ES2642008T3

ES2642008T3 - Moléculas de fusión y variantes de IL-15

Info

Publication number: ES2642008T3
Application number: ES14162248.0T
Authority: ES
Inventors: Hing C. Wong; Peter Rhode; Xiaoyun Zhu; Kai-Ping Han
Original assignee: Altor Bioscience LLC
Current assignee: Altor Bioscience LLC
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2028-05-09
Also published as: US20150132257A1; US20140219955A1; CN108948177A; US11673932B2; CA3028038A1; JP2010527919A; EP2388266B1; US20250066442A1; CA3028038C; ES2518393T3; US9464127B2; EP2160401A1; US10450359B2; US20090324538A1; US20160367635A1; EP2160401B1; JP2014113159A; US11365231B2; CA2690825C; CA2690825A1

Description

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18.: El complejo de proteínas de fusión solubles de uno cualquiera de los apartados 15 -17, en donde la secuencia de la variante de IL-15 tiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de IL15 nativa.

19.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 18, en donde el cambio de aminoácido consiste en una sustitución o deleción de aminoácido en el dominio de IL-15 que interacciona con IL-15Rβ y/o γC.

20.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 18, en donde el cambio de aminoácido consiste en una o más sustituciones o deleciones de aminoácidos en la posición 8, 61, 65, 72, 92, 101, 108, o 111 de la secuencia de IL-15 humana madura (SEQ ID NO: 1).

21.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 18, en donde el cambio de aminoácido consiste en la sustitución de D por N o A en la posición 8, D por A en la posición 61, N por A en la posición 65, N por R en la posición 72 o Q por A en la posición 108 de la secuencia de IL-15 humana madura, o cualquier combinación de estas sustituciones.

22.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 21, en donde el cambio de aminoácido da como resultado una variante de IL-15 que tiene actividad antagónica de IL-15 o disminuye la actividad de unión para los receptores IL-15RβγC en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

23.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 18, en donde el cambio de aminoácido consiste en la sustitución de N por D en la posición 72 de la secuencia de IL-15 humana madura.

24.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 23, en donde el cambio de aminoácido da como resultado una variante de IL-15 que tiene actividad agonística de IL-15 o aumenta la actividad de unión para los receptores IL-15RβγC en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

25.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 1 -24, en donde el primer polipéptido biológicamente activo está unido covalentemente al polipéptido de IL-15 (o un fragmento funcional del mismo) por medio de una secuencia conectora polipeptídica.

26.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 1 -25, en donde el segundo polipéptido biológicamente activo está unido covalentemente al polipéptido IL-15Ra (o un fragmento funcional del mismo) por medio de una secuencia conectora polipeptídica.

27.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 5, en donde el antígeno para el dominio TCR comprende un antígeno peptídico presentado en una molécula del MHC o HLA.

28.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 27, en donde el antígeno peptídico deriva de un polipéptido asociado a tumor o un polipéptido codificado por un virus.

29.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 12, en donde el antígeno para el dominio de anticuerpo comprende un receptor o ligando de la superficie celular.

30.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 12 o 29, en donde el antígeno comprende un antígeno CD, receptor o ligando de citoquina o quimioquina, receptor o ligando de factor de crecimiento, molécula de adherencia celular, moléculas de MHC/de tipo MHC, receptor de Fc, receptor de tipo Toll, receptor de NK, TCR, BCR, receptor o ligando co-estimulador positivo/negativo, receptor o ligando de tipo muerte, antígeno asociado a tumor, o antígeno codificado por virus.

31.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 1 -30 y 73 -74, en donde el polipéptido IL-15Ra comprende el dominio extracelular del receptor alfa de IL-15 capaz de unirse al polipéptido de IL-15.

32.: El complejo de proteínas de fusión solubles de uno cualquiera de los apartados 1 -31 y 73 -74, en donde el polipéptido IL-15Ra comprende el dominio sushi de IL-15a o el dominio IL-15a∆E3.

33.: Una secuencia de aminoácidos que codifica la primera proteína de fusión de uno cualquiera de los apartados 1 -30 y 73 -74.

34.: Una secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína de uno cualquiera de los apartados 1 32 y 73 -74.

35.: La secuencia de ácido nucleico de los apartados 33 o 34, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende adicionalmente un promotor, una señal de inicio de la traducción, y una secuencia líder unida operablemente a la secuencia que codifica la proteína de fusión.

36.: Un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico del apartado 33.

37.: Un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico del apartado 34.

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62.: El complejo de la variante de IL-15 del apartado 59, en donde el cambio de aminoácido consiste en la sustitución de D por N o A en la posición 8, D por A en la posición 61, N por A en la posición 65, N por R en la posición 72 o Q por A en la posición 108 de la secuencia de IL-15 humana madura, o cualquier combinación de estas sustituciones.

63.: El complejo de la variante de IL-15 del apartado 62, en donde el cambio de aminoácido da como resultado una variante de IL-15 que tiene una actividad antagónica de IL-15 o una disminución de la actividad de unión para los receptores IL-15RβγC en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

64.: El complejo de la variente de IL-15 del apartado 59, en donde el cambio de aminoácido consiste en la sustitución de N por D en la posición 72 de la secuencia de IL-15 humana madura.

65.: El complejo de la variente de IL-15 del apartado 64, en donde el cambio de aminoácido da como resultado una variante de IL-15 que tiene actividad agonística de IL-15 o un aumento de la actividad de unión para los receptores IL-15RβγC en comparación con el polipéptido de IL-15 nativo.

66.: Una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de IL-15 de los apartados 57 -65.

67.: Un vector de ADN que comprende la secuencia de ácido nucleico del apartado 66.

68.: Una célula anfitriona que comprende el vector del apartado 67.

69.: Un método para producir la variante de IL-15 del apartado 57, comprendiendo el método:

b) cultivar la célula anfitriona del apartado 68 en condiciones suficientes para expresar la variante de IL-15;

produciendo de ese modo la variante de IL-15.

70.: El método del apartado 70, que comprende adicionalmente purificar la variante de IL-15.

71.: Un método de estimulación de respuestas inmunitarias en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 57 – 65.

72.: Un método de supresión de respuestas inmunitarias en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la variante de IL-15 del apartado 57 – 65.

73.: El complejo de proteínasa de fusión solubles del apartado 1, en donde el primer polipéptido biológicamente activo comprende un polipéptido TCRα o un fragmento funcional del mismo y el segundo polipéptido biológicamente activo comprende un polipéptido TCRβ o un fragmento funcional del miso.

74.: El complejo de proteínas de fusión solubles del apartado 1, en donde el primer polipéptido biológicamente activo comprende un polipéptido de cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo y el segundo polipéptido biológicamente activo comprende un polipéptido de cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 (A y B) es un dibujo esquemático. (A) es un esquema que representa un ejemplo de un complejo de una proteína de fusión que contiene polipéptidos de TCR de cadena sencilla. (B) es un esquema que representa constructos representativos de proteínas de fusión que comprende el complejo de proteínas de fusión. (Referencial)

La Figura 2 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa de del vector de expresión de pNEF38-c264scTCR/huIL15. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15 y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15, incluyendo la secuencia líder. (Referencial)

La Figura 3 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38c264scTCR-bisagra-huIL15. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15 y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15, incluyendo la secuencia líder. (Referencial)

La Figura 4 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15RαΔE3 y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαΔE3, incluyendo la secuencia líder. (Referencial)

La Figura 5 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa un mapa del vector de expresión de pNEF38c264scTCR/huIL15RaSushi. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR/huIL15RαSushi y (C) muestra la secuencia de la proteína de fusión de c264scTCR/huIL15RαSushi, incluyendo la secuencia líder. (Referencial)

La Figura 6 (A -C) consiste en tres paneles. (A) representa el vector de expresión de pNEF38-c264scTCR-bisagrahuIL15RaSushi. (B) muestra la secuencia del gen de fusión de c264scTCR-bisagra-huIL15RαSushi y (C) muestra la

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las cadenas a y b de la molécula de TCR. Cuando semejante cadena peptídica beta es expresada junto con la cadena a, el péptido TCR-efector unido se debe plegar dando como resultado una molécula de TCR funcional como se representa generalmente en la Figura 1. Una secuencia conectora adecuada es ASGGGGSGGG (esto es ala ser gly gly gly gly ser gly gly gly), unida preferiblemente al primer aminoácido del dominio b del TCR. Se podrían utilizar secuencias conectoras diferentes incluyendo cualquiera de los numerosos diseños de conectores flexibles que se ha utilizado con éxito para conectar entre sí regiones variables de anticuerpos, véase Whitlow, M. et al., (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzimology 2:97-105. En algunos ejemplos, para unir covalentemente una molécula efectora a una molécula de la cadena b de TCR, la secuencia de aminoácidos del conector debe ser capaz de abarcar una distancia adecuada desde el residuo C terminal de la cadena beta de TCR hasta el residuo N terminal de la molécula efectora. Las secuencias conectoras adecuadas se pueden identificar fácilmente de manera empírica. Adicionalmente, también se pueden determinar el tamaño y las secuencias adecuadas de las secuencias conectoras mediante técnicas de modelado por ordenador convencionales basadas en el tamaño y en la forma pronosticados de la molécula de TCR.

El general, la preparación de los complejos de proteínas de fusión de la invención se puede completar mediante procedimientos descritos en la presente memoria y mediante técnicas de ADN recombinante reconocidas que implican, p. ej., reacciones de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR), preparación de ADN plasmídico, escisión de ADN con enzimas de restricción, preparación de oligonucleótidos, ligación de ADN, aislamiento de ARNm, introducción del ADN en una célula adecuada, transformación o transfección de un anfitrión, cultivo del anfitrión. Adicionalmente, las moléculas de fusión se pueden aislar y purificar utilizando agentes caotrópicos y métodos electroforéticos, de centrifugación y cromatográficos bien conocidos. Véanse en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Ed.) (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York (1989) para descripciones relacionadas con estos métodos.

Según se utiliza en la presente memoria, los polipéptidos biológicamente activos o moléculas efectoras de la invención pueden incluir factores tales como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, toxinas proteicas, dominios de inmunoglobulina u otras proteínas bioactivas tales como enzimas. Asimismo, los polipéptidos biológicamente activos pueden incluir productos conjugados con otros compuestos, tales como toxinas no proteicas, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, marcas detectables, materiales radiactivos y similares.

Las citoquinas de la invención se definen por medio de cualquier factor producido por células que afectan a otras células y son responsables de cualquiera de una serie de múltiples efectos de la inmunidad celular. Los ejemplos de las citoquinas incluyen, pero no se limitan a, la familia de IL-2, las familias de citoquinas interferón (IFN), IL-10, IL-1, IL-17, TGF y TNF, y a IL-1 a IL-35, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TGF-β, TNF-α y TNF-β.

De acuerdo con la invención, la primera proteína de fusión comprende un primer polipéptido biológicamente activo que es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo unido covalentemente al dominio interleuquina-15 (IL-15) o un fragmento funcional del mismo. La IL-15 es una citoquina que afecta a la activación y proliferación de células T. La actividad de IL-15 al afectar a la activación y proliferación de células inmunitarias es similar en algunos aspectos a IL2, aunque se han caracterizado bien las diferencias fundamentales (Waldmann, TA, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601.

En otro aspecto de la invención, la primera proteína de fusión comprende un dominio interleuquina-15 (IL-15) que es una variante de IL-15 (también referida en la presente memoria como mutante de IL-15). La variante de IL-15 comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos diferente de la de la proteína IL-15 nativa. La variante de IL-15 se une preferiblemente al polipéptido de IL-15Ra y funciona como agonista o antagonista de IL-15. Preferiblemente, las variantes de IL-15 con actividad agonística tienen una actividad superagonística. En algunas realizaciones, la variante de IL-15 puede funcionar como agonista o antagonista de IL-15 independientemente de su asociación con IL-15Ra. Los agonistas de IL-15 se ilustran por una actividad biológica comparable o mayor en comparación con la IL-15 de tipo salvaje. Los antagonistas de IL-15 se ilustran por una actividad biológica menor en comparación con la IL-15 de tipo salvaje o por la capacidad para inhibir las respuestas mediadas por IL-15. En algunos ejemplos, la variante de IL-15 se une con una actividad mayor o menor a los receptores IL-15RβγC. En algunas realizaciones, la secuencia de la variante de IL-15 tiene al menos un cambio de aminoácido, p. ej., sustitución o deleción, en comparación con la secuencia de IL-2 nativa, dando como resultado tales cambios una actividad agonística o antagónica de IL-15. Preferiblemente las sustituciones/deleciones de aminoácidos se encuentran en los dominios de IL-15 que interaccionan con IL-15Rβ y/o γC. Más preferiblemente, las sustituciones/deleciones de aminoácidos no afectan a la unión al polipéptido de IL-15Ra o a la capacidad para producir la variante de IL-15. Las sustituciones/deleciones de aminoácidos adecuadas para generar variantes de IL15 se pueden identificar basándose en estructuras de IL-15 supuestas o conocidas, comparaciones de IL-15 con moléculas homólogas tales como IL-2 con estructura conocida, a través de mutagénesis racional o al azar y análisis funcionales proporcionados en la presente memoria, u otros métodos empíricos. Adicionalmente las sustituciones de aminoácidos adecuadas pueden ser cambios e inserciones conservativos o no conservativos de aminoácidos adicionales. Preferiblemente las variantes de IL-15 de la invención contienen una o más de una sustituciones/deleciones de aminoácidos en la posición 8, 61, 65, 72, 92, 101, 108, o 111 de la secuencia de IL-15 humana madura; concretamente, sustituciones D8N ("D8" se refiere a la posición del aminoácido y el residuo en la secuencia de IL-15 humana madura nativa y "N" se refiere al residuo de aminoácido sustituido en esa posición en la variante de IL-15), D8A, D61A, N65A, N72R o Q108A dan como resultado variantes de IL-15 con actividad

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anfitrión adecuado para la expresión del péptido de fusión de TCR. Véase, en general, Sambrook et al., más arriba. La selección de vectores adecuados puede realizarse empíricamente basándose en factores relacionados con el protocolo de clonación. Por ejemplo, el vector debe ser compatible con, y tener el replicón apropiado para el anfitrión que se está empleando. Adicionalmente el vector debe ser capaz de acomodar la secuencia de ADN que codifica el complejo de fusión de TCR que se va a expresar. Las células anfitrionas adecuadas incluyen células eucarióticas y procarióticas, preferiblemente aquellas células que pueden transformarse fácilmente y exhiben un rápido crecimiento en medio de cultivo. Las células anfitrionas específicamente preferidas incluyen procariotas tales como E. coli, Bacillus subtilis, etc. y eucariotas tales como células animales y cepas de levadura, p. ej., S. cerevisiae. Generalmente se prefieren células de mamíferos, particularmente J558, NSO, SP2-O o CHO. Otros anfitriones adecuados incluyen, p. ej., células de insecto tales como Sf9. Se emplean condiciones de cultivo convencionales. Véase Sambrook, más arriba. A continuación se pueden seleccionar las líneas celulares transformadas o transfectadas estables. Las células que expresan un complejo de fusión de TCR de la invención se pueden determinar por medio de procedimientos conocidos. Por ejemplo, la expresión de un complejo de fusión de TCR unido a una inmunoglobulina se puede determinar mediante un ELISA específico para la inmunoglobulina unida y/o mediante inmunotransferencia. Otros métodos para detectar la expresión de las proteínas de fusión que comprenden TCR unidos a dominios IL-15 o IL-15Ra se describen en los Ejemplos.

Como se menciona generalmente más arriba, se puede utilizar una célula anfitriona con fines preparativos para propagar el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada. De este modo, una célula anfitriona puede incluir una célula procariótica o eucariótica en la cual se desea específicamente la producción de la proteína de fusión. Por lo tanto las células anfitrionas incluyen específicamente, células y órganos de levadura, mosca, gusano, planta, rana, mamífero que son capaces de propagar el ácido nucleico que codifica la fusión. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares de mamífero que se pueden utilizar incluyen células CHO dhfr-(Urlaub y Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), células 293 (Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)) o células de mieloma de tipo SP2 o NSO (Galfre y Milstein, Meth. Enzymol, 73(B): 3 (1981)).

Las células anfitrionas capaces de propagar el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada abarcan también células eucarióticas no de mamífero, incluyendo células de insecto (p. ej., Sp. frugiperda), levadura (p. ej.,

S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha; como fue revisado en general por Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992)), fúngicas y vegetales. También se contemplan ciertos procariotas tales como E. coli y Bacillus.

El ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada se puede introducir en una célula anfitriona mediante técnicas convencionales para la transfección de células. Se pretende que el término "transfectar" o "transfección" incluya todas las técnicas convencionales para introducir ácido nucleico en células anfitrionas, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección, transducción y/o integración viral. Los métodos adecuados para transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook et al. más arriba, y en otros libros de texto de laboratorio.

Se pueden utilizar diversos promotores (región reguladora del inicio de la transcripción) de acuerdo con la invención. La selección del promotor apropiado depende del anfitrión de expresión propuesto. Los promotores procedentes de fuentes heterólogas se pueden ser utilizar siempre y cuando sean funcionales en el anfitrión seleccionado.

La selección del promotor también depende de la eficacia y del nivel de producción del péptido o proteína deseados. A menudo se emplean promotores inducibles tales como TAC con el fin de aumentar drásticamente el nivel de expresión de proteína en E. coli. La expresión en exceso de las proteínas puede ser perjudicial para las células anfitrionas. En consecuencia, el crecimiento de la célula anfitriona puede ser limitado. El uso de sistemas promotores inducibles permite que las células anfitrionas sean cultivadas a densidades aceptables antes de la inducción de la expresión génica, facilitando de este modo mayores rendimientos de productos.

Se pueden utilizar diversas secuencias señal de acuerdo con la invención. Se puede utilizar una secuencia señal que es homóloga a la secuencia codificante de TCR. Alternativamente, también se puede utilizar una secuencia señal que ha sido seleccionada o diseñada para la secreción y procesamiento eficaces en el anfitrión de expresión. Por ejemplo, los pares de secuencia señal/célula anfitriona adecuados incluyen la secuencia señal sacB de B. subtilis para la secreción en B. subtilis, y la secuencia señal del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae o Phol de la fosfatasa ácida de P. pastoris para la secreción en P. pastoris. La secuencia señal se puede unir directamente a través de la secuencia que codifica el sitio de escisión de la peptidasa señal a la secuencia que codifica la proteína, o a través de un puente de nucleótidos corto que consiste normalmente en menos de diez codones, donde el puente garantiza un marco de lectura correcto de la secuencia de TCR aguas abajo.

Los elementos para potenciar la transcripción y la traducción han sido identificados para los sistemas de expresión de proteínas eucarióticas. Por ejemplo, el posicionamiento del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de 1000 pb en cada lado de un promotor heterólogo puede elevar los niveles de transcripción de 10 a 400 veces en células vegetales. El constructo de expresión también debe incluir las secuencias de inicio de la traducción apropiadas. La modificación del constructo de expresión para incluir una secuencia consenso de Kozak para un inicio adecuado de la traducción puede aumentar el nivel de traducción 10 veces.

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proteínas de fusión se encuentran presentes preferiblemente con una homogeneidad de al menos 80% o 90% a 95% (p/p). Las proteínas de fusión que tienen una homogeneidad de al menos 98 a 99% (p/p) son las más preferidas para muchas aplicaciones farmacéuticas, clínicas y de investigación. Una vez purificada sustancialmente, la proteína de fusión debe estar sustancialmente libre de contaminantes para las aplicaciones terapéuticas. Una vez purificada parcialmente o hasta una pureza sustancial, las proteínas de fusión solubles pueden ser utilizadas terapéuticamente,

o en la realización de análisis in vitro o in vivo como se describe en la presente memoria. La pureza sustancial se puede determinar mediante una variedad de técnicas convencionales tales como la cromatografía y la electroforesis en gel.

Los complejos de fusión de TCR truncado de la invención contienen una molécula de TCR que está suficientemente truncada, de manera que el complejo de fusión de TCR puede ser secretado al medio de cultivo después de la expresión. De este modo, un complejo de fusión de TCR truncado no incluirá regiones ricas en residuos hidrófobos, típicamente los dominios transmembrana y citoplásmico de la molécula de TCR. De este modo, por ejemplo, para una molécula de TCR DR1 truncada preferida de la invención, preferiblemente de aproximadamente los residuos 199 a 237 de la cadena b y de aproximadamente los residuos 193 a 230 de la cadena a de la molécula de TCR no están incluidos en el complejo de fusión de TCR truncado.

Los presentes complejos de fusión y conjugados de TCR son adecuados para su uso in vitro o in vivo con una variedad de células que están infectadas o pueden ser infectadas por una o más enfermedades.

Métodos

Terapéuticos

Se describen los métodos para prevenir o tratar enfermedades en pacientes en los que las células enfermas expresan un antígeno asociado con la enfermedad, comprendiendo el método administrar al paciente un complejo de proteínas de fusión soluble que comprende un polipéptido biológicamente activo que reconoce un antígeno asociado con la enfermedad, formar un complejo de unión específico (puente) entre las células enfermas que expresan el antígeno y las células inmunitarias que expresan IL-15R suficiente para localizar las células inmunitarias, y dañar o eliminar las células enfermas lo suficiente como para prevenir o tratar la enfermedad en el paciente.

Se incluyen los métodos para prevenir o tratar enfermedades en pacientes en los que las células enfermas expresan un antígeno asociado con la enfermedad, comprendiendo el método mezclar células inmunitarias que portan las cadenas de IL-15R con un complejo de proteínas de fusión soluble que comprende un polipéptido biológicamente activo que reconoce un antígeno asociado con la enfermedad, por ejemplo un complejo de péptido/MHC, administrar al paciente la mezcla de célula inmunitaria-complejo de proteínas de fusión, formar un complejo de unión específico (puente) entre las células enfermas que expresan el antígeno y las células inmunitarias que expresan IL-15R suficiente para localizar las células inmunitarias, y dañar o eliminar las células enfermas lo suficiente como para prevenir o tratar la enfermedad en el paciente.

Asimismo se describen los métodos para eliminar una célula diana, comprendiendo el método poner en contacto una pluralidad de células con un complejo de proteínas de fusión soluble, donde la pluralidad de células comprende adicionalmente células inmunitarias que portan las cadenas de IL-15R reconocidas por el dominio IL-15 de la reivindicación 1 y las células diana que portan un antígeno reconocido por al menos uno de los polipéptidos biológicamente activos descritos en la presente memoria, formar un complejo de unión específico (puente) entre el antígeno sobre células diana y las cadenas de IL-15R sobre las células inmunitarias suficiente para unirse a y activar las células inmunitarias; y eliminar las células diana por medio de las células inmunitarias activadas unidas.

Asimismo se describen los métodos para incrementar la vida media in vivo de IL-15 y/o potenciar su capacidad para unirse establemente a las células inmunitarias (p. ej. aumento del tiempo de residencia en la superficie celular) a través de la generación de un complejo de proteínas de fusión soluble. Por ejemplo, se lleva a cabo la evaluación de los parámetros farmacocinéticos y el tiempo de residencia en la superficie celular del complejo de proteínas de fusión y se compara con IL-15 como se describe en la presente memoria. Los complejos de proteínas de fusión con un aumento de la vida media en suero o del tiempo de residencia en la superficie celular son preferibles basándose en la mejora de su utilidad terapéutica.

Los ejemplos de las enfermedades que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, neoplasias, incluyendo cáncer, o infecciones virales. Mediante "neoplasia" se quiere significar cualquier enfermedad que es causada por o resulta de niveles inadecuadamente altos de división celular, niveles inadecuadamente bajos de apoptosis, o ambos. Por ejemplo, el cáncer es un ejemplo de una neoplasia. Los ejemplos de cánceres incluyen, sin limitación, leucemias

(p. ej., leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad no de Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (p. ej., fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma

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Si bien uno o más compuestos de la invención se pueden administrar solos, también pueden estar presentes como parte de una composición farmacéutica mezclados con un excipiente convencional, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración parenteral, oral u otra administración deseada y que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos y no sean perjudiciales para el receptor de los mismos. Las composiciones farmacéuticas de la invención en general comprenden uno o más complejos de proteínas de fusión de la invención o constructos de ADN que codifican tales compuestos junto con uno o más portadores aceptables. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroethral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes coadyuvantes, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan de manera perjudicial con los compuestos activos.

Para la aplicación parenteral, son particularmente adecuadas las disoluciones, preferiblemente disoluciones oleosas

o acuosas así como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son dosificaciones unitarias convenientes.

Para la aplicación entérica, son particularmente adecuados los comprimidos, grageas o cápsulas que tienen un aglutinante portador de talco y/o carbohidrato o similar, siendo preferiblemente el portador lactosa y/o almidón de maíz y/o almidón de patata. Se puede utilizar un jarabe, elixir o similar en donde se emplea un vehículo edulcorado. Las composiciones de liberación sostenida se pueden formular incluyendo aquellas en las que el componente activo está protegido con recubrimientos diferencialmente degradables, p. ej., mediante microencapsulación, recubrimientos múltiples, etc.

Los compuestos terapéuticos de la invención también se pueden incorporar a liposomas. La incorporación se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos de preparación de liposomas conocidos, por ejemplo sonicación y extrusión. Los métodos convencionales adecuados de preparación de liposomas también son descritos p. ej., por

A.D. Bangham et al., J. Mol. Biol., 23:238-252 (1965); F. Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, 557:9-23 (1979); F. Szoka et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 75:4194-4198 (1978); S. Kim et al., Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348 (1983); y Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986).

La invención también proporciona el uso para invocar una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como un ser humano, incluyendo la vacunación de un mamífero tal como un ser humano contra un agente infeccioso o un trastorno diana, tal como el cáncer.

Estos métodos comprenden administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una secuencia de ADN que comprende un vector de ADN que codifica un complejo de proteínas de fusión de la invención. La preparación de los vectores de expresión de complejos de proteínas de fusión y variantes de IL-15 se describe más arriba y en los Ejemplos que siguen. Se ha informado sobre los métodos para la administración del ADN plasmídico, la absorción de ese ADN por las células del sujeto al que se ha administrado y la expresión de la proteína. Váse Ulmer, J.B., et al, Science (1993) 259:1745-1749.

Los vectores de ADN que codifican los complejos de proteínas de fusión de la invención se administran adecuadamente a un mamífero incluyendo un ser humano, preferiblemente mediante inyección intramuscular. La administración de ADNc al músculo esquelético de un mamífero con la absorción subsiguiente del vector de expresión administrado por parte de las células musculares y la expresión de la proteína codificada por el ADN han sido descritas por Ulmer et al. y representan un protocolo ilustrativo [Ulmer, J.B., et al, Science 259:1745-1749]. La dosis óptima para una aplicación terapéutica dada se puede determinar mediante métodos convencionales.

Además del tratamiento de trastornos humanos, los complejos de proteínas de fusión de la invención y los constructos de ADN de la invención que codifican tales moléculas tendrán un uso significativo para aplicaciones veterinarias, p. ej., tratamiento de trastornos del ganado tal como ganado vacuno, ovejas, etc. y animales domésticos tales como perros y gatos.

Se apreciará que las cantidades preferidas reales de un complejo de proteínas de fusión de la invención dado o el constructo de ADN que los codifica utilizadas en una terapia dada variarán de acuerdo con el compuesto o compuestos activos concretos que se estén utilizando, las composiciones concretas formuladas, el modo de aplicación, el sitio concreto de administración, el peso del paciente, la salud general, el sexo, etc., la indicación concreta que esté siendo tratada, etc. y otros factores semejantes que son reconocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el médico o veterinario a cargo. La tasas de administración óptimas para un protocolo de administración dado pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica usando ensayos de determinación de dosificación convencionales realizados por ejemplo, con respecto a las directrices anteriores y los ensayos descritos en la presente memoria.

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5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'

mediante PfuUltra (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94°C, 1 min; 63°C, 1 min; 72°C, 1 min; x35 ciclos; 72°C, 10 min. El gen de la proteína IL15 humana madura se purificó en gel y se clonó en el vector lanzadera, pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Vector (Invitrogen), con la reacción TOPO de acuerdo con el protocolo del fabricante. El clon que contenía el inserto de gen de la proteína IL15 humana madura se identificó basándose en la PCR de diagnóstico con el cebador directo

5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'

y el cebador inverso

5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'

mediante Redtag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94°C, 1 min; 63°C, 1 min; 72°C, 1 min; x35 ciclos; 72°C, 10 min. La secuencia del clon correcto se verificó mediante secuenciación de ADN con GenomeLab Dye Termination Cycle Sequencing con un Quick Start Kit (Beckman Coulter) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El gen de la proteína IL15 humana madura se retiró del vector lanzadera mediante digestión con HpaI y MluI y se ligó en un vector de expresión pNEF38-c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. El vector de expresión pNEF38c264scTCR contiene el fragmento génico que codifica una secuencia líder de la cadena ligera de inmunoglobulina (o señal secretora) conectada a la proteína TCR de cadena sencilla quimérica soluble específica del péptido p53 (aa264-272) (c264scTCR) (5). El vector también contiene regiones reguladoras/potenciadoras 5', regiones reguladoras y promotoras de la transcripción, secuencias reguladoras/de inicio/terminación de la traducción, incluyendo una secuencia consenso de Kozak y una región de terminación poli-A, y regiones reguladoras 3' con supuestos elementos reguladores del anclaje a la matriz. El vector también contiene secuencias de ADN que permiten el crecimiento selectivo en células de mamífero (promotor de SV40/gen neoR/poli-A) y bacterias (gen Ori/AMP). La clonación del fragmento de ADN que codifica la proteína IL15 humana madura en el vector pNEF38c264scTCR dio como resultado un gen de fusión c264scTCR/huIL15 que comprendía la siguiente secuencia: 3'-líder de la cadena ligera de inmunoglobulina -264 TCR V-α -conector peptídico -264 TCR V-β -TCR C-β humano -IL-15 humana. El vector resultante (pNEF38-c264scTCR/huIL15), que se muestra en la Figura 2A, se identificó basándose en la PCR de diagnóstico y se volvió a confirmar mediante secuenciación de ADN. Las secuencias del gen de fusión c264scTCR/huIL15 y de la proteína (incluyendo la secuencia líder) se muestran en la Figura 2B y la Figura 2C, respectivamente.

Ejemplo 3 -Construcción de la fusión génica de c264scTCR/huIL15 que contiene una región bisagra de IgG1 humana mutada en un vector de expresión. (Referencial)

La construcción del vector pNEF38-c264scTCR/huIL15 se describió en el Ejemplo 2. Se utilizó una región bisagra mutada de la cadena H de IgG1 humana, en donde se sustituyeron tres residuos de cisteína por tres residuos de serina para conectar c264scTCR y huIL15. La región de bisagra se mutó y se amplificó a partir del gen 264scTCR/IgG1 descrito previamente (7) con el cebador directo

5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'

y el cebador inverso

5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'

mediante PfuUlta (Stratagene) en las siguientes condiciones de PCR: 94°C, 30 s; 65°C, 30 seg; 70°C 1 min; x35 ciclos; 72°C, 10 min. El producto de ADNc de la PCR de la bisagra de IgG1 humana mutada de 70 pb se separó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisló. El producto de ADNc se purificó de la agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El gen de la región bisagra mutado se digirió con HpaI y MluI y se ligó en pNEF38-c264scTCR que había sido digerido con HpaI y MluI. El clon que contenía el inserto del gen de la región bisagra mutado se identificó basándose en la PCR de diagnóstico con el cebador directo

5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'

y el cebador inverso

5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'

mediante Redtag (Sigma) en las siguientes condiciones: 94°C, 30 s; 64°C, 30 seg; 70°C 1 min; x35 ciclos; 72°C, 10 min. La huIL15 se amplificó a partir del vector pNEF38-c264scTCR/huIL15 descrito en el Ejemplo 2 con el cebador directo

5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'

y el cebador inverso

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Claims

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