ES2322936T3 - Modulacion de las respuestas de las celulas t mediadas por il-2 y por il-15. - Google Patents
Modulacion de las respuestas de las celulas t mediadas por il-2 y por il-15. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición para uso como medicamento que incluye un primer agente que es un antagonista de interleuquina 15 (IL-15), en donde el antagonista de IL-15 es un polipéptido mutado de IL-15 que tiene al menos 65% de identidad con IL-15, y en donde el antagonista de IL-15 se enlaza con e inhibe una actividad de IL-15 o a un receptor de IL-15, y un segundo agente que es un agonista de interleuquina 2 (IL-2), en donde el agonista es un polipéptido de IL-2, un polipéptido mutado de IL-2 o un anticuerpo receptor anti-IL-
Description
Modulación de las respuestas de las células T
mediadas por IL-2 y por IL-15.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
solicitud estadounidense de patente No. 60/232.251.
Esta invención se relaciona con inmunología,
rechazo de trasplantes, y con enfermedades asociadas con el sistema
inmune.
El trabajo descrito aquí fue apoyado en parte
por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud. El
gobierno de los Estados Unidos puede, por lo tanto, tener ciertos
derechos en la invención.
Dos de las interleuquinas, IL-2
e IL-15, son funcionalmente redundantes en estimular
la proliferación de células T in vitro. Sin embargo, su
papel en la activación inmune primaria y en la homeostasis inmune
in vivo es mucho menos claro. In vivo,
IL-2 e IL-15 pueden tener distintas
funciones y regular distintos aspectos de la activación de las
células T. Por ejemplo, IL-2 puede cebar las células
T activadas por apoptosis (Lenardo, Nature 353: 858 - 861, 1991),
mientras que IL-15 puede dar soporte para la
supervivencia de las células (Dooms y colaboradores, J. Immunol.
161: 2141 - 2150, 1998; Bulfone y colaboradores, Nature Medicine 3:
1124 - 1128, 1997). IL-15 también parece dirigir la
proliferación de las células T CD8^{+} de memoria in vivo
mientras que IL-2 limita su expansión continuada
(Ku y colaboradores, Science 288: 675 - 678, 2000). Además, el
fenotipo de los ratones deficientes en IL-2 es
linfoproliferativo y autoinmune (Horak y colaboradores, Immunol.
Rev. 148: 35 - 44, 1995), mientras que los ratones deficientes en
IL-15 son algo linfopénicos e incapaces de montar
una respuesta al reto viral (Kennedy y colaboradores, J. Exp. Med.
191: 771 - 780, 2000; Lodolce y colaboradores, Immunity 9: 669 -
676, 1998). La base molecular para esta notable dicotomía sigue
siendo enigmática.
Los receptores funcionales para
IL-2 e IL-15 consisten de una cadena
aislada \alpha, que define la especificidad del enlazamiento para
IL-2 o IL-15, y al receptor \beta
compartido de IL-2 y a las cadenas \gamma. La
cadena \gamma es también un componente crítico de señalización de
los receptores IL-4, IL-7 e
IL-9 (Sugamura y colaboradores, Ann: Rev. Immunol.
14: 179 - 205, 1996). En el compartimiento linfoide, estas
subunidades receptoras se pueden expresar individualmente o en
diferentes combinaciones resultando en la formación de receptores
con diferentes afinidades y/o con distintas capacidades de
señalización (Sugamura y colaboradores, ver más arriba). Por
ejemplo, la cadena \beta puede asociarse ya sea con la cadena
\alpha o con la cadena \gamma para formar estructuras
diméricas, o con ambas cadenas, la \alpha y la \beta para formar
estructuras triméricas. En forma similar, la cadena \gamma puede
interactuar con la cadena \beta y, a través de la cadena \beta,
con la cadena \alpha ya sea del receptor EL-2 o
del receptor E-15. La cadena \alpha sola del
receptor de IL-15, en contraste con la cadena
\alpha del receptor de IL-2, puede enlazarse a
IL-15 con una afinidad notablemente alta (Giri y
colaboradores, EMBO J. 14: 3654 - 3663, 1995). Sin embargo en forma
similar a la cadena \alpha del receptor de IL-2 no
se cree que esta interacción active los eventos de señalización.
Por lo tanto, la trimerización de las subunidades de cadena
\alpha, \beta y \gamma es esencial para la integridad funcional de los receptores de alta afinidad tanto para IL-2 como para IL-15.
\alpha, \beta y \gamma es esencial para la integridad funcional de los receptores de alta afinidad tanto para IL-2 como para IL-15.
Los estudios in vitro han mostrado que
las células T activadas pueden expresar tanto a la cadena \alpha
del receptor de IL-2 como a la cadena \alpha del
receptor de IL-15 (Chae y colaboradores, J. Immunol.
157: 2813 - 2819, 1996) y las cadenas \beta y \gamma son
expresadas constitutivamente por las células T activadas (Ishii y
colaboradores, Int. Immunol. 6: 1273 - 1277, 1994). Además, tanto
IL-2 como IL-15 se detectan
fácilmente durante la activación inmune in vivo (Li y
colaboradores, J. Immunol. 161: 890 - 896, 1998). De este modo, no
es claro cómo las células T activadas distinguen entre
IL-2, IL-15, y otras citoquinas que
dependen de la cadena \gamma in vivo.
Kim y colaboradores (J Immunol. 1998 Enero 15;
160(12): 5742 - 8) describen un antagonista de
IL-15 específico del sitio del receptor generado
por la mutación de los residuos de glutamina con el terminal C de
IL-15 hasta ácido aspártico y enlazar genéticamente
este IL-15 mutante con la gama 2\alpha de Fc de
múrido. Estas proteínas mutantes de IL-15 se
enlazan específicamente con la IL-15R.
Bulfone-Paus y colaboradores
(Cytokine. 1997 Julio; 9(7): 507 - 13) describen una
regulación diferencial de las funciones del linfoblasto T humano
por medio de IL-2 e IL-15. Ellos
seleccionaron las diferencias funcionales entre
IL-2 e IL-15 con respecto al control
de las funciones de la célula T.
WO 97/41232 describe un polipéptido antagonista
de IL-15, particularmente un polipéptido de
IL-15 que tiene una mutación en la posición 156 y
opcionalmente en la posición 149 comparado con la
IL-15 de tipo silvestre. Adicionalmente, el
polipéptido se puede fusionar a la región Fc de IgG.
Zheng y colaboradores (J Immunol. 1999 Octubre
1; 163(7): 4041-8) describen una proteína de
fusión IL-2/Fc citolítica dirigida al receptor de
IL-2, que puede ser utilizada para el tratamiento de
la autoinmunidad diabetogénica en ratones diabéticos no obesos.
La presente invención se basa, en parte, en
estudios de expresión de las subunidades receptoras de
IL-2 e IL-15 por medio de
ciclización de células T in vivo. Sorprendentemente, estas
subunidades dirigen las respuestas de las células T activadas a
IL-2 o IL-15 en una forma selectiva
y, por lo tanto, regulan la respuesta de las células T in
vivo. En otras palabras (y contrario a la sabiduría convencional
de que EL-2 e IL-15 son
redundantes), IL-2 e IL-15 realizan
diferentes papeles en el control de la proliferación de las células
T in vivo. En particular, IL-5 es crítico
para iniciar la división de las células T, mientras que
EL-2 controla la expansión de las células T a
través de la reducción de la expresión de \gammac. Por lo tanto,
en una modalidad, la invención generalmente caracteriza nuevas
combinaciones de agonistas de IL-2 y antagonistas
de IL-15 y métodos para suprimir la respuesta inmune
por medio de la administración de esos agonistas y antagonistas. En
cada caso, se logra la supresión por medio de la administración de
un primer agente que antagoniza a una molécula de
IL-15 o a un receptor de IL-15
(IL-15R) y un segundo agente que agoniza a una
molécula de IL-2 o a un receptor de
EL-2 (Il-2R). En modalidades
alternativas, las composiciones de la invención pueden incluir (en
lugar de, o además de, los agentes descritos anteriormente), agentes
que inhiben la expresión de los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN
o ARN) que codifican una interleuquina (esto es,
IL-15) o un receptor de interleuquina (esto es, el
receptor de IL-15).
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con una composición para uso como medicamento que comprende un
primer agente que es un antagonista de la interleuquina 15
(IL-15), en donde el antagonista de
IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos un 65% de identidad con
IL-15, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza a e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y un
segundo agente que es un agonista de la interleuquina 2
(IL-2), en donde el agonista es un polipéptido de
IL-2, un polipéptido mutado de IL-2
o un anticuerpo receptor de
anti-IL-2.
Otro aspecto de la invención se relaciona con el
uso de antagonistas de IL-15, en donde el
antagonista de IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos un 65% de identidad con
IL-1, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza a e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y un
agonista de IL-2, en donde el agonista es un
polipéptido de IL-2, un polipéptido mutado de
IL-2, o un anticuerpo del receptor de
anti-IL-2 para la preparación de
una composición terapéutica para suprimir una respuesta inmune en un
paciente.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de una antagonista de IL-15, en donde el antagonista
de IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos un 65% de identidad con
IL-15, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza a e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y un
agonista de IL-2 en donde el agonista es un
polipéptido de IL-2, un polipéptido mutado de
IL-2, o un anticuerpo del receptor de
anti-IL-2 para la preparación de
una composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad
maligna de IL-15R^{+}.
Más generalmente, la invención ofrece nuevas
combinaciones de agentes que, cuando se los administra a un
paciente, reducen el número de células T que reaccionan con el
antígeno. Por ejemplo, la invención ofrece composiciones (por
ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables) que incluyen
dos o más agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de
células T. Alternativamente, la composición puede contener al menos
un agente que promueve la muerte de células T y al menos un agente
que inhibe la proliferación de células T. El agente que promueve la
muerte de células T puede promover la AICD (muerte celular inducida
por activación), muerte pasiva de células, ADCC (citotoxicidad
celular dependiente del anticuerpo) o CDC (citotoxicidad dependiente
del complemento).
Los agentes que promueven la AICD incluyen a las
moléculas de IL-2 y moléculas relacionadas (por
ejemplo, IL-2/Fc u otras moléculas que funcionen
como agonistas de IL-2 o del receptor de
IL-2 (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza
específicamente al receptor de IL-2 e imita el
enlazamiento del ligando natural del receptor)). Otro agente que
promueve la AICD es el Ligando Fas, (FasL). Los agentes que
promueven la muerte celular pasiva incluyen a los agentes que
antagonizan a IL-15 (por medio de selección, por
ejemplo, por enlazamiento a, y por lo tanto inhibiendo la actividad
de, IL-15, un receptor de IL-15, o
un componente de la ruta de señalización intracelular que se activa
una vez que el receptor está enlazado) o cualquier otro factor
requerido para la supervivencia de las células T (por ejemplo,
IL-4, IL-7, ligando
OX-4, IFN-\beta,
4-1BB, o IGF-I). En modalidades
alternativas, las composiciones de la invención pueden incluir (en
lugar de, o además de, uno o más de los agentes descritos
anteriormente), agentes que inhiben la expresión de los ácidos
nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) que codifican una interleuquina
(esto es, IL-15) o un receptor de interleuquina
(esto es, el receptor de IL-15).
Se puede promover ADCC o CDC por medio de la
exposición de una célula T a un agente que se enlaza a la superficie
de la célula T y contiene una porción de Fc que activa la ADCC o la
CDC. Más específicamente, los agentes que promueven la ADCC o la
CDC incluyen a las proteínas de fusión que contienen una
interleuquina (por ejemplo, IL-2 o una
IL-15 mutante) y una región Fc (por ejemplo,
IL-2/Fc) así como anticuerpos u otras proteínas que
contienen Fc que se enlazan a un receptor de interleuquina (por
ejemplo, una IL-2 o un receptor de
IL-15).
Como se estableció anteriormente, las
composiciones de la invención pueden incluir no únicamente a un
agente que promueva la muerte de células T, si no también a un
agente que inhiba la proliferación de células T. Los agentes que
inhiben la proliferación de células T incluyen rapamicina, mofetil
micofenolato (MMF), azatioprina, y cualquiera de los otros agentes
conocidos y utilizados en el arte para prevenir la proliferación
celular (incluidos los agentes quimioterapéuticos). El uso de un
agente que inhibe la proliferación de células T es particularmente
útil en combinación con agentes que promueven la AICD y también
estimulan la proliferación de células T (tales como
IL-2/Fc). Por ejemplo, la invención ofrece una
composición farmacéuticamente aceptable que incluye
IL-2/Fc (que promueve, por ejemplo, la AICD y la
lisis celular a través de la ADCC o la CDC), un antagonista de
IL-15 (que promueve, por ejemplo, la muerte celular
pasiva por medio de la antagonización de IL-15, un
factor requerido para la supervivencia de las células T), y
rapamicina (que inhibe la proliferación de células T). Se describen
más adelante las composiciones que contienen otras combinaciones de
agentes. Notablemente, cuando se emplean dos o más agentes, no
necesitan estar físicamente separados uno del otro. Mientras que un
agente puede ser una entidad única que tiene principalmente una
actividad funcional (por ejemplo, un anticuerpo que dirige
IL-2 o IL-15 por medio de
enlazamiento específico de IL-2 o
IL-15), puede ser también una entidad individual
que tiene al menos dos actividades funcionales (por ejemplo,
IL-2/Fc, mIL-15/Fc, o un anticuerpo
anti-IL-2 o
anti-IL-15; en estas moléculas estas
moléculas, la interleuquina media la AICD y la porción Fc de la
molécula media la CDC y la ADCC). De este modo, la composición que
incluye (1) un agente que induce la AICD, (2) un agente que induce
la CDC, y (3) un agente que inhibe la proliferación celular pueden
incluir únicamente dos ingredientes activos (por ejemplo, (1) una
molécula de IL-2/Fc, que induce la AICD y la CDC, y
(2) rapamicina, que inhibe la proliferación celular).
Las composiciones descritas aquí son útiles en
el tratamiento de pacientes que se beneficiarían de la
inmunosupresión (por ejemplo, un paciente que ha recibido o está
programado para recibir, un trasplante; un paciente que tiene una
enfermedad inmune, particularmente una enfermedad autoinmune; un
paciente que tiene cáncer (por ejemplo, un cáncer de un sistema
inmune), o un paciente que sufre de una enfermedad injerto versus
huésped (GVHD)). La GVHD se caracteriza por una respuesta de
leucocitos donantes contra antígenos en el receptor. Esta respuesta
es particularmente problemática en trasplantes de médula ósea, pero
también se presenta en trasplantes de órganos completos; los
leucocitos de los donantes residentes en los órganos trasplantados
son siempre cotrasplantados.
Aunque las composiciones de la invención pueden
contener más de un agente, los métodos de la invención no se
limitan a aquellos en los cuales se administran los agentes en forma
simultánea. Por ejemplo, un paciente podría recibir una composición
que contiene un antagonista de IL-15 o un
antagonista de IL-15R antes de recibir una
composición que contiene un agonista de IL-2. En
forma similar, un paciente podría recibir una composición que
contiene rapamicina antes de recibir una composición que contiene un
agonista de IL-2.
Además, las composiciones de la invención
(aplicadas en forma simultánea o en forma secuencial) se pueden
utilizar para tratar un injerto celular o de órgano antes de ser
implantado a un paciente. Los agentes de la invención, y los
métodos para su uso, son descritos adicionalmente más adelante.
Muchos de los agentes utilizados en el contexto
de la presente invención tienen características terapéuticas
ventajosas. Por ejemplo, agentes que dirigen una
IL-15R pueden ser proteínas de fusión que incluyen a
un polipéptido mutante de IL-15
(mIL-15). Estos agentes no son probablemente
inmunogénicos debido a que la porción mutante de
IL-15 de la proteína de fusión puede diferir de la
IL-15 de tipo silvestre únicamente por unos pocos
residuos sustituidos. Además, ya que los polipéptidos de
mIL-15 pueden enlazar a la
IL-15R\alpha con alta afinidad, ellos pueden
competir efectivamente con la IL-15 de tipo
silvestre por el receptor. Además, los agentes de la invención
pueden activar a los componentes del sistema inmune del huésped tal
como al complemento y a los fagocitos, que en última instancia
median la eliminación de (o el agotamiento de) las células que
soportan al receptor (por ejemplo, un receptor de
IL-2) al cual se enlazan el agente. Por ejemplo, los
agentes de la invención pueden mediar la lisis o la fagocitosis de
las células objetivo. Ya que la subunidad alfa del receptor de
IL-15 (IL-15R\alpha) se expresa
por medio de células inmunes malignas o activadas, pero no por
células inmunes en reposo, los agentes de la invención pueden ser
utilizados para dirigir específicamente aquellas células que han
sido activadas (por ejemplo, células T activadas por antígeno) o que
se han convertido en malignas. De este modo, aunque las células T
representan un objetivo preferido para los agentes de la invención,
pueden ser usadas también las composiciones de la invención para
dirigir otras células involucradas en la patogénesis de desordenes
inmunológicos, tal como otras células del sistema inmune o células
hiperproliferativas de tejidos.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo
significado que usualmente entienden aquellas personas
ordinariamente capacitadas en el arte a los cuales les pertenece
esta invención.
La Fig. 1 es una representación de una secuencia
de ácido nucleico de la IL-15 de tipo silvestre
(SEQ ID NO: 1) y la secuencia predicha de aminoácidos (SEQ ID NO:
2).
La Fig. 2 es una representación de una secuencia
de ácido nucleico de la IL-15 mutante (SEQ ID NO: 3)
y la secuencia predicha de aminoácidos (SEQ ID NO: 4). El codón de
tipo silvestre que codifica a la glutamina en la posición 149, CAG,
y el codón de tipo silvestre que codifica a la glutamina en la
posición 156, CAA, han sido cambiadas ambas a GAC, que codifica
aspartato. (Estas posiciones (149 y 156) corresponden a las
posiciones 101 y 108, respectivamente, en el polipéptido de la
IL-15 madura, que carece de una secuencia de señal
en el aminoácido 48).
La Fig. 3A es una serie de gráficas que
describen la expresión de las cadenas \alpha, \beta y \gammac
del receptor de IL-2 por medio de la división de las
células T en un bazo huésped 3 días después de la inyección
intravenosa (i. v.) de células marcadas con CFSE. Se muestran los
datos representativos de seis experimentos.
La Fig. 3B es una serie de gráficas que
describen la expresión de las cadenas \alpha, \beta y \gammac
del receptor de IL-2 por medio de la división de las
células T in vitro. Los linfocitos de las células marcadas
con CFSE fueron estimuladas con anti-CD3 (2
\mug/ml) in vitro durante tres días. Se analizaron la
división de las células y la expresión de las subunidades del
receptor de IL-2 por medio de la clasificación de
las células activadas por fluorescencia (FACS).
La Fig. 3C es una gráfica que describe la
expresión de selectina L por medio de la división de células T in
vivo. Las células fueron cosechadas de nodos linfáticos de
ratones huésped tres días después de la inyección intravenosa de
las células marcadas con CFSE y coloreadas con mAb
PE-anti-CD62 L. El cuadrante fue
programado con base en las células coloreadas con mAb isotipo de
control.
La Fig. 3D es una serie de gráficas que
describen la expresión diferencial del receptor de la cadena
\alpha del receptor de IL-2 entre células T que
se dividen in vivo. Se estimularon las células marcadas con
CFSE in vivo durante tres días y se clasificaron las células
en la segunda división celular. Las células clasificadas fueron
estimuladas nuevamente in vitro con anti-CD3
y anti-CD28 durante tres días. Se analizaron la
división de las células y la expresión de la cadena \alpha del
receptor de IL-2 por medio de FACS.
La Fig. 4A es una serie de gráficas que
describen la expresión de la cadena \alpha del receptor de
IL-15 por medio de la división de las células T
in vivo tres días después de la inyección intravenosa de las
células marcadas con CFSE. Se colorearon las células con la proteína
de fusión de IL-15-FLAG, seguido por
la coloración con mAb anti-FLAG biotinilado y
PE-estreptavidina. La coloración de las células en
ausencia de IL-15-FLAG fue incluida
como control.
La Fig. 4B es una gráfica de barras que describe
las diferentes respuestas de la división in vivo de las
células T a IL-2 e IL-15 in
vitro. Se estimularon los linfocitos marcados con CFSE in
vivo durante tres días y se analizó la división celular por
medio del examen del perfil de CFSE. Se clasificaron las células T
en la segunda división celular y se cultivaron las células (1 x
10^{4}) in vitro con IL-2 o
IL-15 durante dos días. Se determinó la
proliferación celular por medio de la absorción de
^{3}H-TdR. Se presentan los resultados como el
promedio de CPM \pm SD de los ensayos por triplicado.
La Fig. 4C es un par de gráficas que describen
el efecto del tratamiento con anti-CD25 sobre la
división de las células T in vivo. Se les suministró a los
ratones huésped el mAb anti-CD25 en forma
intraperitoneal (i. p.) a razón de 1 mg/día durante tres días
inmediatamente antes de la inyección intravenosa de las células
marcadas con CFSE. Se incluyeron los ratones tratados con el mAb
isotipo de control (IgG 1 de rata) como control.
La Fig. 5A es una serie de gráficas que
describen la coloración de la IL-2 intracelular de
células T que se dividen in vivo. Las células marcadas con
CFSE fueron estimuladas in vivo durante tres días. Las
células cosechadas del bazo hospedero fueron estimuladas in
vitro con PMA y ionomicina durante cuatro horas en presencia de
GolgiStop^{TM}. Se fijaron luego las células, se las permeabilizó,
y coloreó para la producción de IL-2. Se incluyeron
las células coloreadas con el mAb isotipo de control como
control.
La Fig. 5B es un par de gráficas que describen
la expresión de \gammac por parte de las células T CD4^{+} de
ratones eficientes en IL-2. Se colorearon las
células de bazo de ratones deficientes en IL-2 y en
ratones de control de tipo silvestre con mAb de CD4
PE-antiratón y mAb de \gammac del receptor de
IL-2 FITC-antiratón. Se analizó por
FACS la expresión de \gammac por medio de células T CD4^{+}.
La Fig. 5C es una serie de gráficas que
describen el efecto del tratamiento anti-CD25 sobre
la expresión de \gammac por medio de la división de las células T
in vivo. Se les suministró a los ratones huésped mAb
anti-CD25 a razón de 1 mg/día (i. p.) durante tres
días inmediatamente antes de la inyección intravenosa de células
marcadas con CFSE. Se determinó la expresión de las cadenas \beta
y \gamma del receptor de IL-2 sobre la división
de las células T in vivo el día tres (esto es, tres días
después de la inyección de células marcadas con CFSE). Los ratones
tratados con un mAb isotipo de control (IgG 1 de rata) fueron
incluidos como control.
La Fig. 5D es una serie de gráficas que
describen la muerte de células apoptóticas de células T que se
dividen in vivo. Se estimularon in vivo células
marcadas con CFSE durante tres días. Se cosecharon las células del
bazo hospedero y se las coloreó con PE-anexina V. La
división celular y la muerte celular apoptótica fueron analizadas
por medio de FACS.
La Fig. 5E es una serie de gráficas que
describen la expresión intracelular de Bcl-2 por
medio de la división de las células T in vivo. Se
estimularon las células marcadas con CFSE in vivo durante
tres días. Las células cosechadas del bazo hospedero fueron
coloreadas con mAb Bcl-2
PE-antiratón o un mAb isotipo de control. La
división celular y la expresión de Bcl-2 fueron
analizadas por medio de FACS.
La Fig. 6 es una barra gráfica que describe los
resultados de un experimento en el cual la muerte celular (evaluada
por medio de la liberación del isótopo ^{51}Cr de las células
CTLL-2; ver el eje x) fue evaluada después del
tratamiento con diferentes agentes. NP40 es un detergente;
IL-2/Fc es una proteína de fusión que contiene
IL-2 y la región Fc de una molécula de IgG (esta
molécula es lítica); C' es complemento de rata;
IL-2/Fc-/- es una proteína de fusión no lítica que
contiene IL-2; y mig es una inmunoglobulina de
múrido. Este estudio respalda la conclusión de que
IL-2/Fc citolítica lisa a las células
CTLL-2 que soportan a IL-2R, pero
IL-2/Fc no lítico no lo hace.
La Fig. 7 es una serie de histogramas. Se midió
la intensidad de la fluorescencia de FcRI sobre células de CHO
(ovario de hámster chino) después de que las células fueron
expuestas a una solución salina amortiguada con fosfato (PBS; parte
superior izquierda), una inmunoglobulina de múrido (mlgG2a; parte
superior derecha), una molécula no lítica de
IL-2/Fc (IL-2/Fc-/-; parte inferior
izquierda), y una IL-2 lítica que contiene proteína
de fusión (IL-2/Fc; parte inferior derecha). En cada
histograma, se grafica el número de células contra la intensidad de
la fluorescencia de FcRI/CHO. Este estudio apoya la conclusión de
que IL-2/Fc citolítica se enlaza a FcRI, pero que
la IL-2/Fc no lítica no lo hace.
La Fig. 8 es una serie de ocho gráficas que
describen la respuesta proliferativa de las células T CD4^{+}
(lado izquierdo) y CD8^{+} (lado derecho) in vivo. Las
células fueron marcadas con CFSE y estimuladas in vivo
durante tres días con una molécula lítica (IL-2/Fc),
un agente de proliferación celular (rapamicina (Rap)), o los dos
agentes combinados. Como control negativo, no se trató a un grupo de
animales. Se analizó IL-2/Fc por su perfil de CFSE.
Este estudio soporta la conclusión de que la rapamicina inhibe la
señalización proliferativa de IL-2.
La Fig. 9 es una serie de cuatro gráficas
obtenidas a partir de un experimento en el cual se estimularon los
linfocitos marcados con CFSE in vivo durante tres días. Se
evaluó la expresión de la cadena \alpha de IL-2R
sobre la división de las células T por medio de FACS en animales que
no recibieron tratamiento (parte superior izquierda), solamente
rapamicina (Rap; parte superior derecha), solamente
IL-2/Fc (parte inferior izquierda), o una
combinación de rapamicina y de IL-2/Fc (Rap +
IL-2/Fc; parte inferior derecha). Este estudio
soporta la conclusión de que el tratamiento con rapamicina y con
IL-2/Fc promueve la expresión de la subunidad
\alpha de la IL-2R durante la proliferación
temprana de células T in vivo.
La Fig. 10 es un par de gráficas obtenidas
cuando se estimularon los linfocitos marcados con CFSE in
vivo durante tres días y se analizó por medio de FACS. Se
evaluó la expresión de la Anexina V sobre la división de las
células T (CD4^{+}) en animales que no recibieron tratamiento
(panel del lado izquierdo) o rapamicina e IL-2/Fc
(Rap + IL-2/Fc; panel del lado derecho). Este
estudio soporta la conclusión de que el tratamiento con rapamicina
y con IL-2/Fc promueve la apoptosis de las células
CD4^{+} durante la proliferación temprana de las células T in
vivo.
La Fig. 11 es una Tabla que muestra los
resultados de los experimentos que examinaron la supervivencia de
injertos de islotes de individuos de la misma especie en ratones
diabéticos autoinmunes no obesos (NOD). Se evaluaron los injertos
en términos de la función primaria del injerto de un individuo de la
misma especie (los porcentajes mostrados en esta columna
representan el porcentaje de ratones en los cuales funciono el
injerto de un individuo de la misma especie (se evaluó la función
por medio del monitoreo de los niveles de glucosa en sangre)) y el
tiempo promedio de supervivencia (MST) de los injertos en
funcionamiento. n = el número de animales analizados. Los
tratamientos están indicados bajo el encabezado "Tratamiento"
(ver también la leyenda que acompaña la Tabla y la descripción más
abajo). Los resultados presentados aquí soportan la conclusión de
que el tratamiento con una combinación de rapamicina,
IL-2/Fc y mIL-15/Fc da como
resultado una supervivencia duradera de los injertos de islotes de
individuos de la misma especie.
La Fig. 12 es una Tabla que muestra los
resultados de los experimentos que examinaron la supervivencia de
injertos de piel de individuos de la misma especie en ratones NOD.
Se evaluaron los injertos en términos del tiempo promedio de
supervivencia (MST) de los injertos en funcionamiento. n = el número
de animales analizados. Los tratamientos están indicados bajo el
encabezado "Tratamiento" (ver también la leyenda que acompaña
la Tabla y la descripción más abajo). Los resultados presentados
aquí soportan la conclusión de que el tratamiento con una
combinación de rapamicina, IL-2/Fc y
mIL-15/Fc da como resultado una supervivencia
duradera de los injertos de piel de individuos de la misma
especie.
La Fig. 13 es una gráfica lineal que grafica el
% de animales que permanecieron libes de diabetes durante el
periodo de tiempo posterior al tratamiento con una molécula lítica
de EL-2/Fc, una inmunoglobulina de múrido (mIg), y
una molécula no lítica de IL-2/Fc. La
IL-2/Fc citolítica bloqueo la autoinmunidad, pero la
IL-2/Fc lítica no lo hizo.
Una respuesta inmune efectiva comienza cuando un
antígeno o un mitógeno disparan la activación de células T. En el
proceso de la activación de células T, ocurren numerosos cambios
celulares, que incluyen la expresión de citoquinas y de receptores
de citoquina. Una de las citoquinas involucradas en la respuesta
inmune es la interleuquina 15 (IL-15), que es un
factor de crecimiento de las células T que estimula la proliferación
y la diferenciación de células B, células T, células asesinas
naturales (NK), y células asesinas activadas por linfocitos (LAK)
in vitro. In vivo, la proliferación de estos tipos de
células refuerza la respuesta inmune. Otra citoquina involucrada en
la respuesta inmune, y descrita aquí, el la
IL-2.
Las composiciones de la presente invención
incluyen agentes que dirigen a IL-15, o a su
receptor, y a IL-2, o a su receptor, y métodos en
los cuales aquellas composiciones son utilizadas para suprimir una
respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune celular o
humoral). Los pacientes se benefician de la supresión de la
respuesta inmune en una cantidad de circunstancias, por ejemplo, en
el evento de un trasplante de órgano o de una enfermedad inmune,
particularmente una enfermedad autoinmune, o Enfermedad Injerto
versus Huésped. En otras circunstancias, por ejemplo cuando las
células inmunes seleccionadas se vuelven malignas o autoagresivas,
es conveniente destruirlas en forma activa.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de nuevas formas para inhibir la respuesta inmune. La
inhibición se puede lograr por medio de la administración de una
combinación de agentes, una de las cuales dirige a
IL-15 o a un IL-15R y una de las
cuales dirige a IL-2 o a un IL-2R
(las formas de administración, incluido el tratamiento ex
vivo de injertos, son conocidas en el arte y se las describe más
adelante). En forma más general, se puede reducir el número de
células T reactivas con el antígeno por medio de la activación de
las rutas de señalización que conducen a la muerte de las células T
activadas (por ejemplo, por medio de la AICD); privando a las
células de factores que se requieren para su supervivencia (las
células que mueren después de tal privación se dice que mueren por
muerte celular pasiva); o dirigiendo las células activadas para
lisis por parte de los componentes del sistema inmune (las células
que mueren en esta forma se dice que mueren por medio de ADCC o
CDC). Por lo tanto, las composiciones de la invención incluyen
agentes que logran uno o más de estos fines (esto es que promueven
la muerte de las células T a través de una ruta reconocida de muerte
celular (por ejemplo AICD, muerte celular pasiva, ADCC, o CDC)).
Además de contener uno o más agentes que promueven la muerte de las
células T, las composiciones de la invención pueden incluir uno o
más agentes que inhiben la proliferación de células T (como ocurre,
por ejemplo, en respuesta a un antígeno). Por ejemplo, la invención
ofrece una composición (por ejemplo, una composición
farmacéuticamente aceptable o una formulada para aplicación a un
órgano o a un cultivo celular) que incluye IL-2/Fc
(por ejemplo, que promueve la AICD y la lisis celular a través de
ADCC o de CDC), mIL-15/Fc (que antagoniza a
IL-15 (y por lo tanto promueve la muerte celular
pasiva) y promueve la lisis celular a través de ADCC o CDC), y
rapamicina (que inhibe la proliferación de células T).
El término "agente" significa que abarca
esencialmente cualquier tipo de molécula que pueda ser utilizada
como agente terapéutico. Las proteínas, tales como anticuerpos,
proteínas de fusión y ligandos solubles, cualquiera de las cuales
puede ser o bien idéntica a una proteína de tipo silvestre o
contener una mutación (esto es, una supresión, una adición, o
sustitución de uno o más residuos de aminoácidos), y las moléculas
de ácido nucleico que las codifican (o que son "antisentido"
con ellas; por ejemplo, un oligonucleótido que es antisentido con
los ácidos nucleicos que codifican a IL-2,
IL-15, o un componente (por ejemplo, una subunidad)
de sus receptores), son todos "agentes". Los agentes de la
invención se pueden administrar ya sea en forma sistémica, en forma
local, o por medio de terapias con base en la célula (esto es, se le
puede administrar a una paciente un agente de la invención por
medio de la administración de una célula que expresa a ese agente al
paciente). La célula puede ser una célula administrada al paciente
únicamente con el propósito de que exprese al agente terapéutico.
La célula puede ser también una célula de un trasplante celular, de
tejido o de órgano. Por ejemplo, las células trasplantadas (por
ejemplo, células de islote) o células dentro de tejidos u órganos
(por ejemplo, células dentro de una parte de piel, o de hígado, de
riñón, o de corazón) pueden ser tratadas con un agente o
transducidas con una molécula de ácido nucleico que codifica a un
agente ex vivo (por ejemplo, antes del trasplante). En esta
forma, las células trasplantas producen sus propios agentes
inmunosupresores. Por ejemplo, una célula con un fenotipo deseable
(por ejemplo, una célula que produce insulina) puede ser modificada
para incluir un gen que produce uno o más de los factores
inmunosupresores de la invención. La célula trasplantada, tejido, u
órgano pueden ser tratados ya sea antes o después del trasplante.
Los métodos para administrar los agentes a los pacientes (o a las
células o a los órganos en cultivo) son conocidos y aquellos
ordinariamente capacitados en el arte los utilizan rutinariamente y
se los discute más adelante.
Las composiciones de la invención pueden incluir
uno o más agentes que dirigen a IL-15 o a un
receptor de IL-15. Como se observó anteriormente,
un agente único puede tener múltiples dominios funcionales. Los
agentes que dirigen a IL-15 o a un
IL-15R incluyen a los agentes que se enlazan a (o
bien que interactúan con) IL-15, un
IL-15R, o los ácidos nucleicos que los codifican así
como agentes que se enlazan a y posteriormente destruyen a las
células que soportan IL-15R, tal como células T
activadas. De este modo, los agentes útiles para lograr la
inmunosupresión pueden contener dos mitades funcionales: una
fracción objetivo que dirige al agente a una célula que soporta a
un IL-15R y una fracción que agota a las células T
objetivo (por ejemplo, lítica) que conducen a la eliminación de las
células que soportan TL-15R. En una modalidad, la
fracción objetivo se enlaza a un IL-15R sin
transducir efectivamente una señal a través de ese receptor. Por
ejemplo, la fracción objetivo puede incluir a un polipéptido
mutante de IL-15, y la fracción que agota las
células T objetivo puede incluir a la región Fc de una molécula de
inmunoglobulina. La región Fc se puede derivar de una IgG, tal como
las IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o las IgG análogas de mamífero o de una
IgM, tal como IgM humana o las IgM análogas de mamífero. En una
modalidad preferida, la región Fc incluye los dominios de bisagra,
CH2 y CH3 de IgG1 humana o IgG2a de múrido. Aunque la invención no
se limita a agentes que trabajan por medio de ningún mecanismo
particular, se cree que la región Fc media la eliminación dirigida
del complemento y del fagocito de las células que soportan un
IL-15R.
Se han producido los polipéptidos mutantes de
IL-15 que enlazan al complejo receptor de
IL-15 con una afinidad similar a la de
IL-15 de tipo silvestre, pero fallan en activar
completamente la transducción de la señal. Estos polipéptido
mutantes compiten efectivamente con los polipéptidos de
IL-15 de tipo silvestre y pueden inhibir uno o más
de los eventos que normalmente se presentan en respuesta a la
señalización de IL-15, tal como la proliferación
celular. El "polipéptido de IL-15 de tipo
silvestre" mencionado aquí es un polipéptido que es idéntico a
una IL-15 de ocurrencia natural (por ejemplo, en la
Fig. 1 se muestra un polipéptido de IL-15 de tipo
silvestre). En contraste, un "polipéptido mutante de
IL-15" es un polipéptido que tiene al menos una
mutación con relación a IL-15 de tipo silvestre y
que inhibe al menos una de las actividades in vivo o in
vitro que son usualmente promovidas por la IL-15
de tipo silvestre.
Un polipéptido mutante de IL-15
que puede ser utilizado de acuerdo con la presente invención
bloqueará generalmente al menos 40%, más preferiblemente al menos
70%, y lo más preferible al menos 90% de una o más de las
actividades de la molécula de IL-15 de tipo
silvestre. La habilidad de un polipéptido mutante de
IL-15 para bloquear la actividad de la
IL-15 de tipo silvestre se puede evaluar por medio
de numerosos ensayos, incluido el ensayo de proliferación celular
BAF-BO3 descrito aquí (en el cual las células fueron
transfectadas con una construcción que codifica un
IL-2R\beta). Además los polipéptidos mutantes de
la invención se pueden definir de acuerdo al porcentaje de
identidad particular que ellos exhiben con la IL-15
de tipo silvestre. Cuando se examina el porcentaje de identidad
entre dos polipéptidos, la longitud de las secuencias comparadas
será generalmente al menos de 16 aminoácidos, preferiblemente al
menos de 20 aminoácidos, más preferiblemente al menos de 25
aminoácidos, y lo más preferible al menos de 35 aminoácidos. El
término "identidad", como se lo utiliza en referencia con
secuencias de polipéptido o de ADN, se refiere a la identidad entre
subunidades (residuos de aminoácidos de proteínas o nucleótidos de
moléculas de ADN) dentro de las dos secuencias de polipéptido o de
ADN que están siendo comparadas. Cuando la posición de una subunidad
en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica
(esto es, el mismo residuo de aminoácido o nucleótido), entonces las
moléculas son idénticas en esa posición. La similitud entre dos
secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos es una
función directa del número de posiciones idénticas. De este modo, un
polipéptido que es 50% idéntico a un polipéptido de referencia de
100 aminoácidos de longitud puede ser un polipéptido de 50
aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50
aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. Podría ser
también un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es 50%
idéntico al polipéptido de referencia en toda su longitud. Desde
luego, muchos otros polipéptidos reunirán los mismos criterios. LA
identidad se mide típicamente y más convenientemente utilizando un
software para el análisis de secuencias, tal como el Paquete de
Software para Análisis de Secuencia del Genetics Computer Group del
Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin (1710
University Avenue, Madison, WI 53705), con los parámetros por
defecto del mismo.
Un polipéptido mutante de IL-15
de la invención tiene al menos 65%, preferiblemente al menos 80%,
más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferible al menos 95%
(por ejemplo, 96%, 97%, 98% ó 99%) de identidad con la
IL-15 de tipo silvestre. La mutación puede
consistir de un cambio en el número o en el contenido de residuos de
aminoácidos. Por ejemplo, la IL-15 mutante puede
tener un número mayor o menor de residuos de aminoácidos que la
IL-15 de tipo silvestre. Alternativamente, o
adicionalmente, el polipéptido mutante puede contener una
sustitución de uno o más residuos de aminoácidos que están presentes
en la IL-15 de tipo silvestre. El polipéptido
mutante de IL-15 puede diferir de la
IL-15 de tipo silvestre por la adición, supresión, o
sustitución de un único residuo de aminoácido, por ejemplo, una
adición supresión o sustitución del residuo en posición 156. En
forma similar, el polipéptido mutante puede diferir del de tipo
silvestre por una adición, supresión, o sustitución de dos residuos
de aminoácidos, por ejemplo, los residuos en las posiciones 156 y
149. Por ejemplo, el polipéptido mutante de IL-15
puede diferir de la IL-15 de tipo silvestre por la
sustitución de aspartato por glutamina en los residuos 156 y 149
(como se muestra en la Fig. 2). Los polipéptidos mutante útiles como
agentes objetivo, como la IL-15 de tipo silvestre,
reconocen y se enlazan a un componente del IL-15R.
En una modalidad, la mutación de IL-15 está en el
dominio carboxi terminal de la citoquina, que se cree que se enlaza
a IL-2R\gamma (la subunidad receptora de
IL-2). Alternativamente, o adicionalmente, los
polipéptidos mutantes de IL-15 pueden incluir una o
más mutaciones dentro del dominio de enlazamiento de
IL-2R\beta (la subunidad \beta del receptor de
EL-2).
Incluso en el caso de que un polipéptido mutante
de IL-15 contenga una sustitución de un residuo de
aminoácido por otro, la sustitución puede ser, pero no
necesariamente, una sustitución conservadora, que incluye una
sustitución dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina;
valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico;
asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y
fenilalanina, tirosina.
En vez de utilizar, o además de utilizar, un
polipéptido objetivo de IL-15(por ejemplo un
polipéptido mutante de IL-15), el agente
terapéutico puede ser un anticuerpo. Por ejemplo,
IL-15 puede ser dirigido (esto es, específicamente
enlazado) con un anticuerpo. En forma similar, el
IL-15R puede ser dirigido con anticuerpos que
enlazan a un componente del IL-15R (por ejemplo, a
la subunidad IL-15R\alpha). Los métodos por medio
de los cuales se pueden generar anticuerpos, incluidos los
anticuerpos Humanizados, contra un componente del
IL-15R son bien conocidos en el arte. Los
anticuerpos preferiblemente deben ser capaces de activar al
complemento y la fagocitosis, por ejemplo, las subclases IgG3 e
IgG1 humanas (preferiblemente la última), o la subclase IgG2a de
múrido.
Los métodos de la invención pueden también ser
llevados a cabo con composiciones que contienen: (a) dos o más
agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de células T o
(b) al menos un agente que promueve la muerte de células T y al
menos un agente que inhibe la proliferación de células T. El agente
que promueve la muerte de células T puede hacer esto promoviendo la
muerte celular pasiva, que se presenta cuando una célula T es
privada de un factor requerido para su supervivencia.
IL-15 es uno de tales agentes (se describen otros
más adelante). De este modo, los agentes que interfieren con la
habilidad de IL-15 para servir como un factor de
supervivencia (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza
específicamente a IL-15 o al receptor de
IL-15) pueden ser incluidos en las composiciones de
la invención (por ejemplo, una composición puede incluir un agente
que promueve la AICD, un agente que promueve la muerte pasiva de
células (por ejemplo, un anticuerpo
anti-IL-15), y opcionalmente, un
agente que inhibe la proliferación de células T.
Como se describió anteriormente, los agentes
útiles para lograr la inmunosupresión pueden contener dos fracciones
funcionales: una fracción objetivo que dirige al agente a una
célula que soporta un IL-15R (tal como la molécula
mutante de IL-15 recién descrita) y una fracción de
agotamiento de células objetivo, por ejemplo, que lisa o bien
conduce a la eliminación de, la célula que soporta a
IL-15R. De este modo, el agente puede ser un
polipéptido quimérico que incluye un polipéptido mutante de
IL-15 y un polipéptido heterólogo tal como la región
Fc de la IgG y subclases de IgM de anticuerpos. La región Fc puede
incluir una mutación que inhibe la fijación del complemento y el
enlazamiento del receptor de Fc, o puede ser un agotamiento de
células objetivo (esto es, capaz de destruir células por
enlazamiento del complemento o por medio de cualquier otro
mecanismo, tal como la lisis del complemento que depende del
anticuerpo).
La región Fc se puede aislar de una fuente de
ocurrencia natural, producida en forma recombinante, o sintetizada
(tal como puede ser cualquier polipéptido ofrecido en la presente
invención). Por ejemplo, se puede producir una región Fc que es
homóloga al dominio C-terminal de IgG por medio de
la digestión de IgG con papaína. La Fc de IgG tiene un peso
molecular aproximadamente de 50 kDa. Los polipéptidos de la
invención pueden incluir la región Fc completa, o una porción más
pequeña que retenga la habilidad para lisar células. Además, las
regiones Fc fragmentadas o de longitud completa pueden ser variantes
de la molécula de tipo silvestre. Esto es, pueden contener
mutaciones que pueden afectar o no la función del polipéptido.
Se hace referencia aquí a los agentes que
"dirigen" a una interleuquina o a un receptor de interleuquina.
El direccionamiento se presenta cuando un agente se enlaza directa
o indirectamente a, o bien interactúa con, una interleuquina o un
receptor de interleuquina en una forma que afecta la actividad de la
interleuquina o al receptor de interleuquina. Aquellos
ordinariamente capacitados en el arte pueden evaluar la actividad
por medio de métodos de rutina de laboratorio. Por ejemplo, se puede
evaluar la fuerza de la transducción de la señal u otro evento
biológico secuencia abajo que se presente, o que normalmente se
presentaría, después del enlazamiento del receptor. La actividad
generada por un agente que dirija una interleuquina o a un receptor
de interleuquina puede ser, pero no necesariamente, diferente de la
actividad generada cuando una interleuquina de ocurrencia natural
se enlaza a un receptor de interleuquina de ocurrencia natural. Por
ejemplo, un agente que dirija a un receptor de IL-2
cae dentro del alcance de la invención incluso si ese agente genera
sustancialmente la misma actividad que se presentaría habiendo sido
enlazado el receptor por IL-2 de ocurrencia natural.
Cuando un agente genera actividad que es sustancialmente la misma
que, o superior a, la actividad generada por un ligando de
ocurrencia natural, el agente puede ser descrito como un agonista
del receptor (siendo examinados el agente y el ligando natural bajo
las mismas condiciones). Cuando un agente genera actividad que es
menor que la actividad generada por un ligando de ocurrencia
natural, se puede describir al agente como un antagonista del
receptor (si la interacción primaria del agente es con el receptor,
por ejemplo, mIL-15) o de la interleuquina (si la
interacción primaria del agente es con la interleuquina; por
ejemplo, un anticuerpo anti-IL-15).
Aquí nuevamente, los niveles de actividad se evalúan por medio del
análisis del agente y del receptor de ocurrencia natural (o
ligando) bajo las mismas condiciones.
La región Fc que puede ser parte de los agentes
de la invención puede ser de "agotamiento de las células
objetivo" o de "agotamiento de las células no objetivo".
Una región Fc que es de agotamiento de las células no objetivo
carece típicamente de un sitio de enlazamiento de alta afinidad del
receptor Fc y de un sitio de enlazamiento C'1q. El sitio de
enlazamiento de alta afinidad del receptor de Fc de Fc de IgG de
múrido incluye al residuo Leu en la posición 235 de Fc de IgG. De
este modo, se puede destruir el sitio de enlazamiento del receptor
de Fc de múrido por medio de mutación o de supresión de Leu 235. Por
ejemplo, la sustitución de Glu por Leu 235 inhibe la habilidad de
la región Fc para enlazar al receptor de alta afinidad de Fc. El
sitio de enlazamiento C'1q de múrido puede ser destruido
funcionalmente por medio de la mutación o supresión de los residuos
Glu 3118', Lys 320 y Lys 322 de IgG. Por ejemplo, la sustitución de
los residuos de Ala por Glu 318, Lys 320, y Lys 322 produce una Fc
de IgG1 incapaz de dirigir la lisis del complemento que depende del
anticuerpo. En contraste, una región Fc de IgG de agotamiento de
células objetivo tiene un sitio de enlazamiento del receptor de
alta afinidad de Fc y un sitio de enlazamiento C'1q. El sitio de
enlazamiento del receptor de alta afinidad de Fc incluye al residuo
Leu en la posición 235 de Fc de IgG, y el sitio de enlazamiento C'1q
incluye a los residuos Glu 318, Lys 320, y Lys 322 de IgG1. Fc de
IgG de agotamiento de células objetivo tiene residuos de tipo
silvestre o sustituciones conservadoras de aminoácidos en estos
sitios. Fc de IgG de agotamiento de células objetivo puede dirigir
a las células para citotoxicidad celular que depende del anticuerpo
o citólisis dirigida al complemento (CDC). Se conocen también
mutaciones apropiadas para IgG humana (ver, por ejemplo, Morrison y
colaboradores, The Immunologist 2: 125, 1994; y Brekke y
colaboradores, The Immunologist 2: 125, 1994).
Los agentes que dirigen al
IL-15R pueden dirigir a los polipéptidos mutantes de
IL-15, opcionalmente fusionados a una etiqueta
antigénica (por ejemplo, una secuencia señal). Las secuencias señal
son reconocidas por anticuerpos anti-FLAG
biotinilados, altamente específicos, como se describe aquí (ver
también, Blanar y colaboradores, Science 256: 1014, 1992; LeClair y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci, EUA 89: 8145, 1992).
Además, se puede utilizar la cadena \alpha de
IL-15R como antagonista. Aunque el complejo del
receptor de IL-15 consiste de subunidades \alpha
\beta \gamma, la cadena \alpha sola muestra una alta afinidad
por IL-15 y evita que IL-15 se
enlace a un complejo de IL-15R enlazado a la
superficie de la célula. De este modo, una cadena \alpha soluble
de IL-15R puede actuar como un antagonista
específico del receptor.
La construcción de la cadena \alpha soluble de
IL-15R involucra la clonación del fragmento
extracelular de la cadena \alpha de IL-15R de las
células positivas del receptor, tal como las células T activadas o
las líneas de células que expresan al receptor, y, opcionalmente,
fusionarlo a una secuencia de una etiqueta molecular. La secuencia
de la etiqueta puede ser, por ejemplo, FLAG, GST, o Histidina. Esta
construcción genética en un vector de expresión puede ser
transfectada en líneas celulares de expresión. La cadena \alpha
soluble etiquetada de IL-15R producida por líneas
celulares de expresión será purificada utilizando los mAb
específicos para la secuencia de la Etiqueta. Además, se puede
enlazar un dominio extracelular de IL-15R (por
ejemplo, fusionado por medio de un enlace peptídico) a un dominio
Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, dominios de bisagra, CH2 y CH3
de inmunoglobulina G), preferiblemente de un subtipo de IgG o IgM.
Tal proteína de fusión se podría expresar en un tipo de célula
adecuado, muchas de las cuales son conocidas por aquellos
ordinariamente capacitados en el arte.
Para inhibir una respuesta inmune, los agentes
que dirigen a las células que soportan a IL-15R,
descritos anteriormente, pueden ser administrados con un agente que
dirija a IL-2 o a un IL-2R. Un
agente que se administra "con" otro puede ser, pero no
necesariamente se lo administra al mismo tiempo o en la misma forma
(aunque se expone este comentario en el contexto de una discusión
de agentes relacionados con IL-2, es aplicable para
cualquiera de los agentes o moléculas combinadas en las
composiciones de la invención). Por ejemplo, se puede administrar
un agente que dirija a un IL-15R antes o después de
un agente que dirija a un IL-2R. En forma similar,
se puede administrar ex vivo a un agente que dirija a
IL-15 o a un IL-15R (para tratar,
por ejemplo, una célula, un tejido, o un órgano expuesto a
trasplante) mientras que se puede administrar sistémicamente un
agente que dirige a IL-2 o a un
IL-2R (por ejemplo, en forma intravenosa) a un
paciente (por ejemplo, un paciente que ha recibido un trasplante
que fue tratado ex vivo con un agente que dirige a
IL-15). En forma similar, se puede administrar un
agente que promueva la AICD en un momento diferente o en una forma
diferente que un agente que inhiba la proliferación celular. De
este modo, en los métodos de la invención se pueden administrar
separadamente cualquiera de los agentes o tipos de moléculas que se
combinan en las composiciones de la invención.
Los agentes que dirigen a IL-2 o
a un IL-2R incluyen a los agentes que se enlazan a
IL-2 o a un IL-2R así como los
agentes que se enlazan a, y posteriormente destruyen a las células
que soportan a un IL-2R, tal como las células T
activadas. Como se describió anteriormente en el contexto de la
dirección de IL-15, los agentes útiles para lograr
la supresión inmune pueden contener una fracción que dirija al
agente a una célula que soporte a IL-2R y una
fracción de agotamiento de las células objetivo (por ejemplo,
líticas) que conduzca a la eliminación de la célula que soporta a
IL-2R. En el evento de que se incluya una región Fc,
esa región se puede derivar de las mismas moléculas de
inmunoglobulina descritas anteriormente.
Los agentes objetivo, tales como un agente
IL-2/Fc (ver, por ejemplo, Zheng y colaboradores, J.
Immunol. 163: 4041 - 4048, 1999) se pueden administrar con un
agente que evite la señalización de IL-2R mediada
por IL-2, tal como la rapamicina. Los agentes que
inhiben la proliferación celular son bien conocidos por aquellos
normalmente capacitados en el arte (y se discuten adicionalmente
más adelante).
Como se explicó anteriormente, los métodos de la
invención (por ejemplo, los métodos para inhibir una respuesta
inmune (por ejemplo, una respuesta celular inmune), los métodos para
inhibir el rechazo de un trasplante, y los métodos para tratar el
cáncer) se pueden llevar a cabo también con composiciones (por
ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables) que contienen:
(a) dos o más agentes, cada uno de los cuales promueve la muerte de
células T o (b) al menos un agente que promueve la muerte de células
T y al menos un agente que inhibe la proliferación de células T. El
agente que promueve la muerte de células T puede hacerlo promoviendo
la AICD (muerte celular inducida por activación), y tales agente
incluyen IL-2 y moléculas que funcionan como
agonistas de IL-2. Por ejemplo,
IL-2/Fc, los mutantes de IL-2 que
retienen la habilidad para enlazar y transducir una señal a través
del receptor de IL-2, y anticuerpos que se enlazan
específicamente y agonizan al receptor de IL-2 (por
ejemplo, un anticuerpo que se enlaza específicamente a la subunidad
a del receptor de IL-2) pueden ser incluidos en las
composiciones de la invención. Otros agentes que promueven la AICD
incluyen al Ligando Fas (FasL), que estimula la muerte de las
células T por medio de la activación de la cascada de transducción
de la señal Fas sobre las células T activadas, y los mutantes
biológicamente activos de los mismos.
La muerte pasiva de las células T se presenta
cuando una célula T es privada de un agente requerido para su
supervivencia. Además de IL-15, son esenciales los
factores que incluyen IL-4, IL-7,
ligando OX-40, IFN\beta, 4-IBB e
IGF-I (esto es, las células T mueren en ausencia de
cada uno de estos factores; ver, por ejemplo, Tu y colaboradores,
J. Immunol. 165: 1331 - 1336, 2000; Tsuda y colaboradores, J.
Immunol Meth. 236: 37 - 51, 2000; Bertolino y colaboradores, Int.
Immunol. 11: 1225 - 1238, 1999; Takahashi y colaboradores, J.
Immunol 162: 5037 - 5040, 1999; Pilling y colaboradores, Eur. J.
Immunol. 29: 1041 - 1050, 1999; Chu y colaboradores, J. Immuno.
162: 1896 - 1903, 1999; y Weinberg y colaboradores, Semin. Immunol.
10: 471 - 480, 1998). Se puede privar a las células T de uno o más
de estos factores (IL-15, IL-4,
IL-7, etc.) por ejemplo, por exposición de las
céluls, in vivo o en cultivo, a agentes que selectivamente se
enlazan a uno o más de los factores o bien evitan que ellos
interactúen con las células T como normalmente lo harían (siendo el
resultado de la privación, la muerte pasiva de las células).
La ADCC y la CDC pueden ser provocadas por
agentes que se enlazan a la superficie de las células T y que
contienen una porción de Fc de una molécula de inmunoglobulina que
activa la ADCC o la CDC. Los ejemplos de tales agentes incluyen
anticuerpos que se enlazan a las estructuras de la superficie de la
célula que están expuestas sobre las células inmunes activadas (por
ejemplo, receptores de la superficie de la célula tales como CD154,
el receptor de IL-2, y el receptor de
IL-15). Además, se puede utilizar una proteína
quimérica de fusión ligando/Fc, que se enlaza a las proteínas del
receptor sobre la superficie de las células activadas (por ejemplo,
una IL-2/Fc o una mIL-15/Fc).
Dados
estos ejemplos, serán evidentes otros agentes adecuados para aquellas personas ordinariamente capacitadas en el arte.
estos ejemplos, serán evidentes otros agentes adecuados para aquellas personas ordinariamente capacitadas en el arte.
Los agentes que inhiben la proliferación celular
incluyen rapamicina (Sirolimus), mofetil micofenolato (MMF),
azatioprina, y cualquier otro de los agentes que se sabe que son
útiles para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos (tal
como el cáncer). Los compuestos quimioterapéuticos bien
caracterizados incluyen a los agentes que inhiben el metabolismo
del ácido nucleico (tal como los inhibidores de la biosíntesis de
purina y pirimidina, los inhibidores de la síntesis de ARN, y el
enlazamiento de ADN, la modificación de ADN o los agentes de
intercalación). Estos agentes son especialmente útiles cuando la
composición utilizada, por ejemplo, para inhibir una respuesta
inmune, contiene también un agente tal como IL-2/Fc,
que no solamente promueve la AICD sino que también estimula la
proliferación de células T.
Los agentes que inhiben la proliferación celular
también incluyen antimetabolitos de ácido fólico tales como
metotrexato (MTX) y pirimetamina; antimetabolitos de purina (tales
como la 6-mercaptopurina (6-MP) y
azatioprina) y antagonistas de pirimidina tales como citarabina
(ara-C), 5-azacitidina, y 5-
fluorouracilo (estas categorías fueron mencionadas anteriormente);
agentes de alquilación y otros agentes de enlazamiento de ADN (por
ejemplo, ciclofosfamida (CPA); mitomicina C, y Doxorubicina
(Adriamicina)); alcaloides vinca (por ejemplo vincristina);
inhibidores de calcineurina (por ejemplo, Ciclosporina A, FK506, y
Brequinar).
Otros agentes que pueden ser utilizados para
inhibir la proliferación celular incluyen a los agentes que
interfieren directamente con las proteínas involucradas en la
regulación del ciclo celular (tales como las
anti-CDK (Cell Division Kinase) o
anti-ciclinas) o proteínas que afectan los puntos de
chequeo de la proliferación celular (todas las células que
proliferan tienen puntos de chequeo en diferentes etapas del ciclo
celular que evitan que ellas entren en la siguiente etapa del ciclo
de la división celular (CDC) antes de que ellas hayan concluido la
etapa anterior). Las rutas que alimentan a los controles del punto
de chequeo incluyen inhibidores de la síntesis de ADN, ARN y
proteína (por ejemplo, los inhibidores de la quinasa S6 e
inhibidores de la quinasa PI-3). Se puede utilizar
también inhibidores de citoquinesis.
Además de analizar un agente candidato (por
ejemplo, un IL-15 mutante o un polipéptido de
IL-2) en los ensayos in vitro descritos en
los ejemplos más adelante, se puede utilizar cualquiera de los
siguientes ensayos in vitro para analizar qué combinaciones
particulares de los agentes descritos aquí logran más efectivamente
una inmunosupresión. Por ejemplo, se pueden analizar uno o más de
los agentes que dirigen al IL-15R en combinación
con uno o más de los agentes que antagonizan a IL-2
o a su receptor. Estos ensayos in vivo representan
únicamente algunas de las formas rutinarias en las cuales alguien
ordinariamente capacitado en el arte podría analizar adicionalmente
la eficacia de los agentes de la invención. Ellos fueron
seleccionados para incluirlos aquí debido a su relevancia para la
variedad de condiciones clínicas sensibles a tratamiento con agentes
que dirijan a IL-2, IL-15, y a sus
receptores. Por ejemplo, los ensayos son relevantes para un
trasplante de órgano, una enfermedad inmune, particularmente una
enfermedad autoinmune, una enfermedad injerto versus huésped y
cánceres del sistema inmune (por ejemplo, cánceres que surgen cuando
las células T se convierten en malignas).
Para determinar si una combinación de agentes de
la invención logra una inmunosupresión, se puede administrar la
combinación (ya sea directamente, por medio de terapia con base en
los genes, o por medio de terapia con base en la célula) en el
contexto de los paradigmas bien establecidos de los trasplantes.
Los agentes de la invención, las moléculas de
ácido nucleico que los codifican (o que hibridan con ellos y por lo
tanto los inhiben), pueden ser administrados sistémicamente o
localmente por un medio estándar para cualquier animal convencional
de laboratorio, tal como una rata, un ratón, un conejo, un conejillo
de indias, o un perro, antes de llevar a cabo un injerto de piel de
un individuo de la misma especie o de otra especie, un trasplante
de órgano, o un implante de células sobre el animal. Las cepas de
ratones tales como C57B1-10, B10.BR, y B10.AKM
(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), que tienen la misma base
genética pero no coinciden en los locus H-2, son
adecuados para evaluar diferentes injertos de órganos.
Un método para llevar a cabo injertos cardiacos
por medio de anastomosis del corazón del donante con los bases
mayores en el abdomen del huésped, fue publicado primero por Ono y
colaboradores (J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57: 225, 1969; ver
también Corry y colaboradores, Transplantation 16: 343, 1973). Por
medio de este procedimiento quirúrgico, se anastomosa la aorta del
corazón del donante a la aorta abdominal del huésped, y se
anastomosa la arteria pulmonar del corazón del donante con la vena
cava adyacente utilizando técnicas estándar microvasculares. Una
vez se injerta el corazón en su lugar y se lo calienta a 37ºC con
solución de lactato de Ringer, se reanuda el ritmo sinusal normal.
Se puede evaluar frecuentemente la función del corazón trasplantado
por medio de la palpación de las contracciones ventriculares a
través de la pared abdominal. Se define el rechazo como la cesación
de las contracciones del miocardio. Los agentes de la invención (por
ejemplo, una combinación de IL-15/Fc mutante,
IL-2/Fc, y rapamicina) se considerarían efectivos en
la reducción del rechazo del órgano si los huéspedes que reciben
esos agentes experimentan un periodo más largo de aceptación del
injerto del corazón del donante que los huéspedes que no fueron
tratados.
La efectividad de diferentes combinaciones de
los agentes de la invención puede ser evaluada también después de
un injerto de piel. Para llevar a cabo los injertos de piel sobre un
roedor, se anestesia a un animal donante y se remueve el espesor
completo de la piel de una parte de la cola. El animal receptor es
anestesiado también y se prepara una capa de injerto removiendo un
parche de piel del flanco afectado. Generalmente, el parche es
aproximadamente de 0,5 x 0,5 cm. Se le da forma a la piel del
donante para adaptarse a la capa del injerto, posicionarla y
cubrirla con gasa, y vendarla. Se pueden posicionar los injertos
diariamente comenzando el sexto día después de la operación, y se
consideran rechazados cuando más de la mitad del epitelio
trasplantado parece ser no viable. Los agentes de la invención (por
ejemplo, una combinación de IL-15/Fc,
IL-2/Fc, y rapamicina) se considerarían efectivos
en la reducción del rechazo del injerto de piel si los huéspedes que
recibieron esos agentes experimentaron un período más largo de
aceptación del injerto de la piel del donante que los huéspedes no
tratados.
Un ejemplo típico de un experimento de injerto
de piel, cuyo resultado demuestra la utilidad de una composición
que contiene IL-2/Fc, mIL-15/Fc y
rapamicina, es descrito en los Ejemplos (más adelante) y resumido en
la Fig. 12.
Los injertos de células de islotes de individuos
de la misma especie DBA/2J pueden ser trasplantados en roedores,
tal como ratones B6 AFI de 6 - 8 semanas de edad que se volvieron
diabéticos por medio de una inyección intraperitoneal única de
estreptozotocina (225 mg/kg; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Como control, se pueden trasplantar injertos isogénicos de células
de islote en ratones diabéticos. El trasplante de células de islote
se puede llevar a cabo siguiendo los protocolos publicados (por
ejemplo, ver Gotoh y colaboradores, Transplantation 42: 387, 1986).
En resumen, se hace perfusión de los páncreas de los donantes in
situ con colagenasa tipo IV (2 mg/ml; Worthington Biochemical
Corp., Freehold, NJ). Después de un período de digestión de 40
minutos a 37ºC, se aíslan los islotes sobre un gradiente
discontinuo de Ficoll. Posteriormente, se trasplantan 300 - 400
islotes bajo la cápsula renal de cada receptor. Se puede hacer
seguimiento a la función del injerto del individuo de la misma
especie por medio de mediciones seriales de glucosa en sangre
(Accu-Check III^{TM}; Boehringer, Mannheim,
Alemania). Se define la función primaria del injerto como un nivel
de glucosa en sangre por debajo de 11,1 mmol/l el día 3 después del
trasplante, y se define el rechazo del trasplante como una
elevación de la glucosa en sangre que excede los 16,5 mmol/l (en
cada uno de al menos 2 días sucesivos) después de un periodo de la
función primaria del injerto.
Los modelos de enfermedad autoinmune
proporcionan otro medio para evaluar combinaciones de los agentes de
la invención in vivo. Estos modelos son bien conocidos por
aquellos ordinariamente capacitados en el arte y pueden ser
utilizados para determinar si una combinación dada de agentes, que
incluye, por ejemplo, un agente que dirige a un
IL-15R, sería terapéuticamente útil en el
tratamiento de una enfermedad autoinmune específica cuando se lo
suministra ya sea directamente, a través de terapia genética o a
través de terapias con base en la célula.
Las enfermedades autoinmunes que han sido
modeladas en animales incluyen enfermedades reumáticas, tal como la
artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico (SLE), diabetes
tipo I, y enfermedades autoinmunes de la tiroides, el intestino, y
el sistema nervioso central. Por ejemplo, los modelos animales de
SLE incluyen ratones MRL, ratones BXSB, y ratones NZB y sus
híbridos F_{1}. Estos animales pueden ser cruzados con el
propósito de estudiar aspectos particulares del proceso de la
enfermedad reumática; la progenie de la cepa NZB desarrolla
glomerulonefritis de lupus severo cuando se la cruza con ratones NZW
(Bielschowsky y colaboradores, Proc. Univ. Otago Med Sch. 37: 9,
1959; ver también Fundamental Immunology, Paul, Ed., Raven Press,
New York, NY, 1989). En forma similar, se observa un cambio a
nefritis letal en la progenie de acoplamientos NBZ X SWR (Data y
colaboradores, Nature 263: 412, 1976). La apariencia histológica de
lesiones renales en ratones SNF_{1} ha sido bien caracterizada
(Eastcott y colaboradores, J. Immunol. 131: 2232, 1983; ver también
Fundamental Immunology, más arriba). Por lo tanto, se puede
utilizar la salud general del animal así como la apariencia
histológica del tejido renal para determinar si la administración de
agentes que dirigen a un IL-15R y, por ejemplo,
dirigen al IL-2R, puede efectivamente suprimir la
respuesta inmune en un modelo animal de SLE.
Una de las cepas MRL de ratones que desarrolla
SLE, MRL-lprllpr, también desarrolla una
forma de artritis que se parece a la artritis reumatoide en humanos
(Theofilopoulos y colaboradores, Adv. Immunol. 37: 269, 1985).
Alternativamente, de puede inducir una artritis experimental en
roedores por medio de la inyección de colágeno tipo II en ratas (2
mg/ml) mezclado 1:1 en adyuvante completo de Freund (100 \mul en
total) en la base de la cola. Se desarrolla la artritis 2 - 3
semanas después de la inmunización. La habilidad de las moléculas
de ácido nucleico que codifican agentes de la invención (por
ejemplo, agentes que dirigen al IL-15R y agentes
que dirigen al IL-2R o que se enlazan a, e inactivan
células T activadas con antígeno) para suprimir una respuesta
inmune puede ser evaluada dirigiendo las moléculas de ácido nucleico
a los linfocitos T. Una manera de dirigir a los linfocitos T es la
siguiente. Se preparan suspensiones de células de bazo 2 - 3
después del inicio de la artritis y se incuban con colágeno (100
\mug/ml) durante 48 horas para inducir proliferación de células T
activadas con colágeno. Durante este tiempo, se transducen las
células con un vector que codifica al agente del polipéptido de
interés. Como control, se hacen cultivos en paralelo pero no se los
transduce o, se los transduce con un vector "vacío". Se
inyectan luego las células en forma intraperitoneal (5 x 10^{7}
células/animal). Se evalúa la efectividad del tratamiento siguiendo
los síntomas de la enfermedad durante las siguientes 2 semanas,
como los describen Chernajovsky y colaboradores (Gene Therapy 2: 731
- 735, 1995). Menos síntomas, comparado con el control, indican que
los agentes combinados de la invención, y las moléculas de ácido
nucleico que los codifican, funcionan como inmunosupresores y son
por lo tanto útiles en el tratamiento de una enfermedad inmune,
particularmente una enfermedad autoinmune.
La habilidad de diferentes combinaciones de
agentes para suprimir la respuesta inmune en el caso de la diabetes
Tipo I puede ser analizada en la cepa de rata BB, que fue
desarrollada a partir de una colonia comercial de ratas Wistar en
los Bio-Breeding Laboratories es Ottawa. Estas retas
desarrollan espontáneamente anticuerpos contra las células islote y
la insulina, tal como se presenta con la diabetes humana Tipo I.
Alternativamente, se puede utilizar ratones NOD (diabéticos no
obesos) como sistema modelo. Un ejemplo típico de un experimento en
el cual se restablecen los niveles de azúcar en la sangre en ratones
NOD después de un trasplante de islotes de un donante de la misma
especie, se describe más adelante y se resume en la Fig. 11. Los
animales fueron tratados con una combinación de
IL-2/Fc, IL-15/Fc, y rapamicina. El
resultado fue un injerto de larga duración.
Las enfermedades autoinmunes de la tiroides han
sido moderadas en los pollos. Los pollos de cepa obesa (OS)
desarrollaron consistentemente tiroiditis autoinmune espontánea
parecida a la enfermedad de Hashimoto (Cole y colaboradores,
Science 160: 1357, 1968). Aproximadamente 15% de estas aves producen
anticuerpos para células parietales del estómago, tal como en la
contraparte humana de la tiroiditis autoinmune. Las manifestaciones
de la enfermedad en pollos OS, que podrían ser monitoreadas en el
transcurso de cualquier régimen de tratamiento, incluyen el tamaño
corporal, los depósitos de grasa, los lípidos en suero, sensibilidad
al frío, e infertilidad.
Se pueden inducir también experimentalmente
modelos de una enfermedad autoinmune en el sistema nervioso central
(CNS). Se puede inducir una inflamación del CNS, que conduce a
parálisis, por medio de una inyección única de tejido cerebral o de
la espina dorsal con adyuvante en muchos animales diferentes de
laboratorio, incluidos roedores y primates. Este modelo denominado
como encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es mediado por
células T. En forma similar, se puede producir miastenia grave
inducida experimentalmente por medio de una inyección sencilla de
receptor de acetilcolina con adyuvantes (Lennon y colaboradores,
Ann. N.Y. Acad Sci. 274: 283, 1976).
Las enfermedades autoinmunes del intestino
pueden ser modeladas en ratones "con desactivación genética" de
IL-2 ó IL-10, o en ratones que
recibieron enemas que contenían albúmina de suero bovino.
\vskip1.000000\baselineskip
Los agentes de polipéptido de la invención,
incluidos aquellos que son proteínas de fusión (por ejemplo, las
moléculas de IL-2/Fc y de IL-15/Fc
mutante) no solamente pueden ser obtenidos por medio de expresión de
una molécula de ácido nucleico en un sistema adecuado de expresión
eucariota o procariota in vitro y posterior purificación del
agente de polipéptido, pero también se pueden administrar a un
paciente por medio de un vector adecuado de expresión terapéutica
genética que codifica a una molécula de ácido nucleico. Además, se
puede introducir un ácido nucleico en una célula de un injerto
antes del trasplante del injerto. De este modo, las moléculas de
ácido nucleico que codifican a los agentes descritos anteriormente
están dentro del alcance de la invención. Al igual que los
polipéptidos de la invención se pueden describir en términos de su
identidad con polipéptidos de tipo silvestre, las moléculas de
ácido nucleico que los codifican tendrán necesariamente una cierta
identidad con aquellas que codifican a los correspondientes
polipéptidos de tipo silvestre. Por ejemplo, la molécula de ácido
nucleico que codifica a un polipéptido mutante de
IL-15 puede ser al menos 65%, preferiblemente al
menos 75%, más preferiblemente al menos 85%, y lo más preferible al
menos 95% (por ejemplo, 96%, 97%, 98%, ó 99%) idéntica al ácido
nucleico que codifica IL-15 de tipo silvestre. Para
los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias comparadas será
generalmente al menos de 50 nucleótidos, preferiblemente al menos
de 60 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 75 nucleótidos, y
lo más preferible de 110 nucleótidos.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
agentes de la invención pueden contener secuencias de ocurrencia
natural, o secuencias que difieren de aquellas de ocurrencia
natural, pero, debido a la degeneración del código genético,
codifican al mismo polipéptido. Estas moléculas de ácido nucleico
pueden consistir de ARN o de ADN (por ejemplo, ADN genómico, ADNc,
o ADN sintético, tal como aquel producido por la síntesis con base
en fosforamidita), o combinaciones o modificaciones de los
nucleótidos dentro de estos tipos de ácidos nucleicos. Además, las
moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias
(esto es, o bien una cadena sentido o una anti-
sentido).
sentido).
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
son denominadas como "aisladas" debido a que ellas están
separadas ya sea de la secuencia de codificación 5' o de la 3' con
lo cual son inmediatamente contiguas en el genoma de ocurrencia
natural de un organismo. De este modo, las moléculas de ácido
nucleico no se limitan a las secuencias que codifican polipéptidos;
algunas o todas las secuencias no codificadoras que se extienden
secuencia arriba o secuencia debajo de una secuencia de
codificación pueden ser incluidas también. Aquellos ordinariamente
capacitados en el arte de la biología molecular están familiarizados
con los procedimientos de rutina para aislar moléculas de ácido
nucleico. Se las puede generar, por ejemplo, por medio de
tratamiento de ADN genómico con endonucleasas de restricción, o
llevando a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el
evento de que una molécula de ácido nucleico sea un ácido
ribonucleico (ARN), se pueden producir las moléculas por medio de
transcripción in vitro.
Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la
invención pueden incluir fragmentos que no se encuentran como tales
en estado natural. De este modo, la invención abarca moléculas
recombinantes, tal como aquellas en las cuales se incorpora en un
vector una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia
que codifica una IL-15 mutante) (por ejemplo, un
vector viral o plásmido) o en el genoma de una célula heteróloga (o
el genoma de una célula homóloga, en una posición diferente a la
ubicación cromosómica natural).
Como se describió anteriormente, los agentes de
la invención pueden ser proteínas de fusión. Además, o en lugar de,
los polipéptidos heterólogos descritos anteriormente, una molécula
de ácido nucleico que codifica a un agente de la invención puede
contener secuencias que codifican a un "marcador" o a un
"reportero". Los ejemplos de genes marcadores o reporteros
incluyen \beta-lactamasa, cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT), adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido
fosfotransferasa (neo^{r}, G418^{r}), dihidrofolato reductasa
(DHFR),
higromicina-B-fosfotransferasa
(HPH), timidina quinasa (TK), lacZ (que codifica
\beta-galactosidasa), y xantina guanina
fosforibosiltransferasa (XGPRT). Como con muchos de los
procedimientos estándar asociados con la práctica de la invención,
alguien capacitado en el arte será consciente de que reactivos
útiles adicionales, por ejemplo, de secuencias adicionales que
pueden servir la función de un marcador o de un reportero.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
se pueden obtener por medio de la introducción de una mutación en
un agente de la invención (por ejemplo, una molécula de
IL-15 o una molécula de IL-2)
obtenido a partir de cualquier célula biológica, tal como la célula
de un mamífero, o producido por medio de métodos rutinarios de
clonación. De este modo, los ácidos nucleicos de la invención pueden
ser aquellos de un ratón, rata, conejillo de indias, vaca, oveja,
caballo, cerdo, conejo, mono, babuino, perro o gato.
Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico serán aquellas de
un humano.
Las moléculas de ácido nucleico descritas
anteriormente pueden estar contenidas dentro de un vector que sea
capaz de dirigir su expresión, por ejemplo, en una célula que haya
sido transducida con el vector. Por lo tanto, además de los agentes
de polipéptido, los vectores de expresión contienen una molécula de
ácido nucleico que codifica a esos agentes y las células
transfectadas con esos vectores están entre las modalidades
preferidas.
Los vectores adecuados para uso en la presente
invención incluyen a los vectores con base en T7 para uso en
bacterias (ver, por ejemplo, Rosenberg y colaboradores, Gene 56:
125, 1987), al vector de expresión pMSXND para uso en células de
mamífero (Lee y Nathans, J. Bill Chem. 263: 3521, 1988), sistemas de
expresión de levaduras, tal como Pichia pastoris (por
ejemplo, la familia PICZ de vectores de expresión de Invitrogen,
Carlsbad, CA) y vectores derivados de baculovirus (por ejemplo, el
vector de expresión pBacPAK9 de Clontech, Palo Alto, CA) para uso
en células de insectos. Los insertos de ácido nucleico, que
codifican al polipéptido de interés en tales vectores, pueden ser
operativamente enlazados a un promotor, que se selecciona con base,
por ejemplo, en el tipo de célula en la cual se pretende la
expresión. Por ejemplo, se puede utilizar al promotor T7 en
bacterias, se puede utilizar un promotor de polihedrina en células
de insectos, y se puede utilizar un promotor de citomegalovirus o
de metalotioneina en células de mamífero. También, en el caso de
eucariotas superiores, se encuentran ampliamente disponibles
promotores específicos para el tipo de célula y específicos para el
tejido. Estos promotores se llaman así por su habilidad para dirigir
la expresión de una molécula de ácido nucleico en un tejido dado o
tipo de célula dentro del organismo. Alguien capacitado en el arte
es muy consciente de numerosos promotores y de otros elementos
reguladores que se pueden utilizar para dirigir la expresión de
ácidos nucleicos.
Además de las secuencias que facilitan la
transcripción de la molécula insertada de ácido nucleico, los
vectores pueden contener orígenes de replicación, y otros genes que
codifican marcadores seleccionables. Por ejemplo, el gen de
resistencia a la neomicina (neo^{r}) imparte resistencia a
G418 a las células en las cuales se expresa, y de este modo permite
la selección fenotípica de las células transfectadas. Otros genes
marcadores seleccionables factibles que permiten la selección
fenotípica de células incluyen a diferentes proteínas fluorescentes,
por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) y variantes de la
misma. Aquellos capacitados en el arte pueden determinar fácilmente
si un elemento regulador dado o marcador seleccionable es adecuado
para uso en un contexto experimental particular.
Los vectores virales que pueden ser utilizados
en la invención incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales,
adenovirales, y vectores adenoasociados, de virus del herpes, de
virus 40 de simio (SV40) y vectores del virus de papiloma bovino
(ver, por ejemplo, Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Las células eucariotas o procariotas que
contienen una molécula de ácido nucleico que codifica a un agente
de la invención y expresan la proteína codificada en esa molécula de
ácido nucleico in vitro son también características de la
invención. Una célula de la invención es una célula transfectada,
esto es, una célula dentro de la cual se ha introducido una
molécula de ácido nucleico, por ejemplo una molécula de ácido
nucleico que codifica a un polipéptido mutante de
IL-15, por medio de técnicas de ADN recombinante. La
progenie de tales células es también considerada dentro del alcance
de la invención. Los componentes precisos del sistema de expresión
no son críticos. Por ejemplo, se puede producir un polipéptido
mutante de IL-15 en un huésped procariota, tal como
la bacteria E. coli, o en un huésped eucariota, tal como una
célula de insecto (por ejemplo, células Sf21), o células de
mamífero (por ejemplo, células COS, células CHO, células 293,
células NIH 3R3, o células HeLa). Estas células están disponibles a
partir de muchas fuentes, incluida la American Type Culture
Collection (Manassas, VA). En la selección de un sistema de
expresión, solamente importa que los componentes sean compatibles
entre sí. Alguien ordinariamente capacitado en el arte es capaz de
hacer tal determinación. Además, si se requiere guía en la
selección de un sistema de expresión, se puede consultar Ausubel y
colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, New York, NY, 1993) y Pouwels y colaboradores (Cloning
Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987). Las células
eucariotas que contienen una molécula de ácido nucleico que
codifica al agente de la invención y expresa la proteína codificada
en tal molécula de ácido nucleico in vivo con también
características de la invención.
Además, las células eucariotas de la invención
pueden ser células que son parte de un trasplante celular, un
trasplante de tejido o de órgano. Tales trasplantes pueden incluir
ya sea células primarias tomadas de un organismo donante o células
que fueron cultivadas, modificadas y/o seleccionadas in vitro
antes del trasplante a un organismo receptor (por ejemplo, líneas
de células eucariotas, o células progenitoras). Ya que, después del
trasplante en un organismo receptor, puede ocurrir proliferación
celular, la progenie de tal célula es también considerada dentro
del alcance de la invención. Una célula, que es parte de un
trasplante celular, de tejido o de órgano, puede ser transfectada
con un ácido nucleico que codifica a un polipéptido mutante de
IL-15, y posteriormente ser trasplantada en el
organismo receptor, donde ocurre la expresión del polipéptido
mutante de IL-15. Además, tal célula puede contener
una o más construcciones adicionales de ácido nucleico que permiten
la aplicación de procedimientos de selección, por ejemplo de linajes
específicos de células o de tipos de células antes del trasplante
en un organismo receptor.
Los polipéptidos expresados se pueden purificar
a partir del sistema de expresión utilizando procedimientos
biomédicos de rutina, y se los puede utilizar como agentes
terapéuticos, como se describe más adelante.
Las composiciones de la invención son útiles en
la inhibición de células T que están involucradas, o estarían
involucradas, en una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta
celular inmune) con un antígeno; en la inhibición de otras células
involucradas en la patogénesis de trastornos inmunológicos (por
ejemplo, monocitos, macrófagos, y otras células que presentan
antígenos tal como las células dendríticas, las células NK, y los
granulocitos), y en la destrucción de células hiperproliferativas
(como se observa, por ejemplo, en tejidos involucrados en
trastornos inmunológicos tal como fibroblastos sinoviales (que se
afectan en la artritis reumatoide), queratinocitos (que se afectan
en la soriasis), o fibroblastos dérmicos (que se afectan en el lupus
eritematoso sistémico). Dados estos ejemplos, otros tipos de
células que pueden ser dirigidas en forma útil serán evidentes para
aquellos ordinariamente capacitados en el arte. Las células
hiperproliferativas pueden ser también células cancerosas (por
ejemplo, células T malignas).
De este modo, se pueden utilizar las
composiciones de la invención para tratar pacientes que padecen una
enfermedad inmune, particularmente una enfermedad autoinmune,
incluyendo, pero sin limitarse a las siguientes: (1) una enfermedad
reumática tal como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso
sistémico, el síndrome de Sjögren, la escleroderma, enfermedades
mezcladas del tejido conectivo, dermatomiositis, polimiositis,
síndrome de Reiter o enfermedad de Behcet, (2) diabetes tipo I o
tipo II, (3) una enfermedad autoinmune de la tiroides, tal como
tiroiditis de Hashimoto o Enfermedad de Graves, (4) una enfermedad
autoinmune del sistema nervioso central, tal como esclerosis
múltiple, miastenia grave o encefalomielitis, (5) una variedad de
pénfigos tal como el pénfigo vulgar, el pénfigo vegetante, el
pénfigo foliáceo, síndrome de Senear-Usher, o el
pénfigo brasileño, (6) enfermedades de la piel tal como soriasis o
neurodermitis, y (7) síndrome de intestino irritable (por ejemplo,
colitis ulcerativa o Enfermedad de Crohn). Se pueden utilizar
también combinaciones de agentes de la invención para tratar el
síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA). En forma similar,
los métodos por medio de los cuales se administran estos agentes se
pueden utilizar para tratar un paciente que ha recibido un
trasplante de material biológico o sintético, o una combinación de
ambos. Tales trasplantes pueden ser trasplantes de órgano, de
tejido o de células, o injertos sintéticos sembrados con células,
por ejemplo, injertos vasculares sintéticos sembrados con células
vasculares. Además, los pacientes que sufren de GVHD o los pacientes
que han recibido una lesión vascular se beneficiarían de este
método.
Debido a que la invención abarca la
administración de una forma de agotamiento de las células objetivo
de un agente que dirige al IL-15R (o a un receptor
de IL-2, o una combinación de IL-15
o del IL-15R e IL-2 o al
IL-2R), es posible matar selectivamente células
inmunes autorreactivas o "destructoras de trasplantes" sin
destrucción masiva de células T normales. Por lo tanto, la invención
ofrece un método para matar células que expresan al
IL-15R in vivo, que incluye células inmunes
activadas o autorreactivas o "destructoras de trasplantes" o
células malignas. Estos métodos se pueden llevar a cabo por medio de
la administración a un paciente de una combinación de agentes que
incluye un agente que dirige el IL-15R y que activa
al sistema de complemento, lisa a las células por medio de un
mecanismo de ADCC, o bien mata células que expresan al complejo
receptor de IL-15 de tipo silvestre. Se puede
utilizar este método para tratar pacientes que tienen leucemia de
IL-15R^{+}, linfoma, u otras enfermedades malignas
de IL-15R^{+}, tales como cáncer de colon.
Los métodos de la presente invención y las
composiciones terapéuticas utilizadas para llevarlos a cabo
contienen agentes "sustancialmente puros". Por ejemplo, en el
evento de que el agente sea un polipéptido, el polipéptido es al
menos 60% en peso (peso seco) del polipéptido de interés, por
ejemplo un polipéptido que enlaza y destruye células que soportan
IL-15R. Preferiblemente, los agentes (por ejemplo,
los polipéptidos) son al menos 75%, más preferiblemente al menos
90%, y lo más preferible al menos 99%, en peso, del agente de
interés. Se puede medir la pureza por medio de cualquier método
estándar apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna,
electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC.
Aunque los agentes útiles en los métodos de la
presente invención se pueden obtener a partir de fuentes de
ocurrencia natural, también se pueden sintetizar o también fabricar
(por ejemplo, se pueden producir agentes que enlazan y destruyen
células que soportan IL-15R por medio de la
expresión de una molécula recombinante de ácido nucleico). Los
polipéptidos que se derivan de organismos eucariotas o sintetizados
en E. coli, u otros procariotas, y polipéptidos que son
químicamente sintetizados estarán sustancialmente libres de sus
componentes naturalmente asociados. En el evento de que el
polipéptido sea una quimera, puede ser codificado por una molécula
híbrida de ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica
todo o parte del agente (por ejemplo, una secuencia que codifica un
polipéptido mutante de IL-15 y una secuencia que
codifica una región Fc de IgG). Los agentes de la invención (por
ejemplo, polipéptidos) se pueden fusionar a una etiqueta de
hexa-histidina para facilitar la purificación de la
proteína bacterialmente expresada, o a una etiqueta de
hemaglutinina para facilitar la purificación de proteína expresada
en células eucariotas.
Las técnicas que se requieren para elaborar los
agentes de la invención son rutinarias en el arte, y se pueden
llevadas a cabo sin recurrir a experimentación indebida por parte de
alguien capacitado en el arte. Por ejemplo, se puede crear una
mutación que consiste de una sustitución de uno o más de los
residuos de aminoácidos en IL-15 utilizando la
técnica de mutagénesis asistida por PCR descrita aquí para la
creación del polipéptido mutante de IL-15 en el
cual se cambiaron los residuos de glutamina en las posiciones 149 y
156 por residuos de ácido aspártico. Las mutaciones que consisten
de supresiones o de adiciones de residuos de aminoácidos (en un
polipéptido de IL-15 o en cualquiera de los otros
polipéptidos útiles descritos aquí, por ejemplo, polipéptidos que
inhiben la coestimulación o que enlazan células T activadas) pueden
ser elaboradas también con técnicas recombinantes estándar. En
aplicaciones terapéuticas, los agentes de la invención se pueden
administrar con un portador fisiológicamente aceptable, tal como
solución salina fisiológica. Las composiciones terapéuticas de la
invención pueden contener también un portador o excipiente, muchos
de los cuales son conocidos por las personas ordinariamente
capacitadas en el arte. Los excipientes que pueden ser utilizados
incluyen amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de citrato,
amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato, y amortiguador de
bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico,
fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero), EDTA,
cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Los
agentes de la invención se pueden formular en diferentes formas, de
acuerdo con la ruta correspondiente ruta de administración. Por
ejemplo, se pueden elaborar soluciones líquidas para ingestión o
para inyección; se pueden elaborar geles o polvos para ingestión,
inhalación, o aplicación tópica. Los métodos para elaborar tales
formulaciones son conocidos y se pueden encontrar, por ejemplo, en
"Remington's Pharmaceutical Sciences".
Las rutas de administración son también bien
conocidas por farmacólogos y médicos e incluyen la administración
intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, e intravenosa. Otras
rutas adicionales incluyen administración intracraneal (por
ejemplo, intracisternal o intraventricular), intraorbital,
oftálmica, intracapsular, intraespinal, intraperitoneal,
transmucosal, tópica subcutánea, y oral. Se espera que las rutas
tanto intravenosa o intraarterial sean las preferidas para la
administración de agentes que dirijan a un receptor de
IL-15. La ruta subcutánea puede ser utilizada
también frecuentemente ya que el tejido subcutáneo proporciona un
ambiente estable para los polipéptidos, a partir del cual éstos se
pueden liberar lentamente.
En caso de terapias con base en las células
(terapias génicas), se pueden transfectar las
células/tejidos/órganos ya sea por incubación, infusión o perfusión
antes de un trasplante con una composición de ácido nucleico, de
tal manera que la proteína terapéutica se exprese y posteriormente
se libere por medio de las células/tejidos/órganos trasplantados
dentro del organismo receptor. Igualmente, las
células/tejidos/órganos podrían sufrir un pretratamiento por medio
de perfusión o de incubación simple con la proteína terapéutica
antes del trasplante con el propósito de eliminar a las células
inmunes asociadas con el trasplante adheridas a las
células/tejidos/órganos del donante (aunque esto es únicamente un
aspecto secundario, que probablemente no tendrá ninguna relevancia
clínica). En el caso de trasplantes de células, se pueden
administrar las células ya sea por medio de un procedimiento de
implantación o con un procedimiento por inyección por medio de un
catéter a través de la pared de un vaso sanguíneo. En algunos
casos, se pueden administrar las células por medio de liberación
dentro de la vasculatura, a partir de la cual se distribuyen
posteriormente por medio del torrente sanguíneo y/o migran dentro
del tejido circundante (esto se hace en el trasplante de células
de
islote, donde las células de islote son liberadas en la vena porta y posteriormente migran dentro del tejido del hígado).
islote, donde las células de islote son liberadas en la vena porta y posteriormente migran dentro del tejido del hígado).
Se conoce bien en el arte médico que las dosis
para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido el
estado general de salud, el sexo, el peso, el área de la superficie
corporal y la edad del paciente, así como del compuesto particular
que se va a administrar, el tiempo y la ruta de administración, y de
otros fármacos que se administran al mismo tiempo. Las dosis para
el polipéptido de la invención variarán, pero pueden, cuando se las
administra en forma intravenosa, ser suministradas en dosis del
orden de 1 microgramo hasta 10 mg/kg de peso corporal o de un orden
de magnitud de 0,01 mg/l hasta 100 mg/l de volumen sanguíneo. Se
puede administrar una dosis una o más veces por día, si fuera
necesario, y se puede continuar el tratamiento durante períodos
prolongados de tiempo. La determinación de la dosis
correcta para una aplicación dada está dentro de las habilidades de la persona ordinariamente capacitada en el arte.
correcta para una aplicación dada está dentro de las habilidades de la persona ordinariamente capacitada en el arte.
Se utilizaron los siguientes reactivos en los
estudios descritos aquí: se obtuvo la IL-2 humana
recombinante de Hoffman-La Roche (Nutley, NJ); se
obtuvo rapamicina de Wyeth-Ayerst (Princeton, NJ);
se obtuvo ciclosporina-A (CsA) de Sandoz (East
Hanover, NJ); se obtuvieron RPMI-1640 y el suero
fetal de ternera (FCS) de BioWittaker (Walkersville, MD); se
obtuvieron la penicilina, la estreptomicina, la G418, y la
estrepavidina-RED670 de Gibco-BRL
(Gaithersburg, MD); se obtuvieron la dexametasona, PHA, lisozima,
Nonidet P-40, NaCl, HEPES, y PMSF de Sigma (St.
Louis, MO); se obtuvo Ficoll-Hypaque de Pharmacia
Biotech (Uppsala, Suecia); se obtuvieron IL-15
humana recombinante y Ab IL-15 antihumano de
PeproTech (Rocky Hill, NJ); se obtuvieron Ab
anti-señal y gránulos de afinidad
anti-FLAG de International Biotechnologies, Inc.
(Kodak, New Haven, CT); se obtuvo pRcCMV de In Vitrogen Corporation
(San Diego, CA); se obtuvo genisteína de ICN Biomedicals (Irvine,
CA); se obtuvo disuccinimidil suberato (DSS) de Pierce (Rockford,
IL); se obtuvieron las endonucleasas de restricción de New England
Biolabs (Beverly, MA); se obtuvo [^{3}H]TdR de New England
Nuclear (Boston, MA); y se obtuvieron los anticuerpos conjugados
con colorante fluorescente CD25-PE3, CD
14-PE, CD16-PE,
CD122-PE, CD4-FITC,
CD8-FITC, IgG1-PE o
IgG1-FITC de Beckton/Dickinson (San José, CA). Se
sintetizó el péptido señal en las Instalaciones de Síntesis de
Péptidos en la Escuela de Medicina de Harvard.
Para estudiar el patrón celular de expresión del
receptor humano de IL-15, se construyó un plásmido
que podría ser utilizado para expresar una proteína de fusión de
IL-15. El plásmido codifica un polipéptido de
IL-15 que tiene un N-terminal
covalentemente enlazado a la secuencia FLAG-HMK de
18 aminoácidos
(FLAG-HMK-IL-15).
Las secuencias FLAG son reconocidas por anticuerpos
anti-FLAG (Blanar y colaboradores, Science 256:
1014, 1992); LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:
8145,1992) mientras que las secuencias de HMK (sitio de
reconocimiento de la Quinasa del Músculo Cardíaco) permiten la
introducción de la etiqueta radioactiva [^{32}P] dentro de la
molécula (Blanar y colaboradores, ver más arriba, LeClair y
colaboradores, ver más arriba).
Para la construcción del plásmido
FLAG-HMK-IL-15, se
amplificó un fragmento de ADNc de 322 pb que codifica a la proteína
madura de IL-15 por medio de PCR utilizando
oligonucleótidos sintéticos
[5'-GGAATTCAACTGGGTG
AATGTAATA-3' sentido (SEQ ID NO: 5; sitio EcoRI (subrayado) más las bases 145 - 162); 5'-CGGGATCCTCAA
GAAGTGTTGATGAA-3' (SEQ ID NO: 5 antisentido; sitio BamHI [subrayado] más las bases 472 - 489)]. Se obtuvo el molde de ADN a partir de las PBMC humanas activadas con PHA. Se purificó el producto PCR, se lo digirió con EcoRI y BamHI, y se lo clonó dentro del plásmido pAR(DRI)59/60 digerido con EcoRI-BamHI como se describió (Blanar y colaboradores, Science 256: 1014, 1992; LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 8145, 1992). La columna vertebral del plásmido pAR(DRI)59/60 contiene en las secuencias del marco que codifican a las secuencias de reconocimiento del péptido FLAG y a HMK (Blanar y colaboradores, Science 256:1014, 1992; LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8145, 1992).
AATGTAATA-3' sentido (SEQ ID NO: 5; sitio EcoRI (subrayado) más las bases 145 - 162); 5'-CGGGATCCTCAA
GAAGTGTTGATGAA-3' (SEQ ID NO: 5 antisentido; sitio BamHI [subrayado] más las bases 472 - 489)]. Se obtuvo el molde de ADN a partir de las PBMC humanas activadas con PHA. Se purificó el producto PCR, se lo digirió con EcoRI y BamHI, y se lo clonó dentro del plásmido pAR(DRI)59/60 digerido con EcoRI-BamHI como se describió (Blanar y colaboradores, Science 256: 1014, 1992; LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 8145, 1992). La columna vertebral del plásmido pAR(DRI)59/60 contiene en las secuencias del marco que codifican a las secuencias de reconocimiento del péptido FLAG y a HMK (Blanar y colaboradores, Science 256:1014, 1992; LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8145, 1992).
La construcción de fusión relacionada con
IL-15,
FLAG-HMK-IL-15, se
expresó en la cepa de E. coli BL-21 y se la
purificó por afinidad con gránulos recubiertos con
anti-FLAG como se describió (Blanar y colaboradores,
Science 256: 1014, 1992; LeClair y colaboradores, Proc. Natl. Acad
Sci. USA 89: 8145, 1992). Se eluyó la proteína de fusión de las
columnas de afinidad después de un extenso lavado con glicina 0,1 M
(pH 3,0). Se dializó el eluato que contenía
FLAG-HMK-IL-15
contra un amortiguador que contenía Tris 50 mM (pH 7,4) y NaCl 0,1
M durante 18 horas a 4ºC, se filtró a través de una membrana de 0,2
\mum, y se almacenó a -20ºC.
Se analizó la proteína de fusión purificada
FLAG-HMK-IL-15 para
determinar si interactúa con los receptores de
IL-15 de la superficie de la célula. Como se
describió anteriormente, se añadió [^{32}P]-
FLAG-HMK-IL-15 a
cultivos de las PBMC que fueron activadas por medio de un mitógeno,
PHA. Con el propósito de enlazar permanentemente proteínas
interactivas entre sí, se añadió el entrelazador químico
disuccinimidil suberato (DSS). Se lavaron, lisaron, y centrifugaron
las células, y se separaron las proteínas solubles en detergente por
medio de SDS-PAGE. La autorradiografía de las
proteínas separadas por SDS-PAGE reveló una banda
única de 75 - 80 kDa correspondiente al peso molecular combinado de
FLAG-HMK-IL-15 (15
kDa) y la subunidad de IL-15R\alpha humana (60 -
65 kDa). Se confirmó la identidad de esta banda como la subunidad
de IL-15R\alpha por medio de experimentos de
entrelazamiento realizados en presencia de un exceso molar de
hIL-15. Bajo estas condiciones, fallamos en detectar
la banda de 15 kDa marcada en forma radioactiva. De este modo, la
conformación de la proteína de fusión [^{32}P]-
FLAG-HMK-IL-15
permite el enlazamiento específico en el sitio de la subunidad de
IL-15R\alpha de 60 - 65 kDa expresada sobre la
superficie de la PBMC activadas por mitógeno.
En la siguiente serie de experimentos, se
analizó la proteína de fusión
FLAG-HMK-IL-15 para
determinar si podría funcionar como un factor de crecimiento
biológicamente activo. Las PBMC humanas activadas con PHA proliferan
en respuesta ya sea a
FLAG-HMK-IL-15 o a
la IL-2 recombinante humana, como se detectó a
través del ensayo de incorporación de
[^{3}H]-TdR. Un péptido FLAG que carece de la
secuencia de IL-15 no estimula la proliferación
celular. Como lo hace IL-2, la proteína de fusión
FLAG-HMK-IL-15
estimula la proliferación de las células transfectantes
IL-2R\gamma^{+}BAF-BO3 que
expresan la subunidad IL-2R\beta. La proteína de
fusión
FLAG-HMK-IL-15, sin
embargo, no estimula la proliferación de células parentales
BAF-BO3 que fueron transfectadas con un vector que
carece de las secuencias de la cadena de
IL-2R\beta. Por lo tanto,
FLAG-HMK-IL-15 es un
factor de crecimiento biológicamente activo que requiere de la
expresión de las cadenas de IL-2R\beta sobre las
células objetivo con el propósito de estimular la proliferación
celular.
Se emplearon la proteína de fusión
FLAG-HMK-IL-15, el
anticuerpo biotinilado anti-FLAG, y
estreptavidina-RED670 para detectar la expresión de
los sitios de enlazamiento de IL-15 sobre las PBMC
humanas por medio de análisis citofluorométrico. Las PBMC
analizadas fueron o bien aisladas en forma fresca o activadas por
PHA. Estas células fueron lavadas e incubadas ya sea con medio solo
o con FLAG-HMK-IL-15
seguido por Ab biotinilado anti-FLAG y
estreptavidina-RED670. Se analizaron las células
coloreadas por medio de citometría de flujo. Las PBMC que fueron
activadas con PHA expresaron a las proteínas de
IL-15R\alpha pero no a las PBMC restantes. En
consonancia con los resultados de los experimentos de
entrelazamiento descritos anteriormente, se bloquea el enlazamiento
de FLAG-HMK-IL-15
con las PBMC activadas por PHA por medio de un exceso molar de
rIL-15, demostrando así la especificidad del
enlazamiento de
FLAG-HMK-IL-15 por
los sitios de enlazamiento de IL-15. Tanto las
células activadas CD4^{+} como CD8^{+} expresan las cadenas de
IL-15\alpha. La activación indujo a que las
cadenas de IL-15R\alpha fueran detectadas también
sobre células CD14^{+} (monocito/macrófago) y sobre células
CD16^{+} (asesinas naturales).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis FACS de las PBMC activadas por PHA
coloreadas con proteínas
FLAG-HMK-IL-15 y Mab
anti-CD25, contra la subunidad de
IL-2R\alpha, revelan poblaciones de células que
expresan tanto las subunidades de IL-15R\alpha
como IL-2R\alpha, así como poblaciones de células
que expresan a cualquier subunidad, pero no a ambas. Existen
células IL-2R\alpha^{+} que no se enlazan a
FLAG-HMK-IL-15. Casi
todas las PBMC que fueron estimuladas con PHA únicamente durante un
día expresan tanto a las cadenas de IL-15R\alpha
como a las de IL-2R\beta (positivo doble) y una
población mucho más pequeña de IL-15R\alpha^{+}.
Se observaron células IL-2R\beta^{-} (positivo
sencillo). En forma muy interesante, existen células
IL-2R\beta^{+} que fallan en enlazarse a
IL-15. Por lo tanto, la expresión de las cadenas de
IL-2R\beta no es suficiente para el enlazamiento
de IL-15.
Tomados junto, estos datos indican que
IL-15 puede enlazarse a las células
IL-15R\alpha^{+},
IL-2R\alpha^{-}, e
IL-2R\beta^{-}. Se alcanzó una conclusión
similar a través de una experimentación que probó que la interacción
de IL-15 con células
IL-2R\alpha^{-}, \beta^{-} transfectadas con
subunidades de IL-15R\alpha (Anderson y
colaboradores, J. Biol. Chem. 270: 29862, 1995; Giri y
colaboradores, EMBO J. 14: 3654, 1995). Además del requerimiento
para la expresión de la subunidad de IL-15R\alpha,
se requieren las subunidades IL-2R\beta e
IL-2R\gamma para volver a las células sensibles al
crecimiento activado por IL-15.
En resumen, los experimentos presentados
anteriormente han demostrado que: (i) las subunidades de
IL-15R\alpha se expresan rápidamente por medio de
macrófagos activados, células T, y células NK, y (ii) la inducción
de la subunidad de IL-15R\alpha se bloquea por
medio de la dexametasona pero no por la CsA o la rapamicina.
Además, los experimentos han confirmado que la subunidad de
IL-15R\alpha es necesaria y suficiente para el
enlazamiento de IL-15 y que la proteína de fusión
FLAG-HMK-IL-15 es
una herramienta extremadamente útil para el estudio de los
receptores de IL-15.
\vskip1.000000\baselineskip
La disminución de la viabilidad de las células T
activadas y por lo tanto el agotamiento de las células T activadas
proporciona una forma para disminuir la producción de linfoquinas y
de mitógenos que contribuyen a una aterosclerosis acelerada, un
rechazo de un injerto de un individuo de la misma especie, ciertas
leucemias y otras patologías mediadas en forma inmune. Además, el
bloqueo de la ruta de transducción de la señal activada por
IL-15 proporciona también una forma para disminuir
la producción de linfoquinas y de mitógenos que contribuye a una
aterosclerosis acelerada, un rechazo de injerto de un individuo de
la misma especie, ciertas leucemias y otras patologías mediadas en
forma inmune. Cuando se las activa, proliferan las células T y
expresan receptores sobre su superficie celular para
interleuquinas. Además las células T activadas liberan al menos 3
linfoquinas: interferón gama, factor II de diferenciación de
células B, e IL-3. Estas linfoquinas pueden producir
diferentes eventos indeseables, tales como el rechazo de un injerto
de un individuo de la misma especie. En contraste, el resto de las
células T y la memoria de largo plazo de las células T no expresan
receptores de linfoquina. Esta diferencia en la expresión del
receptor proporciona un medio para dirigir a las células
inmunoactivadas sin interferir con el resto de las células. Las
moléculas diseñadas para reconocer algunas subunidades del
IL-15R reconocerán monocitos/macrófagos activados
así como células T activadas y pueden ser utilizadas para inhibir o
destruir selectivamente estas células. Los derivados de
IL-15 que se enlazan a una subunidad de
IL-15R pero que carecen de la actividad de
IL-15, ya sea porque bloquean el enlazamiento y/o la
absorción de IL-15 auténtica, son útiles en el
método de la invención. La molécula de IL-15 mutante
descrita más adelante proporciona un ejemplo de trabajo de tal
derivado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó la proteína de IL-15
humana que soporta una mutación doble (Q149D; Q156D) para dirigir
los sitios putativos críticos para el enlazamiento con la subunidad
de IL-2R\gamma. Los residuos de glutamina polares
pero no cargados en las posiciones 149 y 156 fueron mutados en
residuos ácidos de ácido aspártico utilizando mutagénesis asistida
por PCR. Un ADNc que codifica al mutante doble de
IL-15 fue amplificado por medio de PCR utilizando
un oligonucleótido sintético sentido
[5'-GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA-3'
(SEQ ID NO:_); sitio EcoRI (hexámero subrayado) más las
bases 145 - 162] y un oligonucleótido sintético antisentido
(5'-CGGGATCCTCAAGAA
GTGTTGATGAACATGTCGACAAT-ATGTACAAAACTGTCCAAAAAT-3'
(SEQ ID NO:_); sitio BamHI (hexámero subrayado) más las
bases 438 - 489; las bases mutadas están subrayadas en forma
individual]. El molde era un plásmido que contenía ADNc que
codifica
FLAG-HMK-IL-15
humana. El fragmento amplificado fue digerido con EcoRI/BamHI
y clonado dentro del plásmido pAR(DRI) 59/60 digerido con
EcoRI/BamRI como se describió (LeClair y colaboradores,
Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 8145, 1989). La presencia de una
mutación en el residuo 156 fue confirmada por medio de digestión
con SalI; la mutación introduce un nuevo sitio de restricción
SalI. Además, se verificaron las mutaciones por medio de
secuenciación de ADN, de acuerdo con técnicas estándar. Se produjo
la proteína mutante doble
FLAG-1-nVlK-IL-15
(Q149D; Q156D), se la purificó, y se hizo la verificación por medio
de secuenciación como se describió anteriormente para la proteína
FLAG-HMK-IL-15 de
tipo silvestre.
Utilizando esta misma estrategia, se prepararon
los mutantes que contenían una única sustitución de aminoácidos, ya
sea en posición 149 o en posición 156. Como se describió
anteriormente, estas posiciones (149 y 156) corresponden a las
posiciones 101 y 108, respectivamente, en el polipéptido maduro de
IL-15, que carece de una secuencia de señal de 48
aminoácidos.
En forma similar, se puede utilizar esta
estrategia para incorporar cualquier otro aminoácido en lugar de
los residuos de glutamina en las posiciones 149 ó 156 o para
introducir sustituciones de aminoácidos en posiciones diferentes a
149 y/o 156.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido mutante doble de
IL-15 puede inhibir la proliferación de
BAF-BO3 en una forma que depende de la dosis: la
adición de 30 \mul (aproximadamente 50 \mug/ml) de
Il-15 mutante doble inhibió la proliferación más
completamente que la adición hecha de 20 \muL de la misma
concentración de la IL-15 mutante doble.
\vskip1.000000\baselineskip
La habilidad del polipéptido mutante doble de
FLAG-HMK-IL-15 para
enlazar a las PBMC humanas activadas con PHA fue demostrada de la
siguiente manera. Se lavaron las PBMC activadas con PHA y se las
incubo con medio solo, o con el mutante doble de
FLAG-HMK-IL-15. Se
incubaron luego las células con un anticuerpo biotinilado
anti-FLAG y coloreadas con estreptavidina conjugada
con RED670. Las células coloreadas fueron analizadas por medio de
citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una serie de experimentos similares a
aquellos anteriores, se mostró la habilidad del polipéptido
FLAG-HMK-IL-15 de
tipo silvestre para enlazar células de leucemia. Las células
tratadas se obtuvieron a partir de líneas de células leucémicas
MOLT-14, YT, HuT-102, y a partir de
líneas de células que se están estableciendo actualmente en el Beth
Israel Hospital (Boston, MA), y llamadas 2A y 2B. Se lavaron las
células cultivadas y se las incubó ya sea con medio solo o con
medio que contenía al polipéptido
FLAG-HMK-IL-15 de
tipo silvestre. Se incubaron luego las células con el anticuerpo
biotinilado anti-FLAG y se las coloreó con
estreptavidina conjugada con RED670. Se analizaron las células
coloreadas por medio de citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la quimera de
FLAG-HMK-IL-15, que
proporciona a la IL-15 mutante con una etiqueta
antigénica, se pueden enlazar numerosos otros polipéptidos a
cualquier mutante de IL-15 o IL-2.
Por ejemplo, IL-15 o IL-2 mutantes
se pueden enlazar al fragmento Fc de la subclase de IgG de
anticuerpos e acuerdo con el siguiente método.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede generar el ADNc para Fc\gamma2a a
partir del ARN extraído de un hibridoma que secreta IgG2a utilizando
técnicas estándar con transcriptasa inversa
(MMLV-RT; Gibco-BRL, Grand Island,
NY) y un oligonucleótido oligo-dT sintético (12 -
18) (Gibco BRL). El ADNc de IL-15 mutante se puede
amplificar a partir de un molde de plásmido por medio de PCR
utilizando oligonucleótidos sintéticos específicos de
IL-15.
Se diseña el oligonucleótido 5' para insertar un
único sitio de restricción NotI de 40 nucleótidos 5' al
codón de iniciación transcripcional, mientras que el oligonucleótido
3' elimina el codón de terminación y modifica el uso del codón del
residuo Ser C-terminal desde AGC hasta TCG para
acomodar la creación de un único sitio BamHI en la unión de
IL-15/Fc mutante. Los oligonucleótidos sintéticos
utilizados para la amplificación del ADNc del dominio de
Fc\gamma2a cambian el primer codón de la bisagra de de Glu por ASP
con el propósito de crear un único sitio BamHI que abarca al
primer codón de la bisagra e introduce un único sitio XbaI
3' al codón de terminación.
Se puede modificar el fragmento Fc para que no
se agoten las células objetivo, esto es, no sean capaces de activar
al sistema del complemento. Para hacer que la construcción de la
IL-15 mutante no agote las células objetivo
(mIL-15/Fc), se utiliza mutagénesis dirigida al
sitio del oligonucleótido para remplazar al motivo de enlazamiento
C'lq de Glu318, Lys320, Lys322 con residuos Ala. En forma similar se
remplaza a Leu235 con Glu para inactivar al sitio de enlazamiento
Fc\gammaR I. La ligación de citoquina y de componentes de Fc en
el marco de lectura correcto de traducción en el sitio único
BamHI produce un marco de lectura abierta de 1236 pares de
bases que codifican a un único polipéptido de 411 aminoácidos
(incluido el péptido señal de IL-15 de 18
aminoácidos) con un total de 13 residuos de cisteína. Se predice que
la IL-15/Fc homodimérica madura secretada tiene un
total hasta de ocho enlaces intramoleculares y tres enlaces
disulfuro intermoleculares de cadena pesada y un peso molecular
aproximadamente de 85 kDa, exclusivo de glicosilación.
La construcción genética adecuada de
mIL-15/Fc se puede confirmar por medio de un
análisis de secuencia del ADN después de la clonación del gen de
fusión como un casete NotI-XbaI dentro del
plásmido de expresión eucariota pRc/CMV (Invitrogen, San Diego,
CA). Ese plásmido transporta un promotor/reforzador de CMV, una
señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino y un
gen de resistencia a la neomicina para la selección con G418. Los
plásmidos que transportan al gen de fusión mIL-15/Fc
se transfectan dentro de las células de ovario de hámster chino
(CHO-K1, disponible con la American Type Culture
Collection) por medio de electroporación (1,5 kV/3 \muF/0,4
cm/PBS) y se selecciona en medio de Ultra-CHO libre
de suero (BioWhittaker Inc, Walkerville, MD) que contiene 1,5 mg/ml
de G418 (Geneticin, Gibco BRL). Después de la subclonación, se
seleccionan los clones que producen niveles altos de la proteína de
fusión por medio de selección de los sobrenadantes de
IL-15 por medio de ELISA (PharMingen, San Diego,
CA). Las proteínas de fusión de mIL-15/Fc se
purifican a partir de los sobrenadantes del cultivo por medio de
cromatografía de afinidad en sefarosa con proteína A seguido por
diálisis contra PBS y esterilización a través de un filtro de 0,22
\mum. Se pueden almacenar las proteínas purificadas a -20ºC antes
de utilizarlas.
El análisis de transferencias Western seguido
por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (con DTT) y
no reductoras (sin DTT) se puede llevar a cabo utilizando
anticuerpos primarios anti-Fc\gamma o
anti-mIL-15 monoclonales o
policlonales para evaluar el tamaño y la especificidad isotipo de
las proteínas de fusión. La actividad funcional de
IL-15/Fc mutante se puede evaluar por medio de un
ensayo estándar de proliferación de células T, como se describió
anteriormente. Se obtuvieron los siguientes mAb de PharMingen (San
Diego, CA): CD25 PE-anti-ratón
(cadena \alpha de IL-2R, IgG1, PC61), CD122
anti-ratón de rata (cadena \beta
IL-2R, IgG2b, TM-b1), CD132
anti-ratón de rata (IL-2R \gammac,
IgG2b, TUGm2), CD3 anti-ratón de hámster (IgG, 145 -
2C11), CD28 anti-ratón de hámster (IgG, 37.51),
CD62L PE-anti-ratón (IgG2a, MEL14),
Bcl-2 anti-ratón de hámster
conjugado con PE (IgG, 3FI1), IL-2
anti-ratón conjugado con PE (IgG2b,
JES6-5H4), PE-anexina V, IgG2b
anti-rata biotinilada,
PE-estreptavidina, PE-CiCromo, y los
mAb isotipo de control conjugados con PE. Un mAb biotinilado
anti-FLAG de ratón y un mAb de control de IgG1 de
rata fueron obtenidos a través de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO).
Se obtuvo un hibridoma de células AB que secreta al mAb CD25
anti-ratón de rata (TIB 222, IgGI) a través de
American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Se cultivaron
las células en medio de cultivo UltraCulture libre de suero
(BioWhittaker, Walkerville, MD) y se purificó el mAb en el
sobrenadante de cultivo con una columna de proteína G.
Se adquirieron las IL-2 e
IL-15 humanas recombinantes con R & D System
(Minneapolis, MN). Se construyeron, expresaron y analizaron las
proteínas de fusión IL-15-FLAG e
IL-15 mutante/Fc como se reportó previamente (Chae
y colaboradores, J. Immunol. 157: 2813 - 2819, 1996; Kim y
colaboradores, J. Immunol. 161: 5742 - 5748, 1998). Se utilizaron
los mAb gc anti-ratón de rata (4G3/3E12, IgG2b) como
se reportó previamente (Li y colaboradores J. Immunol. 164: 1193 -
1199, 2000). Se marcaron los linfocitos con el fluorocromo
5-carboxifluorescein diacetato succinimidil éster
(CFSE; Molecular Probes, Inc., Portland, OR) de la siguiente manera.
Se recolectaron bazos y nodos periféricos de linfa de ratones
donantes y se prepararon suspensiones de células individuales en
solución salina balanceada de Hanks (HBSS). Se lisaron glóbulos
rojos por medio de choque hipotónico. Se resuspendieron las células
en HBSS a razón de 1x10^{7}/ml y se las marcó con CFSE como lo
describen Wells y colaboradores (J. Clin. Invest. 100: 3173 - 3183,
1997).
Para activar células T marcadas con CFSE in
vivo, se irradiaron 2 ratones/DBA (1000 rad) con un Gammacell
Exactor (Kanata, Ontario, Canadá). Cada ratón recibió entonces de 4
a 6 x 10^{7} células marcadas con CFSE en 0,5 ml de HBSS a través
de la vena de la cola. Tres días después, se sacrificaron los
ratones huésped y se recolectaron separadamente bazos y nodos
periféricos de linfa. Se prepararon suspensiones de células
individuales para coloración de la superficie de las células y
análisis FACS.
En algunos experimentos, se trataron los ratones
huésped irradiados con mAb anti-CD25 o los mAb
anti-\gammac (en forma intraperitoneal, a razón
de 1 mg/día durante 3 días con una inyección intravenosa de células
marcadas con CFSE). Se determinó la división de las células in
vivo al tercer día después de la inyección de células marcadas
con CFSE. El tratamiento con proteína de fusión
IL-15 mutante/Fc consistió de 1,5 \mug diariamente
en forma intraperitoneal, durante tres días, comenzando con una
inyección intravenosa de células marcadas.
Las células marcadas con CFSE activadas in
vivo en huéspedes alogénicos irradiados fueron coloreadas para
la expresión de subunidades del receptor de IL-2 y
de IL-15. Para detectar la expresión de la cadena
\alpha del receptor de IL-2, se colorearon
células (2 x 10^{6}) con mAb CD25 PE-antiratón
sobre hielo durante 30 minutos, se las lavó, y se las resuspendió
en 1 ml de PBS que contenía 0,5% de BSA. Para detectar la expresión
de \gammac y \betac de IL-2R, se incubaron las
células con una cadena \beta antiratón de rata (IgG2b) o con mAb
\gammac (IgG2b) sobre hielo durante 30 minutos, seguido por
incubación con una IgG2b biotinilada antirrata. Se lavaron las
células y se las coloreó adicionalmente con
PE-estreptavidina durante 20 minutos. Se lavaron y
resuspendieron las células en PBS - 0,5% de BSA para análisis. Para
detectar la expresión de la cadena \alpha de
IL-15R, se incubaron las células con proteína de
fusión de IL-15-FLAG que se enlaza
a la cadena \alpha (Chae y colaboradores, J. Immunol. 157: 2813 -
2819, 1996) y luego se las coloreó con mAb
anti-FLAG biotinilado de ratón. Se lavaron y
colorearon luego las células con PE-estreptavidina.
Se incluyeron los mAb isotipo de control que hacen juego en cada
experimento como control. Se analizaron todas las muestras
utilizando FACSort con el software CellQuest^{TM} (Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Se recolectaron y analizaron los
datos por medio de activación periódica sobre células CFSE^{+}.
Todas las células de división CFSE^{+} fueron células T, como se
definió por medio de la expresión de CD3. Se recolectaron al menos
100.000 eventos por cada muestra.
Se analizó la apoptosis de las células T en
división in vivo de la siguiente manera. Se estimularon
in vivo linfocitos marcados con CFSE en huéspedes alogénicos
irradiados como se describió anteriormente. Se recolectaron células
del bazo hospedero o de nodos periféricos de linfa tres días después
y se las coloreó con anexina V conjugada con PE sobre hielo durante
15 minutos en amortiguador de marcación. Se identificó la división
de la célula con base en el perfil CFSE de las células, y se analizó
la muerte apoptótica de las células en cada diferente división
celular por medio de coloración con anexina V.
Se colorearon también las células para expresión
intracelular de IL-2 y de citoquinas
Bcl-2. Se recolectaron las células marcadas con
CFSE que habían sido activadas in vivo durante tres días a
partir del bazo hospedero y de nodos de linfa. Se estimularon
nuevamente las células in vitro con PMA (50 ng/ml) y
ionomicina (500 ng/ml) durante cuatro horas y se añadió
GolgiStop^{TM} (PharMingen) durante las últimas dos horas del
cultivo. Se fijaron las células y se las permeabilizó con
Cytofix/Cytoperm (PharMingen) a 4ºC durante 10 minutos, y luego se
coloreó con un mAb IL-2 anti-ratón
conjugado con PE, se incluyó el mAb isotipo de control que hace
juego como control. Para la coloración con Bcl-2se
fijaron las células y se las permeabilizó con Cytofix/Cytoperm
durante 10 minutos y se coloreó con mAb
anti-Bcl-2 conjugado con PE o con el
Ab isotipo de control durante 30 minutos. Se lavaron las células y
se las analizó por medio de FACS.
Se llevó a cabo la clasificación de las células
y la nueva estimulación in vitro de la siguiente manera. Se
prepararon células marcadas con CFSE a partir de huésped alogénicos
irradiados tres días después de la inyección intravenosa de células
marcadas. Se identificó la proliferación de células in vivo a
través del análisis de sus perfiles de CFSE. Se seleccionaron las
segundas divisiones celulares, activadas, y se las clasificó con el
clasificador Ventage^{TM} para FACS (Becton Dickinson) a razón de
2,000 eventos/segundo. Las células clasificadas fueron
resuspendidas en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% de
penicilina y estreptomicina a razón de 5 x 10^{5}/ml y se la
sembró en placa sobre placas recubiertas con
anti-CD3 (2 \mug/ml) junto con el mAb
anti-CD28 (1 \mug/ml). Tres días después, se
recolectaron las células y se las coloreó con CD25
anti-ratón conjugado con PE y Ab isotipo de control.
Se analizaron la proliferación celular y la expresión de la cadena
\alpha del receptor de IL-2 por medio de FACS. La
clasificación de las células y los ensayos de proliferación in
vitro se realizaron de la siguiente manera. Se prepararon
células marcadas con CFSE a partir de huéspedes alogénicos
irradiados tres días después de la inyección intravenosa de células
marcadas, y se identificó la proliferación de células in vivo
a través del análisis del perfile de CFSE de las células. Se
seleccionó la segunda división celular, activada, y se la clasificó
con Ventage^{TM} para FACS. Se resuspendieron las células (1 x
10^{4}/ml) en medio RPMI 1640 con 10% de FCS y 1% de penicilina y
estreptomicina, y se las estimuló con IL-2 (40
\mu/ml hasta 500 \mu/ml) o IL-15 (5 ng/ml)
durante 48 horas. Se pulsaron las células con 1 mCi
^{3}H-TdR (Amersham, Boston, MA) durante 16 horas
y se determinó la asimilación de ^{3}H-TdR por
medio de recuento de centelleo (Beckman Instruments, Columbia,
MD).
Los reactivos y las técnicas descritas
anteriormente suministraron las bases para diferentes hallazgos.
Primero, los linfocitos alogénicos B6AF1 marcados con CFSE
(H-2b/d.k.), en contraste con los controles
isogénicos (Li y colaboradores, Nature Medicine 5: 1298 - 1302,
1999), proliferaron vigorosamente en huéspedes DBA/2 irradiados
(H-2d). Aproximadamente 20% de las células T
marcadas con CFSE recuperadas del bazo hospedero entraron al ciclo
celular dentro de los tres días de la transferencia adoptiva, y se
identificaron claramente de siete a ocho ciclos discretos de
división celular (Fig. 3A). Sorprendentemente, la cadena \alpha
del receptor de IL-2, que es requerida para la
señalización de alta afinidad del receptor de IL-2,
no podía ser detectada durante las primeras 5 divisiones, esto es,
esta subunidad del receptor se expresa únicamente después de cinco
divisiones celulares. En contraste, las subunidades \beta del
receptor de IL-2 se expresaron constitutivamente
para todas las células T en división, y se incrementó
progresivamente su nivel de expresión en la medida en que
continuaron dividiéndose las células. El patrón de expresión de
\gammac in vivo difiere fuertemente de aquel de la cadena
\alpha y de la cadena \beta (Fig. 3A). Las células T no
divididas (división 0) expresaron niveles muy bajos de la cadena
\gamma (< 10%). Después de entrar en el ciclo celular, la
cadena \alpha fue altamente expresada por las células T en
división, y continuó el incremento en los niveles de expresión
después de cada división celular consecutiva. Después de cinco
divisiones celulares, sin embargo, se redujo drásticamente la
expresión de la cadena \gamma, cerca de alcanzar el nivel basal
después de la sexta división celular (Fig. 3A).
La expresión diferencial de las subunidades del
receptor de IL-2 no es debida a la acumulación
selectiva de un subconjunto de células T activadas en el bazo
hospedero, ya que las células marcadas con CFSE recolectadas a
partir de los nodos periféricos de linfa mostraron un patrón
notablemente similar de expresión para las tres subunidades del
receptor de EL-2.
Segundo, la estimulación de las células T
marcadas con CFSE in vitro dio como resultado la expresión
uniforme de todas las tres subunidades del receptor de
IL-2 (Fig. 3B). Este sugiere que la regulación de la
expresión del receptor de IL-2 in vivo es
distinta de aquella in vitro. Se sabe que la cadena \alpha
del receptor de IL-2 es sensible a la escisión
proteolítica in vivo en una forma similar a la de las
selectinas (Hemar y colaboradores, J. Cell. Biol. 129: 55 - 64,
1995). La coloración para la expresión de
L-selectina por medio de las células T en división
in vivo mostró que la L-selectina se expresó
en nivele altos durante las primeras cinco divisiones celulares
(Fig. 3C), sugiriendo que la falla para detectar la expresión de la
cadena \alpha del receptor de IL-2 durante las
primeras cinco divisiones celulares no es debida a la rápida
escisión proteolítica. Para determinar si las células T en las
primeras cinco divisiones celulares son capaces de expresar a la
cadena \alpha del receptor de IL-2, se
clasificaron las células T en la segunda división celular, que no
expresaron a la cadena \alpha del receptor de
IL-2, y se las estimuló in vitro con
anti-CD3 inmovilizado y anti-CD28
soluble durante tres días. Estas células T clasificadas continuaron
dividiéndose por nueva estimulación in vitro, y todas las
células T en división expresaron a la cadena \alpha del receptor
de IL-2. Claramente, la expresión de la cadena
\alpha del receptor de IL-2 in vivo e in
vitro está regulada de diferente manera.
Ya que el receptor para IL-15
también utiliza las cadenas \gamma y \beta del receptor de
IL-2 como componentes críticos de la señalización
(Tagaya y colaboradores, Immunity 4: 329 - 336,1996), que son
altamente expresados durante las primeras cinco divisiones
celulares, nos preguntamos si las células expresan una cadena
\alpha del receptor de IL-15 que las haga
responsables por IL-15 durante las divisiones
celulares iniciales. La aplicación de una proteína de fusión
IL-15-FLAG como reactivo primario de
coloración (Chae y colaboradores, J. Immunol. 157: 2813 - 2819,
1996), demostró que la cadena \alpha del receptor de
IL-15 es claramente detectable, aunque en niveles
bajos, sobre las células T en división independientemente del número
de divisiones celulares (Fig. 4A). No se detectó la cadena \alpha
para el receptor de IL-2 sobre todas las células T
en división in vivo. De este modo, la expresión selectiva de
la cadena \alpha para el receptor de IL-15, pero
no para el receptor de IL-2, junto con la expresión
de las cadenas \gamma y \beta compartidas durante las primeras
cinco divisiones celulares, sugiere que la división celular inicial
in vivo probablemente depende de IL-15 pero
no de IL-2.
Para analizar esta hipótesis, se evaluó la
producción de IL-2 en las células T en división
in vivo. La coloración intracelular de IL-2
reveló que IL-2 fue altamente expresada únicamente
por las células que se han dividido más de cinco veces. El
tratamiento de ratones huésped con dosis de saturación de mAb
anti-CD25 citolítico falló en inhibir las primeras
cinco divisiones celulares (con relación a los ratones de control
tratados con Ab), y las células en división en la primera y en la
quinta divisiones fueron notablemente similares en ratones tratados
con anti-CD25 y en ratones de control. Además, se
clasificaron y cultivaron in vitro las células T en a
segunda división celular in vivo en presencia de
IL-2 o IL-15, y se analizó la
proliferación celular por medio de la asimilación de
^{3}H-TdR. La IL-2, suministrada
en dosis tan altas como 500 \mu/ml en cultivo, falló en soportar
la proliferación de las células T. En contraste, la
IL-15 estimuló una proliferación celular vigorosa
(Fig. 4B).
El patrón de expresión de IL-2
in vivo está estrechamente asociado con el favorecimiento de
la expresión de las cadenas \alpha y \beta del receptor de
IL-2, y con una expresión marcadamente inferior de
la cadena \gamma común (Fig. 5A). Esto sugiere que
IL-2 regula la expresión de la cadena \gamma in
vivo. Para analizar esta posibilidad, se examinó la expresión
de la cadena \gamma en las células T de ratones deficientes en
IL-2 y en ratones de control de tipo silvestre. Las
células T CD4^{+} de ratones deficientes en IL-2
expresaron niveles muy altos de cadena \gamma sobre la superficie
de las células en comparación con los controles de tipo silvestre
(Fig. 5B). El tratamiento de los ratones huésped con
anti-CD25 inhibió la reducción de la expresión de
la cadena \gamma sobre las células T en división in vivo,
pero este tratamiento no tuvo efecto sobre la expresión de la
cadena \beta del receptor de IL-2 (Fig. 5C).
La cadena \gamma es un elemento crítico de la
señalización para todos los factores conocidos de crecimiento de la
célula T y las señales de la cadena \gamma son esenciales para la
supervivencia celular, lo que se logra al menos en parte a través
de la expresión sostenida de las proteínas
anti-apoptóticas de la familia
Bcl-2 ((Nakajima y colaboradores, J. Exp. Med. 185:
189 - 195, 1997). Para determinar si la menor expresión de la
cadena \gamma después de cinco divisiones celulares in vivo
regula la expresión clonal, se colorearon las células marcadas con
CFSE con PE-anexina V después de analizar in
vivo la recuperación de los huéspedes y de la muerte celular
apoptótica de las células T en división. Se produjo una muerte
celular precipitada después de cuatro divisiones celulares. Las
células no divididas (división 0) tenían < 10% de células
positivas con anexina V. Después de la sexta división celular, sin
embargo, menos de 40% de las células fueron positivas con anexina
V. Este tipo de muerte celular no depende de Fas, ya que las células
T de ratones MRL-1pr mutantes de Fas tenían un
patrón similar de muerte celular apoptótica in vivo (Li y
colaboradores, J. Immunol. 163: 2500 - 2507, 1999). La coloración
para la expresión de Bcl-2 mostró que la intensidad
promedio de la fluorescencia del canal de la coloración de
Bcl-2 disminuyó marcadamente después de cuatro
divisiones celulares (Fig. 5E). De este modo, los eventos de
señalización por reducción de la expresión de la cadena \gamma
pueden fallar en soportar la expresión sostenida de
Bcl-2 y las células se hacen susceptibles a la
muerte celular apoptótica (Nakajima y colaboradores, J. Exp. Med.
185: 189 - 195, 1997).
Estos resultados sugieren que el bloqueo de la
señalización de IL-2 o IL-15 tendrá
diferentes efectos sobre la expansión de las células T in
vivo. Para explorar esta posibilidad adicional, se inyectaron
linfocitos marcados con CFSE de ratones deficientes en
IL-2 (H - 2b) en huéspedes DBA/2 irradiados (H -
2d), se analizó la división celular in vivo tres días
después y se la comparó con aquella en ratones de control de tipo
silvestre. Las células T de ratones deficientes en
IL-2 continuaron dividiéndose y expandiéndose in
vivo. Aproximadamente 30% de las células marcadas con CFSE
entraron al ciclo celular, y la mayoría de las células se
dividieron más de cinco veces, comparadas con las de control.
El tratamiento de los ratones huésped con un
mutante de IL-15/Fc, que actúa como un antagonista
específico del receptor de IL-15 (Kim y
colaboradores, J. Immunol. 161: 5742 - 5748, 1998), redujo
marcadamente la frecuencia de proliferación de las células T
marcadas con CFSE, y una abrumador mayoría de células marcadas con
CFSE falló en entrar al ciclo celular en los ratones tratados.
Además, el tratamiento de los ratones huésped con los mAb de
bloqueo contra la cadena \gamma común, un componente de
señalización compartido de los receptores de IL-2 e
IL-15, inhibió marcadamente también la división de
las células T in vivo. De este modo, IL-2 e
IL-15 regulan distintos aspectos de la expresión de
las células T in vivo, y la administración de antagonistas
para estas interleuquinas puede suprimir la respuesta inmune, como
se discutió anteriormente.
Estos resultados también demuestran que la
reducción de la expresión de la cadena \gamma requiere de la
activación de las células T y del progreso del ciclo celular así
como de la señalización de IL-2. Claramente, la
reducción de la expresión de la cadena \gamma in vivo está
muy asociada con la producción de IL-2 con la
expresión de alta afinidad del receptor de IL-2. En
ausencia de IL-2, la cadena \gamma se expresa en
niveles extremadamente altos y el bloqueo del receptor de
IL-2 inhibe la reducción de la expresión de la
cadena \gamma in vivo sobre el ciclo de las células T. De
este modo, estos estudios proporcionan nueva evidencia de que
IL-2 e IL-15 regulan distintos
aspectos de la activación primaria de células T in vivo.
Contrario a las creencias tradicionales y a las conclusiones con
base en estudios in vitro, IL-15 es un
factor de crecimiento crítico en la iniciación de la división de las
células T in vivo y el único papel de IL-2
in vivo es controlar la magnitud de la expansión clonal por
medio de la regulación de la expresión de la cadena \gamma sobre
el ciclo de las células T.
Estos resultados soportan las aplicaciones
clínicas descritas anteriormente. Los intentos por estimular la
respuesta de las células T con IL-2 exógena en
inmunidad tumoral y en SIDA puede promover la muerte prematura de
las células T y las terapias para bloquear a IL-2 en
la inducción de tolerancia y autoinmunidad pueden inducir una
expansión indeseada de células T. Además, la dirección combinada y
escenificada de IL-15 e IL-2
representa una forma importante de bloquear la activación de las
células T en condiciones citopáticas que dependen de las células
T.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcaron las células de una línea de células
T (células CTLL-2; 10^{6}) con 100 mCi^{51}Cr e
incubadas con una forma lítica de IL-2/Fc y un
complemento de baja toxicidad de rata (C'), una forma no lítica de
IL-2/Fc y de C', inmunoglobulina de múrido y C' (un
control negativo) o C' solo (un control negativo de 0,5 \mug/ml).
Se trató de las mismas células con un detergente (1% de NP40) (un
control positivo). Se midió la lisis celular por medio de la
liberación de ^{51}Cr. El grado de lisis observado en presencia
del detergente representa una lisis del 100%. Se calculó la lisis
específica después del tratamiento como se describió anteriormente
de acuerdo a la fórmula: % específico de lisis = [(cpm experimental
- cpm de fondo)/(liberación total de cpm - cpm de fondo) x 100%].
Los resultados que se muestran en la Fig. 6, soportan la conclusión
de que IL-2/Fc citolítica lisa a las células
CTLL-2 que soportan a IL-2R, pero no
lo hace la IL-2/Fc no lítica.
Para evaluar la habilidad de la
IL-2/Fc lítica y no lítica para enlazar a los
receptores de Fc sobre células CHO transfectadas con FcRI (FcRI de
múrido, FcRII, e IL-2R negativo) se incubaron
previamente transfectantes de FcRI con PBS, mIgG2a,
IL-2/Fc lítica, o IL-2/Fc no lítica.
Después de lavar se utilizó Fc anti-ratón de cabra
conjugado con fluorescencia para colorear las células para el
análisis por FACS. Como se muestra en Fig. 7, al
IL-2/Fc citolítica puede enlazar a FcRI, pero no
puede hacerlo con IL-2/Fc lítica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crearon dos variantes diferentes de
IL-2/Fc. La primera contenía un terminal Fc derivado
de IgG2a de múrido que mediará la CDC y la CDCC
(IL-2/Fc), y la segunda fue una porción puntual
mutada de Fc que no activaría a CDC o a CDCC
(IL-2/Fc-/-). Aunque IL-2/Fc media
la CDC en células que soportan IL-2R (tal como
aquellas de la línea de células T CTLL-2 de múrido)
y se enlaza con FcRI, IL-2/Fc-/- no lo hace (Figs. 6
y 7). Además, la molécula de IL-2/Fc lítica evitará
el desarrollo de diabetes en un modelo adoptivo de transferencia NOD
pero una forma no lítica de la molécula
(IL-2/Fc-/-) es inefectiva (Fig. 13). En el modelo
animal, se agotaron los eritrocitos de las células monodispersas de
bazo por medio de tratamiento con ACK Lysing Buffer (BioWhittaker
Inc., Walkersville, MD). Los receptores machos NOD irradiados de 8 a
12 semanas de edad (700 rad), que no eran diabéticos, fueron
inyectados luego con 2 x 10^{7} leucocitos esplénicos de ratones
NOD hembra con diabetes aguda (hiperglicemia < dos semanas). Se
analizaron semanalmente los niveles de glucosa en sangre (BGL), y
se diagnosticó la diabetes cuando BGL fue superior a 16,5 mmol/L
sobre cualquier medición individual o superior a 13,8 mmol/L
durante 3 días consecutivos. Como se muestra en la Fig. 13, la
mayoría de los animales permaneció libre de diabetes incluso
después de que se descontinuó el tratamiento.
Como se observó anteriormente, los ensayos y los
modelos animales presentados aquí se pueden utilizar para analizar
diferentes combinaciones de los agentes de la invención por su
eficacia terapéutica.
En un injerto in vivo versus el modelo
huésped (como se describió anteriormente), se analizó el destino de
las células T reactivas del huésped en presencia de
IL-2/Fc y de rapamicina. Como se muestra en la Fig.
8, la rapamicina inhibirá la proliferación de células T CD4^{+} y
CD8^{+} como incluso en presencia de IL-2/Fc,
pero permitirá la expresión de un IL-2R funcional.
Como se evidencio por medio de la coloración con Anexina V, las
células T reactivas del huésped activadas con antígeno sufrirán
apoptosis en presencia de IL-2/Fc y de rapamicina
(Fig. 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Para evitar el rechazo ya sea de los islotes
alogénicos trasplantados en receptores NOD con diabetes aguda o el
rechazo de una capa de piel trasplantada sobre ratones NOD, se
utilizó una combinación de agentes que promueven la muerte de las
células T y la inhibición de la proliferación de las células T. Como
se muestra en las Figs. 11 y 12, una combinación de
IL-2/Fc lítica, mutIL-15/Fc y
rapamicina probó ser efectiva para prevenir el rechazo del injerto
(y más efectiva que otros regímenes de tratamiento analizados). La
supervivencia del injerto y la función del injerto persistieron
durante todo el periodo de observación mostrado, y la mayoría de
los injertos sobrevivió después de la descontinuación de la terapia.
Este dramático efecto se cree que es debido a la combinación de
agentes utilizados (agentes que promueven la muerte de las células T
así como que inhiben la proliferación de las células T).
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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Claims (34)
1. Una composición para uso como medicamento que
incluye un primer agente que es un antagonista de interleuquina 15
(IL-15), en donde el antagonista de
IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos 65% de identidad con
IL-15, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza con e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y
un segundo agente que es un agonista de interleuquina 2
(IL-2), en donde el agonista es un polipéptido de
IL-2, un polipéptido mutado de IL-2
o un anticuerpo receptor
anti-IL-2.
2. La composición terapéutica de la
reivindicación 1, en donde dicho antagonista de
IL-15 se fusiona a una etiqueta antigénica.
3. La composición terapéutica de la
reivindicación 1, en donde el primer agente incluye un polipéptido
mutante de IL-15 que se enlaza con una subunidad de
un receptor de IL-15 (IL-15R).
4. La composición terapéutica de la
reivindicación 3, en donde la subunidad es una subunidad de
IL-15R\alpha.
5. La composición terapéutica de la
reivindicación 4, en donde el polipéptido mutante de
IL-15 tiene una mutación en posición 156 de la SEQ
ID NO: 2.
6. La composición terapéutica de la
reivindicación 5, en donde el polipéptido mutante de
IL-15 tiene también una mutación en posición 149 de
la SEQ ID NO: 2.
7. La composición terapéutica de la
reivindicación 5, en donde la mutación en posición 156 de la SEQ ID
NO: 2 es una sustitución de aspartato por glutamina.
8. La composición terapéutica de la
reivindicación 6, en donde la mutación en posición 149 de la SEQ ID
NO: 2 es una sustitución de aspartato por glutamina.
9. La composición terapéutica de la
reivindicación 6, en donde el polipéptido mutante de
IL-15 tiene una sustitución de aspartato por
glutamina en las posiciones 149 y 156 de la SEQ ID NO: 2.
10. La composición terapéutica de la
reivindicación 3, en donde el primer agente comprende además una
fracción que conduce a la eliminación de las células que soportan
IL-15R.
11. La composición terapéutica de la
reivindicación 10, en donde la fracción es una región de Fc de una
molécula de IgG.
12. La composición terapéutica de la
reivindicación 1, en donde el primer agente comprende un anticuerpo
anti-IL-15R sustancialmente
puro.
13. La composición terapéutica de la
reivindicación 1, en donde el segundo agente comprende un anticuerpo
que se enlaza específicamente con una IL-2R.
14. La composición terapéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a13, que comprende además rapamicina.
15. El uso de un antagonista de
IL-15, en donde el antagonista de
IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos 65% de identidad con
IL-15, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza con e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y un
agonista de IL-2, en donde el agonista es un
polipéptido de IL-2, un polipéptido mutado de
IL-2 o un anticuerpo receptor
anti-IL-2 para la preparación de una
composición terapéutica para suprimir una respuesta inmune en un
paciente.
16. El uso de la reivindicación 15, en donde
dicho antagonista de IL-15 se fusiona con una
etiqueta antigénica.
17. El uso de la reivindicación 15, en donde el
paciente tiene una enfermedad autoinmune o está en riesgo de
desarrollar una enfermedad autoinmune.
18. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es una enfermedad reumática seleccionada del
grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, el síndrome de
Sjögren, la escleroderma, enfermedades mezcladas del tejido
conectivo, dermatomiositis, polimiositis, síndrome de Reiter y
enfermedad de Behcet.
19. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
20. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es diabetes tipo I.
21. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune de la tiroides
seleccionada del grupo que consiste de tiroiditis de Hashimoto y
Enfermedad de Graves.
22. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del sistema
nervioso central seleccionada del grupo que consiste de esclerosis
múltiple, miastenia grave, y encefalomielitis.
23. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es una variedad de pénfigos seleccionados del
grupo que consiste de pénfigos vulgares, pénfigo vegetante, pénfigo
foliáceo, síndrome de Senear-Usher, y pénfigo
brasileño.
24. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es soriasis.
25. El uso de la reivindicación 17, en donde la
enfermedad autoinmune es síndrome de intestino irritable.
26. El uso de la reivindicación 15, en donde el
paciente tiene el síndrome de inmunodeficiencia adquirido
(SIDA).
27. El uso de la reivindicación 15, en donde el
paciente ha recibido un trasplante de un órgano, tejido o célula
biológicos.
28. El uso de la reivindicación 15, en donde el
paciente tiene una enfermedad injerto versus huésped.
29. El uso de un antagonista de
IL-15, en donde el antagonista de
IL-15 es un polipéptido mutado de
IL-15 que tiene al menos 65% de identidad con
IL-15, y en donde el antagonista de
IL-15 se enlaza con e inhibe una actividad de
IL-15 o a un receptor de IL-15, y un
agonista de IL-2, en donde el agonista es un
polipéptido de IL-2, un polipéptido mutado de
IL-2 o un anticuerpo receptor
anti-IL-2 para la preparación de una
composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad
maligna por IL-15R^{+}.
30. El uso de la reivindicación 29, en donde
dicho antagonista de IL-15 se fusiona a una etiqueta
antigénica.
31. El uso de la reivindicación 29, en donde la
enfermedad maligna por IL-15R^{+} es una leucemia,
un linfoma, o un cáncer de colon.
32. La composición de la reivindicación 1, en
donde el agonista de IL-2 es un polipéptido de
IL-2.
33. La composición terapéutica de la
reivindicación 32, en donde el polipéptido de IL-2
incluye además una fracción que conduce a la eliminación de las
células que soportan a IL-2R.
34. La composición terapéutica de la
reivindicación 33, en donde la fracción es una región de Fc de una
molécula de IgG.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23225100P | 2000-09-14 | 2000-09-14 | |
| US232251P | 2000-09-14 |
Publications (1)
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