JP2004525076A - Il−2およびil−15媒介t細胞応答の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2000年9月14日出願の米国特許出願第60/232251号の利益を主張するものである。
【0002】
(技術分野)
本発明は、免疫学、移植拒絶、および免疫系に関連する疾患に関する。
(連邦政府支援研究)
本明細書に記載の研究は、部分的に国立衛生研究所(NIH)の助成金によって支援されたものである。したがって、米国政府が本発明において一定の権利を有し得る。
【0003】
(背景)
2種のインターロイキン、IL−2およびIL−15は、インビトロでのT細胞増殖の刺激に機能上重複している。しかしながら、インビボでの1次免疫活性化および免疫ホメオスタシスにおけるそれらの役割は明らかでない。インビボにおいて、IL−2およびIL−15は、異なる機能を有し、T細胞活性化の異なる側面を調節する可能性がある。たとえば、IL−2はアポトーシスに対して活性化T細胞を刺激する可能性があり(レナルド(Lenardo)、Nature353、858〜861ページ、1991年)、IL−15は、細胞生存を支援する可能性がある(ドゥームズら(Dooms et al.)、J.Immunol.161、2141〜2150ページ、1998年、ブルフォンら(Bulfone et al.)、Nature Medicine3、1124〜1128ページ、1997年)。IL−15はまた、インビボでメモリー型CD8+T細胞の増殖を促進すると考えられ、IL−2は、メモリー型CD8+T細胞の持続的増殖を制限する(クら(Ku et al.)、Science288、675〜678ページ、2000年)。さらに、IL−2欠損マウスの表現型は、リンパ増殖性および自己免疫性であり(ホラークら(Horak et al.)、Immunol.Rev.148、35〜44ページ、1995年)、IL−5欠損マウスは、幾分リンパ球減少性であり、ウイルス負荷に対する1次反応を開始できない(ケネディーら(Kennedy et al.)J.Exp.Med.191、771〜780ページ、2000年、ロドルチェら(Lodolce et al.)、Immunity9、669〜676ページ、1998年)。この著しい対立の分子的機序は依然として謎のままである。
【0004】
IL−2およびIL−15の機能性受容体は、IL−2またはIL−15に対する結合特異性を定義する固有のα鎖と、共有のIL−2受容体β,γ鎖とからなる。このγ鎖はまた、IL−4、IL−7、およびIL−9受容体の重要なシグナル伝達成分である(スガムラら(Sugamura et al.)Ann.Rev.Immunol.14、179〜205ページ、1996年)。リンパ球画分において、これらの受容体サブユニットは、個々にまたは様々な組み合わせで発現し、異なる親和性および/または異なるシグナル伝達能力を有する受容体の形成をもたらし得る(スガムラら(Sugamura et al.)、前掲)。たとえば、β鎖は、α鎖またはγ鎖のいずれかと結合して2量体構造を形成可能であり、あるいはα鎖およびγ鎖の両方と結合して3量体構造を形成可能である。同様に、γ鎖は、IL−2受容体またはIL−15受容体いずれかのβ鎖と相互作用し、およびβ鎖を介してα鎖と相互作用し得る。IL−2受容体α鎖とは対照的に、IL−15受容体α鎖は単独で著しく高い親和性でIL−15と結合可能である(ギリら(Giri et al.)、EMBO J.14、3654〜3663ページ、1995年)。しかしながら、IL−2受容体α鎖と同様に、この相互作用はシグナル伝達事象を誘発しないと考えられている。したがって、α、β、およびγサブユニットの3量化は、IL−2およびIL−15の両方に対する高親和性受容体の機能的完全性にとって必須である。
【0005】
インビトロでの研究は、活性化T細胞がIL−2受容体α鎖およびIL−15受容体α鎖の両方を発現し得ること(チェら(Chae et al.)、J.Immunol.157、2813〜2819ページ、1996年)、ならびにβおよびγ鎖が活性化T細胞によって構成的に発現すること(イシイら(Ishii et al.)、Int.Immunol.6、1273〜1277ページ、1994年)が示されている。さらに、IL−2およびIL−15は共に、インビボでの免疫活性化中に容易に検出される(リら(Li et al.)J.Immunol.161、890〜896ページ、1998年)。このように、インビボにおいて活性化T細胞がどのようにIL−2、IL−15、および他のγ鎖依存サイトカインを識別しているのかは不明である。
【0006】
(概要)
本発明は、部分的に、インビボでの循環T細胞によるIL−2およびIL−15受容体サブユニットの発現研究に基づく。驚くべきことに、これらのサブユニットは、選択的に活性化T細胞応答をIL−2またはIL−15に誘導し、それによってインビボでのT細胞応答を調節する。換言すれば(IL−2およびIL−15が重複しているという広く受け入れられている知識に反して)、IL−2およびIL−15は、インビボでのT細胞増殖の制御において異なる役割を果たす。特に、IL−15はT細胞の分裂の開始に重要であり、IL−2はγc発現のダウンレギュレーションによってT細胞増殖を制御する。したがって1実施形態において、本発明は一般に、IL−2およびIL−15アンタゴニストの新規な組み合わせ、ならびにそれらのアンタゴニストを投与することにより免疫応答を抑制する方法を特徴とする。いずれの場合にも、IL−15分子またはIL−15受容体(IL−15R)に拮抗する第1の薬剤と、IL−2分子またはIL−2受容体(IL−2R)に拮抗する第2の薬剤とを投与することによって抑制が達成される。別の実施形態において、本発明の組成物は(上述の薬剤の代わりに、または上述の薬剤に加えて)、インターロイキン(たとえば、IL−2またはIL−15)あるいはインターロイキン受容体(たとえば、IL−2またはIL−15受容体)をコードする核酸(たとえば、DNAまたはRNA)の発現を阻害する薬剤を含み得る。
【0007】
より一般的には、本発明は、患者に投与されたときに抗原反応性T細胞の数を低減する薬剤の新規な組み合わせを特徴とする。たとえば、本発明は、それぞれがT細胞死を促進する2種以上の薬剤を含む組成物(たとえば、医薬として許容される組成物)を特徴とする。あるいは、この組成物は、T細胞死を促進する少なくとも1種の薬剤と、T細胞増殖を阻害する少なくとも1種の薬剤を含有することが可能である。T細胞死を促進する薬剤は、AICD(活性化誘導細胞死)、受動的細胞死、ADCC(抗体依存性細胞媒介細胞障害)、またはCDC(補体依存性細胞障害)を促進することが可能である。
【0008】
AICDを促進する薬剤には、IL−2および関連分子(たとえば、IL−2/Fcか、IL−2またはIL−2受容体のアゴニストとして機能する他の分子(たとえば、IL−2受容体に特異的に結合し、その受容体の天然リガンドの結合を模倣する抗体))が含まれる。AICDを促進する他の薬剤は、Fasリガンド(FasL)である。受動的細胞死を促進する薬剤には、IL−15に(IL−15、IL−15受容体、または受容体の結合後に活性化される細胞内シグナル伝達経路の成分を標的にし、たとえば結合し、それによってその活性を阻害することにより)拮抗するか、またはT細胞生存に必要とされる他の因子(たとえば、IL−4、IL−7、OX−4リガンド、IFN−β、4−1BB、またはIGF−I)に拮抗する薬剤が含まれる。別の実施形態において、本発明の組成剤は(上述の1種または複数の薬剤の代わりに、またはそれに加えて)、インターロイキン(たとえば、IL−2またはIL−15)あるいはインターロイキン受容体(たとえば、IL−2またはIL−15受容体)をコードする核酸(たとえば、DNAまたはRNA)の発現を阻害する薬剤を含み得る。
【0009】
T細胞表面に結合し、かつADCCまたはCDCを活性化するFc部分を含有する薬剤にT細胞を曝露することによって、ADCCまたはCDCを促進することが可能である。より具体的には、ADCCまたはCDCを促進する薬剤には、インターロイキン(たとえば、IL−2、または変異IL−15)およびFc領域を含有する融合タンパク質(たとえば、IL−2/Fc)、ならびにインターロイキン受容体(たとえば、IL−2またはIL−15受容体)に結合する抗体または他のFc含有タンパク質が含まれる。
【0010】
上述のとおり、本発明の組成物は、T細胞死を促進する薬剤だけでなく、T細胞増殖を阻害する薬剤も含み得る。T細胞増殖を阻害する薬剤には、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、アザチオプリン、および細胞増殖を防ぐために当該技術分野で知られ用いられている他の任意の薬剤(化学療法剤を含む)が含まれる。T細胞増殖を阻害する薬剤の使用は特に、AICDを促進し、さらにT細胞増殖を刺激する薬剤との組み合わせにおいて特に有用である(たとえば、IL−2/Fcなど)。たとえば、本発明は、IL−2/Fc(たとえば、AICD、およびADCCまたはCDCによる細胞溶解を促進する)、IL−15アンタゴニスト(たとえば、IL−15、T細胞生存に必要とされる因子に拮抗することによって、受動的細胞死を促進する)、ラパマイシン(T細胞増殖を阻害する)を含む医薬として許容される組成物を特徴とする。薬剤の他の組み合わせを含有する組成物を下に記載する。
【0011】
特に2種以上の薬剤を用いるとき、それらは互いに物理的に分離している必要はない。ある薬剤は、主として1つの機能活性を有する単一実体であり得るが(たとえば、特異的にIL−2またはIL−15に結合することによってIL−2またはIL−15を標的とする抗体)、その薬剤はまた、少なくとも2つの機能活性を有する単一実体であることも可能である(たとえば、IL−2/Fc、mIL−15/Fc、あるいは抗IL−2または抗IL−15抗体。これらの分子において、インターロイキンはAICDを媒介し、分子のFc部分はCDCおよびADCCを媒介する)。したがって、(1)AICDを誘発する薬剤、(2)CDCを誘発する薬剤、および(3)細胞増殖を阻害する薬剤を含む組成物は、2種のみの活性成分を含んでもよい(たとえば、(1)AICDおよびCDCを誘発するIL−2/Fc分子、ならびに(2)細胞増殖を阻害するラパマイシン)。
【0012】
本明細書に記載の組成物は、免疫抑制から利益を得るであろう患者の治療において有用である(たとえば、移植を受けた、または受ける予定の患者、免疫疾患、特に自己免疫疾患を有する患者、癌(たとえば、免疫系の癌)を有する患者、または対宿主性移植片病(GVHD)を罹患している患者)。GVHDは、レシピエントでの抗原に対するドナー白血球の反応によって特徴づけられる。この反応は特に骨髄移植において問題となるが、臓器移植においても起こる。移植臓器に内在するドナー白血球は、常に共移植される。
【0013】
本発明の組成物は複数の薬剤を含有し得るが、本発明の方法は、それらの薬剤が同時に投与される方法に限定されない。たとえば、患者は、IL−2アンタゴニストまたは該IL−2Rアンタゴニストを含有する組成物を投与する前に、IL−15アンタゴニストまたは該IL−15Rアンタゴニストを含有する組成物を投与することが可能である。同様に、患者は、IL−2アゴニストを含有する組成物を投与する前に、ラパマイシンを含有する組成物を投与することが可能である。さらに、本発明の組成物は(同時に、または連続的に適用)、患者に移植される前に器官または細胞移植片を処理するために用いることが可能である。本発明の薬剤、およびそれらを使用する方法は、以下にさらに記載する。
【0014】
本発明において用いられる薬剤の多くは、有利な治療特性を有する。たとえば、IL−15Rを標的とする薬剤は、変異IL−15(mIL−15)ポリペプチドを含む融合タンパク質であり得る。この融合タンパク質の変異IL−15部分はわずか少数の置換残基が野生型IL−15と異なり得るので、これらの薬剤は免疫原性とはなる可能性は低い。さらに、mIL−15ポリペプチドは高親和性でIL−15Rαを結合し得るので、受容体に対して野生型IL−15と有効に競合することが可能である。さらに本発明の薬剤は、補体や食細胞などの宿主免疫系の成分を活性化可能であり、これは最終的に、その薬剤が結合する受容体(たとえば、IL−2受容体)を有する細胞の除去(または枯渇)を媒介する。たとえば、本発明の薬剤は、標的化細胞の溶解またはファゴサイトーシスを媒介し得る。IL−15受容体のアルファ・サブユニット(IL−15Rα)は活性化または悪性免疫細胞によって発現されるが、休止免疫細胞によっては発現されないので、本発明の薬剤は、活性化された細胞(たとえば、抗原活性化T細胞)、または悪性となった細胞を特異的に標的とするために用いることが可能である。このように、T細胞は本発明の薬剤の好ましい標的であるが、本発明の組成物は、免疫障害の病因にかかわる他の細胞、たとえば免疫系の他の細胞、または組織の過増殖細胞などを標的とするためにも用い得る。
【0015】
特に定義のない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を本明細書に援用する。
【0016】
本発明の他の特徴および利点は、図面、詳細な説明、および請求の範囲から明らかとなるであろう。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の材料および方法を用いることが可能であるが、好ましい材料および方法を以下に記載する。
【0017】
(詳細な説明)
抗原またはマイトジェンがT細胞の活性化を誘発するとき、有効な免疫応答が開始する。T細胞活性化のプロセスにおいて、多くの細胞の変化が起こるが、これにはサイトカインおよびサイトカイン受容体の発現が含まれる。免疫応答にかかわるサイトカインの1種はインターロイキン−15(IL−15)であり、これはインビトロにおいてB細胞、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびリンパ球活性化キラー(LAK)細胞の増殖および分化を刺激するT細胞増殖因子である。インビボでは、これらの細胞型の増殖は免疫応答を増強する。免疫応答にかかわり本明細書に記載される他のサイトカインはIL−2である。
【0018】
本発明の組成物には、IL−15またはその受容体を標的とする薬剤、およびIL−2またはその受容体を標的とする薬剤、ならびに免疫応答(たとえば、体液性または細胞性免疫応答)を抑制するためにそれらの組成物を用いる方法が含まれる。いくつかの状況において、たとえば臓器移植、または免疫疾患、特に自己免疫疾患、または対宿主性移植片病の場合において、患者は免疫応答の抑制から利益を得る。他の状況、たとえば選択された免疫細胞が悪性または自己攻撃性となったとき、それらを積極的に破壊することは有益である。
【0019】
本発明は、免疫応答を阻害する新規な方法の発見に基づく。阻害は、1種がIL−15またはIL−15Rを標的とし、1種がIL−2またはIL−2Rを標的とする、薬剤の組み合わせを投与することによって達成し得る(エキソビボでの移植片の処理を含む投与経路は、当該技術分野で知られており、以下にさらに記載する)。より一般的には、活性化T細胞死に至るシグナル伝達経路を活性化する(たとえば、AICDによって)、その生存に必要とされる因子の細胞を除去する(そのような除去に続いて死ぬ細胞は、受動的細胞死による死と呼ばれる)、または活性化細胞を免疫系の成分による細胞溶解の標的とする(このように死ぬ細胞は、ADCCまたはCDCによる死と呼ばれる)ことによって、抗原反応性T細胞の数を低減することが可能である。したがって、本発明の組成物は、これらの目的の1つまたは複数を達成する(すなわち、認められている細胞死経路(たとえば、AICD、受動的細胞死、ADCC、またはCDC)を経るT細胞死を促進する)薬剤を含む。T細胞死を促進する1種または複数の薬剤を含有することに加えて、本発明の組成物は、T細胞増殖を阻害する(たとえば抗原に応答して起こる)1種または複数の薬剤を含み得る。たとえば、本発明は、IL−2/Fc(たとえば、AICD、およびADCCまたはCDCによる細胞溶解を促進する)、mIL−15/Fc(IL−15に拮抗し(それによって受動的細胞死を促進)、ACDDまたはCDCによる細胞溶解を促進する)、およびラパマイシン(T細胞増殖を阻害する)を含む組成物(たとえば、医薬として許容される組成物、または器官または細胞培養に適用するために製剤されたもの)を特徴とする。
【0020】
「薬剤」という用語は、治療薬として用いることが可能である本質的に任意の型の分子を包含するものである。野生型タンパク質と同一であっても、変異(すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換)を含有してもよい抗体、融合タンパク質、および可溶性リガンドなどのタンパク質、およびそれらをコードする(またはそれらの「アンチセンス」である、たとえば、IL−2、IL−15、またはそれらの受容体の成分(たとえば、サブユニット)をコードする核酸のアンチセンスであるオリゴヌクレオチド)核酸分子は、すべて「薬剤」である。本発明の薬剤は、全身に、局所的に、または細胞療法(すなわち、その患者に薬剤を発現する細胞を投与することによって、本発明の薬剤を患者に投与することが可能である)によって投与することが可能である。この細胞は、治療薬を発現する目的のためだけに患者に投与された細胞であり得る。この細胞はまた、細胞、組織、または臓器移植の細胞であり得る。たとえば、移植された細胞(たとえば、膵島細胞)、あるいは組織または器官内の細胞(たとえば、皮膚断片内、あるいは肝臓、腎臓、または心臓内の細胞)は、薬剤で処理し、エキソビボで薬剤をコードする核酸分子を用いて形質導入することが可能である(たとえば、移植前)。このようにして、移植された細胞は、それ自体の免疫抑制剤を産生する。たとえば、所望の表現型を有する細胞(たとえば、インスリン産生細胞)は、本発明の1種または複数の免疫抑制因子を産生する遺伝子を含むように修飾することが可能である。この移植された細胞、組織、または器官は、移植に先立って、または移植に続いて処理することが可能である。患者(または培養の細胞または器官)に薬剤を投与する方法は、当該技術分野の技術者に知られ、慣例的に用いられているが、以下にさらに記載する。
【0021】
IL−15またはIL−15Rを標的とする薬剤
本発明の組成物は、IL−15またはIL−15受容体を標的とする1種または複数の薬剤を含み得る。上述のとおり、単一の薬剤が複数の機能ドメインを有してもよい。IL−15またはIL−15Rを標的にする薬剤には、IL−15、IL−15R、またはそれらをコードする核酸に結合する(あるいはそれらと相互作用する)薬剤、ならびに活性化T細胞などの、IL−15Rを有する細胞に結合し、その後破壊する薬剤が含まれる。したがって、免疫抑制の達成に有用な薬剤は、2つの機能部分、つまり薬剤の標的をIL−15Rを有する細胞とする標的化部分とIL−15Rを有する細胞の除去をもたらす標的細胞枯渇(たとえば、溶解)部分を有することが可能である。1実施形態において、標的化部分は、受容体を介して有効にシグナルを伝達することなくIL−15Rに結合する。たとえば、標的化部分は、変異IL−15ポリペプチドを含むことが可能であり、標的細胞枯渇部分は、免疫グロブリン分子のFc領域を含むことが可能である。Fc領域は、IgG、たとえばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、または類似哺乳動物IgGなどから、あるいはIgM、たとえばヒトIgM、または類似哺乳動物IgMなどから誘導することができる。好ましい実施形態において、Fc領域は、ヒトIgG1またはマウスIgG2aのヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含む。本発明は任意の特定の機構によって作用する薬剤に限定するものではないが、このFc領域はIL−15Rを有する細胞の補体および食細胞主導の除去を媒介すると考えられる。
【0022】
野生型IL−15に類似の親和性でIL−15受容体複合体に結合するが、完全にはシグナル伝達を活性化しない変異IL−15ポリペプチドがすでに産生されている。この変異ポリペプチドは、野生型IL−15ポリペプチドと有効に競合し、IL−15シグナル伝達に応答して通常起こる1つまたは複数の事象、たとえば細胞増殖などを阻害し得る。本明細書では、「野生型IL−15ポリペプチド」は、天然IL−15(たとえば、図1に示す野生型IL−15ポリペプチド)と同一のポリペプチドである。対照的に、「変異IL−15ポリペプチド」は、野生型IL−15と比較して少なくとも1つの変異を有し、野生型IL−15によって通常促進される少なくとも1つのインビボまたはインビトロの活性を阻害するポリペプチドである。
【0023】
本発明によって用いることが可能な変異IL−15ポリペプチドは一般に、野生型IL−15分子の1つまたは複数の活性の少なくとも40%、より好ましくは少なくとも70%、もっとも好ましくは少なくとも90%を遮断する。変異IL−15ポリペプチドが野生型IL−15活性を遮断する能力は、本明細書に記載のBAF−BO3細胞増殖アッセイ(IL−2Rβをコードする構築物で細胞をトランスフェクトした)を含む多くのアッセイによって評価可能である。さらに、本発明の変異ポリペプチドは、それらが示す野生型IL−15との特定の同一性のパーセントによって定義可能である。2つのポリペプチド間の同一性パーセントを調査するとき、比較される配列の長さは、一般に少なくとも16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個のアミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも35個のアミノ酸である。ポリペプチドまたはDNA配列に関して用いられる「同一性」という用語は、比較される2つのポリペプチドまたはDNA配列内のサブユニット(タンパク質のアミノ酸残基、またはDNA分子のヌクレオチド)間の同一性を指す。両方の分子のあるサブユニット位置を同一のモノマー・サブユニット(すなわち、同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド)が占めているとき、それらの分子はその位置において同一である。2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の1次関数である。したがって、アミノ酸長100の参照ポリペプチドと50%同一であるポリペプチドは、参照ポリペプチドのアミノ酸長50部分と完全に同一であるアミノ酸50個のポリペプチドであり得る。これはその全長にわたって参照ポリペプチドと50%同一であるアミノ酸長100のポリペプチドであってもよい。当然ながら、多くの他のポリペプチドが、同じ基準を満たすことになる。同一性は、典型的に、かつもっとも都合よく、ウィスコンシン大学バイオテクノロジー・センター(University of Wisconsin Biotechnology Center)(ウィスコンシン州マディソン(Madison)、ユニバーシティ・アベニュー1710、53705)の遺伝子コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)のSequence Analysis Software Packageなどの配列分析ソフトウェアをそのデフォルト・パラメータと共に用いて測定される。
【0024】
本発明の変異IL−15ポリペプチドは、少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは少なくとも95%(たとえば、96%、97%、98%、または99%)、野生型IL−15と同一であり得る。変異は、アミノ酸残基の数または含量の変化からなる。たとえば、変異IL−15は、野生型IL−15より多いかまたは少ない数のアミノ酸残基を有することが可能である。あるいは、または上記に加えて、この変異ポリペプチドは、野生型IL−15に存在する1つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み得る。変異IL−15ポリペプチドは、単一アミノ酸残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、たとえば156位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型IL−15と異なり得る。同様に、変異ポリペプチドは、2つのアミノ酸残基、たとえば156位および149位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型と異なり得る。たとえば、変異IL−15ポリペプチドは、156位および149位の残基でグルタミンの代わりにアスパラギン酸を置換するぶんだけ(図2に示したとおり)、野生型IL−15と異なり得る。標的化剤として有用な変異ポリペプチドは、野生型IL−15と同様に、IL−15Rの成分を認識し、結合する。1実施形態において、IL−15の変異は、IL−2Rγ(IL−2受容体サブユニット)に結合すると考えられているサイトカインのカルボキシ末端ドメインである。別法として、または上記に加えて、変異IL−15ポリペプチドは、IL−2Rβ(IL−2受容体βサブユニット)結合ドメイン内に1つまたは複数の変異を含み得る。
【0025】
変異IL−15ポリペプチドが、他の残基の代わりに1つのアミノ酸残基の置換を含む場合、その置換はこれに限定されないが保存的置換であることが可能であり、以下のグループ内の置換が含まれる。グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシンである。
【0026】
IL−15標的化ポリペプチド(たとえば、変異IL−15ポリペプチド)を用いる代わりに、またはそれを用いることに加えて、治療薬剤は抗体であることが可能である。たとえば、IL−15は抗体によって標的とされ得る(すなわち、特異的に結合され得る)。同様に、IL−15Rは、IL−15Rの成分(たとえば、IL−15Rαサブユニット)を結合する抗体の標的となり得る。ヒト化抗体を含む抗体をIL−15Rの成分に対して産生し得る方法は、当該技術分野でよく知られている。この抗体は、好ましくは、補体およびファゴサイトーシス、たとえばヒトIgG3およびIgG1(好ましくは後者)サブクラス、またはマウスIgG2aサブクラスを活性化することができる。
【0027】
本発明の方法はまた、(a)それぞれがT細胞死を促進する2種以上の薬剤、または(b)T細胞死を促進する少なくとも1種の薬剤とT細胞増殖を阻害する少なくとも1種の薬剤、を含有する組成物を用いて行うことも可能である。T細胞死を促進する薬剤は、T細胞がその生存に必要とされる因子を枯渇したときに起こる受動的細胞死を促進することによって、T細胞死を促進し得る。IL−15はそのような薬剤の1つである(他は以下に記載する)。したがって、IL−15の能力を妨げ、生存因子として働く薬剤(たとえば、IL−15またはIL−15受容体に特異的に結合する抗体)を、本発明の組成物に含み得る(たとえば、組成物は、AICDを促進する薬剤、受動態細胞死を促進する薬剤(たとえば、抗IL−15抗体)、および任意選択でT細胞増殖を阻害する薬剤を含み得る)。
【0028】
上述のとおり、免疫抑制を達成するのに有用な薬剤は、2つの機能部分、薬剤の標的をIL−15Rを有する細胞(直前に記載の変異IL−15分子など)とする標的化部分、およびIL−15Rを有する細胞をたとえば溶解する、または他の方法で除去をもたらす標的細胞枯渇部分を含有し得る。したがって、この薬剤は、変異IL−15ポリペプチド、および異種ポリペプチド、たとえば抗体のIgGおよびIgMサブクラスのFc領域などを含む、キメラポリペプチドであり得る。Fc領域は、補体結合およびFc受容体結合を阻害する変異を含むことができ、あるいは標的細胞枯渇性(すなわち、補体を結合することによって、または抗体依存性補体溶解などの他の機序によって細胞を破壊することができる)であってよい。
【0029】
Fc領域は、天然源から単離する、組換えによって産生する、または合成することが可能である(本発明に用いられる任意のポリペプチドと同様)。たとえば、IgGのC末端ドメインと同種のFc領域は、IgGをパパインで消化することによって産生可能である。IgGFcは、分子量約50kDaを有する。本発明のポリペプチドは、Fc領域全体、または細胞を溶解する能力を維持しているより小さい部分を含み得る。さらに、全長Fc領域、またはフラグメント化Fc領域は、野生型分子の変種であり得る。すなわち、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼすかまたは及ぼさない変異を含有することが可能である。
【0030】
本明細書では、インターロイキンまたはインターロイキン受容体を「標的とする」薬剤について言及される。薬剤が、インターロイキンまたはインターロイキン受容体の活性に影響を及ぼすような方法でインターロイキンまたはインターロイキン受容体に直接または間接的に結合するかまたは相互作用するときに、標的化が起こる。活性は、当該技術分野の技術者によって、通常の実験手法を用いて評価可能である。たとえば、シグナル伝達、あるいは受容体の結合に続いて起こる、または通常起こるであろう下流の他の生物事象の強度を評価可能である。インターロイキンまたはインターロイキン受容体を標的とする薬剤によって生じる活性は、そのように限定されないが、天然インターロイキンが天然インターロイキン受容体に結合するときに生じる活性と異なり得る。たとえば、その受容体が天然IL−2によって結合した場合に起こるものと実質的に同じ活性をその薬剤が生じる場合にも、IL−2受容体を標的とする薬剤は本発明の範囲に含まれる。ある薬剤が天然リガンドによって生じる活性と実質的に同じ、またはより高い活性を生じるとき、その薬剤は受容体アゴニストとみなし得る(薬剤と天然リガンドは同一条件下で検査される)。ある薬剤が天然リガンドによって生じる活性より低い活性を生じるとき、その薬剤は受容体のアンタゴニスト(その薬剤の主要な相互作用が受容体との相互作用である場合、たとえばmIL−15)、またはインターロイキンのアンタゴニスト(その薬剤の主要な相互作用がインターロイキンとの相互作用である場合、たとえば抗IL−15抗体)とみなし得る。ここでも、活性のレベルは、その薬剤および天然受容体(またはリガンド)を同一の条件下で試験することによって評価される。
【0031】
本発明の薬剤と一部となり得るFc領域は、「標的細胞枯渇性」、または「標的細胞非枯渇性」であり得る。非標的細胞枯渇性Fc領域は、典型的に、高親和性Fc受容体結合部位、およびC’1q結合部位を欠いている。マウスIgGFcの高親和性Fc受容体結合部位は、IgGFcの235位のLeu(ロイシン)残基を含む。したがって、マウスFc受容体結合部位は、Leu235を変異または欠失することによって破壊され得る。たとえば、Leu235のGlu(グルタミン酸)による置換は、Fc領域が高親和性Fc受容体に結合する能力を阻害する。マウスC’1q結合部位は、IgGのGlu318、Lys(リシン)320、およびLys322残基を変異または欠失することによって、機能的に破壊され得る。たとえば、Glu318、Lys320、およびLys322のAla(アラニン)残基による置換によって、IgG1Fcは抗体依存性補体溶解を誘導することができなくなる。対照的に、標的細胞枯渇性IgGFc領域は、高親和性Fc受容体結合部位、C’1q結合部位を有する。高親和性Fc受容体結合部位は、IgGFcの235位のLeu(ロイシン)残基を含み、C’1q結合部位は、IgG1のGlu318、Lys320、およびLys322残基を含む。標的細胞枯渇性IgGFcは、これらの部位において、野生型残基、または保存的アミノ酸置換を有する。標的細胞枯渇性IgGFcは、細胞を抗体依存性細胞性細胞障害、または補体依存性細胞溶解(CDC)の細胞を標的にすることが可能である。ヒトIgGの適切な変異も知られている(たとえば、モリソンら(Morrison et al.)、The Immunologist2、119〜124ページ、1994年、およびブレッケら(Brekke et al.)、The Immunologist2、125ページ、1994年を参照のこと)。
【0032】
IL−15Rを標的にする薬剤は、任意選択で抗原性タグ(たとえば、FLAG配列)に融合した変異IL−15ポリペプチドが可能である。FLAG配列は、本明細書に記載のとおり、ビオチン化高特異性抗FLAG抗体によって認識される(さらに、ブラナーら(Blanar et al.)、Science256、1014ページ、1992年、ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1992年を参照のこと)。
【0033】
さらに、可溶性IL−15Rα鎖をアンタゴニストとして用いることが可能である。IL−15受容体複合体はαβγサブユニットからなるが、α鎖は単独でIL−15に対して高親和性を示す。したがって、可溶性IL−15Rα鎖はIL−15を結合し、IL−15が細胞表面結合IL−15R複合体に結合するのを妨げることになる。したがって、可溶性IL−15Rα鎖は、受容体特異アンタゴニストとして作用し得る。
【0034】
可溶性IL−15Rα鎖の構築には、受容体陽性細胞、たとえば活性化T細胞または受容体発現細胞系など由来のIL−15Rα鎖の細胞外フラグメントをクローニングすること、任意選択でそれを分子タグ配列に融合することが含まれる。タグ配列は、たとえば、FLAG、GST、またはヒスチジンであり得る。この発現ベクター中の遺伝子構築物は、発現細胞系にトランスフェクトされ得る。発現細胞系によって産生されたタグ付き可溶性IL−15Rα鎖は、そのタグ配列に特異的なmAbを用いて精製される。さらに、IL−15R細胞外ドメインは、好ましくはIgGまたはIgMサブタイプの、免疫グロブリンFcドメイン(たとえば、免疫グロブリンGのヒンジ、CH2、およびCH3ドメイン)に結合(たとえば、ペプチド結合によって融合)可能である。そのような融合タンパク質は適切な細胞型において発現可能であり、その多くが当該技術分野の技術者に知られている。
【0035】
IL−2またはIL−2受容体を標的とする薬剤
免疫応答を阻害するために、上述のIL−15Rを有する細胞を標的とする薬剤を、IL−2またはIL−2Rを標的とする薬剤と共に投与することが可能である。他のものと「共に」投与される薬剤は、限定されないが、同時に、または同じ方法で投与できる(この注釈はIL−2関連薬剤の議論において述べるが、本発明の組成物において組み合わせるいずれの薬剤または分子にも適用できる)。たとえば、IL−15Rを標的とする薬剤は、IL−2Rを標的とする薬剤の前、または後に投与できる。同様に、IL−15またはIL−15Rを標的とする薬剤はエキソビボで投与することができ(たとえば、移植が予定されている細胞、組織、または器官を処理するため)、IL−2またはIL−2Rを標的とする標的とする薬剤は、患者(たとえば、エキソビボでIL−15を標的とする薬剤によって処理された移植片を受けた患者)に、全身的に(たとえば、静脈内に)投与可能である。同様に、細胞増殖を阻害する薬剤とは異なる時間、または異なる方法で、AICDを促進する薬剤を投与することが可能である。したがって、本発明の方法において、本発明の組成物で組み合わせられるいずれの型の薬剤または分子も個別に投与可能である。
【0036】
IL−2Rを阻害するために、IL−2またはIL−2Rに結合し、拮抗する任意の薬剤を投与可能である。IL−2またはIL−2Rを標的とする薬剤には、IL−2またはIL−2Rに結合する薬剤、ならびに活性化T細胞などのIL−2Rを有する細胞に結合し、その後それを破壊する薬剤が含まれる。IL−15標的化に関連して上述したとおり、免疫抑制の達成に有用な薬剤は、薬剤の標的をIL−2Rを有する細胞とする部分と、IL−2Rを有する細胞の除去をもたらす標的細胞枯渇(たとえば、溶解)部分とを有することが可能である。たとえば、この標的化部分は、受容体を介して有効にシグナルを伝達することなくIL−2Rに結合可能である。Fc領域が含まれる場合、その領域は、上述したものと同じ免疫グロブリン分子から誘導可能である。
【0037】
標的化薬剤、たとえばIL−2/Fc薬剤など(たとえば、チェンら(Zheng et al.)J.Immunol.163、4041〜4048ページ、1999年を参照のこと)は、IL−2媒介IL−2Rシグナル伝達を妨げる薬剤、たとえばラパマイシンなどと共に投与可能である。細胞増殖を阻害する薬剤は、当該技術分野の技術者によく知られている(さらに以下に考察する)。IL−2R標的ポリペプチド(たとえば、IL−2ポリペプチド)を用いる代わりに、またはそれを用いる以外に、IL−15アンタゴニストと併用される治療剤は、各々IL−2またはIL−2Rに拮抗する抗IL−2または抗IL−2R抗体(たとえば、ヒト化抗体)であることが可能である。
【0038】
上に説明のとおり、本発明の方法(たとえば、免疫応答(たとえば、細胞免疫応答)を阻害する方法、移植片拒絶を阻害する方法、および癌を治療する方法)は、(a)それぞれがT細胞死を促進する2種以上の薬剤、または(b)T細胞死を促進する少なくとも1種の薬剤とT細胞増殖を阻害する少なくとも1種の薬剤、を含有する組成物(たとえば、医薬として許容される組成物)を用いて行うことも可能である。T細胞死を促進する薬剤は、AICD(活性化誘導細胞死)を促進することによってT細胞死を促進することが可能であり、そのような薬剤には、IL−2、およびIL−2アゴニストとして機能する分子が含まれる。たとえば、IL−2/Fc、IL−2受容体に結合し、それを介してシグナルを伝達する能力を維持しているIL−2の変異体、およびIL−2受容体に特異的に結合し、それに拮抗する抗体(たとえば、IL−2受容体のαサブユニットを特異的に結合する抗体)を、本発明の組成物に含み得る。AICDを促進する他の薬剤には、活性化T細胞においてFasシグナル伝達カスケードを活性化することによってT細胞死を刺激するFasリガンド(FasL)、および生物学的に活性なその変異体が含まれる。
【0039】
受動的細胞死を促進する薬剤
T細胞からその生存に必要とされる薬剤が枯渇したとき、受動的T細胞死が起こる。IL−15に加えて、IL−4、IL−7、OX−40リガンド、IFNβ、4−1BB、およびIGF−Iを含む因子が不可欠である(すなわち、これらの各因子が存在しないときT細胞は死ぬ。たとえば、ツら(Tu et al.)J.Immunol.165、1331〜1336ページ、2000年、ツダら(Tsuda et al.)、J.Immunol.Meth.236、37〜51ページ、2000年、ベルトリーノら(Bertolino et al.)、Int.Immunol.11、1225〜1238ページ、1999年、タカハシら(Takahashi et al.)、J.Immunol.162、5037〜5040ページ、1999年、ピリングら(Pilling et al.)、Eur.J.Immunol.29、1041〜1050ページ、1999年、チュら(Chu et al.)、J.Immunol.162、1896〜1903ページ、1999年、およびワインバーグら(Weinberg et al.)、Semin.Immunol.10、471〜480ページ、1998年を参照のこと)。たとえば、1種または複数のそれらの因子に選択的に結合する、あるいは別の方法でそれらの因子のT細胞との通常生じる相互作用を妨げる薬剤にインビボまたは培養中で細胞を曝露することによって、T細胞から1種または複数のそれらの因子(IL−15、IL−4、IL−7など)を枯渇することが可能である(その枯渇の結果は受動的細胞死である)。
【0040】
ADCCまたはCDCを促進する薬剤
ADCCおよびCDCは、T細胞表面に結合し、かつADCCまたはCDCを活性化する免疫グロブリン分子のFc部分を含有する薬剤によって誘発され得る。そのような薬剤の例には、活性化免疫細胞に発現する細胞表面構造(たとえば、CD154などの細胞表面受容体、IL−2受容体、およびIL−15受容体)に結合する抗体が含まれる。さらに、活性化細胞の表面において受容体タンパク質に結合するリガンド/Fcキメラ融合タンパク質を用いることが可能である(たとえば、IL−2/Fc、またはmIL−15/Fc)。これらの例から、他の適切な薬剤は当該技術分野の技術者に明らかであろう。
【0041】
細胞増殖を阻害する薬剤
細胞増殖を阻害する薬剤には、ラパマイシン(Sirolimus)、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、アザチオプリン、および過増殖障害(癌など)の治療に有用であることが知られている他の任意の薬剤が含まれる。充分に特徴づけられている化学療法薬には、核酸代謝を阻害する薬剤が含まれる(プリンおよびピリミジン生合成阻害剤、RNA合成阻害剤、およびDNA結合、DNA修飾、または挿入剤など)。たとえば免疫応答を阻害するために用いられる組成物がさらに、AICDを促進するだけでなく、T細胞増殖を刺激するIL−2/Fcなどの薬剤を含有するとき、それらの薬剤は特に有用である。
【0042】
細胞増殖を阻害する薬剤にはさらに、メトトレキサート(MTX)およびピリメタミンなどの葉酸代謝拮抗剤;プリン代謝拮抗剤(6−メルカプトプリン(6−MP)、およびアザチオプリンなど)、ならびにシタラビン(ara−C)、5−アザシチジン、および5−フルオロウラシルなどのピリミジン・アンタゴニスト(これらの類は上述した);アルキル化剤および他のDNA結合剤(たとえば、シクロホスファミド(CPA)、ミトマイシンC、およびドキソルビシン(アドリアマイシン));ビンカアルカロイド(たとえば、ビンクリスチン);ならびにカルシニューリン阻害剤(たとえば、シクロスポリンA、FK506、およびブレキナール(Brequinar))が含まれる。
【0043】
細胞増殖を阻害するために用いることが可能な他の薬剤には、細胞周期制御にかかわるタンパク質を直接妨げる薬剤(抗CDK(細胞分裂キナーゼ)、または抗サイクリンなど)、あるいは細胞増殖細胞増殖チェックポイントに影響を及ぼすタンパク質(すべての増殖細胞は、前の工程が終わる前に細胞分裂周期(CDC)の次の段階にはいるのを防ぐチェックポイントを細胞周期の異なる段階に有する)を直接妨げる薬剤が含まれる。チェックポイント制御に通じる経路は、DNA、RNA、およびタンパク質合成阻害剤(たとえば、S6キナーゼ、およびPI−3キナーゼ阻害剤)を含む。細胞質分裂阻害剤も用いることが可能である。
【0044】
免疫応答を阻害する薬剤のスクリーニング法
下の実施例に記載するインビトロアッセイにおける薬剤候補(たとえば、変異IL−15またはIL−2ポリペプチド)の試験に加えて、本明細書に記載の薬剤のどの特定の組み合わせが最も有効に免疫抑制をもたらすかを試験するために、以下の任意のインビボアッセイを用いることが可能である。たとえば、IL−2またはその受容体に拮抗する1種または複数の薬剤と組み合わせた、IL−15Rを標的とする1種または複数の薬剤を、試験することが可能である。これらのインビボアッセイは、当該技術分野の技術者が本発明の薬剤の有効性をさらに試験することのできるいくつかの慣例的な方法を示すにすぎない。これらはIL−2、IL−15、およびそれらの受容体を標的とする薬剤による治療を受けることのできる多様な病態に適切であるために、本明細書に含めるべく選択された。たとえば、これらのアッセイは、臓器移植、免疫疾患、特に自己免疫疾患、対宿主移植片病、および免疫系の癌(たとえば、T細胞が悪性となるときに生じる癌)に適切である。
【0045】
移植の模範例
本発明の薬剤の組み合わせが免疫抑制を達成できるかどうかを判定するために、確立された移植の模範例においてその組み合わせを投与することが可能である(直接投与、遺伝子療法、または細胞療法のいずれかによる)。
【0046】
本発明の薬剤、それらをコードする核酸分子(またはそれらとハイブリッド形成し、それによって阻害する)は、同種異系または異種皮膚移植、臓器移植、または細胞移植を動物に行う前に、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、またはイヌなどの任意の通常の実験動物に、標準的な手段によって、全身投与または局所投与可能である。同じ遺伝的背景を有するが、H−2遺伝子座がミスマッチであるC57B1−10、B10.BR、およびB10.AKMなどのマウス系統(ジャクソン・ラボラトリー(Jackson Laboratory)、メイン州バーハーバー)は、種々の臓器移植の評価に適している。
【0047】
心臓移植
宿主腹部の大血管にドナー心臓を吻合することによって心臓移植を行う方法は、オノら(Ono et al.)によって最初に発表された(J.Thorac.Cardiovasc.Surg.57、225ページ、1969年、さらにコリーら(Corry et al.)、Transplantation16、343ページ、1973年を参照のこと)。この外科手術手法によって、ドナー心臓の大動脈を宿主の腹部大動脈に吻合し、さらに標準的な微小血管技術を用いて、ドナー心臓の肺動脈を隣接する大動脈に吻合する。心臓が適所に移植され、乳酸リンゲル液によって37℃に加温されると、正常な洞調律が再開する。移植された心臓の機能は、腹壁を通して心室収縮を触診することによって多くの場合評価可能である。拒絶は心筋収縮の停止として定義される。本発明の薬剤(たとえば、変異IL−15/Fcと、IL−2またはIL−2Rに結合しそれを阻害する抗体との組み合わせ、あるいは変異IL−15/Fc、IL−2/Fc、およびラパマイシンの組み合わせ)は、これらの薬剤を投与された宿主が処理を受けていない宿主より長い期間ドナー心臓の移植を受容した場合、臓器拒絶の低減に有効であるとみなされる。
【0048】
皮膚移植
本発明の薬剤の種々の組み合わせの有効性は、皮膚移植後に評価することも可能である。齧歯動物に皮膚移植を行うために、ドナー動物を麻酔して、尾の一部から皮膚全層を除去する。レシピエント動物も麻酔し、剃毛側腹部から皮膚片を除去することによって移植床を準備する。一般に、皮膚片は約0.5×0.5cmである。ドナーの皮膚を移植床に適合するように形成し、配置し、ガーゼで覆い、包帯をする。移植片は手術後6日から毎日検査することが可能であり、半数を超える移植上皮が生育不能に見えるとき、拒絶とみなされる。本発明の薬剤(たとえば、変異IL−15/Fcと、IL−2またはIL−2Rに結合しそれを阻害する抗体との組み合わせ、あるいは変異IL−15/Fc、IL−2/Fc、およびラパマイシンの組み合わせ)は、これらの薬剤を投与された宿主が処理を受けていない宿主より長い期間ドナー皮膚の移植を受容した場合、皮膚移植拒絶の低減に有効であるとみなされる。
【0049】
その結果がIL−2/Fc、mIL−15/Fc、およびラパマイシンを含有する組成物の有用性を実証する、皮膚移植実験の典型的な例を、実施例(下記)で説明し、図12に要約する。
【0050】
膵島同種異系移植片モデル
DBA/2J膵島細胞同種異系移植片は、ストレプトゾトシン(225mg/kg、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)、ミズーリ州セントルイス)の単回腹腔内注射によって糖尿病にした6〜8週齢のB6AF1マウスなどの齧歯動物に移植可能である。コントロールとして、同種同族膵島細胞移植片を、糖尿病マウスに移植可能である。膵島細胞の移植は、発表されたプロトコルに従って行うことが可能である(たとえば、ゴトウら(Gotoh et al.)、Transplantation42、387ページ、1986年を参照のこと)。簡潔に述べれば、ドナー膵臓をコラゲナーゼIV型(2mg/ml、ワーシントン・バイオケミカル社(Worthington Biochemical Corp.)、ニュージャージー州フリーホールド)と共にin situで潅流する。37℃、40分の消化後、不連続Ficoll勾配で膵島を単離する。その後、膵島300〜400個を各レシピエントの腎皮膜下に移植する。同種異系移植片の機能は、連続血糖測定(Accu−CheckIII(商標)、ベーリンガー・マンハイム社(Boehringer Mannheim)ドイツ)によって追跡可能である。初期移植片機能は、移植後第3日の血糖値11.1mmol/l未満と定義し、移植拒絶は、初期移植片機能の期間後16.5mmol/lを超える血糖値の上昇(それぞれ少なくとも連続2日)と定義する。
【0051】
自己免疫疾患モデル
自己免疫疾患モデルは、インビボで本発明の薬剤の組み合わせを評価する他の手段を提供する。これらのモデルは当該技術分野の技術者に知られており、たとえばIL−15Rを標的とする薬剤を含む所与の薬剤組み合わせが、直接、遺伝子療法、または細胞療法によって供給されたとき特定の自己免疫疾患の治療において治療上有用であるかどうか判定するために用いることが可能である。
【0052】
動物においてモデル化されている自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、および全身性エリテマドーデス(SLE)などのリウマチ疾患、I型糖尿病、ならびに甲状腺、消化管、および中枢神経系の自己免疫疾患が含まれる。たとえば、SLEの動物モデルには、MRLマウス、BXSBマウス、およびNZBマウス、ならびにそれらのF1ハイブリッドが含まれる。これらの動物は、リウマチ疾患過程の特定の側面を研究するために交配することが可能であり、NZWマウスと交配させたとき、NZB系統の子孫は重いループス糸球体腎炎を罹患する(ビールショースキーら(Bielschowsky et al.)Proc.Univ.Otago Med.Sch.37、9ページ、1959年、さらにポール(Paul)編、「Fundamental Immunology」、レーブンプレス(Raven Press)、ニューヨーク州ニューヨーク、1989年を参照のこと)。同様に、NBZ×SWR交配の子孫において、致死性腎炎へのシフトが認められる(データら(Data et al.)、Nature263、412ページ、1976年)。SNF1マウスにおける腎病変の組織所見は、充分に特徴づけられている(イーストコットら(Eastcott et al.)、J.Immunol.131、2232ページ、1983年、さらに上述の「Fundamental Immunology」を参照のこと)。したがって、IL−15Rを標的とし、かつ、たとえばIL−2Rを標的とする薬剤の投与が、SLEの動物モデルにおいて有効に免疫応答を抑制し得るのかどうかを判定するために、その動物の全身の健康状態、ならびに腎組織の組織所見を用いることが可能である。
【0053】
SLEを発症するMRL系統マウスの1種、MRL−lpr/lprは、ヒトの慢性関節リウマチに類似の形態の関節炎を発症する(テオフィロポーラスら(Theofilopoulos et al.)、Adv.Immunol.37、269ページ、1985年)。あるいは、フロイント完全アジュバント(全量100μl)に1:1で混合したラットコラーゲンII型(2mg/ml)を尾の基部に注射することによって、齧歯動物に実験的関節炎を誘発可能である。関節炎は、免疫処理の2〜3週後に発症する。本発明の薬剤(IL−15Rを標的とする薬剤、およびIL−2Rを標的とする、または抗原活性化T細胞に結合し、不活性化する薬剤)をコードする核酸分子が免疫応答を抑制する能力は、核酸分子の標的をTリンパ球とすることによって評価可能である。Tリンパ球を標的とする方法の1つは以下のとおりである。関節炎発現の2〜3日後に脾細胞懸濁液を調製し、コラーゲン(100μg/ml)と共に48時間インキュベートして、コラーゲン活性化T細胞の増殖を誘発する。この間に、対象となるポリペプチド薬剤をコードするベクターで形質導入する。コントロールとして、形質導入しない、または「空の」ベクターで形質導入した平行培養物を増殖させる。次いで、細胞を腹腔内に注射する(細胞5×107個/動物)。この処理の有効性は、チェルナヨフスキーら(Chernajovsky et al.)によって記載されているとおり(Gene Therapy2、731〜735ページ、1995年)、その後の2週間、疾患の症状を追跡することによって評価する。コントロールと比較して症状が低度であれば、本発明の薬剤の組み合わせ、およびそれをコードする核酸分子が免疫抑制剤として機能し、したがって免疫疾患、特に自己免疫疾患の治療に有用であることを示している。
【0054】
薬剤の様々な組み合わせがI型糖尿病において免疫応答を抑制する能力は、オタワのバイオ・ブリーディング・ラボラトリーズ(Bio−Breeding Laboratories)においてWistarラットの市販コロニーから発生させたBBラット系統で試験可能である。これらのラットは、ヒトI型糖尿病で起こるように、膵島細胞およびインスリンに対する自己抗体を自発的に発現する。あるいは、モデル系としてNOD(非肥満性糖尿病)マウスを用いることが可能である。同種異系のドナー膵島の移植後、NODマウスにおいて血糖値が回復する実験の典型的な例を以下に説明し、図11に要約する。これらの動物は、IL−2/Fc、IL−15/Fc、およびラパマイシンの組み合わせで処理した。結果は移植の長期定着であった。
【0055】
甲状腺の自己免疫疾患は、ニワトリにおいてモデル化されている。肥満系統(OS)ニワトリは、橋本病に類似の突発性自己免疫性甲状腺炎を一貫して発症する(コールら(Cole et al.)、Science160、1357ページ、1968年)。これらのトリの約15%が、対応するヒトの自己免疫性甲状腺炎と同様に、胃の壁細胞に対する自己抗体を産生する。OSニワトリにおけるこの疾患の発現は、任意の治療法の過程においてモニターすることができ、これには体の大きさ、脂肪蓄積、血清脂質、低温感受性、および不妊が含まれる。
【0056】
中枢神経系(CNS)における自己免疫疾患のモデルも、実験的に誘発可能である。麻痺に至るCNSの炎症は、齧歯類および霊長類を含む多くの異なる実験動物においてアジュバントと共に脳または脊髄組織を単回注射することによって誘発可能である。実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)と呼ばれるこのモデルは、T細胞に媒介される。同様に、実験的に誘発される重症筋無力症は、アジュバントと共にアセチルコリン受容体を単回注射することによって生じ得る(レノンら(Lennon et al.)、Ann.N.Y.Acad.Sci.274、283ページ、1976年)。
【0057】
消化管の自己免疫疾患は、IL−2またはIL−10「ノックアウト」マウス、またはウシ血清アルブミンを含有する浣腸を受けたマウスにおいてモデル化可能である。
【0058】
本発明の薬剤をコードする核酸分子
融合タンパク質であるもの(たとえば、変異IL−15/FcおよびIL−2/Fc分子)を含む本発明のポリペプチド薬剤は、インビトロで適切な真核または原核発現系において核酸分子を発現し、次いでそのポリペプチド薬剤を精製することによって得られるだけでなく、核酸分子をコードする適切な遺伝子療法発現ベクターとして患者に投与することが可能である。さらに、核酸は、移植片の移植に先立って、その移植片の細胞に導入することが可能である。したがって、上述の薬剤をコードする核酸分子は、本発明の範囲内である。本発明のポリペプチドを、野生型ポリペプチドとの同一性の点から説明し得るのと同様に、それらをコードする核酸分子も必然的に、対応する野生型ポリペプチドをコードする核酸と一定の同一性を有することになる。たとえば、変異IL−15ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型IL−15をコードする核酸と、少なくとも65%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは85%、もっとも好ましくは少なくとも95%(たとえば、96%、97%、98%、または99%)同一であり得る。核酸の場合、比較される配列の長さは一般に、少なくともヌクレオチド50個、好ましくは少なくともヌクレオチド60個、より好ましくは少なくともヌクレオチド75個、もっとも好ましくはヌクレオチド110個である。
【0059】
本発明の薬剤をコードする核酸分子は、天然配列、または天然に生じるものとは異なる配列であるが、遺伝コードの縮重の結果、同一のポリペプチドをコードする配列を含むことが可能である。これらの核酸分子は、RNAまたはDNA(たとえば、ゲノムDNA、cDNA、または合成DNA、たとえばホスホアミダイトをベースとする合成によって生成したものなど)、あるいはこれらの型の核酸内のヌクレオチドの組み合わせまたは修飾からなる。さらに、この核酸分子は、2本鎖または1本鎖であり得る(すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖)。
【0060】
本発明の核酸分子は、生体の天然ゲノムにおいて隣接する5’または3’コード配列から離れているため、「単離」と呼ばれる。したがって、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列の上流または下流に位置する非コード配列の一部または全体も含むことが可能である。分子生物学の分野の技術者は、核酸分子を単離する慣例的な手順を熟知している。たとえば、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって核酸分子を産生可能である。核酸分子がリボ核酸(RNA)の場合、インビトロ転写によって分子を産生することが可能である。
【0061】
本発明の単離核酸分子は、天然の状態ではそのような形で見出されない断片を含み得る。したがって、本発明は、核酸配列(たとえば、変異IL−15をコードする配列)がベクター(たとえば、プラスミドまたはウイルス・ベクター)、あるいは異種細胞のゲノム(または天然の染色体位置以外の位置にある同種細胞のゲノム)に組み込まれているような組換え分子を包含する。
【0062】
上述のとおり、本発明の薬剤は融合タンパク質であってもよい。上述の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の薬剤をコードする核酸分子は、「マーカー」または「リポーター」をコードする配列を含有可能である。マーカーまたはリポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neor、G418r)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ヒグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、lacZ(β−ガラクトシダーゼ・コード)、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が含まれる。本発明の実施に関連した多くの標準的な手順と同様に、当該技術分野の技術者は、他の有用な試薬、たとえばマーカーまたはリポーターの機能を果たし得る他の配列を認識するであろう。
【0063】
本発明の核酸分子は、哺乳動物の細胞など任意の生物細胞から得られた、または慣例的なクローニング法によって産生された本発明の薬剤(たとえば、IL−15分子またはIL−2分子)に変異体を導入することによって得ることが可能である。したがって、本発明の核酸は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコの核酸であり得る。好ましくは、核酸分子はヒトのものである。
【0064】
上述の核酸分子は、たとえばそのベクターで形質導入された細胞にそれらの発現を誘導することのできるベクターに含有され得る。したがって、ポリペプチド薬剤に加えて、それらの薬剤をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、およびそれらのベクターでトランスフェクトされた細胞は、好ましい実施形態に含まれる。
【0065】
本発明での使用に適したベクターには、細菌用のT7ベースのベクター(たとえば、ローゼンバーグら(Rosenberg et al.)、Gene56、125ページ、1987年)、哺乳動物細胞用のpMSXND発現ベクター(リー(Lee)およびネイサンズ(Nathans)、J.Biol.Chem.263、3521ページ、1988年)、酵母発現系、たとえばPichia pastorisなど(たとえば、インビトロゲン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバッド製の発現ベクターのPICZファミリー)、および昆虫細胞用のバキュロウイルス由来ベクター(たとえば、クロンテック社(Clontech)、カリフォルニア州パロアルト製の発現ベクターpBacPAK9)が含まれる。そのようなベクターの対象となるポリペプチドをコードする核酸挿入部は、たとえば発現を求める細胞型に基づいて選択されるプロモーターに機能的に結合させることが可能である。たとえば、T7プロモーターは細菌において用いることが可能であり、ポリヘドリン・プロモーターは昆虫細胞において用いることが可能であり、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネイン・プロモーターは哺乳動物細胞において用いることが可能である。さらに、高等真核生物の場合、組織特異および細胞特異プロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内の所与の組織または細胞型において核酸分子の発現を誘導することができるので、そのように呼ばれる。当該技術分野の技術者は、核酸の発現を誘導するために用いることのできる多数のプロモーターおよび他の調節因子を熟知している。
【0066】
挿入された核酸分子の転写を促進する配列に加えて、ベクターは、複製起点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含むことが可能である。たとえば、ネオマイシン耐性(neor)遺伝子はそれが発現する細胞にG418耐性を付与し、それによってトランスフェクトされた細胞の表現型選択が可能となる。細胞の表現型選択を可能にする他の適切な選択マーカー遺伝子には、種々の蛍光タンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質(GFP)、およびその変異体が含まれる。当該技術分野の技術者は、所与の調節因子または選択マーカーが特定の実験での使用に適しているかどうか容易に判定可能である。
【0067】
本発明に用いることが可能なウイルス・ベクターには、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、およびウシパピローマウイルス・ベクターが含まれる(たとえば、グルツマン(Gluzman)編、「Eukaryotic Viral Vectors」、CSHラボラトリー・プレス(CSH Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと)。
【0068】
本発明の薬剤をコードする核酸分子を含有し、インビトロでその核酸分子がコードされたタンパク質を発現する原核細胞または真核細胞も本発明の特徴である。本発明の細胞はトランスフェクトされた細胞であり、すなわち核酸分子、たとえば変異IL−15ポリペプチドをコードする核酸分子が組換えDNA技術によって導入された細胞である。そのような細胞の後代も、本発明の範囲内であるとみなされる。発現系の厳密な成分は重要でない。たとえば、変異IL−15ポリペプチドは、大腸菌などの原核宿主において、あるいは昆虫細胞(たとえば、Sf21細胞)、または哺乳動物細胞(たとえば、COS細胞、CHO細胞、293細胞、NIH3T3細胞、またはHeLa細胞)などの真核宿主において産生可能である。これらの細胞は、米国菌株保存機関(American Type Culture Collection)(バージニア州マナサス)を含む多くの供給源から入手可能である。発現系の選択においては、成分が互いに適合性であることのみが重要である。当該技術分野の技術者はそのような判別をすることができる。さらに、発現系の選択において手引きが必要である場合、オースベルら(Ausubel et al.)(Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、ニューヨーク州ニューヨーク、1993年)、およびパウエルズら(Pouwels et al.)(Cloning Vectors:A Laboratory Manual、1985年、補遺1987年)を参照可能である。本発明の薬剤をコードする核酸分子を含有し、インビボでそのような核酸分子がコードされたタンパク質を発現する真核細胞も本発明の特徴である。
【0069】
さらに、本発明の真核細胞は、細胞移植片、組織または臓器移植片の一部である細胞であり得る。そのような移植片は、ドナー生体から採取された初代細胞、あるいはレシピエント生体に移植される前にインビトロで培養、修飾、および/または選択された細胞(たとえば、幹細胞または前駆細胞を含む真核細胞系)からなり得る。レシピエント生体に移植後、細胞増殖が起こる可能性があるので、そのような細胞の子孫も本発明の範囲内である。細胞、組織、または臓器移植片の一部である細胞は、変異IL−15ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトし、その後、レシピエント生体に移植することが可能であり、そこで変異IL−15ポリペプチドの発現が起こる。さらに、そのような細胞は、レシピエント生体への移植に先立って、選択手順、たとえば特定の細胞系統または細胞型の適用を可能にする1種または複数のさらなる核酸構築物を含有可能である。
【0070】
発現したポリペプチドは、慣例的な生化学手順を用いて発現系から精製することが可能であり、以下に記載するように診断ツールとして、または治療薬剤として用いることが可能である。
【0071】
IL−15を標的とする薬剤は診断に有用である
IL−15を標的とする薬剤は、本明細書に記載の薬剤の組み合わせで治療を行うことのできる疾患(たとえば、免疫疾患、特に自己免疫疾患)をある患者が有しているかどうかを判定するために用いることが可能である。この診断法は、たとえば免疫疾患、特に自己免疫疾患、または悪性免疫細胞として顕在する癌を有する疑いのある患者の組織試料を得て、その組織をIL−15Rを標的とする抗原タグ・ポリペプチドに曝露することによって実行可能である。この試料は、血液、尿、血清、または血漿試料などの任意の生体試料であってよい。さらにこの試料は、組織試料(たとえば、生検組織)、関節から得られた滲出液(たとえば、滑液)、腹腔から得られた滲出液(たとえば、腹水)、胸部から得られた滲出液(たとえば、胸膜液)、または中枢神経系から得られた滲出液(たとえば、脳脊髄液)であってよい。試料は、元は患者から得られた培養細胞(たとえば、末梢血単核細胞)からなることもできる。この試料は、ヒト患者などの哺乳動物から得ることが可能である。試料が、曝露した薬剤により結合されている細胞を含有する場合、インビボでその薬剤(たとえば、IL−15Rを標的とする薬剤)によって結合され、それによりインビボで増殖を阻害されるかまたは破壊される可能性が高い。そのような試験の候補となる患者に表れる症状、および特定の一連の症状を与えられた試料となる関連組織は、当該技術分野の技術者によく知られている。
【0072】
治療を施すことのできる患者
本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答(たとえば、細胞性免疫応答)に関連する、または関連するであろうT細胞の阻害、あるいは免疫障害の病因に関連する他の細胞(たとえば、単球、マクロファージ、および他の抗原提示細胞、たとえば樹状細胞、NK細胞、および顆粒球など)の阻害、ならびに過増殖性細胞(たとえば、滑膜線維芽細胞(慢性関節リウマチで影響を受ける)、ケラチノサイト(乾癬で影響を受ける)、または皮膚線維芽細胞(全身性エリテマトーデスで影響を受ける)などの免疫障害に関連する組織に認められる)の破壊に有用である。これらの例に照らして、有効に標的とされ得る他の細胞型は当該技術分野の技術者に明らかとなるであろう。過増殖性細胞は、癌性細胞(たとえば、悪性T細胞)であってもよい。
【0073】
したがって、本発明の組成物は、免疫疾患、特に自己免疫疾患を罹患している患者を治療するために用いることが可能であり、その疾患には、以下に限定されるわけではないが、(1)慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、またはベーチェット病などのリウマチ疾患、(2)I型またはII型糖尿病、(3)橋本甲状腺炎、またはグレーヴズ病などの甲状腺の自己免疫疾患、(4)多発性硬化症、重症筋無力症、または脳脊髄炎などの中枢神経系の自己免疫疾患、(5)尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー・アッシャー症候群、またはブラジル天疱瘡などの種々の天疱瘡、(6)乾癬、または神経皮膚炎などの皮膚の疾患、および(7)炎症性腸疾患(たとえば、潰瘍性大腸炎、またはクローン病)が含まれる。本発明の薬剤の組み合わせは、後天性免疫不全症候群(AIDS)の治療に用いることも可能である。同様に、これらの薬剤を投与する方法は、合成材料または生物材料、あるいは両方の組み合わせの移植片を受けた患者の治療に用いることが可能である。そのような移植片は、臓器、組織、または細胞移植片、あるいは細胞を接種した合成移植片、たとえば血管細胞を接種した合成血管移植片であり得る。さらに、GVHDを罹患している患者または血管損傷を受けた患者は、この方法から利益を得るであろう。
【0074】
本発明は、IL−15R(またはIL−2受容体、あるいはIL−15またはIL−15RとIL−2またはIL−2Rとの組み合わせ)を標的とする薬剤の標的細胞枯渇性形態を包含するので、正常なT細胞を大量に破壊することなく、自己反応性または「移植片破壊性」免疫細胞を選択的に殺すことが可能である。したがって、本発明は、活性化、あるいは自己反応性または「移植片破壊性」免疫細胞、あるいは悪性細胞を含む、インビボでIL−15Rを発現する細胞を殺す方法を特徴とする。これらの方法は、IL−15Rを標的とし、かつ補体系を活性化し、ADCC機序によって細胞を溶解、または野生型IL−15受容体複合体を発現する細胞を殺す薬剤を含む薬剤の組み合わせを患者に投与することによって実施可能である。この方法は、IL−15+白血病、リンパ腫、または結腸癌などの他のIL−15+悪性疾患を有する患者の治療に用いることが可能である。
【0075】
使用製剤および投与経路
本発明の方法、およびそれを実施するために用いられる治療組成物は、「実質的に純粋な」薬剤を含有する。たとえば、薬剤がポリペプチドの場合、そのポリペプチドは、対象となるポリペプチド、たとえばIL−15Rを有する細胞に結合しそれを破壊するポリペプチドが、少なくとも60重量%(乾燥重量)である。好ましくは、薬剤(たとえば、ポリペプチド)は、対象となる薬剤が少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、もっとも好ましくは少なくとも99重量%である。純度は、任意の適切な標準法、たとえば、カラム・クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などによって測定可能である。
【0076】
本発明の方法において有用な薬剤は天然源から得ることが可能であるが、合成または他の方法で製造することも可能である(たとえば、IL−15Rを有する細胞に結合し、破壊する薬剤は、組換え核酸分子の発現によって産生可能である)。真核生物由来、あるいは大腸菌または他の原核生物において合成されたポリペプチド、および化学的に合成されたポリペプチドは、それらの天然関連成分を実質的に含まない。ポリペプチドがキメラである場合、その薬剤の全部または一部をコードする配列(たとえば、変異IL−15ポリペプチドをコードする配列、およびIgGのFc領域をコードする配列)を含有するハイブリッド核酸分子によってコードされ得る。本発明の薬剤(たとえば、ポリペプチド)は、細菌発現タンパク質の精製を促進するためにヘキサヒスチジン・タグに融合することが可能であり、または真核細胞に発現したタンパク質の精製を促進するためにヘマグルチニン・タグに融合することが可能である。
【0077】
本発明の薬剤を製造するために必要な技術は当該技術分野で慣例であり、当該技術分野の技術者によって、過度な実験に頼ることなく実行可能である。たとえば、IL−15の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換からなる変異体は、149位および156位のグルタミン残基をアスパラギン酸残基に代えた変異IL−15ポリペプチドを作製するために本明細書に記載したPCR利用変異誘発技術を用いて作製することが可能である。アミノ酸残基の欠失または付加(IL−15ポリペプチド、または本明細書に記載した他の有用な任意のポリペプチド、たとえば共刺激を阻害する、または活性化T細胞に結合するポリペプチドに対して)からなる変異体も、標準的な組換え技術で製造可能である。治療的適用において、本発明の薬剤は、生理食塩水などの生理的に許容される担体と共に投与し得る。本発明の治療組成物はさらに、担体または賦形剤を含有することが可能であり、その多くが当該技術分野の技術者に知られている。使用可能な賦形剤には、緩衝液(たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液)、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質(たとえば、血清アルブミン)、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが含まれる。本発明の薬剤は、対応する投与経路に従って、様々な形態で調剤可能である。たとえば、摂取または注射用に溶液を製造可能であり、摂取、吸入、または局所適用のためにゲルまたは粉剤を製造可能である。そのような製剤を製造する方法はよく知られており、たとえば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0078】
投与経路も薬理学者および医師によく知られており、腹腔内、筋肉内、皮下、および静脈内投与を含む。さらなる経路には、頭蓋内(たとえば槽内または脳室内)、眼窩内、眼、嚢内、脊椎内、腹腔内、経粘膜、局所、皮下、および経口投与が含まれる。静脈内経路または動脈内経路は、IL−15受容体を標的とする薬剤の投与に好ましいことが予期される。皮下組織はポリペプチドに安定な環境を提供し、ポリペプチドはそこからゆっくりと放出され得るので、皮下経路も頻繁に用いることができる。
【0079】
細胞療法(遺伝子療法)の場合、細胞/組織/器官は、治療タンパク質が発現し、その後レシピエント生体内で移植細胞/組織/器官によって放出されるように、核酸組成物を用いて移植に先立ってインキュベーション、注入、または潅流によってトランスフェクトすることが可能である。同様に、細胞/組織/器官は、ドナー細胞/組織/器官に癒着性の移植片関連免疫細胞を除去するために、移植前に治療タンパク質を用いて潅流または単純なインキュベーションによって前処理を行うことが可能である(これは側面に過ぎず、おそらく臨床的意義はない)。細胞移植の場合、細胞は、植え込み法によって、または血管壁を経るカテーテルによる注射法を用いて投与できる。場合によって、細胞は脈管構造への放出によって投与することができ、その後、そこから血流によって分配され、かつ/または周囲組織に移動する(これは膵島細胞移植において行われ、そこで膵島細胞は門脈に放出され、その後、肝臓組織に移動する)。
【0080】
患者に対する用量が、その患者の全身健康状態、性別、体重、体表面積、および年齢、ならびに投与される特定の化合物、投与時間および経路、同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因によって決まることは、医療分野においてよく知られている。本発明のポリペプチドの用量は変わり得るあるが、静脈内に投与されるとき、体重1kg当たり1マイクログラムから10mgの範囲、または血液量1l当たり0.01mgから100mgの範囲の用量で投与可能である。必要であれば、用量は1日1回または複数回投与することが可能であり、治療は長期間継続可能である。所与の適用例に対する正確な投与量の決定は、当該技術分野の技術者の能力範囲内である。
【0081】
(実施例)
試薬
本明細書に記載の研究において、以下の試薬を用いた。組換え型ヒトIL−2は、ホフマン・ラ・ロシュ社(Hoffman−LaRoche)(ニュージャージー州ナトレー)から得た。ラパマイシンは、ワイエス・アイエルスト社(Wyeth−Ayerst)(ニュージャージー州プリンストン)から得た。シクロスポリン−A(CsA)は、サンド社(Sandoz)(ニュージャージー州イーストハノーバー)から得た。RPMI−1640、およびウシ胎児血清(FCS)は、バイオウイタッカー社(BioWittaker)(メリーランド州ウォーカーズビル)から得た。ペニシリン、ストレプトマイシン、G418、およびストレプトアビジン−RED670は、ギブコ−BRL社(Gibco−BRL)(メリーランド州ゲイサースバーグ)から得た。デキサメタゾン、PHA、リゾチーム、NonidetP−40、NaCl、HEPES、およびPMSFは、シグマ社(Sigma)(ミズーリ州セントルイス)から得た。Ficoll−Hypaqueは、ファルマシア・バイオテク社(Pharmacia Biotech)(スウェーデン、ウプサラ)から得た。組換え型ヒトIL−15、および抗ヒトIL−15Abは、ペプロテック社(Pepro Tech)(ニュージャージー州ロッキーヒル)から得た。抗FLAGAb、および抗FLAG親和性ビーズは、インターナショナル・バイオテクノロジー社(International Biotechnologies Inc.)(コネチカット州ニューへブン、コダック)から得た。pRcCMVは、インビトロゲン社(InVitrogen Corporation)(カリフォルニア州サンディエゴ)から得た。ゲニステインは、ICNバイオメディカルズ社(ICN Biomedicals)(カリフォルニア州アービン)から得た。スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)は、ピアス社(Pierce)(イリノイ州ロックフォード)から得た。制限エンドンクレアーゼは、ニューイングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)(マサチューセッツ州ビバリー)から得た。[3H]TdRは、ニューイングランド・ヌクレア社(New England Nuclear)(マサチューセッツ州ボストン)から得た。蛍光色素複合抗体CD25−PE3、CD14−PE、CD16−PE、CD122−PE、CD4−FITC、CD8−FITC、IgG1−PE、またはIgG1−FITCは、ベクトン/ディッキンソン社(Beckton/Dickinson)(カリフォルニア州サンノゼ)から得た。FLAGペプチドは、ハーバード・メディカル・スクール(Harvard Medical School)のペプチド合成施設(Peptide Synthesis Facility)で合成した。
【0082】
FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質の産生
ヒトIL−15受容体発現の細胞パターンを研究するために、IL−15融合タンパク質の発現に用いることが可能なプラスミドを構築した。このプラスミドは、アミノ酸18個のFLAG−HMK配列に共有結合したN末端を有するIL−15ポリペプチド(FLAG−HMK−IL−15)をコードする。FLAG配列は、ビオチン化高特異性抗FLAG抗体によって認識され(ブラナーら(Blanar et al.)、Science256、1014ページ、1992年、ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1992年)、HMK(心筋キナーゼ認識部位)配列は、放射性標識[32P]の分子への導入を可能にする(ブラナーら(Blanar et al.)、上記、ルクレールら(LeClair et al.)前掲)。
【0083】
プラスミドFLAG−HMK−IL−15を構築するために、成熟IL−15タンパク質をコードする322bp cDNAフラグメントを、合成オリゴヌクレオチド[センス5’−GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA−3’(配列番号5、EcoRI部位(下線)+塩基145〜162)、アンチセンス5’−CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAA−3’(配列番号5、BamHI部位(下線)+塩基472〜489)]を用いるPCRによって増幅した。テンプレートDNAは、PHA活性化ヒトPBMCから得た。このPCR産物を精製し、EcoRIおよびBamHIで消化し、(ブラナーら(Blanar et al.)、Science256、1014ページ、1992年、ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1992年)に記載のとおり、EcoRI−BamHIで消化したpAR(DRI)59/60プラスミドに入れてクローニングした。pAR(DRI)59/60プラスミドのバックボーンは、FLAGおよびHMK認識ペプチド配列をコードする配列をインフレームに含有する(ブラナーら(Blanar et al.)、Science256、1014ページ、1992年、ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1992年)。
【0084】
FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質の発現および精製
IL−15関連融合構築物FLAG−HMK−IL−15を、(ブラナーら(Blanar et al.)、Science256、1014ページ、1992年、ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1992年)に記載のとおり、大腸菌BL−21株に発現し、抗FLAG被覆ビーズを用いてアフィニティ精製した。この融合タンパク質を、0.1Mのグリシン(pH3.0)で充分に洗浄した後、アフィニティ・カラムから溶出した。FLAG−HMK−IL−15を含有する溶出液を、50mMトリス(pH7.4)および0.1MNaClを含有する緩衝液に対して4℃で18時間透析し、0.2μmのメンブランで濾過し、−20℃で保存した。
【0085】
FLAG−HMK−IL−15はIL−15Rαサブユニットに結合する
精製したFLAG−HMK−IL−15融合タンパク質が細胞表面IL−15受容体と相互作用するかどうか判定するために試験した。上述のとおり、[32P]−FLAG−HMK−IL−15を、マイトジェンPHAで活性化したPBMCの培養物に添加した。相互作用タンパク質を互いに永続的に結合させるために、化学架橋剤スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)を添加した。細胞を洗浄、溶解、遠心分離し、洗浄剤可溶性タンパク質をSDS−PAGEによって分離した。SDS−PAGE分離タンパク質のオートラジオグラフィは、FLAG−HMK−IL−15(15kDa)とヒトIL−15Rαサブユニット(60〜65kDa)とを合わせた分子量に相当する75〜80kDaの単一のバンドを示した。このバンドがIL−15Rαサブユニットと同一であることは、モル過剰量のhIL−15の存在下で行った架橋実験によって確認した。この条件下で、放射性標識15kDaのバンドは検出できなかった。このように、[32P]−FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質の確認によって、マイトジェン活性化PBMCの表面に発現した60〜65kDaIL−15Rαサブユニットへの部位特異結合が認められる。
【0086】
FLAG−HMK−IL−15はIL−2Rβの発現を必要とする生物活性増殖因子である
次の一連の実験において、FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質が生物活性増殖因子として機能し得るのかどうかを判定するために試験した。PHA活性化ヒトPBMCは、[3H]−TdR取り込みアッセイによって検出されるとおり、FLAG−HMK−IL−15またはヒト組換え型IL−2に応答して増殖する。IL−15配列を欠損するFLAGペプチドは細胞増殖を刺激しない。IL−2と同様に、FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質は、IL−2Rβサブユニットを発現するIL−2Rγ+BAF−BO3細胞トランスフェクタントの増殖を刺激する。しかしながら、FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質は、IL−2Rβ鎖配列を欠損するベクターでトランスフェクトした親BAF−BO3細胞の増殖を刺激しない。このように、FLAG−HMK−IL−15は、細胞増殖を刺激するために、標的細胞上にIL−2Rβ鎖の発現を必要とする生物活性増殖因子である。
【0087】
マイトジェン活性化PBMCはIL−15αサブユニットを発現するが、休止PBMCは発現しない
ヒトPBMC上のIL−15結合部位の発現を細胞蛍光分析によって検出するために、FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質、ビオチン化抗FLAG抗体、およびストレプトアビジン−RED670を用いた。試験を行ったPBMCは、新しく単離した細胞、またはPHA活性化細胞であった。これらの細胞を洗浄し、培地のみ、またはFLAG−HMK−IL−15共に、続いて抗FLAGビオチン化抗体、およびストレプトアビジン−RED670と共にインキュベートした。この染色細胞を、フロー・サイトメトリによって分析した。PHAで活性化したPBMCはIL−15Rαタンパク質を発現したが、休止PBMCは発現しなかった。上述の架橋実験の結果と一致して、FLAG−HMK−IL−15のPHA活性化PBMCへの結合は、モル過剰のrIL−15によって遮断され、したがってIL−15結合部位に対するFLAG−HMK−IL−15結合の特異性を実証する。活性化CD4+およびCD8+細胞は共に、IL−15α鎖を発現する。活性化誘発IL−15Rα鎖は、CD14+(単球/マクロファージ)細胞、およびCD16+(ナチュラルキラー)細胞においても検出された。
【0088】
IL−2RαおよびIL−2RβサブユニットはIL−15結合に必要とされない
IL−2Rαサブユニットに対して、FLAG−HMK−IL−15タンパク質および抗CD25Mabで染色したPHA活性化PBMCのFACS分析は、IL−15RαおよびIL−2Rαサブユニットの両方を発現する細胞集団と、いずれかのサブユニットを発現するが両方は発現しない細胞集団とを明らかにする。FLAG−HMK−IL−15に結合しないIL−2Rα+細胞が存在する。1日だけPHAで刺激したほぼすべてのPBMCが、IL−15RαまたはIL−2Rβ鎖を発現するが、両方のタンパク質は発現しない。対照的に、PHA刺激の3日後には、IL−15Rα+、IL−2Rβ+細胞(ダブル・ポジティブ)のはるかに大きな集団、IL−15Rα+、IL−2Rβ−細胞(シングル・ポジティブ)のはるかに小さな集団が認められた。興味深いことに、IL−15に結合できないIL−2Rβ+細胞が存在する。したがって、IL−2Rβ鎖の発現は、IL−15結合に充分でない。
【0089】
すべてを考慮すると、これらのデータは、IL−15がIL−15Rα+、IL−2Rα−、およびIL−2Rβ−細胞に結合し得ることを示している。IL−15と、IL−15RαサブユニットでトランスフェクトしたIL−2Rα−、β−細胞との相互作用を調べた実験によっても同様の結果が得られた(アンダーソンら(Anderson et al.)J.Biol.Chem.270、29862ページ、1995年、ギリら(Giri et al.)EMBO J.14、3654ページ、1995年)。IL−15Rαサブユニット発現に必要であることに加えて、IL−2RβおよびIL−2Rγサブユニットは、細胞をIL−15誘発増殖に対して感受性にするために必要とされる。
【0090】
要約すると、上に示した実験は(i)IL−15Rαサブユニットが、活性化マクロファージ、T細胞、およびNK細胞によって迅速に発現されること、ならびに(ii)IL−15Rαサブユニットの誘発は、デキサメタゾンによって遮断されるがCsAまたはラパマイシンでは遮断されないこと、を実証した。さらに、これらの実験は、IL−15RαサブユニットがIL−15結合に必要かつ充分であり、FLAG−HMK−IL−15融合タンパク質がIL−15受容体の研究に極めて有用なツールであることを確認した。
【0091】
IL−2RβサブユニットはIL−2およびIL−15両方のシグナル伝達に重要である
活性化T細胞の生存能力の低下、それによる活性化T細胞の枯渇は、加速性アテローム性動脈硬化症、同種異系移植片の拒絶、ある種の白血病、および他の免疫媒介病変の原因であるリンフォカインおよびマイトジェンの産生を低減する方法を提供する。さらに、IL−15によって活性化されたシグナル伝達経路の遮断も、加速性アテローム性動脈硬化症、同種異系移植片の拒絶、ある種の白血病、および他の免疫媒介病変の原因であるリンフォカインおよびマイトジェンの産生を低減する方法を提供する。T細胞は活性化されたとき、増殖し、その細胞表面にインターロイキンに対する受容体を発現する。さらに活性化T細胞は、少なくとも3種のリンフォカイン、すなわちガンマインターフェロン、B細胞分化因子II、およびIL−3を放出する。これらのリンフォカインは、同種異系移植片拒絶のような種々の望ましくない事象を生じ得る。対照的に、休止T細胞および長期記憶T細胞はリンフォカイン受容体を発現しない。この受容体発現の差異は、休止細胞に干渉することなく、活性化免疫細胞を標的にする手段を提供する。IL−15Rのいくつかのサブユニットを認識するように設計された分子は、活性化単球/マクロファージ、ならびに活性化T細胞を認識し、これらの細胞を選択的に阻害または破壊するために用いることが可能である。IL−15Rサブユニットに結合するが、IL−15活性を持たないIL−15誘導体は、真のIL−15の結合を遮断し、および/または取り込みを遮断するため、本発明の方法において有用である。下記の変異IL−15分子は、そのような誘導体の実施例を提供する。
【0092】
IL−15Rを標的とする変異IL−15ポリペプチド
変異IL−15の遺伝子構築物
2重変異(Q149D、Q156D)を有するヒトIL−15タンパク質を、IL−2Rγサブユニットに対する結合に重要な推定部位を標的とするように設計した。149位および156位の極性であるが電荷は持たないグルタミン残基を、PCR補助変異誘発を利用して、アスパラギン酸の産生残基に変異させた。IL−15の2重変異体をコードするcDNAを、合成センス・オリゴヌクレオチド[5’−GGAATTCAACTGGGTGAATGTAATA−3’(配列番号 )、EcoRI部位(下線のヘキサマー)+塩基145〜162]、および合成アンチセンスオリゴヌクレオチド[5’−CGGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAACATGTCGACAAT−ATGTACAAAACTGTCCAAAAAT−3’(配列番号 )、BamHI部位(下線へ基サマー)+塩基472〜489、変異塩基は一重下線で示す]を用いるPCRによって増幅した。テンプレートは、ヒトFLAG−HMK−IL−15をコードするcDNAを含むプラスミドであった。記載のとおり、増幅したフラグメントをEcoRI/BamHIで消化し、EcoRI/BamRIで消化したpAR(DRI)59/60プラスミドにクローニングした(ルクレールら(LeClair et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89、8145ページ、1989年)。156位残基における変異の存在はSalIを用いた消化によって確認され、この変異は新たなSalI制限部位を導入する。さらに、変異を標準的な技術に従って、DNAシークエンシングによって実証した。FLAG−HMK−IL−15野生型タンパク質に関して上述したとおり、FLAG−HMK−IL−15(Q149D、Q156D)2重変異タンパク質を産生し、精製して、シークエンシングによって確認した。
【0093】
同じ方法を用いて、149位または156位のいずれかに、単一のアミノ酸置換を含む変異体を調製した。前述のとおり、これらの位置(149および156)は、48個のアミノ酸シグナル配列を欠損する成熟IL−15ポリペプチドでは、それぞれ101位および108位に対応する。
【0094】
同様に、この方法は、149位または156位のグルタミン残基の代わりに任意のアミノ酸を組み込むために、または149位および/または156位以外の位置にアミノ酸置換を導入するために用いることが可能である。
【0095】
IL−15関連タンパク質の存在下におけるBAF−BO3細胞の増殖
この2重変異IL−15ポリペプチドは、用量依存的にBAF−BO3の増殖を阻害する可能性があり、2重変異IL−15を30μl(約50μg/ml)添加した場合、同じ濃度の2重変異IL−15を20μl添加した場合に比べて、より完全に増殖を阻害した。
【0096】
PHA刺激ヒトPBMCの増殖
FLAG−HMK−IL−15の2重変異ポリペプチドが、PHA活性化ヒトPBMCを結合する能力を以下のように実証した。PHA活性化PBMCを洗浄し、培地のみ、またはFLAG−HMK−IL−15 2重変異体と共にインキュベートした。次いで、細胞を抗FLAGビオチン化抗体と共にインキュベートし、ストレプトアビジンRED670複合体で染色した。染色した細胞を、フロー・サイトメトリで分析した。
【0097】
野生型FLAG−HMK−IL−15で染色した白血病細胞系のFACS分析 上述と類似の一連の実験において、野生型FLAG−HMK−IL−15ポリペプチドが白血病細胞を結合する能力を示した。処理した細胞は、白血病細胞系MOLT−14、YT、HuT−102、およびベス・イスラエル病院(Beth Israel Hospital)(マサチューセッツ州ボストン)において現在確立されており、2Aおよび2Bと称する細胞系から得た。培養細胞を洗浄し、培地のみ、またはFLAG−HMK−IL−15野生型ポリペプチドを含有する培地と共にインキュベートした。次いで、細胞をビオチン化抗FLAG抗体と共にインキュベートし、ストレプトアビジンRED670複合体で染色した。染色した細胞を、フロー・サイトメトリで分析した。
【0098】
さらなる変異IL−15キメラポリペプチドの遺伝子構築
抗原性タグを有する変異IL−15を提供するFLAG−HMK−IL−15キメラに加えて、他の多くのポリペプチドを、IL−15またはIL−2の任意の変異体に結合させることが可能である。たとえば、変異IL−15またはIL−2を、以下の方法に従って、抗体のIgGサブクラスのFcフラグメントに結合させることが可能である。
【0099】
変異IL−15/Fcの遺伝子構築
Fcγ2aに対するcDNAは、逆転写酵素(MMLV−RT、ギブコ−BRL社(Gibco−BRL)、ニューヨーク州グランドアイランド)、および合成オリゴ−dT(12〜18)オリゴヌクレオチド(ギブコ−BRL社(Gibco−BRL))によって、標準的な技術を用い、IgG2a分泌ハイブリドーマから抽出されたmRNAから産生することが可能である。この変異IL−15cDNAを、IL−15特異合成オリゴヌクレオチドを用いるPCRによって、プラスミド・テンプレートから増幅可能である。
【0100】
この5’オリゴヌクレオチドは、独自のNotI制限部位40ヌクレオチド5’を翻訳開始コドンに挿入するように設計され、一方3’オリゴヌクレオチドは、終止コドンを除去し、さらに変異IL−15/Fc接合部において独自のBamHI部位の作製を容易にするために、C末端セリン残基コドンをAGCからTCGに修飾する。Fcγ2aドメインcDNAの増幅に用いられる合成オリゴヌクレオチドは、ヒンジの最初のコドンにわたる独自のBamHI部位を作製し、さらに独自のXbaI部位3’を終止コドンに導入するためにヒンジの最初のコドンをGluからAspに変える。
【0101】
Fcフラグメントは、標的細胞非枯渇性であるように、すなわち補体系を活性化できないように修飾可能である。標的細胞非枯渇性変異IL−15構築物(mIL−15/Fc)を製造するために、オリゴヌクレオチド部位誘導変異誘発を用いて、C’1q結合モチーフ、Glu318、Lys320、Lys322をAla残基で置き換える。同様に、Leu235をGluで置き換えて、FcγRI結合部位を不活化する。独自のBamHI部位における正確な翻訳リーディング・フレーム内のサイトカインとFc’’成分とのライゲーションにより、全体で13個のシステイン残基を有するアミノ酸411個の単一ポリペプチド(アミノ酸18個のIL−15シグナル・ペプチドを含む)をコードする1236塩基対のオープン・リーディング・フレームが生じる。成熟分泌ホモダイマーIL−15/Fcは、全体で8個までの分子内ジスルフィド結合および3個の重鎖間ジスルフィド結合と、グリコシル化を除き約85kDaの分子量を有すると予測される。
【0102】
mIL−15受容体Fc融合タンパク質の発現および精製
mIL−15/Fcの適切な遺伝子構築は、融合遺伝子をNotI−XbaIカセットとして真核発現プラスミドpRc/CMV(インビトロゲン社(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)にクローニングした後に、DNA配列分析をすることによって確認可能である。このプラスミドは、CMVプロモーター/エンハンサ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびG418による選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を有する。mIL−15/Fc融合遺伝子を有するプラスミドを、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO−K1、米国菌株保存機関から入手可能)にエレクトロポレーション(1.5kV/3μF/0.4cm/PBS)によってトランスフェクトし、G418(Geneticin、ギブコ−BRL社(Gibco−BRL))1.5mg/mlを含有する血清を含まないUltra−CHO培地(バイオウイタッカー社(BioWhittaker Inc.)メリーランド州ウォーカーズビル)中で選択する。サブクローニングの後、ELISA(ファーミンジェン社(PharMingen)カリフォルニア州サンディエゴ)によってIL−15の上清をスクリーニングすることによって、高レベルの融合タンパク質を産生するクローンを選択する。mIL−15/Fc融合タンパク質を、タンパク質Aセファロース・アフィニティ・クロマトグラフィー、それに続くPBSによる透析、および0.22μmの濾過滅菌によって、培養上清液から精製する。精製したタンパク質は、使用まで−20℃で保存可能である。
【0103】
融合タンパク質の大きさおよびアイソタイプ特異性を評価するために、還元条件下(DTTあり)および非還元条件下(DTTなし)でのSDS−PAGEの後、モノクローナルまたはポリクローナル抗mIL−15または抗Fcγ1次抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行うことが可能である。変異IL−15/Fcの機能活性は、上述の標準的なT細胞増殖アッセイによって評価可能である。以下のmAbはファーミンジェン社(PharMingen)(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。PE抗マウスCD25(IL−2Rα鎖、IgG1、PC61)、ラット抗マウスCD122(IL−2Rβ鎖、IgG2b、TM−b1)、ラット抗マウスCD132(IL−2Rγc、IgG2b、TUGm2)、ハムスター抗マウスCD3(IgG、145−2C11)、ハムスター抗マウスCD28(IgG、37.51)、PE抗マウスCD62L(IgG2a、MEL14)、PEハムスター抗マウスBcl−2複合体(IgG、3F11)、PE抗マウスIL−2複合体(IgG2b、JES6−5H4)、PEアネキシンV、ビオチン化抗ラットIgG2b、PEストレプトアビジン、PE−CyChrome、およびPEアイソタイプ・コントロールmAb複合体である。ビオチン化マウス抗FLAGmAb、およびラットIgG1コントロールmAbは、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)(ミズーリ州セントルイス)から得た。B細胞ハイブリドーマ分泌ラット抗マウスCD25mAb(TIB222、IgG1)は、米国菌株保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC、バージニア州マナサス)から得た。細胞は、血清を含まないUltraCulture培地(バイオウイタッカー社(BioWhittaker)、メリーランド州ウォーカーズビル)で増殖し、培養上清中のmAbをタンパク質Gカラムで精製した。
【0104】
インビボでのIL−2およびIL−15の発現研究
組換え型ヒトIL−2およびIL−15を、R&Dシステム(R&D System)(ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。IL−15−FLAGおよびIL−15変異体/Fc融合タンパク質を構築し、発現し、以前に報告されているとおり試験した(チェら(Chae et al.)、J.Immunol.157、2813〜2819ページ、1996年、キムら(Kim et al.)、J.Immunol.161、5742〜5748ページ、1998年)。前に報告されているとおり、ラット抗マウスγcmAb(4G3/3E12、IgG2b)を用いた(リら(Li et al.)、J.Immunol.164、1193〜1199ページ、2000年)。
【0105】
リンパ球を以下のように、蛍光色素5−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE、モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes Inc.)、オレゴン州ポートランド)で標識した。脾臓および末梢リンパ節をドナー・マウスから採取し、単一細胞懸濁液をハンクス平衡塩溶液(HBSS)で調製した。赤血球を低浸透圧ショックによって溶解した。細胞を1×107/mlでHBSSに再懸濁し、ウェルズら(Wells et al.)(J.Clin.Invest.100、3173〜3183ページ、1997年)によって記載のとおり、CFSEで標識した。
【0106】
CFSE標識T細胞をインビボで活性化するために、DBA/2マウスを、Gammacell Exactor(カナタ社(Kanata)カナダ、オンタリオ州)を用いて照射(1000rad)した。次いで、それぞれのマウスに、0.5mlHBSS中4から6×107のCFSE標識細胞を尾の静脈から投与した。3日後、宿主マウスを殺し、脾臓および末梢リンパ節を別々に採取した。細胞表面染色およびFACS分析のために、単一細胞懸濁液を調製した。
【0107】
いくつかの実験において、照射宿主マウスを、抗CD25mAbまたは抗γcmAbで処理した(CFSE標識細胞の静脈内注射後から3日間、腹腔内に1mg/日)。インビボでの細胞分裂を、CFSE標識細胞の注射後、第3日に判定した。IL−15変異体/Fc融合タンパク質の処理は、標識細胞の静脈内注射後から3日間、腹腔内に1.5μg/日であった。
【0108】
照射同種異系宿主内のインビボ活性化CFSE標識細胞を、IL−2およびIL−15受容体サブユニットの発現のために染色した。IL−2受容体α鎖の発現を検出するために、細胞(2×106)を氷上で30分間、PE抗マウスCD25mAbで染色し、洗浄して、0.5%BSAを含有する1mlPBSに再懸濁した。IL−2Rβおよびγcの発現を検出するために、細胞を氷上で30分間、ラット抗マウスβ鎖(IgG2b)またはγcmAb(IgG2b)と共にインキュベートし、その後、ビオチン化抗ラットIgG2bと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、さらに20分間、PEストレプトアビジンで染色した。細胞を洗浄し、分析のために、PBS−0.5%BSAに再懸濁した。IL−15Rα鎖の発現を検出するために、細胞をそのα鎖と結合するIL−15−FLAG融合タンパク質と共にインキュベートし(チェら(Chae et al.)、J.Immunol.157、2813〜2819ページ、1996年)、次いでビオチン化マウス抗FLAGmAbで染色した。次いで細胞を洗浄し、PEストレプトアビジンで染色した。各実験において、アイソタイプ対応コントロールmAbを、コントロールとして含めた。すべての試料を、CellQuest(商標)ソフトウェア(ベクトンディッキンソン社(Beckton Dickinson)、カリフォルニア州マウンテンビュー)を備えたFACSortを用いて分析した。データを集め、CFSE+細胞にゲーティングすることによって分析した。すべての分裂CFSE+細胞は、CD3の発現によって定義されるとおりT細胞であった。各試料に関して、少なくとも100000事象を回収した。
【0109】
インビボでの分裂T細胞のアポトーシスを、以下のとおり分析した。CFSE標識リンパ球を、上述のとおり照射同種異系宿主内インビボで刺激した。3日後、細胞を宿主脾臓および末梢リンパ節から採取し、標識緩衝液中、氷上で15分間、PEアネキシンV複合体で染色した。細胞のCFSEプロファイルに基づいて細胞分裂を同定し、識別される各細胞分裂におけるアポトーシス細胞死をアネキシンV染色によって分析した。
【0110】
さらに細胞を、細胞内IL−2およびBcl−2サイトカイン発現に対して染色した。3日間インビボで活性化させたCFSE標識細胞を、宿主脾臓およびリンパ節から採取した。細胞をインビトロで4時間、PMA(50ng/ml)およびイオノマイシン(500ng/ml)で再刺激し、培養の最後の2時間にGolgiStop(商標)(ファーミンジェン社(PharMingen))を添加した。細胞を固定して、4℃で10分間、Cytofix/Cytoperm(ファーミンジェン社(PharMingen))で浸透化し、次いでPE抗マウスIL−2mAb複合体で染色し、さらにアイソタイプ対応コントロールmAbをコントロールとして用いた。Bcl−2染色のために、細胞を固定して、10分間、Cytofix/Cytopermで浸透化し、30分間、PE抗Bcl−2mAb複合体またはアイソタイプ・コントロールAbで染色した。細胞を洗浄し、FACSによって分析した。
【0111】
細胞選別およびインビボ再刺激を以下のように行った。標識細胞の静脈内注射の3日後、照射同種異系宿主からCFSE標識細胞を調製した。インビボでの細胞増殖を、CFSEプロファイルの分析によって同定した。第2細胞分裂を選択し、ゲーティングして、2000事象/秒でFACS Vantage(商標)ソータ(ベクトンディッキンソン社(Beckton Dickinson))を用いて選別した。選別した細胞を、10%FCSならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地に5×105/mlで再懸濁し、抗CD3(2μg/ml)被覆プレートに、抗CD28mAb(1μg/ml)と共に平板培養した。3日後、細胞を回収し、PE抗マウスCD25複合体およびアイソタイプ・コントロールAbで染色した。細胞増殖およびIL−2受容体α鎖発現を、FACSによって分析した。
【0112】
細胞選別およびインビトロ増殖アッセイを以下のように行った。標識細胞の静脈内注射の3日後、照射同種異系宿主からCFSE標識細胞を調製し、その細胞のCFSEプロファイルの分析によって、インビボでの細胞増殖を同定した。第2細胞分裂を選択し、ゲーティングして、FACS Vantage(商標)を用いて選別した。細胞(1×104/ml)を、10%FCSならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシン添加のRPMI1640培地に再懸濁し、48時間、IL−2(40μ/mlから500μ/ml)またはIL−15(5ng/ml)で刺激した。細胞を1mCi3H−TdR(アマーシャム社(Amersham)、マサチューセッツ州ボストン)で16時間パルスし、3H−TdR取り込みをシンチレーション・カウンティング(ベックマン・インスツルメント社(Beckman Instrument)、メリーランド州コロンビア)によって求めた。
【0113】
上述の試薬および技術は、いくつかの発見の基礎を提供した。第1に、CFSE標識B6AF1(H−2b/d.k)同種異系リンパ球は、同系コントロールと対照的に(リら(Li et al.)、Nature Medicine5、1298〜1302ページ、1999年)、照射DBA/2(H−2d)宿主内で活発に増殖した。宿主脾臓から回収したCFSE標識T細胞の約20%が、養子免疫伝達から3日以内に細胞周期にはいり、7から8巡の個別の細胞分裂が明らかに同定された(図3A)。驚いたことに、高親和性のIL−2受容体シグナル伝達に必要とされるIL−2受容体α鎖は、最初の5回の分裂の間に検出できなかった。すなわち、この受容体サブユニットは、5回の細胞分裂後にのみ発現される。対照的に、IL−2受容体のβサブユニットは、すべての分裂T細胞によって構成的に発現され、その発現レベルは細胞が分裂を続けるにつれて次第に上昇した。インビボにおけるγc発現のパターンは、α鎖およびβ鎖と著しく異なっていた(図3A)。非分裂T細胞(0分裂)は、非常に低いレベルのγ鎖を発現した(<10%)。細胞周期にはいった後、γ鎖は分裂T細胞から非常に高いレベルで発現された。連続する各細胞分裂の後、発現レベルは上昇を続けた。しかしながら、5回の細胞分裂後、γ鎖の発現は急激にダウンレギュレーションされ、6回の細胞分裂後にはほぼ基底レベルにまで達した(図3A)。
【0114】
末梢リンパ節から採取されたCFSE標識細胞もIL−2受容体の3種のサブユニットに関して極めて類似するパターンを示したので、IL−2受容体サブユニットの差異的な発現は、宿主脾臓における活性化T細胞のサブセットの選択的蓄積によるものではない。
【0115】
第2に、インビボでのCFSE標識T細胞の刺激は、IL−2受容体の3種すべてのサブユニットに一様な発現をもたらした(図3B)。これは、インビボでのIL−2受容体発現の調節がインビトロとは異なることを示唆している。IL−2受容体α鎖は、セレクチンに類似の挙動で、インビボでのタンパク分解分割に感受性であることが知られている(ヘマーら(Hemar et al.)J.Cell.Biol.129、55〜64ページ、1995年)。インビボでの分裂T細胞によるL−セレクチン発現の染色は、L−セレクチンが最初の5回の細胞分裂の間に高レベルで発現されることを示し(図3C)、最初の5回の細胞分裂の間にIL−2受容体α鎖の発現を検出できなかったのは、急速なタンパク分解分割によるものではないことを示唆した。最初の5回の細胞分裂のT細胞がIL−2受容体α鎖を発現し得るのかどうかを判定するために、IL−2受容体α鎖を発現しなかった第2細胞分裂にあるT細胞を選別し、インビトロにおいて3日間、固定化抗CD3および可溶性抗CD28で刺激した。これらの選別されたT細胞はインビトロでの再刺激において分裂を続け、すべての分裂T細胞はIL−2受容体α鎖を発現した。明らかに、インビボおよびインビトロにおけるIL−2受容体α鎖の発現の調節は異なっている。
【0116】
IL−15の受容体も重要なシグナル伝達成分として、最初の5回の細胞分裂の間に高レベルに発現するIL−2受容体βおよびγ鎖を用いるので(タガヤら(Tagaya et al.)、Immunity4、329〜336ページ、1996年)、初期細胞分裂の間、IL−15に対する応答性を付与するIL−15受容体α鎖を細胞が発現するかどうかを本出願人らは調べた。主要な染色試薬としてIL−15−FLAG融合タンパク質を適用することによって、(チェら(Chae et al.)、J.Immunol.157、2813〜2819ページ、1996年)、細胞分裂数にかかわらず、分裂T細胞において、たとえ低レベルであってもIL−15受容体α鎖が明らかに検出可能であることが実証された(図4A)。IL−2受容体のα鎖は、インビボにおいてすべての分裂T細胞で検出されなかった。したがって、最初の5回の細胞分裂の間、α鎖がIL−15受容体に対して選択的に発現するが、IL−2受容体に対して発現しないことは、共通β鎖およびγ鎖の発現と共に、インビボにおける初期細胞分裂がIL−15依存性であり、IL−2依存性ではないらしいことを示唆している。
【0117】
この仮説を試験するために、インビボの分裂T細胞におけるIL−2産生を評価した。細胞内IL−2染色は、IL−2が5回を超えて分裂した細胞によってのみ高レベルに発現されることを示した。飽和用量の細胞溶解性抗CD25mAbによる宿主マウスの処理は、最初の5回の細胞分裂を阻害できず(コントロールAb処理マウスと比較)、第1および第5分裂の分裂細胞は抗CD25処理マウスとコントロール・マウスにおいて著しく類似していた。さらに、インビボの第2細胞分裂にあるT細胞を選別して、IL−2またはIL−15の存在下インビトロで培養し、細胞増殖を3H−TdRの取り込みによって分析した。培養中に500μ/mlという高用量で投与されたIL−2は、T細胞増殖を支持できなかった。対照的に、IL−15は活発な細胞増殖を刺激した(図4B)。
【0118】
インビボでのIL−2発現のパターンは、IL−2受容体αおよびβ鎖のアップレギュレーション、および際立って減少する共通γ鎖の発現と密接に関連している(図5A)。これは、IL−2がインビボにおいてγ鎖の発現を調節することを示唆している。この可能性を試験するために、IL−2欠損マウスおよび野生型コントロール・マウス由来のT細胞において、γ鎖の発現を検査した。IL−2欠損マウス由来のCD4+T細胞は、野生型コントロールに比べて、細胞表面で非常に高いレベルでガンマ鎖を発現した(図5B)。抗CD25による宿主マウスの処理は、インビボの分裂T細胞においてγ鎖のダウンレギュレーションを阻害したが、この処理はIL−2受容体β鎖の発現に影響を及ぼさなかった(図5C)。
【0119】
γ鎖は、知られているすべてのT細胞増殖因子にとって決定的に重要なシグナル伝達要素であり、γ鎖シグナルは細胞生存に必須であって、細胞生存は少なくとも部分的にはBcl−2ファミリー抗アポトーシスタンパク質の持続発現によって達成される(ナカジマら(Nakajima et al.)、J.Exp.Med.185、189〜195ページ、1997年)。インビボでの5回の細胞分裂後のγ鎖発現の減少がクローン増殖を調節するのかどうか判定するために、宿主からの回収後、CFSE標識細胞をPRアネキシンVで染色し、分裂T細胞のアポトーシス細胞死をインビボで分析した。4回の細胞分裂後に、急激な細胞死が生じた。非分裂細胞(0分裂)は、<10%のアネキシンV陽性細胞を有した。しかしながら、第6細胞分裂後は、〜40%の細胞がアネキシンV陽性であった。Fas変異MRL−lprマウスのT細胞もインビボにおいて類似のアポトーシス細胞死パターンを有するので、この種の細胞死はFas依存性ではない(リら(Li et al.)、J.Immunol.163、2500〜2507ページ、1999年)。Bcl−2発現の染色は、Bcl−2染色の平均チャネル蛍光強度は、4回の細胞分裂後に著しく減少した(図5E)。したがって、γ鎖ダウンレギュレーションにおけるシグナル伝達事象は、持続的なBcl−2発現を支持できない可能性があり、細胞はアポトーシス細胞死を受けやすくなる(ナカジマら(Nakajima et al.)、J.Exp.Med.185、189〜195ページ、1997年)。
【0120】
これらの結果は、IL−2またはIL−15シグナル伝達の遮断が、インビボにおいてT細胞発現に異なる影響を及ぼすであろうことを示唆している。この可能性をさらに調査するために、IL−2欠損マウス(H−2b)由来のCFSE標識リンパ球を、照射DBA/2宿主(H−2d)に注射し、3日後にインビボにおいて細胞分裂を分析して、野性株コントロール・マウスと比較した。IL−2欠損マウスのT細胞は、インビボで分裂および増殖を続けた。約30%のCFSE標識細胞が細胞周期にはいり、コントロールに比べて、細胞の大多数が5回を超えて分裂した。
【0121】
IL−15受容体特異アンタゴニストとして作用する(キムら(Kim et al.)、J.Immunol.161、5742〜5748ページ、1998年)IL−15変異体/Fcで処理した宿主マウスは、CFSE標識T細胞の増殖頻度が著しく減少し、CFSE標識細胞の圧倒的多数が処理マウスにおいて細胞周期にはいることができなかった。さらに、IL−2およびIL−15受容体の共有シグナル伝達成分、共通γ鎖に対する遮断mAbで処理した宿主マウスも、インビボにおけるT細胞分裂を著しく阻害した。したがって、IL−2およびIL−15は、インビボにおいてT細胞発現の異なる側面を調節し、これらのインターロイキンのアンタゴニストの投与は上述のとおり免疫応答を抑制し得る。
【0122】
これらの結果はまた、γ鎖のダウンレギュレーションがT細胞活性化および細胞周期進行、ならびにIL−2シグナル伝達を必要とすることを実証した。明らかに、インビボにおけるγ鎖のダウンレギュレーションは、IL−2産生、および高親和性IL−2受容体発現と密接に関連している。IL−2の不在下、γ鎖は極めて高レベルで発現し、IL−2受容体の遮断は、循環T細胞におけるインビボγ鎖ダウンレギュレーションを阻害する。このように、これらの研究は、IL−2およびIL−15がインビボにおいて初期T細胞活性化の異なる側面を調節するということの新規な証拠を提供する。インビトロ研究に基づく従来の考えおよび結論に反して、IL−15はインビボのT細胞分裂開始において重要な増殖因子であり、インビボでのIL−2の特異な役割は、循環T細胞におけるγ鎖発現を調節することによってクローン性増殖の規模を制御することである。
【0123】
これらの結果は上述の臨床適用例を支持する。腫瘍免疫およびAIDSにおいて外因性IL−2とのT細胞応答を高めようとする試みは、早期T細胞死を促進する可能性があり、耐性誘導および自己免疫においてIL−2を遮断する療法は、望ましくないT細胞増殖を誘発する可能性がある。さらに、IL−15およびIL−2の段階的かつ複合的標的化は、T細胞依存性細胞変性状態においてT細胞活性を遮断する重要な方法を示す。
【0124】
溶解性IL−2/FcはIL−2Rを有する細胞を溶解し、FcRIに結合する
T細胞系の細胞(CTLL−2細胞、106)を100mCi51Crで標識し、IL−2/Fcの溶解性形態およびラット低毒性補体(C’)、IL−2/Fcの非溶解性形態およびC’、マウス免疫グロブリンおよびC’(陰性コントロール)、またはC’単独(0.5μg/ml、陰性コントロール)と共にインキュベートした。同じ細胞の別のグループを、洗浄剤(1%NP40)で処理した(陽性コントロール)。細胞溶解は、51Cr放出によって測定した。洗浄剤存在下で認められた溶解の程度を100%溶解と表す。上述した処理に続く特異的細胞溶解を、以下の式に従って算出した。特異的細胞溶解%=[(実験から得たcpm−バックグラウンドcpm)/(全放出cpm−バックグラウンドcpm)×100%]。図6に示す結果は、細胞溶解性IL−2/FcはIL−2Rを有するCTLL−2細胞を溶解するが、非溶解性IL−2/Fcは溶解しないという結論を支持している。
【0125】
溶解性および非溶解性IL−2/Fcが、FcRIトランスフェクトCHO細胞上でFc受容体を結合する能力を評価するために(マウスFcRI、FcRII、およびIL−2R陰性)、FcRIトランスフェクタントをPBS、mIgG2a、溶解性IL−2/Fc、または非溶解性IL−2/Fcであらかじめインキュベートした。洗浄後、蛍光ヤギ抗マウスFc複合体を用いて、FACS分析のために細胞を染色した。図7に示したとおり、細胞溶解性IL−2/FcはFcRIを結合し得るが、溶解性IL−2/Fcは結合できない。
【0126】
溶解性IL−2/Fcは養子移植モデルにおいて糖尿病の予防に有効である
IL−2/Fcの2種の異なる変異体を作製した。CDCおよびCDCCを媒介する第1の変異体はマウスIgG2a由来のFc末端を含有し(IL−2/Fc)、CDCまたはCDCCを活性化しない第2の変異体はFc部分による点変異であった(IL−2/Fc−/−)。IL−2/Fcは、IL−2Rを有する細胞(マウスCTLL−2T細胞系など)においてCDCを媒介し、FcRIに結合するが、IL−2/Fc−/−は媒介、結合しない(図6および7)。さらに、溶解性IL−2/Fc分子は、NOD養子移植モデルにおいて糖尿病の発症を予防するであろうが、その分子の非溶解性形態(IL−2/Fc−/−)は無効である(図13)。この動物モデルにおいて、単分散脾細胞をACK Lysing Buffer(バイオウイタッカー社(BioWhittaker,Inc.)、メリーランド州ウォーカーズビル)で処理することによって赤血球を枯渇させた。次いで、非糖尿病の8から12週齢の照射(700rad)NOD雄レシピエントに、急性糖尿病の雌NODマウス(高血糖<2週)由来の脾臓白血球2×107を注射した。血糖値(BGL)を週ごとに試験し、BGLが任意の単回の測定で16.5mmol/lを超えたとき、または3日連続で13.8mmol/lを超えたとき、糖尿病と診断した。図13に示したとおり、動物の大部分は、処理を中止した後も、糖尿病を発症しないままであった。
【0127】
上述のとおり、本明細書に示したアッセイおよび動物モデルは、治療有効性に関して本発明の薬剤の種々の組み合わせを試験するために用いることが可能である。
【0128】
ラパマイシンはインビボ対宿主性移植片モデルにおいてT細胞増殖を阻害するが、活性化T細胞のアポトーシスを阻害しない
インビボ対宿主性移植片モデル(上述のとおり)において、IL−2/Fcおよびラパマイシンの存在下、宿主反応性T細胞の運命を分析した。図8に示したとおり、ラパマイシンはIL−2/Fcの存在下であっても、CD4+およびCD8+T細胞の増殖を阻害するが、機能性IL−2Rの発現を許容する。アネキシンV染色によって明らかなように、抗原活性化宿主反応性T細胞は、IL−2/Fcおよびラパマイシンの存在下アポトーシスを受ける(図10)。
【0129】
本発明の組成物は膵島および皮膚同種異系移植片の長期生存を可能にする
急性糖尿病NODレシピエントに移植された同種異系膵島の拒絶、またはNODマウスに移植された皮膚移植片の拒絶を防ぐために、T細胞死を促進し、T細胞増殖を阻害する薬剤の組み合わせを用いた。図11および12に示したとおり、溶解性IL−2/Fc、mutIL−15/Fc、およびラパマイシンの組み合わせは、移植片拒絶の予防に有効(かつ、試験を行った他の処理より有効である)であることが証明された。移植片の生存および移植片の機能は観察期間を通じて持続し、大部分の移植片は治療停止後も生存した。この劇的な効果は、用いた薬剤の組み合わせ(T細胞死を促進する薬剤、ならびにT細胞増殖を阻害する薬剤)によるものであると考えられる。
【0130】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1】
野生型IL−15核酸配列(配列番号1)と、予想されるアミノ酸配列(配列番号2)とを表示する図である。
【図2】
変異IL−15核酸配列(配列番号3)と、予想されるアミノ酸配列(配列番号4)とを表示する図である。149位でグルタミンをコードする野生型コドンCAG、および156位でグルタミンをコードする野生型コドンCAAが、いずれもアスパラギン酸をコードするGACに変更されている(これらの位置(149および156)はそれぞれ、48個のアミノ酸シグナル配列を欠損する成熟IL−15ポリペプチドの101位および108位に相当する。
【図3A】
CFSE標識細胞の静脈内(i.v.)注射3日後、宿主脾臓での分裂T細胞によるIL−2受容体α、β、およびγc鎖の発現を示す一連のプロットである。6回の実験の代表的なデータを示す。
【図3B】
インビトロでの分裂T細胞によるIL−2受容体α、β、およびγ鎖の発現を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞リンパ球を、3日間インビトロで抗CD3(2μg/ml)を用いて刺激した。細胞分裂およびIL−2受容体サブユニットの発現を、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。
【図3C】
インビボでの分裂T細胞によるL−セレクチンの発現を示すプロットである。CFSE標識細胞の静脈内注射3日後、宿主マウスのリンパ節から細胞を採取し、PE−抗CD62LmAbで染色した。アイソタイプ・コントロールmAbで染色した細胞に基づいて、四分区間を設定した。
【図3D】
インビボでの分裂T細胞間におけるIL−2受容体α鎖の発現の差異を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞を3日間インビボで刺激した後、第2細胞分裂にある細胞を選別した。選別した細胞を、3日間インビトロで抗CD3および抗CD28を用いて再刺激した。細胞分裂、およびIL−2受容体α鎖の発現を、FACSによって分析した。
【図4A】
CFSE標識細胞の静脈内注射3日後、インビボでの分裂T細胞によるIL−15受容体α鎖の発現を示す一連のプロットである。細胞をIL−15−FLAG融合タンパク質で染色し、続いてビオチン化抗FLAGmAbおよびPE−ストレプトアビジンで染色した。IL−15−FLAG不在下で染色した細胞をコントロールとして含めた。
【図4B】
インビトロのIL−2およびIL−15に対するインビボでの分裂T細胞の異なる応答を示す棒グラフである。CFSE標識リンパ球を3日間インビボで刺激し、CFSEプロファイルを検査することによって細胞分裂を分析した。第2細胞分裂にあるT細胞を選別し、細胞(1×104)を、2日間IL−2またはIL−15を用いてインビトロで培養した。細胞増殖を、3H−TdR取り込みによって求めた。結果は、3重検定の平均CPM±SDで表す。
【図4C】
インビボでのT細胞分裂に対する抗CD25処理の効果を示す1対のグラフである。CFSE標識細胞の静脈内注射の直前3日間、宿主マウスに1mg/日で腹腔内(i.p.)に抗CD25mAbを与えた。アイソトープ・コントロールmAbで処理したマウス(ratIgG1)をコントロールとして含めた。
【図5A】
インビボでの分裂T細胞の細胞内IL−2染色を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞を、3日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、GolgiStop(商標)の存在下、インビトロで4時間PMAおよびイオノマイシンで刺激した。次いで細胞を固定、浸透し、IL−2産生に関して染色した。アイソトープ・コントロールmAbで染色した細胞をコントロールとして含めた。
【図5B】
IL−2欠損マウスのCD4+T細胞によるγcの発現を示す1対のグラフである。IL−2欠損マウス、および野生型コントロール・マウスの脾臓細胞を、PE−抗マウスCD4mAb、およびFITC−抗マウスIL−2受容体γcmAbで染色した。CD4+T細胞によるγcの発現をFACSによって分析した。
【図5C】
インビボでの分裂T細胞によるγc発現に対する抗CD25処理の効果を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞の静脈内注射の直前3日間、宿主マウスに1mg/日(i.p.)で抗CD25mAbを与えた。インビボでの分裂T細胞におけるIL−2受容体βおよびγ鎖の発現を、第3日(すなわちCFSE標識細胞注射の3日後)に求めた。アイソトープ・コントロールmAbで処理したマウス(ratIgG1)をコントロールとして含めた。
【図5D】
インビボでの分裂T細胞のアポトーシス細胞死を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞を、3日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、PE−アネキシンVで染色した。細胞分裂およびアポトーシス細胞死をFACSによって分析した。
【図5E】
インビボでの分裂T細胞による細胞内Bcl−2発現を示す一連のプロットである。CFSE標識細胞を、3日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、PE−抗マウスBel−2mAb、またはアイソトープ・コントロールmAbで染色した。細胞分裂、およびBcl−2の発現をFACSによって分析した。
【図6】
種々の薬剤による処理後に細胞死を評価した(CTLL−2細胞からのアイソトープ51Crの放出によって評価、X軸参照)実験の結果を示す棒グラフである。NP40は洗浄剤、IL−2/FcはIgG分子(この分子は細胞溶解性である)のFc領域とIL−2を有する融合タンパク質、C’はラット補体、IL−2/FC−/−は、非細胞溶解性IL−2含有融合タンパク質であり、mIgはマウス免疫グロブリンである。細胞溶解性IL−2/FcはIL−2Rを有するCTLL−2細胞を溶解し、非細胞溶解性IL−2/Fcは溶解しないという結論をこの研究は支持している。
【図7】
一連のヒストグラフである。CHO(チャイニーズ・ハムスター卵巣)細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、左上)、マウス免疫グロブリン(mIgG2a、右上)、非細胞溶解性IL−2/Fc分子(IL−2/FC−/−、左下)、および細胞溶解性IL−2含有融合タンパク質(IL−2/Fc、右下)に曝露した後、その細胞におけるFcRIの蛍光強度を測定した。各ヒストグラフにおいて、FcRI/CHOの蛍光強度に対して細胞数をプロットする。細胞溶解性IL−2/FcはFcRIに結合し、非細胞溶解性IL−2/Fcは結合しないという結論をこの研究は支持している。
【図8】
インビボにおけるCD4+(左側)およびCD8+(右側)T細胞の増殖性反応を示す1連の8つのプロットである。細胞をCFSEで標識し、細胞溶解性分子(IL−2/Fc)、細胞増殖剤(ラパマイシン(Rap))、または2種の薬剤の組み合わせを用いて、3日間インビボで刺激した。陰性コントロールとして、1群の動物は処理しなかった。IL−2/FCを、CFSEプロファイルによって分析した。ラパマイシンはIL−2増殖シグナル伝達を阻害するという結論をこの研究は支持している。
【図9】
CFSE標識リンパ球を3日間インビボで刺激した実験から得られた一連の4つのプロットである。分裂T細胞でのIL−2Rα鎖の発現を、非処理(左上)、ラパマイシン単独(Rap、右上)、IL−2/Fc単独(左下)、またはラパマイシンとIL−2/Fcとの組み合わせ(Rap+IL−2/Fc、右下)を与えられた動物においてFACSによって評価した。ラパマイシンおよびIL−2/Fcによる処理は、インビボにおいて、初期T細胞増殖中にIL−2Rのαサブユニットの発現を促進するという結論をこの研究は支持している。
【図10】
CFSE標識リンパ球を3日間インビボで刺激し、FACSによって分析したときに得られた1対のプロットである。分裂T細胞(CD4+)でのアネキシンVの発現を、非処理(左図)、ラパマイシンおよびIL−2/Fc(Rap+IL−2/Fc、右図)を与えられた動物において評価した。ラパマイシンおよびIL−2/Fcによる処理は、インビボにおいて、初期T細胞増殖中にCD4+細胞のアポトーシスを促進するという結論をこの研究は支持している。
【図11】
自己免疫非肥満性糖尿病(NOD)マウスに生存する膵島同種異系移植片を試験した実験の結果を示す表である。移植片を、初期同種異系移植片機能(この列に示したパーセントは、同種異系移植片が機能したマウスのパーセントを表す(機能は血中gluocose濃度を監視することにより評価した))、および機能性移植片の平均生存時間(MST)に関して評価した。n=試験動物数である。処理は、「処理」という見出しの下に示す(さらに表に添付の凡例、および下の説明を参照のこと)。ここに示された結果は、ラパマイシン、IL−2/Fc、およびmIL−15/Fcの組み合わせによる処理が、膵島同種異系移植片の長期生存をもたらすという結論を支持している。
【図12】
NODマウスにおいて皮膚同種異系移植片の生存を試験した実験の結果を示す表である。移植片を、機能性移植片の平均生存時間(MST)に関して評価した。n=試験動物数である。処理は、「処理」という見出しの下に示す(さらに表に添付の凡例、および下の説明を参照のこと)。ここに示された結果は、ラパマイシン、IL−2/Fc、およびmIL−15/Fcの組み合わせによる処理が、皮膚同種異系移植片の長期生存をもたらすという結論を支持している。
【図13】
細胞溶解性IL−2/Fc分子、マウス免疫グロブリン(mIg)、および非細胞溶解性IL−2/Fc分子による処理に続く期間にわたって、糖尿病が認められないままであった動物の%をプロットする線グラフである。細胞溶解性IL−2/Fcは自己免疫を遮断したが、溶解性IL−2/Fcは遮断しなかった。
Claims (34)
- インターロイキン−15受容体(IL−15R)を標的とする第1の薬剤と、インターロイキン−2受容体(IL−2R)を標的とする第2の薬剤とを含む治療組成物。
- 前記第1の薬剤が、IL−15Rのサブユニットに結合する実質的に純粋な変異IL−15ポリペプチドからなる請求項1に記載の治療組成物。
- 前記サブユニットがIL−15Rαサブユニットである請求項2に記載の治療組成物。
- 前記変異IL−15ポリペプチドが、配列番号2の156位に変異を有する請求項3に記載の治療組成物。
- 前記変異IL−15ポリペプチドがさらに、配列番号2の149位に変異を有する請求項4に記載の治療組成物。
- 配列番号2の156位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項4に記載の治療組成物。
- 配列番号2の149位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項5に記載の治療組成物。
- 前記変異IL−15ポリペプチドが、配列番号2の149位および156位にグルタミンをアスパラギン酸に代える置換を有する請求項5に記載の治療組成物。
- 前記第1の薬剤がさらに、IL−15Rを有する細胞の除去をもたらす部分からなる請求項2に記載の治療組成物。
- IL−15Rを有する細胞を溶解する前記部分が、IgG分子のFc領域である請求項9に記載の治療組成物。
- 前記第1の薬剤が、実質的に純粋な抗IL−15R抗体からなる請求項1に記載の治療組成物。
- 前記第2の薬剤が、IL−2またはIL−2Rに特異的に結合する抗体からなる請求項1に記載の治療組成物。
- 患者において免疫応答を抑制する方法であって、IL−15Rを標的とする第1の薬剤と、IL−2Rを標的とする第2の薬剤とを含む治療組成物を該患者に投与する工程からなる方法。
- 前記患者が、免疫疾患、特に自己免疫疾患を有するか、あるいは免疫疾患、特に自己免疫疾患を発症するおそれのある請求項13に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、およびベーチェット病からなるグループから選択されたリウマチ疾患である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチである請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、I型糖尿病である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎およびグレーヴズ病からなるグループから選択された甲状腺の自己免疫疾患である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、および脳脊髄炎からなるグループから選択された中枢神経系の自己免疫疾患である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー・アッシャー症候群、およびブラジル天疱瘡からなるグループから選択された種々の天疱瘡である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、乾癬である請求項14に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である請求項14に記載の方法。
- 前記患者が、後天性免疫不全症候群(AIDS)を有する請求項13に記載の方法。
- 前記患者が、生物器官、組織、または細胞の移植を受けている請求項13に記載の方法。
- 前記患者が、対宿主性移植片病を有する請求項13に記載の方法。
- IL−15に対する受容体を発現する細胞を除去する方法であって、IL−15Rを標的とする第1の薬剤と、IL−2Rを標的とする第2の薬剤とを含む治療組成物に、該細胞を曝露する工程からなる方法。
- 前記細胞が、免疫系の細胞である請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、悪性細胞である請求項26に記載の細胞。
- 患者が請求項1に記載の治療組成物で治療可能な疾患または状態を有すると診断する方法であって、該患者から得た生体試料がIL−15および抗原性タグからなるポリペプチドによって結合している細胞を含有しているかどうかを判定する工程からなり、該結合の発生が、該細胞がインビボでIL−15Rを標的とする薬剤によって結合可能であり、それによりインビボで野生型IL−15に応答して増殖を阻害可能であることを示唆している方法。
- それぞれがT細胞死を促進する2種以上の薬剤を含む、医薬として許容される組成物。
- T細胞増殖を阻害する薬剤をさらに含む、請求項30に記載の薬剤組成物。
- 細胞溶解性IL−2/Fc分子、IL−15受容体に拮抗する変異IL−15分子、およびラパマイシンからなる請求項31に記載の薬剤組成物。
- T細胞死を促進する少なくとも1種の薬剤と、T細胞増殖を阻害する少なくとも1種の薬剤とを含む、医薬として許容される組成物。
- 前記T細胞死が、AICD(活性化誘導細胞死)、受動的細胞死、ADCC(抗体依存性細胞媒介細胞障害)、またはCDC(補体依存性細胞障害)である請求項32に記載の薬剤組成物。
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