CN1305905C - 人源化抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人源化抗体，由包含下述步骤的方法制成：(a)选择鼠单克隆抗体重链和轻链可变区的互补决定区(CDR)的特异性决定残基(SDR)；和(b)将所述SDR移接到人抗体可变区中至少一个相应的氨基酸序列上。

Description

人源化抗体及其制备方法
发明领域
本发明涉及通过将鼠单克隆抗体的CDR(互补决定残基)中的SDR(特异性决定残基)移接(graft)到人的抗体中来制备人源化抗体的方法，以及通过所述方法制备的人源化抗体。
发明背景
为了预防传染病如乙型肝炎，通常采用施用在血浆中形成的针对靶抗原免疫球蛋白的方法。但是，该方法存在免疫球蛋白一般特异性很低而且可能含有污染的问题。
已经有报道称，来自小鼠的鼠单克隆抗体对抗原具有很高的亲和力，并且适合大规模生产。但是反复注射鼠单克隆抗体会诱发免疫反应，因为在人体中鼠单克隆抗体被看作外来抗原(Sbawler D.L.等，J.Immunol.，135，1530-1535(1985))。
因此，人们作出许多努力来制备“人源化抗体”：将能直接与抗原结合的鼠单克隆抗体的可变区CDR(互补决定区)移接到人抗体的构架上(CDR-移接方法)；和用鼠单克隆抗体的氨基酸残基替换影响CDR的构象的人抗体的构架区域(FR)的氨基酸残基。这样获得的人源化抗体保持了原始的鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，并且在人体中将HAMA(人抗鼠抗体)反应降到最低。(Riechmann等，Nature，332，323-327(1988)；Queen C.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，86，10029-10033(1989)；Nakatani等，Protein Engineering，7，435-443(1994))。但是当该人源化抗体反复注射到人体中时仍会产生问题(Stephens等，Immunology，85，668-674(1995)；Sharkey等，Cancer Research，55，5935s-5945s(1995))。
世界上大约有300百万的人携带可以引起慢性传染的，导致肝硬化和肝细胞癌症的乙型肝炎病毒(“HBV”)(Tiollais P.和Buendia M.A.，Sci.Am，264，48(1991))。HBV的外壳由3种蛋白构成，主要蛋白含有S抗原，中间蛋白含有S和前-S2抗原，大蛋白则含有S、前-S2和前-S1抗原(Neurath A.R.和Kent S.B.，Adv.Vir.Res.，34，65-142(1988))。已知这些表面抗原在肝炎患者体内形成抗HBV抗体的过程中起着重要的作用。具体而言，发现前-S1区处于传染性的病毒颗粒上(Heermann等，J.Virol.，52，396-402(1984))并且在与细胞表面感染的附着中起作用(Neurath等，Cell，46，429(1986)；Pontisso等，Virol.，173，533，(1989)；Neurath等，Vaccine，7，234(1989))。因此，抗前-S1的单克隆抗体将有效抗病毒的感染。
本发明人以前报道过抗HBV前-S1的鼠单克隆抗体(KR127)(韩国专利No.246128)、编码鼠单克隆抗体KR127的基因(韩国专利No.250832)和通过CDR-移接方法制备的KR127的人源化抗体(HZKP127I))(韩国专利No.246128)。
本发明人经过进一步的努力改进了人源化抗体，它将不利的免疫反应(HAMA反应)降到最低，同时增强了与抗原的亲和力，并且发现当小鼠抗体的CDR氨基酸残基用人抗体的氨基酸残基替换后，可以降低HAMA反应。
发明概述
因此，本发明的目的是提供一种用于制备人源化抗体的方法，期望它与已有技术中人源化抗体相比能表现出较低的HAMA反应和更高的亲和力。
本发明的另一个目的是提供根据所述方法制备的人源化抗体。
本发明的另一个更进一步的目的是提供编码所述抗体重链或轻链的DNA和含有所述DNA的载体。
本发明再进一步的目的是提供用所述载体转化了的微生物。
依照本发明的一个方面，提供了制备人源化抗体的方法，包括步骤：(a)选择鼠单克隆抗体的重链和轻链的可变区的互补决定区(CDR)的特异性决定残基(SDR)；和(b)将所述SDR的氨基酸残基移接到人抗体可变区中至少一个相应的氨基酸序列上。
附图简要说明
上述的以及本发明的其它的目的和特点将通过下文的发明详述并结合下面相应的附图来说明，这些附图分别是：
图1：嵌合重链的表达载体的构建过程；
图2：人源化重链可变区的核苷酸和氨基酸序列；
图3：嵌合轻链的表达载体的构建过程；
图4：人源化轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列；
图5：具有重链CDR突变的人源化抗体的抗原亲和力；
图6：人源化抗体的表达载体的构建过程；和
图7和图8：HuKR127重链可变区上MHC II类-结合肽序列和HuKR127轻链可变区上MHC II类-结合肽序列分别与HzKR127I相比的分析结果。
发明详述
本发明的人源化抗体可以通过移接鼠单克隆抗体的SDR氨基酸残基到人抗体可变区中相应的氨基酸序列上来制备。
可以通过用丙氨酸独立地替换鼠单克隆抗体CDR的每一个氨基酸残，选择比原始的鼠抗体抗原亲和力(KD)低的转化体，并确定所述转化体的替换的CDR氨基酸残基作为SDR确定用于本发明的鼠单克隆抗体的SDR。
进一步地，为了提高抗原亲和力，增加亲和力的小鼠抗体的CDR残基和影响CDR环构象的构架残基也可以移接到人抗体的相应位点上。
举例来说，本发明描述了利用鼠单克隆抗体KR127(韩国专利No.250832)来制备针对乙型肝炎(HBV)前-S1的人源化抗体的方法，如下所述：
从鼠单克隆抗体KR127的重链和轻链上的CDR中选取在结合抗原时起重要作用的SDR氨基酸残基后，可以通过用人抗体的恒定区(Cγ1)与KR127抗体重链的可变区组合，或可以通过用人抗体恒定区(Cκ)与KR127抗体轻链可变区组合来制备嵌合重链和嵌合轻链的基因。
通过丙氨酸扫描突变的方法如下确定HBV 前-S1的鼠单克隆抗体的SDR，以丙氨酸替代鼠单克隆抗体KR127重链(SEQ ID NO：2)CDR的HCDR1(aa31-35)、HCDR2(aa50-65)和HCDR3(aa95-102)以及轻链(SEQ ID NO：4)CDR的LCDR1(aa24-34)、LCDR2(aa50-56)和LCDR3(aa89-97)上的每一个氨基酸，并且选择那些用丙氨酸替代后比原始鼠抗体的抗原(KD)亲和力降低3倍以上氨基酸残基(SDR)。总体来说，是根据Kabat的编号方式来确定氨基酸残基的号码((Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.National Institute of Health，Bethesda，MD.，1991)。
优选的SDR的实例包括鼠单克隆抗体KR127重链上HCDR1的第33位的色氨酸(用“Trp33”来表示)、Met34和Asn35；HCDR2的Arg50、Tyr52和Pro52a以及HCDR3的Glu95、Tyr96和Glu98；鼠单克隆抗体KR127轻链上LCDR1的Leu27b，Tyr27d，Ser27e；Asn28、Lys30、Tyr32和Asn34；LCDR2的Leu50和Asp55；和LCDR3的Val89、Gln90、Gly91、Thr92、His93、Phe94、Pro95以及Gln96。
本发明人源化抗体可以通过在人抗体重链和/或轻链之上移接一个或多个如上确定的SDR来制备。可以用于本发明的人抗体的重链是人重链DP7-JH4，其由人免疫球蛋白种系VH基因片段DP7(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227，776-798，1992)和JH4片段(Ravetch等，Cell，27，583-591，1981)组成。可用于本发明的人抗体的轻链是由人免疫球蛋白种系VK基因片段DPK12(Cox等，Eur.J.Immunol.，24，827-836(1994))和JH4片段(Hieter等，J.Biol.Chem.，257，1516-1522(1982))构成的人轻链DPK12-JH4。
本发明人源化重链可以通过移接鼠单克隆抗体KR127重链的HCDR1的Trp33、Met34和Asn35；HCDR2的Arg50、Tyr52和Pro52a；HCDR3的Glu95、Tyr96和Glu98中的至少一个到人抗体重链相应的氨基酸序列上来制备。本发明的人源化轻链可以通过移接鼠单克隆抗体KR127轻链的LCDR1的Leu27b、Tyr27d、Ser27e；Asn28、Lys30、Tyr32和Asn34；LCDR2的Leu50和Asp55；以及LCDR3的Val89、Gln90、Gly91、Thr92、His93、Phe94、Pro95和Gln96中的至少一个到人抗体轻链DPH12-JK4相应的氨基酸序列上来制备。
另外，可以利用下述置换来提高人源化抗体抗原亲和力：
(a)用Ala替换修饰的人重链DP7-JH4上HCDR1中第32位的氨基酸残基；
(b)用Arg或Ala替换修饰的人重链DP7-JH4上HCDR3中第97位的氨基酸残基；
(c)用Val替换修饰的人重链DP7-JH4上HCDR3中第98位的氨基酸残基；和
(d)用Arg或Ala替换修饰的人重链DP7-JH4上HCDR3中第102位的氨基酸残基。
再者，KR127重链可变区的构架区3上的影响CDR环构象的Ala71和Lys73可进一步被移接到人重链DP7-JH4上。KR127轻链可变区构架区2上影响CDR环构象的Leu36和Arg46也可以进一步移接到人轻链DPH12-JK4上。
本发明人源化抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码，发明的人源化抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码。
本发明人源化抗体的重链和轻链可以由含有根据遗传密码推断出的人源化重链和轻链的核苷酸序列的基因来编码。已知由于密码子的简并性，所以可能存在编码一个特异氨基酸的几个不同的密码子，因此本发明在其范围内包括了从人源化抗体重链和轻链氨基酸序列推导出所有的核苷酸序列。优选地，人源化抗体的重链和轻链的基因序列包括一个或多个宿主细胞的优选密码子。
通过CDR-移接制备的由本发明的人源化重链HuKR127HC和人源化轻链HZKR127I组成的人源化抗体，与抗原的亲合力比人源化抗体HZKR127I大约高出50倍。
通过CDR-移接法制备的由本发明的人源化重链HuKR127KC和人源化轻链HZKR127I构成的人源化抗体，其抗原亲合力与人源化抗体HZIK127I相等。
将上述方法制备的人源化抗体的重链和轻链的基因插入到pdCMV-dhfrC-HAV6载体(KCTC 10028BP)，获得了表达载体pdCMV-dhfrC-HuKR127，其可以表达人源化抗体的重链HuKR127HC和轻链HZKR127I。本发明的表达载体可以依照传统的转化方法引入到微生物如大肠杆菌(E.coli)DH5α中，获得大肠杆菌DH5α/pdCMV-dhfrC-HuKR127转化体。该大肠杆菌DH5α/pdCMV-dhfrC-HuKR127转化体按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，已于2002年3月13日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国生物科学和生物技术研究学会(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登记号为KCTC10198BP。
同时转化了pdCMV-dhfrC-HuKR127载体的CHO/HuKR127，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，已于2002年3月13日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，登记号为KCTC 10199BP。
通过培养CHO/HuKR127细胞系制得的本发明人源化抗体HuKR127与抗原有较高的亲合力，有望比按照CDR-移接方法得到的传统的抗体在较大程度上降低HAMA(人抗-鼠抗体)反应。
因此，本发明人源化抗体可被用于预防乙型肝炎病毒感染和治疗慢性乙型肝炎。
因此可以以任何一种传统的方法来制备本发明的人源化抗体的药物制剂用来预防乙型肝炎感染和治感性乙型肝炎的。
本发明的药物细合物可以通过不同的途径来给药，包括静脉内和肌内引入。可以理解的是实际施用的有效成分的量应该按照不同的相关因素来确定，包括欲治疗疾病、选择的给药途径、病人的年龄性别和体重以及患者症状的严重程度，因而上述剂量不应该导致任何形式的对本发明范围进行的限制。
下述的实施例是用来进一步阐述本发明而不是限制其范围的。
实施例1：小鼠/人嵌合重链基因的制备
编码前导序列和人抗体重链γ1恒定区的基因分别是利用pCMV-HKR127HC(韩国专利No.：246128，KCTC0531BP)为模板，以Ryu94(SEQ ID NO：5)和HUR43-1(SEQ ID NO：6)或HUR46-1(SEQ ID NO：9)和HUR31(SEQ ID NO：10)为一组引物进行PCR而制备的。
编码鼠单克隆抗体KR127重链可变区的基因是以pKR127H(韩国专利No.：250832，KCTC 0333BP)为模板，以HUR44-1(SEQ ID NO：7)和HUR45-1(SEQ IDNO：8)为引物进行PCR而制备的。
Ryu94：5′-GAG AAT TCA CAT TCA CGA TGT ACT TG-3′
HUR43-1：5′-CTG CTG CAG CTG GAC CTG ACT CTG GAC ACC ATT-3′
HUR44-1：5′-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAA CTG-3′
HUR45-1：5′-TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGTGAC-3′
HUR46-1：5′-GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG-3′
HUR31：5′-CAG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GGG ACA G-3′
每次进行PCR反应时，使用模板10ng，每种引物1μl(50ppm)，Pfu DNA聚合酶(Promega)0.5μl，2.5mM的dNTP混合物4μl以及10×Pfu反应缓冲液5μl。95℃预变性5分钟后，PCR循环重复25次，每个循环为95℃30秒，50℃30秒及72℃45秒。退火后利用引物Ryu94和HUR43-1而获得的DNA片段与利用引物HUR44-1和HUR45-1而获得的DNA片段，利用引物HUR46-1和HUR31而获得的DNA片段再通过引物Ryu94和HUR31进行重组PCR再连接起来。进行重组PCR反应时采用上述同样的反应缓冲液。95℃预变性5分钟后，PCR循环重复30次，每个循环为95℃30秒，50℃30秒及72℃60秒，最终扩增反应在72℃下进行5分钟。
如此制备的嵌合的重链基因用EcoRI(GAATTC)和NdeI(GCGGCCdC)切开，并插入到载体pcDdA(源自Invitrogen的、pcDNA的多克隆位点上删除ApaI位点的质粒)的EcoRI/NdeI部分，从而得到pcDdAchKR127HC载体(图1)。通过DNA序列分析确定嵌合重链可变区基因(KR127VH)的碱基序列(图2)。
实施例2：小鼠/人嵌合轻链基因的制备
编码前导序列和人抗体轻链恒定区的基因分别是利用pKC-dhfr-HKR127(韩国专利No.2000-33008，KCTC 0529BP)为模板，Ryu86(SEQ ID NO：11)和HUR48(SEQ ID NO：12)或HUR51(SEQ ID NO：15)和CK1D(SEQ ID NO：16)为一组引物进行PCR而制备的。
编码鼠单克隆抗体KR127轻链可变区的基因是以pKR127K(韩国专利No.250832，KCTC 0334BP)为模板，HUR49(SEQ ID NO：13)和HUR50(SEQ ID NO：14)为引物进行PCR而制备的。
Ryu86：5′-CAA AGC TTG GAA GCA AGA TGG ATT CA-3′
HUR48：5′-CAA GAT ATC CCC ACA GGT ACC AGA TAC-3′
HUR49：5′-TGT GGG GAT ATC TTG ATG ACC CAA ACT-3′
HUR50：5′-CAC AGA TCT TTT GAT TTC CAG CTT GGT-3′
HUR51：5′-ATC AAA AGA TCT GTG GCT GCA CCA TCT-3′
CK1D：5′-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGAAGC TCT TTG TGA CGG GCG AACTCAG-3′
除了引物Ryu86和CK1D是用于连接PCR反应获得的退火的DNA片段外，每个PCR反应都是依照实施例1所描述的方法来进行。
如此制备的嵌合轻链基因用HindIII(AAGCTT)和XbaI(TCTAGA)切开并插入到载体pBluescript KS的HindIII/XbaI部分，从而获得重组质粒。随后再用HindII和ApaI切开重组质粒并插到质粒pCMV-dhfr(KCTC8671P)的HindIII/ApaI部分，从而得到质粒pKC-dhfr-chKR127(图3)。通过DNA序列分析确定嵌合轻链可变区基因(KR127VK)的碱基序列(图4)。
实施例3：通过丙氨酸插入的嵌合KR127抗体重链CDR的突变
为检验KR127重链HCDR1(aa 31-35)、HCDR2(aa 50-65)和HCDR3(aa95-102)每个氨基酸是否都与抗原结合，利用载体pcDdA-chKR127HC为模板进行PCR反应来制备修饰基因，其中CDR的氨基酸残基用丙氨酸替换(由Kabat编号法来表示被替换的氨基酸残基序号)(见图2)。
设计SEQ ID NO：17的正向引物YM001N，以此提供与嵌合重链基因的5’端的前导序列和EcoRI限制位点相应的序列，设计SEQ ID NO：18的反向引物YM003，使之具有与人的重链基因CH1结构域下游N-末端和ApaI限制位点相应的序列。
YM001N：5′-CCG  GAA TTC ACA TTC ACG ATG TAC TTG-3′
YM003：5′-TGC CCC CAG AGG TGC T-3′
设计SEQ ID NO：19的5’末端引物ym257(与SEQ ID NO：1 No.80-112核苷酸相对应)，用丙氨酸(S31A)替换HCDR1的Ser31，和SEQ ID NO：20的3’末端引物YM258(与SEQ ID NO：1的No.101到71的核苷酸相对应)，用GCT(编码丙氨酸)替换HCDR1基因的No.91到93的核苷酸AGT(编码丝氨酸)。
除了引物组不同，用引物YM001N和YM258；ym258和YM003按实施例1描述的方法进行每次PCR反应，使用引物YM001N和YM003重组PCR获得的退火的DNA片段。
如此获得的嵌合的轻链基因用EcoRI和ApaI切开并插入到实施例1制备的载体pcDdA-chKR127HC的EcoRI/ApaI部分，从而得到pcDdA-chKR127HC-S31A。通过DNA序列分析确定人源化抗体重链可变区基因的碱基序列。由此制备的带突变的载体如表1所示。
表1中，依照SEQ ID NO：1的碱基序列为引物和突变位置编号。
表1
CDR   引物   引物位置   突变位置   突变   载体
HCDR1 F ym257 80-112 91-93 Ser(AGT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-S31A
  R   YM258   101-71
  F   ym259   83-112 94-96   Ser(TCT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-S32A
  R   YM260   106-73
  F   ym261   86-117 97-99   Trp(TGG)→Ala(GCG) pcDdA-chKR127HC-W33A
  R   YM262   108-76
  F   ym263   90-118 100-102   Met(ATG)→Ala(GCG) pcDdA-chKR127HC-M33A
  R   YM264   111-79
  F   ym265   94-120 103-105   Asn(AAC)→Ala(GCC) pcDdA-chKR127HC-N35A
  R   ym66   112-81
  HCDR2   F   YM221   139-174 148-150   Arg(CGG)→Ala(GCC) pcDdA-chKR127HC-R50A
  R   YM222   158-128
F YM225 143-178 151-153 Ile(ATT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-I51A
  R   YM226   162-131
  F   YM227   145-180 154-156   Tyr(TAT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-Y52A
  R   YM228   165-135
F ym229 148-181 157-159 Pro(CCT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-P52aA
  R   YM230   167-136
  F   ym231   150-186 160-162   Gly(GGA)→Ala(GCA) pcDdA-chKR127HC-G53A
  R   YM232   173-145
F ym233 152-188 163-165 Asp(GAT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-D54A
  R   YM234   176-144
  F   ym235   155-193 166-168   Gly(GGA)→Ala(GCA) pcDdA-chKR127HC-G55A
  R   YM236   178-146
  F   ym237   158-194 169-171   Asp(GAT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-D56A
  R   ym238   184-149
F ym239 160-195 172-174 Thr(ACT)→Ala(GCT) pcDdA-chKR127HC-T57A
  R   ym240   185-150
  F   ym241   164-196 175-177   Asn(AAC)→Ala(GCC) pcDdA-chKR127HC-N58A
  R   ym242   187-150
  HCDR3   F   YM207   286-317 295-297   Glu(GAG)→Ala(GCG) pcDdA-chKR127HC-E95A
  R   YM208   305-274
  F   YM209   289-316 298-300   Tyr(TAC)→Ala(GCC) pcDdA-chKR127HC-Y96A
  R   YM210   307-276
F YM211 292-318 301-303 Asp(GAC)→Ala(GCC) pcDdA-chKR127HC-D97A
  R   YM212   313-279
F YM213 296-321 304-306 Glu(GAG)→Ala(GCG) pcDdA-chKRR127HC-E98A
  R   YM214   315-285
  F   YM255   303-327 310-312   Tyr(TAC)→Ala(GGC) pcDdA-chKR127HC-Y102A
  R   YM256   319-289
检测实施例1：带有修饰重链的嵌合抗体的表达及其与抗原的亲和力
(步骤1)嵌合抗体的表达
将COS7细胞(ATCC CRL-1651)接种到含有10％牛血清的DMEM培养基(GIBCO)中，在5％的CO2气氛37℃培养箱中进行传代培养。将获得的细胞1×106接种到同样培养基中37℃培养过夜。将5μg实施例2中得到的质粒pKC-dhfr-chKR127(表达嵌合轻链)、5μg由实施例3得到的质粒用OPTI-MEMI(GIBCO)稀释800μl。用同样的溶液将50μl的Lipofectamine(GIBCO)稀释到800μl。将得到的溶液加到15ml的试管中混匀，然后室温保持15分钟以上。与此同时，用OPTI-MEMI将如上培养的COS7细胞洗涤3次。然后，将6.4ml的OPTI-MEMI加到DNA-Lipofectamine混合液中，并使所得溶液均匀分布于COS7细胞上，在5％CO2培养箱中培养48小时获得上清。对获得的溶液进行夹层ELISA分析，即用抗-人IgG(Sigma)作为捕捉抗体，抗-人抗原(Fc-特异)-辣根过氧化物酶(PIERCE)作为第二抗体以确定嵌合抗体的表达。
(步骤2)与抗原的亲和力
将150ng的HBV重组抗原GST-pre-S1(1-56)(H.S.Kim和H.J.Hong，Biotechnology Letters，17，871-876(1995))包被在微孔板的每一个孔中，并将步骤1得到的5ng上清液加到每个孔里。用步骤1中同样的第二抗体对所得溶液进行间接ELISA，随后在450hm下测定吸光度。接着，用竞争ELISA方法(Ryu等，J.Med.Virol.，52，226(1997))测定每个修饰的重链的抗原亲和力(KD)，并与含有野生型嵌合重链的pCK-dhfr-chKR127相比较。结果显示在表2中。
表2
CDR 突变体   KD(nM)
  WT   11.0±1.664
  H1   S31AS32AW33AM34AN35A   14.67±2.3868.455±0.840＞10000＞10000＞10000
  H2   R50AI51AY52AP52aAG53AD54AG55AD56AT57AN58A   ＞1000012.8±1.05276.8±23.60170.3±5.3187.697±0.9801.663±0.4775.766±0.2116.59±1.0913.68±4.0161.568±0.085
  H3   E95AY96AD97AE98AY102A   ＞10000＞100000.57±0.0364.2±7.783.581±0.457
如表2所示，通过用丙氨酸替换HCDR1的Trp33、Met34或Asn35；HCDR2的Arg50、Tyr52或Pro52a、HCDR3的Glu95、Tyr96或Glu98而获得的突变体的抗原亲和力比野生型的低3倍多。但是，具有HCDR3的Asp97或Tyr102丙氨酸替换的突变体表现出的却是抗原亲和力增强。
实施例4：HCDR3突变体的制备及其抗原亲和力
(步骤1)D97R和E98V突变体
每个突变体的制备是依照实施例3中所用的定点诱变，用精氨酸作为正电荷的氨基酸替换HCDR3的Asp97或Glu98(由“D97R”表示)或缬氨酸作为中性氨基酸替换HCDR3的Asp97或Glu98(由“E98V”表示)。如上制备的带有突变体的载体显示在表3中。
表3
  CDR   引物   引物位置   突变位置   突变   载体
  HCDR3   R   P1   312-279 301-303   Asp(GAC)→Arg(CGG) pcDdA-chKR127HC-D97R
  F   P2   295-326
  R   P3   312-279 301-303   Asp(GAC)→Val(GTT) pcDdA-chKR127HC-D97V
  F   P4   295-326
R P5 312-279 304-306 Glu(GAG)→Arg(CGG pcDdA-chKR127HC-E98R
  F   P6   295-326
R P7 312-279 304-306 Glu(GAG)→Val(GTT) pcDdA-chKR127HC-E98V
  F   P8   295-326
随后，如此得到的每个突变体依照检测实施例1的方法测定其抗原亲和力并与野生型相比较。
如图5所示，D97R的抗原亲和力比野生型提高了3倍多，E98V的抗原亲和力比野生型提高4倍。但是，突变体E98R却显示很低的亲和力。
(步骤2)D97R/E98V突变体
利用含D97R基因的pcDdA-chKR127HC-D97R作为模板，P7和P8为引物进行PCR反应来制备高抗原亲和力的同时含有D97R和E98V的D97R/E98V突变体。
然后依照测试实施例1描述的方法测定如此获得的D97R/E98V突变体的抗原亲和力。
如图5所示，D97R/E98V的抗原亲和力高于野生型15倍之多。
(步骤3)D97R/E98V/Y102A突变体
利用含D97R/E98V的pcDdA-chKR127HC-RV作为模板，YM255和YM256为引物进行PCR反应来制备含有D97R，E98V和Y102A的D97R/E98V/Y102A突变体。
然后依照测试实施例1描述的方法测定如此获得的D97R/E98V/Y102A突变体(下文的“RVAA”)的抗原亲和力。
如图5所示，D97R/E98V/Y102A的抗原亲和力与D97R/E98V相同。
(步骤4)D97R/E98V/Y102E和D97R/E98V/Y102R突变体
利用含D97R/E98V的pcDdA-chKR127HC-RV作为模板，引物组分别为P17/P18和P19/P20进行PCR反应来制备D97R/E98V/Y102E和D97R/E98V/Y102R突变体。
含有上述突变体的载体显示在表4中。
表4
  引物   引物位置   突变位置   突变   载体
 HCDR3   R   P17   312-279 307-309   Tyr(TAC)→Glu(GAG) pcDdA-chKR127HC-RVAE
  F   P18   295-326
  R   P19   312-279 307-309   Tyr(TAC)→Arg(CGT) pcDdA-chKR127HC-RVAR
  F   P20   295-326
然后依照测试实施例1描述的方法分别测定上述方法得到的D97R/E98V/Y102E突变体(下文的“RVAE”)和D97R/E98V/Y102R突变体(下文的″RVAR″)的抗原亲和力。
如图5所示，RVAE的抗原亲和力与RVAA相同，而RVAR的抗原亲和力要比RVAA高。
检测实施例2：RVAR抗原亲和力的测定
利用竞争ELISA测定实例4步骤4制备的RVAR突变体的抗原亲和力，如下所示：
用实例4的步骤4制备的质粒和实施例2制备的表达嵌合轻链的质粒(pKC-dhfr-chKR127)转化COS7细胞来产生抗体。由此获得的5ng的抗体与前-S1抗原(1×10-7至1×10-12M)在37℃反应2小时。将所得溶液加到包被有前-S1抗原的96-微孔平板上的每个微孔中，37℃反应30分钟，随后对所得溶液依照实施例4所描述的方法进行ELISA分析。对照采用由pcDdA-chKR127HC和pKC-dhfr-chKR127转染的COS7产生的嵌合抗体(chKR127)。
RVAR的抗原亲和力大约是1.8×10-10M，高于chKR127(大约8.2×10-9M)45倍。
实施例5：通过插入丙氨酸的嵌合KR127抗体轻链CDR的突变
为检验KR127轻链上LCDR1(aa 24-34)、LCDR2(aa 50-60)和LCDR3(aa89-97)每个氨基酸残基对抗原的亲和力，利用载体pKC-dhfr-chKR127为模板进行PCR反应来制备修饰基因，其中CDR的每个氨基酸残基用丙氨酸替换(由Kabat编号法来确定被替换的氨基酸残基号)(见图2)。
设计SEQ ID NO：21的正向引物YM004用来提供与嵌合轻链基因的5’端的前导序列和HindIII限制位点相应的序列，设计SEQ ID NO：22的反向引物YM009，使之具有与人的轻链基因N-末端和BsiWI(CGTACG)限制位点相应的序列。这些引物用于轻链CDR残基突变体的制备。
YM004：5′-CCA  AAG CTT GGA AAG ATG GAT TCA CAG-3′
YM009：5′-GCA GCC AC C GTA CGT TTG ATT TCC ACC TTG GT-3′
设计正向引物YM135，使得LCDR1的Ser26被丙氨酸(S26A)替换，设计反向引物YM136，用编码丙氨酸的GCT替换LCDRI基因No.76到78编码丝氨酸的核苷酸AGT。
除了引物组不同，用YM004/YM135和YM136/YM009为引物按实施例1描述的方法进行PCR反应，用YM004和YM009重组PCR获得的退火的DNA片段。
如此制备的突变体可变区的基因用HindIII和BsiWI切开并插入到载体pKC-dhfr-chKR127的HindIII/BsiWI部分，从而得到pKC-dhfr-chKR127BS-S26A。通过DNA序列分析确定修饰的嵌合轻链可变区基因的碱基序列。由此制备的带突变的载体如表5所示。
表5中，依照SEQ ID NO：3的碱基序列为引物和突变位置编号。
表5
  引物   引物位置   突变位置   突变   载体
LCDR1   F   YM135   67-102 76-78   Ser(AGT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-S26A
  R   YM136   86-54
  F   YM137   69-107 79-81   Gln(CAG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-Q27A
  R   YM138   91-56
  F   YM139   70-111 82-84   Ser(AGC)-Ala(GCC) pKC-dhfr-chKR127BS-S27aA
  R   YM140   94-58
  F   YM141   73-114 85-87   Leu(CTC)-Ala(GCC) pKC-dhfr-chKR127BS-L27bA
  R   YM142   98-64
  F   YM143   73-116 88-91   Leu(TTA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-L27cA
  R   YM144   102-68
  F   YM145   79-118 91-93   Tyr(TAT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-Y27dA
  R   YM146   103-69
  F   YM147   83-119 94-96   Ser(AGT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-S27eA
  R   YM148   107-69
  F   YM149   84-120 97-99   Asn(AAT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-N28A
  R   YM150   110-70
  F   YM151   88-127 100-102   Gly(GGA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-G29A
  R   YM152   114-74
  F   YM153   91-130 103-105   Lys(AAA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-K30A
  R   YM154   116-77
  F   YM155   93-132 106-108   Thr(ACC)-Ala(GCC) pKC-dhfr-chKR127BS-T31A
  R   YM156   118-80
  F   YM103   99-133 109-111   Tyr(TAT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-Y32A
  R   YM104   120-83
  F   N34A-F   106-132 115-118   Asn(AAT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-Y34A
  R   N34A-R   126-100
  引物   引物位置   突变位置   突变   载体
  LCDR2   F   YM129   151-188 163-165   Leu(CTG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-L50A
  R   YM130   175-140
  F   YM131   153-191 166-168   Val(GTG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-V51A
  R   YM132   179-145
  F   YM133   157-192 169-171   Ser(TCT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-S52A
  R   YM134   181-147
  F   K53A-F   163-187 172-174   Lys(AAA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-K53A
R K53A-R 178-154
  F   L54A-F   163-189 175-177   Leu(CTG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-L54A
  R   L54A-R   180-159
  F   D55A-F   170-195 178-180   Asp(GAC)-Ala(GCC) pKC-dhfr-chKR127BS-D55A
  R   D55A-R   184-163
  F   K56A-F   175-198 181-183   Ser(TCT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-S56A
  R   K56A-R   190-168
LCDR3   F   YM113   270-304 280-282   Val(GTG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-V89A
  R   YM114   292-258
  F   YM115   274-307 283-285   Gln(CAA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-Q90A
  R   YM116   294-259
  F   YM117   277-310 286-288   Gly(GGT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-G91A
  R   YM118   296-265
  F   YM119   281-310 289-291   Thr(ACA)-Ala(GCA) pKC-dhfr-chKR127BS-T92A
  R   YM120   302-266
  F   YM121   282-313 292-294   His(CAT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-H93A
  R   YM122   304-271
  F   YM111   286-314 295-297   Phe(TTT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-F94A
  R   YM112   307-274
  F   YM123   286-317 298-300   Pro(CCT)-Ala(GCT) pKC-dhfr-chKR127BS-P95A
  R   YM124   308-278
  F   YM125   292-319 301-303   Gln(CAG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-Q96A
  R   YM126   311-279
  F   YM127   294-320 304-306   Thr(ACG)-Ala(GCG) pKC-dhfr-chKR127BS-T97A
  R   YM128   313-282
检测实施例3：轻链突变体抗原亲和力的测定
用实施例5中制备的每个轻链突变体和表达嵌合的重链(pcDdA-chKR127HC)的质粒转染COS7细胞，来生产抗体。按照检测实施例1描述的方法测定所获抗体的抗原亲和力。
表6显示了由突变体和含有野生型嵌合KR127重链的pdDA-chKR127HC获得的结果。
表6
CDR 突变   KD(nM)
  L1   S26AQ27AS27aAL27bAL27cAY27dAS27eAN28AG29AK30AT31AY32AN34A   6.49±0.24414.2±2.2937.9±6.66＞1000036.8±11.011032.7±56.1＞10000＞1000023.94±2.62＞1000013.19±1.98＞10000＞10000
  L2   L50AV51AS52AK53AL54AD55AS56A   159.4±21.3737.00±10.3314.08±0.5097.928±0.97612.57±2.453225.2±2.97012.95±0.367
  L3   V89AQ90AG91AT92AH93AF94AP95AQ96AT97A   121.2±4.62＞10000＞1000074.2±2.9054.5±4.48＞10000＞10000293.6±7.1317.3±2.56
如表6所示，通过用丙氨酸分别替换LCDR1的Leu27b、Tyr27d、Ser27e、Asn28、Lys30、Tyr32和Asn34；LCDR2的Leu50和Asp55；LCDR3的Val89、Gln90、Gly91、Thr92、His93、Phe94、Pro95和Gln96而获得的突变体的抗原亲和力比野生型的低3倍多。所以这些残基被确定为SDR。
实施例6：SDR-移接方法制备人源化重链
利用DP7-JH4制备人源化重链，通过具有与KR127重链可变区相似的氨基酸序列的人的免球蛋疫白种系VH基因片段DP7(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227，776-798，1992)和人的免疫球蛋白种系JH4的片段(Ravetch等，Cell，27，583-591(1981))组合构建DP7-JH4。
将KR127的HCDR1中的Trp33和Asn35移接到DP7-JH4中。KR127的HCDR1的Met34与DP7-JH4的相同。另外，为了避免抗原亲和力的降低，KR127的HCDR1的Tyr32被人抗体的HCDR1上的丙氨酸替代(Gen Bank data base 75023(SAWMN))。
KR127的HCDR2中的Arg50和Tyr52被移接到DP7-JH4上。KR127的HCDR2的Pro52a与DP7-JH4的相同。
将HCDR3的Asp95、Tyr96、Arg97、Val98和Arg102移接到DP7-JH4上。
进一步地，将影响CDR环构象的KR127抗体的重链可变区中的FR3(构架区3)的Ala71和Lys73也移接到DP7-JH4中。
然后依照实施例3描述的方法，以SEQ ID NO：23的Ryu166和SEQ ID NO：24的Hur37为引物进行PCR反应，从而得到人源化重链可变区基因，HuKR127VH-VII。
Ryu 166：5′-GGA TTT GTC TGC AGT CAT TGT GGC TCT GCC CTGGAA CTT-3′
Hur 37：5-GAC AAA TCC ACG AGC ACA GTC TAC ATG-3′
通过DNA序列分析测定人源化重链可变区基因的碱基顺序(图2)。随后用EcoRI和ApaI将基因切开并插入到载体pdDdA-chKR127HC的EcoRI/ApaI部分，得到pHuKR127HC。
组合上述获得的人源化重链和韩国专利No.246128描述的人源化抗体HZKR127I的轻链制备成人源化抗体，按照检测实施例2中描述的方法测定抗原亲和力。人源化抗体HZKR127I作为对照。
人源化抗体的抗原亲和力大约是1.5×10-10M，高于HZKR127I(大约8.2×10-9M)约50倍。
实施例7：SDR-移接方法制备人源化轻链
利用DP7-JH4制备人源化轻链，通过具有与KR127轻链可变区相似的氨基酸序列的人的免疫球蛋白种系VK基因片段DPK12(Cox等，Eur.J.Immunol.，24，827-836(1994))和人的免疫球蛋白种系JK4的片段(Hieter等，J.Biol.Chem.，257，1516-1522(1982)组合构建DP7-JH4。
将KR127的LCDR1的Tyr27d、Asn28和Asn34移接到DPK12-JK4中。DP7上第27b、27e、30和32位上的氨基酸残基与KR127轻链上的相同。
将KR127的LCDR2的Leu50和Asp55移接到DPK12-JK4基因中。
将KR127的LCDR3的Val89、Gly91、Thr92、His93、Phe94和Gln96移接到DPK12-JK4中。DP7的90和95位的残基与KR127上的相同。
另外将KR127抗体轻链可变区上的FR2的Leu36和Arg46(其作用于与重链或CDR的相互作用)也移接其上。
然后依照实例3描述的方法，以SEQ ID NO：25的Ryu118和SEQ ID NO：26的Ryu119为引物进行PCR反应，以制备人源化轻可变区基因，HuKR127VH-IV。
Ryu 118：5′-CTG TGG AGG CTG GCC TGG CTT CTG TAA TAA CCA-3′
Ryu 119：5′-GGC CAG CCT CCA CAG CTC CTA ATC TAT CTG-3′
通过DNA序列分析测定人源化轻链可变区基因的碱基顺序(见图4的HZIV)。随后用HindIII和BsiWI将基因切开并插入到载体pKC-dhfr-chKR127BS的HindIII/BsiWI部分，得到pHuKR127KC。
组合上述获得的人源化轻链和韩国专利No.246128描述的人源化抗体HZKR127I的重链制备成人源化抗体，按照检测实施例2中描述的方法测定抗原亲和力。人源化抗体HZKR127I作为对照。
人源化抗体的抗原亲和力大约是8.4×10-9M，与HZKR127I相近(约8.2×10-9M)。
实施例8：人源化抗体的制备及抗原亲合力的测定
为了制备含有人源化重链质粒pHuKR127HC和人源化轻链质粒pHuKR127KC的质粒，将带有pHuKR127HC的人源化重链可变区基因的EcoRI/ApaI片段和带有pHuKR127KC的人源化轻链可变区基因的HindIII/BsiWI片段插入到载体pdCMV-dhfrC-HAV6(KCTC 10028BP)的EcoRI/ApaI和HindIII/BsiWI部分，得到质粒pdCMV-dhfrC-HuKR127(附图6)。用该获得的质粒转化大肠杆菌DH5α，由此获得的转化的大肠杆菌DH5α/pdCMC-dhfrC-HuKR127按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，已于2002年3月13日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国生物科学和生物技术研究学会(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登记号为KCTC 10198BP。
将质粒pdCMV-dhfrC-HuKR 127按下述方法转化到dhfr-缺陷型CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中制备表达人源化抗体细胞系：
将CHO细胞(ATCC CRL9096)接种到含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(GIBCO)中，在5％CO2气氛的37℃培养箱中进行传代培养。将获得的细胞5×105接种到同样培养基中37℃培养过夜，随后用OPTI-MEMI(GIBCO)溶液洗涤三次。
同时将5μg的pdCMV-dhfrC-HuKR127质粒稀释到500μl的OPTI-MEM I溶液中。25μl的Lipofectamine稀释到500μl同样的溶液中。将得到的溶液加到15ml的试管中混匀，然后室温保持15分钟以上。然后，将2ml的OPTI-MEMI加到DNA-Lipofectamine混合液中，将所得溶液均匀分布COS7细胞上，在5％CO2培养箱中，37℃培养6小时。再将含有20％的胎牛血清的3ml DMEM/F12加进去并培养48小时。
接着，用胰蛋白酶处理CHO细胞并在10％的含G418(GIBCO BRL，550mg/l)的透析过的胎牛血清的MEM培养基(GIBCO)中培养2个星期。在确定转化克隆的抗体产生能力后，将克隆培养在10％的含有20nM MTX的透析过的胎牛血清的a-MEM培养基中以诱导基因的扩增。
从克隆中挑选抗体产生能力最高的CHO/HuKR 127细胞系，并按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于2002年3月13日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，登记号为KCTC 10199BP。
为了测定人源化抗体HuKR127的抗原亲合力，将上面得到的CHO细胞系在无血清培养基(CHO-SFMII，GIBCO)中大量培养，然后置于蛋白G-shepharose 4B柱上(Pharmacia)。用0.1M的甘氨酸容液(pH2.7)将吸附在柱上的抗体洗脱下来，用1.0M的tris溶液(pH 9.0)中和后，在PBS缓冲液(pH 7.0)中透析。接着，用检测实施例2描述的竞争ELISA方法测定纯化抗体的抗原亲合力，并与作为对照的人源化HuKR127I相比较。结果显示在表7中。
如表7所示，本发明人源化抗体的抗原亲合力为1.6×10-10M，比对照组的8.2×10-9M3高大约50倍。
实施例9：人源化抗体诱导的免疫充应的确定
为了确定本发明的人源化抗体(HuKR127)是否抑制了HAMA反应，按照TEPITOPE方法(Sturniolo等，Nature Biotechnology，17，555-561，1999)进行分析，以此来检验人源化抗体重链和轻链可变区上是否存在能与MHC(主要组织相容性复合体)II类相结合的肽序列。
表7和8分别显示HuKR127上重链可变区和轻链可变区上MHC II类-结合肽序列的分析结果。
表7
  抗体   HzKR127I   HuKR127
MHC II类-结合   肽   MHC类II   肽   MHC类II
LVQSGAEVV   DRB1_0306DRB1_0307DRB1_0308DRB1_0311DRB1_0421DRB1_0701DRB1_0703 LVQSGAEVK 0
  VKPGASVKV   DRB1_0102   KKPGASVKV   0
  FSSSWMNWV   DRB1_0703   FTSAWMNWV   0
WIGRIYPGD   DRB1_0801DRB1_0817 WMGRIYPSG   0
FQGKATLTA   DRB1_0401DRB1_0402DRB1_0405DRB1_0408DRB1_0421DRB1_0426DRB1_0801DRB1_0802DRB1_0804DRB1_0806DRB1_0813DRB1_0817DRB1_1101DRB1_1102DRB1_1104DRB1_1106DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1121DRB1_1128DRB1_1302DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1311DRB1_1321DRB1_1322DRB1_1323 FQGRVTMTA DRB1_0305DRB1_0401DRB1_0402DRB1_0408DRB1_0426DRB1_0801DRB1_0802DRB1_0804DRB1_0806DRB1_0813DRB1_0817DRB1_1101DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1128DRB1_1302DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1321DRB1_1323DRB1_1502
YWGQGTLVT   DRB1_0401DRB1_0405DRB1_0421DRB1_0426 RWGQGTLVT 0
IGRIYPGDG DRB5_0101DRB5_0105 MGRIYPSGG   DRB1_0404DRB1_0405DRB1_0410DRB1_0423
  YAQKFQGKA   DRB1_0802   YAQKFQGRV   0
  YYFCAREYD   DRB1_1304   VYYCAREYR   DRB1_0301
YWGQGTLVT   DRB1_0401DRB1_0405DRB1_0421DRB1_0426 RWGQGTLVT 0
  合计   50   26
表8a
  抗体   HzkR127I   HuKR127
MHC II类-结合   肽   MHCII类   肽   MHCI类
ILMTQTPLS   DRB1_0301DRB1_0305DRB1_0306DRB1_0307DRB1_0308DRB1_0309DRB1_0311DRB1_0401DRB1_0402DRB1_0404DRB1_0405DRB1_0408DRB1_0410DRB1_0421DRB1_0423DRB1_0426DRB1_0804DRB1_1101DRB1_1102DRB1_1104DRB1_1106DRB1_1107DRB1_1114DRB1_1121DRB1_1128DRB1_1301DRB1_1304DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1311DRB1_1321DRB1_1322DRB1_1323DRB1_1327DRB1_1328 IVMTQTPLS 0
LMTQTPLSL   DRB1_0101DRB1_0102DRB1_1304 VMTQTPLSL 0
WLLQKPGQS   DRB1_0101DRB1_0305DRB1_0309DRB1_0401DRB1_0408DRB1_0421DRB1_0426DRB1_0802DRB1_1101DRB1_1107DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1128DRB1_1302DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1321DRB1_1323DRB5_0101DRB1_0105 WLLQKPGQP 0
YYCVQGTHF   DRB1_0101DRB1_0701DRB1_0703DRB5_0101DRB5_0105 YYCVQGTHF   DRB1_0101DRB1_0701DRB1_0703DRB5_0101DRB5_0105
YCVQGTHFP   DRB1_0401DRB1_0421DRB1_0426 YCVQGTHFP   DRB1_0401DRB1_0421DRB1_0426
表8b
  抗体   HzKR127I   HuKR127
  肽   MHC II类   肽   MHC II类
  VGVYYCVQG   DRB1_0806   VGVYYCVQG   DRB1_0806
IYLVSKLDS   DRB1_0301DRB1_0305DRB1_0306DRB1_0307DRB1_0308DRB1_0309DRB1_0311DRB1_0405DRB1_0410DRB1_0801DRB1_0802DRB1_0804DRB1_0806DRB1_0813DRB1_0817DRB1_1101DRB1_1102DRB1_1104DRB1_1106DRB1_1107DRB1_1114DRB1_1120DRB1_1121DRB1_1128DRB1_1301DRB1_1302DRB1_1304DRB1_1305DRB1_1307DRB1_1311DRB1_1321DRB1_1322DRB1_1323DRB1_1327DRB1_1328DRB1_1501DRB1_1506 IYLVSNRDS DRB1_0402DRB1_0404DRB1_0405DRB1_0408DRB1_0410DRB1_0423DRB1_0804DRB1_1102DRB1_1104DRB1_1106DRB1_1114DRB1_1121DRB1_1301DRB1_1307DRB1_1311DRB1_1322DRB1_1323DRB1_1327DRB1_1328DRB5_0101DRB5_0105
LIYLVSKLD DRB1_0806DRB1_1304DRB1_1321 LIYLVSNRD   DRB1_0401DRB1_0404DRB1_0405DRB1_0408DRB1_0410DRB1_0421DRB1_0423DRB1_0426DRB1_1304
  YLVSKLDSG   0   YLVSNRDSG   DRB1_0309
  合计   106   40
从图7和图8可以看出人源化抗体HuKR127中与MHC II类结合的肽序列的数量要比HzKR127I少。这些结果显示可以预见到本发明的人源化抗体HuKR127比HzKR127I在很大程度上降低HAMA反应。
虽然描述和举例说明了本发明的实施方案，很明显可以在其中进行各种不脱离本发明宗旨的改变和调整，本发明应该仅仅由所附加的权利要求限定的。
    关于用于专利程序的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约
                     国际表格
               收到原始保藏的情况
                    根据细则7.1
致：HONG，Hyo Ieong
    Clover Apt.117-201，Dunsan-dong，Seo-ku，Taejon 302-772，
    Republic of Korea
Form BF/1(KCTC Form17)                       sole Daet
    关于用于专利程序的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约
                         国际表格
                   收到原始保藏的情况
                        根据细则7.1
致：HONG，Hyo Jeong
    Clover Apt.117-201，Dunsan-dong，Seo-ku，Taejon 302-772，
    Republic of Korea
Figure C0381152400311
Form BF/4(KCTC Form 17)                          sole Daet
                       序列表
<110>APROGEN INC.
<120>人源化抗体及其制备方法
<130>PCA30215/APG
<150>KR10-2002-0015708
<151>2002-03-22
<160>38
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>345
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HZVII重链
<400>1
caggtccagc tggtgcagtc tggagctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt    60
tcctgcaaag cttctggcta caccttcacc agtgcttgga tgaactgggt gcgacaggcc    120
cctggacagg gtcttgagtg gatgggacgg atttatccta gtggtggaag cactagctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcacaatg actgcagaca aatccacgag cacagtctac    240
atggagctca gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt attactgtgc aagagagtac    300
cgggttgccc gttggggcca aggaactctg gtcactgtct cttca                    345
<210>2
<211>115
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HZVII重链
<400>2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Ala Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ala
             20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Tyr Arg Val Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ala
        115
<210>3
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HZVII轻链
<400>3
gatatcgtga tgacccaaac tccactttct ttgtcggtta cccctggaca accagcctct    60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg    120
ttattacaga agccaggcca gcctccacag cgcctaatct atctggtgtc taatcgggac    180
tctggagtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc    240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttcct    300
cagacgttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaa                              336
<210>4
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HZVII轻链
<400>4
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
         35                  40                  45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
                 85                  90                  95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>HZI的轻链
<220>
<223>Ryu94
<400>5
gagaattcac attcacgatg tacttg                                         26
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR43-1
<400>6
ctgctgcagc tggacctgac tctggacacc att                                 33
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR44-1
<400>7
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctg                                 33
<213>人工序列
<220>
<223>Ryu86
<400>11
caaagcttgg aagcaagatg gattca                                         26
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR48
<400>12
caagatatcc ccacaggtac cagatac                                        27
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR49
<400>13
tgtggggata tcttgatgac ccaaact                                        27
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR45-1
<400>8
tgggcccttg gtggaggctg cagagacagt gac                                 33
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR46-1
<400>9
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctg                                 33
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR31
<400>10
cagcggccgc tcatttaccc ggggacag                                       28
<210>11
<211>26
<212>DNA
<223>HUR50
<400>14
cacagatctt ttgatttcca gcttggt                                        27
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HUR51
<400>15
atcaaaagat ctgtggctgc accatct                                        27
<210>16
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CK1D
<400>16
gcgccgtcta gaattaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc gaactcag      58
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>YM001N
<400>17
ccggaattca cattcacgat gtacttg                                        27
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>YM003
<400>18
tgcccccaga ggtgct                                                    16
<210>19
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ym257
<400>19
acgcattcag tgcttcttgg atgaactggg tga                                 33
<210>20
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>YM258
<400>20
atccaagaag cactgaatgc gtagccagaa g                                   31
<210>21
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>YM004
<400>21
ccaattcaaa gcggtttttc cattactata taagaggc                            38
<210>22
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>YM009
<400>22
gcagccaccg tacgtttgat ttccaccttg gt                                  32
<210>23
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Ryu 166
<400>23
ggatttgtct gcagtcattg tggctctgcc ctggaactt                           39
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Hur 37
<400>24
gacaaatcca cgagcacagt ctacatg                                        27
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Ryu 118
<400>25
ctgtggaggc tggcctggct tctgtaataa cca                                 33
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Ryu 119
<400>26
ggccagcctc cacagctcct aatctatctg                                     30
<210>27
<211>345
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KR127VH
<400>27
caggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt    60
tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agttcttgga tgaactgggt gaagcagagg    120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac    180
aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac ctctgtggac tctgcggtct atttctgtgc aagagagtac    300
gacgaggctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca                    345
<210>28
<211>115
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KR127VH
<400>28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
             20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
     50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Tyr Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ala
        115
<210>29
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KR127VK
<400>29
gatatcttga tgacccaaac tccacttatt ttgtcggtta ccattggaca accagcctct    60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg    120
ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac    180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc    240
atcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttcct    300
cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa                              336
<210>30
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>KR127VK
<400>30
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly
  1               5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
                 85                  90                  95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>31
<211>294
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DP7
<400>31
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt    60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga          294
<210>32
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>DP7
<400>32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>33
<211>302
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DPK12
<400>33
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc    60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccta tttgtattgg    120
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc    180
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc    240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaagtat acagcttcct    300
cc                                                                   302
<210>34
<211>100
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>DPK12
<400>34
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
             20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
                 85                  90                  95
Ile Gln Leu Pro
            100
<210>35
<211>345
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HZI的重链
<400>35
caggtccagc tggtgcagtc tggagctgaa gtggtgaagc ctggggcctc agtgaaggtt    60
tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agttcttgga tgaactgggt gcgacaggcc    120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tactaactac    180
gcacagaagt tccagggcaa ggccacactg actgcagaca aatccacgag cacagcctac    240
atggagctca gcagcctgag atctgaggac acggcggtct atttctgtgc aagagagtac    300
gacgaggctt actggggcca aggaactctg gtcactgtct cttca                    345
<210>36
<211>115
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HZI的重链
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
             20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Glu Tyr Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val  Ser Ser
         115
<210>37
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HZI的轻链
<400>37
gatatcttga tgacccaaac tccactttct ttgtcggtta cccctggaca accagcctct    60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg    120
ttattacaga agccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac    180
tctggagtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc    240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttcct    300
cagacgttcg gtggaggcac caaggtggaa atcaaa                              336
<210>38
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HZI的轻链
<400>38
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
                 85                  90                  95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110

Claims (23)

1.一种制备人源化抗体的方法，包括步骤(a)：用丙氨酸替换鼠单克隆抗体重链和轻链可变区的互补决定区(CDR)中的每个氨基酸残基以生成转化体，选择与人抗原亲和力(KD)比原始鼠抗体低的转化体并确定所述转化体的被替代的氨基酸残基为特异性决定残基(SDR)；和(b)将所述SDR移接到人抗体的可变区中至少一个相应的氨基酸序列上。
2.权利要求1所述的方法，其中CDR选自由乙型肝炎病毒前-S1抗原的鼠单克隆抗体可变区域重链(SEQ ID NO：2)的HCDR1(aa 31-35)、HCDR2(aa 50-65)和HCDR3(aa 95-102)；以及轻链(SEQ ID NO：4)的LCDR1(aa 24-34)、LCDR2(aa 50-56)和LCDR3(aa 89-97)组成的组，选择用丙氨酸替换后抗原亲和力比原始鼠抗体低3倍以上的转化体，确定所述转化体被替换的氨基酸残基为SDR，将所述SDR移接到人抗体重链和轻链中相应的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于鼠单克隆抗体KR127重链的HCDR1的Trp33、Met34和Asn35；HCDR2的Arg50、Tyr52和Pro52a；以及HCDR3的Glu95、Tyr96和Glu98中的至少一个被移接到人抗体重链中相应的氨基酸序列上。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于进行下述移接步骤中的至少一个：(a)用丙氨酸替换人抗体HCDR1的32位的氨基酸残基；(b)用精氨酸或丙氨酸替换人抗体HCDR3的97位的氨基酸残基；(c)用缬氨酸替换人抗体HCDR3的98位的氨基酸残基；以及(d)用精氨酸或丙氨酸替换HCDR3的102位的氨基酸残基。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于鼠单克隆抗体KR127重链的HCDR1的Trp33和Asn35；HCDR2的Arg50和Tyr52；以及HCDR3的Arg95和Tyr96中的至少一个被移接到人抗体重链DP7-JH4中。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于进一步将鼠单克隆抗体KR127重链可变区中构架区3的Ala71和Lys73氨基酸残基移接到人抗体重链DP7-JH4中。
7.权利要求2所述的方法，其特征在于将鼠单克隆抗体KR127轻链中LCDR1的Leu27b、Tyr27d、Ser27e、Asn28、Lys30、Tyr32和Asn34；LCDR2的Leu50和Asp55，以及LCDR3的Val89、Gln90、Gly91、Thr92、His93、Phe94、Pro95和Gln96的至少一个移接到人抗体轻链中。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于将鼠单克隆抗体KR127轻链的LCDR1的Tyr27d、Asn28、Asn34；LCDR2的Leu50和Asp55；以及LCDR3的Val89、Gly91、Thr92、His93、Phe94、Pro95和Gln96移接到人抗体轻链DPH12-JK4中。
9.权利要求7所述的方法，其特征在于进一步将鼠单克隆抗体KR127轻链可变区的构架区2中Leu36和Arg46移接到人抗体轻链DPH12-JK4中。
10.由权利要求1到9任何一项所述的方法制备的人源化抗体，其抗原亲和力高于8.2×10-9M，并且比用CDR-移接方法制备的抗体在更大程度上抑制了HAMA(人抗-鼠抗体)反应。
11.权利要求10所述的人源化抗体，其具有针对HBV前-S1抗原的重链可变区的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
12.权利要求10所述的人源化抗体，其具有针对HBV前-S1抗原的轻链可变区的SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
13.权利要求10到12的任一项所述的人源化抗体，其是由CHO/HuKR127(登记号No.：KCTC10199BP)产生的。
14.编码人源化抗体重链的DNA，其中所述的人源化抗体重链含有针对HBV前-S1抗原的重链可变区的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
15.权利要求14的DNA，其中可变区具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
16.编码人源化抗体轻链的DNA，其中所述的人源化抗体轻链含有针对HBV前-S1抗原的轻链可变区的SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
17.权利要求16的DNA，其中可变区具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
18.一种表达载体，包含权利要求15的DNA，用于表达针对HBV前-S1抗原的人源化抗体重链。
19.一种表达载体，包含权利要求17的DNA，用于表达针对HBV前-S1抗原的人源化抗体轻链。
20.一种表达载体，同时包含权利要求15和17的DNA，用于表达针对HBV前-S1抗原的人源化抗体重链和轻链。
21.用权利要求20的表达载体转化的大肠杆菌(E.coli)DH5α/pdCMV-dhfrC-HuKR127(登记号No.：KCTC 10198BP)。
22.生产权利要求10的人源化抗体的CHO细胞系CHO/HuKR127(登记号No.：KCTC10199BP)。
23.一种包含权利要求10到12的任何一项所述的人源化抗体的用于预防或治疗HBV感染的组合物。
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