RS59080B1 - Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen - Google Patents

Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen

Info

Publication number
RS59080B1
RS59080B1 RS20190975A RSP20190975A RS59080B1 RS 59080 B1 RS59080 B1 RS 59080B1 RS 20190975 A RS20190975 A RS 20190975A RS P20190975 A RSP20190975 A RS P20190975A RS 59080 B1 RS59080 B1 RS 59080B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
antibody
seq
kaag1
variable region
Prior art date
Application number
RS20190975A
Other languages
English (en)
Inventor
Gilles Bernard Tremblay
Anna N Moraitis
Traian Sulea
Mario Filion
Original Assignee
Adc Therapeutics Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adc Therapeutics Sa filed Critical Adc Therapeutics Sa
Publication of RS59080B1 publication Critical patent/RS59080B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na specifična antitela ili fragmente koji se vezuju za antigen koji se specifično vezuju za antigen 1 (KAAG1) povezan sa bubrezima i njihovu upotrebu za lečenje, otkrivanje i dijagnozu kancera. Posebno se razmatra davanje terapeutskog sredstva ćelijama sa ovim antitelima ili fragmentima koji se vezuju za antigen.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Među ginekološkim malignitetima, kancer jajnika predstavlja najveći mortalitet povezan sa tumorima kod žena u Sjedinjenim Državama (Jemal i dr., 2005). To je četvrti vodeći uzrok smrti od kancera kod žena u SAD-a (Menon i dr., 2005). Američko udruženje za kancer procenilo je ukupno 22.220 novih slučajeva u 2005. godini i pripisalo 16.210 smrtnih slučajeva bolesti (Bonome i dr., 2005). U proteklih 30 godina, statistika je uglavnom ostala ista - većina žena koje imaju kancer jajnika umreće od ove bolesti (Chambers i Vanderhyden, 2006). Bolest nosi životni rizik od 1:70 i smrtnost od > 60% (Chambers i Vanderhyden, 2006). Visoka stopa smrtnosti je zbog teškoća u ranom otkrivanju kancera jajnika kada se malignitet već proširio izvan jajnika. Zaista, > 80% pacijenata ima dijagnozu uznapredovale bolesti (III ili IV stadijum) (Bonome i dr., 2005). Ovi pacijenti imaju lošu prognozu koja se ogleda u < 45% 5-godišnjoj stopi preživljavanja, iako će 80% do 90% u početku reagovati na hemoterapiju (Berek i dr., 2000). Ovaj povećani uspeh u poređenju sa 20% 5-godišnjom stopom preživljavanja godina ranije je, barem delimično, zbog sposobnosti optimalnog uklanjanja tumorskog tkiva kada je ograničen na jajnike, što je značajan prognostički faktor za kancer jajnika (Bristow R. E., 2000; Brown i dr., 2004). Kod pacijenata kod kojih je dijagnostikovana rana bolest (stadijum I), 5-godišnja stopa preživljavanja kreće se od > 90 (Chambers i Vanderhyden, 2006).
[0003] Karcinom jajnika obuhvata heterogenu grupu tumora koji su izvedeni iz površinskog epitela jajnika ili iz površinskih inkluzija. Razvrstavaju se u serozne, mucinozne, endometrioidne, bistre i Brenerove (prelazne) tipove koji odgovaraju različitim tipovima epitela u organima ženskog reproduktivnog trakta (Shih i Kurman, 2005). Od ovih, serozni tumori predstavljaju -60% slučajeva kancera jajnika koji su dijagnostikovani. Svaka histološka potkategorija je dalje podeljena u tri grupe: benigni, srednji (granični tumor ili mali potencijal malignosti (LMP)) i maligni, odražavajući njihovo kliničko ponašanje (Seidman i dr., 2002). LMP predstavlja 10% do 15% tumora koji su dijagnosticirani kao serozni i predstavlja zagonetku jer pokazuju atipičnu nuklearnu strukturu i metastatsko ponašanje, ali su znatno manje agresivni od visokokvalitetnih seroznih tumora. Petogodišnje preživljavanje pacijenata sa tumorom LMP je 95% u poređenju sa <45% preživljavanja napredne bolesti više klase u istom periodu (Berek i dr., 2000).
[0004] Dijagnoza kancera jajnika trenutno se delom odvija kroz rutinsku analizu anamneze pacijenata i obavljanjem fizičkih, ultrazvučnih i rendgenskih pregleda i hematološkog pregleda. Prijavljene su dve alternativne strategije za ranu hematološku detekciju serumskih biomarkera. Jedan pristup je analiza uzoraka seruma masenom spektrometrijom da bi se pronašli proteini ili fragmenti proteina nepoznatog identiteta koji detektuju prisustvo ili odsustvo kancera (Mor i dr., 2005; Kozak i dr., 2003). Međutim, ova strategija je skupa i nije široko dostupna. Alternativno, prisustvo ili odsustvo poznatih proteina/peptida u serumu se detektuje korišćenjem mikročipova antitela, ELISA ili drugih sličnih pristupa. Serumsko testiranje za biomarker proteina nazvan CA-125 (antigen kancera-125) dugo se dugo koristilo kao marker za kancer jajnika. Međutim, iako ćelije kancera jajnika mogu da proizvedu višak ovih proteinskih molekula, postoje i neki drugi kanceri, uključujući kancer jajovoda ili endometrijumski kancer (kancer sluznice materice), 60% ljudi sa kancerom pankreasa i 20 % -25% ljudi sa drugim malignitetima sa povišenim nivoima CA-125. Test CA-125 daje samo pravi pozitivan rezultat za oko 50% pacijenata sa kancerom jajnika u fazi I i ima 80% šanse da da istinite pozitivne rezultate od pacijenata sa karcinomom jajnika II, III i IV stadijuma. Ostalih 20% pacijenata obolelih od kancera jajnika ne pokazuje povećanje koncentracije CA-125. Pored toga, povišeni CA-125 test može ukazati na druge benigne aktivnosti koje nisu povezane sa kancerom, kao što su menstruacija, trudnoća ili endometrioza. Shodno tome, ovaj test ima veoma ograničenu kliničku primenu za otkrivanje bolesti u ranom stadijumu kada se još može lečiti, pokazujući pozitivnu prediktivnu vrednost (PPV) <10%. Čak i sa dodatkom ultrazvučnog skrininga na CA-125, PPV se samo poboljšava na oko 20% (Kozak i dr., 2003). Dakle, ovaj test nije efikasan test skrininga.
[0005] Uprkos poboljšanim saznanjima o etiologiji bolesti, agresivnoj citoreduktivnoj hirurgiji i modernoj kombinovanoj hemoterapiji, došlo je do male promene u mortalitetu. Loši ishodi pripisani su (1) nedostatku adekvatnih testova skrininga za rano otkrivanje bolesti u kombinaciji sa samo suptilnom prezentacijom simptoma u ovoj fazi - dijagnoza se često postavlja tek nakon progresije u kasnijim fazama, nakon čega se peritonealna diseminacija kancera ograničava efikasan tretman i (2) čest razvoj rezistencije na standardne hemoterapijske strategije ograničavajući poboljšanje u 5-godišnjoj stopi preživljavanja pacijenata. Početni režim hemoterapije za kancer jajnika uključuje kombinaciju karboplatina (paraplatin) i paklitaksela (taksola). Godine kliničkih ispitivanja su dokazale da je ova kombinacija najefikasnija nakon efikasne operacije - smanjuje volumen tumora kod oko 80% žena sa novodijagnostikovanim karcinomom jajnika i 40% do 50% će imati potpunu regresiju - ali studije nastavljaju da traže načine da poboljšati odgovor pacijenta. Skorašnja abdominalna infuzija hemoterapeutika za ciljanje teško dostupnih ćelija u kombinaciji sa intravenskim davanjem povećala je efikasnost. Međutim, teški neželjeni efekti često dovode do nepotpunog tretmana. Neka druga hemoterapeutska sredstva uključuju doksorubicin, cisplatin, ciklofosfamid, bleomicin, etopozid, vinblastin, topotekan hidrohlorid, ifosfamid, 5-fluorouracil i melfalan. Nedavno, klinička ispitivanja su pokazala da intraperitonealna primena cisplatina daje prednost u preživljavanju u poređenju sa sistemskom intravenoznom hemoterapijom (Cannistra i McGuire, 2007). Odlične stope preživljavanja za žene sa ranim stadijumom bolesti koje primaju hemoterapiju pružaju snažan razlog za istraživačke napore da se razviju strategije za poboljšanje otkrivanja kancera jajnika. Štaviše, otkriće novih biomarkera povezanih sa kancerom jajnika će dovesti do razvoja efikasnijih terapijskih strategija sa minimalnim sporednim efektima za buduće lečenje kancera jajnika.
[0006] Uprkos ovim nedavnim dostignućima u razumevanju i tretmanu kancera jajnika, upotreba hemoterapije je uvek povezana sa ozbiljnim neželjenim reakcijama, koje ograničavaju njihovu upotrebu. Shodno tome, potreba za specifičnijim strategijama, kao što je kombinovanje specifičnosti tkiva antigena sa selektivnošću monoklonskih antitela, treba da omogući značajno smanjenje neželjenih efekata koji su povezani sa ciljanjem. Upotreba monoklonskih antitela za terapiju kancera jajnika počinje da se pojavljuje sa sve većim brojem tekućih kliničkih ispitivanja (Oei i dr., 2008; Nicodemus and berek, 2005). Većina ovih ispitivanja je ispitala upotrebu monoklonalnih antitela konjugovanih sa radioizotopima, kao što je itrijum-90, ili antitela koja ciljaju tumorske antigene koji su već identifikovani u drugim tipovima kancera. Primer za to je upotreba bevacizumaba, koji cilja faktor rasta vaskularnog endotela (Burger, 2007). Postoji vrlo malo specifičnih antigena za karcinom jajnika koji su trenutno pod istragom kao terapijski ciljevi za monoklonska antitela. Neki primeri uključuju upotrebu proteina nazvanog B7-H4 (Simon i dr., 2006) i nedavno folatni receptor-alfa (Ebel i dr., 2007), koji je nedavno ušao u fazu II kliničkih ispitivanja.
[0007] Antigen 1 (KAAG1) povezan sa bubrezima je originalno kloniran iz cDNK biblioteke izvedene iz ćelijske linije karcinoma bubrežnog karcinoma leukocita histokompatibilnosti-B7 kao antigenski peptid predstavljen citotoksičnim T limfocitima (Van den Eynde i dr.,1999; Pristupni broj banke gena K9UBP8, SEQ ID NO:28; 29). Nađeno je da lokus koji sadrži KAAG1 kodira dva gena prepisana na suprotnim lancima DNK. Nađeno je da smisleni lanac kodira transkript koji kodira protein nazvan DCDC2. Ekspresiona ispitivanja ovih autora su otkrile da je KAAG1 antisense transkript specifičan za tumor i da pokazuju veoma malo ekspresije u normalnim tkivima, dok je DCDC2 senzorski transkript sveprisutno izražen (Van den Eynde i dr., 1999). Ekspresija KAAG1 transkripta kod kancera, a posebno kancera jajnika, kancera bubrega, kancera pluća, kancera debelog creva, kancera dojke i melanoma, otkrivena je u objavljenoj patentnoj prijavi br. PCT/CA2007/001134 (objavljenoj kao WO2007/147265A1). Van den Eynde i saradnici su takođe primetili RNK ekspresiju u bubrežnim karcinomima, kolorektalnim karcinomima, melanomima, sarkomima, leukemijama, tumorima mozga, tumoru štitne žlezde, karcinomima prostate, karcinomima jednjaka, tumora bešike, karcinoma pluća i tumora glave i vrata. Nedavno, snažni genetički dokazi dobijeni putem studija neravnoteže povezivanja otkrili su da je VMP/DCDC2/KAAG1 lokus povezan sa disleksijom (Schumacher i dr., 2006; Cope i dr., 2005). Jedan od ovih izveštaja ukazuje na DCDC2 marker kao krivca kod pacijenata sa disleksijom, jer je funkcija ovog proteina u migraciji kortikalnih neurona bila u skladu sa simptomima ovih pacijenata koji često pokazuju abnormalnu migraciju i sazrevanje neurona (Schumacher i dr., 2006). WO2013/104050A2 navodi da ćelije kancera dojke koje nemaju ekspresiju ER proteina, ekspresiju PgR proteina i/ili pokazuju odsustvo prekomerne ekspresije HER2 proteina (tj. trostruko negativne ćelije raka dojke, bazalne) mogu biti efikasno ciljane sa anti-KAAG1 antitelom i ubijene nakon isporuke terapeutske grupe. Ovaj dokument spada u član 54(3) EPC.
REZIME PRONALASKA
[0008] Pronalazak se odnosi na specifična anti-KAAG1 antitela i fragmente koji se vezuju za antigen i njihovu upotrebu za tretman, detekciju i dijagnostiku kancera koji obuhvataju tumorske ćelije koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1. Primeri takvih karcinoma uključuju, na primer, kancer jajnika, kancer kože, kancer bubrega, kolorektalni kancer, sarkom, leukemiju, kancer mozga, kancer štitne žlezde, kancer dojke, kancer prostate, kancer jednjaka, kancer bešike, kancer pluća, kancer pluća i kancer glave i vrata.
[0009] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti posebno efikasni kod ciljanja KAAG1 ili KAAG1 varijante eksprimirane na površini tumorskih ćelija.
[0010] U stvari, izgleda da su antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen ovog pronalaska poboljšali sposobnost vezivanja za KAAG1-ekspresujuće tumorske ćelije u poređenju sa, na primer, 3D3 i 3G10 antitelima opisanim u PCT/CA2009/001586 (objavljenim kao WO2010/060186). Ova antitela i fragmenti koji vezuju antigen su takođe internalizovani i stoga mogu biti korisni za davanje terapeutskih sredstava tumorskim ćelijama. Naši rezultati sugerišu da se antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji imaju željene karakteristike (npr., poboljšano vezivanje i internalizacija), generalno vezuju za C-terminalni region KAAG1, ograničen aminokiselinama 61 do 84. Međutim, iako se i antitela 3A4 i 3G10 vezuju za isti region, izgleda da se antitelo 3A4 veže za površinu tumorskih ćelija efikasnije nego 3G10 antitelo. Konkretno, ćelije kancera koje eksprimiraju KAAG1 antigen zahtevaju približno 10 puta manje 3A4 u poređenju sa 3G10 u pokusima protočne citometrije, što je pristup koji meri direktno vezivanje antitela na površinu ćelija. Pored toga, u eksperimentima vezivanja korišćenjem površinske plazmonske rezonance, otkriveno je da je afinitet 3A4 za KAAG1 ispod 10 pikomolara, dok su antitela 3D3 i 3G10 pokazala afinitete veće od 200 nanomolarnih (20 puta manji afinitet). Prema tome, očekuje se da se ovo povećanje u sposobnosti vezivanja 3A4 prevodi u poboljšanu terapeutsku aktivnost.
[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen 1 (KAAG1) povezanog sa bubregom i koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5, CDRH2 aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:6 i CDRH3 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 aminokiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO.:8, CDRL2 aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO. i CDRL3 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:10, gde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži ljudske okvirne regione i opciono jednu ili više povratnih mutacija u varijabilnom regionu lakog lanca i/ili varijabilnom regionu teškog lanca, gde su jedna ili više povratnih mutacija u okvirnom regionu i odgovaraju okvirnim aminokiselinama u sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca prikazanog u SEQ ID NO:2 i/ili u aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca prikazanog u SEQ ID NO:4 matičnog antitela miša.
[0012] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje humanizovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen 1 (KAAG1) povezan sa bubregom, pri čemu humanizovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina iznetu u SEQ ID NO.:35, SEQ ID NO:36 ili SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO.:30, SEQ ID NO.:31 ili SEQ ID NO.:32.
[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku.
[0014] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska.
[0015] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu ćeliju koja sadrži:
a. nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema pronalasku i nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska, pri čemu je svaka nukleinska kiselina odvojeni vektor ili na istom vektoru; ili
b. humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen pronalaska.
[0016] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sastav ili farmaceutski sastav koji sadrži humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku, gde navedeni sastav dalje sadrži nosač i gde navedeni farmaceutski sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0017] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji sadrži humanizovano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment iz pronalaska.
[0018] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema pronalasku ili sastav ili farmaceutski sastav pronalaska, za upotrebu u lečenju, otkrivanju ili dijagnostikovanju kancera koji obuhvataju ćelije koje eksprimiraju KAAG1 ili KAAG1 varijantu.
[0019] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod rekombinantne DNK za dobijanje humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema pronalasku, koji obuhvata kultivaciju izolovane ćelije pronalaska tako da se proizvodi antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.
[0020] Poželjna otelotvorenja pronalaska su navedene u patentnim zahtevima.
[0021] Ovde je obelodanjeno izolovano ili značajno prečišćeno antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji može biti sposoban za specifično vezivanje za sekvencu koja je identična najmanje 10 (npr., 10 do 20 ili više) uzastopnih aminokiselina lociranih između aminokiselina 61 do 84 od KAAG1 (SEQ ID NO.:29)
[0022] Takođe su obelodanjena izolovana antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen sposobni su da se takmiče sa ovde opisanim antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen.
[0023] Ovde su obelodanjena specifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji imaju ovde opisane aminokiselinske sekvence. Takva antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti u obliku monoklonskih antitela, poliklonalnih antitela, himernih antitela, humanizovanih antitela i humanih antitela (izolovana) kao i fragmenti koji vezuju antigen koji imaju ovde opisane karakteristike. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen u skladu sa ovim pronalaskom su humanizovana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji obuhvataju permutacije lakog i/ili teškog lanca između monoklonskog, himernog, humanizovanog ili humanog antitela su takođe obuhvaćeni ovde.
[0024] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže aminokiseline humanog konstantnog regiona i aminokiseline okvira humanog antitela. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska sadrže okvirne aminokiseline humanog antitela.
[0025] Termin "antitelo" se odnosi na netaknuta antitela, monoklonska ili poliklonska antitela. Termin "antitelo" takođe obuhvata multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela. Humana antitela su obično napravljena od dva laka lanca i dva teška lanca od kojih svaki sadrži varijabilne regione i konstantne regione. Varijabilni region lakog lanca sadrži 3 CDR-a, identifikovana ovde kao CDRL1 ili L1, CDRL2 ili L2 i CDRL3 ili L3 koji su okruženi okvirnim regionima. Varijabilni region teškog lanca sadrži 3 CDR-a, identifikovana ovde kao CDRH1 ili H1, CDRH2 ili H2 i CDRH3 ili H3 koji su okruženi okvirnim regionima. CDR humanizovanih antitela iz predmetnog pronalaska su identifikovani korišćenjem Kabat i Chotia definicija (npr., CDRH2 prikazana u SEQ ID NO.:56). Međutim, drugi (Abhinandan i Martin, 2008) su koristili modifikovane pristupe zasnovane labavo na Kabat i Chotia, što je rezultiralo u razgraničenju kraćih CDR (npr. CDRH2 prikazano u SEQ ID NO.:6).
[0026] Termin "fragment koji se vezuje za antigen", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost vezivanja za antigen (npr., KAAG1, izlučeni oblik KAAG1 ili njegove varijante). Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima netaknutog antitela. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni terminom "fragment koji vezuje antigen" antitela pune dužine obuhvataju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment sadrži VHi CH1domene; (iv) Fv fragment koji se sastoji iz VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmenata (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji iz VHdomena; i (vi) izolovani region koje određuje komplementarnost (CDR), npr., VHCDR3. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana za odvojene gene, oni se mogu spojiti, koristeći rekombinantne metode, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan polipeptidni lanac u kome je VLi VHregioni spajaju se da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird i dr. (1988) Science 242:423-426; i Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena terminom "fragment koji se vezuje za antigen" antitela. Dalje, fragmenti koji vezuju antigen uključuju fuzione proteine imunoglobulina domena vezivanja koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena (kao što je varijabilni region teškog lanca, varijabilni region lakog lanca, ili varijabilni region teškog lanca fuzionisan na varijabilnu oblast lakog lanca preko vezivnog peptida) koji je fuzionisan sa polipeptidom imunoglobulinskog zglobnog regiona, (ii) konstantnim regionom CH2 imunoglobulina teškog lanca spojenim na zglobnom regionu, i (iii) CH3 konstantnim regionom imunoglobulinskog teškog lanca fuzionisanom na CH2 konstantni region. Zglobni region može biti modifikovan zamenom jednog ili više cisteinskih ostataka sa serinskim ostacima kako bi se sprečila dimerizacija. Takvi fuzioni proteini imunoglobulina u domenu vezivanja su dalje obelodanjeni u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate onima koji su verzirani u stanje tehnike, a fragmenti se pregledavaju na korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.
[0027] Termin "humanizovano antitelo" obuhvata potpuno humanizovano antitelo (tj., okviri su 100% humanizovani) i delimično humanizovano antitelo (npr., najmanje jedan varijabilni domen sadrži jednu ili više aminokiselina iz humanog antitela, dok su druge aminokiseline ne-humanog roditeljskog antitela). Tipično "humanizovano antitelo" sadrži CDRs ne-humano roditeljsko antitelo (npr., miša, pacova, zeca, primata koji nisu ljudi, itd.) i okviri koji su identični onima prirodnog humanog antitela ili konsenzusa humanog antitela. U tom slučaju, ona "humanizovana antitela" su okarakterisana kao potpuno humanizovana. "Humanizovano antitelo" može takođe da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje nemaju podudarnost sa onima humanog antitela ili konsenzusa humanog antitela. Takve supstitucije uključuju, na primer, povratne mutacije (npr., ponovno uvođenje ne-humanih aminokiselina) koje mogu sačuvati karakteristike antitela (npr., afinitet, specifičnost itd.). Takve zamene su obično u okvirnom regionu. "Humanizovano antitelo" opciono takođe sadrži bar deo konstantnog regiona (Fc) koji je tipično humano antitelo. Tipično, konstantni region "humanizovanog antitela" je identičan onom od humanog antitela.
[0028] Termin "prirodno humano antitelo" se odnosi na antitelo koje je kodirano (kodirano) repertoarom humanog antitela, tj., sekvenca germinalne linije.
[0029] Termin "himerno antitelo" se odnosi na antitelo koje ima ne-humani varijabilni region(e) i humani konstantni region.
[0030] Termin "hibridno antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži jedan od njegovih varijabilnih regiona teškog ili lakog lanca (njegov teški ili laki lanac) iz određenih tipova antitela (npr., humanizovano) dok je drugi varijabilan region teškog ili lakog lanca (teški ili laki lanac) je iz drugog tipa (npr., mišji, himerni).
[0031] U nekim otelotvorenjima, okvirni region teškog lanca i/ili lakog lanca humanizovanog antitela može sadržati od jedne do trideset aminokiselina iz ne-humanog antitela koje se želi humanizovati i preostali deo je iz prirodnog humanog antitela ili konsenzus humanog antitela. U nekim slučajevima, humanizovano antitelo može sadržati od 1 do 6 ne-humanih CDR-a i često šest CDR-a nisu humani.
[0032] Prirodno humano antitelo koje je odabrano za humanizaciju nehumanog roditeljskog antitela može da sadrži varijabilni region koji ima trodimenzionalnu strukturu sličnu onoj (koja se može postaviti na) (modelovano) varijabilno područje ne-humanog roditeljskog antitela. Kao takvo, humanizovano antitelo ima veću šansu da ima trodimenzionalnu strukturu sličnu onoj za ne-humano roditeljsko antitelo.
[0033] Varijabilni region lakog lanca prirodnog humanog antitela izabranog u svrhu humanizacije, može imati, na primer, ukupnu (preko čitavog varijabilnog regiona lakog lanca) najmanje 70%, 75%, 80%, itd. identičnost sa identitetom ne-humanog roditeljskog antitela. Alternativno, okvirni region lakog lanca prirodnog humanog antitela izabranog u svrhu humanizacije, može imati, na primer, najmanje 70% 75%, 80%, 85% itd. Identičnosti sekvence sa okvirnim regionom lakog lanca ne-humanog roditeljskog antitela. U nekim otelotvorenjima, prirodno humano antitelo, koje je izabrano u svrhu humanizacije, može imati isti ili suštinski isti broj aminokiselina u svom regionu za određivanje komplementarnosti lakog lanca sa onim regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca nehumanog roditeljskog antitela.
[0034] Varijabilni region teškog lanca prirodnog humanog antitela izabranog u svrhu humanizacije, može imati, na primer, ukupnu (preko čitavog varijabilnog regiona teškog lanca) najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, itd. identičnost sa identitetom ne-humanog roditeljskog antitela. Takođe, u skladu sa predmetnim pronalaskom, aminokiselinski ostaci humanog okvirnog regiona teškog lanca humanizovanog antitela mogu biti iz okvira okvirnog regiona teškog lanca prirodnog humanog antitela koji ima najmanje 70%, 75%, 89% itd. identiteta sa teškim lancem okvirnog regiona nehumanog roditeljskog antitela. U nekim otelotvorenjima, prirodno humano antitelo, koje je izabrano u svrhu humanizacije, može imati isti ili suštinski isti broj aminokiselina u svom regionu za određivanje komplementarnosti teškog lanca sa onim regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca ne-humanog roditeljskog antitela.
[0035] Prirodno humano antitelo koje je odabrano za humanizaciju nehumanog roditeljskog antitela može da sadrži varijabilni region koji ima trodimenzionalnu strukturu sličnu onoj (koja se može postaviti na) (modelovano) varijabilno područje ne-humanog roditeljskog antitela. Kao takvo, humanizovano ili hibridno antitelo ima veću šansu da ima trodimenzionalnu strukturu sličnu onoj za ne-humano roditeljsko antitelo.
[0036] Na primer, varijabilni region teškog lanca prirodnog humanog antitela koji može biti izabrana u svrhu humanizacije može imati sledeće karakteristike: a) trodimenzionalnu strukturu sličnu ili identičnu (koja se može preklapati) sa teškim lancem ne-humanog antitela i/ili b) okvirni region koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu okvirnom regionu teškog lanca ne-humanog antitela. Opciono, (broj) aminokiselinskih ostataka u CDR teškog lanca (npr., sva tri CDR-a) je isti ili suštinski isti kao i ostaci CDR aminokiselinskih ostataka ne-humanog teškog lanca.
[0037] Alternativno, varijabilni region lakog lanca prirodnog humanog antitela koji može biti izabrana u svrhu humanizacije može imati sledeće karakteristike: a) trodimenzionalnu strukturu sličnu ili identičnu (koja se može preklapati) sa lakim lancem ne-humanog antitela i/ili b) okvirni region koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu okvirnom regionu lakog lanca ne-humanog antitela. Opciono, (broj) aminokiselinskih ostataka u CDR lakog lanca (npr., sva tri CDR-a) koji je isti ili suštinski isti kao i ostaci CDR aminokiselinskih ostataka ne-humanog lakog lanca.
[0038] Tipično mesto za vezivanje antigena se sastoji iz varijabilnih regiona formiranih uparivanjem imunoglobulina lakog lanca i imunoglobulina teškog lanca. Struktura varijabilnih regiona antitela je veoma konzistentna i pokazuje veoma slične strukture. Ovi varijabilni regioni tipično se sastoje od relativno homolognih okvirnih regiona (FR), razmaknutih sa tri hipervarijabilna regiona nazvana regioni koji determinišu komplementarnost (CDR). Ukupna aktivnost vezivanja antigen-vezujućeg fragmenta je često diktirana sekvencom CDR-a. FR često igraju ulogu u pravilnom pozicioniranju i poravnanju u tri dimenzije CDR-a za optimalno vezivanje antigena.
[0039] Antitela i/ili fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska mogu da potiču, na primer, od miša, pacova ili bilo kog drugog sisara ili iz drugih izvora, kao što su tehnologije rekombinantne DNK.
[0040] Dalji opseg, primenljivost i prednosti predmetnog pronalaska će postati očigledni iz detaljnog opisa koji se ne ograničava u daljem tekstu. Treba, međutim, razumeti da je ovaj detaljan opis, iako ukazuje na primer ostvarenja pronalaska, dat samo kao primer, uz pozivanje na priložene crteže.
KRATAK OPIS SLIKA
[0041]
Slika 1 prikazuje rezultate ELISA testa koji poredi vezivanje 3A4 himernog anti-KAAG1 antitela sa kontrolnim antitelom kada se inkubira sa rastućim koncentracijama rekombinantnog humanog KAAG1. Kriva vezivanja 3A4 je prikazana svetlijom bojom.
Slika 2 prikazuje histogram koji opisuje rezultate ELISA analiza za mapiranje specifičnosti epitopa 3A4 anti-KAAG1 antitela. Rezultati su pokazali da 3A4 interaguje sa sekvencom aminokiselina sadržanih na karboksi-terminusu KAAG1 između aminokiselina 61 - 84. Vezivanje 3A4 je upoređeno sa 3C4, 3D3 i 3G10 anti-KAAG1 antitelima za koja je poznato da interaguju sa regionima 1 - 35, 36 - 60, i 61 - 84 od KAAG1, respektivno.
Slika 3A prikazuje rezultate protočne citometrije izvedene na SKOV-3 i TOV-21G ćelijama raka jajnika sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom (tamnija linija) u poređenju sa kontrolnim IgG (svetlijom linijom).
Slika 3B prikazuje rezultate protočne citometrije koja je izvršena na 293E ćelijama humanog bubrega sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom (tamnija linija) u poređenju sa kontrolnim IgG (svetlijom linijom).
Slika 4 predstavlja detekciju KAAG1 antigena na površini SKOV-3 ćelija protočnom citometrijom sa 3A4 anti-KAAG1 antitelom. Signal fluorescencije opada sa vremenom kada su ćelije inkubirane na 37 °C, što sugeriše da je kompleks KAAG1/antitela internalizovan tokom inkubacije kada su ćelije inkubirane sa 3A4.
Slika 5 prikazuje internalizaciju 3A4 anti-KAAG1 antitela i njegovu zajedničku lokalizaciju sa LAMP1, proteinom povezanim sa endosomalnim i lizosomskim membranama.
Slika 6A i 6B su grafici koji predstavljaju FACs analizu tumorskih ćelija izloženih različitim anti-KAAG1 antitelima.
Slika 7 su šeme koje predstavljaju 2 verovatno predstavljanje KAAG1 orijentacije u ćelijskoj membrani.
Slika 8 je molekularni model (trakasti dijagram) mišijeg 3A4 varijabilnog domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom.
Slika 9a je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh1Hh1 (tj., humanizovanog lakog lanca 1 i humanizovanog teškog lanca 1) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh1 označava humanizovani laki lanac varijante 1 i Hh1 označava teški lanac varijante 1.
Slika 9b je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh1Hh2 (tj., humanizovanog lakog lanca 1 i humanizovanog teškog lanca 2) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh1 označava humanizovani laki lanac varijante 1 i Hh2 označava teški lanac varijante 2.
Slika 9c je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh1Hh3 (tj., humanizovanog lakog lanca 1 i humanizovanog teškog lanca 3) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh1 označava humanizovani laki lanac varijante 1 i Hh3 označava teški lanac varijante 3.
Slika 9d je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh1Hh4 (tj., humanizovanog lakog lanca 1 i humanizovanog teškog lanca 4) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh1 označava humanizovani laki lanac varijante 1 i Hh4 označava teški lanac varijante 4.
Slika 9e je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh2Hh1 (tj., humanizovanog lakog lanca 2 i humanizovanog teškog lanca 1) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh2 označava humanizovani laki lanac varijante 2 i Hh1 označava teški lanac varijante 1.
Slika 9f je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh2Hh2 (tj., humanizovanog lakog lanca 2 i humanizovanog teškog lanca 2) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh2 označava humanizovani laki lanac varijante 2 i Hh2 označava teški lanac varijante 2.
Slika 9g je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh2Hh3 (tj., humanizovanog lakog lanca 2 i humanizovanog teškog lanca 3) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh2 označava humanizovani laki lanac varijante 2 i Hh3 označava teški lanac varijante 3.
Slika 9h je molekularni modeli humanizovanog antitela Lh2Hh4 (tj., humanizovanog lakog lanca 2 i humanizovanog teškog lanca 4) 3A4 varijabilnih domena. CDR petlje su obojene u crno i obeležene su L1, L2 i L3 u lakom lancu i H1, H2 i H3 u teškom lancu. Okvirni region je prikazan sivom bojom. Bočni lanci ostataka koji su mutirani iz mišijeg okvira u humani okvir prikazani su u prikazu lopte i štapa. Lh2 označava humanizovani laki lanac varijante 2 i Hh4 označava teški lanac varijante 4.
Slika 10a je poravnanje aminokiselinske sekvence 3A4 varijabilnih domena mišijih i humanizovanih lakih lanaca. Laki lanac ima dve humanizovane varijante (Lhl a Lh2). CDRs su prikazani masnim slovima i označeni sa CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Povratne mutacije u humanim okvirnim regionima koji su mišije aminokiseline su podvučene u humanizovanim sekvencama.
Slika 10b je poravnanje aminokiselinske sekvence 3A4 varijabilnih domena mišijih i humanizovanih teških lanaca. Teški lanac ima četiri humanizovane varijante (Lhl a Hh4). CDRs su prikazani masnim slovima i označeni sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3. Povratne mutacije u humanim okvirnim regionima koji su mišije aminokiseline su podvučene u humanizovanim sekvencama.
Slika 11A je poravnanje varijabilnog regiona lakog lanca mišijeg 3A4 (SEQ ID NO.:4) sa varijabilnim regionom lakog lanca (SEQ ID NO.:33) korišćenjem programa ClustalW2 (Larkin M.A., i dr., (2007) ClustalW i ClustalX verzija 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948) gde "*" (zvezdica) označava pozicije koje imaju jedan, potpuno konzervisani ostatak, gde ":" (dve tačke) označava očuvanje između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje > 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici i gde "." (tačka) označava očuvanje između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje =< 0.5 u Gonnet PAM 250 matrici. ;Slika 11B je poravnanje varijabilnog regiona teškog lanca mišijeg 3A4 (SEQ ID NO.:2) sa varijabilnim regionom lakog lanca (SEQ ID NO.:38) korišćenjem programa ClustalW2 (Larkin M.A., i dr., (2007) ClustalW i ClustalX verzija 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948) gde "*" (zvezdica) označava pozicije koje imaju jedan, potpuno konzervisani ostatak, gde ":" (dve tačke) označava očuvanje između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje > 0,5 u Gonnet PAM 250 matrici i gde "." (tačka) označava očuvanje između grupa jako sličnih svojstava - bodovanje =< 0.5 u Gonnet PAM 250 matrici.
Slika 12a predstavlja mapu plazmida pKCR5-3A4-HC-varijante 1. Teški lanci humanizovanih 3A4 varijanti su klonirani na isti način u HindIII mesto pK-CR5. Prema tome, dobijeni plazmidi su identični varijanti 1 pKCR5-3A4-HC, izuzev sekvence varijabilnog domena imunoglobulina teškog lanca.
Slika 12b predstavlja mapu plazmida pMPG-CR5-3A4-LC-varijante 1. Laki lanci humanizovanih varijanti 1 i 23A4 antitela su klonirani na isti način na BamHI mesto pMPG-CR5. Prema tome, dobijeni plazmid je identičan sa pMPG-CR5-3A4-LC-varijantom 1, izuzev sekvence varijabilnog domena imunoglobulina lakog lanca.
Slika 13 predstavlja analizu proizvodnje antitela nakon prolazne transfekcije u CHO ćelijama. Supernatant (13 dana posle transfekcije) CHOcTA ćelija transfektovanih sa različitim kombinacijama lakih i teških lanaca humanizovanog 3A4 antitela je analiziran pomoću vestern blota. Kvantifikacija antitela proizvedenog u supernatantima je određena nakon skeniranja traka Vestern blota protiv razblaženja poznatog standarda (humano prečišćeno IgG antitelo). Marker molekularne težine g (kDa).
Slika 14 je grafik Superdex G75 gel filtracije rekombinantnog KAAG1 uzorka. KAAG1 je injektiran preko gel filtracije i razdvojen na 0.4 ml/min. Najveći vrh između frakcija 15 - 19.
Slika 15 je tabela koja prikazuje konstante brzine i afiniteta za mišije i humanizovane varijante 3A4 antitela.
Slika 16A je histogram koji prikazuje konstantu asocijacije (Ka) humanizovanih antitela.
Slika 16B je histogram koji prikazuje konstantu disocijacije (Kd) humanizovanih antitela.
Slika 16C je histogram koji prikazuje konstante afiniteta (KD) humanizovanih antitela.
Slika 17a ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vezuju za KAAG1 u ELISA. Ova slika prikazuje uporedno vezivanje varijanti humanizovanog antitela 3A4 i mišijeg 3A4. Koncentracioni zavisni profili vezivanja humanizovanih teških lanaca (Hhl, Hh2, Hh3 i Hh4), sastavljeni sa varijantom lakog lanca Lh1.
Slika 17b ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vezuju za KAAG1 u ELISA. Ova slika prikazuje uporedno vezivanje varijanti humanizovanog antitela 3A4 i mišijeg 3A4. Koncentracioni zavisni profili vezivanja humanizovanih teških lanaca (Hhl, Hh2, Hh3 i Hh4), sastavljeni sa varijantom lakog lanca Lh2.
Slika 18 ilustruje humanizovane 3A4 varijante koje se vezuju za KAAG1 na površini ćelija kancera. Ova ilustracija pokazuje uporednu aktivnost vezivanja humanizovanih i mišijih 3A4 antitela na nepermeabilne SKOV-3 ćelije kancera jajnika.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Ekspresija i biološka aktivnost KAAG1 u ćelijama kancera
[0042] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu antitela za ciljane tumore koji se nalaze u različitim tipovima kancera, posebno kancera jajnika. U cilju usmeravanja antitela na tumore, mora se izvršiti identifikacija tumorspecifičnih antigena koji se eksprimiraju na ćelijskoj površini ćelija kancera. Postoji nekoliko tehnologija koje su dostupne za identifikaciju tumor-specifičnih antigena i metoda koja je korišćena za identifikaciju KAAG1 u tumorima jajnika, inovativna platforma za otkrivanje pod nazivom substraktivna amplifikacija bazirana na transkripciji RNK (STAR), opisana je u objavljenoj patentnoj prijavi PCT/CA2007/001134 objavljena pod brojem WO/2007/147265 u decembru 27, 2007.
[0043] Analiza STAR biblioteka kancera jajnika dala je mnoge gene koji kodiraju sekretovane i površinski proteine ćelija. Jedan od njih, nazvan AB-0447, sadržao je otvoreni okvir za čitanje koji je kodirao polipeptid od 84 aminokiselina, što odgovara SEQ ID NO:29 koji je kodiran cDNK od 885 parova baza sa sekvencom nukleotida prikazanom u SEQ ID NO.:28. Pretraživanje javno dostupnih baza podataka otkrilo je da je AB-0447 nukleotidna sekvenca identična sa genom koji se zove KAAG1. Bioinformatička analiza je predvidela protein koji je usidren na membrani i predstavlja njegov funkcionalni domen vanćelijskog dela. KAAG1 je prvobitno kloniran iz biblioteke karcinoma bubrega kao antigen ćelijske površine, što potvrđuje njegovu lokalizaciju membrane. Pored toga, naša ispitivanja su pokazale da je protein obrađen na svom amino-terminisu, što je rezultat koji je bio u skladu sa cepanjem funkcionalnog signalnog peptida na ili između aminokiselina 30 i 34. Pored toga, prolazna ekspresija cDNK pune dužine rezultirala je detekcijom cepanog KAAG1 u podlozi kulture. Ovaj poslednji nalaz je pokazao da se ovaj protein koji je usidren na membrani može izbaciti iz ćelija kada se eksprimira na visokim nivoima. Nasuprot tome, ekspresija amino-skraćenog mutanta KAAG1 rezultirala je unutar-ćelijskim zadržavanjem proteina. Trenutno ne postoje objavljeni izveštaji koji bacaju bilo kakvo svetlo na njegovu funkciju i preteranu ekspresiju KAAG1 kod kancera jajnika, kako je otkriveno ovim pronalaskom, nikada ranije nije dokumentovano.
[0044] Tako smo istražili da li se KAAG1 može koristiti za dijagnostiku i terapiju na bazi antitela.
[0045] Utvrđeno je nekoliko modela na bazi karcinoma jajnika, kao što su TOV-21G, TOV-112D, OV-90 i drugi, i poznati su stručnjacima. Ove ćelije su deo kolekcije humanih ćelijskih linija kancera jajnika izvedenih od pacijenata sa tumorima jajnika ili ascitesnom tečnošću. Ove ćelijske linije su podvrgnute dubinskoj analizi, uključujući globalne obrasce ekspresije gena na mikrotalasima koji ih čine odličnim modelima baziranim na ćelijama za ljudski karcinom jajnika. Svojstva rasta, obrasci ekspresije gena i odgovor na hemoterapeutske lekove pokazali su da su ove ćelijske linije veoma reprezentativne za ponašanje tumora jajnika in vivo (Benoit i dr., 2007). RT-PCR analiza ukupne RNA izolovane iz ovih ćelijskih linija kancera jajnika pokazala je da je KAAG1 transkript slabo izražen u ćelijskim linijama izvedenim iz primarnih tumora. Nasuprot tome, ćelijske linije izvedene iz ascitesne tečnosti sadrže visok nivo ekspresije KAAG1. Povećana ekspresija KAAG1 u ćelijama iz ascitesne tečnosti sugeriše da sredina ćelija utiče na regulaciju gena KAAG1. Ascitesne ćelije su povezane sa uznapredovalom bolešću i ovaj obrazac izražavanja podrazumeva da su povećani nivoi KAAG1 povezani sa rastom nezavisnim od sidrenja. U saglasnosti sa ovim poslednjim sugestijama, nađeno je da ekspresija KAAG1 značajno povećava ćelijske linije izvedene iz primarnih tumora kada su te ćelije kultivisane kao sferoidi u 3D kulturama. Ovi sferoidi su opširno karakterizirani i nađeno je da pokazuju mnoga svojstva povezana sa tumorima in vivo (Codi i dr., 2008). Tako je nađeno da je ekspresija KAAG1 značajno povećana u modelima koji oponašaju progresiju tumora, posebno tokom evolucije kancera jajnika.
[0046] Uz demonstraciju da je ekspresija KAAG1 regulisana u ćelijama kancera jajnika, funkcija ovog gena u ponašanju ćelija kancera jajnika je ispitana u testovima baziranim na ćelijama. U tom smislu, RNK interferencija (RNKi) je korišćena za snižavanje ekspresije endogenog KAAG1 gena u ćelijskim linijama kancera jajnika i pronađeno je da smanjena ekspresija KAAG1 rezultira značajnim smanjenjem migracije ćelija kako je određeno u testu standardne ćelijske pokretljivosti, kao što je ilustrovano testom zarastanja rane (ili ogrebotine). Ovaj tip testa meri brzinu kojom ćelije popunjavaju ogoljene površine u konfluentnom monosloju. Smanjena ekspresija KAAG1 rezultirala je smanjenjem preživljavanja ćelijskih linija karcinoma jajnika, mereno klonogenim testom, kao što je test preživljavanja kolonije. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da koriste druge metode za procenu zahteva KAAG1 u ponašanju ćelija kancera, posebno ćelija kancera jajnika.
[0047] Na osnovu ekspresije KAAG1 u velikom procentu tumora jajnika, njegove ograničene ekspresije u normalnim tkivima i saglasnosti između nivoa ekspresije i povećane malignosti, i pretpostavljene biološke uloge za KAAG1 u ponašanju ćelijskih linija kancera jajnika, izabran je KAAG1. kao terapeutski cilj za razvoj antitela za detekciju, prevenciju i lečenje kancera jajnika. Ekspresija KAAG1 u kancerima, osim kancera jajnika takođe dovodi podnosioca zahteva do procene terapeutskih ili dijagnostičkih antitela za druge indikacije kancera.
[0048] Predmetno obelodanjivanje stoga obezbeđuje anti-KAAG1 antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično ciljaju KAAG1 i koji se mogu koristiti, na primer, kao konjugat antitelo-lek. Anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji specifično ciljaju KAAG1 prema pronalasku mogu se koristiti, na primer, kao konjugat antitelo-lek.
[0049] Takva antitela i fragmenti koji vezuju antigen obuhvataju, na primer, monoklonska antitela, poliklonska antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, fragmente antitela, jednolančana antitela, domenska antitela i polipeptide koji imaju antigen vezujući region. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen u skladu sa ovim pronalaskom su humanizovana antitela i fragmenti koji vezuju antigen.
Antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju za KAAG1
[0050] Antitela su inicijalno izolovana iz Fab biblioteka zbog njihove specifičnosti prema antigenu od interesa.
[0051] Varijabilni regioni antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani mogu biti fuzionisani sa konstantnim regionima željene vrste, čime se omogućava prepoznavanje antitela pomoću efektorskih ćelija željenih vrsta. Konstantni region može da potiče, na primer, iz IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipa. Kloniranje ili sintetizovanje konstantnog regiona u okviru sa varijabilnim regionom je u okviru stručnjaka i može biti izvedeno, na primer, tehnologijom rekombinantne DNK. Prema tome, antitela koja sadrže konstantni region humanog antitela, kao i antitela ili fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže aminokiseline okvira humanog antitela su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
[0052] Predmetni pronalazak, prema tome, obezbeđuje u jednom primeru otelotvorenja, izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima;
a. CDRL1 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:8 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:8;
b. CDRL2 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:9 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:9; i
c. CDRL3 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:10 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:10; i
teški lanac varijabilnog regiona koji ima;
d. CDRH1 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:5 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:5;
e. CDRH2 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:6 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:6 i;
f. CDRH3 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:7 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:7,
pri čemu antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži humane okvirne regione.
[0053] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima;
a. CDRL1 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:8 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:8;
b. CDRL2 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:9 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:9, ili;
c. CDRL3 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:10 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:10;
Izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može takođe da sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima;
a. CDRH1 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:5 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:5,
b. CDRH2 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:6 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:6, ili;
c. CDRH3 sekvenca sadrži SEQ ID NO.:7 ili kao što je izneto SEQ ID NO.:7.
[0054] U jednom primernom otelotvorenju, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može da sadrži bilo koji pojedinačni CDR ili kombinaciju CDR1, CDR2 i/ili CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca. CDR3 može biti posebno odabran. Kombinacija može da obuhvati, na primer, CDRL1 i CDRL3; CDRL1 i CDRL2; CDRL2 i CDRL3 i; CDRL1, CDRL2 i CDRL3.
[0055] U drugom primernom otelotvorenju, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može da sadrži bilo koji pojedinačni CDR ili kombinaciju CDR1, CDR2 i/ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca. CDR3 može biti posebno odabran. Kombinacija može da obuhvati, na primer, CDRH1 i CDRH3; CDRH1 i CDRH2; CDRH2 i CDRH3 i; CDRH1, CDRH2 i CDRH3.
[0056] U skladu sa ovim obelodanjivanjem, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može sadržati najmanje dva CDRs od CDRL1, CDRL2 ili CDRL3.
[0057] Takođe, u skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može sadržati jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0058] Dalje, u skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može sadržati:
a. Barem dva CDRs od CDRL1, CDRL2 ili CDRL3 i;
b. Barem dva CDRs od CDRH1, jedan CDRH2 ili jedan CDRH3.
[0059] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može poželjnije sadržati jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0060] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može takođe poželjnije sadržati jedan CDRH1, jedan CDRH2 i jedan CDRH3.
[0061] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može sadržati jedan CDRH1, jedan CDRH2 ili jedan CDRH3.
[0062] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može takođe sadržati jedan CDRH1, jedan CDRH2 i jedan CDRH3.
[0063] Kada je na raspolaganju samo jedan varijabilni region lakog lanca ili varijabilni region teškog lanca, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može biti rekonstituisan skriningom biblioteke komplementarnih varijabilnih regiona koristeći metode poznate u struci (Portolano i dr. The Journal of Immunology (1993) 150:880-887, Clarkson i dr., Nature (1991) 352:624-628).
[0064] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koji sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u najmanje jednom od ovde opisanih CDR (u poređenju sa originalnim CDR).
[0065] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koji sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u najmanje dva CDR-a (u poređenju sa originalnim CDR-ima).
[0066] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koja sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u 3 CDR-a (u poređenju sa originalnim CDR).
[0067] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koji sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje dva CDR-a (u poređenju sa originalnim CDR-ima).
[0068] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koji sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u najmanje dva CDR-a (u poređenju sa originalnim CDR-ima).
[0069] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polipeptide ili antitela koja sadrže varijabilne lance koji imaju najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u 3 CDR-a (u poređenju sa originalnim CDR).
[0070] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje se odnosi na polipeptid, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži (na jednom polipeptidnom lancu ili na odvojenim polipeptidnim lancima) najmanje jedno područje koje određuje komplementarnost varijabilnog regiona lakog lanca i najmanje jedno komplementarno određivanje region varijabilnog regiona teškog lanca jednog od antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen koji je ovde opisan.
[0071] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na drugi njegov aspekt na anti-KAAG1 antitela koja mogu sadržati (na jednom polipeptidnom lancu ili na odvojenim polipeptidnim lancima) svih šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen opisanog ovde.
Varijantno antitelo i fragmenti koji vezuju antigen
[0072] Predmetni pronalazak takođe obuhvata varijante antitela ili fragmente koji se vezuju za antigen koji su ovde opisani. Varijantna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen su oni koji imaju varijaciju u aminokiselinskoj sekvenci. Na primer, varijantna antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen koji su ovde opisani su oni koji imaju najmanje jednu varijantu CDR (dve, tri, četiri, pet ili šest varijantnih CDR ili čak dvanaest varijantnih CDR); varijantna antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen, koji su ovde opisani ili iz ovog pronalaska, uključuju one koji imaju varijabilni region varijantnog lakog lanca, varijabilni region varijabilnog teškog lanca, varijantni laki lanac i/ili varijantni teški lanac. Varijantna antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen uključeni u predmetni pronalazak su oni koji imaju, na primer, sličan ili poboljšan afinitet vezivanja u poređenju sa originalnim antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen.
[0073] Kako je ovde korišćen, termin "varijanta" se odnosi na bilo koju sekvencu koja je ovde opisana i uključuje, na primer, varijantu CDR (bilo CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 i/ili CDRH3), varijabilni varijantni region varijantnog lakog lanca, varijanti varijabilni region teškog lanca, varijantni laki lanac, varijantni teški lanac, varijantno antitelo, varijantni antigen-vezujući fragment i KAAG1 varijantu.
[0074] Varijantna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su oni koji mogu sadržati inserciju, deleciju ili aminokiselinsku supstituciju (konzervativna ili ne-konzervativna). Ove varijante mogu imati najmanje jedan aminokiselinski ostatak u svojoj aminokiselinskoj sekvenci uklonjen i različit ostatak ubačen na njegovo mesto.
[0075] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska može imati varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca u skladu sa pronalaskom i može dalje da sadrži aminokiseline konstantnog regiona, kao što su, na primer, aminokiseline konstantnog regiona humanog antitela.
[0076] U jednom primeru otelotvorenja, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska može da sadrži, na primer, humani IgGl konstantni region.
[0077] U skladu sa drugim primerom otelotvorenja pronalaska, fragment za vezivanje antigena može biti, na primer, scFv, a Fab, Fab' ili (Fab')2.
[0078] Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione (CDRs), ali se takođe razmatraju modifikacije u okvirnom regionu ili čak u konstantnom regionu. Konzervativne supstitucije mogu biti napravljene zamenom aminokiseline (CDR, promenljivog lanca, antitela, itd.) iz jedne od grupa navedenih ispod (grupa 1 do 6) za drugu aminokiselinu iste grupe.
[0079] Druga primerna otelotvorenja konzervativnih supstitucija prikazana su u Tabeli 1A pod naslovom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije dovode do neželjenog svojstva, onda se mogu uvesti značajnije promene, nazvane "primeri supstitucija" u Tabeli 1A, ili kao što je dalje opisano u daljem tekstu u odnosu na klase aminokiselina, i proizvodi se pregledaju.
[0080] U struci je poznato da varijante mogu biti generisane supstitucionom mutagenezom i zadržati biološku aktivnost polipeptida predmetnog pronalaska. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u svojoj aminokiselinskoj sekvenci uklonjen i različit ostatak ubačen na njegovo mesto. Na primer, jedno mesto od interesa za supstitucionu mutagenezu može da obuhvati mesto gde su određeni ostaci dobijeni od različitih vrsta identični. Primeri supstitucija identifikovanih kao "konzervativne supstitucije" prikazani su u Tabeli 1A. Ako takve supstitucije dovode do promene koja nije poželjna, onda se uvodi drugi tip supstitucija, nazvan "primeri supstitucija" u Tabeli 1A, ili kao što je ovde dalje opisano u odnosu na klase aminokiselina, i proizvodi se pregledaju.
[0081] Značajne modifikacije u funkciji ili imunološkom identitetu postižu se odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne osnove u području supstitucije, na primer, kao list ili spiralna konformacija. (b) naboj ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) masu bočnog lanca. Prirodno nastali ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:
(grupa 1) hidrofobni: norleucin, metionin (Met), Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu), Izoleucin (Ile) (grupa 2) neutralni hidrofilni: Cistein (Cys), Serin (Ser), Teronin (Thr)
(grupa 3) kiseli: Aspartinska kiselina (Asp), Glutaminska kiselina (Glu)
(grupa 4) bazni: Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Histidin (His), Lizin (Lis), Arginin (Arg)
(grupa 5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Glicin (Gly), Prolin (Pro); i
(grupa 6) aromatični: Triptofan (Trp), Tirozin (Tyr), Fenilalanin (Phe)
[0082] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati supstituciju člana jedne od ovih klasa za drugu.
Tabela 1A. Supstitucija aminokiseline
[0083] Varijantno antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može imati značajnu sličnost sekvenci i/ili identičnost sekvence u svojoj aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa originalnim antitelom ili aminokiselinskom sekvencom antigen vezujućeg fragmenta. Stepen sličnosti između dve sekvence zasniva se na procentu identiteta (identične aminokiseline) i na konzervativnoj supstituciji.
[0084] Generalno, stepen sličnosti i identiteta između promenljivih lanaca je ovde određen korišćenjem Blast2 sekvencijskog programa (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) upotrebom podrazumevanih podešavanja, tj. programa blast, matrice BLOSUM62 (otvoreni razmak 11 i kazna za produženje razmaka 1; razmak 50, 10.0, veličina reči 3) i aktivirani filteri.
[0085] Procenat identiteta će stoga biti indikativan za aminokiseline koje su identične u poređenju sa originalnim peptidom i koje mogu zauzeti isto ili slično mesto.
[0086] Procenat sličnosti će biti indikativan za aminokiseline koje su identične i one koje su zamenjene konzervativnom supstitucijom aminokiselina u poređenju sa originalnim peptidom na istom ili sličnom položaju.
[0087] Varijante predmetnog pronalaska stoga obuhvataju one koje mogu imati najmanje 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnost sekvence sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0088] Primeri otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 81% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0089] Druga primerna otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 82% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0090] Dalja primerna otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 85% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0091] Druga primerna otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 90% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0092] Dodatni primeri otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 95% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0093] Dodatni primeri otelotvorenja varijanti su oni koji imaju najmanje 97% identičnosti sekvence prema ovde opisanoj sekvenci i 97%, 98%, 99% ili 100% sličnosti sekvenci sa originalnom sekvencom ili delom originalne sekvence.
[0094] U svrhu konciznosti, aplikant ovde obezbeđuje Tabelu 1B koja ilustruje primer ostvarenja pojedinačnih varijanti obuhvaćenih predmetnim pronalaskom i koje sadrže specifičan% identičnosti sekvence i% sličnosti sekvenci. Svaki "X" treba tumačiti kao definisanje date varijante.
[0095] Predmetni pronalazak obuhvata CDR, varijabilne regione lakog lanca, varijabilne regione teškog lanca, lake lance, teške lance, antitela i/ili fragmente koji vezuju antigen koji sadrže najmanje 80% identiteta sa ovde opisanom sekvencom.
[0096] Primerna otelotvorenja antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska su ona koja sadrže varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80% identična sa SEQ ID NO:4.
[0097] Ovaj varijabilni region lakog lanca koji je ovde prikazan može da sadrži CDRL1 sekvencu najmanje 80% identičnu SEQ ID NO.:8, CDRL2 sekvenca najmanje 80% identična sa SEQ ID NO.:9 i CDRL3 sekvenca najmanje 80% identična SEQ ID NO.:10.
[0098] U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL1 sekvencu koja može biti najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:.8.
[0099] U drugom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL1 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.8.
[0100] U drugom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL2 sekvencu najmanje 90 % identičnu sa SEQ ID NO:.9.
[0101] U još daljem otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL2 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.9.
[0102] U još jednom primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL3 sekvencu koja može biti najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:.10.
[0103] U drugom primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRL3 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.10.
[0104] U jednom primernom otelotvorenju, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može sadržati varijabilni region teškog lanca koja sadrži sekvencu najmanje 70%, 75%, 80% identična SEQ ID NO.:2.
[0105] Ovaj varijabilni region lakog lanca koji je ovde prikazan može da sadrži CDRH1 sekvencu najmanje 80% identičnu SEQ ID NO.:5, CDRH2 sekvenca najmanje 80% identična sa SEQ ID NO.:6 i CDRH3 sekvenca najmanje 80% identična SEQ ID NO.:7.
[0106] U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH1 sekvencu koja može biti najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:.5.
[0107] U drugom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH1 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.5.
[0108] U još jednom primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH2 sekvencu koja može biti najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:.6.
[0109] U daljem primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH2 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.6.
[0110] U još jednom primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH3 sekvencu koja može biti najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:.7.
[0111] U drugom primernom otelotvorenju predmetnog obelodanjivanja, bilo koje od ovde dobijenih antitela može sadržati CDRH3 sekvencu koja može biti 100% identična sa SEQ ID NO:.7.
[0112] U nekim slučajevima varijabilni region teškog lanca antitela može da sadrži aminokiselinske delecije ili dodatke (u kombinaciji ili ne sa supstitucijama aminokiselina). Često se mogu tolerisati 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih delecija ili dodataka.
[0113] Primeri otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region lakog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:30:
SEQ ID NO.:30
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4. Zamena aminokiseline može biti, na primer, aminokiselina pronađena na odgovarajućem položaju prirodnog humanog antitela ili konsenzusom humanog antitela. Zamena aminokiseline može biti, na primer, konzervativna.
[0114] Druga primerna otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region lakog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:31:
SEQ ID NO.:31
Gde Xa1može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xa2može biti A ili P;
Gde Xa3može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
Gde Xa4može biti L ili P;
Gde Xa5može biti kisela aminokiselina;
Gde Xa6može biti Q ili P;
Gde Xa7može biti bazna aminokiselina;
Gde Xa8može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xa9može biti A ili Q;
Gde Xa10može biti bazna aminokiselina; ili
Gde Xa11može biti hidrofobna aminokiselina;
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4.
[0115] Druga dodatna primerna otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region lakog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:32:
SEQ ID NO.:32
Gde XA1može biti V ili I
Gde XA2može biti A ili P
Gde XA3može biti S ili T
Gde XA4može biti L ili P
Gde XA5može biti D ili E
Gde XA6može biti Q ili P
Gde XA7može biti K ili Q;
Gde XA8može biti L ili V
Gde XA9može biti A ili Q
Gde XA10može biti A ili K ili
Gde XA11može biti L ili I,
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4.
[0116] U skladu sa otelotvorenjem, varijantni domen varijabilnog lanca može imati sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO.:33 ili 34:
SEQ ID NO.:33
SEQ ID NO.:34
[0117] Primeri otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region teškog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:35:
SEQ ID NO.:35
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2. Zamena aminokiseline može biti, na primer, aminokiselina pronađena na odgovarajućem položaju prirodnog humanog antitela ili konsenzusom humanog antitela. Zamena aminokiseline može biti, na primer, konzervativna.
[0118] Druga primerna otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region teškog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:36:
SEQ ID NO.:36
Gde Xb1može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb2može biti P ili A;
Gde Xb3može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb4može biti V ili K;
Gde Xb5može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb6može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb7može biti S ili A;
Gde Xb8može biti H ili P;
Gde Xb9može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb10može biti S ili G;
Gde Xb11može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb12može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb13može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb14može biti I ili T;
Gde Xb15može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb16može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb17može biti K ili T;
Gde Xb18može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
Gde Xb19može biti Q ili E;
Gde Xb20može biti N ili S;
Gde Xb21može biti T ili R;
Gde Xb22može biti neutralna hidrofilna aminokiselina; ili
Gde Xb23može biti S ili L;
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2.
[0119] Druga dodatna primerna otelotvorenja varijantnog antitela ili fragmenta koji vezuju antigen uključuju one koji imaju varijabilni region teškog lanca kao što je prikazano u tekstu SEQ ID NO.:37:
SEQ ID NO.:37
Gde XB1može biti I ili T;
Gde XB2može biti P ili A;
Gde XB3može biti M ili V;
Gde XB4može biti V ili K;
Gde XB5može biti M ili V;
Gde XB6može biti K ili R;
Gde XB7može biti S ili A;
Gde XB8može biti H ili P;
Gde XB9može biti K ili Q;
Gde XB10može biti S ili G;
Gde XB11može biti I ili M;
Gde XB12može biti K ili R;
Gde XB13može biti A ili V;
Gde XB14može biti I ili T;
Gde XB15može biti L ili I;
Gde XB16može biti V ili A;
Gde XB17može biti K ili T;
Gde XB18može biti S ili T;
Gde XB19može biti Q ili E;
Gde XB20može biti N ili S;
Gde XB21može biti T ili R;
Gde XB22može biti S ili T; ili
Gde XB23može biti S ili L,
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2.
[0120] U skladu sa otelotvorenjem, varijantni domen varijabilnog teškog lanca može imati sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO.:38 ili 41:
SEQ ID NO.:38
SEQ ID NO.:39
SEQ ID NO.:40
SEQ ID NO.:41
Proizvod antitela u ćelijama
[0121] Anti-KAAG1 antitela koja su ovde obelodanjena mogu biti napravljena različitim metodama koje su poznate stručnjacima, kao što su metodologija hibridoma ili metode rekombinantne DNK.
[0122] U jednom od primernih otelotvorenja predmetnog pronalaska, anti-KAAG1 antitela mogu biti proizvedena konvencionalnom hibridnom tehnologijom, gde je miš imunizovan sa antigenom, ćelijama slezine izolovanim i fuzionisanim sa ćelijama mijeloma koje nemaju HGPRT ekspresiju i hibridne ćelije izabrane od hipoksantina, aminopterin i podlogu koja sadrži timin (HAT).
[0123] U dodatnom primeru otelotvorenja pronalaska, anti-KAAG1 antitela se mogu proizvesti metodama rekombinantne DNK.
[0124] U cilju ekspresije anti-KAAG1 antitela, nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca koji su ovde opisani ili bilo koji drugi mogu biti ubačeni u ekspresioni vektor, tj. vektor koji sadrži elemente za transkripcionu i translacionu kontrolu umetnute kodirajuće sekvence u određenom domaćinu. Ovi elementi mogu uključivati regulatorne sekvence, kao što su pojačivači, konstitutivni i inducibilni promotori, i 5' i 3' neprevedeni regioni. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstrukciju takvih vektora ekspresije. Ovi postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze i genetičku rekombinaciju in vivo.
[0125] Različiti sistemi ekspresionog vektora/ćelije domaćina koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za ekspresiju polipeptida ili RNK izvedenog iz nukleotidnih sekvenci sposobnih da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških imunoglobulinskih lanaca. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmidnim ili kosmidnim DNK ekspresionim vektorima; kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; sisteme ćelija insekata inficiranih sa bakulovirusnim vektorima; sisteme biljnih ćelija transformisanih virusnim ili bakterijskim ekspresionim vektorima; ili sisteme životinjskih ćelija. Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina u sistemima sisara, može se izvršiti stabilna ekspresija u ćelijskim linijama. Na primer, nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca koji su ovde opisani, mogu se transformisati u ćelijske linije korišćenjem ekspresionih vektora koji mogu da sadrže virusne poreklo replikacionih i/ili endogenih ekspresionih elemenata i selektivni ili vidljivi markerski gen na isti ili na posebnom vektoru. Pronalazak ne treba da bude ograničen vektorom ili upotrebljenom ćelijom domaćinom. U izvesnim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca antitela prema pronalasku mogu biti lizirane u odvojeni vektor ekspresije i svaki lanac eksprimiran odvojeno. U još jednom otelotvorenju, i laki i teški lanci koji mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca antitela prema pronalasku mogu biti vezani u jedan ekspresioni vektor i eksprimirani istovremeno.
[0126] Alternativno, RNK i/ili polipeptid može biti eksprimiran iz vektora koji sadrži nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca koji su ovde opisani upotrebom in vitro transkripcionog sistema ili kombinovanog in vitro transkripcionog/translacionog sistema.
[0127] Generalno, ćelije domaćini koje sadrže nukleotidne sekvence koje mogu da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca opisanih ovde i/ili koje eksprimiraju polipeptid kodiran nukleotidnim sekvencama sposobnim da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških imunoglobulinskih lanaca, ili njegov deo, mogu se identifikovati različitim postupcima koji su poznati stručnjacima. Ove procedure uključuju, ali nisu ograničene na hibridizacije DNK/DNK ili DNK/RNK, PCR amplifikaciju i proteinske biološke testove ili tehnike imunoanalize koje uključuju tehnologije na membrani, rastvoru ili čipu za detekciju i/ili kvantifikaciju nukleinske kiseline ili sekvence aminokiselina. U struci su poznate imunološke metode za detekciju i merenje ekspresije polipeptida korišćenjem ili specifičnih poliklonalnih ili monoklonskih antitela. Primeri takvih tehnika uključuju imunosorbentne enzime (ELISA), radioimunološke probe (RIA) i sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS). Stručnjaci u ovoj oblasti lako mogu prilagoditi ove metodologije ovom pronalasku.
[0128] Stanice domaćini koje sadrže nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od ovde opisanih lakih i teških imunoglobulinskih lanaca mogu se tako kultivisati pod uslovima za transkripciju odgovarajuće RNK (mRNK, itd.) I/ili ekspresije polipeptida iz ćelijske kulture. Polipeptid proizveden od strane ćelije može se izlučiti ili zadržati intracelularno u zavisnosti od sekvence i/ili korišćenog vektora. U jednom otelotvorenju, ekspresioni vektori koji sadrže nukleotidne sekvence sposobne da kodiraju bilo koji od lakih i teških imunoglobulinskih lanaca antitela iz pronalaska mogu biti dizajnirani da sadrže signalne sekvence koje usmeravaju sekreciju polipeptida kroz prokariotsku ili eukariotsku ćelijsku membranu.
[0129] Zbog inherentne degeneracije genetskog koda, druge sekvence DNK koje kodiraju iste, suštinski iste ili funkcionalno ekvivalentne aminokiselinske sekvence mogu biti proizvedene i upotrebljene, na primer, da eksprimiraju polipeptid kodiran nukleotidnim sekvencama sposobnim da kodiraju bilo koji ovde opisanih lakih i teških imunoglobulinskih lanaca. Nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska mogu biti konstruisane korišćenjem postupaka koji su opšte poznati u struci, kako bi se izmenile nukleotidne sekvence za različite svrhe uključujući, ali ne ograničavajući se na, modifikaciju kloniranja, obrade i/ili ekspresije gena proizvoda. Za menjanje nukleotidnih sekvenci mogu se koristiti dvoličnost DNK slučajnim fragmentiranjem i PCR ponovnom sastavljanju fragmenata gena i sintetskih oligonukleotida. Na primer, oligonukleotidom posredovana mutageneza usmerena na mesto može se koristiti za uvođenje mutacija koje stvaraju nova restrikciona mesta, menjaju obrasce glikozilacije, menjaju prednost kodona, proizvode varijante povezivanja, i tako dalje.
[0130] Pored toga, soj ćelije domaćina može biti izabran zbog njegove sposobnosti da modulira ekspresiju ubačenih sekvenci ili da procesira eksprimirani polipeptid na željeni način. Takve modifikacije polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. U jednom primernom otelotvorenju, mogu biti poželjna anti-KAAG1 antitela koja sadrže određene strukture ili obrasce glikozilacije. Post-translacijska obrada, koja cepa "prepro" oblik polipeptida, može se takođe koristiti za određivanje ciljanja proteina, preklapanja i/ili aktivnosti. Različite ćelije domaćini koje imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za post-translacione aktivnosti (npr. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 i W138) su komercijalno dostupne i iz American Type Culture Collection (ATCC) i mogu biti izabrane tako da obezbede ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog polipeptida.
[0131] Stručnjaci u ovoj oblasti lako će shvatiti da se prirodne, modifikovane ili rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina mogu vezati za heterolognu sekvencu koja rezultira translacijom fuzionog polipeptida koji sadrži heterologne polipeptidne grupe u bilo kom od iznad pomenutih domaćinskih sistema. Takve heterologne polipeptidne grupe mogu olakšati prečišćavanje fuzionih polipeptida koristeći komercijalno dostupne afinitetne matrice. Takve grupe uključuju, ali nisu ograničene na, glutation S-transferazu (GST), protein za vezivanje maltoze, tioredoksin, peptid koji veže kalmodulin, 6-His (His), FLAG, c-myc, hemaglutinin (HA) i epitopi antitela kao što su kao epitopi monoklonskih antitela.
[0132] Takođe je obelodanjen polinukleotid koji može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein. Fuzioni protein može da sadrži fuzionog partnera (npr., HA, Fc, itd.) fuzionisan sa polipeptidom (npr., kompletan laki lanac, kompletan teški lanac, varijabilni region, CDR itd.) koji su ovde opisani.
[0133] Stručnjaci u ovoj oblasti će takođe lako prepoznati da se nukleinske kiseline i polipeptidne sekvence mogu sintetizovati, u celosti ili delimično, korišćenjem hemijskih ili enzimskih postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, sinteza peptida se može izvesti korišćenjem različitih tehnika u čvrstoj fazi i mašine kao što je ABI 431A Peptidni sintisajzer (PE Biosystems) mogu se koristiti za automatizaciju sinteze. Ako se želi, aminokiselinska sekvenca može biti izmenjena tokom sinteze i/ili kombinovana sa sekvencama iz drugih proteina da se proizvede varijantni protein.
Konjugati antitela
[0134] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska može biti konjugovan sa detektabilnom grupom (tj., za detekciju ili dijagnostičke svrhe) ili sa terapeutskom grupom (u terapeutske svrhe).
[0135] "Detektabilna grupa" je grupa koja se može detektovati spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, hemijskim i/ili drugim fizičkim sredstvima. Detektabilni ostatak se može vezati ili direktno i/ili indirektno (na primer preko veze, kao što je, bez ograničenja, DOTA ili NHS veza) sa antitelima i njihovim fragmentima koji se vezuju za antigen prema predmetnom pronalasku koristeći metode koje su dobro poznate u tehnici. Može se koristiti širok spektar detektabilnih grupa, pri čemu izbor zavisi od potrebne osetljivosti, lakoće konjugacije, zahteva stabilnosti i raspoložive instrumentacije. Pogodna detektabilna grupa uključuje, ali nije ograničena na, fluorescentnu etiketu, radioaktivnu oznaku (na primer, bez ograničenja,<125>I, In<111>, Tc<99>,<I131>i uključujući izotop koji emituje pozitron za PET skener itd.), nuklearna magnetna rezonanca aktivna oznaka luminiscentna oznaka, hemiluminiscentna oznaka, hromoforna oznaka, enzimska oznaka (na primer i bez ograničenja peroksidaza hrena, alkalne fosfataze, itd.), kvantnih tačaka i/ili nanočestica. Detektabilna grupa može uzrokovati i/ili proizvesti signal koji se može detektovati, čime se omogućava detektovanje signala iz detektabilne grupe.
[0136] U sledećem otelotvorenju pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti vezan (modifikovan) sa terapeutskom grupom (npr., lek, citotoksični deo, sredstvo protiv kancera).
[0137] U jednom primernom otelotvorenju, anti-KAAG1 antitela i fragmenti koji vezuju antigen mogu da sadrže hemoterapeutik, citotoksično sredstvo ili lek protiv karcinoma (npr., mali molekul). Takva hemoterapeutska ili citotoksična sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, itrijum-90, skandijum-47, renijum-186, lodin-131, lodin-125, i mnoge druge poznate od strane stručnjaka (npr., lutecijum (npr., Lu<177>), bizmut (npr., Bi<213>), bakar (npr., Cu<67>)). U drugim slučajevima, hemoterapeutsko, citotoksično sredstvo ili lek protiv kancera može biti, između ostalih poznatih stručnjacima, 5-fluorouracil, adriamicin, irinotekan, taksani, pseudomonas endotoksin, ricin, auristatini (npr., monometil auristatin). E, monometil auristatin F), majtanzinoidi (npr., mertansin) i drugi toksini.
[0138] Alternativno, da bi se sproveli postupci iz predmetnog pronalaska i kao što je poznato u tehnici, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska (konjugovano ili ne) može se koristiti u kombinaciji sa drugim molekulom (npr., sekundarno antitelo). itd.) koji se može specifično vezati za antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen ovog pronalaska i koji može da sadrži željeni detektabilni, dijagnostički ili terapeutski deo. Farmaceutski sastavi antitela i njihova upotreba
[0139] Farmaceutski sastavi anti-KAAG1 antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz pronalaska (konjugovani ili ne) su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Farmaceutski sastav može da sadrži anti-KAAG1 antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen i može takođe da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0140] Drugi aspekti pronalaska se odnose na sastav koji može da sadrži antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen pronalaska i nosač.
[0141] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji može da sadrži antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0142] Pored aktivnih sastojaka, farmaceutska kompozicija može da sadrži farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže vodu, PBS, rastvore soli, želatine, ulja, alkohole i druge ekscipijense i pomoćna sredstva koja olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. U drugim slučajevima, takvi preparati se mogu sterilisati.
[0143] Kako se ovde koristi, "farmaceutski sastav" označava terapeutski efikasne količine sredstva zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, konzervansima, rastvaračima, emulgatorima, adjuvansima i/ili nosačima. "Terapeutski efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na onu količinu koja obezbeđuje terapeutski efekat za dato stanje i režim primene. Takvi sastavi su tečnosti ili liofilizirane ili na drugi način osušene formulacije i uključuju razblaživače različitih sadržaja pufera (npr., Tris-HCl., acetat, fosfat), pH i jonske snage, aditiva kao što su albumin ili želatina za sprečavanje apsorpcije na površine, deterdžente (npr., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, soli žučne kiseline). Sredstva za rastvaranje (npr., glicerol, polietilen glicerol), antioksidanti (npr., Askorbinska kiselina, natrijum metabisulfit), konzervansi (npr. timerosal, benzil alkohol, parabeni), supstance koje povećavaju volumen ili modifikatori toničnosti (npr., laktoza, manitol), kovalentni pričvršćivanje polimera kao što je polietilen glikol na protein, kompleksiranje sa metalnim jonima, ili inkorporacija materijala u ili na preparate od čestica polimernih jedinjenja kao što su polilaktična kiselina, poliglikolna kiselina, hidrogelovi, itd., ili na lipozome, mikroemulzije, micele, unilamelar ili multilamelarne vezikule, duhove eritrocita ili sferoplasti. Takvi sastavi će uticati na fizičko stanje, rastvorljivost, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu uklanjanja in vivo. Sastav sa kontrolisanim ili odloženim oslobađanjem uključuju formulaciju u lipofilnim depoima (npr., masne kiseline, voskovi, ulja). Pronalazak je takođe obuhvatio čestične sastave obložene polimerima (npr. poloksameri ili poloksamini). Druga otelotvorenja sastava prema pronalasku obuhvataju čestične oblike zaštitnih prevlaka, inhibitore proteaze ili pojačivače propusnosti za različite puteve davanja, uključujući parenteralne, pulmonalne, nazalne, oralne, vaginalne, rektalne puteve. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav se daje parenteralno, paracanceralno, transmukozno, transdermalno, intramuskularno, intravenski, intradermalno, subkutano, intraperitonealno, intraventrikularno, intrakranijalno i intratumoralno.
[0144] Dalje, kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "farmaceutski nosač" su poznati u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na, 0.01-0.1 M ili 0.05 M fosfatni pufer ili 0.8% slan. Dodatno, takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući slanu i puferisanu podlogu. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, ili Ringerova ili laksirana ulja. Intravenski nosači uključuju tekuće i hranljive dopune, elektrolitske punioce, kao što su oni bazirani na Ringerovoj dekstrozi i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu takođe biti prisutni, kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, antioksidanti, sredstva za sabijanje, inertni gasovi i slično.
[0145] Za bilo koje jedinjenje, terapeutski efikasna doza može biti procenjena početno bilo u analizama ćelijske kulture ili u životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi ili svinje.
[0146] Životinjski model se takođe može koristiti da se odredi opseg koncentracije i put primene. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina davanja kod ljudi. Ove tehnike su dobro poznate prosečnom stručnjaku i terapeutski efikasna doza se odnosi na onu količinu aktivnog sastojka koja ublažava simptome ili stanje. Terapijska efikasnost i toksičnost mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, kao što je izračunavanje i kontrastiranje ED50(doza koja je terapeutski efikasna u 50% populacije) i LD50(doza smrtonosna na 50% od stanovništva). Bilo koji od iznad opisanih terapeutskih preparata može se primeniti na bilo kojeg ispitanika kome je potrebna takva terapija, uključujući, ali ne ograničavajući se na sisare kao što su psi, mačke, krave, konji, zečevi, majmuni i ljudi.
[0147] Farmaceutski sastavi koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu se davati bilo kojim brojem puteva uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intravenozni, intramuskularni, intra-arterijski, intramedularni, intratekalni, intraventrikularni, transdermalni, subkutani, intraperitonealni, intranazalni, enteralni, topički, sublingvalna ili rektalna sredstva.
[0148] Termin "tretman" u svrhu ovog obelodanjivanja odnosi se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je predmet usporavanje (smanjivanje) ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji su već sa poremećajem, kao i oni koji su skloni da imaju poremećaj ili oni kod kojih se ovaj poremećaj treba sprečiti. Naročito, ispitanici kojima je to potrebno uključuju ispitanika sa povišenim nivoom jednog ili više markera kancera.
[0149] Anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu imati terapeutsku upotrebu u lečenju različitih tipova kancera, kao što su kancer jajnika, kancer bubrega, kancer debelog creva, kancer pluća, melanom, itd. terapeutske primene kod kancera jajnika. U posebnijom otelotvorenju, ispitanik može imati, na primer, rekurentni kancer jajnika. U još jednom otelotvorenju, ispitanik može imati, na primer, metastatski kancer.
[0150] U određenim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i fragmenti mogu blokirati interakciju KAAG1 sa njenim proteinskim partnerima. Anti-KAAG1 antitela iz predmetnog pronalaska se naročito mogu koristiti za isporuku terapeutske grupe u ćelije koje eksprimiraju KAAG1.
[0151] Anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu imati terapeutsku upotrebu u tretmanu različitih tipova kancera jajnika. Nekoliko različitih tipova ćelija može dovesti do različitih histotipova kancera jajnika. Najčešći oblik kancera jajnika sastoji se od tumora koji potiču iz epitelnog sloja jajnika ili jajovoda. Takvi epitelni kanceri jajnika uključuju serozne tumore, tumore endometroida, mucinozne tumore, tumore bistre ćelije i granične tumore. U drugim otelotvorenjima, anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen imaju upotrebu u lečenju drugih tipova kancera jajnika kao što je klica zarodne linije i kancera jajnika polnog tkiva.
[0152] U izvesnim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se davati istovremeno u kombinaciji sa drugim tretmanima datim za isto stanje. Kao takva, antitela se mogu primenjivati sa anti-mitoticima (npr., taksani), sredstvima baziranim na platini (npr., cisplatin), agensima koji oštećuju DNK (npr. doksorubicin) i drugim terapijama protiv kancera koje su poznate stručnjacima u struci. U drugim slučajevima, anti-KAAG1 antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se primenjivati sa drugim terapeutskim antitelima. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja ciljaju EGFR, CD-20 i Her2.
[0153] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za inhibiciju rasta ćelije koja eksprimira KAAG1, postupak koji može obuhvatiti kontakt ćelije sa efikasnom količinom ovde opisanog antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen.
[0154] Predmetno obelodanjivanje takođe obuhvata metod lečenja kancera ili inhibiranje rasta KAAG1 eksprimirajućih ćelija kod sisara, postupak može da obuhvati davanje antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen, na primer, konjugovanog sa terapeutskim ostatkom koji je ovde opisan, ispitaniku kojem je to potrebno.
[0155] U daljim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje terapeutsku upotrebu, dijagnostičke postupke i metodu detekcije koristeći antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska i upotrebu ovih antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen u proizvodnji farmaceutskog sastava ili leka za takve svrhe.
[0156] Pronalazak se stoga odnosi na upotrebu izolovanog antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen koji je ovde opisan za (proizvodnji farmaceutskog sastava za) lečenje kancera.
[0157] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može biti naročito pogodan za maligne tumore, uključujući, na primer, maligni tumor koji ima sposobnost metastaziranja i/ili tumorskih ćelija karakterističnih za rast nezavisan od sidrenja.
[0158] Antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska može takođe da se koristi u dijagnostici kancera. Dijagnoza kancera može se izvesti in vivo davanjem antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen predmetnog pronalaska sisaru koji ima ili se sumnja da ima kancer. Dijagnoza se takođe može izvoditi ex vivo kontaktiranjem uzorka dobijenog od sisara sa antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen i određivanjem prisustva ili odsustva ćelija (tumorskih ćelija) koje eksprimiraju KAAG1 ili KAAG1 varijantu.
[0159] Prema tome, predmetno obelodanjivanje takođe obuhvata metod za detekciju raka ili detektovanje KAAG1 eksprimirajućih ćelija kod sisara, metod može da sadrži davanje antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen koji je ovde opisan ispitaniku kojem je to potrebno.
[0160] Predmetni pronalazak se odnosi na drugi njegov aspekt na upotrebu za detekciju ćelije koja eksprimira KAAG1 ili varijantu KAAG1, upotreba može obuhvatiti kontakt ćelije sa antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen pronalaska i detektovanjem kompleksa formiranog od antitela i KAAG1- ili KAAG1 ćelija koja eksprimira varijantu. Primeri otelotvorenja antitela ili fragmenata koji se vezuju za antigen koji se koriste u detekcionoj upotrebi su oni koji su sposobni da se vežu za vanćelijski region KAAG1.
[0161] Drugi primeri otelotvorenja antitela ili fragmenata koji se vezuju za antigen koji se koriste u metodama detekcije su oni koji se vezuju za KAAG1 ili KAAG1 varijantu eksprimiranu na površini ćelija tumora.
[0162] Ispitanik koji ima potrebu koji bi imao koristi od tretmana, otkrivanja ili dijagnostičkih metoda opisanih ovde su oni koji imaju ili se sumnja da imaju kancer, npr. kancer jajnika (npr. serozni, endometroid, bistra ili mucinozna), kancer kože (npr. melanomi, karcinomi skvamoznih ćelija), karcinomi bubrega (npr. karcinomi papilarnih ćelija, jasni ćelijski karcinomi), kolorektalni kancer (npr. kolorektalni karcinomi), sarkom, leukemija, tumor mozga, tumor štitnjače, kancer dojke (npr. karcinomi dojke), kancer prostate (npr. karcinomi prostate), tumor jednjaka, tumor bešike, tumor pluća (npr. karcinom pluća) ili tumor glave i vrata, a posebno kada se karcinom karakteriše kao maligni i/ili kada se ćelije koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1 karakterišu rast nezavisan od sidrišta.
[0163] Ispitanici koji imaju kancer mogu se identifikovati snimanjem, biopsijom tkiva, genetskim testiranjem. Alternativno, ispitanici koji imaju kancer mogu se identifikovati prisustvom markera kancera u njihovim telesnim tečnostima koristeći standardne testove (npr., ELISA i slično).
[0164] Posebno obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su pacijenti koji imaju ili su podložni kanceru jajnika (npr. serozni, endometroidni, bistri ili mucinozni), kancer kože (npr. melanomi, karcinomi skvamoznih ćelija) ili kancer bubrega (npr. karcinomi papilarnih ćelija) i posebno kada se karcinom karakteriše kao maligni i/ili kada se ćelije koje eksprimiraju KAAG1 ili KAAG1 varijantu karakterišu rastom nezavisan od sidrenja.
[0165] Drugo obelodanjivanje se odnosi na metodu za detekciju KAAG1 (SEQ ID NO.:29), varijantu KAAG1 koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:29 ili izlučenim oblikom cirkulišućeg oblika KAAG1 ili KAAG1 varijante, metoda može da sadrži kontakt ćelije koja eksprimira KAAG1 ili KAAG1 varijantu ili uzorak (biopsija, serum, plazma, urin itd.) koji sadrži ili se sumnja da sadrži KAAG1 ili varijantu KAAG1 sa ovde opisanim antitelom ili fragmentima koji vezuju antigen i merenjem vezivanja. Uzorak može poticati od sisara (npr. čoveka) koji može imati rak (npr. kancer jajnika, metastatski kancer) ili se može sumnjati da ima kancer (npr. kancer jajnika, metastatski kancer). Uzorak može biti uzorak tkiva dobijenog od sisara ili supernatanta ćelijske kulture.
[0166] U skladu sa pronalaskom, uzorak može biti uzorak seruma, uzorak plazme, uzorak krvi, sperma ili ascitna tečnost dobijena od sisara. Ovde opisano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen može povoljno detektovati izlučeni ili cirkulišući oblik (cirkulirajući u krvi) KAAG1.
[0167] Postupak može da obuhvati kvantifikovanje kompleksa formiranog antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen vezan za KAAG1 ili varijantu KAAG1.
[0168] Vezivanje antitela na antigen će izazvati povećanje očekivane molekulske težine antigena. Fizička promena se stoga dešava nakon specifičnog vezivanja antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen i antigena.
[0169] Takve promene se mogu detektovati korišćenjem, na primer, elektroforeze praćene Vestern blotom i bojenjem gela ili blota, masene spektrometrije, HPLC zajedno sa računarom, FACS ili drugim. Uređaj koji je sposoban da izračuna promenu u molekularnoj težini je poznat u struci i uključuje na primer Phosphorimager ™.
[0170] Kada antitelo sadrži, na primer, detektabilnu oznaku, kompleks antigen-antitelo može biti detektovan fluorescencijom koju emituje etiketa, zračenje etikete, enzimatska aktivnost etikete obezbeđene sa njenim supstratom ili drugo.
[0171] Detekcija i/ili merenje vezivanja između antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen i antigena može se izvesti različitim postupcima poznatim u struci. Vezivanje između antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen i antigena može se pratiti pomoću uređaja koji može detektovati signal koji emituje detektabilna oznaka (zračenje, fluorescencija, promena boje itd.). Takva aparatura daje podatke koji ukazuju na to da se vezivanje desilo i može takođe da pruži indikaciju o količini antitela vezanog za antigen. Aparat (obično povezan sa kompjuterom) može takođe biti sposoban da izračuna razliku između pozadinskog signala (npr., signal dobijenog u odsustvu vezivanja antigena-antitela) ili pozadinske buke i signala dobijenog nakon specifičnog vezivanja antitela i antigena. Takvi aparati mogu na taj način pružiti korisniku indikacije i zaključke o tome da li je antigen otkriven ili ne.
[0172] Dodatni aspekti pronalaska se odnose na komplete koji mogu da sadrže jedan ili više kontejnera koji sadrže jedno ili više antitela ili fragmente koji vezuju antigen iz pronalaska.
Nukleinske kiseline, vektori i ćelije
[0173] Antitela se obično prave u ćelijama koje omogućavaju ekspresiju lakog lanca i teškog lanca eksprimiranog iz vektora koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i/ili teški lanac.
[0174] Prema tome, predmetni pronalazak obuhvata nukleinske kiseline koje mogu da kodiraju bilo koji od CDR, varijabilnih regiona lakog lanca, varijabilnih regiona teškog lanca, lakih lanaca, teških lanaca koji su ovde opisani.
[0175] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi u daljem aspektu na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca antitela koja je sposobna za specifično vezivanje za KAAGI pronalaska.
[0176] Primeri nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilni region lakog lanca koja sadrži:
a. CDRL1 kao što je navedeno u SEQ ID NO.:8 ili sadrži SEQ ID NO.:8;
b. CDRL2 kao što je navedeno u SEQ ID NO.:9 ili sadrži SEQ ID NO.:9, ili;
c. CDRL3 kao što je navedeno u SEQ ID NO.:10 ili sadrži SEQ ID NO.:10.
[0177] U skladu sa predmetno obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati varijabilni region lakog lanca koji može da sadrži najmanje dva CDR-a CDRL1, CDRL2 ili CDRL3.
[0178] Takođe, u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinska kiselina može kodirati varijabilni region lakog lanca koji može da sadrži jedan CDRL1, jedan CDRL2 i jedan CDRL3.
[0179] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži:
a. CDRH1 sekvenca kao što je navedeno u SEQ ID NO.:5 ili sadrži SEQ ID NO.:5;
b. CDRH2 sekvenca kao što je navedeno u SEQ ID NO.:6 ili sadrži SEQ ID NO.:6, ili;
c. CDRH3 kao što je navedeno u SEQ ID NO.:7 ili sadrži SEQ ID NO.:7.
[0180] U skladu sa ovim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati varijabilni region teškog lanca koji može sadržati najmanje dva CDRs CDRH1, CDRH2 ili CDRH3.
[0181] U skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinska kiselina može kodirati varijabilnu regiju teškog lanca koja može da sadrži jedan CDRH1, jedan CDRH2 i jedan CDRH3.
[0182] Predmetni pronalazak takođe obuhvata nukleinske kiseline koje kodiraju varijante antitela koje imaju najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.
[0183] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju.
[0184] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u barem dva CDRs.
[0185] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje jednu konzervativnu aminokiselinsku supstituciju u 3 CDRs.
[0186] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u barem jednom od CDRs.
[0187] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstitucije u barem dva od CDRs.
[0188] U skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, nukleinska kiselina može kodirati CDR koji sadrži najmanje dve konzervativne aminokiselinske supstituciju u 3 CDRs.
[0189] Druga otelotvorenja se odnose na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 70%.75%, 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:4.
[0190] Druga otelotvorenja se odnose na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 70%.75%, 80% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.:2.
[0191] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži nukleinske kiseline iz pronalaska.
[0192] U skladu sa predmetnim pronalaskom, vektor može biti ekspresioni vektor.
[0193] U struci je poznat vektor koji sadrži elemente za transkripcionu i translacijsku kontrolu umetnute kodirajuće sekvence u određenom domaćinu. Ovi elementi mogu uključivati regulatorne sekvence, kao što su pojačivači, konstitutivni i inducibilni promotori, i 5' i 3' neprevedeni regioni. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstrukciju takvih vektora ekspresije. Ovi postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze i genetičku rekombinaciju in vivo.
[0194] U drugom aspektu predmetnog pronalaska se odnosi na izolovanu ćeliju koja može da sadrži nukleinsku kiselinu, antitela ili fragment koji se vezuje za antigen iz pronalaska.
[0195] Izolovana ćelija može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca ili na odvojenim vektorima ili na istom vektoru. Izolovana ćelija može takođe da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac i nukleinsku kiselinu koja kodira teški lanac ili na odvojenim vektorima ili na istom vektoru.
[0196] U skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelija može biti sposobna za ekspresiju, sastavljanje i/ili izlučivanje antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen.
[0197] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja može da sadrži i/ili može eksprimirati ovde opisano antitelo.
[0198] U skladu sa pronalaskom, ćelija može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region lakog lanca i nukleinsku kiselinu koji kodira varijabilni region teškog lanca.
[0199] Ćelija može biti sposobna za ekspresiju, sastavljanje i/ili izlučivanje antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen.
[0200] Dolje prikazani primeri su prikazani u daljem prikazu detalja predmetnog pronalaska.
PRIMERI
Primer 1
[0201] Ovaj primer opisuje vezivanje antitela 3A4 za KAAG1.
[0202] Antitela koja vezuju KAAG1 su generisana korišćenjem Alere fag tehnologije prikaza. Detaljan opis tehnologije i metode za generisanje ovih antitela mogu se naći u patentnu SAD br.6,057,098. Pored toga, detaljan opis generacije antitela protiv KAAG1 može se naći u PCT/CA2009/001586 (objavljen kao WO2010/060186). Ukratko, tehnologija koristi strogo paniranje biblioteka faga koje prikazuju fragmente koji vezuju antigen (Fabs). Nakon nekoliko rundi ispiranja, dobijena je biblioteka, nazvana Omniclonal, koja je obogaćena za rekombinantne Fabs koji sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca koji su vezani za KAAG1 sa veoma visokim afinitetom i specifičnošću. Iz ove biblioteke, preciznije označenog Omniclonal AL0003 A2ZB, pripremljeno je 96 pojedinačnih rekombinantnih monoklonskih Fab iz E. coli i testirano na vezivanje KAAG1. Monoklonski označeni 3A4 je izveden iz ove ploče sa 96 udubljenja monoklonskih antitela na osnovu njene visoke aktivnosti vezivanja za rekombinantni KAAG1 i njegovog afiniteta za KAAG1 na površini ćelija kancera jajnika.
[0203] Nukleotidne sekvence varijabilnih regiona lanaca imunoglobulina teškog i lakog lanca su prikazane u SEQ ID NOS.:1 i 3, a polipeptidne sekvence varijabilnih regiona imunoglobulinskih lanaca teškog i lakog lanca su prikazane u SEQ ID NOS : 2 i 4, respektivno. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) imunoglobulina 3A4 teškog lanca su prikazani u SEQ ID NOS., 6 i 7, respektivno, a CDRs imunoglobulina lakog lanca 3A4 su prikazani u SEQ ID NOS.:8, 9 i 10 , redom.
[0204] Pored mogućnosti sprovođenja studija interakcija između Fab monoklonalna i KAAG1 proteina, upotreba Fabs je ograničena u pogledu sprovođenja značajnih in vitro i in vivo ispitivanja kako bi se potvrdila biološka funkcija antigena. Prema tome, bilo je neophodno da se varijabilna regiona lakog i teškog lanca sadržana u 3A4 Fabs prebace u potpune skele antitela, da bi se proizveo himerni mišji IgGl miša. Ekspresioni vektori i za lake i za teške imunoglobulinske lance su konstruisani tako da i) originalne sekvence bakterijskog signalnog peptida uzvodno od Fab ekspresionih vektora zamenjene su sisarskim signalnim peptidima i ii) konstantni regioni lakog i teškog lanca u mišjim antitelima zamenjeni ljudskim stalnim regionima. Postupci za ostvarivanje ovog transfera koriste standardne tehnike molekularne biologije koje su poznate stručnjacima. Ovde je opisan kratak pregled metodologije.
[0205] Ekspresioni vektor lakog lanca - postojeći ekspresioni plazmid sisara, nazvan pTTVH8G (Durocher i dr., 2002), dizajniran da se koristi u 293E tranzijentnom sistemu transfekcije je modifikovan da prihvati varijabilni region lakog lanca miša. Rezultujući miš-humani himerni laki lanac sadrži mišji varijabilni region praćen ljudskim kappa konstantnim domenom. Sekvenca cDNK koja kodira humani kappa konstantni domen je amplifikovana pomoću PCR sa primerima OGS1773 i OGS1774 (SEQ ID NOS:11 i 12, redom). Sekvenca nukleotida i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za humani kappa konstantni region prikazani su u SEQ ID NOS:13 i 14, respektivno. Rezultujući 321 PCR bazni par liziran je u pTTVH8G neposredno nizvodno od sekvence signalnog peptida humanog VEGF A (NM_003376). Ovaj korak kloniranja takođe je postavio jedinstvena mesta za restrikcionu endonukleazu koja su omogućila precizno pozicioniranje cDNK koje kodiraju varijabilne regione mišjeg lakog lanca. Sekvenca konačnog ekspresionog plazmida, nazvana pTTVKl, je prikazana u SEQ ID NO.15. Bazirano na varijabilnoj sekvenci 3A4 lakog lanca koja je prikazana u SEQ ID NO.:3, dizajniran je PCR prajmer specifičan za varijabilni region lakog lanca koji je uključen, na svom 5'-kraju, sekvencu identičnu poslednjih 20 parova baza VEGF A signalni peptid. Sekvenca ovog primera je prikazana u SEQ ID NO:16. Reverzni prajmer (SEQ ID NO:17) ugrađen je, na svom 3'-kraju, sekvencu identičnu prvim 20 baznih parova humanog kappa konstantnog domena. I PCR fragmenti i digestirani pTTVK1 su tretirani sa 3'- 5' eksonukleaznom aktivnošću T4 DNK polimeraze što je rezultiralo besplatnim krajevima koji su spojeni žarenjem. Reakcije žarenja su transformisane u kompetentne E. coli i ekspresioni plazmidi su verifikovani sekvenciranjem da bi se osiguralo da su varijabilni regioni lakog lanca miša ispravno umetnuti u pTTVK1 ekspresioni vektor.
[0206] Ekspresioni vektor teškog lanca - vektor ekspresije koji je proizveo imunoglobulin teškog lanca 3A4 je dizajniran na sličan način kao pTTVK1 opisan iznad za proizvodnju imunoglobulina lakog lanca. Plazmid pYD11 (Durocher i dr., 2002), koji sadrži sekvencu ljudskog IgGK signalnog peptida kao i CH2 i CH3 regione humanog Fc domena IgGl, je modifikovan liziranjem cDNK sekvence koja kodira humanu konstantnu CH1 oblast. PCR prajmeri OGS1769 i OGS1770 (SEQ ID NOS:18 i 19), dizajnirani da sadrže jedinstvene restrikcione endonukleazne lokacije, korišćeni su za amplifikaciju ljudskog IgGl CH1 regiona koji sadrži nukleotidnu sekvencu i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NOS:20 i 21. Posle ligacije fragmenta 309 baznih parova humanog CH1 odmah iza sekvence IgGK signalnog peptida, modifikovani plazmid (SEQ ID NO.:22) je označen pYD15. Kada se odabrani varijabilni region teškog lanca veže u ovaj vektor, dobijeni plazmid kodira puni IgG1 imunoglobulin teškog lanca sa humanim konstantnim regionima. PCR prajmeri specifični za varijabilni region teškog lanca antitela 3A4 (SEQ ID NOS:1) je dizajniran tako da je na svom 5'-kraju uključio sekvencu identičnu poslednjih 20 parova baza IgGK signalnog peptida. Sekvenca ovih prajmera je prikazana u SEQ ID NOS:23. Reverzni prajmer (SEQ ID NO:24) ugrađen je, na svom 3'-kraju, sekvencu identičnu prvim 20 baznih parova humanog CH1 konstantnog domena. I PCR fragmenti i digestirani pYD15 su tretirani sa 3'- 5' eksonukleaznom aktivnošću T4 DNK polimeraze što je rezultiralo besplatnim krajevima koji su spojeni žarenjem. Reakcije žarenja su transformisane u kompetentne E. coli i ekspresioni plazmidi su verifikovani sekvenciranjem da bi se osiguralo da su varijabilni regioni teškog lanca miša ispravno umetnuti u pYD15 ekspresioni vektor.
[0207] Ekspresija humanog 3A4 himernog IgG1 u 293E ćelijama - Vektori ekspresije pripremljeni iznad koji kodiraju imunoglobuline lakog i teškog lanca su eksprimirani u 293E ćelijama korišćenjem sistema prolazne transfekcije (Durocher i dr., 2002). Odnos lakog i teškog lanca je optimizovan da bi se postigao najveći prinos antitela u podlozi kulture tkiva i nađeno je da je 9:1 (L:H).
[0208] Vezivanje himernog 3A4 za KAAG1 - Za merenje relativnog vezivanja 3A4 monoklonskog antitela, rekombinantni humani KAAG1 je proizveden u 293E ćelijama korišćenjem tehnologije velike tranzijentne transfekcije (Durocher i dr., 2002; Durocher, 2004). Ekspresija i prečišćavanje humanog rekombinantnog KAAG1 kao Fc fuzionog proteina se nalazi u PCT/CA2009/001586 (objavljenog kao WO2010/060186). Da bi se izvršilo vezivanje Fc-KAAG1 za preparat antitela, Fc-KAAG1 biotinilisan je sa NHS-biotinom (Pierce, Rockford, IL) i 10 ng/udubljenje je obložen u streptavidin ploči sa 96 udubljenja 1 sat na sobnoj temperaturi. Prečišćena himerna 3A4 je dodata u rastućim koncentracijama i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Vezano antitelo detektovano je sa HRP-konjugovanim humanim anti-kapa antitelom lakog lanca u prisustvu TMB tečnog supstrata (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON) i očitavanja su izvedena na 450 nm u čitaču mikrotitarske ploče. Kao što je prikazano na Slici 1, 3A4 interaguje sa imobilisanim proteinom KAAG1 na način zavisan od doze. Kada se kontrolni nepovezani IgG inkubira sa rekombinantnim KAAG1, nije primećena aktivnost vezivanja, čak ni pri najvećoj koncentraciji. Ovaj rezultat je pokazao da se 3A4 vezuje za humani KAAG1. Vezivanje 3A4 je upoređeno sa vezivanjem himernog 3D3 (opisano u Tremblai i Filion (2009)), koji ima različitu epitopnu specifičnost (videti Primer 2). Aktivnost vezivanja 3A4 je veoma slična 3D3 u ovom tipu testa (videti sliku 1).
Primer 2
[0209] Ovaj primer opisuje ispitivanja mapiranja epitopa da bi se odredilo koji region KAAG1 se vezuje 3A4 antitelo.
[0210] Da bi se dalje odredila područja KAAG1 koja su povezana sa 3A4 antitelom, skraćeni mutanti KAAG1 su eksprimirani i korišćeni u ELISA. Što se tiče KAAG1 pune dužine, skraćene verzije su pojačane PCR-om i lizirane u BAMHI/Hindlll digestiran pYD5. Prajmeri koji su korišćeni kombinuju prednji oligonukleotid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NO:25 sa primerima SEQ ID NOS:26 i 27, da bi se proizveli Fc-fuzionisani fragmenti koji su završili na aminokiselini broj 60 i 35 KAAG1, respektivno. Ekspresija ovih rekombinantnih mutanata je izvedena kao što je iznad opisano za punu dužinu Fc-KAAG1 i prečišćeno sa Protein-A agarozom.
[0211] Na osnovu učenja Tremblaia i Filiona (2009), bilo je poznato da druga antitela interaguju sa specifičnim regionima rekombinantnog KAAG1. Prema tome, anti-KAAG1 antitelo 3C4, 3D3 i 3G10 su interagovali sa regionima 1 - 35, 36 - 60, i 61 - 84 od KAAG1, respektivno. Ovi rezultati vezivanja su reprodukovani i prikazani su na Slici 2. Da bi se odredio region u KAAG1 koji je vezan za 3A4 antitelo, ELISA je izvedena korišćenjem KAAG1 skraćenih fuzija Fc u skladu sa sličnim protokolom koji je opisan u Primeru 1. Jedine modifikacije bile su upotreba različitih biotiniliranih Fc-KAAG1 skraćenih mutanata. Rezultati pokazuju da je specifičnost vezivanja 3A4 slična 3G10. Kod KAAG1 mutanata koji nemaju aminokiselinske sekvence iza aminokiseline 60, ne dolazi do vezivanja 3A4 za KAAG1. Ovo ukazuje da 3A4 interaguje sa regionom označenim sa aminokiselinama 61 - 84 humanog KAAG1. Opažanje da 3A4 i 3D3 imaju praktično identičnu aktivnost vezivanja kao što je mereno pomoću ELISA (Primer 1) ali imaju veoma različitu specifičnost epitopa sugeriše da su svojstva vezivanja 3A4 sasvim različita od 3D3.
Primer 3
Ovaj primer opisuje sposobnost 3A4 da se veže za KAAG1 na površini ćelijskih linija kancera
[0212] Protočna citometrija je korišćena za detekciju KAAG1 na površini ćelijskih linija. Na osnovu RT-PCR ekspresionih analiza uz primenu KAAG1 mRNK specifičnih prajmera, očekivano je da izabrane ćelijske linije raka eksprimiraju KAAG1 protein. Da bi se to potvrdilo, ćelije raka jajnika (SKOV-3 i TOV-21G) i kontrolne ćelijske linije koje su pokazale veoma malo KAAG1 ekspresije (293E). Ćelije su sakupljene korišćenjem 5 mM EDTA, prebrojane sa hemocitometrom, i resuspendovane u FCM puferu (0.5% BSA, 10 ug/ml kozjeg seruma u 1 x PBS) pri gustini ćelija od 2 x 10<6>ćelija/ml. Himerni 3A4 ili kontrolni IgG su dodani u 100 µl ćelija u konačnoj koncentraciji od 5 µg/ml i inkubirani na ledu tokom 2 h. Ćelije su isprane u hladnom PBS da bi se uklonila nevezana antitela, resuspendovana u 100 µl FCM pufera koji je sadržao anti-humani IgG konjugovan sa FITC (razblažen 1:200) kao sekundarno antitelo i inkubiran na ledu 45 minuta na ledu. Nakon sledećeg koraka ispiranja u hladnom PBS, ćelije su resuspendovane u 250 µl FCM pufera i analizirane protočnim citometrom. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slikama 3A i 3B. Inkubacija ćelijskih linija sa kontrolnim antitelom rezultirala je histogramima koji su odgovarali signalu koji je tipično postignut kada je antitelo izostavljeno iz ćelija. Ovo je uspostavilo pozadinski signal ovih FCM vrednosti (Slike 3A i 3B). Nasuprot tome, inkubacija SKOV-3, TOV-21G sa 3A4 himernim antitelom rezultirala je jakim signalom fluorescencije (Slike 3A). Ovo je pokazalo da antitelo efikasno detektuje KAAG1 na površini ovih ćelija kancera. Od ćelija 293E, ćelijske linije ljudskog bubrega, očekivalo se da će pokazati veoma malo KAAG1 ekspresije i zaista, histogram FCM gotovo da nije pokazao pomak u odnosu na kontrolno antitelo (videti Sliku 3B). Prema tome, 3A4 je specifično detektovao KAAG1 na površini ćelija kancera. Aktivnost 3A4 je upoređena sa 3D3, anti-KAAG1 antitelom opisanim u učenju Tremblay i Filion (2009). Na osnovu ove patentne prijave, bilo je poznato da 3D3 može detektovati KAAG1 na površini ćelija kancera mereno pomoću FCM. Ovo je potvrđeno kada je 3D3 inkubiran u prisustvu SKOV-3 i TOV-21G ćelija (videti Sliku 3A). Signal fluorescencije nije bio tako visok u poređenju sa 3A4, što ukazuje da 3A4 ima različitu i povećanu sposobnost da detektuje KAAG1 na površini ćelija kancera jajnika. Drugi rezultati dobijeni u našoj laboratoriji pokazuju da je 3A4 mogao da detektuje KAAG1 na površini ćelija kancera pod uslovima kada 3D3 nije pokazao aktivnost u ovom testu (rezultati nisu prikazani). Uzeta zajedno, ova opažanja i razlika u specifičnosti epitopa 3A4 u poređenju sa 3D3 sugeriše da ova antitela imaju različita anti-KAAG1 svojstva.
Primer 4
Postupci za upotrebu 3A4 anti-KAAG1 antitela kao konjugata antitela
[0213] Kao što je pokazano iznad, KAAG1 antigen je detektovan pomoću 3A4 na površini ćelija kancera pomoću protočne citometrije. Postoji nekoliko različitih molekularnih događaja koji se mogu pojaviti nakon vezivanja antitela za svoj cilj na površini ćelija. Oni uključuju: i) blokiranje dostupnosti drugog antigena/receptora na površini ćelije ili liganda, ii) formiranje relativno stabilnog kompleksa antitela i antigena kako bi se omogućilo ciljanje ćelija preko ADCC ili CDC, iii) događaji signalizacije mogu se pojaviti kao primeri agonističkog antitela, iv) kompleks može biti internalizovan, ili v) kompleks se može ispustiti sa površine ćelije. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, želeli smo da ispitamo ponašanje kompleksa 3A4 antitelo-KAAG1 na površini ćelija. SKOV-3 ćelije su nanesene na ploče, isprane i inkubirane sa 5 µg/ml himernog 3A4 antitela kao što je opisano u Primeru 3. Posle ispiranja, dodata je potpuna OSE sredina i ćelije su postavljene na 37 °C do 90 minuta. Ćelije su uklonjene u naznačenim vremenima (videti Sliku 4), brzo ohlađene, pripremljene za citometriju sa FITC-konjugovanim antihumanim IgG i rezultati su izraženi kao procenat srednje intenziteta fluorescencije (Srednji intenzitet fluorescencije,%) koji je preostao. Kao što je prikazano na Slici 4, signal fluorescencije brzo opada tokom perioda od 30 - 45 minuta. Ovaj rezultat ukazuje da je kompleks 3A4/KAAG1 nestao iz ćelija, što je pokazalo da se verovatno dogodila internalizacija kompleksa. Preliminarna ispitivanja da bi se razjasnio mehanizam odgovoran za ovo smanjenje fluorescencije na površini ćelije otkrila su da se kompleks čini internalizovanim.
[0214] Ovi rezultati su dalje potvrđeni sprovođenjem imunofluorescencije na živim ćelijama se videti da li se ova internalizacija može mikroskopski posmatrati. SKOV-3 ćelije su zasijane na pokrivačima u punoj podlozi (OSE medijum (Visent) koji sadrži 10% FBS, 2 mM glutamina, 1 mM natrijum-piruvat, 1X ne-esencijalne aminokiseline i antibiotike). Kada su ćelije pravilno adherirane, dodata je sveža podloga koja sadrži 3A4 anti-KAAG1 himerno antitelo na 10 ug/ml i inkubira 4 h na 37 °C. Ćelije su isprane u PBS i zatim fiksirane u 4% paraformaldehidu (u PBS) 20 minuta. Posle ispiranja, ćelije su permeabilizovane sa 0.1% Triton X-100 u PBS tokom 5 minuta. Blokiranje je izvedeno sa 1.5% suvog mleka u PBS u toku 1 h. Lizosomalno-asocirani membranski protein 1 (LAMP1, Chang i dr., 2002) je detektovan inkubacijom sa anti-LAMP1 (Santa Cruz, sc-18821, razblažen 1:100) u 1.5% mleka u PBS u toku 2 h. Posle ispiranja u PBS, sekundarna antitela su dodata zajedno u 1.5% mleka i inkubirana tokom 1 h. Za anti-KAAG1 himerna antitela sekundarno antitelo je konjugirano magareće anti-humano IgG (H+L) konjugovanog Rodamin Red-Ks razblaženo 1:300. Za anti-LAMP1 antitelo sekundarno antitelo je bilo DiLight488-konjugovano kozje anti-mišji IgG (H+L) razblaženo 1:300. Oba sekundarna antitela su bila od Jackson ImmunoResearch. Pokrivači su isprani u PBS i montirani u ProLong Gold antifade reagens sa DAPI. Kao što se vidi na Slici 5A, nakon 4 sata inkubacije na 37 °C u prisustvu SKOV-3 ćelija kancera jajnika, 3A4 antitelo je bilo moguće detektovati u kompleksima pretežno blizu peri-nuklearnog područja (strelice, videti crveno bojenje u levi panel na slici 5A), što je tipično za endosomalno-lizosomalne puteve internalizacije. Ovo opažanje je dalje potvrđeno kada je vizuelizovan lizosomalni marker, LAMP1 i nađeno je da je takođe eksprimirano u ovim područjima (strelice, videti zeleno bojenje u srednjem panelu na Slici 5A). Važno je da je spajanje dve slike rezultiralo pojavom žuto-narandžastih struktura koje ukazuju da su 3A4 i anti-LAMP1 antitela prisutna u istim strukturama (strelice, videti žuto bojenje u desnom panelu na Slici 5A). Ko-lokalizacija 3A4, koja se vezuje za KAAG1 na površini ćelija kancera, sa LAMP1, marker kasnih endosoma/lizosoma, pokazuje da je kompleks antitela/antigena internaliziran i da sledi put koji je pogodan za oslobađanje tereta koji bi bio konjugovan sa 3A4 antitelom. Identični rezultati su uočeni u drugoj liniji ćelija kancera, TOV-21G (videti Sliku 5B).
[0215] Uzete zajedno, ove studije su pokazale da antitela specifična za KAAG1, kao što je 3A4, mogu imati upotrebu kao konjugat antitelo-lek (ADC). Prema tome, visok nivo specifičnosti raka jajnika KAAG1 u kombinaciji sa kapacitetom ovog cilja da se internalizuje u ćelijama podržao bi razvoj aplikacija kao ADC.
Primer 5
[0216] Preferencijalna detekcija KAAG1 na površini ćelija kancera.
[0217] Iako je razvijeno nekoliko antitela u interakciji sa različitim epitopima proteina KAAG1, pristupačnost ovih epitopa kada se KAAG1 eksprimira na površini netaknutih ćelija kancera nije potpuno razjašnjen. Bioinformatička analiza primarne aminokiselinske strukture KAAG1 (ukupan broj aminokiselina u humanom proteinu je 84) nije otkrila nikakve očigledne sekvence koje bi mogle da odgovaraju transmembranskom domenu i prema tome kako KAAG1 je usidren na ćelijsku membranu nije u potpunosti poznat.
[0218] Nađeno je da su antitela stvorena protiv KAAG1 vezana za tri različita regiona u KAAG1 proteinu (vidi PCT/CA2009/001586, objavljen kao WO2010/060186). Većina antitela interaguje sa aminokiselinama 35 - 60 u KAAG1 proteinu i prikazane su primerima antitela 3D3 i 3G12 u ovoj patentnoj prijavi. Antitela koja interaguju sa karboksi-terminalnim krajem KAAG1 između aminokiselina 61 - 84 su ilustrovana antitelom 3A4. Konačno, antitela koja interaguju sa amino-terminalnim delom proteina, kao što je ilustrovano sa 3C4, pokazala su veoma malo vezivanja za ćelije koje eksprimiraju KAAG1.
[0219] Ova primena pokazuje da kada se KAAG1 eksprimira u ćelijama, karboksi-terminalni region (aminokiseline 61 - 84) je izložen ekstracelularnom prostoru i da su antitela koja ciljaju ovaj region najefikasnija u otkrivanju i potencijalno lečenju KAAG1-pozitivnih ćelija. Antitela koja se vezuju za srednji region KAAG1 (aminokiseline 35 - 60) mogu takođe da detektuju KAAG1 na površini ćelija, ali u manjoj meri nego antitela koja interaguju sa karboksi-krajem
[0220] Stanične linije karcinoma jajnika, kao što je SKOV-3, pozitivne su na ekspresiju KAAG1. Ove ćelije su korišćene za detektovanje ekspresije KAAG1 protočnom citometrijom, koja je metoda koja omogućava detekciju proteina na površini ćelija i dobro je poznata stručnjacima. Ukratko, za svaki uzorak 100.000 ćelija je inkubirano na ledu tokom 1 h sa primarnim antitelom (bilo anti-KAAG1, ili kontrolnim antitelom) u koncentraciji od 1 µg/ml. Posle nekoliko ispiranja sa ledeno hladnim PBS, obojene ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitelom koji je konjugovan sa fluorohromom (FITC) koji detektuje prisustvo primarnog antitela vezanog za ćelije. Posle nekoliko dodatnih ispiranja, ćelije su analizirane protočnim citometrom. Rezultati prikazani na Slici 6 prikazuju Y-osu koja predstavlja broj brojeva (ćelija) i X-osa koja predstavlja količinu fluorescencije (signal fluorescencije). Kada su SKOV-3 ćelije inkubirane sa 3A4 antitelom, primećeno je veliko pomeranje fluorescencije što ukazuje na postojanje obilja KAAG1 proteina na površini ćelija (slika 6A) i da je efikasno prepoznato od strane ovog antitela. U identičnim uslovima, antitela koja su u interakciji sa srednjim regionom KAAG1, 3G12 i 3D3 (Slika 6A) bila su značajno manje efikasna za detekciju KAAG1. Kada su ćelije inkubirane sa povećanom koncentracijom 3G12 ili 3D3, KAAG1 se može detektovati na površini ćelije (nije prikazano). Kada su ćelije inkubirane ili sa kontrolnim IgG (Slika 6A) ili sa 3C4, antitelo protiv amino terminala KAAG1 (Slika 6A), nije primećen nikakav signal. Ovi rezultati pokazuju da antitela koja interaguju sa karboksi-terminalom KAAG1 mogu efikasnije da detektuju antigen na površini ćelija kancera nego antitela usmerena protiv drugih regiona KAAG1. To je značilo da je karboksi-kraj KAAG1 izložen ekstracelularnom (spoljašnjem) prostoru ćelije. Slični rezultati su dobijeni za druge ćelijske linije kancera koje eksprimiraju KAAG1.
[0221] Eksperiment je takođe izveden u SKOV-3 ćelijama koje su permeabilizovane sa Triton X-100. Triton X-100 se tipično koristi za permeabilizaciju ćelijskih membrana i oslobađanje membranskih proteina. Kada su permeabilizovane ćelije inkubirane sa 3A4 i merene u protočnom citometru (videti Sliku 6B), signal je bio sličan onom dobijenom u intaktnim ćelijama. Zapanjujuće, kada su permeabilizovane ćelije inkubirane sa 3G12 antitelom koje se vezuje za srednji region KAAG1 (Slika 6B), signal je bio jak kao 3A4. Ovi rezultati pokazuju da je srednji region KAAG1 verovatno prisutan u ćelijskoj membrani ili u unutrašnjosti ćelije. Sličan rezultat je postignut sa 3D3 antitelom, drugim srednjim regionom veziva (Slika 6B), ali signal dobijeni za 3D3 nije bio tako jak. Kao i ranije, kontrola IgG nije pokazala nikakav detektabilni signal u ovom testu (Slika 6B). Zanimljivo, inkubacija ćelija sa 3C4 antitelom koja se vezuje za amino region KAAG1, nije rezultirala bilo kojim detektabilnim signalom (Slika 6B). Ovaj poslednji rezultat je sugerisao da se amino region KAAG1 verovatno otklanja tokom transporta proteina do ćelijske membrane.
[0222] Sve u svemu, ovi eksperimenti pružaju mnogo uvida u strukturu i orijentaciju KAAG1 antigena kada se eksprimira na površini ćelija kancera. Na osnovu ovih podataka, predložena su dva modela za strukturu KAAG1 na površini ćelije (Slika 7). U prvom modelu (Slika 7, Model A), podaci sugerišu da je srednji deo zapravo transmembranski region KAAG1 koji je samo delimično izložen vanćelijskom prostoru. Ovo bi učinilo karboksikraj KAAG1 lako detektabilnim i srednji region je bio teže vezati. U drugom modelu (Slika 7, Model B), KAAG1 je usidren na membranu pomoću drugog proteina koji je ugrađen u ćelijsku membranu. Ponovo, karboksi-kraj bi bio lako dostupan antitelima kao što je 3A4, ali bi interakcija između KAAG1 i proteina partnera otežala pristup srednjem regionu. Rezultati koji pokazuju da antitela koja se sastoje i od karboksi-terminalnih veziva (kao što je prikazano kao primer 3A4) i srednjih regiona (kao što je ilustrovano sa 3G12 i 3D3), testirana u prisustvu permeabilnih ćelija, slažu se sa oba modela. Nesposobnost 3C4 antitela da se veže za KAAG1 u intaktnim ili permeabilnim ćelijama verovatno je posledica nedostatka aminokiselina sadržanih u amino terminusu zrelog obrađenog membranskog oblika KAAG1 i oba modela se slažu sa ovim.
[0223] Ovi rezultati ukazuju na to da su antitela koja ciljaju karboksi-kraj KAAG1 u ćelijama kancera, posebno regionima obuhvaćenim aminokiselinama 61 - 84, najprikladniji za razvoj antitela za upotrebu kao terapeutici za lečenje karcinoma koji eksprimiraju KAAG1. Pored toga, druge upotrebe za KAAG1 antitela koje se vezuju za karboksi-terminalni region uključuju dijagnostičke reagense za detekciju karcinoma koji eksprimiraju KAAG1.
[0224] Antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen koji imaju specifičnost vezivanja sličnu antitelu 3A4 mogu biti generisani ili izolovani imunizacijom životinje sa C-terminalnim delom KAAG1 prema postupcima poznatim u tehnici, uključujući hibridomsku tehnologiju, skriningom biblioteke antitela ili fragmenti koji vezuju antigen sa C-terminalnim delom KAAG1 i/ili izvođenje kompetitivnog testa izolovanih antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen sa ovde opisanim antitelom 3A4.
Primer 6
Humanizacija pomoću dizajna 3A4 mišjeg monoklonskog antitela
3D modeliranje varijabilnih regiona mišjeg 3A4 monoklonskog antitela.
[0225] Ovaj zadatak je postignut modeliranjem homologije. Najsličnije strukture šablona na sekvence varijabilnih regiona mišjih 3A4 lakih i teških lanaca (SEQ ID NOs: 4 i 2) su identifikovani BLAST pretragom u odnosu na PDB. Da bi se izgradio početni model mišjeg 3A4 varijabilnog regiona korišćene su sledeće strukture šablona (PDB kodovi): 2IPU (lanac L) za laki lanac, i 1F11 (lanac B) za teški lanac. Drugi pogodni predlošci mogu se naći u PDB unosu 2DDQ za laki lanac, i u PDB unosima 3IY3, 1KTR, 2VXT, 1A6T ad 1IGI za teški lanac. Potrebne mutacije su operisane na ovim strukturama šablona u skladu sa mišjim 3A4 sekvencama: 7 mutacija u 2IPU lakom lancu i 17 mutacija plus 3-ostatna delecija u teškom lancu 1F11. Mutirane strukture koje odgovaraju teškim i lakim lancima mišjih varijabilnih regiona 3A4 su spojene u dvo-lančane strukture antitela tako što su položene teške i lake lance odgovarajućih struktura šablona. Rezultujuća struktura montiranog 3A4 varijabilnog regiona je prvo rafinisana minimizacijom energije sa AMBER sila-poljem i stepenastim oslobađanjem ograničenja, od CDR petlji koje su prvo bile opuštene, do teških atoma okosnice u okvirima koji su bili potpuno opušteni samo u poslednjoj fazi. CDR-H3 petlja u svakoj strukturi varijabilnog regiona antitela je zatim rafinisana konformacionim uzorkovanjem Monte-Carlo-minimizacijom (MCM), u kojem su diedarski uglovi u CDR-H3 regionu uzorkovani u svakom MCM ciklusu praćenom minimizacijom energije unapred definisanog regiona protežući se 10 A oko početne konformacije petlje CDR-H3. Prikaz modelovanog varijabilnog regiona mišjeg 3A4 antitela je dat na Slici 8. Strukture humanih ili humanizovanih varijabilnih sekvenci koje su najsličnije svakoj od 3A4 varijabilnih sekvenci su takođe identifikovane iz PDB-a, a zatim superponirane na modelirane strukture mišjih varijabilnih regiona 3A4. Ove strukture uključuju PDB unose 3QCT, 3AAZ, 1WT5 i 3M8O za laki lanac, i PDB unose 1I9R, 3NFP, 1T04, 1ZA6, 3HC4, 2D7T i 1WT5 za teški lanac. Ove strukture su korišćene da pomognu u modeliranju mutacija u okvirnom regionu kako bi se izgradile humanizovane 3D-strukture počevši od modelirane mišje 3D strukture.
Karakterizacija mišjih 3A4 amino kiselinskih sekvenci i modelirane strukture.
[0226] Ovaj korak je sproveden da bi se procenio indeks humanosti, indeks sklonosti antigenskom kontaktu, da bi se odredili CDR, kanonski ostaci, pakovanje između lanaca (ostaci VH/VL interfejsa), pakovanje sa promenljivim/konstantnim regionom (VH/CH i VL/CL interfejs ostaci), neobični okvirni ostaci, potencijalna N- i O-glikozilaciona mesta, ukopani ostaci, ostaci Vernier zone, i blizina CDR-a. Za procenu ovih svojstava korišteni su resursi dostupni na internetu i lokalni softver.
Izbor najboljih humanih okvira lakog i teškog lanca za mišje CDR.
[0227] Ovo je urađeno standardnim poređenjem homologije sekvence u odnosu na lokalnu kopiju baza podataka o ljudskim klicama (VBASE), protiv drugih biblioteka sekvenci (Genbank i SwissProt), kao i skupa humanih konsenzus sekvenci. BLAST pretrage su sprovedene da bi se pronašli podudarnosti sekvenci sa najvišom homologijom samo u okvirnom regionu (čime su isključeni CDR) dok su odgovarali dužini CDR petlji. Humani okviri identifikovani za lake i teške lance 3A4 antitela odgovaraju klasama k2 i h1, respektivno. Nekoliko humanih okvirnih sekvenci klica koje su najsličnije 3A4 okvirnim sekvencama su zadržane pored humanih konsenzus sekvenci za ove klase.
Identifikacija okvirnih ostataka za povratne mutacije i dizajn višestrukih humanizovanih varijanti.
[0228] Ovo je važan korak koji označava aminokiselinske ostatke koji treba da se mutiraju u odgovarajuće humane sekvence sa posebnom pažnjom. Ovi ostaci predstavljaju primarne kandidate za povratne mutacije u mišjim sekvencama u slučaju gubitka afiniteta. To je najteži i nepredvidivi korak humanizacije po dizajnu, posebno u odsustvu eksperimentalne strukture kompleksa antitelo-antigen. Ona se oslanja na identifikaciju ostataka u jednoj ili više od sledećih kategorija: kanonske, CDR-H3, Vernier zone, neobične, CDR-proksimalne (unutar 5 A), pakovanja između lanaca i ostataka glikozilacionog mesta. Takvi ostaci mogu direktno ili indirektno da utiču na mesto vezivanja antigena i afinitet. Indeks sklonosti antigenskom kontaktu, kao i pojava aminokiselina u bazama podataka o humanoj zametnoj liniji na svakom položaju su takođe izuzetno važni u odlučivanju da li se određeni ostatak može bezbedno mutirati od sekvence miša do ljudske sekvence. Humanizacija varijabilnog regiona lakog lanca 3A4 antitela uključuje 11 mutacija u predloženom humanizovanom okviru za 100% humanizovanje okvira. Humanizacija varijabilnog regiona teškog lanca 3A4 antitela uključuje 23 mutacija u predloženom humanizovanom okviru za 100% humanizovanje okvira. Ove sekvence sa 100% humanizovanim varijabilnim regionom su obeležene Lvhl i Hvhl, respektivno (SEQ ID NO:33 i 38). Takođe su dizajnirane dodatne humanizovane sekvence u kojima je zadržano nekoliko ostataka iz 3A4 mišjih sekvenci na osnovu pažljivih strukturnih i komparativnih analiza sekvenci koje ukazuju na visoku verovatnoću promene afiniteta vezivanja antigena ako se mutacije uvode na ovim položajima. Ove sekvence varijabilnih regiona su obeležene Lvh2, Hvh2, Hvh3 i Hvh4 (SEQ ID NOs: 34, 39, 40 i 41).
[0229] Dve varijante humanizovanog lakog lanca (uključujući konstantni region) su identifikovane ovde kao Lh1 (SEQ ID NO.: 43) i Lh2 (SEQ ID NO.:44). Četiri varijante humanizovanog teškog lanca (uključujući konstantni region_ su identifikovane ovde kao Hh1 (SEQ ID NO.:46), Hh2 (SEQ ID NO.:47), Hh3 (SEQ ID NO.:48) i Hh4 (SEQ ID NO.:49). Dva humanizovana laka lanca i 4 humanizovana teška lanca mogu biti sastavljena u 8 humanizovanih antitela (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3, Lh1Hh4, Lh2Hh1, Lh2Hh2, Lh2Hh3 i Lh2Hh4). Molekularni modeli za sve ove kombinacije konstruisani su modeliranjem homologije počevši od 3D modela varijabilnog regiona mišjeg 3A4 i prikazani su na slikama 9a-9h.
[0230] U slučaju 3A4 lakog lanca humanizovane sekvence Lvh2 (SEQ ID NO:34), okvirni ostaci Val-L2 i Lys-L45 su zadržani iz mišje sekvence pošto ostatak L2 je polu-ukopan, kontaktira i CDR-L1 i CDR- L3, i ima sklonost za kontakt sa antigenom, dok se ostatak L45 približava teškom lancu. Napominjemo da se oba ova mišja ostatka mogu pojaviti u humanim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh2 (SEQ ID NO:39), okvirni ostaci Ile-H2 i Lys-L73 su zadržani iz mišje sekvence pošto ostatak H2 je polu-ukopan, kontaktira i CDR-H1 i CDR- H3, i ima antigen-kontaktnu sklonost, dok ostatak H73 pripada Vernier zoni koja podržava CDR-H2 i oba ova mišja ostatka mogu se pojaviti u humanim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh3 (SEQ ID NO:40), Ile-H2 i Lys-L73 povratne mutacije su zadržane i pored ovih, okvirni ostaci Ile-H48, Ala-H67, Leu-H69 i Val-H71 su zadržani iz mišje sekvence pošto su svi ovi dodatni mišji ostaci zakopani ostaci i pripadaju Vernier zoni koja podržava CDR-H2, a takođe se mogu pojaviti mišji ostaci H71 u humanim okvirima. U slučaju 3A4 teškog lanca humanizovane sekvence Hvh4 (SEQ ID NO:41), uključeno je svih 6 povratnih mutacija Hvh3 humanizovane varijante plus dodatna dva ostatka mišjeg okvira Lis-H38 i Lys-H66, pošto oni predstavljaju poluukopane ostaci blizu CDR-H2. Rezultujuće aminokiselinske sekvence mišjih i humanizovanih lanaca navedene su u Tabeli 1. Poravnanje varijabilnih regiona mišjeg i humanizovanog lakog lanca prikazano je na slici 10a, a poravnanje varijabilnih regiona mišjeg i humanizovanog teškog lanca je prikazano na slici 10b.
[0231] Slika 11a i 11b je poravnanje varijabilnog regiona mišjeg lakog lanca sa 100% humanizovanim varijabilnim regionom lakog lanca i varijabilnim regionom teškog lanca miša sa 100% humanizovanim varijabilnim regionom teškog lanca. Ova slika ilustruje aminokiseline koje su sačuvane i one koje su izabrane za supstituciju.
Primer 7.
Sastavljanje i ekspresija humanih varijantnih antitela 3A4
[0232] Svrha ovih istraživanja je da se odrede kinetički parametri anti-klasterin antitela. Posebno, da bi se odredilo da li humanizacija 3A4 anti-KAAG1 monoklonskog antitela utiče na kinetičke parametre njegovog vezivanja za humani KAAG1. U tu svrhu razvijen je postupak kinetičke analize korišćenjem instrumenta ProteOn KSPR36 iz BioRad-a. Humani KAAG1 je imobilisan na senzorskom čipu. Antitela pune dužine ili Fab fragmenti su injektirani i ostavljeni da interaguju sa imobilisanim KAAG1.
Konstrukcija plazmida koji kodira himerne (mišje) teške i lake lance 3A4
[0233] Teški i laki lanci himernog antitela su amplifikovani pomoću PCR iz originalnih mišjih imunoglobulinskih lanaca korišćenjem sledećih parova oligonukleotidnih primera: teški lanac, 5'-oligo kodiran SEQ ID NO:50 i 3'-oligo kodiran sa SEQ ID NO:51; laki lanac, 5'-oligo kodiran sa SEQ ID NO:52 i 3'-oligo kodiran sa SEQ ID NO:53. Dobijeni PCR produkti su digestirani sa Hind III i klonirani u pK-CR5 (SEQ ID NO:21) prethodno digestiran sa Hind III.
Konstrukcija plazmida koji kodira humanizovane teške lance 3A4 varijante 1, 2, 3 i 4
[0234] Fragmenti koji kodiraju područje humanizovanog teškog lanca antitela 3A4 (Hhl, Hh2, Hh3 i Hh4) su naručeni iz GenScript (Piscataway, USA). Fragmenti DNK uključujući kozak i stop kodon sekvence su digestirani sa Hindlll i klonirani u Hindlll mesto plazmida pK-CR5 koji je prethodno defosforilisan sa tele intestinalnom fosfatazom (NEB) da bi se sprečila recirkularizacija. Slika 12a prikazuje mapu plazmida pK-CR5-3A4-HC-varijante1. Sve varijante teškog lanca humanizovanog 3A4 su konstruisane na sličan način.
Konstrukcija plazmida koji kodira humanizovani laki lanac 3A4 varijante 1 i 2
[0235] Fragmenti koji kodiraju za regione humanog lakog lanca antitela 3A4 (Lhl i Lh2) su naručeni iz GenScripta. Fragmenti DNK uključujući kozak i stop kodon sekvence su digestirani sa BamHI i klonirani u BamHI mesto plazmida pMPG-CR5 (SEQ ID NO:55) koji je prethodno defosforilisan sa tele intestinalnom fosfatazom (NEB) da bi se sprečila recirkularizacija. Slika 12b prikazuje mapu plazmida pMPG-CR5-3A4-LC-varijanta1. Sve varijante lakog lanca humanizovanog 3A4 su konstruisane na sličan način.
Ispitivanje tranzijentne transfekcije
[0236] Plazmidna DNK je izolovana iz malih kultura E. coli korišćenjem Mini-Prep kit (Qiagen Inc, Mississauga, ON) prema preporuci proizvođača. Ukratko, 2 ml LB medijuma koji sadrži 100 µg/ml ampicilina inokulisano je sa jednom kolonijom izabranom posle ligacije i transformacije. Kulture su inkubirane na 37°C preko noći uz snažno mućkanje (250 RPM). Plazmid je zatim izolovan iz 1.5 ml kulture uz korišćenje protokola, pufera i kolona obezbeđenih u kompletu. DNK je eluirana korišćenjem 50 µl sterilne vode. Plazmidna DNK je izolovana iz velike kulture E. coli korišćenjem kompleta Plasmid Plus Maxi (Qiagen Inc, Mississauga, ON) prema preporuci proizvođača. 200 mL LB medijuma koji sadrži 100 µg/mL ampicilina inokulisano je jednom jedinom svežom kolonijom E. coli i inkubirano preko noći na 37°C uz snažno mućkanje (250 RPM). Bakterije (130 mL kulture za teški lanac i 180 mL kulture za laki lanac) su peletirane centrifugiranjem na 6000 kg, tokom 15 minuta, na 4°C i plazmid je izolovan korišćenjem protokola, pufera i kolona od kompleta. Čisti plazmidi su resuspendovani u sterilnoj 50 mM Tris, pH 8 i kvantifikovani merenjem optičke gustine na 260 nm. Pre transfekcije, prečišćeni plazmid je sterilisan ekstrakcijom sa fenol/hloroformom, a zatim taloženjem etanolom. Plazmid se resuspenduje u sterilnom 50 mM Tris, pH 8 i kvantifikuje optičkom gustinom na 260 nm.
[0237] Pre transfekcije, ćelije (CHO-cTA) su isprane sa PBS i resuspendovane u koncentraciji od 4.0 X 10<6>ćelija/ml u medijumu rasta (CD-CHO, Invitrogen) bez dekstran sulfata tokom 3 h u suspenzivnoj kulturi. Za svaku plazmidnu kombinaciju, 45 ml ćelija je transfektovano dodavanjem polako 5 ml CDCHO medijuma dopunjenog sa 10 µg/ml svakog plazmida i 50 µg/ml polietilenimina (PEI Max; Polysciences). Konačna koncentracija je bila 1 µg/ml svakog plazmida i 5 µg/m1 PEI. Posle 2 h, ćelije su prenesene na 30°C. Sledećih dana, u ćelije su dodati 50 µg/mL dekstran sulfata i 3.75 ml svakog dodatka (Efficient Feed A i B Invitrogen) i oni su inkubirani na 30°C tokom 13 dana.2,5 ml hrane za hranjenje A i 2.5 ml hrane za hranjenje B je dodato na dan 4, 6, 8 i 11. Na dan 13, supernatant je izbistren centrifugiranjem i filtriran kroz 0.22 µM filter.
[0238] CHO ćelije (CHOcTA) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju različite varijante humanizovanog teškog i lakog lanca 3A4 antitela regulisanih sa CR5 promotorom. Izvršena je transfekcija sa različitim kombinacijama lakih i teških lanaca. Kao kontrola, ćelije su takođe transfektovane sa plazmidima koji kodiraju himerno/mišja antitela.
Prečišćavanje antitela
[0239] 15 ml supernatanta iz transfekcija CHO ćelija je koncentrovano centrifugiranjem upotrebom Amicon Ultra (Ultacell-50k) kasete na 1500 rpm. Koncentrovano antitelo (550 µl) je prečišćeno korišćenjem Nab spin kompleta Protein A Plus (Thermo Scientific) u skladu sa preporukama proizvođača. Prečišćena antitela su zatim osoljena upotrebom PBS-a i koncentrovane Amicon Ultra (Ultracel-10K) kasete na 2500 rpm do konačne zapremine od 250 µl. Prečišćeno antitelo je kvantifikovano očitavanjem OD280pomoću Nanodrop spektrofotometra i čuvano je zamrznuto na -20°C. Alikvot pročišćenog antitela je resuspendovan u jednaku zapreminu Laemmli 2X i zagrevan na 95°C tokom 5 minuta i ohlađen na ledu. Standardna kriva je napravljena korišćenjem poznate količine prečišćene humane IgGl kapa iz humane Mieloma plazme (Athens Research). Uzorci su razdvojeni na poliakrilamidnom Novex 10% Tris-Glycin gelu (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON) i prebačeni na Hibond-N nitroceluloznu membranu (Amersham Bioscience Corp., Baie d'Urfee, KC) tokom 1 h na 275 mA. Membrana je blokirana tokom 1 h u 0.15% Tween 20, 5% obranog mleka u PBS i inkubirana tokom 1 h sa kozjim antihumanim IgG (H+L) konjugovanim za Cy5 (Jackson, Cat # 109-176-099). Signal je otkriven i kvantifikovan skeniranjem pomoću Typhoon Trio+ skenera (GE Healtcare). Kao što je prikazano na Slici 13, sve kombinacije varijanti humanizovanog antitela 3A4 su eksprimirane u CHO ćelijama.
Primer 8.
Kinetička analiza mišjeg i humanizovanog 3A4 antitela
Zalihe
[0240] GLM sensorchips, Biorad ProteOn aminski kit za spajanje (EDC, sNHS i etanolamin), i 10 mM natrijum acetatni puferi su nabavljeni od Bio-Rad Laboratories (Mississauga, ON). HEPES pufer, EDTA i NaCl su nabavljeni od Sigma-Aldrich (Oakville, ON). Deset procenata Tween 20 rastvora je nabavljeno od Teknova (Hollister, CA). Specifično antitelo kozjeg anti-humanog IgG Fc fragmenta je nabavljeno od Jackson ImmunoResearch. Kolona za gel filtraciju Superdex 7510/300 GL je nabavljena od GE Healthcare.
Gelska filtracija
[0241] Protein KAAG1 u koncentraciji od 3.114 mg/ml i zapremina od 220 µL je ubrizgan u kolonu Superdex G75. Odvajanje je izvršeno na 0.4 ml/min u HBST puferu (videti dole) bez Tween 20. Zapremina sakupljenih frakcija je 500 µL. Koncentracija KAAG1 u svakoj frakciji je određena pomoću OD280korišćenjem koeficijenta ekstenzije od 5500 i MW od 8969. Slika 14 predstavlja profil gel filtracije KAAG1. Mali vrh potencijalnog agregata se eluira na oko 11 ml. Protein koji se eluira sa 13 ml je korišćen kao analit za SPR analizu (frakcije 15 -19).
SPR biosenzor testovi
[0242] Sva ispitivanja površinske plazmonske rezonance izvedena su korišćenjem BioRad ProteOn XPR36 instrumenta (Bio-Rad Laboratories Ltd. (Mississauga, ON) sa puferom HBST (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA i 0.05% Tween 20, pH 7.4) na temperaturi od 25°C. Površinu anti-mišjeg Fc hvatanja je generisana korišćenjem GLM senzorskog čipa aktiviranog sa 1:5 razblaženjem standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora ubrizganih tokom 300 s na 30 µL/min u analitnom (horizontalnom) pravcu. Odmah nakon aktivacije, 13 µg/mL rastvora anti-humanog IgG Fc fragmenta specifičnog u 10 mM NaOAc pH 4.5 je ubrizgano u smeru analita sa brzinom protoka od 25 µL/min dok se nije imobilisalo približno 8000 rezonantnih jedinica (RU). Preostale aktivne grupe su ugašene 300-inčnim ubrizgavanjem 1M etanolamina na 30 µL/min u smeru analita, a to takođe obezbeđuje da se kreiraju lažno aktivirani interspoti za prazno referenciranje. Skrining varijanti 3A4 za vezivanje za KAAG1 dogodio se u dva koraka: indirektno hvatanje 3A4 varijanti iz ćelijskog supernatanta na specifičnu površinu anti-humanog IgG Fc fragmenta u pravcu liganda (vertikalno) praćeno KAAG1 injekcijom u pravcu analita. Prvo, jedna puferska injekcija za 30 s na 100 uL/min u smeru liganda je korišćena za stabilizaciju osnovne linije. Za svako 3A4 hvatanje, neprečišćene 3A4 varijante u medijumu za kulturu ćelija su razređene do 4% u HBST, ili je korišćeno približno 1.25 µg/mL prečišćenog 3A4 u HBST. Četiri do pet 3A4 varijanti zajedno sa divljim tipom 3A4 su istovremeno injektirane u pojedinačne kanale liganda za 240 s pri protoku od 25 µL/min. Ovo je rezultiralo zasićenjem 3A4 hvatanja približno 400-700 RU na specifičnu površinu anti-humanog IgG Fc fragmenta. Prvi kanal liganda ostao je prazan da bi se koristio kao kontrola praznog uzorka ako je bila potrebna. Ovaj korak hvatanja 3A4 odmah je praćen sa dve injekcije pufera u pravcu analita da bi se stabilizovala osnovna linija, a zatim je injektiran gel filtracioni prečišćeni KAAG1. Za tipičan ekran, pet KAAG1 koncentracija (8, 2.66, 0.89, 0.29 i 0.098 nM) i kontrola pufera su istovremeno injektirane u pojedinačne kanale analita na 50 µL/minuta u toku 120 s sa fazom disocijacije 600s, što je rezultiralo skupom vezivanje senzograma sa referencom bafera za svaku od zarobljenih 3A4 varijanti. Kompleksi specifični za 3A4 Fc fragmenta humanog IgG su regenerisani 18 s pulsom od 0.85% fosforne kiseline tokom 18 sekundi na 100 µL/min da bi se pripremila specifična površina antihumanog IgG Fc fragmenta za sledeći ciklus ubrizgavanja. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referencirani upotrebom prazne injekcije pufera i interspota, a dobijeni senzorski signali su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.0. Kinetičke i afinitetne vrednosti su utvrđene podešavanjem referentnih senzograma na 1:1 Langmuirov model vezivanja pomoću lokalnog Rmax, a konstante afiniteta (KD M) su izvedene iz rezultujućih konstanti brzine (kds<-1>/kaM<-1>s<-1>).
Određivanje konstante brzine i afiniteta
[0243] Slika 15 rezimira konstante brzine asocijacije (ka, 1/Ms) i disocijacije (kd, 1/s) kao i konstante afiniteta (KD, M) za interakciju KAAG1 sa prečišćenim mišjim 3A4, mišji 3A4 prolazno izražen kao himerni i prolazno izražene humanizovane varijante. Ove konstante su grafički predstavljene na Slici 16. Konstanta brzine asocijacije je veoma slična za čiste roditeljske, himerne i humanizovane varijante 3A4 (Slika 16a). Konstante brzine disocijacije su slične za prolazno eksprimirane himerne u poređenju sa čistim roditeljskim 3A4 sa sugeriraju da postupak transfekcije nije promenio parametre interakcije KAAG1 sa antitelom (Slika 16b). Međutim, čini se da sve humanizovane varijante imaju malo izmenjenu stopu, tj. bržu brzinu disocijacije (Slika 16b). Ovo se ogleda u konstantama afiniteta (Slika 16c). Ukratko, postoji linearna korelacija između afiniteta vezivanja (logKD) humanizovane varijante i broja povratnih mutacija napravljenih u roditeljskom antitelu (LcHc) sa smanjenjem afiniteta vezivanja kako se broj mutacija povećava. Međutim, razlika u afinitetu vezivanja je samo 4 puta različita između gore varijante (H1L1, 0.47 nM) koja nema zadržani mišji ostatak i najbolja varijanta koja ima 10 mišjih ostataka zadržana (H4L2, 0.1 nM). Konačno, afinitet vezivanja svih varijanti za KAAG1 je nađeno da je subnanomolarni i najbolja varijanta (H4L2, 0.1 nM) pokazuje afinitet oko 6 puta slabiji od mišje (LcHc, 0.057 nM). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju da je humanizacija bila uspešna jer su sve varijante pokazale veoma visok afinitet za KAAG1.
Primer 9.
Vezivanje 3A4 humanizovanih varijanti za KAAG1 u ELISA testu
[0244] ELISA metode su takođe korišćene za poređenje aktivnosti vezivanja humanizovanih 3A4 varijante sa mišjim 3A4 antitelom. Rekombinantni humani KAAG1 je obložen u ploče sa 96 udubljenja O/N, ispran i inkubiran tokom 1 h na sobnoj temperaturi sa povećanim količinama mišjih ili humanizovanih 3A4 varijanti. Posle još jedne runde koraka ispiranja, anti-humano antitelo konjugovano sa HRP je dodato u udubljenja i vezano 3A4 antitelo je mereno kalorimetrijski na Abs450. Kao što je prikazano na Slici 17A, humanizovane varijante (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3 i Lh1Hh4) pokazuju veoma slično vezivanje za KAAG1 u poređenju sa mišjim 3A4 (LcHc). Ovaj rezultat je pokazao da su sva četiri humanizovana varijanta teškog lanca bila uporediva sa originalnim h3A4 teškim lancem kada su sastavljena sa L1 varijantom humanizovanog lakog lanca. Slika 17B prikazuje rezultate kada su varijante teškog lanca sakupljene sa varijantom Lh2 humanizovanog lakog lanca 3A4. U ovom slučaju, postojala je razlika u vezivanju varijanti. Na primer, Lh2hh4 je varijanta sa najbližim profilom u poređenju sa mišjim 3A4. Ovo je bilo u skladu sa SPR podacima (videti Primer 3), koji su pokazali da varijanta 4 teškog lanca ima najveći afinitet za KAAG1. Uzeti zajedno, ovi rezultati vezivanja pokazuju da su humanizovane varijante sve u interakciji sa humanim KAAG1 u ovom testu. Iako je bilo nekih suptilnih razlika, vezivanje u ELISA je bilo u skladu sa rezultatima SPR.
Primer 10.
Vezivanje humanizovanih varijanti 3A4 na površini ćelija kancera
[0245] Protočna citometrija je korišćena za procenu kapaciteta humanizovanih 3A4 varijanti za interakciju sa KAAG1 eksprimiranim na površini ćelija kancera. U tom cilju, SKOV-3 ćelije kancera jajnika, koje smo prethodno pokazale, efikasno su vezane sa 3A4 protočnom citometrijom, inkubirane su sa osam humanizovanih varijanti i originalnim mišjim antitelom. Ukratko, SKOV-3 ćelije su odvojene od ploče sa EDTA i inkubirane na ledu sa 3.0 mg/ml, 0.3 mg/ml ili 0.3 mg/ml antitela za 1 h. Posle tri koraka ispiranja, ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitelom, anti-humanim IgG-konjugovanim sa FITC tokom 1 h na ledu. Fluorescencija ćelijske površine je merena u protočnom citometru, a vrednosti prikazane na histogramu sa Slike 18. Kao što je prikazano, sve varijante mogu da detektuju KAAG1 na površini na nepermeabilnim, a najjači signali su dobijeni pri najvišoj koncentraciji 3A4 antitela (3 mg/ml) i smanjeni kako je koncentracija antitela smanjena. Među različitim varijantama, one sa većinom mišjih povratnih mutacija (Slika 18, vidi Lh1Hh4 i Lh2Hh4) su interagovale sa KAAG1 na površini ćelija sa najvećom aktivnošću. U stvari, LhlHh4 i Lh2hh4 su se činili kao blago poboljšano vezivanje ćelijske površine za KAAG1 u poređenju sa mišjim 3A4 antitelom (LcHc).
OBJAVE
[0246]
• Jemal A, Murray T, Ward E, Samuels A, Tiwari RC, Ghafoor A, Feuer EJ and Thun MJ. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 2005; 55: 10-30.
• Menon U, Skates SJ, Lewis S, Rosenthal AN, Rufford B, Sibley K, Macdonald N, Dawnay A, Jeyarajah A, Bast RC Jr, Oram D and Jacobs IJ. Prospective study using the risk of ovarian cancer algorithm to screen for ovarian cancer. J Clin Oncol.2005; 23(31):7919-26.
• Bonome T, Lee JY, Park DC, Radonovich M, Pise-Masison C, Brady J, Gardner GJ, Hao K, Wong WH, Barrett JC, Lu KH, Sood AK, Gershenson DM, Mok SC and Birrer MJ. Expression profiling of serous low malignancy potential, low grade, and high-grade tumors of the ovary. Cancer Res 2005; 65: 10602-10612.
• Chambers, A and Vanderhyden, B. Ovarian Cancer Biomarkers in Urine. Clin Cancer Res 2006; 12(2):
323-327.
• Berek i dr. Cancer Medicine.5th ed. London: B.C. Decker, Inc.; 2000. pp.1687-1720.
• Bristow R.E. Surgical standards in the management of ovarian cancer. Curr Opin Oncol 2000; 12: 474-480.
• Brown E, Stewart M, Rye T, Al-Nafussi A, Williams AR, Bradburn M, Smyth J and Gabra H.
Carcinosarcoma of the ovary: 19 years of prospective data from a single center. Cancer 2004; 100: 2148-2153.
• Shih L-M and Kurman RJ. Molecular Pathogenesis of Ovarian Borderline Tumors: New Insights and Old Challenges. Clin Cancer Res 2005; 11(20): 7273-7279.
• Seidman JD, Russell P, Kurman RJ. Surface epithelial tumors of the ovary. In: Kurman RJ, editor.
Blaustein's pathology of the female genital tract.5th ed. New York: Springer-Verlag; 2002. pp.791-904. • Cannistra SA and McGuire WP. Progress in the management of gynecologic cancer. J. Clin. Oncol.2007;
25(20): 2865-2866.
• Oei AL, Sweep FC, Thomas CM, Boerman OC, Massuger LF. The use of monoclonal antibodies for the treatment of epithelial ovarian cancer. Int. J. Oncol.2008; 32(6): 1145-1157.
• Nicodemus CF and Berek JS. Monoclonal antibody therapy of ovarian cancer. Expert Rev. Anticancer Ther.2005; 5(1): 87-96.
• Burger RA. Experience with bevacizumab in the management of epithelial ovarian cancer. J. Clin. Oncol.
2007; 25(20): 2902-2908.
• Simon I, Zhuo S, Corral L, Diamandis EP, Sarno MJ, Wolfert RL, Kim NW. B7-H4 is a novel membranebound protein and a candidate serum and tissue biomerker for ovarian cancer. Cancer Res. 2006; 66(3): 1570-1575.
• Ebel W, Routhier EL, Foley B, Jacob S, McDonough JM, Patel RK, Turchin HA, Chao Q, Kline JB, Old LJ, Phillips MD, Nicolaides NC, Sass PM, Grasso L. Preclinical evaluation of MORab-003, a humanized monoclonal antibody antagonizing folate receptor-alpha. Cancer Immun.2007; 7: 6-13.
• Van den Eynde BJ, Gaugler B, Probst-Kepper M, Michaux L, Devuyst O, Lorge F, Weynants P, Boon T.
A new antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes on a human kidney tumor results from reverse strand transcription. J. Exp. Med.1999; 190(12): 1793-1799.
• Sooknanan R, Tremblay GB, Filion M. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer.
2007; PCT/CA2007/001134 published under No. WO/2007/147265 on December 27, 2007.
• Schumacher J, Anthoni H, Dahdouh F, König IR, Hillmer AM, Kluck N, Manthey M, Plume E, Warnke A, Remschmidt H, Hülsmann J, Cichon S, Lindgren CM, Propping P, Zucchelli M, Ziegler A, Peyrard-Janvid M, Schulte-Körne G, Nöthen MM, Kere J. Strong genetic evidence of DCDC2 as a susceptibility gene for dyslexia. Am. J. Hum. Genet.2006; 78: 52-62.
• Cope N, Harold D, Hill G, Moskvina V, Stevenson J, Holmans P, Owen MJ, O'Donovan MC, Williams J.
Strong evidence that KIAA0319 on chromosome 6p is a susceptibility gene for developmental dyslexia. Am. J. Hum. Genet.2005; 76: 581-591.
• Mor G, Visintin I, Lai Y, Zhao H, Schwartz P, Rutherford T, Yue L, Bray-Ward P and Ward DC Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. PNAS 2005; 102: 7677-7682.
• Kozak KR, Amneus MW, Pusey SM, Su F, Luong MN, Luong SA, Reddy ST and Farias-Eisner R.
Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis. PNAS 2003; 100: 12343-12348.
• Benoît MH, Hudson TJ, Maire G, Squire JA, Arcand SL, Provencher D, Mes-Masson AM, Tonin PN.
Global analysis of chromosome X gene expression in primary cultures of normal ovarian surface epithelial cells and epithelial ovarian cancer cell lines. Int. J. Oncol.2007; 30(1): 5-17.
• Cody NA, Zietarska M, Filali-Mouhim A, Provencher DM, Mes-Masson AM, Tonin PN. Influence of monolayer, spheroid, and tumor growth conditions on chromosome 3 gene expression in tumorigenic epithelial ovarian cancer cell lines. BMC Med. Genomics 2008; 1(1):34.
• Buechler J, Valkirs G, Gray J. Polyvalent display libraries.2000; U.S.6,057,098.
• Durocher Y, Kamen A, Perret S, Pham PL. Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells.2002; Canadian patent application No. CA 2446185. • Durocher Y. Expression vectors for enhanced transient gene expression and mammalian cells expressing them.2004; U.S. patent application No.60/662,392.
• Tremblay GB, Filion M. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen.2009;
PCT/CA2009/001586.
• Durocher Y, Kamen A, Perret S, Pham PL. Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells.2002; Canadian patent application No. CA 2446185 (published as CA2446185C).
• Durocher Y. Expression vectors for enhanced transient gene expression and mammalian cells expressing them.2004; U.S. patent application No.60/662,392.
• Chang MH, Karageorgos LE, Meikle PJ. CD107a (LAMP-1) and CD107b (LAMP-2).2002; J Biol Regul Homeost Agents.16:147-51.
• Abhinandan, KR and Martin, ACR. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains.2008; Mol Immunol, 45, 3832-3839.
Sekvence navedene u opisu
[0247]
SEQ ID NO.:1-3A4 sekvenca nukleotida varijabilnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO.:2-3A4 polipeptidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca
SEQ ID NO.:3-3A4 sekvenca nukleotida varijabilnog regiona lakog lanca
SEQ ID NO.:4-3A4 polipeptidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca
SEQ ID NO.:5-3A4 CDR1 polipeptidna sekvenca teškog lanca GYTFTDDYMS SEQ ID NO.:6-3A4 CDR2 polipeptidna sekvenca teškog lanca DINPYNGDTN SEQ ID NO.:7-3A4 CDR3 polipeptidna sekvenca teškog lanca DPGAMDY SEQ ID NO.:8-3A4 CDR1 polipeptidna sekvenca lakog lanca RSSQSLLHSNGNTYLE SEQ ID NO.:9-3A4 CDR2 polipeptidna sekvenca lakog lanca TVSNRFS SEQ ID NO.:10-3A4 CDR3 polipeptidna sekvenca lakog lanca FQGSHVPLT SEQ ID NO.:11 - OGS1773 GTAAGCAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC SEQ ID NO.:12 - OGS1774 GTAAGCGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC SEQ ID NO.:13 - humana kappa konstantna nukleotidna sekvenca
SEQ ID NO.:14 - humana kappa konstantna polipeptidna sekvenca
SEQ ID NO.:15
SEQ ID NO.:16 - OGS18500 ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGATGTTGTGATGACCCAAACTCC SEQ ID NO:.17 - OGS2084 GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTCCG SEQ ID NO.:18 - OGS1769 GTAAGCGCTAGCGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCC SEQ ID NO.:19 - OGS1770 GTAAGCGAATTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTG SEQ ID NO.:20 - humani imunoglobulinski CH1 region nukleotidne sekvence
SEQ ID NO.:21 - humani imunoglobulinski CH1 region polipeptidne sekvence
SEQ ID NO.:22
SEQ IDNO.:23 - OGS1879
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGATCCAGTTGGTGCAATCTGG EQ ID NO.:24 - OGS1810
GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC SEQ ID NO.:25
GTAAGCGGATCCATGGATGACGACGCGGCGCCC SEQ ID NO.:26
GTAAGCAAGCTTAGGCCGCTGGGACAGCGGAGGTGC SEQ ID NO.:27
GTAAGCAAGCTTGGCAGCAGCGCCAGGTCCAGC SEQ ID NO.:28
SEQ ID NO.:30 (varijabilni region varijantnog lakog lanca)
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4. Zamena aminokiseline može biti, na primer, konzervativna.
SEQ ID NO.:31 (varijabilni region varijantnog lakog lanca)
Gde Xa1može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xa2može biti A ili P;
Gde Xa3može biti neutralna hidrofilna aminokiselina;
Gde Xa4može biti L ili P;
Gde Xa5može biti kisela aminokiselina;
Gde Xa6može biti Q ili P;
Gde Xa7može biti bazna aminokiselina;
Gde Xa8može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xa9može biti A ili Q;
Gde Xa10može biti bazna aminokiselina; ili
Gde Xa11može biti hidrofobna aminokiselina;
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4. SEQ ID NO.:32 (varijabilni region varijantnog lakog lanca)
Gde XA1može biti V ili I
Gde XA2može biti A ili P
Gde XA3može biti S ili T
Gde XA4može biti L ili P
Gde XA5može biti D ili E
Gde XA6može biti Q ili P
Gde XA7može biti K ili Q;
Gde XA8može biti L ili V
Gde XA9može biti A ili Q
Gde XA10može biti A ili K ili
Gde XA11može biti L ili I,
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:4. SEQ ID NO.:33 (varijabilni region varijante 1 lakog lanca: Lvh1)
SEQ ID NO.:34 (varijabilni region varijante 2 lakog lanca: Lvh2)
SEQ ID NO.:35 (varijabilni region varijantnog teškog lanca)
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2. Zamena aminokiseline može biti, na primer, konzervativna.
SEQ ID NO.:36 (varijabilni region varijantnog teškog lanca)
Gde Xb1može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb2može biti P ili A;
Gde Xb3može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb4može biti V ili K;
Gde Xb5može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb6može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb7može biti S ili A;
Gde Xb8može biti H ili P;
Gde Xb9može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb10može biti S ili G;
Gde Xb11može biti hidrofobna aminokiselina; Gde Xb12može biti bazna aminokiselina;
Gde Xb13može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb14može biti I ili T;
Gde Xb15može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb16može biti hidrofobna aminokiselina;
Gde Xb17može biti K ili T;
Gde Xb18može biti neutralna hidrofilna aminokiselina; Gde Xb19može biti Q ili E;
Gde Xb20može biti N ili S;
Gde Xb21može biti T ili R;
Gde Xb22može biti neutralna hidrofilna aminokiselina; ili
Gde Xb23može biti S ili L;
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2.
SEQ ID NO.:37 (varijabilni region varijantnog teškog lanca)
Gde XB1može biti I ili T;
Gde XB2može biti P ili A;
Gde XB3može biti M ili V;
Gde XB4može biti V ili K;
Gde XB5može biti M ili V;
Gde XB6može biti K ili R;
Gde XB7može biti S ili A;
Gde XB8može biti H ili P;
Gde XB9može biti K ili Q;
Gde XB10može biti S ili G;
Gde XB11može biti I ili M;
Gde XB12može biti K ili R;
Gde XB13može biti A ili V;
Gde XB14može biti I ili T;
Gde XB15može biti L ili I;
Gde XB16može biti V ili A;
Gde XB17može biti K ili T;
Gde XB18može biti S ili T;
Gde XB19može biti Q ili E;
Gde XB20može biti N ili S;
Gde XB21može biti T ili R;
Gde XB22može biti S ili T; ili
Gde XB23može biti S ili L;
pri čemu je najmanje jedna od aminokiselina identifikovanih sa X aminokiselinska supstitucija (konzervativna ili ne-konzervativna) u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u polipeptidu prikazanom u SEQ ID NO.:2. SEQ ID NO.:38 (varijanta 1 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh1)
SEQ ID NO.:39 (varijanta 2 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh2)
SEQ ID NO.:40 (varijanta 3 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh3)
SEQ ID NO.:41 (varijanta 4 varijabilnog regiona teškog lanca: Hvh4)
SEQ ID NO:423A4 mišiji lak (kapa) lanac
SEQ ID NO:433A4 varijanta 1 humanizovanog lakog (kapa) lanca; Lh1
SEQ ID NO:443A4 varijanta 2 humanizovanog lakog (kapa) lanca; Lh2
SEQ ID NO:453A4 mišiji teški (Igg1) lanac
SEQ ID NO:463A4 varijanta 1 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh1
SEQ ID NO:473A4 varijanta 2 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh2
SEQ ID NO:483A4 varijanta 3 humanizovanog teškog (Igg1) lanca; Hh3
SEQ ID NO:493A4 varijanta 4 humanizovanog teškog (Igg1) lanca: Hh4
SEQ ID NO:50 ATACCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAC SEQ ID NO:51 ATACCCAAGCTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAG SEQ ID NO:52 ATACCCAAGCTTGGGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG SEQ ID NO:53 ATACCCAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG SEQ ID NO:54 pK-CR5
SEQ ID NO:55 pMPG-CR5
SEQ ID NO.:56- 3A4 humanizovani CDR2 polipeptidni niz teškog lanca DINPYNGDTNYNQKFKG

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen 1 (KAAG1) povezan sa bubregom i koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5, CDRH2 aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:6 i CDRH3 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 aminokiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO.:8, CDRL2 aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO i CDRL3 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:10, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži humane okvirne regione i opciono jednu ili više povratnih mutacija u varijabilnom regionu lakog lanca i/ili varijabilnom regionu teškog lanca, gde su jedna ili više povratnih mutacija u okvirnom regionu i odgovaraju okvirnim aminokiselinama u sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca prikazanog u SEQ ID NO:2 i/ili u aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca prikazanog u SEQ ID NO:4 matičnog antitela miša.
2. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnom zahtevu 1, gde su povratne mutacije u varijabilnom regionu teškog lanca Ile na poziciji 2 i Lys na položaju 73.
3. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnom zahtevu 2, koje sadrži dodatne povratne mutacije u varijabilnom regionu teškog lanca, pri čemu su pomenute dodatne povratne mutacije Ile na poziciji 48, Ala na poziciji 67, Leu na poziciji 69 i Val na položaju 71.
4. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema patentnom zahtevu 3, koje sadrži dodatne povratne mutacije u varijabilnom regionu teškog lanca, pri čemu su navedene dodatne povratne mutacije Lys na položaju 38 i Lys na položaju 66.
5. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde su povratne mutacije u varijabilnom regionu lakog lanca Val na poziciji 2 i Lys na položaju 45.
6. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen 1 (KAAG1) povezan sa bubregom, pri čemu humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina iznetu u SEQ ID NO.:35, SEQ ID NO:36 ili SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO.:30, SEQ ID NO.:31 ili SEQ ID NO.:32.
7. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde je antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena konjugovan sa terapeutskom grupom, citotoksičnim sredstvom ili sa detektabilnom grupom.
8. Nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6.
9. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu patentnog zahteva 8.
10. Izolovana ćelija koja sadrži:
(a) nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 i nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen patentnih zahteva 1 ili 6, pri čemu je svaka nukleinska kiselina na odvojenom vektoru ili na istom vektoru; ili
(b) humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
11. Sastav ili farmaceutski sastav koji sadrži humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu navedeni sastav dalje sadrži nosač i gde navedeni farmaceutski sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. Komplet koji sadrži humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.
13. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 ili sastav ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu u lečenju, otkrivanju ili dijagnozi karcinoma koji obuhvataju ćelije koje eksprimiraju KAAG1 ili varijantu KAAG1.
14. Humanizovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ili sastav ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je kancer izabran iz grupe koju čine kancer jajnika, kancer kože, kancer bubrega, kolorektalni kancer, sarkom, leukemija, kancer mozga, kancer štitnjače, kancer dojke, kancer prostate, kancer jednjaka, kancer mokraćne bešike, kancer pluća i kancer glave i vrata i/ili u kojima je kancer metastatski.
15. Postupak rekombinantne DNK za dobijanje humanizovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koji sadrži kultivaciju izolovane ćelije kao što je definisano u delu (a) prema patentnom zahtevu 10, tako da se proizvodi antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.
RS20190975A 2011-03-31 2012-03-28 Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen RS59080B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161470063P 2011-03-31 2011-03-31
US201161533346P 2011-09-12 2011-09-12
EP16190193.9A EP3173427B1 (en) 2011-03-31 2012-03-28 Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59080B1 true RS59080B1 (sr) 2019-09-30

Family

ID=46929256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190975A RS59080B1 (sr) 2011-03-31 2012-03-28 Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen

Country Status (24)

Country Link
US (5) US8937163B2 (sr)
EP (3) EP2691421B1 (sr)
JP (3) JP6294221B2 (sr)
KR (2) KR101993259B1 (sr)
CN (2) CN106146664B (sr)
AU (1) AU2012234754B2 (sr)
BR (1) BR112013025198A2 (sr)
CA (3) CA2829105C (sr)
CY (1) CY1122156T1 (sr)
DK (2) DK2691421T3 (sr)
EA (1) EA038979B1 (sr)
ES (2) ES2615387T3 (sr)
HR (1) HRP20191590T1 (sr)
HU (1) HUE045943T2 (sr)
IL (3) IL228434B (sr)
LT (1) LT3173427T (sr)
MX (1) MX352373B (sr)
PL (1) PL3173427T3 (sr)
PT (1) PT3173427T (sr)
RS (1) RS59080B1 (sr)
SI (1) SI3173427T1 (sr)
SM (1) SMT201900505T1 (sr)
WO (1) WO2012129668A1 (sr)
ZA (1) ZA201307027B (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3050455A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Adc Therapeutics Sa Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
SI3173427T1 (sl) 2011-03-31 2019-08-30 ADC Therapeutics SA, Protitelesa proti antigenu 1, povezanemu z ledvicami, in antigen vezavni fragmenti le-tega
IN2014CN04690A (sr) 2012-01-09 2015-09-18 Alethia Biotherapeutics Inc
US20130280282A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
PL3579883T3 (pl) 2017-02-08 2022-01-24 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało
IL266153A (en) * 2019-04-18 2019-07-31 Aharon Anat Extracellular vesicles derived from t cells containing a chimeric antigen receptor
GB201908128D0 (en) * 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP2024504240A (ja) * 2021-01-07 2024-01-31 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 安定した細胞株を用いた生物製剤製造のための厳密に制御された誘導性発現系
EP4568748A2 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Epibiologics, Inc. Degradation of egfr using a bispecific binding agent
WO2024108193A2 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Epibiologics, Inc. Degradation of cmet using a bispecific binding agent

Family Cites Families (195)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US662392A (en) 1899-12-12 1900-11-27 Friedrich Wilhelm Buehne Method of making metal wool.
DK365785A (da) 1984-09-17 1986-03-18 Hoffmann La Roche Metalcomplexer
US5075447A (en) 1984-09-17 1991-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Ruthenium complexes useful as carriers for immunologically active materials
US5585279A (en) 1986-01-23 1996-12-17 Davidson; Robert S. Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium
GB8601646D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Davidson R S Binding assay & reagent
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
WO1991009849A1 (en) 1989-12-28 1991-07-11 The Upjohn Company Diaromatic substituted anti-aids compounds
IL105325A (en) 1992-04-16 1996-11-14 Minnesota Mining & Mfg Immunogen/vaccine adjuvant composition
WO1996013510A1 (en) 1994-10-28 1996-05-09 Procept, Inc. Ruthenium complexes and their use as immunosuppressive agents
US5708022A (en) 1994-10-28 1998-01-13 Procept, Inc. Method for inhibiting immune response
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5831003A (en) 1996-06-28 1998-11-03 Bayer Corporation Peptides which bind to prothrombin and thrombin
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
AU755913B2 (en) 1997-06-18 2003-01-02 Masad Damha Nucleic acid biosensor diagnostics
WO1999031513A1 (en) 1997-12-15 1999-06-24 Lakowicz Joseph R Method and composition for characterizing a sample containing a sample lipid and an assay kit
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6472367B1 (en) 1998-05-05 2002-10-29 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion
CA2328422A1 (en) 1998-05-13 1999-11-18 Diversys Limited Selection system
JP2002514400A (ja) 1998-05-13 2002-05-21 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 遍在的に発現される新規な遺伝子のリバースストランドによってコードされている腫瘍関連抗原
US7037667B1 (en) 1998-06-01 2006-05-02 Agensys, Inc. Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer
US7521197B2 (en) 1998-06-05 2009-04-21 Alexis Biotech Limited Method for producing cytotoxic T-cells
US20020106678A1 (en) 1998-06-30 2002-08-08 Robishaw Janet D. cDNA clones encoding human G protein gamma subunits
EP1090012A4 (en) 1998-07-02 2005-04-06 Merck & Co Inc INHIBITORS OF PRENYL-PROTEIN TRANSFERASE
US6288221B1 (en) 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
US6806089B1 (en) 1998-09-08 2004-10-19 University Of Maryland, Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
WO2000014515A1 (en) 1998-09-08 2000-03-16 University Of Maryland At Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
AU1223400A (en) 1998-10-22 2000-05-08 Phillip B. B. Moheno Novel pterin antineoplastic agents
EP1158984A4 (en) 1998-10-29 2003-05-21 Merck & Co Inc Inhibitors of prenyl protein transferase
JP2004500321A (ja) 1999-03-19 2004-01-08 アノーメッド　インコーポレイティド 金属錯体を含む薬学的組成物
US6872519B1 (en) 1999-04-27 2005-03-29 Mirus Bio Corporation In vitro process for selecting phage resistant to blood inactivation
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
CA2385589A1 (en) 1999-09-17 2001-03-22 Bing-Yan Zhu Inhibitors of factor xa
WO2001046209A1 (en) 1999-12-20 2001-06-28 Fluorrx, Inc. Fluorescent probes
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US7585839B2 (en) 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
US20030215860A1 (en) 2000-02-29 2003-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18636, 2466, 43238, 1983, 52881, 2398, 45449, 50289, 52872 and 26908 molecules and uses therefor
WO2001070979A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
JP2004515217A (ja) 2000-06-16 2004-05-27 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド プロテアーゼ
AU2002214531A1 (en) 2000-07-03 2002-01-30 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20050053930A1 (en) 2000-07-18 2005-03-10 David Anderson Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
GB0023008D0 (en) 2000-09-20 2000-11-01 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7320793B2 (en) 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US6783969B1 (en) 2001-03-05 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Cathepsin V-like polypeptides
US7030236B2 (en) 2001-03-09 2006-04-18 Mona Savitri Jhaveri Antisense oligonucleotides tarageting folate receptor alpha, and the use thereof
US20030087250A1 (en) 2001-03-14 2003-05-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US20030065157A1 (en) 2001-04-04 2003-04-03 Lasek Amy W. Genes expressed in lung cancer
WO2002083921A2 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Agensys, Inc. Nuleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
CA2444691A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
EP1390511B1 (en) 2001-05-07 2008-03-12 National Research Council Of Canada Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
US20040053824A1 (en) 2001-06-29 2004-03-18 Tang Y Tom Extracellular matrix and cell adhesion molecules
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
PT1421105E (pt) 2001-08-31 2010-12-07 Btg Int Ltd Compostos anticancerígenos de ciclopenta-g quinazolina
PT1420809E (pt) 2001-08-31 2012-01-03 Btg Int Ltd Utilização de derivados de ciclopenta[g]quinazolina para tratamento de cancro
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7622260B2 (en) 2001-09-05 2009-11-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic and prognostic tests
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
WO2003043987A2 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Elan Pharmaceuticals, Inc. (4-phenyl) piperidin-3-yl-phenylcarboxylate derivatives and related compounds as beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease
WO2003047526A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Incyte Genomics, Inc. Cell adhesion and extracellular matrix proteins
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2003057725A2 (en) 2002-01-09 2003-07-17 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
ES2291613T3 (es) 2002-01-16 2008-03-01 Biocompatibles Uk Limited Conjugados de polimeros.
ES2426420T3 (es) 2002-01-28 2013-10-23 Keraplast Technologies Ltd. Péptidos de queratina bioactivos
US6962910B2 (en) 2002-02-01 2005-11-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Supramolecular complexes as photoactivated DNA cleavage agents
AU2003225573A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of He Identification of ovarian cancer tumor markers and therapeutic targets
DE10206616A1 (de) 2002-02-15 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach Markierungsreaktionen
CA2477780A1 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
WO2003080672A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
AU2003223520A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
WO2003099205A2 (en) 2002-05-20 2003-12-04 Abgenix, Inc. Treatment of renal carcinoma using antibodies against the egfr
US20070224201A1 (en) 2002-10-02 2007-09-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1422242A1 (en) 2002-11-22 2004-05-26 Emory University Plastic and elastic protein copolymers
KR20050115231A (ko) 2003-02-10 2005-12-07 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 포유동물 세포의 조절
WO2004087874A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
CA2526069A1 (en) 2003-05-20 2004-12-02 Cellpep Sa Modified antiviral peptides with increased activity and cell membrane affinity
EP1636363A1 (en) 2003-05-21 2006-03-22 GeneSense Technologies Inc. Antisense oligonucleotides directed to ribonucleotide reductase r1 and uses thereof in the treatment of cancer
US20050008649A1 (en) 2003-06-02 2005-01-13 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US20060078941A1 (en) 2003-06-09 2006-04-13 Santin Alessandro D Gene expression profiling in primary ovarian serous papillary tumors and normal ovarian epithelium
US20070027075A1 (en) 2003-06-09 2007-02-01 Smithrud David B Compositions and methods for targeted drug delivery
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
GB0318096D0 (en) 2003-08-01 2003-09-03 Queen Mary & Westfield College Vaccine
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US20070178458A1 (en) 2003-09-05 2007-08-02 O'brien Philippa Methods of diagnosis and prognosis of ovarian cancer II
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
US7202234B2 (en) 2003-10-24 2007-04-10 Eisai Co., Ltd. Compounds and methods for treating Toll-like receptor 2-related diseases and conditions
US20050153333A1 (en) 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
EP1547581A1 (en) 2003-12-23 2005-06-29 Vectron Therapeutics AG Liposomal vaccine for the treatment of human hematological malignancies
EP1550458A1 (en) 2003-12-23 2005-07-06 Vectron Therapeutics AG Synergistic liposomal adjuvants
WO2005070456A2 (en) 2004-01-09 2005-08-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Diagnosing and treating female reproductive tract or chilhood cancer with pmsa antibodies
EP1756272A2 (en) 2004-01-09 2007-02-28 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compounds, pharmaceutical compositions and therapeutic methods of preventing and treating diseases and disorders associated with amyloid fibril formation
AU2005213464A1 (en) 2004-02-06 2005-08-25 Wyeth Diagnosis and therapeutics for cancer
EP2026071B1 (en) 2004-02-19 2013-07-31 Yale University Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
KR20070007128A (ko) 2004-03-01 2007-01-12 펩테라 파마슈티컬스 엘티디. 카제인 파생 펩타이드들과 그의 치료적 사용들
CA2558767A1 (en) 2004-07-06 2006-01-12 Warwick Effect Polymers Limited Living radical polymerization initiator comprising a functional group capable of reacting with polyeptides or the like, comb polymer obtained therewith, polypeptide conjugates anddrugs obtained therefrom
US7772271B2 (en) 2004-07-14 2010-08-10 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis C
WO2007084413A2 (en) 2004-07-14 2007-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis c
US7553944B2 (en) 2004-07-21 2009-06-30 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
US20080280317A1 (en) 2004-08-27 2008-11-13 Northeastern University Comprehensive Characterization Of Complex Proteins At Trace Levels
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
WO2006027202A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Unite De Recherche En Biotherapie Et Oncologie (Rubio) Generation of multiparent cell hybrids
EP1791544A4 (en) 2004-09-08 2007-09-12 Chelsea Therapeutics Inc CHINAZOLINE DERIVATIVES AS METABOLIC INERT ANTIFOLATE
US8247371B2 (en) 2004-10-14 2012-08-21 Yale University Therapy with Clostridium perfringens enterotoxin to treat ovarian and uterine cancer
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
AU2005323062A1 (en) 2005-01-04 2006-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Sustained delivery of PDGF using self-assembling peptide nanofibers
US7531533B2 (en) 2005-01-27 2009-05-12 Asahi Kasei Pharma Corporation 6-Membered heterocyclic compound and use thereof
JP5014978B2 (ja) 2005-01-27 2012-08-29 旭化成ファーマ株式会社 ヘテロ６員環化合物及びその用途
BRPI0607323B8 (pt) 2005-02-14 2021-05-25 Epitopix Llc composições, usos de polipeptídeos e de anticorpos, bem como kits para a detecção de anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo
EP1859266A4 (en) 2005-02-24 2010-07-28 Cemines Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR CLASSIFYING BIOLOGICAL SAMPLES
CA2601135A1 (en) 2005-03-17 2006-09-28 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of avrainvillamide, stephacidin b, and analogues thereof
EP1861498A4 (en) 2005-03-17 2009-06-24 Ca Nat Research Council EXPRESSION VECTORS FOR TRANSIENT GENETIC EXPRESSION AND MAMMALIAN CELLS EXPRESSING THE SAME
FR2885525B1 (fr) 2005-05-13 2009-09-18 Urodelia Sa Medicament notamment anti-cancereux, destine a des traitements par immunotherapie, en particulier autologue
BRPI0611586A2 (pt) 2005-06-13 2010-09-21 Cleveland Biolabs Inc métodos de proteção contra apoptose mediante uso de lipopeptìdeos
CA2611944A1 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
WO2007002559A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Exelixis, Inc. Pyrazole based lxr modulators
WO2007005249A2 (en) 2005-06-29 2007-01-11 Hyperbranch Medical Technology, Inc. Nanoparticles and dendritic-polymer-based hydrogels comprising them
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7820790B2 (en) 2005-07-13 2010-10-26 Amgen Mountain View Inc. IL-6 binding proteins
EP1904649A2 (en) 2005-07-18 2008-04-02 Epigenomics AG Compositions and methods for cancer diagnostics comprising pan-cancer markers
GB0516058D0 (en) 2005-08-04 2005-09-14 Oxford Genome Sciences Uk Ltd New protein isoforms and uses thereof
GB0517293D0 (en) 2005-08-24 2005-10-05 Cancer Rec Tech Ltd Vectors and uses thereof
EP1931998B1 (en) 2005-09-15 2010-06-09 Alk-Abello A/S A method for quantification of allergens
US7576218B2 (en) 2005-10-11 2009-08-18 Chemocentryx, Inc. 4-phenylpiperdine-pyrazole CCR1 antagonists
CA2620248A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Chromenones and their use as modulators of metabotropic glutamate receptors
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
DK1954274T3 (da) 2005-11-10 2011-01-31 Chemocentryx Inc Substituerede quinoloner og fremgangsmåder til anvendelse
EP1954134B1 (en) 2005-11-23 2011-09-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for synthesizing a 2-phenyl-1h-phenantrho[9,10-d]imidazole derivative
KR101049859B1 (ko) 2007-11-28 2011-07-19 대한민국 Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법
CA2638833A1 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Symphogen A/S Recombinant polyclonal antibody for treatment of respiratory syncytial virus infections
EP2338898A1 (en) 2006-03-09 2011-06-29 The Board of Regents of the University of Texas System Compositions and methods related to profiling a plurality of cell lines based on peptide binding
JP5394074B2 (ja) 2006-03-10 2014-01-22 ワーウィック イフェクト ポリマーズ リミテッド ポリマー
WO2007110755A1 (en) 2006-03-27 2007-10-04 Medical Therapies Limited Prophylaxis or treatment of cardiovascular inflammation
JP5093783B2 (ja) 2006-04-20 2012-12-12 クリングルファーマ株式会社 Ｈｇｆ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質
WO2007131191A2 (en) 2006-05-05 2007-11-15 Perkinelmer Life And Analytical Sciences Mass spectrometry methods for multiplexed quantification of protein kinases and phosphatases
EP2348106B1 (en) 2006-05-08 2014-07-02 Adaerata, Limited Partnership Chimeric proteins, cells comprising same, and assays using same
US20120128661A1 (en) 2006-06-23 2012-05-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotide and polypeptide sequences involved in cancer
WO2007147265A1 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
EP2041556A1 (en) 2006-06-28 2009-04-01 RGB Technologies AB A sensor kit and a system for detecting an analyte in a test environment
US8198046B2 (en) 2006-07-11 2012-06-12 Danisco Us Inc. KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
US20080248959A1 (en) 2006-07-21 2008-10-09 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
WO2008012362A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Oxford Genome Sciences (Uk) Ltd New protein isoforms and uses thereof
WO2008016356A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
CA2660286A1 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
US8314221B2 (en) 2006-09-07 2012-11-20 Laurence Claude Faure Pharmacodiagnostic test targeting oncology and neurodegeneration
WO2008033932A2 (en) 2006-09-13 2008-03-20 The Institutes For Pharmaceutical Discovery, Llc Biarylthiazole carboxylic acid derivatives as protein tyrosine phosphatase-ib inhibitors
WO2008054793A2 (en) 2006-10-30 2008-05-08 Sanrx Pharmaceuticals, Inc. Dipterinyl calcium pentahydrate (dcp) and therapeutic methods based thereon
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
NZ578354A (en) 2006-12-14 2012-01-12 Medarex Inc Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof
CA2672860C (en) 2006-12-28 2013-01-29 Abbott Laboratories Inhibitors of poly(adp-ribose)polymerase
NZ578928A (en) 2007-01-09 2013-03-28 Cleveland Biolabs Inc Methods to increase mobility of hematopoietic stem cells by use of a lipopeptide compound and treatment of associated diseases
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
WO2008124483A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Specigen, Inc. Protein cage immunotherapeutics
WO2009009186A2 (en) 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
US20080306007A1 (en) 2007-04-30 2008-12-11 Newcastle Innovation Limited Agents for prophylaxis or treatment of neurological related diseases and conditions
US20090110662A1 (en) 2007-04-30 2009-04-30 Intezyne Technologies, Inc. Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer
US8143372B2 (en) 2007-05-21 2012-03-27 Children's Hospital & Research Center Oakland Synthetic regulators of ferritin protein nanocage pores and methods of use thereof
US20100093554A1 (en) 2007-06-01 2010-04-15 Keting Chu Methods for identifying biomarkers, autoantibody signatures, and stratifying subject groups using peptide arrays
EP2170886A1 (en) 2007-07-02 2010-04-07 Cancer Research Technology Limited 9h-pyrimido[4,5-b]indoles, 9h-pyrido[4',3':4,5]pyrrolo[2,3-d]pyridines, and 9h-1,3,6,9-tetraaza-fluorenes as chk1 kinase function inhibitors
US9018138B2 (en) 2007-08-16 2015-04-28 The Johns Hopkins University Compositions and methods for generating and screening adenoviral libraries
CN101821289A (zh) 2007-09-07 2010-09-01 西福根有限公司 重组制造抗rsv抗体的方法
EP2197908A2 (en) 2007-09-27 2010-06-23 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
GB0719644D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
CN108196072A (zh) 2007-11-05 2018-06-22 北欧生物科技公司 用于进行cvd风险评估的生物化学标志物
WO2009061681A2 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Amira Pharmaceuticals, Inc Antagonists of pgd2 receptors
EP2071334A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Transmedi SA Compositions and methods of detecting TIABS
US20110165223A1 (en) 2008-01-02 2011-07-07 The Johns Hopkins University Antitumor Immunization by Liposomal Delivery of Vaccine to the Spleen
EP2269070A1 (en) 2008-03-14 2011-01-05 DNAR, Inc Dna repair proteins associated with triple negative breast cancers and methods of use thereof
WO2009114942A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
US8445648B2 (en) 2008-04-30 2013-05-21 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products relating to GSK3β regulation
PT2296629E (pt) 2008-05-09 2014-09-22 Evonik Corp Polímero elastomérico biocompatível e biodegradável
US20110123637A1 (en) 2008-05-26 2011-05-26 Universitat Zurich Protamine/rna nanoparticles for immunostimulation
MX2010014172A (es) 2008-07-03 2011-02-22 Amira Pharmaceuticals Inc Antagonistas de receptores de prostaglandina d2.
US8148088B2 (en) 2008-07-18 2012-04-03 Abgent Regulation of autophagy pathway phosphorylation and uses thereof
CA2730428A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lixte Biotechnology, Inc. Methods for regulating cell mitosis by inhibiting serine/threonine phosphatase
PT2328893E (pt) 2008-08-08 2013-06-27 Synta Pharmaceuticals Corp Compostos de triazol que modulam a actividade da hsp90
WO2010033220A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
MX2011003117A (es) 2008-09-19 2011-04-21 Nektar Therapeutics Conjugados polimericos de peptidos terapeuticos.
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CA3050455A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Adc Therapeutics Sa Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
EP2451844B1 (en) * 2009-07-10 2015-04-22 Innate Pharma Tlr3 binding agents
WO2011017687A1 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Ray Partha S Diagnosis of primary and metastatic basal-like breast cancer and other cancer types
WO2011054112A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1
DK2544680T3 (en) 2010-03-11 2015-04-27 Merrimack Pharmaceuticals Inc USE OF ErbB3 INHIBITORS IN TREATMENT OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER
US20110233107A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Emily Jainine Lockett Personal Cosmetic Palette
SI3173427T1 (sl) * 2011-03-31 2019-08-30 ADC Therapeutics SA, Protitelesa proti antigenu 1, povezanemu z ledvicami, in antigen vezavni fragmenti le-tega
IN2014CN04690A (sr) 2012-01-09 2015-09-18 Alethia Biotherapeutics Inc

Also Published As

Publication number Publication date
DK2691421T3 (en) 2017-02-20
US20210054067A1 (en) 2021-02-25
JP2018075018A (ja) 2018-05-17
US10597450B2 (en) 2020-03-24
BR112013025198A2 (pt) 2018-12-04
US9393302B2 (en) 2016-07-19
IL266452A (en) 2019-06-30
WO2012129668A1 (en) 2012-10-04
HUE045943T2 (hu) 2020-02-28
DK3173427T3 (da) 2019-08-05
SI3173427T1 (sl) 2019-08-30
AU2012234754A1 (en) 2013-10-10
AU2012234754B2 (en) 2016-09-29
EA038979B1 (ru) 2021-11-17
EP2691421A1 (en) 2014-02-05
IL258914A (en) 2018-07-31
IL266452B (en) 2020-10-29
KR20140033014A (ko) 2014-03-17
MX352373B (es) 2017-11-22
CN106146664A (zh) 2016-11-23
KR20190074325A (ko) 2019-06-27
PL3173427T3 (pl) 2019-11-29
US9828426B2 (en) 2017-11-28
CA2829105C (en) 2019-09-24
JP6650432B2 (ja) 2020-02-19
US8937163B2 (en) 2015-01-20
JP2020074785A (ja) 2020-05-21
US20160304605A1 (en) 2016-10-20
US20180291099A1 (en) 2018-10-11
SMT201900505T1 (it) 2019-11-13
EP3173427B1 (en) 2019-06-19
EP3173427A1 (en) 2017-05-31
IL228434A0 (en) 2013-12-31
ES2743913T3 (es) 2020-02-21
CA2888908A1 (en) 2012-10-04
CA2829105A1 (en) 2012-10-04
EP2691421A4 (en) 2014-11-05
EP3511345A1 (en) 2019-07-17
KR102140984B1 (ko) 2020-08-06
US20150209427A1 (en) 2015-07-30
CN103492418B (zh) 2016-06-29
CY1122156T1 (el) 2020-11-25
KR101993259B1 (ko) 2019-06-27
CA2893376A1 (en) 2012-10-04
JP6294221B2 (ja) 2018-03-14
CN103492418A (zh) 2014-01-01
ZA201307027B (en) 2016-08-31
ES2615387T3 (es) 2017-06-06
NZ615694A (en) 2015-01-30
US20140140990A1 (en) 2014-05-22
MX2013011354A (es) 2014-06-11
PT3173427T (pt) 2019-09-17
LT3173427T (lt) 2019-09-10
HRP20191590T1 (hr) 2019-11-29
EA201391423A1 (ru) 2014-06-30
JP2014515600A (ja) 2014-07-03
EP2691421B1 (en) 2016-11-09
CN106146664B (zh) 2021-09-07
IL228434B (en) 2018-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10597450B2 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US9855291B2 (en) Anti-kidney associated antigen 1 (KAAG1) antibodies
RS58918B1 (sr) Agensi za tretman trostruko negativnog raka dojke
HK40011472A (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1238268B (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1238268A1 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1193835B (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1193835A (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
NZ615694B2 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
HK1234432A (en) Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
HK1234432A1 (en) Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen