CN1317301C - Il－2－和il－15－介导的t细胞应答的调节 - Google Patents

Il－2－和il－15－介导的t细胞应答的调节 Download PDF

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Abstract

本发明部分是基于对体内周期性T细胞的IL-2和IL-15受体亚基的表达研究。在一项实施方案中，本发明涉及一种IL-2和IL-15拮抗剂的新型组合物，以及通过这些拮抗剂给药抑制免疫应答的方法。每种情形下，通过给予靶向IL-15分子或IL-15受体(IL-15R)的第一制剂，和靶向IL-2分子或IL2受体(IL-2R)的第二制剂来实现抑制。一般地说，本发明涉及一种新的组合制剂，当对患者给药(或体外移植物)时能减少抗原反应T细胞数量。例如，本发明的涉及一种包括两种或多种制剂的组合物(例如，药学上可接受的组合物)，其中每一种都能促进T细胞死亡。此外，这种组合物包含至少一种促进T细胞死亡的制剂，和至少一种抑制T细胞增殖的制剂。这种促进T细胞死亡的制剂能促进AICD(激活诱导细胞死亡)、被动细胞死亡、ADCC(依赖抗体细胞介导的细胞毒性)或CDC(补体主导细胞毒性)。

Description

IL-2-和IL-15-介导的T细胞应答的调节
本申请要求2000年9月14日提交的U.S.S.N.60/232,251的权利。
技术领域
本发明涉及免疫学、移植排斥和与免疫系统有关的疾病。
                    联邦商业研究
本文描述的工作部分上得到国家卫生研究所的授权。因此，美国政府对本发明有某些权利。
                        背景
两种白细胞介素，IL-2和IL-15，在体外刺激T细胞增殖的功能中是多余的。然而，它们在体内初次免疫激活和免疫稳态的作用还是不太清楚。在体内，IL-2和IL-15具有不同的功能且调节T细胞激活的不同方面。例如，IL-2能最初激活T细胞产生细胞凋亡(Lenardo，Nature 353：858-861，1991)，而IL-15能支持细胞存活(Dooms等，J.Immunol.161：2141-2150，1998；Bulfone等Nature Medicine 3：1124-1128，1997)。IL-15还显示推动记忆型CD8+T细胞的增殖，而IL-2限制它们的连续扩增(Ku等，Science288：675-678，2000)。此外，IL-2缺失小鼠的表型是淋巴组织增生性和自身免疫(Horak等，Immunol.Rev.148：35-44，1995)，而IL-15缺失小鼠在某种程度上是淋巴细胞减少、且不能对病毒攻击产生初次免疫反应(Kennedy等，J.Exp.Med.191：771-780，2000；Lodolce等，Immunity 9：669-676，1998)。用于这种触发双歧分枝的分子机理仍然是费解的。
IL-2和IL-15的功能受体包括一个各自独立的α链，该链决定了IL-2和IL-15的结合特异性，他们还包括共同的IL-2受体β和γ链。γ链还是IL-4，IL-7，和IL-9受体的关键信号组成部分(Sugamura等，Ann.Rev.Immunol.14：179-205，1996)。在淋巴区，这些受体亚基可以分别或以各种组合方式表达，以致形成了各种具有不同亲和性和/或不同信号传导能力的受体(Sugamura等，supra)。例如，β链可择一地与α链或γ链结合，形成二聚结构，或者与α链和γ链一起结合形成三聚结构。同样地，γ链可与β链互相作用，并且通过β链，和IL-2受体或IL-15受体的α链中的一条相互作用。与IL-2受体α链相比，单独的IL-15受体α链可以高亲和性地与IL-15结合(Giri等，EMBO J.14：3654-3663，1995)。然而，类似于IL-2受体α链，不认为这种相互作用会引发信号传导。因此，α、β和γ链亚基的三聚体对于IL-2和IL-15的高亲和性受体的功能完整性是必需的。
体外研究已经显示，激活的T细胞能表达IL-2受体α链和IL-15受体α链(Chae等，J Immziiiol.157：2813-2819，1996)，并且β和γ链由激活的T细胞表达(Ishii等，Int.Immunol.6：1273-1277，1994)。此外，免疫激活期间，在体内易于检测到IL-2和IL-15(Li等，J.Immunol.161：890-896，1998)。因此，激活的T细胞如何区别IL-2、IL-15和其它依赖γ链的细胞因子是不清楚的。
概述
本发明部分上是基于对体内循环T细胞表达IL-2和IL-15受体亚基的研究。令人惊奇地，这些亚基以选择性的方式直接激活T细胞对IL-2或IL-15的应答，因此调节体内的T细胞应答。换言之(相对于IL-2和IL-15多余的传统知识)，在控制体内T细胞增殖中，IL-2和IL-15起到不同的作用。尤其，IL-15对于引发T细胞分裂是关键的，而IL-2经γc表达的下游调节(down-regulation)控制T细胞扩增。相应地，在一项实施方案中，本发明提供了IL-2和IL-15的新型组合拮抗剂和通过这些拮抗剂给药抑制免疫应答的方法。在每个场合中，采用拮抗IL-15分子或IL-15受体(IL-15R)的第一制剂，和拮抗IL-2分子或IL2受体(IL-2R)的第二制剂给药的方式来产生抑制。在另外的实施方案中，本发明的组合物包括(代替，或除上述的制剂以外)，抑制编码白细胞介素(例如，IL-2或IL-15)或编码白细胞介素受体(例如，IL-2或IL-15受体)的核酸(例如，DNA或RNA)表达的制剂。
一般地说，本发明涉及新的药剂组合物，当对患者给药时可减少抗原反应性T细胞的数量。例如，本发明涉及包括两种或更多制剂的组合物(例如，药学上可接受的组合物)，其中每种制剂都可促进T细胞死亡。另外，这种组合物也可包括至少一种促进T细胞死亡的制剂和至少一种抑制T细胞增殖的制剂。促进T细胞死亡的制剂能促进AICD(激活诱导的细胞死亡)、被动细胞死亡、ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或CDC(补体主导的细胞毒性)。
促进AICD的制剂包括IL-2和相关分子(例如，IL-2/Fc或其它起IL-2或IL-2受体激动剂作用的分子(例如，特异性结合IL-2受体的抗体和模拟受体天然配体的抗体))。另一种促进AICD的制剂是Fas配体(FasL)。促进被动细胞死亡的制剂包括拮抗IL-15(通过靶向，例如，结合，藉此抑制IL-15和IL-15受体的活性，或者一旦结合受体立即激活胞内信号通道的成分)的制剂，或者T细胞存活需要的任何其它的因子(例如，IL-4，IL-7，OX-4配体，IFN-β，4-1BB，或IGF-I)。在其它实施方案中，本发明的组合物包括(代替，或除一种或多种上述的制剂之外)，抑制编码白细胞介素(例如，IL-2或IL-15)或编码白细胞介素受体(例如，IL-2或IL-15受体)的核酸(例如，DNA或RNA)表达的制剂。
将T细胞暴露在可结合T细胞表面且含有激活ADCC或CDC的Fc部分的制剂中，则可促进ADCC或CDC。更特别地，促进ADCC或CDC的制剂包括含白细胞介素(例如，IL-2或突变体IL-15)和Fc区(例如，IL-2/Fc)以及抗体或结合白细胞介素受体(例如，IL-2或IL-15受体)的其它含Fc蛋白的融合蛋白。
如上叙述的，本发明的组合物不仅包括促进T细胞死亡的制剂，而且包括抑制T细胞增殖的制剂。抑制T细胞增殖的制剂包括雷帕霉素(Rapamycin)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)，硫唑嘌呤(azathioprine)，和任何本领域已知的并能用来防止细胞增殖的其它制剂(包括化学治疗剂)。将抑制T细胞增殖的制剂与促进AICD和刺激T细胞增殖(例如IL-2/Fc)的制剂组合使用尤其有效。例如，本发明公开了一种药学上可接受的组合物，包括IL-2/Fc(该物质，例如可促进AICD和经由ADCC或CDC的细胞裂解)，IL-15拮抗剂(该物质，例如可通过拮抗一种T细胞存活必需的因子IL-15而促进被动细胞死亡)，和雷帕霉素(它抑制T细胞增殖)。含有其它组合物制剂的组合物如下所述。
明显地，当采用两种或多种制剂时，它们不必彼此物理隔离。制剂是主要有一种功能活性(例如，通过特异结合IL-2或IL-15靶向IL-2或IL-15的抗体)的单一实体的同时，它还可以是具有至少两种功能活性(例如，IL-2/Fc，mIL-15/Fc，或抗-IL-2或抗-IL-15抗体；在这些分子中，白细胞介素介导AICD，并且该分子的Fc部分介导CDC和ADCC)的单一实体。因此，包含：(1)诱导AICD的制剂，(2)诱导CDC的制剂，和(3)抑制细胞增殖的制剂形成的组合物可能仅仅包含两种活性成分(例如，(1)IL-2/Fc分子，它诱导AICD和CDC，和(2)雷帕霉素，它抑制细胞增殖)。
本文描述的这种组合物在治疗会受益于免疫抑制的病人中有效(例如，已经接受或计划接受移植的病人；具有免疫疾病，尤其自身免疫性疾病的病人；患有癌症(例如，免疫系统癌症)的病人；或者患有移植物对抗宿主疾病(GVHD)的病人))。GVHD特征在于供体白细胞抗受体抗原的反应。这种反应在骨髓移植中特别成问题，但是还发生在整个器官移植中；存在于移植器官中的供体白细胞经常是一同移植的。
尽管本发明的组合物包含一种以上的制剂，但本发明并不限于制剂同时给药的那些方式。例如，病人在接受含IL-2拮抗剂或IL-2R拮抗剂的组合药物之前，能接受含有IL-15拮抗剂或IL-15R拮抗剂的组合物。同样地，在接受含IL-2激动剂的组合物之前，病人能接受含雷帕霉素的组合物。此外，本发明的组合物(同步或顺序施用)在其植入病人之前可用于治疗器官或细胞移植。本发明的制剂和它们的用法，进一步如下所述。
本发明使用的许多制剂具有有益的治疗特性。例如，靶向IL-15R的制剂可以是包括突变体IL-15(mIL-15)多肽的融合蛋白。这些制剂不像是致免疫的，因为通过某些残基的取代使得融合蛋白的突变体IL-15部分可不同于野生型IL-15。此外，由于mIL-15多肽能以高亲和性地结合IL-15Rα，它们能够有效地与野生型IL-15竞争受体。进一步地，本发明的制剂能够激活宿主免疫系统的成分，例如补体和吞噬细胞，它们最终介导带有制剂可结合的受体(例如，IL-2受体)的细胞的消灭(或缺失)。例如，本发明的制剂能够介导靶细胞的裂解或噬菌作用。IL-15受体(IL-15Rα)的α亚基由激活或恶性免疫细胞表达，而不是静止免疫细胞，本发明的制剂能够用于特异性地靶向已经被激活的那些细胞(例如，抗原-激活的T细胞)或已经成为恶性的那些细胞。因此，尽管T细胞代表本发明制剂的优选目标，本发明的组合物还可用于靶向其它涉及免疫疾病发病机理的细胞，例如免疫系统的其它细胞或组织的过增殖细胞。
除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有和本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。通过参考全部并入本文述及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献。
本发明的其它特征和优点从附图、详细说明书和权利要求可明显的获知。尽管类似或等同于本文描述的那些材料和方法可用本发明的实践或试验获知，优选的材料和方法如下所述。
附图说明
图1是野生型IL-15核酸序列(SEQ ID NO：1)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的图示。
图2是突变体IL-15核酸序列(SEQ ID NO：3)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的图示。在位置149编码谷氨酰胺的野生型密码子CGA以及在位置156编码谷氨酰胺的野生型密码子CAA，都已经变成编码天冬氨酸的GAC。(在成熟的IL-15多肽中，它缺少48个氨基酸的信号序列，这些位置(149和156)分别对应于位置101和108)。
图3A是在静脉内(i.v.)注射CFSE-标记的细胞3天之后，分裂宿主脾脏中的T细胞得到的IL-2受体α、β和γc链的表达图表。显示了6个实验的代表数据。
图3B是一系列通过体外分裂T细胞而描绘的IL-2受体α、β和γ链的表达的图表。用抗-CD3(2μg/ml)体外刺激CFSE标记的细胞淋巴细胞3天。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)分析细胞分裂和IL-2受体亚基表达。
图3C是在体内通过分裂T细胞而描绘的L-选择蛋白的表达图表。静脉内注射CFSE标记细胞3天之后从宿主小鼠的淋巴结收获细胞，并且用PE-抗-CD62L mAb染色。基于以同种型对照mAb染色的细胞设置象限。
图3D是一系列描写体内分裂T细胞之间IL-2受体α链差异表达的图表。体内刺激CFSE标记的细胞三天，分选第二次细胞分裂的细胞。分选过的细胞用抗-CD3和抗-CD28体外再刺激3天。通过FACS分析细胞分裂和IL-2受体α链的表达。
图4A是在静脉内注射CFSE标记细胞3天之后，通过体内分裂T细胞而描绘的一系列IL-15受体α链表达的图表。用IL-15-FLAG融合蛋白将细胞染色，接着用生物素化抗FLAG mAb和PE-链霉抗生物素蛋白染色。缺少IL-15-FLAG时的细胞染色作为对照。
图4B是显示体内分裂T细胞对IL-2和IL-15体外的不同反应的直方图。体内刺激CFSE-标记的淋巴细胞3天后，通过检查CFSE分布图分析细胞分裂。分选第二次细胞分裂的T细胞，将细胞(1×104)和IL-2或IL-15体外共培养2天。通过3H-TdR摄取测定细胞增殖。结果表示为三重测定的平均CPM±SD。
图4C是一对显示抗-CD25处理对T细胞体内分裂作用的图表。在CFSE标记的细胞静脉内注射之前，宿主小鼠立即以1mg/天腹膜内(i.p.)给予抗-CD25mAb 3天。包括作为对照的以同种型对照mAb(大鼠IgG1)治疗的小鼠。
图5A是一系列显示体内分裂T细胞细胞内IL-2染色的图表。体内刺激CFSE标记的细胞3天。从宿主脾脏收获的细胞，在有GolgiStopTM的条件下，用PMA和离子霉素(ionomycin)体外刺激4小时。接着进行细胞固定、透化和染色以便生产IL-2。包括作为对照的以同种型对照mAb染色的细胞。
图5B是显示源自IL-2缺失小鼠的CD4+T细胞的γc表达的一对图表。IL-2缺失小鼠和野生型对照小鼠的脾细胞用PE-抗-小鼠CD4mAb和FITC-抗-小鼠IL-2受体γc mAb染色。通过FACS分析CD4+T细胞的γc表达。
图5C是一系列显示抗-CD25对体内分裂T细胞中γc表达的作用效果的图表。在CFSE标记的细胞静脉内注射之前，宿主小鼠立即以1mg/天腹膜内(i.p.)给予抗-CD25mAb 3天。体内分裂T细胞中的IL-2受体β和γ链的表达在第3天测定(即，CFSE-标记的细胞注射之后3天)。也包括以同种型对照mAb(大鼠IgG1)作用的小鼠作为对照。
图5D是一系列显示体内分裂T细胞的凋亡细胞死亡的图表。体内刺激CFSE-标记的细胞3天。由宿主脾脏收获细胞且以PE-膜联蛋白V染色。由FACS分析细胞分裂和凋亡细胞死亡。
图5E是一系列显示体内分裂T细胞中胞内Bcl-2表达的图表。刺激CFSE-标记的细胞3天。由宿主脾脏收获的细胞用PE-抗-小鼠Bel-2mAb或同种型对照mAb染色。通过FACS分析细胞分裂和Bcl-2的表达。
图6是显示实验结果的直方图，其中在以各种制剂处理之后评估细胞死亡(由CTLL-2细胞释放同种型51Cr评估；参见x轴)。NP40是去污剂；IL-2/Fc是含有IL-2和IgG分子(这种分子是溶菌的)Fc区的融合蛋白；C′是大鼠补体；IL-2/FC-/-是非裂解的含IL-2-融合蛋白；且mIg是鼠免疫球蛋白。这种研究支持溶细胞IL-2/Fc裂解带有IL-2R的CTLL-2细胞的结论，但是非裂解IL-2/Fc不会。
图7是一系列的曲线图。FcRI对CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的荧光强度是在这种细胞暴露于磷酸盐缓冲盐溶液(PBS；左上)、鼠免疫球蛋白(mIgG2a；右上)、非裂解IL-2/Fc分子(IL-2/Fc-/-；左下)和含融合蛋白的裂解IL-2(IL-2/Fc；右下)之后测量。每个曲线图中，细胞数量相对于FcRJ/CHO荧光强度绘图。这种研究支持溶细胞IL-2/Fc结合FcRI的结论，但非-裂解IL-2/Fc不会。
图8是一系列显示体内CD4+(左手侧)和CD8+(右手侧)T细胞增殖反应的8个图表。细胞以CFSE标记，并且用裂解分子(IL-2/Fc)和细胞增殖剂(雷帕霉素(Rap))，或者联合的这两种制剂在体内刺激三天。作为阴性对照，一组动物不用制剂处理。通过它们的CFSE分布图分析IL-2/FC。这种研究支持雷帕霉素抑制IL-2增生信号的结论。
图9是一系列的四个图表，它们来自体内刺激CFSE-标记的淋巴细胞3天的实验。通过在未接受制剂处理(左上)、接受单独的雷帕霉素(Rap；右上)、单独的IL-2/Fc(左下)，或者雷帕霉素和IL-2/Fc(Rap+IL-2/Fc；右下)的组合处理的动物中的FACS，来评价分裂T细胞上的IL-2Rα链的表达。这种研究支持了在T细胞体内增殖早期用雷帕霉素和IL-2/Fc处理可促进IL-2R亚基表达的结论。
图10是体内刺激CFSE-标记的淋巴细胞3天且由FACS分析时获得的一对图表。在未接受处理(左手区)或接受雷帕霉素和IL-2/Fc(Rap+IL-2/Fc；右手区)处理的动物中评价膜联蛋白V在分裂T细胞(CD4+)上的表达。这种研究支持在T细胞体内增殖早期，雷帕霉素和IL-2/Fc处理能促进CD4+细胞凋亡的结论。
图11是显示在自身免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠中检查胰岛同种异体移植存活的实验结果的表格。依据初始同种异体移植功能(此栏显示的百分比表示同种异体移植功能(功能由监测血糖水平评价)小鼠)和功能移植物平均存活时间(MST)评价移植。n＝试验的动物数量。治疗如标题″治疗″下所示(还参见伴随表的图例和以下的说明)。这里呈现的结果支持雷帕霉素、IL-2/Fc和mIL-15/Fc组合治疗引起胰岛同种异体移植的长期存活的结论。
图12是表示在NOD小鼠中检查皮肤同种异体移植存活实验结果的表格。根据功能移植物的平均存活时间(MST)评价移植。n＝试验的动物数量。治疗如标题″治疗″下所示(还参见伴随表的图例和以下的说明)。这里呈现的结果支持雷帕霉素、IL-2/Fc和mIL-15/Fc组合治疗引起皮肤同种异体移植的长期存活的结论。
图13是经裂解IL-2/Fc分子、鼠免疫球蛋白(mIg)和非裂解IL-2/Fc分子治疗之后，整个时间内仍然无糖尿病的动物的％曲线图。溶细胞IL-2/Fc阻断自身免疫性，但是裂解IL2/Fc不会。
                        详细说明
当抗原或促细胞分裂原触发T细胞激活时便开始了有效的免疫应答。T细胞激活的过程中，会发生很多的细胞变化，它包括细胞因子和细胞因子受体的表达。包含于免疫应答中的细胞因子之一是白细胞介素-15(IL-15)，它是体外刺激B细胞、T细胞、天然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞增殖和分化的T细胞生长因子。在体内，这些细胞类型的增殖增强了免疫应答。包含于免疫应答中的且本文描述的另一细胞因子是IL-2。
本发明的组合物包括靶向IL-15或其受体，和IL-2或其受体的制剂，以及那些组合物用于抑制免疫应答(例如，体液或细胞免疫应答)的方法。在许多情况下，病人受益于的免疫应答的抑制，例如，在器官移植或免疫疾病的事件中，尤其是自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。其它情况下，例如选择已经变成恶性或自攻击性的免疫细胞时，积极地毁坏它们是有益的。
本发明是一种基于抑制免疫应答的新途径的发现。可通过给予组合制剂实现抑制，其中一种靶向IL-15或IL-15R，其中一种靶向IL-2或IL-2R(给药模式，包括体外治疗移植，是本领域已知的且以下进一步描述)。一般地说，人们通过激活导致激活T细胞死亡的信号通道(通过，例如，AICD)可以减少抗原反应T细胞的数量；除去细胞存活必需的因子(这种除去之后死亡的细胞称为以被动细胞死亡)；或者靶向激活细胞以便通过免疫系统的成分裂解(以这种方式死亡的细胞据称是以ADCC或CDC方式死亡)。因此，本发明的组合物包括达到这些目标之一或更多目标的制剂(即，经识别出的细胞死亡途径(例如，AICD，被动细胞死亡，ADCC，或CDC)促进T细胞死亡)。除了含有一种或多种促进T细胞死亡的制剂之外，本发明的组合物还包括一种或多种抑制T细胞增殖(如，例如在对抗原的反应中发生的)的制剂。例如，本发明进一步涉及一种组合物(例如，药学上可接受的组合物或配制的用于器官或细胞培养的组合物)，它包括IL-2/Fc(它，例如，促进经ADCC或CDC的AICD和细胞裂解)，mIL-15/Fc(它拮抗IL-15(并且因此促进被动细胞死亡)和经ACDD或CDC促进细胞裂解)，和雷帕霉素(抑制T细胞增殖)。
术语″制剂″指基本上包括任何一种类型的可用于治疗剂的分子。蛋白质，例如抗体，融合蛋白，和可溶性配体，它们中的任何或者等同于野生型蛋白，或者包含突变(即，一个或多个氨基酸残基的缺失、添加或取代)，以及编码它们的核酸分子(或者它们的″反义″；即，与编码IL-2、IL-15或它们受体的成分(例如，亚基)的核酸反义的寡核苷酸)都是″制剂″。本发明的制剂或者可以全身、局部给药，或者通过细胞水平治疗(即，本发明的制剂可通过在表达该制剂至病人的细胞上给药)给药。将这种细胞给予病人仅仅是为了表达治疗剂。这种细胞还可以是细胞、组织或器官移植的细胞。例如，移植细胞(例如，胰岛细胞)或组织或器官内细胞(例如，皮肤或肝脏、肾脏或心脏的小块内的细胞)，它们可以用制剂治疗或用编码制剂的核酸分子体外(例如，移植之前)转导。这样，移植细胞产生它们自身的免疫抑制剂。例如，具有期望的表型的细胞(例如，胰岛素生成细胞)可以被修饰成为包括可产生一种或多种本发明的免疫抑制因子的基因。移植的细胞、组织或器官可以在移植之前，或者移植之后进行治疗。对病人的给药(或培养中的细胞或器官)方法是本领域普通技术人员已知和常规使用的，并且以下进一步讨论。
                 靶向IL-15或IL-15R的制剂
本发明的组合物包括靶向IL-15或IL-15受体的一种或多种制剂。如上所述，单一的制剂具有多功能域。靶向IL-15或IL-15R的制剂包括结合(或另外的相互作用于)IL-15、IL-15R的制剂或编码它们的核酸的制剂，以及结合且随后破坏具有IL-15R的细胞的制剂，例如激活的T细胞。因此，用于获得免疫抑制的制剂包含两个功能部分：靶向具有IL-15R的细胞的靶向功能部分，和清除具有IL-15R的细胞的清除(例如，裂解)功能部分。在一项实施方案中，靶向功能部分结合IL-15R，而不会通过受体有效地转导信号。例如，靶向部分包括突变体IL-15多肽，并且清除靶细胞部分包括免疫球蛋白分子的Fc区。Fc区衍生于IgG，例如人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或类似的哺乳动物IgG，或者衍生于IgM，例如人IgM或类似的哺乳动物IgM。在优选的实施方案中，Fc区包括人IgG1或鼠IgG2a的铰链、CH2和CH3域。尽管本发明不限于任何具体机理的制剂，但据信Fc区介导补体和吞噬细胞产生的含有IL-15R的细胞的清除。
已经生产出突变体IL-15多肽，它以类似于野生型IL-15的亲和性结合IL-15受体复合物，但是完全不能激活信号转导。这些突变体多肽与野生型IL-15多肽有效竞争，并且能够抑制在对IL-15信号应答中通常发生的一种或多种现象，例如细胞增殖。″野生型IL-15多肽″本文指等同于天然产生的IL-15的多肽(例如，图1所示的野生型IL-15多肽)。相反，″突变体IL-15多肽″是相对于野生型IL-15具有至少一个突变的多肽，它抑制通常由野生型IL-15促进的体内或体外活性中的至少一种。
按照本发明使用的突变体IL-15多肽通常会阻断野生型IL-15分子的一种或多种活性的至少40％，更优选至少70％，最优选至少90％。突变体IL-15多肽阻断野生型IL-15活性的能力可通过多种分析评价，包括本文描述的BAF-BO3细胞增殖分析(其中细胞以编码IL-2Rβ的构建子转染)。进一步地，本发明的突变体多肽可按照它们显示与野生型IL-15的具体相同百分比定义。检查两个多肽之间的相同百分比时，被比较的序列的长度通常会是至少16个氨基酸，优选至少20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选至少35个氨基酸。参照多肽或DNA序列使用的术语″相同性″，指两个比较的多肽或DNA序列内亚基(蛋白质的氨基酸残基或DNA分子的核苷酸)之间的相同性。两个分子中的亚基位置由相同的单体亚基(即，相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，则这些分子在那个位置相同。两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数目的同向功能(direct function)。因此，100个氨基酸长的50％等同于参照多肽的多肽有50个氨基酸多肽，它完全等同于参照多肽的50个氨基酸长的部分。它还可以是在其整个长度内50％等同于100个氨基酸长的参照多肽。当然，许多其它的多肽会符合同样的标准。通常，采用序列分析软件能最方便地测量相同性，例如Wisconsin大学生物工程中心(1710 University大街，Madison，WI 53705)的Genetics Computer Group的序列分析软件包和其设置的参数。
本发明的突变体IL-15多肽至少65％等同于野生型IL-15，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％(例如，96％，97％，98％或99％)。突变由氨基酸残基数目或内容上的变化组成。例如，突变体IL-15具有比野生型IL-15更多或更少数量的氨基酸残基。此外，突变体多肽含有位于野生型IL-15中的一种或多种氨基酸残基的取代。突变体IL-15多肽通过单个氨基酸残基添加、缺失或取代不同于野生型IL-15，例如，位置156的残基的添加、缺失或取代。同样地，突变体多肽通过两个氨基酸残基的添加、缺失或取代不同于野生型，例如，位置156和149的残基。例如，突变体IL-15多肽不同于野生型IL-15之处在于在残基156和149以天冬氨酸代替谷氨酰胺(如图2所示)。用作靶向制剂的突变体多肽，和野生型IL-15一样，能识别和结合IL-15R的成分。一项实施方案中，IL-15的突变在细胞因子的羧基末端域，据信它结合IL-2Rγ(IL-2受体亚基)。此外，突变体IL-15多肽包括IL-2Rβ(IL-2受体β亚基)结合域内的一个或多个突变。
在突变体IL-15多肽含有取代另一个多肽的一个氨基酸残基的取代情形下，取代可以是，但不必需是保守取代，它包括以下基团的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
代替使用的，或除了使用的之外，IL-15靶向多肽(例如，突变体IL-15多肽)，治疗剂可以是抗体。例如，以抗体靶向(即，特异性的结合)IL-15。同样地，以结合IL-15R成分(例如，IL-15Rα亚基)的抗体靶向IL-15R。产生相对于IL-15R成分的抗体，包括人源抗体，的方法是本领域公知的。抗体优选能够激活补体和噬菌作用，例如，人IgG3和IgG1(优选后者)小类，或鼠IgG2a小类。
还可以用组合物实施本发明的方法，它含有：(a)两种或多种制剂，每一种促进T细胞死亡，或(b)至少一种促进T细胞死亡的制剂和至少一种抑制T细胞增殖的制剂。促进T细胞死亡的制剂可通过促进被动细胞死亡而生效，被动细胞死亡发生在除去T细胞存活所必需的因子时。IL-15是这样一种因子(其它的如下所述)。因此，妨碍IL-15用作存活因子能力的制剂(例如，特异性结合IL-15或IL-15受体的抗体)可包含在本发明的组合物内(例如，组合物可包括促进AICD的制剂，促进被动细胞死亡的制剂(例如，抗-IL-15抗体)，和，任选地，抑制T细胞增殖的制剂)。
如上所述，用于获得免疫抑制的制剂含有两个功能部分：制剂靶向带有IL-15R的细胞(例如刚刚描述的突变体IL-15分子)的靶向部分，和靶细胞清除部分，例如裂解或另外导致带有IL-15R的细胞损耗的功能区。因此，这种制剂可以是嵌合多肽，它包括突变体IL-15多肽和异种多肽，例如IgG和IgM抗体亚类的Fc区。Fc区可包括抑制补体结合和Fc受体结合的突变，或者它是清除靶细胞的结构(即，通过结合补体或通过另一机理，例如依赖抗体的补体裂解来破坏细胞)。
Fc区可从天然来源中分离，被重组或合成(可以是如本发明表征的任何多肽)。例如，同源于IgG C-末端域的Fc区可用木瓜蛋白酶消化IgG而得到。IgG Fc具有大约50kDa的分子量。本发明的多肽包括整个的Fc区，或保留裂解细胞能力的较小部分。此外，全长或片段Fc区可以是野生型分子的变体。换言之，它们可以包含可能或不会影响多肽功能的突变。
此处涉及到″靶″白细胞介素或白细胞介素受体的制剂。靶向发生在制剂以影响白细胞介素或白细胞介素受体活性的方式，与白细胞介素或白细胞介素受体直接或间接结合，或相互作用。活性可由本领域普通技术人员且以常规实验室方法评价。例如，人们可评价信号传导的强度，或者评价受体结合之后发生或通常会发生的另一下游生物现象。靶向白细胞介素或白细胞介素受体的制剂产生的活性可以，但非必需地，不同于天然的白细胞介素结合天然的白细胞介素受体时产生的活性。例如，即使该制剂实质上产生的活性和天然IL-2结合受体产生的活性一样，靶向IL-2受体的制剂也落入本发明的范围。当制剂产生基本上等于或大于天然配体产生的活性时，该制剂被称为受体激动剂(该制剂和天然配体在同样条件下检查)。当制剂产生活性小于天然配体产生的活性时，该制剂被称为受体(如果制剂的初始相互作用是和受体；例如，mIL-15)或白细胞介素(如果制剂的初始相互作用是和白细胞介素；例如，抗-EL-15抗体)拮抗剂。活性水平是在同样条件下试验制剂和天然受体(或配体)而评价。
可以是本发明制剂一部分的Fc区是″清除靶细胞″或″不清除靶细胞″的结构。不清除靶细胞的Fc区通常缺乏高亲和性Fc受体结合位点和C′lq结合位点。鼠IgG Fc的高亲和性Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位置的Leu残基。因此，通过突变或删除Leu 235可破坏鼠Fc受体结合位点。例如，Glu代替Leu 235会抑制Fc区结合高亲和性的Fc受体的能力。通过IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基的突变或删除可在功能上破坏鼠C′lq结合位点。例如，Ala残基取代Glu 318，Lys 320，和Lys 322使得IgG1 Fc不能指导依赖抗体的补体裂解。相反，清除靶细胞的IgG Fc区具有高亲和性的Fc受体结合位点和C′lq结合位点。高亲和性的Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位置的Leu残基，并且C′lq结合位点包括IgG1的Glu 318，Lys 320，和Lys 322残基。清除靶细胞IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。缺失IgG Fc的靶细胞能靶向细胞进行抗体依赖的细胞细胞毒性或补体主导的细胞毒性(CDC)。人IgG适当的突变也是已知的(参见，例如，例如，Morrison等，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等，The Immunologist 2：125，1994)。
靶向IL-15R的制剂可以是突变体IL-15多肽，任意地融合抗原标记(例如，FLAG序列)。如本文所述，FLAG序列由生物素化、高特异性、或抗FLAG抗体识别(还参见Blanar等，Science 256：1014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。
此外，可溶的IL-15Rα链可用作拮抗剂。而由αβγ亚基组成的IL-15受体复合物，其中的α链单独表现出对IL-15的高亲和性。因此，可溶的IL-15Rα链会结合IL-15，并防止IL-15结合至细胞表面-结合IL-15R的复合物。因此，可溶的IL-15Rα链充当受体特异性拮抗剂。
可溶的IL-15Rα链的构建包括从带有受体的细胞中克隆IL-15Rα链的细胞外片段，例如激活的T细胞或者表达受体的细胞系，并且任选地将它融合到分子标记序列上。标记序列可以是例如，FLAG、GST或组氨酸。表达载体中的基因构建子能被转染至表达细胞系中。由表达细胞系产生的标记的可溶IL-15Rα链会采用特异于标记序列的mAb纯化。此外，IL-15R胞外域能连接(例如，通过肽键融合)至免疫球蛋白Fc域(例如免疫球蛋白G的绞链，CH2和CH3域)，优选IgG或IgM亚型。这样一种融合蛋白会以适当的细胞类型表达，它们中的许多是本领域普通技术人员已知的。
靶向IL-2或IL-2受体的制剂
为了抑制免疫应答，上述靶向带有IL-15R的细胞的制剂，可和靶向IL-2或IL-2R的制剂一起给药。与另一种一起给药的制剂可以是，但非必需，同时或以同样的方式给药(涉及IL-2的制剂的讨论的上下文中阐明了这个注解，它适用于在本发明的组合物中联合的任何制剂或分子)。例如，靶向IL-15R的制剂可以在靶向IL-2R的制剂之前或之后给药。同样地，靶向IL-15或IL-15R的制剂可以体外给药(治疗，例如，预定移植的细胞、组织或器官)，同时靶向IL-2或IL-2R的制剂对病人(例如已经接受以靶向IL-15的制剂体外治疗的移植物的病人)全身给药(例如，静脉内)。同样地，与抑制细胞增殖的制剂相比，人们可以在不同时间或以不同方式服用促进AICD的制剂。因此，本发明的方法中，本发明的组合物中联合的任何制剂或类型的分子可以分别给药。
为了抑制IL-2R，人们可服用任何结合且拮抗IL-2或IL-2R的制剂。靶向IL-2或IL-2R的制剂包括结合IL-2或IL-2R的制剂，以及结合且随后破坏带有IL-2R的细胞(例如激活的T细胞)的制剂。如上所述在IL-15靶向的上下文中，用于获得免疫抑制的制剂包含将制剂靶向带有IL-2R的细胞的功能区，以及包含导致带有IL-2R的细胞消失的清除靶细胞(例如，裂解)的功能区。例如，靶向功能部分结合IL-2R，而不会通过该受体有效地转导信号。在该现象中，包括Fc区，该区可从上述同样的免疫球蛋白分子中获得。
靶向制剂，例如IL-2/Fc制剂(例如，参见Zheng等，J.Immunol.163：4041-4048，1999)能够和阻止IL-2介导的IL-2R信号传导的制剂一起给药，例如雷帕霉素。抑制细胞增殖的制剂是本领域普通技术人员已知的(以下进c一步讨论)。代替使用的，或除了使用的IL-2R靶向多肽(例如，IL-2多肽)之外，与IL-15拮抗剂组合使用的治疗剂可以分别是拮抗IL-2或IL-2R的抗-IL-2或抗-IL-2R抗体(例如，人源抗体)。
如上说明，本发明的方法(例如，抑制免疫应答(例如，细胞免疫应答)的方法，抑制移植排斥的方法和治疗癌症的方法)也可以以组合物(例如，药学上可接受的组合物)实施，该组合物含有：(a)两种或多种制剂，它们的每一种都能促进T细胞死亡，或(b)至少一种促进T细胞死亡的制剂和至少一种抑制T细胞增殖的制剂。促进T细胞死亡的制剂可通过促进AICD(激活诱导细胞死亡)来实现，这种制剂包括IL-2和作为IL-2激动剂的分子。例如，本发明的组合物可包括IL-2/Fc，保留经IL-2受体结合和传导信号能力的IL-2突变体，和特异性结合和竞争IL-2受体的抗体(例如，特异性结合IL-2受体亚基的抗体)。其它促进AICD的制剂包括Fas配体(FasL)，它通过在激活的T细胞和其生物学上的活性突变体上，激活Fas信号转导级联而刺激T细胞死亡。
促进被动细胞死亡的制剂
T细胞失去其存活必需的因子时，被动T细胞死亡发生。除了IL-15外，包括IL-4、IL-7、OX-40配体、IFNβ、41BB和IGF-I在内的因子是必需的(即，在缺少这些因子中的每一种时T细胞都会死亡；参见，例如，Tu等，J.ImmunoL 165：1331-1336，2000；Tsudaetal.，J：Immzmol.Meth.236：37-51，2000；Bertolino等，Int.ImmunoL 11：1225-1238，1999；Takahash等，J.ImmunoL 162：5037-5040，1999；Pilling等，Eur.J.Immunol.29：1041-1050，1999；Chu等，J Immunol.162：1896-1903，1999；and Weinberg等，Semiz Immunol.10：471-480，1998)。人们通过，例如，在体内或培养物中将细胞暴露于选择性结合一种或多种这些因子的制剂，或另外阻止它们如通常一样与T细胞相互作用的制剂，则可使T细胞失去这些因子中的一种或多种(IL-15，IL-4，IL-7等)(除去这些因子的结果是被动细胞死亡)。
促进ADCC或CDC的制剂
ADCC和CDC可通过能结合T细胞表面并且包含激活ADCC或CDC的免疫球蛋白分子的Fc部分的制剂引起。这种制剂的例子包括能够与激活的免疫细胞上表达的细胞表面结构结合(例如，细胞表面受体，如CD154，IL-2受体，和IL-15受体)的抗体。此外，人们可使用配体/Fc嵌合融合蛋白，它结合激活的细胞表面上的受体蛋白(例如，IL-2/Fc或mIL-15/Fc)。由举出的这些例子，其它适合的制剂对本领域普通技术人员是明显的。
抑制细胞增殖的制剂
抑制细胞增殖的制剂包括雷帕霉素(Sirolimus)、霉酚酸酯(MMF)，硫唑嘌呤(azathioprine)和任何其它的已知用于过增殖性疾病(例如癌症)治疗的制剂。良好定义的化学治疗剂包括抑制核酸代谢的制剂(例如嘌呤和嘧啶生物合成抑制剂、RNA合成抑制剂和DNA结合、DNA修饰或插入剂)。当组合物用于，例如，抑制免疫应答时这些制剂是特别有效的，也包含如IL-2/Fc的制剂，它不仅能促进AICD，而且还能刺激T细胞增殖。
抑制细胞增殖的制剂还包括叶酸抗代谢产物，例如氨甲喋呤(MTX)和乙胺嘧啶；嘌呤抗代谢产物(例如6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤)以及嘧啶拮抗剂，如阿糖孢苷(ara-C)，5-氮胞苷，和5-氟尿嘧啶(以上述及这些种类)；烷基化和其它的DNA-连接剂(例如，环磷酰胺(CPA)；丝裂霉素C，和阿霉素(亚德里亚霉素))；长春碱(例如，长春新碱)；和钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢霉素A，FK506，和布喹那)。
其它的可用于抑制细胞增殖的制剂包括直接干扰涉及细胞周期调节的蛋白(例如抗-CDKs(细胞分裂激酶)或抗-细胞周期蛋白)或影响细胞增殖关卡(check points)(所有增殖细胞在细胞周期的不同阶段都具有关卡，以便在它们结束先前步骤之前，防止它们进入下一细胞分裂周期阶段(CDC)的)的蛋白的制剂。注入关卡调控的路径包括DNA-，RNA-和蛋白-合成抑制剂(例如，S6激酶和PI-3-激酶抑制剂)。还可以使用胞质分裂抑制剂。
筛选抑制免疫应答制剂的方法
除了在以下实例描述的体外检测中试验候选制剂(例如，突变体IL-15或IL-2多肽)之外，人们还可采用以下任何体内检测，以试验本文描述的哪一种具体组合的制剂最能有效地产生免疫抑制。例如，人们可以试验一种或多种靶向IL-15R的制剂与一种或多种拮抗IL-2或其受体的制剂的组合。这些体内检测仅仅表示某些常规方法，其中本领域的普通技术人员能进一步试验本发明制剂的功效。由于它们与适合采用靶向IL-2、IL-15和它们的受体的制剂治疗的各种的临床条件的关联性，在此将它们包含进来。例如，与器官移植、免疫疾病(尤其是自身免疫性疾病)、移植物抗宿主病和免疫系统癌症(例如，T细胞成为恶性时发生的癌症)相关的检测。
移植范例
为了确定本发明的制剂的组合是否能实现免疫抑制，在上下文的良好建立的移植范例中给予(或者直接地，通过基因治疗，或者通过细胞水平的治疗)这种组合。
在对动物实施同种异体或异种皮肤移植、器官移植或者细胞移植之前，本发明的制剂，编码它们的核酸分子(或与它们杂交，由此抑制它们)，可通过标准方式全身或局部给予任何常规的实验室动物，例如大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或狗。小鼠的品系，如C57B1-10，B10.BR，和B10.AKM(Jackson实验室，Bar Harbor，ME)，它们具有同样的基因背景，但是错配于H-2部位，非常适于评价各种器官移植。
心脏移植
Ono等首先公布了通过供体心脏与宿主腹部大脉管吻合实施心脏移植的方法(J.Thorac.Cardiolsasc.Surf.57：225，1969；还参见Corry等，Transplantation 16：343，1973)。用这种外科手术的方法，采用标准的微血管技术使供体心脏的主动脉与宿主腹部主动脉吻合，供体心脏的肺动脉与毗邻的腔静脉吻合。一旦在适当的位置移植心脏且以林格乳酸盐溶液加热至37℃，则可恢复正常的室性节律。可通过腹壁的心室收缩来经常评价移植心脏的功能。排斥被定义为心肌收缩的停止。如果接受这些制剂的宿主，与未接收治疗的宿主相比，能经受更长时期的植入供体心脏，则本发明的制剂(例如，突变体IL-15/Fc和结合并抑制IL-2或IL-2R的抗体的组合物，或者突变体IL-15/FC，IL-2/Fc，和雷帕霉素的组合物)被认为在减少器官排斥中有效，。
皮肤移植
本发明制剂的各种组合物的效力还可通过皮肤移植进行评价。为了在啮齿动物上实施皮肤移植，将一供体动物麻醉，从尾部部分除去全部厚度皮肤。麻醉受体动物，从剃过的横腹部上除去一片皮肤以预备移植床。通常，这片皮肤大小近似0.5×0.5cm。供体的皮肤制成适合移植床的形状，安置，以纱布覆盖，并包扎。在手术日后第6天开始每天检查移植物，当超过一半的移植上皮显示不能存活时则认为排斥。如果接受这些制剂的宿主，与未接收治疗的宿主相比，能经受更长时期的植入供体皮肤，则本发明的制剂(例如，突变体IL-15/Fc和结合且抑制IL-2或L-2R的抗体的组合物，或者突变体IL-15/FC，IL-2/Fc，和雷帕霉素的组合物)会被认为在减少器官排斥中有效。
实施例(以下)中描述并且附图12概述了皮肤移植试验的典型例子，它的结果证明含有IL-2/Fc，mIL-15/Fc和雷帕霉素的组合物的有效。
胰岛同种异体移植模型
DBA/2J胰岛细胞同种异体移植可被移植入啮齿动物，例如6-8周龄B6 AF1小鼠，该鼠通过一次腹膜内注射链佐星(225mg/kg；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)患上了糖尿病。作为对照，同系胰岛细胞移植物移植入糖尿病小鼠。依出版的方案进行胰岛细胞移植(例如，参见Gotoh等，Transplantation 42：387，1986)。简要地，以IV型胶原酶原位灌注供体胰腺(2mg/ml；Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)。37℃消化40分钟之后，以不连续的Ficoll梯度分离胰岛。随后，将300-400胰岛移植到每个受体肾囊下。系列血糖测量后面是同种异体移植功能(Accu-CheckIJITM；Boehringer，Mannheim，德国)。初始移植功能定义为移植3天后血糖水平在11.1mmol/l以下，移植排斥定为初始移植功能期后，血糖升高超过16.5mmol/l(每个至少2个连续工作日)。
自身免疫性疾病模型
自身免疫性疾病模型提供了另一种体内评价本发明的制剂组合物的方式。这些模型对于本领域普通技术人员是公知的，并且可用于确定给定的制剂组合物在治疗特异性自身免疫性疾病中是否有效，例如，靶向IL-15R的制剂，在直接地，经基因治疗，或者经细胞水平治疗时，是否对特异性自身免疫性疾病有效。
已经有动物模型的自身免疫性疾病包括风湿性疾病，例如风湿性关节炎和全身性红斑狼疮(SLE)，I型糖尿病，以及甲状腺、肠和中枢神经系统的自身免疫性疾病。例如，SLE动物模型包括MRL小鼠、BXSB小鼠，和NZB小鼠以及它们的F1杂种。为了研究风湿疾病过程的特别方面，杂交这些动物；与NZW小鼠杂交时NZB系子代发生严重的狼疮性肾小球性肾炎(Bielschowsky等，Proc.Unit.Otago Med.Sch.37：9，1959；还参见Fundamental Immunology，Paul，Ed.，Raven Press，New York，NY，1989)。同样地，在NBZ X SWR交配的子代中可发现转移成致使的肾炎(Data等，Nature 263：412，1976)。已经良好表征了SNF1小鼠中肾损害组织学外表(Eastcott等，J.Imm2mol.131：2232，1983；还参见FundamentalImmunology，supra)。因此，动物的总体健康以及肾组织的组织学外表可用于确定靶向IL-15R的制剂，例如靶向IL-2R的制剂给药后能否有效地抑制SLE动物模型中的免疫反应。
发生SLE、MRL-lpr/lpr的MRL系小鼠中的一只，还发生了一种形式的类似人风湿性关节炎的关节炎(Theofilopoulos等，Adv.Immunol.37：269，1985)。此外，通过尾部注射1∶1混合Freund完全佐剂的大鼠II型胶原(2mg/ml)(总计100μl)，在啮齿动物中诱导实验性关节炎。免疫后2-3周发生关节炎。可通过靶向T淋巴细胞的核酸分子，来评价编码本发明制剂的核酸分子(例如，靶向IL-15R的制剂和靶向Il-2R的制剂或者结合和灭活抗原-激活T细胞的制剂)抑制免疫应答的能力。靶向T淋巴细胞的一种方式如下。在关节炎开始之后2-3天制备脾细胞悬浮液，并以胶原培养(100μg/ml)48小时以诱导胶原激活T细胞的增殖。此时间期间，用编码所需多肽制剂的载体转导细胞。作为对照，生长平行培养物不转导，或以″空″载体转导。接着腹膜内注射这些细胞(5×107细胞/动物)。通过随后2周期间的疾病症状评价治疗的效力，如Chernajovsky等所述(Gene Therapy2：731-735，1995)。与对照组相比，较少的症状表明本发明的联合制剂，和编码它们的核酸分子起到了免疫抑制作用，并且因此在免疫疾病，特别是自身免疫性疾病的治疗中有效。
在BB大鼠系上试验I型糖尿病的情形下，各种组合的制剂抑制免疫应答的能力，该鼠系产生于Ottawa Bio-Breeding实验室的Wistar大鼠商业群体。这些大鼠自发地产生抗胰岛细胞和胰岛素的自身抗体，正如发生在人I型糖尿病中的。此外，NOD(非肥胖性糖尿病)小鼠可用作模型系统。在下文和附图11中概述了实验的典型例子，其中NOD小鼠在同种异体供体胰岛移植之后血糖水平复原。该动物以IL2/Fc，IL-15/Fc，和雷帕霉素的组合治疗。结果是长期移植。
已经在小鸡中制造了甲状腺的自身免疫性疾病模型。肥胖系(OS)小鸡连续发生类似桥本甲状腺炎(hashimoto′s disease)的自发自身免疫甲状腺炎(Cole等，Science 160：1357，1968)。这些禽中的约15％产生对胃壁细胞的自身抗体，正如在自身免疫性甲状腺炎的人对应物中一样。OS小鸡中疾病的表现，包括体格大小、脂肪沉积、血脂、寒冷敏感度和不育症，都能在任何治疗方案的过程中被监控。
中枢神经系统(CNS)上的自身免疫性疾病模型可被实验诱导。会引起麻痹的CNS炎症，可通过在许多不同的实验室动物中一次注射含有佐剂的脑或脊髓组织来诱导，这些动物包括啮齿动物和灵长类。这种模型称为实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，它是T细胞介导。同样地，通过一次注射有佐剂的乙酰胆碱受体可产生实验性诱导重症肌无力(Lennon等，Afin.N.Y.Acad.Sci.274：283，1976)。
在IL-2或IL-10″剔除″鼠，或者在接受含牛血清白蛋白灌肠的小鼠中，建立消化道自身免疫性疾病模型。
编码本发明制剂的核酸分子
本发明的多肽制剂，包括那些融合蛋白(例如，突变体IL-15/Fc和IL-2/Fc分子)，不仅能通过在体外适当的真核或原核表达系统中经核酸的表达并且随后纯化该多肽制剂获得，而且还可通过编码核酸分子的适当的基因治疗表达载体对病人给药。此外，核酸在移植物移植之前可引入移植物细胞。因此，编码上述制剂的核酸分子在本发明的范围内。正如本发明的多肽可依照它们和野生型多肽的同一性来描述，编码它们的核酸分子和编码相应野生型多肽的核酸必需具有某些同一性。例如，编码突变体IL-15多肽的核酸分子至少65％等同于编码野性型IL-15的核酸，优选至少75％，更优选至少85％，最优选至少95％(例如，96％，97％，98％，或99％)。对于核酸，比较的序列长度通常会是至少50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少70个核苷酸，最优选110个核苷酸。
编码本发明制剂的核酸分子包含天然序列，或者由于遗传密码简并性，不同于天然的核酸但是编码同样多肽的序列。这些核酸分子由RNA或DNA(例如，基因组DNA，cDNA，或合成DNA，例如由亚磷酰胺基合成产生)，或这些类型核酸内组合或修饰的核苷酸组成。此外，核酸分子可以是双链或单链(即，或者有义或者反义链)。
本发明的核酸分子被称为″分离的″，由于它们由或者5′或者3′编码序列分离，在天然基因组的生物中它们是直接连接的。因此，核酸分子不限于编码多肽的序列；还包括位于编码序列上游或下游的非编码序列部分或全部。分子生物学领域内普通技术人员熟悉分离核酸分子的常规方法。例如，他们可以用限制性内切酶处理基因组产生，或者通过聚合酶链反应(PCR)完成。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情形下，分子可由体外转录产生。
本发明分离的核酸分子包括天然状态下未发现的片段。因此，本发明包括重组分子，例如其中核酸序列(例如，编码突变体IL-15的序列)掺入载体(例如，质粒或病毒载体)或掺入异源细胞基因组(或者同源细胞基因组，在非天然染色体位置)。
如上所述，本发明的制剂可以是融合蛋白。除了，或代替上述的异源多肽，编码本发明制剂的核酸分子还包含编码″标记″或″报告基因″的序列。标记或报道基因的例子包括β-内酰胺酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，腺苷脱氨酶(ADA)，氨基糖苷磷酸转移酶(neo1，G4181)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B磷酸转移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)，lacZ(编码β-半乳糖苷酶)，和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。由于许多标准方法与本发明的实践有关，本领域的普通技术人员会意识到另外有益的试剂，例如适合标记或报道基因功能的另外序列。
本发明的核酸分子可通过在本发明的制剂(例如，IL-15分子或IL-2分子)中引入突变而获得，其中本发明的制剂可以是从任何生物细胞(例如哺乳动物细胞)中获得，或者由常规克隆方法制备得到。因此，本发明的核酸可以是小鼠、大鼠、豚鼠、母牛、绵羊、马、猪、兔、猴、狒狒、狗或猫的。优选地，核酸分子是人的。
上述的核酸分子可包含在能够使它们表达的载体内，例如，已经被载体转导的细胞。因此，除了多肽制剂之外，含有编码那些制剂的核酸分子的表达载体和用那些载体转染的细胞在优选的实施方案之中。
适用于本发明的载体包括适用于细菌的T7-载体(T7-based vector)(参见，例如，Rosenberg等，Gene 56：125，1987)，适用于哺乳动物细胞的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，A Biol.Chem.263：3521，1988)，酵母表达系统，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)(例如Invitrogen的PICZ族的表达载体，Carlsbad，CA)和适用于昆虫细胞的杆状病毒衍生载体(例如Clontech的表达载体pBacPAK9，Palo Alto，CA)。在这样的载体中，编码所需特定多肽的核酸插入物能够可操作地与启动子连接，启动子是根据例如表达所需的细胞类型选择的。例如，T7启动子可用于细菌中，多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞中，细胞肥大病毒或金属硫蛋白启动子可用于哺乳动物细胞中使。同样，在高等真核生物的情形下，组织特异性和细胞型特异性启动子是广泛有效的。如此命名这些启动子，是由于它们指导核酸在体内给定的组织或细胞类型中表达。本领域普通技术人员能很好地意识到各种启动子和其它的能用于指导核酸表达的调节元件。
除了促进插入核酸分子转录的序列之外，载体包含复制起点和其它编码可选择标记的基因。例如，新霉素耐药性(neo1)基因使得表达它的细胞具有G418抗性，因此允许转染细胞的表型选择。其它的允许细胞表型选择的可行选择标记基因包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)和其变异体。本领域技术人员易于确定给定的调节元件或选择标记是否适用于具体的实验中。
用于本发明的病毒载体包括，例如，逆转录病毒、腺病毒和腺相关载体、疱疹病毒、猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见，例如，Gluzman(Ed.)，真核Viral Vectors，CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约)。
含有编码本发明制剂的核酸分子和在体外表达该核酸分子编码的蛋白的原核或真核细胞也是本发明的特征。本发明的细胞是转染细胞，即，通过重组DNA技术在细胞中引入核酸分子，例如编码变体IL-15多肽的核酸分子。这种细胞的子代也在本发明的范围内。表达系统的精确组分不是关键的。例如，突变体IL-15多肽可以在原核宿主，例如细菌E.coli，或真核宿主，例如昆虫细胞(例如，Sf21细胞)，或者哺乳动物细胞(例如，COS细胞，CHO细胞，293细胞，NIH 3T3细胞，或HeLa细胞)中生产。这些细胞可从多种渠道获得，包括美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection，Manassas，VA)。在选择表达系统中，重要性仅在于该组分相互兼容。本领域普通技术人员能够进行这种测定。此外，如果在选择表达系统中需要指导，可查阅Ausubel等(Cztrrent Protocols in MolecitlarBiology，John Wiley and Sons，纽约，NY，1993)和Pouwels等(CloningVectors：A Laboratory Manual，1985 Suppl.1987)。
含有编码本发明制剂的核酸分子，并且在体内表达该核酸分子编码的蛋白的真核细胞也是本发明的特征。
此外，本发明的真核细胞是为细胞移植、组织或器官移植的一部分的细胞。这样的移植物包括或者取自供体组织的原始细胞，或者在移植入受体生物之前，体外培养、修饰和/或选择的细胞(例如，真核细胞系，包括干细胞或祖细胞)。由于移植入受体生物之后，会发生细胞增殖，这样的子代细胞也被认为在本发明的范围内。细胞作为细胞、组织或器官移植的一部分，可以用编码突变体IL-15多肽的核酸转染，并且随后移植入受体生物中来表达突变体IL-15多肽。此外，这样的细胞可包含一种或多种额外的核酸构建子，它允许在移植入受体生物之前应用选择步骤，核酸构建子可以是例如特异性细胞谱系或细胞类型。
表达的多肽可由表达系统采用常规的生化方法纯化，并且如下所述，可用作诊断工具或作为治疗剂。
靶向IL-15R的制剂在进行诊断中有用
靶向IL-15R的制剂可用于测定病人是否具有适于本文描述的组合制剂治疗的疾病(例如，免疫疾病，尤其自身免疫性疾病)。例如，通过由怀疑具有免疫疾病，尤其自身免疫性疾病，或表现为恶性免疫细胞的癌的病人的组织中采样，接着暴露该组织于靶向IL-15R的抗原标记的多肽中，以实施诊断。样品是任何生物样品，例如血液、尿、血清或血浆样品。此外，样品可以是组织样品(例如，生检组织)，或关节渗出液(例如，滑液)、腹腔(例如，腹水)、胸腔(例如，胸膜腔积液)，或中枢神经系统的渗出液(例如，脑脊液)。该样品还包括最初得自病人的培养细胞(例如，外周血单核细胞)。该样品可以取自哺乳动物，例如病人。如果该样品包含的细胞能被它们所暴露的制剂结合，那么极有可能它们会由那种制剂(例如，靶向IL-15R的制剂)体内结合且因此被体内抑制增生或破坏，这是很可能的。侯选病人表现的适于这种试验的症状和给出具体一组症状的取样的相关组织对于本领域普通技术人员是公知的。
顺从治疗的病人
本发明的组合物在抑制涉及抗原的免疫应答或可能涉及抗原的免疫应答的T细胞中有效；本发明化合物还可有效抑制包含于免疫学疾病的致病原因中的其它细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞，和其它位于细胞，例如树突状细胞、NK细胞和粒细胞中的抗原)；和破坏过增殖细胞(例如，在包含于免疫学疾病的组织中，例如关节成纤维细胞(它在风湿性关节炎中受影响)角质化细胞(它在牛皮癣中受影响)，或皮肤纤维原细胞(它在全身性红斑狼疮受影响)。给出这些例子，其它的可用作靶的细胞类型对于本领域普通技术人员是明显的。过增殖细胞也可以是癌性细胞(例如，恶性T细胞)。
因此，本发明的组合物可用于治疗患有免疫疾病，特别是自身免疫性疾病的病人，它们包括但不限于以下：(1)风湿性疾病，例如风湿性关节炎，全身性红斑狼疮，斯耶格伦氏综合征，硬皮病，混合性结缔组织病，皮肌炎，多肌炎，莱特尔氏综合征或贝切特氏病；(2)I型或II型糖尿病；(3)甲状腺自身免疫性疾病，例如桥本甲状腺炎或格雷夫斯氏病；(4)中枢神经系统自身免疫性疾病，例如多发性硬化，重症肌无力，或脑脊髓炎；(5)各种天疱疮(phemphigus)，例如寻常性天疱疮，增殖性天疱疮，落叶性天疱疮，塞-阿二氏综合征，或巴西天疱疮；(6)皮肤病，例如牛皮癣或神经性皮炎，和(7)炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)。本发明制剂的组合还可用于治疗获得性免疫缺损综合症(AIDS)。同样地，这些制剂的给药方法可用于治疗已经接受合成或生物材料，或者两者组合移植的病人。这种移植可以是器官、组织或细胞移植，或者细胞接种的合成移植物，例如以血管细胞接种的合成移植物。此外，患有GVHD或已经受到血管损伤的病人会受益于这种方法。
由于本发明包括清除靶细胞形式的靶向IL-15R(或IL-2受体，或IL-15或IL-15R和IL-2或IL-2R的组合)的制剂的给药，它可能选择性杀死自反应或″移植破坏″的免疫细胞，而不量破坏正常T细胞。因此，本发明的特征在于提供了一种杀死体内表达IL-15R的细胞的方法，它包括激化或自反应或″移植破坏″免疫细胞或恶性细胞。该方法通过给予病人组合制剂，它包括靶向IL-15R且激活补体系统的制剂，通过ADCC机理裂解细胞、或另外杀死表达野生型IL-15受体复合物细胞的制剂。这种方法可用于治疗患有IL-15R+白血病、淋巴瘤或其它IL-15R+恶性疾病，例如结肠癌的病人。
适于使用的制剂和给药途径
本发明的方法和用于实现它们的治疗组合物包含″充分纯的″制剂。例如，在制剂是多肽的情形下，以所需的多肽重量计(干重)多肽至少是60％，例如，结合且破坏含IL-15R的细胞的多肽。优选地，以需的制剂重量计，制剂(例如，肽)至少是75％，更优选至少90％，最优选至少99％。通过任何适当的标准方法，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析，可测量纯度。
尽管用于本发明方法的制剂可从天然来源得到，它们还可合成或另外制造(例如，结合且破坏含IL-15R的细胞的制剂可通过重组核酸分子的表达生产)。来源于真核生物或在E.coli或其它原核生物中合成的多肽，和化学合成的多肽实质上不含它们天然相关成分。在多肽是嵌合体的情形下，它可通过含有一个编码全部或部分制剂的序列(例如，编码突变体IL-15多肽的序列和编码IgG Fc区的序列)的杂交核酸分子编码。本发明的制剂(例如，多肽s)可融合至六组氨酸标记中以促进细菌表达蛋白的纯化，或者融合至红细胞凝集素标记中以促进真核细胞内表达蛋白的纯化。
制备本发明的制剂需要的技术是本领域常规的，并且可由本领域普通技术人员实施，不需要求助于过度的实验。例如，IL-15内由一种或多种氨基酸残基取代形成的突变体可采用借助PCR的突变发生技术制得，如本文描述的制备突变体IL-15多肽，其中位置149和156的谷氨酰胺残基变成天冬氨酸残基。由氨基酸残基缺失或添加组成的突变(对于IL-15多肽或任何一种本文描述的其它有用多肽，例如，抑制共刺激或结合激活T细胞的多肽)也可以标准重组技术进行。在治疗应用中，本发明的制剂可和生理学上可接受的载体一起给药，例如生理盐水。本发明的治疗组合物还包含载体或赋形剂，它们中的许多对于本领域普通技术人员是已知的。使用的赋形剂包括缓冲剂(例如，枸椽酸缓冲液，磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，和碳酸氢盐缓冲盐)，氨基酸，尿素，乙醇，抗坏血酸，磷脂，蛋白质(例如，血清白蛋白)，EDTA，氯化钠，脂质体，甘露醇，山梨醇，和甘油。本发明的制剂可以各种方式按照相应的给药途径配制。例如，制备咽入或注射用液体溶液；制备咽入、吸入或局部施用的凝胶或粉末。制备这些制剂的方法是公知的，并且见于，例如，″Remington′s PharmaceuticalSciences.″。
给药途径对于熟练药理学家和医生也是公知的，并且包括腹膜内、肌肉内、皮下和静脉内给药。其它的途径包括颅内(例如，脑池内或心室内)，眶内，眼，囊内，脊柱内，腹膜内，透粘膜，局部，皮下，和口服给药。预计对于靶向IL-15受体的制剂给药，静脉内或动脉内途径是优选的。皮下途径也可经常使用，因为皮下组织提供多肽稳定的环境，它们从中可缓慢释放。
在细胞水平治疗(基因治疗)的情形，细胞/组织/器官在用核酸组合物移植之前，可由培养、灌输或灌注三者择一地转染，以表达治疗蛋白，并且随后由移植的细胞/组织/器官在受体生物内释放。同样，细胞/组织/器官在移植之前与治疗蛋白灌注或简单的培养来进行预处理，以便消除粘着在供体细胞/组织/器官上的有关移植的免疫细胞(尽管这仅仅是次要方面，它或许不具有任何临床相关性)。在细胞移植的情形下，细胞或者通过移植方法或者以导管介导的注射法经血管壁给药。某些情形下，细胞通过释放入脉管系统给药，从中通过血流分布和/或渗透进入周围组织(这在胰岛细胞移植中实施，其中胰岛细胞释放入门静脉并且随后渗入肝脏组织)。
医学领域众所周知，任何一名病人的剂量取决于许多因素，包括总体健康，性别，体重，体表面积，和病人年龄，以及给予的具体化合物，给药的时间和途径，和同时给予的其它药物。本发明的多肽剂量会变化，但是静脉内给药时，以大约1微克至10mg/kg体重的量或以大约0.01mg/l至100mg/l血液体积量的剂量给予。剂量可每天一次或多次给药，如果需要的话可持续治疗长时期。确定适于给出用途的正确剂量正好在本领域普通技术人员的能力之内。
                     实施例
试剂
下列试剂用于本文描述的研究：来源于Hoffman-La Roche(Nutley，NJ)的重组人IL-2；来源于Wyeth-Ayerst(Princeton，NJ)的雷帕霉素；来源于Sandoz(East Hanover，NJ)的环孢霉素-A(CsA)；来源于Bio Wittaker(Walkersville，MD)的RPMI-1640和胎牛血清；青霉素，链霉素，G418，和链霉和素(strepavidin)-RED670，来源于Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)；地塞米松，PHA，溶菌酶，Nonidet P-40，NaCl，HEPES，和PMSF，来源于Sigma(St.Louis，MO)；Ficoll-Hypaque，来源于Pharmacia Biotech(Uppsala，瑞典)；重组人IL-15和抗人IL-15Ab，来源于PeproTech(Rocky Hill，NJ)；抗FLAG Ab和抗FLAG-亲和玻珠，来源于Intemational Biotechnologies，Inc.(Kodak，New Haven，CT)；pRcCMV，来源于InVitrogen Corporation(San Diego，CA)；染料木黄酮，来源于ICN Biomedicals(Irvine，CA)；二琥珀酰胺辛二酸盐(DSS)，来源于Pierce(Rockford，IL)；限制性内切酶，来源于新英格兰Biolabs(Beverly，MA)；[3H]TdR，来源于新英格兰Nuclear(Boston，MA)；和荧光染料接合抗体CD25-PE3，CD14-PE，CD16-PE，CD122-PE，CD4-FITC，CD8-FITC，IgG1-PE或IgG1-FITC，来源于Beckton/Dickinson(San Jose，CA)。在合佛医学院的肽合成设备中合成FLAG肽。
FLAG-WK-IL-15融合蛋白的制备
为了研究人IL-15受体表达细胞的模式，构建能用于表达IL-15融合蛋白的质粒。这种质粒编码N-末端共价结合18氨基酸FLAG-HMK序列的IL-15多肽(FLAG-HMK-IL-15)。FLAG序列由生物素化、高特异性抗-FLAG抗体识别(Blanar等，Science 256：1014，1992)；LeClair等，Proc，.Natl.Acad.Sci，.USA 89：8145，1992)同时HMK(心肌激酶识别位点)序列允许引入放射性标记[32P]至该分子(Blanar等，supra，LeClair等，supra)。
为了构建质粒FLAG-E3MK-IL-15，通过PCR扩增编码成熟IL-15蛋白的322bp cDNA片段，利用合成的寡核苷酸[有义5′- GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3′(SEQ ID NO：5；EcoRI位点(加下划线)加145-162碱基；反义5′-CG GGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAA-3′(SEQ IDNO：5；BamHI位点[加下划线]加472-489碱基)]。模板DNA来源于PHA-激活的人PBMCs。纯化PCR产品，并用EcoRI和BamHI消化，并将其克隆到如文献所述的，用EcoRI-BamHI消化的pAR(DRI)59/60质粒中(Blanar等，Science 256：1014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：8145，1992)。pAR(DRI)59/60质粒主链包含在编码FLAG和HMK识别肽序列的框序列中(Blanar等，Science 256：1014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。
FLAG-HMK-IL-15融合蛋白的表达和纯化
如文献介绍的，IL-15-相关的融合构建子，FLAG-SK-IL-15，在BL21株E.coli中表达，并用抗-FLAG包被玻珠亲和纯化(Blanar等，Science256：1014，1992；LeClair等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。在用0.1M甘氨酸(pH3.0)广泛洗脱之后，从亲和柱洗脱融和蛋白。含有FLAG-HMK-IL-15的洗脱物用含50mM Tris(pH7.4)和0.1M NaCl的缓冲液在4℃透析18小时，经0.2μm膜过滤，且在-20℃贮藏。
FLAG-HMK-L-15结合IL-15Rα亚基
试验纯化的FLAG-HMK-IL-15融合蛋白，以测定它是否与细胞表面IL-15受体相互作用。如上所述，[32P]-FLAG-HMK-IL-15加到由促细胞分裂原，PHA激活的PBMCs培养物中。为了永久结合彼此相互作用的蛋白，加入化学交联剂二琥珀酰胺辛二酸盐(DSS)。细胞被洗涤、裂解、离心，由SDS-PAGE分离去污剂-可溶的蛋白。SDS-PAGE分离蛋白放射自显影揭示，单独的75-80kDa带对应于联合分子量的FLAG-HMK-IL-15(15kDa)和人IL-1SRα亚基(60-65kDa)。鉴定该条带是IL-15Rα亚基，是通过在hIL-15摩尔过量条件实施的交联实验确认的。这些条件下，我们不能检测放射标记的15kDa带。因此，[32p]-FLAG-FEVIK-IL-15融合蛋白的构象允许位点特异性地结合到表达在促细胞分裂原-激活PBMCs上的60-65kDa IL-15Rα亚基。
FLAG-HMK-IL-15是需要IL-2Rβ表达的生物活性生长因子
在下一系列实验中，试验FLAG-HMK-IL-15融合蛋白，以测定它是否起生物活性生长因子作用。在对FLAG-HMK-IL-15或者人重组IL-2的应答中，PHA-激活的人PBMCs扩增，可经[3H]-TdR掺入分析所检测。缺失IL-15序列的FLAG肽不会刺激细胞增殖。如IL-2所为，FLAG-HMK-IL-15融合蛋白会刺激表达IL-2Rβ亚基的IL-2Rγ+BAF-BO3细胞转染子的增殖。然而，FLAG-HMK-IL-15融合蛋白不会刺激用缺失IL-2Rβ链序列的载体转染的亲本BAF-BO3细胞的增殖。因此，FLAG-HMK-IL-15是生物学活性生长因子，它需要在靶细胞上的IL-2R链的表达，以便刺激细胞增殖。
促细胞分裂原激活的，但未静息的，PBMCs表达IL-15Rα亚基
采用FLAG-HMK-IL-15融合蛋白、生物素化的抗FLAG抗体，和链霉抗生物素蛋白-RED670，通过细胞荧光分析以检测人PBMCs上IL-15结合位点的表达。试验的PBMCs是新鲜分离或者PHA-激活的。将细胞洗涤，并单独与培养基或者FLAG-HMK-IL-15孵育培养，接着用抗-FLAG生物素化Ab和链霉抗生物素蛋白-RED670培养细胞。通过流式细胞术分析染色细胞。以PHA激活的PBMCs表达IL-15Rα蛋白，但是静息的PBMCs不会表达。上述交联试验结果放在一起，FLAG-HMK-IL-15与PHA激活的PBMCs结合会被摩尔过量的rIL-15阻滞，因此证明了FLAG-HMK-IL-15对IL-15结合位点的结合特异性。激活的CD4+和CD8+细胞都表达IL-15α链。在CD14+(单核细胞/巨噬细胞)细胞和CD16+(天然杀伤)细胞上也能检测到诱导的IL-15Rα链。
IL-2Rα和IL-2Rβ亚基对IL-15结合不是必需的
针对IL-2Rα亚基的，以FLAG-HMK-IL-15蛋白和抗-CD25Mab染色的PHA-激活的PBMCs的FACS分析揭示了既表达IL-15Rα又表达IL-2Rα的细胞群，以及表达IL-15Rα或IL-2Rα的细胞群。这里有不结合FLAG-HMK-IL-15的IL-2Rα+细胞。几乎所有的以PHA刺激仅一天的PBMCs表达IL-15Rα或IL-2Rβ链，但不是两者都表达。相反地，PHA刺激3天后，观察到非常多的IL-15Rα+、IL-2Rβ+细胞(双阳性)和较少量的IL-15Rα+、IL-2Rβ-细胞(单阳性)。有趣地，有不结合IL-15的IL-2Rβ+细胞。因此，表达IL-2Rβ链的细胞并不完全结合IL-15。
总之，这些数据表明IL-15能结合IL-15Rα+，IL-2Rα-，和IL-2Rβ-细胞。通过检测IL-15和以IL-15Rα亚基转染的IL-2Rα-、β-细胞相互作用的实验可获得同样的结论(Anderson等，J.Biol.Chen.270：29862，1995；Giri等，EMBO J.14：3654，1995)。除了需要IL-15Rα亚基表达之外，还需要IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基使细胞对IL-15触发的生长敏感。
总之，上述的实验已经证明：(i)IL-15Rα亚基由激活的巨噬细胞、T细胞和NK细胞迅速表达，和(ii)IL-15Rα亚基的诱导可由地塞米松而不是CsA或雷帕霉素来阻断。此外，实验已经证实IL-15Rα亚基对于IL-15结合是必需和充分的，并且FLAG-HMK-IL-15融合蛋白对于研究IL-15受体是极其有用的工具。
IL-2Rβ亚基对于IL-2和IL-15的信号转导是关键
减少激活的T细胞的活力并且因此减少激活细胞提供了一种减少淋巴因子和促细胞分裂原产生的方法，其中淋巴因子和促细胞分裂原有助于加速动脉粥样硬化、同种异体移植排斥、某些白血病和其它免疫调节病变。另外，阻断由IL-15激活的信号转导路径也提供了一种减少淋巴因子和促细胞分裂原的产生的方法，其中淋巴因子和促细胞分裂原有助于加速动脉粥样硬化、同种异体移植排斥、某些白血病和其它免疫调节病变的。激活时，T细胞增殖并在它们细胞表面上表达适于白细胞介素的受体。另外，激活的T细胞释放至少3个淋巴因子：γ干扰素，B细胞分化因子II，和IL-3。这些淋巴因子能产生各种不希望的现象，例如同种异体移植排斥。相反，静息T细胞和长期记忆T细胞不表达淋巴因子受体。受体表达的差异提供了一种靶向激活的免疫细胞且不干扰静息细胞的方式。设计的用于识别IL-15R部分亚基的分子会识别激活的单核细胞/巨噬细胞以及激活的T细胞，并且可选择性抑制或破坏这些细胞。结合IL-15R亚基但无IL-15活性的IL-15衍生物，由于阻断了真正的IL-15的结合和/或摄取，它们在本发明的方法中有效。下述突变体IL-15分子提供了这种衍生物的实施例。
靶向IL-15R的突变体IL-15多肽
突变体IL-15的基因构建
有双突变(Q149D；Q156D)的人IL-15蛋白设计成靶向结合IL-2Rγ亚基的关键的推定位点。利用借助PCR诱变，将位置149和156极性但不带电的谷氨酰胺残基突变成天冬氨酸酸性残基。PCR扩增编码这种双突变体IL-15的cDNA，扩增时采用合成的有义寡核苷酸[5′-G GAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3′(SEQ ID NO：)；EcoRI位点(加下划线的六聚物)加145-162碱基]和合成的反义寡核苷酸(5′-C GGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAACAT GT CGACAAT-ATGTACAAAACT GTC CAAAAAT-3′(SEQ ID NO：_)；BamHI位点(加下划线的六聚物)加438-489碱基；突变的碱基单独地加下划线]。模板是含有编码人FLAG-HMK-IL-15的cDNA的质粒。扩增片段用EcoRI/BamHI消化并克隆入所述的以EcoRI/BamRI消化的pAR(DRI)59/60质粒(LeClair等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：8145，1989)。经SalI消化确定了在156位残基上存在突变，该突变引入了一个新的SalI限制酶切位点。此外，按照标准技术，由DNA测序证实了该突变。生产、纯化FLAG-HMK-IL-15(Q149D；Q156D)双突变体蛋白，并通过上述用于FLAG-HMK-IL-15野生型蛋白的测序确定。
采用同样的策略，制备在位置149或者在位置156的单氨基酸取代的突变体。如上所述，这些位置(149和156)分别对应于成熟IL-15多肽的位置101和108，它缺少48-氨基酸信号序列。
同样地，这种策略可用于在位置149或156引入任何其它突变体代替谷氨酰胺残基，或者在149和/或156之外的位置引入氨基酸取代。
有IL-15相关蛋白的条件下BAF-BO3细胞的增殖
双突变体IL-15多肽可以剂量依赖的方式抑制BAF-BO3增殖：与加入20μl同样浓度的双突变体IL-15相比，加入30μl(约50g/ml)双突变体IL-15能更彻底地抑制增殖。
PHA-刺激的人PBMCs的扩增
如下证实FLAG-HMK-IL-15双突变体多肽结合PHA激活的人PBMCs的能力。将PHA-激活的PBMCs洗涤，并在单独的培养基中或FLAG-HMK-IL-15突变体中孵育培养。细胞接着在抗-FLAG生物素化的抗体中培养，并且用偶联RED670的链霉抗生物素蛋白染色。采用流式细胞术分析染色的细胞。
FACS分析以野生型FLAG-HMK-IL-15染色的白血病细胞系
在一系列和上述类似的实验中，显示了野生型FLAG-HMK-IL-15多肽结合白血病细胞的能力。这种处理过的细胞来源于白血病细胞系MOLT-14，YT，HuT-102，以及目前在Beth Israel Hospital(Boston，MA)确定的名为2A和2B的细胞系。将PHA-激活的PBMCs洗涤，并在单独的培养基中或FLAG-HMK-IL-15突变体中孵育培养。细胞接着以生物素化的抗-FLAG抗体培养，并且用偶连RED670的链霉抗生物素蛋白染色。采用流式细胞术分析染色的细胞。
基因构建额外的突变体IL-15嵌合体多肽
除了提供具有抗原标记的突变体IL-15的FLAG-HMK-IL-15嵌合体之外，很多其它的多肽可与IL-15或IL-2的任何突变体连接。例如，突变体IL-15或IL-2按照以下方法能与IgG小类抗体的Fc片段连接。
基因构建突变体IL-15/Fc
采用标准技术以逆转录酶(MMLV-RT；Gibco-BRL，Grand Island，NY)和合成寡-dT(12-18)寡核苷酸(GibcoBRL)，从IgG2a分泌性杂交瘤中提取的mRNA生产Fcγ2a的cDNA。突变体IL-15cDNA采用IL-15特异性合成寡核苷酸由质粒模板通过PCR扩增。
设计5′寡核苷酸，在翻译起始密码子位置插入独特的NotI限制位点40核苷酸5′，同时3′寡核苷酸除去终止密码子并且修饰C-末端Ser残基密码子由AGC至TCG，以适应独特的BamHI位点在突变体IL-15/Fc接头产生。用于Fcγ2a域cDNA扩增的合成寡核苷酸改变铰链的第一密码子，由Glu至Asp，以便产生独特的生成铰链第一密码子的BamHI位点，并在终止密码子位置引入独特的XbaI位点3′。
修饰Fc片段以便使之不是针对靶细胞的清除，即，不能激活补体系统。为了制备这种不清除靶细胞的突变体IL-15结构(mIL-15/Fc)，寡核苷酸位点介导的突变用Ala残基取代C′lq结合区域的Glu318、Lys320、Lys322。同样，用Glu代替Leu235以使FcγRI结合位点失活。细胞因子和正确的翻译阅读框内Fc″成分在独特的BamHI位点的连接产生了一个1,236个碱基对的开放阅读框，它编码一个单一的总共有13个半胱氨酸残基的411个氨基酸多肽(包括18个氨基酸的IL-15信号肽)。除糖基化以外，成熟分泌性相同双体(homodimeric)IL-15/Fc预计有总计高达8个分子内和3个中-重链二硫键，并且分子量约85kDa。
mIL-15受体Fc融合蛋白的表达和纯化
在将Notl-XbaI框的融合基因克隆入真核表达质粒pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)之后，通过DNA测序证明合适的mIL-15/Fc基因构建。这种质粒携带CMV启动子/增强子，牛生长激素多聚腺苷酸信号和适于G418选择的新霉素耐药性基因。携带mIL-15/Fc融合基因的质粒通过电穿孔(1.5kV/3μF/0.4cm/PBS)转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1，来源于美国模式培养物保藏所)，并且在含有1.5mg/ml的G418(Geneticin，Gibco BRL)的无血清超-CHO培养基(Bio Whittaker Inc.，Walkerville，MD)中选择。亚克隆之后，通过ELISA(PharMingen，San Diego，CA)由IL-15筛选上清液，选择产生高水平融合蛋白的克隆。来自培养物上清液的mIL-15/Fc融合蛋白通过蛋白A琼脂糖亲和柱层析纯化，接着用PBS透析且经0.22μm过滤灭菌。纯化蛋白在使用之前于-20℃贮藏。
进行还原(有DTT)和非还原(无DTT)条件下的SDS-PAGE之后，采用单克隆或多克隆抗-mIL-15或抗Fcγ原发抗体实施蛋白质印迹分析，以评估融合蛋白的大小和同型特异性。如上所述，突变体IL-15/Fc的功能活性可由标准的T细胞增殖试验评价。下列mAb来源于PharMingen(San Diego，CA)：PE-抗-小鼠CD25(IL-2Rα链，IgG1，PC61)，大鼠抗-小鼠CD 122(IL-2Rα链，IgG2b，TM-bl)，大鼠抗-小鼠CD 132(IL2Rγc，IgG2b，TUGm2)，仓鼠抗-小鼠CD3(IgG，145-2C11)，仓鼠抗-小鼠CD28(IgG，37.51)，PE-抗-小鼠CD62L(IgG2a，MEL14)，PE偶联的仓鼠抗-小鼠Bcl-2(IgG，3F11)，PE偶联的抗-小鼠IL-2(IgG2b，JES6-5H4)，PE膜联蛋白V，生物素化抗-大鼠IgG2b，PE-链霉抗生物素蛋白，PE-细胞色素基因(CyChrome)，和PE偶联的同型对照mAb。生物素化小鼠抗-FLAG mAb和大鼠IgG1对照mAb来源于Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)。B-细胞杂交瘤分泌大鼠抗小鼠CD25mAb(TIB 222，IgG1)来源于美国模式培养物保藏所(ATCC；Manassas，VA)。细胞在不含血清的UltraCulture培养基(Bio Whittaker，Walkerville，MD)中生长，并且培养物上清液中的mAb以蛋白G柱纯化。
IL-2和IL-15的体内表达研究
重组人IL-2和IL-15购自R&D System(Minneapolis，Mon)。如先前报道的方法来构建、表达和试验IL-15-FLAG和IL-15突变体/Fc融合蛋白(Chae等，J.Immunol.157：2813-2819，1996；Kim等，J Immacnol.161：5742-5748，1998)。如先前报道的方式使用大鼠抗-小鼠γc mAb(4G3/3E12，IgG2b)(Li等J.Immunol.164：1193-1199，2000)。
以荧光染料5-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；MolecularProbes，Inc.，Portland，OR)标记淋巴细胞，如下所述。从供体小鼠中收集脾和外周淋巴结，在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中制备单细胞悬浮液。用低渗透压冲击裂解红细胞。细胞以1×107/ml浓度再悬浮于HBSS溶液中并用CFSE标记，参见Wells等所述(J Clin.Invest.100：3173-3183，1997)。
为了在体内激活CFSE-标记的T细胞，用Gammacell Exactor(Kanata，Ontario，加拿大)辐射DBA/2小鼠(1000rad)。接着每个小鼠经尾静脉注射含有4-6×107个CFSE-标记的细胞的0.5ml HBSS溶液。三天之后，处死宿主小鼠，分别收集脾和外周淋巴结。制备单细胞悬浮液，用于细胞表面染色和FACS分析。
在一些实验中，用抗-CD25mAb或抗-γc mAb处理经辐射的宿主小鼠(先在静脉内注射CFSE-标记的细胞，然后腹膜内注射抗-CD25mAb或抗-γc mAb，剂量为每天1mg，持续3天)。注射CFSE-标记的细胞之后第三天测定体内细胞分裂。先在静脉内注射标记细胞，然后用IL-15突变体/Fc融合蛋白处理小鼠，每天腹膜内注射1.5μg，持续3天。
在辐射过的同种宿主中，体内激活的CFSE-标记的细胞经染色以测定IL-2和IL-15受体亚基的表达。为了检测IL-2受体α链的表达，细胞(2×106)在冰上用PE-抗-小鼠CD25mAb染色30分钟，洗涤，然后再悬浮于含有0.5％BSA的1ml PBS中。为了检测IL-2R的β和γc的表达，细胞和大鼠抗-小鼠β链(IgG2b)或γc mAb(IgG2b)在冰上孵育培养30分钟，接着用生物素化的抗-大鼠IgG2b孵育培养。细胞经洗涤并进一步用PE-链霉抗生物素蛋白染色20分钟。细胞经洗涤并在PBS-0.5％BSA中再悬浮以便用于分析。为了检测IL-15Rα链的表达，细胞与结合α链的IL-15-FLAG融合蛋白孵育培养(Chae等，J.Inzmunol.157：2813-2819，1996)，接着用生物素化抗-FLAG mAb染色。接着洗涤细胞并用PE-链霉抗生物素蛋白染色。每个实验中都用同型匹配的对照mAbs作为对照。所有样品都用带有CellQuestTM软件的FACSort(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析。通过CFSE+细胞上的选通(gating)来收集和分析数据。如表达CD3的细胞一样，所有分裂的CFSE+细胞都是T细胞。每个样品至少收集100,000个结果。
分裂中的T细胞在体内的凋亡分析如下。如上所述，在辐射过的同种宿主中，体内刺激CFSE-标记的淋巴细胞。3天之后从宿主的脾和外周淋巴结中收集细胞，并且在标记缓冲液中用PE偶联的膜联蛋白V在冰上染色15分钟。用细胞CFSE标记分布图鉴别细胞分裂，通过膜联蛋白V染色分析每个不同细胞的凋亡。
将细胞染色，以便能观察到胞内IL-2和Bcl-2细胞因子的表达。从宿主的脾和淋巴结中收集经体内刺激3天的CFSE-标记的细胞。用PMA(50ng/ml)和离子霉素(ionomycin)(500ng/ml)再刺激细胞4小时，然后在培养的最后两小时加入GolgiStopTM(PharMingen)。细胞在4℃用Cytofix/Cytoperm(PharMingen)固定和渗透10分钟，接着用PE-偶联的抗-小鼠IL2mAb染色，用同型匹配的对照mAb作为对照。为了将Bcl-2染色，细胞用Cytofix/Cytoperm固定和渗透10分钟，接着用PE-偶联的抗-小鼠IL2mAb或同型对照Ab染色30分钟。洗涤细胞，并用FACS分析。
如下所述实施细胞分选和体外再刺激。经静脉内注射标记细胞3天后，从辐射过的同种宿主中制备CFSE-标记的细胞。通过它们的CFSE标记分布图鉴别体内细胞增殖。用FACS VantageTM分选仪(Becton Dickinson)以2000结果/秒来选择、选通和分选第二次细胞分裂。分选的细胞在添加有10％FCS和1％青霉素和5×105/ml链霉素的RPMI 1640培养基中再次悬浮，并涂覆在包被有抗-CD3(2μg/ml)和抗-CD28mAb(1μg/ml)的板上。三天后收集细胞，并用PE-偶联的抗-小鼠CD25和同型对照Ab染色。用FACS分析细胞增殖和IL-2受体α链的表达。
细胞分选和体外增殖试验如下所述。在静脉内注射标记的细胞3天后，从辐射过的同种宿主中制备CFSE-标记的细胞，并用细胞的CFSE分布图分析鉴别体内细胞增殖。用FACS VantageTM选择、选通和分选第二次细胞分裂。将细胞(1×104/ml)再次悬浮于含有10％FCS和1％青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中，并且用IL-2(40μ/ml至50μ/ml)或IL-15(5ng/ml)刺激48小时。细胞以1mCi3H-TdR(Amersham，Boston，MA)脉冲16小时，并用闪烁计数器(Beckman Instrument，Columbia，MD)测定3H-TdR的摄取。
上述的试剂和技术为几种发现提供了基础。首先，与同系对照相比(Li等，Nature Medicine 5：1298-1302，1999)，CFSE-标记的B6AF1(H-2b/d.k)同种淋巴细胞在辐射过的DBA/2(H-2d)宿主中增殖很快。过继性转移三天内，由宿主脾回收得到的大约20％的CFSE-标记的T细胞进入了细胞周期，并且能清楚地识别七至八个细胞分裂的不连续过程(图3A)。令人惊奇的是，高亲和性的IL-2受体信号传导所必需的IL-2受体α链，在头5次分裂期间不能被检测到，即这种受体亚基仅仅在五次细胞分裂之后表达。相反，所有正在分裂的T细胞都表达IL-2受体的β亚基，当细胞持续分裂时它们的表达水平逐渐地升高。γc体内表达的模式明显不同于α链和β链的表达(图3A)。未分裂的T细胞(0分裂)表达极低水平的γ链(＜10％)。随着进入细胞周期，正在分裂的T细胞高水平表达γ链，并且在各自连续的细胞分裂后表达水平持续升高。然而，五次细胞分裂后，γ链的表达急剧下调，第六次细胞分裂后几乎达到基线水平(图3A)。
IL-2受体亚基的差异表达不是因为宿主脾内部分激活的T细胞的选择性积累，而是由于从外周淋巴结收集的CFSE-标记的细胞对这三种IL-2受体亚基表现出显著相同的表达模式。
第二，体外刺激CFSE-标记的T细胞导致IL-2受体所有三种亚基的均匀表达(图3B)。这表明IL-2受体体内表达的调节不同于体外的调节。已知IL-2受体α链在体内对解蛋白剪切敏感，该方式类似于对选择蛋白(Hemar等，J.Cell.Biol.129：55-64，1995)。对体内正在分裂的T细胞表达的L-选择蛋白进行染色，显示L-选择蛋白在头五次细胞分裂期间高水平表达(图3C)，这就说明头五次细胞分裂期间检测不到IL-2受体α链的表达不是因为解蛋白的快速剪切。为了测定在头五次细胞分裂期间T细胞是否能够表达IL-2受体α链，分选第二次细胞分裂期的T细胞，该T细胞不表达IL-2受体α链，并且以固定化抗-CD3和可溶的抗-CD28刺激3天。紧接着体外再刺激这些分选的T细胞继续分裂，所有分裂的T细胞表达IL-2受体α链。非常明显，IL-2受体α链在体内和体外的表达受不同的调节。
由于IL-15受体也采用IL-2受体α和γ链作为关键的信号传导元件(Tagaya等，Inmunity 4：329-336，1996)，这些链在头五次分裂期间被高度表达，于是我们就会问细胞会不会在分裂初始期间表达对IL-15起反应的IL-15受体α链。将IL-15-FLAG融合蛋白用作初始的染色试剂(Chae等，J.Immunol.157：2813-2819，1996)，证实了在分裂T细胞上IL-15受体α链尽管水平低，不考虑细胞分裂的数目是可清楚检测的，(图4A)。IL-2受体α链不是在所有体内分裂T细胞上都能检测到。因此，在头五次细胞分裂期间IL-15受体而不是IL-2受体上的α链的选择性表达，与共享的β、γ链的表达一道，暗示了体内初始细胞分裂有可能是IL-15-依赖的，但是不是IL-2-d依赖的。
为了测试这种假设，在体内分裂T细胞内评价IL-2的产生。细胞内的IL-2染色揭示IL-2仅仅在已分裂超过五次的细胞内高度表达。用饱和剂量的溶细胞抗-CD25mAb处理宿主小鼠未能抑制头五次分裂(相对于对照Ab处理的小鼠)，经抗-CD25处理的小鼠和对照小鼠的第一次和第五次分裂中的分裂细胞明显类似。此外，分选体内第二次细胞分裂的T细胞，并在有IL-2或IL-15的条件下体外培养，通过3H-TdR摄取分析细胞增殖。含高达500u/ml剂量的IL-2培养物不能支持T细胞增殖。相反，IL-15强烈地刺激增殖(图4B)。
IL-2体内表达模式与IL-2受体α和β链的上调紧密相关，还和普通的γ链表达的显著减少紧密相关(图5A)。这暗示IL-2调节γ链的体内表达。为了测试这种可能性，在IL-2缺失小鼠和野生型对照鼠中检测γ链的表达。与野生型对照组相比，IL-2缺失小鼠的CD4+T细胞在细胞表面上表达了高水平的γ链(图5B)。用抗-CD25处理宿主小鼠抑制了体内分裂T细胞γ链的下调，但是这种处理对IL-2受体β链表达无影响(图5C)。
对于所有已知的T细胞生长因子而言γ链是关键的信号传导元素，并且γ链信号对于细胞存活是必需的，它至少部分上经Bcl-2族抗凋亡蛋白的持续表达完成(Nakajima等，J.Exp.Med.185：189-195，1997)。为了测定在五次细胞体内分裂后，γ链表达的下降是否会调节克隆扩增，CFSE-标记的细胞在从宿主回收后用PE-膜联蛋白V染色，并且在体内分析正在分裂的T细胞的凋亡。突然的细胞死亡发生在四次细胞分裂之后。未分裂的细胞(0分裂)中具有＜10％的膜联蛋白V阳性细胞。然而，第六次分裂之后，～40％的细胞是膜联蛋白V阳性。由于取自Fas突变体MRL-lpr小鼠的T细胞和体内细胞凋亡模式类似，因此这种类型的细胞死亡不是Fas依赖性的(Li等，J.Immlmol.163：2500-2507，1999)。对Bcl-2表达染色显示了Bcl-2染色的平均通道荧光强度在四次细胞分裂之后显著减小(图5E)。因此，紧接着γ链下调的信号传导结果不能支持持续的Bcl-2表达，并且细胞变得对凋亡的细胞死亡敏感(Nakajima等，J.Exp.Med.185：189-195，1997)。
这些结果暗示阻断IL-2或IL-15的信号传导对T细胞体内扩展有不同的影响。为了进一步探究这种可能性，将取自IL-2缺失小鼠(H-2b)的CFSE-标记的淋巴细胞注射到辐射过的DBA/2宿主(H-2d)，三天后体内分析细胞分裂并且与野生型对照小鼠内的结果比较。来自IL-2缺失小鼠的T细胞连续分裂并且在体内扩增。约30％的CFSE-标记的细胞进入细胞周期，与对照组相比，这些细胞的大多数分裂超过五次。
用IL-15突变体/Fc处理宿主小鼠，以充当IL-15受体特异性拮抗剂(Kim等，J.Immunol.161：5742-5748，1998)，经处理的小鼠明显减少了CFSE-标记T细胞的增殖频率，并且在处理过的小鼠内，绝大多数的CFSE-标记细胞不能进入细胞周期。此外，通过采用mAb阻断IL-2与IL-15受体都具有的信号传导元件γ链来处理宿主小鼠，结果显示能明显抑制体内T细胞分裂。因此，IL-2和IL-5调节体内T细胞扩增的不同方面，并且如上所述，通过给予这些白细胞介素的拮抗剂能够抑制免疫应答。
这些结果也证实γ链的下调需要T细胞激活和细胞周期进程以及IL-2的信号传导。很明显，γ链在体内表达的下调与IL-2生产和高亲和性的IL-2受体表达密切相关。在缺少IL-2条件下，细胞在极高水平表达γ链，并且IL-2受体功能的阻断抑制了体内周期性T细胞中γ链表达水平的下调。因此，这些研究提供IL-2和IL-15在体内调节原始T细胞激活的不同方面的新证据。与传统的基于体外研究的看法和结论相反，IL-15在初始化T细胞体内分裂中是一个关键的生长因子，IL2在体内的独特作用是通过调节周期性T细胞上γ链表达来控制克隆扩增的大小。
这些结果支持上述的临床应用。用外源IL-2在肿瘤免疫和AIDS患者中激发T细胞应答会促进早熟的T细胞死亡，并且在诱导耐受和自体免疫患者中阻断IL-2的治疗会诱导不希望的T细胞扩增。此外，IL-15和IL-2分阶段和联合的靶向代表了在T细胞依赖的细胞变性条件中阻断T细胞激活的一种重要方法。
裂解性IL-2/Fc裂解带有IL-2R的细胞且结合FcRI
T细胞系细胞(CTLL-2细胞；106)用100mCi51Cr标记，并且与裂解形式的IL-2/Fc和大鼠低毒性补体(C′)，非裂解形式的IL-2/Fc和C′，鼠免疫球蛋白和C′(阴性对照)或单独的C′(0.5μg/ml浓度的阴性对照)孵育培养。另一组的相同细胞用去污剂(1％NP40)(阳性对照)处理。通过51Cr的释放测量细胞裂解。在有去污剂条件下观察到的裂解度代表100％裂解。处理之后按照这种公式计算如上所述的特异裂解：％特异裂解＝[(实验的cpm-背景cpm)/(总的释放cpm-背景cpm)×100％]。图6所示的结果支持下述结论：溶细胞IL-2/Fc裂解带有IL-2R的CTLL-2细胞，但非-裂解IL-2/Fc不会的。
为了评价在FcRI-转染的CHO细胞中(鼠FcRI，FcRII，和IL-2R-阴性)裂解和非裂解IL-2/Fc结合Fc受体的能力，FcRI转染子和PBS，mIgG2a，裂解性IL-2/Fc，或非裂解性IL-2/Fc预培养。洗涤之后，用荧光接合的山羊抗小鼠Fc染色细胞用于FACS分析。如图7所示，溶细胞IL-2/Fc可结合FcRI，但是裂解性IL-2/Fc不会。
裂解性IL-2/Fc在过继转移模型中能有效预防的糖尿病
创建两个不同突变体IL-2/Fc。第一个突变体包含一个取自鼠IgG2a的Fc末端，它会介导CDC和CDCC(IL-2/Fc)，第二个突变体是一个点突变Fc部分，它不会激活CDC或CDCC(IL-2/Fc-/-)的。然而，IL-2/Fc能在含有IL-2R的细胞中介导CDC(例如鼠CTLL-2T细胞系中的那些)并且结合FcRI，而IL-2/Fc-/-则不会(图6和7)。此外，在一个NOD过继转移模型中，裂解性IL-2/Fc分子会防止糖尿病的发生，但是该分子的非裂解形式(IL-2/Fc-/-)则不具有这种能力(图13)。在动物模型中，用ACK裂解缓冲液处理单分散的脾细胞，去除了其中的红细胞(Bio Whittaker Inc.，Walkersville，MD)。用取自急性糖尿病雌性NOD小鼠(高血糖＜两周)的2×107个脾白细胞，注射8至12周龄的辐射(700拉德)过的无糖尿NOD病雄性受体。每周检验血糖水平(BGL)，当任何一次测量中BGL大于16.5mmol/L或者连续三天大于13.8mmol/L时，诊断为糖尿病。如图13所示，即使在这种处理中止后，大多糖的动物仍然无糖尿病。
如上所提到的，本文中出现的实验和动物模型可用于试验各种组合的本发明制剂的治疗功效。
在体内移植物抗宿主模型中雷帕霉素抑制T细胞增殖，但是不抑制激活T细胞的凋亡
在体内移植物抗宿主模型(如上所述)中，分析在IL-2/Fc和雷帕霉素存在的条件下宿主反应性T细胞的命运。如图8所示，即使在有BL-2/Fc的条件下，雷帕霉素也会抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖，但是会允许功能性IL-2R的表达。如膜联蛋白V染色证明的，在有IL-2/Fc和雷帕霉素(图10)的条件下，抗原激活的宿主反应性T细胞在会凋亡。
本发明的组合物可使胰岛和皮肤同种异体移植长期存活
为了防止移植入急性糖尿病NOD受体中的同种异体胰岛排斥或移植到NOD小鼠上的皮肤移植物被排斥，使用促进T细胞死亡和抑制T细胞增殖的制剂组合物。如图11和12所示，裂解IL-2/Fc，mutlL-15/Fc和雷帕霉素的组合物被证明在防止移植排斥中有效(并且比其它的试验的治疗方案更有效)。在整个观察期都表现出移植物存活和移植物功能，并且在治疗停止之后大多数移植物都存活。这种惊人作用相信是因为使用了组合制剂(促进T细胞死亡以及抑制T细胞增殖的制剂)。
已经描述了本发明大量的实施方案。然而，在不背离本发明的精神和范围下实施的各种修正是可以理解的。因此，其它的实施方案在权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种治疗组合物，它包括第一制剂：白细胞介素15(IL-15)拮抗剂，和第二制剂：白细胞介素-2(IL-2)激动剂。
2.权利要求1的治疗组合物，其特征在于第一制剂包括实质上纯的突变体IL-15多肽，其中该多肽能结合IL-15R的一个亚基。
3.权利要求2的治疗组合物，其特征在于所述的亚基是IL-15Rα亚基。
4.权利要求3的治疗组合物，其特征在于突变体IL-15多肽在SEQ IDNO：2的156位点有一个突变。
5.权利要求4的治疗组合物，其中突变体IL-15多肽在SEQ ID NO：2的149位点有一个突变。
6.权利要求4的治疗组合物，其中在SEQ ID NO：2的156位置的突变是天冬氨酸取代谷氨酰胺。
7.权利要求5的治疗组合物，其中在SEQ ID NO：2的149位置的突变是天冬氨酸取代谷氨酰胺。
8.权利要求5的治疗组合物，其中突变体IL-15多肽在SEQ ID NO：2的位置149和156以天冬氨酸取代谷氨酰胺。
9.权利要求2的治疗组合物，其中第一制剂进一步包括一个使具有IL-15R的细胞被清除的功能部分。
10.权利要求9的治疗组合物，其中裂解具有IL-15R的细胞的部分是IgG分子的Fc区。
11.权利要求1的治疗组合物，其中第一制剂包括实质上纯的抗-IL15R抗体。
12.权利要求1的治疗组合物，其中第二制剂包括特异性结合IL-2或IL-2R的抗体。
13.权利要求1的治疗组合物在制备用于抑制病人免疫应答的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中病人具有免疫疾病或者具有发生免疫疾病的风险。
15.权利要求14的用途，其中病人具有自身免疫性疾病或者具有发生自身免疫性疾病的风险。
16.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是风湿性疾病，包括全身性红斑狼疮，斯耶格伦氏综合征，硬皮病，混合性结缔组织病，皮肌炎，多肌炎，莱特尔氏综合征或贝切特氏病。
17.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是风湿性关节炎。
18.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是I型糖尿病。
19.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是选自桥本甲状腺炎和格雷夫斯氏病的甲状腺自身免疫性疾病。
20.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是选自多发性硬化、重症肌无力和脑脊髓炎的中枢神经系统自身免疫性疾病。
21.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是选自寻常性天疱疮、增殖性天疱疮、落叶性天疱疮、塞-阿二氏综合征和巴西天疱疮的各种天疱疮。
22.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是牛皮癣。
23.权利要求15的用途，其中自身免疫性疾病是炎症性肠病。
24.权利要求13的用途，其中病人患有获得性免疫缺损综合症(AIDS)。
25.权利要求13的用途，其中病人已经接受了生物器官、组织或细胞移植。
26.权利要求13的用途，其中病人患有移植物抗宿主病。
27.权利要求1的治疗组合物在制备用于消除表达IL-15受体的细胞的药物中的用途。
28.权利要求27的用途，其中细胞是免疫系统细胞。
29.权利要求27的用途，其中细胞是恶性细胞。
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