ES2470772T3 - Moléculas de fusión y variantes de IL-15 - Google Patents

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Abstract

Una variante interleuquina 15 humana (hIL-15) aislada que comprende una sustitución de aminoácido de N a D en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde la variante de hIL-15 funciona como un agonista IL- 15 y tiene un incremento de la actividad de unión para los receptores de cadena beta/gamma del receptor de interleuquina 15 (IL-15RßγC) en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

Description

Mol�culas de fusión y variantes de IL-15
Antecedentes de la invención
Los Receptores de Células T (TCR) son efectores primarios del sistema inmunitario que tienen ventajas únicas como plataforma para desarrollar agentes terapéuticos. Si bien los agentes terapéuticos de anticuerpos se limitan al reconocimiento de pat�genos en la sangre y los espacios extracelulares o a dianas proteicas sobre la superficie de la célula, los receptores de células T pueden reconocer ant�genos presentados con moléculas del MHC sobre las superficies de las células (incluyendo ant�genos derivados de proteínas intracelulares). Dependiendo del subtipo de células T que reconocen el ant�geno presentado y se activan, los receptores de células T y las células T que albergan los receptores de células T pueden participar en el control de diversas respuestas inmunitarias. Por ejemplo, las células T est�n implicadas en la regulaci�n de la respuesta inmunitaria humoral a través de la inducción de la diferenciación de las células B a células productoras de anticuerpos. Además, las células T activadas actúan iniciando las respuestas inmunitarias mediadas por células. De este modo, los receptores de células T pueden reconocer dianas adicionales no disponibles para los anticuerpos.
Las células T son un subgrupo de células que junto con otros tipos de células inmunitarias (células polimorfonucleares, eosin�filos, bas�filos, mastocitos, células B y NK) constituyen el componente celular del sistema inmunitario. En condiciones fisiológicas, las células T funcionan en la vigilancia inmunitaria y en la eliminación de ant�genos foráneos. Sin embargo, en condiciones patológicas existe una evidencia convincente de que las células T juegan un papel principal en la causalidad y la propagación de enfermedades. En estos trastornos, el desmoronamiento de la tolerancia inmunol�gica de las células T, ya sea central o periférica es un proceso fundamental en la causalidad de la enfermedad inmunitaria.
Se cree que los TCR juegan un papel importante en el desarrollo y la función del sistema inmunitario. Por ejemplo, se ha informado de que los TCR median la destrucción celular, incrementan la proliferaci�n de las células B, e impactan en el desarrollo y la gravedad de diferentes trastornos incluyendo cáncer, alergias, infecciones virales y trastornos autoinmunitarios.
Por lo tanto sería deseable proporcionar agentes de direccionamiento novedosos basados en los receptores de las células T, as� como métodos para producir y utilizar tales agentes para marcos terapéuticos y diagnósticos. Por consiguiente, sería particularmente deseable proporcionar moléculas que tuvieran ciertas ventajas en comparación con los complejos de la técnica anterior basados en el direccionamiento de anticuerpos.
Por otra parte, es deseable utilizar los TCR para dirigir las diferentes moléculas efectoras al sito de la enfermedad donde pueden proporcionar beneficio terapéutico sin los efectos secundarios asociados con la actividad sist�mica no dirigida. Uno de ellos es la IL-15, un miembro de la familia de linfoquinas de cuatro haces de hélices alfa. La IL-15 juega un papel multifac�tico en el desarrollo y el control del sistema inmunitario. Más específicamente, la IL-15 influye en la función, el desarrollo, la supervivencia, y la proliferaci�n de las células T CD8+, las células NK, las células T asesinas, las células B, los linfocitos intraepiteliales intestinales (LIE) y las células presentadoras de ant�genos (CPA). Se ha demostrado que los ratones transg�nicos tanto IL-15-/-, como IL-15Ra-/-carecen de poblaciones de células T NK periféricas y asesinas, ciertos subgrupos de LIE, y la mayor parte de células T CD8+ de fenotipo de memoria, sugiriendo que la IL-15 juega un papel en el desarrollo, la proliferaci�n o/y la supervivencia de estos tipos de células. El receptor (R) de IL-15 consiste en tres polip�ptidos, el IL-15R alfa de tipo específico ("IL15Rα" o "IL-15Ra"), el IL-2/IL-15R beta ("IL-2Rβ" o "IL-15Rb"), y la cadena gamma común ("γC," o "gC" que es compartida por múltiples receptores de citoquinas).
La se�alizaci�n de IL-15 se puede producir a través del complejo heterotrim�rico de IL-15Rα, IL-2Rβ y γC; a través del complejo heterodim�rico de IL-2Rβ y γC. Un mecanismo novedoso de acción de la IL-15 es el de la transpresentaci�n en la que la IL-15 y el IL-15Rα son expresados de manera coordinada por las células presentadoras de ant�genos (monocitos y células dendr�ticas), y la IL-15 unida al IL-15Rα se presenta en trans a las células T Nk o CD8 próximas que expresan solamente el receptor IL-15RβγC. En cuanto al evento co-estimulador que se produce en la sinapsis inmunol�gica, la transpresentaci�n de IL-15 parece ser ahora un mecanismo dominante para la acción de IL-15 in vivo y parece jugar un papel principal en la inmunovigilancia tumoral (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601). Se ha demostrado que las subunidades de IL-2Rα soluble, que inducen isoformas que contienen una deleci�n del ex�n 3 y el denominado dominio "sushi" en el extremo N, portan la mayor parte de los elementos estructurales responsables de la unión de las citoquinas. Mientras IL-2Rα solo es un receptor de baja afinidad para la IL-2 (Kd _10 nM), IL-15Rα se une a IL-15 con una afinidad elevada (Kd_ 100 pM). De este modo el IL-2Rα soluble y la IL-15 son capaces de formar complejos heterodim�ricos estables en disolución y estos complejos son capaces de modular (esto es estimular o bloquear) las respuestas inmunitarias a través del complejo de IL-15R de afinidad elevada o intermedia (Mortier et al. 2006. J Biol Chem 281: 1612-1619; Stoklasek et al. 2006. J Immunol 177: 6072-6080; Rubinstein et al. 2006. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 9166-9171).
El documento US 2004/253587 A1 describe antagonistas de interleuquina-15 de mamífero y mute�nas de IL-15 y
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mol�culas de IL-15 modificadas que son capaces de unirse a la subunidad IL-15Rα y que son incapaces de transducir una señal a través de las subunidades β o γ del complejo receptor de IL-15.
El documento WO 2006/063974 A2 describe una composición que comprende una matriz antig�nica ordenada y repetitiva, en donde el ant�geno es una proteína IL-15, una mute�na de IL-15 o un fragmento de IL-15.
La entrada de la base de datos que tiene el N�m. de acceso de la base de datos 097687, procedente del Número de acceso EBI UniProt: 097687 describe la secuencia de amino�cidos de Felis silvestris catus. (1 de Mayo, 1999).
La entrada de la base de datos que tiene el N�m. de acceso de la base de datos Q8SPY0, procedente del Número de acceso EBI UniProt: Q8SPY0 describe la secuencia de 128 amino�cidos de la interleuquina-15 de Canis familiaris. (1 Junio, 2002)
La entrada de la base de datos que tiene el N�m. de acceso de la base de datos Q6B4I6, procedente del N�m. de acceso EBI UniProt: Q6B4I6 describe la secuencia de 162 amino�cidos de la interleuquina-15 de Equus caballus. (13 Septiembre, 2004)
Dados los efectos conocidos de la IL-15 sobre el sistema inmunitario, se han explorado numerosos enfoques basados en IL-15 para manipular el sistema inmunitario en beneficio de los anfitriones. Si bien la administración de IL-15 se ha empleado para reforzar las respuestas inmunitarias o aumentar la reconstitución del sistema inmunitario, el bloqueo de la actividad de IL-15 puede inhibir las respuestas autoinunitarias y otras respuestas inmunitarias no deseadas (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601). De hecho, una de las limitaciones con el tratamiento sist�mico con IL-15 es la posible inducción de enfermedades autoinmunitarias. Otras limitaciones incluyen la dificultad para producir esta citoquina en sistemas de expresión de células de mamífero convencionales as� como su vida media muy corta in vivo. Por lo tanto, existe la necesidad de generar una forma terapéutica inmunoestimuladora adecuada de IL-15 que presente una vida media in vivo más prolongada, un aumento de la actividad de unión a células inmunitarias, o un incremento de la bioactividad. Adicionalmente existe la necesidad de antagonistas de IL-15 eficaces. En teoría sería deseable que tales moléculas fueran dirigidas selectivamente al lugar de la enfermedad para evitar toxicidades sist�micas no deseadas y proporcionar un beneficio terapéutico más eficaz.
Compendio de la invención
La presente descripción proporciona numerosas variantes de IL-15 y complejos de proteínas de fusión solubles que tienen uso terapéutico y métodos para elaborar tales proteínas.
Las variantes de IL-15 y los complejos solubles descritos en la presente memoria tienen una utilidad terapéutica potencial.
Por consiguiente, la invención proporciona:
una variante de interleuquina 15 humana aislada (hIL-15) que comprende una sustitución de amino�cidos de N a D en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde la variante de hIL15 funciona como un agonista de IL-15 y tiene una mayor actividad de unión a la cadena beta/gamma del receptor de interleuquina 15 (receptores IL-15RβγC) en comparación con el polip�ptido de IL-15 nativo;
una variante de interleuquina 15 humana aislada (hIL-15) que comprende una sustitución de amino�cido de N a R en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde la variante de hIL-15 funciona como un antagonista de IL-15 y tiene una menor actividad de unión a los receptores IL-15RβγC en comparación con el polip�ptido de IL-15 nativo;
una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IL-15 del apartado 1 o 2;
un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico del apartado 3;
una célula anfitriona que comprende el vector del apartado 4;
un método para producir la variante de IL-15 del apartado 1 o 2, comprendiendo el método: cultivar la célula anfitriona del apartado 5 en condiciones suficientes para expresar la variante de IL-15; produciendo de ese modo la variante de IL-15;
el método del apartado 6, que comprende adicionalmente la purificación de la variante de IL-15;
una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 1 para su uso en un método de estimulaci�n de respuestas inmunitarias en un mamífero; y
una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 2 para su uso en un método de supresión de las respuestas inmunitarias en un mamífero.
En un aspecto, la invención proporciona una variante de IL-15 (también referida en la presente memoria como IL-15
mutante) que tiene una secuencia de amino�cidos diferente de la de la proteína IL-15 nativa (o de tipo salvaje) y que se une al polip�ptido de IL-15Ra y funciona como un agonista o un antagonista de IL-15. Las realizaciones de la invención proporcionan una variante de IL-15 como una proteína no de fusión que comprende un polip�ptido biol�gicamente activo descrito anteriormente, en donde la variante de IL-15 se utiliza en lugar del dominio de IL-15.
En una realización de los aspectos descritos anteriormente, la invención ofrece una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IL-15 de cualquiera de los aspectos o realizaciones descritos en la presente memoria.
En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente un promotor, una señal de inicio de la traducción, y una secuencia líder conectada operablemente a la secuencia que codifica la proteína de fusión o la variante de IL-15. En otra realización, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente est� contenida en un vector de ADN.
En otro aspecto, la invención ofrece un método para elaborar una variante de IL-15 de los aspectos descritos anteriormente, comprendiendo el método la introducción en una célula anfitriona de un vector de ADN de los aspectos y realizaciones descritos anteriormente que codifica una variante de IL-15, el cultivo de la célula anfitriona en un medio en condiciones suficientes para expresar la variante de IL-15 en la célula o el medio, la purificación de la variante de IL-15 de las células anfitrionas o el medio.
Adicionalmente se describe un método para destruir una célula diana, comprendiendo el método el contacto de una pluralidad de células con una variante de IL-15 de cualquiera de los aspectos o realizaciones descritos anteriormente, en donde la pluralidad de células comprende adicionalmente células inmunitarias que portan las cadenas de IL-15R reconocidas por el dominio de IL-15 de los aspectos descritos anteriormente y las células diana que portan un ant�geno reconocido por al menos uno de los polip�ptidos biol�gicamente activos de los aspectos descritos anteriormente, la formación de un complejo de unión específico (puente) entre el ant�geno sobre las células diana y las cadenas de IL-15R sobre las células inmunitarias suficiente para unir y activar las células inmunitarias, y la destrucción de las células diana por las células inmunitarias activadas unidas.
En una realización del método, las células diana son células tumorales o células infectadas viralmente.
En otra realización del método, el polip�ptido biol�gicamente activo comprende un TCR.
En otra realización más del método, el ant�geno sobre las células diana comprende un ant�geno pept�dico tumoral o codificado viralmente presentado en una molécula del MHC o HLA y reconocido por el TCR.
En una realización adicional del método, las células inmunitarias son células T, células LAK o células NK.
Adicionalmente se proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad en un paciente en el que las células enfermas expresan un ant�geno asociado con la enfermedad, comprendiendo el método la administración al paciente de una variante de IL-15 de cualquiera de los aspectos o realizaciones descritos anteriormente, que comprende un polip�ptido biol�gicamente activo que reconoce un ant�geno asociado con la enfermedad que forma un complejo de unión específico (puente) entre las células enfermas que expresan el ant�geno y las células inmunitarias que expresan IL-15R suficiente para localizar las células inmunitarias, y la lesión o destrucción de las células enfermas suficiente para prevenir o tratar la enfermedad en el paciente.
Adicionalmente se describe un método para prevenir o tratar una enfermedad en un paciente en el cual las células del paciente expresan un ant�geno asociado con la enfermedad, comprendiendo el método la administración al paciente de una variante de IL-15 de cualquiera de los aspectos o realizaciones descritos anteriormente, que comprende un polip�ptido biol�gicamente activo que reconoce un ant�geno asociado con la enfermedad sobre las células del paciente, la localización de la variante de IL-15 sobre las células del paciente en donde el dominio de IL15 de la variante de IL-15 se une a las células inmunitarias que portan las cadenas de IL-15R y la supresión de la respuesta inmunitaria de las células inmunitarias.
En una realización del método, la enfermedad es un cáncer o una infección viral.
En otra realización del método, la enfermedad es un trastorno inmunitario, una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno inflamatorio.
En otra realización del método, el ant�geno asociado con la enfermedad es un complejo de p�ptido/MHC.
En otra realización, la invención ofrece una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 1 para su uso en un método para estimular respuestas inmunitarias en un mamífero.
En otra realización, la invención ofrece una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 2 para su uso en un método de supresión de las respuestas inmunitarias en un mamífero.
Descripci�n de los dibujos
La Figura 1 (A y B) es un dibujo esquemático. (A) es un esquema que representa un ejemplo de un
complejo de una proteína de fusión que contiene polip�ptidos de TCR de cadena sencilla. (B) es un esquema que representa constructos representativos de proteínas de fusión que comprende el complejo de la proteína de fusión.
La Figura 2 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa de del vector de expresión de pNEF38-c264scTCR/huIL15. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15 y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15, incluyendo la secuencia líder.
La Figura 3 (A - C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38c264scTCR-bisagra-huIL15. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15 y
(C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15, incluyendo la secuencia líder.
La Figura 4 (A - C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15RαΔE3 y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαΔE3, incluyendo la secuencia líder.
La Figura 5 (A - C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38c264scTCR/huIL15RaSushi. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15RαSushi y
(C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαSushi, incluyendo la secuencia líder.
La Figura 6 (A - C) consiste en tres paneles. (A) representa el vector de expresión de pNEF38-c264scTCR-bisagra-huIL15RaSushi. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15RaSushi y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15RαSushi, incluyendo la secuencia líder.
La Figura 7 es un mapa del vector de expresión de pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi.
La Figura 8 es un mapa del vector de expresión de pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3.
La Figura 9 (A y B) expone la caracterización de células transfectadas que expresan la proteína de fusión de TCR/IL15Rα. (A) son dos gráficos que muestran el análisis citom�trico de flujo de células que expresan la proteína de fusión. (B) es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA basado en TCR para la producción de la proteína de fusión.
La Figura 10 (A y B) muestra el análisis de las proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα por medio de SDS PAGE reductora. (A) muestra los sobrenadantes de cultivo celular que contienen c264scTCR/huIL15 o c264scTCR/huIL15RaSushi. (B) muestra los sobrenadantes de cultivo celular que contienen c264scTCR/huIL15 o c264scTCR/huIL15RαΔE3.
La Figura 11 (A - C) muestra el análisis de TCR/IL15, TCR/IL15Ra y complejos de proteínas de fusión mediante cromatograf�a de exclusión por tamaños. (A) es un gráfico que muestra el perfil de cromatograf�a SEC de c264scTCR/huIL15. (B) es un gráfico que muestra el perfil de cromatograf�a SEC de c264scTCR/huIL15RαSushi. (C) es un gráfico que muestra el perfil de cromatograf�a SEC del complejo de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi.
La Figura 12 (A y B) es un análisis de TCR/IL15Rα y complejos de proteínas de fusión mediante cromatograf�a de exclusión por tamaños. (A) es un gráfico que ilustra el perfil de cromatograf�a SEC de c264scTCR/huIL15RαΔE3. (B) es un gráfico que ilustra el perfil de cromatograf�a SEC del complejo de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαΔE3.
La Figura 13 es un gráfico que muestra la unión de TCR/IL15, TCR/IL15Rα y complejos de proteínas de fusión a complejos de p�ptido/MHC presentados sobre las células, según se determina mediante citometr�a de flujo.
La Figura 14 (A-D) consiste en cuatro paneles. (A) muestra la secuencia de la proteína IL15 humana madura (SEQ ID NO: 1) y los residuos subrayados en color azul est�n sustituidos en las variantes de IL-15 como se muestra en la Tabla 1. (B) muestra los vectores de expresión pNEF38-c264scTCR-bisagrahuIL15D8A y pNEF38-c264scTCR-bisagra-huIL15D8N. (C) muestra la secuencia de los genes pNEF38c264scTCR-bisagra-huIL15D8A y pNEF38-c264scTCR-bisagra-huIL15D8N y (D) muestra la secuencia de la proteína de fusión de pNEF38-c264scTCR-bisagra-huIL15D8A y pNEF38-c264scTCR-bisagrahuIL15D8N, incluyendo la secuencia líder. Los nucleótidos subrayados se cambiaron para generar las variantes de IL-15 indicadas.
La Figura 15 es un gráfico que muestra el análisis de citometr�a de flujo de células CTLL2 portadoras de IL15R teñidas con las proteínas y los complejos de fusión seguido del reactivo de p�ptido/MHC específico de TCR.
La Figura 16 (A - C) son gráficos que muestran la unión de complejos de proteínas de fusión dim�ricas de TCR/IL15RaSushi y TCR/IL15, que comprende formas nativas y variantes de IL15, a complejos de p�ptido cognado/MHC que se presentan en células cargadas con el p�ptido, como se determina mediante citometr�a de flujo. También se muestra la unión de fondo de los complejos de proteínas de fusión dim�ricas en las células sin p�ptido cargado (A) es un gráfico que muestra la unión de los complejos dim�ricos de TCR/IL15RαSushi y TCR/IL15wt (forma nativa), o variantes de TCR/IL15D8N o TCR/IL15D8A a complejos de p�ptido cognado/MHC que se presentan en las células. (B) es un gráfico que muestra la ligera unión de fondo de complejos dim�ricos de TCR/IL15RαSushi y TCR/IL15wt (forma nativa) a las células sin p�ptido cargado. No se observ� unión de fondo de complejos dim�ricos de TCR/IL15RαSushi y variantes de TCR/IL15D8N o TCR/IL15D8A a las células no cargadas. (C) es un gráfico que muestra el análisis de citometr�a de flujo de células 32Dβ que portan IL-15RβγC teñidas con complejos d�meros de TCR/IL15RαSushi y TCR/IL15wt (forma nativa), o variantes de TCR/IL15N72D, TCR/IL15D8N o TCR/IL15D8A. Se observ� el aumento de la unión a IL-15RβγC del complejo que contenía TCR/IL15N72D y la disminución de la unión a IL-15RβγC de los complejos que contenían TCR/IL15D8N o TCR/IL15D8A.
La Figura 17 (A y B) son gráficos que muestran las actividades de unión de proteínas de fusión de TCR/IL15, antagonistas, y agonistas de tipo amplio a complejos de p�ptidos cognados/MHC e IL15Rα según se determina mediante ELISA. (A) es el análisis que muestra la actividad de unión de las proteínas de fusión a complejos de p�ptidos cognados/MHC. (B) es el análisis que muestra la actividad de unión de las proteínas de fusión a IL15Rα.
La Figura 18 es un gráfico que muestra las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión que apoyan el crecimiento de células que portan IL15R como se determina mediante un análisis de proliferaci�n celular.
La Figura 19 (A - C) son gráficos que muestran la capacidad de las proteínas de fusión de TCR/IL-15 que comprenden variantes de IL-15 para inhibir o aumentar el crecimiento de células que portan IL15R, como se determina mediante un análisis de proliferaci�n celular. (A) es un gráfico que muestra la actividad de las proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 para inhibir la proliferaci�n de células CTLL-2 que portan IL15R (complejo receptor αβγ) de alta afinidad. (B) es un gráfico que muestra la actividad de las proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 para inhibir o potenciar la proliferaci�n células 32Dβ que portan IL15R (complejo receptor βγ) de baja afinidad. (C) es un gráfico que muestra la actividad de las proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 para bloquear la proliferaci�n estimulada por TCR/IL15wt de células CTLL-2 que portan IL15R de alta afinidad (complejo receptor αβγ).
La Figura 20 representa los efectos de la incubaci�n in vitro de células de NK con complejos de proteínas de fusión dim�ricas de TCR/IL15RαSushi y TCR/IL15 sobre la supervivencia de xenoinjertos de ratones carentes de sistema inmunitario portadores de tumores. A los ratones carentes de sistema inmunitario atómicos se les inyectaron células NSCLC A549-A2 humanas para permitir el establecimiento de metástasis de pulmón. Las células NK purificadas aisladas de bazos de ratones donantes alog�nicos se incubaron in vitro con rhIL-2, MART1scTCR-IL2, c264scTCR-IL2 o c264scTCR-IL15/c264scTCR-IL15Rα y se transfirieron adoptivamente a los ratones portadores de tumores que habían sido pretratados con ciclofosfamida (CTX), como se indica en la leyenda de la figura. Se trazó el porcentaje de supervivencia después del tratamiento.
La Figura 21 expone la Tabla 1 que muestra las sustituciones de amino�cidos en las variantes de IL-15 y los efectos de estos cambios sobre la actividad de IL-15.
Las Figuras 22A-B exponen la secuencia de amino�cidos de la IL-15 (SEC ID NO: 1) y la secuencia de ácido nucleico de IL-15 (SEC ID NO: 2), respectivamente.
Descripci�n detallada de la invención
Se ha establecido que IL-15 se une de forma estable al dominio extracelular del IL-15Rα y que el complejo resultante es capaz de modular (es decir, estimular o bloquear) las respuestas inmunitarias a través del complejo de IL-15R de afinidad intermedia o elevada (1-4). Además, se ha demostrado que el TCR de cadena sencilla o los polip�ptidos de anticuerpos se pueden fusionar a las citoquinas y otros dominios efectores inmunitarios y que tales moléculas de fusión biespec�ficas conservan la actividad funcional de ambos dominios de fusión (5-8). Adicionalmente, se ha demostrado que las formas multivalentes del TCR proporcionan una mayor unión a sus ligandos (9).
Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para los términos específicos que se utilizan en la siguiente descripción escrita.
Seg�n se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la forma singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. El término "una molécula de ácido nucleico"
incluye una pluralidad de moléculas de ácido nucleico.
Tal según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "que comprende" signifique que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros elementos. "Que consiste esencialmente en", cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significar� que excluye otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. De este modo, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos en la presente memoria no excluiría contaminantes traza del método de aislamiento y purificación ni portadores farmac�uticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes, y similares. "Que consiste en" significar� que excluye más elementos traza de otros ingredientes y etapas sustanciales del método para la administración de las composiciones de esta invención. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición est�n dentro del alcance de esta invención.
Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un ep�topo específico. El término abarca anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y de cadena sencilla, as� como anticuerpos biespec�ficos.
El término "ant�geno", según se utiliza en la presente memoria representa cualquier sustancia que hace que el sistema inmunitario produzca anticuerpos o respuestas inmunitarias mediadas por células específicas contra ella. Un ant�geno asociado a una enfermedad es cualquier sustancia que est� asociada con cualquier enfermedad.
Se pretende que el término "polip�ptido biol�gicamente activo" según se utiliza en la presente memoria se refiera a una secuencia de amino�cidos tal como una proteína, polip�ptido o p�ptido; un azúcar o polisac�rido; un lípido o un glicol�pido, glicoprote�na, o lipoprote�na que puede producir los efectos deseados comentados en la presente memoria, incluyendo un TCR o un complejo de una proteína de fusión de anticuerpo con actividad de unión al ant�geno.
Se pretende que el término "célula", según se utiliza en la presente memoria incluya cualquier célula primaria procari�tica, eucari�tica o línea celular inmortalizada, cualquier grupo de células tales como, un tejido o un órgano. Preferiblemente las células son de mamífero y particularmente de origen humano, y pueden estar infectadas por uno
o más pat�genos. Una "célula anfitriona" de acuerdo con la invención puede ser una célula transfectada, transformada, transducida o infectada de cualquier origen, incluyendo células procari�ticas, eucari�tica, de mamífero, de ave, de insecto, de planta o bacteriana, o puede ser una célula de cualquier origen que se puede utilizar para propagar un ácido nucleico descrito en la presente memoria.
Se pretende que el término "molécula conjugada", según se utiliza en la presente memoria se refiera un TCR o molécula de anticuerpo y una molécula efectora, normalmente un molécula química o sintetizada unida covalentemente (es decir fusionada) mediante un método químico u otro método adecuado. Si se desea, la molécula conjugada se puede fusionar en uno o varios sitios a través de una secuencia conectora pept�dica o una molécula portadora. Alternativamente, el conector pept�dico o portador se pueden utilizar para ayudar a la construcción de la molécula conjugada. Las moléculas conjugadas específicamente preferidas son toxinas conjugadas o marcas detectables.
Se pretende que el término "molécula efectora" según se utiliza en la presente memoria se refiera a una secuencia de amino�cidos tal como una proteína, polip�ptido o p�ptido; un azúcar o polisac�rido; un lípido o un glicol�pido, glicoprote�na, lipoprote�na o agente químico que puede producir los efectos deseados comentados en la presente memoria, incluyendo un dominio de IL-15, variante de IL-15 o receptor de IL-15 tal como IL-15Rα, IL-2Rβ o γC, o fragmentos funcionales de los mismos.
Los términos "molécula de fusión" y "proteína de fusión" se utilizan indistintamente y se pretende que se refieran a un polip�ptido biol�gicamente activo, normalmente un TCR o anticuerpo y una molécula efectora normalmente una secuencia de proteína o p�ptido unida covalentemente (es decir fusionada) por medio de un método recombinante, químico u otro método adecuado. Si se desea, la molécula de fusión se puede fusionar en uno o varios sitios a través de una secuencia conectora pept�dica. Alternativamente, el conector pept�dico se puede utilizar para ayudar a la construcción de la molécula de fusión. Las moléculas de fusión específicamente preferidas son las proteínas de fusión. Generalmente molécula de fusión también puede estar compuesta de moléculas conjugadas.
Se pretende que el término "célula anfitriona" se refiera a cualquier célula procari�tica o eucari�tica que contenga un vector de clonaci�n o un vector de expresión. Este término también incluye aquellas células procari�ticas o eucari�ticas que se han modificado genéticamente para contener el gen o los genes clonados en el cromosoma o el genoma de la célula anfitriona.
Se pretende que el término "respuesta inmunitaria", según se utiliza en la presente memoria se refiera al proceso mediante el cual las células inmunitarias son estimuladas y reclutadas de la sangre a tejidos linfoides as� como no linfoides a través de un proceso multifactorial que implica distintas etapas de adherencia y activación. Las condiciones de activación causan la liberación de citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas y otros factores, regulan al alza la expresión de las moléculas de adherencia y otras moléculas de activación sobre las células inmunitarias, promueven la adherencia, cambios morfológicos, y/o la extravasaci�n concurrente con quimiotaxis a través de los tejidos, aumentan la proliferaci�n celular y la actividad citot�xica, estimulan la presentación de
ant�genos y proporcionan otros cambios fenot�picos incluyendo la generación de tipos de células de memoria. También se pretende que la respuesta inmunitaria se refiera a la actividad de las células inmunitarias para suprimir o regular la actividad inflamatoria o citot�xica de otras células inmunitarias.
Seg�n se utilizan en la presente memoria, los términos "polinucle�tido" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan indistintamente para referirse a formas polim�ricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucle�tidos pueden contener desoxirribonucle�tidos, ribonucle�tidos, y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucle�tido" incluye, por ejemplo, moléculas helicoidales de hebra sencilla, doble y triple, un gen o fragmento g�nico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, moléculas antisentido, ADNc, polinucle�tidos recombinantes, polinucle�tidos ramificados, apt�meros, pl�smidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Una molécula de ácido nucleico también puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas (p. ej., que comprenden bases modificadas, azúcares, y/o conectores internucleot�dicos).
Se pretende que el término "polip�ptido" se refiera a cualquier pol�mero que consista preferiblemente esencialmente en cualquiera de los 20 amino�cidos naturales, independientemente de su tamaño. Aunque el término "proteína" se utiliza a menudo en referencia a proteínas relativamente grandes, y "p�ptido" se utiliza a menudo en referencia a polip�ptidos pequeños, el uso de estos términos en la materia a menudo se solapa. El término "polip�ptido" se refiere generalmente a proteínas, polip�ptidos, y p�ptidos a no ser que se indique lo contrario. Los p�ptidos útiles de acuerdo con la presente invención, en general, tendrán generalmente entre aproximadamente 0,1 y 100 KD o más hasta aproximadamente 1.000 KD, preferiblemente entre aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 y 50 KD a juzgar por las técnicas convencionales de dimensionamiento de moléculas tales como centrifugaci�n o electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Se pretende que los términos "prevenir", "que previene", "prevención", "tratamiento profiláctico" y similares se refieran a la reducción de la probabilidad de desarrollar un trastorno o afección en un sujeto, que no tiene, pero est� en riesgo de o es susceptible de desarrollar un trastorno o afección.
Se pretende que el término "anticuerpo de cadena sencilla" haga referencia a un anticuerpo basado en un formato de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden consistir en subunidades de anticuerpos de unión mínimas. Los anticuerpos de cadena sencilla se pueden combinar solamente con aquellas regiones de unión al ant�geno de los anticuerpos en una cadena polipept�dica sencilla plegada establemente. Como tales, los anticuerpos de cadena sencilla tienen un tamaño considerablemente menor que las inmunoglobulinas clásicas pero conservan las propiedades de unión específicas del ant�geno de los anticuerpos. Los anticuerpos de cadena sencilla se pueden conectar con una amplia gama de ligandos, por ejemplo moléculas efectoras o productos conjugados de fármacos.
El término "soluble" según se utiliza en la presente memoria significa que la molécula de fusión y concretamente una proteína de fusión no sedimenta fácilmente a una centrifugaci�n de fuerza G baja (p. ej. menos de aproximadamente
30.000 revoluciones por minuto en una centrífuga convencional) en un tampón acuoso, p. ej., medio celular. Adicionalmente, la molécula de fusión es soluble si permanece en disolución acuosa a una temperatura mayor de aproximadamente 5-37�C y a un pH neutro o próximo al neutro en presencia de una concentración baja o nula de un detergente ani�nico o no iónico. En estas condiciones, una proteína soluble tendr� a menudo un valor de sedimentación bajo p. ej., menos de aproximadamente 10 a 50 unidades svedberg.
Las disoluciones acuosas referidas en la presente memoria tienen típicamente un compuesto tamponador para establecer un pH, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5-9, y un intervalo de fuerza iónica entre aproximadamente 2 mM y 500 mM. En ocasiones se añade un detergente no iónico suave inhibidor de la proteasa. Adicionalmente, se puede añadir si se desea una proteína portadora tal como albúmina de suero bovino (BSA) a unos pocos mg/ml. Los tampones acuosos ilustrativos incluyen solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con tris, u otros tampones y formulaciones de medios celulares conocidos.
Se pretende que el término "estimular" o "que estimula" haga referencia a incrementar, amplificar, aumentar, reforzar una respuesta inmunitaria. La estimulaci�n puede ser una alteración positiva. Un incremento ilustrativo puede ser p. ej., de 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, o incluso 90-100%. Otros incrementos ilustrativos incluyen 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 40 veces, o incluso 100.
Se pretende que el término "suprimir" o "que suprime" haga referencia a reducir, atenuar, disminuir, detener, o estabilizar una respuesta inmunitaria. La supresión puede ser una alteración negativa. Una reducción ilustrativa puede ser p. ej., de 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, o incluso 90-100%. Las reducciones ilustrativas incluyen 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 40 veces, o incluso 100 veces.
Se pretende que el término "Receptor de células T" (TCR) haga referencia a polip�ptidos de un complejo de proteínas integrantes de la membrana que participa en la activación de las células T en respuesta a la presentación del ant�geno. Las células T reconocen un p�ptido unido al producto del MHC a través del receptor de células T (TCR) heterodim�rico αβ. El repertorio de TCR tiene una considerable diversidad creada por el mismo mecanismo de reordenamiento g�nico utilizado en los genes de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos [Tonegawa, S.
(1988) Biosci. Rep. 8:3-26]. La mayor parte de la diversidad se genera en las conexiones de las regiones variable (V) y de empalme (J) (o diversidad, D) que codifican la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de las cadenas α y β [Davis and Bjorkman (1988) Nature 334:395-402]. Sin embargo, los TCR no experimentan mutaciones puntuales somáticas como lo hacen los anticuerpos y, quizás no casualmente. Los TCR tampoco experimentan el mismo grado de maduración de la afinidad que los anticuerpos. Los TCR como ocurre en la naturaleza parece que tienen afinidades que oscilan de 105 a 107 M-1 mientras que los anticuerpos tiene típicamente afinidades que oscilan de 105 a 109M M-1 [Davis et al. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16:523-544; Eisen et al. (1996) Adv. Protein Chem. 49:156]. Si bien la ausencia de mutación somática en los TCR puede estar asociada con afinidades inferiores, también se ha señalado que no es una ventaja selectiva para un TCR tener una afinidad más alta. De hecho, los modelos de activación en serie [Valitutti et al. (1995) Nature 375:148-151] y de actividad correctora cinética [Rabinowitz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1401-1405] de activación de células T sugieren ambos que tasas de disociaci�n más extensas (asociadas con una afinidad más alta) serían perjudiciales para el proceso de se�alizaci�n. También es posible que los TCR de afinidad más alta no mantuvieran la especificidad por el p�ptido requerida para las respuestas de la célula T. Por ejemplo, los p�ptidos unidos en la hendidura del MHC despliegan una superficie accesible limitada [Bjorkman, P. J. (1997) Cell 89:167-170], lo que a su vez puede limitar la cantidad de energía que se puede generar en la interacción. Por otro lado, el aumento de la afinidad de un TCR dirigiendo la energía hacia las hélices del MHC conduciría presumiblemente a la deleci�n t�mica durante la selección negativa [Bevan, M. J. (1997) Immunity 7:175-178]. Se pretende que el término "TCR" abarque receptores de células T policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, heterodim�ricos y de cadena sencilla o un fragmento funcional de los mismos, incluyendo la molécula que comprende los dominios Vα y Vβ del TCR. Se pretende que el término "TCR" también abarque los receptores de células T descritos por ejemplo en, la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Titulada "T CELL RECEPTOR FUSIONS AND CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF", presentada el 19 de Marzo de 2008 y en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2003 0144474A1.
El término "vector" es una molécula de ácido nucleico que es capaz de replicarse aut�nomamente en una célula anfitriona y puede aceptar ADN foráneo. Un vector porta su propio origen de replicaci�n, uno o más sitios de reconocimiento únicos para endonucleasas de restricción que se pueden utilizar para la inserción de ADN foráneo, y usualmente marcadores seleccionables tales como genes que codifican resistencia a antibióticos, y a menudo secuencias de reconocimiento (p. ej. promotor) para la expresión del ADN insertado. Los vectores comunes incluyen vectores plasm�dicos y vectores de fagos.
Receptores de células T (TCR)
Las células T son un subgrupo de células que junto con otros tipos de células inmunitarias (polimorfonucleares, eosin�filos, bas�filos, mastocitos, células B, NK), constituyen el componente celular del sistema inmunitario. En condiciones fisiológicas las células T funcionan en la vigilancia inmunol�gica y en la eliminación de ant�genos foráneos. Sin embargo, en condiciones patológicas existen pruebas convincentes de que las células T desempeñan un papel importante en la causa y la propagación de la enfermedad. En estos trastornos, el fallo de la tolerancia inmunol�gica de las células T, ya sea central o periférica es un proceso fundamental en la causa de las enfermedades autoinmunitarias.
El TCR est� compuesto de al menos siete proteínas transmembrana. El heterod�mero unido mediante disulfuro (alfa..beta.) forma la unidad de reconocimiento del ant�geno monot�pico, mientras que las cadenas invariables de CD3, que consisten en �psilon., .gamma., .delta., y .zeta. y .eta., son responsables del acoplamiento del ligando que se une en las rutas de se�alizaci�n que dan como resultado la activación de las células T y de la elaboración de las respuestas inmunitarias celulares. A pesar de la diversidad g�nica de las cadenas de TCR, dos características estructurales son comunes a todas las subunidades conocidas. En primer lugar, son proteínas transmembrana con un solo dominio que atraviesa la membrana, presumiblemente en hélice alfa. En segundo lugar, todas las cadenas de los TCR tienen la característica inusual de poseer un amino�cido cargado dentro del dominio transmembrana pronosticado. Las cadenas invariantes tiene una sola carga negativa, conservada entre ratones y seres humanos, y las cadenas variantes poseen una (TCR-beta) o dos (TCR-alfa) cargas positivas. La secuencia transmembrana del TCR-.alfa. est� altamente conservada en varias especies y de este modo filogen�ticamente pueden cumplir un papel funcional importante. La secuencia octapept�dica que contiene los amino�cido hidrófilos lisina y arginina es idéntica entre las especies.
Una respuesta de las células T es modulada por la unión del ant�geno al TCR. Un tipo de TCR es un heterod�mero unido a membrana que consiste en una cadena α y β que se asemeja a una región variable (V) y constante (C) de inmunglobulina. La cadena α de TCR incluye una cadena V-α y C-α conectadas covalentemente, mientras que la cadena β incluye una cadena V-β conectada covalentemente a una cadena C-β. Las cadenas V-α y V-β forman un bolsillo o hendidura al que se pueden unir un superant�geno o un ant�geno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (conocido en seres humanos como complejo HLA). Véase generalmente Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985); Fundamental Immunology 3a Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. New York (1993).
La invención proporciona un dominio de interleuquina-15 (IL-15) que es una variante de IL-15 (también referida como IL-15 mutante). La variante de IL-15 comprende una secuencia de amino�cidos diferente que la proteína IL-15 nativa (o de tipo salvaje). La variante de IL-15 se une preferiblemente al polip�ptido IL-15Ra y funciona como un agonista
de IL-15. Preferiblemente las variantes de IL-15 con actividad agon�stica tienen una actividad superagon�stica. En algunas realizaciones, la variante de IL-15 puede funciona como un agonista de IL-15 independiente de su asociación con IL-15Ra. Los agonistas de IL-15 son ilustrados por una actividad biológica comparable o aumentada con IL-15 de tipo salvaje.
En algunos ejemplos, la variante de IL-15 se une con una mayor actividad de los receptores IL-15RβγC. En algunas realizaciones, la secuencia de la variante de IL-15 tiene al menos un cambio de amino�cido, p. ej., sustitución o deleci�n, en comparación con la secuencia de IL-2 nativa, dando como resultado tales cambios una actividad agon�stica o antagónica de IL-15. Preferiblemente las sustituciones/deleciones de amino�cidos est�n en los dominios de IL-15 que interact�an con IL-15Rβ y/o γC. Más preferiblemente, las sustituciones/deleciones de amino�cidos no afectan a la unión al polip�ptido de IL-15Ra o la capacidad de producir la variante de IL-15. Las sustituciones/deleciones de amino�cidos apropiadas para generar variantes de IL-15 se pueden identificar sobre la base estructuras de IL-15 supuestas o conocidas, comparaciones de IL-15 con moléculas homólogas tales como IL2 con una estructura conocida, a través de mutag�nesis racional o al azar y análisis funcionales, según se proporciona en la presente memoria, u otros métodos empíricos. Adicionalmente las sustituciones de amino�cidos adecuadas pueden ser cambios e inserciones conservativos o no conservativos de amino�cidos adicionales. Se describen variantes de IL-15 que contienen una o más sustituciones/deleciones un ácido amino en la posición 8, 61, 65, 72, 92, 101 , 108, o 111 de la secuencia de IL-15 humana madura; concretamente, sustituciones D8N ("D8" se refiere a la posición del residuo de amino�cido en la secuencia de la IL-15 humana madura nativa y "N" se refiere al residuo de amino�cido sustituido en esa posición en la variante de IL-15), D8A, D61A , N65A, N72R o Q108A dan como resultado variantes de IL-15 con actividad antagónica y las sustituciones N72D dan como resultado variantes de IL-15 con actividad agon�stica.
La variante de IL-15 de la invención es una proteína no de fusión. Preferiblemente, la forma no de fusión de la variante de IL-15 es una citoquina soluble que funciona como un agonista de IL-15.
En algunas realizaciones, la variante de IL-15 no de fusión forma un complejo con IL-15Ra mientras que en otra realización, actúa de forma independiente de IL-15Ra.
Los polip�ptidos de IL-15 e IL-15RA de la invención corresponden adecuadamente en secuencia de amino�cidos a moléculas de IL-15 e IL-15RA de origen natural, p. ej., moléculas de IL-15 e IL-15RA de ser humano, ratón u otro roedor, u otro mamífero.
Por ejemplo, la proteína se puede modificar mediante la inclusión de secuencias que codifican las secuencias de etiquetas que se pueden modificar, tales como la etiqueta de biotinilaci�n BirA o residuos de amino�cidos con cadenas laterales químicamente reactivas tales como Cys o His. Tales etiquetas de amino�cidos o amino�cidos químicamente reactivos pse puede situar en una variedad de posiciones en la proteína de fusión, preferiblemente distales con respecto al sitio activo del polip�ptido biol�gicamente activo o molécula efectora. Por ejemplo, el extremo C de una proteína de fusión soluble se puede unir covalentemente a una etiqueta u otra proteína fusionada que incluye tales uno o más amino�cidos reactivos. Se pueden incluir cadenas laterales adecuadas para conectar químicamente dos o más proteínas de fusión a un dendr�mero adecuado u otra nanopart�cula para dar una molécula multivalente. Los dendr�meros son pol�meros químicos sintéticos que pueden tener cualquiera de una serie de diferentes grupos funcionales en su superficie (D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101 (1993)). Los dendr�meros ilustrativos para uso de acuerdo con la presente invención incluyen p. ej., dendr�mero de poliamina "starburst" E9 y dendr�mero de poliamina "combust" E9, que pueden conectar residuos de cistina.
�cidos nucleicos y Vectores
�cidos nucleicos
La invención proporciona adicionalmente secuencias de ácido nucleico y en particular secuencias de ADN que codifican las presentes proteínas de fusión. Preferiblemente, la secuencia de ADN es transportada por un vector adecuado para la replicaci�n extracromos�mica tal como un fago, virus, pl�smido, fag�mido, c�smido, YAC, o episoma. En particular, se puede utilizar un vector de ADN que codifica una proteína de fusión deseada para facilitar los métodos preparativos descritos en la presente memoria y obtener cantidades significativas de la proteína de fusión. La secuencia de ADN se puede insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Se puede utilizar una variedad de sistemas de anfitrión-vector para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (p. ej., virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (p. ej., baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteri�fago, ADN plasm�dico
o ADN cosm�dico. Dependiendo del sistema de anfitrión-vector utilizado, se puede emplear cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados. Véanse generalmente Sambrook et al., Supra y Ausubel et al. más arriba.
La homología entre secuencias de nucleótidos se puede determinar mediante análisis de hibridación de ADN, en donde la estabilidad del híbrido de ADN de doble hebra depende del grado de emparejamiento de bases que se
produzca. Las condiciones de alta temperatura y/o de bajo contenido de sal reducen la estabilidad del híbrido, y se pueden variar para evitar la hibridación de las secuencias que tienen menos de un grado seleccionado de homología. Por ejemplo, para las secuencias con aproximadamente 55% de contenido de GC, las condiciones de hibridación y lavado de 40-50�C, 6XSSC (tampón de cloruro de sodio/citrato de sodio) y SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1% indican aproximadamente una homología de aproximadamente 60-70%, las condiciones de hibridación y lavado de 50-65�C, 1XSSC y SDS al 0,1% indican una homología de aproximadamente 82-97%, y las condiciones de hibridación y lavado de 52�C, 0,1XSSC y SDS al 0,1% indican una homología de aproximadamente 99-100%. También se encuentra disponible una amplia gama de programas inform�ticos para comparar secuencias de nucleótidos y de amino�cidos (y medir el grado de homología), y una lista que proporciona fuentes de soporte lógico tanto asequible comercialmente como libre se encuentra en Ausubel et al. (1999). Los algoritmos de comparación de secuencias y alineamiento de secuencias múltiples fácilmente asequibles son, respectivamente, los programas Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1997) y ClustalW. BLAST est� disponible en la red en ncbi.nlm.nih.gov y una versión de ClustalW est� disponible en 2.ebi.ac.uk.
Vectores y Expresión
La selección de vectores adecuados puede realizarse empíricamente basándose en factores relacionados con el protocolo de clonaci�n. Por ejemplo, el vector debe ser compatible con, y tener el replic�n apropiado para el anfitrión que se est� empleando.
Las células anfitrionas adecuadas incluyen células eucari�ticas y procari�ticas, preferiblemente aquellas células que pueden transformarse fácilmente y exhiben un rápido crecimiento en medio de cultivo. Las células anfitrionas específicamente preferidas incluyen procariotas tales como E. coli, Bacillus subtilis, etc. y eucariotas tales como células animales y cepas de levadura, p. ej., S. cerevisiae. Generalmente se prefieren células de mamíferos, particularmente J558, NSO, SP2-O o CHO. Otros anfitriones adecuados incluyen, p. ej., células de insecto tales como Sf9. Se emplean condiciones de cultivo convencionales. Véase Sambrook, más arriba. A continuación se pueden seleccionar las líneas celulares transformadas o transfectadas estables.
Por lo tanto las células anfitrionas incluyen específicamente, células y órganos de levadura, mosca, gusano, planta, rana, mamífero que son capaces de propagar el ácido nucleico que codifica la fusión. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares de mamífero que se pueden utilizar incluyen células CHO dhfr- (Urlaub y Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), células 293 (Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)) o células de mieloma de tipo SP2
o NSO (Galfre y Milstein, Meth. Enzymol, 73 (B): 3 (1981)).
Las células anfitrionas capaces de propagar el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada abarcan células eucariotas no de mamífero, as�, como de insecto (p. ej., Sp. frugiperda), levadura (p. ej., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha; como fue revisado en general por Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5): 486-496 (1992)), células f�ngicas y vegetales. También se contemplan ciertos procariotas tales como E. coli y Bacillus.
El ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada se puede introducir en una célula anfitriona mediante técnicas convencionales para la transfecci�n de células. Se pretende que el término "transfectar" o "transfecci�n" incluya todas las técnicas convencionales para introducir ácido nucleico en células anfitrionas, incluyendo coprecipitaci�n con fosfato de calcio, transfecci�n mediada por DEAE-dextrano, lipofecci�n, electroporaci�n, microinyecci�n, transducci�n y/o integración viral. Los métodos adecuados para transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook et al. más arriba, y en otros libros de texto de laboratorio.
Se pueden utilizar diversos promotores (región reguladora del inicio de la transcripción).
La selección del promotor apropiado depende del anfitrión de expresión propuesto. Los promotores procedentes de fuentes heter�logas se pueden ser utilizar siempre y cuando sean funcionales en el anfitrión seleccionado.
0074] La selección del promotor también depende de la eficacia y del nivel de producción del p�ptido o proteína deseados. A menudo se emplean promotores inducibles tales como TAC con el fin de aumentar drásticamente el nivel de expresión de proteína en E. coli. La expresión en exceso de las proteínas puede ser perjudicial para las células anfitrionas. En consecuencia, el crecimiento de la célula anfitriona puede ser limitado. El uso de sistemas promotores inducibles permite que las células anfitrionas sean cultivadas a densidades aceptables antes de la inducción de la expresión g�nica, facilitando de este modo mayores rendimientos de productos. También se puede utilizar el procesamiento en el anfitrión de expresión. Por ejemplo, los pares de secuencia señal/célula anfitriona adecuados incluyen la secuencia señal sacB de B. subtilis para la secreción en B. subtilis, y la secuencia señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae o Phol de la fosfatasa ácida de P. pastoris para la secreción en P. pastoris.
Los elementos para potenciar la transcripción y la traducción han sido identificados para los sistemas de expresión de proteínas eucari�ticas. Por ejemplo, el posicionamiento del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de 1000 pb en cada lado de un promotor heter�logo puede elevar los niveles de transcripción de 10 a 400 veces en células vegetales. El constructo de expresión también debe incluir las secuencias de inicio de la traducción apropiadas. La modificación del constructo de expresión para incluir una secuencia consenso de Kozak para un
inicio adecuado de la traducción puede aumentar el nivel de traducción 10 veces.
A menudo se emplea un marcador selectivo, que puede ser parte del constructo de expresión o puede estar separado de él (p. ej., transportado por el vector de expresión), de manera que el marcador se pueda integrar en un sitio diferente del gen de interés. Los ejemplos incluyen marcadores que confieren resistencia a los antibióticos (p. ej., bla confiere resistencia a la ampicilina para las células anfitrionas de E. coli, nptII confiere resistencia a la kanamicina a una amplia variedad de células procariotas y eucariotas) o que permiten que el anfitrión crezca en un medio mínimo (p. ej., HIS4 permite que P. pastoris o S. cerevisiae His- crezcan en ausencia de histidina). El marcador seleccionable tiene sus propias regiones reguladoras del inicio y terminación de la transcripción y de la traducción para permitir la expresión independiente del marcador. Si se emplea la resistencia a antibióticos como marcador, la concentración del antibiótico para la selección variar� dependiendo del antibiótico, oscilando generalmente entre 10 y 600 μg de antibiótico/ml de medio.
El constructo de expresión se ensambla mediante el empleo de técnicas de ADN recombinante conocidas (Sambrook et al, 1989; Ausubel et al, 1999). La digestión y ligación con enzimas de restricción son etapas básicas empleadas para unir dos fragmentos de ADN. Los extremos del fragmento de ADN pueden requerir modificación antes de la ligación, y esto se puede conseguir rellenando los salientes, suprimiendo las porciones terminales de los fragmentos con nucleasas (p. ej., ExoIII), mutag�nesis dirigida al sitio, o mediante la adición de nuevos pares de bases por medio de PCR. Se pueden emplear poliligadores y adaptadores para facilitar la unión de los fragmentos seleccionados. El constructo de expresión se ensambla típicamente en fases que emplean rondas de restricción, ligación, y transformación de E. coli. Se conocen en la técnica numerosos vectores de clonaci�n adecuados para la construcción del constructo de expresión (Lambda.ZAP y pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, La Jolla, California, PET, Novagen Inc., Madison, Wis - citado en Ausubel et al, 1999) y la elección concreta no es crítica para la invención. La selección del vector de clonaci�n se ver� influida por el sistema de transferencia g�nica seleccionado para la introducción del constructo de expresión en la célula anfitriona. Al final de cada fase, el constructo resultante se puede analizar mediante análisis de restricción, de la secuencia de ADN, de hibridación y de PCR.
El constructo de expresión se puede transformar en el anfitrión en forma del constructo del vector de clonaci�n, ya sea lineal o circular, o se puede retirar del vector de clonaci�n y utilizar tal cual o introducirlo en un vector de liberación. El vector de liberación facilita la introducción y el mantenimiento del constructo de expresión en el tipo de célula anfitriona seleccionada. El constructo de expresión se introduce en las células anfitrionas mediante cualquiera de una serie de sistemas de transferencia de genes conocidos (p. ej., competencia natural, transformación mediada químicamente, transformación de protoplastos, electroporaci�n, transformación biol�stica, transfecci�n, o conjugación) (Ausubel et al, 1999; Sambrook et al., 1989). El sistema de transferencia g�nica seleccionado depende de las células anfitrionas y de los sistemas vectores utilizados.
Por ejemplo, el constructo de expresión se puede introducir en células de S. cerevisiae mediante transformación de protoplastos o electroporaci�n. La electroporaci�n de S. cerevisiae se lleva a cabo fácilmente, y proporciona eficacias de transformación comparables a la transformación de esferoplastos.
M�todos
Terap�utico
Los ejemplos de las enfermedades que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, neoplasias, incluyendo cáncer, o infecciones virales. Mediante "neoplasia" se quiere significar cualquier enfermedad que es causada por o resulta de niveles inadecuadamente altos de división celular, niveles inadecuadamente bajos de apoptosis, o ambos. Por ejemplo, el cáncer es un ejemplo de una neoplasia. Los ejemplos de c�nceres incluyen, sin limitación, leucemias
(p. ej., leucemia aguda, leucemia linfoc�tica aguda, leucemia mieloc�tica aguda, leucemia mielobl�stica aguda, leucemia promieloc�tica aguda, leucemia mielomonoc�tica aguda, leucemia monoc�tica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mieloc�tica crónica, leucemia linfoc�tica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad no de Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (p. ej., fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteog�nico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pr�stata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudor�para, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncog�nico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma ac�stico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). Se considera que los trastornos linfoproliferativos también son enfermedades proliferativas.
Tambi�n se incluyen métodos de estimulaci�n de la respuesta inmunitaria en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad eficaz de la variante de IL-15 como se describe en la presente memoria.
Tambi�n se describen métodos de supresión de respuestas inmunitarias en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la variante de IL-15 como se describe en la presente memoria. En el caso de la supresión inmunitaria, puede ser particularmente ventajosa una variante de IL-15 que comprende antagonistas de IL15 o dominios IL-15 que carecen de la capacidad para unirse al complejo IL-15βγc.
Tambi�n se pueden utilizar diferentes terapias combinadas, as� como con otros agentes terapéuticos conocidos, tales como fármacos anti-inflamatorios para proporcionar un tratamiento más eficaz de un trastorno. Por ejemplo, se puede utilizar variantes de IL-15 inmunosupresoras combinadas con agentes anti-inflamatorios tales como corticosteroides y fármacos no esteroideos para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y alergias.
Los compuestos de la invención ser�n especialmente útiles para un paciente humano que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección malignos. Los compuestos de la invención ser�n particularmente útiles en la elección como diana de determinados ant�genos tumorales en pacientes humanos. Los ejemplos específicos de las enfermedades que se pueden tratar incluyen c�nceres, p. ej., de mama, de pr�stata, etc., infecciones virales,
p. ej., VHC, VIH, etc., as� como otros trastornos específicos de las afecciones mencionadas en la presente memoria.
Dosificaci�n y administración
La administración de los compuestos de la invención se puede realizar mediante una variedad de rutas adecuadas, incluyendo oral, típica (incluyendo transd�rmica, bucal o sublingual), nasal y parenteral (incluyendo inyección intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intrad�rmica o intramuscular) siendo particularmente preferidas la ruta oral
o parenteral. También se apreciar� que el método preferido de administración y la cantidad de dosificación pueden variar con, p. ej., la afección y la edad del receptor.
Los compuestos de la invención se pueden usar en terapia solos o junto con otros medicamentos tales aquellos con actividad farmacol�gica reconocida para tratar las indicaciones deseadas. Los medicamentos ilustrativos incluyen terapias reconocidas tales como cirugía, radiación, quimioterapia y otras formas de inmunoterapia (p. ej., vacunas, terapias basadas en anticuerpos). Los compuestos de esta invención se pueden administrar antes, durante o después de tales terapias según se requiera.
Si bien uno o más compuestos de la invención se pueden administrar solos, también pueden estar presentes como parte de una composición farmacéutica mezclados con un excipiente convencional, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmac�uticamente aceptables adecuadas para la administración parenteral, oral u otra administración deseada y que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos y no sean perjudiciales para el receptor de los mismos. Las composiciones farmacéuticas de la invención en general comprenden una o más de variante de IL-15 de la invención o constructos de ADN que codifican tales compuestos junto con uno o más portadores aceptables. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Los portadores farmac�uticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido sil�cico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglic�ridos y diglic�ridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroethral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes coadyuvantes, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osm�tica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos.
Para la aplicación parenteral, son particularmente adecuadas las disoluciones, preferiblemente disoluciones oleosas
o acuosas as� como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son dosificaciones unitarias convenientes.
Para la aplicación ent�rica, son particularmente adecuados los comprimidos, grageas o cápsulas que tienen un aglutinante portador de talco y/o carbohidrato o similar, siendo preferiblemente el portador lactosa y/o almidón de maíz y/o almidón de patata. Se puede utilizar un jarabe, elixir o similar en donde se emplea un vehículo edulcorado. Las composiciones de liberación sostenida se pueden formular incluyendo aquellas en las que el componente activo est� protegido con recubrimientos diferencialmente degradables, p. ej., mediante microencapsulaci�n, recubrimientos múltiples, etc.
Los compuestos terapéuticos de la invención también se pueden incorporarse a liposomas. La incorporación se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos de preparación de liposomas conocidos, por ejemplo sonicaci�n y extrusi�n. Los métodos convencionales adecuados de preparación de liposomas también son descritos p. ej., por
A.D. Bangham et al., J. Mol. Biol., 23:238-252 (1965); F. Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, 557:9-23 (1979); F. Szoka et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 75:4194-4198 (1978); S. Kim et al., Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348 (1983); y Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986).
Adicionalmente se describen métodos para invocar una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como un ser humano, incluyendo la vacunación de un mamífero tal como un ser humano contra un agente infeccioso o un trastorno diana, tal como el cáncer.
Estos métodos comprenden administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una secuencia de ADN que comprende un vector de ADN que codifica una variante de IL-15 de la invención. La preparación de los vectores de expresión de las variantes de IL-15 se describe más arriba y en los Ejemplos que siguen. Se ha informado sobre los métodos para la administración del ADN plasm�dico, la absorción de ese ADN por las células del sujeto al que se ha administrado y la expresión de la proteína. V�se Ulmer, J.B., et al, Science (1993) 259:1745-1749.
Los vectores de ADN que codifican las variantes de IL-15 de la invención se administran adecuadamente a un mamífero incluyendo un ser humano, preferiblemente mediante inyección intramuscular. La administración de ADNc al músculo esquel�tico de un mamífero con la absorción subsiguiente del vector de expresión administrado por parte de las células musculares y la expresión de la proteína codificada por el ADN han sido descritas por Ulmer et al. y representan un protocolo ilustrativo [Ulmer, J.B., et al, Science 259:1745-1749]. La dosis óptima para una aplicación terapéutica dada se puede determinar mediante métodos convencionales.
Adem�s del tratamiento de trastornos humanos, las variantes de IL-15 y los constructos de ADN que codifican tales moléculas tendrán un uso significativo para aplicaciones veterinarias, p. ej., tratamiento de trastornos del ganado tal como ganado vacuno, ovejas, etc. y animales domésticos tales como perros y gatos.
Se apreciar� que las cantidades preferidas reales de una variante de IL-15 dada o constructo de ADN que codifica la misma utilizadas en una terapia dada variarán de acuerdo con el compuesto o compuestos activo concretos que se est�n utilizando, las composiciones concretas formuladas, el modo de aplicación, el sitio concreto de administración, el peso del paciente, la salud general, el sexo, etc., la indicación concreta que est� siendo tratada, etc. y otros factores semejantes que son reconocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el m�dico o veterinario a cargo. La tasas de administración óptimas para un protocolo de administración dado pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica usando ensayos de determinación de dosificación convencionales realizados por ejemplo, con respecto a las directrices anteriores y los ensayos descritos en la presente memoria.
Ejemplos
Ejemplo 1 -Diseño de un complejo de proteína de fusión que comprende las proteínas de fusión de scTCR/huIL15 y scTCR/huIL15Rα. (de referencia)
Se ha establecido que la IL-15 se une de forma estable al dominio extracelular de IL-15Rα y que el complejo resultante es capaz de modular (es decir, estimular o bloquear) las respuestas inmunitarias a través del Complejo de IL-15R de afinidad intermedia o elevada (1-4). Además, se ha demostrado que el TCR de cadena sencilla o los polip�ptidos de anticuerpos se pueden fusionar a citoquinas y otros dominios efectores inmunitarios y que tales moléculas de fusión biespec�fica conservan la actividad funcional de ambos dominios de fusión (5-8). Adicionalmente, se ha demostrado que las formas multivalentes del TCR proporcionan una mayor unión a sus ligandos (9). Por lo tanto una característica de la invención proporciona un complejo de la proteína de fusión que comprende al menos una proteína de fusión en donde un primer polip�ptido de TCR se fusiona a IL-15 y al menos una fusión en donde un segundo polip�ptido de TCR se fusiona al dominio extracelular de IL-15Rα, de manera que las dos proteínas de fusión forman un complejo a través de las interacciones de unión entre los dominios de IL-15 e IL-15Rα. En tal complejo de proteína de fusión, los polip�ptidos de TCR pueden ser iguales o diferentes y pueden estar en formato de cadena sencilla o heterodim�rico.
Un ejemplo de un complejo de la proteína de fusión que contiene polip�ptidos de TCR de cadena sencilla se muestra esquemáticamente en la Figura 1A. En este complejo de proteína de fusión, los dominios de TCR multivalentes proporcionan una mayor avidez/afinidad de unión por sus ligandos. Los ligandos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, complejos de p�ptido/MHC. Los dominios de IL-15/IL-15Rα proporcionan actividad inmunomoduladora. Los constructos de proteínas de fusión representativos que comprenden el complejo de la proteína de fusión se muestran esquemáticamente en la Figura 1B. En estos constructos el polip�ptido de TCR es un TCR de cadena sencilla (264scTCR) compuesto de los dominios TCR-Vα y TCR-Vβ-Cβ conectados por una secuencia conectora pept�dica ((G4S)4). El polip�ptido scTCR se fusiona a cualquiera de los dominios de IL-15 o IL-15Ra, directamente o a través de una secuencia conectora pept�dica. Partiendo del polip�ptido scTCR hay una secuencia de p�ptido señal (o p�ptido líder) que permite la expresión soluble. El p�ptido señal se escinde posteriormente durante el transporte de la proteína para generar la proteína de fusión madura. En otros ejemplos del complejo de la proteína de fusión, un dominio de anticuerpo puede sustituir a un dominio de TCR representado en la Figuras 1� y 1B. Tal anticuerpo puede estar en un formato de cadena sencilla o heteromultim�rico. Para cualquiera de los complejos de proteínas de fusión descritos anteriormente, las secuencias pueden ser humanas o no humanas, p. ej., pero no limitadas a ratón. Estas secuencias se pueden emplear para una parte o la totalidad de los dominios de la proteína de fusión. Además, la disposición de los dominios puede variar siempre que las proteínas de fusión sigan siendo solubles y funcionales.
Ejemplo 2 -Construcción de la fusión g�nica de c264scTCR/huIL15 en un vector de expresión. (de referencia)
El aislamiento y la caracterización de los genes de TCR para TCR específico de p53 (aa264-272) se describieron previamente (5-7). Para obtener genes de IL15 e IL15Rα humanos, se aislaron PBMC humanas de 200 ml de sangre de un donante (N�m. de Lote 2238789, Community Blood Bank, Miami, FL) con HISTOPAGUE-1077 (Sigma). Las células (1,5 x 107) se activaron por medio de 30 ng/ml de PMA (Sigma), 200 ng/ml de ionomicina, y 220 ng/ml de IL2
humana recombinante en IMDM que contenía FBS al 10% en una incubadora con CO2 durante 10 días. Las células activadas (1 x 107 por ml) se congelaron a -70�C para aplicaciones adicionales. Para purificar el ARN total de las PBMC activadas, se utilizó RNEASY PLUS MINI (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El Gen de IL15 humana que contenía la región codificante y una porción de las regiones limítrofes 5' y 3' se amplificó a partir del ARN total con el cebador directo
5'-CACCTTGCCATAGCCAGCTCTTC-3'
y el cebador inverso
5'-GTCTAAGCAGCAGAGTGATGTTTG-3'
por medio de SUPERSCRIPT III One-Step RT-PCR Platinum Tag HiFi (Invitrogen) de acuerdo con las siguientes condiciones: para RT; 55�C 30 min; 94�C, 2 min; para amplificar ADNc; 94�C, 30 segundos; 53�C, 30 segundos; 68�C, 1 min; x40 ciclos; 68�C, 5 min. El producto de ADNc de la PCR de IL15 humana de 600 pb se separ� mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se aisl�. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen de la proteína IL15 humana madura se amplificó a partir del ADNc de IL15 humana de 600 pb con el cebador directo
5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'
y el cebador inverso
5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 1 min; 63�C, 1 min; 72�C, 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El gen de la proteína IL15 humana madura se purificó en gel y se clon� en el vector lanzadera, pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Vector (Invitrogen), con la reacción TOPO de acuerdo con el protocolo del fabricante. El clon que contenía el inserto de gen de la proteína IL15 humana madura se identificó basándose en la PCR de diagnóstico con el cebador directo
5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'
y el cebador inverso
5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'
mediante Redtag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94�C, 1 min; 63�C, 1 min; 72�C, 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. La secuencia del clon correcto se verificó mediante secuenciaci�n de ADN con GenomeLab Dye Termination Cycle Sequencing con un Quick Start Kit (Beckman Coulter) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El gen de la proteína IL15 humana madura se retir� del vector lanzadera mediante digestión con HpaI y MluI y se ligó en un vector de expresión pNEF38-c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. El vector de expresión pNEF38c264scTCR contiene el fragmento g�nico que codifica una secuencia líder de la cadena ligera de inmunoglobulina (o señal secretora) conectada a la proteína TCR de cadena sencilla quimérica soluble específica del p�ptido p53 (aa264-272) (c264scTCR) (5). El vector también contiene regiones reguladoras/potenciadoras 5', regiones reguladoras y promotoras de la transcripción, secuencias reguladoras/de inicio/terminación de la traducción, incluyendo una secuencia consenso de Kozak y una región de terminación poli-A, y regiones reguladoras 3' con supuestos elementos reguladores del anclaje a la matriz. El vector también contiene secuencias de ADN que permiten el crecimiento selectivo en células de mamífero (promotor/gen neoR/poli-A de SV40) y bacterias (gen Ori/AMP). La clonaci�n de fragmento de ADN que codifica la proteína de IL15 humana madura en el vector pNEF38c264scTCR dio como resultado un gen de fusión c264scTCR/huIL15 que comprendía la siguiente secuencia: 3'- líder de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α - conector pept�dico - 264 TCR V-β - TCR C-β humano -IL-15 humana. El vector resultante (pNEF38-c264scTCR/huIL15), que se muestra en la Figura 2A, se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y volvió a confirmar mediante secuenciaci�n de ADN. Las secuencias del gen de fusión c264scTCR/huIL15 y de la proteína (incluyendo la secuencia líder) se muestran en la Figura 2B y la Figura 2C, respectivamente.
Ejemplo 3 -Construcción de la fusión g�nica de c264scTCR/huIL15 que contiene una región bisagra de IgG1 humana mutada en un vector de expresión (de referencia)
La construcción del vector pNEF38-c264scTCR/huIL15 se describió en el Ejemplo 2. Se utilizó una región bisagra mutada de la cadena H de IgG1 humana, en donde se sustituyeron tres residuos de ciste�na por tres residuos de serina para conectar c264scTCR y huIL15. La región de bisagra se mut� y se amplificó a partir del gen 264scTCR/IgG1 descrito previamente (7) con el cebador directo
5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'
y el cebador inverso
5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'
mediante PfuUlta (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 30 s; 65�C, 30 seg; 70�C 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de ADNc de la PCR de la bisagra de IgG humana mutada de 70 pb se separ� mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisl�. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen de la región bisagra mutado se digirió con HpaI y MluI y se ligó en pNEF38-c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. El clon que contenía el inserto del gen de la región bisagra mutado se identificó basándose en la PCR de diagnóstico con el cebador directo
5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'
y el cebador inverso
5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'
mediante Redtag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94�C, 30 s; 64�C, 30 seg; 70�C 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. La huIL15 se amplificó a partir del vector pNEF38-c264scTCR/huIL15 descrito en el Ejemplo 2 con el cebador directo
5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'
y el cebador inverso
5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 30 s; 65�C, 30 seg; 70�C 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de ADNc de la PCR de huIL15 de 380 pb se separ� mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisl�. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen huIL15 se digirió con MluI y XbaI y se ligó en pNEF38-c264scTCR que contenía el gen mutado de la bisagra que había sido digerido con MluI y XbaI. El clon que contenía el inserto del gen de huIL15 se identificó basándose en la PCR de diagnóstico con el cebador directo
5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'
y el cebador inverso
5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'
mediante Redtag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94�C, 30 s; 64�C, 2 min; 70�C 2 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. La secuencia del clon correcto se verificó mediante secuenciaci�n de ADN con GenomeLab Dye Termination Cycle Sequencing con un Quick Start Kit (Beckman Coulter) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector de expresión pNEF38-c264scTCR se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. La clonaci�n del fragmento de ADN que codifica la región bisagra de IgG1 humana mutada y la proteína IL15 humana madura en el vector de pNEF38c264scTCR dio como resultado un gen de fusión c264scTCR-hrnt-huIL15 que comprendía la secuencia siguiente: 3'
-
l�der de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α - conector pept�dico - 264 TCR V-β - TCR C-β humano
-
bisagra de IgG1 humana mutada -IL-15 humana. El vector resultante (pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15), que se muestra en la Figura 3A, se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n de ADN. Las secuencias del gen de fusión c264scTCR-hmt-huIL15 y de la proteína (incluyendo la secuencia líder) se muestran en la Figura 3B y Figura 3C, respectivamente.
Ejemplo 4 -Construcción de la fusión g�nica c264scTCR/huIL15RαΔE3 en un vector de expresión. (de referencia)
El ARN total de las PBMC se prepar� como se ha descrito anteriormente. El gen de IL15Rα humano que contenía la región codificante y una porción de las regiones limítrofes 5' y 3' se amplificó a partir del ARN total de las PBMC con el cebador directo
5'-AGTCCAGCGGTGTCCTGTGG -3'
y el cebador inverso
5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'
mediante SUPERSCRIPT III One-Step RT-PCR Platinum Tag HiFi (Invitrogen) de acuerdo con las siguientes condiciones: para RT; 55C, 30 min; 94�C, 2 min; para amplificar ADNc; 94�C, 1 min; 66�C, 1 min; 72�C, 1 min; x35 ciclos; 72�C, 5 min. El producto de ADNc de la PCR de IL15Rα humano de 970 pb se separ� por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisl�. El ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen del dominio extracelular de IL15 Rα humano se amplificó a partir del ADNc de IL15Rα humano de 970 pb con el cebador directo
5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3' 16
y el cebador inverso
5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 1 min; 72�C 2 min; x35 ciclos, 72�C, 10 min. El gen del dominio extracelular de IL15 Rα humano se purificó en gel y se clon� en el vector lanzadera, pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Vector (Invitrogen), mediante reacción TOPO de acuerdo con el protocolo del fabricante. El clon que contenía el inserto del gen del dominio extracelular IL15Rα humano correcto se seleccion� basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n del ADN con el GenomeLab Dye Termination Cycle Sequencing con un Quick Start Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se determin� que el gen era el gen del dominio extracelular de IL15RαΔE3 humano. El gen del dominio extracelular de IL15RαβE3 humano se retir� del vector lanzadera mediante digestión con HpaI y MluI y se ligó en pNEF38c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. La clonaci�n del fragmento de ADN que codificaba el dominio extracelular de IL15RαΔE3 humano en el vector pNEF38-c264scTCR dio como resultado un gen de fusión c264scTCR/huIL15Rα que comprendía la siguiente secuencia: 3' - líder de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α - conector pept�dico - 264 TCR V-β - TCR C-β humano - dominio extracelular de IL15 RαΔE3. El vector resultante (pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3), mostrado en la Figura 4A, que contiene el inserto del gen del dominio extracelular de IL15RαΔE3 correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n de ADN. Las secuencias del gen c264scTCR/huIL15RαΔE3 y de la proteína se muestran en Figura 4B y la Figura 4C, respectivamente.
Ejemplo 5 -Construcción de la fusión g�nica c264scTCR/huIL15RαSushi en un vector de expresión. (de referencia)
El ARN total de las PBMC se prepar� como se ha descrito anteriormente. El gen de IL15RαSushi humano se amplificó a partir del ADNc de IL15Rα humano de 970 pb (véase el Ejemplo 3) con el cebador directo
5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3'
y el cebador inverso
5'-TTGTTGACGCGTTTATCTAATGCATTTGAGACTGG-3'
mediante PfuULTRA (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 1 min; 66�C, 1 min; 70�C, 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de PCR del gen 1L15RαSushi humano se purificó en gel y se digirió con HpaI y MluI. El gen se ligó en pNEF38-c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. La clonaci�n del fragmento de ADN que codificaba el dominio IL15RαSushi humano en el vector de pNEF38-c264scTCR dio como resultado una fusión g�nica c264scTCR/huIL15Rα que comprendía la siguiente secuencia: 3' -líder de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α -conector pept�dico - 264 TCR V-β - TCR C-β humano -IL15RαSushi humano. El vector resultante, mostrado en la Figura 5A, que contenía el inserto del gen IL15RαSushi humano correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n del ADN. Las secuencias del gen c264scTCR/huIL15RαSushi y de la proteína se muestran en la Figura 5B y la Figura 5C, respectivamente.
Ejemplo 6 -Construcción de la fusión g�nica c264scTCR/huIL15RαSushi que contiene una región bisagra de IgG1 humana mutada en un vector de expresión. (de referencia)
Construcci�n del vector de pNEF38-c264scTCR/huIL15RαSushi se describió anteriormente. Una región bisagra mutada de la cadena H de IgG1 humana, en la que tres residuos de ciste�na se habían remplazado por tres residuos de serina se utilizó para conectar c264scTCR y huIL15RαSushi. La región de bisagra se mut�, se amplificó, se ligó, y se verificó como antes. El huIL15RαSushi se amplificó a partir del vector pNEF38-c264scTCR/huIL15RαSushi descrito anteriormente con el cebador directo
5'-TAATAAACGCGTATCACGTGCCCTC-3'
y el cebador inverso
5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG -3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 30 s; 65�C, 30 seg; 70�C 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de ADNc de la PCR de huIL15RαSushi de 250 pb se separ� mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisl�. El producto de ADNc se purificó a partir de la agarosa con un Kit de Extracción de Gel Qiaquick (Qiagen). El gen huIL15RαSushi se digirió con MluI y XbaI y se ligó en pNEF38c264scTCR que contenía el gen de la bisagra mutado que había sido digerido con MluI y XbaI. El clon que contenía el inserto del gen de huIL15 se identificó basándose en la PCR de diagnóstico de con el cebador directo
5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'
y el cebador inverso
5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG -3'
mediante RedTag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94�C, 30 s; 65�C, 1 min; 70�C 1 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. La secuencia del clon correcto se verificó mediante secuenciaci�n de ADN con GenomeLab Dye Termination Cycle Sequencing con un QUICK START KIT (Beckman Coulter) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector de expresión pNEF38-c264scTCR se ha descrito anteriormente. La clonaci�n del fragmento de ADN que codifica la región bisagra de IgG1 humana mutada y proteína IL15R□Sushi humana en el vector pNEF38c264scTCR dio como resultado una fusión g�nica c264scTCR-hmt-huIL15R□Sushi que comprendía la siguiente secuencia: 3' - líder de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α - conector pept�dico - 264 TCR V-β -TCR C-β humano - bisagra de IgG1 humana mutada -IL15R□Sushi humano. El vector resultante (pNEF38-c264scTCRhmt-huIL15R□Sushi), que se muestra en la Figura 6A, se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n de ADN. Las secuencias del gen de fusión c264scTCR-hmt-huIL15R□Sushi y de la proteína (incluyendo la secuencia líder) se muestran en la Figura 6B y la Figura 6C, respectivamente.
Ejemplo 7 -Construcción de los genes c264scTCR/huIL15RαSushi y c264scTCR/huIL15 en un único vector de expresión. (de referencia)
Para lograr la expresión de dos proteínas de fusión en una única célula anfitriona, los genes que codificaban c264scTCR/huIL15RαSushi y c264scTCR/huIL15 se clonaron en un único vector de expresión. El gen c264scTCR/huIL15RαSushi se amplificó a partir del molde descrito en el Ejemplo 5 mediante PfuUltra (Stratagene) con el cebador directo 5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3' y el cebador inverso 5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCATCTAATGCATTTGAG-3' en las siguientes condiciones: 94�C, 1 min ; 68�C, 1 min; 72�C, 2 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de la PCR del gen c264scTCR/huIL15RαSushi se purificó en gel, se digirió con BspEI y NotI y se ligó en el vector de expresión pSUN34R1 que había sido digerido con BspEI y NotI. El vector de expresión pSUN34R1 contiene dos sitios de clonaci�n de genes de interés, as� como regiones reguladoras/potenciadoras 5', regiones reguladoras y promotoras de la transcripción, secuencias reguladoras/de inicio/terminación de la traducción que incluyen una secuencia consenso de Kozak y una región de terminación poli-A, y un intr�n y regiones 3' con elementos reguladores. Este vector también contiene secuencias de ADN que permiten el crecimiento selectivo en células de mamífero (promotor de SV40/gen neoR/poli-A) y bacterias (gen Ori/AMP). El vector que contiene el inserto del gen c264scTCR/IL15R□Sushi correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n del ADN. El gen c264scTCR/huIL15 se amplificó a partir del molde descrito en el Ejemplo 2 mediante PfuUltra (Stratagene) con el cebador directo
5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'
y el cebador inverso
5'-TGAGTGTTCGAATTATCAAGAAGTGTTGATGAAC-3'
en las siguientes condiciones: 94�C, 1 min; 65�C, 1 min; 72�C, 2 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de la PCR del gen c264scTCR/huIL15 se purificó en gel, se digirió con ClaI y Csp45I y se ligó en el vector de expresión pSUN34R1-c264scTCR/huIL15RαSushi que había sido digerido con ClaI y Csp45I. El vector resultante (pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi), mostrado en la Figura 7, que contenía el inserto del gen c264scTCR/huIL15 correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n del ADN. Este vector contiene ambos genes c264scTCR/huIH15RαSushi y c264scTCR/huIL15.
Ejemplo 8 -Construcción de los genes c264scTCR/huIL15RαΔE3 y c264scTCR/huIL15 en un único vector de expresión. (de referencia)
El gen de fusión c264scTCR/huIL15RαΔE3 se amplificó a partir del molde descrito en el Ejemplo 4 mediante PfuUltra (Stratagene) con el cebador directo
5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3'
y el cebador inverso
5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCAAGTGGTGTCGCTG-3'
en las siguientes condiciones: 94�C, 1 min; 68�C, 1 min; 72�C, 2 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. El producto de la PCR del gen c264scTCR/huIL15RαΔE3 se purificó en gel, se digirió con BspEI y NotI y se ligó al vector de expresión pSUN34R1 que había sido digerido con BspEI y NotI. El vector que contenía el inserto del gen c264scTCR/huIL15RαΔE3 correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciaci�n del ADN. El gen c264scTCR/huIL15 se amplificó y se clon� en el vector de expresión descrito en el Ejemplo 7. El vector resultante (pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3), mostrado en la Figura 8, que contiene el inserto del gen c264scTCR/huIL15 correcto se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante la secuenciaci�n del ADN. Este vector contiene ambos genes c264scTCR/huIL15RαΔE3 y c264scTCR/huIL15.
Ejemplo 9 -Generación de líneas celulares anfitrionas transfectadas que producen proteínas de fusión. (de referencia)
Los vectores de expresión se pueden introducir en una variedad de líneas de células anfitrionas mediante varios métodos diferentes de transformación, transfecci�n o transducci�n. En uno de tales métodos, se sembraron células CHO-K1 (5 x 104) en una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche en una incubadora con CO2. Las células se transfectaron con 5 μg de vector de expresión que contenía los genes de fusión TCR/IL15 y/o TCR/IL15Rα utilizando 10 μl de reactivo Mirus TransIT-LT1 (Mirus) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se seleccionaron con 4 mg/ml de G418 (Invitrogen) un día después de la transfecci�n. Las células resistentes a G418 se expandieron y las células que expresaban la proteína de fusión con TCR fueron enriquecidas mediante 35 rondas de selección de MACS como se describe a continuación. Las células se desprendieron en EDTA 10 mM y se lavaron una vez con IMDM que contenía FBS al 10%. Las células se resuspendieron (107 células en 100 μl) y se incubaron con 5 μg de reactivo de tetr�mero de p53 conjugado con R-ficoeritrina (PE) (aa264-272)/HLA-A2 durante 15 minutos a 4C. Las células se lavaron una vez y se incubaron con cuentas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-PE (Miltenyi Biotec) durante 15 min a 4�C. Las células se cargaron a una columna magnética (en un campo magnético) y las células no unidas se eliminaron con tampón de lavado (PBS que contenía BSA al 0,5%). Las células unidas a la columna se hicieron eluir con IMDM que contenía FBS al 10% después de que la columna se hubiera retirado del campo magnético. Este procedimiento permite el enriquecimiento de las células que expresan la proteína de fusión basándose en la presentación transitoria de la proteína de fusión soluble sobre la superficie celular durante el proceso de producción/secreción. La asociación en la superficie de la célula de las proteínas de fusión se control� después de cada enriquecimiento. Los niveles de proteínas de fusión unidas a la superficie celular determinados mediante citometr�a de flujo se compararon con los niveles de proteínas de fusión solubles presentes en el medio de cultivo celular según se determin� mediante ELISA. Un ejemplo de la comparación se muestra en la Figura 9A y 9B. En este ejemplo, células CHO-KI transfectadas con pNEF38-c264scTCR/huIL15RαSushi se enriquecieron por medio de MACS de una a cinco veces y a continuación se sembraron (1 x 106 células/pocillo) en una placa de 6 pocillos. Al cabo de de 24 horas, las células se desprendieron después con EDTA 10 mM, se lavaron una vez con IMDM + FBS al 10%, y se tiñeron (a 2 x 105 células/100 μl de IMDM + FBS al 10%) con 0,6 μg de tetr�mero de p53 (aa264-272) conjugado con PE/HLA-A2 o la misma cantidad de tetr�mero de CMVpp65 (aa495503) conjugado con PE/HLA-A2 de 30 min a 4�C. Las células se lavaron una vez y se analizaron para determinar los niveles de proteína de fusión soluble asociada a la superficie celular mediante citometr�a de flujo, como se muestra en la Figura 9A. El nivel de proteína de fusión soluble secretada al medio de cultivo celular también se determin� mediante ELISA específico de TCR con un anticuerpo de captura, anticuerpo anti-TCR Cβ humano (BF1), y un anticuerpo de detección, anticuerpo anti-TCR Cβ humano biotinilado (W4F) descrito previamente (5), como se muestra en la Figura 9B. Los resultados indican que el proceso de enriquecimiento basado en cuentas magnéticas produjo transfectantes que producían un aumento de los niveles de proteína de fusión soluble. Las células transfectadas enriquecidas se subclonaron a continuación tres veces mediante dilución limitante y las líneas celulares de producción se escrutaron basándose en el nivel de proteína de fusión soluble secretada al medio de cultivo (determinado mediante el ELISA descrito anteriormente). Las líneas celulares de producción se expandieron y se cultivaron en IMDM + FBS al 10% o medio libre de suero en condiciones (p. ej., matraces, centrífugas, fermentadores, bolsas, botellas) adecuadas para generar la proteína de fusión soluble.
En algunos casos, las células anfitrionas se co-transfectaron con diferentes vectores de expresión para generar transfectantes capaces de expresar múltiples proteínas de fusión. Los transfectantes que expresaban una proteína de fusión también pudieron ser transfectados de nuevo con un uno o más vectores de expresión para generar transfectantes que expresaban múltiples proteínas de fusión. Las células también se transfectaron con un vector de expresión que contenía más de un gen de proteínas de fusión, como se ilustra en los Ejemplos 7 y 8, para generar un transfectante que expresa múltiples proteínas de fusión. Las células resultantes se pudieron utilizar para producir los complejos de proteínas de fusión de múltiples componentes de la invención como moléculas solubles en el medio de cultivo celular.
Tambi�n se pudieron lograr altos niveles de producción de proteína de fusión o de complejo de proteína de fusión a través de métodos de transfecci�n y selección celulares descritos en U.S.S.N. 09/204.979.
Ejemplo 10 - Purificación de las proteínas de fusión o complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα. (de referencia)
Las proteínas de fusión o los complejos de proteínas de fusión solubles se pueden purificar a partir de las células anfitrionas o los medios de cultivo celulares utilizando una variedad de métodos, incluyendo partición selectiva o solubilidad en disolventes o mediante separación (es decir, a través de cromatograf�a) basándose en la carga, el carácter hidrófobo, el carácter hidrófilo, el tamaño, y/o la unión selectiva o semiselectiva a un ligando. Las proteínas de fusión o los complejos de proteínas de fusión solubles se pueden generar a partir de materiales insolubles a través del uso de condiciones de plegamiento de proteínas apropiadas. En un ejemplo, la proteína de fusión de c264scTCR/IL15 se purificó del medio de cultivo celular mediante cromatograf�a de afinidad utilizando un anticuerpo (BF1) que reconocía el dominio TCR-Cβ humano. Típicamente, una columna que contenía Sefarosa conjugada con BF1 se equilibr� primero con Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 (tampón de carga) y después se cargó a 2 ml/min con medio de cultivo celular de pH ajustado que contenía la proteína de fusión de c264scTCR/IL15. A continuación, la columna se lav� con 5 veces el volumen de la columna de tampón de carga para eliminar las proteínas no unidas, y la
prote�na de fusión de c264scTCR/IL15 se hizo eluir con 4 veces el volumen de la columna de citrato de Na 0,5 M, pH
4. Después de la recogida, el eluato se ajust� a pH 8,0 por medio de Tris-HCl 2 M, pH 8,0. La proteína purificada se cambi� de tampón a PBS y se filtr� utilizando un filtro de 0,22 μm. La columna BF1 se vaci� con glicina-HCl 50 mM, pH 3,0, y se almacen� en etanol al 20% a 4�C para su uso posterior. La proteína de fusión se puede purificar adicionalmente mediante cromatograf�a de intercambio iónico y/o de exclusión por tamaño. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían las proteínas de fusión de c264scTCR/IL15, c264scTCR/IL15RαSushi y c264scTCR/IL15RαΔE3 se purificaron mediante los métodos anteriores y las muestras de las proteínas de fusión purificadas se analizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS en condiciones reductoras y seguido de tinción con azul brillante de Coomassie. Los ejemplos de tales geles se muestran en la Figura 10. Las principales bandas de proteínas corresponden a los pesos moleculares correctos esperados basándose en las secuencias de las proteínas de fusión.
Ejemplo 11 - Generación de un complejo de proteína de fusión de las proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα. (de referencia)
IL15 se une específicamente al dominio extracelular de IL15Rα con una alta afinidad (4). De este modo se puede formar un complejo de proteínas de fusión que porta los dominios de IL-15 e IL15Rα en una variedad de condiciones, incluyendo dentro de la célula expresión o extracelularmente con proteínas de fusión no purificadas o purificadas. En un ejemplo, se pueden mezclar cantidades molares iguales de proteínas de fusión purificadas en las condiciones apropiadas (es decir, 10 min a temperatura ambiente) para formar un complejo de proteína de fusión. La formación de complejos se puede verificar utilizando una variedad de técnicas que incluyen análisis de unión directa, análisis de unión competitiva, inmunoprecipitaci�n, resonancia de plasm�n superficial, o análisis basados en el tamaño, la actividad u otras propiedades del complejo. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 11, la cromatograf�a de exclusión por tamaño puede verificar la formación de complejos que comprenden las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 y c264scTCR/huIL15RαSushi basándose en el peso molecular. En este estudio, se cargaron aproximadamente 100 μg de c264scTCR/huIL15 (0,5 mg/ml) en una columna Superdex 200 HR 10/30 para el análisis. El peso molecular calculado para c264scTCR/huIL15 es de aproximadamente 57 kD. Basándose en el perfil SEC (Figura 11A), el peso molecular estimado es de aproximadamente 98 kD, lo que sugiere que es probable que esta proteína de fusión sea un mon�mero. Del mismo modo, se cargaron aproximadamente 60 μg de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαSushi (0,3 mg/ml) en la columna Superdex. El peso molecular calculado para c264scTCR/huIL15RαSushi es de aproximadamente 52 kD. Basándose en el perfil SEC (Figura 11B), el peso molecular estimado de la proteína de fusión es de aproximadamente 81 kD, lo que sugiere de nuevo que esta proteína de fusión es un mon�mero. El análisis SEC anterior de otras proteínas de fusión basadas en TCR mostr� diferencias similares entre el peso molecular monom�rico calculado y el peso molecular estimado de la proteína de fusión glicosilada. Cuando las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 y c264scTCR/huIL15RαSushi se mezclaron en cantidades molares iguales y se cargaron aproximadamente 126 μg de las proteínas mezcladas (0,63 mg/ml) en la columna, se obtuvo el perfil mostrado en la Figura 11C. Se estimaron los pesos moleculares de los dos picos principales: uno a aproximadamente 170 kD, que es un heterod�mero de las dos proteínas de fusión y otro a aproximadamente 91 kD, que es probablemente una mezcla de formas monom�ricas de las proteínas de fusión. De este modo, la aparición de las especies de 170 kD en la preparación de las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi mezcladas es una evidencia de que se puede generar el complejo de la proteína de fusión de la invención.
Tambi�n se llev� a cabo análisis del complejo de proteínas de fusión que comprendía las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 y c264scTCR/huIL15RαΔE3. Se cargaron aproximadamente 100 μg de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαΔE3 (0,5 mg/ml) en la columna Superdex. El peso molecular calculado para c264scTCR/huIL15RαΔE3 es de aproximadamente 60 kD. Basándose en el perfil SEC (Figura 12A), el peso molecular estimado de la proteína es de aproximadamente 173 KD, lo que sugiere que esta proteína existe como un homod�mero. Cuando las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 y c264scTCR/huIL15RαΔE3 se mezclaron en cantidades molares iguales y se cargaron aproximadamente 118 μg de las proteínas mezcladas (0,59 mg/ml) en la columna, se obtuvo el perfil que se muestra en la Figura 12B. Se estimaron los pesos moleculares de los dos picos principales: uno es >210 kD, que es probablemente un tetr�mero compuesto por dos heterod�meros y el otro es de aproximadamente 93 kD, que es probable que sea un mon�mero de c264scTCR/huIL15. De este modo, la aparición de la especies d 170 kD en la preparación de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαΔE3 mezcladas es una evidencia de que se puede generar el complejo de la proteína de fusión de la invención.
Ejemplo 12 - El complejo de proteína de fusión de las proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα muestra una mayor unión a los complejos de p�ptido/MHC. (de referencia)
Los complejos de proteínas de fusión generados como se ha descrito anteriormente se caracterizan por su capacidad para unirse al ant�geno específico de TCR, p53 (aa264-272)/HLA-A2.1. Para generar células que presentaban este ant�geno, se cargaron células T2 HLA-A2.1 positivas con el p�ptido p53 (aa264-272) a 26�C durante la noche y después se almacenaron a 5 x 106 células/ml en nitrógeno líquido. Las células T2 que no se incubaron con p�ptido sirvieron como controles. Las células T2 cargadas con el p�ptido p53 o de control se descongelaron y se resuspendieron en 1 ml de IMDM + FBS al 10%. Las células (5 x 105/100 μl) se tiñeron a continuación durante 30 min a RT con 0,5 μg de las proteínas de fusión siguientes: c264scTCR/huIL15,
c264scTCR/huIL15RαSushi, complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi. Las células se lavaron una vez con tampón de lavado (PBS que contenía BSA al 0,5% y azida de sodio al 0,05%) y se tiñeron con 0,1 μg de anticuerpo anti-TCR Cβ humano monoclonal biotinilado de ratón (BF1) en 100 μl de tampón de lavado durante 30 min a RT. Las células se lavaron una vez y se tiñeron con 0,5 μg de estreptavidina conjugada R-Ficoeritrina en 100 μl de tampón de lavado durante 30 min a RT. Las células se lavaron y se resuspendieron para el análisis mediante citometr�a de flujo. Como se muestra en la Figura 13, cada una de las proteínas de fusión fue capaz de teñir específicamente las células cargadas con p�ptido p53. Además, el complejo proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi present� una mayor unión específica a través de los dominios c264scTCR multivalentes a los complejos de p53(aa264-272)/HLA-A2.1 presentados sobre las células T2. En particular, el complejo de proteína de fusión dim�ricas mostr� una mejor la tinción de las células T2 cargadas con p�ptido p53 que las proteínas de fusión monom�ricas c264scTCR/huIL15 o c264scTCR/huIL15RαSushi. Estos datos sugieren que el complejo de proteína de fusión multim�rica proporcionar� mejores propiedades de reconocimiento del ant�geno que la forma monom�rica de las proteínas de fusión.
Ejemplo 13 -Generación de genes mutantes de huIL-15 y construcción de vectores de expresión de genes mutantes de c264sc TCR-hmt-huIL15 de referencia.
Como se ha descrito anteriormente, los polip�ptidos c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi son capaces de formar un complejo a través de interacciones de los dominios de IL-15 e IL-15Rα y el complejo de proteína de fusión multivalente ha mejorado de unión para los complejos de p�ptido/MHC. Tal complejo de proteína de fusión tiene ventajas como agente de búsqueda específico de ant�geno o dirigido, de diagnóstico y terapéutico basadas en la actividad de unión mejorada. La capacidad de los dominios de IL-15/IL-15Rα de la proteína de fusión para unirse a células que expresan los receptores de IL-15 también es una característica deseable como se indica en la presente memoria. Sin embargo, existen aplicaciones en las que resulta ventajoso aumentar o disminuir la capacidad de los dominios de IL-15/IL-15Rα para interactuar con y/o afectar a las respuestas de las células que expresan los receptores de IL15. Por ejemplo, puede ser deseable reducir esta interacción en las aplicaciones (es decir, usos de búsqueda y de diagnóstico), en las que el objetivo principal es la utilización del complejo de proteína de fusión para la detección específica de los complejos de p�ptido/MHC. En aplicaciones terapéuticas, también puede ser deseable que los complejos de proteínas de fusión generados contengan dominios de IL-15 capaces de aumentar o disminuir las respuestas mediadas por IL-15. Para abordar esta cuestión, se llev� a cabo el análisis mutacional para identificar los residuos de IL-15 que afectan a su unión al complejo de IL-2/15Rβγc sin afectar a sus interacciones con IL-15Rα. Las mutaciones resultantes pueden crear variantes de IL-15 incluyendo antagonistas o agonistas. Además del uso de las proteínas de fusión de la invención, los antagonistas y agonistas de IL-15 resultantes también pueden tener utilidad como citoquinas solubles (es decir, proteínas de no fusión) o como un complejo con dominios de IL-15Ra, para aplicaciones de búsqueda, diagnóstico o terapéuticas. Por ejemplo, los antagonistas de IL-15 antagonistas pueden ser útiles en la supresión de respuestas inmunitarias no deseadas, mientras que los agonistas de IL-15 se pueden utilizar para estimular respuestas inmunitarias en estrategias terapéuticas para el tratamiento de diversas enfermedades.
Bas�ndose en la comparación entre la secuencia de amino�cidos y la estructura de IL-15 con IL-2, se identificaron varios amino�cidos que podrían afectar potencialmente a las interacciones entre IL-15 e IL-15Ra, IL-15Rβ y/o γC. Como se muestra en la Figura 21 y en la Figura 14A, se crearon variantes de IL-15, en la que los posibles sitios de unión de la proteína de IL-15 humana madura a los receptores IL-15Rβγc, amino�cidos en las posiciones 8, 61, 65, 72, y 108 (numeración basada en la secuencia de IL-15 humana nativa madura), fueron sustituidos cada uno o en combinación con dos o más sustituciones distintas. El ácido asp�rtico de la posición 8 se sustituyó por alanina o asparragina. El ácido asp�rtico en la posición 61 se sustituyó por alanina. La asparragina de la posición 65 se sustituyó por alanina o ácido asp�rtico. La asparragina de la posición 72 se sustituyó por arginina o ácido asp�rtico. La glutamina de la posición 108 se sustituyó por alanina. Tanto el Asp de la posición 8 como la Gln de la posición 108 se sustituyeron cada uno por alanina. Tanto el Asp de la posición 8 como la Asn de la posición 65 se sustituyeron cada uno por una asparragina o alanina. Tanto el Asp de la posición 8 como la Asn de la posición 65 se sustituyeron cada uno por una serina o arginina. Para generar mutantes de IL-15, se utilizó la PCR solapante.
Por ejemplo, para generar el Asp de la posición 8 con la sustitución de residuos alanina o asparragina, se utilizó el vector pNEF38-c264scTCR/huIL15 como molde para amplificar dos fragmentos solapantes de ADN-c con el cebador directo para el fragmento 1
5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'
y con el cebador inverso para el fragmento 1
5'-AGATCTTCAATTTTTTTCAAMKHACTTATTACATTCACCCAG-3'
y con el cebador directo para el fragmento 2
5'-ACTGGGTGAATGTAATAAGTDMKTTGAAAAAAATTGAAGATC-3'
y con el cebador inverso para el fragmento 2
5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 1 min; 66�C, 1,5 min; 72�C 1,5 min; x35 ciclos; 72�C, 10 min. Los productos de ADNc de la PCR de los fragmentos 1 y 2 se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aislaron. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). Los productos de ADNc de la PCR de los fragmentos 1 y 2 se fusionaron entre s� mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, 1 min; 66�C, 1,5 min; 72�C 1,5 min; x10 ciclos. El fragmento de ADNc de la PCR solapante se amplificó con el cebador directo
5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'
y con el cebador inverso
5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG -3'
mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94�C, I min; 64�C, 1,5 min; 69�C 1,5 min; x30 ciclos; 72�C, 10 min. Los productos de ADNc de la PCR de huIL-15 mutante se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aislaron. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen de huIL15 mutante se digirió con MluI y XbaI y se ligó en pNEF38-c264scTCR-hmt que había sido digerido con MluI y XbaI. El clon que contenía el gen de huIL15 de la posición 8 con una sustitución de alanina o asparragina se verificó mediante secuenciaci�n de ADN con GenomeLab Dye termination Cycle Sequencing con un QUICK START KIT (Beckman Coulter) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector de expresión pNEF38-c264scTCR se ha descrito anteriormente. La clonaci�n del fragmento de ADN que codificaba la proteína IL-15 humana mutada en el vector pNEF38-c264scTCR dio como resultado un gen de fusión c264scTCR-hmt-huIL15D8A o c264scTCR-hmt-huIL15D8N que comprendía la secuencia siguiente: 3' -líder de la cadena ligera de inmunoglobulina - 264 TCR V-α -conector pept�dico - 264 TCR V-β - TCR C-β humano - bisagra de IgG1 humana mutada - IL15D8A humana o -IL15D8N humana. El vector resultante (pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A o pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N), mostrado en la Figura 14B, se confirm� mediante secuenciaci�n del ADN. Las secuencias del gen de fusión pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A o pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N y de la proteína (incluyendo la secuencia líder) se muestran en la Figura 14C y en la Figura 14D, respectivamente.
Se introdujeron otras mutaciones de una manera similar y se construyó un vector de expresión como se ha descrito anteriormente. Los vectores de expresión se introdujeron en células CHO.K1 para generar transfectantes estables como se describe en el Ejemplo 9. La producción y purificación de las proteínas de fusión de TCR/IL15 y complejos de proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 se llevaron a cabo usando métodos similares a los descritos en los Ejemplos 10 y 11. La generación de variantes de IL-15 como citoquinas solubles se puede llevar a cabo a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo la producción en sistemas de expresión procari�ticos y eucari�ticos (véanse, p. ej., el documento WO9527722; Hsu et al. 2005 J. Immunol. 175:7226).
Ejemplo 14 - Caracterización funcional de las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα (de referencia)
La unión funcional del dominio TCR de la proteína de fusión se demostr� basándose en el ELISA y los métodos de tinción celular utilizando los reactivos de p53 (aa264-272)/HLA-A2.1 descritos en el Ejemplo 9 y los métodos de tinción de células presentadoras de ant�geno de descritos en el Ejemplo 12. La capacidad de los dominios de IL15 e IL15Rα de la proteína de fusión para interaccionar se demostr� como se describe en el Ejemplo 11. Adicionalmente la actividad funcional de los dominios de IL15 e IL15Rα se puede evaluar a través de una variedad de métodos, incluyendo la unión a receptores IL-2/15Rβγc o la modulación de la actividad de las células inmunitarias que portan los receptores de IL-15. En un ejemplo, las células CTLL-2, que expresan IL-15R (cadenas αβγc) heterotrim�rico, se incubaron con 0,5 μg de las proteínas de fusión individuales: c264scTCR/huIL15, 264scTCR/huIL15RαSushi, o complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi durante 30 min a RT. Las células se lavaron una vez con tampón de lavado (PBS que contenía BSA al 5% y azida de sodio al 0,05%) y se tiñeron con 0,5 μg de tetr�mero de p53 (aa 264-272) conjugado R-ficoeritrina (PE)/HLA-A2 durante 30 min a RT. Las células se lavaron y se resuspendieron para su análisis por medio de citometr�a de flujo. Como se muestra en la Figura 15, la asociación de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 y el complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi a través de sus dominios huIL15 con los receptores de IL-15 sobre las células CTLL-2 se puede detectar con el tetr�mero de p53 (aa264-272) conjugado con PE/HLA-A2 que reconoce el dominio c264scTCR de la proteína de fusión unida. Estos resultados indican que los dominios tanto de IL-15 como de TCR de la proteína de fusión/complejos de proteína de fusión son capaces de interactuar funcionalmente con sus ligandos cognados.
Adem�s, las células CTLL-2 son dependientes de citoquinas para el crecimiento y pueden responder a IL-15 hamana recombinante. Se desarroll� un análisis de proliferaci�n de WST-1 basado en células utilizando células CTLL-2 para evaluar la actividad biológica frente a IL-15 de las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión. WST-1 (Roche) es un reactivo que se puede convertir en formaz�n por las enzimas deshidrogenasas que se encuentran en las células metab�licamente activas. En el análisis de WST-1, la cantidad de formaz�n en el medio de cultivo medida por la cantidad de absorbancia 440-450 nm es directamente proporcional al número de células vivas
en el cultivo. Las células CTLL-2 (2 x 104/ 200 μL) se incubaron con las concentraciones indicadas de las proteínas de fusión (0-28 ng/ml): c264scTCR/huIL15, complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi o complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαΔE3 durante 3 días en placas de 96 pocillos a 37�C en una incubadora con CO2. Las células se incubaron con 10 μl de WST-1 durante 4 horas antes de recoger 100 μl de medio de cultivo para la medición de la absorbancia a 440-450 nm con un lector de placas de microtitulaci�n. Como se muestra en Figura 16, la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 puede apoyar la proliferaci�n de células CTLL2 a una concentración tan baja como 1,8 ng/ml (~ 31,25 pM), lo que sugiere la activación de las células CTLL-2 con la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 a través del receptor de IL15 de alta afinidad. Curiosamente, los complejos de proteínas de fusión también apoyaron proliferaci�n de células CTLL-2, pero en un menor grado lo que sugiere que la actividad estimuladora de c264scTCR/huIL15 era inhibida tras la formación del complejo con c264scTCR/huIL15RαSushi o c264scTCR/huIL15RαΔE3 (una vez o cuatro veces, respectivamente). Esto sugiere que la unión de c264scTCR/hulL15 al receptor de IL-15 de alta afinidad es inhibida por las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL5RαSushi o c264scTCR/huIL15RαΔE3. Estos resultados proporcionan evidencia de que las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión pueden activar o suprimir las respuestas de las células inmunitarias en diferentes condiciones.
Se llevaron a cabo análisis similares con líneas celulares que expresaban solamente los receptores de IL-15βγc de afinidad intermedia, tales como las líneas celulares 32Dβ (véase más abajo). En algunos casos, es posible que la actividad biológica de IL15 en la estimulaci�n de la proliferaci�n de las células que portan IL-15R sea mejorada cuando ésta se encuentra en un complejo con el dominio de IL15Rα (1-3). Se evaluar� la estimulaci�n de la proliferaci�n celular por los complejos de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi o c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαΔE3 y puede proporcionar una evidencia adicional de que los complejos de proteína de fusión pueden estimular o activar la respuesta inmunitaria de las células inmunitarias.
Ejemplo 15 -Los complejos de proteínas de fusión dim�ricas de las variantes TCR/IL15RαSushi y TCR/IL15 exhiben una unión específica de TCR al complejo de p�ptido/MHC pero menos unión a los receptores IL-15RβγC. (de referencia)
Los complejos de proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 descritos anteriormente se caracterizaron por su capacidad para unirse al ant�geno específico de TCR, p53 (aa264-272)/HLA-A2.1. Para generar células que presentaban p53 (aa264-272)/HLA-A2.1, se cargaron células T2 positivas para HLA-A2.1 (2 x 106 mL) con p�ptido p53 (aa264-272) 20 mM a 37�C en presencia de 1 x PLE (Altor Bioscience) durante 2-3 horas. Las células T2 que no se incubaron con el p�ptido y las células 32Dβ que expresaban IL-2/15RβγC sirvieron como controles. Las células T2 cargadas con p�ptido p53, las células T2 de control, o las células 32Dβ (2 x 105/ 100 μl) se incubaron a continuación durante 30 min a 4�C con 320 nM de los siguientes complejos de proteínas de fusión dim�ricas: 1) c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi, 2) c264scTCR/huIL15D8A + c264scTCR/huIL15RαSushi, y 3) c264scTCR/huIL15D8N + c264scTCR/huIL15RαSushi. Estos complejos se generaron incubando 160 nM de proteína de fusión de c264scTCRhuIL15 purificada y 160 nM de proteína de fusión de c264scTCRhuIL15RαSushi purificada a 4�C durante 3 horas: Después de la tinción, las células se lavaron una vez con tampón de lavado (PBS que contenía BSA al 0,5% y azida de sodio al 0,05%) y se tiñeron con 0,5 μg de anticuerpo anti-TCR Cβ humano monoclonal biotinilado de ratón (BF1) en 100 μl de tampón de lavado durante 30 minutos a 4�C. Las células se lavaron una vez y se tiñeron con 0,5 μg de estreptavidina conjugada con R-ficoeritrina en 100 μl de tampón de lavado durante 30 minutos a 4�C. Las células se lavaron y se resuspendieron para su análisis mediante citometr�a de flujo. Como se muestra en la Figura 17A, el complejo de c264scTCR/huIL15D8A + c264scTCR/huIL15RαSushi y el complejo de c264scTCR/huIL15D8N + c264scTCR/huIL15RαSushi exhibieron una actividad equivalente a la del complejo c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi para teñir específicamente las células T2 cargadas con p�ptido p53. Estos resultados indican que los dominios scTCR multivalentes son completamente funcionales en cada uno de estos complejos de fusión. Sin embargo, como se muestra en la Figura 17B y la Figura 17C, los complejos de proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 mutantes mostraron una menor tinción de fondo en las células T2 de control (Figura 17B) y en las células 32Dβ positivas para IL-15Rβγc (Figura 17C) que el complejo de proteína de fusión de c264scTCR/IL15 de tipología amplia. As�, estos complejos de proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 (D8a y D8N) no muestran actividad de unión a los receptores IL-15Rβγc presentes en las células 32Dβ. Se llevaron a cabo estudios similares de unión al receptor IL-15Rβγc con otras proteínas de fusión que comprendían variantes de IL-15 y se resumen en la Figura 21. Los resultados indican que las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión de la invención que comprenden variantes de IL-15 conservan la actividad para reconocer complejos de p�ptido/MHC y muestran una actividad de unión menor o mayor de los receptores IL15Rβγc.
Para confirmar los dominios TCR e IL-15 funcionales de las proteínas de fusión anteriores, se midió la actividad de unión del p�ptido/MHC e IL-15Ra mediante un análisis ELISA. Las placas de microtitulaci�n de 96 pocillos se recubrieron previamente con BF1 20 nM, un anticuerpo anti-TCR Cβ, o TCR/IL15RαSushi 20 nM en tampón carbonatada de pH 9,1 (bicarbonato de sodio 35 mM, Na2CO3 17,5 mM, NaCl 50 mM) durante 3 horas a 4C. Las placas se lavaron con tampón de lavado (imidazol 40 mM, NaCl 150 mM) 4 veces y se bloquearon con BSA-PBS al 1% durante 10 minutos. Se añadieron las proteínas de fusión indicadas a una concentración de 0,03 - 4 nM a las placas y se incubaron a RT durante 30 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces. Las proteínas de fusión capturadas con BF1 se incubaron con 1 μg/ml de tetr�mero de p53 conjugado con HRP/HLA-A2.1 durante 45 minutos a RT y las proteínas de fusión capturadas con TCR/IL15RaSushi se incubaron con 50 ng/ml de anti-IL-15
humana biotinilada de ratón durante 30 minutos a RT. Después de lavar 4 veces, la placa incubada con anti-IL-15 humana biotinilada de ratón se incub� con 0,25 μg/ml de HRP-estreptavidina durante 15 minutos. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron con sustrato de peroxidasa ABT durante 1-10 minutos y se desarrollaron para la medición de absorbancia a 405 nm con un lector de placas de microtitulaci�n. Como se muestra en la Figura 18� y en la Figura 18B, las proteínas de fusión compartieron una actividad de unión específica de TCR similar para el tetr�mero p53/HLA-A2 y una actividad de unión a IL-15 equivalente para IL15RαSushi. Se llevaron a cabo estudios similares de la unión de IL-15Ra con otras proteínas de fusión que comprendían variantes de IL-15 y se resumen en la Figura 21. Los resultados indican que las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión que comprenden variantes de IL-15 conservan la actividad para reconocer los complejos de p�ptido/MHC y los receptores IL-15Ra.
Ejemplo 16 - Caracterización funcional de las proteínas de fusión y los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 mutante (de referencia)
Como se ha indicado anteriormente, las proteínas de fusión que comprenden un antagonista o agonista de IL-15 pueden ser útiles como agentes dirigidos para inhibir o estimular las respuestas mediadas por IL-15 (es decir, actividad de células T o células NK) en el sitio de la enfermedad. Para determinar la bioactividad frente a IL-15 de estas proteínas de fusión para afectar a las respuestas inmunitarias, se llevaron a cabo estudios de proliferaci�n de celular con células CTLL-2 que expresaban IL-15R (cadenas αβγc) de alta afinidad y con células 32Dβ que expresaban IL-15R (cadenas βγc) de afinidad intermedia. Las células (2 x 104/200 μL) se incubaron con 0,4-40 nM de las proteínas de fusión de TCR/IL15 descritas anteriormente durante 3 días en placas de 96 pocillos a 37�C en una incubadora con CO2. Las células se incubaron con 10 μl de WST-1 durante 4 horas antes de recoger 150 μl de medio de cultivo para la medición de la absorbancia 440 nm con un lector de placas de microtitulaci�n. Como se muestra en la Figura 19A y en la Figura 19B, la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15 que comprende el dominio de IL-15 de tipo salvaje puede apoyar la proliferaci�n de células CTLL-2 y 32Dβ a una concentración tan baja como 40 pM o 1 nM, respectivamente. Curiosamente, la proteína de fusión que comprende una variante de IL15 con una sustitución de asparragina a ácido asp�rtico en la posición 72 con un amino�cido (c264scTCR/hulL15N72D) era mucho más activa que la proteína de fusión que comprendía el dominio de IL-15 de tipo salvaje al apoyar la proliferaci�n de la línea celular 32Dβ, que muestra la actividad biológica a una concentración tan baja como 80 pM (Figura 19B). En este sentido, la proteína de fusión que comprende la variante de IL-15 (huIL15N72D) mostr� una actividad s�peragon�stica. En un complejo con c264scTCR/IL15RαSushi a una razón uno a uno, c264scTCR/huIL15N72D tenía una capacidad de unión similar a la de c264scTCR/huIL15wt al complejo de p53/HLA-A2.1 en células T2 (Figura 17A), pero mostr� una mayor capacidad de unión a los receptores IL-15Rβγc sobre las células 32Dβ (Figura 17C). En contraste, las proteínas de fusión que comprendían variantes de IL-15 con sustituciones de la posición 8 (c264scTCR/huIL15D8N o c264scTCR/huIL15D8A), en la posición 65 (c264scTCR/huIL15N65A), en la posición 108 (c264scTCR/huIL15Q108A), o una sustitución diferente en la posición 72 (c264scTCR/huIL15N72R) fueron menos activas en el apoyo a la proliferaci�n de las células tanto CTLL-2 como 32Dβ en comparación con la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15wt (Figura 19A y Figura 19B). Se llevaron a cabo estudios similares de la actividad proliferativa dependiente de IL-15 con otras proteínas de fusión que comprendían variantes de IL-15 y se resumen en la Figura 21. Los datos apoyan la hipótesis de que las mutaciones en las posiciones 8, 61, 65, 72 y 108 de la proteína IL-15 pueden dar como resultado antagonistas de IL-15 con disminución de la unión a IL-15R y poca o ninguna actividad para estimular la respuesta inmunitaria. Los resultados con las sustituciones en la posición 72 son inesperados, dado que un mutante (c264scTCR/huIL15N72R) actu� como antagonista de IL-15, mientras que un mutante diferente (c264scTCR/huIL15N72D) mostr� un aumento de la unión a IL-15 R y mayor actividad en la estimulaci�n de respuestas inmunitarias.
En una circunstancia típica, la IL-15 es trans-presentada por IL15Rα sobre la superficie de una célula dendr�tica a los receptores IL-15Rβγc sobre una célula T de memoria, NKT, o NK para apoyar la supervivencia celular y estimular las respuestas inmunitarias. Un antagonista debe bloquear la trans-presentación de IL-15 uniéndose a IL15Rα. Para evaluar si las proteínas de fusión antagonistas pueden competir con c264scTCR/huIL15wt para bloquear su actividad para apoyar el crecimiento de células CTLL-2, se incubaron 4 x 104 células CTLL-2 con 0,5 nM de c264scTCR/huIL15wt en presencia o ausencia de 50 nM (exceso molar de 100 veces) de diversas proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 mutante a 37�C en una incubadora con CO2 durante 24 horas. Las células se incubaron con 10 μl de WST-1 durante 4 horas antes de recoger 150 μl de medio de cultivo para la medición de la absorbancia a 440 nm con un lector de placas de microtitulaci�n. Como se muestra en la Figura 19C, la capacidad de c264scTCR/huIL15wt para apoyar la proliferaci�n de células CTLL-2 fue totalmente bloqueada en presencia de 100 veces más de c264scTCR/huIL15D8N, c264scTCR/huIL15D8A, c264scTCR/huIL15D8A/Q108A, c264scTCR/huIL15Q108A, o c264scTCR/huIL15D8N/N65A, y se redujo 62% en presencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15N72R. Esto sugirió que estas proteínas de fusión eran los antagonistas de la proteína de fusión de c264scTCR/IL15. Estos datos indican que las proteínas de fusión de c264scTCR/huIL15 mutante eran antagonistas funcionales de la actividad de IL-15, como era de esperar basándose en la capacidad de estas proteínas para unirse a los receptores IL-15Rα pero no IL-15Rβγc.
Se llevarán a cabo estudios similares con otras proteínas de fusión de TCR/IL15 y variantes de IL-15 descritas en la presente memoria para demostrar la actividad antagónica y agon�stica de IL-15. Como se resume en la Figura 21, las sustituciones en las posiciones 8, 61, 65, 72, y 108 de IL-15 muestran la capacidad de afectar a la unión de IL-15 a IL-15R (cadenas βγc). Otras sustituciones en las posiciones 92, 101, y 111 de IL-15 también se evaluarán como
posibles sitios de unión para la interacción con IL-15R. Además, las combinaciones de los cambios que incluyen sustituciones en todos o varios de estos residuos pueden crear los antagonistas o agonistas de IL-15 eficaces. Incluyendo las moléculas descritas anteriormente, las variantes de IL-15 que se van a evaluar incluyen aquellas con cambios en la posición 8 a alanina, asparragina, serina, lisina, treonina, o tirosina; en la posición 61 a alanina, asparragina, serina, lisina, treonina, o tirosina; en la posición 65 a alanina, ácido asp�rtico, o arginina; en la posición 72 a alanina, ácido asp�rtico, o arginina; y en las posiciones 92, 101, 108, o 111 a alanina o serina.
Ejemplo 17 -Conjugación célula-célula y redireccionamiento de las células inmunitarias por las proteínas de fusión y complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 y TCR/IL15Rα. (de referencia)
Para demostrar que las proteínas de fusión o los complejos de proteínas de fusión pueden tender puentes entre las células que portan el receptor de IL-15 células diana que portan el p�ptido/MHC, se cargarán células T2 con p�ptido p53 (aa264-272) o p�ptido CMVpp65 (aa495-503) de control y a continuación se marcarán con dihidroetidio. Las células CTLL-2 se marcarán con calce�na AM y las dos poblaciones de células marcadas se mezclarán y se incubar�n en presencia o ausencia de las proteínas de fusión o los complejos de proteínas de fusión. En la ausencia de los complejos de proteínas de fusión o cuando las células T2 se cargaban con p�ptido de control, se prev� que las células permanezcan como dos poblaciones distintas según se evalúa por citometr�a de flujo. Sin embargo, cuando las células T2 se cargan con p53 (aa264-272) y se incuban con las células CTLL-2 en presencia de proteínas o complejos de fusión, la aparición de una población de células con doble tinción sería indicativa de conjugación de las células T2 con las células CTLL-2 a través de las proteínas de fusión o los complejos de proteínas de fusión.
Del mismo modo, se pueden llevar a cabo estudios para demostrar que los complejos de proteínas de fusión pueden tender puentes entre células inmunitarias que portan el receptor de IL-15 y células diana que portan el p�ptido/MHC y dirigir la citotoxicidad inmunitaria contra las células diana. Por ejemplo, las células T2 se cargarán con p�ptido p53 (aa264-272) o p�ptido CMVpp65 (aa495-503) de control y a continuación se marcarán con calce�na AM. Las células efectoras inmunitarias que portan receptores de IL-15 (es decir, células NK o células T activadas) se mezclarán en diferentes proporciones y se incubar�n en condiciones adecuadas (es decir 37�C durante 2-4 horas) en presencia o ausencia del complejo de proteína de fusión. La citotoxicidad se evaluar� basándose en la liberación de calce�na desde las células diana T2 al medio de cultivo mediante métodos convencionales. La liberación específica de calce�na-AM se medir� o se comparar� con el control no específico de calce�na-AM liberada espontáneamente. En ausencia del complejo de proteína de fusión o cuando las células T2 se cargaron con el p�ptido de control, se esperaban bajos niveles de citotoxicidad para las células diana. Sin embargo, cuando las células T2 se cargan con p53 (aa264-272) y se incuban con las células efectoras inmunitarias en presencia del complejo de la proteína de fusión, la lisis específica de las células T2 sería una indicación de que las células efectoras inmunitarias son redireccionadas contra las células presentadoras del p�ptido p53 a través del complejo de proteína de fusión. Se llevarán a cabo estudios similares con líneas de células tumorales que presentan complejos de p53 (aa264272)/HLA-A2.1 como células diana.
Ejemplo 18 - Demostración in vivo de los efectos antitumorales de agonistas de variantes de IL-15 y proteínas de fusión y complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 de referencia
Para determinar si los complejos de proteínas de fusión o agonistas de variantes de IL-15 tienen actividad antitumoral in vivo, se utilizó un modelo de tumor de xenoinjerto experimental. Se han empleado líneas de células tumorales humanas que expresan complejos de p53 (aa264-272)/HLA-A2.1, tales como melanoma A375, adenocarcinoma mamario MDA-MB-231, carcinoma pancreático PANCI, en estudios de eficacia en animales similares utilizando otras proteínas de fusión basadas en TCR (5-7). Por ejemplo, se inyectar�n células de melanoma humano A375 por vía subcutánea en el flanco de ratones carentes de sistema inmunitario y se permitir� que se establezcan los tumores durante tres días. A los ratones portadores de tumor se les inyectar� por vía intravenosa complejo c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi o un agonista de variante de IL-15 (intervalo de dosis - 0,1 a 2 mg/kg), o el volumen de dosis equivalente de PBS, diariamente durante cuatro o más días. Durante el estudio, se medir� el tamaño del tumor y se calcularán los volúmenes del tumor. Se espera que todos los ratones tratados con PBS desarrollen tumores. La supresión del crecimiento del tumor o la regresión completa del tumor en algunos o en todos los ratones tratados con el complejo de proteína de fusión o el agonista de la variante de IL-15 sería una indicación de un efecto antitumoral del tratamiento. Programas de dosificación alternativos, que incluyen la dosificación en múltiples ciclos también pueden demostrar la eficacia antitumoral de la proteína de fusión
o el agonista de la variante de IL-15. Las líneas de células tumorales que carecen de complejos de p53 (aa264272)/HLA-A2.1 (tales como HT-29 o AsPC-1 (5, 9)) se pueden utilizar como controles para el reconocimiento específico de ant�genos por el dominio c264scTCR del complejo de proteína de fusión. Se podrían utilizar complejos de proteínas de fusión alternativos que comprendían otros dominios de TCR (es decir, específicos para el p�ptido CMVpp65 (aa495-503) (9)) como controles d redireccionamiento no tumoral.
Adem�s, se llevarán a cabo estudios de transferencia adoptiva de células en ratones portadores de tumores de xenoinjertos. Por ejemplo, se aislarán células inmunitarias que portan el receptor de IL-15, tales como esplenocitos no sometidos a tratamiento previo o activados (o de memoria), células NK o células T, de ratones y se incubar�n con el complejo de c264scTCR/huIL15 + c264scTCR/huIL15RαSushi o un variante de IL-15 agon�stica en condiciones que permitan la unión a las células. En algunos casos, se utilizarán el complejo de proteína de fusión o una variante
de IL-15 agon�stica para activar las células inmunitarias. Las células activadas con la variante de IL-15 o las células recubiertas con los complejos de proteína de fusión se transferirán a continuación a ratones carentes de sistema inmunitario portadores de tumores A375. Los controles incluirán la transferencia de las células inmunitarias no tratadas, el complejo de proteína de fusión solo y PBS. El crecimiento del tumor se controlar� y se espera que todos los ratones tratados con PBS desarrollen tumores. La supresión del crecimiento del tumor o la regresión completa del tumor en algunos o en todos los ratones tratados con las células activadas con la variante de IL-15 o las células recubiertas con complejos de proteínas de fusión sería una indicación de un efecto antitumoral del tratamiento. Alternativamente, la variante de IL-15 o el complejo de proteínas de fusión y las células inmunitarias se administrarán al mismo tiempo, o por separado en los mismo momento o en momentos diferentes. Las células inmunitarias pueden ser aut�logas o alog�nicas en relación con el anfitrión portador de un tumor. El número de células transferidas y el programa de dosificación se variarán para evaluar y optimizar la eficacia antitumoral. Como se ha descrito anteriormente, se emplearán otras líneas tumorales o complejos de proteínas de fusión para determinar el papel del direccionamiento al ant�geno en cualquier actividad antitumoral observada.
Ejemplo 19 - El tratamiento in vitro de células inmunitarias con complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15: TCR/IL15Rα seguido de transferencia adoptiva de células proporcionan una mejora de la supervivencia en el modelo animal de tumor por xenoinjerto (de referencia)
Para demostrar la eficacia anti-tumoral de las células NK de ratón alog�nicas enriquecidas preincubadas con complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15:TCR/IL15Rα sobre el crecimiento del tumor, se llev� a cabo el siguiente estudio utilizando células tumorales NSCLC A549A2 humanas en un modelo de metástasis experimental en ratones carentes de sistema inmunitario.
A los ratones carentes de sistema inmunitario atómicos (n = 4 por grupo, hembra, 5-6 semanas de edad) se les inyect� por vía intravenosa (IV) a través de la vena lateral de la cola la línea de células tumorales NSCLC humana A549-A2 a 5 x 106 células/ratón. La línea celular A549-A2 representa un transfectante de la línea parental A549 positiva para p53 que porta un vector que expresa el ADNc de HLA-A2.1 humano.
Los bazos de los ratones A2 (fondo B6) se recogieron y las células NK se aislaron utilizando un kit de aislamiento de células NK de Miltenyi Biotech, Inc. de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se prepar� una suspensión de células individuales de esplenocitos mediante homogeneización de los bazos a través de un tamiz met�lico (60 de malla) en HBSS. Los glóbulos rojos de la sangre se lisaron en tampón de lisis sangre roja ACK. Las células se incubaron con cóctel de biotina-anticuerpo (10 μl para 107 células) durante 10 min a 4-8�C. Se determin� el número de leucocitos y se añadieron 30 μl de tampón (PBS, pH 7,2, BSA al 0,5% y EDTA 2 mM) y 20 μl de microcuentas anti-biotina por 107 células y la mezcla se incub� a 4-8�C durante 15 min. Las células se lavaron en 2 ml de tampón y se centrifugaron a 300xg durante 10 min. Las células se resuspendieron en 500 μl de tampón para cargarlas en la columna MACS. Se recogió el flujo continuo y se determin� la pureza de las células NK utilizando el análisis FACScan.
Con el fin de activar las células, las células NK (5 x 106) se cultivaron a 37�C durante la noche en presencia o ausencia de complejo de proteína de fusión de c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα, proteína de fusión de TCR-IL2
o rhIL-2 en matraces T25 en 10 mL de RPMI 1640 con un suplemento de FBS al 10%. El complejo de proteína de fusión de c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα y la proteína de fusión de TCR-IL2 se añadieron a una concentración de 0,8 μg/ml y se a�adi� rhIL-2 a 0,2 mg/ml. Después incubar durante la noche, las células se recogieron y se preincubaron en 0,5 mg/ml de complejo de proteína de fusión de c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα o proteína de fusión de TCR-IL2 o 0,125 mg/ml de rhIL-2 en 100 μl sobre hielo durante 30 min. Después de lavar en PBS (1 ml), las células se resuspendieron en PBS a 10 x 106/mL para la transferencia adoptiva.
El día 1, se inyectaron i.v. a los ratones a través de la vena de la cola células tumorales A549A2 (5 x 106) para establecer tumores pulmonares. Catorce días después de la inyección de las células tumorales, los ratones se aleatorizaron y se dividieron en 5 grupos (n = 4). Los ratones se trataron con ciclofosfamida (CTX) a través de inyección intraperitoneal a una dosis de 200 mg/kg los días 14 y 21. Las células NK (1 x 106/ratón) preincubadas con diferentes proteínas de fusión o rhIL-2 se inyectaron iv los días 16 y 22, y los ratones que recibieron PBS sirvieron como controles. Un resumen del programa de tratamiento es el siguiente:
Grupo
CTX Células NK
Dosis (mg/kg) Inyección (IP) Dosis (x106) Inyección (IV)
CTX
200 Días 14, 21 0 Días 16, 22
CTX + NK/rhIL2
200 Días 14, 21 1 Días 16, 22
CTX + NK/MART-1scTCR-IL2
200 Días 14, 21 1 Días 16, 22
CTX + NK/c264scTCR-IL2
200 Días 14, 21 1 Días 16, 22
CTX + NK/ complejo de proteína de fusión c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα
200 Días 14, 21 1 Días 16, 22
La supervivencia de los ratones portadores de tumores se control� cada día. Los ratones moribundos se sacrificaron y se contaron como muertos. Los ratones que sobrevivieron más de 100 días después de la inyección del tumor se consideraron curados.
Las supervivencias medias para los ratones en los grupos de tratamiento con CTX, CTX + NK/rhIL-2, CTX + NK/MARTIscTCR-IL2, CTX + NK/c264scTCR-IL2 y complejos de proteínas de fusión de c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα son de 52, 67,5, 64,5, 85,5, y 80 días, respectivamente (Figura 20). De este modo, la transferencia adoptiva de las células NK activadas con c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα dio como resultado un tiempo más largo de supervivencia media que el observado en los animales portadores de tumor tratados con quimioterapia solo o con células NK activadas por MARTscTCR-IL2 o rhIL-2 no dirigidos. Los resultados de este experimento piloto indican que la activación y el direccionamiento de las células NK de ratón con c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα pueden proporcionar una mayor actividad antitumoral.
Ejemplo 20 -Mejora de la unión de los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15:TCR/IL15Rα a células inmunitarias que portan IL-15R como se evidencia por un tiempo de residencia prolongado en la superficie celular (de referencia)
El tiempo de residencia en la superficie celular de los complejos de proteínas de fusión sobre las células portadoras de IL-15R puede influir en la capacidad de la proteína de fusión para elegir como diana, o unir mediante puentes células efectoras con células tumorales específicas de TCR. Para investigar esto, se compararon directamente la unión de las proteínas de fusión de scTCR/IL-15, los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15:TCR/IL15Rα e IL-15 recombinante a células CTLL-2 que portan receptor IL-15RαβγC y células CTLL-2 que portan receptores IL15RβγC, células 32Dβ por citometr�a de flujo. Después de la incubaci�n con las diversas proteínas, las células se lavaron y se incubaron en medio a 37�C durante hasta 180 min y el nivel de las proteínas que permanecían en la superficie celular se detect� con mAb anti-IL-15 marcado con PE. Las comparaciones entre la tinción inicial a tiempo cero y tiempos posteriores permitieron la determinación del tiempo de residencia de la superficie celular para cada una de las proteínas que se unían a IL-15R. El aumento del tiempo de residencia sobre la superficie celular de las proteínas de fusión de scTCR/IL-15 o los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15:TCR/IL15Rα en comparación con IL-15 sería una indicación de la actividad de unión al receptor mayor y más estable.
Ejemplo 21 - Aumento de la vida media in vivo de las proteínas de fusión de TCR/IL15 y los complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15:TCR/IL15Rα en comparación con IL-15 en ratones (de referencial)
Se evaluaron los parámetros farmacocin�ticos de c264scTCR/IL-15, complejo c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα, IL-15 recombinante o complejo de IL-15:IL-15Ra soluble en la cepa de ratón transg�nico para HLA-A2.1/Kb. La presencia del dominio HLA-A2.1, para la cual est� restringido c264scTCR/IL-2, puede influir en la farmacocin�tica de esta proteína de fusión y debe proporcionar una visión "humanizada" más relevante de la farmacocin�tica que otras cepas de ratón. A los ratones se les inyectaron por vía intravenosa cantidades equivalentes molares de c264scTCR/IL-15, complejo c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα, IL-15 recombinante o complejo de IL-15:IL-15Ra soluble y se recogió la sangre en varios momentos de 5 minutos a dos semanas después de la inyección. Las concentraciones en suero de las proteínas de fusión se evaluaron utilizando formatos de ELISA, descritos anteriormente. Las concentraciones de IL-15 se detectaron con un ELISA específico de IL-15 convencional.
Los parámetros farmacocin�ticos in vivo de c264scTCR/IL-15, complejo c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα, IL-15
recombinante o complejo de IL-15:IL-15Ra soluble se determinaron utilizando un soporte lógico de ajuste de curvas
(p. ej., WinNonlin). Los valores de Cmax elevados, el incremento de la vida media en suero o la disminución del aclaramiento para c264scTCR/IL-15 o complejo c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Rα en comparación con IL-15 recombinante o complejo de IL-15:IL-15Ra soluble serían una indicación de que la generación de la fusión de TCR-IL15 o del complejo de TCR/IL15:TCR/IL-15Ra proporciona una farmacocin�tica más favorable que la observada con IL-15 sola.
Ejemplo 22 - Demostración in vivo de los efectos inmunosupresores de antagonistas de variantes de IL-15, y proteínas de fusión y complejos de proteínas de fusión de TCR/IL15 de referencia
Para determinar si los complejos de proteínas de fusión o los antagonistas de variantes de IL-15 tienen actividad inmunosupresora in vivo, se utilizó un modelo de artritis autoinmunitaria experimental. Se ha demostrado que la artritis autoinmunitaria se puede inducir después de la administración de col�geno de tipo II (CII) en ratones transg�nicos HLA-DR4 (Rosloniec et al. 1998. J Immunol. 160:2573-8). Adicionalmente, se han caracterizado las células T específicas de CII implicadas en la patología de esta enfermedad. Los genes de TCR de estas células T se utilizaron para construir vectores de expresión y las líneas celulares anfitrionas adecuados para generar CIIscTCR/IL15 que comprendían antagonistas de variantes de IL-15 y proteínas de fusión de CIIscTCR/IL15RαSushi como se ha descrito en ejemplos anteriores. Después de la inducción de la artritis mediante administración de CII, se inyectaron intravenosamente a ratones transg�nicos HLA-DR4 CIIscTCR/IL15-antagonista+complejo CIIscTCR/IL15RαSushi o un antagonista de variante de IL-15 (intervalo de dosificación - 0,1 a 2 mg/kg), o el volumen de dosis equivalente de PBS diariamente durante cuatro o más días. Durante el estudio, se evaluaron las articulaciones de la pata del ratón y se evaluaron para determinar el grado de inflamación en una escala de 0 a 4. Se espera que todos los ratones tratados PBS desarrollen artritis. La supresión de la artritis (p. ej. disminución de la incidencia o la puntuación clónica) en algunos o todos los ratones tratados con el complejo de proteína de fusión o la variante de IL-15 sería una indicación de un efecto inmunosupresor del tratamiento. Estudios de dosificación alternativos que incluyen ciclos múltiples de dosificación también pueden demostrar la eficacia inmunosupresora de la proteína de fusión o la variante de IL-15. Se podrían utilizar complejos de proteínas de fusión alternativos que comprendieran otros dominios de TCR (esto es específicos para el p�ptido p53) como controles no dirigidos a la enfermedad para demostrar la especificidad de la capacidad de las proteínas de fusión de TCR redireccionadas para dirigir la actividad inmunosupresora al sitio de la enfermedad.
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<110> ALTOR BIOSCIENCE CORPORATION 5
<120> Moléculas de fusión y variantes de IL-15
<130> 20793EP1 10 <140>
<141>
<150> 60/928,900
<151> 15
<160> 40
<170> PatentIn Ver. 3.3 20 <210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25 <400> 1
<210> 2 30 <211> 345
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 20 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: P�ptido sintético 10
<400> 3
<210> 4
<211> 1563 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética 20
<400> 4
<210> 5 25 <211> 517
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 5
<210> 6
<211> 1614 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética 10
<400> 6
<210> 7 5 <211> 534
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 7
<210> 8
<211> 1647
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 8
<210> 9
<211> 545
<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
15 <400> 9
<210> 10
<211> 1410 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética 10
<400> 10
<210> 11 15 <211> 468
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 11
<210> 12
<211> 1467 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética 10
<400> 12
<210> 13
<211> 485
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 13
<210> 14
<211> 1614 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética 10
<400> 14 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 15
<210> 16
<211> 534
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Construcción sintética
<400> 16
<210> 17
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Descripci�n de la secuencia artificial: Construcción sintética 10
<400> 17
<210> 18
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Descripción de la Secuencia Artificial: P�ptido sintético 10 <400> 18
<210> 19
<211> 23
<212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
20 <400> 19 caccttgcca tagccagctc ttc 23
<210> 20
<211> 24 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético 30
<400> 20 gtctaagcag cagagtgatg tttg 24
<210> 21 35 <211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 40 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 21 tggttaacaa ctgggtgaat gtaataagtg 30
45 <210> 22
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
50 <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 22 acgcgtttat caagaagtgt tgatgaacat ttggac 36
48 <210> 23
<211> 28
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 23 tggtgggtta acgagcccaa atcttctg 28
<210> 24
<211> 29 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 24 attattacgc gttggagacg gtggagatg 29
<210> 25 25 <211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 25 tgagtgatcg ataccaccat ggagacagac ac 32
35 <210> 26
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 26
tggtggacgc gtaactgggt gaatg 25 45
<210> 27
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 27 55 tggtggtcta gaattatcaa gaagtgttga tg 32
<210> 28
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
65 <400> 28 agtccagcgg tgtcctgtgg 20
49 <210> 29
<211> 31
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 29 tgacgcgttt aagtggtgtc gctgtgccct g 31
<210> 30
<211> 29 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 30 tggttaacat cacgtgccct ccccccatg 29
<210> 31 25 <211> 35
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 31 ttgttgacgc gtttatctaa tgcatttgag actgg 35
35 <210> 32
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 32
taataaacgc gtatcacgtg ccctc 25 45
<210> 33
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 33 55 tggtggtcta gattatcatc taatgcattt g 31
<210> 34
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
65 <400> 34 tgagtgtccg gaaccaccat ggagacagac ac 32
50 <210> 35
<211> 35
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 35 ttgttggcgg ccgcttatca tctaatgcat ttgag 35
<210> 36
<211> 34 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 36 tgagtgttcg aattatcaag aagtgttgat gaac 34
<210> 37 25 <211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 37 ttgttggcgg ccgcttatca agtggtgtcg ctg 33
35 <210> 38
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 38
agatcttcaa tttttttcaa mkhacttatt acattcaccc ag 42 45
<210> 39
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 39 55 actgggtgaa tgtaataagt dmlcttgaaaa aaattgaaga tc 42
<210> 40
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
65 <400> 40 tggtggtcta gattatcaag aagtgttgat g 31

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una variante interleuquina 15 humana (hIL-15) aislada que comprende una sustitución de amino�cido de N a D en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde la variante de hIL-15
    5 funciona como un agonista IL- 15 y tiene un incremento de la actividad de unión para los receptores de cadena beta/gamma del receptor de interleuquina 15 (IL-15RβγC) en comparación con el polip�ptido de IL-15 nativo.
  2. 2. Una variante interleuquina humana 15 (hIL-15) aislada que comprende una sustitución de amino�cido de N a R en la posición 72 de una secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde la variante de hIL-15 funciona como un antagonista de IL-15 y tiene una disminución de la actividad de unión para los receptores IL
    10 15RβγC en comparación con el polip�ptido nativo de la IL-15.
  3. 3.
    Una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IL-15 de la reivindicación 1 o 2.
  4. 4.
    Un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 4.
  6. 6. Un método para producir la variante de IL-15 de la reivindicación 1 o 2, comprendiendo el método: 15 cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 5 en condiciones suficientes para expresar la variante de IL
    15; producir de este modo la variante de IL-15.
  7. 7. El método de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente la purificación de la variante de IL-15.
  8. 8. Una cantidad eficaz de la variante de IL-15 de la reivindicación 1 para su uso en un método de 20 estimulaci�n de respuestas inmunitarias en un mamífero.
  9. 9. Una cantidad eficaz de la variante de IL-15 de la reivindicación 2 para su uso en un método para suprimir las respuestas inmunitarias en un mamífero.
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