JP2004525076A5

JP2004525076A5 -

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Publication number: JP2004525076A5
Application number: JP2002527247A
Authority: JP
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2008-11-06

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】インターロイキン−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）を標的とする第１の薬剤と、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を標的とする第２の薬剤とを含む治療組成物。
【請求項２】前記第１の薬剤が、ＩＬ−１５Ｒのサブユニットに結合する実質的に純粋な変異ＩＬ−１５ポリペプチドからなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項３】前記サブユニットがＩＬ−１５Ｒαサブユニットである請求項２に記載の治療組成物。
【請求項４】前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号４の１５６位に変異を有する請求項３に記載の治療組成物。
【請求項５】前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドがさらに、配列番号４の１４９位に変異を有する請求項４に記載の治療組成物。
【請求項６】配列番号４の１５６位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項４に記載の治療組成物。
【請求項７】配列番号４の１４９位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項５に記載の治療組成物。
【請求項８】前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号４の１４９位および１５６位にグルタミンをアスパラギン酸に代える置換を有する請求項５に記載の治療組成物。
【請求項９】前記第１の薬剤がさらに、ＩＬ−１５Ｒを有する細胞の除去をもたらす部分からなる請求項２に記載の治療組成物。
【請求項１０】ＩＬ−１５Ｒを有する細胞を溶解する前記部分が、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である請求項９に記載の治療組成物。
【請求項１１】前記第１の薬剤が、実質的に純粋な抗ＩＬ−１５Ｒ抗体からなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１２】前記第２の薬剤が、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに特異的に結合する抗体からなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１３】ＩＬ−１５に対する受容体を発現する細胞を除去する方法であって、ＩＬ−１５Ｒを標的とする第１の薬剤と、ＩＬ−２Ｒを標的とする第２の薬剤とを含む治療組成物に、該細胞を曝露する工程からなる方法。
【請求項１４】前記細胞が、免疫系の細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記細胞が、悪性細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】患者が請求項１に記載の治療組成物で治療可能な疾患または状態を有すると診断する方法であって、該患者から得た生体試料がＩＬ−１５および抗原性タグからなるポリペプチドによって結合している細胞を含有しているかどうかを判定する工程からなり、該結合の発生が、該細胞がインビボでＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤によって結合可能であり、それによりインビボで野生型ＩＬ−１５に応答して増殖を阻害可能であることを示唆している方法。
【請求項１７】それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤を含む、医薬として許容される組成物。
【請求項１８】Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤をさらに含む、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子、ＩＬ−１５受容体に拮抗する変異ＩＬ−１５分子、およびラパマイシンからなる請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】Ｔ細胞死を促進する少なくとも１種の薬剤と、Ｔ細胞増殖を阻害する少なくとも１種の薬剤とを含む、医薬として許容される組成物。
【請求項２１】前記Ｔ細胞死が、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）、受動的細胞死、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞障害）、またはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）である請求項３２に記載の薬剤組成物。

野生型ＩＬ−１５に類似の親和性でＩＬ−１５受容体複合体に結合するが、完全にはシグナル伝達を活性化しない変異ＩＬ−１５ポリペプチドがすでに産生されている。この変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドと有効に競合し、ＩＬ−１５シグナル伝達に応答して通常起こる１つまたは複数の事象、たとえば細胞増殖などを阻害し得る。本明細書では、「野生型ＩＬ−１５ポリペプチド」は、天然ＩＬ−１５（たとえば、図２に示す野生型ＩＬ−１５ポリペプチド）と同一のポリペプチドである。対照的に、「変異ＩＬ−１５ポリペプチド」は、野生型ＩＬ−１５と比較して少なくとも１つの変異を有し、野生型ＩＬ−１５によって通常促進される少なくとも１つのインビボまたはインビトロの活性を阻害するポリペプチドである。

本発明の変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９６％、９７％、９８％、または９９％）、野生型ＩＬ−１５と同一であり得る。変異は、アミノ酸残基の数または含量の変化からなる。たとえば、変異ＩＬ−１５は、野生型ＩＬ−１５より多いかまたは少ない数のアミノ酸残基を有することが可能である。あるいは、または上記に加えて、この変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み得る。変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、単一アミノ酸残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、たとえば１５６位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型ＩＬ−１５と異なり得る。同様に、変異ポリペプチドは、２つのアミノ酸残基、たとえば１５６位および１４９位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型と異なり得る。たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、１５６位
および１４９位の残基でグルタミンの代わりにアスパラギン酸を置換するぶんだけ（図１に示したとおり）、野生型ＩＬ−１５と異なり得る。標的化剤として有用な変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５と同様に、ＩＬ−１５Ｒの成分を認識し、結合する。１実施形態において、ＩＬ−１５の変異は、ＩＬ−２Ｒγ（ＩＬ−２受容体サブユニット）に結合すると考えられているサイトカインのカルボキシ末端ドメインである。別法として、または上記に加えて、変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβ（ＩＬ−２受容体βサブユニット）結合ドメイン内に１つまたは複数の変異を含み得る。

プラスミドＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５を構築するために、成熟ＩＬ−１５タンパク質をコードする３２２ｂｐｃＤＮＡフラグメントを、合成オリゴヌクレオチド［センス５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号５、ＥｃｏＲＩ部位（下線）＋塩基１４５〜１６２）、アンチセンス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号６、ＢａｍＨＩ部位（下線）＋塩基４７２〜４８９）］を用いるＰＣＲによって増幅した。テンプレートＤＮＡは、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣから得た。このＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒｅｔａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒｅｔａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）に記載のとおり、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドに入れてクローニングした。ｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドのバックボーンは、ＦＬＡＧおよびＨＭＫ認識ペプチド配列をコードする配列をインフレームに含有する（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒｅｔａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒｅｔａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）。

ＩＬ−１５Ｒを標的とする変異ＩＬ−１５ポリペプチド
変異ＩＬ−１５の遺伝子構築物
２重変異（Ｑ１４９Ｄ、Ｑ１５６Ｄ）を有するヒトＩＬ−１５タンパク質を、ＩＬ−２Ｒγサブユニットに対する結合に重要な推定部位を標的とするように設計した。１４９位および１５６位の極性であるが電荷は持たないグルタミン残基を、ＰＣＲ補助変異誘発を利用して、アスパラギン酸の産生残基に変異させた。ＩＬ−１５の２重変異体をコードするｃＤＮＡを、合成センス・オリゴヌクレオチド［５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号５）、ＥｃｏＲＩ部位（下線のヘキサマー）＋塩基１４５〜１６２］、および合成アンチセンスオリゴヌクレオチド［５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴ−ＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’（配列番号７）、ＢａｍＨＩ部位（下線へ基サマー）＋塩基４７２〜４８９、変異塩基は一重下線で示す］を用いるＰＣＲによって増幅した。テンプレートは、ヒトＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドであった。記載のとおり、増幅したフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＲＩで消化したｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドにク
ローニングした（ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒｅｔａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９８９年）。１５６位残基における変異の存在はＳａｌＩを用いた消化によって確認され、この変異は新たなＳａｌＩ制限部位を導入する。さらに、変異を標準的な技術に従って、ＤＮＡシークエンシングによって実証した。ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５野生型タンパク質に関して上述したとおり、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５（Ｑ１４９Ｄ、Ｑ１５６Ｄ）２重変異タンパク質を産生し、精製して、シークエンシングによって確認した。

【図１】
変異ＩＬ−１５核酸配列（配列番号１）と、予想されるアミノ酸配列（配列番号２）とを表示する図である。１４９位でグルタミンをコードする野生型コドンＣＡＧ、および１５６位でグルタミンをコードする野生型コドンＣＡＡが、いずれもアスパラギン酸をコードするＧＡＣに変更されている（これらの位置（１４９および１５６）はそれぞれ、４８個のアミノ酸シグナル配列を欠損する成熟ＩＬ−１５ポリペプチドの１０１位および１０８位に相当する。

【図２】
野生型ＩＬ−１５核酸配列（配列番号３）と、予想されるアミノ酸配列（配列番号４）とを表示する図である。