CN1085953A - 人白细胞介素13 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码人IL-13的核酸和纯化的 IL-13蛋白质及其片段。还提供了包括单克隆抗体 和多克隆抗体在内的抗体，并提供了本发明的组合物 在诊断和治疗中的使用方法。

Description

本发明涉及影响人免疫系统的组合物和方法。具体地说，本发明提供了调整免疫系统反应和发育的核酸、蛋白质及抗体。本文还公开了这些材料在诊断和治疗上的用途。

若干时间以来，即已知道哺乳动物免疫反应是基于称为“免疫网络”的一系列复杂的细胞相互作用。近年来的研究已对该网络的内在工作情况有了新的认识。

虽然仍认为大多数免疫反应涉及淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞及其他一些细胞的网络样相互作用，但现在免疫学家一般都持有这样的观点，即被称作淋巴激活素、细胞激活素或单活素（monokines）等的可溶性蛋白质在控制这些细胞相互作用中起着关键的作用。

鉴于它们的重要性而要求鉴定并分离新的淋巴激活素。

本发明为适应这一需要而提供了一种这样的新的淋巴激活素。更具体地说，本发明提供了人白细胞介素13（IL-13）及其使用方法。

本发明还提供了编码该多肽的核酸和其生产及使用方法。本发明之核酸的特征是根据它们同源于本文公开的克隆的互补DNA（cDNA）顺序，和/或根据对通常由这些核酸编码之多肽所作的IL-13活性的功能性检测而确定的。本发明提供了调节或介入免疫反应控制作用的方法。

本发明部分地基于已发现并克隆了能够表达具有IL-13活性之蛋白质的人cDNA。cDNA克隆包括分别含有部分或全长序列的质粒载体pB21.2Bf和pA10.66的人cDNA插入段。可使用聚合酶链反应（PCR）技术和插入段的顺序构建等价载体。

本发明提供了包括同源于表1所示人IL-13之顺序的片段的分离的核酸。该片段一般至少约含50个核甘酸，通常将编码表现有IL13的特征性生物学活性的蛋白质，即表1所示的氨基酸顺序。在其他实施方案中，该片段至少有80%同源于表1所示的编码顺序。在其他实施方案中，该核甘酸还编码第二种蛋白质。本发明还包括含有所述核酸的载体或细胞。

此外，该核酸可以是带有同源于表1中公开之人IL-13顺序之片段的重组核酸。该核酸通常编码人IL-13或者可编码一种融合蛋白质。本发明还包括含有核酸的载体如表达载体和含有核酸的细胞。

在另外的实施方案中，本发明提供了一种分离的人IL-3蛋白质或肽。在某些实施案中，蛋白质具有表1所示的全长顺序，或者是其突变体，并可包括改变了的转译后修饰形式如糖基化变异体。其他实施方案包括含有人IL-13肽的融合蛋白质及含有该融合蛋白质的细胞。

在另一实施方案中，本发明提供了重新折迭胍变性的小鼠p600或人IL-13蛋白质的方法，包括以大约为2.5mg/ml的浓度在6M胍中稳定所说的蛋白质;在还原和氧化谷胱甘肽存在下在数小时内将胍稀释至大约60mM;并将稀释的胍溶液温育（incubating）至少约12小时。

本发明还提供了与人IL-13特异结合的抗体，如小鼠单克隆抗体或嵌合抗体。还提供了支样品中的单核细胞或B细胞增殖，或维持所说细胞的生存性的方法，包括使样品单与有效量的人IL-13或合并有另一种细胞激活素如IL-4或IL-10接触。在某些实施方案中，提供了使样品与识别人IL-13或识别与编码人IL-13之核酸杂交的核酸的结合组合物接触，以检测人IL-13的方法。结合结合物可以是单克隆抗体，且样品可以是血液样品。

在其他实施方案中，本发明提供了调节造血B细胞或T细胞生长的方法，该方法包括使细胞与有效量的合用的IL-13和IL-4或其拮抗剂包括IL-4拮抗剂接触。造血细胞生长可伴随细胞分化为抗体生成细胞。

本发明还提供了调节髓样前体细胞增殖的方法，包括使细胞与有效量的人IL-13，小鼠P600或其激动剂或拮抗剂接触。调节增殖作用常常伴有细胞分化。

本发明提供了调节对感染或变应原之免疫反应的方法，如使用有效量的人IL-13、小鼠P600、或其激动剂或拮抗剂包括IL-4拮抗剂。本发明还提供了使细胞与有效量的人IL-13、小鼠P600、或其激动剂或拮抗剂包括IL-4拮抗剂，以及合用的其他细胞激动剂如IL4和IL10接触，以维持髓样前体细胞之细胞存活性的方法。

本文所列举的所有文献均全文列入本文作为参考文献。

1.概述

本发明提供了具有特别限定之结构和生物学特性的本文定名为人白细胞介素13（IL-13）之人白细胞介素分子的氨基酸和DNA顺序。该分子是使用编码称为P600之相关小鼠蛋白质的小鼠基团得到的。

在Maniatis等人（1982）的Molecuilar  Cloning，A  Labora-tory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Har-bmr  Press;Sambrook等人（1989）的Molecular  Cloning：A  Lab-ratory  Manual，（2d  ed），Vo  1.1-3，CSH  Press，NY;Ausubel等人的Biology，Greene，Publishing  Associates，Brooklyn，NY;或Ausubel等人（1987和定期增刊）的Current  Protocols  in  Mol-ecular  Biology，Greene/Wiley，NY等文献中已描述或论及了某些标准方法。

分离已存在之人基因的困难使其他人没有取得成功。早期使用寡核苷酸探针和引物分离小鼠P600蛋白质之人同系物的尝试以失败而告终。使用这类方法所造成的困难在于不能选择为提供分离正确克隆所需之足够信/噪比例的足够长度的探针。此外，即使用高敏感性聚合酶链反应（PCR）技术，许多小鼠细胞系也不能产生可检测水平的小鼠基因的mRNA。

因为小鼠基因的mRNA。

因为小鼠和人基因的同源性相对较低（约60%），所以须使用相对长的探针来提供足够高的同源性，以确保可识别出杂交的阳性信号。但在分离人基因之前，不可能知道同源性程度或推测哪个将从中选择探针的靶基因的区域表现有高的同源性。事实上，使用各种探针（单独或联合使用）从各种文库中分离基因的多次尝试都没有获得成功。

当用寡核苷酸或基因组DNA探针筛选时，从中分离小于全长之中间体克隆的文库没有提供正确的克隆。事实上，使用小鼠基因组顺序作为探针分离的克隆结果证明是假阳性的，即它们并不编码如经顺序分析所估测的人等同物。至少还有另外一个研究小组也没有使用相似方法分离到该基因。

设计了一种不同的方法，得以成功地分离出与小鼠P600基因同源的人基因。不是使用相对较短的寡核苷酸探针，而是使用几乎相当于全长小鼠基因编码区的探针。再者，用以制取cDNA文库的细胞类型也是很重要的。如上文所指出的，小鼠基因的表达在不同类型细胞中差异很大。结果证明用于产生可提供本文所述阳性克隆之cDNA文库的人B21细胞是一个以相对高水平表达人基因的细胞类型。

然而，这一事实在进行早期筛选时并不是显而易见的。此外，由杂交产生的阳性信号难以与本底区分开。用于筛选的杂交和洗涤条件显很重要的，而且稍微苛刻的条件将会很容易地除去阳性信号（如参见Wetmur  et  al.，J，Molecular  Biology  31∶349（1968））。

最初分离的定名为pB21.Bf2的克隆比全长度短。分离全长克隆还须使用另一个cDNA文库。因此，分离定名为pA10.66的全长度人克隆需要投入很多时间和资金。知道了小鼠和人基因间的高同源性区域后，现在再使用相对短的寡核苷酸探针进行分离就相对简单易行了。

分离IL-13的程序概述如下。从分离自人B21细胞的RNA制备在pCD载体中构建的cDNA文库。现已了解到，这些表现与提供小鼠克隆的细胞有许多相同标志的细胞是人T细胞。当用寡核苷酸探查文库时，利用几种改进的和惯用的技术来克服与分离cDNA克隆有关的问题。

具体地说，不使用相对短的寡核苷酸探针，而是代之以选用约400个核苷酸的近全长双股探针。虽然以前使用B21衍生的cDNA文库的尝试没有成功，但近全长双股探针却提供了微弱的阳性信号。虽然几位有经验的分子生物学家很怀疑这些微弱的信号是否是真的，但继续追踪这些信号，我们终于获得了成功。

最初的人分离物显示出与小鼠基因同源，但缺少一段氨基末端编码部分。因此，该中间分离物小于全长度克隆。试图从B21衍生的文库分离全长度克隆但没有成功。然而，在选用另一个cDNA文库后，得以用接近全长度的人探针分离到全长度人克隆。

表1中显示了pA10.66克隆的完整核苷酸及由之推测的氨基酸顺序。该核苷酸顺序相当于由SEQ  ID  NO∶1限定的顺序。表2中对表1的基因顺序与已发表的小鼠P600蛋白质的基因顺序作了比较。表3中对人IL-13的推测的氨基酸顺序与已发表的小鼠P600氨基酸顺序进行了比较。

表1：huIL-13的核苷酸和氨基酸顺序。

表2：人IL-13与小鼠P600核酸顺序的比较

（上行为顺序，下行为小鼠顺序）。

表3：人IL-13与小鼠P600氨基酸顺序的比较（上行为人顺序，下行为小鼠顺序）。另一种形式的人IL-13因不同的mRNA连接方式而在氨基酸序号97和98之间有一个GLN（用1标示的位置）。

表3说明中提到的另一形式的人IL-13的氨基酸顺序在顺序一览表中是由SEQ  ID  NO∶2限定的。

本文所用的术语“IL-13”是指包括具有表1中所示氨基酸顺序之蛋白质或肽片段的蛋白质或其片段。该术语还指以与IL-13等位基因产物（其顺序已提供）相似的方式从功能上影响细胞或亚细胞成分的多肽。该术语还包括那些等位基因及其他变异体，如所述蛋白质的代谢物。一般说来，它将以高亲和性结合于相应生物学受体上，其结合亲和力如至少约为100nM，一般好于约30nM，优选好于约10nM，更优选的是好于约3nM。用于本文中的这一术语还指相关的天然存在形式的人蛋白质，如人蛋白质的等位基因和代谢变异体。

本发明还包括与表1中所示氨基酸顺序有实质性氨基酸顺序同源性的蛋白质或肽，但不包括比见于小鼠中的相应P600蛋白质实质上表现有相同或较小氨基酸顺序同源性的任何蛋白质或肽。

肽“片段”是一段至少有8个氨基酸，一般至少10个氨基酸，更常见至少12个氨基酸，常常至少14个氨基酸，更多见为至少16个氨基酸，典型的为至少18个氨基酸，更典型的为至少20个氨基酸，通常为至少22个氨基酸，更通常为至少24个氨基酸，较好有至少26个氨基酸，更选的是至少有28个氧基酸，且在一特别优选的实施方案中为至少约有30或更多个氨基酸的氨基酸残基顺序。不同蛋白质片断的顺序能在合适的长度段上相互比较。

氨基酸顺序同源性或顺序相同性是由最适残基匹配决定的，且必要时须引入缺口（如参见Needleham  et  al.，J.Mol.Biol.48∶443（1970）;Sankoff  et  al.，Time  Warps，String  Edits，and  Ma-cromolecules∶The  Theory  and  Practice  of  Sequence  Comparsion（Chapter  1），1983，Addison-Wesley，Reading  MA;and  Software  Packages  from  Intelli  Genetics，Mountain  View，CA;and  the  University  of  Wisconsin  Genetics  Computer  Group，Madison，WI）。当考虑到保守取代时，这样就改变为匹配了。

保守取代通常包括下列几组氨基酸内的取代：甘氨酸，丙氨酸;缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸;天冬氨酸，谷氨酸;天冬酰胺，谷氨酰胺;丝氨酸，苏氨酸;赖氨酸，精氨酸;以及苯丙氨酸，酪氨酸。同源氨基酸顺序意欲包括所提供之顺序中的天然等位基因变异。典型的同源蛋白质或肽与表1的氨基酸顺序片段将具有50-100%同源性（如果可以引入缺口的话）至60-100%同源性（如果包括保守取代的话）。

同源性将至少约为50%，一般至少58%，更一般为至少63%，常常为至少69%，更常见为至少75%，典型的为至少81%，更典型的为至少86%，通常为至少90%，更通常为至少93%，较好为至少95%，更好为至少97%，且在特别优选的实施方案中至少为98%或更大。同源性的程度将随着所比较之片段的长度而异。同源蛋白质或肽，如等位基因变异体将与表1所示的实例共有大多数生物学活性。

本文所用的术语“生物学活性”是用于描述但不仅限于诱导特征性细胞刺激作用、Ig产生、细胞分化或细胞生存性功能、或作为与抗所述人IL-13或其等位基因变异体之抗体有结合和交叉反应性的受体的更多结构特性。

术语配基、激动剂、拮抗剂和类似物包括调节对IL-13或类IL-13蛋白质之特征性细胞反应的分子，以及具有配基-受体相互作用的更多标准结构结合竞争特性的分子（所说的受体如可以是天然受体或抗体）。细胞反应可能是通过IL-13与细胞受体结合介导的。另外，配基可以是作为能与所说的受体或其类似物结合的天然配基的分子，或者是天然配基之功能性类似物的分子。

功能性类似物可以是有结构修饰的配基，或者是具有可与适当的配基结合决定基相互作用之分子形状的完全无关分子。配基可用作激动剂或拮抗剂（如参见Goodman  et  al.，Eds.，The  Pharmacological  Bases  of  Therapeutics，1990，Pergamon  Press，New  York）。

Ⅱ.活性

人IL-13蛋白质具有许多不同的生物学活性。人IL-13同源于小鼠P600蛋白质，但具有结构差异。例如，人IL-13基因编码顺序与小鼠P600的核苷酸编码顺序只有约50%同源性。在氨基酸水平上，约有66%相同性。

小鼠P600分子具有很少已确定的生物学活性。具体地说，它具有刺激未分化的小鼠骨髓细胞进入早期分化阶段的能力。在此检测法中小鼠P600蛋白质似乎可激活小鼠细胞和人细胞。

本公开还描述已使用小鼠P600分子发现的新的活性。人IL-13和同源小鼠P600蛋白质之间结构上的差异在是否两种蛋白质会具有相同的功能特性问题上引入了某些不确定性。然而，似乎有少数已鉴定的活性是同源物间所共有的。小鼠P600对小鼠细胞或人细胞所表现许多活性很可能也是人IL-13所具有的。事实上，种间交叉活性表明，许多结构特征对于分子功能并不是很严格的。

特别是、当作用于人细胞时，人IL-13表现有许多已鉴定的活性。下面的实例描述了用于研究人IL-13对细胞存活性、形态学、增殖和分化之影响的方法。特别是人IL-13影响B细胞、PBMC和巨噬细胞。对于B细胞，该细胞激活素单独或与其他细胞活素联合影响其增殖、保持细胞生存性、影响其存活力、引起Ig表面标志的修饰、特异影响CD40以及影响IgE开通（Switching）。

对于PBMC或巨噬细胞，它可诱导形态学改变，引起细胞表面标志的改变，影响氧化氮的产生、影响IL-1α和IL-6的表达，以及影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。重要的是，由于IL-4和IL-13间的结构相似性而导致结构以IL-4之相似拮抗剂为基础的IL-13的拮抗剂。这些活性可用于处理以相应功能失调为特征的免疫学状态（如参见Merck  Manual，或Paul，Fundamental  Immunology）。

A.B细胞

1.辅助因子/因子增殖：细胞生存性

从大肠杆菌制得的小鼠P600具有刺激或协同刺激大的体内激活的小鼠B细胞增殖的能力。IL-4，可溶性抗-CD40与小鼠P600合用，可诱导这些细胞的增殖。但因为大的体内激活的小鼠B细胞可能包含某些单核细胞和其他细胞，所以其他细胞可被诱导以分泌支持所观察到的增殖作用的各种生长因子。因此，小鼠P600可单独地或与其他因子协同，直接或间接地刺激B细胞，人IL-13应表现有相似的生物学活性。

2.维持B细胞的存活力：选择性

IL-13增加通过其抗原受体激活之B细胞的DNA合成。这种诱导作用是剂量依赖性的，并且与IL-10的作用差不多，但比IL-2或IL-4小。其影响的时间历程也不同于IL-2和IL-4。同样，通过它们的CD40受体激活的B细胞也以剂量依赖方式受到影响，并与IL-4和IL-13的作用差不多。作用的动力学表现出与IL-4或IL-10反应有不同的时间历程。合用IL-10和IL-13可表现有加合作用，但IL-13似乎并不提高IL-4的作用。这一观察结果连同其他数据都提示，在信号转导中这两种细胞激素可能共有某些成分，不过其他一些实验数据则表明各自作用的独立性。

更具体地说，IL-13诱导了各种Ig，特别是IgE的表达。IL-13的靶细胞群体似乎也比IL-4的更为局限。可见，虽然IL-4和IL-13共有许多生物学特性，但它们信号转导途径是可以从生理上和机械上加以区别的。

3.Ig产生的修饰作用

由B21T细胞克隆，它们的膜，或抗CD40激活的B细胞在接触小鼠P600或人IL-13之后似乎表现出经过修饰的Ig产生曲线。当将人IL-13与某种诱导剂如激活的B21T细胞、激活的B21T细胞膜或抗CD40抗体一起作用于B细胞时，增加了各种Ig分子亚型特别是IgE的产生水平。Ig产率的改变提示加速了包括IgG4和/或IgE类开通在内的分化作用。这两种可能性均与由小鼠P600或人IL-13引起的分化作用相一致。

如下文所述，当用CD40-L刺激B细胞时，可观察到IL-13对IgE和IgG4合成的相似的诱导作用。

4.对CD40介导的B细胞增殖和分化的影响

在IL-4或IL-13存在下，可提高抗CD40抗体或CD40配基对B细胞增值的影响。两种细胞激活素尽管有明显的顺序差异但它们作用都差下多。B细胞增值同时伴随有对IgM，IgG4、总IgG和IgE水平的诱导作用。但不刺激IgA的生成。因为抗IL-4抗体阻断了IL-4作用但不阻断IL-13作用，所以这两种细胞激活素是通过不同的结构机制发挥作用的。对IgE的影响提示IL-13促成IgE产生，并且是一种控制IgE介导的过敏性反应的重要因子。

5.IgE开通

IL-13诱导在激活的CD4⁺T细胞或其细胞膜存在下培养的未分离之外周血单核细胞（PBMNC）和高度纯化的B细胞合成IgG4和IgE。因为IL-13诱导的IgG4和IgE合成不受中和性抗IL-4单克隆抗体（m Ab）的影响，故可知这一作用并不依赖于IL-4。高度纯化的sIgD⁺B细胞也可受IL-13的诱导以产生IgG4和IgE，表明这些亚型的产生影响了IgG4和IgE开通，并且不使所牵涉的B细胞选择性地过度生长。

IL-4和IL-13以最适浓度加在一起没有相加或协同作用，提示可能包括共同的信号发生途径。IL-13与IL-4一样诱导了B细胞上的CD23表达，并提高了CD72、表面IgM（sIgM）和Ⅱ类MHC抗原的表达，这一观察结果进一步支持了上述观点。另外，与IL-4一样，IL-13诱导了高度纯化之B细胞中的菌系ε转录。总之，这些结果表明IL-13是除了IL-4以外的另一种有效地指导天然人B细胞开通IgG4和IgE产生的T细胞衍生的细胞激活素。

B.PBMC和巨噬细胞

1.诱导形态学改变

小鼠P600也诱导粘附性人外周血单核细胞的形态学改变。经处理的细胞表现有明显不同的形态学和小细胞簇。将种属细胞集中起来，并存在克隆增殖的证据，可见这些观察结果均与对细胞增殖的诱导作用相符。

2.修饰细胞表面标志

小鼠P600诱导了粘附性外周血细胞之细胞表面标志的显著改变。这些粘附细胞大多是单核细胞如巨噬细胞前体，但也包括分化更好的细胞类型如树状细胞和某些B细胞。

这些粘附细胞上的许多细胞表面标志受到上调或下调，或者改变了它们的表达水平的离散。每个细胞上的下列标志物趋向增加：CD11b，CD11c，Ⅱ类MHC（如经单克隆抗体Q5/13或PdV5.2结合试验测得的）、CD23和CD18。相反，各细胞下列标志物的表达出现降低：CD32、CD16、IL-2Rα和CD14。改变了每个细胞表达CD32和CD14的均一性。对于CD11α、CD54和CD58的表达则没有改变。虽然在一次实验中没有观察到CD44和Ⅰ类MHC的改变，但其他一些实验则表明增加了其表达水平。

这些表达水平的改变也可在第10天检测到，并且在某些情况下表现出更为显著的变动，而其他一些情况下则显示有较小的改变。根据细胞亚群的不同，可能在到第10天时已丢失了某些特征。

尽管小鼠P600和人IL-13间有顺序差异，但两种分子似乎在人粘附细胞中引起相似的改变。很可能见于一种分子的活性也可见于另一种分子。此外，这些分子似乎表现有种间交叉活性，如小鼠P600对人细胞有活性，而人IL-13对小鼠细胞有活性。

3.氧化氮合成

根据其对GM-CSF衍生物的骨髓巨噬细胞产生氧化氮（NO）能力的LPS刺激的抑制效应来检测IL-13（P600）。IFN-γ诱导了NO产生，而IL-4或IL-13则抑制NO产生。

4.对IL-Iα、IL-6、IL-10和TNF-α产生的影响

IL-4和IL-13抑制LPS激活的人单核细胞产生IL-1α、IL-6、IL-10和TNF-α。因为IL-4和IL-13可在中和性抗-IL-10mAb19F1存在下抑制IL-1α、IL-6和TNF-α的产生，所以IL-4和IL-13对LPS激活的人单核细胞产生细胞激活素的抑制效应不依赖于IL-10。

5.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

IL-13诱导了单核细胞表型的显著改变。与IL-4一样，它可以剂量依赖方式提高CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD49e（VLA-5）、Ⅱ类MHC、CD13和CD23的表达水平，而降低CD64、CD32、CD16和CD14的表达水平。IL-10可阻止IL-13诱导的对Ⅱ类MHC抗原的上调作用，和对CD64、CD32及CD16表达的下调作用。

IFN-α也能部分地阻止IL-13诱导的下调CD64，但不影响CD32和CD16。然而，IL-13强烈地抑制人单核细胞对抗IgD包被之Rh⁺红细胞的自发性和IL-10或IFN-α诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）活性，此表明单核细胞的细胞毒活性受到了抑制。这些结果显示IL-13具有抗炎和免疫调节活性。

C.IL-4拮抗剂：相互作用

hIL-4.Y124D拮抗剂竞争性抑制hIL-4和IL-13对TF-1细胞的生物学作用这一观察结果证明了IL-4R和IL-13R之间的关系。mIL-13与I¹²⁵-hIL-4竞争结合TF-1细胞的能力进一步证实了IL-4R和IL-13R的共性，这种相关特征也已根据已知由hIL-4和IL-13引发的相似生物学反应，以及可能从人和小鼠中IL-4和IL-13基因的密切联系而预见到（参见Morgan et al.，Nucleic Acids Res.20∶5173（1992），和本文所述其实验结果）。对上述观察的一个直截了当的解释是IL-4和IL-13通过同一受体发挥作用。

D.生物学关联

小鼠P600蛋白质可支持或促进大的体内激活的B细胞增殖。据此，该因子似乎是用于促进激活的B细胞生长的刺激或协助刺激因子。因此，可望将IL-13作为一种有用的因子用于要求被激活的B细胞生长的环境中。

这些环境包括遗传、发育、或获得性免疫系统缺陷，如无球蛋白血症（aglobulinemia）、不成熟儿或化学治疗的病人。应进行体外实验以确定IL-13具有什么效应。特别是使用本发明的组合物来试验各种免疫学检测法的剂量反应关系（如参见Coligan  et  al.，Current  Protocols  in  Immunology，1991，Greene/Wiley，New  York）。

就增殖反应来说，小鼠P600可诱导单核细胞的形态学改变。单核细胞主要由巨噬细胞前体组成，而且相似的结果也应适用于见于外周血以外的器官或组织中的单核细胞等同物，如非囊腔器官（ave-olar）、腹腔内或脾/淋巴巨噬细胞前体。应指明IL-13或拮抗剂，如抗体或IL-4拮抗剂调节局部性或全身性免疫反应所需的和适当的条件。在这些情况下，对Ⅱ类MHC的影响是特别相关的。

除了生长因子/辅助因子活性外，人IL-13也影响免疫系统中各种不同细胞的分化。例如，在激活的B细胞中，它加速或促进Ig生成细胞的分化。它诱导B细胞产生体现较晚或较快分化作用之特征的Ig分子。据此，认为人IL-13和鼠P600似乎是B细胞的分化因子。

因此，Ig产生应是单独受IL-13或IL-13加上其他因子的共同作用调节的。当以适当的剂量和用药程序提供其激动剂和拮抗剂时，它们可被用于治疗或控制异常的B细胞状态，或者在适当情况下用于加速或减缓B细胞分化。

外周血单核细胞也对人IL-13和小鼠P600的存在很敏感。这些主要由巨噬细胞前体和分化更好的细胞类型组成的细胞表现有增殖反应和分化反应。

一个方面，IL-4适用于抗肿瘤情况，如刺激内源性抗肿瘤反应;IL-13也应适用于治疗目的。在针对增殖性疾病的另一不同情况下，即在放射治疗或化疗后典型地累及到免疫功能时，可用IL-13来促进其余免疫功能的恢复和分化以恢复受损的免疫功能（如参见Moller（ed.，），“Fc  Receptors”，Immunological  Reviews125∶1（1982））。在器官移植以及其他一些遗传或发育性免疫缺陷（如某些新生儿）中也存在相似的问题（如参见Baker  et  al.，N.Eng.J.Med.327∶213（1992））。

事实上，所观察到的细胞标志改变支持在这些条件下IL-13在促进免疫功能恢复中发挥作用的观点。就细胞标志分化来说，总的趋势是Ⅱ类MHC标志受到影响。另外CD23也受影响。对Ⅱ类MHC的影响表明可以用IL-13或小鼠P600，或者它们的激动剂或拮抗剂来调节对感染的全身反应。

所观察到的CD23和CD16降低表明IgG  Fc的受体降低，后者可能与对感染反应减小有关。如果是这样，即可应用IL-13拮抗剂或小鼠P600拮抗剂刺激免疫球蛋白介导的反应。该拮抗剂活性可导致Fcα受体表达的增加和调理素作用的功能性提高以及感染性颗粒的清除。

IL-13的拮抗剂如抗体或IL-4拮抗剂显示可调节B细胞生长和增殖，也许反映了存在过度的体液反应。各种自身免疫状态或高免疫球蛋白血症应对以适当量拮抗剂在有限疗程内进行的治疗有反应。IL-4拮抗剂将是产生IL-13效应的优选拮抗剂。

IL-13介导CD11标志表达的改变，这些改变则与细胞粘附如细胞-细胞接触有关。可见，增加CD11应有利于细胞相互作用并从此产生相应的功能（参见Springer  et  al.，Leukocyte  Adhesion  Molecules，1988，Springer-Verlag，New  York）。

与IL-4一样，IL-13诱导IgG4和IgE开通以及IgG4和IgE合成。IgE抗体是过敏反应的主要介导物。IgE异型的变应原特异性抗体具有与肥大细胞和嗜碱细胞上IgE的高亲和力Fc受体（FcεRI）特异性结合的能力。相关变应原结合这些受体结合的IgE抗体后，导致受体的交联并激活肥大细胞和嗜碱细胞。从而可使这些细胞脱颗粒并释放出可在各种靶器官（如鼻道、肺、肠和皮肤）中引起速发型超敏反应的变态反应介质如组胺、前列腺素和蛋白酶。

此外，IL-13也同IL-4一样诱导B细胞和单核细胞上低亲和性IgE受体（FeεRⅡ或CD23）的表达，并继而释放可溶形式的CD23。可溶性CD23能提高IgE产生量（如参见Pene  et  al.，Eur.J.Immunol.18∶929（1988）;Aubry  et  al.，Nature  358∶505（1992））。因此，下调IgE合成和可溶性CD23产生量，可减少或抑制IgE介导的变态反应性疾病。IL-4和/或IL-13拮抗剂如抗体，或IL-4突变蛋白质如Y124D或竞争IL-4/IL-13结合的相似突变体IL-13蛋白质，应适用于阻断IgE产生。

Ⅲ.核酸

本发明试图使用编码这种或密切相关蛋白质或其片段的分离的核酸或片段编码生物学活性相应多肽。另外，本发明包括编码具有特征性IL-13活性之生物学活性蛋白质或多肽的分离的或重组的DNA。一般该核酸可在适当条件下与表1中所示的核酸顺序片段杂交。

所说的生物学活性蛋白质或多肽可以是全长度蛋白质或片段，并且典型地具有与表1所示顺序高度同源之氨基酸顺序的片段。另外，本发明包括使用编码具有与已公开的IL-13蛋白质同源之片段的蛋白质的分离或重组的核酸或其片段。分离的核酸可在5′和3′侧翼带有各自的调节顺序，如启动子、增强子、poLyA加入信号，以及来自天然基因的其他调节顺序。

“分离的”核酸是指基本上纯的，如与天然伴随固有顺序的其他成分如核糖体、聚合酶、及不同种来源之侧翼基因组顺序分离开的核酸，如RNA、DNA或混合的多聚体。该术语包括已从其天然发生环境中除去的核酸顺序，并包括重组或克隆的DNA分离物，因而它不同于天然存在的组合物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子包括完全或实质上纯的分离形式的分子。

分离的核酸一般是分子的均一组合物，但在有些实施方案中，其可包含小的异源性部分。这种异源性典型地见于多聚体末端或对于预期的生物学功能或活性来说不重要的部分。

“重组”核酸是由其生产方法或其结构限定的。就其生产方法来说，如某产物是以使用重组核酸技术的方法制得的，如包括人为干预核苷酸顺序。虽然在某些情况下也可包括更为传统的动物繁殖技术，但这种干预典型地包括体外操纵。

另外，它可以是通过产生包括两个彼此天然不相连接的片段的融合体的顺序所制得的核酸，但意味着排除天然的产物，如以其天然状态存在的天然的突变体。例如，包括使用任何非天然存在的载体转化细胞而制得的产物，该产物是含有用任何合成寡核苷酸方法衍生之顺序的核酸。这样一种方法常常是用编码同一种或某保守氨基酸的冗余密码子取代某个密码子，同时引入或除去某限制性酶顺序识别位点而完成的。

再一种方法是将有所需功能的核酸片段连接在一起，以产生包括不是以通常可得到的天然形式如编码融合蛋白质的形式存在的有所需联合功能的单一遗传整体。这类人工操作的目标主要是限制性酶识别位点，但也可在设计中掺入如启动子、DNA复制位点、调节顺序、控制顺序或其他有用特征位点特异性靶顺序。

重组体的相类概念可包括融合蛋白质、肽等。特别是包括借助遗传密码重复编码与白细胞介素的片段相似之多肽，和来自不同白细胞介素或其相关分子（如生长因子）之顺序的融合体的合成核酸。

所说的核酸“片段”是至少约17个核苷酸，一般至少20个核苷酸，更一般至少23个核苷酸，普通至少26个核苷酸，更普通至少29核苷酸，常常至少32个核苷酸，更多是至少35个核苷酸，典型地至少为38个核苷酸，更典型地至少为41个核苷酸，通常至少44个核苷酸，更通常至少47个核苷酸，较好至少有50个核苷酸，更好至少有53个核苷酸，且在一特别优选的实施方案中将是至少有56个或更多个核苷酸的连续片段。典型情况下，不同基因顺序的片段可在适当长度内与另一个相比较。

编码IL-13的核酸特别适用于鉴定编码IL-13或密切相关蛋白质的基因、mRNA和cDNA，以及编码等位基因或其他遗传变异体为来自不同个体之变异体的DNA。用于进行这类筛选的优选探针是那些在不同等位基因变异体间保守的白细胞介素的区域，并最好是全长度或接近全长度的。在其他情况，更有用的是等位基因特异性顺序。

本发明还包括具有与本文所列分离的DNA完全相同或高度同源之核酸顺序的重组体核酸分子和片段。特别是这些顺序常常被可操作地连接到控转录、转译及DNA复制的DNA片段上。这些附加片段一般都是用来帮助表达所需的核苷酸片段。

当彼此间或与表1所示顺序比较时，同源核酸顺序表现有明显的相似性。核酸同源性的标准是本领域中通用的以顺序比较方法检测同源性，或者基于杂交条件来确定同源性程度。下文将更详细地描述对比性杂交条件。

在进行核酸顺序比较时所说的“基本上同源”是指当将顺序进行最佳对应排列，并进行适当的核苷酸插入或缺失时，将片段与它们的互补链相比较，至少约有60%核苷酸，一般至少约有66%，普通至少有71%，常常至少有76%，更常见至少有80%，通常至少有84%，更通常至少有88%，典型地至少有91%，更典型地至少约有93%，较好至少有95%，更好约至少有96至98%，且在一特别优选的实施方案中，有高达约99%或99%以上的核苷酸完全相同。

另外，当片段在选择性杂交条件下与一条顺序链或其互补链特别是得自表1的顺序链杂交时，则它们间即存在实质上的同源性。一般说来，当至少约有14个核苷酸的一段顺序上至少有大约55%，更通常约有至少65%，较好至少约有75%，更好约有至少90%同源时即可发生选择性杂交（参见Kanehisa，Nucleic  Acids  Res.，12∶203（1984））。

所述同源性比较的长度可以是较长的一段，在某些实施方案中可跨越至少约17个核苷酸，一般至少约20个核苷酸，普通至少约24个核苷酸，通常至少约28个核苷酸，典型至少约32个核苷酸，更典型至少约40个核苷酸，较好至少约50个核苷酸，更好至少约75至100或更多个核苷酸。

在涉及杂交同源性的严格条件时，一般应在杂交反应中控制如盐、温度、有机溶剂及其他参数等的严格组合的条件。严格温度条件一般包括约30℃以上，通常超过约37℃，典型地超过约45℃，更典型地超过约55℃，较好超过约65℃，更好超过约70℃的温度。严格盐浓度条件一般是小于约1000mM，通常小于约500mM，更通常小于约400mM，典型地小于约300mM，较好小于约200mM，更好小于约150mM。但结合考虑这些参数要比单测某一参数更为重要（如参见Wetmur  et  al.，J.Mol.Biol.31∶349（1968））。

可通过核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和一段核苷酸的颠倒很容易地修饰分离的DNA。这些修饰将产生编码该蛋白质、其衍生物或具有IL-13活性之蛋白蛋的新的DNA顺序。可用这些经过修饰的顺序产生突变蛋白质（突变体）或提高变异体的表达水平。提高的表达可涉及基因扩散、提高的转录作用，提高的转译作用以及其他机制。如此突变的IL-13衍生物包括对蛋白质或其片段的预定的或位点特异性突变。

本文所说的“突变体IL-13”包括借助缺失、取代或插入而没有落入上文所列入IL-13的同源性定义内，但具有不同于天然人IL-13之氨基酸顺序的多肽。具体地说，“位点特异性突变体IL-13”包括与表1所示蛋白质有实质上的同源性，并典型分离本文所公开之蛋白质形式的大多数生物学活性的蛋白质。

虽然位点特异性突变位点是预先确定的，但突变体不一定是位点特异的。可在基因中与表达过程相偶联造成氨基酸的插入或缺失，以完成对人IL-13的诱变。可进行取代、缺失、插入或这些修饰方式的任意结合，以得到最终的构建体。插入包括氨基或羧基末端融合。可在靶密码子上进行随机诱变，然后根据所需活性筛选已表达的人IL-13突变体。在具有已知顺序的DNA中的预先确定的位点上造成取代突变的方法是本领域已知的，如可使用M13引物诱变法（参见Sambrook  et  al.，（1989）;Ausubel  et  al.，（1987和定期增刊））。

正常情况下，DNA中的突变不应在读码以外的编码顺序上，并最好不造成能够杂交而产生次级mRNA结构（如环或发卡结构）的互补区域。

可用Beaucage等人（Tetra.Letts.22∶1859（1981））描述的亚磷酰胺法产生适当的合成DNA片段。通常可合成互补链并在适当条件下将两链退火在一起，或者用适当的引物顺序在DNA聚合酶作用下加入互补链，从而制得双链片段。

在诱变中常常可应用聚合酶链反应（PCR）技术。此外，在完成于预定位点上产生限定突变的方法时，常常使用诱变引物。

Ⅳ.蛋白质，肽

如上所述，本发明包括具有表1中公开的顺序并在上文中描述过的人IL-13。等位基因和其他变异体也包括在内。

提到多肽时所说的“基本上纯的”一般是指该蛋白质没有其他污染蛋白质、核酸以及从原始生物体衍生的其他生物材料。可用标准方法检测纯度，且一般是至少约40%纯，更一般是至少约50%纯，通常至少约60%纯，更通常至少约70%纯，常常至少约75%纯，更常见至少约80%纯，典型地至少约85%纯，更典型地至少约90%纯，较好至少约95%纯，更好至少约98%纯，且在最优选的实施方案中至少99%纯。分析结果可以是例如用凝胶染色法、分光光度法和末端标记法估测的重量或摩尔百分比例。

本发明还提供了重组蛋白质，如使用得自该人蛋白质的阶段产生的异源融合蛋白质。异源融合蛋白质是在天然情况下一般不以同样方式融合的蛋白质成片段的融合体。因此，生长因子与白细胞介素的融合产物是具有以典型肽键相融合之顺序的一般作为单一转译产物制得的并表现有各来源肽之特性的连续蛋白质分子。相似的概念也适用于异源核酸顺序。

此外，可将来自其他相关蛋白质如生长因子或其他细胞激活素的相似功能或结构区域结合在一起而制得新的构建体。例如，可在不同的新融合多肽或片段间“互换”受体结合或其他片段（如参见Cunn-ingham  et  al.，Science  243∶1330（1989）;O′Dowd  et  al.，J.Biol.Chem.263∶15985（1988））。

因此，新的嵌合多肽将因受体结合特异性的功能性键合而表现出新的联合的特异性。例如，可以加入来自其他相关配基分子的受体结合区域或者取代该蛋白质或相关蛋白质的其他区域。所得到的蛋白质将常常具有杂合功能和特性。例如，融合蛋白质可包括击靶区域，后者可使该融合蛋白质隐伏于特定器官，如被脾细胞特异性结合的并可有利在脾中积聚的配基部分。

可从多种顺序数据库，如GenBank，c/o  Intelli  Genetics，Mountain  View  CA，和BCG，University  of  Wisconsin  Biotechno-logy  Computing  Group，Madison，WI中选择候选融合对象和顺序。

人IL-13的“衍生物”包括氨基酸顺序突变体、糖基化变异体、代谢衍生物和与其他化学部分形成的共价或聚集结合体。可按本领域已知的方法，将功能性顺序键合到见于IL-13氨基酸侧链或见于N或C末端的基团上，制得共价衍生物。这些衍生物可包括但不只限于羧基末端或含羧基侧链之残基的脂族酯或酰胺、含羟基基团残基的O-酰基衍生物、以及氨基末端氨基酸或含氨基基团残基如赖氨酸或精氨酸的N-酰基衍生物。酰基基团选自包括C3至C18正烷基的烷基部分的基团，从而形成链烷醇基芳酰基基团。

特别是包括糖基化改变，如在其合成和加工期间或在进一步的加工步骤中修饰多肽的糖基化型式而改变糖基化特征。实现糖基化改变的特别优选的方法是使多肽与衍生于正常情况下提供这种加工之细胞的糖基化酶如哺乳动物糖基化酶接触。也可考虑使用去糖基化酶。还包括带其他一些小的修饰，如包括磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸）的同一一级氨基酸顺序的变体。

主要衍生物是白细胞介素或其片段与其他多肽蛋白质的共价结合物。这些衍生物可以是在重组体培养物中合成的，如N或C末端融合体，或者是使用已知可用于通过反应性侧链基团来交联蛋白质的试剂合成的。交联剂的优选修饰位点是在游离氨基、碳水化合物部分和半胱氨酸残基上。

还提供了白细胞介素和其他同源或异源蛋白质间的融合多肽。同源多肽可以是不同生长因子间的融合体，产生例如表现有多个不同受体之配基特异性的杂合蛋白质，或者可能已加宽或减弱了与其受体结 合之特异性的配基。同样，可以构建将表现各衍生蛋白质之联合特征或活性的异源融合体。

典型的例子是受体多肽的融合体，例如带有受体片段或区域如配基结合片段的荧光素酶，这样即可很容易地检测预期之配基的存在和定位（如参见Dull  et  al.，US  Patent  No.4，859，609）。其他基因融合对象包括谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、醇脱氢酶和酵母  α-接合因子（如参见Godowski  et  al.，Science  241∶812（1988））。

用Beaucage等人（Tetra.Letts.22∶1859（1981））所述的亚磷酰胺法产生适当的合成DNA片段。可合成互补链并将各链在适当条件下退火在一起，或者使用DNA聚合酶借助适当的引物顺序加入互补链，常常可制得双股片段。

这样的多肽也可以已通过磷酸化作用、硫化作用、生物素化作用受的化学修饰的，或者加入或除去了其他部分特别是具有与磷酸基团相似之分子形状的部分的氨基酸残基。在某些实施方案中，上述修饰对于标记试剂，或作为纯化靶如亲合性配基将是有用的。

一般可用重组核酸法或合成肽法制备融合蛋白质。有关核酸操作和表达的技术可参见Sambrook  et  al.，Molecular  Cloning∶A  Laboratory  Mannual（2d  ed），1989，Vols，1-3，Cold  Spring  Harbor  Laboratory和Ausubel  et  al.，（eds），Current  Protocols  in  Molecular  Biology，1987和定期增刊，Greene/Wiley，New  York。有关多肽合成的技术可参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85∶2149（1963）;Merrifield，Seience  232∶341（1986）和Atherton  et  al.，Solid  Phase  Peptide  Synthesis∶A  Practical  Approach，1989，IRL  Press，Oxford。

本发明还意欲使用除了有氨基酸顺序变异或糖基化产物以外的人IL-13的衍生物。这些衍生物可包括与化学部分的共价或聚集结合物。一般可将这些衍生物分为3类：（1）盐，（2）侧链和末端残基共价修饰产物，以及（3）吸附复合物，如细胞膜吸附的。这些共价或聚集衍生物可用作免疫原，在免疫试验中或在纯化方法例如受体或其它结合分子（如抗体）的亲合纯化中可用作试剂。

例如，可按本领域已知的方法，将人IL-13配基共价结合到固相载体如溴化氰活化的Sepharose上以使之固相化，或者用或不用戊二醛交联使人IL-13吸附到聚烯烃表面上，用于检测或纯化IL-13受体、抗体或其他相似分子。也可用可检测的基团标记IL-13，例如用氯胺T法进行放射标记，共价结合到稀土螫合剂上，或结合到另一种用于诊断检测的荧光素部分上。

本发明的人IL-13可用作免疫原以生产对白细胞介素或其任何片段特异的抗血清或抗体。纯化的白细胞介素可用于筛选用各种形式的含该蛋白质的不纯制剂进行免疫所制得的单克隆抗体或抗原结合部分。具体地说，术语“抗体”也包括天然抗体的抗原结合片断。纯化的白细胞介素也作为检测试剂，用于检测任何在对提高的表达水平之反中所产生的抗体，或者检测导致抗内源性细胞激活素之抗体产生的免疫学疾病。

另外，也可用IL-13片段作为免疫原，按下文所述方法产生本发明的抗体。例如，本发明意欲涉及对表1所示氨基酸顺序或其片段，或类似肽有结合亲和性或抗所述顺序或片段的抗体。特判是本发明包括对推测或确实暴露在天然细胞激活素之外蛋白质表面的特异性片段有结合亲和性，或已产生的抗所说片段的抗体。

阻断对这些白介素的生理学反应可能是由于例如通过竟争性抑制作用抑制了配基与受体的结合。因此，本发明的体外检测法常常使用抗体或这些抗体的配基结合片段，或连接到固相基质上的片段。这些检测法也可用于诊断确定结合区域突变和修饰物，或配基突变和修饰物（如配基类似物）的效应。

本发明还考虑使用竟争性药物筛选检测法，例如，其中涉及针对白细胞介素的中和抗体或其片段和待测试的化合物进行竟争以结合至一种受体或抗体上。在这种方法中，可以使用中和抗体或其片段来检测共有与受体结合的一个或多个结合位点的任何多肽的存在，也可用中和抗体或其片段占领受体上的结合位点，否则这些结合位点将结合白细胞介素。

Ⅴ.制备核酸和蛋白质

通过化学合成，筛选cDNA文库，或通过筛选从各种类型的细胞系或组织样品中制备的基因组文库可以获得编码上述蛋白质或其片段的DNA。使用经典方法能够分离出天然序列，并且本文提供了这些序列，列于表1中。

该DNA可以在各种类型的宿主细胞中表达以合成生长的人白细胞介素或其片段，而白细胞介素或其片段依次又可用于例如，制备多克隆或单克隆抗体;用于结合性研究试验;用于构建和表达经修饰的激动剂/拮抗剂分子;以及用于进行结构和功能的研究。各种变异体或其片段都可以在用合适的表达载体转化或转染的宿主细胞中表达。除了来源于重组宿主的蛋白质分子之外，这些蛋白质分子基本上不含有蛋白质或细胞的污染物，因此，这些分子与一种药用可接受载体和/或稀释剂组合时特别适用于药用组合物。人的蛋白质或其部分可以以带有其他蛋白质融合体的形式表达。

典型的表达载体是自我复制DNA或RNA构建体，该构建体含有通常经过操作连接至能在合适宿主细胞中被识别的合适遗传控制因子上的所需的受体基因或其片段。这些控制因子能在合适宿主中影响表达。对影响表达必需的特定类型的控制因子将依据所使用的最后的宿主细胞而定。

一般来说，遗传控制因子可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，典型的情况下，包括一个转录启动子，一个控制转录开始的可任意选择的操纵子，用于提高mRNA表达水平的转录增强子，一个编码合适的核糖体结合位点的序列，以及终止转录和转译的序列。表达载体通常还含有一个允许载体在宿主细胞中独立复制的复制原点。

本发明的载体包括那些含有编码本文所述蛋白质DNA的，或者其编码一种生物学活性等同多肽的片段。该DNA可受病毒启动子的控制并且编码一种选择性标志。本发明进一步考虑使用这样的表达载体，其能够在原核或真核宿主中表达编码这样一种蛋白质的真核cDNA，其中该载体与宿主相容，并且将编码该受体的真核cDNA插入到该载体中，以便含有该载体的宿主生长而表达正在讨论的cDNA。

通常，将表达载体设计为能在其宿主细胞中稳定地复制，或者可以扩增以极大地提高每个细胞中所需基因的总拷贝数。要求表达载体能在宿主细胞中复制并不总是必要的，例如，利用不含有能被宿主细胞识别的复制原点的载体也可以在各种宿主中影响白细胞介素蛋白质或其片段的瞬时表达。也可以使用通过重组方法将人蛋白质或其片段整合到宿主DNA中的载体。

本发明所使用的载体包括质粒，病毒，噬菌体，可整合性DNA片段，和其他能使DNA片段整合到宿主基因组中的载体。将表达载体限定为含有影响可操作连接基因表达的遗传控制因子的载体。质粒是最普遍使用的载体形式，但是所有具有等同功能并且是将成为本领域内已知的其他形式的载体都适合于本发明使用（如参见，Pouwels  et  al.，Cloning  Vectors∶A  Laboratory  Manual，1985以及增刊，Elsevier，N.Y.;以及Rodriquez  et  al.（eds），Vectors∶A  Survey  of  Molecular  Cloning  Vectors  and  Their  Uses，1988，Buttersworth，Boston）。

经转化的细胞，优选的是已用利用重组DNA技术构建的受体载体进行转化或转染的哺乳动物细胞。经转化的宿主细胞通常表达所需的蛋白质或其片段，但是为了克隆，扩增和加工其DNA的目的时，不必表达该主体蛋白。本发明还考虑在营养培养基中培养经转化的细胞，从而使白细胞介素积累于培养物中。能够从培养物或者从培养基中回收该蛋白质。

为了实现本发明的目的，将功能上互相关联的核序列经过操作如工后连接在一起。例如，如果需要将编码前序列或分泌引导肽的DNA以前蛋白质形式表达或需要参与将多肽引向细胞膜上或需要参与多肽的分泌，则可将该DNA通过操作加工后连接到多肽上。如果需要一种启动子控制多肽的转录则将它通过操作加工后连接到编码序列上;如果需要将一种核糖体结合位点定位后可以允许转译则将它通过操作加工后连接到编码序列上。通常，经过操作后的连接方法是与阅读框架相邻接并且在阅读框架内，但是，某些遗传因子如抑制基因不是相邻连接，而是仍结合至依次控制表达的操纵序列上。

合适的宿主细胞包括原核生物，低等真核生物，和高等真核生物的细胞。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌和枯草杆菌。低等真核生物包括酵母，例如，啤酒酵母和毕赤酵母属，以及网柄菌属内的种。高等真核生物包括从动物细胞建立起来的组织培养细胞系，包括非哺乳动物来源的细胞如昆虫细胞和鸟类细胞，以及哺乳动物来源的细胞，如人，灵长类动物和啮齿类动物的细胞。

原核宿主载体系统包括许多不同种的各种类型的载体。如在本文中使用的，大肠杆菌及其载体通常包括在其他原核生物中使用的相等载体。一种用于扩增DNA的典型载体是pBR322或它的许多衍生物。能用于表达受体或其片段的载体包括（但不限于此）如那些含有lac启动子（pUC-系列）;trp启动子（pBR322-trp）;Ipp启动子（pIN-系列）;λ-pP或pR启动子（pOTS）;或如ptac（pDR540）的杂交启动子的载体（参见Brosius  et  al.，“Expression  Vectors  Employing  Lambda-，trp-，Lac-，and  Ipp-drived  Promoters”，in  Vectors∶A  Survey  of  Molecular  Cloning  Vectors  and  Their  Uses，（eds.Rodriguez  and  Denhardt），1988，Buttersworth，Boston，Chapter  10，pp.250-236）。

可用含有IL-13序列的载体转化低等真核生物，例如，酵母和网柄菌。为了实现本发明的目的，最常用的低等真核宿主是啤酒酵母。尽管许多其他菌株和物种都可以使用，但通常以啤酒酵母代表低等真核生物。典型的酵母载体由复制原点（除整合型外），一种选择性基因，一种启动子，编码受体或其片段的DNA，以及用于终止转译，聚腺苷化以及终止转录的序列。

酵母合适的表达载体包括如3-磷酸甘油酸激酶和各种其他酵解酶基因启动子的组成型启动子或如乙醇脱氢酶2启动子或金属硫因（metallothionine）启动子的诱导型启动子。合适的载体包括下列类型的衍生物：自我复制低拷贝数（如YRp系列），自我复制高拷贝数（如YEp系列）;整合型（如YIp系列），或小染色体（如YCp系列）。

高等真核组织培养细胞通常是用于表达功能活性白细胞介素蛋白质的优选的宿主细胞。原则上讲，任何高等真核组织培养细胞系都是可用的，例如，昆虫杆状病毒表达系统，不论是来源于非脊椎动物源或脊椎动物源。然而，哺乳动物细胞是优选的。上述细胞的转化或转染以及繁殖已成为常规方法。有用的细胞系的实例包括海拉细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，幼大鼠肾（BRK）细胞系，昆虫细胞系，鸟细胞系，以及猴（COS）细胞系。

上述细胞系的表达载体通常包括一复制原点，一个启动子，一个转译起始位点，RNA拼接位点（如果使用基因组DNA），一个聚腺苷化位点，以及一个转录终止位点。这些载体通常还含有一个选择性基因或扩增基因。合适的表达载体可以是质粒，病毒，或是携带来源于例如腺病毒，SV40，微小病毒，疫苗病毒或巨细胞病毒的启动子的逆转录病毒。合适表达载体的代表性例子包括pCDNA1;pCD（参见Okayama  et  al.，Mol.Cell  BioI.5∶1136（1985））;pMClneo  PolyA（参见Thomas  et  al.，Cell51∶503（1987））以及如pAC373或pAC610的杆状病毒载体。

为了分泌蛋白质，通常由一种开放式阅读框架编码一种多肽，该多肽由一个共价连接到一个信号肽的N-末端的成熟的或可分泌的产物组成。在该成熟的或活化的多肽分泌前，切去信号肽。根据经验法则（例如，von  Heijne，Nucleic  Acids  Research  14∶4683（1986））可以高度精确地推测切割位点，而且信号肽的精确的氨基酸组成并不显示对其功能是关键性的（例如，Randall  et  al.，Science  243∶1156（1989）;Kaiser  et  al.，Science  235∶312（1987））。

人们常期望在能提供一种特定的或所限定的糖基化方式的系统中表达这些多肽。在这种情况下，通常的方式自然是由表达系统提供的。然而，该方式是可以通过将例如一种未糖基化形式的多肽与导入到异源表达系统中的合适的糖基化的蛋白接触而改进的。例如，白细胞介素基因可以用一种或多种编码哺乳动物或其他糖基化酶的基因进行转化。利用该方法，可在原核生物或其他细胞中获得特定的哺乳动物糖基化方式。

人IL-13可来源于能表达重组huIL-13  DNA的真核或原核宿主，如上文所述。也来源于如小鼠Swiss  3T3成纤维细胞的细胞系，但是，对本发明来说也可以考虑其他哺乳动物细胞系，优选的细胞系是来源于人类。

既然完整序列是已知的，采用常规合成肽的方法可以制备人IL-13，其片段或衍生物。这些方法包括如Stewart等人描述的（Stewart  et  al.，Solid  Phase  Peptide  Synthesis，1984，Pierce  Chemical  Co.，Rockford，IL;Bodanszky  et  al.，The  Practice  of  Peptide  Synthesis，1984，Springer-Verlag，New  York;Bodan-szky，The  Principles  of  Peptide  Synthesis，1984，Springer-Verlag，New  York）。例如，可以使用叠氮化合物法，酰基氯法，酸酐法，混合酸酐法，活性酯法（例如，对硝基苯酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯，或氰甲基酯），碳化二亚胺吡咯（Carbodiimidazole）法，氧化还原法，或二环己基碳化二亚胺（DCCD）/添加法。固相和液相合成都可应用于上述方法。

根据上述典型地用于肽合成中的方法，即通常所说的包括从序列上一个一个地缩短氨基酸直至末端氨基酸的逐级方法，或者是通过将肽片段偶合到末端氨基酸上的方法，适当地制备IL-13蛋白质，片段或衍生物。通常必须保护在偶合反应中没有使用的氨基团以阻止在不正确的位点发生偶合反应。

如果采用固相合成法，则将C-末端氨基酸与不溶性载体或支持物通过其羧基进行结合。只要该不溶性载体具有结合到反应性羧基上的能力则没有特定的限制。这样的不溶性载体的实例包括卤甲基树脂，如氯甲基树脂或溴甲基树脂，羟甲基树脂，酚树脂，叔烷氧羰基酰肼化的树脂，等等。

通过将氨基得到保护的氨基酸的活化羧基与前面形成的肽或链的反应性氨基缩合而依次结合，以逐步合成肽。在合成完整序列后，从不溶性载体上分裂出该肽以生产该肽。Merrifield等人综合描述了该固相方法（Merrifield  et  al.，in  j.Am.Chem.Soc.85∶2149（1963））。

借助于肽分离法，例如通过提取，沉淀，电泳，各种方式的色谱等等可以从反应混合物中分离和纯化出已制得的蛋白质及其片段。根据其所期望的用途，获得不同纯度的本发明的白细胞介素。通过使用本文中公开的蛋白质纯化技术或使用本文在免疫吸附亲和色谱方法中描述的抗体来完成纯化过程。通过首先将该抗体连接到固体载体上，然后将该连接的抗体与合适细胞的溶解的裂解液，表达白细胞介素的其他细胞的裂解液，或采用DNA技术而产生蛋白质的细胞的裂解液或上清液相接触而完成免疫吸附亲和色谱层析，参见下文。

大体上而言，纯化蛋白质至少约40%纯度，一般至少约50%纯度，通常是至少约60%纯度，典型地是至少约70%纯度，更典型地至少约80%纯度，优选的是至少约90%纯度，更优选的是约95%纯度，并且在特定的实施方案中纯度为97%-99%或更高。纯度通常是以重量为基础，但也可以以摩尔为基础。按照是否适用而应用不同的分析方法。

Ⅵ.抗体

可以制备针对天然存在形式和其重组形式的各种人IL-13蛋白质及其片段的抗体，不同之处在于针对活性配基的抗体可以更好地识别仅在天然构型中存在的抗原决定簇。还打算制备可作为天然受体或抗体的激动剂或拮抗剂的抗个体基因型抗体。

通过免疫原蛋白质的片段接种的免疫动物来制备抗预定的蛋白质片段的抗体包括结合片段和单链形式。从分泌所需抗体的细胞中制备单克隆抗体。这些抗体能筛分为与正常或缺陷型蛋白质结合的，或筛分为激动或拮抗活性的。这些单克隆抗体通常与至少K_D值为约1mM蛋白质相结合，更通常是与至少约300μM，典型地与至少约100μM，更典型地至少约30μM，优选的为至少约10μM，以及更优选的是至少约3μM或更好的K_D相结合。

本发明的含有抗原结合片段的抗体有显著的诊断或治疗价值。它们是结合至白细胞介素上的潜在的拮抗剂，并且抑制与受体的结合或抑制人IL-13诱导生物学应答的能力。它们也可作为非中和抗体，并且能偶合到毒素或放射性核素上以结合产生的细胞，或偶合到定位于白细胞介素源的细胞上。再者，借助于一个接头可以直接或间接地将这些抗体结合到药物或其他治疗剂上。

本发明的抗体也可作为诊断应用。作为捕获或非中和抗体，它们能结合到白细胞介素上而不抑制受体结合。作为中和抗体，它们能用于竟争结合分析中。它们也可用于检测或定量IL-13。

可以将蛋白质片段与其他材料，特定的多肽相连，如融合或共价连接到作为免疫原的多肽上。可以将人IL-13和其片段融合或共价连接到各种免疫原上，如锁眼虫戚血蓝蛋白（Keyhole  Limpet  hemocyanin），牛血清白蛋白，破伤风类毒素，等（参见Microbi-ology，Hoeber  Medical  Division，Harper  and  Row，1969;Lands-teiner，Specificity  of  Serological  Reactions，1962，Dover  Publication，New  York;Williams  et  al.，Methods  in  Immunology  and  Immunochemistry，1967，Vol.1，Academic  Press，New  York描述的制备多克隆抗血清的方法）。一种典型的方法包括用一种抗原高度免疫动物。然后在重复免疫接种后不久收集动物血液，并且分离γ-球蛋白。

在某些情况下，期望能从各种哺乳动物宿主，如鼠，啮齿动物，灵长类动物，人等中制备单克隆抗体。对制备这类单克隆抗体的技术的描述可以参见，例如，Stites  et  al.（eds），Basic  and  Clinical  Immunology（4th，ed.），Lange  Medical  Publications，Los  Altos，CA以及文中描述的参考文献;Harlow  et  al.，Antibodies∶A  Labo-ratory  Manual，1988，CSH  Press;Goding，Monoclonal  Antibodi-es∶Principles  and  Practice（2d  ed），1986，Academic  Press，New  York;以及尤其是Kohler  and  Milstein，Nature  256∶495（1975），其中讨论了制备单克隆抗体的一种方法。

简而言之，本方法包括用免疫原给动物注射。然后杀死该动物，并由其脾脏中获得细胞，然后与骨髓瘤细胞融合。结果是得到能在体内重复产生的杂交细胞或“杂交瘤”。然后筛选杂交瘤群以分离单个克隆，每一个克隆分离一种针对该免疫原的单一抗体种类。在该方法中，所获得的单独抗体种类是来自于免疫动物在应答所识别的免疫原物质上的特定位点时产生的不死的和克隆的单一β细胞的产物。

其他合适的技术包括体外将淋巴细胞与抗原多肽接触，或者另采用在噬菌体或相似载体中筛选抗体文库（参见，Huse  et  al.，Sc-ience  246∶1275（1989）;Ward  et  al.，Nature  341∶544（1989））。本发明的多肽和抗体可使用经过或未经修饰的，包括嵌合或人类化抗体。

时常将多肽和抗体共价或非共价地连接到提供检测信号的物质上而对其进行标记。各种类型的标记和连接技术是已知的，并且在科学和专利文献上都有许多报道。合适的标记物包括放射性核素，酶，底物，辅助因子，抑制剂，荧光基团，化学发光基团，码性颗粒等。使用这些标记物的专刊文献包括美国专利No.3，817，837;3，850，752;3，939，350;3，996，345;4，277，437;4，275，149;和4，366，241。也可以参见Cabilly，美国专利No.4，816，567的方法制备重组或嵌合免疫球蛋白。

本发明的抗体也可用于进行亲和色谱层析以分离IL-13。制备柱子，其中抗体连接到一种固相载体上，例如颗粒状的，如琼脂糖，葡聚糖等等，将一种细胞裂解液通过该柱子后，洗涤柱子，随后提高温和变性剂的浓度，从而将纯化的蛋白质释放出来。

也常用抗体来筛选表达文库中的特定表达产物。通常在此方法中使用的抗体可以用通过与抗体结合后可以很容易地检测抗原存在的一种成分进行标记。

也常用针对各种人IL-13而制备的抗体来制备抗个体基因型抗体。这些抗体可用于检测或诊断与蛋白质的表达或将表达蛋白质受体的细胞相关的各种免疫症状。它们也可用作白细胞介素的激动剂或拮抗剂，即天然存在的配位体的竟争性抑制剂或替代物。

Ⅶ.IL-13组合物的使用，核酸

本发明的天然存在和重组形式的人白细胞介素-13分子在药盒和检测的方法中都特别适用。例如，可用这些方法筛选对这些蛋白质的结合活性。近几年来已发展了几种自动检测方法，以便可以在每年筛选成千上万的化合物，例如参见，一种BIOMEK自动工作台，Beekman  Instruments，Palo  Alto，California，以及Fodor  et  al.，Science  251∶767（1991）。后者描述了通过与在固体物质上合成的大量限定聚合物的结合来试验的方法。由于可以采用大量的纯化的活性状态的可溶性白细胞介素，如由本发明提供的，因而大大地促进发展了一种合适的筛选一种受体或激动剂/拮抗剂同源性蛋白质的分析方法。

基于一种受体或抗体和其他效应剂或配基的分子形状的结构研究，也可以设计合适的药物。效应剂可以是介导其它对配基结合应答的功能的其他蛋白质，或者是与受体在正常情况下相互作用的其他蛋白质。一种测定与特异的其他蛋白质相互作用的位点的方法属于物理结构的测定，例如，X-射线结晶学或二维NMR技术。这些方法将为氨基酸残基形成分子的相关联区域提供指导。蛋白质结构测定的详细描述可见，例如，Blundell  et  al.，Protein  Crystallography，（1976）Academic  Press，New  York。

可将纯化的白细胞介素-13直接包被（coat）于平板上以用于前面介绍的受体筛选技术中。但是，可将针对这些蛋白质的非中和抗体用作捕获抗体以将各个白细胞介素固定于固相上，以适用于例如诊断使用。

本发明也考虑在各种诊断药盒和方法中使用白细胞介素-13，其片段，肽和其融合产物，以检测该蛋白质或其受体是否存在。换种方法，或者在上述方法基础上，将抗该分子的抗体引入到该药盒和方法中。典型情况下，该药盒具有一种含有特定的IL-13肽或基因片段或识别一个种类或其他种类的试剂的隔室。典型的情况下，对于肽而言，识别试剂是一种受体或抗体，或对于一种基因片段而言，识别试剂是一种探针。

通常一种用于测定一种样品例如IL-13的浓度的优选药盒包括一种对IL-13具有已知结合亲和性的标记化合物（例如受体或抗体），作为阳性对照的IL-13源（天然存在或重组体），以及一种用于从游离的标记化合物中分离结合化合物的工具，例如用于固定测试样品中的IL-13的固相物，一般情况下提供含有试剂的隔室和说明书。

在诊断应用中可以使用特异于IL-13或肽片段，或受体片段的抗体（包括抗原结合片段），以检测是否存在高含量的IL-13和/或其片段。诊断检测可以是同类方法（没有位于游离试剂和抗体-抗原复合物之间的分离步骤）或异类方法（有一个分离步骤）。各种商品化的检测法包括如放射免疫检测法（RIA），酶结合的免疫吸附检测法（ELISA），酶免疫检测法（EIA），酶增殖免疫检测技术（EMIT），底物标记的荧光免疫检测法（SLFIA）等等。

例如，通过使用一种被标记和能识别针对IL-13或针对其特定片段的抗体的第二抗体来使用未标记的抗体。在文献中已广泛地讨论了这些检测法。例如参见，Harlow  et  al.，Antibodies∶A  Labora-tory  Manual，1988，CSH;以及Coligan（Ed.），Current  Protocols  In  Immunology，1991以及定期的增刊，Greene/Wiley，New  York。

同样可以使用抗个体基因型抗体作为IL-13的激动剂或拮抗剂。在适当的环境中这些抗体将用作治疗剂。

通常，在药盒中包括用于诊断检测的试剂以使检测具有最大灵敏度。对于本发明，根据检测的特点，方案和标记物，来提供已标记的或未标记的抗体，或已标记的受体。上述方法也常与其他附加物，如缓冲液，稳定剂，产生信号必需的物质（如酶的底物）等等混合。优选的是，该药盒还含有指示正确使用的说明书以及使用后含量的控制法。典型情况下，该药盒中含有每一种适用试剂的隔室。令人满意的情况是，所提供的试剂是冻干粉剂形式，在水介质中该试剂可重新形成合适浓度以完成检测方法。

任何构成的诊断检测法可未加改变而使用，或以各种方法修饰后使用。例如，通过共价或非共价结合一种直接或间接提供可检测的信号的成分来完成标记。对于任何一种检测法，可以直接或间接地标记所要测试的化合物，IL-13或其抗体。直接标记的可能情况包括标记基团：如¹²⁵I的放射性标物，酶，如过氧化物酶和碱性磷酸酶的酶（美国专利No.3.645，090），以及能检测荧光强度，波长漂移，或荧光极化变化的荧光标记物（美国专利No.3，940，475）。间接标记的可能情况包括一种成分的生物素化，随后结合到已偶合了上述标记基团之一的抗生物素蛋白上。

还有许多从游离配基中分离结合形式，或者是从游离测试化合物中分离结合形式的方法。可以将IL-13固定于各种基质上，随后洗涤。合适的基质包括如ELISA平板的塑料板，滤膜和珠。将受体固定到基质上的方法包括（没有限制）使用一种捕获抗体，化学偶合剂以及生物素抗生物素蛋白而直接吸附到塑料板上。

该处理过程的最后步骤包括通过几种方法中的任何一种沉淀抗体/抗原复合物，这些方法包括那些利用如象聚乙二醇的有机溶剂或象硫酸铵的盐的方法。其他合适的分离技术包括（没有限制）在Rattle  et  al.，Clin.Chem.30∶1457（1984）中描述的荧光素抗体磁性化颗粒法，以及在美国专利NO.4，659，678中描述的双抗体磁性颗粒分离法。

已在文献中广泛地报道了将蛋白质或片段连接到各种标记物上的方法，不需要在这里详细讨论。许多技术包括了使用或者借助于使用碳化二亚胺或活性酯以形成肽键，通过将巯基基团与一种活化的卤素如氯乙基反应形成硫醚的活化羧基，或者是借助用于连接的一种活化烯烃如马来酰亚胺等等。在这些用途中也可以使用融合蛋白。

本发明的另一诊断方面包括使用从IL-13序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列。也可以用这些序列作为探针以检测怀疑有增殖细胞病状如癌的患者中IL-13的含量。在该文献中已经详细地描述和讨论了RNA和DNA核苷酸序列的制备，该序列的标记，以及该序列的优选大小。

正常情况下，一个寡聚核苷酸探针应至少有14个核苷酸，通常至少有约18个核苷酸，并且多核苷酸探针高至几千个碱基。可以使用各种标记物，最常用的是放射性核素，尤其是³²P。但是，也可以用其他技术，如使用生物素修饰的核苷酸以导入到多核苷酸中。然后将生物素作为结合抗生物素蛋白或抗体的位点，该生物素可以用各种标记物，如放射性核素，荧光剂，酶等进行标记。

另外，可以使用能识别特异性双联体，包括DNA双联体，RNA双联体，DNA-RNA杂交双联体，或DNA-蛋白质双联体的抗体。依次可以标记这些抗体，并且通过将双联体结合到一个表面上，从而根据该表面上形成的二联体而检测结合到双联体上的抗体的存在来完成检测过程。在任何常规方法如核酸杂交，加和减筛选法，重组探测，杂交释放翻译（HRT），以及杂交扣留翻译（HART）中可以利用探针探测到新的反意义RNA。这一过程也可包括如聚合酶链反应（PCR）的扩增技术。

还注意到利用诊断药盒也可以定量或定性地检测其他标志物的存在。诊断或预报可以依据用作标志物的多种指示的结合进行。因此，药盒可以检测结合标志物（例如参见，Viallet  et  al.，Progress  in  Growth  Factor  Res.1∶89（1989））。

Ⅷ.治疗用途

本发明提供了具有显著治疗价值的试剂。IL-13（天然存在或重组体），其片段，以及针对其的抗体，与被识别为具有白细胞介素或其受体或抗体结合亲和性的化合物一起可用于治疗显示有不正常表达白细胞介素的病状。典型情况下，由于免疫紊乱而加强了这种不正常性。另外，本发明应对与不正常的表达或不正常地引发对白细胞介素的应答相关的任何疾病或紊乱具有治疗价值。

可以纯化到重组IL-13或IL-13抗体，然后给予患者。这些试剂与例如在常规的药用可接受载体或稀释剂中的其他活性成分，与生理学上无毒的稳定剂和赋形剂一起组合用于治疗中。可将这些组合物过滤灭菌，并且通过冻干以剂量形式置于剂量小瓶中或以剂量形式贮存于稳定的水制剂中。本发明还考虑使用抗体或其不会互补结合的结合片段。

用IL-13或其片段完成筛选抗体以鉴别与白细胞介素具有结合亲和性的分子。然后使用随后的生物学分析法来测定是否一种受体能产生竞争性结合，这种结合能阻碍内在的刺激活性。可以使用受体片段作为阻滞剂或拮抗剂，在上述检测中它可以阻碍IL-13的活性。同样，具有内在刺激活性的化合物可以激活受体，从而在上述检测分析中它成为一种刺激IL-13活性的激动剂。本发明进一步考虑，IL-13抗体作为拮抗剂的治疗学用途。

进行有效的治疗必需的试剂的量将取决于许多不同因素，包括给药方式，靶位点，患者的生理学状态，以及所使用的其他药物。因此，应该滴定治疗剂量而使尽可能地安全和有效。典型的情况是，体外使用的剂量可以作为将这些试剂原位供药时使用量的有用的参考。治疗特定紊乱的动物试验有效剂量可以进一步预先指示人的剂量。各种建议描述于，例如，Gilman  et  al.（eds），The  Pharmacological  Bases  of  Therapeutics，8th  Ed.，1990，Pergamon  Press;和Remington′s  Pharmaceutical  Sciences，17th  ed.1990，Mack  Publishing  Co.，Easton，Penn。

本文下文中讨论了例如，口服，静脉内，腹膜内或肌肉给药，透皮扩散，和其他形式的给药方法。药用可接受的载体包括水，盐水，缓冲液，以及在例如，Merck  Index（Merck  ＆  Co.，Rahway，New  Jersey）中描述的其他化合物。

由于在IL-13和其受体间有同样高的亲和结合力，因而一开始就期望低剂量的这些试剂应该是有效的。因此，通常期望剂量范围低于1mM浓度的量，典型情况是低于约10μM浓度，通常低于约100nM，优选的是低于约10pM（皮摩尔），更优选的是低于约1fM（毫微微摩尔），并含有合适载体。经常使用缓释制剂或缓释装置以持续供药。

可以将IL-13或其片段，抗体或其片段，拮抗剂和激动剂直接给药于需要治疗的宿主或依据化合物的大小而使用，在将它们给药前与如卵蛋白或血清白蛋白的载体蛋白结合也是合乎要求的。可将治疗制剂以任何常规剂量制剂形式给药。

如果活性成可以单独给药，则优选的是以药用制剂形式给药。这些制剂包括至少一种如上文中定义的活性成分和一种或多种其可接受载体。每一种载体必须是与其他成分相容意义上的药用和生理学上可接受的，并且不会损坏患者。这些制剂包括那些适应于口腔、肛门、鼻腔或肠胃外（包括皮下，肌内，静脉和皮内）给药的制剂。

这些制剂通常以单位剂量形式存在并且可用药剂学领域内熟知的任何方法制备。本发明的治疗法可与其他的免疫治疗或免疫预防剂结合或联合使用。

实施例

参照下面实施例能最好地理解本发明的主要范围，这些实施例并不以任何方式限制本发明。除非有特别限定，否则下文中给出的固体混合物中固体物质的百分数，液体混合物中液体的白分数，液体混合物中固体的百分数分别以Wt/Wt，Vol/Vol以及Wt/Vol来表示。除非有其他定义，所有在本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属的领域内任一普通技术人员共同理解的含义相同。

应用于IL-4和IL-10的许多技术都可应用于IL-13，如在美国专利No.5，017，691（IL-4）和美国申请号07/453，951（IL-10）中描述的。

Ⅰ.编码人IL-13的cDNA克隆的分离

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及随后进行洗脱和乙醇沉淀方法可以分离源于Pst/PvuⅡ限制性消化的小鼠P600 cDNA克隆的一个约400bp DNA片段。通过在[³²P]dCTP存在下随机引发方法可以放射性标记该含有小鼠P600 cDNA的大部分编码区的片段。

使用经典的方法可以从各有大约5000个B21  cDNA文库的菌落的十个琼脂平板中制备filter  lifts。该文库可从命名为B21的克隆化人T细胞中制备，在分离RNA前，它已用抗-CD3刺激该细胞7小时。该文库的构建方法描述于美国申请号07/453，951中。

用在20%甲酰胺，6×SSPE，0.1%SDS，5×Denhardt溶液，和100μg/ml  tRNA中的已标记的小鼠P600片段，在42℃下与滤膜杂交过夜。将滤膜用2×SSPE，0.1%  SDS在室温下洗涤三次每次20分钟，用1×SSPE，0.1%  SDS在55℃下洗涤两次，洗1小时，然后在胶片上曝光过夜。鉴别八个阳性克隆并挑取这些克隆以进一步纯化。在再次筛选后有七个克隆是阳性的。六个克隆有1.35kb的Bam  H1插入片段，而其中一个有仅0.6kb的插入片段。将命名为pB21.2Bf克隆的1.35kb插入片段的亚克隆至M13中，并且采用双脱氧法测序。顺序比较证明该1.16kb  cDNA编码一个人与小鼠P600的同源区。

与鼠P600  cDNA相比，从B21文库分离的hu  IL-13  cDNA不是全长度的。从B21文库中分离全长cDNA的重复试验没有成功。因此，用pB21.2Bf插入片段筛选不同的文库以得到全长克隆。从人cDNA的5′末端的50bp开始至终止密码子结束的区域得到一个PCR探针。

从一个A10T细胞系克隆制备cDNA文库。使用如上文中描述的相同杂交条件。将滤膜于室温下在1×SSPE，0.05%SDS中洗涤15分钟，然后在55℃洗涤二次，洗30分钟至1小时。将它们曝光于胶片过夜。检测几个阳性菌落并且再次筛选。从这些阳性菌落的几个cDNA插入片段的5′末端获得的双股序列显示是全长的。将命名为pA  10.66的克隆获得的一个1.3kb  cDNA插入片段亚克隆到M13中并且测序。其顺序显示于表1中。全长克隆的序列与较短克隆的序列有一个密码子不同，该密码子存在于全长克隆中，见表3。

Ⅱ.小鼠P600和人IL-13蛋白质的表达和纯化

含有编码人IL-13的1.16kb  cDNA的pB21.2Bf克隆缺失了起始的23个N-末端氨基酸。为了连接到一个表达载体pGEX-2T上，使用PCR制备该插入片段以提供在5′Bam  H1和3′EcoR  I末端的特定的限制性位点。设计用该pGEX-2T载体制备融合蛋白，其中用一个很容易切割的蛋白酶位点分离开不同的蛋白质片段。将凝胶纯化的DNA连接到表达载体pGEX-2T上，从而当在大肠杆菌中表达该质粒时。由DNA插入片段编码的蛋白质产生与谷胱甘肽-硫-转移酶的融合蛋白，在两蛋白之间有一个凝血酶切割位点，如在Gene67∶31（1988）中由Smith等人详细描述了该过程。将得到的质粒转移至大肠杆菌中。并在IPTG存在下培养转化成功的转化体。当在诱导条件下生长时，该构建体的表达产物积累于包含体中。

小鼠P600的重新折叠和纯化

在培养基中于37℃下培养转化的大肠杆菌细胞，并在0.5OD值时用IPTG诱导。通过振荡培养瓶或发酵将经诱导的细胞生长至达到最大OD值。通过在4℃以4000xg离心30分钟而收集细胞，并于-10℃下冰冻。

将细胞于室温下重新悬浮于TE缓冲液（50mM  Tris-HCl，10mM  EDTA  pH8，加1mM  Peflobloc，一种蛋白酶抑制剂）。以18，000pSi将细胞通过一个微流体化仪，收集细胞，并在4℃下以10，000xg离心30分钟。将细胞丸团在TE缓冲液中重复洗涤并离心直至上清液澄清。用6M胍-HCl，10mM  DTT，50mM  Tris-HCl  pH9，以及1mM  Peflobloc溶解丸团，并在4℃下混合2小时。

利用Bradford蛋白质方法测定蛋白质浓度，通常总蛋白浓度约为2.5mg/ml。在几个小时的时期内，将该混合物在50mM  Tris-HCl，150mM  NaCl，2mM还原态谷胱甘肽，1mM氧化态谷胱甘肽，0.5M胍-HCl，以及10mM  EDTA  pH9.0中稀释至100倍的未折叠体积。将溶液在4℃下混合24小时，使分子的二硫键重新折叠。

通过在4℃下以4000xg离心30分钟或通过用0.45μm滤膜过滤而去除沉淀。用Pellicon浓缩上清液，于4℃下在50mM Tris-HCl，150mM NaCl，2.5mM CaCl₂PH7.5的缓冲液中渗透过滤。通过以10ng/50μg的融合蛋白加入人凝血酶而切除谷胱甘肽-S-转移酶融合对。将溶液在4℃混合18至48小时，以允许凝血酶切割融合蛋白。使用SDS-PAGE凝胶和TF-1生物测定对P600构象和活性进行定性。

在观察到凝血酶完全切割后，以25%的饱和程度将硫酸铵加到重新折叠材料中。用6N NaOH将已重新折叠的材料调至pH8.5，并且装载于丁基Toyo Pearl柱上，用25%硫酸铵，50mM Tris-HCl，0.05M NaCl缓冲液在pH8.5时平衡柱子。用平衡缓冲液洗涤柱子直至

280接近基线。用5柱床体积的50mM Tris pH8.5缓冲液洗脱该柱子。收集 280集合体，并在一个截止5000分子量的Amicon搅拌室中将其浓缩至体积小于S200凝胶过滤柱的3%的柱床体积。

用已脱热原的缓冲液50mM  NaPi，150mM  NaCl，以及0.01%Tween-20  pH6.0平衡S-200柱。将经浓缩的S集合体装载于凝胶过滤柱上，并收集馏分，通过SDS-PAGE凝胶验证P600蛋白质的含量。根据SDS-PAGE收集馏分浓缩，通过0.22μM滤膜过滤，并通过TF-1生物测定法检测生物活性。通过银染色测定蛋白质浓度并用Molecular  Dynamic凝胶扫描仪扫描。

用Whittaker鲎比色检测法测定内毒素，并且典型情况下通过染色后，产生大于95%纯度的小于10eu/ml的典型制剂，这时具有约1×10⁵单位/ml的生物活性。在重新折叠步骤中可发生有效的变化，例如，蛋白质浓度可在某个范围内变化，通常有5倍不同时也有效。谷胱甘肽的浓度也可以变化，并且可滴定缓慢稀释以及过夜培养的时间期间。如果合适可测定描述的每一个重新折叠参数。

同样的步骤可用于制备和纯化人IL-13。

Ⅲ.对B细胞的活性

A.辅助因子/因子增殖;细胞的生存性

具有作为细胞生存性刺激剂/辅助刺激剂功能的小鼠P600，如，从大肠杆菌制备的小鼠P600能刺激或辅助刺激体内激活小鼠大B细胞的增殖。采用³H-胸腺嘧啶掺入法测得，减少供给细胞的P600的量可以降低细胞的生长。

为了构建编码CD40的细胞外区域（命名为可溶性CD40）的cDNA，在Applied  Biosystems  380A  DNA合成仪上合成含有XhoⅠ位点的下列PCR引物：

有意：5′-ACAGCTCGAGCCATG-GTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3′和

反意：5′-GTAGCTCGAGCTCACCGGGACTTTAAACCACAGATG-3′。

用这些引物生产编码从小鼠CD40的起始密码子开始的191个氨基酸的PCR片段。用XhoⅠ消化PCR片段，并连接到XhoⅠ切割的哺乳动物/细菌表达载体（pME  18S）上。采用双脱氧测序法测定插入片段的顺序以证实该序列。

采用标准的电击穿操作（如参见Ausubel等人（1987和定期增刊）），将携带可溶性CD40 cDNA的质粒转染到COS-7细胞中。简单地讲，在室温下用50μl的20μg质粒将以10⁷个细胞/ml浓度在无血清的杜伯科氏基本必需（DME）培养基中的0.75ml的COS-7细胞悬浮液培养10分钟，并用Bio-Rad基因脉冲仪（960F，220V）将其进行电击穿。电击穿后10分钟，将COS-7细胞在4个10cm培养皿中培养3天。为了纯化可溶性CD40，电击穿后一天将培养基改为使用补充了HB101（HANA  Biologics，Alameda，CA）的无酚红RPMI640。

利用标准步骤在阴离子交换柱上进行离子交换色谱层析来纯化可溶性CD40。用线性NaCl梯度液从该柱上洗脱蛋白质，并用由标准方法制备的抗CD40肽的免抗血清通过Western印迹分析法来分析蛋白质洗脱液。

从Harlan  Sprague-Dawley（Indianapolis，IN）获得8周龄的雌性Lewis大鼠。用溶于完全佛氏佐剂中的10μg可溶性CD40腹腔内免疫接种这些大鼠，再用溶于不完全佛氏佐剂中的10，10，10和50μg的可溶性CD40分别在3，4.5，6和8.5周时加强接种。在12周时用盐水进行最后一次加强接种注射。采用ELISA法评价血样中抗CD40抗体的含量。

按照Hodgkin等人（Hodgkin et al.，Cell.Immunol.134∶14（1991））描述的方法从未受刺激的小鼠脾中制得密集的小型B细胞。将脾表面拉成绒状置于含5%胎牛血清（FCS;J.R.Scientific，Woodland，CA），5×10^-5M 2-巯基乙醇（Polysciences，Inc.Warrington，PA），2mM谷氨酰胺（J.R.Scientific），和25mMHEPES缓冲液（Irvine Scientific Santa Ana，CA），100U/ml青霉素，以及100μg/ml链霉素（Irvine）的完全RPMI（cRPMI）中。用0.83%氯化铵，pH7.4溶解血红细胞。

用抗小鼠Thy  1.2mAb（New  England  Nuclear，Boston，MA）和抗L3T4抗体（RL  172.4杂交瘤，由Dr.H.R.MacDonald，Ludwig  Institute，Epalinges，Switzerland赠送）在冰上两个连续处理20分钟，然后在37℃下用补体（1∶10稀释的兔低毒补体，Cedarlane  Laboratory，Ontario，Canada）处理30分钟来去除T细胞。然后用由75%，65%和50%percoll（Pharmacia  Fine  Chemicals，Uppsala，Sweden）组成的不连续的梯度在4℃以2500xg密度梯度离心25分钟来分离密集的小型B细胞。

将从65%与75%Percoll之间的界面上收集的细胞用于进行随后的试验。从65%与50%界面处收集体内激活的大B细胞。将B细胞以不同的细胞密度在平底96孔组织培养平板（3072，Falcon Labware）中，按说明添加了其他刺激剂的cRPMI中进行培养。通过在培养起始后48小时添加的³H-胸苷（Amersham）的4小时脉冲而评价增殖作用。

B.维持B细胞的存活;选择性试剂

利用标准步骤制备抗相应抗原的抗CD40 mAb 89和抗CD23mAb25（参见Valle et al.，Eur.J.Immunol.19∶1463（1989）;Bonnefoy et al.，J.Immunol.138∶2970（1987））。Peltz等人（Peltz et al.，J.Immunol.141∶1891（1988））描述了用CD_W32/FcγRⅡ转染LtK-细胞系（CD_W32L细胞）。从Biorad（Richmond，CA）购买偶合到珠子上的抗IgM抗体（抗M）。

用来源于Becton  Dickinson的结合了FITC的mAb（Mountain  View，CA）测定细胞表现型。中和抗IL-4单克隆抗体由Dr.Grassi友好赠送。130  KDa  IL-4受体的细胞外区域源于用含有一个被截短的IL-4  cDNA（由Garrone  et  al.，Eur.J.Immunol.21∶1365（1991）描述）的质粒转染的COS-7细胞。通过用一个IL-4-Affi-gel  10柱从转染细胞培养后的上清液中纯化出重组蛋白质。用IL-4受体的细胞外区域接种小鼠后产生抗130  KDa  IL-4受体抗体。培养是在改良的Iscove培养基中完成的。

B细胞的制备和细胞培养

按照Defrance等人（Defrance  et  al.，J.Immunol.139∶1135（1987））描述的方法从扁桃腺中分离B细胞。简而言之，用羊血红细胞完成一个玫瑰花结步骤后，在用包被了抗小鼠IgG的磁珠（Dynabeads，Dynal，Oslo，Norway）进行阴性选择之前进一步用抗CD2，抗CD3和抗CD14mAbs培养未形成玫瑰花结的细胞。已分离到的群体表达大于98%CD19或CD20（B细胞）和小于1%CD2（T细胞）或CD14（单核细胞）。

用抗原受体激活的B细胞进行检测分析

用不溶的抗IgM（5μg/ml）刺激调至5×10⁵个细胞/ml的B淋巴细胞72小时。通常在第3和6天用1μCi（³H）TdR脉冲16小时。利用标准的液体闪烁计数技术测定[³H]-TdR的摄入量。

CD40系统

为了进行增殖分析，在2.5×10³个经辐射（7000拉德）的CD_W32L细胞和0.5μg/ml的抗CD40mAb89存在下终体积为200μl中培养2.5×10⁴个纯化B细胞。为了制备Ig，以2.5×10⁵个细胞/ml检测B细胞。在10天后收集上清液并通过ELISA测定Ig的含量。

sIgD⁺和sIgD^-B细胞群的分离

根据由Miltenyi等人（Miltenyi et al.，Cytometry 11∶231（1990））详细描述的试验步骤，用制备性磁性细胞分离系统（MACS，Becton-Dickinson）分离纯化的B淋巴细胞。Defrance等人（Defrance et al.，J.Exptl Med.175∶671（1992））较早地描述了基于sIgD表达的分离。当小于1%的sIgD-B细胞亚群表达dIgD时，用FAC Scan进行的荧光分析估测，对于sIgD⁺B细胞亚群，挑选出的细胞群的纯度大于99%。

细胞激活素

分别以10U/ml，50U/ml和100ng/ml使用纯化的重组hIL-2（Amgen，Thousand Oaks，CA，3×10⁶U/ml），重组hIL-4（Schering-Plough Research Institute，Bloomfield，NJ，1×10⁷U/mg），重组hIL-10（Schering-Plough Research Institute，Bloomfield，NJ，1×10⁷U/ml）。用pGEX-2T载体（Pharmacia，Uppsala，Sweden）将IL-13表达为谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白形式。

用聚合酶链反应（PCR）制备编码hIL-13的24-109残基的DNA片段，并将其克隆到该载体的Bam  HI/EcoR  I位点上。还制备并克隆了编码mIL-13的19-109残基的DNA片段。在大肠杆菌中以不溶性的聚合体形式表达人和鼠的IL-13融合蛋白，通过离心提取，溶解，并将其完成一个复原步骤（参见Van  Kimmenade  et  al.，Eur.J.Biochem.173∶109（1988））。

用凝血酶从融合配体上切下重新折叠的IL-13，通过阳离子交换（S-Sepharose  FPLC，Pharmacia）和凝胶过滤（Sephacryl  S-200FPLC，Parmacia）色谱而纯化。用标准蛋白质（Bio-Rad）对凝胶过滤柱进行校准。通过SDS-PAGE，银染色（ISS），以及具有中和鸡蛋溶菌酶（Sigma，St.Louis，MO）能力的扫描显象测密术（Molecular  Dynamics）测定蛋白质的量。内毒素的含量（采用鲎变形细胞溶解物检测法（Limulus  ameobocyte  lysate  assay）（Whittaker  Bioproducts，Inc.）测得）通常为小于leu/ml。

IL-13增加借助其抗原受体而激活的B细胞的DNA合成

通过重组细胞激活素如IL-2，IL-4和IL-10可以增加由抗IgM抗体借助其抗原受体激活的高度纯化的人B淋巴细胞的DNA合成。重组鼠IL-13也能以剂量依赖性方式增加在不溶性抗IgM抗体存在下培养到第3天的人扁桃腺B淋巴细胞的DNA的合成。鼠（或人）IL-13的浓度为10-25ng/ml时获得最大的刺激作用。

IL-13的刺激作用低于IL-2或IL-4的刺激作用但相当于IL-10的刺激作用。与IL-4相似，但与IL-2不同，IL-13对抗IgM激活的B细胞的辅助刺激作用能在培养3天后观察到，并且在6天后降得实际上不能检测到。

IL-13起CD40抗原刺激的B细胞的生长因子的作用

还分析了IL-13增强抗CD40激活的B细胞的增殖作用，并将其结果与IL-4和IL-10的结果相比较。于是，在有或没有IL-13浓度增高的情况下，在L细胞表达CD_W32期间内将2.5×10⁴纯化的扁桃体B淋巴细胞与0.5μg/ml的抗CD40抗体Mab89一起培养。在第6天时检测掺入的[³H]-TdR。鼠和人IL-13都能强烈地增加抗CD40诱导的DNA合成。当IL-13的浓度在3和30ng/ml之间时刺激程度达到最大值。其后达到稳定时期，因而证明没有任何抑制作用（即使在1000mg/ml）。在这些培养条件下，在三个相互独立的试验中当IL-13浓度为0.03和0.3ng/ml之间时能够观察到刺激程度为最大值的一半。

然后将IL-13的生长刺激作用与IL-4和IL-10的进行比较。当在培养的前6天检测时，IL-13的活性与IL-4和IL-10的活性是类似的。在培养第9天时IL-13的刺激活性特别强烈，超过了IL-10的作用，比IL-4更有显著增加。IL-13在第12天时还显示有刺激作用，并且又比IL-4或IL-10更有效。在IL-13存在下生长的培养物形成非常紧密的细胞簇。要分裂开细胞簇是十分困难的并因此在细胞培养期间对活的淋巴细胞计数，其结果是十分不精确的。因此，每到第五天将细胞培养物剪开直至25天，同时，活的B淋巴细胞的量增加约12倍（保守估测结果）。

研究IL-13是否能与IL-4或IL-10的最大程度地增殖B细胞的作用相一致。最适浓度的IL-4和递增浓度的IL-13相结合后产生的DNA合成作用与IL-4相类似，因此，说明这两个细胞激活素之间缺乏协同作用甚至也设有加和作用。相反，将IL-13和IL-10结合后产生它们的刺激作用加和性。在整个测试时间内都可观察到IL-13和IL-10对B细胞增殖的加和效果。总而言之，这些结果表明IL-13是人B淋巴细胞的一种生长因子。

IL-13诱导抗CD40激活的B细胞分泌IgE

考虑到IL-13对抗CD40激活的B细胞增殖的巨大作用，分析培养物上清液中免疫球蛋白的含量。与IL-4相类似，但与IL-10不同，在培养8天的抗CD40激活的B细胞培养物中IL-13不刺激IgM，IgG和IgA的产生。但是，IL-13能以剂量依赖性模式诱导B细胞分泌IgE（表4）。在诱导IgE能力方面，IL-13与IL-4相类似。与单独用IL-4获得的结果相比，将IL-4和IL-13组合后获得相类似的IgE产量或略有提高。IL-13不能诱导对休眠B细胞或抗μ激活的B细胞分泌IgE。

表4：IL-13诱导抗CD40激活的B细胞分泌IgE

细胞激活素 IgG(μg/ml) IgA(μg/ml) IgM(μg/ml) IgE(ng/ml)

无  1.2±0.09  0.4±0.04  0.08±0.005  <bg

IL-4  1.4±0.01  0.4±0.005  0.2±0.005  37±1.1

IL-10  15.0±1.9  12.0±2  18.0±0.6  <bg

IL-13  1.6±0.4  0.4±0.001  0.2±0.04  25.2±3.3

在有或没有50U/ml IL-4，100ng/ml IL-10，30ng/ml hIL-13存在下，用2.5×10³个经照射并带有抗CD40 mAb89的CD_W32 L细胞将5×10⁴个纯化的B细胞培养10天。Ig含量表示在三个典型实验中四次重复测定的平均值±SD值（<bg＝小于150pg/ml的IgE）。

IL-13比IL-4能更有针对性地击中B细胞亚群

为了进一步比较IL-4和IL-13的作用，在培养6天后检测在带有任一种细胞激活素的CD40系统中培养的B细胞的表现型。IL-13能诱导在经培养的B细胞上表达CD23，其强度与IL-4相当。但是，如果IL-4诱导大于90%的经培养的B细胞表达CD23，则IL-13仅诱导在40%的B细胞群表达CD23。另外，如果IL-4能容易地在诱导休眠的及抗-M激活的B细胞上表达CD23，则在这些条件下IL-13的效果更低。

还分析了在有或没有IL-4或IL-13的CD40系统中培养6天的B细胞上铁传递蛋白受体的表达。所有B细胞表达铁传递蛋白受体（TfR），但是根据表达水平能明显地区分这两群细胞，分别命名为低TfR和高TfR。在单独CD40系统中，80%的B细胞是低TfR，5%为高TfR。在用IL-13生长的培养物中。55%的细胞是低TfR，而40%为高TfR。在用IL-4生长的培养物中，10%的细胞是低TfR，85%是高TfR。

sIgD⁺B细胞由幼嫩B细胞组成，而sIgD^-B细胞由胚体中央B细胞和记忆B细胞的混和物组成，在CD40系统中测试IL-4，IL-10和IL-13与sIgD⁺和sIgD^-B细胞的反应性。根据在培养6天后[³H]TdR掺入的测量，sIgD⁺和sIgD^-B细胞都大大地增强了对IL-4和IL-40的应答。相反，IL-13优先地增加抗CD40诱导的sIgD⁺细胞的DNA合成。而且，IL-13和IL-4能诱导sIgD⁺和sIgD^-细胞都分泌IgE。

总之，这些结果表明IL-13优选地作用于sIgD⁺细胞，因此其对B细胞亚群的作用在大小上比IL-4的刺激作用更有限。

IL-13生物作用不依赖于IL-4

由于IL-13显示出具有许多IL-4的生物作用，因而怀疑IL-13可能通过对IL-4分泌的诱导作用或经结合到IL-4受体上而起作用。为了解决这个问题，在下列三种不同IL-4拮抗剂存在下来检测IL-13诱导的B细胞增殖作用：（1）一种中性抗IL-4单克隆抗体;（2）130  KDa  IL-4R的可溶性细胞外区[参见Garrone  et  al.，Eur.J.Immunol.21∶1365（1991）];以及（3）一种阻滞抗130KDa  IL-4R的单克隆抗体。这三种拮抗剂阻滞IL-4在抗CD40激活的B淋巴细胞的增殖作用上的80-90%的作用，而不影响由IL-13诱导的增殖作用。这些IL-4拮抗剂也不阻碍IL-13诱导CD23的表达和IgE的产生，而他们却完全阻滞了IL-4的诱导作用。

由IL-13或IL-4诱导的B细胞增殖以及Cos细胞表达人或小鼠CD40-L

将用人或小鼠CD40-L或作为对照的空白pJFE-14载体转染的并经辐射（7，000拉德）的1.6×10⁴COS细胞与5×10⁴高度纯化（>98%CD20+）阴性分类（negativelysorted）的脾脏B细胞共培养。以400U/ml加入IL-13或IL-4。可溶性抗CD40mAB89和对照mAbA4以50μg/ml使用。在培养的最后16小时内加入[³H]-胸苷后，培养3天并收集培养物。用任一种IL-4，含有小鼠或人IL-13的COS上清液，或该上清液和IL-4或IL-13组合物来刺激B细胞。

已经描述了IL-13对人B细胞生长和分化的生物效应。用抗IgM抗体共刺激IL-13以诱导DNA合成，但其作用比IL-2或IL-4的作用明显低。如其他细胞激活素一样，IL-13不能大大地诱导通过其抗原受体而激活的B细胞的增殖。但是，IL-13显示出对在CD40系统中培养的B细胞的强烈生长促进作用，CD40系统由表达人Fc受体CD_W32的成纤维细胞和针对CD40的单克隆抗体组成。在这些条件下，IL-13至少有与IL-4相同的活性，其对B细胞的作用是长期持久的，因此允许活的B细胞增殖。由于IL-13诱导B细胞表达CD23，因而其改变了激活B细胞的表现型。

由于还可以诱导休眠的B细胞以及抗-IgM激活的B细胞表达应答IL-13的CD23，因而抗CD40活化并不介导IL-13依赖性诱导在CD40激活的B细胞表达CD23。但是用IL-13获得的表达CD23的细胞比例低于用IL-4获得的比例。同样，IL-4实际上诱导所有CD40激活的B细胞以表达高含量的铁传递蛋白受体。IL-13仅诱导半数细胞表达高密度的铁传递蛋白受体。这一结果表明IL-13作用于一个B细胞亚群上，其作用比IL-4的作用更局限。

因此，当根据表面IgD（SIgD）分离细胞时，（该SIgD可将幼嫩B细胞与胚体中央和记忆B细胞区分开），发现IL-13比IL-4对sIgD⁺B细胞的作用更有效。IL-4比IL-13能更好地加强sIgD^-B细胞的增殖。由不同的IL-13和IL-4受体表达可以解释针对IL-13和IL-4的不同的群体靶细胞，证明这一结果通过产生标记的IL-13或IL-13受体特异性抗体而获得。sIgD^-B细胞的较低应答尤其有趣，并且成为进一步分析的依据。如IL-4一样，IL-13少量地增加由在CD40系统中培养的B细胞合成IgG和IgM。但是，令人吃惊的是，IL-13诱导抗CD40激活的B细胞生产IgE。

应答IL-13产生的IgE的含量相当于应答IL-4产生的IgE的含量。IL-4，以及IL-13都能诱导抗CD40激活的B细胞合成IgE。由于同型之间开通，与IL-4相类似，IL-13能诱导sIgD⁺分泌IgE。如同IL-4一样，IL-13不能诱导休眠B细胞分泌IgE。首先，IL-13诱导IgE产生的结果与其他指示IL-4是IgE合成的唯一诱导剂的研究结果相反。但是，最近研究已经描述了导致IgE分泌的检测系统，其中IL-4完全被中性抗体阻滞。已有报道，IL-2能诱导由金黄色葡萄球菌活化的B细胞的分泌作用，而IL-4却是无效的。可能在这些研究中，这些效果应归因于IL-13的作用。

由于在B细胞上IL-13产生许多类似于IL-4的功能，本研究证明这些作用不依赖于对IL-4分泌的可能的诱导作用或130KDa  IL-4受体的使用，例如，中和抗IL-4抗体，阻滞可溶性IL-4受体，并且阻滞抗IL-4受体抗体不能影响IL-13对B细胞增殖和IgE分泌的作用。但是，这不能排除IL-13与IL-4共有某个共同的传导物。

通过交联研究已经证明IL-4与60-70和70-80  KDa成分相结合并不涉及130  KDa分子。在本文上下文中，值得注意的是人和鼠IL-3以相类似的效率作用于人B细胞上，而鼠IL-4是种特异性的。如果对其IL-4基因已被破坏的鼠（例如IL-4无效鼠）进行研究来测定IgE的循环水平时能够更特定地测定IL-13和IL-4各自对IgE产生的作用。

最后，弄清楚人IL-13是否仅由T细胞产生或是否其他细胞类型也能产生人IL-13是很重要的。而且，IL-13可能与不正常B细胞增殖有关，因为它出现于白血病和自体免疫疾病中。因此，IL-13的激动剂或拮抗剂可用于治疗上述症状。

C.修饰激活的人B细胞上的Ig表面标志

从得自尸体移植供体的正常人的脾脏中分离高度纯化的B细胞。脾细胞的获得是借助于一个消毒的金属筛孔，无菌挤压脾脏，并以等份试样冷冻以备后用。在用下列结合PE的mAb，即抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD14、抗CD16和抗CD56（Becton Dickinson）将脾细胞染色后，利用阴性FAC Star Plus Becton Dickinson分类得到高度纯化的B细胞（>98% CD20⁺）。

使用30ng/ml最终浓度的人IL-13。重组IL-4（所用浓度为400U/ml）由Schering  Research（Bloomfield，NJ）提供。

将5000个高度纯化的B细胞与等量来自克隆B21或spA3的T细胞在添加了10% FCS、10μg/ml超纯转铁因子（Pierce）和400U/ml重组IL-4的0.2ml终体积Yssel培养基中共同培养，并在用喂养细胞和PHA刺激5天后收获细胞。培养物置于8个具有U型底96孔板的复制平板中，并于37℃、5%CO₂的条件下培养14天。在培养末期，从8个孔的每一孔中收集上清液用于同种型测定。在某些培养物中，T细胞克隆用衍生于T细胞克隆的5μg质膜，或者用50μg/ml的抗CD40mAb89代替。

根据Gascan等人所述（Gascan  et  al.，Eur.J.Immunol  22∶1133，1992）的方法利用ELISA来测定上清液中的Ig成分。由CD4⁺T细胞克隆B21制备的质膜也按上文所述的方法进行。当在IL-4存在的情况下用膜物质刺激B细胞时，各种Ig同种型的产量一般是最高的，但IL-3常具有上述类似的作用。IgG4的产量尤其高，不过在用T细胞克隆刺激后IL-13似乎增强了IL-4对产生IgE的作用。

将高度纯化的sIgD⁺脾脏B细胞（5000细胞/孔）与用pJFE14载体转染的或用载体转染并表达人（h）或小鼠（m）CD40-L的被分类COS-7细胞（250个细胞/孔）一起培养。加入30ng/ml IL-13和400U/ml IL-4。用标准化的Ig标准物（Behring，Marburg，Germany）测定ELISA（IgE和IgM用0.2ng/ml，IgG4和总IgG用0.4ng/ml）的灵敏度。IgG和IgE两者的水平都被IL-13增高。

D.CD40配基的作用

从一个由激活的CD8⁺T细胞克隆构建的cDNA文库克隆人类CD40配基（hCD40-L），并检测代表2.1kb和1.2kb克隆的两段cDNA。两个cDNA克隆具有含261个氨基酸的相同开放读码且它们的区别仅在于其3′非翻译末端的长度不同，并可能代表利用Northern分析法在激活的CD4⁺T细胞克隆中检测到的2.1kb和1.2kb瞬间表达的mRNA种类。hCD4-L转录物也可在CD4⁺和CD8⁺T细胞受体（TCR）αβT细胞、TCRγδT细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、小肠和胎胸腺细胞中检测到，但不能够在纯化的B细胞、胎肝、胎骨髓、脑、肾或心脏中检测到。

当用经EB病毒（EBV）转化的B细胞和正常的B细胞的同型聚集的诱导作用进行判断时，用hCD40-L转染的COS-7细胞（COS-7/h  CD40-L）能诱导人B细胞的激活。此外，COS-7/hCD还诱导B细胞增殖，这种作用进一步由IL-4或IL-13增强。象IL-4一样，IL-13与小鼠和人的CD40协同诱导高度纯化的B细胞产生IgM、总IgG、IgG4和IgE，但不产生IgA。

抗IL-4的抗体抑制IL-4且COS-7/h CD40-L诱导B细胞产生Ig，但不影响IL-13和COS-7/h CD40-L诱导B细胞分化，这说明IL-13和hCD40-L诱导Ig产生，包括不依赖IL-4的IgE同种型开通（switching）。可溶性CD40阻断hCD40-L诱导B细胞分化，证明需要特异性指定CD40-L。总之，这些数据表明由人CD4⁺T辅助细胞表达的CD40-L和IL-13是T细胞和B细胞相互作用引起B细胞增殖、分化和IgE开通的重要成分。然而，hCD40-L的分布情况表明了该分子的更广泛的功能。

诱导B细胞增殖和分化成Ig产生细胞需要T细胞辅助。涉及TCR与B细胞上Ⅱ类MHC复合物肽结合的抗原特异性T细胞和B细胞的相互作用导致T细胞激活。激活的T细胞传递接触信号和细胞激活素介导的信号，包括B细胞的增殖和分化。一旦T细胞被激活，它们即可以抗原非依赖性Ⅱ类MHC非限制方式与任何B细胞发生相互作用。由激活的T辅助细胞产生的淋巴激活素不仅决定产生Ig的量，而且还指导同型开通。

IL-4是一种B细胞生长因子，该因子诱导B细胞开通生产IgG4和IgE，而TGF-β指导IgA的开通。P600的人cDNA同系物是由激活后的小鼠Th2克隆产生的一种蛋白质，它如本文所述最近已得以克隆和表达。人IL-13蛋白质诱导人单核细胞和B细胞生长与分化，并被命名为IL-13。人IL-13是一种含有132个氨基酸的非糖基化蛋白质，分子量（Mr）为10，000，它由T细胞产生。除了IL-4外，IL-13与其它的淋巴因子没有明显的同源性（约30%的同源性）。和IL-4一样，IL-13能不依赖于IL-4在人B细胞中特异性诱导IgG4和IgE的开通。

由激活的T辅助细胞传递的接触介导信号可用抗CD40mAb代替。接触T辅助细胞信号之一是由在激活的CD4⁺T细胞上表达的33KDa分子的CD40配基（CD40-L）传递的。CD40-L转染物诱导B细胞的增殖，并在IL-4的存在下诱导IgE的产生。本文描述了从一个由激活的CD8⁺T细胞克隆构建的cDNA文库中分离人CD40-L克隆的过程。评价了人CD40-L的分布、其激活B细胞的能力和其与IL-13作为共同激活分子（与IL-4相比较）分化B细胞的作用。用人CD40-L转染的细胞在IL-13的存在下表现出诱导B细胞聚集、增殖和生产大量的Ig，包括IgE合成的作用。

试剂

人rIL-4由Schering-Plough  Research（Bloomfield，NJ）提供，人rIL-13由W.Dang（DNAX  Research  Institute，Palo  Alto，CA）提供。将编码CD40的细胞外区域的cDNA片段与编码人IgG1的cDNA片段融合获得CD40-Ig融合蛋白。mAb89由Dr.J.Banchereau（Schering-Plough，Dardilly，France）友好提供。除非有其它说明，抗生物素蛋白链菌素-PE和所有的抗体均来自Becton-Diekinson（Mountain  View，CA）。

细胞的纯化和培养

利用Ficoll-Hypaque（Pharmacia Fine Chemicals，Pisca-taway，NJ）密度梯度离心，随后再通过利用FAC Star Plus（Becton Dickinson）的阴性细胞分类法从脾脏中纯化B淋巴细胞（>98% CD20+）。直接从阴性分类的B细胞群中将表面IgD⁺阳性细胞分类。CD4⁺T细胞克隆B21和CD8⁺T细胞克隆A10已由Roncarolo等人描述过（Roncarolo et al.，J.Exp.Med.167∶1523，1988）。在共同培养实验中，各种数量的纯化B细胞与不同浓度的COS-7细胞在0.2ml体积的U型底96孔板中培养。

10天后，补充一半的培养基，并在14天后收集上清液，用ELISA测定Ig。瞬间转染COS-7细胞。为了CD40-L染色，COS-7或B21细胞和溶于PBS中的1.4μg/ml生物素化的CD40-Ig及1%的FCS一起在冰上保温20分钟，用含1%FCS的PBS洗涤2次，并用抗生物素蛋白链菌素-PE的 1/5 稀释液染色，再冲洗2次。使用之前用FAC Star Plus（Becton Dickinson）将特异性表达CD40-L的细胞分类。

人和小鼠的CD40-L  cDNA

由Dr.N.Harada和Dr.R.Chang（DNAX Research Institute）以PCR产物形式提供的小鼠CD40-L DNA被亚克隆入哺乳动物表达载体pJFE14。利用小鼠CD40-L cDNA作探针筛选源于CD8⁺T细胞克隆A10的cDNA文库的集落印迹来克隆人CD40-L。为了制备文库，用10μg/ml的刀豆素A激活10⁸A10细胞，历时8小时，然后收集细胞并提取RNA。用mRNA纯化试剂盒（Pharmacia，Uppsala，Sweden）纯化mRNA。除了用pJFE14作为克隆载体这一改变外，基本上根据制造商的说明利用Super Script质粒系统（BRL，Grand Island，NY）合成和克隆cDNA。该文库含有10⁶的单个克隆。其平均插入段大小为1.4kb。

Northern分析和PCR分析

根据制造商的说明用RNA₂₀l B（CDNA：Biotech，Friendswood，TX）分离RNA。脑、心、肾和小肠的RNA是得自Clontech（Palo Alto，CA）。利用Super Script（BRL）和在GeneAmp PCR系统（Perkin-Elmer Cetus，Emeryville，CA）中进行的PCR反应合成cDNA，所说的PCR反应在94℃、55℃和72℃分别维持0.5分钟、0.5分钟和1分钟，共进行30次循环。用于检测CD40-L转录的引物是5′-ACA GCA TGA TCG AAA CAT ACA-3′，5′-TGG CTC ACT TGG CTT GGA TCA GTC-3′，而用于检测次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）转录的引物是5′-TAT GGA CAG GAC TGA ACG TCT TGC-3′，5′-GAG ACA AAC ATG ATT CAA ATC CCT GA-3′。

根据制造商的说明将PCR的反应产物通过1.2%琼脂糖的电泳，再经毛细吸印作用转移至Gene Screen尼龙膜上（NEN Rsearch Products，Boston，MA）。为了进行Northern分析，将RNA通过0.85%琼脂糖电泳并转移到BA-S硝基纤维素膜上（Schleicher and Schuell，Keone，NH）。将含有CD40-L编码区的pJFE14-CD40-L的1.3kb EcoRI-Xho I片段作为模板使用来制备用于Northern和Southern印迹的CD40-L³²P cDNA探针。

人CD40-L的克隆和特性

为了获得人CD40-L的克隆，用小鼠CD40-L cDNA作探针筛选由CD8⁺T细胞克隆A10衍生的cDNA文库（参见Armitage et al.，Nature 57∶80，1992）。

存在于文库中的阳性克隆为0.005%，并且主要以2.1kb长度的克隆为代表，但也检测到一个1.2kb的其它克隆。这两种cDNA含有261个氨基酸的相同开放读码，产生一个分子量为29254不变的蛋白质。2.1kb克隆和1.2kb克隆的区别仅在于其3′非翻译末端的长度，并且推测代表了由Northern分析法检到的两种大小的mRNA。本文所克隆的人CD40-L核苷酸顺序及其推测的氨基酸顺序与Hollenbaugh等人报道的一致（Hollenbaugh  et  al.，EMBO  J.11∶4313，1992;Spriggs  et  al.，J.Exp.Med.176∶1543，1992）。

利用与抗生物素蛋白链菌素-PE组合的生物素化人CD40-Fc融合蛋白，很容易检测出在用含有2.1kb人CD40-L  cDNA的表达质粒pJFE14瞬间转染的COS-7细胞上特异性表达的人CD40-L，但不能在用空白pJFE14载体DNA转染的对照细胞上检测到。人CD40-Fc试剂也与用含有小鼠CD40-L  cDNA的相同表达载体转染的COS-7细胞反应，这个结果与以前的研究相一致，表明人CD40与小鼠CD40-L的这种间交叉结合。

CD40-L诱导B细胞的同型聚集和B细胞的增殖

用抗CD40抗体激活的B细胞导致同型聚集。为了确定CD40-L是否也具有类似的作用，利用FACS来纯化表达CD40-L的COS-7细胞，并与纯化的B细胞或JY细胞（一种用EBV转化的B细胞系）一起培养。确实，观察到在与表达人或小鼠CD40-L的COS-7细胞一起培养后，JY细胞发生聚集，而在模拟转染的COS-7细胞中是无效的。与此相似，纯化的B细胞与表达人或小鼠CD40-L的细胞一起培养表现出明显的同型聚集，而与-未转染的COS-7细胞一起培养的B细胞仍维持分散状态。

与用显微镜观察到的B细胞激活现象一致，当将纯化的B细胞也与COS-7/人CD40-L或COS-7/小鼠CD40-L一起培养时，B细胞得以显著增殖（参见表5）。这种增殖作用在IL-4或IL-13的存在下被进一步加强。在上述培养条件下IL-4和IL-13的生长促进作用似乎是类似的。

表5  IL-13或IL-4和表达人或小鼠CD40-L的COS细胞对B细胞增殖的诱导作用

掺入的³H TdR（C.P.m.×10^-3）

B  0.1±0

B+IL-13  0.1±0

B+IL-4  0.2±0

B+IL-4+对照mAb  0.2±0

B+IL-4+抗CD40  21.2±4.1

COS人CD40-L  1.1±0.2

COS小鼠CD40-L  1.0±0.1

COS  1.4±0.2

B+COS人CD40-L  16.9±2.4

B+COS小鼠CD40-L  17.5±2.1

B+COS  1.2±0.2

B+IL-4  COS人CD40-L  30.7±3.8

B+IL-4  COS小鼠CD40-L  35.4±4.5

B+IL-4  COS  1.3±0.2

B+IL-13  COS人CD40-L  22.5±3.0

B+IL-13  COS小鼠CD40-L  33.8±2.8

B+IL-13  COS  1.2±0.4

5×10⁴高度纯化（>98%CD20⁺）阴性分类的脾脏B细胞与用人或小鼠CD40-L或作为对照的空白pJFE-14载体转染的1.6×10⁴放射性（7，000 rads）COS细胞一起培养。IL-13或IL-4以400U/ml加入。所用可溶性抗CD40mAb89和对照的mAb A4为50μg/ml。培养3天后收获培养物，其中在培养的最后16个小时时加入³H胸腺嘧啶。表中的数值表示三次培养物的均数和标准差。

IL-13诱导由COS-7/人CD40-L刺激B细胞产生Ig

在IL-4或IL-13的存在下表达人或小鼠CD40的COS-7细胞也诱导由高度纯化的天然表面IgD⁺人B细胞产生Ig（表6）。产生了相当水平的IgM、IgG、总IgG和IgE，但没有IgA。与先前的观察结果相比，无IgA产生表明了在上述培养条件下IL-4特异性地抑制了IgA的合成。由IL-13诱导所产生的Ig水平与由IL-4诱导的Ig水平在相同范围内。

在模拟转染的COS-7细胞存在的情况下无Ig产生。表达CD40-L的COS-7细胞对所有Ig同种型的诱导作用可以被CD40-Ig（10μg/ml）有效地阻止，这证明CD40-L的特异指定对于诱导B细胞增殖和Ig产生是必要的。不能检测到CD40-Ig对总IgG产生的抑制作用，因为CD40-Ig融合蛋白的Ig部分在IgG  ELISA中产生了强信号。

抗IL-4的mAb（10μg/ml）不阻断在COS-7/CD40-L存在下IL-3诱导包括IgG4和IgE在内的Ig产生，而这些mAb强烈地阻断在COS-7/CD40-L存在下IL-4诱导Ig产生（表6）。这些结果表明IL-13诱导Ig产生不依赖于IL-14。它们还表明IL-13是另一种淋巴激活素，该激活素在由表达小鼠或人CD40-L的COS-7细胞传递的接触介导共同刺激信号存在下指导天然表面IgG⁺人B细胞开通为产生IgG4和IgE的细胞。

表6IL-13或IL-4和表达CD40-L的COS细胞诱导Ig合成

IgM  IgG  IgG4  IgE

(ng/ml)

COShCD40-L  4±2  38±4  12±1  <0.2

COSmCD40-L  <0.2  6±0  3±0  <0.2

IL-4+COShCD40-L  87±8  195±21  148±30  80±4

IL-4+COShCD40-L+CD40-Ig 3±1 ND^*1.8±1.4 2.7±1

IL-4+COShCD40-L+anti-IL-4  8±3  28±7  5±3  4±2

IL-4+COSmCD40-L  64±6  208±5  177±42  68±7

IL-4+COSmCD40-L+CD40-Ig <0.2 ND^*<0.4 <0.2

IL-4+COS  0±0  4±0  1±0  <0.2

IL-13+COShCD40-L  51±1  151±9  127±9  54±7

IL-13+COSmCD40-L  31±3  100±2  55±0  37±6

IL-13+COS  3±3  5±0  1±1  <0.2

IL-13+COShCD40-L+antiIL-4  48±8  167±12  111±7  48±4

-  <0.2  8±1  2±0  <0.2

IL-13  <0.2  7±0  1±1  <0.2

IL-4  <0.2  4±1  2±0  <0.2

高度纯化的sIgD⁺脾脏B细胞（5，000个细胞/孔）与用pJFE14载体转染的或用载体转染并表达人（h）或小鼠（m）CD40-L的分类COS-7细胞（250个细胞/孔）一起培养。按前文所述加入IL-13（30ng/ml）和IL-4（400U/ml）。用标准化的Ig标准物（Behring，Marburg，Germany）测定ELISA（IgE和IgM为0.2ng/ml，IgG4和总IgG为0.4ng/ml）的灵敏度。

^＊当检测到所加入的CD40-Ig融合蛋白的Ig部分时，有可能不能测定IgG。

人CD40-L（hCD40-L）的表达和分布

当通过PE标记的抗生物素蛋白链菌素与结合至T细胞上的生物素化CD40-Ig进行结合来判断时，休眠的CD4⁺T细胞克隆不表达或仅表达低水平的CD40-L。然而，在用PHA激活4小时之后在CD4⁺T细胞克隆B21上观察到CD40-L的显著表达。与CD40-L存在于B21细胞表面相一致，利用Northern分析和PCR检测到了hCD40-LmRNA。在休眠的B21细胞中表达低水平的hCD40-L mRNA。动力学研究表明，不管T细胞激活的方式如何，在激活2小时内2.1kb和1.2kb的两种mRAN都已经以最高的水平表达。

4小时后表达稍微有点隆低。激活7小时后观察到CD40-L mRNA的表达有相当程度的降低，但在激活48小时后仍可见明显的CD40-LmRNA水平。尽管以乎用Ca²⁺离子载体+PMA进行激活稍稍更为有效，但用Ca²⁺离子载体+PMA、ConA、抗CD3mAb+PMA或PHA+PMA激活B21细胞不产生巨大的数量差别，或者说在hCD40-LmRNA表达的动力学方面不产生差别。借助利用与人CD40-L基团编码区互补的引物，通过PCR来分析hCD40-L的分布情况。CD40-L转录不存在于B细胞、脑、肾脏、心脏、胎肝或胎骨髓中，但在CD4⁺T细胞克隆、CD8⁺T细胞克隆、一种TCRγδT细胞克隆、纯化的自然杀伤细胞、单核细胞、胎胸腺和小肠中能够很容易地检测出。CD40-L在小肠中的表达可以反映通过渗入MNC产生IL-13。

克隆和表达在COS-7细胞中的人CD40-LcDNA在诱导人B细胞激活方面是非常有效的。与用抗CD40mAbs观察相似，COS-7/hCD40-L诱导经EVB转化的B细胞和正常的B细胞同型聚集以及B细胞增殖。此外，在IL-4或IL-13存在时观察到B细胞分化分泌Ig的浆细胞。从CD8⁺T细胞cDNA文库中分离2.1kb hCD40-L cDNA且看似一个全长的克隆，经顺序比较分析，它与早先描述的1.8kbcDNA的顺序相同。另外一个1.2kb cDNA克隆可能代表在激活的T细胞中检测到的第二种大小的mRNA，并且显然是编码相同的蛋白质。

hCD40-L与相应的小鼠基因具有80%的同源性。令人感兴趣的是，hCD40-L与TNF-α和TNF-β也具有某种程度的同源性。小鼠CD40-L中的四个半胱氨酸残基的位置和潜在的细胞外N键糖基化作用位点在人CD40-L中是保守的，然而人的蛋白质在194位上有一个额外的取代的半胱氨酸。据报道CD40-L是一种Ⅱ型膜固定蛋白质，并具有一个人的蛋白的疏水区（氨基酸22-45），代表位于氨基末端附近的一个潜在的值号/固定区。IL-4或IL-13能够加强COS-7/CD40-L诱导B细胞增殖的作用。IL-4和IL-13看似具有相同的效果，这表明和IL-4一样，IL-13具有促进B细胞生长活性。象IL-4一样，IL-13也能在已由COS-7/hCD40-L共同（cO-stimulated）刺激的天然表面IgD⁺B细胞的培养中诱导产生Ig。

在上述培养条件下产生了相当水平的IgM、IgG4、总IgG和IgE。由IL-4和IL-13与hCD40-L一起诱导产生Ig的种类与在IL-4和抗CD40mAb存在下所得的种类相类似。因此，IL-13和IL-4在诱导B细胞增殖和Ig产生两方面显然具有相同的效力。而且，这些结果说明hCD40-L给IL-4或IL-13诱导B细胞增殖提供了一个共同的刺激信号，从而证明了CD40在B细胞激活和分化中的重要作用。因为这些实验是用天然sIg D⁺进行的，所以这些结果证实了IL-13是除IL-4之外的另一种由CD4⁺T细胞衍生的淋巴激活素，它能指导B细胞开通（switch）为产生IgG4和IgE的细胞这一先前的观察结果。在hCD40-L存在时由IL-13诱导的包括IgG4和IgE在内的Ig产生可以被抗IL-4mAb阻断，这表明IL-13的作用之介导不依赖于IL-4。

由CD40-L转染子提供的辅助作用以及CD40-Ig对这种辅助作用的特异性阻断表明，在CD4⁺T细胞上表达的CD40-L可能是导致B细胞激活和分化的两种抗原性和非特异性T-B细胞相互作用中的重要成分。这些数据与用抗小鼠CD40-L的mAb或CD40-Ig进行的阻断研究相类似，表明CD40-L和CD40的相互作用对于小鼠系统中的T细胞辅助作用是关键的。应该重视由CD40和激活的CD4⁺T细胞传递的信号之结果存在差别的重要性，这揭示其它的T细胞表面分子可以参予形成的T-B细胞间的相互作用。事实上，在激活的CD4⁺T细胞上表达的TNF-α之跨膜形式也与T细胞诱导B细胞增殖和分化有关。

考虑到这些功能的相似性，CD40-L与TNF-α的细胞表面形式的同源性和其具有的某些结构的相似性以及CD40与TNF受体之间的上述类似关系引起了人们的兴趣。由克隆的人和小鼠CD40-L给予人B细胞的实质性辅助作用与先前的研究结果一致，这表明通过CD40传递的信号对于B细胞的存活、激活和分化具有显著的作用。小鼠CD40-L与人CD40-L在激活人B细胞方面似乎同样有效，并与鼠CD40-L和人CD40结合的能力相一致。蛋白质顺序的相似性和小鼠及人CD40-L与CD40进行种间交叉结合的能力表明这是在体内被如此高度保守的重要相互作用。

人IL-13cDNA从同样的CD8⁺T细胞克隆文库分离出来作为CD40-L。然而，尽管IL-13在CD8⁺T细胞中得到表达，但更多的IL-13是在CD4⁺T细胞中表达的。这两种新的分子在诱导IgE合成上的组合效力和其在CD4⁺T细胞中充分的共同表达以及在T细胞激活后IL-13 mRNA的延期表达，所有这些都可以是起体内产生IgE和IgE介导的变态反应作用的机理。

这些实验集中研究在CD4⁺T细胞上表达的CD40-L的功能，其涉及B细胞的激活。CD40-L在包括从中克隆其基因的CD8⁺T细胞在内的（CD4⁺T细胞除外）细胞上表达，这说明该分了有比在T-B细胞相互作用上更广泛的功能。有可能CD40-L在其它细胞类型上表达，甚至包括CD4⁺T细胞，这将对其功能产生重要结果，而不是仅仅提供一条刺激CD40阳性细胞（如B细胞）的途径。例如，CD40-L和CD40在胸腺细胞和胸腺上皮细胞中的表达可以说明涉及T细胞发育的相互作用。

E.IgE开通（Ig  Switching）

本发明的一系列实验证明IL-13诱导人B细胞合成IgG4和IgE。IL-13诱导未分离的外周血单核细胞（PBMNC）和在激活的CD4⁺T细胞或其膜物质存在下培养的高度纯化的B细胞合成IgG4和IgE。IL-13诱导IgG4和IgE合成是IL-4非依赖性的，因为它不受中和抗IL-4单克隆抗体（mAb）的影响。IL-13也能诱导高度纯化的sIgD⁺B细胞产生IgG4和IgE，这表明这些同种型Ig的产生反映了IgG4和IgE的开通而不是定型B细胞的选择性生长。IL-4和IL-13一起以合适浓度加入时不产生相加或协同作用，这表明可能涉及共同的信号传递途径。

上述观点得到下述观察结果的支持，即IL-13象IL-4一样，诱导CD23在B细胞上表达，并增强CD72、表面IgM（sIgM）和Ⅱ类MHC抗原的表达。此外，象IL-4一样，IL-13还诱导菌系ε在高度纯化的B细胞中转录。总之，这些数据表明IL-13是除IL-4之外能有效地指导天然人B细胞开通产生IgG4和IgE的另一种T细胞衍生的淋巴激活素。

B细胞在由CD4⁺T细胞提供的共同刺激因子存在下对sIgM介导的信号所作出的反应是使Ig同种型开通并分化成Ig分泌细胞。抗原特异性的T-B细胞相互作用要求T细胞受体与B细胞上的Ⅱ型主要组织相容性复合物9MHC）肽结合，导致T细胞激活和淋巴激活素合成。一旦T细胞被激活，它们就能以抗原非依赖性的方式激活B细胞。

淋巴激活素对于B细胞的增殖和分化是必要的，它们不仅决定Ig的分泌量，而且还指导Ig同种型开通。IL-4诱导IgG4和IgE的开通，而转化的生长因子β（TGF-β）则指导IgA的开通。（如参见Van Vlasselaer et al.，J.Immunol.148∶2062 1992;Defrance et al.，J.Exp.Med.175∶671，1992）。除了淋巴激活素外，由CD4⁺T细胞传递的接触介导信号也是B细胞增殖和Ig产生所必需的。如上所述，已证明在激活的CD4⁺T细胞上表达的CD40之配基就是一种对于鼠和人B细胞产生IgE（IL-4非依赖性的）充当共同刺激信号的膜相关分子。（例如参见Armitage et al.，Nature 357∶80，1992）。而且，数种淋巴激活素，诸如IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、α-干扰素（IFN-α）、TFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和TNF-β调节IL-4诱导的IgG4和IgE的合成。

曾以为IL-4是唯一能诱导IgE合成的淋巴激活素。在被测试的16种淋巴激活素中，IL-4是能诱导菌系或生产性ε转录物或IgE合成的唯一一种淋巴激活素。此外，抗IL-4  mAb优先抑制由产生TL-4的T细胞克隆诱导的IgE合成，而不对IgM、IgG或IgA的合成产生明显的影响。在鼠模型中，抗IL-4抗体也能强烈地抑制体内的IgE合成而不影响其它的Ig同种型。最重要的是，IL-4不足的小鼠在线虫感染后其血清中缺乏IgE。可是，不产生IL-4的T细胞克隆诱导菌系ε在纯化的B细胞中转录，这表明诱导菌系（germline）ε转录的IL-4非依赖性途径是可行的。IL-13诱导人B细胞中CD23的表达、菌系εmRNA的合成以及IgG4和IgE的开通。

试剂

如本文所述的方法来纯化人重组IL-13。重组IL-4、IFN-α和IFN-γ由Schering-Plough  Research（Bloomfield，NJ）提供。异硫氰酸荧光素（FITC）共轭了的抗-CD72  mAb和中和抗TGF-β  mAb购自R  ＆  D  Systems，Inc.（Minneapolis，MN）。与FITC和藻红素（PE）共轭的、对CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD56和HLA-DR有特异性的mAb以及具有非相关特异性的对照抗体得自Becton-Dickinson（Mountain  View，CA）。与FITC或PE共轭的、对LFA-1（L130）、LFA-3、ICAM-1（LB2）、B7（L307）有特异性的mAb和Ⅰ类MHC抗原由Dr.J.Phillips（DNAX）友好提供。与FITC共轭的抗IgD和IgM  mAb得自Nordic  Immunological  Laboratories（Tilburg，The  Netherlanda）.纯化的抗-CD40  mAb89（IgG1）（Tanchereau  et  al.，Science  251∶70，1991）由Dr.J.Banchereau（Schering-Plough  France，Dardilly，France）赠送。中和抗IL-4  mAb  25D2.11由Dr.J.Abrams（DNAX）友好提供。

细胞制备

血样和脾脏分别得自健康的自愿者或因外伤进行脾切除术的病人。通过用Histopaque-1077（Sigma，st.Louis，MO）离心分离单核细胞。

通过利用荧光素激活的细胞分类器FAC Star Plus（Becton-Dickinson）或磁珠（Dakopatts，Norway）的阴性分类法获得纯化的B细胞。简单地说，将脾MNC洗涤两次，以饱和浓度加入与PE共轭的、抗CD3、CD4、CD8、CD14、CD16和CD56的mAb，并于4℃下保温30分钟。用PBS洗涤该细胞两次。将具有淋巴细胞光扫描特征的细胞闸住（gate），并将PE^-细胞分类。此外，将用抗CD3、CD4、CD8、CD14、CD16和CD56的mAb染色的细胞与用抗小鼠Ig mAb包被的磁珠一起于4℃下保温30分钟。

用磁场除去结合了鼠Ig的细胞。将余下的细胞洗涤，计算，并用于进一步的实验中。为了分离sIg D⁺B细胞，应用了借助FAC Star Plus的阳性分类法。脾MNC用与PE共轭（Conjugate）的抗CD3、CD4、CD8、CD14、CD16和CD56的mAb以及与FTTC共轭的抗IgD mAb染色，并将FITC⁺和PE^-细胞分类。通过反复分析，分类的细胞群的纯度＞98%，而用磁珠分离的细胞纯度＞95%。

根据Roncarolo等人描述的方法（Roncarolo et al.，J.Exp.Med.167∶1523，1988）来培养CD4⁺T细胞克隆B21和生产CD4⁺不产生IL-4的T细胞克隆SP-A3。在用喂养细胞的混和物和PHA激活后4-6天收获细胞。此外，加入IL-2（100  U/ml）以维持T细胞克隆的激活状态。

制备T细胞膜

根据Gascan等人所的方法（Gascan et al.，Eur.J.Immunol.22∶1133，1992）来制备CD4⁺T细胞克隆膜。简单地说，在用喂养细胞混合物和植物血凝素（PHA）激活12天后收获CD4⁺T细胞克隆B21，洗涤细胞，并用10μg/ml的刀豆素A（ConA）于37℃下再刺激7-8小时。在用ConA进行刺激的最后30分钟期间，加入100μg/ml的α-甲基-D-甘露糖苷（Sigma，St.louis，MO）。利用Brian等人描述的方法（Brian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶564，1988;Maeda et al.，Biochim.Biophys.Acta 731∶115，1983）由上述细胞来制备细胞膜，该细胞膜使用前一直贮存于液氮条件下（1×10⁸T细胞等量物/ml＝0.2mg蛋白质/ml膜制备物）。

培养条件

纯化的b细胞一式四份（5000个细胞/孔）置于园底96孔板中（Linbro，McLean，VA），在37℃、含有5%CO₂的湿润环境及0.2ml添加了10%胎牛血清（FCS）的Yssel培养基的条件下进行培养。未分离的PBMNC一式12份以10⁵个细胞/孔的浓度进行培养。在共同的培养实验中，CD4⁺T细胞克隆SP-A3以5000个细胞/孔（T、B细胞之比为1∶1）进行培养。培养12天后，利用ELISA检测培养特上清液中的Ig含量。

测量Ig产物

根据Péne等人（Péne  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶6880，1988）描述的方法利用ELISA测定IgM、总IgG、IgA和IgE分泌物。IgG4分泌物是根据Punnonen等人（Punnonen  et  al.，J.Immunol.148∶3398，1992）描述的方法利用ELISA进行测定。IgM、总IgG和IgA  ELISA的灵敏度为0.5-1  ng/ml，而IgG4和IgE  ELISA的灵敏度为0.2ng/ml。

培养细胞的表型分析

如上所述培养纯化的B细胞，然后收获细胞并洗涤2次。以饱和浓度加入与FITC和PE共轭的mAb，并于4℃保温30分钟。具有非相关特异性的与FITC和PE共轭的mAb用作阴性对照。用PBS洗涤细胞2次，并用FACScan流式细胞计数器（Becton-Dickinson）分析具有淋巴细胞光扫描特征的细胞。

RNA分离和Nothern分析

根据制造商的说明书利用RNAzolB（CNNA：Biotech，Friendswood，TX）来分离总RNA。再将RNA通过0.85%琼脂糖电泳，并转移至BA-S硝基纤维素膜上（Schleicher and Schuell，Keone，NH）。利用pBSIgE1-4的EcoRI/HindⅢ片段作为菌系e的模板和与pHFgA-1的BglI/SmaI片段互补的DNA作为肌动蛋白的模板，借助随机引物法制备³²PcDNA探针（参见Gauchat et al.，J.Exp.Med.172∶463，1990;Erba et al.，Nucleic Acids Res.14∶5275，1986）。

IL-13诱导CD23在纯化的B细胞上表达

利用FACS分析法来研究IL-13对各种B细胞表面抗原表达的影响。纯化的B细胞与IL-13（200U/ml）一起保温对CD23在一定比例（约20%）B细胞上的表达产生强的诱导作用。IL-13还上调Ⅱ类MHC抗原、sIgM和CD72在B细胞上的表达。IL-13的这些作用类似于用IL-4进行实验时所观察到的。24小时的培养期之后，已可检测到CD23的表达，但是在培养72小时后才观察到最强的反应。IL-13对CD19、CD20、CD25、CD40、Ⅰ类MHC抗原、B7、ICAM-1、LFA-1和LAF-3的表达不产生显著的改变。

IL-13诱导PBMNC合成IgE

因为B细胞上的CD23表达与IgE的合成相关联，所以试验IL-13对人PBMNC合成IgE的诱导作用。如表7如示，在没有外源IL-4存在时，IL-13以剂量依赖方式诱导人PBMNC合成IgE。另外，还观察到应答IL-13而大大地产生IgG4。

中和抗IL-4  mAb未能抑制IL-13诱导IgE合成，而事实上完全阻断了IL-4诱导IgE产生，这表明IL-13诱导IgE合成不是通过PBMNC产生的IL-4的诱导作用介导的（参见表8）。与IL-4相似，IL-13通常在50U/ml的浓度时达到对IgE合成的最大诱导作用。应答IL-13所产生的IgE之平均水平（63ng/ml，n＝6）比由IL-4诱导的（169ng/ml，n＝6）稍低。当IL-4和IL-13以饱和浓一起使用时未观察到相加或协同作用。

表7IL-13对IgE和IgG4合成的诱导作用

IgE(ng/ml)  IgG4(ng/ml)

培养基  <0.2  31±14

IL-13  62±17  413±138

表8IL-4和IL-13对IgE合成的诱导作用;

抗IL-4mAb的影响

IgE  合成  (ng/ml)

培养基  <0.2

IL-13(0.5U/ml)  <0.2

IL-13(5U/ml)  13±3

IL-13(50U/ml)  35±13

IL-13(500U/ml)  32±10

IL-13(500U/ml)+抗-IL-4mAb  26±5

IgE  合成  (ng/ml)

培养基  <0.2

IL-4(0.5U/ml)  <0.2

IL-4(5U/ml)  6±3

IL-4(50U/ml)  68±13

IL-4(500U/ml)  71±11

IL-4(500U/ml)+IL-13(500U/ml)  75±10

IL-4(500U/ml)+抗-IL-4mAb  4±1

IL-13诱导B细胞中的IgG4和IgE开通

还测试了IL-13诱导纯化的B细胞合成IgG4和IgE的能力，因而发现IL-13诱导在激活的CD4⁺T细胞克隆膜存在下培养的高度纯化的B细胞合成IgG4和IgE。在该培养系统中，IL-13诱导产生的IgG4和IgE水平一般也是低于IL-4诱导的。当对未分离的PBMNC的培养物进行观察时发现其间的差别在相同的范围内。IL-13还诱导产生显著水平的IgM和总IgG，但末观察到IgA的合成。

在抑制IgA合成方面，IL-13具有与IL-4相似的特性（参见Van  Vlasselaer  et  al.，J.Immunol.148∶1674，1992）。这些结果表明在不存在IL-4时IL-13诱导人B细胞合成IgG4和IgE，并说明IL-13直接作用于B细胞上诱导IgG4和IgE的合成。而且，这些结果有力地揭示IL-13以不依赖于IL-4的方式诱导IgG4和IgE的Ig同种型开通。

为了证实在上述实验中观察到的IgE合成是因为Ig同种型开通而不是少数IgE定型B细胞的生长，研究了IL-13对天然sIgD⁺B细胞的影响。在IL-13存在下将高度纯化的sIgD⁺B细胞与激活的、不产生IL-4的T细胞克隆SP-A3一起培养产生对IgE合成的诱导作用。此外，IL-13还增强由这种不产生IL-4的T细胞克隆单独诱导IgG4的合成。正如用PBMNC证明的那样，IL-13诱导的IgG4和IgE合成不被抗IL-4 mAb抑制。

IL-13对菌系ε转录的诱导作用

迄今为止，IL-4是唯一已知能诱导B细胞中菌系ε转录的淋巴激活素。因为由IL-4开通是在菌系εRNA合成的诱导作用之后，所以假设IL-13也将诱导菌系ε转录。事实上，当在IL-13和抗CD40  mAb存在下培养高度纯化的B细胞时，于5天培养期后进行检测，菌系εmRNA合成的水平与在IL-4和抗CD40  mAb存在下相差不大（参见表9和10）。因为抗CD40  mAb不能单独诱导B细胞中的菌系ε转录，因此上述结果表明IL-13是与IL-4一样能诱导B细胞中的菌系ε转录的另一种T细胞衍生的细胞激活素。此外，这些结果还证实了菌系ε转录和随后开通的IgE合成之间的相互关系。

表9：IL-13诱导在抗-CD40  mAb存在下培养的胎BM细胞合成Ig

IgM  IgG  IgG4  IgE

培养基  <1  <1  <0.2  <0.2

抗-CD40(10μg/ml)  <1  <1  <0.2  <0.2

抗-CD40(10μg/ml)

+IL-13(400U/ml)  5±2  10±3  2±2  1±1

表10：IL-13诱导CD19⁺、sIgM⁺未成熟B细胞和CD19⁺、sIgM^-前B细胞合成Ig

分类的CD19⁺、sIgM⁺胎B细胞：

IgM  IgG  IgG4  IgE

培养基  <1  <1  <0.2  <0.2

B21  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-13  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-7  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-7+IL-13  8±2  23±6  6±2  2±1

B21+IL-7+IL-13

+抗-IL-4mAb  7±2  21±4  2±1  2±1

分类的CD19⁺、sIgM⁺胎B细胞：

IgM  IgG  IgG4  IgE

培养基  <1  <1  <0.2  <0.2

B21  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-13  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-7  <1  <1  <0.2  <0.2

B21+IL-7+IL-13  5±1  6±1  2±1  1±1

B21+IL-7+IL-13

+抗-IL-4mAb  6±1  3±2  1±1  2±1

IL-12对IL-13和抗CD40诱导的IgE合成的影响

在抗-CD40单克隆抗体（20μg/ml）和IL-13（400U/ml）或IL-4（400U/ml）存在下培养10⁴个高度纯化的B细胞。加入含有IL-12的COS上清液或模拟的COS上清液，并于培养14天后利用ILISA来检测IgE。IL-12减弱了IL-13的作用而增强IL-4的作用。

已经认为IL-4是在人或鼠B细胞中诱导IgE开通的唯一细胞激活素。这个结论基于表明抗IL-4 mAb在体内和体外都优先阻断IgE合成的研究工作，也基于在小鼠中不能检测到循环IgE，该小鼠中的IL-4基因已被分裂。然而，已发现IL-13诱导的IgE合成是IL-4非依赖性的，因为在缺乏外源IL-4的情况下IL-13在高度纯化的B细胞的培养中诱导IgG4和IgE合成。此外，能有效地阻断IL-4诱导IgE合成的抗IL-4 mAb不影响IL-13诱导IgE产生。而且，与IL-4所诱导的情况一样，IL-13诱导的IgG4和IgE合成反映了Ig同种型开通，而不是由于少数定型合成IgG4和IgE的B细胞的选择性生长，因为IL-13还诱导天然的、分类的sIgD⁺B细胞合成IgG4和IgE。

菌系εmRNA合成的诱导作用先于由IL-13引起的IgE开通，但IgE产生的诱导作用需要由激活的T细胞提供共同的刺激信号。这与证明IL-4在鼠和人B细胞中诱导开通ε在菌系εRNA合成的诱导作用之后，且由激活的CD4⁺T细胞克隆或抗-CD40 mAb提供共同的刺激信号是IL-4诱导产生εmRNA转录物和合成IgE所必需的之研究相一致。尽管菌系ε转录物的确切作用尚有待于确定，但已揭示它们在ε开通过程中起重要作用。

尽管存在IL-4被认为是诱导菌系ε在B细胞中转录的唯一细胞激活素之一事实，但诱导菌系ε转录的IL-4非依赖性途径是可行的，因为不产生IL-4的T细胞克隆也能够诱导大量地合成菌系εRNA。有可能是由不产生IL-4的T细胞克隆产生的IL-13负责在B细胞中对菌系εmRNA的IL-4非依赖性诱导作用。这些结果也可以解释抗IL-4  mAb从不完全抑制由生产IL-4的T细胞克隆诱导的IgE合成的原因。IL-4和IL-13拮抗剂的组合可以非常有效地阻断开通过程，其中的每种拮抗剂为较低水平，例如低于引起不利副作用的阈水平。

当IL-4和IL-13以合适浓度一起加入时未观察到对IgE合成的相加作用或协同作用，这表明IL-4和IL-13可能利用共同诱导IgG4和IgE开通的信号传递途径。事实上，目前的研究已经表明IL-13和IL-4的受体共有一个信号传导功能的共同的亚单位。然而，IL-13不与带有130kDa  IL-4受体的细胞结合，表明IL-13不是通过这种IL-4结合蛋白起作用。

与IL-4一样，IL-13诱导CD23在纯化的B细胞上表达，这一观察结果进一步支持了IL-13和IL-4之间的共性。与IL-4相似，IL-13也对Ⅱ类MHC抗原、sIgM和CD5的配体CD72的表达具有上调作用。尽管CD23在调节IgE合成中的确切作用尚待确定，但已观察到CD23的表达与IgE合成的诱导之间有很强的相关性，并发现可溶形式的CD3能增强IgE合成。因为IL-13在24小时内诱导CD23的显著表达，所以这些数据也表明CD23的表达先于IL-13诱导的ε开通，因而证明了CD23表达的诱导与随后IgE合成之间的相互关系。

尽管IL-4和IL-13在对B细胞的作用方面具有相似性，但两者的功能却不相同。应答IL-13所产生的IgG4和IgE水平通常低于IL-4诱导的。而且，初步的结果表明，与IL-4相反，IL-13并不作用于T细胞或T细胞克隆。IL-13不具有明显的T细胞生长促进活性，并且不显示诱导CD8a在CD4⁺T细胞克隆上的表达，这可能是由于在T细胞上缺乏功能性IL-13受体。T细胞的激活状态是其传递B细胞增殖和分化所需的共同刺激信号的能力必需的。因而，缺乏IL-13诱导T细胞激活作用可以部分解释为什么由PBMNC应答IL-13所产生的最高水平的IgG4和IgE合成低于IL-4诱导的。

这些数据似乎与缺乏IL-4的小鼠在线虫感染后没有可检测的循环IgE的结果不相符。然而，尚不清楚IL-13是否也诱导鼠B细胞合成IgE。初步的数据表明，在T细胞激活后产生IL-13比产生IL-4需要长得多的时间，这说明IL-13在对过敏性个体中增强IgE合成的调节中起重要作用。

Ⅳ.对PBMC和巨噬细胞的活性

A.诱导非附着性人PBMC形态学的改化

经Ficoll-Hypaque离心从正常的健康人供体中分离外周血单核细胞（PBMNC）。总PBMNC（1×10⁸细胞）在10mm组织培养皿中于37℃下保温30分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）广泛地冲洗平皿以除去未附着细胞。如上所述，附着细胞在仅含1%人AB血清或含衍生于大肠杆菌的小鼠P600（lot 560-137-1;所用浓度为30ng/ml）的Yessel培养基（Yessel et al.，J.Immunol.Methods 72∶219，1974）中保温。此外，来源于小鼠P600的COS-7或人IL-13以最终1/20的稀释度应用。以规律的时间间隔来观察细胞。

B.非附着细胞上细胞表面标志的修饰

在经过如上所述的非附着性筛选后5或10天，值助荧光激活的细胞分类法（FACS）（例如参见Shapiro，Practical  Flow  Cytometry（2nd  Ed.）1988，Alan  Liss，New  York）对所得细胞进行细胞表面标志的表达分析。作为识别每种标志之例证的抗体有：CD11a[LFA-1;SFN-L7，来自DNAX，Palo  Alto，CA]、CD11b[Bearl，参见Spits  et  al.，Eur.J.Immunol.14;229，1984]、CD11c[p150;NGH  93，参见Visser  et  al.，blood  74∶320，1989];CD54[ICAM;LB2，参见Azuma  et  al.，J.Expt′l  Med.175∶353  1992]、Ⅰ类MHC[W6/32，来自在Sera  Labs，还可参见Barnstable  et  al.，Cell  14∶9，1978];Ⅱ类  MHC[Q5/13，参见Quaranta  et  al.，J.Immunol.125∶1421，1980]Ⅱ类MHC[PdV5.2，参见Koning  et  al.，Human  Immunol.9∶221，1984]，Ⅱ类MHC（DQ;SPV-L3）、CD58[LFA-3;TS2/9，参见Krensky  et  al.，J.Immunol  132∶2180，1984]、CD32[Ⅳ.3，参见Looney  et  al.，J.Immunol.136∶1641，1986]、CD16[粒细胞-1，参见Huizinga  et  al.，Nature  333∶667，1988];或Leulla（Becton  Dickinson，Mountain  View，CA）;CD23（gp25，来自DNAX，Palo  Alto，CA）、IL-2Ra[7G7;或BB10，参见Herve  et  al.，Blood  75∶1017，1990]，CD44[NKI-P1;参见Vennegoor  et  al.，J.Immunol.148∶1093，1992]，CD14（LeuM3，Becton  Dickinson）和CD18及B7[L130和L307;两者均描述于Azuma  et  al.，J.Immunol.149∶1115，1992]。

来自COS-7上清液或大肠杆菌包涵体的小鼠P600材料与人IL-13的COS-7上清液进行比较。

C.氧化氮的合成

通过IL-13（P600）对由GM-CSF衍生的骨髓巨噬细胞产生氧化氮（NO）的抑制作用来测定IL-13。所说的巨噬细胞来自含GM-CSF的RPMI之9-12天培养物，并通过保留附着的、GM-CSF反应性馏份而得以纯化。采用双色染色的FACS分析法确定细胞纯度为99+%。

如所说明的那样，在用或不用细胞激活素预先刺激的情况下，于适当的实验中以LPS（3μg/ml）进行刺激以激活巨噬细胞产生NO。在用LPS处理16小时之前，先将巨噬细胞与细胞激活素（如果用的说）一起保温16小时。在与LPG加入相关表示的时间时取出上清液，即0小时是加入LPS的时间。

利用用于亚硝酸根的标准Griess测定法测定上清液中NO的生成[例如参见，Coligan，Current  Protocols  in  Immunology，（1991和定期的增刊）Greene/Wiley，New  York]。已试验了在向巨噬细胞培养物中加入LPS之后或加入LPS之时加入的细胞激活素，在这种培养条件下，所试验的细胞激活素（包括IL-13）均不产生明显的作用。还测试了其它的巨噬细胞，但因它们一般产生较低水平的NO，所以没有广泛地用于生物测定。

在表11中，A部分表示在用所命名的细胞激活素处理16小时后由GM-CSF处理的骨髓衍生的巨噬细胞所产生的NO。应注意，IFN-γ诱导NO产生而IL-4或IL-13却抑制NO产生。L-NMMA是NO产生的特异性抑制剂。B和C部分是滴定在不同范围P600量的相似实验。在每一种情况下，IL-13都减少NO的产生。

表11：GM-CSF衍生的巨噬细胞产生的NO（nM）

处理方式  0小时  24小时  48小时

A

培养基  1.551  3.638  3.103

+LPS+IFN-γ  3.852  10.057  9.576

+LPS+IL-4  1.016  1.016  3.798

+LPS+L-NMMA  0.963  0.802  0.000

+LPS+IL-13  0.856  0.802  0.321

+LPS  0.963  4.708  5.189

B

培养基  0.000  0.144  0.190

LPS  0.193  4.826  8.253

LPS+L-NMMA  0.144  0.482  0.145

LPS+IFN-γ  0.917  11.872  14.189

LPS+IL-4  0.000  4.633  7.095

LPS+P600(25ng/ml)  0.000  2.992  4.537

LPS+P600(50ng/ml)  0.000  3.282  4.730

LPS+P600(100ng/ml)  0.261  3.137  4.488

C

培养基  0.705  2.512  2.757

LPS  0.766  2.390  2.665

LPS+IFN-γ  2.359  10.509  15.319

LPS+L-NMMA  0.643  0.735  0.950

LPS+IL-13(400pg/ml)  0.306  1.225  1.562

LPS+IL-13(2ng/ml)  0.674  1.225  1.593

LPS+IL-13(10ng/ml)  0.643  1.164  1.532

LPS+IL-13(50ng/ml)  0.613  1.072  1.409

LPS+IL-13(250ng/ml)  0.613  1.134  1.409

D.IL-1α、IL-6的调节

IL-13抑制由LPS激活的人单核细胞产生IL-1α、IL-6、IL-10和TNFα

经Ficoll-Hypaque离心从正常的健康供血者中分离外周血单核细胞。将总PBMNC（100×10⁶细胞/100mm细胞培养皿）于37℃下保温30分钟，接着用PBS广泛冲洗组织培养皿以除去非附着细胞。在含有1%人AB血清、存在或缺乏LPS（E.coli 0127∶B8，Difco，Detroit，MI）下并与IL-4（50ng/ml）、IL-13（50ng/ml）或IL-10（100U/ml）组合的Yssels培养基中培养附着的细胞。此外，在中和抗-IL-10mAb 19F1（10 μg/ml）存在下用LPS与IL-4或IL-13的组合物来激活细胞。12小时后收集上清液，并用细胞激活素特异性的ELISA检测IL-1α、IL-6、IL-10和TNF-α的产生。表12表示上述研究结果。

表12：IL-13对LPS激活的人单核细胞产生IL-1α、IL-6、IL-10和TNF-α的影响

IL-1α  IL-6  IL-10  TNF-α

(ng/ml)  (ng/ml)  (ng/ml)  (ng/ml)

培养基  0  0  0  0

LPS  8.1  54.4  35.4  2.2

LPS+IL-4  1.7  33.1  30  0.7

LPS+IL-13  2  35.4  22  0.5

LPS+IL-10  0  8.6  ND  0

LPS+αIL-10mAb  12  101  ND  10.6

LPS+αIL-10mAb+IL-4  3.7  59.5  ND  1.2

LPS+αIL-10mAb+IL-4  5.4  79.5  ND  1.5

上述结果表明IL-4和IL-13抑制由LPS激活的人单核细胞产生IL-1α、IL-6、IL-10和TNF-α。IL-10也抑制由LPS激活的人单核细胞产生IL-1α、IL-6和TNF-α。IL-10是由人单核细胞产生并以自动调节的方式抑制IL-1α、IL-6和TNF-α。IL-10中和mAb  19F1的加入表明内源产生的IL-10同样也抑制IL-1α、IL-6和TNF-α的产生。IL-4和IL-13对于LPS激活的人单核细胞产生细胞激活素的抑制作用不依赖于IL-10，因为存在中和抗IL-10  mAb  19Fl时IL-4和IL-13也抑制IL-1α、IL-6和TNF-α的产生。

E.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）

本实验研究IL-13单独或与IL-4、IFN-α或IL-10相结合对人单核细胞的影响。IL-13诱导单核细胞表型的显著改变。和IL-4一样，IL-13增强CDllb、CDllc、CD18、CD29、CD49e（VLA-5）、Ⅱ类MHC、CD13和CD23的表达而以剂量依赖方式减弱CD64.CD32 CD16和CD14的表达。IL-10对抗IL-13诱导的对Ⅱ类MHC抗原的上调作用及其对CD64、CD32和CD16表达的下调作用。IFN-γ也能部分地阻止IL-13诱导的对CD64的下调作用，但对CD32和CD16没有影响。然而，IL-13强力地抑制人单核细胞针对抗-IgD⁺包被的Rh⁺红细胞的自发的和IL-10或IFN-γ诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性，表明单核细胞的细胞毒性被抑制。

而且，IL-13抑制由LPS激活的单核细胞产生IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P35、IL-12  P40、GM-CSF、G-CSF、IFN-α和TNF-α。与此相反，IL-13增强这些细胞产生IL-1RA。对于IL-4观察到或者已获得在细胞激活素产生上的相似结果。因此，IL-13与IL-4共有大部分对人单核细胞的活性，但未观察到IL-13和IL-4对人单核细胞的相加或协同作用，这揭示这些细胞激活素可能共有共同的受体成分。综合这些结果，说明IL-13具有抗炎和免疫调节活性。

激活的T细胞分泌大量生物活性多肽，调节参予对抗抗原的免疫应答之细胞的增殖、分化和功能。已经描述过在鼠和人中经抗原性或多克隆刺激后产生IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ、GM-CSF和TNF/LT的T细胞。这些T辅助细胞被命名为Th0以使之与更特化的Th1和Th2亚群相区别。鼠Th1细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF/LT、IL-3和GM-CSF，它们支持其在细胞免疫应答（如迟发型超敏反应，DTH）中作为调节细胞和效应细胞的功能，而Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-3和GM-CSF，它们使之适宜在产生不同的同种型免疫球蛋白时给B细胞提供帮助。

在人类中，也已从炎性或变态性疾病的患者中分离出具有限定性细胞激活素产生类型的T细胞克隆。尽管这些克隆类型类似于鼠Th1和Th2克隆，但还是存在某些区别。根据激活的方式，Th1克隆通常只能产生小量的IL-4而Th2能够产生小量至正常量的IFN-γ。然而，经抗原刺激后观察到由Th2克隆产生的IL-4和IFN-γ的比例明显不平衡。因此，定义产生高水平IFN-γ和不产生或产生低水平IL-4人T细胞克隆为Th1“样”细胞，以及不产生或产生低水平IFN-γ和高水平IL-4的T细胞克隆为Th2“样”细胞。而且，在小鼠中由Th0和Th2T细胞亚群专门产生IL-10，在人体中由Th0、Th1“样”和Th2“样”亚群产生IL-10。

本发明制造可以利用的一种新的细胞激活细-人IL-13，它与小鼠P600蛋白相关。人IL-13和小鼠P600蛋白质都具有生物活性，并且影响人单核细胞和B细胞的功能。

进一步描述了鼠和人IL-13对人单核细胞的生物活性之特征，并与IL-4、IL-10、IFN-γ以及对人单核细胞具有刺激性抑制作用的其它细胞激活素进行了比较，IL-13引起人单核细胞表型的明显改变，并抑制由LPS激活后的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、IFN-α和TNF-α产生，但它却诱导IL-1RA的产生。这些结果表明IL-13具有抗炎活性，并且在免疫应答中可以起重要的调节作用。

人单核细胞的分离和培养

经Ficoll-Hypaque离心从健康供血者的外周血中分离人单核细胞，并附着于塑料板上。简单地说，将100×10⁶PBMNC置于100mm组织培养皿中，其中含有添加了人血清白蛋白（HSA）和1%贮备人AB⁺血清的Yssel培养基，并于37℃下保温30分钟。经鲎变形细胞溶解物试验（Limulus amoebocyte Lysate assay）确定该培养基无内毒素（内毒素<0.2ng/ml）。随后经广泛冲洗除去非附着细胞，并如前所述在含HSA和1%贮备人AB血清的Yssel培养基中培养。此外，利用离心淘洗从500ml正常供血者的血液中获得高度纯化的人外周血单核细胞。

通过在血成分分离器中的密度离心，随后分为淋巴细胞和单核细胞来分离单核细胞。经非特异性脂酶染色判断，该单核细胞制备物的纯度＞95%，并含有多于98%的存活细胞。将这些单核细胞以4×10⁶细胞/ml的浓度在特氟龙袋（Jansen MNL，St Niklaas，Belgium，可防止这些细胞的粘附）中的含有HSA和1%贮备人AB⁺血清的Yssel培养基中进行培养。在培养指定时间后，收集单核细胞，并用间接免疫荧光法分析细胞表面标志的表达，或者利用Northern和PCR分析法分析淋巴激活素基因的表达。此外，在用1μg/ml的LPS（E.coli 0127∶B8）（Difco，Detroit，MI）激活这些细胞后收集单核细胞培养物上清液以测定IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF、G-CSF和IL-1RA产生。经台盼兰排除测定，培养后细胞的存活率通常超过95%。

试剂

重组人和小鼠IL-13在大肠杆菌中作为谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质的可溶性聚集物进行表达，通过离心提取，然后溶解，并在用凝血酶消化以除去N末端合部分之前将重组人和小鼠IL-13进行复性。随后用阳离子交换及凝胶滤过色谱层析纯化蛋白质，产生有活性的人和小鼠IL-13。纯化的人rIL-10、rIL-4和rIFN-γ由Scherng-Plough  Research  Institute（Bloomfield，NJ）提供。

以前已描述过中和抗IL-4  mAb25D2[Chretien  et  al.，J.Immunol  Methods，117∶67，1989]和抗IL-10  mAb  19F1[Abrams  et  al.，Immunol.Rev.125∶5，1992]。对于细胞表面标志的表达进行免疫荧光研究所用的mAb如下：SPV-L7[CD11a;Spits  et  al.，Hybridoma  2∶423（1983）]，Bear-1[CD11b;Keizer  et  al.，Eur.J.Immunol.15∶1142（1985）]，CLB  FcR  gran-1[CD16;Klaassen  et  al.，J.Immunol.144∶599（1990）]，gp25[CD23;Bonnefoy  et  al.，J.Immunol.138∶2970（1987）]，Ⅳ.3[CD32;Looney  et  al.，J.Immunol.136∶1641（1986）]，32.2[CD64;Anderson  et  al.，J.Biol.Chem.261∶12856（1986）]，Q5/13[HLA-DR/DP;Quaranta  et  al.，J.Immunol.125∶1421（1980）]，PdV5.2[HLA-DR/DP/DQ;Koning  et  al.，Hum.Immunol.9∶221（1984）]，SAM-1[VLA-5，CD49e;Keizer  et  al.，Eur.J.Immunol.17∶1317（1987）]，CD29（Ts2/16;a  kind  gift  of  C.Figdor，Amsterdam），L307[B7;Azuma  et  al.，J.Immunol.149∶1115（1992）]，IOM13（CD13;购自AMAC，Inc.，Westbrook，ME）;Leu-M3（CD14），Leu15（CD11c），and  L130（CD18）得自Becton-Dickinson（San  Jose，CA）.

探针

对IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF、G-CSF和β-肌动蛋白的PCR产物进行Southern分析所用的寡核苷酸已由de  Waal  Malefyt等人描述过（de  Waal  Malefyt  et  al.，J.Exp.Med.174∶1209，1991）。

用于检测IFN-α、IL-1RA、IL-12  P35、IL-12  P40和TGF-β1的寡核苷酸如下：

IFN-α：5′-TTCTGGCTGTGAGGAAATACT-3′（nt  360-378），

IL-1RA：5′-GTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATGTGG-3′（nt  207-234），

IL-12  P35：5′-AATGGGAGTTGCCTGGCCTC-3′（nt  488-507），

IL-12  P40：5′-TAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCC-3′（nt  417-441），和TGF-β1：5′-CGAGCCTGAGGCCGACTACTACGCCAAGGAGGTCACC-CGC-3′（nt  1131-1170）.

mRNA的分离和Northern分析

利用硫氰胍-氯化铯程序从20×10⁶单核细胞中分离总RNA。为了进行Northern分析，根据分子大小不同在含有6.6%甲醛的琼脂糖凝胶上分成每份10μg总RNA的样品，然后转移至Nytran尼龙膜（Schleicher ＆ Schuell，Keene，NH），并与利用六聚物标记技术标记为高度特异活性（>10⁸cpn/mg）的探针杂交。在严格的条件下将滤膜杂交、洗涤，然后显影。

PCR分析

利用Oligo（dT）12-18作引物（Boehringer  Mannheim，India-napolis，IN）和AMV逆转录酶（Boehringer  Mannheim）在20μl反应体积中将1μg总RNA进行逆转录。将2μl逆转录物（相当于100ng总RNA）直接用于每一扩增反应。进行PCR的条件如下：在50μl反应体积中，每种引物25nmol，dGTP、dATP、dCTP、dTTP（Pharmacia，Uppsala，Sweden）各125μM，50mMKCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl₂、1mg/ml明胶、100μg/ml非乙酰化BSA和1单位Vent DNA聚合酶（New England Biolabs，Beverly，MA）。

用于扩增IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF、G-CSF和β-肌动蛋白的引物已由de  Waal  Malefyt等人早先描述过（de  Waal  Malefyt  et  al.，J.Exp.Med.174∶1209，1991）。还应用了下列引物：IFN-α有意义引物：5′-GCTGAAACCATCCCTGTC-3′（nt  161-178），IFN-α反意引物：

5′-CTGCTCTGACAACCTCCCAG-3′（nt  450-430），IL-1RA有意义引物：

5′-GCAAGCCTTCAGAATCTGGGATG-3′（nt  118-141），IL-1RA反意引物：5′-GATGTTAACTGCCTCCAGCTGGAGTC-3′（nt  344-319），IL-12P35有意义引物：5′-CTTCACCACTCCCAAAACCTG-3′（nt  281-302），IL-12  P35  反意引物：5′-AGCTCGTCACTCTGTCAATAG-3′（nt813-792），IL-12  P40有意义引物：5′-CATTCGCTCCTGCTGCTTCAC-3′（nt  337-358），IL-12P40反意引物：5′TACTCCTTGTTGTCCCCTCTG-3′（nt  603-582），TGF-β1有意义引物5′-ACCGGGTGGCCGGGGAGAGTGC-3′（nt  1097-1118），TGF-β1反意引物：5′-GCCGGTTGCTGAGGTATCGCCAGG-3′（nt  1399-1376）.

反应在Perkin-Elmer/Cetus  DNA热循环仪9600中保温循环25次（94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸60秒）。取每种反应物40μl载样于TAE缓冲剂中的1%琼脂糖凝胶上。并利用溴化乙锭染色观察PCR产物。随后，用0.5M  NaOH和1.5M  NaCl将凝胶变性，再用1M乙酸铵中和，然后转移至Nytran尼龙膜上。将膜置于6X  SSC、1%SDS、10X  Denhardt溶液（0.2%  Ficoll、0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%BSA、pentax  fraction  V）和200μg/ml大肠杆菌tRNA（Boehringer，Mannheim，FRG）于55℃下预杂交4小时。

利用T4聚核苷酸激酶（New England Biolabs）和γ-³²P-ATP（Amersham，Arlington Heights，IL）在5′端标记寡核苷酸探针（200ng），该探针对用于扩增中的引物的顺序内部构件具有特异性。通过一个Nick柱（Pharmacia，Uppsala，Sweden）从未掺入的核苷酸中分出探针，并加入到杂交混合物中。在55℃杂交12小时后，在0.1×SSC（1×SSC：150mM NaCl、15mM柠檬酸钠pH＝7.0）和1%SDS中于室温下漂洗滤膜，并暴露于Kodak XAR-5胶片1-2小时。此外，在分子力学磷光体成象仪（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）上对信号进行定量分析。

淋巴激活素测定

采用细胞激活素特异性的ELISA来测定培养物上清液中由单核细胞产生的细胞激活素。细胞激活素特异的ELISA及其灵敏度如下：IL-1α，Endogen（Boston，MA）（50pg/ml）;TNF-α，Endogen（Boston，MA）（10pg/ml）;IL-1β，Cistron（Pine  Brook，NJ）（20pg/ml）;IL-6，Genzyme（Boston，MA）（0.313ng/ml）;IL-8，R  ＆  D  Systems（Minneapolis，MN）（4.7pg/ml）;G-CSF，R  ＆  D  Systems（Minneapolis，MN）（7.2pg/ml）;IL-1RA，R  ＆  D  Systems（Minneapolis，MN）（12.5pg/ml）;GM-CSF，Bacchetta  et  al.，J.Immunol.144∶902，1990，（50pg/ml）和IL-10（75pg/ml）。

免疫荧光分析

将10⁵细胞与10μl纯化的mAb（1mg/ml）一起置于V型底微量滴定板（Flow Laboratories，Mclean，VA）中于4℃下保温30分钟。用含有0.02mM叠氮化钠和1%BSA（Sigma，St Louis，MO）的PBS洗涤两次后，再将细胞与以1∶40稀释的、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗小鼠抗体的F（ab′）₂片段（TAGO，Inc.Burling-ame，CA）一起于4℃下保温30分钟。另外洗涤3次之后，在FACScan（Becton Dickinson，Sunnyvale，CA）上用流动显微荧光法（flow microfluometry）分析被标记的细胞标本。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）

根据de Velde等人以前描述的方法（de Velde et al.，J.Immunol.149∶4048，1992）来测定培养的人单核细胞抗体包被的Rh⁺人红细胞的ADCC活性。

IL-13和IL-4诱导人单核细胞细胞表面抗原表达的相同改变

小鼠和人IL-13诱导CD23（FCεRⅡ）的表达，并上调Ⅱ类MHC抗原在人单核细胞上的表达。研究了IL-13对一大批细胞表面抗原的表达的影响。IL-13影响属于不同超基因家族的多种细胞表面分子的表达。IL-13增强整合（integrin）超家族之数种成员的粘附分子的表达。IL-13上调α亚单位CDllb（C3bi受体，Mac-1）CDllc（gp150，95）和VLA-5（FNR）及其各自的β亚单位CD18（β2）和CD29（β1，VLA-b）的表达。IL-13对该家族的其它成员，包括CDlla（LFA-1）、VLA-2（CD49b）、VLA-3、VLA-4（CD49d）、VLA-6（CD49f）、β3（CD61）和β4的表达不产生明显影响。

IL-13增强Ⅱ类MHC抗原的表达。IL-13上调HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的表达。IL-13对包括Ⅰ类MHC、CDlla（LFA-1）、CD54（ICAM-1）、ICAM-2和CD58（LAF-3）在内的免疫球蛋白超家族的其它成员的表达不产生显著影响。

IL-13调节各种Fc受体在单核细胞上的表达。CD64（FcγR1）、CD32（FcγRⅡ）和CD16（FcγRⅢ）在人单核细胞上的表达受到IL-13强烈的下调。相反，IL-13诱导CD23（FcεRⅡ）的表达。此外，IL-13上调CD13（氨肽酶N）的表达并下调CD14的表达。未检测出IL-13对CD25、CD33和CD44表达的重要影响。

IL-4对CDllb、CDllc、CD18、VLA-5、CD29、Ⅱ类MHC、CD13和CD23的上调作用和对CD16、CD32、CD64及CD14在人单核细胞上的表达的抑制作用与IL-13的作用相同。综上所述，这些结果表明IL-13诱导细胞表面分子表达的改变类似于IL-4所诱导的改变。与IL-4或者IL-13单独引起的变化相比，单核细胞与饱和浓度的IL-4和IL-13两者一起保温时所引起的表型变化没有区别。

在上述条件下未检测出IL-13和IL-4对各种细胞表面分子表达的相加或协同作用。没有证据表明单核细胞能够产生IL-4。然而，为了排除IL-13是通过诱导单核细胞或少数污染的T细胞产生IL-4而起作用的可能性，在IL-13和一种中和抗IL-4mAb的存在下培养单核细胞。

如表13所示，抗IL-4mAb不影响IL-13对CD23的诱导作用、对CD14的下调作用和对Ⅱ类MHC的上调节作用。然而，因为抗IL-4mAb在对照实验中完全抑制IL-4的作用，所以它是有效的。因此，IL-13的作用不依赖于IL-4。

表13  IL-13的作用不依赖于IL-4

mAb  培养基  IL-13  IL-13  IL-4  IL-4

+αIL-4  +αIL-4

对照 3^*5 6 5 3

MHCclassII  443  1904  1845  2084  220

CD23  3  99  79  89  8

CD14  222  97  83  80  444

在有或没有中和抗IL-4mAb  25D2（10μg/ml）的情况下将单核细胞与培养基、IL-13（50ng/ml）或IL-4（400U/ml）一起在37℃下保温120小时，用间接免疫荧光法测定HLA-DR/DP（Q5/13）、CD23（gp25）和CD14（Leu-M3）的表达。

^＊平均荧光强度（通道数）

根据所显示的对CDllb、CD18、CD16、CD32、CD64、CD23、Ⅱ类MHC、CD13和CD14表达的调节作用（表14），IL-13诱导细胞表面标志表达的改变是剂量依赖性的。总的说来，人单核细胞与5pg/ml  IL-13一起保温不足以诱导这些细胞表面标志表达的改变，而用0.5ng/ml  IL-13则可导致与由0.5ng/ml  IL-4差不多的显著的表型改变。50ng/ml  IL-13引起最强的反应，由50ng/ml  IL-4引起的反应也在相同范围内，这表明IL-4和IL-13具有相同的效果。

表14  IL-13以剂量依赖性方式诱导单核细胞细胞表面表型的改变

mAB  IL-13  (pg/ml)  IL-4  (U/ml)

0  5  500  50000  4  400

对照 3^*3 3 4 3 3

CD11b  59  54  102  139  102  168

CD18  71  54  79  108  99  127

CD16  25  20  20  15  20  13

CD32  50  48  44  40  43  39

CD64  57  50  36  26  31  17

CD23  4  4  12  56  7  67

MHCclassII  355  386  586  607  609  908

CD13  26  26  113  121  57  102

CD14  110  110  75  37  86  16

单核细胞与培养基、IL-13（5pg/ml、500pg/ml或50，000pg/ml）或IL-4（4U/ml或400U/ml）一起于37℃下保温120小时，并利用间接免疫荧光法测定细胞表面抗原的表达。

^＊平均荧光强度（通道数）

IL-10向下调节IL-13诱导的Ⅱ类MHC在人单核细胞上的表达为了比较IL-13与其它调节细胞表面表型的细胞激活素的作用，在有或无IL-13的情况下将单核细胞与IL-10或IFN-γ一起保温培养，并分析细胞表面抗原的表达。IL-10或IFN-γ并不单独明显影响CDllb、CDllC、CD18、CD13、CD23、CD29和VLA-5的表达另外，IL-10或IFN也不明显地影响由IL-13诱导的这些标志表达的增加。未观察到IL-10或IFN对CD14表达及IL-13诱导CD14表达的抑制的影响。

然而，IL-10不仅下调固有的Ⅱ类MHC在单核细胞上的表达，而且还强烈地抑制IL-13诱导的Ⅱ类MHC的表达。当应用经淘析分离的和在特氟龙袋中培养的高度纯化的单核细胞时获得了上述类似数据（表15）。单核细胞单独在培养基中保温后观察到Ⅱ类MHC抗原表达的增强，这种增强的表达将被IL-10完全阻止。IL-10可以阻断由所有m-IL-13、h-IL-13、IL-4和IFN-γ诱导的Ⅱ类MHC的高水平表达（表15）。IL-13可以进一步增强IFN-γ诱导的Ⅱ类MHC表达。IFN-γ轻度上调B7的表达。综上所述，这些结果表明IL-13、IL-10和IFN-γ独立调节单核细胞细胞表面抗原的表达。

表15  IL-10抑制人单核细胞上固有的和由IL-13、IL-4及IFN-γ诱导的Ⅱ类MHC表达

保温  IL-10(200U/ml)

+  -

对照 4℃ 69^*nd^**

培养基  37℃  150  46

mIL-13  212  73

hIL-13  197  81

IL-4  407  94

IFN-γ  347  36

在有或无IL-10（200U/ml）的特氟龙袋中，将陶析的单核细胞与mIL-13（50ng/ml）、hIL-13（50ng/ml）、IL-4（400U/ml）或IFN-γ（100U/ml）一起在培养基中于4℃促37℃下保温48小时，并用间接免疫荧光法测定HLA-DR/DP的表达。

^＊平均荧光强度（通道数）

^＊＊未测出

IL-13抑制单核细胞的FcγR细胞表面表达和细胞毒性

IFN-γ、IL-4和IL-10能够调节FcγRⅠ（CD64）、FcγRⅡ（CD32）和FcγRⅢ（CD16）在人单核细胞上的表达。IFN-γ和IL-10增强CD64的表达，而IL-4下调CD64、CD32和CD16的表达。向单核细胞中加入上述细胞激活素的组合物表明IL-10能够阻止IL-4诱导的所有三种FcγR在细胞表面表达上的下调作用，并表明IFN-γ部分地恢复IL-4对CD64表达的下调作用。IL-10阻止IL-13诱导的对CD64、CD32和CD16的下调作用。此外，IFN-γ能部分地恢复IL-13诱导的对CD64的下调作用，但不影响IL-13诱导的对CD32和CD16的下调作用。

已经证明人单核细胞的ADCC活性水平与FcγRⅠ的表达相关。通过其溶解抗D调理的人Rh⁺红细胞的能力来确定IL-13对单核细胞上FcγRⅠ功能活性的影响。人和小鼠IL-13两者都能单独抑制在培养基中培养的单核细胞的ADCC活性。另一方面，当单核细胞在IFN-γ或IL-10存在下进行培养时增强了ADCC的活性。尽管IFN-γ和IL-10部分或完全地逆转FcγRⅠ表达的抑制作用，但IL-13还是明显地抑制IFN-γ和IL-10的这些作用，这表明IL-13也通过其它机制来影响FcγR介导的细胞毒性。

IL-13抑制促炎性细胞激活素和造血生长因子的产生但诱导IL-1RA的产生

为了确定IL-13对人单核细胞产生细胞激活素的影响，用LPS激活单核细胞并在6和24小时后利用细胞激活素特异性ELISA测定培养物上清液中细胞激活素的产生。LPS激活单核细胞引起IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、TNF-α和IL-1RA的产生。激活后6小时出现了显著水平的IL-lα、IL-lβ、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-lRA，而在24小时时检测到IL-10、G-CSF和GM-CSF的产生。在激活后6-24小时，IL-13、IL-4和IL-10抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的产生，但增强IL-1RA的产生。

IL-13影响单核细胞的形态学、表型、功能和细胞激活素的产生。单核细胞与IL-13一同保温诱导这些细胞与塑料底物的强烈粘附以及其形态变化为树状形式。另外，还观察到细胞的同型聚集物。IL-13上调作为整合（integrin）超家族成员的CDllb、CDllc、CD18、VLA-5和CD29的表达，这一发现与所观察到的聚集现象和形态学的改变相一致，这是因为CDllb/CD18和CDllc/CD18的杂二聚体涉及细胞一细胞间相互作用、同型聚集与人造底物的粘附和结合纤维蛋原。

另外，α5β1整合的VLA-5/CD29是纤维连结素的受体，所说的纤维连结素是一种丰富的细胞外基质蛋白，它涉及粘附过程。IL-13并不诱导涉及粘附或细胞-细胞间相互作用的其它分子表达的改变，例如CDlla、VLA-2、VLA3、VLA-4、VLA-6、β3、β4、ICAM-1、ICAM-2、LFA-3、MEL-14和CD44，但是IL-13诱导的形态学和粘附作用的改变涉及其它细胞表面结构仍是可能的。

IL-13上调人单核细胞上Ⅱ类MHC抗原的表达。IL-13显著增加HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的表达。IL-10抑制人单核细胞上固有的和由IL-4及IFN-γ诱导的Ⅱ类MHC的表达。IL-10因此抑制IL-13诱导的Ⅱ类MHC的表达，这进一步支持了IL-10总的免疫抑制活性。

有多种细胞激活素影响单核细胞上针对IgG和IgE的各种Fc受体的表达。IFN-γ和IL-10上调CD64（FcγRⅠ）的表达，但IL-4却抑制其表达。而且，IFN-γ和IL-10能够阻止IL-4诱导CD64产生的下调作用。本文证明了IL-13抑制CD64固有的表达，并且该抑制作用也能被IL-10和IFN-γ所阻止。已证明CD64的表达与单核细胞的ADCC活性相关。

单核细胞针对IgD包被的Rh阳性红细胞所自发产生的或由IL-10或IFN-γ诱导的FcγRⅠ介导的细胞毒性受到IL-13的强烈抑制，说明IL-13不仅影响人单核细胞表型而且影响其功能。虽然IL-10能够阻止IL-13对CD64表达的下调作用，但是ADCC活性仍然受到抑制。这就支持了有关ADCC活性是由多种因素而非仅有CD64表达水平决定的观点。

IL-13也影响FcγR2和FcγR3的表达。IL-13以剂量依赖性方式下调CD32和CD16的表达。然而，IL-10而非IFN-γ能够阻断IL-13对单核细胞上CD32和CD16表达的下调作用。这些结果表明细胞激活素高度调节Fc受体的表达水平。

IL-4是唯一已知诱导单核细胞上对IgE（CD23）低亲和力Fc受体的细胞激活素。然而，IL-13也诱导单核细胞上CD23的表达。已证明IFN-γ能够部分抑制IL-13诱导的CD23的表达。也证明了IL-13能诱导PBMC产生Ig。另外，当由γ细胞克隆、T细胞膜或CD40配基提供的第二信号存在时，IL-13能够启动在纯化的sIgM⁺B细胞中菌系ε转录和开通IgE产生。IgE（包括可溶性CD23）的产生受到具有增强和抑制作用的多种细胞激活素的调节。IL-13和IFN-γ对人单核细胞上CD23表达的影响非常符合此概念。

Ⅵ.IL-4拮抗剂的活性;相互作用

IL-4和IL-13是由激活的T细胞分泌的两种细胞激活素，对单核细胞和B细胞具有相似的作用。人白细胞介素-4（hIL-4）的一种突变形式竞争性地拮抗hIL-4和人白细胞介素-13（hIL-13）。IL-4和IL-13的氨基酸顺序有30%的同源性，并且圆二色性光谱学（CD）表明两种蛋白质具有高度α螺旋结构。IL-13竞争性抑制hIL-4与在hIL-4反应性细胞系上表达的功能性人IL-4受体（称为hIL-4R）结合，但不影响与在异源性细胞上表达的克隆IL-4R配基结合蛋白的结合。hIL-4与IL-4R配基结合蛋白的亲和力比功能性IL-4R的亲和性约低50倍，而突变的hIL-4拮抗蛋白都以较低的亲和力与两种受体类型结合。上述结果表明IL-4和IL-13共同享有一种对于信号传导非常重要的受体成分。此外，这些数据表明IL-4R是至少两种成分的复合体，其中一种是新的亲和力转化的亚单位，它对细胞信号传导起关键性作用。

IL-13是由激活T细胞分泌的、被称为细胞激活素的大量蛋白质激素之一。人IL-13引起人单核细胞形态和细胞表面表型的改变，并且还利于人B细胞的生长和免疫球蛋白（Ig）的产生。由激活的T细胞分泌的另外一种蛋白质激素hIL-4也产生上述所有的生物作用。

IL-4的生物作用是由以高度特异性和亲和力与IL-4结合的细胞表面受体介导的[离解常数或Kd～10^-10M。参见Harada et al.，in Spits et al.（eds），IL-4∶Structure and Function，1992，CRC Press，Boca Raton，p33-54]。利用cDNA克隆已将人和小鼠IL-4R的特征定义为具有单膜跨距的130KDa的糖蛋白（本文称作IL-4R配作结合蛋白）。IL-4R配基结合蛋白的细胞外区域顺序与其它细胞激活素受体蛋白的细胞外区域具有结构同源性。

所说的其它蛋白质中的数种蛋白质参予了异侧的（heteromeric）相互作用，其中一个亚单位本身以相对低的亲和力与配基结合而其它的亚单位提供了额外的结合亲和力，这对于信号传递通常是重要的。然而，仅IL-4R配基结合蛋白的细胞外区域似乎以高亲和与IL-4结合，此为各种IL-4反应性细胞上IL-4R的特征。虽然细胞内区域对于结合并不重要，但它对于信号传导却是重要的。

许多细胞激活素受体之间的结构同源性反映在其配基之间的结构同源性上。例如，IL-4、白细胞介素-2（IL-2）、生长激素、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在顺序水平并不相关，但所有分子仍然具有一个含4个反向平行α-螺旋的相似紧密核心束结构。[如参见，Diederichs  et  al.，Science  254∶1779，1991;Bazan，Science  57∶410，1992;Mckay，Science  257∶412，1992;Powers  et  al.，Sciene  256∶1673，1992）。在小鼠IL-2方面，彻底的突变分析导致发现位于第四α螺旋之C端残基的取代（Gln141变为Asp）致使受体激活作用的丧失，但保留大部分的受体结合能力。该突变蛋白是IL-2生物作用有效的和特异竞争性的拮抗剂。

基于IL-2和IL-4之间的结构同源性，研究了可能类似于mIL-2  Gln141的hIL-4残基的重要性。在这些实验中，人IL-4（hIL-4）第四α螺旋之C端残基的取代（以Asp取代Tyr124）特异性消除IL-4R激活作用，并提供了一种竞争性拮抗IL-4生物作用的蛋白质。已单独对hIL-4、Tyr124变为Asp（称为hIL-4、Y124D）的特性进行了描述。（参见Kruse  et  al.，EMBO  J.11∶3237，1992）。这种突变的hIL-4拮抗剂缺乏与先前未知的功能性IL-4R的第二亚单位的相互作用。此外，hIL-4拮抗剂阻断IL-13的许多生物作用。

hIL-4的诱变

基于对mIL-2的诱变研究[Zurawski  et  al.，EMBO  J.9∶3899  1990;Zurawski  et  al.，EMBO  J.11∶3905，1992]、hIL-2和hIL-4共同的结构骨架[Bazan，Science  257∶410，1992;Mckay，Science  257∶412，1992;Powers  et  al.，Science  256∶1673，1992]并假定功能性重要残基进化的保守性，选择hIL-4残基E114、K117和Y124作为最可能特异性涉及受体激活的那些分子。这些位置上的取代诱变是用一个合成重建的hIL-4编码区插入pTacrbs大肠杆菌表达质粒[Zurawski  et  al.，J.Immunol.137∶3354，1986]中进行的。将与C末端编码区Sal  Ⅰ和HindⅢ识别位点之间顺序相应的并含有等摩尔被选择用于随机取代的密码子上的各种脱氧核苷酸的双链合成寡核苷酸（合成仪和试剂均来自Applied  Biosystems）与经SalⅠ和HindⅢ消化的pTac-hIL-4质粒连接。

通过转化回收重组质粒，并且测定了其SalⅠ和HindⅢ段的DNA顺序（Sequenase  2.0kit，US  Biochemical  Corp.）。除了再折叠缓冲液含有还原的和氧化的谷胱甘肽并且用TF-1细胞进行测定外，均按对mIL-2蛋白质所述的方法[Zurawski  et  al.，EMBO  J.8∶2583，1989]，制备部分纯的突变hIL-4蛋白质。发现在Y124上的取代产生部分激动蛋白质，而Y124D取代在细胞激活方面存在最严重的缺陷。在这项工作过程中，Kruse等人（同上文）获得了类似的观察结果，他们也证明hIL-4.Y124D和hIL-4对hIL-4R具有相似的亲和力。

为了生产纯的hIL-4.Y124D，利用下列寡核苷酸将pTrpC11-hIL-4大肠杆菌表达质粒进行PCR（Geneamp  kit，Perkin  Elmer  Cetus）：

CTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTT（最接近编码区中的单一PstⅠ限制性位点）和TTGATTAAGCTTTCAGCTCGAACACTTTGAATCTTTCTC（在对应于含有残基124GAT密码子的C末端编码区的划线部分之前是一个HindⅢ识别位点）。用PstⅠ和HindⅢ裂解PCR产物和pTrpCll-hIL-4质粒，并进行连接，采用前述的方法（Zurawski  et  al.，EMBO  J.8∶2583，1989）通过转化和顺序分析来回收和证实pTrpCll-hIL-4Y124D质粒。在hIL-13的上述位置发生的相应变化也具有IL-13拮抗剂的作用。

蛋白质纯化

如前所述来纯化大肠杆菌衍生的hIL-4[van  Kimmenade  et  al.，Eur.J.Biochem.173∶109，1988]，人白细胞介素-1α（hIL-1α;Kronheim  et  al.，Bio/Technology  4∶1078，1986）和mIL-13。将含有pTrpCll-hIL-4.Y124D质粒的大肠杆菌K12细胞（CQ21株）在12升L-肉汤培养基中（含有50μg/ml氨苄青霉素）置于G53旋转摇床上（New  Brunswick  Scientific）以200rpm转速于37℃下生长过夜来制得hIL-4Y124D。用RC-3离心机（所有转子为Sorvall）以4500rpm转速、于4℃下离心10分钟来收获细胞。以200rpm转速振摇15分钟使细胞团丸重新悬浮于450ml  TE缓冲液中（50mM  Tris-HCl  pH8，1mM  EDTA）。经4次通过冰冷的微型流化110型细胞破碎器（Microfluidics）来破碎细胞。

用GS-3转子以9000rpm转速于4℃下离心40分钟来收集包含体。然后经重新悬浮于450ml  TE中而洗涤团丸，并加入Triton-X-100使最终浓度为0.5%。样品在室温下保持30分钟，然后再用GSA转子以8500rpm转速于4℃下离心10分钟而成团丸。将该包涵体重新悬浮于60ml  5M胍-HCl的PBS（120mM  NaCl，2.7mM  KCl，10mM  NaPi  pH7.4）、2mM还原的谷胱甘肽和0.2mM氧化的谷胱甘肽液中，并用SS-34转子以20，000rpm转速于4℃下离心30分钟除去任何其余的不溶物。

将上清液用不含盐酸胍的相同缓冲液稀释10倍，并于4℃下缓慢搅拌过夜以使产生重折叠和氧化作用。然后利用装有切线流式超滤盒（具有10KDa的排阻作用）的Millipore  Pellicon装置（Millipore）进行浓缩并交换到100ml  50mM乙酸钠（pH5.0）中。将该样品在相同的缓冲液中经0-0.7M  NaCl梯度洗脱进行阴离子交换色谱（CM琼脂糖16/100柱，Pharmacia）。收集含有hIL-4蛋白质的馏份，并以溶于0.1%三氟乙酸/水中的0-50%乙腈梯度液洗脱进行反相色谱（Poros  R  10/100柱，Perseptive  Biosystems）。冻干含有hIL-4的馏份，溶于50mM乙酸钠pH5.0，并采用以鸡卵溶菌酶（Sigma）作为标准物的染色SDS-PAGE之光密度分析法（Molecular  Dynamics）进行定量。

细胞增殖测定

比色细胞增殖测定用人TF-1细胞系（30，000细胞/孔）进行3天并根据Mosmann所述方法（J.Immunol.Methods  65∶55，1983）来完成。在含有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（JRH  Biosciences）、0.5mM  β-巯基乙醇（Sigma）的RPMI培养基中测定细胞。将细胞保存在含有1nM  hGM-CSF（Schering-Plough）的上述培养基中。

通过将外周血单核细胞（10⁶细胞/ml）与0.1mg/ml植物血凝素（Wellcome Diagnostics）在添加了1%人AB⁺血清的Yssel培养基[参见Yssel et al.，J.Immunol.Methods 72∶219，1984]中置于24孔Linbro板中（Flow Laboratories）保温来制备PHA胚细胞，并在保温6天后用于增殖测定。SP-B21是具有未知抗原特异性的CD4⁺克隆T细胞系，并按以前描述的方法[Spits et al.，J.Immunol.128∶95，1982]来培养。PHA胚细胞和SP-B21细胞的增殖反应以5×10⁴细胞/孔来测定，并按描述TF-1细胞的方法，3天后进行比色显色。

配基结合

Zurawski等人（Zurawski  et  al.，EMBO  J.11∶3905，1992）已描述过细胞制备、游离配基中结合细胞的分离、计算机分析和定量分析的方法。除了用小鼠白细胞介素-3（IL-3，100U/ml）代替hGM-CSF并加入50μg/ml硫酸庆大霉素（Sigma）和800μg/ml新霉素G418（Schering-Plough）外按照描述TF-1细胞的方法培养表达表面hIL-4R-S蛋白（缺失大部分细胞内区域的hIL-4R配基结合蛋白）的Ba/F3细胞。

大肠杆菌衍生的hIL-4的¹²⁵Ⅰ放射性标记和结合条件如Harada等人所述（Harada et al.，J.Biol.Chem.267∶22752，1992）。

圆二色光谱法

在J720分光光度计上用450W氙灯和J700数据分析软件（Jasco）检查hIL-4、hIL-1α和mIL-13蛋白质的二级结构特征。将样品对20mM  NaPi，pH7透析。借助于在入6分光光度计（Perkin-Elmer）上的UV吸收扫描重新测定样品中的蛋白质浓度。280nm处的最大吸收度用于以已知分子量和预测残余吸收度分布为基础的理论消光系数计算蛋白质含量。将在0.2mm光程长度测定池中的样品稀释为0.2mg/ml。

近UV范围的典型描述参数是以10mdeg灵敏度和时间常数为2秒的50nm/分扫描速度的0.1nm逐步溶解的连续波长扫描，增加的信噪比是4次累积/扫描的平均值。设置磷酸盐缓冲液空白并从随后的蛋白扫描中减去，利用J700数据分析软件对光谱作降噪处理。

突变的hIL-4拮抗剂阻断IL-13对TF-1细胞的作用

在寻找突变的hIL-4拮抗剂时注意到，在hIL-4残基Tyr124处发生Asp取代导致受体激活作用的丧失但不明显失去受体结合能力。由这些特性预料，hIL-4.Y124D是一种天然hIL-4作用于TF-1细胞的竞争性拮抗剂。TF-1是一种人前髓样红白血病细胞系，该细胞系显示对各种人蛋白激素的生长的反应，所说激素例如GM-CSF、白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-4和人与小鼠IL-13。TF-1细胞对这些因子最强的反应变化很大，但对IL-4和IL-13最大的生物学反应相似。hIL-4.Y124D不影响TF-1对GM-CSF、IL-3或IL-6的反应。相反，hIL-4.Y124D是mIL-13和hIL-13两者作用于TF-1细胞的有效的拮抗剂。hIL-4.Y124D等效对抗hIL-4、mIL-13和hIL-13对TF-1细胞的活性，并以剂量依赖性方式进行抑制。

IL-13竞争性抑制hIL-4与TF-1细胞结合

因为hIL-4.Y124D通过竞争性地抑制hIL-4与IL-4R的结合而拮抗hIL-4，所以可假定其对抗IL-13的作用具有类似的机理。hIL-4.Y124D对抗IL-13的这种作用方式会揭示IL-4R和IL-13R两者间的共性。这一点通过比较hIL-4和mIL-13竞争性取代与TF-1细胞结合¹²⁵I-hIL-4的能力来测试。hIL-4以抑制50%所需浓度（或IC₅₀）～2×10^-12M完全对抗¹²⁵I-hIL-4与TF-1细胞的结合。mIL-13也竞争¹²⁵I-hIL-4的结合。然而，与hIL-4相比，mIL-13不能完全取代¹²⁵I-hIL-4的结合（约取代结合的70%）并且其IC₅₀值（2×10^-10M）较高。

IL-13不与IL-4R配基结合蛋白结合

IL-4R和IL-13R之间具有共性的可能基础是两者相同。这一点通过比较hIL-4和mIL-13竞争性取代I¹²⁵-hIL-4与在小鼠前B Ba/F3细胞上表达的克隆hIL-4R配基结合蛋白之衍生物结合的能力来测试。使用缺失了大部分胞质区域的hIL-4R配基结合蛋白的形式的Ba/F3 hIL-4R-S细胞，该细胞具有大量的结合位点/细胞（～2000）（参见Harada et al.，J.Biol.Chem.267∶22752，1992）。虽然hIL-4（IC₅₀≈2×10^-10M）完全竞争¹²⁵I-hIL-4与Ba/F3 hIL-4R-S细胞结合，但甚至更高水平的mIL-13（10^-6M）也不能竞争。某些hIL-4反应性细胞类型不对IL-13发生反应

如本文所述，IL-13生物活性的最早期特征已显示细胞对IL-4和IL-13的反应相一致。用植物血凝素（PHA）激活的人外周血单核细胞（PBMNC）和某些人T细胞克隆细胞系（如SP-B21）在对hIL-4产生应答中增殖。这些hIL-4反应的细胞类型在对hIL-13产生应答中都不增殖。

hIL-4.Y124D和hIL-4的结合特性

hIL-4与Ba/F3 hIL-4R-S细胞的结合（Kd＝1.6×10^-10M）和先前描述的高亲和力IL-4R（Kd≈10^-10M）十分一致。人淋巴瘤Raji细胞具有对hIL-4的高亲和性结合位点（Kd≈10^-10M;参见Kruse et al.，文献同上），而与hIL-4相比，hIL-4.Y124D蛋白质仅以低3倍的亲和力与这些细胞结合。hIL-4.Y124D以足以低3.5倍的亲和力与在Ba/F3 hIL-4R-S细胞上表达的hIL-4结合位点结合。

TF-1细胞以一个比hIL-4与Ba/F3  hIL-4R-S细胞“高亲和性”结合高约50倍的表现亲和力与hIL-4结合。这是非常意外的，因为虽然平行地进行了比较并使用了相同的条件和试剂，但是已经报导这两种细胞类型具有按平衡结合研究所定义的对hIL-4类似数量的结合位点和亲和力。与通过竞争性取代结合研究所观察到的对hIL-4的不同结合亲和力相反，hIL-4.Y124D与TF-1和Ba/F3hIL-4R-S细胞都具有相同的结合。在其它的实验中，hIL-4.Y124D用作被标记的配基，并且所得结果是相似的。

IL-4和IL-13结构同源

IL-4R和IL-13R之间的共性促使对IL-4和IL-13序列的相关性进行周密检查。仅检查了成熟的人和小鼠IL-4和IL-13蛋白质的顺序，同时假定IL-4中的已知二硫键在IL-13中保守。尽管在IL-4和IL-13之间具有低的（30%）序列同源性，这仍具有重要意义。当考虑hIL-4的已知的结构特征时，就增强上述观察的意义。给hIL-4提供疏水性结构核心的所有25个残基是保守的或者说在IL-13中具有保守的疏水性取代。除了一个例外，IL-4和IL-13之间广泛性插入/缺失的区别被限制为连接4个α-螺旋或2个短的β-链的环。所说的例外是一个缩短的α-螺旋C，尽管提供结构核心的α-螺旋C残基仍然保留于IL-13中。

与β-链的hIL-1α不同，小鼠IL-13具有一个特征性的高度α-螺旋蛋白质（如hIL-4）的CD吸收光谱（参见Johnson，Ann.Rev，Biophys.Chem.17∶146  1988）。

两种细胞激活素的相似性使得能够改变两者之一对另外一种细胞激活素相似特性的影响。因此，用IL-4拮抗剂的受体探讨IL-4拮抗剂的机理将可能在用其受体调节IL-13中是有用的。尤其是，本研究提供了希望导致IL-13拮抗剂的IL-13分子中的位置。而且，期望所描述的IL-4受体在保留其IL-13拮抗剂活性的同时能够进行修饰。这将揭示IL-4拮抗剂的缩短在维持其拮抗剂功能的同时是有用的。尤其是，揭示细胞激活素的特异性区域对于进行修饰以达到所需的生物活性是有用的。

IL-13和IL-4受体具有功能相关性

hIL-4.Y124D拮抗剂竞争性抑制hIL-4和IL-13两者对TF-1细胞的生物作用，这一观察结果表明了IL-4R和IL-13R之间的相互关系。mIL-13对抗¹²⁵I-hIL-4与TF-1细胞结合的能力证实了IL-4R和IL-13R之间的共性。从已知由hIL-4和IL-13诱发的相似生物反应以及或许从IL-4和IL-13基因在人和小鼠中的密切联系也已经可以预料到这种相关性（如参见Morgan et al.，Nucleic.Acids Res.20∶5173（1992），和本文的其它实验）。对上述观察结果的直接解释是IL-4和IL-13通过相同的受体起作用。

然而，某些对IL-4发生反应的细胞类型并不对IL-13发生反应。这是IL-4R和IL-13R为不同整体的初步证据。这并不排除IL-13是一种弱的IL-4的部分激动剂的可能性以及仅具有IL-4R运载细胞的亚群能够有效地扩增由IL-13结合IL-4R产生信号的可能性。三个方面的证据有助于解决关于IL-4R和IL-13R的难题。

首先，IL-13不能对抗¹²⁵I-hIL-4与仅载有hIL-4R配基结合蛋白质的细胞结合。该结果证明hIL-4R配基结合蛋白本身不是IL-13R。其次，两种T细胞类型对hIL-4起反应而不对hIL-13起反应。如果hIL-13是通过hJIL-4R起部分激动剂的作用，那么hIL-13将竞争性拮抗hIL-4对这细胞的作用。这并不是已被检测的一种hIL-4反应性T细胞系统中的情况。第三，如果hIL-13是通过hIL-4R起部分激动剂的作用，那么hIL-13应当能够完全对抗hIL-4与所有载有hIL-4R的细胞类型的结合。然而，IL-13仅部分对抗¹²⁵I-hIL-4与TF-1细胞的结合。

由上述三个方面的证据所得的结论是IL-13不是IL-4的部分激动剂，并且IL-4R和IL-13R是不同的。在TF-1细胞上，mIL-13竞争hIL-4的结合并且hIL-4.y124D拮抗IL-13的作用。由这些数据得出了进一步结论即IL-4R和IL-13R具有共同的功能上重要的受体成分。该结论与IL-4R配基结合蛋白质本身具有IL-4R全部的功能特性的说法恰好相反。寻找与IL-4R配基结合蛋白质相关的蛋白质的研究提示IL-4R的复杂性。而且，可溶性天然小鼠IL-4R配基结合蛋白质的动力学研究表明与膜结合的功能性IL-4R/IL-4复合物比可溶性IL-4R/IL-4更稳定。

功能性IL-4R含有增强亲和性、有助于传导信号并与IL-13R共有的另外的亚单位

由受体结合分析所获的两个结果表明TF-1细胞上的IL-4R为复合物并能够以比以前所认为的更高的亲和力状态存在。首先，hIL-4对TF-1细胞上的hIL-4R的表现亲和性比其对Ba/F3 IL-4R-S细胞上克隆的hIL-4R配基结合蛋白的表现亲和性约大50倍。在Ba/F3IL-4R-S细胞上hIL-4结合位点为在许多细胞类型中存在的典型的“高亲和性”IL-4R。所估算的hIL-4对hIL-4R结合的解离常数普遍地有所不同，但都在Kd～10^-10M的5倍范围内。

由于实验为平行的、独立重复的、使用相同的试剂和有类似IL-4R数目的细胞并应用不同标记的配体得出类似的结果，所以TF-1细胞上所测出的hIL-4结合的“高亲和性”应是有意义的。其次，当其以稍降的亲和性与在Ba/F3细胞上表达的IL-4R配基结合蛋白结合时，hIL-4.Y124D以比hIL-4低约50倍的亲和性与TF-1细胞上的IL-4R结合。实质上，此结果提供了一种内部对照物以证实在TF-1细胞上测出的hIL-4结合的“高亲和性”。由于hIL-4R配基结合蛋白质的cDNA是从TF-1细胞中克隆的，因而用异常的IL-4R配基结合蛋白解释上述结果是不可能的。

能解释上述观察结果的模型是TF-1细胞上功能性IL-4R是一种IL-4R配基结合蛋白质和附加的一种（或几种）能够增强IL-4R配基结合蛋白质对IL-4亲和性的成分的复合物。此附加的成分也与仅在IL-4反应性细胞子集上存在的形成IL-13R的IL-13配基结合蛋白相关联。进一步来说，hIL-4.TYR124残基与此成分的相互作用对产生的信号传导是必要的。

然而，不能诱导这种产生的信号传导的hIL-4.Y124D维持IL-4配基结合蛋白和此附加的成分之间的联系。在该模型中，hIL-4.Y124D通过竞争IL-4结合位点拮抗hIL-4的作用，但是它是通过形成非生产性的hIL-4R/hIL-4.Y124D复合物将此附加的成分与IL-13R复合物隔绝的方式来拮抗IL-13的作用。

过去未正确定义IL-4R以及对新试验模型的建议

有两个因素是过去没有认识到在TF-1细胞上检测的IL-4R“高亲和性”状态的原因。首先，现在已知hIL-4，Tyr124残基的完整性对这种“高亲和性”结合是非常重要的（这对于mIL-4的类似的Tyr119残基也是这样，在该残基处以Asp取代会产生mIL-4生物作用的强的竞争性拮抗剂）。标准的放射标记IL-4的方法是通过Tyr残基的碘化作用进行的。在hIL-4上只有两个Tyr残基，因此标记的hIL-4转化Tyr124为碘酪氨酸是可能的。

的确，以Bolton-Hunter试剂标记的hIL-4.Y124D结合的有效性较hIL-4小3倍。有可能hIL-4.Y124碘Tyr降低功能性IL-4R的亲和性，并且用这种试剂在直接结合实验中所产生的亲和力常数有可能低估了IL-4R对IL-4的实际亲和力。这不是用hIL-4.Y124D碘Tyr作为标记配基和天然hIL-4作为“冷”竞争物的实验中的问题。可妨碍对IL-4R的两种亲和状态发现的第二个因素是两个亲和力之间仅相差约50倍。因此，如果细胞有以两种状态存在的IL-4R混合物，或者如果“低亲和性”状态占优势，那么用常规方法分别识别两种亲和性会是不可能的。hIL-4R亚单位特异缺陷的hIL-4.Y124D是一种用于分解hIL-4R复合体的强效新试剂。

对IL-4反应性细胞类型在IL-4R组成上不同的观点正在进行试验。该模型的其它直接试验将需要通过结合分析、交联研究和克隆的方法获得IL-13R配基结合蛋白质的分子特征。然而，还没有发展出可直接定义IL-13R特征的试剂。已在人淋巴细胞上测出的很低亲和性（Kd≈3×10^-8M）IL-4结合位点可能是附加的IL-4R成分的特征。

其它细胞激活素受体中的共同亚单位

在IL-4R和IL-13R之间共同存在的功能性重要的受体成分的分子属性是不清楚的。解释我们的数据的以上模型是基于其它亲和力调节蛋白质的存在，该蛋白质是某些功能性细胞激活素受体间共有的专性成分。此共有的成分已在IL-6、oncostatin-M、白血病抑制因子和睫状嗜中性因子的受体中发现，均为gP13。[参见Kishimoto  et  al.，Science  258∶593（1992）]，以及人IL-3、白细胞介素-5（IL-5）和GM-CSF受体中共有的成分也已被发现，均为βc蛋白质[Miya-jima  et  al.，Trends  In  Biochemical  Sciences  17∶378（1992）]。

此共有的βc受体亚单位可解释IL-3，IL-5和GM-CSF与某些细胞类型结合所观察到的交叉竞争作用。当在TF-1细胞上进行测定时，hIL-4.Y124D不拮抗hIL-6、小鼠白血病抑制因子、hIL-3或hGM-CSF的生物学活性，而hIL-6或hGM-CSF都不竞争hIL-4的结合。所以，gP130或βc蛋白既不是附加的IL-4R成分的侯补物，也不是IL-4R和IL-13R间共有的成分。

在其共同的遗传学定位/结构和在蛋白质结构相关的基础上，已建议，IL-4、IL-3、IL-5和GM-CSF构成一个蛋白质家族（参见Boulay  et  al.，J.Biol.Chem.267∶20525，1992）。有关IL-4和IL-13间共性的生物学数据表明IL-13也属于这个家族。然而，有力的数据支持在IL-4/IL-13和IL-3/IL-5/GM-CSF受体间具有一种清楚的分功。例如，注意到在TF-1上hIL-4.Y124D对IL-3或GM-CSF反应没有影响。而且，在TF-1细胞中，由IL-3/GM-CSF诱导的细胞内酪氨酸-磷酸化作用的方式不同于IL-4所诱导的。

在体内联合拮抗IL-4和IL-13应答的含意

hIL-4.Y124D拮抗剂对抗hIL-4和hIL-13生物学反应的能力应当引起hIL-4.Y124D治疗潜在性的重新评价。这些结果表明，不象可溶性IL-4R配基结合蛋白或抗IL-4抗体，hIL-4.Y124D不是一种特异的hIL-4作用的拮抗剂。抑制剂IL-4的变异体已经揭示了在IgE介导的疾病治疗中可作为潜在有用的药物。由hIL-4.Y124D拮抗hIL-4和hIL-13应答来治疗各种疾病的可能性是存在的。IL-4和IL-13间结构的同源性和IL-4R和IL-13R共有的受体亚单位揭示特定的具有α-螺旋D的IL-13残基对受体的信号传递是特别重要的并且这些残基上的取代可产生IL-13变异体，即为拮抗剂。这些结果也预示此IL-13拮抗剂将是对抗细胞类型（也对IL-13应答）对IL-4产生应答的有效拮抗剂。

对其它IL-13活性的拮抗作用

高度纯化的B细胞和用400U/ml  IL-4激活的T细胞克隆共同培养的结果表明使用10μG/ml的IL-4拮抗剂对IgE合成的抑制作用。参见表16和17，按以上对IgE合成中所描述的方法进行测定。

表16：IL-4、IL-13和IL-4-突变蛋白质对IgE合成的诱导作用

IgE合成(ng/ml)

培养基  <0.2

IL-4(200U/ml)  173±45

IL-13(200U/ml)  110±42

IL-4拮抗剂(Y.124,1mg/ml)  13±6

模拟对照  <0.2

表17：IL-4突变蛋白质抑制IL-4诱导的由PBMC合成IgE

IgE合成（ng/ml）

培养基  <0.2

IL-4(500U/ml)  265±49

IL-4(500U/ml)+Y.124(0.003mg/ml)  108±60

IL-4(500U/ml)+Y.124(0.03mg/ml)  12±5

IL-4(500U/ml)+Y.124(0.3mg/ml)  12±3

IL-4(500U/ml)+Y.124(3mg/ml)  5±2

IL-4(500U/ml)+模拟对照  194±46

在IL-4或IL-3存在下，IL-4拮抗剂象Y124一样也有效地抑制由抗CD40mAb刺激的纯化人B细胞的增殖。IL-13拮抗剂可具有类似的作用。因此，给予IL-4和IL-13拮抗剂可提供不仅抑制IgE合成而且也阻止IgE产生细胞的扩增的优选方法。

Ⅶ.人IL-13的抗体

按标准方法诱生抗大肠杆菌衍生的人IL-13的大鼠多克隆抗血清（如参见，Harlow ＆ Lane（1989）或Coligan（1991和增补））。由这些大鼠中获得的血清在免疫沉淀表达IL-13 COS7细胞的³⁵S-甲硫氨酸标记的上清液中是有用的。

采用标准的方法来生产抗hIL-13的单克隆抗体。将大鼠用大肠杆菌产生的hIL-13进行免疫。试验四种不同的单克隆抗体在由COS产生的hIL-13或由大肠杆菌产生的hIL-13刺激的TF-1细胞上的中和能力。将TF-1细胞（5，000细胞/孔）与1∶100稀释的COS产生的hIL-13或5ng/ml大肠杆菌产生的hIL-13和含有大鼠抗hIL-13单克隆抗体上清液的稀释液保温72小时。72小时后，通过alamar蓝染色来确定细胞生存力。

为了确定以上脾-杂交瘤融合的哪些单克隆抗体与由COS或大肠杆菌产生的hIL-13结合，进行间接的ELISA。将PVC微量板用0.5μg/ml大肠杆菌产生的hIL-13或1∶15稀释的COS产生的hIL-13的PBS液在37℃下包被两小时。使用标准的ELISA技术方案。观察在两种情况下的特异性结合。

不脱离本发明精神和范围，本发明能作许多改进和变化，因为这对于本专业技术人员来说是显而易见的。本文所描述的具体的实施方案仅通过实施例的方法来提供，因而本发明仅是由附加的权利要求的词意来限定的。

顺序表

（1）概况：

（ⅰ）申请人：

（A）姓名：先灵公司

（B）街道：One  Giralda  Farms

（C）城市：Madison

（D）州：新泽西

（E）国家：美国

（F）邮编：07940-1000

（G）电话：201-822-7375

（H）传真：201-822-7039

（I）电传：219165

（ⅱ）发明名称：人白细胞介素13

（ⅲ）顺序数：6

（ⅳ）计算机可读形式

（A）介质类型：软盘

（B）计算机：Apple  Macintosh

（C）操作系统：Macinotsh  6.0.5

（D）软件：Microsoft  Word  5.1a

（ⅴ）现申请的资料：

（A）申请号：

（B）申请日：

（ⅵ）在先申请的资料：

（A）申请号：US  08/012543

（B）申请日：01-02-1993

（ⅵ）在先申请的资料：

（A）申请号：US  08/010977

（B）申请日：29-01-1993

（ⅵ）在先申请的资料：

（A）申请号：US  07/933416

（B）申请日：21-08-1992

（2）SEQ  ID  NO∶1的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：1290  bp

（B）类型：核酸

（C）股数：双

（D）拓扑结构：线型

（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO∶1：

（2）SEQ  ID  NO∶2的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：132氨基酸

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑结构：线型

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）SEQ  ID  NO∶2的顺序描述：

（2）SEQ  ID  NO∶3的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：1212  bp

（B）类型：核酸

（C）股数：双

（D）拓扑结构：线型

（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO∶3：

（2）SEQ  ID  NO∶4的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：131氨基酸

（B）类型：氨基酸

（D）拓扑结构：线型

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO∶4：

（2）SEQ  ID  NO∶5的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：35  bp

（B）类型：核酸

（C）股数：1股

（D）拓扑结构：线型

（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO∶5：

ACAGCTCGAG  CCATGGTGTC  TTTGCCTCGG  CTGTG  35

（2）SEQ  ID  NO∶6的信息：

（ⅰ）顺序特征：

（A）长度：36  bp

（B）类型：核酸

（C）股数：1股

（D）拓扑结构：线型

（ⅹⅰ）顺序描述：SEQ  ID  NO∶6：

GTAGCTCGAG  CTCACCGGGA  CTTTAAACCA  CAGATG  36

Claims (11)

1、具有由 SEQ IDNO∶2所定义的氨基酸顺序的人 IL-13。

2、一种药用组合物，含有一种药用可接受的载体和一种有效量的、具有由SEQ  ID  NO∶2所定义的氨基酸顺序的人IL-13。

3、一种制备药用组合物的方法，包括将一种药用可接受的载体和一种有效量的、具有由SEQ  ID  NO∶2所定义的氨基酸顺序的人IL-13进行混合。

4、一种抗人IL-13的抗体，其中所说的人IL-13具有由SEQ  ID  NO∶2所定义的氨基酸顺序，优选的是一种单克隆抗体。

5、一种用于抑制向IgE或IgG4抗体同种型开通的药用组合物，包括一种药用可接受载体和一种有效量的IL-13的拮抗剂。

6、一种制备用于抑制向IgE或IgG4抗体同种型开通的药用组合物方法，包括将一种药用可接受载体和一种有效量的IL-13的拮抗剂进行混合。

7、IL-13的拮抗剂用于抑制向IgE或IgG4的抗体同种型开通。

8、IL-13的拮抗剂用于制备抑制向IgE或IgG4抗体同种型开通的药用组合物。

9、如权利要求5-8中任一种药用组合物、方法或用途，其中拮抗剂是抗IL-13的抗体，优选的是单克隆抗体。

10、如权利要求5-9中任一种药用组合物、方法或用途，其中抗体同种型开通的抑制作用导致IgE抗体水平的隆低。

11、如权利要求5-10中任一种药用组合物、方法或用途，其中拮抗剂是人IL-13的拮抗剂。