EA038979B1 - Антитела к ассоциированному с почками антигену 1 и их антигенсвязывающие фрагменты - Google Patents

Антитела к ассоциированному с почками антигену 1 и их антигенсвязывающие фрагменты Download PDF

Info

Publication number
EA038979B1
EA038979B1 EA201391423A EA201391423A EA038979B1 EA 038979 B1 EA038979 B1 EA 038979B1 EA 201391423 A EA201391423 A EA 201391423A EA 201391423 A EA201391423 A EA 201391423A EA 038979 B1 EA038979 B1 EA 038979B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
antigen
binding fragment
variable region
Prior art date
Application number
EA201391423A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391423A1 (ru
Inventor
Жилль Бернар Тремблэ
Анна Н. Морайтис
Трейен Сулеа
Марио Филион
Original Assignee
Адс Терапьютикс Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Адс Терапьютикс Са filed Critical Адс Терапьютикс Са
Publication of EA201391423A1 publication Critical patent/EA201391423A1/ru
Publication of EA038979B1 publication Critical patent/EA038979B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

В данном документе раскрыты новые антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с KAAG1 и которые можно применять при лечении, выявлении и диагностике рака с клетками, экспрессирующими KAAG1. Также раскрыты клетки, экспрессирующие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, а также способы выявления и лечения рака при помощи антител и фрагментов. Типы рака, на которые может оказывать благоприятное воздействие лечение или выявление, включают карциному яичников, рак почек, рак легких, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головного мозга и рак простаты, а также виды меланомы.

Description

Область настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к конкретным антителам или антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с ассоциированным с почками антигеном 1 (KAAG1), и их применению для лечения, выявления и диагностики рака. В частности, рассматривается доставка терапевтического средства к клеткам при помощи данных антител или антигенсвязывающих фрагментов.
Предшествующий уровень техники изобретения
Среди гинекологических злокачественных новообразований карцинома яичников является причиной наиболее высокой смертности, связанной с опухолями, у женщин в Соединенных Штатах (Jemal et al., 2005). Это четвертая основная причина связанной с раком смерти у женщин в США (Menon et al., 2005). В 2005 году Американское онкологическое общество установило в общей сложности 22220 новых случаев, и 16210 смертей было обусловлено данным заболеванием (Bonome et al., 2005). За последние 30 лет статистические данные остались на таком же высоком уровне - большинство женщин, у которых развивается карцинома яичников, умрут от данного заболевания (Chambers and Vanderhyden, 2006). Заболевание характеризуется пожизненным риском 1:70 и коэффициентом смертности >60% (Chambers and Vanderhyden, 2006). Высокий коэффициент смертности является следствием проблем, связанных с ранним определением карциномы яичников, при метастазировании злокачественной опухоли за пределы яичников. Фактически, у >80% пациенток заболевание диагностируют на более поздних стадиях (III или IV стадия) (Bonome et al., 2005). Такие пациентки имеют неблагоприятный прогноз, который отражается в <45% коэффициенте 5-летней выживаемости, несмотря на то, что 80-90% с самого начала реагируют на химиотерапию (Berek et al., 2000). Этот повышенный успех по сравнению с 20% коэффициентом 5-летней выживаемости в более ранние годы по меньшей мере частично обусловлен возможностью оптимально сокращать опухолевую ткань, когда она находится на яичнике, что является значительным прогностическим фактором для карциномы яичников (Bristow R.E., 2000; Brown et al., 2004). У пациенток, у которых диагностировали заболевание на ранней стадии (I стадия), коэффициент 5-летней выживаемости варьирует от >90 (Chambers and Vanderhyden, 2006).
Карцинома яичников включает гетерогенную группу опухолей, которые происходят из поверхностного эпителия яичника или из поверхностных включений. Их классифицируют на серозные, муценозные, эндометриоидные, светлоклеточные типы и по типу Бреннера (переходные) в соответствии с различными типами эпителия в органах женских половых путей (Shin and Kurman, 2005). Среди них серозные опухоли составляют '~60% диагностируемых случаев карциномы яичников. Каждую гистологическую субкатегорию дополнительно разделяют на три группы: доброкачественная, промежуточная (пограничная опухоль или опухоль с низким злокачественным потенциаломЦМР)) и злокачественная, отражающие их клинический характер (Seidman et al., 2002). LMP представляет от 10 до 15% опухолей, диагностированных как серозные, и является загадкой, так как они демонстрируют атипичную структуру ядра и метастатическое поведение, а также они являются в значительной степени менее агрессивными, чем высокодифференцированные серозные опухоли. Коэффициент 5-летней выживаемости пациенток с опухолями LMP составляет 95% в отличие от <45% выживания при прогрессирующем высокодифференцированном заболевании за такой же период (Berek et al., 2000).
В настоящее время диагностику карциномы яичников выполняют, частично, посредством стандартного анализа по истории болезни пациенток и выполнением физических, ультразвуковых и рентгенологических обследований и гематологического скрининга. Описаны две альтернативные методики для раннего гематологического выявления серозных биомаркеров. Один подход представляет собой анализ серологических образцов при помощи масс-спектрометрии для обнаружения белков или фрагментов белков неизвестного типа, который выявляет наличие или отсутствие рака (Mor et al., 2005; Kozak et al., 2003). Однако эта методика является дорогостоящей и не широкодоступной. Кроме того, наличие или отсутствие известных белков/пептидов в сыворотке выявляют с применением микрочипов с антителами, ELISA или других сходных подходов. Серологическое тестирование на белковый биомаркер, называемый СА-125 (раковый антиген - 125), уже давно широко применяют в качестве маркера на карциному яичников. Однако, несмотря на то, что клетки карциномы яичников могут продуцировать избыток таких белковых молекул, существуют некоторые другие виды рака, включая рак фаллопиевой трубы или эндометриальный рак (рак выстилки матки), 60% людей с раком поджелудочной железы и 20-25% людей с другими злокачественными опухолями с повышенным уровнем СА-125. Анализ на СА-125 дает на выходе только истинно положительный результат для приблизительно 50% пациенток с I стадией карциномы яичников и имеет 80% шанс отображения истинно положительных результатов для пациенток с II, III и IV стадией карциномы яичников. Другие 20% пациенток с карциномой яичников не демонстрируют какого-либо повышения концентраций СА-125. Кроме того, тест на повышенный СА-125 может указать на иную доброкачественную активность, не связанную с раком, такую как менструация, беременность или эндометриоз. Следовательно, данный тест имеет очень ограниченное клиническое применение для выявления заболевания на ранней стадии, когда оно все еще поддается лечению, демонстрируя положительную прогностическую значимость (PPV) <10%. Даже с учетом ультразвукового скрининга СА-125, PPV повышается только до около 20% (Kozak et al., 2003). Таким образом, данный тест не является эффективным скрининг-тестом.
- 1 038979
Несмотря на возросшие знания об этиологии заболевания, агрессивное циторедуктивное хирургическое вмешательство и современную комбинированную химиотерапию, произошло лишь небольшое изменение смертности. Неблагоприятные исходы связаны с (1) недостатком надлежащих скринингтестов для выявления заболевания на ранней стадии в сочетании лишь с едва различимым проявлением симптомов на данной стадии - диагноз часто ставят лишь после прогрессирования до более поздних стадий, при которых перитонеальная диссеминация рака ограничивает эффективное лечение, и (2) частым развитием устойчивости к стандартным химиотерапевтическим подходам, что ограничивает повышение коэффициента 5-летней выживаемости пациенток. Изначальная схема химиотерапии для карциномы яичников включает комбинацию карбоплатины (параплатины) и паклитаксела (таксола). Годы клинических испытаний доказали, что данная комбинация является наиболее эффективной после успешного хирургического вмешательства - уменьшает объем опухоли у приблизительно 80% женщин с впервые диагностированной карциномой яичников, и у 40-50% будет полная регрессия - но исследования продолжают поиск путей улучшения ответа у пациенток. Эффективность была повышена благодаря существующим в настоящее время абдоминальным инфузиям химиотерапевтических препаратов для нацеливания на труднодоступные клетки в сочетании с внутривенной доставкой. Тем не менее тяжелые побочные эффекты часто приводят к прерыванию курса лечения. Некоторые другие химиотерапевтические средства включают доксорубицин, циспластин, циклофосфамид, блеомицин, этопозид, винбластин, топотекана гидрохлорид, ифосфамид, 5-фторурацил и мелфалан. Совсем недавно клинические испытания продемонстрировали, что внутрибрюшинное введение циспластина обеспечивает повышение выживаемости по сравнению с системной внутривенной химиотерапией (Cannistra and McGuire, 2007). Отличные коэффициенты выживаемости для женщин с заболеванием на ранней стадии, которые получают химиотерапию, дают серьезные основания для научно-исследовательских работ с целью разработать стратегии улучшения выявления карциномы яичников. Кроме того, открытие новых биомаркеров, связанных с карциномой яичников, приведет к разработке более эффективных терапевтических стратегий с минимальными побочными эффектами для последующего лечения карциномы яичников.
Несмотря на данные последние достижения в понимании и лечении карциномы яичников, применение химиотерапии неизменно связано с тяжелыми нежелательными реакциями, которые ограничивают ее применение. В результате, необходимость в более специфических подходах, таких как сочетание антигенной тканевой специфичности с избирательностью моноклональных антител, должно обеспечить значительное уменьшение побочных эффектов, связанных с нецелевым воздействием. По мере увеличения количества проходящих клинических испытаний начинает обнаруживаться возможность применения моноклональных антител для терапии карциномы яичников (Oei et al., 2008; Nicodemus and berek, 2005). В большинстве из этих испытаний было изучено применение моноклональных антител, конъюгированных с радиоизотопами, такими как иттрий-90, или антител, которые нацеливаются на опухолевые антигены, которые уже идентифицированы у других типов рака. Примером этого является применение бевацизумаба, который нацелен на фактор роста сосудистого эндотелия (Burger, 2007). Существуют очень небольшое количество антигенов, специфических для карциномы яичников, которые на данный момент исследуются в качестве терапевтических целей для моноклональных антител. Некоторые примеры включают применение белка под названием В7-Н4 (Simon et al., 2006) и согласно более поздним данным применение рецептора фолиевой кислоты альфа (Ebel et al., 2007), при этом последний недавно вошел во II фазу клинических испытаний.
Ассоциированный с почками антиген 1 (KAAG1) изначально клонировали из библиотеки кДНК, полученной из линии клеток гипернефромы с антигеном В7 главного комплекса гистосовместимости, в качестве антигенного пептида, презентируемого цитотоксическим Т-лимфоцитам (Van den Eynde et al., 1999; номер доступа в Genebank Q9UBP8, SEQ ID NO: 28; 29). Было обнаружено, что локус, содержащий KAAG,1 кодирует два гена, транскрибируемых на противоположных цепях ДНК. Было обнаружено, что смысловая цепь кодирует транскрипт, который кодирует белок под названием DCDC2. При исследовании экспрессии авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антисмысловой транскрипт KAAG1 был опухоль-специфичным и демонстрировал очень небольшую экспрессию в нормальных тканях, тогда как смысловой транскрипт DCDC2 транскрибируется повсеместно (Van den Eynde et al., 1999). Экспрессия транскрипта KAAG1 при раке, в частности при карциноме яичников, раке почек, раке легких, раке толстой кишки, раке молочной железы и меланоме, раскрыта в опубликованной патентной заявке № РСТ/СА2007/001134 (полное содержание которой включено в данный документ при помощи ссылки). Van den Eynde et al., также наблюдали экспрессию РНК при гипернефромах, колоректальных карциномах, меланомах, саркомах, лейкозах, опухолях головного мозга, опухолях щитовидной железы, карциномах молочной железы, карциномах предстательной железы, карциномах пищевода, опухолях мочевого пузыря, карциномах легких и опухолях головы и шеи. Недавно, в результате исследований неравновесного сцепления было получено убедительное генетическое доказательство, демонстрирующее, что локус VMP/DCDC2/KAAG1 ассоциирован с дислексией (Schumacher et al., 2006; Соре et al., 2005). Одно из этих сообщений было посвящено маркеру DCDC2 в качестве виновника у пациентов с дислексией, поскольку функция этого белка в миграции кортикальных нейронов согласовывалась с симптомами у этих пациентов, у которых часто проявлялись атипичная миграция и созревание нейронов (Schumacher
- 2 038979 et al., 2006).
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к конкретным антителам к KAAG1 и антигенсвязывающим фрагментам и их применению для лечения, выявления и диагностики злокачественного новообразования, содержащего опухолевые клетки, экспрессирующие KAAG1 или вариант KAAG1. Иллюстративные варианты осуществления такого злокачественного новообразования включают, например, карциному яичников, рак кожи, рак почек, колоректальный рак, саркому, лейкоз, рак головного мозга, рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак пищевода, рак мочевого пузыря, рак легких и рак головы и шеи.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть особенно эффективны при воздействии на KAAG1 или вариант KAAG1, экспрессируемый на поверхности опухолевых клеток.
Фактически, антитела и антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения, по-видимому, обладают повышенной способностью связываться с KAAG1-экспрессирующими опухолевыми клетками по сравнению, например, с антителами 3D3 и 3G10, раскрытыми в РСТ/СА2009/001586 (полное содержание которой включено в данный документ при помощи ссылки). Данные антитела и антигенсвязывающие фрагменты также интернализируются и, следовательно, могут быть пригодны для доставки терапевтических средств в опухолевые клетки. Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, позволяют предположить, что антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обладающие необходимыми характеристиками (например, повышенным связыванием и интернализацией), обычно связываются с С-концевым участком KAAG1, ограниченным аминокислотами 61-84. Тем не менее, хотя как антитела 3А4, так и антитела 3G10 связываются с одним и тем же участком, антитело 3А4, по-видимому, связывается с поверхностью опухолевых клеток более эффективно, чем антитело 3G10. В частности, раковые клетки, которые экспрессируют антиген KAAG1, нуждаются в примерно 10-кратно меньшем количестве 3А4 по сравнению с 3G10 в экспериментах с применением проточной цитометрии, подходе, который измеряет непосредственное связывание антител с поверхностью клеток. Кроме того, в экспериментах по связыванию с применением поверхностного плазмонного резонанса было обнаружено, что аффинность 3А4 к KAAG1 составляет менее 10 пмоль, в то время как антитела 3D3 и 3G10 демонстрировали аффинности более 200 нмоль (20-кратно меньшую аффинность). Таким образом, ожидается, что эти увеличения связывающей способности 3А4 перейдут в повышенную терапевтическую активность.
Настоящее изобретение в одном своем аспекте обеспечивает выделенное или практически очищенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который может быть способен к специфическому связыванию с последовательностью, которая идентична по меньшей мере 10 (например, 10-20 или более) последовательным аминокислотам, расположенным между аминокислотами 61-84 KAAG1 (SEQ ID NO: 29).
Настоящее изобретение также обеспечивает выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, способные конкурировать с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, описанным в данном документе.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к конкретным антителами или антигенсвязывающим фрагментам с аминокислотными последовательностями, описанными в данном документе. Такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть в форме моноклональных антител, поликлональных антител, химерных антител, гуманизированных антител и антител человека (выделенных), а также антигенсвязывающих фрагментов, обладающих характеристиками, описанными в данном документе. Также настоящим изобретением охватываются антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пермутации легких и/или тяжелых цепей между моноклональным, химерным, гуманизированным антителом или антителом человека.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения могут, таким образом, содержать аминокислоты человеческих константных участков и/или каркасные аминокислоты антитела человека.
Термин антитело относится к интактному антителу, моноклональным или поликлональным антителам. Термин антитело также охватывает мультиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела. Антитела человека обычно состоят из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит вариабельные участки и константные участки. Вариабельный участок легкой цепи содержит три CDR, обозначенных в данном документе как CDRL1 или L1, CDRL2 или L2 и CDRL3 или L3, фланкированные каркасными участками. Вариабельный участок тяжелой цепи содержит три CDR, обозначенных в данном документе как CDRH1 или Н1, CDRH2 или Н2 и CDRH3 или Н3, фланкированные каркасными участками. CDR гуманизированных антител настоящего изобретения были идентифицированы при помощи определений по Kabat и Chotia (например, CDRH2, изложенный в SEQ ID NO: 56). Однако другие авторы (Abhinandan and Martin, 2008) применили модифицированные подходы, в общих чертах основанные на Kabat и Chotia, что в результате привело к очерчиванию более коротких CDR (например, CDRH2, изложенного в SEQ ID NO: 6).
Термин антигенсвязывающий фрагмент, применяемый в данном документе, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с антигеном (напри
- 3 038979 мер, KAAG1, секретируемой формой KAAG1 или его вариантами). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающий фрагмент антитела, включают (i) Fab фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2 фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, соединенных посредством дисульфидного мостика в шарнирном участке; (iii) Fd фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1;; (iv) Fv фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) dAb фрагмент (Ward et al., (1989), Nature, 341:544546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенный определяющий комплементарность участок (CDR), например, VH CDR3. Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv фрагмента, VL и VH, кодированы раздельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов, при помощи синтетического линкера, который позволяет им быть сконструированными в качестве отдельной полипептидной цепи, в которой пара участков VL и VH соединяются с образованием моновалентных молекул (известных как отдельная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988), Science, 242:423-426 и Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предполагаются как охватываемые термином антигенсвязывающий фрагмент антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают химерные белки иммуноглобулинов со связывающим доменом, содержащие (i) полипептид со связывающим доменом (как, например, вариабельный участок тяжелой цепи, вариабельный участок легкой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи, слитый с вариабельным участком легкой цепи посредством линкерного пептида), который слит с полипептидом с шарнирным участком иммуноглобулина, (ii) константный участок СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитый с шарнирным участком, и (iii) константный участок СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитый с константным участком СН2. Шарнирный участок может быть модифицирован при помощи замены одного или нескольких цистеиновых остатков на сериновые остатки для предупреждения димеризации. Такие химерные белки иммуноглобулина со связывающим доменом дополнительно раскрыты в US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Такие фрагменты антитела получают при помощи общепринятых способов, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела.
Термин гуманизированное антитело охватывает полностью гуманизированное антитело (т.е. каркасы являются 100% гуманизированными) и частично гуманизированное антитело (например, по меньшей мере один вариабельный домен содержит одну или несколько аминокислот из антитела человека, в то время как другие аминокислоты являются аминокислотами антитела, происходящего не от человека). Как правило, гуманизированное антитело содержит CDR антитела, происходящего не от человека (например, мыши, крысы, кролика, низшего примата и т.д.), и каркасы, которые идентичны каркасам естественного антитела человека или консенсусной последовательности антитела человека. В таком случае такие гуманизированные антитела характеризуют как полностью гуманизированные. Гуманизированное антитело может также содержать одну или несколько аминокислотных замен, которые не имеют сходство с заменами у антитела человека или консенсусной последовательности антитела человека. Такие замены включают, например, обратные мутации (например, повторное введение аминокислот, которых нет в антителе человека), которые могут сохранять характеристики антитела (например, аффинность, специфичность и т.д.). Такие замены обычно находятся в каркасном участке. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть константного участка (Fc), который, как правило, является участком из антитела человека. Как правило, константный участок гуманизированного антитела идентичен таковому в антителе человека.
Термин естественное антитело человека относится к антителу, которое кодируется (кодируемое) репертуаром антител человека, т.е. последовательностью зародышевой линии.
Термин химерное антитело относится к антителу с вариабельным(и) участком(ами), происходящему не от человека, и константным участком человека.
Термин гибридное антитело относится к антителу, содержащему один его вариабельный участок тяжелой или легкой цепи (его тяжелую или легкую цепь) от определенных типов антитела (например, гуманизированного), в то время как другой вариабельный участок легкой или тяжелой цепи (тяжелая или легкая цепь) происходит от другого типа (например, мышиный, химерный).
В некоторых вариантах осуществления каркасный участок тяжелой цепи и/или легкой цепи гуманизированного антитела может содержать от 1 до 30 аминокислот из антитела, происходящего не от человека, которое стремятся гуманизировать, и оставшуюся часть, происходящую от естественного антитела человека или консенсусной последовательности антитела человека. В некоторых случаях гуманизированное антитело может содержать от одного до шести CDR, происходящих не от человека, и часто шесть CDR являются происходящими не от человека.
Естественное антитело человека, выбранное для гуманизации антитела, происходящего не от человека, может содержать вариабельный участок с трехмерной структурой, подобной структуре (совпадающей при наложении) (моделированного) вариабельного участка антитела, происходящего не от человека. В связи с этим гуманизированное антитело имеет больший шанс иметь трехмерную структуру, подобную структуре антитела, происходящего не от человека.
- 4 038979
Вариабельный участок легкой цепи естественного антитела человека, выбранного с целью гуманизации, может иметь, например, в целом (по всему вариабельному участку легкой цепи) по меньшей мере 70, 75, 80% и т.д. идентичности с таковым антителом, происходящим не от человека. Кроме того, каркасный участок легкой цепи естественного антитела человека, выбранного с целью гуманизации, может иметь, например, по меньшей мере 70, 75, 80, 85% и т.д. идентичности последовательности с каркасным участком легкой цепи антитела, происходящего не от человека. В некоторых вариантах осуществления естественное антитело человека, выбранное с целью гуманизации, может иметь такое же или практически такое же число аминокислот в его определяющем комплементарность участке легкой цепи по сравнению с таковым в определяющем комплементарность участке легкой цепи антитела, происходящего не от человека.
Вариабельный участок тяжелой цепи естественного антитела человека, выбранного с целью гуманизации, может иметь, например, в целом (по всему вариабельному участку тяжелой цепи) по меньшей мере 60, 70, 75, 80% и т.д. идентичности с таковым антителом, происходящим не от человека. Также, в соответствии с настоящим изобретением аминокислотные остатки каркасного участка, происходящего от человека, тяжелой цепи гуманизированного антитела могут происходить от каркасного участка тяжелой цепи естественного антитела человека, обладающего по меньшей мере 70, 75, 89% и т.п. идентичностью с каркасным участком тяжелой цепи антитела, происходящего не от человека. В некоторых вариантах осуществления естественное антитело человека, выбранное с целью гуманизации, может иметь такое же или практически такое же число аминокислот в его определяющем комплементарность участке тяжелой цепи по сравнению с таковым определяющим комплементарность участком тяжелой цепи антитела, происходящего не от человека.
Естественное антитело человека, которое выбирают для гуманизации антитела, происходящего не от человека, может содержать вариабельный участок с трехмерной структурой подобной структуре (совпадающей при наложении) (моделированного) вариабельного участка антитела, происходящего не от человека. В связи с этим гуманизированное или гибридное антитело имеет больший шанс иметь трехмерную структуру, подобную структуре антитела, происходящего не от человека.
Например, вариабельный участок тяжелой цепи естественного антитела человека, который может быть выбран с целью гуманизации, может иметь следующие характеристики: а) трехмерную структуру, подобную или идентичную (совпадающую при наложении) таковой тяжелой цепи антитела, происходящего не от человека, и/или b) каркасный участок с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 70% идентична каркасному участку тяжелой цепи антитела, происходящего не от человека. Необязательно, аминокислотные остатки (их число) CDR тяжелой цепи (например, все три CDR) являются такими же или практически такими же, как и аминокислотные остатки (их число) CDR тяжелой цепи, происходящей не от человека.
Альтернативно, вариабельный участок легкой цепи естественного антитела человека, который может быть выбран с целью гуманизации, может иметь следующие характеристики: а) трехмерную структуру, подобную или идентичную (совпадающую при наложении) таковой легкой цепи антитела, происходящего не от человека, и/или b) каркасный участок с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 70% идентична с каркасным участком легкой цепи антитела, происходящего не от человека. Необязательно, аминокислотные остатки (их число) CDR легкой цепи (например, все три CDR) являются такими же или практически такими же, как и аминокислотные остатки (их число) CDR легкой цепи, происходящей не от человека.
Обычный сайт связывания антигена находится в составе вариабельных участков, сформированных путем спаривания иммуноглобулина легкой цепи и иммуноглобулина тяжелой цепи. Структура вариабельных участков антитела является очень устойчивой и демонстрирует очень сходные структуры. Такие вариабельные участки обычно содержат сравнительно гомологичные каркасные участки (FR), прерываемые тремя гипервариабельными участками, называемыми определяющие комплементарность участки (CDR). Общая связывающая активность антигенсвязывающего фрагмента часто обусловливается последовательностью CDR. FR часто играют некоторую роль в точном моделировании и выравнивании CDR по трем измерениям для оптимального связывания антигена.
Антитела и/или антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения могут происходить, например, от мыши, крысы или другого млекопитающего или от других источников, как, например, получаемые посредством методик рекомбинантной ДНК.
Дополнительный объем, применимость и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из неограничивающего подробного описания, приведенного ниже. Следует понимать, однако, что такое подробное описание, несмотря на то, что приводит иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения, приведено только в качестве примера, со ссылкой на сопровождающие графические материалы.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты ELISA, в котором сравнивают связывание химерного антитела 3А4 к KAAG1 с контрольным антителом при инкубировании с повышающимися концентрациями рекомбинантного KAAG1 человека. Кривая связывания 3А4 показана при помощи линии, окрашенной в более
- 5 038979 светлый цвет.
На фиг. 2 показана гистограмма, которая описывает результаты анализов ELISA для картирования специфичности эпитопа антитела 3А4 к KAAG1. Результаты показали, что 3А4 взаимодействовал с последовательностью аминокислот, содержащейся на карбоксильном конце KAAG1 между аминокислотами 61-84. Связывание 3А4 сравнили с 3С4, 3D3 и 3G10 антителами к KAAG1, которые, как было известно, взаимодействуют с участками 1-35, 36-60 и 61-84 KAAG1 соответственно.
На фиг. 3А показаны результаты проточной цитометрии, осуществленной на клетках SKOV-3 и TOV-21G карциномы яичника с антителом 3А4 к KAAG1 (более темная линия) по сравнению с контрольным IgG (более светлая линия).
На фиг. 3В показаны результаты проточной цитометрии, осуществленной на клетках 293Е почки человека с антителом 3А4 к KAAG1 (более темная линия) по сравнению с контрольным IgG (более светлая линия).
На фиг. 4 представлено выявление антигена KAAG1 на поверхности клеток SKOV-3 при помощи проточной цитометрии с антителом 3А4 к KAAG1. Флуоресцентный сигнал снижается со временем при инкубировании клеток при 37°С, что свидетельствует о том, что комплекс KAAG1/антитело интернализировался в ходе инкубирования при инкубации клеток с 3А4.
На фиг. 5 показана интернализация антитела 3А4 к KAAG1 и его совместная локализация с LAMP1, белком, ассоциированным с эндосомальными и лизосомальными мембранами.
На фиг. 6А и 6В графически отображены результаты анализа FACS опухолевых клеток, на которые воздействовали различными антителами к KAAG1.
На фиг. 7 схематически представлены две возможные модели ориентации KAAG1 в клеточной мембране.
На фиг. 8 представлена молекулярная модель (ленточная схема) мышиного вариабельного домена 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 у легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 у тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым.
На фиг. 9A показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh1Hh1 (т.е. гуманизированной легкой цепи 1 и гуманизированной тяжелой цепи 1) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 у легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 у тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh1 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 1, а Hh1 обозначал тяжелую цепь варианта 1.
На фиг. 9B показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh1Hh2 (т.е. гуманизированной легкой цепи 1 и гуманизированной тяжелой цепи 2) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh1 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 1, а Hh2 обозначал тяжелую цепь варианта 2.
На фиг. 9С показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh1Hh3 (т.е. гуманизированной легкой цепи 1 и гуманизированной тяжелой цепи 3) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh1 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 1, а Hh3 обозначал тяжелую цепь варианта 3.
На фиг. 9D показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh1Hh4 (т.е. гуманизированной легкой цепи 1 и гуманизированной тяжелой цепи 4) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 у легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 у тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh1 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 1, а Hh4 обозначал тяжелую цепь варианта 4.
На фиг. 9Е показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh2Hh1 (т.е. гуманизированной легкой цепи 2 и гуманизированной тяжелой цепи 1) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh2 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 2, а Hh1 обозначал тяжелую цепь варианта 1.
На фиг. 9F показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh2Hh2 (т.е. гуманизированной легкой цепи 2 и гуманизированной тяжелой цепи 2) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh2 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 2, а Hh2 обозначал тяжелую цепь варианта 2.
На фиг. 9G показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh2Hh3 (т.е. гуманизиро- 6 038979 ванной легкой цепи 2 и гуманизированной тяжелой цепи 3) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh2 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта
2, а Hh3 обозначал тяжелую цепь варианта 3.
На фиг. 9H показаны молекулярные модели гуманизированного антитела Lh2Hh4 (т.е. гуманизированной легкой цепи 2 и гуманизированной тяжелой цепи 4) вариабельных доменов 3А4. Петли CDR окрашены в черный и обозначены L1, L2 и L3 в легкой цепи и Н1, Н2 и Н3 в тяжелой цепи. Каркасный участок показан серым. Боковые цепи остатков, мутировавших из мышиного каркаса в человеческий каркас, представлены в виде шаростержневой модели. Lh2 обозначал гуманизированную легкую цепь варианта 2, а Hh4 обозначал тяжелую цепь варианта 4.
На фиг. 10А показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных доменов 3А4 мышиных и гуманизированных легких цепей. Легкая цепь имеет два гуманизированные варианта (Lh1 и Lh2). CDR показаны жирным и обозначены CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Обратные мутации в каркасных участках человека, которые являются мышиными аминокислотами, представлены подчеркнутыми для гуманизированых последовательностей.
На фиг. 10B показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных доменов 3А4 мышиных и гуманизированных тяжелых цепей. Тяжелая цепь имеет четыре гуманизированных варианта (Hh1-Hh4). CDR показаны жирным и обозначены CDRH1, CDRH2 и CDRH3. Обратные мутации в каркасных участках человека, которые являются мышиными аминокислотами, представлены подчеркнутыми для гуманизированных последовательностей.
На фиг. 11А показано выравнивание вариабельного участка легкой цепи 3А4 мыши (SEQ ID NO: 4) с вариантом вариабельного участка легкой цепи (SEQ ID NO: 33) при помощи программы ClustalW2 (Larkin M.A., et al. (2007), ClustalW и ClustalX версия 2. Bioinformatics, 2007, 23(21):2947-2948), в которой * (звездочка) указывает на положения, которые имеют отдельный, полностью сохраненный остаток, где : (двоеточие) указывает на консервативность между группами с сильно схожими свойствами - подсчет >0,5 по матрице Gonnet РАМ 250 и где . (точка) обозначает консервативность между группами с мало схожими свойствами - подсчет >0,5 по матрице Gonnet РАМ 250.
На фиг. 11В показано выравнивание вариабельного участка тяжелой цепи 3А4 мыши (SEQ ID NO: 2) с вариантом вариабельного участка легкой цепи (SEQ ID NO: 38) при помощи программы ClustalW2 (Larkin M.A., et al. (2007), ClustalW и ClustalX версия 2. Bioinformatics, 2007, 23(21):29472948), в которой * (звездочка) указывает на положения, которые имеют отдельный, полностью сохраненный остаток, где : (двоеточие) указывает на консервативность между группами с сильно схожими свойствами - подсчет >0,5 по матрице Gonnet РАМ 250 и где . (точка) обозначает консервативность между группами с мало схожими свойствами - подсчет >0,5 по матрице Gonnet РАМ 250.
На фиг. 12А представлена карта плазмиды pKCR5-3A4-HC-Variant 1. Тяжелые цепи гуманизированных вариантов 3А4 клонировали таким же образом в сайт Hind III pK-CR5. Следовательно, полученные в результате плазмиды идентичны pKCR5-3A4-HC-Variant 1, за исключением последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина.
На фиг. 12B представлена карта плазмиды pMPG-CR5-3A4-LC-Variant 1. Легкие цепи гуманизированных вариантов 1 и 2 антитела 3А4 клонировали таким же способом в сайт BamHI pMPG-CR5. Следовательно, полученная в результате плазмида идентична pMPG-CR5-3A4-LC-Variant 1, за исключением последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина.
На фиг. 13 представлен анализ получения антитела после временной трансфекции в клетках СНО. Супернатант (13 дней после трансфекции) клеток СНОсТА, трансфицированных различными комбинациями легких или тяжелых цепей гуманизированного антитела 3А4, проанализировали при помощи вестерн-блоттинга. Количественный анализ антитела, полученного в супернатантах, определили после сканирования бэндов вестерн-блоттинга против разбавления известного стандарта (очищенного антитела IgG человека). Mr маркер молекулярного веса (кДа).
На фиг. 14 представлено графическое отображение результатов гель-фильтрации в Superdex G75 образца рекомбинантного KAAG1. KAAG1 ввели в ходе гель-фильтрации и разделили при 0,4 мл/мин. Наивысший пик между фракциями 15-19.
На фиг. 15 представлена таблица, в которой перечислены константы скорости и аффинности для мышиных и гуманизированных вариантов антитела 3А4.
На фиг. 16А изображена гистограмма, иллюстрирующая скорости ассоциаций (Ka) гуманизированных антител.
На фиг. 16В изображена гистограмма, иллюстрирующая скорости диссоциации (Kd) гуманизированных антител.
На фиг. 16С изображена гистограмма, иллюстрирующая аффинные константы (KD) гуманизированных антител.
На фиг. 17А проиллюстрировано связывание вариантов гуманизированного 3А4 с KAAG1 в ELISA.
- 7 038979
Эта фигура демонстрирует сравнительное связывание вариантов гуманизированного антитела 3А4 и мышиного 3А4. Графики связывания в зависимости от концентрации гуманизированных тяжелых цепей (Hh1, Hh2, Hh3 и Hh4), объединенных с вариантом легкой цепи Lh1.
На фиг. 17B проиллюстрировано связывание вариантов гуманизированного 3А4 с KAAG1 в ELISA. На данной фигуре продемонстрировано сравнительное связывание вариантов гуманизированного антитела 3А4 и мышиного 3А4. Графики связывания в зависимости от концентрации гуманизированных тяжелых цепей (Hh1, Hh2, Hh3 и Hh4), объединенных с вариантом легкой цепи Lh2.
На фиг. 18 проиллюстрировано связывание вариантов гуманизированного 3А4 с KAAG1 на поверхности раковых клеток. На данной иллюстрации продемонстрирована сравнительная связывающая активность гуманизированных и мышиных антител 3А4 на непермеабилизированных клетках карциномы яичника SKOV-3.
Подробное описание изобретения
Экспрессия и биологическая активность KAAG1 в раковых клетках.
Настоящее изобретение относится к применению антител для нацеливания на опухоли, обнаруживаемые при различных типах рака, в частности карциноме яичников. Для того чтобы направить антитела к опухолям, нужно осуществить определение опухолеспецифических антигенов, которые экспрессируются на клеточной поверхности раковых клеток. Существует несколько методик, которые доступны для определения опухолеспецифических антигенов, и способ, который применяли для определения KAAG1 в опухолях яичников, новаторская платформа для обнаружения, называемая субтрактивной транскрипционной амплификацией мРНК (STAR), описана в публикации патентной заявки № РСТ/СА2007/001134, опубликованной под № WO/2007/147265 27 декабря 2007 г.
Анализ STAR-библиотек карциномы яичников дал множество генов, которые кодируют секретируемые белки и клеточно-поверхностные белки. Один из них, называемый АВ-0447, содержал открытую рамку считывания, которая кодировала полипептид из 84 аминокислот, соответствующий SEQ ID NO: 29, который закодировали с помощью кДНК из 885 пар оснований с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 28. При поиске общедоступных баз данных выявили, что нуклеотидная последовательность АВ-0447 была идентична последовательности гена, называемого KAAG1. Биоинформационный анализ дал прогноз в отношении белка, заякоренного в мембране, у которого его функциональный домен выставлен во внеклеточное пространство. KAAG1 изначально клонировали из библиотеки клеток рака почки в качестве антигена клеточной поверхности, результат, который подтверждает его мембранную локализацию. Дополнительно, исследование авторов настоящего изобретения показало, что белок был процессирован на своем аминоконце, результат, который указывал на расщепление функционального сигнального пептида по 30 и 34 аминокислоте или между ними. Кроме того, временная экспрессия полноразмерной кДНК приводила к выявлению расщепленного KAAG1 в культуральной среде. Данное последнее обнаружение указывало на то, что данный белок, заякоренный в мембране, может быть выброшен из клеток при его высоких уровнях экспрессии. В отличие от этого, экспрессия укороченного по аминоконцу мутанта KAAG1 приводила к удерживанию белка внутри клетки. В настоящее время не существуют опубликованных данных, которые проливали бы какой-либо свет на его функцию, и никогда ранее не сообщалось о сверхэкспрессии KAAG1 при карциноме яичников, как раскрыто настоящим изобретением.
Авторы настоящего изобретения, таким образом, исследовали, можно ли KAAG1 применять для диагностики и терапии на основе антител.
Было построено несколько моделей, основанных на клетках карциномы яичников, как, например, TOV-21G, TOV-112D, OV-90 и другие, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Такие клетки являются частью коллекции линий клеток карциномы яичников, полученных от пациенток с опухолями яичников или из жидкости асцитов. Такие линии клеток были подвергнуты детальному анализу, включая общие наборы экспрессирующихся генов на микрочипах, что делает их отличными клеточными моделями для карциномы яичников человека. Свойства роста, наборы экспрессирующихся генов и реакция на химиотерапевтические лекарственные средства указали на то, что такие линии клеток являются очень показательными относительно поведения in vivo опухоли яичников (BenoTt et al., 2007). RT-PCR анализ общей РНК, выделенной из таких линий клеток карциномы яичников, показал, что транскрипт KAAG1 слабо экспрессировался в линиях клеток, полученных от первичных опухолей. В отличие от этого, линии клеток, полученные из асцитической жидкости, имели высокие уровни экспрессии KAAG1. Повышенная экспрессия KAAG1 в клетках из асцитической жидкости свидетельствовала о том, что окружающая среда клеток влияет на регуляцию гена KAAG1. Асцитные клетки, ассоциированные с прогрессирующим заболеванием, и такой паттерн экспрессии означают, что повышенные уровни KAAG1 ассоциированы с безъякорным ростом клеток. В соответствии с этим последним обстоятельством было обнаружено, что экспрессия KAAG1 значительно повышается в линиях клеток, полученных от первичных опухолей, когда такие клетки были культивированы как сфероиды в 3D-культурах. Такие сфероиды были подробно охарактеризованы и, как было обнаружено, отражают многие связанные с опухолями свойства in vivo (Cody et al., 2008). Таким образом, было обнаружено, что экспрессия KAAG1 значительно повышалась в моделях, которые имитируют развитие опухоли, в частности в ходе развития
- 8 038979 карциномы яичников.
При помощи демонстрации того, что экспрессия KAAG1 регулируется в клетках карциномы яичника, функцию этого гена в поведении клеток карциномы яичника исследовали в клеточном анализе. Для такого эффекта применили РНК-интерференцию (RNAi) для нокаутирования экспрессии эндогенного гена KAAG1 в линиях клеток карциномы яичников и обнаружили, что пониженная экспрессия KAAG1 приводит к значительному уменьшению миграции клеток, как определено в стандартном анализе на подвижность клеток, на примере анализа заживления раны (или царапины). Такой тип анализа позволяет измерить скорость, с которой клетки заполняют обнаженный участок в слившийся монослой. Пониженная экспрессия KAAG1 приводит к уменьшению выживаемости линий клеток карциномы яичника, которую измеряли при помощи оценки клоногенности, как, например, анализом выживаемости колонии. Специалисты в данной области техники могут применять другие способы для оценки необходимости KAAG1 в поведении раковых клеток, в частности, клеток карциномы яичника.
Исходя из экспрессии KAAG1 в большой части опухолей яичников, его ограниченной экспрессии в нормальных тканях, и соответствия между уровнями экспрессии и повышенной злокачественностью, и предполагаемой биологической роли KAAG1 в поведении линий клеток карциномы яичников, KAAG1 выбрали в качестве терапевтической мишени для разработки антител для выявления, предупреждения и лечения карциномы яичников. Экспрессия KAAG1 при видах рака, отличных от карциномы яичников, также подтолкнула заявителя к оценке терапевтических или диагностических антител для определений другого вида рака.
Настоящее изобретение, вследствие этого, обеспечивает антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически нацеливаются на KAAG1 и которые можно применять, например, в качестве конъюгата антитела-лекарственного средства.
Такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты включают, например, моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, фрагменты антител, одноцепочечные антитела, доменные антитела и полипептиды с антигенсвязывающим участком.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с KAAG1.
Антитела изначально были выделены из Fab-библиотек по их специфичности к представляющему интерес антигену.
Вариабельные участки антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанные в данном документе, можно слить с константными участками необходимых видов, таким образом делая возможным узнавание антитела эффекторными клетками необходимых видов. Константный участок может иметь происхождение, например, от подтипа lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4. Клонирование или синтез константного участка в рамке с вариабельным участком хорошо известны специалисту в данной области и могут быть осуществлены, например, при помощи методики рекомбинантной ДНК. Таким образом, антитела, содержащие константный участок антитела человека, а также антитела или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие каркасные аминокислоты антитела человека, также охватываются настоящим изобретением.
Настоящее изобретение, таким образом, предлагает в иллюстративном варианте осуществления выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок легкой цепи с:
a) последовательностью CDRL1, содержащей SEQ ID NO: 8 или изложенной в SEQ ID NO: 8;
b) последовательностью CDRL2, содержащей SEQ ID NO: 9 или изложенной в SEQ ID NO: 9; или
c) последовательностью CDRL3, содержащей SEQ ID NO: 10 или изложенной в SEQ ID NO:: 10.
Выделенное антитело и антигенсвязывающий фрагмент может также содержать вариабельный участок тяжелой цепи с:
a) последовательностью CDRH1, содержащей SEQ ID NO: 5 или изложенной в SEQ ID NO: 5;
b) последовательностью CDRH2, содержащей SEQ ID NO: 6 или изложенной в SEQ ID NO: 6; или
c) последовательностью CDRH3, содержащей SEQ ID NO: 7 или изложенной в SEQ ID NO: 7.
В иллюстративном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать любой отдельный CDR или комбинацию из CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельного участка легкой цепи. CDR3 может быть выбран конкретнее. Комбинация может включать, например, CDRL1 и CDRL3; CDRL1 и CDRL2; CDRL2 и CDRL3 и CDRL1, CDRL2 и CDRL3.
В другом иллюстративном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать любой отдельный CDR или комбинацию из CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи. CDR3 может быть выбран конкретнее. Комбинация может включать, например, CDRH1 и CDRH3; CDRH1 и CDRH2; CDRH2 и CDRH3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3.
В соответствии с настоящим изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать по меньшей мере два CDR из CDRL1, CDRL2 или CDRL3.
Также в соответствии с настоящим изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать один CDRL1, один CDRL2 и один CDRL3.
Дополнительно, в соответствии с настоящим изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать:
- 9 038979
а) по меньшей мере два CDR из CDRL1, CDRL2 или CDRL3 и
b) по меньшей мере два CDR из CDRH1, одного CDRH2 или одного CDRH3.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут более предпочтительно содержать один
CDRL1, один CDRL2 и один CDRL3.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут более предпочтительно содержать один CDRH1, один CDRH2 и один CDRH3.
В соответствии с настоящим изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать один CDRH1, один CDRH2 и один CDRH3.
В соответствии с настоящим изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать один CDRH1, один CDRH2 или один CDRH3.
В тех случаях, когда доступен только один из вариабельного участка легкой цепи или вариабельного участка тяжелой цепи, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно восстановить при помощи скрининга библиотеки комплементарных вариабельных участков с помощью способов, известных в данной области техники (Portolano et al. The Journal of Immunology (1993), 150:880-887, Clarkson et al., Nature (1991), 352:624-628).
Также настоящим изобретением охватываются полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой по меньшей мере в одном из описанных в данном документе CDR (по сравнению с исходными CDR).
Настоящее изобретение также охватывает полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой по меньшей мере в двух из CDR (по сравнению с исходными CDR).
Настоящее изобретение также охватывает полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой в трех CDR (по сравнению с исходными CDR).
Настоящее изобретение также охватывает полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с двумя консервативными аминокислотными заменами по меньшей мере в одном из CDR (по сравнению с исходными CDR).
Настоящее изобретение также охватывает полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с двумя консервативными аминокислотными заменами по меньшей мере в двух из CDR (по сравнению с исходными CDR).
Настоящее изобретение также охватывает полипептиды или антитела, содержащие вариабельные цепи по меньшей мере с двумя консервативными аминокислотными заменами по меньшей мере в трех CDR (по сравнению с исходными CDR).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, антителу или антигенсвязывающему фрагменту, содержащему (на одной полипептидной цепи или на раздельных полипептидных цепях) по меньшей мере один определяющий комплементарность участок вариабельного участка легкой цепи и по меньшей мере один определяющий комплементарность участок вариабельного участка тяжелой цепи одного из антител или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе.
Настоящее изобретение относится в другом аспекте к антителам к KAAG1, которые могут содержать (на одной полипептидной цепи или на раздельных полипептидных цепях) все шесть определяющих комплементарность участков (CDR) антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе.
Вариантное антитело и антигенсвязывающие фрагменты.
Настоящее изобретение также охватывает варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе. Включенные вариантные антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой такие, которые имеют вариацию в аминокислотной последовательности. Например, включенные вариантные антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере один вариантный CDR (два, три, четыре, пять или шесть вариантных CDR или даже двенадцать вариантных CDR), вариабельный участок вариантной легкой цепи, вариабельный участок вариантной тяжелой цепи, вариантную легкую цепь и/или вариантную тяжелую цепь. Вариантные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, включенные в настоящее изобретение, являются такими, которые имеют, например, подобную или повышенную связывающую способность по сравнению с исходным антителом или антигенсвязывающим фрагментом.
Как используется в данном документе, термин вариантный применяют к любой последовательности, описанной в данном документе, и он включает, например, вариантный CDR (или CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3), вариабельный участок вариантной легкой цепи, вариабельный участок вариантной тяжелой цепи, вариантную легкую цепь, вариантную тяжелую цепь, вариантное антитело, вариантный антигенсвязывающий фрагмент и вариант KAAG1.
Вариантные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, охватываемые настоящим изобретением, представляют собой такие, которые могут содержать вставку, делецию или аминокислотную замену (консервативную или не консервативную). Такие варианты могут иметь по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в своей аминокислотной последовательности и другой остаток, вставлен- 10 038979 ный на его место.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения могут иметь вариабельный участок легкой цепи и/или вариабельный участок тяжелой цепи, как описывалось выше, и могут дополнительно содержать аминокислоты константного участка, такие как, например, аминокислоты константного участка человеческого антитела.
В иллюстративном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения могут содержать, например, константный участок lgG1 человека.
В соответствии с другим иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающим фрагментом может быть, например, scFv, Fab, Fab' или (Fab')2.
Представляющий интерес сайт для замещающего мутагенеза включает гипервариабельные участки (CDR), но также предполагаются модификации в каркасном участке или даже в константном участке. Консервативные замены могут быть осуществлены при помощи обмена аминокислоты (из CDR, вариабельной цепи, антитела и т.д.) из одной из перечисленных ниже групп (группа 1-6) на другую аминокислоту аналогичной группы.
Другие иллюстративные варианты осуществления консервативных замен показаны в табл. 1А под заголовком Предпочтительные замены. Если такие замены в результате дают нежелательное свойство, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные иллюстративные замены в табл. 1А или которые дополнительно описаны ниже по отношению к классам аминокислот, а продукты подвергнуты скринингу.
В данной области техники известно, что варианты могут быть получены замещающим мутагенезом, и они сохраняют биологическую активность полипептидов настоящего изобретения. Такие варианты имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в своей аминокислотной последовательности и другой остаток, вставленный на его место. Например, один представляющий интерес сайт для замещающего мутагенеза может включать сайт, в котором определенные остатки, получены из различных видов, являются идентичными. Примеры замен, обозначенных как консервативные замены, показаны в табл. 1А. Если такие замены в результате дают нежелательное изменение, то вводят другой тип замен, обозначенных как Иллюстративные замены в табл. 1А или которые дополнительно описаны в данном документе по отношению к классам аминокислот, а продукты подвергнуты скринингу.
Существенные модификации в функции или иммунологической идентичности выполняют путем выбора замен, которые значительно отличаются по их эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного скелета в области замены, например, в виде конформации пласта или спирали; (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (с) основной части боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки разделены на группы на основе общих свойств боковых цепей:
(группа 1) гидрофобные: норлейцин, метионин (Met), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile);
(группа 2) нейтральные гидрофильные: цистеин (Cys), серин (Ser), треонин (Thr);
(группа 3) кислые: аспаргиновая кислота (Asp), глютаминовая кислота (Glu);
(г руппа 4) основные: аспаргин (Asn), глютамин (Gln), гистидин (His), лизин (Lys), аргинин (Arg);
(группа 5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: глицин (Gly), пролин (Pro); и (группа 6) ароматические: триптофан (Trp), тирозин (Tyr), фенилаланин (Phe).
Неконсервативные замены повлекут обмен члена одного из таких классов на другой.
- 11 038979
Таблица 1А
Аминокислотная замена
Исходный остаток Иллюстративная замена Консервативная замена
Ala (А) Vai, Leu, lie Vai
Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys
Asn(N) Gin, His, Lys, Arg, Asp Gin
Asp (D) Glu, Asn Glu
Cys (С) Ser, Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp, Gin Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn, Gin, Lys, Arg, Arg
He (1) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, норлейцин Leu
Leu (L) Норлейцин, lie, Vai, Met, Ala, Phe lie
Lys (K) Arg, Gin, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, lie Leu
Phe (F) Leu, Vai, lie, Ala, Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr, Phe Tyr
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Vai (V) He, Leu, Met, Phe, Ala, норлейцин Leu
Вариантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь существенное аминокислотное сходство и/или идентичность последовательности в своей аминокислотной последовательности по сравнению с таковой аминокислотной последовательности исходного антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Степень сходства между двумя последовательностями основана на доле идентичностей (идентичных аминокислот) и консервативной замены.
Как правило, степень сходства и идентичности между вариабельными цепями определяли в данном документе при помощи программы для последовательностей Blast2 (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) при помощи настроек по умолчанию, т.е. программы blastp, матрицы BLOSUM62 (штраф за открытие гэпа 11 и штраф за удлинение гэпа 1; предельная длина гэпа 50, порог 10,0, размер слова 3) и активированных фильтров.
Процентная идентичность будет, таким образом, свидетельствовать об аминокислотах, которые идентичны по сравнению с исходным пептидом и которые могут занимать такое же или сходное положение.
Процентное сходство будет свидетельствовать об аминокислотах, которые идентичны, и аминокислотах, которые заменены консервативной аминокислотной заменой по сравнению с исходным пептидом в таком же или сходном положении.
Варианты настоящего изобретения, таким образом, содержат такие, которые могут иметь по меньшей мере 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере 81% идентичность последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Другие иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере 82% идентичность последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Дополнительно, иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Другие иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые
- 12 038979 имеют по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Дополнительные иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
Другие дополнительные иллюстративные варианты осуществления вариантов представляют собой такие, которые имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с последовательностью, описанной в данном документе, и 97, 98, 99 или 100% сходство последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности.
В целях краткости заявитель приводит в данном документе табл. 1В, показывающую иллюстративные варианты осуществления отдельных вариантов, охватываемых настоящим изобретением и включающих указанный % идентичности последовательности и % сходства последовательности. Каждый X следует истолковывать как обозначающий заданный вариант.
Таблица 1B
Настоящее изобретение охватывает CDR, вариабельные участки легкой цепи, вариабельные участки тяжелой цепи, легкие цепи, тяжелые цепи, антитела и/или антигенсвязывающие фрагменты, которые имеют по меньшей мере 80% идентичность с последовательностью, описанной в данном документе.
Иллюстративные варианты осуществления антитела или антигенсвязывающего фрагмента настоящего изобретения представляют собой такие, которые содержат вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80% идентичную SEQ ID NO: 4.
Такой вариабельный участок легкой цепи может содержать последовательность CDRL1, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 8, последовательность CDRL2, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 9, и последовательность CDRL3 по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 10.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL1, которая может быть по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 8.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL1, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 8.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL2, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 9.
В еще другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL2, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 9.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL3, которая может быть по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 10.
В дополнительном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRL3, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 10.
- 13 038979
В иллюстративном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80% идентичную SEQ ID NO: 2.
Такие вариабельные участки тяжелой цепи могут содержать последовательность CDRH1, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 5, последовательность CDRH2, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 6, и последовательность CDRH3, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 7.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH1, которая может быть по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 5.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH1, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 5.
В еще другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH2, которая может быть по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 6.
В дополнительном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH2, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 6.
В еще дополнительном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH3, которая может быть по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 7.
В дополнительном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения любое из приведенных в данном документе антител может содержать последовательность CDRH3, которая может быть на 100% идентична SEQ ID NO: 7.
В отдельных случаях вариабельный участок тяжелой цепи вариантного антитела может содержать аминокислотные делеции или присоединения (в сочетании с аминокислотными заменами или без них). Зачастую, могут быть допустимы 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных делеций или присоединений.
Иллюстративные варианты осуществления вариантного антитела или антигенсвязывающих фрагментов включают такие, которые имеют вариабельный участок легкой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 30:
SEQ ID NQ:30
DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGV
PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK где по меньшей мере одна из аминокислот, указанных X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4.
Аминокислотная замена может быть, например, аминокислотой, обнаруженной в соответствующем положении естественного антитела человека или в консенсусной последовательности антитела человека. Аминокислотная замена может быть, например, консервативной.
Другой иллюстративный вариант осуществления вариантного антитела или антигенсвязывающего фрагмента включают такие, которые имеют вариабельный участок легкой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 31:
SEQ ID NO:31
DXa1VMTQTPLSLXa2VXa3Xa4GXa5Xa6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXa7LLIHTV
SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXa8GVYYCFQGSHVPLTFGXa9GTXaioLEXa11K, где Ха1 может быть гидрофобной аминокислотой;
Ха3 может быть А или Р;
Ха3 может быть нейтральной гидрофильной аминокислотой;
Ха4 может быть L или Р;
Ха5 может быть кислой аминокислотой;
Ха6 может быть Q или Р;
Ха7 может быть основной аминокислотой;
Ха3 может быть гидрофобной аминокислотой;
Ха9 может быть А или Q;
Ха10 может быть основной аминокислотой;
Ха11 может быть гидрофобной аминокислотой;
по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4.
Дополнительный иллюстративный вариант осуществления вариантного антитела или антигенсвя- 14 038979 зывающего фрагмента включает такие, которые имеют вариабельный участок легкой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 32:
SEQ ID NO:32
DXAiVMTQTPLSLXa2VXa3Xa4GXa5Xa6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXA7LLIHTV
SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXa8GVYYCFQGSHVPLTFGXa9GTXaioLEXaiiK где ХА1 может быть V или I;
ХА2 может быть А или Р;
ХА3 может быть S или Т;
ХА4 может быть L или Р;
ХА5 может быть D или Е;
ХА6 может быть Q или Р;
ХА7 может быть K или Q;
ХА8 может быть L или V;
ХА9 может быть А или Q;
ХА10 может быть R или K или
XA11 может быть L или I, по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4.
В соответствии с вариантом осуществления вариант вариабельного домена легкой цепи может иметь последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 33 или 34:
SEQ ID NO:33
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVP
DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK.
SEQ ID NO:34
DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVP
DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK.
Иллюстративные варианты осуществления вариантного антитела или антигенсвязывающих фрагментов включают те, которые имеют вариабельный участок тяжелой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 35.
SEQ ID NO:35
QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSWVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYN
QKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS, где по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2.
Аминокислотная замена может быть, например, аминокислотой, обнаруженной в соответствующем положении естественного антитела человека или в консенсусной последовательности антитела человека. Аминокислотная замена может быть, например, консервативной.
Другой иллюстративный вариант осуществления вариантного антитела или антигенсвязывающего фрагмента включают такие, которые имеют вариабельный участок тяжелой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 36:
SEQ ID NO.:36
QXb1QLVQSGXb2EXb3Xb4KPGASVKXb5SCKASGYTFTDDYMSWVXb6QXb7Xb8GXb9XbioLEWXb11
GDINPYNGDTNYNQKFKGXb12Xbi3Xbi4Xbi5TXbi6DXb17SXb18STAYMXb19LXb2oSLXb21SEDXb22AV
YYCARDPGAMDYWGQGTXb23VTVSS, где Xb1 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb2 может быть Р или А;
Xb3 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb4 может быть V или K;
Xb5 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb6 может быть основной аминокислотой;
Xb7 может быть S или А;
Xb8 может быть Н или Р;
Xb9 может быть основной аминокислотой;
Xb10 может быть S или G;
Xb11 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb12 может быть основной аминокислотой;
Xb13 может быть гидрофобной аминокислотой;
- 15 038979
Xb14 может быть I или Т;
Xb15 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb16 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb17 может быть K или Т;
Xb18 может быть нейтральной гидрофобной аминокислотой;
Xb19 может быть Q или Е;
Xb20 может быть N или S;
Xb21 может быть Т или R;
Xb22 может быть нейтральной гидрофильной аминокислотой или
Xb23 может быть S или L;
по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2.
Дополнительный иллюстративный вариант осуществления вариантного антитела или антигенсвязывающего фрагмента включает такие, которые имеют вариабельный участок тяжелой цепи, который изложен в SEQ ID NO: 37:
SEQ ID NO.:37
QXBiQLVQSGXb2EXB3XB4KPGASVKXb5SCKASGYTFTDDYMSWVXb6QXb7Xb8GXB9XbioLEWXb1 1GDINPYNGDTNYNQKFKGXbi2Xbi3Xbi4Xbi5TXbi6DXBi7SXBi8STAYMXBi9I-Xb2oSI_Xb2iSEDXb22A
VYYCAR D PGAM DYWGQGTXB23VTVSS где ХВ1 может быть I или V;
ХВ2 может быть Р или А;
ХВ3 может быть М или V;
ХВ4 может быть V или K;
ХВ5 может быть М или V;
ХВ6 может быть K или R;
ХВ7 может быть S или А;
ХВ8 может быть Н или Р;
ХВ9 может быть K или Q;
XB10 может быть S или G;
XB11 может быть I или М;
ХВ12 может быть K или R;
ХВ13 может быть А или V;
XB14 может быть I или Т;
ХВ15 может быть L или I,
ХВ16 может быть V или А;
ХВ17 может быть K или Т;
ХВ18 может быть S или Т;
ХВ19 может быть Q или Е;
ХВ20 может быть N или S;
ХВ21 может быть Т или R;
ХВ22 может быть S или Т или
ХВ23 является S или L, по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2.
В соответствии с вариантом осуществления вариант вариабельного домена тяжелой цепи может иметь последовательность, которая изложена в любой из SEQ ID NO: 38-41:
SEQ ID NO:38
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNY
NQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO:39
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYN
- 16 038979
QKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO:40
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO:41
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ
KFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS.
Продуцирование антител в клетках.
Антитела к KAAG1, которые раскрыты в данном документе, можно получить при помощи ряда способов, которые знакомы специалистам в данной области техники, как, например, способ с использованием гибридомы или способами рекомбинантной ДНК.
В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к KAAG1 (например, антитело, которое конкурирует с антителами, раскрытыми в данном документе) можно получить с помощью традиционной методики с использованием гибридомы, в котором мышь иммунизируют антигеном, выделяют клетки селезенки, сливают с миеломными клетками без экспрессии HGPRT и отбирают гибридные клетки при помощи среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимин (HAT).
В дополнительном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к KAAG1 можно получить при помощи способов рекомбинантной ДНК.
Для экспрессии антител к KAAG1 нуклеотидные последовательности, которые могут кодировать любую из легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, или любую другую, можно вставить в вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит элементы для управления транскрипцией и трансляцией вставленной кодирующей последовательности у конкретного хозяина. Эти элементы могут включать регуляторные последовательности, такие как энхансеры, конститутивные и индуцибельные промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые участки. Для построения таких векторов экспрессии можно применять способы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти способы включают in vitro методики рекомбинантной ДНК, методики синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo.
Для экспрессии полипептида или РНК, полученной из нуклеотидных последовательностей, которые могут кодировать любую из описанных в данном документе легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, можно использовать ряд систем вектор экспрессии/хозяин, которые известны специалистам в данной области техники.
Такие системы включают, без ограничения, микроорганизмы, как, например, бактерии, трансформированные векторами экспрессии ДНК на основе рекомбинантного бактериофага, плазмиды или космиды; дрожжи, трансформированные векторами экспрессии на основе дрожжей; системы клеток насекомых, инфицированные векторами на основе бакуловирусов, системы растительных клеток, трансформированные вирусными или бактериальными векторами экспрессии; или системы животных клеток. Для долгосрочного продуцирования рекомбинантных белков в системах млекопитающих можно выполнить устойчивую экспрессию в клеточных линиях. Например, нуклеотидные последовательности, способные кодировать любую тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, могут быть трансформированы в линию клеток при помощи векторов экспрессии, которые могут содержать вирусные источники репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и селектируемый или видимый маркерный ген на одном и том же или на отдельном векторе. Настоящее изобретение не следует ограничивать используемым вектором или клеткой-хозяином. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, способные кодировать каждую любую из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, можно лигировать в отдельный вектор экспрессии и отдельно экспрессировать каждую цепь. В другом варианте осуществления как легкие, так и тяжелые цепи, способные кодировать любую из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, можно лигировать в один вектор экспрессии и экспрессировать одновременно.
Альтернативно, РНК и/или полипептид можно экспрессировать с вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, способные кодировать любую из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, с помощью системы транскрипции in vitro или связанной системы транскрипции/трансляции in vitro, соответственно.
В целом, клетки-хозяева, которые содержат нуклеотидные последовательности, способные кодировать любую из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, и/или которые экспрессируют полипептид, кодируемый нуклеотидными последовательностями, способными кодировать любую из легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, или их части, могут быть определены при помощи ряда процедур, известных специалистам в данной области техники. Такие процедуры включают, без ограничения, гибридизации ДНК/ДНК или ДНК/РНК, ПЦР-амплификацию и биологические способы анализа белка или метод иммуноанализа белка, которые
- 17 038979 включают основанные на мембране, растворе или чипе методики определения и/или количественного анализа последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислот. Иммунологические способы определения и измерения экспрессии полипептидов при помощи либо специфических поликлональных, либо моноклональных антител, известны в данной области техники. Примеры таких методик включают твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы (RIA) и сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Специалисты в данной области техники могут легко адаптировать такие методики для настоящего изобретения.
Клетки-хозяева, содержащие нуклеотидные последовательности, способные кодировать любую из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, можно, таким образом, культивировать в условиях для транскрипции соответствующей РНК (мРНК и т.д.) и/или экспрессии полипептида из клеточной культуры. Продуцируемый клеткой полипептид может секретироваться или может удерживаться внутриклеточно, в зависимости от применяемой последовательности и/или вектора. В иллюстративном варианте осуществления векторы экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности, способные кодировать любую из тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе, могут быть сконструированы с содержанием сигнальных последовательностей, которые направляют секрецию полипептида через мембрану прокариотической или эукариотической клетки.
В связи с природной вырожденностью генетического кода другие ДНК-последовательности, которые кодируют такую же, практически такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, можно получить и применять, например, для экспрессии полипептида, кодируемого нуклеотидными последовательностями, способными кодировать любую из тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, описанных в данном документе. Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения могут быть сконструированы при помощи способов, которые, как правило, известны в данной области техники для изменения нуклеотидных последовательностей для ряда целей, включая, без ограничения, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генетического продукта. Для конструирования нуклеотидных последовательностей можно применять перетасовку ДНК при помощи рандомизированной фрагментации и вторичную сборку фрагментов гена и синтетических олигонуклеотидов при помощи ПЦР. Например, олигосахарид-опосредованный сайт-направленный мутагенез можно применять для введения мутаций, которые создают новые рестрикционные сайты, изменяют паттерны гликозилирования, изменяют предпочтение в использовании кодонов, производят сплайс-варианты и т.п.
Кроме того, штамм клеток-хозяев можно выбрать по его способности необходимым образом модулировать экспрессию вставленных последовательностей или процессировать экспрессированный полипептид. Такие модификации полипептида включают, без ограничения, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. В иллюстративном варианте осуществления могут быть необходимыми антитела к KAAG1, которые содержат специальные структуры или паттерны гликозилирования. Посттрансляционный процессинг, который расщепляет препроформу полипептида, также можно применять с тем, чтобы точно задать белковое нацеливание, фолдинг и/или активность. Различные клетки-хозяева, которые имеют специфическое клеточное устройство и характерные механизмы посттрансляционных активностей (например, СНО, HeLa, MDCK, HEK293 и W138), доступны коммерчески и из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и могут быть выбраны для обеспечения надлежащей модификации и процессинга экспрессированного полипептида.
Специалисты в данной области техники легко поймут, что природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью, что приведет к трансляции химерного полипептида, содержащего гетерологичные полипептидные фрагменты в любых вышеупомянутых системах хозяев. Такие гетерологичные полипептидные фрагменты могут облегчать очистку химерных полипептидов при помощи коммерчески доступных аффинных матриц. Такие фрагменты включают, без ограничения, глутатион-S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу, тиоредоксин, пептид, связывающий кальмодулин, 6-His (His), FLAG, c-myc, гемагглютинин (НА) и эпитопы антител, такие как эпитопы моноклональных антител.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, который может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный белок. Химерный белок может содержать партнера слияния (например, НА, Fc и т.д.), слитого с полипептидом (например, полной легкой цепью, полной тяжелой цепью, вариабельными участками, CDR и т.д.), описанным в данном документе.
Специалисты в данной области легко поймут, что последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов могут быть синтезированы полностью или частично при помощи хорошо известных в данной области техники химических или ферментативных способов. Например, синтез пептидов можно осуществить при помощи ряда твердофазных методик и оборудования, как, например, для автоматического синтеза можно применять синтезатор пептидов ABI 431A (РЕ Biosystems). В случае необходимости, для получения вариантного белка аминокислотную последовательность можно изменить в ходе синтеза и/или объединить с последовательностями из других белков.
Конъюгаты антител.
Антитело и его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения могут быть сконъюгированы с выявляемым фрагментом (т.е. предназначенным для выявления или диагностики) или с терапевти
- 18 038979 ческим фрагментом (для терапевтических целей).
Выявляемый фрагмент представляет собой фрагмент, выявляемый при помощи спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, химических и/или других физических средств. Выявляемый фрагмент может быть связан напрямую и/или опосредованно (например, посредством связи, как, например, без ограничений, DOTA или NHS связь) с антителами и их антигенсвязывающими фрагментами настоящего изобретения при помощи способов, хорошо известных в данной области техники. Можно применять широкий спектр выявляемых фрагментов, при этом выбор зависит от необходимой чувствительности, облегчения конъюгации, требований к устойчивости и доступности оборудования. Подходящий выявляемый фрагмент включает, без ограничения, флуоресцентную метку, радиоактивную метку (например, без ограничения, 125I, In111, Тс, I131 и включая позитронно-активные изотопы для РЕТ-сканера и т.д.), активную метку для ядерного магнитного резонанса, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку, хромофорную метку, ферментную метку (например, и без ограничения, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и т.д.), квантовые точки и/или наночастицу. Выявляемый фрагмент может выступать причиной и/или производить выявляемый сигнал, таким образом обеспечивая выявление сигнала от выявляемого фрагмента.
В другом иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть связаны (модифицированы) с терапевтическим фрагментом (например, лекарственным средством, цитотоксичным фрагментом, противораковым средством).
В иллюстративном варианте осуществления антитело к KAAG1 и антигенсвязывающие фрагменты могут содержать химиотерапевтическое, цитотоксичное средство или противораковое лекарственное средство (например, малую молекулу). Такие химиотерапевтические или цитотоксичные средства включают, без ограничения, иттрий-90, скандий-47, рений-186, йод-131, йод-125 и многие другие известные специалистам в данной области техники (например, лютеций (например, Lu177), висмут (например, Bi213), медь (например, Cu67)). В иных случаях химиотерапевтическое, цитотоксичное средство или противораковое лекарственное средство может состоять, наряду с другими известными специалистам в данной области техники, из 5-фторурацила, адриамицина, иринотекана, таксанов, эндотоксина представителей рода Pseudomonas, рицина, ауристатина (например, монометилауристатина Е, монометилауристатина F), майтанзиноидов (например, мертанзина) и других токсинов.
Кроме того, для осуществления способов настоящего изобретения, и как известно в данной области техники, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения (конъюгированное или нет) можно применять в сочетании со второй молекулой (например, вторичным антителом и т.д.), которые способны специфически связываться с антителом или антигенсвязывающим фрагментом настоящего изобретения и которые могут нести необходимый выявляемый, диагностический или терапевтических фрагменты.
Фармацевтические композиции антител и их применение.
Также настоящим изобретением охватываются фармацевтические композиции антител к KAAG1 или антигенсвязывающих фрагментов (конъюгированных или нет). Фармацевтическая композиция может содержать антитело к KAAG1 или антигенсвязывающий фрагмент и может также включать фармацевтически приемлемый носитель.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к композиции, которая может содержать антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, и носитель.
Настоящее изобретение относятся к фармацевтической композиции, которая может содержать антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные8 в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
В дополнение к активным ингредиентам, фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемые носители, включая воду, PBS, солевые растворы, виды желатина, масла, спирты и другие наполнители и вспомогательные добавки, которые способствуют переработке активных соединений в препараты, которые можно применять в фармацевтических целях. В других случаях такие препараты могут быть простерилизованы.
Как используется в данном документе, выражение фармацевтическая композиция означает терапевтически эффективные количества средства вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, растворителями, эмульгаторами, вспомогательным средством и/или носителями. Как используется в данном документе, выражение терапевтически эффективное количество относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и схемы введения. Такие композиции представляют собой жидкости или лиофилизированные или иным образом высушенные составы и включают разбавители с различным содержанием буферных компонентов (например, Tris-HCl, ацетат, фосфат), рН и ионной силой, добавок, как, например, альбумин или желатин, для предупреждения абсорбции на поверхностях, детергентов (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчной кислоты).
Солюбилизирующие средства (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), вещества-наполнители или модификаторы концентрации (например, лактоза, маннит),
- 19 038979 ковалентное связывание полимеров, как, например, полиэтиленгликоля с белком, комплексообразование с ионами металлов или введение материала в или на препараты в виде частиц полимерных соединений, как, например, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, гидрогели и т.д., или на липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, тени эритроцитов или сферопласты. Такие композиции будут оказывать действие на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость очистки in vivo. Композиции с контролируемым или пролонгированным высвобождением включают состав в липофильном депо (например, жирные кислоты, виды воска, масла). Также настоящим изобретением охватываются композиции в виде частиц, покрытые полимерами (например, полоксамерами или полоксаминами). Другие варианты осуществления композиций настоящего изобретения включают защитные оболочки для форм в виде частиц, ингибиторы протеаз или усилители проникновения для различных путей введения, включая парентеральные, пульмональные, назальные, пероральные, вагинальные, ректальные пути. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят парентерально, в район опухоли, трансмукозально, трансдермально, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутрибрюшинно, интравентрикулярно, интракраниально и в опухоль.
Дополнительно, как используется в данном документе, выражения фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтический носитель известны в данной области техники и включают, без ограничения, 0,01-0,1 М или 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Дополнительно, такие фармацевтически приемлемые носители могут быть водными или неводными растворами, суспензиями и эмульсиями. Примерами неводных растворов являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, как, например, оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, как, например, этилолеат. Водные носители включают воду, спирто/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и буферную среду. Парентеральные среды для лекарства включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу с хлоридом натрия, раствор Рингера с нелетучими маслами и лактатом. Внутривенные среды включают жидкие и питательные подкрепители, подкрепители электролитов, как, например, те, которые основаны на растворе Рингера с декстрозой, и т.д. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, объединяющие средства, инертные газы и т.п.
Для любого соединения терапевтически эффективная доза может быть рассчитана изначально либо при анализах в клеточной культуре, либо в животных моделях, таких как мыши, крысы, кроли, собаки или свиньи. Животную модель можно применять для определения интервала концентрации и пути введения. Такую информацию затем можно применять для определения пригодных доз и путей введения у людей. Такие методики хорошо известны специалисту в данной области техники, и терапевтически эффективная доза относится к количеству активного ингредиента, которое облегчит симптомы или состояние. Терапевтическую эффективность и токсичность можно определить при помощи стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или с экспериментальными животными, как, например, при помощи подсчета и установления различий статистических данных ED50 (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Любые описанные выше терапевтические композиции можно применять для любого нуждающегося в терапии подобного рода субъекта, включая, без ограничения, млекопитающих, таких как собаки, коты, коровы, лошади, кроли, обезьяны и люди.
Используемые в настоящем изобретении фармацевтические композиции можно вводить посредством любого числа путей, включая, без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедулярный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, подкожный, интраперитонеальный, интраназальный, энтеральный, местный, подъязычный или ректальный способы.
Термин лечение в целях настоящего раскрытия относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, при этом у объекта замедляется (уменьшается) целевое патологическое состояние или расстройство. Нуждающиеся в лечении включают уже имеющих расстройство, а также тех, которые склонны иметь расстройство, или тех, у которых расстройство необходимо предупредить. В частности, нуждающиеся субъекты включают субъектов с повышенным уровнем одного или нескольких маркеров рака.
Антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты могут оказывать терапевтические эффекты при лечении различных типов рака, как, например, карциномы яичников, рака почек, рака толстой кишки, рака легких, меланомы и т.д. В иллюстративном варианте осуществления антитела и фрагменты оказывают терапевтические эффекты при карциноме яичников. В более конкретном варианте осуществления субъект может иметь, например, рецидивирующую карциному яичников. В еще одном варианте осуществления субъект может иметь, например, метастазирующий рак.
В иных случаях антитела и фрагменты к KAAG1 могут блокировать взаимодействие KAAG1 с его белковыми партнерами. Антитела к KAAG1 настоящего изобретения можно, в частности, применять для доставки терапевтического фрагмента к клетке, экспрессирующей KAAG1.
Антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты могут оказывать терапевтические эффек
- 20 038979 ты при лечении различных типов карциномы яичников. Источником различных гистотипов карциномы яичников могут послужить несколько различных типов клеток. Наиболее распространенная форма карциномы яичников состоит из опухолей, которые образовываются в слое эпителиальных клеток яичника или фаллопиевой трубы. Такие виды эпителиальной карциномы яичников включают серозные опухоли, опухоли эндометрия, муцинозные опухоли, светлоклеточные опухоли и пограничные опухоли. В других вариантах осуществления антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты оказывают эффекты при лечении других типов карциномы яичников, таких как карцинома яичников зародышевой линии и зародышевого шнура.
В конкретных случаях антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить конкурентно в сочетании с другими лечебными средствами, предназначенными для такого же состояния. В связи с этим антитела можно вводить с антимитотическими средствами (например, таксанами), средствами на основе платины (например, цисплатин), ДНК-разрушающими средствами (например, доксорубицин) и другими противораковыми терапевтическими средствами, которые известны специалистам в данной области техники. В других случаях, антитела к KAAG1 и их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить с другими терапевтическими антителами. Они включают, без ограничения, антитела, которые нацелены на EGFR, CD-20 и Her2.
Настоящее изобретение в дополнительном аспекте относится к способу ингибирования роста клетки, экспрессирующей KAAG1, способу, который может включать приведение в контакт клетки с эффективным количеством антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе.
Настоящее изобретение также охватывает способ лечения рака или ингибирования роста клеток, экспрессирующих KAAG1, у млекопитающего, способ может включать введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента, например, конъюгированного с описанным в данном документе терапевтическим фрагментом, нуждающемуся в этом субъекту.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение предоставляет способ лечения, диагностические способы и способ выявления при помощи антитела или антигенсвязывающего фрагмента настоящего изобретения и применение таких антител или антигенсвязывающего фрагмента в производстве фармацевтической композиции или лекарственного средства для таких целей.
Вследствие этого настоящее изобретение относится к применению описанного в данном документе выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента при (производстве фармацевтической композиции для) лечении рака.
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, конкретнее, можно применять в отношении злокачественных опухолей, включая, например, злокачественную опухоль, обладающую способностью к метастазированию, и/или опухолевые клетки, которые характеризуются безъякорным ростом.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения также можно применять для диагностики рака. Диагностику рака можно осуществлять in vivo при помощи введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента настоящего изобретения млекопитающему, которое имеет рак или подозревается на наличие рака. Диагностику также можно осуществить ex vivo путем приведения в контакт образца, полученного от млекопитающего, с антителом или антигенсвязывающим фрагментом и выявления присутствия или отсутствия клеток (опухолевых клеток), экспрессирующих KAAG1 или вариант KAAG1.
Таким образом, настоящее изобретение также охватывает способ выявления рака или выявления клеток, экспрессирующих KAAG1, у млекопитающего, способ может включать введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту.
Настоящее изобретение в другом своем аспекте относится к способу выявления клеток, экспрессирующих KAAG1 или вариант KAAG1, при этом способ может включать приведение в контакт клетки с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, описанным в данном документе, и выявление комплекса, образованного антителом и клеткой, экспрессирующей KAAG1 или вариант KAAG1. Иллюстративные варианты осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, применяемых в способах выявления, являются такими, которые могут связываться с внеклеточным участком KAAG1.
Другие иллюстративные варианты осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, применяемых в способах выявления, являются такими, которые связываются с KAAG1 или вариантом KAAG1, экспрессируемым на поверхности опухолевых клеток.
Нуждающимися субъектами, которые получат благоприятное воздействие от лечения, выявления или диагностики, описанных в данном документе, являются такие, которые имеют рак или подозреваются на наличие рака, например карциномы яичника (например, серозной, эндометриоидной, светлоклеточной или мусцинозной), рака кожи (например, меланом, плоскоклеточных карцином), рака почек (например, папиллярных карцином, виды светлоклеточного рака), колоректального рака (например, колоректальных карцином), саркомы, лейкоза, рака головного мозга, рака щитовидной железы, рака молочной железы (например, карцином молочной железы), рака простаты (например, карцином простаты), опухоли пищевода, опухоли мочевого пузыря, опухоли легких (например, легочных карцином) или опухоли шеи и головы, и, особенно если рак характеризуется злокачественностью и/или если клетки, экспрессирующие KAAG1 или вариант KAAG1, характеризуются безъякорным ростом.
- 21 038979
Субъекты, имеющие рак, могут быть идентифицированы по снимкам, биопсии тканей, генетическому тестированию. Альтернативно, субъекты, имеющие рак, могут быть идентифицированы по наличию маркеров рака в их жидкостях организма при помощи стандартных анализов (например,
ELISA и т.п.).
Настоящим изобретением, в частности, охватываются пациенты, имеющие или подозреваемые на наличие карциномы яичников (например, серозной, эндометриоидной, светлоклеточной или мусцинозной), или рака кожи (например, меланом, плоскоклеточных карцином), или рака почек (например, папиллярных карцином), и, особенно если рак характеризуется злокачественностью и/или если клетки, экспрессирующие KAAG1 или вариант KAAG1, характеризуются безъякорным ростом.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу выявления KAAG1 (SEQ ID NO: 29), варианта KAAG1, имеющего по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 29, или секретированной формы или циркулирующей формы KAAG1 или варианта KAAG1, при этом способ может включать приведение в контакт клетки, экспрессирующей KAAG1 или вариант KAAG1, или образца (биопсии, сыворотки, плазмы, мочи и т.д.), содержащего или подозреваемого на содержание KAAG1 или варианта KAAG1, с описанными в данном документе антителом или антигенсвязывающими фрагментами и измерение связывания. Образец может происходить от млекопитающего (например, человека), который может иметь рак (например, карциному яичников, метастазирующий рак) или может подозреваться на наличие рака (например, карциномы яичников, метастазирующего рака). Образец может представлять собой образец ткани, полученный от млекопитающего, или супернатант клеточной культуры.
В соответствии с настоящим изобретением образец может быть образцом сыворотки, образцом плазмы, образцом крови, спермой или асцитной жидкостью, полученной от млекопитающего. Описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может преимущественно выявлять секретированную или циркулирующую форму (циркулирующую в крови) KAAG1.
Способ может включать определение количества комплекса, образованного связанным с KAAG1 или с вариантом KAAG1 антителом или антигенсвязывающим фрагментом.
Связывание антитела с антигеном будет обусловливать повышение предполагаемой молекулярной массы антигена. Таким образом, физическое изменение происходит при специфическом связывании антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном.
Такие изменения можно выявить при помощи, например, электрофореза с последующим вестернблоттингом и окрашиванием геля или блотта, масс-спектрометрией, HPLC в сочетании с компьютерной обработкой, FACS или др. Устройства, способные рассчитывать сдвиг молекулярной массы, известны в данной области техники и включают, например, Phosphorimager™.
Если антитело включает, например, выявляемую метку, то комплекс антиген-антитело можно выявить по флюоресценции, излучаемой меткой, радиационному излучению метки, ферментативной активности метки, обеспеченной ее субстратом, или др.
Выявление и/или измерение связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном может быть осуществлено при помощи ряда способов, известных в данной области техники. Связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном можно отслеживать при помощи устройства, способного выявлять сигнал, излучаемый выявляемой меткой (радиационное излучение, флюоресценция, изменение цвета и т.д.). Такое устройство предоставляет данные, которые указывают на произошедшее связывание, и может также предоставлять показания в том, что касается количества антитела, связавшегося с антигеном. Устройство (обычно, соединенное с компьютером) может также быть способно рассчитывать разницу между фоновым сигналом (например, сигналом, получаемым при отсутствии связывания антиген-антитело) или фоновым шумом и сигналом, получаемым при специфическом связывании антитело-антиген. Такие устройства, таким образом, могут предоставлять пользователю показатели и выводы относительно того, был ли выявлен антиген или нет.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к наборам, которые могут включать один или несколько контейнеров, содержащих одно или несколько описанных в данном документе антител или антигенсвязывающих фрагментов.
Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки.
Антитела обычно получают в клетках, допускающих экспрессию легкой цепи и тяжелой цепи, экспрессируемых с вектора(ов), содержащего(их) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь и/или тяжелую цепь.
Настоящее изобретение, таким образом, охватывает нуклеиновые кислоты, способные кодировать любые из описанных в данном документе CDR, вариабельных участков легкой цепи, вариабельных участков тяжелой цепи, легких цепей, тяжелых цепей.
Настоящее изобретение, таким образом, в дополнительном аспекте относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, и/или вариабельный участок тяжелой цепи антитела, которое способно специфически связываться с KAAG1.
Иллюстративные варианты осуществления нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельный участок легкой цепи, содержащий:
- 22 038979
a) CDRL1, изложенный в SEQ ID NO: 8 или содержащий SEQ ID NO: 8;
b) CDRL2, изложенный в SEQ ID NO: 9 или содержащий SEQ ID NO: 9;
c) последовательность CDRL3, изложенную в SEQ ID NO: 10 или содержащую SEQ ID NO: 10.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать вариабельный участок легкой цепи, который может содержать по меньшей мере два CDR из CDRL1, CDRL2 или CDRL3.
Также в соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать вариабельный участок легкой цепи, который может содержать один CDRL1, один CDRL2 и один CDRL3.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий:
a) последовательность CDRH1, изложенную в SEQ ID NO: 5 или содержащую SEQ ID NO: 5;
b) последовательность CDRH2, изложенную в SEQ ID NO: 6 или содержащую SEQ ID NO: 6; или
c) последовательность CDRH3, изложенную в SEQ ID NO: 7 или содержащую SEQ ID NO: 7.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать вариабельный участок тяжелой цепи, который может содержать по меньшей мере два CDR из CDRH1, CDRH2 или CDRH3.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать вариабельный участок тяжелой цепи, который может содержать один CDRH1, один CDRH2 и один CDRH3.
Также настоящим изобретением охватываются нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты антитела по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену по меньшей мере в двух из CDR.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену в трех CDR.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере две консервативные аминокислотные замены по меньшей мере в одном из CDR.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере две консервативные аминокислотные замены по меньшей мере в двух из CDR.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может кодировать CDR, содержащий по меньшей мере две консервативные аминокислотные замены в трех CDR.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, имеющий 70, 75, 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 4.
Еще другие аспекты настоящего изобретения относятся к нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий 70, 75, 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2.
В еще другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему описанные в данном документе нуклеиновые кислоты.
В соответствии с настоящим изобретением вектор может представлять собой вектор экспрессии.
Вектор, который содержит элементы для управления транскрипцией и трансляцией вставленной кодирующей последовательности у конкретного хозяина, известны в данной области техники. Эти элементы могут включать регуляторные последовательности, такие как энхансеры, конститутивные и индуцибельные промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемыеучастки. Для построения таких векторов экспрессии можно применять способы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти способы включают in vitro методики рекомбинантной ДНК, методики синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной клетке, которая может содержать описанные в данном документе нуклеиновую кислоту, антитела или антигенсвязывающий фрагмент.
Выделенная клетка может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, и нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи, либо на отдельных векторах, либо на одном векторе. Выделенная клетка также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, и нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, либо на отдельных векторах, либо на одном векторе.
В соответствии с настоящим изобретением клетка может быть способна к экспрессии, сборке и/или секреции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет клетку, которая может содержать и/или может экспрессировать описанное в данном документе антитело.
В соответствии с настоящим изобретением клетка может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный участок легкой цепи, и нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи.
Клетка может быть способна к экспрессии, сборке и/или секреции антитела или его антигенсвязы- 23 038979 вающего фрагмента.
Приведенные ниже примеры представлены для дополнительного описания деталей настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1.
Данный пример описывает связывание антитела 3А4 с KAAG1.
Антитела, которые связывают KAAG1, получили с помощью методики фагового дисплея Alere. Подробное описание методики и способов получения таких антител можно найти в патенте США № 6057098. Кроме того, подробное описание получения антител к KAAG1 можно найти в РСТ/СА2009/001586. Вкратце, методика использует строгий пэннинг фаговых библиотек, которые несут антигенсвязывающие фрагменты (Fab). Спустя несколько циклов пэннинга получали библиотеку под названием Omniclonal, которая была насыщена рекомбинантными Fab, содержащими вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, которые связывались с KAAG1 с очень высокой аффинностью и специфичностью.
Из этой библиотеки, более точно называемой Omniclonal AL0003 A2ZB, получали 96 отдельных рекомбинантных моноклональных Fab из Е. coli и тестировали на связывание KAAG1. Из данного 96-луночного планшета моноклональных антител, исходя из их высокой связывающей активности в отношении рекомбинантного KAAG1 и их аффинности к KAAG1 на поверхности клеток карциномы яичника, получали моноклональное антитело, обозначенные 3А4.
Нуклеотидные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина соответственно показаны в SEQ ID NO: 1 и 3, а полипептидные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина соответственно показаны в SEQ ID NO: 2 и 4. Определяющие комплементарность участки (CDR) тяжелой цепи иммуноглобулина 3А4 соответственно показаны в SEQ ID NO: 5, 6 и 7, a CDR легкой цепи иммуноглобулина 3А4 соответственно показаны в SEQ ID NO: 8, 9 и 10.
За исключением возможности проведения исследования взаимодействия моноклональных антител с Fab фрагментами и белка KAAG1, применение Fab ограничено в отношении проведения существенных in vitro и in vivo исследований для подтверждения биологической функции антигена. Таким образом, было необходимо перенести вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, содержащиеся в Fab 3A4, в полные остовы антител для получения химерного lgG1 мыши-человека. Векторы экспрессии как для легкой, так и для тяжелой цепей иммуноглобулина построили таким образом, чтобы i) последовательности исходного бактериального сигнального пептида перед Fab в векторах экспрессии были заменены сигнальными пептидами млекопитающих и ii) константные участки легкой и тяжелой цепей в антителах мыши были заменены константными участками человека. В способах осуществления такого переноса используют стандартные методики молекулярной биологии, которые известны специалистам в данной области техники. Краткий обзор методики описан в данном документе.
Вектор экспрессии легкой цепи - существующая экспрессирующая плазмида млекопитающих, называемая pTTVH8G (Durocher et al., 2002), предназначенная для применения в системе для временной трансфекции 293Е, модифицировали для встраивания вариабельного участка легкой цепи мыши. Полученная химерная легкая цепь мыши-человека содержала вариабельный участок мыши, за которым следовал константный домен каппа человека. Последовательность кДНК, кодирующую константный домен каппа человека, амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров OGS1773 и OGS1774 (SEQ ID NO: 11 и 12 соответственно). Нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность константного участка каппа человека показаны в SEQ ID NO: 13 и 14 соответственно. Полученный ПЦР-продукт длиной 321 пара оснований лигировали в pTTVH8G сразу после последовательности сигнального пептида VEGF А человека (NM_003376). В ходе данного этапа клонирования также разместили уникальные сайты для рестрикционных эндонуклеаз, которые делают возможным точное размещение кДНК, кодирующих вариабельные участки легкой цепи мыши. Последовательность конечной экспрессирующей плазмиды, называемой pTTVKI, показана в SEQ ID NO: 15. Исходя из последовательности вариабельного участка легкой цепи 3А4, показанной в SEQ ID NO: 3, сконструировали ПЦР-праймер, специфический к вариабельному участку легкой цепи, который включал на своем 5'-конце последовательность, идентичную по меньшей мере 20 парам оснований сигнального пептида VEGF А. Последовательность праймера показана в SEQ ID NO: 16. Обратный праймер (SEQ ID NO: 17) включал на своем 3'-конце последовательность, идентичную первым 20 парам оснований константного домена каппа человека. Как на ПЦР-фрагменты, так и на расщепленную pTTVK1 воздействовали 3'-5' экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы Т4, что в результате дало комплементарные концы, которые соединили путем гибридизации. Полученные в результате реакции гибридизации продукты трансформировали в компетентные Е. coli и экспрессирующие плазмиды проверили путем секвенирования для того, чтобы убедиться, что вариабельные участки легкой цепи мыши правильно вставлены в вектор экспрессии pTTVK1.
Вектор экспрессии тяжелой цепи - вектор экспрессии, который давал тяжелую цепь иммуноглобулина 3А4, конструировали аналогичным образом, как и описанную выше pTTVKI, для получения легких
- 24 038979 цепей иммуноглобулинов. Плазмиду pYD11 (Durocher et al., 2002), которая содержит последовательность сигнального пептида IgGK человека, а также участки СН2 и СН3 Fc-домена человека lgG1, модифицировали путем лигирования последовательности кДНК, кодирующей константный участок СН1 человека. ПЦР-праймеры OGS1769 и OGS1770 (SEQ ID NO: 18 и 19), сконструированные для содержания уникальных сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, применяли для амплификации участка СН1 IgG1 человека, содержащего нуклеотидную последовательность и соответствующую аминокислотную последовательность, показаны в SEQ ID NO: 20 и 21. После лигирования фрагмента длиной 309 пар оснований СН1 человека непосредственно после последовательности сигнального пептида IgGK модифицированную плазмиду (SEQ ID NO.:22) назвали pYD15. Если выбранный вариабельный участок тяжелой цепи лигирован в вектор, то полученная плазмида кодирует полную тяжелую цепь иммуноглобулина lgG1 с константными участками человека. ПЦР-праймеры, специфичные к вариабельному участку тяжелой цепи антитела 3А4 (SEQ ID NO: 1), сконструировали так, чтобы они включали на своем 5'-конце последовательность, идентичную по меньшей мере 20 парам оснований сигнального пептида IgGK. Последовательность данных праймеров показана в SEQ ID NO: 23. Обратный праймер (SEQ ID NO: 24) включал на своем 3'-конце последовательность, идентичную первым 20 парам оснований константного домена СН1 человека. Как на ПЦР-фрагменты, так и на расщепленную pYD15 воздействовали 3'-5' экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы Т4, что в результате дало комплементарные концы, которые соединили путем гибридизации. Полученные в результате реакции гибридизации продукты трансформировали в компетентные Е. coli и экспрессирующие плазмиды проверили путем секвенирования для того, чтобы убедиться, что вариабельные участки тяжелой цепи мыши правильно вставлены в вектор экспрессии pYD15.
Экспрессия химерного IgG1 3A4 человека в клетках 293Е - полученные, как описано выше, векторы экспрессии, которые кодировали легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, экспрессировали в клетках 293Е с помощью системы для временной трансфекции (Durocher et al., 2002). Соотношение легкой к тяжелой цепи оптимизировали с тем, чтобы достигнуть наибольшего выхода антитела в среде для тканевой культуры, и, как обнаруживали, оно составило 9:1 (LH).
Связывание химерного 3А4 с KAAG1 - для измерения относительного связывания моноклонального антитела 3А4 получили рекомбинантный KAAG1 человека в клетках 293Е с помощью методики для крупномасштабной временной трансфекции (Durocher et al., 2002; Durocher, 2004). Описание экспрессии и очистки рекомбинантного KAAG1 человека в виде химерного белка с Fc приведено в РСТ/СА2009/001586. Для осуществления связывания Fc-KAAG1 с препаратом антитела к Fc-KAAG1 пришили NHS-биотин (Pierce, Рокфорд, Иллинойс) и вносили 10 нг/лунка в 96-луночный планшет со стрептавидином на 1 ч при комнатной температуре для нанесения покрытия. Добавили очищенный химерный 3А4 с возрастающими концентрациями и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Связавшееся антитело выявили с помощью антитела к легкой каппа цепи человека, конъюгированного с HRP, в присутствии жидкого субстрата ТМВ ((Sigma-Aldrich Canada Ltd., Оквилл, Онтарио) и осуществили считывание результатов при 450 нм в ридере для титрационных микропланшетов. Как показано на фиг. 1, 3А4 взаимодействовал с иммобилизированным белком KAAG1 дозозависимым образом. При инкубировании контрольного, несвязанного IgG с рекомбинантным KAAG1 не наблюдали связывающую активность даже при самой высокой концентрации. Данный результат продемонстрировал, что 3А4 связывается с KAAG1 человека. Связывание 3А4 сравнили со связыванием химерного 3D3 (описано в Tremblay и Filion (2009)), которое характеризуется иной специфичностью эпитопа (см. пример 2). Связывающая активность 3А4 очень похожа с 3D3 в данном типе анализа (см. фиг. 1).
Пример 2.
Данный пример описывает исследования по картированию эпитопа для определения того, с каким именно участком KAAG1 связывается антитело 3А4.
Для дополнительного определения участков KAAG1, которые связываются антителом 3А4, экспрессировали укороченных мутантов KAAG1 и использовали их в ELISA. Что касается полноразмерного KAAG1, укороченные версии амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали в pYD5, расщепленную BamHI/HindIII. С помощью использованных праймеров объединили прямой олигонуклеотид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 25, с праймерами SEQ ID NO: 26 и 27 с получением слитых с Fc фрагментов, которые заканчивались на аминоконцевом номере 60 и 35 KAAG1 соответственно. Экспрессию этих рекомбинантных мутантов осуществили, как было описано выше для полноразмерного Fc-KAAGI, и очистили с помощью протеин-А-агарозы.
Исходя из идей Tremblay и Filion (2009), стало известно, что со специфическими участками рекомбинантного KAAG1 взаимодействовали другие антитела. Таким образом, антитело к KAAG1 3С4, 3D3 и 3G10 взаимодействовало с участками 1-35, 36-60 и 61-84 KAAG1 соответственно. Воспроизвели эти результаты по связыванию, и они показаны на фиг. 2. Для определения участка KAAG1, который связывается антителом 3А4, осуществили ELISA с применением гибридов укороченного KAAG1 с Fc согласно аналогичному протоколу, который был описан в примере 1. Единственными модификациями было применение иных биотинилированных укороченных мутантов Fc-KAAGI. Результаты демонстрируют, что специфичность связывания 3А4 похожа с 3G10. У мутантов KAAG1, у которых нет аминокислотных
- 25 038979 последовательностей после аминокислоты 60, связывание 3А4 с KAAG1 не происходит. Это указывает на то, что 3А4 взаимодействует с участком, ограниченным аминокислотами 61-84 KAAG1 человека. Результаты наблюдений, что 3А4 и 3D3 имеют практически идентичную активность связывания при измерении с помощью ELISA (пример 1), но имеют очень отличающуюся специфичность эпитопа, позволяют предположить, что свойства связывания 3А4 в некоторой степени отличаются от 3D3.
Пример 3.
Данный пример описывает способность 3А4 связываться с KAAG1 на поверхности клеток различных линий раковых клеток.
Проточную цитометрию применяли для выявления KAAG1 на поверхности клеток различных линий клеток. Исходя из анализов экспрессии с помощью RT-PCR с применением специфических мРНК-праймеров для KAAG1, ожидалось, что избранные линии раковых клеток будут экспрессировать белок KAAG1. Для проверки этого использовали клетки карциномы яичника (SKOV-3 и TOV-21G) и контрольные линии клеток, которые демонстрировали очень небольшую экспрессию KAAG1 (293Е). Клетки собрали с помощью 5 мМ EDTA, подсчитывали с помощью гемоцитометра и ресуспендировали в FCM-буфере (0,5% BSA, 10 мкг/мл козьей сыворотки в 1х PBS) с плотностью клеток 2x106 клеток/мл. Химерные 3А4 или контрольные IgG добавили к 100 мкл клеток в конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубировали на льду в течение 2 ч. Клетки промывали в холодном PBS для удаления несвязавшихся антител, ресуспендировали в 100 мкл FCM-буфера, содержащего антитело к IgG человека, конъюгированное с FITC (разведение 1:200), в качестве вторичного антитела и инкубировали на льду в течение 45 мин. После еще одного этапа промывания в холодном PBS клетки ресуспендировали в 250 мкл FCM-буфера и анализировали с помощью проточного цитометра. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 3А и 3В. Инкубирование линий клеток с контрольным антителом дало гистограммы, которые соответствуют сигналу, обычно получаемому в случае, когда антитело покидает клетки. Это позволило получить фоновый сигнал с такими значениями FCM (фиг. 3А и 3В). И наоборот, инкубирование SKOV-3, TOV-21G с химерным антителом 3А4 дало сильный флуоресцентный сигнал (фиг. 3А). Это указывало на то, что антитело эффективно выявляет KAAG1 на поверхности таких раковых клеток. Ожидалось, что клетки 293Е, линия клеток почки человека, продемонстрирует очень незначительную экспрессию KAAG1, и, действительно, гистограмма результатов FCM показала почти полное отсутствие сдвига по сравнению с контрольным антителом (см. фиг. 3В). Следовательно, 3А4 специфически выявляет KAAG1 на поверхности раковых клеток. Активность 3А4 сравнили с 3D3, антителом к KAAG1, которое описано в работах Tremblay и Filion (2009). Исходя из данной патентной заявки, было известно, что 3D3 может выявлять KAAG1 на поверхности раковых клеток при измерении с помощью FCM. Это подтвердили инкубацией 3D3 в присутствии клеток SKOV-3 и TOV-21G (см. фиг. 3А). Флуоресцентный сигнал был не настолько высоким как для 3А4, что указывает на то, что 3А4 характеризуется отличной и повышенной способностью к выявлению KAAG1 на поверхности клеток карциномы яичника. Другие результаты, полученные в нашей лаборатории, указывают на то, что 3А4 может выявлять KAAG1 на поверхности раковых клеток в условиях, при которых в данном анализе 3D3 не проявлял активности (результаты не показаны). Все вместе, эти результаты наблюдения и различие в специфичности эпитопа 3А4 по сравнению 3D3 позволяют предположить, что эти антитела характеризуются различными свойствами по отношению к KAAG1.
Пример 4.
Способы применения антитела к KAAG1 3А4 в качестве конъюгата антитела.
Как продемонстрировано выше, антиген KAAG1 выявляется посредством 3А4 на поверхности раковых клеток с помощью поточной цитометрии. Существуют несколько различных молекулярных событий, которые могут произойти при связывании антитела с его целью на поверхности клеток. Они включают i) блокирование доступа к другому антигену/рецептору клеточной поверхности или лиганду, ii) образование относительно стабильного комплекса антитело-антиген позволяющий нацеливаться на клетки с помощью ADCC или CDC, iii) могут происходить события, связанные с передачей сигнала, которые проиллюстрированы с помощью эгоистических антител, iv) комплекс может быть интернализирован или v) комплекс может быть сброшен с клеточной поверхности. Для решения данного вопроса изучали поведение комплекса KAAG1-антитело 3А4 на поверхности клеток. Клетки SKOV-3 высеяли, промыли и инкубировали с 5 мкг/мл химерного антитела 3А4, как описано в примере 3. После промывания добавили полную среду OSE и клетки поместили в 37°С на срок до 90 мин. Клетки забрали через указанные промежутки времени (см. фиг. 4), быстро охладили, приготовили для цитометрии с конъюгированным с FITC антителом к IgG человека и результаты выразили в виде процента оставшейся средней интенсивности флуоресценции (средняя интенсивность флуоресценции, %). Как проиллюстрировано на фиг. 4, флуоресцентный сигнал быстро снизился за период 30-45 мин. Эти результаты показывают, что комплекс 3A4/KAAG1 исчез с клеток, что указывало на то, что могла произойти интернализация комплекса. Предварительные исследования для выяснения механизма, ответственного за такое снижение флуоресценции клеточной поверхности, показали, что, судя по всему, комплекс интернализировался.
Эти результаты дополнительно подтвердили путем проведения иммунофлуоресценции на живых
- 26 038979 клетках для того, чтобы узнать, можно ли наблюдать такую интернализацию с помощью микроскопии. Клетки SKOV-3 высеяли на покровные стекла в полную среду (среда OSE (Wisent), содержащую 10% FBS, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1х неосновных аминокислот и антибиотики). После того как клетки надлежащим образом закрепились, добавили свежую среду, содержащую химерное антитело к KAAG1 3А4 в количестве 10 мкг/мл, и инкубировали при 37°С в течение 4 ч. Клетки промывали в PBS, затем фиксировали в 4% параформальдегиде (в PBS) в течение 20 мин. После промывания клетки пермеабилизировали при помощи 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин. Блокировку осуществляли с помощью 1,5% сухого молока в PBS в течение 1 ч. Ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP1, Chang et al., 2002) выявили путем инкубирования с антителом к LAMP1 (Santa Cruz, sc-18821, разведенное 1:100) в 1,5% молоке в PBS в течение 2 ч. После промывания в PBS добавляли все вместе вторичные антитела в 1,5% молока и инкубировали в течение 1 ч. Для химерных антител к KAAG1 вторичным антителом было антитело осла к IgG (H+L) человека, конъюгированное с родамином Red-X, в разведении 1:300. Для антитела к LAMP1 вторичным антителом было антитело козы к IgG (H+L) мыши, конъюгированное с DyLight488, в разведении 1:300. Оба вторичных антитела получали от Jackson ImmunoResearch. Покровные стекла промывали в PBS и погружали в препятствующий обесцвечиванию реактив ProLong Gold с DAPI. Как видно на фиг. 5А, спустя 4 ч инкубирования при 37°С в присутствии клеток SKOV-3 карциномы яичника антитело 3А4 можно было выявить в комплексах в основном вблизи околоядерной области (стрелочками, в левой части фиг. 5А), что представляет собой типичные пути эндосомально-лизосомальной интернализации. Это наблюдение дополнительно подтвердили в случае, когда визуализировали лизосомальный маркер LAMP1 и обнаруживали, что он также экспрессировался в данных областях (стрелочками, в средней части фиг. 5А). Что важно, объединение двух изображений привело к появлению структур, что указывает на то, что 3А4 и антитела к LAMP1 присутствовали в одних и тех же структурах (стрелочками, в правой части фиг. 5А). Совместная локализация 3А4, которое связывается с KAAG1 на поверхности раковых клеток, с LAMP1, маркером поздних эндосом/лизосом, демонстрирует, что комплекс антитело/антиген интернализировался и что он проходит по пути, пригодному для высвобождения полезного груза, который может быть конъюгирован с антителом 3А4. Идентичные результаты наблюдали в другой линии раковых клеток TOV-21G (см. фиг. 5В).
Все вместе, эти исследования продемонстрировали, что антитела, специфичные к KAAG1, такие как 3А4, можно применять в качестве конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Таким образом, высокий уровень специфичности к карциноме яичников у KAAG1 в сочетании с возможностью интернализации данной цели в клетки может способствовать разработке средств по типу ADC.
Пример 5.
Предпочтительное выявление KAAG1 на поверхности раковых клеток.
Несмотря на то что были разработаны несколько антител, взаимодействующих с различными эпитопами белка KAAG1, доступность этих эпитопов при экспрессии KAAG1 на поверхности интактных раковых клеток не была полностью изучена. Биоинформационный анализ первичной аминокислотной структуры KAAG1 (общее число аминокислот в белке человека составляет 84) не выявил каких-либо очевидных последовательностей, которые могли соответствовать трансмембранному домену, и поэтому не было полностью понятно то, как KAAG1 заякоривается в клеточной мембране.
Было обнаружено, что полученные антитела к KAAG1 связывались с тремя различными участками в белке KAAG1 (см. РСТ/СА2009/001586). Большинство антител взаимодействуют с аминокислотами 35-60 белка KAAG1 и в данном описании проиллюстрированы посредством антител 3D3 и 3G12. Антитела, которые взаимодействуют с карбоксиконцом KAAG1 между аминокислотами 61-84, проиллюстрированы посредством антитела 3А4. Наконец, антитела, которые взаимодействуют с аминоконцевым участком белка, которые проиллюстрированы посредством 3С4, продемонстрировали очень незначительное связывание с клетками, которые экспрессируют KAAG1.
В настоящем документе показано, что при экспрессии KAAG1 в клетках карбоксиконцевой участок (аминокислоты 61-84) выставлен во внеклеточное пространство и что антитела, которые нацеливаются на данный участок, являются наиболее эффективными при выявлении и потенциальном лечении положительных по KAAG1 клеток. Антитела, которые связываются со срединным участком KAAG1 (аминокислоты 35-60), также могут выявлять KAAG1 на поверхности клеток, но в меньшей степени, чем антитела, которые взаимодействуют с карбоксиконцом.
Линии клеток карциномы яичника, такие как SKOV-3, положительны в отношении экспрессии KAAG1. Эти клетки применяли для выявления экспрессии KAAG1 путем проточной цитометрии, которая представляет собой способ, позволяющий выявлять белки клеточной поверхности, и хорошо известна специалистам в данной области техники. Вкратце, для каждого образца 100000 клеток инкубировали на льду в течение 1 ч с первичным антителом (либо с антителом к KAAG1, либо с контрольным антителом) в концентрации 1 мкг/мл. Спустя несколько промываний ледяным PBS окрашенные клетки инкубировали с вторичным антителом, которое было сконъюгировано с флурохромом (FITC), которое выявляет наличие первичного антитела, связанного с клетками. Спустя несколько дополнительных промывок клетки проанализировали посредством проточного цитометра. Выраженные на фиг. 6 результаты пока
- 27 038979 зывают количество сигналов (клеток), представлены на оси Y, и величину флуоресценции (флуоресцентный сигнал), - на оси X. При инкубировании клеток SKOV-3 с антителом 3А4 наблюдали большой сдвиг флуоресценции, что указывает на то, что на поверхности клеток (фиг. 6А) присутствовал избыточный белок KAAG1 и что он эффективно распознавался этим антителом. В идентичных условиях антитела, которые взаимодействовали со срединным участком KAAG1, 3G12 и 3D3 (фиг. 6А), были гораздо менее эффективны для выявления KAAG1. При инкубировании клеток с повышенной концентрацией 3G12 или 3D3 на клеточной поверхности можно было выявить KAAG1 (не показано). При инкубировании клеток либо с контрольным IgG (фиг. 6А), либо с 3С4 антитело к аминоконцу KAAG1 (фиг. 6А) не наблюдали какой-либо сигнал. Эти результаты указывают на то, что антитела, взаимодействующие с карбоксиконцом KAAG1, могут выявлять антиген на поверхности раковых клеток более эффективно, чем антитела, направленные к другим участкам KAAG1. Это позволяет предположить, что карбоксиконец KAAG1 выставлен во внеклеточное (внешнее) пространство клетки. Похожие результаты получили для других линий раковых клеток, которые экспрессируют KAAG1.
Также провели эксперимент на клетках SKOV-3, которые были пермеабилизированы посредством Triton X-100. Triton X-100, как правило, применяют для пермеабилизации клеточных мембран и высвобождения мембранных белков. При инкубации пермеабилизированных клеток с 3А4 и измерении в проточном цитометре (см. фиг. 6В) сигнал был похож на сигнал, полученный от интактных клеток. К удивлению, при инкубации пермеабилизированных клеток с антителом 3G12, которое связывается со срединным участком KAAG1 (фиг. 6В), сигнал был таким же сильным, как и для 3А4. Эти результаты указывают на то, что срединный участок KAAG1, вероятно, находится в клеточной мембране или внутри клетки. Похожий результат получили с антителом 3D3, другим связывающимся со срединным участком фрагментом (фиг. 6В), но сигнал, полученный для 3D3, был не настолько сильным. Как и ранее, IgG-контроль не демонстрировал какой-либо выявляемый сигнал в данном анализе (фиг. 6В). Что интересно, инкубация клеток с антителом 3С4, которое связывается с аминоучастком KAAG1, не давала какой-либо выявляемый сигнал (фиг. 6В). Этот последний результат позволяет предположить, что аминоучасток KAAG1, вероятно, отщепляется при транспорте белка к клеточной мембране.
В целом, данные эксперименты дают большее понимание структуры и ориентирования антигена KAAG1 при его экспрессии на поверхности раковых клеток. Исходя из этих данных, предложены две модели структуры KAAG1 на клеточной поверхности (фиг. 7). Согласно первой модели (фиг. 7, модель А) данные позволяют предположить, что срединная часть является собственно трансмембранным участком KAAG1, который только частично выступает во внеклеточное пространство. Это сделает карбоксиконец KAAG1 легко выявляемым, а срединный участок более трудным для связывания. Согласно второй модели (фиг. 7, модель В) KAAG1 заякорен в мембране с помощью другого белка, который сам по себе залегает в клеточной мембране. И снова, карбоксиконец будет легко доступным для антител, таких как 3А4, но взаимодействие KAAG1 и белка-партнера сделает трудным доступ к срединному участку. Результаты, демонстрирующие, что антитела, состоящие как связывающегося с карбоксиконцом фрагмента (как проиллюстрировано посредством 3А4) и связывающегося со срединным участком фрагмента (как проиллюстрировано посредством 3G12 и 3D3), при тестировании в присутствии пермеабилизированных клеток согласуются с обеими моделями. Неспособность антитела 3С4 связываться с KAAG1 у интактных или пермеабилизированных клеток, вероятно, является следствием отсутствия аминокислот, содержащихся в аминоконце зрелой процессированной мембранной формы KAAG1, и обе модели согласуются с этим.
Эти результаты позволяют предположить, что антитела, которые нацелены на карбоксиконец KAAG1 у раковых клеток, в частности участок, перекрываемый аминокислотами 61-84, являются наиболее пригодными для разработки антител для применений в качестве терапевтических средств для лечения разновидностей карцином, экспрессирующих KAAG1. Кроме того, другие применения для антител к KAAG1, которые связываются с карбоксиконцевым участком, включают диагностические вещества для выявления разновидностей карцином, экспрессирующих KAAG1.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты со специфичностью связывания, сходной с антителом 3А4, можно получить или выделить путем иммунизации животного С-концевой частью KAAG1 в соответствии со способами, известными в данной области техники, включая методику с применением гибридом, путем скрининга библиотеки антитела или антигенсвязывающих фрагментов с С-концевой частью KAAG1 и/или осуществления анализа конкурентного связывания выделенных антител или антигенсвязывающего фрагмента с описанным в данном документе антителом 3А4.
Пример 6.
Гуманизация путем конструирования мышиного моноклонального антитела 3А4.
3D моделирование вариабельных участков мышиного моноклонального антитела 3А4.
Данную задачу выполнили с помощью гомологичного моделирования. Наиболее похожие матричные структуры по отношению к последовательностям вариабельного участка легкой и тяжелой цепей мышиного 3А4 (SEQ ID NO: 4 и 2) обнаружили с помощью BLAST-поиска по PDB. Для построения начальной модели вариабельного участка мышиного 3А4 использовали следующие матричные структуры (коды PDB): 2IPU (цепь L) для легкой цепи и 1F11 (цепь В) для тяжелой цепи. Другие подходящие мат
- 28 038979 рицы можно обнаружить в записи 2DDQ в PDB для легкой цепи и в записях 3IY3, 1KTR, 2VXT, 1А6Т и 1IGI в PDB для тяжелой цепи. На данных матричных структурах в соответствии с последовательностями мышиного 3А4 произвели необходимые мутации, 7 мутаций в легкой цепи 2IPU и 17 мутаций плюс делеция трех остатков в тяжелой цепи 1F11. Мутантные структуры, соответствующие тяжелой и легкой цепям с вариабельными участками мышиного 3А4, собрали в двухцепочечные структуры антитела путем наложения тяжелой и легкой цепей с соответствующими матричными структурами. Полученную структуру собранного вариабельного участка 3А4 сначала совершенствовали путем минимизации энергии с помощью силового поля AMBER, а затем поэтапного освобождения от ограничений, начиная от петель CDR, которые были релаксированы первыми, до тяжелых атомов скелета в каркасном участке, которые были полностью релаксированы лишь на последней стадии. Петлю CDR-H3 в каждой структуре вариабельного участка антитела затем совершенствовали путем получения конформационного образца с минимизацией по Монте-Карло (МСМ), в котором двугранные углы в участке CDR-H3 подбирали в каждом цикле МСМ с последующей минимизацией энергии предварительно заданного участка, простирающегося на 10 А вокруг изначальной конформации петли CDR-H3. Представление смоделированного вариабельного участка мышиного антитела 3А4 приведено на фиг. 8. Структуры человеческих или гуманизированных вариабельных последовательностей, которые наиболее похожи на каждую из вариабельных последовательностей 3А4, также определили из PDB, а затем наложили на смоделированные структуры вариабельных участков мышиного 3А4. Эти структуры включают записи 3QCT, 3AAZ, 1WT5 и 3М8О в PDB для легкой цепи и записи 1I9R, 3NFP, 1Т04, 1ZA6, 3НС4, 2D7T и 1WT5 в PDB для тяжелой цепи. Эти структуры использовали для оценки при моделировании мутаций в каркасном участке для построения гуманизированных 3D-структур, исходя из смоделированной мышиной 3D-структуры.
Характеристика аминокислотных последовательностей мышиного 3А4 и смоделированной структуры.
Данный этап осуществляли для оценки показателя гуманизации, показателя предрасположенности контактировать с антигеном, для очерчивания CDR, канонических остатков, упаковки внутри цепи (граничные остатки VH/VL), упаковки вариабельных/константных участков (граничные остатки VH/CH и VL/CL), нестандартных каркасных остатков, потенциальных сайтов для N- и О-гликозилирования, погруженных остатков, остатков верньерной зоны и вблизи CDR. Для оценки данных свойств применяли доступные в Интернете ресурсы и локальное программное обеспечение.
Выбор наилучших каркасов тяжелой цепи и легкой цепи человека для мышиных CDR.
Это осуществляли с помощью стандартного сравнения гомологии последовательностей по отношению к локальной копии баз данных эмбриональных линий человека (VBASE) по отношению к другим библиотекам последовательностей (Genbank и SwissProt), а также набору каркасных консенсусных последовательностей человека. Поиски BLAST провели для отыскивания совпадений последовательностей с наивысшей гомологией только в каркасом участке (исключая, таким образом, CDR), при этом приводя в соответствие с длиной петель CDR. Каркасы человека, обнаруженные для легкой и тяжелой цепей антитела 3А4, соответствуют классам k2 и hl соответственно. Помимо консенсусных последовательностей человека для данных классов, получили несколько каркасных последовательностей зародышевой линии человека, которые наиболее схожи с каркасными последовательностями 3А4.
Определение каркасных остатков для возвратных мутаций и разработка множественных гуманизированных вариантов.
Это важный этап, при помощи которого отмечают аминокислотные остатки, которые с особой осторожностью необходимо мутировать в соответствующие последовательности человека. Эти остатки представляют собой основные кандидаты для возвратных мутаций в мышиных последовательностях в случае потери аффинности. Это наиболее трудный и непредсказуемый этап гуманизации по схеме, особенно в отсутствие экспериментальной структуры комплекса антитело-антиген. Он основан на определении остатков в одной или нескольких из следующих категорий: канонические остатки, остатки CDR-H3, остатки верньерной зоны, нестандартные остатки, остатки вблизи CDR (в пределах 5 А), упаковка внутри цепи и остатки сайта гликозилирования. Такие остатки могут прямо или опосредованно затрагивать сайт связывания антигена и аффинность. Показатель предрасположенности контактирования с антигеном, а также встречаемость аминокислот в базах данных зародышевых линий человека в каждом положении также очень важны при вынесении решения, можно ли безопасно мутировать определенный остаток из мышиной последовательности в последовательность человека. Гуманизация вариабельного участка легкой цепи антитела 3А4 включает 11 мутаций в его предложенном гуманизированном каркасе для 100% гуманизации каркаса. Гуманизация вариабельного участка тяжелой цепи антитела 3А4 включает 23 мутации в его предложенном гуманизированном каркасе для 100% гуманизации каркаса. Эти на 100% гуманизированные последовательности вариабельного участка обозначены Lvh1 и Hvh1 соответственно (SEQ ID NO: 33 и 38). Также были сконструированы дополнительные гуманизированные последовательности, в которых несколько остатков из мышиных последовательностей 3А4 сохранили, исходя из тщательного структурного и сравнительного анализов последовательностей, которые показали высокую вероятность изменения антигенсвязывающей аффнинности в случае введения мутаций в эти положения. Эти последовательности вариабельных участков обозначены Lvh2, Hvh2, Hvh3 и Hvh4 (SEQ ID NO: 34,
- 29 038979
39, 40 и 41).
Два варианта гуманизированных легких цепей (включающие константный участок) в данном документе определены как Lh1 (SEQ ID NO: 43) и Lh2 (SEQ ID NO: 44). Четыре варианта гуманизированных тяжелых цепей (включающие константный участок) в данном документе определены как Hh1 (SEQ ID NO: 46), Hh2 (SEQ ID NO: 47), Hh3 (SEQ ID NO: 48) и Hh4 (SEQ ID NO: 49). Две гуманизированные легкие цепи и четыре гуманизированные тяжелые цепи можно собрать в восьми гуманизированных антител (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3, Lh1Hh4, Lh2Hh1, Lh2Hh2, Lh2Hh3 и Lh2Hh4). Молекулярные модели для этих комбинаций построили при помощи гомологичного моделирования, исходя из 3D модели вариабельного участка мышиного 3А4, и они изображены на фиг. 9A-9H.
В случае гуманизированной последовательности Lvh2 (SEQ ID NO: 34) легкой цепи 3А4 сохраняли каркасные остатки Val-L2 и Lys-L45 из мышиной последовательности, поскольку остаток L2 наполовину погружен, контактирует как с CDR-L1, так и с CDR-L3 и имеет предрасположенность к контакту с антигеном, в то время как остаток L45 взаимодействует с тяжелой цепью. Отмечали, что оба этих мышиных остатка могут встречаться в человеческих каркасах. В случае гуманизированной последовательности Hvh2 (SEQ ID NO: 39) тяжелой цепи 3А4 сохраняли каркасные остатки I[e-Н2 и Lys-L73 из мышиной последовательности, поскольку остаток Н2 наполовину погружен, контактирует как с CDR-H1, так и с CDR-H3 и имеет предрасположенность к контакту с антигеном, в то время как остаток Н73 принадлежит к верньерной зоне, поддерживающей CDR-H2, и оба этих мышиных остатка могут встречаться в человеческих каркасах. В случае гуманизированной последовательности Hvh3 (SEQ ID NO: 40) тяжелой цепи 3А4 сохраняли, возвратные мутации IIe-Н2 и Lys-L73, и помимо них сохранили каркасные остатки IIe-H48, Ala-H67, Leu-H69 и Val-H71 из мышиной последовательности, поскольку все эти дополнительные мышиные остатки являются погруженными остатками и входят в верньерную зону, поддерживающую CDR-H2, а также мышиный остаток Н71 может встречаться в человеческих каркасах. В случае гуманизированной последовательности Hvh4 (SEQ ID NO: 41) тяжелой цепи 3А4 включили все шесть возвратных мутаций гуманизированного варианта Hvh3 плюс два дополнительных мышиных каркасных остатка Lys-H38 и Lys-H66, поскольку они являются наполовину погруженными остатками, близкими к CDR-H2. Полученные аминокислотные последовательности мышиных и гуманизированных цепей приведены в табл. 1. Выравнивание вариабельных участков мышиных и гуманизированных легких цепей показано на фиг. 10А, а выравнивание вариабельных участков мышиных и гуманизированных тяжелых цепей показано на фиг. 10B.
Фиг. 11А и 11B представляют собой выравнивание вариабельного участка мышиной легкой цепи с вариабельным участком на 100% гуманизированной легкой цепи и вариабельного участка мышиной тяжелой цепи с вариабельным участком на 100% гуманизированной тяжелой цепи соответственно. Данная фигура иллюстрирует аминокислоты, которые являются консервативными, и аминокислоты, которые были выбраны для замены.
Пример 7.
Сборка и экспрессия гуманизированных вариантных антител 3А4.
Цель данных исследований заключается в определении кинетических параметров антител к кластерину. В частности, для определения того, влияет ли гуманизация моноклонального антитела 3А4 к KAAG1 на кинетические параметры его связывания с KAAG1 человека. С этой целью разработали способ кинетического анализа с помощью прибора ProteOn XPR36 от BioRad. KAAG1 человека иммобилизировали на сенсорном чипе. Ввели полноразмерные антитела или Fab-фрагменты и позволили провзаимодействовать с иммобилизированным KAAG1.
Построение плазмиды, кодирующей химерные (мышиные) тяжелую и легкую цепи 3А4.
Тяжелую и легкую цепи химерного антитела амплифицировали с помощью ПЦР с исходными цепями иммуноглобулина мыши с применением следующих олигонуклеотидных праймерных пар: тяжелая цепь, 5'-олиго, кодируемый SEQ ID NO: 50, и 3'-олиго, кодируемый SEQ ID NO: 51; легкая цепь, 5'-олиго, кодируемый SEQ ID NO: 52, и 3'-олиго, кодируемый SEQ ID NO: 53. Полученные ПЦР-продукты расщепили с помощью Hind III и клонировали в pK-CR5 (SEQ ID NO: 21), предварительно расщепленную с помощью Hind III.
Построение плазмид, кодирующих варианты 1, 2, 3 и 4 гуманизированной тяжелой цепи 3А4.
Фрагменты, кодирующие гуманизированный участок тяжелой цепи антитела 3А4 (Hh1, Hh2, Hh3 и Hh4), заказали у GenScript (Пискатауэй, США). ДНК-фрагменты, включающие последовательности козак и стоп-кодонов, расщепили с помощью HindIII и клонировали в сайт HindIII плазмиды pK-CR5, предварительно дефосфорилированной при помощи фосфатазы из кишечника коровы (NEB) для предупреждения рециркуляризации. На фиг. 12А изображена карта плазмиды pK-CR5-3A4-HC-variant1. Все варианты тяжелой цепи гуманизированного 3А4 построили аналогичным образом.
Построение плазмид, кодирующих варианты 1 и 2 гуманизированной легкой цепи 3А4.
Фрагменты, кодирующие участки легкой цепи человека антитела 3А4 (Lh1 и Lh2), заказали у GenScript. ДНК-фрагменты, включающие последовательности козак и стоп-кодонов, расщепили с помощью BamHI и клонировали в сайт BamHI плазмиды pMPG-CR5 (SEQ ID NO: 55), предварительно дефосфорилированной при помощи фосфатазы из кишечника коровы (NEB) для предупреждения рецирку- 30 038979 ляризации. На фиг. 12B изображена карта плазмиды pMPG-CR5-3A4-LC-variant1. Все варианты легкой цепи гуманизированного 3А4 построили аналогичным образом.
Исследование временной трансфекции.
Плазмидную ДНК выделили из небольших культур Е. coli с применением набора Mini-Prep (Qiagen Inc, Миссиссога, Онтарио) согласно рекомендациям производителя. Вкратце, 2 мл LB среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, засеяли одной колонией, забранной после лигирования и трансформации. Культуры инкубировали при 37°С в течение ночи с интенсивным помешиванием (250 об/мин). Затем плазмиду выделили из 1,5 мл культуры с применением протоколов, буферов и колонок, поставляемых с набором. ДНК элюировали с помощью 50 мкл стерильной воды. Плазмидную ДНК выделили из большой культуры Е. coli с применением набора Plasmid Plus Maxi (Qiagen Inc, Миссиссога, Онтарио) согласно рекомендациям производителя. 200 мл LB среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, засеяли одной свежей колонией Е. coli и инкубировали в течение ночи при 37°С с интенсивным помешиванием (250 об/мин). Бактерии (130 мл культуры для тяжелой цепи и 180 мл культуры для легкой цепи) осаждали центрифугированием при 6000xg, в течение 15 мин, при 4°С и выделяли плазмиду с применением протоколов, буферов и колонок, поставляемых с набором. Чистые плазмиды ресуспендировали в стерильном 50 мМ Tris, pH 8, и количественно оценили путем измерения оптической плотности при 260 нм. Перед трансфекцией очищенную плазмиду простерилизовали экстракцией с фенолом/хлороформом с последующим осаждением этанолом. Плазмиды ресуспендировали в стерильном 50 мМ Tris, pH 8, и количественно оценивали по оптической плотности при 260 нм.
Перед трансфекцией клетки (СНО-сТА) промывали посредством PBS и ресуспендировали в концентрации 4,0x106 клеток/мл в ростовой среде (CD-CHO, Invitrogen) без сульфата декстрана в течение 3 ч в суспензионной культуре. Для каждой комбинации плазмид 45 мл клеток трансфицировали путем медленного добавления 5 мл среды CD-CHO, дополненной 10 мкг/мл каждой плазмиды и 50 мкг/мл полиэтиленимина (PEI Max; Polysciences). Конечная концентрация составила 1 мкг/мл каждой плазмиды и 5 мкг/мл PEL. Через 2 ч клетки трансфицировали при 30°С. На следующие дни к клеткам добавляли 50 мкг/мл сульфата декстрана и 3,75 мл каждой добавки (Efficient Feed А и В, Invitrogen) и инкубировали их при 30°С в течение 13 дней. 2,5 мл Feed А и 2,5 мл Feed В добавили на 4, 6, 8 и 11 день. На 13-й день очищали супернатант путем центрифугирования и профильтровали через 0,22 мкм фильтр.
Клетки СНО (СНО-сТА) трансфицировали плазмидами, кодирующими различные варианты гуманизированных тяжелых и легких цепей антитела 3А4, под управлением промотора CR5. Осуществили трансфекцию различными комбинациями легкой и тяжелой цепей. В качестве контроля клетки также трансфицировали плазмидами, кодирующими химерное/мышиное антитело.
Очистка антитела.
мл супернатанта от трансфицированных образцов клеток СНО концентрировали центрифугированием с применением кассеты Amicon Ultra (Ultacell-50k) при 1500 об/мин. Сконцентрированное антитело (550 мкл) очистили с помощью набора Nab spin kit Protein A Plus (Thermo Scientific) согласно рекомендациям производителя. Очищенные антитела затем обессолили с помощью PBS и кассеты для концентрирования Amicon Ultra (Ultracel-10K) при 2500 об/мин до конечного объема 250 мкл. Очищенное антитело количественно оценили путем считывания OD280 с помощью спектрофотометра Nanodrop и хранили замороженным при -20°С. Аликвоту очищенного антитела ресуспендировали в равном объеме Laemmli 2x и нагревали при 95°С в течение 5 мин, и охлаждали на льду.
Строили стандартную кривую с помощью известного количества очищенной каппа lgG1 человека из плазмы с миеломой человека (Athens Research). Образцы разделяли на полиакриламидном геле Novex с 10% Tris-глицин (Invitrogen Canada Inc., Берлингтон, Онтарио) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-N (Amersham Bioscience Corp., Бэ-д'Юрфе, Квебек) на 1 ч при силе тока 275 мА. Мембрану фиксировали в течение 1 ч в 0,15% Tween 20, 5% обезжиренного молока в PBS и инкубировали в течение 1 ч с антителом козы к IgG человека (H+L), конъюгированным с Су5 (Jackson, № по каталогу 109-176-099). Проявляли сигнал и определяли количество путем сканирования при помощи сканера Typhoon Trio+ (GE Healthcare). Как показано на фиг. 13, все комбинации вариантов гуманизированного антитела 3А4 экспрессировались в клетках СНО.
Пример 8.
Кинетический анализ мышиного и гуманизированного антитела 3А4.
Источники.
GLM сенсорные чипы, набор для связывания аминоконца Biorad ProteOn (EDC, sNHS и этаноламин) и буферы с 10 мМ ацетатом натрия приобрели у Bio-Rad Laboratories (Миссиссога, Онтарио). Буфер HEPES, EDTA и NaCl приобрели у Sigma-Aldrich (Оаквилль, Онтарио). 10%-ный раствор Tween 20 приобрели у Teknova (Холлистер, Калифорния). Антитело козы, специфическое к Fc-фрагменту IgG человека, приобрели у Jackson ImmunoResearch. Колонку для гель-фильтрации Superdex 75 10/300 GL приобрели у GE Healthcare.
Гель-фильтрация.
Белок KAAG1 в концентрации 3,114 мг/мл и объемом 220 мкл ввели в колонку Superdex G75. Раз- 31 038979 деление выполнили при 0,4 мл/мин, в подвижном буфере HBST (см. ниже) без Tween 20. Объем собранных фракций составил 500 мкл. Концентрацию KAAG1 в каждой фракции определили по OD280 с помощью коэффициента удлинения 5500 и MW 8969. На фиг. 14 представлен профиль гель-фильтрации
KAAG1. Небольшой пик возможного агрегата представляет собой элюат на уровне около 11 мл. Элюат белка на уровне 13 мл использовали в качестве аналита для анализа SPR (фракции 15-19).
Анализы с биосенсорами SPR.
Все анализы с применением поверхностного плазмонного резонанса осуществляли с помощью прибора BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories Ltd. (Миссиссога, Онтарио) с подвижным буфером HBST (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3,4 мМ EDTA и 0,05% Tween 20, рН 7,4) при температуре 25°С. Поверхность для захвата мышиного Fc-участка создали при помощи сенсорного чипа GLM, активированного посредством 1:5 разведения стандартных растворов BioRad sNHS/EDC, вводимых в течение 300 с при 30 мкл/мин в направлении подачи аналита (горизонтальное). Сразу после активации в направлении подачи аналита вводили 13 мкг/мл раствор антитела, специфичного к Fc-фрагменту IgG человека в 10 мМ NaOAc, pH 4,5, со скоростью потока 25 мкл/мин до тех пор, пока не иммобилизировалось примерно 8000 резонансных единиц (RU). Оставшиеся активные группы заблокировали посредством 300 с введения 1 М этаноламина со скоростью 30 мкл/мин в направлении подачи аналита, и это также обеспечивает создание ложно активированных промежуточных сигналов для холостого контроля. Скрининг вариантов 3А4 на связывание с KAAG1 проходил в два этапа, непрямой захват вариантов 3А4 из клеточного супернатанта на поверхность, специфическую к Fc-фрагменту IgG человека, в направлении подачи лиганда (вертикальное) с последующим введением KAAG1 в направлении подачи аналита. Сначала для стабилизации фонового уровня использовали одно введение буфера в течение 30 с со скоростью 100 мкл/мин в направлении подачи лиганда. Для каждого захвата 3А4 неочищенные варианты 3А4 в среде для культивирования клеток разбавили до 4% в HBST или использовали примерно 1,25 мкг/мл очищенного 3А4 в HBST. Четыре-пять вариантов 3А4 вместе с 3А4 дикого типа одновременно ввели в отдельные каналы для лигандов за 240 с при потоке 25 мкл/мин. Это привело к насыщающему захвату 3А4 примерно 400-700 RU на поверхности, специфической к Fc-фрагменту IgG человека. Первый канал для лиганда, при необходимости, оставляли пустым в качестве холостого контроля. Сразу после этапа захвата 3А4 последовали два введения буфера в направлении подачи аналита для стабилизации фонового уровня, а затем ввели очищенный при помощи гель-фильтрации KAAG1. Для типичного скрининга в отдельные каналы для аналита одновременно вводили пять концентраций KAAG1 (8, 2,66, 0,89, 0,29 и 0,098 нМ) и буферный контроль со скоростью 50 мкл/мин в течение 120 с с 600 с фазой диссоциации, что дало набор сенсограмм связывания с буферным эталоном для каждого из захваченных вариантов 3А4. Комплексы поверхности, специфической к Fc-фрагменту IgG человека, - 3А4 разбили путем 18 с подачи 0,85% фосфорной кислоты в течение 18 с при 100 мкл/мин для подготовки поверхности, специфической к Fc-фрагменту IgG человека, к следующему циклу введения. Сенсограммы выровняли и сопоставили с двумя эталонами с помощью введения буферной холостой пробы и промежуточных сигналов и полученные сенсограммы проанализировали с помощью программного обеспечения ProteOn Manager, версии 3.0. Кинетические значения и значения аффинности определили путем приближения упомянутых сенсограмм к модели связывания Langmuir 1:1 с применением локального Rmax, а константы аффинности (KD M) вывели из полученных констант скорости (kd c’1/ka М’-с’1).
Определение констант скорости и аффинности.
На фиг. 15 подытожены константы скорости ассоциации (ka, 1/М-с) и диссоциации (kd, 1/с), а также константы аффинности (KD, M) для взаимодействия KAAG1 с очищенным мышиным 3А4, мышиным 3А4, которое временно экспрессировалось в качестве химерного, и временно экспрессируемыми гуманизированными вариантами. Эти константы графически представлены на фиг. 16. Константы скорости ассоциации очень сходны с чистыми исходными, химерными и гуманизированными вариантами 3А4 (фиг. 16А). Константы скорости диссоциации сходны с временно экспрессируемыми химерами при сравнении с исходными 3А4, что указывает на то, что процедура трансфекция не изменила параметры взаимодействия KAAG1 с антителом (фиг. 16B). Тем не менее все гуманизированные варианты похоже имели слегка измененную скорость диссоциации, т.е. более быструю скорость диссоциации (фиг. 16B). Это отражено в константах аффинности (фиг. 16С). Таким образом, существует линейная корреляция между аффиностью связывания (logKD) гуманизированного варианта и количеством возвратных мутаций, осуществленных в исходном антителе (LcHc) с понижением аффинности связывания по мере увеличения количества мутаций. Однако разница аффинности связывания отличается лишь в 4 раза между наихудшим вариантом (H1L1, 0,47 нМ), у которого не было сохраненных мышиных остатков, и наилучшим вариантом, у которого было 10 сохраненных мышиных остатков (H4L2, 0,1 нМ). Наконец, было обнаружено, что аффинность связывания у всех вариантов с KAAG1 является субнаномолярной, а наилучший вариант (H4L2, 0,1 нМ) демонстрировал аффинность приблизительно в 6 раз слабее, чем мышиное антитело (LcHc, 0,057 нМ). В целом, данные результаты указывают на то, что гуманизация была успешной, поскольку все варианты проявляли очень высокую аффинность к KAAG1.
- 32 038979
Пример 9.
Связывание гуманизированных вариантов 3А4 с KAAG1 в ELISA.
Также применили способы ELISA для сравнения связывающей активности гуманизированных вариантов 3А4 с мышиным антителом 3А4. Рекомбинантный KAAG1 человека внесли в 96-луночные планшеты для нанесения покрытия на ночь, промыли и инкубировали в течение 1 ч при RT с повышающимися количествами мышиных или гуманизированных вариантов 3А4. После другого цикла этапов промывки в лунки добавили антитело к антителу человека, конъюгированное с HRP, и калориметрически измерили связанное антитело 3А4 при Abs450. Как показано на фиг. 17А, гуманизированные варианты (Lh1Hh1, Lh1Hh2, Lh1Hh3 и Lh1Hh4) проявляли очень сходное связывание с KAAG1 при сравнении с мышиным 3А4 (LcHc). Этот результат указывал на то, что все четыре варианта гуманизированной тяжелой цепи были сопоставимы с исходной тяжелой цепью h3A4 при сборке с вариантом L1 гуманизированной легкой цепи. На фиг. 17В показаны результаты, полученные при сборке вариантов тяжелой цепи с вариантом Lh2 гуманизированной легкой цепи 3А4. В этом случае существует различие в связывании вариантов. Например, Lh2hh4 был вариантом с наиболее близким профилем в сравнении с мышиным 3А4. Это согласовывалось с данными SPR (см. пример 3), из которых видно, что вариант 4 тяжелой цепи характеризовался наивысшей аффинностью к KAAG1. Взятые вместе, эти данные по связыванию демонстрируют, что все гуманизированные варианты в данном анализе взаимодействуют с KAAG1 человека. Несмотря на то что существовали тонкие различия, связывание в ELISA согласовывалось с результатами SPR.
Пример 10.
Связывание гуманизированных вариантов 3А4 на поверхности раковых клеток.
Применили проточную цитометрию для оценки способности гуманизированных вариантов 3А4 взаимодействовать с KAAG1, экспрессируемым на поверхности раковых клеток. В связи с этим клетки карциномы яичника SKOV-3, которые, как показали ранее, эффективно связывались 3А4 с помощью проточной цитометрии, инкубировали с восемью гуманизированными вариантами и исходным мышиным антителом. Вкратце, клетки SKOV-3 отделяли от планшета при помощи EDTA и инкубировали на льду либо с 3,0, 0,3 мг/мл, либо 0,3 мг/мл антител в течение 1 ч. После трех этапов промывания клетки инкубировали с вторичным антителом, антителом к IgG человека, конъюгированным с FITC, в течение 1 ч на льду. Флуоресценцию на клеточной поверхности измерили в проточном цитометре, и значения показаны в гистограмме на фиг. 18. Как показано, все варианты могли выявлять KAAG1 на поверхности непермеабилизированных клеток, и наиболее сильные сигналы получили при наиболее высокой концентрации антител 3А4 (3 мг/мл), и они понижались по мере понижения концентрации антитела. Среди различных вариантов варианты с наибольшим количеством обратных мутаций мышиной цепи (фиг. 18, см. Lh1Hh4 и Lh2Hh4) взаимодействовали с KAAG1 на поверхности клеток с наивысшей активностью. Фактически, Lh1Hh4 и Lh2hh4, по-видимому, демонстрировали слегка улучшенное связывание на клеточной поверхности с KAAG1 по сравнению с мышиным антителом 3А4 (LcHc).
Публикации (содержание которых включено в данный документ по ссылке)приведены ниже.
- 33 038979
Ссылки
- Jemal A, Murray Т, Ward Е, Samuels A, Tiwari RC, Ghafoor A, Feuer EJ and Thun MJ. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 2005; 55: 10-30.
- Menon U, Skates SJ, Lewis S, Rosenthal AN, Rufford B, Sibley K, Macdonald N, Dawnay A, Jeyarajah A, Bast RC Jr, Oram D and Jacobs IJ. Prospective study using the risk of ovarian cancer algorithm to screen for ovarian cancer. J Clin Oncol. 2005; 23(31):7919-26.
- Bonome T, Lee JY, Park DC, Radonovich M, Pise-Masison C, Brady J, Gardner GJ, Hao K, Wong WH, Barrett JC, Lu KH, Sood AK, Gershenson DM, Mok SC and Birrer MJ. Expression profiling of serous low malignancy potential, low grade, and high-grade tumors of the ovary. Cancer Res 2005; 65: 10602-10612.
- Chambers, A and Vanderhyden, B. Ovarian Cancer Biomarkers in Urine. Clin Cancer Res 2006; 12(2): 323-327.
- Berek et al. Cancer Medicine. 5th ed. London: B.C. Decker, Inc.; 2000. pp. 1687-1720.
- Bristow R.E. Surgical standards in the management of ovarian cancer. Curr Opin Oncol 2000; 12: 474-480.
- Brown E, Stewart M, Rye T, Al-Nafussi A, Williams AR, Bradburn M, Smyth J and Gabra H. Carcinosarcoma of the ovary: 19 years of prospective data from a single center. Cancer 2004; 100: 2148-2153.
- Shih L-M and Kurman RJ. Molecular Pathogenesis of Ovarian Borderline Tumors: New Insights and Old Challenges. Clin Cancer Res 2005; 11(20): 7273-7279.
- Seidman JD, Russell P, Kurman RJ. Surface epithelial tumors of the ovary. In: Kurman RJ, editor. Blaustein’s pathology of the female genital tract. 5th ed. New York: Springer-Verlag; 2002. pp. 791-904.
- Cannistra SA and McGuire WP. Progress in the management of gynecologic cancer. J. Clin. Oncol. 2007; 25(20): 2865-2866.
- Oei AL, Sweep FC, Thomas CM, Boerman ОС, Massuger LF. The use of monoclonal antibodies for the treatment of epithelial ovarian cancer. Int. J. Oncol. 2008; 32(6): 1145-1157.
- Nicodemus CF and Berek JS. Monoclonal antibody therapy of ovarian cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 2005; 5(1): 87-96.
- Burger RA. Experience with bevacizumab in the management of epithelial ovarian cancer. J. Clin. Oncol. 2007; 25(20): 2902-2908.
- Simon I, Zhuo S, Corral L, Diamandis EP, Sarno MJ, Wolfert RL, Kim NW. B7-H4 is a novel membrane-bound protein and a candidate serum and tissue biomerker for ovarian cancer.
- 34 038979
Cancer Res. 2006; 66(3): 1570-1575.
- Ebel W, Routhier EL, Foley B, Jacob S, McDonough JM, Patel RK, Turchin HA, Chao Q, Kline JB, Old LJ, Phillips MD, Nicolaides NC, Sass PM, Grasso L. Preclinical evaluation of MORab-003, a humanized monoclonal antibody antagonizing folate receptor-alpha. Cancer Immun. 2007; 7: 6-13.
- Van den Eynde BJ, Gaugler B, Probst-Kepper M, Michaux L, Devuyst O, Lorge F, Weynants P, Boon T. A new antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes on a human kidney tumor results from reverse strand transcription. J. Exp. Med. 1999; 190(12): 1793-1799.
- Sooknanan R, Tremblay GB, Filion M. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer. 2007; PCT/CA2007/001134 published under No. WO/2007/147265 on December 27, 2007.
- Schumacher J, Anthoni H, Dahdouh F, Konig IR, Hillmer AM, Kluck N, Manthey M, Plume E, Warnke A, Remschmidt H, Hulsmann J, Cichon S, Lindgren CM, Propping P, Zucchelli M, Ziegler A, Peyrard-Janvid M, Schulte-Korne G, Nothen MM, Kere J. Strong genetic evidence of DCDC2 as a susceptibility gene for dyslexia. Am. J. Hum. Genet. 2006; 78: 52-62.
- Cope N, Harold D, Hill G, Moskvina V, Stevenson J, Holmans P, Owen MJ, O'Donovan MC, Williams J. Strong evidence that KIAA0319 on chromosome 6p is a susceptibility gene for developmental dyslexia. Am. J. Hum. Genet. 2005; 76: 581-591.
- Mor G, Visintin I, Lai Y, Zhao H, Schwartz P, Rutherford T, Yue L, Bray-Ward P and Ward DC Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. PNAS 2005; 102: 76777682.
- Kozak KR, Amneus MW, Pusey SM, Su F, Luong MN, Luong SA, Reddy ST and FariasEisner R. Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis. PNAS 2003; 100: 12343-12348.
- Benoit MH, Hudson TJ, Maire G, Squire JA, Arcand SL, Provencher D, Mes-Masson AM, Tonin PN. Global analysis of chromosome X gene expression in primary cultures of normal ovarian surface epithelial cells and epithelial ovarian cancer cell lines. Int. J. Oncol. 2007; 30(1): 5-17.
- Cody NA, Zietarska M, Filali-Mouhim A, Provencher DM, Mes-Masson AM, Tonin PN. Influence of monolayer, spheroid, and tumor growth conditions on chromosome 3 gene expression in tumorigenic epithelial ovarian cancer cell lines. BMC Med. Genomics 2008; 1(1) :34.
- Buechler J, Valkirs G, Gray J. Polyvalent display libraries.2000; U.S. 6,057,098.
- Durocher Y, Kamen A, Perret S, Pham PL. Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells. 2002; Canadian patent
- 35 038979 application No. CA 2446185.
- Durocher Y. Expression vectors for enhanced transient gene expression and mammalian cells expressing them.2004; U.S. patent application No. 60/662,392.
- Tremblay GB, Filion M. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen. 2009; PCT/CA2009/001586.
- Durocher Y, Kamen A, Perret S, Pham PL. Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells. 2002; Canadian patent application No. CA 2446185.
- Durocher Y. Expression vectors for enhanced transient gene expression and mammalian cells expressing them.2004; U.S. patent application No. 60/662,392.
- Chang MH, Karageorgos LE, Meikle PJ. CD107a (LAMP-1) and CD107b (LAMP-2). 2002; J Biol Regul Homeost Agents. 16:147-51.
- Abhinandan, KR and Martin, ACR. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. 2008; Mol Immunol, 45, 3832-3839.
Последовательности, на которые ссылаются в описании, приведены ниже.
Последовательности
SEQ ID NO:1 - нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи ЗА4.
CAGATCCAGTTGGTGCAATCTGGACCTGAGATGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATG TCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACGACTACATGAGCTGGGTGAAACAGAGCC ATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTTACAACGGTGATACTAACTACAAC CAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGC AGCTCAACAGCCTGACATCGGAAGACTCAGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACCCGGGGG CTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:2 - полипептидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи ЗА4.
QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:3 - нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи ЗА4.
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGGCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTCTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTAC CTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCCACACAGTTTCCAACCGATTTTCTG GGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCA GAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCAC GTTCGGTGCTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO:4 - полипептидная последовательность вариабельного участка легкой цепи ЗА4.
DWMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIHTVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELK
SEQ ID NO:5 - полипептидная последовательность CDR1 тяжелой цепи ЗА4. GYTFTDDYMS
SEQ ID NO:6 - полипептидная последовательность CDR2 тяжелой цепи ЗА4. DINPYNGDTN
SEQ ID NO:7 - полипептидная последовательность CDR3 тяжелой цепи ЗА4. DPGAMDY
SEQ ID NO:8 - полипептидная последовательность CDR1 легкой цепи ЗА4. RSSQSLLHSNGNTYLE
- 36 038979
SEQ ID NO:9 - полипептидная последовательность CDR2 легкой цепи ЗА4.
TVSNRFS
SEQ ID NO: 10 - полипептидная последовательность CDR3 легкой цепи ЗА4. FQGSHVPLT
SEQ ID NO:11 -OGS1773
GTAAGCAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC
SEQ ID NO:12 - OGS1774
GTAAGCGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC
SEQ ID NO: 13 - нуклеотидная последовательность константных участков каппа цепи человека.
GCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAA GGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAA GGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACA CAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT CAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 14 - полипептидная последовательность константных участков каппа цепи человека.
AVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:15
CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGT GAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGA GGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCAC TTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAAT TCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCAT GCCAAGTGGTCCCAGGCTTGAGACGGAGCTTACAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGA ATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAG CACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGGTAC CGCGGCCGCTTCGAATGAGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTT TCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCA
- 37 038979
AATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAA ACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGG TTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACA AAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGA GTGGCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTAT GTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGGGGCC CAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATA AGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAAC GGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCA TATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAA CAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTCCAC GAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTG AACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTG AGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCA GAATAAAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTC ACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAACAATA GAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCTCACACGAATTTATGG CTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGC AGGGACCAAGACAGGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTG GACGCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGC TCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTGTGGA GTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGT GTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAA CCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGC GCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGG GTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGT AGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA GGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGC TATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTAT CCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCT AATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAAT ATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATC TGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGT AGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAG CATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGG GCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAG GTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCA
- 38 038979
ATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT AAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTA TGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGT AAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGT CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCT ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTA CACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGAC GTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCC CGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTG TTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACC CGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGG ATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCAC CGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGA TGTAATTAAAGTAGGCGGT
SEQ ID NO:16 - OGS18500
ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGATGTTGTGATGACCCAAACTCC
SEQ ID NO:17 - OGS2084
GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTCCG
SEQ ID NO:18 - OGS1769
GTAAGCGCTAGCGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCC
SEQ ID NO:19 - OGS1770
GTAAGCGAATTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTG
SEQ ID NQ:20 - нуклеотидная последовательность участка CH1 иммуноглобулина человека.
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGG GGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGT
SEQ ID NO:21 - полипептидная последовательность участка СН1 иммуноглобулина человека.
- 39 038979
AATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAA GAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCC TGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCA CGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCG AAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGT GTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTG AGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAG TGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGA CCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTT GGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAG CAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCA ACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTA AGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTT TTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACG TGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATC CTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTT TGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGC AGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTA GCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATA AGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGA GATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACA GGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGA AACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTG TGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCG AGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCG GGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTAC ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGA AACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCTAGAGGTCGACCAATTCTCATGTTTGAC AGCTTATCATCGCAGATCCGGGCAACGTTGTTGCATTGCTGCAGGCGCAGAACTGGTAGGT ATGGCAGATCTATACATTGAATCAATATTGGCAATTAGCCATATTAGTCATTGGTTATATAGC ATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTAT
- 40 038979
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:22
CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGT GAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGA GGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCAC TTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTGCCGCCACCATGGAGACA GACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGGAGACGGA GCTTACGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG CCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATT TATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGA GGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACG AACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTC AGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATG CTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAA GATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCC AAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTT GCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAG CATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA
- 41 038979
CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAAT CTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTA TATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTAT CCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTA GACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAA TACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAA AAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTT GCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTT GGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTT CGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATT ATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGAC TTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAAT TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGAT CGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATG CCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCG CGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACG ACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCA CTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAA CTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT CTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCA GCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAA GAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCC AGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCG CAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTA CACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAG AAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGC TTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTAT CCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAG CCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGTACATTTATATTGGCTCATG
- 42 038979
TCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGC CTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCAC TTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTA AATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTA CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGC GTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGA CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGA ACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGC GGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTC CGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAAC CTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGC GGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAG TAGGCGGT
SEQ IDNO:23 - OGS1879
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGATCCAGTTGGTGCAATCTGG
EQ ID NO:24 - OGS1810
GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC
SEQ ID NO:25
GTAAGCGGATCCATGGATGACGACGCGGCGCCC
SEQ ID NO:26
GTAAGCAAGCTTAGGCCGCTGGGACAGCGGAGGTGC
SEQ ID NO:27
GTAAGCAAGCTTGGCAGCAGCGCCAGGTCCAGC
SEQ ID NO:28
GAGGGGCATCAATCACACCGAGAAGTCACAGCCCCTCAACCACTGAGGTGTGGGGGGGTA GGGATCTGCATTTCTTCATATCAACCCCACACTATAGGGCACCTAAATGGGTGGGCGGTGG GGGAGACCGACTCACTTGAGTTTCTTGAAGGCTTCCTGGCCTCCAGCCACGTAATTGCCCC CGCTCTGGATCTGGTCTAGCTTCCGGATTCGGTGGCCAGTCCGCGGGGTGTAGATGTTCC TGACGGCCCCAAAGGGTGCCTGAACGCCGCCGGTCACCTCCTTCAGGAAGACTTCGAAGC TGGACACCTTCTTCTCATGGATGACGACGCGGCGCCCCGCGTAGAAGGGGTCCCCGTTGC GGTACACAAGCACGCTCTTCACGACGGGCTGAGACAGGTGGCTGGACCTGGCGCTGCTGC CGCTCATCTTCCCCGCTGGCCGCCGCCTCAGCTCGCTGCTTCGCGTCGGGAGGCACCTCC GCTGTCCCAGCGGCCTCACCGCACCCAGGGCGCGGGATCGCCTCCTGAAACGAACGAGA AACTGACGAATCCACAGGTGAAAGAGAAGTAACGGCCGTGCGCCTAGGCGTCCACCCAGA GGAGACACTAGGAGCTTGCAGGACTCGGAGTAGACGCTCAAGTTTTTCACCGTGGCGTGC ACAGCCAATCAGGACCCGCAGTGCGCGCACCACACCAGGTTCACCTGCTACGGGCAGAAT CAAGGTGGACAGCTTCTGAGCAGGAGCCGGAAACGCGCGGGGCCTTCAAACAGGCACGC CTAGTGAGGGCAGGAGAGAGGAGGACGCACACACACACACACACACAAATATGGTGAAAC CCAATTTCTTACATCATATCTGTGCTACCCTTTCCAAACAGCCTA
SEQ ID NO:29
MDDDAAPRVEGVPVAVHKHALHDGLRQVAGPGAAAAHLPRWPPPQLAASRREAPPLSQRPH RTQGAGSPPETNEKLTNPQVKEK
SEQ ID NQ:30 - (вариантный вариабельный участок легкой цепи)
DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK где по меньшей мере одна из аминокислот, указанных X, является аминокислотной заменой (консервативной или не консервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4. Аминокислотная замена может быть, например, консервативной.
- 43 038979
SEQ ID NO:31 - (вариантный вариабельный участок легкой цепи)
DXa1VMTQTPLSLXa2VXa3Xa4GXa5Xa6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXa7LLIHTV
SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXa8GVYYCFQGSHVPLTFGXa9GTXa10LEXaiiK где Ха1 может быть гидрофобной аминокислотой;
Ха2 может быть А или Р;
Ха3 может быть нейтральной гидрофильной аминокислотой;
Ха4 может быть L или Р;
Ха5 может быть кислой аминокислотой;
Ха6 может быть Q или Р;
Ха7 может быть основной аминокислотой;
Ха8 может быть гидрофобной аминокислотой;
Ха9 может быть А или Q;
Ха10 может быть основной аминокислотой;
Ха11 может быть гидрофобной аминокислотой;
по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO:32 - (вариантный вариабельный участок легкой цепи)
DXaiVMTQTPLSLXa2VXa3Xa4GXa5Xa6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXa7LLIHTV
SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXasGVYYCFQGSHVPLTFGXasGTXaioLEXauK где ХА1 может быть V или I;
ХА2 может быть А или Р;
ХА3 может быть S или Т;
ХА4 может быть L или Р;
ХА5 может быть D или Е;
ХА6 может быть Q или Р;
ХА7 может быть K или Q;
ХА8 может быть L или V;
XA9 может быть А или Q;
XA10 может быть R или K или
XA11 может быть L или I, по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO:33 - (вариантный вариабельный участок легкой цепи 1: Lvh1)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVP
DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:34 - (вариантный вариабельный участок легкой цепи 2: Lvh2)
DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVP
DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSWVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYN
QKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS где по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2. Аминокислотная замена может быть, например, консервативной.
SEQ ID NO:36 - (вариантный вариабельный участок тяжелой цепи)
QXbiQLVQSGXb2EXb3Xb4KPGASVKXb5SCKASGYTFTDDYMSWVXb6QXb7Xb8GXb9XbioLEWXb11
GDINPYNGDTNYNQKFKGXbi2Xbi3Xbi4Xbi5TXbi6DXb17SXbi8STAYMXb19LXb2oSLXb21SEDXb22AV
YYCARDPGAMDYWGQGTXb23VTVSS где Xb1 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb2 может быть Р или А;
Xb3 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb4 может быть V или K;
Xb5 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb6 может быть основной аминокислотой;
Xb7 может быть S или А;
Xb8 может быть Н или Р;
Xb9 может быть основной аминокислотой;
Xb10 может быть S или G;
Xb11 может быть гидрофобной аминокислотой;
- 44 038979
Xb12 может быть основной аминокислотой;
Xb13 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb14 может быть I или Т;
Xb15 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb16 может быть гидрофобной аминокислотой;
Xb17 может быть K или Т;
Xb18 может быть нейтральной гидрофобной аминокислотой;
Xb19 может быть Q или Е;
Xb 20 может быть N или S;
Xb 21 может быть Т или R;
Xb 22 может быть нейтральной гидрофильной аминокислотой или
Xb 3 может быть S или L;
по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO:37 - (вариантный вариабельный участок тяжелой цепи)
IQXbiQLVQSGXb2EXb3Xb4KPGASVKXb5SCKASGYTFTDDYMSWVXB6QXb7Xb8GXb9XbioLEWXbi 1GDINPYNGDTNYNQKFKGXbi2Xbi3Xbi4Xbi5TXbi6DXbi7SXbi8STAYMXbi9LXb2oSLXb2iSEDXb22A
VYYCARDPGAM DYWGQGTXb23VTVSS где ХВ1 может быть I или V;
ХВ2 может быть Р или А;
ХВ3 может быть М или V;
ХВ4 может быть V или K;
ХВ5 может быть М или V;
ХВ6 может быть K или R;
ХВ7 может быть S или А;
ХВ8 может быть Н или Р;
ХВ9 может быть K или Q;
ХВ10 может быть S или G;
ХВ11 может быть I или М;
ХВ12 может быть K или R;
ХВ13 может быть А или V;
XB14 может быть I или Т;
ХВ15 может быть L или I,
ХВ16 может быть V или А;
ХВ17 может быть K или Т;
ХВ18 может быть S или Т;
ХВ19 может быть Q или Е;
ХВ20 может быть N или S;
ХВ21 может быть Т или R;
ХВ22 может быть S или Т или
ХВ23 может быть S или L;
по меньшей мере одна аминокислота, указанная X, является аминокислотной заменой (консервативной или неконсервативной) по сравнению с соответствующей аминокислотой в полипептиде, изложенном в SEQ ID NO: 2.
- 45 038979
SEQ ID NO:38 - (вариантный вариабельный участок 1 тяжелой цепи: Hvh1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNY NQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:39 - (вариантный вариабельный участок 2 тяжелой цепи: Hvh2)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYN QKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NQ:40 - (вариантный вариабельный участок 3 тяжелой цепи: Hvh3)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.:41 - (вариантный вариабельный участок 4 тяжелой цепи: Hvh4)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 42 мышиная легкая (каппа) цепь ЗА4
DWMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIHTVSNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:43 вариант 1 гуманизированной легкой (каппа) цепи ЗА4; Lh1
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:44 вариант 2 гуманизированной легкой (каппа) цепи ЗА4; Lh2
DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:45 тяжелая (Igg 1) цепь мышиного 3A4
QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYN QKFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO:46 вариант 1 гуманизированной тяжелой (Igg1) цепи 3A4; Hh1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNY NQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO:47 вариант 2 гуманизированной тяжелой (Igg 1) цепи 3A4; Hh2
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYN QKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
- 46 038979
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO:48 вариант 3 гуманизированной тяжелой (Igg1) цепи 3A4; Hh3
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO:49 вариант 4 гуманизированной тяжелой (Igg 1) цепи 3A4; Hh4 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQ KFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NQ:50
ATACCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAC
SEQ ID NO:51
ATACCCAAGCTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAG
SEQ ID NO:52
ATACCCAAGCTTGGGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG
SEQ ID NO:53
ATACCCAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG
SEQ ID NO:54 pK-CR5
CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTT TTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAG
- 47 038979
GGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGT CAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATC AAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCG ATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGA AAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACA CCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAA CTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGG GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACC GCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACATCGGCGCGCCAAATGATTTGCCCTC CCATATGTCCTTCCGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAA TTTCCTTTATTAGCCAGAGGTCGAGATTTAAATAAGCTTGCTAGCAGATCTTTGGACCTGGG AGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTCATTGTCACTCAAGTGTATGGCCA GATCGGGCCAGGTGAATATCAAATCCTCCTCGTTTTTGGAAACTGACAATCTTAGCGCAGA AGTAATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACTCACCCCAACAGCTGGATCTCAAGCCTGCCAC ACCTCACCTCGACCATCCGCCGTCTCAAGACCGCCTACTTTAATTACATCATCAGCAGCAC CTCCGCCAGAAACAACCCCGACCGCCACCCGCTGCCGCCCGCCACGGTGCTCAGCCTAC CTTGCGACTGTGACTGGTTAGACGCCTTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCGATGCGG ACTCGCTCAGGTCCCTCGGTGGCGGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCA AGAGTACTGGAAAGACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTC GCAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTA TGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT CTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATA CAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAAT ACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAA TACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAA GGTTGTCGAGTGAAGACGAAAGGGTTCATTAAGGCGCGCCGTCGACCTCGAGGGGGGGC CCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGT CATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGG AAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG CGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGC CAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGAC TCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATA CGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCT GACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAA AGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCG CTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCAC
- 48 038979
GCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAAC CCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGG TAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGA CAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTC TTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATT ACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTC AGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCAC CTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTT CATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATC TGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGC AATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTC CATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGC GCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC ATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAA GCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCAC TCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCT GTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCAT CATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTC TGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAA ATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCT CATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACAT TTCCCCGAAAAGTGCCAC
SEQ ID NO:55 pMPG-CR5
GTCGACGATACCGTGCACTTAATTAAGCGCGCTCGACCAAATGATTTGCCCTCCCATATGT CCTTCCGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTT ATTAGCCAGAGGTCGAGGTCGGGGGATCCGTTTAAACTTGGACCTGGGAGTGGACACCTG TGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTCATTGTCACTCAAGTGTATGGCCAGATCGGGCCAGG TGAATATCAAATCCTCCTCGTTTTTGGAAACTGACAATCTTAGCGCAGAAGTAATGCCCGCT TTTGAGAGGGAGTACTCACCCCAACAGCTGGATCTCAAGCCTGCCACACCTCACCTCGAC CATCCGCCGTCTCAAGACCGCCTACTTTAATTACATCATCAGCAGCACCTCCGCCAGAAAC AACCCCGACCGCCACCCGCTGCCGCCCGCCACGGTGCTCAGCCTACCTTGCGACTGTGA CTGGTTAGACGCCTTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCGATGCGGACTCGCTCAGGTC CCTCGGTGGCGGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCAAGAGTACTGGAAA GACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTCGCAGACAGCGAT
- 49 038979
GCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAA CAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAG GCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATACAAACAGACCAG ATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCA GATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACC AGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAAGGTTGTCGAGTG AAGACGAAAGGGTTAATTAAGGCGCGCCGTCGACTAGCTTGGCACGCCAGAAATCCGCGC GGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCG CCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCA GTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTC CCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCC CCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAA GGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCC AGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCT GTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTT AGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCA CTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATT TGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGC CCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATG CGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAA GTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGAC CTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCC ATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGG GCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGG TGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATC ACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTG GCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGG GCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAAT AGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCG ATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCG CAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGA GAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGT CGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACG CTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATA TGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAAT GACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTT CCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGCATGGC GGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCC
- 50 038979
CCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGT CCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCA GCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCA CATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGT TGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCG CTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGC GCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCG GCGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTC CGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCG ACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCT CATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGT GTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAG TCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGC AGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTAC ACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAA GCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG TCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAA GGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATG AGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTG TCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAG GGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCA GATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAG TTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTT TGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATG TTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCG CAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTA AGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGC GACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTT TAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTT TCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAA GGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC AGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGG GTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGA CATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCTCATGTTTG
- 51 038979
ACAGCTTATCTCTAGCAGATCCGGAATTCCCCTCCCCAATTTAAATGAGGACCTAACCTGT GGAAATCTACTGATGTGGGAGGCTGTAACTGTACAAACAGAGGTTATTGGAATAACTAGCA TGCTTAACCTTCATGCAGGGTCACAAAAAGTGCATGACGATGGTGGAGGAAAACCTATTCA AGGCAGTAATTTCCACTTCTTTGCTGTTGGTGGAGACCCCTTGGAAATGCAGGGAGTGCTA ATGAATTACAGGACAAAGTACCCAGATGGTACTATAACCCCTAAAAACCCAACAGCCCAGT CCCAGGTAATGAATACTGACCATAAGGCCTATTTGGACAAAAACAATGCTTATCCAGTTGA GTGCTGGGTTCCTGATCCTAGTAGAAATGAAAATACTAGGTATTTTGGGACTTTCACAGGA GGGGAAAATGTTCCCCCAGTACTTCATGTGACCAACACAGCTACCACAGTGTTGCTAGATG AACAGGGTGTGGGGCCTCTTTGTAAAGCTGATAGCCTGTATGTTTCAGCTGCTGATATTTG TGGCCTGTTTACTAACAGCTCTGGAACACAACAGTGGAGAGGCCTTGCAAGATATTTTAAG ATCCGCCTGAGAAAAAGATCTGTAAAGAATCCTTACCTAATTTCCTTTTTGCTAAGTGACCT TATAAACAGGAGAACCCAGAGAGTGGATGGGCAGCCTATGTATGGTATGGAATCCCAGGT AGAAGAGGTTAGGGTGTTTGATGGCACAGAAAGACTTCCAGGGGACCCAGATATGATAAG ATATATTGACAAACAGGGACAATTGCAAACCAAAATGCTTTAAACAGGTGCTTTTATTGTAC ATATACATTTAATAAATGCTGCTTTTGTATAAGCCACTTTTAAGCTTGTGTTATTTTGGGGGT GGTGTTTTAGGCCTTTTAAAACACTGAAAGCCTTTACACAAATGCAACTCTTGACTATGGGG GTCTGACCTTTGGGAATGTTCAGCAGGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTG TGATTGGGATTCAGTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATCCTCTTCTCTTG TAATATCAAGAATACATTTCCCCATGCATATATTATATTTCATCCTTGAAAAAGTATACATACT TATCTCAGAATCCAGCCTTTCCTTCCATTCAACAATTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTAGATG CTATTACAGAGGTAGAATGCTTCCTAAACCCAGAAATGGGGGATCTGC
SEQ ID NO:56 - полипептидная последовательность CDR2 гуманизированной тяжелой цепи ЗА4 .
DINPYNGDTNYNQKFKG
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (62)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с ассоциированным с почками антигеном 1 (KAAG1), имеющие вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит определяющие комплементарность участки (CDR), где CDRH1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 5, CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6 или в SEQ ID NO: 56, и CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR, где CDRL1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8, CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9, и CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10.
  2. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок легкой цепи по меньшей мере на 90% идентичен SEQ ID NO: 4.
  3. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи по меньшей мере на 90% идентичен SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок легкой цепи идентичен SEQ ID NO: 4.
  5. 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи идентичен SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32.
  7. 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 37.
  8. 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 33 или в SEQ ID NO: 34.
  9. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 41.
  10. 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 41, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 33.
  11. 11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 38, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 33.
  12. 12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 41, и вариабельный участок легкой цепи является та-
    - 52 038979 ким, как изложенный в SEQ ID NO: 34.
  13. 13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 39, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 33.
  14. 14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 40, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 33.
  15. 15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 38, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 34.
  16. 16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 39, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 34.
  17. 17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 40, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 34.
  18. 18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный участок тяжелой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 2, и вариабельный участок легкой цепи является таким, как изложенный в SEQ ID NO: 4.
  19. 19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 49, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 43.
  20. 20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 46, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 43.
  21. 21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 47, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 43.
  22. 22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 48, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 43.
  23. 23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 49, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 44.
  24. 24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 46, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 44.
  25. 25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 47, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 44.
  26. 26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 48, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 44.
  27. 27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 45, и легкая цепь является такой же, как изложенная в SEQ ID NO: 42.
  28. 28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-27, где антитело является моноклональным антителом, химерным антителом, гибридным антителом, гуманизированным антителом.
  29. 29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело является антителом человека.
  30. 30. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит человеческие каркасные участки и, необязательно, одну или несколько обратных мутаций в вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, где одна или несколько обратных мутаций находятся в каркасном участке и соответствуют аминокислотам каркаса, обнаруженным в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 2, и/или в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 4 исходного мышиного антитела.
  31. 31. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.30, где обратные мутации в вариабельной области тяжелой цепи включают Ile в положении 2 и Lys в положении 73 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  32. 32. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.31, включающие дополнительные обратные мутации в вариабельной области тяжелой цепи, где указанные дополнительные обратные мутации включают Ile в положении 48, Ala в положении 67, Leu в положении 69 и Val в положении 71 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  33. 33. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, включающие дополнительные обратные мутации в вариабельной области тяжелой цепи, где указанные дополнительные обратные мутации содержат Lys в положении 38 и Lys в положении 66 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  34. 34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.30, где обратные мутации в вариабельной области легкой цепи содержат Val в положении 2 и Lys в положении 45 и где указанное положение соот-
    - 53 038979 ветствует нумерации по Kabat.
  35. 35. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.31, где обратные мутации в вариабельной области легкой цепи содержат Val в положении 2 и Lys в положении 45 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  36. 36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, где обратные мутации в вариабельной области легкой цепи включают Val в положении 2 и Lys в положении 45 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  37. 37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.33, где обратные мутации в вариабельной области легкой цепи включают Val в положении 2 и/или Lys в положении 45 и где указанное положение соответствует нумерации по Kabat.
  38. 38. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.30-37, где антителом или его антигенсвязывающим фрагментом является гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
  39. 39. Конъюгат для нацеливания на опухолевые клетки, экспрессирующие ассоциированный с почками антиген 1 (KAAG1), содержащий:
    а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит определяющие комплементарность участки (CDR), где CDRH1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 5, CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6 или в SEQ ID NO: 56, и CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR, где CDRL1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8, CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9, и CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и
    b) терапевтический фрагмент, подходящий для лечения рака, такой как цитотоксическое средство, противораковое средство или химиотерапевтическое средство.
  40. 40. Конъюгат по п.39, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются такими же, как изложено в любом из пп.2-38.
  41. 41. Конъюгат по п.39 или 40, где цитотоксическое средство содержит ауристатин.
  42. 42. Конъюгат по п.41, где ауристатин содержит монометилауристатин Е или монометилауристатин F.
  43. 43. Конъюгат для обнаружения опухолевых клеток, экспрессирующих ассоциированный с почками антиген 1 (KAAG1), содержащий:
    а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит определяющие комплементарность участки (CDR), где CDRH1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 5, CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6 или в SEQ ID NO: 56, и CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи, который содержит CDR, где CDRL1 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8, CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9, и CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и
    b) выявляемую метку, такую как флуоресцентная метка, радиоактивная метка, активная метка для ядерного магнитного резонанса, люминесцентная метка, хемилюминесцентная метка, хромофорная метка, ферментная метка, квантовые точки и/или наночастица.
  44. 44. Конъюгат по п.43, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются такими же, как изложено в любом из пп.2-38.
  45. 45. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38.
  46. 46. Набор нуклеиновых кислот для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38, содержащий первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
  47. 47. Вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту по п.45.
  48. 48. Набор векторов экспрессии, включающий набор нуклеиновых кислот по п.46.
  49. 49. Выделенная клетка для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38, содержащая нуклеиновую кислоту по п.45, набор нуклеиновых кислот по п.46, вектор по п.47 или набор векторов по п.48.
  50. 50. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-38 или конъюгат по любому из пп.39-42 и фармацевтически приемлемый носитель.
  51. 51. Композиция для обнаружения раковых клеток, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-38 или конъюгат по любому из пп.43, 44 и фармацевтически приемлемый разбавитель, консервант, растворитель, эмульгатор или вспомогательное средство.
  52. 52. Способ лечения рака, содержащего клетки, экспрессирующие KAAG1 или вариант KAAG1, об-
    - 54 038979 ладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29, при этом способ включает введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38 или конъюгата по любому из пп.3942 нуждающемуся в этом субъекту.
  53. 53. Способ выявления опухоли, содержащей клетки, экспрессирующие KAAG1 или вариант KAAG1, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29, при этом способ включает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38 или конъюгата по любому из пп.43-44 нуждающемуся в этом субъекту и выявление клеток опухоли, связывающихся с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
  54. 54. Способ по п.52 или 53, отличающийся тем, что нуждающийся субъект выбран из субъекта, имеющего карциному яичников или у которого подозревают наличие карциномы яичников, субъекта, имеющего рак кожи или у которого подозревают наличие рака кожи, субъекта, имеющего рак почек или у которого подозревают наличие рака почек, субъекта, имеющего колоректальный рак или у которого подозревают наличие колоректального рака, субъекта, имеющего саркому или у которого подозревают наличие саркомы, субъекта, имеющего лейкоз или у которого подозревают наличие лейкоза, субъекта, имеющего рак головного мозга или у которого подозревают наличие рака головного мозга, субъекта, имеющего рак щитовидной железы или у которого подозревают наличие рака щитовидной железы, субъекта, имеющего рак молочной железы или у которого подозревают наличие рака молочной железы, субъекта, имеющего рак простаты или у которого подозревают наличие рака простаты, субъекта, имеющего рак пищевода или у которого подозревают наличие рака пищевода, субъекта, имеющего рак мочевого пузыря или у которого подозревают наличие рака мочевого пузыря, субъекта, имеющего рак легких или у которого подозревают наличие рака легких, и субъекта, имеющего рак головы и шеи или у которого подозревают наличие рака головы и шеи.
  55. 55. Способ выявления KAAG1 или варианта KAAG1, обладающего по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29, при этом способ включает приведение в контакт клетки, экспрессирующей KAAG1 или вариант KAAG1, или образца, подозреваемого в содержании KAAG1 или варианта KAAG1, с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-38 или конъюгата по любому из пп.43, 44 и выявление антитела или антигенсвязывающего фрагмента помощью второго антитела или выявляемой метки, присоединенной к нему.
  56. 56. Набор для лечения рака, содержащий контейнеры, включающие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-38 или конъюгат по любому из пп.39-42.
  57. 57. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38 для производства лекарственного препарата для лечения рака с клетками, экспрессирующими KAAG1 или вариант KAAG1.
  58. 58. Применение конъюгата по любому из пп.39-42 для производства лекарственного препарата для лечения рака с клетками, экспрессирующими KAAG1 или вариант KAAG1.
  59. 59. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38 для диагностики рака с клетками, экспрессирующими KAAG1 или вариант KAAG1, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29, или для выявления клеток, экспрессирующих KAAG1 или вариант KAAG1, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29.
  60. 60. Применение конъюгата по любому из пп.43, 44 для диагностики рака с клетками, экспрессирующими KAAG1 или вариант KAAG1, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29, или для выявления клеток, экспрессирующих KAAG1 или вариант KAAG1, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 29.
  61. 61. Применение по любому из пп.57-60, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из карциномы яичников, рака кожи, рака почек, колоректального рака, саркомы, лейкоза, рака головного мозга, рака щитовидной железы, рака молочной железы, рака простаты, рака пищевода, рака мочевого пузыря, рака легких и рака головы и шеи.
  62. 62. Набор для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способных специфически связываться с KAAG1, содержащий первый контейнер, включающий нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии, кодирующий вариабельный участок легкой цепи, и второй контейнер, включающий нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-38.
EA201391423A 2011-03-31 2012-03-28 Антитела к ассоциированному с почками антигену 1 и их антигенсвязывающие фрагменты EA038979B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161470063P 2011-03-31 2011-03-31
US201161533346P 2011-09-12 2011-09-12
PCT/CA2012/000296 WO2012129668A1 (en) 2011-03-31 2012-03-28 Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391423A1 EA201391423A1 (ru) 2014-06-30
EA038979B1 true EA038979B1 (ru) 2021-11-17

Family

ID=46929256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391423A EA038979B1 (ru) 2011-03-31 2012-03-28 Антитела к ассоциированному с почками антигену 1 и их антигенсвязывающие фрагменты

Country Status (23)

Country Link
US (5) US8937163B2 (ru)
EP (3) EP2691421B1 (ru)
JP (3) JP6294221B2 (ru)
KR (2) KR101993259B1 (ru)
CN (2) CN106146664B (ru)
AU (1) AU2012234754B2 (ru)
BR (1) BR112013025198A2 (ru)
CA (3) CA2829105C (ru)
CY (1) CY1122156T1 (ru)
DK (2) DK2691421T3 (ru)
EA (1) EA038979B1 (ru)
ES (2) ES2615387T3 (ru)
HR (1) HRP20191590T1 (ru)
HU (1) HUE045943T2 (ru)
IL (3) IL228434B (ru)
LT (1) LT3173427T (ru)
MX (1) MX352373B (ru)
PL (1) PL3173427T3 (ru)
PT (1) PT3173427T (ru)
RS (1) RS59080B1 (ru)
SI (1) SI3173427T1 (ru)
WO (1) WO2012129668A1 (ru)
ZA (1) ZA201307027B (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3050455A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Adc Therapeutics Sa Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
RS59080B1 (sr) * 2011-03-31 2019-09-30 Adc Therapeutics Sa Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen
PL2802351T3 (pl) 2012-01-09 2019-11-29 Adc Therapeutics Sa Środki do leczenia potrójnie negatywnego raka piersi
US20130280282A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
HUE056289T2 (hu) 2017-02-08 2022-02-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
IL266153A (en) * 2019-04-18 2019-07-31 Aharon Anat Extracellular vesicles derived from t cells containing a chimeric antigen receptor
GB201908128D0 (en) 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2024036333A2 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Epibiologics, Inc. Degradation of egfr using a bispecific binding agent
WO2024108193A2 (en) 2022-11-18 2024-05-23 Epibiologics, Inc. Degradation of cmet using a bispecific binding agent

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010060186A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen

Family Cites Families (194)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US662392A (en) 1899-12-12 1900-11-27 Friedrich Wilhelm Buehne Method of making metal wool.
DK365785A (da) 1984-09-17 1986-03-18 Hoffmann La Roche Metalcomplexer
US5075447A (en) 1984-09-17 1991-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Ruthenium complexes useful as carriers for immunologically active materials
GB8601646D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Davidson R S Binding assay & reagent
US5585279A (en) 1986-01-23 1996-12-17 Davidson; Robert S. Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
CA2071529C (en) 1989-12-28 2001-03-20 Donna Lee Romero Diaromatic substituted anti-aids compounds
IL105325A (en) 1992-04-16 1996-11-14 Minnesota Mining & Mfg Immunogen/vaccine adjuvant composition
WO1996013510A1 (en) 1994-10-28 1996-05-09 Procept, Inc. Ruthenium complexes and their use as immunosuppressive agents
US5708022A (en) 1994-10-28 1998-01-13 Procept, Inc. Method for inhibiting immune response
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5831003A (en) 1996-06-28 1998-11-03 Bayer Corporation Peptides which bind to prothrombin and thrombin
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
WO1998058079A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 Krull Ulrich J Nucleic acid biosensor diagnostics
AU1824899A (en) 1997-12-15 1999-07-05 Joseph R Lakowicz Method and composition for characterizing a sample containing a sample lipid andan assay kit
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6472367B1 (en) 1998-05-05 2002-10-29 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion
AU762814B2 (en) 1998-05-13 2003-07-03 Domantis Limited Selection system
AU3900399A (en) 1998-05-13 1999-11-29 Ludwig Institute For Cancer Research Tumor associated antigen encoded by the reverse strand of a new ubiquitously expressed gene
US7037667B1 (en) 1998-06-01 2006-05-02 Agensys, Inc. Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer
US7521197B2 (en) 1998-06-05 2009-04-21 Alexis Biotech Limited Method for producing cytotoxic T-cells
US20020106678A1 (en) 1998-06-30 2002-08-08 Robishaw Janet D. cDNA clones encoding human G protein gamma subunits
EP1090012A4 (en) 1998-07-02 2005-04-06 Merck & Co Inc INHIBITORS OF PRENYL PROTEIN TRANSFERASE
US6288221B1 (en) 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
AU6136599A (en) 1998-09-08 2000-03-27 University Of Maryland At Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
US6806089B1 (en) 1998-09-08 2004-10-19 University Of Maryland, Baltimore Low frequency modulation sensors using nanosecond fluorophores
AU1223400A (en) 1998-10-22 2000-05-08 Phillip B. B. Moheno Novel pterin antineoplastic agents
JP2002528504A (ja) 1998-10-29 2002-09-03 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド プレニル蛋白トランスフェラーゼ阻害薬
AU3268500A (en) 1999-03-19 2000-10-09 Anormed Inc. Pharmaceutical compositions comprising metal complexes
US6872519B1 (en) 1999-04-27 2005-03-29 Mirus Bio Corporation In vitro process for selecting phage resistant to blood inactivation
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
AU781880B2 (en) 1999-09-17 2005-06-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of factor Xa
WO2001046209A1 (en) 1999-12-20 2001-06-28 Fluorrx, Inc. Fluorescent probes
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US7585839B2 (en) 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
US20030215860A1 (en) 2000-02-29 2003-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18636, 2466, 43238, 1983, 52881, 2398, 45449, 50289, 52872 and 26908 molecules and uses therefor
WO2001070979A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
WO2001098468A2 (en) 2000-06-16 2001-12-27 Incyte Genomics, Inc. Proteases
AU2002214531A1 (en) 2000-07-03 2002-01-30 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20050053930A1 (en) 2000-07-18 2005-03-10 David Anderson Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
GB0023008D0 (en) 2000-09-20 2000-11-01 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US6783969B1 (en) 2001-03-05 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Cathepsin V-like polypeptides
US7030236B2 (en) 2001-03-09 2006-04-18 Mona Savitri Jhaveri Antisense oligonucleotides tarageting folate receptor alpha, and the use thereof
AU2002258518A1 (en) 2001-03-14 2002-09-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US20030065157A1 (en) 2001-04-04 2003-04-03 Lasek Amy W. Genes expressed in lung cancer
AU2002318112B2 (en) 2001-04-10 2007-12-06 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
EP1463928A2 (en) 2001-04-18 2004-10-06 Protein Design Labs Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2002090533A2 (en) 2001-05-07 2002-11-14 National Research Council Of Canada Enhanced production of recombinant proteins by transient transfection of suspension-growing mammalian cells
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
WO2002102235A2 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US20040053824A1 (en) 2001-06-29 2004-03-18 Tang Y Tom Extracellular matrix and cell adhesion molecules
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
KR100983962B1 (ko) 2001-08-31 2010-09-27 비티지 인터내셔널 리미티드 항암제로서 사용되는 시클로펜타[ｇ]퀴나졸린 화합물
ES2373644T3 (es) 2001-08-31 2012-02-07 Btg International Limited Uso de derivados de ciclopenta[g]quinazolina para el tratamiento del c�?ncer.
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7622260B2 (en) 2001-09-05 2009-11-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic and prognostic tests
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
NZ533158A (en) 2001-11-19 2006-09-29 Elan Pharm Inc 3,4-Disubstituted, 3,5-disubstituted and 3,4,5-substituted piperidines and piperazines
WO2003047526A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Incyte Genomics, Inc. Cell adhesion and extracellular matrix proteins
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2003057725A2 (en) 2002-01-09 2003-07-17 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway
EP1465933B1 (en) 2002-01-16 2007-08-29 Biocompatibles UK Limited Polymer conjugates
NZ534919A (en) 2002-01-28 2006-08-31 Keraplast Tech Ltd Bioactive keratin peptides
US6962910B2 (en) 2002-02-01 2005-11-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Supramolecular complexes as photoactivated DNA cleavage agents
AU2003225573A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of He Identification of ovarian cancer tumor markers and therapeutic targets
DE10206616A1 (de) 2002-02-15 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Reduktion der Background-Kontamination nach Markierungsreaktionen
US20040009939A1 (en) 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
WO2003080672A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
WO2003087768A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
WO2003099205A2 (en) 2002-05-20 2003-12-04 Abgenix, Inc. Treatment of renal carcinoma using antibodies against the egfr
WO2004030615A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1422242A1 (en) 2002-11-22 2004-05-26 Emory University Plastic and elastic protein copolymers
EP1592791A2 (en) 2003-02-10 2005-11-09 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Regulation of gene expression by dna interference
WO2004087874A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
JP2007531705A (ja) 2003-05-20 2007-11-08 セルペップ ソシエテ アノニム 増大した活性および細胞膜親和性を有する修飾抗ウイルス性ペプチド
US20070274947A1 (en) 2003-05-21 2007-11-29 Young Aiping H Antisense Oligonucleotides Directed to Ribonucleotide Reductase R1 and Uses Thereof in the Treatment of Cancer
WO2005021710A2 (en) 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US20060078941A1 (en) 2003-06-09 2006-04-13 Santin Alessandro D Gene expression profiling in primary ovarian serous papillary tumors and normal ovarian epithelium
WO2005004795A2 (en) 2003-06-09 2005-01-20 University Of Cincinnati Compositions and methods for targeted drug delivery
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
GB0318096D0 (en) 2003-08-01 2003-09-03 Queen Mary & Westfield College Vaccine
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US20070178458A1 (en) 2003-09-05 2007-08-02 O'brien Philippa Methods of diagnosis and prognosis of ovarian cancer II
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
EP1697389A4 (en) 2003-10-24 2008-12-24 Eisai R&D Man Co Ltd COMPOUNDS AND METHODS FOR TREATING ILLNESS AND SUFFERING TOLL-LIKE RECEPTOR 2 RELATED DISORDERS
US20050153333A1 (en) 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
EP1550458A1 (en) 2003-12-23 2005-07-06 Vectron Therapeutics AG Synergistic liposomal adjuvants
EP1547581A1 (en) 2003-12-23 2005-06-29 Vectron Therapeutics AG Liposomal vaccine for the treatment of human hematological malignancies
US20090169520A1 (en) 2004-01-09 2009-07-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compounds, Pharmaceutical Compositions and Therapeutic Methods of Preventing and Treating Diseases and Disorders Associated With Amyloid Fibril Formation
WO2005070456A2 (en) 2004-01-09 2005-08-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Diagnosing and treating female reproductive tract or chilhood cancer with pmsa antibodies
EP1747284A4 (en) 2004-02-06 2009-03-11 Wyeth Corp DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS OF CANCER
CN1922490B (zh) 2004-02-19 2012-07-04 耶鲁大学 使用蛋白质组学技术鉴定癌症蛋白生物标志物的方法
CA2558155A1 (en) 2004-03-01 2005-09-09 Zvi Sidelman Casein derived peptides and therapeutic uses thereof
CA2558767A1 (en) 2004-07-06 2006-01-12 Warwick Effect Polymers Limited Living radical polymerization initiator comprising a functional group capable of reacting with polyeptides or the like, comb polymer obtained therewith, polypeptide conjugates anddrugs obtained therefrom
US7772271B2 (en) 2004-07-14 2010-08-10 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis C
WO2007084413A2 (en) 2004-07-14 2007-07-26 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating hepatitis c
US7553944B2 (en) 2004-07-21 2009-06-30 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
WO2006026569A2 (en) 2004-08-27 2006-03-09 Northeastern University Comprehensive characterization of complex proteins at trace levels
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
WO2006027202A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Unite De Recherche En Biotherapie Et Oncologie (Rubio) Generation of multiparent cell hybrids
JP2008512490A (ja) 2004-09-08 2008-04-24 チェルシー・セラピューティクス，インコーポレイテッド 異常細胞増殖および炎症の障害を治療するための代謝的に不活性な葉酸拮抗剤
WO2006044335A2 (en) 2004-10-14 2006-04-27 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Therapy with clostridium perfringens enterotoxin to treat ovarian and uterine cancer
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
EP1833504A4 (en) 2005-01-04 2009-08-12 Brigham & Womens Hospital PERMANENT DELIVERY OF SELF-ARRANGING PEPTIDE NANOFIBER USING THE PDGF
US7531533B2 (en) 2005-01-27 2009-05-12 Asahi Kasei Pharma Corporation 6-Membered heterocyclic compound and use thereof
JP5014978B2 (ja) 2005-01-27 2012-08-29 旭化成ファーマ株式会社 ヘテロ６員環化合物及びその用途
CN101119744B (zh) 2005-02-14 2013-03-13 埃皮托皮克斯有限责任公司 来自金黄色葡萄球菌的多肽和使用方法
EP1859266A4 (en) 2005-02-24 2010-07-28 Cemines Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR CLASSIFYING BIOLOGICAL SAMPLES
CN101189229A (zh) 2005-03-17 2008-05-28 哈佛大学校长及研究员协会 阿韦艾利酰胺、斯特伐希丁b和其类似物的合成
US8551774B2 (en) 2005-03-17 2013-10-08 National Research Council Of Canada Expression vectors containing a truncated epstein barr nuclear antigen 1 lacking the Gly-Gly-Ala domain for enhanced transient gene expression
FR2885525B1 (fr) 2005-05-13 2009-09-18 Urodelia Sa Medicament notamment anti-cancereux, destine a des traitements par immunotherapie, en particulier autologue
WO2006138238A2 (en) 2005-06-13 2006-12-28 Cleveland Biolabs, Inc. Methods of protecting against apoptosis using lipopeptides
JP5777846B2 (ja) 2005-06-15 2015-09-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミン含有脂質およびその使用
AU2006261841B8 (en) 2005-06-27 2012-12-06 Exelixis Patent Company Llc Pyrazole based LXR modulators
WO2007005249A2 (en) 2005-06-29 2007-01-11 Hyperbranch Medical Technology, Inc. Nanoparticles and dendritic-polymer-based hydrogels comprising them
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7820790B2 (en) 2005-07-13 2010-10-26 Amgen Mountain View Inc. IL-6 binding proteins
EP1904649A2 (en) 2005-07-18 2008-04-02 Epigenomics AG Compositions and methods for cancer diagnostics comprising pan-cancer markers
GB0516058D0 (en) 2005-08-04 2005-09-14 Oxford Genome Sciences Uk Ltd New protein isoforms and uses thereof
GB0517293D0 (en) 2005-08-24 2005-10-05 Cancer Rec Tech Ltd Vectors and uses thereof
ATE470864T1 (de) 2005-09-15 2010-06-15 Alk Abello As Verfahren zur quantifizierung von allergenen
WO2007044804A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Chemocentryx, Inc. Piperidine derivatives and methods of use
EP1957475A1 (en) 2005-10-21 2008-08-20 Merz Pharma GmbH & Co.KGaA Chromenones and their use as modulators of metabotropic glutamate receptors
UA96139C2 (ru) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитело к нейропилину-1 (nrp1)
DK1954274T3 (da) 2005-11-10 2011-01-31 Chemocentryx Inc Substituerede quinoloner og fremgangsmåder til anvendelse
US20090203922A1 (en) 2005-11-23 2009-08-13 Kevin Michael Belyk Process for Synthesizing 2-Phenyl-1H-Phenanthro[9,10-d]Imidazole Derivative
KR101049859B1 (ko) 2007-11-28 2011-07-19 대한민국 Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법
BRPI0708636A2 (pt) 2006-03-06 2011-06-07 Symphogen As anticorpo policlonal recombinante para tratamento de infecções por vìrus sinciciais respiratórios
JP5167155B2 (ja) 2006-03-09 2013-03-21 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム ペプチド結合に基づく多数の細胞株のプロファイリングに関連した組成物および方法
MX2008011584A (es) 2006-03-10 2008-12-12 Warwick Effect Polymers Ltd Polimeros.
WO2007110755A1 (en) 2006-03-27 2007-10-04 Medical Therapies Limited Prophylaxis or treatment of cardiovascular inflammation
ATE548380T1 (de) 2006-04-20 2012-03-15 Kringle Pharma Inc Mutante des hgf-precursor-proteins und aktivierte form davon
US20090253156A1 (en) 2006-05-05 2009-10-08 Perkinelmer Las, Inc. Mass spectrometry methods for multiplexed quantification of protein kinases and phosphatases
CA2900402C (en) 2006-05-08 2018-01-16 Adaerata, Limited Partnership Pcsk9 polypeptide, ligand to said polypeptide, kits and methods using said ligands
CA2655933C (en) 2006-06-23 2014-09-09 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
US20120128661A1 (en) 2006-06-23 2012-05-24 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotide and polypeptide sequences involved in cancer
US20090297401A1 (en) 2006-06-28 2009-12-03 Rgb Technologies Ab Sensor kit and a system for detecting an analyte in a test environment
US8198046B2 (en) 2006-07-11 2012-06-12 Danisco Us Inc. KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
WO2008012362A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Oxford Genome Sciences (Uk) Ltd New protein isoforms and uses thereof
US20100120627A1 (en) 2006-08-02 2010-05-13 Abdelmajid Belouchi Genemap of the human genes associated with psoriasis
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
EP2066806A2 (fr) 2006-09-07 2009-06-10 Laurence Faure Test pharmaco diagnostique ciblant l'oncologie
WO2008033932A2 (en) 2006-09-13 2008-03-20 The Institutes For Pharmaceutical Discovery, Llc Biarylthiazole carboxylic acid derivatives as protein tyrosine phosphatase-ib inhibitors
CN101663308A (zh) 2006-10-30 2010-03-03 桑尔克斯药品公司 N-甲基色胺钙五水合物(dcp)和基于它的治疗方法
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
MX2009006277A (es) * 2006-12-14 2009-07-24 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan a cd70 y usos de los mismos.
EP2114948B1 (en) 2006-12-28 2014-06-25 AbbVie Inc. Inhibitors of poly(adp-ribose)polymerase
KR101493474B1 (ko) 2007-01-09 2015-02-16 클리브랜드 바이오랩스, 아이엔씨. 조혈 줄기 세포를 증가시키고 이동시키는 방법들
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
WO2008124483A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Specigen, Inc. Protein cage immunotherapeutics
WO2009009186A2 (en) 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
US20080306007A1 (en) 2007-04-30 2008-12-11 Newcastle Innovation Limited Agents for prophylaxis or treatment of neurological related diseases and conditions
EP2155177A2 (en) 2007-04-30 2010-02-24 Intezyne Technologies Incorporated Modification of biological targeting groups for the treatment of cancer
US8143372B2 (en) 2007-05-21 2012-03-27 Children's Hospital & Research Center Oakland Synthetic regulators of ferritin protein nanocage pores and methods of use thereof
WO2008151146A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Digitab, Inc. Peptide arrays and methods of use
WO2009004329A1 (en) 2007-07-02 2009-01-08 Cancer Research Technology Limited 9h-pyrimido[4,5-b]indoles, 9h-pyrido[4',3':4,5]pyrrolo[2,3-d]pyridines, and 9h-1,3,6,9-tetraaza-fluorenes as chk1 kinase function inhibitors
US9018138B2 (en) 2007-08-16 2015-04-28 The Johns Hopkins University Compositions and methods for generating and screening adenoviral libraries
KR20100087283A (ko) 2007-09-07 2010-08-04 심포젠 에이/에스 항­ｒｓｖ 항체의 재조합 제조 방법
WO2009039854A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
GB0719644D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
ES2777948T3 (es) 2007-11-05 2020-08-06 Nordic Bioscience As Marcadores bioquímicos para la evaluación de riesgos de CVD
WO2009061681A2 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Amira Pharmaceuticals, Inc Antagonists of pgd2 receptors
EP2071334A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Transmedi SA Compositions and methods of detecting TIABS
US20110165223A1 (en) 2008-01-02 2011-07-07 The Johns Hopkins University Antitumor Immunization by Liposomal Delivery of Vaccine to the Spleen
EP2269070A1 (en) 2008-03-14 2011-01-05 DNAR, Inc Dna repair proteins associated with triple negative breast cancers and methods of use thereof
WO2009114942A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
WO2009134370A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products relating to gsk3 beta regulation
CA2723824C (en) 2008-05-09 2022-12-06 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible and biodegradable elastomeric polymers
ES2872377T3 (es) 2008-05-26 2021-11-02 Univ Zuerich Nanopartículas de protamina/ARN para inmunoestimulación
KR101325367B1 (ko) 2008-07-03 2013-11-11 판미라 파마슈티칼스, 엘엘씨 프로스타글란딘 ｄ２ 수용체의 길항제
US8148088B2 (en) 2008-07-18 2012-04-03 Abgent Regulation of autophagy pathway phosphorylation and uses thereof
CA2730428A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lixte Biotechnology, Inc. Methods for regulating cell mitosis by inhibiting serine/threonine phosphatase
DK2328893T3 (da) 2008-08-08 2013-06-17 Synta Pharmaceuticals Corp Triazolforbindelser som modulerer hsp90 aktivitet
MX2011003117A (es) 2008-09-19 2011-04-21 Nektar Therapeutics Conjugados polimericos de peptidos terapeuticos.
WO2010033220A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
RU2562865C2 (ru) * 2009-07-10 2015-09-10 Иннэйт Фарма Tlr3 связывающие агенты
WO2011017687A1 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Ray Partha S Diagnosis of primary and metastatic basal-like breast cancer and other cancer types
WO2011054112A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1
NZ602084A (en) 2010-03-11 2014-07-25 Merrimack Pharmaceuticals Inc Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative and basal-like breast cancers
US20110233107A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Emily Jainine Lockett Personal Cosmetic Palette
RS59080B1 (sr) * 2011-03-31 2019-09-30 Adc Therapeutics Sa Antitela protiv antigena 1 povezanog sa bubrezima i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen
PL2802351T3 (pl) * 2012-01-09 2019-11-29 Adc Therapeutics Sa Środki do leczenia potrójnie negatywnego raka piersi

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010060186A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUDNICK, S.I. et al., "Influence of affinity and antigen internalization on the uptake and penetration of Anti-HER2 antibodies in solid tumors", Cancer Research, March 15, 2011, Vol. 71, No. 6, p. 2250-2259, ISSN: 0008-5472, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180291099A1 (en) 2018-10-11
CA2888908A1 (en) 2012-10-04
US20160304605A1 (en) 2016-10-20
PL3173427T3 (pl) 2019-11-29
ES2615387T3 (es) 2017-06-06
CY1122156T1 (el) 2020-11-25
IL266452B (en) 2020-10-29
IL258914A (en) 2018-07-31
US10597450B2 (en) 2020-03-24
CN106146664A (zh) 2016-11-23
MX352373B (es) 2017-11-22
CN103492418A (zh) 2014-01-01
JP2018075018A (ja) 2018-05-17
IL228434A0 (en) 2013-12-31
JP6294221B2 (ja) 2018-03-14
CA2829105C (en) 2019-09-24
JP6650432B2 (ja) 2020-02-19
MX2013011354A (es) 2014-06-11
JP2014515600A (ja) 2014-07-03
US20140140990A1 (en) 2014-05-22
BR112013025198A2 (pt) 2018-12-04
EP3511345A1 (en) 2019-07-17
KR102140984B1 (ko) 2020-08-06
KR101993259B1 (ko) 2019-06-27
RS59080B1 (sr) 2019-09-30
CN103492418B (zh) 2016-06-29
HRP20191590T1 (hr) 2019-11-29
KR20190074325A (ko) 2019-06-27
LT3173427T (lt) 2019-09-10
PT3173427T (pt) 2019-09-17
WO2012129668A1 (en) 2012-10-04
DK3173427T3 (da) 2019-08-05
KR20140033014A (ko) 2014-03-17
IL228434B (en) 2018-05-31
AU2012234754A1 (en) 2013-10-10
CA2829105A1 (en) 2012-10-04
IL266452A (en) 2019-06-30
US20210054067A1 (en) 2021-02-25
EP2691421A1 (en) 2014-02-05
AU2012234754B2 (en) 2016-09-29
JP2020074785A (ja) 2020-05-21
CA2893376A1 (en) 2012-10-04
US20150209427A1 (en) 2015-07-30
US8937163B2 (en) 2015-01-20
ES2743913T3 (es) 2020-02-21
HUE045943T2 (hu) 2020-02-28
US9393302B2 (en) 2016-07-19
US9828426B2 (en) 2017-11-28
DK2691421T3 (en) 2017-02-20
ZA201307027B (en) 2016-08-31
EA201391423A1 (ru) 2014-06-30
EP2691421A4 (en) 2014-11-05
CN106146664B (zh) 2021-09-07
NZ615694A (en) 2015-01-30
SI3173427T1 (sl) 2019-08-30
EP3173427A1 (en) 2017-05-31
EP2691421B1 (en) 2016-11-09
EP3173427B1 (en) 2019-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10597450B2 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US20180369269A1 (en) Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
US11084872B2 (en) Method for treating breast cancer
WO2011054112A1 (en) Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1
NZ615694B2 (en) Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
CA2816437A1 (en) Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1