ES2777948T3 - Marcadores bioquímicos para la evaluación de riesgos de CVD - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de bioensayo para la cuantificación de fragmentos peptídicos que comprende un neoepítopo formado por escisión de colágeno de tipo III mediante MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-13, Catepsina K, Catepsina S, ADAMTS1, ADAMTS4 o ADAMTS8, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos peptídicos con un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicho anticuerpo monoclonal a fragmentos peptídicos en dicha muestra, en el que dicho anticuerpo monoclonal no es reactivo con el colágeno de tipo III inalterado, en el que dicho anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión específica por la secuencia del neoepítopo Nterminal KNGETG y no es reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido.

Description

DESCRIPCIÓN

Marcadores bioquímicos para la evaluación de riesgos de CVD

La presente invención se refiere a ensayos para la detección de marcadores bioquímicos valiosos para fines de diagnóstico en enfermedades cardiovasculares y pronóstico del desarrollo de enfermedades, incluyendo marcadores bioquímicos indicativos del riesgo de eventos cardiovasculares resultantes del desarrollo ateroesclerótico y la inestabilidad de placas.

A nivel mundial, la enfermedad cardiovascular (CVD) es la principal causa de morbilidad y mortalidad. Actualmente, no existen procedimientos de diagnóstico eficaces y no invasivos que permitan el diagnóstico y la clasificación de pacientes en diferentes grupos de riesgo y el diagnóstico de pacientes de bajo riesgo. Las herramientas de diagnóstico y pronóstico se componen principalmente de análisis multivariantes de marcadores simples, tales como edad, tabaquismo y diversas concentraciones de lípidos y lipoproteínas.

La CVD cubre varios síndromes clínicos, principalmente, angina de pecho, infarto de miocardio (trombosis coronaria) y accidente cerebrovascular. Todos estos síndromes suelen ser las secuelas de una ateroesclerosis complicada.

La ateroesclerosis comienza con engrosamiento de la íntima en la infancia y progresa a estrías grasas en la íntima de las arterias; estas lesiones se caracterizan como tipo I y II, respectivamente. Las estrías grasas son las primeras lesiones macroscópicamente visibles en el desarrollo de la ateroesclerosis y ocurren en casi todos los seres humanos de todas las razas y sociedades. En el estado no patogénico, las células endoteliales (EC) resisten las interacciones adhesivas con leucocitos. Sin embargo, las acciones de las citocinas proinflamatorias y las lipoproteínas oxidadas acumuladas en la pared arterial durante la aterogénesis, inician la expresión de moléculas de adhesión, tales como las moléculas de adhesión intercelular (ICAM) -1 y las moléculas de adhesión celular vascular (VCAM) -1, en la superficie de las EC de la aorta. Esto permite la captura y transmigración de leucocitos a través de la superficie endotelial, hacia la parte íntima de la pared del vaso. El desarrollo de placas implica un número creciente de células de músculo liso (SMC) que sufren desplazamiento y apoptosis, lo que da como resultado un aumento de la renovación de la matriz. La síntesis alterada de colágeno puede dar como resultado un tapón fibroso debilitado y una placa ateroesclerótica que es más propensa a la rotura; sin embargo, la mayoría de los investigadores creen que las acciones de enzimas proteolíticas, tales como las metaloproteasas de matriz (MMP) y otras proteasas, contribuyen de manera importante al riesgo de rotura de la placa (Clarkson y Kaplan 509-28).

Las placas son divisibles en dos tipos diferentes: placas 'vulnerables' y 'estabilizadas'. Sin embargo, para análisis histológicos detallados y comprensión molecular, a menudo se usa una clasificación más detallada. Hay tres etapas principales en el desarrollo de la placa: iniciación, estrías grasas y la placa compleja/avanzada (Stary H.C.).

Las placas ateroescleróticas se desarrollan dentro de la íntima de las arterias y pueden clasificarse según su composición y estructura. Esta clasificación divide las lesiones en ocho tipos (Stary H.C.):

I. Los macrófagos cargados y agrandados mediante gotículas de lípidos (células de espuma de macrófagos) aumentan en la íntima.

II. Las células de espuma de macrófagos se acumulan en la parte profunda de la capa de proteoglucanos junto con las gotículas de lípidos dentro de las SMC de la íntima. Las capas de células de espuma son visibles como estrías grasas. En las lesiones de tipo II, los monocitos penetran en el revestimiento endotelial mediante proteínas quimioatrayentes de monocitos (principalmente MCP-1), que se sobreexpresan en el ateroma humano. Los primeros tipos de lesión (tipo I y II) pueden comenzar en la infancia y no necesariamente conducen a la rotura de la placa. Asimismo, el desarrollo de la ateroesclerosis puede terminar después de la formación de la lesión de tipo III, y la formación de placa no es predecible (Stary H.C.).

III. La lesión de tipo III se determina como la lesión intermedia entre las estrías grasas (tipo II) y el ateroma (tipo IV). Estas lesiones contienen grupos de lípidos extracelulares y, por lo tanto, expanden los espacios entre las SMC normalmente adyacentes de la capa musculoelástica profunda de la íntima. Los grupos de material pueden reemplazar los proteoglucanos y las fibras de colágeno que normalmente residen aquí, pero esto ocurre con poco impacto en esta etapa de la aterogénesis.

IV. El ateroma es el primer signo clínico de ateroesclerosis. El desplazamiento de las SMC en la íntima de las arterias mediante la acumulación de grupos extracelulares de lípidos y la alteración de la arquitectura de la íntima es un rasgo característico de una lesión de tipo IV. La formación de los núcleos lipídicos es el resultado final de este desplazamiento de SMC. La formación de un núcleo lipídico explica el aumento del engrosamiento de la pared. El núcleo lipídico es una región grande y bien delimitada de la íntima profunda donde los elementos estructurales normales de esta parte de la pared arterial se han reemplazado por restos de células de espuma densamente empaquetadas, gotículas de lípidos libres, cristales de colesterol y partículas de calcio. Las SMC que normalmente residen en esta área están disminuidas o completamente ausentes en esta etapa de progresión de la ateroesclerosis. Cualquier SMC remanente se dispersa ampliamente y ha desarrollado cuerpos celulares alargados y muy a menudo membranas basales inusualmente gruesas. En esta etapa, comienza el desarrollo de una capa que recubre el núcleo lipídico. Esta capa consiste en colágeno y matriz intercelular rica en proteoglucanos, SMC con y sin gotículas de lípidos, macrófagos y células espumosas.

V. La respuesta a la lesión de tipo IV es la formación de una matriz reparadora de tejido fibroso, formando un "tapón" fibroso. Normalmente, estas lesiones consistirán en capas de núcleos lipídicos y tejido reparador apilados irregularmente uno encima del otro. Eventos como el hematoma y la formación de trombos pueden complicar adicionalmente este tipo de lesiones. Si no es fatal, estas complicaciones de la lesión se integran en la lesión y se cubren con una capa delgada de tejido de matriz reparadora, que consiste en colágenos y proteoglucanos. El contenido de proteínas de matriz extracelular de colágeno y proteoglucanos aumenta en la placa ateroesclerótica durante la formación del tapón.

VI. Los defectos del endotelio, tales como fisuras, erosiones, ulceraciones, hematomas, trombos, hemorragias, pueden, si se combinan, dar lugar a un tipo de lesión más complicada designada como lesión de tipo VI.

VII. La lesión a menudo se conoce como lesión calcificada, donde más de un 50 % de la lesión consiste en minerales. Además de las calcificaciones, estas lesiones contienen abundancia de tejido conectivo fibroso reparador. Cuando las SMC atrapadas en esto sufren apoptosis y se desintegran; sus orgánulos mineralizados se convierten en parte de la calcificación.

VIII. La lesión fibrótica sigue a la lesión calcificada. La lesión fibrótica puede consistir completamente en colágeno y sin lípidos. (Stary H.C.)

Los eventos cardiovasculares son a menudo el resultado de la rotura de la placa, en la cual la inflamación y la liberación de proteasas debilitan las regiones dorsales del tapón fibroso y permiten que los materiales grasos en la placa entren en contacto con la sangre que precipita un trombo parietal (Clarkson y Kaplan). El adelgazamiento del tapón fibroso por el aumento de la actividad de la proteasa en combinación con la disminución de la producción de matriz, se considera un rasgo característico de la inestabilidad de la placa que aumenta el riesgo de rotura. La vulnerabilidad de las placas y su riesgo de rotura es un área de interés clínico. La definición de una placa vulnerable (VP) no está estandarizada, pero existe un acuerdo general que indica la existencia de tres rasgos característicos histológicos en comparación con la placa estable:

1) Un núcleo lipídico más grande (> 40 por ciento de la lesión total).

2) Un tapón fibroso más delgado (65 - 150 micrómetros).

3) Gran cantidad de células inflamatorias agudas.

Los criterios principales para definir una VP incluyen: inflamación activa (presencia de monocitos, macrófagos y linfocitos T), tapón delgado con núcleo lipídico grande, denudación endotelial con agregación plaquetaria superficial, placa fisurada y > 90 % de estenosis de la arteria. Otros criterios menores incluyen: nódulo superficial calcificado, hemorragia intraplaca, disfunción endotelial y remodelación externa (Shin, Edelberg y Hong).

Las complicaciones, la inestabilidad y la rotura de la placa pueden ser inhibidas por el tratamiento médico y/o la modificación del estilo de vida. En algunos casos, sin embargo, se pueden necesitar procedimientos más invasivos, es decir, angioplastia o cirugía de derivación.

En la actualidad, las herramientas de diagnóstico se basan en análisis de imágenes estáticas aún en desarrollo o en procedimientos de baja tecnología, como los niveles de presión arterial sistólica y diastólica relacionados con el riesgo de CVD. El campo ha dedicado mucha atención al desarrollo de análisis multivariante que puedan identificar mejor a los pacientes con alto riesgo. Uno de estos modelos es el modelo SCORE (modelo de evaluación sistemática de riesgos coronarios). En 1994, con una revisión en 2003, la Sociedad Europea de Ateroesclerosis, la Sociedad Europea de Cardiología y la Sociedad Europea de Hipertensión emitieron un conjunto de recomendaciones sobre la prevención de enfermedades coronarias. Esta guía se basa en varias técnicas de evaluación, que se han desarrollado para evaluar el riesgo de CVD en sujetos asintomáticos, es decir, la identificación de pacientes asintomáticos de alto riesgo. El modelo SCORE integra género, edad, hábito de fumar, presión arterial sistólica y colesterol total o la relación colesterol/HDL como factores de riesgo (Graham et al.).

Para hacer un diagnóstico más detallado, el modelo SCORE no es suficiente y se utilizan técnicas de imagen. Por lo tanto, los procedimientos de imagen se utilizan principalmente en pacientes del grupo de alto riesgo o durante la investigación.

TÉCNICAS DE IMAGEN

La angiografía coronaria (CAG) es actualmente la técnica de imagen de referencia para definir el grado de estenosis. La CAG forma imágenes de la luz del vaso en dos dimensiones, pero está restringido solo a la luz y no a la pared del vaso, por lo que la CAG no puede distinguir entre una arteria con una placa estable y una arteria con una placa vulnerable. La CAG a menudo se usa para determinar si un paciente necesita cirugía; angioplastia o derivación. Para determinar si un punto de estrechamiento de la luz es una placa avanzada, se necesitan otras técnicas, es decir, ecografía coronaria intravascular (IVUS) o angioscopia.

La IVUS proporciona imágenes bidimensionales en sección transversal de la placa y la pared del vaso, y se considera un procedimiento bueno para la caracterización de la pared del vaso y la morfología y el grado de calcificación, pero deficiente para evaluar los lípidos en la lesión. Sin embargo, la IVUS es invasiva y requiere experiencia y gastos: por lo tanto, su uso no está muy extendido. La angioscopia es otro procedimiento útil para comprender e identificar la ateroesclerosis. La angioscopia es una visualización directa de la superficie de la placa y tiene la capacidad de detectar el color de la placa y la trombosis. La angioscopia es, sin embargo, invasiva y técnicamente difícil, y hasta ahora no ha sido capaz de detectar el grado de extensión de la placa. Otra técnica de imagen que actualmente recibe mucha atención es la resonancia magnética nuclear (MRI). La MRI no es invasiva y es capaz de identificar la placa carotídea con alto riesgo de accidente cerebrovascular. Por otro lado, la MRI no es la mejor técnica para formar imágenes de las arterias coronarias, debido a los pequeños tamaños de placa y la ubicación de las arterias coronarias. Se están desarrollando otras técnicas de imagen, es decir, elastografía, termografía y tomografía de coherencia óptica (Schaar et al.).

Las técnicas de imagen mencionadas están todas en desarrollo y solas, ninguna puede identificar una placa vulnerable, pero son herramientas útiles para comprender tanto los eventos moleculares como el recambio de la placa antes de la rotura. En la actualidad, la única oportunidad para diagnosticar CVD en una etapa temprana es utilizar un intervalo de factores de riesgo para la enfermedad coronaria establecida, enfermedad arterial periférica y enfermedad ateroesclerótica cerebrovascular del paciente en cuestión, así como parientes cercanos del paciente. MARCADORES BIOQUIMICOS ACTUALES

Actualmente, varios marcadores bioquímicos se conocen como factores de riesgo para la ateroesclerosis. Recientemente se ha dirigido mucha atención a la medición de las concentraciones de marcadores bioquímicos en suero; tanto de lípidos como del colesterol total, el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) como el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y los marcadores inflamatorios como la proteína C-reactiva (CRP), la interleucina-6 (IL-6), la interleucina-18 (IL-18), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), CD40, el ligando de CD40 (CD40L) y otros.

Entre los marcadores de lipoproteínas, ha habido al menos dos avances notables. El tamaño de las partículas de LDL parece predecir el grado de progresión de la ateroesclerosis. El aumento de las concentraciones de partículas pequeñas de LDL está más relacionado con el riesgo de CVD que el aumento de las concentraciones de partículas grandes (Gardner, Fortmann y Krauss).

El nivel de HDL-C está fuertemente relacionado con los triglicéridos, y el nivel alto de triglicéridos se correlaciona con un mayor riesgo de CHD. Un estudio de cohortes realizado por Jeppesen et al. (2003) encontró que TG altos/HDL-C bajo son los factores de riesgo más fuertes de IHD (cardiopatía isquémica) (Jeppesen et al.).

Los perfiles lipídicos son importantes para la evaluación de los factores de riesgo, pero no permiten comprender y medir los eventos moleculares asociados con el recambio de la placa. Se han sugerido varios marcadores bioquímicos como factores de riesgo para CVD, aunque no es un producto específico de la enfermedad. Estos incluyen CRP y péptido natriurético óseo (BNP) (véase la Tabla 1). La Tabla 1 resume algunos de los marcadores conocidos de CVD.

Tabla 1: Una selección de marcadores bio uímicos actuales en CVD.

(continuación)

Por lo tanto, se ha sugerido una variedad de marcadores bioquímicos diferentes como marcadores de eventos cardiovasculares. Wang et al (2006) midieron 10 marcadores bioquímicos diferentes en 3200 pacientes que participaron en el estudio de Framingham, que se describe en la Tabla 1. La conclusión fue que la medición de 10 marcadores bioquímicos solo contribuye moderadamente al diagnóstico por encima de los factores de riesgo estándar. De los 10 marcadores bioquímicos, el nivel de péptido natriurético de tipo B, el nivel de proteína C-reactiva y la relación de albúmina a creatinina en orina mostraron la mejor correlación entre el marcador y muerte/eventos cardiovasculares (Wang et al.).

PROTEÍNA C-REACTIVA

La proteína C-reactiva (CRP) es una proteína sérica de fase aguda producida por el hígado en respuesta a diferentes condiciones clínicas, tales como, inflamación, infección o trauma (Gabay y Kushner 1999). La producción de CRP es inducida por citocinas como la IL-6, liberada de los tejidos afectados o dañados. Aún se desconoce el papel fisiológico de la CRP y se están discutiendo sus acciones proinflamatorias o antiinflamatorias.

Existe evidencia acumulada de que la CRP es un factor de riesgo de CVD en seres humanos. En un estudio de Ridker et al. 2002, se demostró que la CRP es un mejor factor pronóstico de eventos cardiovasculares futuros que el colesterol LDL, en una gran población compuesta por 28.000 mujeres sanas seguidas durante ocho años por la aparición de infarto agudo de miocardio, accidente cerebrovascular, revascularización coronaria o muerte por CVD. Muchos otros estudios también han informado que los niveles de referencia de CRP constituyen un factor de riesgo independiente para eventos cardiovasculares (Thompson et al. 1995, Mendall et al. 1996, Kuller et al. 1996, Ridker et al. 1997, Tracy et al. 1997, Ridker et al. 2000).

Se ha especulado que la CRP circulante solo refleja la inflamación general que ocurre en el procedimiento ateroesclerótico y no es un componente activo en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, varias líneas de evidencia también respaldan la opinión de que la CRP tiene un papel en la aterogénesis. En primer lugar, las infecciones crónicas que dan lugar a la CRP también están asociadas con un mayor riesgo de CVD (Leinonen y Saikku 2002). En segundo lugar, nosotros y otros hemos identificado que la CRP se encuentra en diferentes niveles de lesiones ateroescleróticas (Reynolds y Vance 1987, Hatanaka et al. 1995). Por último, se ha demostrado que la CRP tiene propiedades proaterogénicas in vitro: la CRP puede activar las células endoteliales para producir moléculas de adhesión (Pasceri et al. 2000). También puede disminuir la producción de eNOS en células endoteliales (Venugopal et al. 2002) y mejorar la absorción de LDL mediante macrófagos (Zwaka et al. 2001).

PÉPTIDO NATRIURÉTICO CEREBRAL

El péptido natriurético cerebral (BNP) (tipo B) es una hormona peptídica secretada por los ventrículos del corazón en respuesta al estiramiento excesivo de los miocitos cardíacos en los ventrículos. El T-proBNP (el fragmento N terminal inactivo), junto con la hormona activa (BNP), se libera al torrente sanguíneo tras la escisión de proBNP. Tanto BNP como NT-proBNP se han sugerido como posibles marcadores bioquímicos de eventos cardiovasculares (Wang et al.).

QUIMIOCINAS

Las quimiocinas también son posibles marcadores de CVD; las quimiocinas son citocinas de bajo peso molecular producidas en la inflamación. Una quimiocina importante en relación con la CVD es la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1). La MCP-1 parece jugar un papel temprano e importante en el reclutamiento de monocitos para lesiones ateroescleróticas. En un estudio que utilizó un modelo de mono de ateroesclerosis, las concentraciones plasmáticas de MCP-1 se asociaron altamente con el tamaño de la placa y las complicaciones de la placa (Register et al.).

LIPIDOS QUE INCLUYEN COLESTEROL

Recientemente se ha dirigido mucha atención a la medición de las concentraciones de colesterol en suero; tanto el colesterol total, como las concentraciones de colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) y el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL-C). Entre los marcadores de lipoproteínas, ha habido al menos dos avances notables. En primer lugar, el tamaño de las partículas de LDL parece predecir el grado de progresión de la ateroesclerosis. El aumento de las concentraciones de partículas pequeñas de LDL está más relacionado con el riesgo de CVD que el aumento de las concentraciones de partículas grandes (Gardner et al). En segundo lugar, el contenido de oleato de colesterilo de las partículas de LDL puede convertirse en un marcador particularmente importante del riesgo de CVD. En monos, el enriquecimiento de los núcleos de partículas de lipoproteína con el oleato de colesterilo se asoció de manera fuerte y positiva con la ateroesclerosis de las arterias coronarias más grave (Rudel et al) y fue aditiva a las contribuciones de las concentraciones de colesterol LDL y HDL. Estos hallazgos en animales de experimentación están respaldados por estudios anteriores en seres humanos (Lawrie et al) que mostraron que las lipoproteínas plasmáticas con proporciones más bajas de linoleato de colesterilo (y, por el contrario, proporciones más altas de oleato de colesterilo) son normales de pacientes con complicaciones de CHD (enfermedad coronaria) en comparación con controles normales.

El nivel de HDL-C está fuertemente relacionado con los triglicéridos, y el nivel alto de triglicéridos se correlaciona con un mayor riesgo de CHD. Un estudio de cohortes realizado por Jeppesen et al. encontró que TG altos/HDL-C bajo son los factores de riesgo más fuertes de IHD (cardiopatía isquémica).

Estos perfiles lipídicos son importantes para la evaluación de los factores de riesgo, pero no permiten comprender y medir los eventos moleculares asociados con el recambio de la placa. Se han sugerido varios marcadores bioquímicos como factores de riesgo para CVD, aunque estos no son los productos específicos de la enfermedad. Estos incluyen CRP y ApoE.

LIPOPROTEINAS

El biomarcador más utilizado para predecir CVD es la concentración de colesterol (tanto el total como la relación colesterol/HDL). Estos se usan junto con otros factores de riesgo, tales como la presión arterial y el nivel de LDL. Ambos factores se utilizan en el modelo SCORE mencionado anteriormente. El nivel de LDL es importante ya que las LDL transporta el colesterol en la sangre y la acumulación de LDL oxidadas puede promover la ateroesclerosis (Graham et al). Además, se encuentra una asociación significativa entre CHD y los niveles de triglicéridos (TG), en los que un mayor riesgo de CHD se asoció con niveles crecientes de TG, independientemente de los niveles de LDL-C y HDL-C, aunque se observa el nivel de colesterol como uno de los principales factores de riesgo de CVD (Jeppeson et al).

APO-E

La apolipoproteína E se encuentra en quilomicrones, VLDL y HDL. Se sintetiza principalmente en el hígado, pero también en muchos otros órganos tales como el cerebro, bazo, riñón (Siest et al. 1995). La ApoE juega un papel esencial en el metabolismo de las lipoproteínas al actuar como un ligando para dos receptores: el receptor de LDL y el receptor remanente de quilomicrón específico de ApoE. La interacción entre ApoE con estos receptores proporciona una base para la regulación metabólica del colesterol. El polimorfismo en el locus del gen apoE da como resultado tres alelos encontrados en la mayoría de las poblaciones: £2, £3 y £4 que determinan seis fenotipos apoE. Las isoformas se diferencian entre sí por un aminoácido en las posiciones 112 y 158. La ApoE2 tiene cisteína en ambos restos y E4 tiene arginina en ambas posiciones. La ApoE3 contiene cisteína en la posición 112 y arginina en la 158. Las frecuencias alélicas difieren en diferentes poblaciones. Algunos estudios han evaluado la posible relación entre el polimorfismo de apoE y la ateroesclerosis. Un metaanálisis de 14 estudios de observación demostró que el alelo £4 está asociado con la enfermedad coronaria tanto en hombres como en mujeres (Wilson et al. 1996). Asimismo, el alelo £4 se ha asociado con la ateroesclerosis de la arteria carótida (Terry et al. 1996, Cattin et al. 1997, Haraki et al. 2002).

La ApoE tiene 299 aminoácidos de largo y transporta lipoproteínas, vitaminas liposolubles y colesterol al sistema linfático y más a la circulación sanguínea. La ApoE se sintetiza principalmente en el hígado. En la actualidad, hay siete receptores de mamíferos para ApoE que pertenecen a la familia conservada de genes de receptores de lipoproteínas de baja densidad.

MARCADORES BIOQUIMICOS ADICIONALES

La microalbuminuria (albúmina al nivel de creatinina) también es un posible marcador independiente. La tasa de excreción de albúmina urinaria es un marcador de cambios en el riñón y, en comparación con una pequeña elevación de creatinina, puede indicar ateroesclerosis (Wang et al.).

De los marcadores de procolágeno, se ha investigado el marcador para la tasa de recambio de colágeno de tipo III (PIIINP) como marcador pronóstico de hipertensión y se ha asociado con infarto de miocardio. Satta et al. examinó la correlación entre el aneurisma aórtico abdominal (^a A^a ) y la concentración del procolágeno (PIIINP) en la sangre. Se mostró que el recambio de colágeno de tipo III aumenta en pacientes con AAA y puede deberse a una síntesis mejorada, degradación mejorada o una combinación de ambas. En el mismo experimento, se midió el propéptido carboxiterminal del procolágeno de tipo I (PICP), y no hubo síntesis acelerada de colágeno de tipo I en el saco del aneurisma.

PERFIL DE PROTEÍNA DE LA PLACA

Las arterias humanas se pueden dividir en arterias más grandes o elásticas, arterias medianas o musculares y arterias pequeñas. Las paredes de las arterias están compuestas de íntima, media y adventicia, separadas por la lámina elástica interna y la lámina elástica externa. La íntima consiste en tejido conectivo, células musculares lisas y algunos macrófagos aislados. Los límites de la íntima se pueden definir como una capa entre la superficie de la luz del endotelio y la lámina elástica interna.

La íntima arterial se puede dividir en dos capas. La capa interna, llamada capa de proteoglucanos, compuesta de abundantes proteoglucanos, células musculares lisas y macrófagos. La capa inferior, la capa musculoelástica, está compuesta de abundantes células musculares lisas y fibras elásticas. En condiciones normales, las dos capas de la íntima apenas son visibles por microscopía óptica, pero son distintas y prominentes cuando se produce un engrosamiento de la íntima.

La media es la parte muscular de la pared arterial, compuesta de células musculares lisas, elastina, fibrillas de colágeno.

La adventicia, capa externa, es altamente microvascular y contiene colágenos, fibrillas elásticas, células musculares lisas y canales linfáticos.

Las placas ateroescleróticas humanas se caracterizan por un núcleo rico en lípidos cubierto por un tapón fibroso compuesto por colágenos fibrilares, elastina, proteoglucanos y SMC. Los proteoglucanos hialuronanos son componentes no fibrilares principales de la matriz extracelular que tienen el potencial de afectar el desarrollo de la lesión al regular eventos tales como la acumulación de lípidos, la trombosis y la proliferación y migración celular y al afectar las propiedades materiales del tejido (Wight 1995). La ApoE infiltrante y la CRP también están presentes y se ha demostrado la localización de ambas en placas ateroescleróticas de arterias coronarias en diferentes etapas de la enfermedad ateroesclerótica.

DISTRIBUCIÓN DE ApoE Y CRP EN SERES HUMANOS

La Tabla 2 dada a continuación muestra la distribución de ApoE y CRP en el cuerpo humano.

_________________________________________ Tabla 2:_________________________________________ Proteína Sitios de expresión

APOE Sangre, Suero, Plasma, Hígado, Saliva, Monocito, Cerebelo, Líquido cefalorraquídeo, Corteza frontal, Hipocampo, Corteza temporal

CRP Sangre, Riñón, Hígado, Líquido peritoneal, Plasma, Suero

La Tabla 3 dada a continuación ilustra las interacciones conocidas de ApoE y CRP con proteínas demostradas in vivo y/o in vitro.

___________________________________________Tabla 3___________________________________________ Proteína Interacciones con proteínas

ApoE Albúmina, Proteína beta amiloide A4, Macroglobulina, Proteína tau asociada a microtúbulos, Receptor de LDL, Catepsina B, Neurofilamento 3, Proteína de transferencia de fosfolípidos, Proteína prión, Receptores de VLDL, Receptores depuradores clase B,

CRP Suero amiloide P, Factor de complemento H, Fibronectina 1, Histona 1, FC gamma RI, FC gamma RIIB, CD32, Glucoproteína plaquetaria VI, Leptina.

Interacción no proteica: Calcio, Colesterol

DISTRIBUCIÓN DE COLÁGENO EN SERES HUMANOS

El colágeno se distribuye ampliamente en el cuerpo humano, es decir, ~ 30 % de la masa de proteína en el cuerpo humano está compuesta de colágeno. En la Tabla 4, los principales tipos de colágeno se enumeran con su distribución de tejido principal.

Tabla 4

Tipo de colágeno Distribución de tejido

I Piel, hueso, tendón, ligamento, córnea

II Cartílago, cuerpo vítreo

III Piel, arteria, intestino, útero

IV Membranas basales

V Hueso, piel, córnea, placenta

VI Hueso, cartílago, córnea, piel, arteria

VII Piel, vejiga, mucosa oral, cordón umbilical, amnios

VIII Membrana de Descemet, arteria, hueso, cerebro, corazón, riñón, piel, cartílago XIII Células endoteliales, piel, ojo, corazón, músculo esquelético

XIV Arteria, hueso, piel, cartílago, ojo, nervio, tendón, útero

XXI Arteria, corazón, estómago, riñón, músculo esquelético, placenta

El colágeno de tipo I es el colágeno más abundante y se encuentra en la mayoría del tejido conectivo. Es especialmente importante para la estructura de los huesos y la piel. El contenido principal de colágeno en el cuerpo humano se distribuye en la piel y los huesos, donde los principales componentes del colágeno son colágenos de tipo I y III. El colágeno de tipo III es un componente principal de las arterias grandes, y también se encuentra en pequeñas cantidades en los tejidos ricos en colágeno de tipo I. Además, el colágeno de tipo IV se encuentra en la membrana basal y alrededor de los vasos sanguíneos y los nervios. La localización más común del colágeno de tipo V se encuentra dentro de las fibrillas de colágeno características, en asociación con el colágeno de tipo I y III (Garrone et al).

Algunos colágenos tienen una distribución de tejido restringida: por ejemplo, el tipo II, que se encuentran casi exclusivamente en el cartílago (Mayne R.).

Las fibrillas de colágeno a menudo consisten en más de un tipo de colágeno. Por ejemplo, las fibrillas de colágeno de tipo I a menudo contienen pequeñas cantidades de tipos III, V y XII, mientras que las fibrillas de colágeno de tipo II de cartílago también contienen de tipo IX y XI.

COLÁGENOS EN ARTERIAS

En las arterias, se encuentran seis tipos de colágeno (tipos I, III, IV, V, VI y VIII), donde los tipos I y III son los más abundantes, 80 - 90 % del contenido de colágeno. Los tipos I y III también son predominantes en la pared del vaso. Parecen estar distribuidos conjuntamente en diferentes cantidades dentro de las tres capas de la pared arterial, la síntesis de colágeno de tipo I y III tiende a ubicarse en la íntima (Mayne R).

COLÁGENOS Y OTRAS PROTEÍNAS ESTRUCTURALES EN EL RECAMBIO DE PLACA

Durante el desarrollo de las placas ateroescleróticas, el colágeno se acumula en el tapón fibroso (Stary H.C.). En un estudio realizado por Katsuda et al (1992), se encontraron colágeno de tipo I, III y IV en el engrosamiento de la íntima en todas las etapas de la lesión en los tejidos aórticos humanos. El colágeno de tipo VI se distribuyó en la membrana basal en la región de las células de la íntima y en las lesiones avanzadas también se detectaron alrededor de las SMC alargadas. Estudios anteriores de tipo I y III han proporcionado evidencia de una distribución igual en la pared arterial ateroesclerótica (Shekhonin et al). De acuerdo con McCullagh et al (1980), el tipo III es el colágeno predominante en la media aórtica humana normal (aproximadamente el 70 % del colágeno extraíble). Un estudio reciente de Eriksen et al (2006) encontró una disminución del contenido de colágeno total en la válvula aórtica humana dependiendo del grado de estenosis. Se cree que el mecanismo molecular de la estenosis es similar a la ateroesclerosis. En válvulas aórticas sanas, el contenido de colágeno es principalmente de tipo I y III. Durante la estenosis, el contenido total de colágeno disminuye, lo que presumiblemente es causado por un aumento en el recambio de colágeno de tipo I. El colágeno de tipo I representaba aproximadamente un 60-70 % del colágeno total; mientras que la proporción de colágeno de tipo III fue de un 30-40 % tanto en válvulas sanas como en válvulas calcificadas.

El colágeno de tipo V también aumenta en las lesiones ateroescleróticas avanzadas y se distribuye por toda la matriz extracelular tanto en la media aórtica como en la región subendotelial de las placas (McCullagh et al).

Parece existir un consenso en cuanto a que los principales tipos de colágeno que se encuentran en la placa ateroesclerótica son los tipos I y III, aún no se ha investigado si están distribuidos por igual en vasos sanos y ateroescleróticos.

En el estudio de Katsuda et al (1992) no se detectó colágeno en el centro del ateroma de las lesiones más avanzadas.

ELASTINA

La elastina es una de las proteínas más estables del cuerpo y se encuentra en la mayoría del tejido conectivo debido a su elasticidad y resistencia. La elastina domina el contenido de proteínas de la pared arterial, donde es la principal proteína de la matriz extracelular.

La elastina es el componente principal en las fibras elásticas y está relacionada con la calcificación. La calcificación vascular ocurre en dos sitios distintos dentro de la pared del vaso: la íntima y la media. La calcificación en la íntima está relacionada con la ateroesclerosis, principalmente dentro del núcleo necrótico. La fibra elástica calcificada constituye el dorso de la placa donde las placas son más propensas a romperse; sugiriendo que la calcificación de la fibra elástica puede afectar la estabilidad de la placa (Bobryshev Y. V.). En la ateroesclerosis, el contenido de fibras elásticas disminuye junto con la deposición de lípidos, esto genera una mayor susceptibilidad a las enzimas que degradan elastina. De este modo, el contenido de elastina en contraste con el colágeno disminuye a medida que se desarrolla la lesión.

DISTRIBUCIÓN DE ELASTINA EN SERES HUMANOS

La tabla 5 muestra la distribución de elastina en el cuerpo humano.

Tabla 5:

Proteína Sitios de expresión

Elastina Aorta y otros vasos sanguíneos, Pulmón, Fibroblastos de la piel La Tabla 6 ilustra las interacciones conocidas de Elastina con proteínas demostradas in vivo y/o in vitro.

_________________________________________Tabla 6:________________________________________ Proteína Interacciones con proteínas

Elastina Decorina, Elastasa, Fibrilina, Fibulina, Lisozima, Lisil oxidasa, Galectina, Biglicano, Nidógeno, Ficolina, Proteinase3.

PROTEOGLUCANOS COMO COMPONENTES DE MATRIZ

Los proteoglucanos (PG) son macromoléculas de polisacárido-proteína localizadas predominantemente en la matriz intercelular de la pared del vaso (Salisbury y Wagner 1981). Los PG son macromoléculas caracterizadas por la presencia de una, o más, cadenas laterales largas de azúcar sin ramificar y altamente polianiónicas llamadas GAG, unidas covalentemente a una proteína central a través de una región de enlace. La unidad repetitiva del GAG consiste en un amino azúcar, ya sea N-acetil-glucosamina (GlcNAc) o N-acetil-galactosamina (GaINAc), y un ácido hexurónico, ácido glucourónico (GlcA) o ácido idurónico (IdoA). Uno o ambos azúcares en la unidad de repetición contienen uno o más grupos sulfato (Rodriguez-Lee 2007). Además de las cadenas GAG, la mayoría de las proteínas centrales llevan oligosacáridos unidos a N y/u O.

CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LOS PG

Los PG son un grupo muy heterogéneo de macromoléculas. Un solo tipo de proteína central puede variar en el número y tipo de cadenas GAG unidas. La longitud de las cadenas y la disposición de los restos sulfatados a lo largo de las cadenas también varían.

Se distinguen cuatro clases principales de GAG de acuerdo con la estructura de la unidad repetida de disacárido: sulfato de condroitina (CS) y sulfato de dermatán (DS), sulfato de heparina (HS) y heparina, hialuronano y sulfato de queratina (KS).

El hialuronano es el más simple de los GAG. A diferencia de todos los demás, no contiene azúcares sulfatados. Todas sus unidades de disacárido son idénticas, la longitud de su cadena es enorme y no está unida a ninguna proteína central.

KS es una cadena de polilactosamina sulfatada. KS-I se describió originalmente en la córnea, y está unida en N a los restos de asparagina en la proteína central, mientras que KS-II o KS de cartílago, está unida en O a los restos de serina o treonina (Funderburgh 2000). Los PG se pueden clasificar de acuerdo con varios parámetros:

- Cadena GAG adjunta (CS/DS o HS que contienen PG)

- Distribución topográfica en relación con la célula (PG extracelulares y de membrana basal, PG asociados a células o PG intracelulares)

- Homología de proteínas centrales (hialectanos, pequeños PG ricos en leucina (SLRP)

Los PG de condroitina/sulfato de dermatán (versicano, agrecano, neurocano y brevicano) pertenecen a la familia de los proteoglucanos de unión a hialuronano. Esta familia de genes se denomina colectivamente hialectanos. Cada miembro de la familia tiene una distribución característica, con agrecano prominente en el cartílago, neurocano y brevicano prominente en el sistema nervioso central, y versicano presente en una variedad de tejidos blandos, incluyendo las paredes arteriales. La estructura de genes y proteínas de versicano sigue una plantilla de dominio. El extremo globular amino-terminal (G1) se une al hialuronano GAG, y el dominio globular carboxiterminal (G3) se asemeja a la familia de proteínas selectina, que consiste en una lectina de tipo C adyacente a dos dominios del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una región reguladora del complemento. La región media de la proteína central de versicano está codificada por dos grandes exones que especifican las regiones de unión CS de versicano. La región codificada por el exón 7 se llama aGAG, mientras que la región codificada por el exón 8 se llama pGAG. Cuatro transcripciones de ARNm surgen del empalme alternativo de versicano, dando lugar a V0, V1, V2 y V3 que difieren en la longitud de la proteína central y el número de GAG adjuntos (Dours-Zimmermann y Zimmermann). El número de posibles sitios de fijación de GAG en versicano humano es: 17-23 para V0, 12-15 para V1, 5-8 para V2 y ninguno para V3 (Wight 617-23).

Decorina y biglicano son miembros de la familia SLRP que comprende al menos nueve miembros agrupados en tres clases (I, II y III) y diferentes subfamilias. Todos se caracterizan por la presencia de un dominio central que contiene repeticiones ricas en leucina para lograr una fuerte presencia de un dominio central que contiene repeticiones ricas en leucina para lograr fuertes interacciones proteína-proteína. La decorina y el biglicano son miembros de la clase I y muestran la mayor homología de aminoácidos de la familia (-57 %) y son los únicos SLRP con un propéptido. El propéptido está altamente conservado en todas las especies y puede funcionar como una secuencia de reconocimiento para la xilosiltransferasa, la primera enzima implicada en la síntesis de la cadena GAG.

Versicano, decorina y biglicano son las principales PG de CS/DS en la matriz de la pared arterial de los mamíferos (Wight et al. 1986). El tamaño de la proteína central versicano V0 es de 370 kDa, lo que la hace aproximadamente 10 veces más grande que la decorina de 36 kDa y el biglicano de 38 kDa. Las cadenas laterales muestran una amplia gama de tamaños, pero generalmente promedian alrededor de 40-90 kDa cada una.

Proteoglucanos de sulfato de heparán: Los HSPG se dividen en cinco clases distintas de PG pericelulares y asociados a células, y representan al menos un 95 % de los HS de las superficies celulares, membranas basales y ECM de mamífero. Los HSPG asociados a células incluyen sindecanos integrales de membrana y glipicanos anclados. Los HSPG pericelulares incluyen principalmente perlecano, agrina. Estos PG se denominan pericelulares debido a su estrecha asociación con la membrana plasmática a través de las integrinas (Whitelock e Iozzo).

El perlecano es un HSPG modular que se expresa en casi todas las membranas basales, así como en órganos mesenquimales y tejidos conectivos, y es uno de los polipéptidos de cadena sencilla más grandes que se encuentran en animales vertebrados e invertebrados. Los cinco módulos de perlecano y sus cadenas laterales HS participan en una gran cantidad de interacciones moleculares, como el factor de crecimiento de fibroblastos 2, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento procedente de plaquetas (PDGF) y otras proteínas de la matriz. La proteína central del perlecano humano es de -470 kDa y, junto con numerosos oligosacáridos unidos a O y cuatro cadenas laterales HS, puede alcanzar un peso molecular de más de 800 kDa (Knox y Whitelock).

DISTRIBUCIÓN PROTEOGLUCANA

Los proteoglucanos (PG) son macromoléculas distribuidas en casi todo el cuerpo humano. La estructura y el tamaño de los PG varían extremadamente. La estructura básica de todos los PG incluye una proteína central y al menos una, pero a menudo muchas, cadenas de hidratos de carbono, los glucosaminoglucano (GAG). Los PG se pueden encontrar intracelularmente, en la superficie de las células y en la matriz extracelular. La diversidad estructural de los PG sugiere numerosas funciones biológicas, véase la Tabla 7.

Tabla 7:

La Tabla 7 anterior brinda una descripción general de la distribución y función de PG.

PROTEOGLUCANOS EN ARTERIAS

Al menos cinco tipos de PG están presentes en la matriz extracelular de la pared arterial; versicano: que interactúa con el hialuronano para formar grandes agregados; decorina y biglicano pequeños ricos en leucina, que interactúan con componentes de la matriz fibrilar como el colágeno y la elastina; heparánsulfato - perlecano, que es un componente de la lámina basal y queratina sulfato - lumicano (Talusan et al.).

Versicano es una de varias moléculas de ECM que se acumulan en lesiones de ateroesclerosis. Aunque varios estudios indican que versicano es claramente capaz de unirse a LDL, el versicano generalmente no se detecta en el centro rico en lípidos del núcleo necrótico (Evanko et al.).

Se ha demostrado que lumicano se une directamente a los macrófagos y mejora la migración de los macrófagos. Por lo tanto, el lumicano puede influir directamente en el comportamiento de los macrófagos en la íntima vascular, así como estimular la formación del núcleo necrótico, característico de las lesiones ateroescleróticas avanzadas (Funderburgh et al. 1997).

Biglicano se encuentra en el tapón fibroso. Versicano y biglicano tienen afinidad por las LDL y forman complejos insolubles, lo que acelera la oxidación de las LDL. Biglicano puede contribuir a la patogénesis de la ateroesclerosis atrapando lipoproteínas en la pared de la arteria. Los cambios en el metabolismo de los proteoglucanos de la íntima de las arterias constituyen las lesiones iniciales de la ateroesclerosis y la acumulación de proteoglucanos juega un papel fundamental en la progresión de la ateroesclerosis (Kunz J.).

Perlecano se informó en la hiperplasia de la íntima humana como uno de los componentes centrales de la matriz extracelular de la íntima, mediante análisis basado en espectrometría de masas y mediante inmunohistoquímica. La Tabla 8 ilustra la distribución de algunos PG en tinciones inmunohistoquímicas de PG en arterias normales y ateroescleróticas (Evanko et al).

Tabla 8:

(continuación)

IMPLICACIÓN DE LOS PROTEOGLUCANOS EN LA REMODELACIÓN DE MATRICES

Un estudio de la progresión de la ateroesclerosis en primates no humanos ha demostrado que la acumulación de PG específicos varía con la gravedad de la lesión y con la distribución de las células y los factores de crecimiento, lo que sugiere que diferentes PG juegan un papel distinto durante la progresión de la ateroesclerosis. Los diferentes niveles de PG específicos pueden afectar directamente las propiedades materiales del tejido a través de su contribución a la alteración de las disposiciones estructurales de los componentes de la matriz fibrosa, tal como la elastina y el colágeno.

Versicano e hialuronano muestran una localización similar en la matriz, lo que sugiere la formación de agregados entre los dos en la aterogénesis. El marcado aumento de versicano e hialuronano en las lesiones tempranas podría sugerir que desempeñan un papel en las lesiones ateroescleróticas tempranas, tales como la proliferación y la migración de SMC y leucocitos. Asimismo, el versicano y el hialuronano son componentes principales de la matriz de las lesiones restenóticas humanas y se ha demostrado que contribuyen al engrosamiento neointimal después de una lesión vascular in vitro. Una abundancia de versicano temprano en la aterogénesis también podría predisponer a la matriz extracelular a aumentar el atrapamiento de lípidos debido a la unión de las lipoproteínas a las cadenas de sulfato de condroitina de versicano. Esta idea se apoya por la localización conjunta de versicano con apoproteína (a) y apolipoproteína E en la arteriopatía de trasplante (Evanko et al). La pérdida de versicano de la placa puede provocar inestabilidad de la matriz.

Esto se evidencia aún más por el aumento del gen versicano observado después de una lesión vascular. Versicano también se identificó aquí en todas las etapas de la aterogénesis; en la íntima de las placas de desarrollo temprano, pero también en las lesiones avanzadas y en los bordes de los núcleos necróticos llenos de lípidos, así como en la interfaz placa-trombo (Wight y Merrilees 2005). Estas observaciones implican a versicano en la acumulación de lípidos, inflamación y trombosis. Asimismo, el versicano desempeña un papel importante en el ensamblaje de ECM y en el control de la fibrilogénesis de fibra elástica, lo cual es de importancia fundamental en la remodelación de ECM durante la enfermedad vascular (Wight y Merrilees 2005).

El papel de biglicano en la biología celular arterial no está claro. Algunos estudios inmunohistoquímicos han mostrado la asociación de biglicano con la tinción de colágeno I y III en lesiones restenóticas humanas (Evanko et al.).

La importancia del biglicano como proteína matricial se afirmó aún más mediante la generación de ratones BALB/cA homocigotos para una mutación nula del gen biglicano, donde un 50 % de los ratones machos con deficiencia de biglicano murieron repentinamente en los primeros 3 meses de vida como resultado de una rotura aórtica. Esta observación sugiere que el biglicano es esencial para la integridad estructural y funcional de la pared aórtica, así como un posible papel de los defectos genéticos de biglicano en la patogénesis de la disección y rotura aórtica en humanos. (Heegaard et al. 2007)

Otros estudios indican que el biglicano es un PG importante asociado con elastina en arterias de primates; estas observaciones son similares a las de la arteriopatía coronaria humana (Evanko et al).

Se ha demostrado que la decorina se une al colágeno y regula la formación de fibrillas de colágeno (Brown y Vogel) (Danielson et al.).

PERFILES DE PROTEASA

Las proteasas hidrolizan los enlaces peptídicos y son responsables de la degradación de las proteínas de la matriz extracelular, tal como el colágeno, los proteoglucanos y la elastina en el ateroma, véase la Tabla 9. En las placas ateroescleróticas se encuentran tres tipos principales: metaloproteinasas (es decir, MMP), serina proteasas y cisteína proteasas (es decir, catepsinas). Las catepsinas y las MMP son responsables de la degradación de todas las proteínas de la matriz extracelular. Como la matriz es esencial para la estabilidad de la placa, su eliminación del tapón fibroso por las proteasas puede provocar la rotura de la placa (Stary H.C.).

En la Tabla 9 se enumeran una variedad de proteasas encontradas en la placa ateroesclerótica.

Tabla 9 Proteasas detectadas en placas ateroescleróticas.

Proteasa Sustratos de degradación

Catepsina K Proteoglucanos, elastina, colágeno

Catepsina S Proteoglucanos, elastina, colágeno

Catepsina L Proteoglucanos, Colágeno de tipo I

Catepsina B Proteoglucanos

MMP-1 Colágeno de tipo I, II y III

MMP-2 Proteoglucanos, elastina

MMP-3 Proteoglucanos, colágeno de tipo III , elastina

MMP-8 Proteoglucanos, colágeno de tipo I, II y III

MMP-9 Elastina, colágeno de tipo I y III

MMP-13 Proteoglucanos, colágeno de tipo I, II y III

MMP-18 Colágeno de tipo I

Se sospecha que la principal fuente de expresión de MMP en la placa está relacionada con la actividad de macrófagos y SMC. Los macrófagos en las placas contienen abundantes MMP-1, -8, -9 y -13 y se localizan conjuntamente con sitios de degradación de colágeno y proteoglucanos in situ (Kunz J.). Asimismo, los datos propios sugieren la localización de MMP-8 y catepsina K en placas ateroescleróticas.

METALOPROTEINASAS (MMP) DE LA MATRIZ

Las MMP es un gran grupo de endopeptidasas, capaces de degradar la mayoría de los componentes de la ECM. En la actualidad, se han identificado más de 25 MMP. Las metaloproteinasas se caracterizan por un sitio activo que contiene un átomo metálico, normalmente zinc, y se secretan como zimógenos. Los inhibidores de tejido específicos, TIMP, regulan la actividad de las MMP. Se encuentra una gran variedad de MMP en las placas ateroescleróticas. Con mayor frecuencia se ubican en macrófagos que bordean el tapón fibroso, dentro del dorso de la placa en SMC y macrófagos y rara vez se identifican dentro del tapón fibroso (Kunz J.).]

Las MMP se clasifican en diferentes grupos de acuerdo con su especificidad de sustrato: Colagenasas, que degradan el colágeno fibrilar, como el colágeno de tipo I, II, III y V, pero también proteoglucanos; Gelatinasas, que degradan proteoglucanos, colágeno de tipo IV, V, VII y elastina; Estromelisina que es activo contra proteoglucanos y elastina (Rouis M). Estos tres subgrupos son de particular interés con respecto a la remodelación de la matriz en placas ateroescleróticas.

GELATINASAS

La elastina insoluble se digiere mediante MMP-2 y -9, ambas pertenecientes a la familia de gelatinasas de MMP. La MMP-9 tiene un papel importante que afecta el tamaño y la composición de la placa ateroesclerótica. En placas ateroescleróticas humanas inestables y en regiones vulnerables de placas, se ha observado una mayor expresión y concentración de MMP-9. Además, la M^m P-9 se encuentra intracelularmente (lo que indica síntesis activa) en placas coronarias con mayor frecuencia en pacientes con angina inestable en comparación con aquellos con angina estable. El nivel de MMP-9 en sangre aumenta en asociación con la ateroesclerosis coronaria y predice eventos cardiovasculares adversos (Sundstrom y Vasan). Un estudio reciente de Kuzuya et al (2006) indica que MMP-2 es responsable de la acumulación de SMC en el tapón fibroso y, por lo tanto, induce la inestabilidad de la placa.

ESTROMELISINA

La MMP-3 pertenece a las proteasas de estromelisina y es capaz de degradar tanto la elastina como los proteoglucanos. Un estudio realizado por Yamada et al (2002) indica que la MMP-3 puede ser un medio fiable para predecir el riesgo genético de infarto de miocardio en las mujeres.

COLAGENASAS

Las MMP-1, -8 y -13 se han identificado en placas ateroescleróticas donde degradan proteoglucanos y colágeno de tipo I y III.

Las MMP-1, -8 y -13 son colagenasas, que escinden el colágeno en dos fragmentos que se degradan aún más con MMP-2, -3 o -9.

La MMP-8 se expresa mediante neutrófilos, que no se encuentran comúnmente en el ateroma humano, pero se han identificado en placas ateroescleróticas. La MMP-8 puede ser en parte responsable de la degradación del tapón fibroso ya que la MMP-8 tiene preferencia por el colágeno de tipo I (Hermán et al), que tiene una actividad tres veces mayor en la degradación del colágeno I que la MMP-1 y 13. Esto es apoyado por Turu et al (2006), en este estudio el contenido de la MMP-8 en el plasma es significativamente mayor para pacientes con placas vulnerables, que para pacientes con placas estables.

Se ha informado que la MMP-13 escinde SLRPS, con alta especificidad para biglicano. La degradación de biglicano mediante MMP-13 en un sitio de escisión específico (...G¹⁷⁷/V¹⁷⁸) ha sido demostrada previamente por Monfort et al. (2005) y propusieron que jugaba un papel importante en la detección temprana de la degradación del cartílago en la osteoartritis.)

CATEPSINAS

Las catepsinas de cisteína humana constan de 11 miembros, incluidas las catepsinas B, K, L y S, y se expresan predominantemente dentro de los compartimentos endosomales/lisosomales de las células. Las catepsinas son capaces de catalizar la descomposición hidrolítica de proteoglucanos, colágeno y elastina.

En el aneurisma aórtico abdominal (AAA) se encontraron altos niveles de catepsinas S, K y L en comparación con la aorta normal. La SMC vascular humana normal no contiene catepsina K detectable mediante inmunotinción, pero las células dentro de las placas ateroescleróticas son claramente positivas. La catepsina K se localiza en áreas propensas a la rotura, tales como el tapón fibroso, los dorsos de la placa y en el sitio real de las roturas de la placa (Chapman et al). Se encuentra que la catepsina S se localiza conjuntamente con regiones de aumento de la degradación de elastina en las placas ateroescleróticas, y se observa una reducción de la ateroesclerosis en los ratones con deficiencia de catepsina S y K (Liu et al).

Tanto la catepsina L como la K degradan varios proteoglucanos y colágeno de tipo I y II, la catepsina K se degrada dentro de las triple hélices reticuladas covalentemente, mientras que la catepsina L se escinde solo en las regiones telopéptidas no helicoidales. La catepsina K se localiza en el tapón fibroso y el dorso de la placa. La expresión de catepsina K en arterias normales es muy baja. Las primeras lesiones ateroescleróticas humanas mostraron expresión de catepsina K en las SMC de la íntima y la media. En placas ateroescleróticas avanzadas, la catepsina K se localizó principalmente en macrófagos y SMC del tapón fibroso (Lutgens et al). Los niveles de proteína de catepsina K aumentaron en las lesiones ateroescleróticas en comparación con las arterias normales, mientras que los niveles de ARNm de catepsina K fueron similares en las arterias ateroescleróticas y normales. Asimismo, se demostró que los niveles de proteínas y de ARNm de catepsina K eran más altos en las placas ateroescleróticas humanas avanzadas pero estables en comparación con las lesiones ateroescleróticas tempranas y las lesiones que contienen trombo (Chapman et al).

La catepsina S solo se expresa escasamente en SMC de la íntima y la media en lesiones ateroescleróticas humanas tempranas y estrías de grasa. En placas ateroescleróticas humanas avanzadas, la catepsina S se localizó en macrófagos y SMC del tapón fibroso. La EC que recubre la luz del vaso y los microvasos de la placa también expresaron catepsina S. Además, los niveles de proteínas y ARNm de catepsina S aumentaron en el ateroma humano en comparación con las arterias normales (Lutgens et al). La catepsina S puede degradar proteoglucanos, elastina y colágeno (Liu et al).

En la actualidad, la determinación del riesgo de CVD está ocurriendo en una etapa tardía en la progresión de la ateroesclerosis; un punto en el que existe un riesgo significativo de rotura de la placa fibrosa. Existe la necesidad de ensayos de diagnóstico o pronóstico que proporcionen información sobre la ateroesclerosis o el riesgo de CVD tanto en la etapa temprana como en las etapas tardías. Los hallazgos de Katsuda et al (1992) sugieren que existen mecanismos enzimáticos para la eliminación de colágenos de lesiones avanzadas, lo que sugiere un papel importante de los neoepítopos en la arterioesclerosis.

El documento WO95/08115 divulga un procedimiento para analizar fragmentos de colágeno en líquidos corporales, que incluye poner una muestra de líquido corporal en contacto con al menos un compañero de unión inmunitaria para los fragmentos de colágeno, siendo dicho compañero de unión inmunorreactivo con péptidos sintéticos, cuyas secuencias proceden esencialmente de colágeno y que contienen posibles sitios para la reticulación.

El documento US6010862 también describe el uso de un compañero de unión inmunitaria para detectar la degradación del colágeno de tipo III in vivo.

El documento US2004/048321 describe una serie de péptidos sintetizados para que coincidan con los componentes telopéptidos de productos de degradación de colágeno de tipo III en líquidos corporales y su uso en ensayos de reabsorción de colágeno.

Becker et al. describen un fragmento reticulado que se puede aislar de una digestión tríptica de colágeno insoluble III en la piel de ternera.

En el documento EP0829724 se describe un inmunoensayo de tipo sandwich para la detección y/o cuantificación de productos de degradación de colágeno en muestras biológicas.

Hori et al. describen anticuerpos monoclonales producidos contra el colágeno humano de tipo III que son capaces de unirse al epítopo Gly-Ala-Hyp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Ala-Gly.

La presente invención proporciona un procedimiento de bioensayo para la cuantificación de fragmentos peptídicos que comprende un neoepítopo formado por escisión de colágeno de tipo III mediante MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-13, Catepsina K, Catepsina S, ADAMTS1, ADAMTS4 o ^a D^a MTS8, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos peptídicos con un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicho anticuerpo monoclonal a fragmentos peptídicos en dicha muestra, en donde dicho anticuerpo monoclonal no es reactivo con el colágeno de tipo III inalterado,

en donde dicho anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión específica por la secuencia del neoepítopo N-terminal KNGETG y no es reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido.

El resultado de dicho ensayo puede producir un índice indicativo del grado de riesgo en un paciente particular de rotura de una placa ateroesclerótica o del estado vulnerable de las placas ateroescleróticas de un paciente.

Los pacientes que tienen un valor para dicho índice por encima de un nivel umbral pueden ser recomendados para una mayor investigación mediante procedimientos de imagen de placa (incluidos los discutidos anteriormente) o para la prescripción de medicamentos para el tratamiento de la ateroesclerosis o para el tratamiento quirúrgico de la aterosclerosis, y dichas investigaciones o tratamientos de seguimiento pueden formar parte del procedimiento de la invención.

Preferentemente, la invención proporciona además, en donde la muestra es una muestra procedente de un paciente, dicho procedimiento que comprende además comparar el nivel determinado de dicha unión de dichos fragmentos peptídicos con valores característicos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una afección ateroesclerótica patológica.

La invención también proporciona un anticuerpo monoclonal contra un neoepítopo N-terminal formado mediante escisión de proteinasa de colágeno de tipo III, siendo el anticuerpo específicamente inmunorreactivo con la secuencia de neoepítopo N-terminal KNGETG y siendo no reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido. La invención proporciona además una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal de la invención; y un kit de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal de la invención, y

un agente de competencia que se une a dicho anticuerpo monoclonal y, opcionalmente, uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, patrones de calibración, un anticuerpo anti-ratón e instrucciones para realizar un ensayo usando dicho kit.

Tal como se describe en el presente documento, las proteínas de la placa ateroesclerótica incluyen lumicano, versicano, perlecano, decorina, biglicano, colágeno de tipo III, CRP, ApoE y elastina. El colágeno de tipo I no se considera proteínas de la placa ateroesclerótica. Las proteínas presentes en la placa ateroesclerótica que están expuestas allí a proteasas en un grado mayor que en otras partes del cuerpo son de particular interés.

ENSAYOS DE COLÁGENO

En el presente documento se describen ensayos peptídicos para fragmentos peptídicos de colágeno de tipo III (SEQ ID NO: 153), preferentemente de colágeno de tipo III maduro, es decir, no de propéptido de colágeno de tipo III. Las proteínas principales en las placas ateroescleróticas son el colágeno de tipo I y III, así como la elastina, mientras que el proteoglucano contribuye solo en menor medida a la matriz de la placa. De las tres proteínas principales que se encuentran en las placas ateroescleróticas, el colágeno de tipo I y III son dominantes, mientras que la elastina domina el perfil proteico en las arterias, pero no el componente proteico principal en la placa. El colágeno de tipo I es abundante en todo el cuerpo humano, mientras que el tipo III tiene una ubicación de tejido más restringida y, en la presente opinión, constituye un candidato más específico como marcador bioquímico.

Varias proteasas candidatas pueden ser responsables de la digestión del colágeno en la placa ya que la bibliografía informa de muchas proteasas diferentes en la placa ateroesclerótica. Muy probablemente, es que este sea el resultado de la gran variedad de procedimientos complicados que eventualmente conducen a la rotura de la placa. Sin embargo, en la presente evaluación, las fases tempranas pueden consistir en una gama de MMP, mientras que las etapas posteriores pueden depender más de la degradación de la catepsina K de la matriz, lo que da como resultado diferentes perfiles de neoepítopos que dependen de los niveles de enfermedad. Se ha determinado que las enzimas enumeradas en la siguiente tabla escinden el colágeno de tipo III en al menos los siguientes sitios de escisión (marcados *):

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

En consecuencia, en un procedimiento descrito en el presente documento, dichos fragmentos peptídicos comprenden preferentemente un neoepítopo formado por escisión de colágeno de tipo III mediante una proteasa en un sitio marcado por el signo * en una cualquiera de las secuencias parciales de colágeno de tipo III anteriores.

También, en un procedimiento descrito en el presente documento, dichos fragmentos peptídicos comprenden preferentemente un neoepítopo formado por escisión de colágeno de tipo III mediante una (o más) proteasa(s) en un sitio en una cualquiera de las secuencias parciales anteriores de colágeno de tipo III entre los *s, o el compañero de unión inmunitaria es específicamente reactivo con una secuencia que se extiende entre los *s en cualquier entrada de la tabla anterior.

Preferentemente, dicho compañero de unión inmunitaria no es reactivo con colágeno de tipo III inalterado. Preferentemente, dicho compañero de unión inmunitaria no es reactivo con dicha secuencia enumerada anteriormente si se prolonga más allá del sitio de escisión respectivo.

El compañero de unión inmunitaria puede ser uno específicamente reactivo con un neoepítopo C-terminal o N-terminal formado por escisión de colágeno de tipo III.

Por lo tanto, los compañeros de unión inmunitaria adecuados descritos en el presente documento pueden ser específicamente reactivos con cualquiera de las siguientes secuencias en el extremo N de un péptido: (Los n.° de ID de secuencia siguen a cada secuencia)

continuación

o con cualquiera de las siguientes secuencias en el extremo C de un péptido:

En el procedimiento de la invención el anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión específica por la secuencia del neoepítopo N-terminal KNGETG y no es reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido.

Otros sitios de escisión que definen neoepítopos que pueden analizarse de manera similar se pueden identificar mediante la exposición de colágeno de tipo III u otra proteína de placa ateroesclerótica a cualquiera de las enzimas descritas en el presente documento y el aislamiento y segmentación de péptidos producidos de ese modo.

El resultado de un ensayo de acuerdo con la invención puede combinarse con uno o más biomarcadores medidos para formar un índice compuesto de valor de diagnóstico o pronóstico.

El término "compañero de unión inmunitaria", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y también fragmentos de unión específicos de anticuerpos tales como Fab o F(ab')². Por lo tanto, dicho compañero de unión inmunitaria puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica.

El término "proteína", usado en el presente documento incluye, lipoproteínas y proteoglucanos y otros conjugados (no proteicos) de proteínas de origen natural.

En general, todos los formatos de inmunoensayo previamente conocidos se pueden usar de acuerdo con esta invención, incluidos formatos heterogéneos y homogéneos, ensayos tipo sándwich, ensayos de competencia, ensayos ligados a enzimas, ensayos radioinmunitarios y similares. Por lo tanto, opcionalmente, dicho procedimiento se realiza como un inmunoensayo de competencia en el que dicho compañero de unión inmunitaria y un agente de competencia se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competencia compite con los fragmentos peptídicos en la muestra para unirse al compañero de unión inmunitaria.

Dicho agente de competencia puede ser un péptido sintético o un péptido nativo purificado formado por escisión de la proteína a la que pertenece el neoepítopo para revelar dicho neoepítopo. Por lo tanto, el péptido puede proceder del colágeno de tipo III.

Un procedimiento adecuado podría ser un inmunoensayo de competencia que utiliza anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de anticuerpos que se unen a neoepítopos de fragmentos de cualquiera de estas proteínas o neoepítopos en fragmentos peptídicos de otras proteínas procedentes de placas ateroescleróticas. Los péptidos sintéticos seleccionados adecuadamente recubiertos sobre la superficie sólida de una placa de microtitulación podrían competir con la muestra para unirse a los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión. Como alternativa, los fragmentos nativos purificados de una o más de estas proteínas que llevan el neoepítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión podrían usarse en la superficie sólida. Otra alternativa más es inmovilizar el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión en la superficie sólida y luego incubar conjuntamente la muestra con un péptido sintético unido apropiadamente a una molécula señal, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o biotina. La muestra puede ser una muestra de orina, suero, sangre, plasma u otro, por ejemplo, biopsia de placa ateroesclerótica.

En determinados procedimientos preferidos, la muestra es una muestra procedente del paciente, y el procedimiento comprende además comparar el nivel determinado de dicha unión de dichos fragmentos de péptidos con valores característicos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una afección ateroesclerótica patológica y, opcionalmente, asociar un nivel más alto del péptido medido (normalmente indicado por un nivel más alto de unión) con un grado más grave de dicha afección.

Un aspecto de la presente invención se refiere al desarrollo de anticuerpos monoclonales que reconocen neoepítopos como se describe anteriormente. Esto se puede lograr mediante la inmunización de ratones con péptidos sintéticos que se originan a partir de la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína en cuestión (incluidas las secuencias enumeradas anteriormente o las secuencias que terminan en ellas), la fusión de las células del bazo de ratones seleccionados a células de mieloma y la prueba de los anticuerpos monoclonales para la unión a neoepítopos en péptidos sintéticos relevantes. La especificidad para los neoepítopos se puede garantizar exigiendo reactividad con un péptido sintético y una falta de reactividad con una forma C prolongada del péptido inmunizante (para un neoepítopo C-terminal) o una forma N-terminal prolongada del péptido inmunizante (para un neoepítopo N-terminal). Los anticuerpos para los neoepítopos también se pueden evaluar para establecer una falta de capacidad de unión a la proteína nativa. Como alternativa, la especificidad para un neoepítopo se puede garantizar exigiendo que la reactividad del anticuerpo sea negativamente dependiente de la presencia de biotina u otros grupos funcionales unidos covalentemente a uno de los aminoácidos terminales.

La divulgación describe un compañero de unión inmunitaria que es específicamente inmunorreactivo con un neoepítopo formado por la escisión de dicha proteína mediante una proteasa en un sitio final en una cualquiera de las secuencias parciales establecidas anteriormente, y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo.

La divulgación describe una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal contra un neoepítopo C-terminal o N-terminal formado por la escisión de una proteína de placa ateroesclerótica en los sitios finales de secuencias en una cualquiera de las secuencias parciales expuestas anteriormente.

La divulgación describe además un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal formado por escisión de dicha proteína en una cualquiera de las secuencias parciales de estas proteínas expuestas anteriormente. Dicho péptido puede conjugarse como un hapteno a un vehículo para producir una respuesta inmunitaria a dicho péptido, o inmovilizarse a una superficie sólida o conjugarse a un marcador detectable para su uso en un inmunoensayo.

La divulgación describe además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal formado por escisión de dicha proteína en una cualquiera de las secuencias parciales expuestas anteriormente.

La invención comprende además un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una señal de expresión y una secuencia de codificación que codifica la expresión de un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal formado por escisión de una proteína en una cualquiera de las secuencias parciales establecidas anteriormente e incluye además una célula hospedadora transformada con dicho vector y que expresa dicho péptido.

Otro aspecto más de la divulgación se refiere a kits, que se pueden usar convenientemente para llevar a cabo los procedimientos descritos anteriormente. Dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con péptido sintético; (2) un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a anticuerpo de la invención reactivo con dicho péptido sintético; y (3) una inmunoglobulina anti-IgG de ratón marcada. Como alternativa, dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con fragmentos de proteínas nativas purificadas; (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en fragmentos de una cualquiera de dichas proteínas, y que reacciona con dichos fragmentos purificados; y (3) una inmunoglobulina anti-IgG de ratón marcada. Como alternativa, dichos kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina; (2) un péptido sintético unido a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en dichos fragmentos de proteínas y reacciona con dicho péptido sintético; y (4) una inmunoglobulina anti-IgG de ratón marcada. Otra alternativa más podría ser kits que incluyen (1) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina; (2) un péptido sintético unido a biotina; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en dichos fragmentos de proteínas (y que reacciona con dicho péptido sintético) y se conjuga con peroxidasa de rábano picante.

Por lo tanto, la invención incluye un kit de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal que es específicamente inmunorreactivo con la secuencia del neoepítopo N-terminal KNGETG y que no es reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido, y un agente de competencia que se une a dicho anticuerpo monoclonal y, opcionalmente, uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, patrones de calibración, un anticuerpo anti-ratón e instrucciones para realizar dicho inmunoensayo.

Los ensayos descritos en el presente documento son útiles en el diagnóstico de la enfermedad ateroesclerótica en pacientes. Además, las pruebas son útiles para la evaluación de la progresión de la enfermedad y el control de la respuesta al tratamiento. Los compañeros de unión inmunitaria de la invención también pueden usarse en inmunotinción para mostrar la presencia o ubicación de productos de escisión de cualquier proteína de placa ateroesclerótica descrita en el presente documento.

La invención se explicará e ilustrará adicionalmente con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra la tinción de Biglicano (aumentos 2, 4, 4 y 10 x respectivamente) usando un anticuerpo monoclonal de ratón en una muestra aórtica con lesión de tipo III.

La Figura 2 muestra la tinción de catepsina K (aumentos 2, 4, 10 y 10 x respectivamente) usando un anticuerpo monoclonal de ratón en una muestra aórtica con lesión de tipo III.

La Figura 3 muestra la tinción de Biglicano (aumentos 2, 4, 10 y 10 x respectivamente) usando un anticuerpo monoclonal de ratón en una muestra aórtica con lesión de tipo V.

La Figura 4 muestra la tinción de catepsina K (aumentos 2, 4, 10 y 10 x respectivamente) usando un anticuerpo monoclonal de ratón en una muestra aórtica con lesión de tipo V.

La Figura 5 muestra productos de escisión de biglicano generados por proteasas: MMP2, MMP3, MMP8, catepsina K, catepsina S, catepsina B y catepsina L. M = marcador Rainbow. -enz = sin digestión enzimática, ciclo en un gel en el Ejemplo 2.

Las Figuras 6 a 8 muestran los resultados del estudio de competencia obtenidos en el Ejemplo 4.

La Figura 9 muestra los resultados del estudio de competencia obtenidos en el Ejemplo 6.

Las Figuras 10 y 11 muestran los resultados del estudio de competencia obtenidos en el Ejemplo 7.

Ejemplo de referencia 1.

Para el análisis de localización de proteoglucanos y proteasas, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas de muestras arteriales humanas procedentes de arterias descendentes coronarias izquierdas (LAD).

A continuación, se muestra la ubicación conjunta de la proteasa de catepsina K y biglicano.

La tinción inmunohistoquímica como se ve en las Figuras 1 y 2 reveló una ubicación conjunta de biglicano y catepsina K. Esto puede sugerir que biglicano es un sustrato preferido de catepsina K.

La misma tinción inmunohistoquímica se realizó en las muestras aórticas, donde se formó la placa ateroesclerótica y como resultado de esta arquitectura aórtica normal se reemplazó por infiltrados de células de espuma de macrófagos y calcificaciones. Los resultados de estas inmunotinciones se recogen en las Figuras 3 y 4.

Se mostró que la tinción inmunohistoquímica de biglicano y catepsina K se localiza conjuntamente en una lesión ateroesclerótica progresiva. Estos resultados juntos generan hipótesis de sitios específicos de escisión de catepsina K en biglicano, lo que da como resultado una mayor generación de neoepítopos en lesiones ateroescleróticas. Para probar esta hipótesis, se escindió biglicano con diferentes proteasas.

Ejemplo de referencia 2.

Degradación de biglicano para la evaluación de fragmentos de degradación. El biglicano del cartílago articular bovino (B8041 - Sigma-Aldrich) se escindió mediante las siguientes proteasas: MMP2, MMP3, MMP8, Catepsina K, Catepsina S, Catepsina B y Catepsina L. Fragmentos de proteoglucanos generados por la escisión enzimática de las proteasas mencionadas anteriormente se separaron en geles NuPage® Bis-Tris al 10 % y luego se tiñeron con plata mediante "Silver Express" - kit de tinción con plata (n.° de Cat. de Invitrogen LC6100, n.° de lot. 341099). La Figura 5 representa los resultados de la separación de los derivados proteolíticos y las tinciones de biglicano y plata.

Ejemplo 3

Los ratones se inmunizaron con péptidos procedentes de colágeno de tipo III conjugados con ovoalbúmina. Los sueros se seleccionaron para determinar la reactividad con secuencias peptídicas de selección conjugadas con biotina. Se produjeron clones secretores de anticuerpos monoclonales y se seleccionaron usando las secuencias de selección. Se verificó la falta de reactividad de los clones con versiones alargadas del péptido diana que continúan con las secuencias adyacentes del colágeno de tipo III (péptido de deselección) y la falta de reactividad con un péptido sin sentido. Ninguno de los clones positivos para las secuencias diana reaccionó con las secuencias alargadas o sin sentido.

Las secuencias diana, inmunógenos, secuencias de selección y secuencias de deselección fueron las siguientes:

continuación

Ejemplo 4

Reactividad de los anticuerpos monoclonales de neoepítopo de colágeno de tipo III con orina humana

La reactividad de clones de anticuerpos monoclonales seleccionados del ejemplo 3 con orina humana se determinó en un formato de ensayo de competencia usando los péptidos inmunizantes como agente de competencia. En un procedimiento normal, se revistieron placas recubiertas con estreptavidina de 96 pocillos durante 30 minutos con 10 ng/ml de péptido de biotina en PBS-BTE a 20 °C con agitación y se lavaron 5x en tampón de lavado. Se añadieron 20 |jl de muestra diluida (solución de orina o péptido). Se añadieron 100 j l de solución de anticuerpo no purificada (sobrenadante del cultivo celular) diluida como se detalla a continuación. Las placas se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitación a 300 rpm y luego se lavaron 5x en tampón de lavado. Se añadieron 100 j l de anticuerpo secundario-POD (1:5000) y se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitación a 300 rpm antes de lavar 5x en tampón de lavado. Se añadieron 100 j l de TMB y se incubaron durante 15 minutos en agitación en oscuridad a 300 rpm antes de añadir 100 j l de solución de parada. Las placas se leyeron a 450 nm en un lector ELISA con 650 nm como referencia. Por lo tanto, se produjo competencia entre el péptido en la placa y el péptido en solución para el anticuerpo y la cantidad de anticuerpo unido a la placa se determinó mediante la reacción de formación de color de peroxidasa.

Los resultados se ven en la Figura 6 para cuatro clones diferentes. Se puede ver que cada uno de los anticuerpos detecta secuencias relevantes en la orina.

Se realizaron estudios de competencia adicionales en un clon seleccionado para probar la competencia para la unión de anticuerpos entre el péptido inmunizante y el colágeno nativo de tipo III escindido in vitro por MMp9. Los resultados se muestran en la Figura 7 para el colágeno escindido, el péptido KNGETG y una versión alargada de esa secuencia. Se puede ver que el anticuerpo se une a la secuencia del péptido inmunizante y al colágeno escindido por la enzima, pero no a la secuencia extendida.

Se observan estudios de competencia adicionales en el mismo clon en la Figura 8, donde los agentes de competencia fueron el péptido KNGETG, suero humano, suero de rata, FCS (suero de ternera fetal) y extractos de placa ateroesclerótica respectivamente. Se ve que el anticuerpo es reactivo con el péptido, el extracto de placa y el suero humano, pero no con el suero de rata o el FCS.

Ejemplo de referencia 5

Aumento de antisueros a las secuencias decorina, biglicano y versicano

Se generaron antisueros y se obtuvieron anticuerpos monoclonales como en el Ejemplo 3, pero usando los siguientes inmunógenos, secuencias de selección y secuencias de deselección:

Ejemplo de referencia 6

Reactividad del anticuerpo monoclonal de neoepítopo decorina con orina humana

Un ELISA de competencia se llevó a cabo generalmente como en el Ejemplo 5 usando un anticuerpo monoclonal no purificado antidecorina (NB62)

Los resultados se muestran en la Figura 9. La reactividad se observa contra la secuencia peptídica contra la cual se generó y seleccionó el anticuerpo y contra la orina, pero no contra la secuencia peptídica irrelevante NB18.

Ejemplo de referencia 7

Reactividad del anticuerpo monoclonal de neoepítopo versicano con orina humana

Un ELISA de competencia se llevó a cabo generalmente como en el Ejemplo 5 usando dos clones de anticuerpos monoclonales no purificado antiversicano generados contra la secuencia (NB64).

Los resultados se muestran en las Figuras 10 y 11 para los respectivos clones. En cada caso, se observa reactividad contra la secuencia peptídica contra la cual se generó y seleccionó el anticuerpo y contra la orina, pero no contra la secuencia peptídica irrelevante NB18.

En la presente memoria descriptiva, a menos que se indique expresamente lo contrario, la palabra 'o' se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando se cumple una o ambas condiciones, en oposición al operador 'exclusivo o' que requiere que solo se cumpla una de las condiciones. La expresión 'que comprende' se usa en el sentido de 'que incluye' en lugar de que signifique 'que consiste en'.

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de bioensayo para la cuantificación de fragmentos peptídicos que comprende un neoepítopo formado por escisión de colágeno de tipo III mediante MMP-1, MMP-3, Mm P-8, MMP-9, Mm P-13, Catepsina K, Catepsina S, ADAMTS1, ADAMTS4 o ADAMTS8, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos peptídicos con un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicho anticuerpo monoclonal a fragmentos peptídicos en dicha muestra, en el que dicho anticuerpo monoclonal no es reactivo con el colágeno de tipo III inalterado,

en el que dicho anticuerpo monoclonal tiene una afinidad de unión específica por la secuencia del neoepítopo N-terminal KNGETG y no es reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido.

2. Un procedimiento reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento se realiza como un inmunoensayo de competencia en el que dicho anticuerpo monoclonal y un agente de competencia se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competencia compite con los fragmentos peptídicos en la muestra para unirse al anticuerpo monoclonal.

3. Un procedimiento reivindicado en la reivindicación 2, en el que dicho agente de competencia es un péptido sintético o es un péptido nativo purificado formado por escisión de la proteína de la que proviene dicho epítopo para revelar dicho neoepítopo.

4. Un procedimiento reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra es una muestra de orina, suero, sangre o plasma.

5. Un procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que la muestra es una muestra procedente de un paciente, comprendiendo dicho procedimiento además comparar el nivel determinado de dicha unión de dichos fragmentos peptídicos con valores característicos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una afección ateroesclerótica patológica.

6. Un anticuerpo monoclonal contra un neoepítopo N-terminal formado por escisión mediante proteinasa de colágeno de tipo III, siendo el anticuerpo específicamente inmunorreactivo con la secuencia de neoepítopo N-terminal KNGETG y siendo no reactivo con una versión N-prolongada de dicho péptido.

7. Una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal reivindicado en la reivindicación 6.

8. Un kit de inmunoensayo que comprende un anticuerpo monoclonal reivindicado en la reivindicación 6, y un agente de competencia que se une a dicho anticuerpo monoclonal y, opcionalmente, uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, patrones de calibración, un anticuerpo anti-ratón e instrucciones para realizar un ensayo usando dicho kit.