ-１３の能力が、一部は収縮性アゴニスト誘導Ｃａ2+シグナル伝達の調節により仲介されることを証明した[123，124]。
収縮性アゴニストであるヒスタミンに対する初代ヒト気管支平滑筋細胞(ＢＳＭＣ)シグナル伝達応答のＩＬ-１３介在改変に対する、ＩｇＧ４としてフォーマット化した抗ヒトＩＬ-１３抗体であるＢＡＫ５０２Ｇ９の効力を、Ｃａ2+シグナル伝達アッセイで調べた。
ＢＳＭＣ Ｃａ2+シグナル伝達アッセイプロトコール
ヒト初代ＢＳＭＣ、平滑筋増殖培地-２(ＳｍＧＭ-２)と平滑筋基礎培地(ＳｍＢＭ)をバイオウィッタカーから得た。ＢＳＭＣは、販売業者の薦めに従ってＳｍＧＭ-２中で維持した。ＢＳＭＣを９６ウェルマイクロタイター細胞培養プレートに２×１０4細胞／ウェルで撒き、２４時間付着させ、次に再供給し、さらに２４時間インキュベートした。Ｃａ2+シグナル伝達実験の前に、ＢＳＭＣを最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１３(ペプロテク(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ))で抗体有り又は無しで刺激し、１８〜２４時間インキュベートした。ＢＡＫ５０２Ｇ９とイソタイプ一致した無関係の対照モノクローナル抗体ＣＡＴ-０００１を、最終濃度１０μｇ／ｍｌで評価した。ヒスタミン(カルビオケム(Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ))に応答した細胞にＣａ2+濃度(２０μＭから力価測定)を、Ｃａ2+感受性色素Ｆｌｕｏ-４(モレキュラープローブズ(Molecular Probes))と９６ウェル蛍光イメージングプレートリーダー(ＦＬＩＰＲ)(モレキュラーデバイシーズ(Molecular Devices))を用いる標準方法を使用して測定した。ヒスタミンに応答したＣａ2+シグナル伝達応答の曲線下の面積(ＡＵＣ)を、各前処理結合体について測定した。グラフパッドプリズム・ウィンドウズ（登録商標）用バージョン４（GraphPad Software）を使用してデータ解析を行った。
結果
ＩＬ-１３を用いるＢＳＭＣのプレインキュベーションは、ヒスタミンに応答したＣａ2+シグナル伝達を有意に増強した。ＩＬ-１３によるＢＡＫ５０２Ｇ９のプレインキュベーションはヒスタミンに応答したＣａ2+シグナル伝達の強化を有意に阻害した(しかしＩＬ-１３を用いる無関係の対照抗体(図２５Ａ)は阻害しなかった)(図２５)。
実施例２７
ヒトＩＬ-１３依存性ＰＢＭＣ ＣＤ２３発現アッセイにおける抗ＩＬ-１３抗体の中和力価
代表的ＩＬ-１３抗体の力価をヒトＩＬー１３依存性末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)ＣＤ２３発現アッセイで評価した。ＣＤ２３の細胞表面発現を上昇させることにより、ＰＢＭＣはＩＬ-１３とＩＬ-４の両方に反応する[1２0]。ＣＤ２３(FceRII)はＩｇＥについての低親和性受容体であり、種々の炎症性細胞(単核細胞を含む)で発現される。ヒトＩＬ-１３依存性ＣＤ２３発現アップレギュレーションの阻害を、ＰＢＭＣへの蛍光標識ＣＤ２３モノクローナル抗体の結合の低下をフローサイトメトリーにより計測することにより測定した。
アッセイプロトコール
輸血サービス(Blood Transfusion Service)からヒト血液を得て、４０分間のデキストラン-Ｔ５００(ファルマシア(Pharmacia))沈降(最終濃度０．６％)により赤血球を取り除いた。次に白血球と血小板リッチな画分を、３ｍｌの６４％と５ｍｌの８０％(１００％は９部のパーコル(Ｐｅｒｃｏｌｌ)と１部の１０×ＰＢＳである)の不連続パーコル勾配上で２０分間１１３７ｇで遠心することにより分離した。６４％層の上部からＰＢＭＣを採取し、アッセイ緩衝液(インビトロゲン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ-グルタミン)に再懸濁した。アッセイは、２×１０6細胞、±８０ｐＭ組換えヒトＩＬ-１３(ペプロテク)又は２１ｐＭ 組換えヒトＩＬ-４(アールアンドディーシステムズ)、±ＢＡＫ５０２Ｇ９又は無関係のＩｇＧ４を最終容量５００ｍｃｌ中に含有する２４ウェルプレート中で行った。細胞を３７℃で４８時間培養した後採取し、ＣＤ２３-ＰＥ(ビーディーファーミンゲン)で４℃で２０分間染色した。最後に、細胞をフローサイトメーター上で読んだ。ＣＤ２３発現を、ＣＤ２３「スコア」により測定した；ＣＤ２３陽性細胞のパーセントに染色の「明るさ」を掛けた(幾何平均蛍光)。刺激物質の無いＣＤ２３「スコア」を引き、データをＩＬ-１３単独に対する応答(１００％)のパーセントとして示した。データは、４〜６人の個々のドナーからの細胞を使用して各点を三重測定で行い、４〜６回の異なる実験から得られた平均±ＳＥＭとして表した。
結果
ＰＢＭＣと８０ｐＭのＩＬ-１３又は２１ｐＭのＩＬ-４との４８時間のインキュベーションにより、明らかにＣＤ２３が発現された(図２７と図２８)。ＢＡＫ５０２Ｇ９は用量依存性にＩＬ-１３誘導ＣＤ２３発現を阻害し、幾何平均は１２０．２ｐＭであった(図２７)。これに対してＢＡＫ５０２Ｇ９は、２１．４ｐＭのＩＬ-４(個々のドナーからｎ＝４、図２８)により誘導されるＣＤ２３発現は阻害できなかった。無関係のＩｇＧ４は、ＰＢＭＣ上のＩＬ-１３又はＩＬ-４依存性ＣＤ２３発現を阻害しなかった(図２７と図２８)。８０ｐＭのＩＬ-１３と２１．４ｐＭのＩＬ-４によるＰＢＭＣの同時刺激は、付加的ＣＤ２３発現を引き起こした。ＢＡＫ５０２Ｇ９(ＣＡＴ-００１ではない)は、ＣＤ２３発現レベルをＩＬ-４刺激単独で見られるレベルまで低下させた(図２８)。
実施例２８
ヒトＩＬ-１３依存性好酸球形態変化アッセイにおけるヒトＩＬ-１３抗体の中和力価
本試験の目的は、ＩＬ-１３[125,126]、ＴＮＦ-α[127]、ＴＧＦ-β１[128]のような喘息患者の肺に存在する因子で刺激後に、ＮＨＬＦから放出されるメディエーターにより誘導される好酸球形態変化に対するＩＬ-１３抗体の効果を評価することであった。ＩＬ-１３はＴＮＦ-α[1２9]又はＴＧＦ-β１[130]と相乗作用して、エオタキシン-１を産生するように繊維芽細胞を誘導し、次にこれは直接好酸球を化学誘引するように作用することができる。白血球形態変化応答は細胞骨格の再配置により仲介され、微小循環から炎症部位への白血球遊走プロセスに必須である。ＮＨＬＦによるＩＬ-１３依存性形態変化誘導因子放出の阻害は、ＥＬＩＳＡによりエオタキシン-１分泌の低下とフローサイトメトリーにより好酸球の形態変化を減少を測定することにより測定した。
アッセイプロトコール
ＮＨＬＦ細胞を、培地単独又は刺激物質[9．６ｎＭのＩＬ-１３、２８５．７ｐＭのＴＮＦ-α(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))及び１６０ｐＭのＴＧＦ-β１(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))]を含有する培地とともに、ＢＡＫ５０２Ｇ９(濃度範囲８７５ｎＭ〜６．８４ｎＭ)の非存在下又は存在下で同時培養した。次に細胞を３７℃でさらに４８時間培養後、得られた調整培地を吸引し、-８０℃で保存した。調整培地中のエオタキシン-１の濃度は、アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)ヂュオセット(Ｄｕｏｓｅｔ)ＥＬＩＳＡ系(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))を使用して評価した。
輸血サービス(Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ)からヒト血液を得て、４０分間のデキストラン-Ｔ５００(ファルマシア(Ｐｈａｒｍａｃｉａ))沈降(最終濃度０．６％)により赤血球を枯渇させた。次に白血球と血小板リッチな画分を、３ｍｌの６４＆と５ｍｌの８０％(１００％は９部のパーコル(Ｐｅｒｃｏｌｌ)と１部の１０×ＰＢＳである)の不連続パーコル勾配上の２０分間の１１３７ｇの遠心により分離した。６４％：８０％界面から顆粒球を採取し、洗浄し、アッセイ緩衝液(シグマ(Ｓｉｇｍａ)ＰＢＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ヘペス、１０ｍＭ Ｄ-グルコース、０．１％シグマ(Ｓｉｇｍａ)ＢＳＡ、ｐＨ７．３)に再懸濁した。アッセイはＦＡＣＳチューブ中で５×１０5細胞、±３ｎＭ 組換えヒトエオタキシン-１(アールアンドディーシステムズ(Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ))又は調整培地を用いて、最終容量４００μｌで行った。細胞を３７℃℃で８．５分間インキュベート後、４℃に移し、固定剤(セルフィックス(ＣｅｌｌＦｉｘ)、ビーディーバイオサネンス(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ))で固定し、最後にフローサイトメーターで読んだ。好酸球をそのＦＬ-２自己蛍光により同定し、前進スキャター(ＦＳＣ)パラメータを読んだ。好酸球ＦＳＣはエオタキシン-１と調整培地の両方に応答して変化し、形態変化が測定された。チューブを高流速でサンプリングし、１０００の好酸球イベント後又は１分後(いずれか早い方)に採取を停止した。形態変化を、形態変化緩衝液単独により引き起こされたＦＳＣ(１００％ブランク形態変化)のパーセントとして計算した。データは、４回の異なる実験から得られた平均％ブランク形態変化±ＳＥＭとして表した。各実験では、個々のバフィーコート(従って個々のドナー)からの細胞を使用して各点について二重測定で行った。
結果
ＮＨＬＦ細胞を９．６ｎＭのＩＬ-１３、２８５．７ｐＭのＴＮＦ-α及び１６０ｐＭのＴＧＦ-β１で同時刺激し４８時間培養すると、９．６ｎＭのエオタキシン-１を培地中に分泌した。これに対して維持培地のみで培養したＮＨＬＦ細胞は、培地中に０．１ｎＭのエオタキシン-１を分泌したのみである。ＩＬ-１３／ＴＮＦ-α／ＴＧＦ-β１で同時刺激したＮＨＬＦ細胞エオタキシン-１産生は、ＢＡＫ５０２Ｇ９によりＩＣ50が３２．４ｎＭで用量依存性に阻害された(図２９Ａ)ため、このエオタキシン-１産生はＩＬ-１３依存性であった。
本試験のこの部分の主目的は、好酸球形態変化を調べることであった。３ｎＭ好酸球(陽性対照)に応答した好酸球形態変化の大きさは１２２．２±２．１％(ｎ＝４)であった。エオタキシン-１誘導形態変化は、１００ｎＭの抗好酸球抗体ＣＡＴ-２１３により完全に阻害され、平均形態変化は１０１．０±１．０％(ｎ＝４)であった。
９．６ｎＭのＩＬ-１３、２８５．７ｐＭのＴＮＦ-α及び１６０ｐＭのＴＧＦ-β１で同時刺激し４８時間培養したＮＨＬＦ細胞から得られた培地(調整培地)は、明らかな好酸球形態変化を誘導した(図２９Ｂ)。これに対してＮＨＬＦ維持培地単独中で４８時間培養したＮＨＬＦからの培地は好酸球形態変化を誘導しなかった(図２９Ｂ)。
ＮＨＬＦ培養前の同時刺激培地への抗ＩＬ-１３抗体ＢＡＫ５０２Ｇ９の添加は好酸球形態変化の用量依存性阻害を引き起こし、幾何平均ＩＣ50は１：１６希釈で測定すると１６．８ｎＭであった(図２９Ｂ)。
ＮＨＬＦ細胞とともに培養していない刺激物質(ＩＬ-１３、ＴＮＦ-α及びＴＧＦ-β１)の、好酸球と好中球形態変化を誘導する能力も調べた。９．６ｎＭのＩＬ-１３、２８５．７ｐＭのＴＮＦ-α及び１６０ｐＭのＴＧＦ-β１は、明らかな好酸球形態変化を誘導しなかった。これは、刺激物質とのＮＨＬＦ細胞培養の間に発生する調整培地の好酸球形態変化能は、いずれかの刺激物質単独のせいでも又は組合せのせいでもないことを示唆する(図２９Ｂ)。
実施例２９
ヒトＩＬ-１３上の抗ＩＬ-１３抗体のマッピング
代表的なＩＬ-１３抗体ＢＡＫ５０２Ｇ９のエピトープマッピングを、分子的アプローチと標準的ペプチド切断を使用して行った。
分子的アプローチ
ヒトＩＬ-１３配列の一部がネズミ配列で置換されたＩＬ-１３キメラを作成した。これらのキメラは、特定のエピトープの同定を助けるために代表的ＩＬ-１３抗体との結合試験で使用した。
ＩＬ-１３キメラの２つのパネルを作成した。第１のパネルは９つのキメラ(図３０)を含み、エピトープの全体的位置を捜すために使用した。第２のパネルは１０個のキメラ(図３１)を含有し、エピトープを細かくマッピングするために使用した。
ＰＣＲを使用してキメラＩＬ-１３配列を組み立て、ゲートウェイ(Ｇａｔｅｗａｙ)(商標)エントリーベクター中にクローン化し、次にこれをデスティネーションベクターｐＤＥＳＴ８(組換えタンパク質のＣ末端で検出タグと親和性タグとをコードするように修飾されている)と組換えを行った。これらの発現ベクターを使用して、化学処理によるＤＨ１０Ｂａｃ(商標)のコンピテント大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)を形質転換して、バキュロウイルスシャトルベクター(バクミド)中へのタグ付きキメラＩＬ-１３の部位特異的転位を可能にした。組換えバクミドＤＮＡを各ＩＬ-１３キメラについて単離し、セルフェクチン (商標)試薬を使用してＳｆ９(スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda))昆虫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に組換えバキュロウイルスを採取し、Ｓｆ９昆虫細胞によりさらに２回継代した。
昆虫の２０００〜５００ｍｌの培養上清をアフィニティ・カラムで精製し、溶出した物質を１６ｍｌから１ｍｌに濃縮し、最後の仕上げと緩衝液交換のためにサイズ排除スーパーデックス(Ｓｕｐｅｒｄｅｘ)２００ＨＲ１０／３００ＧＬカラムにロードした。
ビオチン化ヒトＩＬ-１３、ストレプトアビジン-アントフィオシアネート及びユーロピウム標識ＢＡＫ５０２Ｇ９を使用する同種競合アッセイを開発した。このアッセイは以下の通りである：Ｅｕ-ＢＡＫ５０２Ｇ９はビオチン化ヒトＩＬ-１３に結合し、次に複合体がストレプトアビジンＡＰＣ結合体により認識され、閃光が適用されると、エネルギーがＡＰＣ標識物から近傍のユーロピウムに転移し、時間分解蛍光を測定することができる。非標識ヒトＩＬ-１３(対照として)とキメラ構築体により、この結合の競合が導入される。この競合を定量して、ＩＬ-１３抗体に対するＩＬ-１３変異体の相対的親和性を計算することにより、結合を変化させる変異を同定することが可能になる。
結果
ＢＡＫ５０２Ｇ９への結合について、キメラ構築体ＩＬ１３-へリックスＤ(表５)はビオチン化ヒトＩＬ-１３に対する最も弱い競合物質であり、ＩＬ-１３分子内のへリックスＤがＢＡＫ５０２Ｇ９エピトープ結合に関与していることを示す(表５)。親配列の残基４０、４１、及び３３、３４がそれぞれ変化している４０、４１と３３、３４変異体について活性の低下が見られ、ＢＡＫ５０２Ｇ９の認識におけるヘリックスＡの関与の可能性を示している。ループ３はヒト分子と比較してこの変異体中のアミノ酸の数が減少しており、タンパク質の全体構造を変化させる可能性があるため、このループの活性低下は無視した。キメラＩＬ-１３分子がＢＡＫ５０２Ｇ９結合について競合する能力の他の低下は、かかるアミノ酸の変化には重要であると考えられなかった。
次にへリックスＤ(図２６)中のより標的化された変異のセットを試験した。得られた結果は表６に示し、以下の通りである：
結果は、キメラ構築体１１６１１７ＴＫ(１１６位のリジンはスレオニンで置換され、１１７位のアスパラギン酸はリジンで置換されていた)、１２３ＫＡ(１２３位のリジンは置換されていた)、及び１２７ＲＡ(１２７位のアルギニンは置換されていた)は、少なくともＢＡＫ５０２Ｇ９への結合について競合することができる(１２３ＫＡと１２７ＲＡは１μＭで競合しない)ことを示す。競合アッセイでの有効性の低下のためにＢＡＫ５０２Ｇ９へ結合するとされている他の残基には、へリックスＤ残基１２４Ｑ(リジンはグルタミンで置換されている)と１２０１２１ＳＹ(ロイシンヒスチジン対はセリンチロシン対に変化している)がある。５８Ｌ位のロイシンの変異はまた結合性を低下させ、３Ｄ構造の分析はこの残基がヘリックスＤに対して集まり、ＢＡＫ５０２Ｇ９により直接接触されるか又はヘリックスＤの整列に影響を与えることを明らかにした。
これらの実験は、ヘリックスＤ内の残基がＩＬ-１３へのＢＡＫ５０２Ｇ９の結合に決定的に重要であることを証明する。特に１２３位のリジンと１２７位のアルギニンは、このいずれかの変異がＢＡＫ５０２Ｇ９への結合を無くさせるため、この結合にとって決定的に重要である。
エピトープ切断
またＢＡＫ５０２Ｇ９のエピトープマッピングを標準的ペプチド切断法を使用して行った。ここでＩｇＧは固相に固定化され、ＩＬ-１３リガンドを捕捉するようにされる。形成された複合体は次に、特異的タンパク質分解的消化を受け、この間アクセス可能なペプチド結合が切断されるが、ＩｇＧ：リガンド界面により防御されるものは無傷のままである。すなわちエピトープを含有するペプチドはＩｇＧに結合する。次にこれが脱着され、採取され、質量スペクトル(ｍｓ)により同定される。
２つの相補的技術が使用され、最初の方法はサイファージェンプロテインチップリーダー(Ciphergen ProteinChip Reader)ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトル計を使用し、ここではＩｇＧを質量スペクトル計チップに共有結合させることができ、次にインサイチュで消化と抽出を行うことができる。第２の技術は、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合したビオチン化ＢＡＫ５０２Ｇ９を使用し、これは、タンデム質量スペクトル法(ｍｓ／ｍｓ)により配列確認のための充分なペプチドの採取を可能にした。
２つの方法は絶対的な詳細とスケールが異なるが、基本的に同じ段階(ＩｇＧの結合、未反応結合部位のブロッキング、洗浄、リガンド捕捉、非結合リガンドの除去、消化、及び最後の洗浄工程)を含んだ。
ＭＡＬＤ-ＴＯＦ ｍｓアプローチは、ＰＢＳ中１〜２ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを４℃で一晩結合させた遊離の１級アミン基に共有結合するカルボニルジイミダゾールで活性化した専用のｍｓチップを使用する。次にチップを室温で１時間エタノールアミン溶液でブロックし、次にＰＢＳ又はＨＢＳ＋適当な界面活性剤を用いて充分に洗浄した。次に１ピコモルアリコートのＩＬ-１３をＰＢＳ又はＨＢＳ中でチップに適用し、化学的に固定化したＩｇＧに室温で２時間結合させた。次に、界面活性剤有り及び無しのＰＢＳ又はＨＢＳでさらに洗浄して、非特異的に結合したＩＬ-１３を除去した。ＰＢＳ又はＨＢＳ中２００〜３．１μｇ／ｍｌの範囲のトリプシン溶液をＩｇＧ：リガンド複合体に適用し、室温で３０分消化を進行させ、次にＰＢＳ又はＨＢＳ＋界面活性剤で、ＰＢＳ又はＨＢＳで、そして最後に水でチップを洗浄した。適当なＭＡＬＤ-ＴＯＦ ｍｓ マトリックスを適用後、チップを直接質量スペクトル計に入れて分析した。
ビーズベースのアプローチは、ＮＨＳビオチン化合物を使用して、ＩｇＧのビオチン化(１・ＩｇＧ対４・ビオチン分子のモル比)で出発した。次に、ゲルろ過を使用して、非結合ビオチンと反応の副産物を除去した。次にビオチン化ＩｇＧをニュートラアビジン被覆アガロースビーズに結合させ、ここでＩｇＧ捕捉を最大にするようにした。次にＩｇＧ被覆ビーズの一定量を濃縮スピンカラムに入れ、ダルベッコーＰＢＳ＋０．０５％Tween２０で洗浄し、次にダルベッコーＰＢＳ＋０．０５％Tween２０に再懸濁した。次にＩＬ-１３のパルスを再懸濁ＩｇＧビーズに適用し、さらに１０分結合を進行させ、次に液相を遠心分離して除去し、ビーズをダルベッコーＰＢＳ＋０．０５％Tween２０で洗浄し、次にダルベッコーＰＢＳ＋０．０５％Teen２０に再懸濁した。
次にビーズ：ＩｇＧ：リガンド複合体をトリプシン又はキモトリプシンとともに室温又は３７℃でインキュベートしてタンパク質分解に付した。次にビーズを再度ダルベッコーＰＢＳ＋０．０５％Tween２０で洗浄し、次にさらに界面活性剤の無いダルベッコーＰＢＳで洗浄した。次にビーズを水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸混合物に再懸濁し、上清を回収した。次にこれを、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ｍｓ又は逆相ＨＰＬＣ質量スペクトル(例えば、ThermoQuest LCQ ESIイオントラップ質量スペクトル計を使用するタンデム(ｍｓ／ｍｓ)断片化）により、種々分析した。得られる断片パターンをヒトＩＬ-１３配列及びＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧの別の重鎖と軽鎖配列に一致するようにした。
実験工程の間、多くの対照(主にブランク表面、ＩｇＧのみ、イソタイプ対照)を使用して、同定されたペプチドがＩｇＧ捕捉ＩＬ-１３から特異的に得られたものであり、ＢＡＫ５０２Ｇ９の生成物又は非特異的に結合したＩＬ-１３消化の生成物ではないことを証明した。
結果
この実験シリーズは一貫して、各消化について単一のＩＬ-１３特異的ペプチドを与えた。ＬＣＱイオン捕捉装置からのデータは、トリプシン断片が３２５８Ｄａ(ＭＨ＋)のモノアイソトピック質量を有し、キモトリプシン断片が３９３７Ｄａ(ＭＨ＋)のモノアイソトピック断片を有することを明らかにした。
ヒトＩＬ-１３の適切なｉｎ ｓｉｌｉｃｏ消化に対するこれらの質量の検索は、分子のＣ末端部分の関連ペプチドとの密接な一致を与えた。
トリプシンペプチド質量の一致：３２５８Ｄａ
１０００ｐｐｍの許容誤差(ｔｏｌｅｒａｎｃｅ)で、３２５８Ｄａは１０６位のアスパラギン酸から１３２位のＣ末端アスパラギンまでの配列に一致する。この許容誤差(ｔｏｌｅｒａｎｃｅ)では他の一致は無い。この領域を、以下のヒトＩＬ-１３の前駆体型の配列上で太字で強調する。
Figure 0004891074
キモトリプシンペプチド質量の一致：３９３７Ｄａ
１０００ｐｐｍの許容誤差(ｔｏｌｅｒａｎｃｅ)で、３９３７Ｄａは９９位のセリンから１３２位のＣ末端アスパラギンまでの配列に一致する。この領域を、以下のヒトＩＬ-１３の前駆体型の配列上で太字で強調する。
Figure 0004891074
これらの一致の両方とも、抗体：リガンド複合体のタンパク質分解の間、ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＩｇＧがＩＬ-１３分子のＣ末端部分を保持することを示す。
両方のペプチドの本体は、ｍｓ／ｍｓによりうまく確認され、いずれもＢＡＫ５０２Ｇ９との有意な配列類似物を示さなかった。Ｙ又はＢイオンを同定するように調整したｍｓ／ｍｓ断片地図は、トリプシンペプチドの１電荷状態の１０４の可能なイオンうちの２６に一致し、キモトリプシンペプチドの１２８の可能なイオンのうちの１９に一致した。すべての電荷状態を調べると、トリプシン断片の２７アミノ酸残基のうちの２３とキモトリプシン断片の３３残基のうちの２９の同定を示す。これは同一性を確認するのに充分である。
全体としての実験配列は、ヒトＩＬ-１３上のＢＡＫ５０２Ｇ９エピトープの一部が、２７個のＣ末端アミノ酸残基内に存在することを同定した。これらの知見は、前記で詳述した分子的アプローチの知見を確証する。
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第Ｉ相でＡＨＲ(ＰＣ30)を示す２１匹の動物と抗原プライミング症状を有する追加の動物を第ＩＩ相の試験に進めた(全部で２２匹)。ＡＵＣとＰＣ30で測定されたように、必ずしもすべての動物がＡＨＲをもってはいない。第Ｉ相でＡＨＲを示し、そのＡＨＲを第Ｉ相と第ＩＩ相で評価した動物のみをＡＨＲの結果に含めた。インスタット(ＩｎＳｔａｔ)を使用して統計的検定を行った。検定は両側スチューデントｔ検定を、終点は数０を含むという(すなわち、第Ｉ相と比較して第ＩＩ相では変化がなかった)帰無仮説に対して行った；＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１。データは算術平均±ＳＥＭとして示す(ｎ＝１４〜２１)。
a ５匹の動物は第Ｉ相でＡＨＲ(ＡＵＣ増加)を示さなかったため、ＡＵＣ解析から除外した。
第ＩＩ相の気道機能データ採取における技術的失敗のために、さらに３匹の動物を除外した。
b ３匹の動物は第ＩＩ相の気道機能データ採取における技術的失敗のためにＰＣ30解析から除外した(ａと同じ動物)。抗原プライミング症状を有する追加の動物は第Ｉ相においてＰＣ30 ＡＨＲを示さなかったため除外した。
c 第Ｉ相の気道機能データ採取における技術的失敗のために、２匹の動物を抗原プライミング解析から除外した。
d 試験の開始時の顕著なＢＡＬ炎症のために１匹の動物をＢＡＬ解析から除外した。
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図１は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３に対するｓｃＦｖとしてのＢＡＫ１６７Ａ１１(黒四角)とその誘導体ＢＡＫ６１５Ｅ３(白四角)の中和力価(％阻害)を示す。三角は無関係のｓｃＦｖである。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図２は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３に対するｓｃＦｖとしてのＢＡＫ２７８Ｄ６(黒四角)とその誘導体ＢＡＫ５０２Ｇ９(白四角)の中和力価(％阻害)を示す。三角は無関係のｓｃＦｖである。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図３は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける２５ｎｇ／ｍｌネズミＩＬ-１３に対するｓｃＦｖとしてのＢＡＫ２０９Ｂ１１(黒四角)の中和力価(％阻害)を示す。三角は無関係のｓｃＦｖである。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図４は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおけるＩＬ-１３に対するｓｃＦｖとしてのＢＡＫ２７８Ｄ６(黒四角)の中和力価(％阻害)を示す。三角は無関係のｓｃＦｖである。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図４Ａは、２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３に対する力価を示す。 図４Ｂは、２５ｎｇ／ｍｌヒト変種ＩＬ-１３に対する力価を示す。 図４Ｃは、５０ｎｇ／ｍｌ非ヒト霊長類ＩＬ-１３に対する力価を示す。 図５は、ＴＦ-１細胞増殖アッセイにおける抗ヒトＩＬ-１３抗体の力価の比較を示す。データは、２５ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ-１３に対する５〜７回の実験の平均中和力価を標準誤差棒とともに示す。市販の抗体(Ｂ-Ｂ１３)と比較した性能を、ダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより、統計的に評価した。Ｂ-Ｂ１３と比較して、＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１。 図６は、Ｆ-１細胞増殖アッセイにおける標識ＩＬ-１３に対するヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９(黒四角)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(黒三角)、及びＢＡＫ１１８３Ｈ４(黒逆三角)の中和力価(％阻害)を示す。白三角は無関係のＩｇＧ４である。データは、３回の異なる実験の平均を標準誤差棒とともに示す。 図６Ａは、２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３に対する力価を示す。 図６Ｂは、２５ｎｇ／ｍｌヒト変種ＩＬ-１３に対する力価を示す。 図６Ｃは、５０ｎｇ／ｍｌ非ヒト霊長類ＩＬ-１３に対する力価を示す。 図７は、未変性のＩＬ-１３依存性ＨＤＬＭ-２細胞増殖アッセイにおけるヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９(黒四角)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(黒三角)、ＢＡＫ１１８３Ｈ４(黒逆三角)と、市販の抗ヒトＩＬ-１３抗体(Ｂ-Ｂ１３-白四角；ＪＥＳ１０-５Ａ２-白逆三角)の中和力価(％阻害)を示す。白三角は無関係のＩｇＧ４である。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図８は、ＮＨＬＦアッセイにおける抗ヒトＩＬ-３抗体の力価の比較を示す。データは、ＮＨＬＦエオタキシン放出アッセイにおける１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ-１３に対する４〜５回の実験の平均中和力価(ＩＣ50 ｐＭ)を標準誤差棒とともに示す。市販の抗体(Ｂ-Ｂ１３)と比較した性能を、ダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより、統計的に評価した。Ｂ-Ｂ１３と比較して、＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１。 図９は、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１３に応答したＨＵＶＥＣの表面上のＶＣＡＭ-１アップレギュレーションに対する、ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９(黒四角)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(黒三角)、及びＢＡＫ１１８３Ｈ４(黒逆三角)の中和力価(％阻害)を示す。白三角は無関係のＩｇＧ４である。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図１０は、１ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-４(図１０Ａ)又は０．５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ-１β(図１０Ｂ)に応答したＨＵＶＥＣの表面上のＶＣＡＭ-１アップレギュレーションからのエオタキシン放出に対する、ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９(黒四角)、ＢＡＫ１１６７Ｆ２(黒三角)、及びＢＡＫ１１８３Ｈ４(黒逆三角)の中和力価(％阻害)を示す。白三角は無関係のＩｇＧ４である。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図１１は、因子依存性Ｂ９細胞増殖アッセイにおける、１ｎｇ／ｍｌ ネズミＩＬ-１３に対するヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１(四角)の中和力価(％阻害)を示す。白三角は無関係のＩｇＧ４である。データは、同じ実験内の三重測定の平均を標準誤差棒とともに示す。 図１２は、急性肺アレルギー性炎症のネズミモデルにおける、抗原刺激後の感作(ｓ)(右の棒)及び非感作(ｎｓ)(左の棒)マウスからの肺ホモジネート中のＩＬ-１３の相対レベルを示す。感作の影響を、ＩＬ-１３量のデータを使用してスチューデント(Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ)ｔ-検定により、統計的に評価した。非感作対照動物(ｎ＝５〜６匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１３は、オボアルブミン感作マウスの肺へのオボアルブミン誘導白血球動員に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の静脈内投与の効果を示す。白血球の数を示す(×１０４)。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原刺激ＰＢＳ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝５〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１４は、オボアルブミン感作マウスの肺へのオボアルブミン誘導好酸球動員に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の静脈内投与の効果を示す。好酸球の数を示す(×１０４)。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原刺激ＰＢＳ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝５〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１５は、オボアルブミン感作マウスの肺へのオボアルブミン誘導好中球動員に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の静脈内投与の効果を示す。好中球の数を示す(×１０４)。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原刺激ＰＢＳ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝５〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１６は、オボアルブミン感作マウスの肺へのオボアルブミン誘導リンパ球動員に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の静脈内投与の効果を示す。リンパ球の誘導はＢＡＫ２０９Ｂ１１により用量依存性に阻害され、３μｇ／ｍｌのＢＡＫ２０９Ｂ１１で最大の阻害が得られた。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原刺激ＰＢＳ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝５〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１７は、オボアルブミン感作マウスの肺へのオボアルブミン誘導単球／マクロファージ動員に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ２０９Ｂ１１の静脈内投与の効果を示す。対照動物と比較して感作動物の単球／マクロファージレベルの有意な上昇は無かった。しかしこれらの細胞のかかるバックグランドレベルは、感作動物において≧３６μｇ／ｍｌ ＢＡＫ２０９Ｂ１１により抑制された。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原刺激ＰＢＳ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝５〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１８は、細菌由来の組換えヒトＩＬ-１３の投与により誘発される、ネズミエアパウチへの細胞(白血球の数を示す(×１０４))の流入に対する、市販の抗ＩＬ-１３中和抗体ＪＥＳ１０-５Ａ２の作用を示す。抗体処理の効果を、白血球百分率データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。ＣＭＣ対照動物(＝０％阻害；ｎ＝１１〜１３匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図１９は、ヒトＩＬ-１３アミノ酸配列に対するカニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)ＩＬ-１３の配列の整列を示す。ヒトとカニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)ＩＬ-１３とで異なる７つのアミノ酸残基を黒くしてある。アカゲザル(ｒｈｅｓｕｓ)とカニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)ＩＬ-１３は同じアミノ酸配列を有する。 図２０は、２９日間の４匹のアレルギー性であるが非抗原刺激カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)霊長類(オス２匹／メス２匹)の血清ＩｇＥレベルに対する、ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内大量単回投与の効果を示す。血清ＩｇＥ濃度は、投与後４及び５日で、対照値の１００％(投与前)から６６±１０％(ｐ＜０．０５)に有意に低下している。血清ＩｇＥ濃度のこの低下は、２２日までに対照レベルの８８±８％まで回復している。＊＝ｐ＜０．０５、投与前ＩｇＥレベルとの比較、ＡＮＯＶＡの後にダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)の多重比較検定を繰り返した(ｎ＝４匹の動物)。 図２０Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＡＫ５０２Ｇ９の単回静脈内投与後のオスとメスのカニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ)霊長類の相対血清ＩｇＥレベルの経時変化を示す。相対血清ＩｇＥデータは、ベースライン値の算術平均±ＳＥＭ％として表される。 図２１は、オボアルブミン感作及び抗原刺激マウスの肺機能に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ１無関係対照抗体と比較した、異なる量(Ｈ＝２３７μｇ／日、Ｍ＝２３．７μｇ／日、及びＬ＝２．３７μｇ／日)のＢＡＫ２０９Ｂ１１の腹腔内投与の効果を示す。図２１Ａでは肺機能は、処理前(０日)と感作、抗原刺激、及び薬剤処理後(２５日)のｌｏｇＰＣ５０ｓ(ベースラインＰｅｎＨを５０％上昇させるのに必要なｌｏｇメタコリン濃度)で示される。図２１Ａは、図２１Ｂに示す試験の最終点(デルタｌｏｇＰＣ５０)を計算するのに使用される生データを示す。データは、ｎ＝８の平均を標準誤差棒とともに示す。 図２１Ｂでは、変化する肺機能が個々のマウスのｌｏｇＰＣ５０の変化(デルタｌｏｇＰＣ５０)で示される。デルタｌｏｇＰＣ５０は、０日に対する２５日のｌｏｇＰＣ５０の個々の変化として定義される。データは群平均デルタｌｏｇＰＣ５０(処理群内で平均した個々の変化)を標準誤差棒とともに示す。抗体処理の効果を、デルタｌｏｇＰＣ５０データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。オボアルブミン抗原感作及び刺激対照動物(ｎ＝８匹のマウス)と比較して、＊ Ｐ＜０．０１。 図２２は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのエアパウチへの総白血球動員(図２２Ａ)と好酸球動員(図２２Ｂ)に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、異なる量のヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の局所的(腹腔内)及び全身性(静脈内)投与の効果を示す。データは、ｎ＝１０の平均を標準誤差棒とともに示す。抗体処理の効果を、ｌｏｇ変換データを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。ｈｕＩＬ-１３抗原刺激マウス(ｎ＝１０)と比較して、＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１。 図２３は、マウスの気道へのヒトＩＬ-１３の気管内投与後のＡＨＲの発症に対する、イソタイプ一致ＩｇＧ４無関係対照抗体と比較した、ヒトＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９の腹腔内投与の効果を示す。抗体処理の効果を、ＰＣ２００メタコリンデータを使用してダネット(Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ)検定を用いる片側ＡＮＯＶＡにより統計的に評価した。ヒトＩＬ-１３陽性対照群(ｎ＝６〜８匹のマウス)と比較して、＊ ＜０．０５、＊＊ ＜０．０１。データは、平均を標準誤差棒とともに示す。 図２４は、ヒトＢ細胞ＩｇＥ産生アッセイにおける、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１３に対するＩｇＧ４としてのＢＡＫ５０２Ｇ９(黒四角)の中和力価(％最大応答)を示す。白四角は無関係のＩｇＧ４を示す。データは、別々の実験からの６匹のドナーの平均を標準誤差棒とともに示す。 図２５は、気管支平滑筋細胞中のアゴニスト誘導Ｃａ２＋シグナル伝達のＩＬ-１３誘導増強に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の影響を示す。各抗体＋／-ＩＬ-１３前処理条件について、Ｃａ２＋シグナル伝達応答の曲線下の面積(ＡＵＣ)を測定した。３つの独立した実験の組合せデータを、ＡＵＣ±ＳＤの未処理細胞に対するパーセント差として、無関係の抗体ＣＡＴ-００１(ａ)とＢＡＫ５０２Ｇ９(ｂ)について示す(ｎｓ＝有意ではない(ｐ＞０．０５)、＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１)。結果を、ボンフェローニ(Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ)多重比較後検定を用いる片側分散分析(ＡＮＯＶＡ)により統計的に評価した。 図２６は、第ＩＩ相で投与したＢＡＫ５０２Ｇ９の効果を示す。 図２６Ａは、ヒスタミン用量応答曲線下の面積で測定したＡＨＲに対する効果を示す(ｎ＝１４)。 図２６Ｂは、ＰＣ３０の変化により測定したＡＨＲに対する効果を示す(ｎ＝１８)。 図２６Ｃは、抗原プライミングに対する効果を示す(ｎ＝２０)。 図２６Ｄは、ＢＡＬ炎症に対する効果を示す(ｎ＝２１)。 図２７は、ＩＬ-１３誘導ＣＤ２３発現に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の効果を示す。データは、ＩＬ-１３単独(１００％)に対する応答のパーセントとして示し、６匹の各ドナーからの６つの異なる実験(三重測定で行った)の平均±ＳＥＭ％対照として表わす。 図２８は、ＩＬ-１３及び／又はＩＬ-４誘導ＰＢＭＣ ＣＤ２３発現に対するＢＡＫ５０２Ｇ９と無関係のＩｇＧ４の効果を示す。データは、ＩＬ-４単独(１００％)に対する応答のパーセントとして示し、４匹の各ドナーからの４つの異なる実験(三重測定で行った)の平均±ＳＥＭ％対照として表わす。 図２９Ａは、ＩＬ-１３／ＴＮＦ-α／ＴＧＦ-β１含有培地を用いる４８時間培養により誘導されるＮＨＬＦエオタキシン-１に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の効果を示す。データは、白血球の形の変化を誘導するためにこの試験で使用した培地の三重測定の算術平均±ＳＥＭとして示す。 図２９Ｂは、１：１６希釈の調整培地により誘導されるヒト好酸球の形態変化に対するＢＡＫ５０２Ｇ９の効果を示す。データ点は、４つの独立したドナーからの別々の実験の平均±ＳＥＭ％ブランク培地形態変化である。 図３０は、ＩＬ-１３キメラの最初のパネルを作成するためのヒトＩＬ-１３に導入された変異を強調する、ネズミＩＬ-１３に対するヒトＩＬ-１３の整列を示す。４つのアルファらせんをボックスで強調してあり、ループ１とループ３を示してある。５つのキメラタンパク質が作成され、らせんＢ、Ｃ及びＤとループ１及びループ３がネズミ配列で置換されている。さらに４つのキメラタンパク質が作成され、ヒトプレタンパク質中のアミノ酸に従って番号付けされ(上記の多重整列の番号付けではない)、残基３０(上記３４位)のアルギニンが変異され、残基３３と３４(上記３７と３８位)が変異され、残基３７と３８(ＶＨ)が変異され(上記４１と４２位)、そして残基４０と４１(ＴＱ)が変異されている(上記４４と４５位)。 図３１は、ＩＬ-１３キメラの第２のパネルを作成するためのヒトＩＬ-１３に導入された変異を強調する、ネズミＩＬ-１３に対するヒトＩＬ-１３の整列を示す。ネズミ残基の代わりにヒト残基が使用された６つのキメラが作成された(ボックスで強調してある)。さらに４つのキメラタンパク質が作成され(番号付けはヒトプレタンパク質中のアミノ酸位置に従う)、残基５８(上記図の６２位)のロイシンが変異され、残基１１９(上記残基１２３)のロイシンが変異され、残基１２３(上記残基１２７)のリジンが変異され、そして残基１２７(上記残基１３２)のアルギニンが変異されている。 図３２は、ヒトＩＬ-１３に作成した変異を示す。暗い灰色の変異はＢＡＫ５０２Ｇ９への結合を低下させ、明るい灰色の変異は結合を変化させなかった。プレヒトＩＬ-１３と変異残基との線状配列を示す。

Claims (11)

  1. ヒトＩＬ-１３に対する単離された特異的結合メンバーであって、ヒト抗体ＶＨドメイン及びヒト抗体ＶＬドメインから構成され、かつＣＤＲのセット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む抗体抗原結合部位を含み、ここで当該ＶＨドメインが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、当該ＶＬドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＣＤＲのセットが、以下の：
    ＢＡＫ２７８Ｄ６のＣＤＲのセット、ここでＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する；
    ＢＡＫ５０２Ｇ９のＣＤＲのセット、ここでＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を有する；
    ここで、当該特異的結合メンバーが、ヒトＩＬ−１３及びＲｈｅｓｕｓ又はアカゲザル又はカニクイザルＩＬ−１３に結合する
    からなる群から選択されるＣＤＲセットからなる、前記メンバー。
  2. 前記ＶＨドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が生殖細胞系列フレームワーク内にあり、及び／又は前記ＶＬドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が生殖細胞系列フレームワーク内にある、請求項１に記載の単離された特異的結合メンバー。
  3. 前記ＶＨドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３が生殖細胞系列フレームワークＶＨ１ ＤＰ１４内にある、請求項２に記載の単離された特異的結合メンバー。
  4. 前記ＶＨドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が生殖細胞系フレームワークＶＬ λ３−３Ｈにある、請求項２又は請求項３の単離された特異的結合メンバー。
  5. １３０位のアルギニンがグルタミンにより置換されているヒトＩＬ-１３変種に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
  6. ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＨドメイン（配列番号１５）を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
  7. ＢＡＫ５０２Ｇ９ ＶＬドメイン（配列番号１６）を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
  8. ヒトＩＬ-１３を中和する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  9. ｓｃＦｖ抗体分子、抗体定常領域、又は全抗体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
  10. 前記全抗体がＩｇＧ４である、請求項９に記載の特異的結合メンバー。
  11. 喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における請求項１〜１０のいずれか一項に記載の特異的結合メンバーの使用。
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