JPH07508403A - デコリンフラグメントおよび細胞調節因子を阻害する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 デコリンフラグメントおよび細胞調節因子を阻害する方法本発明は、Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅからの政府助成金ＣＡ　３０１９９ 、ＣＡ　４２５０７およびＣＡ　２８８９６の支援によってなされた。

したがって、合衆国政府は本発明において特定の権利を有し得る。

発明の分野 本発明は、細胞生物学に関し、そしてより特定すれば細胞調節因子の阻害による 細胞増殖の制御に関する。

発明の背景 プロテオグリカンは、１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタ ンパク質である。既知のプロテオグツカンは、様々な機能を遂行し、種々の細胞 位置で見いだされる。多くのプロテオグリカンは細胞外マトリックス成分であり 、そこで細胞のアセンブリーに関与して細胞をマトリ・、クスへ付着させる。

ＰＧ−１１あるいはＰＧ−４０として知られるデコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）は、 線維芽細胞によって産生される小さなプロテオグリカンである。そのコアタンパ ク質は、約４０．０００ダルトンの分子量を有する。このコアは配列決定され（ ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８３ニア６８３（１９８６）；　Ｄａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｊ、　２４８：８０１（１９８７）、これらは共に本明細書に参考として援用さ れる）、そして単一のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型のグリコサミノグ リカン鎖を有することが知られている（　Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｊ、　Ｂｔｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　２５８：１５１０１ｃ１９８３ン、これは不明ｍ杏に参考として 援用される）。これまでに知られているデコリンの唯一の機能は、１型あるいは ＩＩ型コラーゲンに結合することおよびこれらのコラーゲンのよる繊維形成に及 ぼす効果である（Ｖｏｇｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２２３：５８７（１ ９８４）；　Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０４：１６８３ 、（１９８７））。２種のプロテオグリカン、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ） 　（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６４：４５７１（１９８ ９））およびフィブロモデュリン（ｆ　ｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）　（Ｏｌｄｂ ｅｒｇら、ＥＭＢＯ）、８：２６０］、（１９１１９））　は、デコリンのアミ ノ酸配列と密接に関連するアミノ酸配列を有するコアタンパク質を有し、そして それらはデコリンと共に１つのタンパク質ファミリーと考えられ得る。それらの 配列のいずれもが、約２４のアミノ酸のロイノンに富む繰返しくｒｅｐｅａｔ） により特徴付けられる。いくつかの他のタンパク質が類似の繰返しを有する。こ れらのタンパク質は１つにま七まって、タンパク質のスーパーファミリーを形成 する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｊ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４：２ ２９、（１９８８）；　ＭｃＦａｒｌａｎｄら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５４９４ （１９Ｂ９））。

トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、多くのタイプの細胞によって 種々の形態で産生される多機能細胞調節因子のファミリーである（　５ｐｏｒｎ ら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：１０３９、（１９８７＞を参照）。

５つの異なるＴＧＦβが知られているが、２種類のみ、ＴＧＦβ−１およびＴＧ Ｆβ−２の機能が、詳細に特徴付けられている。ＴＧＦβは、本明細書に参考文 献として援用される米国特許第４．１１６３．８９９号；第４．１１１６．５６ １号；および第４．７４２．００３号の主題である。ＴＧＦβ−１およびＴＧＦ β−２は、多くの商業的供給源を通じて公に入手可能である（例えば、Ｉ？＆Ｄ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｊｎｃ、、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）。これらの ２つのタンパク質は、′ｇ４似の機能を有し、本明細書中ではまとめてＴＧＦβ とする。ＴＧＦβは、本質的に全てのタイプの細胞が有する、細胞表面レセプタ ーに結合して、細胞に重要な変化を引き起こす。特定の細胞においては、ＴＧＦ βは細胞増殖を促進し、別の細胞においては増殖を抑制する。ＴＧＦβ・の顕著 な作用は、細胞外マド１ルＩクスタンパク質およびそのレセプターの細胞による 産生を促進することである（　Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ　３３：９５（１９８７）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、　Ｃｅ１ｌ　４９：４ ３７（１９８７）；　Ｒｏｂｅｒｔｓおよび５ｐｏｒｎ著「ペプチド成長因子お よびそれらのレセプターＪ　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

）１ｅｊｄｅｌｂｅｒｇ＜１９１１９）を参照）。

ＴＧＦβは多くの必須の細胞調節機能を宵しているが、不適切なＴＧＦβ活性は 生物に有害であり得る。開票の成長および開票細胞の増殖は、丁ＧＦβによって 刺激されるので、特定の腫瘍細胞は、ＴＧＦβをオートクライン（ａｕｔｏｃｒ ｉｎｅ）成長因子として使用し得る。従って、ＴＧＦβの成長因子活性を妨げ得 る場合、腫瘍の成長を制御し得る。他の場合では、ＴＧＦβによる細胞増殖の阻 害が有害であり得、その場合には損傷組織の治癒が妨げられ得る。ＴＧＦβによ る細胞外マトリックス産生の刺激は、創傷の治癒のような場合重要である。しか し、特定の場合には、体がこの刺激に過剰反応し、細胞外マトリックスの過度の 蓄積が結果として起こる。細胞外マトリックスの過度の蓄積の例としては、ＴＧ Ｆβの有害な含有を伴う病気である糸球体腎炎がある。

従って、ＴＧＦβのような細胞調節因子の作用を調節し得る化合物を開発する必 要性が存在する。本発明は、この必要性を満足させ、そして関連する利点を提供 する。

発明の要旨 本発明は、細胞調節因子結合性ドメインを有するタン／４り質の活性フラグメン トを提供する。本発明はさらに、細胞調節因子と精製ポリペプチドとを接触させ る工程を包含する細胞調節因子の活性を阻害する方法であって、このポリペプチ ドは、タンパク質の細胞調節因子を結合するドメインを有し、そしてこのタンパ ク質が約２４のアミノ酸のロイノンに富む繰返しにより特徴付けられる。特定の 実施態様において、本発明は、通常、グリコサミノグリカン鎖を有する、４０． ００げルトンのタンパク質であるデコリンの活性に関し、さらにより特定すれば 、デコリンの活性フラグメント、あるいはＴＧＦβまたは他の細胞調節因子に結 合するデコリンの機能的等偽物に関する。本発明はまた、形態修復因子（Ｍｏｒ ｐｈｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｔ。

ｒｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＭＲＦ））と称する新規な細胞調節因子を提供する 。

また、細胞調節因子、および、細胞調節因子に結合しそしてその活性に作用する タンパク質の同定、検出および精製方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、セリン受容体部位のアラニンへの変異を含むデコソンｃＤＮＡの発現を 示す。ＣＱＳ−１培養物を、野生型デコリン（レーンｌ）、４位のセリン残基を アラニンで置換したデコリン（レーン２）、あるいは４位のセリン残基をトレオ ニンに置換したデコリン（レーン３）をコードするｃＤＮＡでトランスフェクト した。抗デフリン抗体、および３５ｓ−硫酸塩（Ａ）あるいは３Ｈ−ロイノン（ Ｂ）で標識した培地を用いて免疫沈降を行った。

レーン４は、偽物（ｍｏｃｋ）でトランスフェクトしたＣＯ５−１培養物からの 免疫沈降物を示す。矢印はゲルの先端を示す。数値は、分子ｊｌ標準をＭｒｘｌ Ｏ−’で示す。

図２　ｔｉ、［１２５１１ＴＧＦβ１のデフリン−セフ７０−スへの結合ヲ示す ：　（Ａ）デフリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによる［ ”＋］ｒＧｐβ１の分画。［１２５１］ＴＧＦβ１（５×１０１０５ｃｐを、Ｌ Ｍ　ＮａＣ１および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２ｎｌのＰＢＳ　ｐＨ ７，４中、０．２ｍｌのパック化デフリン−セファロース（・）するいはゼラチ ン−セファロース（Ｏ）を有するＢＳＡでコートされたポリプロピレンチューブ 中でインキユベートした。１晩インキコベートした後、アフィニティーマトリッ クスをＢＳＡでコートされたディスポーザブルカラム（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に移し 、そして結合緩衝液で洗浄した。まず結合緩衝液中３Ｍ　ＮａＣ１で、次いで同 緩衝液中８Ｍ尿素で溶出を行った：（Ｂ）非還元条件下での５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルによるデフリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィー 溶出物の分析。レーン１：オワノナルの［１２５１］標識ＴＧＦβ１試料；レー ン２−７＝流出および洗浄画分；レーン８−１０　：　３Ｍ　ＮａＣ１画分；レ ーン１１−１４　：　ＢＭ尿素画分。矢印は１２％分離ゲルの先端と底部を示す 。

図３は、プロテオグリカンおよびそれらのコアタンパク質による［１２５１１Ｔ ＧＦβ１のデフリンへの結合の阻害を示す：（Ａ）組換えデフリンによる［”Ｉ ＩＴＧＰβ１のデフリンでコートされたマイクロタイターウェルへの結合の競合 （・）、ラン皮膚（ＰＧｌｌ）から単離されたデフリン（■）、ラン関節軟骨（ ＰＧＩ）から単離されたビグリカン（ム）、ニワトリ軟骨プロテオグリカン（０ ）、およびＢＳＡ　（ロ）。各点は、２回測定した平均を表す。（Ｂ）　［１２ ５１］ＴＧＦβ１結合のコンドロイチナーゼＡＢＣで処理されたプロテオグリカ ンおよびＢＳＡとの競合。競合物質の濃度を、完全（ｉｎｔａｃｔ）なプロテオ グリカンとして表現した。記号は図３Ａと同じである。

図４は、デフリンによるＴＧＦβ１の成長調節活性の中和を示す＝（Ａ）は、Ｃ ＨＯ細胞のＴＧＦβ１で誘導された増殖のデフリンによる阻害を示す。〔３Ｈ〕 チミジン取り込みアッセイを、５０ｇ／＋１のＴＧＦβ−１および表示された濃 度の精製デフリン（・）あるいはＢＳＡ（○）存在下で行った。用いた濃度にお いて、ＴＧＦβ−１は、Ｃ）１０細胞への［３）１］チミジンの取り込みを５０ ％増加させた。データは、この成長刺激の中和割合をパーセントで表示している ；すなわち、ＴＧＦβ１あるいはデフリンが存在しない場合の〔３月チミジン取 り込みを０％、ＴＧＦβが存在し、デフリンが存在しない場合の［３Ｈ］チミジ ン取り込みを１００％とする。各点は、３試料の平均上標準偏差を表す。（Ｂ） は、ＭｖｌＬｕ細°胞におけるデフリンによるＴＧＦβ１で誘導された成長の阻 害の中和を示す。

ＴＧＦβ−１を０．５ｎｇ／ｍｌ加える以外は、Ａと同様にしてアッセイを行っ た。このＴＧＦβ−１の濃度では、ＭｖｌＬｕ細胞への［３Ｈ］チミジンの取り 込みが５０％減少した。データは、ＴＧＦβで誘導された成長阻害の中和を示す ；すなわち、ＴＧＦβおよびデフリンの両方が存在しない場合の［３旧チミジン 取り込みを１００％、ＴＧＦβが存在しデフリンが存在しない場合の［３Ｈ］チ ミジン取り込みを０％とする。

図５Ａは、ゲル濾過による、デコリン発現ＣＨＯ細胞からの成長阻害活性の分離 を示す。デフリン過剰発現細胞の血清フリーの調整培地を中性Ｔｒｉｓ−）１ｃ Ｉ緩衝液中でＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによって分画し、成長 阻害活性を有する画分をプールし、グアニジン−）ＩＣＩで４Ｍにし、そして同 じグアニジン−１（Ｃ１溶液を用いて平衡したセファロースＣＬ−６Ｂカラム上 で分画した。画分をタンパク質含有量、デフリン含有量、そして成長調節活性に ついて分析した。マーカータン７＜り質の溶出位置を矢印で示す。ＢＳＡ、ウシ 血清アルブミン　（Ｍｒ＝６６．０ＯＯ）；ＣＡ：カルボニソクアンヒドラーゼ （Ｍｒ＝２９，０００）：　Ｃｙ：チトクロームｃ（Ｍｒ＝１２．４００）；　 Ａ＋）アプロチニン（ａｐｒｏｔ　１ｎｉｎ）　（Ｍｒ＝６゜５００）；　ＴＧ Ｆ：［”ＩＩＴＧＦβ１　（Ｍｒ＝２５，０００）。

図５Ｂは、ゲル濾過からの成長刺激物質のＴＧＦβ１としての同定を示す。セフ ァ０−ス６Ｂからの後期フラクシ゛ヨン（／セネルＡのバー）に由来する成長刺 激活性を、抗ＴＧＦβ抗血清由来のプロティンＡ精製１ｇＧを用いた活性の阻害 によって同定した。

データは、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイにおける成長刺激活性の阻害割合 をパーセントで表示してし）る。各点１１！、３回の測定の平均上標準偏差を示 す。抗ＴＧＦβ１（・）、正常ウサギのＩｇＧ　（○）。

図６は、ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンノｆり質の概略図である。ＬＲ Ｒは、ロインンに富む繰返しである。ＭＢＰは、マルトース結合性タンパク質で ある。

図７は、”Ｉ−ＴＧＦβの固定化組換えデフリン（ＤＣ１３）ならびにＭＢＰ− デフリンフラグメントＰＴ−６５、ＰＴ−７１、ＰＴ−７２およびＰＴ−７３へ の結合性研究の結果を示す。

図８は、１２５１−ＴＧＦβの固定化デフリン（ＤＣ１８ｖ）ならびにＭＢＰ− デフリンフラグメントＰＴ−７１、ＰＴ−７２、ＰＴ−８４、ＰＴ−８５、ＰＴ −８６およびＰＴ−８７への結合性研究の結果を示す。

図９は、デフリンフラグメントＰＴ−６５、ＰＴ−７１、ＰＴ−７２およびＰＴ −７８存在下での、”Ｉ−ＴＧＦβ１のＨｅｐＧ２細胞への結合性研究の結果を 示す。

図１０は、デフリンならびにデフリンフラグメントＰＴ−７１、ＰＴ−７２、Ｐ Ｔ−８４およびＰＴ−８５存在下での、１２５！−ＴＧＦβのＬ−Ｍ（ｔｋ−） 細胞への結合性研究の結果を示す。

図１１は、デフリンならびに組換えデフリンフラグメントＰ丁−７１、ＰＴ−７ ２、ＰＴ−８６およびＰＴ−８７存在下での、１２５Ｉ−τＧＦβ１のＬ−Ｍ（ ｔｋ−）細胞への結合性研究の結果を示す。

図１２は、合成デフリンペプチドフラグメントＰ２５−Ｑ３６、Ｈ３１”’Ｓ３ ７、および［３ｌ−Ｌ４２ならびにＮ末端１５７−に相当する対照ペプチドの存 在下での、１２５１−ＴＧＦβ１のＬ−Ｍ（ｔｋ−）細胞への結合性研究の結果 を示す。

図１３は、合成デコリノペプチドフラグメント１６Ｄ、　１６Ｅ、１６Ｇおよび １６ＨならびにＮ末端１５マーに相当する対照ペプチドの存在あるいは不存在下 での、”Ｉ−ＴＧＦβの固定化デフリンへの結合結果を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、細胞調節因子を、精製ポリペプチドに接触させる工程を包含する、細 胞調節因子の活性を阻害する方法であって、該ポリペプチドが、タンパク質の細 胞調節因子結合性ドメインを有する、方法を提供する。そのタンパク質は、高ロ インンに富む約２４アミノ酸の繰返しにより特徴付けられる。

癌のような疾患は、非制御細胞増殖に起因する゛ので、本発明はこのような疾、 壱の治療に使用され得る。

「細胞調節因子」により、細胞の活性を調節し得る分子を意味する。細胞調節因 子は、一般に、細胞表面レセプターに結合し、成長因子を含むタンパク質である 。細胞調節因子の例には、５１のＴＧＦβ、血小板来由成長因子（ＰＤＧＦ）　 、表皮成長因子、インスリ７様成長因子１およびＩ＋、線維芽細胞成長因子、イ ンターロイキン−２、神経成長因子、造血細胞成長刃欠に、このようなフラグメ ントは、それらが結合活性を有子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、　Ｍ−ＣＳＦＳＧ −ＣＳＦ４エリトロポエチン）、および新たに発見された形態回復因子（以後、 ｒＭＲＦＪ）が含まれる。異なる調節因子が、調節因子の活性に作用し得る異な るタンパク質に結合され得る。例えば、ＴＧＦβ−１は、デフリンおよびビグリ カンに、そしてＭＲＦは、デフリンに結合される。

「細胞調節因子結合性ドメイン」により、細胞調節因子に結合するタンパク質の フラグメントを意味する。結合活性を有するタンパク質フラグメントは、本発明 の範囲内に包含され、本明細書では活性フラグメントと呼ばれる。デフリンある いはビグリカンの活性フラグメントのような、このような活性を有するフラグメ ントは、デフリンのＴＧＦβに対する、あるいはその他のポリペプチドのその同 系成長因子に対するような、結合を競合的に阻害する活性により認識され得る。

活性フラグメントは、当該分野で公知の方法あるいは実施％１ｌＩＩＩ＋に記載 のような方法により、天然ポリペプチドのタンパク質分解消化により得られ得る 。あるいは、活性フラグメントは、当業者に公知の方法あるいは実施例Ｖｌｌ＋ に記載のよフラグメントはまた、当該分野に公知の方法あるいは実施例Ｖに記載 のような方法により組換え産生され得る。活性フラグメントの例は、表４−１５ に含まれている。

びフィブロモデュリンのような、デフリンに相同である分子すか否かを決定する ために、競合アッセイに使用され得る。

例えば、デフリンは、実施例１１の方法のように、アフィニティーマトリ、クス に結合され得る。次に、標ＸａＴＧＦβおよび活性フラグメントがアフィニティ ーマトリックスに接触され得、それに結合されたＴＧＦβが定量され得る。

本明細書に使用されているように、「デフリン」とは、ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲ ｕｏｓｌａｈｔｉ　（前出）にて、プロテオグリカンに属する構造的特徴を実質 的に有するプロテオグリカンのことである。ヒト線維芽細胞デコリンは、実質的 に、ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｔ＋ｏｓｌａｈｔｉ　（前出）に示されるアミノ酸 配列を有する。「デフリン」とは、天然組成物、および実質的に、機能特性を有 するそれらの改変体の両方のことである。デフリンコアタンパク質は、もはや実 質的にグリコサミノグリカンで置換されておらず、デフリンの定義内に包含され ているデフリンである。

デフリンは、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質に結合し得ない組換えデ フリンを細胞内で産生ずるような、変異あるいはその他の方法により、グ１ノコ サミノグリカンを含有しなくさせられ得る。

デフリンの機能等個物には、その機能特性を有するデフリン改変体、および、例 えば、デフリンの同様の機能活性を有する、デフリンファミリーのメンバーであ るビグリカンおよが包含される。改変は、例えば、デフリンコアタンパク質の機 能活性を妨害しない、１つ以上の側鎖の付加を包含し得る。

調節因子結合性タンパク質は各々、タンパク質の８０％を構成し得る約２４アミ ノ酸のロイシンに富む繰返しを含有するので、結合活性を有するフラグメントは 、ロイシンに富む繰返し中に生じるようである。しかし、結合活性が、カルボキ シ末端アミノ酸、あるいは、繰返しとカルボキシ末端アミノ酸との接続部位のよ うな、どこかその他のところに存在することは可能である。

本発明は、当業者が、細胞調節因子に結合し得るタンパク質を同定、あるいは、 タンパク質の特定のファミリーに結合する細胞調節因子を同定し得る、一般的な 方法を教示する。

さらに、本発明は、これらの新規タンパク質あるいは既存のタンパク質が、細胞 調節因子の活性に作用するか否かを決定するためにアッセイされ得る、一般的な 方法を教示する。特定すれば、本発明は、デフリンおよびビグリカンが、ＴＧＦ β−１およびＭＲＦを結合すること、および、このような結合が、ＴＧＦβ−１ の細胞調節機能を阻害し得ることの発見を教示する。さらに、デフリンおよびビ グリカンの両方は、約８０％相同であり、ロイシン残基配列が保存されている約 ２４アミノ酸のロイシンに富む繰返しを含有する。定義されるように、各繰返し は−般的に、少なくとも２つのロイシン残基を含有し、そして５つ以上のロイシ ン残基を含有し得る。従って、これらのプロテオグリカンは、同じタンパク質フ ァミリーのメンバーであると考えられ得るｏ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　（前出）　 、Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、。

Ｃｈｅｍ、、　２６４：４５７１−４５７６　（１９８９）、およびＰａｔｔｈ ｙ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９８＋５６７−５７７　（１９８７） を参照のこと。これらはすべて、参考として援用されている。このロイシンに富 む繰返しを有する、その他の既知タンパク質あるいは後に発見されたタンパク質 、すなわち、フィブロモデュリンが、同様の細胞調節活性を有することが予測さ れた。このようなタンパク質の細胞調節因子に結合する能力が、例えば、ＴＧＦ β−１のような既知の細胞調節因子を使用した、実施例１１に挙げたアフィニテ ィークロマトグラフィーあるいはマイクロタイターアッセイにより、容易に試験 され得た。あるいは、後に発見された任意の細胞調節因子が、例えば、１つ以上 の調節因子結合性タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより 試験され得た。一旦、このよな結合が生じることが確認されると、全ての調節因 子の活性に対する結合の影響が、実施例ＩＩ＋に挙げた成長アッセイのような方 法により測定され得る。さらに、当業者は、実施例において、ＴＧＦβ−１の代 わりに新規細胞調節因子を単に取り替える得るか、あるいは、デフリンあるいは ビグリカンの代わりに新規のロイシンに富む繰返しを取り替えて、それらの活性 を測定し得る。従って、本発明は、新規な細胞調節因子およびこれらの因子の活 性に作用するタンパク質を同定および試験する、一般的な方法を提供する。

本発明はまた、精製ポリペプチドに結合された細胞調節因子を含有する新規な精 製化合物を提供する。ここで、該ポリペプチドは、タンパク質の細胞調節因子結 合性ドメインを宵し、該タンパク質は、約２４アミノ酸のロイシンに富む繰返し により特徴付けられる。

さらに、本発明は、ＭＲＦと呼ばれる、約２０　ｋｄの分子量を有する新規な精 製タンパク質を提供する。このタンパク質は、ＣＨＯ細胞から単離され、非解離 条件下でデフリンと共精製され、解離条件下でデフリンと分離され得、形質転換 ３Ｔ３細胞の形態を変化させ、そして抗ＴＧＦβ−１抗体により阻害されない活 性を有する。あるいは、ＭＲＦｌｉＨＰＬＣ中でＴＧＦβ−１から分離する。

さらに、本発明は、細胞調節因子に結合しそして約２４アミノ酸のロイシンに富 む繰返しを育するタンパク質に調節因子を接触させる工程を包含し、該タンパク 質に結合されるようになる調節因子を精製するための、細胞調節因子の精製方法 を提供する。この方法は、例えば、デフリンを用いてＴＧＦβ−１を精製するた めに使用され得る。

本発明はその他に、ＴＧＦβを精製ポリペプチドに接触させる工程を包含する、 ＴＧＦβ調節活性に起因する病気の症状を治療する方法を提供する。ここにおい て、該ポリペプチドは、タンパク質のＴＧＦβ結合性ドメインを含有し、該タン パク質は、約２４７ミ／酸のロイシンに富む繰返しにより特徴付けられ、そのこ とにより、病気の症状を生じる活性を妨害あるいは減退させる。この方法は一般 的に適用できるが、治療され得る病気の症状の特定の例には、癌、線維症の疾患 、および糸球体腎炎が含まれる。例えば、癌では、デフリンは、ＴＧＦβ−１を 結合するために使用され得、癌細胞に対するＴＧＦβ−１の成長刺激活性を破壊 する。

最後に、細胞調節因子の阻害を阻む方法が提供される。その方法は、細胞調節因 子の活性を阻害するタン／＜り質を、そのタンパク質の活性を阻害する分子に接 触させる工程を包含する。例えば、デフリンは、抗体のような、デフリンのＴＧ Ｆβ〜１との結合を阻み、このためデフリンがＴＧＦβ−１活性を阻害すること を阻む分子に結合され得た。従って、ＴＧＦβ−１の創傷治＋ｉ！活性は、ＴＧ Ｆβ−１インヒビターの結合により促進され得た。

ＴＧＦβ、ＭＲＦ、デフリン、ビグリカンおよびフイブロモデュリンを含む、本 発明の種々の分子の活性に実質的（こ作用しない改変体もまた、それらの分子の 定義内に包含されることが理解される。さらに、デフリン、ビグリカンおよびフ イブロモデュリンのコアタンパク質もまた、それらの分子の定義内に包含される ことも理解される。

以下の実施例は、本発明を例示するが、限定することは意図しない。

実施例１ 組換えデフリンおよびデフリンコアタンパク質の発現および精製 ＆１玉 本明細書に参考として援用されている、ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕ。

５ｌａｈｔｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ３ニア６８３　（１９８６）に記載の、１．８　ｋｂの全長デフリンｃＤＮＡを 、デフリン発現ベクターの構築に使用した。デフリンコアタンパク質の発現のた めに、ｃＤＮＡを、セブンをコードする第四コドンＴＣＴを、トレオニンをコー ドするＡＣＴあるいはアラニンをコードするＯＣＴに、２１１発した。これは、 本明細書に参考として援用されている、ＫｕｎｋｅｌのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：４８８　（１９８５）の方法に従った部 位特異変異誘発により、実施した。適切な変異の存在は、ＤＮＡ記列決定により 証明された。

哺乳類発現ベクターｐＳＶ２−デコリンおよびｐＳＶ２−デコリン／ＣＰ−ｔｈ ｒ４ニア　７９　ンハク質は、ｐｓＶ２（７）３．４　ｋｂ＋７）ｌ（ｉｎｄ［ Ｉｌ−Ｂａｍ　）１１７ラグメントに、デフリンｃＤＮＡあるいは変異誘発され たデフリンｃＤＮＡを連結して構築した（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２３　（１９８０）：これは、本明細書に参考とし て援用されている）。

ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４）を 、ｐＳ”／２−デコリンあるイハｐＳＶ２−デ＝Ｉ　ＩＪ　７／ＣＰおよびｐｓ Ｖ２ｄｈｆｒで、リン酸カル７ウム共沈降法により、共トランスフェクトした。

ｐｓＶ２デコリンでトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、受託番号 ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　１０３３２のもとにアメリカンタイプカルチャーコレ クションに寄託されている。トランスフェクトされた細胞を、９％透析ウつ胎児 血清、２　ｍＭグルタミン、１００ユニツト／ｍｌペニンジン、およヒ１００μ ｇ／ｍｌ　ストレフトマインンを補充した、ヌクレオシドを除いたα改変最少必 須培地（α−ＭＥＭ）　（’ＧＩＢＣＯ，Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ）中で培養し た。トランスフェクトされた細胞から生じたコロニーを、クローニング／リンダ −を用いて取り出して増殖し、３５ｓｏ４−４１識培養上清から免疫沈降法によ りデコリン発現について調べた。次に、デコリンの有意な量を発現するコロニー を、メトトレキセー１−　（ＭＴＸ）濃度を０．６４μＭまで段階的に増加して 、遺伝子増幅にかけた（ＫａｕｆＩＩｌａｎおよび５ｈａｒｐ、Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、　１５９＋６０１　（１９８２）；これは、本明細書に参考として 援用されている）。増幅された全細胞系を、限界希釈あるいはＭＴＸ耐性コロニ ー単独選択のいずれかにより、クローニングした。これらの確立された細胞系の 貯蔵培養物を、ＭＸＴ含有培地中に保存した。タンノくり質産生に使用する前に 、貯蔵培養物から細胞を、ＭＴＸを除いた培地に継代培養し、少なくとも１度、 可能性のあるＭＴＸの影響を除くためにこの培地中に通した。

あるいは、コアタンパク質は、本明細書に寥考として援用されている、Ａｄａｍ ｓおよびＲｏｓｅ、　Ｃｅ１ｌ　４１：１００７．（１９８５＞に記載されてい るように、ｃｏｓ−を細胞で発現させた。簡単には、６−ウェルの複数ウェルプ レートに、９．６ｃｍ２の増殖面積あたり３−５ｘ１０５細胞を接種し、付着さ せ、２４時間増殖させた。培養物が５０−７０％集密的になったときに、その培 養物をプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞層を３７℃で、１　ｍＭ 　ＣａＣｌ２および０．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２を補充した、５０　ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ、　＋５０　ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ７，２を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ ＴＢＳ）で簡単に洗浄して、分離を防いだ。ウェルを、閉鎖環状プラスミドＤＮ Ａの２μｇ１および、平均分子量５００．０００のＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓ ｉｇｍａ）　０．５　ｍｇ／ｍｌを含有する上記の溶液１ｍｌとともに、３７℃ で３０分間インキユニートした。対照として、培養物を、いかなるデコリン挿入 フラグメントも含まないｐｓＶ２発現プラスミドでトランスフェクトするか、あ るいは、ＤＮＡなしに模擬トランスフェクトした。

次に、ＤＮＡ／ＴＢＳ／ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を除去して、ＴＢＳでウェ ルをすすいだ後に、培養物を、１０％０％ラン血清および１００μＭクロロキン （Ｓ　ｉｇｍａ）を含有するダルべ・ノコ改変イーグル培地（１ｒｖｉｎｅ　５ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、３７°Ｃで３時間インキュベートした。次に、 細胞層を２回すすいで、クロロキンを含まない上記培地中で、約３６時間培養し た。ＷＩ３８ヒト胎児肺線維芽細胞を、同じ培地中で、規定通りに培養した。

プラスミドＤＮＡでのトランスフェクンヨン後に、ＣＯ５−１培養物を３６−４ ８時間放射標識した。放射標識された全代謝前駆体は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｎｕｃｌｅａｒ　（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手した０使用した同位体は、 ３５Ｓ−硫酸塩（４６０ｍｃｉ／ｍｌ）　、＋４３，４．５−３Ｈ（Ｎ）］−０ イシン（１４０Ｃｉ／ｍｌ）　、およびＬ−［”　Ｃ（Ｕ）］−アミ／酸混合物 （製造番号４４５Ｅ）であった。培養物を、１０％透析ウシつ児血清、２　ｍＭ グルタミンおよび１　ｍＭ　ピルビン酸を補充し、２００μＣｉ／ｍｌ　３５Ｓ −硫酸塩または３Ｈ−ロインン、もしくは１０　μＣ４／ｍｌ　”Ｃ−アミノ酸 混合物を含有する、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯＬａｂｓ）中で、２ ４時間４ｊＡ識した。培地を集めて、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェニル メチルスルホニルフルオライド、０．０４　ｍｇ／ｍｌアプロチニンおよび１μ ｇ／ｍｌペプスタチンを補充してプロテアーゼ活性を阻害し、２．０００　ｘ　 Ｇで２０分間遠心分離して細胞片を除き、−２０°Ｃで保存した。細胞抽出物は 、細胞層をＴＢＳですすぎ、次に、ゴム付きポリスマンでかきとって、ｌｌｌ１ ｌ／ウェルの水冷細胞溶解緩衝液中に入れた。細胞溶解緩衝液の組成：０．０５ ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　０．５　Ｍ　ＮａＣ１Ｏ，１％ＢＳＡ、　１％ＮＰ−４ ０ＳＯ，５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，１％ＳＤＳ、　ｐＨ８，３゜細 胞抽出物を、１３．０００　ｘ　Ｇ、　４＠Ｃ１こて、１５時間遠心分離して清 澄化した。

ウサギ抗血清は、ヒトデフリンコアタンノくり質の成熟型の最初の１５残基（Ａ ｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｔ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖ ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ）に基づく合成ペプチドに対し て調製した。合成ペプチドおよびそれに対する抗血清は、他１こも記載されてい る（ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　１９８６前出）。簡単には、 ペプチドは、製造業者により教示された薬品を用いることにより、固相ペプチド 合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、 　ＣＡ）を用いて合成した。ペプチドは、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオネート（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）を使用し、製造業者の指示通りに、キー ホールリンペ・Ｉトヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　１ｉｅｐｅｔ　ｈｅｍｏｃ ｙａｎｉｎ）に結合させた。得られた結合体を、フロイント完全アジ二バントに 乳化し、ウサギに注射した。さらに、１．２および３ケ月後に、フロイント不完 全アジニ／ｓｊント中の接合体を注射した。各注射での投与量は、０．６ｍｇペ プチドに相当した。第３回および４回の注射の１０日後に、血液を採取した。抗 血清をグルタルアルデヒド架橋結合ペプチドに対して試験し、当該分野で公知の ように、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ。

Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０：４１９−４３９　（１９８０））　、免 疫沈降および免疫プロッティング法、および、蛍光抗体法での細胞染色により、 デコソンを単離した。

免疫沈降法は、２０μｌの抗血清を、調整培地ある０は２つのウェルから集めた 細胞抽出物に加え、４°Ｃで一晩混合して、実施した。免疫複合体は、２０μｌ のバンク化プロティンＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いて、４°Ｃにて２時間 のインキュベーションにより単離した。ビーズを、３回チューブを交換して細胞 溶解緩衝液で洗浄し、２回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄して、その後、１０駕メ ルカプトエタノール１含有の電気泳動試料緩衝液中で煮沸した。免疫沈降された タンパク質を、当該分野では公知のように、７．５−２０％グラジェントゲルあ るいは７．５％非グラジェントゲルでの５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。増感 スクリーンを取り付けたＥｎｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｎｕｃｌｅａｒ）を使用して、フルオログラフィーを実施した。典型的な露光時 間は、−７０℃での７−１０日であった。オートラジオグラフは、ＬＫＢ　Ｕｌ ｔｒｏｓｃａｎ　ＸＬ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｌａ５ｅｒ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔ ｅｒにより走査させ、プロテオグリカンのバンドの相対強度および移動度を比較 した。

デコリンーｐｓＶ２構築物でトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞からの細胞 抽出物および培養培地、および、３ＳＳ−硫酸塩で代謝標識された細胞抽出物お よび培養培地の、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、模擬トランスフェクト細胞には存 在しない硫酸化バンドを現した。デフリンコアタンパク質由来の合成ペプチドに 対して誘起された抗血清による免疫沈降は、新たなバンドがデフリンであること を示した。

通常はグリコサミノグリカンで置換されるセリン残基（セリン−４）がトレオニ ン残基で置換されるように変異された構築物の発現は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで、野 生型構築物により得られた、プロテオグリカンレベルの約１０％のみを示した。

残りの免疫反応物質は、遊離コアタンパク質の位置に移動した。

同様の様式で発現および分析されたアラニン変異ｃＤＮＡＩｉ物は、コアタンパ ク質のみを与え、デフリンのプロテオグリカン形態は与えなかった。図１は、ト ランスフェクトＣＯＳ細胞中で発現されたデフリン（レーン１）、および、ソノ トレオニン−４（レーン３）およびアラニン−４（レーア２）変３１７タンパク 質を示す。３５ＳＯ４−標識（Ａ）培養上清および３Ｈ−ロインン標識（Ｂ）培 養上清を、ヒトデフリンのＮｌ２−末端に対して調製されたウサギ抗ペプチド抗 血清で免疫沈降させた。

培養培地からの、デフリンおよびデコリンコアタンパク旦且Ｘ 上記および本明細書に参考として援用されている、ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＲ ｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　３６：２４４−２４６　（１９８８）に記 載されているように、ｐＳＶ２−デフリンベクターでトランスフェクトされ、増 幅された細胞を、９％透析ウつ胎児血清、２ＩＩＩＭグルタミン、１００ユニツ ト／ｉｔペニンジンおよび１００μｇ／＋　１ストレプトマイシンを補充した、 ヌクレオシドを除いたα−ＭＥＭを入れた、８個の培養フラスコ（１７５ｃｍ２ ）中で、９０％集密に増殖させた。

９０χ集密で、培養培地を、０．０５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ）１７．４）中の０ ゜２５　Ｍ　ＮａＣ１で平衡化したＤＥＡＥセファ０−スＦａｓｔ　Ｆｌｏｗカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）に通した、６％透析ウつ胎児血清を補充した、ヌ クレオシドを含まないα−ＭＥＭを、フラスコあたり２５ｍ１に入れ替えた。細 胞を３日間培養し、廃培地を集め、直ちに、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニ ルフルオライド、１Ｈｇ／ｍ　Ｉペプスタチン、０．０４　ｍｇ／ｍｌアプロチ ニンおよび５　ｍＭ　ＥＤＴＡとした。

４００　ｍｌの廃培地を、最初ゼラチンセファロースに通してフィブロネクチン およびセファロースに結合される物質を除去した。次に、流出画分を、５０　ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐｉ（７，４に０．２ＭＮａＣｌを加えたもので予め平 衡化したＤＥＡＥ−セファロースと混合し、おだやかに攪拌しなから、４℃にて 一晩バッチ式で吸着させた。スラリーを１．６　ｘ　２Ａ　ｃｍカラムに注ぎ、 ０．２　ＭＮａＣｌを含む５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７，４）で十分 に洗浄し、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ７，４）中、０．２　Ｍ−０， ８Ｍ　ＮａＣ１の直線的４度グラジェントで溶出した。デフリン濃度は、前出の Ｙａｍａｇｕｃｈ　ｉおよびＲｕｏｓ　１ａｈ１＋に記載のように、競合ＥＬＩ ＳＡにより定量した。デフリンを含有する画分を集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液 中の８Ｍ尿素で平衡化したセファデックスゲル濾過カラムで、さらに分画した。

デフリンを含有する画分を集めた。

コアタンパク質は、上記のように、ｐＳＶ２−デコゾン／ＣＰベクターあるいは アラニン変異されたｃＤＮＡを有するベクターでトランスフェクトされ、増幅さ れた、クローン化された細胞系から精製する。これらの細胞は、上記のように集 密に増殖させる。集密になったときに、細胞の単層を、血清を含まない培地で４ 回洗浄し、２　ｍＭグルタミンを補充したα−ＭＥＭ中で、２時間インキュベー トする。この廃培地を捨てる。次いで、細胞を２　ｍＭグルタミンを補充したａ ＭＥＭ中で２４時間インキュベートする。この廃培地を集めて、血清を含まない 廃培地として、直ちに、０．５　ｍＭフェニルメチルスルボニルフルオライド、 １Ｈｇ／ｍｌペプスクチン、０．０４　ｍｇ／＋ｏｌアプロチニンおよび５ＩＩ ＩＭＥＤＴＡとした。廃培地はまず、ゼラチン−セファロースに通して、次に、 流出画分を、０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐ ｉ（７，４で予め平衡化したＣＭ−セファＣ＋−スＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　 ＮＪ）にバッチ式に吸着させた。４°Ｃでの一晩のインキユベーンコン後に、ス ラリーをカラムに注ぎ、予め平衡化したときの緩衝液で十分に洗浄し、５゜ｍＭ 　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１，ｐＨ７，４中、０．１　Ｍ−Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１の直線的濃 度グラジェントで溶出した。デフリンを含有する画分を集め、５０ｍＭ　ＮＨ４ ＨＣＯ３に透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥された物質を、８Ｍ尿素を含む５０ 　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４に溶解し、セファクリルＳ−２００カラム（１ ，５ｘ　１１０　ｃｍ）にかける。５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で示さ れるような、デフリンコアタンパク質を含む画分を集めて、精製デフリンコアタ ンパク質とする。

実施例Ｉ＋ ＴＧＦ　のデフリンへの結合 デフリンおよびゼラチンを、製造業者の指示に従って、セファロースマトリノク ス１　ｍｌあたり１ｒＡｇのタンパク質を使用して、臭化シアン活性化セファロ ース（Ｓｉｇｍａ）に結合した。

市販品から得たＴＧＦβ−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　 ＣＡ）を、本明細書に参考として援用されている、クロラミンＴ法（Ｆｒｏｌｉ ｋら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：１０９９５−１１０００　（１９Ｂ４ ））　により、１２５１−標識し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含 有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したセファデックスＧ−２５で のゲル濾過により、未反応のヨウ素から分離した（図２）。［１２５１］−ＴＧ Ｆβ１　（５ｘ　１０１０５ｃｐを、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１および０．０５％Ｔｖｅ ｅｎ　２０を含有するＰＢＳ　ｐＨ７，４の２ｍｌ中の、０．２　ａｌｌｌｌバ ックコリンセファロース（・）、あるいは、ゼラチン−セファロース（○）と、 ＢＳＡ被覆されたポリエチレンチューブ中でインキュベートした。−晩インキュ ベートした後に、アフィニティーマトリックスを、ＢＳＡ被覆使い捨てカラム（ Ｂｉｏ　Ｒａｄ）に移し、結合緩衝液で洗浄した。溶出を、まず、結合緩衝液中 の３ＭＮａＣ１で行い、次いで同緩衝液中の８Ｍ尿素で行った。画分を集めて、 ガンマ−カウンターで放射活性を測定し、１２％ゲルを用いて、非還元条件下で の５ＤＳ−ＰＡＧにより分析した。

図２Ａは、２つのカラムからの放射活性プロフィールを示し、画分の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析は図２Ｂに示す。ＴＧＦβ−１開始物質は、２５ｋｄに主要バンドを 有する。このバンドは天然のＴＧＦβ−１ダイマーを示す。さらに、調製物中に は、多くの主要でないノくンドが存在する。約２０−３０％の放射活性がデフリ ンカラムに結合し、８Ｍ尿素で溶出したが、ゼラチン−セファロースで実施した 対照分画での、尿素溶出画分には、約２％放射活性のみしか存在しない（図２Ａ ）。デフリン−セファロース非結合分画は、主要でないすべての成分および特定 の２５　ｋｄ　ＴＧＦβ−１を含有するが、結合された、尿素溶出画分は、ＴＧ Ｆβ−１のみを含有する（図２Ｂ）。もとのＴＧＦβ−１ｗＡ製物には種々の成 分が存在し、ＴＧＦβ−１のみがデフリン−セファロースアフィニティーマトリ ックスに結合し、対照ゼラチン−セファロースアフィニティーマトリ７クスには ほとんど結合するものがないので、これらの結果は、ＴＧＦβ−１が、特異的に デフリンに結合することを示す。デコリンーセファロース力ラムに結合しなかっ たＴＧＰβ−１は、ヨウ素化で変性されている可能性がある。この可能性の証拠 は、以下に記載されているように、非標識ＴＧＦβ−１のアフィニティークロマ トグラフィーにより与えられた。

第二の実験では、上記の１２５１−ＴＧＦβについて記載のように、非標識ＴＧ Ｆβ−１の１８０　ｎｇをデフリン−セファロースで分画した。

ＴＧＦβ−１（１８０ｎｇ）を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，４） 中で、デフリン−セファロースあるいはＢＳＡ−アガロース（０，２ｍ１　バッ ク容量）とインキュベートした。４℃で一晩インキユベートした後に、樹脂を１ ５ｍ１の緩衝液で洗浄し、最初に、ＰＢＳ中の３　Ｍ　ＮａＣ１５ｍｌで溶出し 、次に、　８Ｍ尿素を含有するＰＢＳ　５　ｍｌで溶出した。各貯蔵物の一部（ ａｌｉｑｕｏｔ）を、血清を含まない培養培地に透析し、ｖｖｌＬｕｌｌｌ（胞 での［３１１’ｌチミジン取り込みの阻害についてアッセイした〈実施例ＩＩ＋ ）。各貯蔵物中のＴＧＦβ−１の量を、既知濃度のＴＧＦβ−１を用いた平行実 験から得た［３旧チミジノ取り込みの検量線から算出した。その結果は、ＴＧＦ β−１は本質的にデフリンカラムに定量的に結合したが、対照カラムに結合する ものはほとんどなかったことを示す（表１）。ＴＧＦβ−１活性の部分的な回収 は、透析でのＴＧＦβ−１の喪失に起因し得る。

表−ユ ＭｖｌＬｕ細胞における成長阻害でモニターされた非ｎ識ＴＧＦβ−１のデコリ ンーセファロースニ　トイ　ＮａＣ１２，２（１，８％ｌ　１．３　（１，５Ｊ ８Ｈ４，も　１１６．０　（９５，八）　４．０　（４・６％）Ｂ、マクロタイ ターアッセイにおけるＴＧＦ−１のデフリンへの結合：ファタンパク質およびビ グリカンによる阻ＴＧＦβ−１のデフリンへの結合もまた、マイクロタイター結 合アッセイで調へた。アッセイを実施するために、９６ウエルマイクロタイター プレートのウェルを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨｑ、ｓ中の、Ｚμｇ ／ｍｌの組換えデフリンで一晩被覆した。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　（ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を含有するＰＢＳで洗浄し、５　ｘ　１０’　ｃｐｍの［ １２５１］−ＴＧＦβ−１を含む試料およびＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中の種々の濃度 の競合物を、各ウェルに加えた。次に、プレートを３７℃にて４時間インキュベ ートしく実験では、４℃で一晩、コンドロイチナーゼＡＢＣ消化プロテオグリカ ンを用いて）　、ＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎで洗浄して、結合放射活性を、０．２　Ｍ 　ＮａＯＨ中の１％ＳＤＳで可溶化した。競合物を含まない全結合は、使用条件 下では約４％であった。インキニベー７ジン混合物に、標識ＴＧＦβ−１に対し て１００倍モル過剰の非標識ＴＧＦβ−１を加えて測定した、非特異結合は、全 結合の約１３％であった。このアッセイはまた、その他のデフリン調製物および 関連タンパク質の、十目互作用により競合する能力を研究するために、使用され 得る。

デフリン結合の完了は、以下のタンパク質で試験したく図３；符号は、図面の簡 単な説明の章に示した）。

デフリンはランの皮膚から単離され、そして、ビグリカンは、ランの関節軟骨（ ＰＣＩおよびＰＧＩ　Ｉ、Ｄｒ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、 Ｍｏｎｔｅｆｌｏｒｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎ、Ｙ、から得；本 明細書に参考として援用されている、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ。

２５０：６３０４−６３１３．　（１９８５）に記載されている）、ニワトリ軟 骨プロテオグワカン（Ｄｒ、　Ｐａｕｌ　Ｇｏｅｔｉｎｃｋ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌ ａ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｄａｔｉｏｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌ ａ、　ＣＡ、およびＧｏｅｔｉｎｃｋ、　Ｐ、Ｆ、のＴＨＥ　ＧＬＹＣＯＣＯＮ ＪＵＧＡＴＥＳ、Ｖｏｌ、ＩＩＩ、Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｍ、１．、Ｅｄｉｔｏｒ。

ｐｐ、１９７−２１７．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、罫に記載されている ）から単離した。コアタンパク質の調製には、５００μｇのプロテオグリカンを 、０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ／ｌｌＣｌ、　ｐ）Ｉ　８．０．３０　ｍＭ酢酸ナトリ ウム、２　ｍＭ　ＰＭＳＦ、　１０　ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈ ｙｌｍａｌｅｌｎｉｄｅ）、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．３６ｍＭペプス タチンの２５０μｌ中で、３７℃にて１時間、０８ユニツトのコンドロイチナー ゼＡＢＣとインキュベートすることにより、フンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉ ｋａｇａｋｕ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｊａｐａｎ）で消化した。組換えデフリンおよ びウシの皮膚から単離したデフリン（ＰＧＩ１）は、予想通りに、［１２５１］ −ＴＧＦβ−１の結合を阻害した（図３Ａ）。ラン関節軟骨から単離したビグリ カンは、デフリンと同様に有効なインヒビターであった。多くのコンドロイチン 硫酸鎖を有するニワトリ軟骨プロテオグリカンは、いかなる阻害も示さなかった ので、デフリンおよびビグリカンの効果は、グリコサミノグリカンに起因するの ではないようである。ウシ血清アルブミンは、いかなる阻害も示さなかった。こ のことは、さらに、変異デフリンコアタンパク質（示していない）およびコンド ロイチナーゼＡ　Ｂ　Ｃ？１Ｍ化デコリン、およびビグリカンでの競合実験で支 持されたく図３Ｂ）。これらの各タン、ｆり質は阻害性であったが、軟骨プロテ オグリカンコアタンパク質は阻害性ではなかった。デフリンおよびビグリカンコ アタン、ｆり質は、未変性（ｉｎｔａｃｔ）のプロテオグリカッより幾分より活 性であった。コンドロイチナーゼＡＢＣで処理されたウシ血清アルブミンは、し ＼がなる阻害も示さなかった。さらなる結合実験は、［１２５１］−ＴＧＦβ− １が、ビグリカンあるいはそのコンドロイチナーゼ処理されたコアタンパク質で 被覆されたマイクロタイターウェルに結合することを示した。これらの結果は、 ＴＧＦβ−１が、デフリンおよびビグリカンのコアタンパク質に結合し、ロイシ ンに富む繰返しがこれらのタンパク質の潜在的な結合部位として関与することを 示す。

実施例ＩＩ＋ デフリンかＴＧＦ−１により刺激または阻害されるに　ぼ　づ　の ＴＧＦβ−１の活性を調節するデフリンの能力を、［３Ｈ］チミジンの取り込み アッセイにおいて試験した。一つのアッセイでは、ｐｓｖ２ｄｈｆｒでトランス フェクトしただけの未増幅ＣＨＯ細胞系（参考文献１の対照細胞系Ａで、ここで はＣＨＯ細胞と呼ぶ）を用いた。細胞を、９％の透析したラン胎児血清（ｄＦＣ Ｓ）を補ったヌクレオシド非含有α改変最小要求性培地（α−ＭＥＭ、　ＧＩＢ ＣＯ。

Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中に維持し、そして［３Ｈ］チミジンの取り 込みを、記載のようにアッセイした（Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｃｅ１ｌ　４８：４ ０９−４１５　（１９８７））。ＴＧＦβ−１をＣ）ＩＱ細胞培養物に５　ｎｇ ／ｍｌで添加した。

この濃度でＴＧＦβ−１は、［３Ｈ］チミジンがこれらの細胞中へ５０％増加し て取り込まれるように誘導した。デフリンまたはＢＳＡを、異なる濃度で培地に 添加した。結果を図４Ａに示す。データは、ＴＧＦβ−１が誘導した成長刺激を 中和するパーセントを表す。すなわち、ＴＧＦβ−１またはデフリンのどちらか が存在しない場合の［３Ｈ］チミジンの取り込み＝０％、ＴＧＦβ−１は存在す るがデフリンは存在しない場合の取り込み＝１００％である。

それぞれの点は、３つの試料の平均上標準偏差を表す。デフリンは（・）、ＢＳ Ａは（○）である。

デフリンは、約５μｇ／ｍ　ｌで最大活性の半分のＴＧＦβ−１の成長刺激活性 を中和した。さらに、デフリンを添加すると［３Ｈ］チミジンの取り込みが、Ｔ ＧＦβ−１を全く添加せずに観測されるレベルより低く抑制される。これは、デ フリンもまた、ＣＩＯ細胞自体により生成されるＴＧＦβを阻害したことを示し た。デフリン発現体および対照ＣＩ（０細胞はどちらも明らかに、ミンクの肺上 皮細胞の成長を阻害することにより決定されるように、調整培地中で約０．２５ ｎｇ／ｍｌ１度の活性ＴＧＦβ濃度を生成したくアッセイを培養培地中のデフリ ンからの妨害を受けずに行い得た。

それは、以下に示したように、ＴＧＦβがミンク細胞に及ぼす影響は、デフリン 生産培地に存在するデフリン濃度では実質的に阻害を受けなかったからである。

）。

ＭｖＬｕミックの肺上皮細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ＣＣＬ６４）で行った実験もまた、デフリンがＴＧＦβ −１の活性に影響を及ぼすことを明らかにした。図４Ｂは、これらの細胞におい て、チミジンの取り込みによって測定される成長が、ＴＧＦβ−１により抑制さ れたことを示す。アッセイを、ＴＧＦβ−１を０．５ｎｇ／ｍｌで添加したこと 以外は、図４Ａの通りに行った。

少して取り込まれるように誘導した。データは、ＴＧＦβが誘導した成長阻害を 中和するパーセントを表す；すなわち、ＴＧＦβまたはデフリンの両者が存在し ない場合の［３Ｈ］チミジンの取り込み＝１００％；　ＴＧＦβは存在するがデ フリンは存在しない場合の取り込み＝０％である。

実施例１ｖ の広が　および　０富　を　′　る 新　なデフリン結合因子 過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）培養培地に含有されるデフリンの分析 は、上記のデフリン活性を明らかにしただけではなく、他のデフリン関連成長調 節活性の存在をも明らかにした。過発現培地には、ＴＧＦβ様成長調節活性が含 まれることが判明した。このことは、解離条件下でのＤＥＡ　Ｅで単離したデフ リンのゲル濾過により示された。デフリンのｃＤＮＡでトランスフェクトしたデ コリン過剰発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の無血清調整培地を、中性トリス−ＨＣ１ 緩衝液中でＤＥＡＥ−セファロースにより分画し、そして成長阻害活性を含む画 分を、５０ｍＭ　ＮＨ４１（Ｃｅ３で透析し、凍結乾燥し、酢酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ５，９＞中の４Ｍグアジニンー１（Ｃ１に溶解した。溶解した物質を、 同じグアジニン−１（ＣＩ溶液で平衡化したＬ　５Ｘ　７０ｃｍのセファロース ＣＬ−６Ｂカラムで分画した。画分を全て上述した５ＤＳ−ＰＡＧＥ、デフリン ＥＬＩＳＡ、および細胞成長アッセイにより分析した。３つのタンノ４り質ピー クを得た。１つのピークは、フィブロネクチン（ｍ、　ｗ、　５００゜０００） のような高分子量タンパク質を含んでいたが、成長調節活性は検出されなかった 。２番目のピークは、実施例ＩＩ＋に記載の活性を有するデコリンであり、３番 目のピークは、ミンク細胞アッセイにおいて成長阻害細胞活性を有した低分子量 （１０，０００−３０，０００ダルトン）画分であり、Ｃｌｌ０細胞の成長を刺 激した。

図５にこれらの結果をまとめる。ここには、ＣＨＯ細胞による［３Ｈ］チミジン の取り込みに作用するゲル濾過画分の能力、および酵素免疫アッセイにより測定 したテコ９フ１度が示されている。分子サイズマーカーの溶出位置（矢印）も示 されている：　ＢＳＡ、ウシ血を青アルブミン（Ｍｒ＝　６６、０００）　；　 ＣＡ、カルボニックアンヒドラーゼ（Ｍｒ−２９，０００）　；　Ｃｙ、チトク ロームｃ（Ｍｒ＝１２、４００）　；　ＡＰ、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉ ｎ＞　（Ｍｒ＝　６．５００）　；　ＴＧＦ。

［”　２５Ｉ　］ＴＧＦβ−１（Ｍｒ＝　２５，０００）。

低分子量画分中に検出された成長調節活性の性質を、抗ＴＧＦβ−１抗血清で試 験した。抗血清を、ヒト成熟ＴＧＦβ−１の７８−１０９残基から合成したペプ チドに対して調製した。同じペプチドの環形に対する他のものにより生じた抗血 清（末端の７ステイン残基がジスルフィド結合した）が、ＴＧＦβ−１がそのレ セプターに結合するのを阻害することは以前に示されている（Ｆｌａｎｄｅｒｓ ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７３９−７４６　（１９８８）が本明細 書中に参考として援用されている）。ペプチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ固相ペプチドンンセサイザーにおいて合成し、そして）ＩＰＬＣにより 精製した。ペプチドを、０．５ａ＋ｇのメチル化したＢＳＡ（Ｓｉｇ＊ａ。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）と混合し、そしてフロイント完全アジュバントに 乳化し、これを１回の注入当たりペプチド２ｍｇの皮下注射を行ってウサギを免 疫化した。注射は一般的に４週間あけて行い、そしてウサギを２回目の注射およ びそれぞれその後行った注射の約１週間後に、ウサギから採血した。この研究に おいて用いた抗血清は、放射性免疫アッセイにおいて１：６゜０００の力価（５ ０％結合）を有し、免疫プロ、）においてＴＧＦβ−１と結合した。

この抗血清は、ＣＨＯ細胞上の精製ＴＧＦβ−１の活性を阻害する能力を有する 。さらに、図５に示したように、抗血清もまた、ＣＨＯ細胞における［３Ｈ］チ ミジン取り込みアツセイにより測定されるように、低分子量画分の成長刺激活性 を阻害した。抗ＴＧＦβ−１抗血清から調製したＩｇＧ画分の濃度が高くなるに つれて、濃度に依存して低分子量画分の刺激効果を抑制する（・）。

正常なウサギ血清由来のＩｇＧは、このアッセイにおいて全く影響しなかった（ ○）。

上記の結果により、ＴＧＦβ−１のような低分子量画分の刺激因子が同定された 。しかし、ＴＧＦβ−１はこの画分中での唯一の活性化合物ではない。図５に示 した抗ＴＧＦβ−１抗体により、チミジンの取り込みが元に戻るにもかかわらず 、低分子量画分で処理した細胞は、対照１ｇＧで処理した細胞または抗体のみで 処理した細胞とは形態学的に異なる。この影響は、抗体処理した低分子量画分を Ｈ−ｒａｓ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養物に添加した時に、特に明確であっ た（Ｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９ ：３６３７−３６４０　（１９８２＞）。低分子量画分および抗体で処理した細 胞は、対照細胞よりもさらに広がり、そして接触阻害されたようであった。この 結果は、ＣＨＯ細胞由来組み換えデコリンが、十分特徴付けされたＴＧＦβとは 区別される細胞調節因子のＭＲＦと関連していることを示す。

新規の因子がＴＧＦβ−１とは異なるというもう一つの証拠を、ＨＰＬＣ実Ｍか ら得た。セファロースＣＬ−６Ｂカラムから低分子量体をＶｙｄａｃ　Ｃ４逆相 カラム（ｌ　Ｘ２５ｃｍ、　５　μｍ粒子サイズ、ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏ ｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐｅｒｉａＳＣＡ）上で、０．１％のトリフルオロ 酢酸でさらに分離した。結合タンパク質をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉ　ｔ ｒｉｔｅ）のグラジェント（２２−４０％）で溶出し、そして画分をミンクの脚 上皮細胞中の成長阻害活性、およびＨ−ｒａｓ　３Ｔ３細胞中のＭＲＦ活性に対 してアッセイした。結果は、ＴＧＦβ−１活性はグランエンドの最初に溶出する が、ＭＲＦ活性はグラジェントの終わりのほうで溶出することを示した。

実施例Ｖ ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タン、＜り質の構築および発現 を調製し、図６に示したように、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を、成熟 デコリンをコードする遺伝子のアミン末端に結合させた。このような構築に取り 入れられた技術は、Ｆ、Ｍ。

Ａｕ５ｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｊ。

ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　（１９８７）、およびＭａｎｉａｔｉｓ ら、ＭＯ１６ｃｕ　ｊａｒＣｌｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　（１９ｇ２）に記載され、これらは本明細書に参照により援用さ れている。

デコリンをコードするＤＮＡフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ＞ 、　５ｃｈａｒｆら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１０７６−１０７８（１９８６ ）により生成し、この文献は本明細書に参照によって援用されている。プライマ ー、Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、　Ｔｅｘａｓ）から得た合成オリは、プ ライマーはまた、１個の塩基変化を含み、異なるアミノ酸をコードした。特定の 挿入物を生成するのに使用したプライマーを表２に示し、プライマー配列を表３ に示す。鋳型ＤＮＡは、ＫｒｕｓｉｕｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８３ニア６１１３−７６９７　（１９８６）ニ記載されたｐＰＧ−４０ の大スケールＣｓｃｕｍ製物である。この文献は本明細書に参照によって援用さ れている。ＤＮＡ増幅反応は、製造者の推奨に従い（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ＠ｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ；　Ｎｏｒｗａｌｋ、　Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ）、Ｖｅｎｔ”　Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ；　Ｂｅｖｅｒｌ ｙ、１Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ）を用いて、熱サイクラ−（ｔｈｅｒｍａｌ 　ｃｙｃｌｅｒ）中で行った。デコリンをコードするＤＮＡフラグメントを９４ ℃、４０℃、および７２℃で３５−４０回サイクルした。

ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析しくＡｕ５ｕｂｅｌら、上 述）、およびＭａｎｉａｔｉｓら、上述、デコリンをコードするＤＮＡフラグメ ントを同定し、そして決定したく表２「挿入サイズ」の下参照）。２００塩基対 （ｂｐ）以下のサイズのＰＣＲ生成物をＤＥＡＥセルロースペーパーへの電気泳 動により精製しくＡｕ５ｕｂｅｌ、上述）　；　２００ｂｐ以上のＰＣＲ生成物 を、製造者の指示に従い、Ｐｒｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅＴ′ＤＮＡ生成キット（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ；　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆ。

ｒｎ　ｉａ）を用いて精製した。

デコリンをコードするＤＮＡフラグメント（挿入物）をベクターｐＭＡＬ−ｐ中 のポリリンカーのＥｃｏＲＩおよび珈１制限酵素部位間に連結した（Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ；　Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　ｏ連結反応は、全体で５００ｎＨの ＤＮＡを含み、挿入物ベクターのモル比は３１であった。この連結物を、次いで 、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＨ５ａ細胞（Ｇｉｂ ｃ。

ＢＲＬ：ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｌＭａｒｙｌａｎｄ）、遺伝子型：Ｆ″　φ ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５、△（ｌａｃＺＹＡ−」Ｆ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ，ｒｅ ｃＡｌ、ｅｎｄＡｌ、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−１ｍｋ勺、５ｇ４Ｅ　４４　λ−１ ｔｈｉ−１、■泌９６、ｒｅｌＡｌ、または、Ｌ伝子型：　Ｃ１４−（ｍｃｒＡ ）、△（ｍｃｒｃＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）　１７１．５ｂｃｃ、より、　ｒ ｅｃＪ、　ｕｍｕＣ：：ｒｎ５（ｋａｎ’）、ｕｖｒＣ，瓜Ｅ４４、ｌａｃ、■ 工Ａ　９６、ＬｅｌＡｌ、川−１、ｅｎｄＡＩ［Ｆ’臣ＡＢ、　１ａｃｌ”２６ Ｍ１５、ＴｎｌＯ１Ｑｅｔ’）］中に形質転換させた。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ）１ ５ａ株のφ８０ｄｌａｃＺ△Ｍ１５マーカーは、ｐＭＡＬ−ｐからのβ−ガラク トシダーゼ遺伝子のα相補性を提供する。デコリンをコードするＤＮＡフラグメ ントを有するｐＭＡＬ−ｐを含むコロニーは、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む平板上で、β−ガラクト シダーゼ遺伝子の遮断により着色しない。ｐＭＡＬ−ｐのみを含む宿主細胞が膏 色コロニーを生成する。

着色していないコロニーの小調製物（Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）を、次いで、Ａｕ５ ｕｂｅｌら、上述、および、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上述、に記載のように作製し た。次いで、ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンノくり質ＰＴ−７３、−７ ４、−７５、−７７、および−７８を制限エンド′ヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１お よびＸｂａｌ（両者ともＰｒｏｍｅｇａ；　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓ ｉｎから得た）を用いて切断し、そして特定の挿入物の存在をアガロースゲル電 気泳動により確認した。ＰＴ−７２、−７６、−８４、−８５、−８６、および −８７をコードする他のプラスミドは、製造者の指示に従（ゝ、　５ｅｑｕｅｎ ａｓρＶｅｒｓｉｏｎ　２．０　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｗｉｔ　（Ｕ 、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ：　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）を用 ｌＩＸる配列決定により確認された挿入物を有していた。

ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンノくり質の試験発現を、宿主細菌株で実 施した（表２参照）。ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンパク質プラスミド を含む、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞またはＥ、　ｃｏｌｉ　５ｕｒｅＴｌ′ 細胞の１晩培養を、凍結保存物を１００．ｃｚｇ／ｍｌのアンビンリンを含むし 一培地（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ）　（Ａｕｓｕｂｅｌら、上述）に穿刺（ｓｔａｂ）接 種し、３７°Ｃで急速振盪することにより作製した。翌朝、その１ｍｌを、１０ ｍ１の予熱した培地（アンビンワンを含むし一培地）に接種するのに用いた。３ ７℃で１時間後、培養につき１００μｌの０．１Ｖ　ＩＰＴＧを添加し、そして 誘導された培養を、さらに２−３時間インキュベートさせた。０８％β−メルカ プトエタノールを含むＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；　Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ ａ）に再懸濁し、ｉｃｅの′ンベルクリンンリンジを用いて１０回剪断すること により、細胞を溶解した。試料を、８−１６％グラジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ ル（ＮｏｖｅＸ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で電気 泳動し、そしてウェスタンプロット（Ｎｏｖｅｘ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造者の推奨に従って実施した。プロットを、ＰＴ− ６５、−７３、−７４、−７５、−７６、−７７、および−７８に対しては、ウ サギ抗−ＰＧ４０血清（Ｔｅｌｉ。

ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、　：　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ ａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用Ｉ１１て、そしてＰＴ−７２、−８４、−８５、−８ ６、および−８７に対して（ま、ウサギ抗−ＭＢＰ血清（自家製）で展開した（ Ａｕｓｕｂｅｌら、上述）。結果を、表２のｒＭｗｇの下に示す。

ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンノぐり１ＰＴ−［１４、−８５、−８６ 、および−８７をコードするプラスミドの大スケールＣｓＣ１Ｅ製物を作製しく Ａｕ５ｕｂｅｌら、上述）、および、Ｍａｎ　１ａｔｕｓら、上述、そして、Ｅ 、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換するのに用いた。融合タンパク質の発現は、 上記のように検定発現を行うことにより確認した。

融合タンパク質の生産バッチを以下のように調製した。ＭＢＰ−デフリンフラグ メント融合タンパク質プラスミドを含む、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞の１晩 培養を、凍結保存物を１００μｇ／＋１のアンビンリンを含むし一培地に穿刺接 種し、３７°Ｃで急速振盪することにより作製した。この培養から、５ｍｌを、 より大きい５０ｍ１の１晩培養を接種するのに用いた。翌朝、この５０ｍ１の大 きな培養を予熱した５００ｍ１の培地に添加した。代表的には、１−４’Ｊノト ルの培養を各バッチに対して調製した。３７℃で１時間後、フラスコあたり５ｍ ｌの０．１Ｖ　ＩＰＴＧを添加し、そして誘導された培養を、さらに２−３時間 インキュベートさせた。細胞を、５、　ＯＯＯｒｐｍで１０分間１０°Ｃで、Ｒ Ｃ５Ｂ遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ　ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；　Ｗｉｌｍｉｎｇ ｔｏｎ、　Ｄｅｌａｗａｒｅ）中でＧＳＡまたはＧ５−３０−ターの０ずれかを 用いて、遠心分離することにより回収した。ペレットを０１容量（ｖｏｌｕｍｅ ンの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７゜４、　１５０　ｍＭ　Ｎ ａＣ１，０，１Ｍ　ＰＭＳＦ、および０．２５　ｍｇ／ｌｌ１ｌリゾチーム）に 再懸濁し、そして水浴上で１０−１５分間インキュベートした。

この懸濁液を、ドライアイス／エタノール浴および室温振盪水浴間の繰り返しサ イクルにより、３回凍結／融解した。この懸濁液を、ドウンス（ｄｏｕｎｃｅ） ホモジナイザーを用いるホモジナィゼーションにより剪断した。溶解液を、５Ａ −６００ローター（ＤｕＰｏｎｔ）中で３０分間１２．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分 離することにより、予備清澄化した。清澄化した上澄液を取り出し保存した。最 終の清澄化工程を、ＡＨ−６２９ｏ−夕−（ＤｕＰｏｎｔ＞を用いるＲＣ−８０ 超遠心分離機中４°Ｃで３０分間遠心分離することにより行った。最終の清澄化 溶解液（ｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ）を、精製の準備が整うまで４℃または 一２０°Ｃのいずれかで貯蔵した。

ＭＢＰ−デコリン融合タンパク質のアフィニティー精製を、アミロース樹脂（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。要約すれば、６〜 ７ｍｌの樹脂を、ＭＢＰカラム緩衝液（１０ｎＭトソスーＨＣ１、ｐＨ８，４， １ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５　Ｍ　ＮａＣ１）中の２．５　ｘ　１０　ａｍガラ スカラム中に詰めた。この樹脂を０．２５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＭＢＰカ ラム緩衝液の少なくとも３カラム容量を用いて予備平衡化した。上記のように調 製した清澄化溶解液の１部を、０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＺＸ　ＭＢＰカ ラム緩衝液１部に対して希釈し、そして５０−１００　ｍｌ／時の流速でカラム に添加した。代表的には、１０１００−ｌ５０の希釈溶解液を各カラムに通過さ せた。非特異的物質を、少なくとも３カラム容量の０．２５％Ｔｖｅｅｎ　２０ を含むＭＢＰカラム緩衝液およびＭＢＰカラム緩衝液のそれぞれを用℃）で洗浄 することにより、除去した。精製ＭＢＰ−デコリンフラグメント融合タンパク質 を、１０　ｍＭのマルトースを含むＭＢＰカラム緩衝液の５　ｘ　４　ｍｌアリ コート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を用いて溶出した。融合タンパク質を含むピーク画 分をプールし、タン／　Ｎ＋り質量を測定するだめにアッセイしくＢｉｏ−Ｒａ ｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｔ；　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａま たはＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｔ；　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　 ｌ１ｌｉｎ。

ｉｓ）、８−１６％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で泳動し、そしてクマンーブル−（Ｎｏｖｅｘ 　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色し純度をチェック した。融合タンパク質のこれらの結果を、表ＩのｒＭＷＪの下に示す。精製され た融合タンパク質を、活性試験の！１１！備が整うまで、アリコートで、４°Ｃ または一２０℃で貯蔵した。

ｐＭＡＬ−１）ベクターを、また、終止コドンをＥｃｏ　Ｒ１およびＸｂａ１部 位の間に取り込むことにより調製した。この過程の間で、ベクター中の当初のＥ ｃｏ　Ｒ１部位は破壊され、第２因子Ｘａ切断部位から下流位置で置き換えられ た。第２因子Ｘａ部位は、取り込まれて、ＭＢＰキャリアからデコリン融合タン パク質の引き続（切断を促進する。この構築は、相捕的オリゴ（ＯＴ−９８およ び０Ｔ−９９；　表３中の配列）をアニーリングし、そしてＥｃｏ　Ｒ１および Ｘｂａ　１部位でｐＭＡＬ−ｐ中に連結することを含む（Ａｕｓｕｂｅｌら、上 述、およびＭａｎｉａｔｉｓら、上述）。連結物（ＰＴ−７１）を、Ｌ９ｏ１ｉ 　ＤＨ５α細胞中細胞質転換させ、着色していないコロニーから小調製物（ｍｉ ｎｉ−ｐｒｅｐｓ）を作製し、そしてこのクローンを挿入物について配列決定し た。タンパク質の発現は、上記のＭＢＰ−デフリンフラグメント融合タンパク質 と同じ手法に従った。結果を、表２のｒ　１ｆｆＪの下に示す。

（以下余白） 氷　２ に 写３ （７ｒ−８３５’、、、Ｇ：；、Ｇｕ、ＴｒＣ，Ｇ＆、％、ＧこＴ−ＴＣＴ、ｆ ｌ：、ＡＴｈ、（ｍ、、、３’０ｒ−ＬＯ２５’、、、Ｃｒ−、’ＩＣｒ、ＡＧ Ａ、ＴＴＡ、ＣＴＣ−ＣＸ；、ＡＧＳ、ＣＡＡ、ＡＴＣ，ＡＧＡ、ＡＣ，、，３ ’Ｃ７ｒ−１０３５’、、、Ｃ；−ＴＣｒ、ｆｌ、Ｔ１．ＡＩＩｎ−ＡＣｒ、Ａ ＡＣ，ＴＸＴ、Ｇ？Ｉ’、ＡＡＴ、ＴＦ、ＡＴｒ、Ｇ、、ｊ’Ｃ７Ｉ’−１０４ ５’、、、（Ｚ；−ＴＯ’、Ｘ；Ａ、Ｔ１．ＴＩ！Ｌ’ＩてＩ；、Ｃ１１４＝、 ゛コニｉズ：Ｔ、Ｇ？ｒ、Ｇ’１Ｔ−Ｑ’b，、，３’ σＩ’−１０５５’、、、国、πコ、Ｉλ、コ、αズ、：心℃、にコ、απ、に ℃、に２：、、、３’ＯＩ’−１０６５’、、、Ｇｌｌ；、ＴＣＴ、Ｊｄ、Ｔ］ Ｒ，ＡＩＹ、ＧＸＣＪｊに、；’ｅ　、ＪＧｉｌｔ、Ｇ１１ｌＴ、α？ｒ、、、 ３f ＧＩ’−１０７５’　、　、　、国、ＴＴｒ　、ＡＧＡ、ＴＴＡ、’１０：　、 ＡＸ：　、Ｔ）Ｃ、Ｘ；Ａ、ＧＡＩ”　、ＭＴ、σ：Ｔ、ＧA、、３メ Ｃ７１’−１０８　５’、、、（ＩＩ；−ＴＣＴ、ｆｌ、’ＩＴＡ、＄、Ｇｒｒ 、（Ｚ’ｒ、ＧＩＡ、ＡＡＧＪＣｒ、Ｏに、、、３’σ？−１２０５’、、、印 、以、−℃、πλ、にπ、ＧＣ，！−π℃、αλ、σコ、−，３’Ｃ７ｒ−１２ １５’、、、（ｒ；、ＧＭ、ＴＫ：、ＩＣＡ、ｊｅ、Ｇ’ＩＣ，’ＦＣ，ＴＱ： 、０二Ａ、ＱＩＹ、、、コ１（７ｒ−９８５’、、、ＡＡ、ＴＴｒ、ＡＴＣ，Ｇ ｆｆ、ＧＺ、ＡＧＳ、Ｇｍ’、ＧｉＡ、’ＩＴＣ−ＴＡＡ−Ｔ、、、３’０ｒ− ９９５’、−、ＣｒＪＧＡ、ＴＴＡ、Ｇｖｌ、ＴＴＣＪｆｆニーＣＣＴ、ＡＣＣ ，σ：Ｃ，Ｇｆｆ、Ａ、、、３’以下の表４−１５は、上記のように調製された デフリンフラグメント融合タンパク質のヌクレオチドおよび対応アミノ酸配列を 提供する。各表はまた、Ｅｃｏ　Ｒ１および迦１連結部位を同定している。

ｆ） ≦− 一　〜　門　！　− 一　へ　門　曽　ψ 門　の 三へ 実施例Ｖ＋ β混合物または対照を加え、０°Ｃで゛−晩インキユベートした。

インキュベーションの後、５０μｍの遊離ＴＧＦ−β上清を標識したチューブに 移した。プレートをＰＢＳ中００５％のＴｖｅｅｎ−２０で３回洗浄した（１ウ エル当たり２００μｌ）。次にウェルをチューブに移し、ガンマカウンターでカ ウントした。固定化されたデコリンとの結合性研究の結果を図７および８に示す 。

組換えヒトデコリン（ＤＣ−１３）　、ＭＢＰ−全デコリン（ＰＴ−６５）、Ｍ ＢＰ−デコリンＮ末端（ＰＴ−７２）およびＭＢＰ−デコリンＮ末端＋２０イノ ンに豊む繰返しくＰＴ−７３）は、図７に示されるように、固定化されたデコリ ンへのＩ　２５　ｌ−７ａｐ−βの結合を阻害した。ＭＢＰのみ（ＰＴ−７１） は、固定化デコリンへの１２５１−ＴＧＦ−βの結合には影響を与えなかった。

これらの結果は、デコリンのＮ末端が、溶液中でＴＧＦ−βを結合し、ＴＧＦ− βが固定化されたデコリンに結合するのを防止し得ることを示している。従って 、この分子の２つの部分は、テコリン中のＴＧＦ−βへの結合部位の部分を含ん でいるようである。

図８に示されるように、組換えヒトデコリン（ＤＣ−１８Ｖ）　＋ＭＢＰ−デコ リンＮ末端（ＰＴ−７２）は、固定化されたデコリンへの１２５１−ＴＧＦ−β の結合を阻害した。さらに、ＰＴ−７２のシスティンからセリンへの変異体（Ｃ −２４、Ｃ−２８、Ｃ−３０、Ｃ−３７がセリンに変異した、ＰＴ−８４、Ｃ− ２８およびＣ−３０がセリンに変異した、ＰＴ−８５）は、デコリンへの１２５ １−ＴＧＦ−βの結合を阻害しなかった。

ＭＢＰ−デコリンＣ末端（ＰＴ−８６）およ１びＰＴ−８６の、システィンがラ セリンへの変異体（ＦＴ−８７）もまた、デコリンへの１２５１−ＴＧＦ−βの 結合を阻害した。これらの結果は、デコリンのＣ末端がまた、ＴＧＦ−βを結合 し得、Ｃ末端中の第１システイン残基がＴＧＦ−β結合に必要でないことを示し ている。

実施例Ｖｌｌ ＨＥＰＧ２細胞への１２５１−ＴＧＦ−βの結合部２．５　ｘ　１０’　Ｈｅｐ Ｇ２細胞またはＬ−Ｍ（ｔｋ−）細胞を、２５０　ｐＭ［ｌ’２５１ＴＧＦ−β と、組換えヒトデコリア　（ＤＣ−１２）　、ＰＴ−７１（ＭＢＰ）、デコリン フラグメント（ＰＴ−７２、−７３、−８４、−８５、−８６および−８７）ま たは抗ＴＧＦ−β抗体の存在下で、室温で２時間インキュベートした。結合した ＣＰＭを測定する前に、細胞を洗浄緩衝液（１２Ｂ＋ｎＭのＮａＣ１，５ｍＭの ＫＣＩ、５ｍＭのＭｇ、Ｓ０４．１．２ｍＭのＣａＣｌ２．５０ｍＭのＨＥＰＥ Ｓ、　ｐＨ７，５）で４回洗浄した。結果を図９．１ｏおよび１１に示す。

組換えヒトデコリン、ＭＢＰ−全デコリン（ＰＴ−６５）　、ＭＢＰ−デコリン Ｎ末端（ＰＴ−７２）およびＭＢＰ−デコリンＮ末端＋２　ロイシンに富む繰返 しくＰＴ−７８）は、Ｉ（ｅｐＧ２細胞への１２５１−ＴＧＦ−βの結合を阻害 した。ＭＢＰのみ（ＰＴ−７１）は、ＨｅｐＧ２への１２５Ｉ−丁ＧＦ−βの結 合に影響を与えなかった。図９に示されるこれらの結果は、デコリンのＮ末端が ＴＧＦ−βがＨｅｐＧ２細胞上にあるそのレセプターに結合するのを防止し得る ことを示している。

図１０に示されるように、組換えヒトデコリンおよびＭＢＰ−デコリンＮ末端（ ＰＴ−７２）は、Ｌ−Ｍ（ｔｋ−）細胞への１２５１−ＴＧＦ−βの結合を阻害 した。抗ＴＧＦ−β１抗体はまた、これらの細胞へのＴＧＦ−βの結合を阻害し た。ＰＴ−７２のシスティンからセリンへの変異体（Ｃ−２４、Ｃ−２８、Ｃ− ３０、Ｃ−３７がセリンに変異した、ＰＴ−８４；Ｃ−２８およびＣ−３０がセ リンに変異した、ＰＴ−８５）は、Ｌ−Ｍ（ｔｋ−）細胞への１２５１−ＴＧＦ −βの結合を阻害しなかった。

組換えヒトデコリン、ＭＢＰ−デコリンＮ末端（ＰＴ−７２）および抗ＴＧＦ− β抗体は、Ｌ−Ｍ（ｔｋ−）細胞への’　２５１−ＴＧＦ−βの結合を阻害した 。ＭＢＰ−デコリンＣ末端（ＰＴ−８６）およびＰＴ−８６のシスティンからセ リンへの変異体（ＰＴ−１１７）はまた、Ｌ−Ｍ（ｔｋ−）細胞への１２５１− ＴＧＦ−βの結合を阻害した。図１１に示されるよう（こ、これらの結果は、デ コｌ／ンのＣ末端がまた、ＴＧＦ−βがそのレセプターに結合するのを阻害し得 、Ｃ末端の最初のシスティン残基カシ阻害に必要ではないことを示している。

実施例Ｖ１ 合成ペプチド 以下のペプチドを合成し、１−ｙ（ｔｋ−）細胞へのＴＧＦβ１の結合を阻害す るこれらのペプチドの活性を試験した：表１６ １作　【丑 ）＋３１　−　Ｓ３７　ＨＬＲＶＶＱＳＰ２Ｓ　−Ｑ３６　ＰＦＲＳＱＳＨＬＲ ＶＶＱＨ３１−Ｌ４２　ＨＬＲ’／ＶＱＳＳＤＬＧＬｎＰ２ｓ　−Ｑ３６　ＰＦ ＲＣＱＣＨＬＲＶＶＱペプチドＨ３１−Ｓ３７は、３７位でシスティンがセリン に置換されていること以外は、Ｈｉｓ−３１とＣｙｓ−３７との間の同一のデコ リン配列に対応する。ペプチドＰ２ｓ　−Ｑ３６は、２８位および３０位で天然 のシスティン残基がそれぞれセリンに置換されていること以外は、Ｋｒｕｓｉｕ ｓおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ　（上述）に報告されているＰｒｏ−２５位からＧ ｌｎ−３６位までの配列に対応する。ペプチドＨ３１−Ｌ４２はまた、３７位で システィンがセリンに置換されていること以外は、Ｈｉｓ−３１とＬｅｕ−４２ との間のデコリンに対応する。ペプチドｎＰ２５−０３６は、Ｐｒｏ−２５から Ｇｌｎ−３６までのデコソンと正確に対応する。

上記ペプチドを応用Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａま たは４３１Ａ自動ペプチド合成機およびこの製造業者によって提供された化学薬 品を用いて合成した。

種々の′Ｊ１度のペプチドをデコリンおよび組換えデコリンフラグメントの代わ りに細胞およびＴＧＦβ１とインキュベートしたこと以外は、実施例Ｖｌ＋に記 載されたＬ−Ｍ（ｔｋ−）ＴＧＦβ１結合性阻害アッセイを用いて、ペプチドの 活性を評価した。ネガティブの対照は、配列ＤＥＡＳＧ　ＩＧＰＥＶＰＤＤＲＤ を有するデコリンの最初の１５個のアミノ酸に対応する合成ペプチドであった。

図１２は、ペプチドＰｕ５−Ｑ３６、Ｈ３１−５３７、およびＨ３１−Ｌ４２、 ならびに対照ペプチドの結合性データを示している。３つの試験ペプチドはすべ てＬ−Ｍ（ｔｋ−）細胞へのＴＧＦβ１の結合を阻害した。

天然のＣｙｓ残基が残存しているペプチドｎＰ２ｓ　−０３６はまた、程度は低 かったが阻害活性を示した。表１６は、阻害活性が低くなる順序で試験ペプチド を並べているいる。すなわち、ペプチドＨ３１−３３７は、最も高い阻害活性を 示すことがわかった。

上記のように合成され、固定化デコリンへのＴＧＦ−β１の結合を阻害する活性 を試験した可溶性Ｎ末端デコリンペプチドフラグメントを用いて、さらに結合性 研究を行った。Ｎ末端ペプチドフラグメントを、表１７に示す。

表１７ ペプチド　（丑 １、６Ｄ　ＶＰＤＤＲＤＦＥＰＳＬＧ １６Ｅ　ＦＥＰＳＬＧＰＶＣＰＦＲ １６Ｇ　ＨＬＲＶＶＱＣＳＤＬＧＬ １６ＨＣ５ＤＬＧＬＤＫＶＰＫＤＬＰＰＤ結合性研究の結果を図１３に示す。図 １３は、ペプチド１６Ｇが固定化されたデコリンへのＴＧＦ−βの結合を阻害し たことを示している。

本発明は、好ましい実施態様を参照して説明したが、本発明の範囲を逸脱しない で、種々の変更がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、以下の請求 の範囲にのみ限定されない。

ＦＩＧ、　ＩＡ　”””１８ ｔ　２　３４　＋２３４ ＦＩＧ−２Ｂ １　２３　４　５　６７　Ｂ　９１０１１１２１３１４ＦＩＧ、　３Ｂ （， ７３１１ンド１１　ＢＳＡωｇ／ｍＤ ＦＩＧ、　４Ａ ％ρ喉←シ゛゛ソセ・咽ｈ（。

ＦＩＧ、６ 述、初し− ＦＩＧ、７ １１１００Ｘ　ｉ３１，０ＯＯＸ　口ＩＱ、０ＯＯＸＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌ○ 国際調査報告 ＋＋−−、＋＋−＋−ＰＣＴ／ｕｓ　９３１０３１７１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／４９５ 　８３１８−４Ｈ１４／７１　８３１８−４Ｈ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，Ｎ Ｚ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　ピアーシュバッハ−、マイケル　ディ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１０７゜サン　ディエゴ、エイミフォー ド　ドライブ７６６ ＦＩ （７２）発明者　カーデナス、ホセ アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１２６゜サン　ディエゴ、エンブリー　 ポイント（７２）発明者　クレイグ、ウィリアムアメリカ合衆国　カリフォルニ ア　９２１２２゜サン　ディエゴ、オーナーズ　ドライブ（７２）発明者　ミュ レン、ダニエル　ジー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２１０９゜サン　ディエゴ、エイピーティ ー、　１３０゜ターコイズ　８６０

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞調節因子結合性ドメインを有するタンパク質の活性フラグメント。
2. ２．前記細胞調節因子がＴＧＦβである、請求項１に記載の活性フラグメント。
3. ３．ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項２に記載の活性フラクグメント。
4. ４．ＴＧＦβがＴＧＦβ２である、請求項２に記載の活性フラクグメント。
5. ５．前記細胞調節因子がＭＲＦである、請求項１に記載の活性フラグメント。
6. ６．前記タンパク質がデコリンである、請求項１に記載の活性フラグメント。
7. ７．前記タンパク質がデコリンの機能的等価物である、請求項１に記載の活性フ ラグメント。
8. ８．前記機能的等価物がビグリカンである、請求項７に記載の活性フラグメント 。
9. ９．前記フラグメントが組換えＤＮＡペプチドである、請求項１に記載の活性フ ラグメント。
10. １０．前記フラグメントがＰＴ−７２、ＰＴ−７３、ＰＴ−７８、ＰＴ−８６、 ＰＴ−８７、またはＰＴ−６５である、請求項９に記載の活性フラグメント。
11. １１．前記フラグメントがＰＴ−７８である、請求項９に記載の活性フラグメン ト。
12. １２．前記フラグメントが合成ペプチドである、請求項９に記載の活性フラグメ ント。
13. １３．前記合成フラグメントがＨ３１−Ｓ３７、Ｐ２５−￥Ｑ５６、Ｈ３１−Ｌ ４２、Ｐ２５−Ｑ３６、または１６Ｇである、請求項１に記載の活性フラグメン ト。
14. １４．細胞調節因子結合性ドメインを有するタンパク質の活性フラグメントに結 合する細胞調節因子を含む、精製化合物。
15. １５．前記細胞調節因子がＴＧＦ−βである、請求項１４に記載の精製化合物。
16. １６．細胞調節因子の活性を阻害する方法であって、該細胞調節因子と、細胞調 節因子結合性ドメインを有するタンパク質の活性フラグメントとを接触させる工 程を包含する方法。
17. １７．前記タンパク質がデコリンである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．試料中の細胞調節因子を検出する方法であって、以下の工程を包含する方 法： （ａ）該試料を、細胞調節因子結合性ドメインを有するタンパク質の活性フラグ メントと接触させる工程；および（ｂ）該細胞調節因子の該活性フラグメントヘ の結合を検出する工程であって、結合が該細胞調節因子の存在を示す工程。
19. １９．前記タンパク質がデコリンである、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．細胞調節因子の活性に関連する病状を治療する方法であって、該細胞調節 因子に対応する結合性ドメインを有するタンパク質の活性フラグメントの有効量 を被験体に投与し該病状を予防または治療する方法。
21. ２１．前記タンパク質がデコリンである、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記細胞調節因子がＧＦ−βである、請求項２０に記載の方法。