PT96065A - Processo de preparacao de peptidos e de anticorpos que inibem a ligacao do ligando a integrina e de composicoes contendo os mesmos - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO O presente pedido é uma contlnuação-em-parte do pedido co--pendente com o Número de Série 444 777, depositado em 1 de Dezembro de 1989, cuja descrição é aqui Incorporada por referência.

ÂMBITO.....TÉCNICO 0 presente Invento refere-~se a pollpéptldos derivados da região de ligação ao ligando de subunldades alfa de Integrlna, e à utilização dos pollpéptldos para modular a ligação do ligando à Integrlna. Também são abrangidos anticorpos que Imunorreagem com a região de ligação ao ligando de uma s u b u nIdade alfa de Integrlna e a ut1lIzaçãodos anticorpos para modular ou deteetar a ligação do ligando è Integrlna ou deteetar sítios de ligação ao ligando dentro das Integrlnas.

ANTECEDENTES A adesão celular envolve geralmente o reconhecimento de proteínas adesivas especificas pelos receptores da superfície celular. Uma família de receptores da superfície celular com Interesse particular para o presente Invento são as Integrlnas.

De acordo com Hynes, Cell, 48:: 549-554 (1987), as Integrlnas são um grupo de receptores funcional e estruturalmente relacionados que Interagem com uma grande variedade de Ugandos, Incluindo glIcoprotelnas de matriz extracelular, complemento e outras células. As Integrlnas participam na adesão célula-matriz e célula-célula em muitos processos fIslologlcamente Importantes, Incluindo desenvolvimento embrionário„ hemostase, trombose, cicatrlzação de feridas, mecanismos de defesa imunológlcos e não Imunológleos, a transformação oncogénlca. Pelo menos duas doenças genéticas humanas, a trombastenla de Glanzmann e a deficiência da adesão dos leucócitos, envolvem membros da família das Integrlnas. 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -3-

Estruturalmente, as integrinas são complexos heterodiméricos const 1 tu -idos por subunldades alfa e beta associadas não-côvalsntemente. Dentro da família das integrinas são reconhecidas subfamilias relacionadas' · · pela presença de uma subunidade beta semelhante* e os membros dentro de cada grupo são diferenciados por subunldades alfa distintas.

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Por exemplo, indícios recentes indicam que uma integrina encontrada na superfície das plaquetas © conhecida como GPIIb--1 I I a é um de diversos receptores da adesão que possuem subunldades alfa diferentes, mas que partilham uma subunidade beta semelhante e a propriedade funcional de reconhecer a sequência de resíduos de aminoácido tripeptldica Arg-Gly-Asp (utilizando símbolos de letra única, R6D) . Pytela e colab., Science, 231 : 1 559-1562 (1 986) e Ruoslahti e colab,, Cel 1 , 44:517-518 (1986). Além da GPIIb-IIIa, este grupo de receptores relacionados inclui o receptor da vitronectina (VnR) e o receptor da fibronectina (FnR) isolado a partir de células de osteossar-coma. Pytela e colab., Cel 1 , 40:1 91-1 98 (1 985), e Pytela & colab. , Proc. Natl,........Aca,d. Sei . USA, 82:5766-5770 (1985),

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As propriedades funcionais, estruturais e antigénicas semelhantes destas proteínas sugerem que a GPIIb-IIIa e o VnR são membros duma subfamfHa de integrinas para a qual foi proposta a designação de " ci to-adesina”.. Plow e colab,, Proc. Natl, Ãcad, $ci. USA, 83:6002-6006 (1986). Dentro do grupo da cito-adesina subunldades alfa diferentes combinam-se com uma subunidade beta comum ou muito semelhante, originando receptores funcionalmente distinguíveis. Ginsberg © colab,, J._____Biol. Chem., 262:5437-5.440 (1 987) .

Por exemplo, a GPIIb-IIIa é um complexo heterodimér1co constituído por subunldades alfa e beta. Jennings e colab., J. Biol,Chem., 257:10458-10466 (1982). A subunidade alfa, GPIIb, é constituída por uma cadeia pesada e uma cadeia leve que estão ligadas uma à outra por ligações dissulfeto. A subunidade beta, GPIIIa, é um polipéptido de cadeia simples de cerca de 100 KDa.

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Phillips e colab., J. Biol .............Chem., 252:2121-21 2 6 (1977),

Moléculas da superfície celular imunologicamente relacionadas com a GPIIb-IIIa foram identificadas em diversos tipos celulares, Thiagarajan & colab., J. C11n . Invest., 75:896 —9 01 (1985); Plow e

Fitzgerald e colab., J .........Biol. Chem., 260:10893-10896 (1985). A GPIIb-IIIa contribui para a função das plaquetas através de interseções com proteínas contendo RGD, isto é, proteínas contendo uma sequência de resíduos de aminoácido Arg-Gly-Asp, tais como o fibrinogénio [Bennett e colab,, P roc ...........Natl ............Acad .

Sc 1 , USA, 80:2417-2421 (1983)], a fibronectina [Ginsberg e colab., J..........C1in...........Invest., 71:619-624 (1983)], e o factor de von

Willebrand [Ruggeri e colab.., Pr oc Natl . Acad Sc 1 . USA , 79:6038-6041 (1982)], e consequentemente é um componente do receptor proteico de adesão das plaquetas comum [Pytela e colab., Science, 231:1559-1562 (1986) e Plow e colab., J. Biol. Chem., 259:5388-5391 (1984)],

Foram identificados pelo menos 2 outros grupos de receptores de adesão heterodiméricos nos quais uma subunidade beta comum se combina com um certo número de subunidades alfa diferentes. Um grupo é encontrado nos leucócitos, e foi designado como a familia de adesão dos leucócitos (LeuCam) e inclui LFA-1, Mac-1 e p150,95· . Sanchez-Madrid e colab., J. Exp. Med., 158:1785-1803 (1 9 83) e Springer e colab., Ciba. Found. Symp. , 118:102-126 (1986) . 0 outro grupo encontra-se mais largamente distribuído e foi designado como a família VLA, Hemler e colab., J._________Biol.

Chem. , 262:3300-3309 (1987). A subunidade beta da família VLA

[Hemler e colab. J, Biol.........Chem,, 262:3300-3309 (1987)] na galinha foi clonada, sequenciada e designada como "integrina" [Tamkun e colab,, Cel 1 , 46:271-282 (1986)]., A sequência da integrina de galinha é semelhante à da GPIIIa [Fitzgerald e colab., .J........Biol .

Chem., 262:3936-3939 (1987)] e è da subunidade beta da família de adesão dos leucócitos [Kishimot© e colab., Cel1, 48:681-690 (1987) ]. Além disso, sequências parciais de diversas subunidades alfa também mostram semalhanças. Ginsberg, e colab., J._____________Biol 5

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 C hem.., 262:5437-5440 (1987); Suzuki, e col ab . , Proc. Nat!. Acad

Acad. Sei. USA, 83:8351-8356 (1986).

Os sitios na GPIIb-IIIa, ou nas outras cito-adesinas, que são cruciais para as suas funções como receptores de adesão não estão, no momento, bem caracterizados. Várias observações segerem que um sitio funcional mente significativo na GPIIb-IIIa se encontra próximo do epitopo definido pelo anticorpo monoclonal PMI-1, Este anticorpo liga-se à cadeia pesada da GPÍIb [Shadle e colab., J. Cel1 ♦___Biol., 99:2056-2060 (1984)] e define uma região da GPIIb que está associada com.diversas actividades funcionais distintas. Por exemplo, o PMI-1 inibe a adesão de plaquetas lavadas ao colagéneo. Shadle e colab., J. Cel1. Biol., 99:2056--2060 (1984).

Recentemente, o sitio na subunidade ΘΡΙΙIa para interacção com a região contendo RGD do fibrinogénio foi localizado nos resíduos 109-171 da 6P111a por r^t-t-cu-laçÃo,··.. · ·:..*· quimica· entre, a GPIIIa e o polipéptido sintético KYGRGDS. D'Souza e colab., Science, 242:91-93 (1988). Estudos para identificar o sitio de interacção entre polipéptidos de cadeia gama de fibrinogénio e a GPIIb-IIIa mostraram uma interacção com a subunidade GPIIb. Kloczewick, M., e colab., J. Biochem., 23:1767-74 (1984). Só recentemente é que péptidos contendo a cadeia gama do fibrinogénio foram reticulados selectivamente com uma região identificável, resíduos 294-314, da GPIIb. D1Souza, S. E., e colab., J. .Biol............Chem. , 265:3440-46 (1990). Estes resultados sugerem uma relação próxima! entre a região dos resíduos 294-314 e o sitio de ligação ao ligando da GPIIb-IIIa.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO

Foi identificada uma região recentemente caracterizada de uma subunidade alfa de integrina que participa na ligação ao ligando. Mais particularmente, foi identificada uma nova região da subunidade GPIIb da glicoproteina do receptor das plaquetas, GPIIb-IIIa, que participa na ligação especifica da GPIIb-IIIa ao

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71 924 SCR0353P SCRF 192.1 f ibririogénio. 0 Invento refere-se a polipéptidos [aqui também designados como polipéptido(s) sujeito(s)] de cerca de 10 a cerca de 100 resíduos de amlnoácldo de comprimento, os quais são caracterizados por possuírem uma sequência de resíduos de amlnoácldo substancial mente homól oga a uma porção da região de ligação ao ligando de um® subunldade alfa de integrlna. 0 Invento também se refere a anticorpos pollclonals e monoclonals que imunorreagem com um pollpéptldo sujeito, assim como a anticorpos monoclonals que Imunorreagem com um epltopo formado pela região de ligação ao ligando de uma subunldade alfa de Integrlna. Taís anticorpos são eficazes na modulação da ligação do flbrlnogénlo às plaquetas.

Também estão abrangidos dentro do âmbito do presente Invento os hlbrldomas que possuem a capacidade de produzir um anticorpo monoclonal sujeito. Sãó abrangidos processos para modulação da adesão, In vivo, de células expressando uma subunldade alfa de Integrlna à qual os polipéptidos sujeitos correspondem. Neste processo, a adesão celular é modulada utilizando quer os polipéptidos quer os anticorpos anti-polipéptido de acordo com o presente invento. Deste modo, podem ser inibidas a agregação plaquetária e a ligação das plaquetas ao flbrlnogénlo.

Ainda é abrangido um segmento de nucleótldos compreendendo não mais do que cerca de 12 000 pares de bases nucleotldicas, incluindo uma sequência definindo um gene estrutural que codifica um pollpéptldo sujeito. Também é abrangida uma molécula de ADN recornbinante compreendendo um vector operativamente ligado a um segmento de ADN que define um gene estrutural que codifica um polipéptido sujeito.

Nos desenhos formando uma porção desta descrição:

7 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 A Figura 1 Ilustra a sequência de bases nucleotldicas & a sequência de resíduos de amlnoácldo deduzida de um segmento de AON que codifica a subunldade alfa da GPIIb. Os resíduos de amlnoácldo estão Indicados pelo código de letra única e estão numerados sequencla1 mente na margem direita, começando em -31 para a primeira metlonlna (M) , e começando em 1 para a primeira leuclna (L) encontrada na proteína após a sequência de comando de 31 resíduos de amlnoácldo ser removida. Assim, a subunldade alfa da GPIIb contém 1039 resíduos antes da clivagem da sequência de comando, e 1008 resíduos após a clivagem do comando do terminal amlno. Os resíduos das bases de ácido nuclelco estio Indicados por um código de letra única, e estão numerados sequencial mente na margem esquerda. A sequência apresentada é a da sequência da GPIIb descrita por Poncz e colab., J._________Blol . Cherri. , 262:8476-82 (1987). 0 Painel A representa a metade do terminal amlno da GPIIb, desde o resíduo de amlnoácldo -31 ao 508. 0 Painel B representa a metade do terminal carboxi da GPIIb, desde o resíduo de amlnoácldo 509 ao 1008. A Figura 2 ilustra os resultados da reticulação do péptido de cadeia gama (K16) com sítios distintos na subunldade alfa (GPIIb) de um receptor de adesão da integrina. 0 péptido marcado com K16 (30 μΜ), foi ligado a plaquetas (6 x t0®/ml) durante 45 min a 22° C, e reticulado com BS^ (0,2 mM) de acordo com o Exemplo 1B. As amostras reticuladas foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, Nature, 227:680 (1970)] e auto-radiografa- das de acordo com os Exemplos 1B e 1C, 0 Painel A representa os resultados da reticulação do "K16 com plaquetas estimuladas com trombina na ausência de inibidor peptldico (faixa da esquerda) ou em presença de um excesso molar de 50 vezes do péptido K16 não marcado (faixa da direita) como um controlo da especificidade da reticulação. 0 Painel B representa os resultados d© uma análise por SDS-

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -8- -PA6E das amostras reticuladas após imunoprecipitação utilizando o anticorpo especifico da cadeia pesada da GPIIb, PMI-1. 0 Painel C representa os resultados de uma análise por SDS--PAGE das amostras reticuladas preparadas utilizando plaquetas em presença (faixas 2-4) de ADP (10 μΜ), PMA (0,1 μΜ) ou trombina (0,5 unidades/ml) e na ausência de agonistas (faixa 1). Â Figura 3 ilustra que o sitio de reticulação do K16 se situa na porção da cadeia pesada da subunidade alfa (GPIIb) de acordo com o Exemplo 1C. 0 ^®I-K16 foi primeiro reticulado com plaquetas. As amostras reticuladas foram então analisadas por SDS-PAGE sob condições não-redutoras, e as bandas radioactivas foram excisadas e re-analisadas em geles de SDS-PAGE de gradiente de 10-20% em presença de 2-mercapto-etanol. Os geles resultantes foram submetidos a análise de imuno-mancha de acordo com o Exemplo 1C, utilizando um anticorpo que imunorreage com a cadeia pesada da GPIIb (faixa 1), ou com a cadeia leve da GPIIb (faixa 2). As faixas 3 e 4 representam o auto-radiograma das amostras extraidas analisadas num segundo gel sob condições não--redutoras (faixa 3) ou redutoras (faixa 4). A Figura 4 ilustra a localização do sitio de reticulação do K16 com a região do terminal NH2 da subunidade alfa (GPIIb) de acordo com o Exemplo ÍD. 0 complexo cadeia pesada da GPIIb: K16, que foi extraida de geles d© SDS-PAGE redutores tal como na Figura 3, foi digerido com quimotripsina e, em seguida, re--analisado por imuno-mancha com um anticorpo especifico da cadeia pesada da GPIIb, PMI-1 (faixas 1 e 2), ou por auto-radiografia (faixas 3 e 4) de acordo com o Exemplo 1D. As faixas 1 e 3 representam o complexo extraído sem digestão, e as faixas 2 e 4 representam o complexo extraído após digestão com quimotripsina. A seta indica a posição do fragmento de quimotripsina de 60 kDa detectado. A Figura 5 ilustra a localização especifica do sitio de reticulação do K16 dentro da cadeia pesada da GPIIb de acordo com o Exemp lo 10. 0 complexo GPIIb: l< 16 foi isolado tal como na

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Figura 3 dê geles de SDS-PA6E redutores, e submetido a digestão com CNBr, qulmotripslna ou protease de SV8. Em seguida, as amostras foram analisadas em SDS-PAGE e foram produzidos auto--radiogramas para mostrar os fragmentos radioactivos. 0 complexo Intacto (não-diger1do) foi analisado como um controlo. Em seguida, a banda radloactlva de cada digesto foi extraída e submetida a sequenclamento do terminal NHg tal como na Figura 4, e a sequência resultante está Indicada na figura para cada digesto, As posições dos resíduos de amlnoácldo dentro da sequência da GPIIb também estão Indicadas acima de cada sequência do fragmento e correspodem às posições na Figura 1., A Figura 6 Ilustra uma representação esquemática das análises descritas nas Figuras 3-5 para determinar a localização do sitio de retlculação do K16 dentro da GPIIb. A cadela leve da GPIIb, constituída por 137 aminoácldos, e a cadela pesada de 871 aminoácldos, estão desenhadas à escala no passo 1. Os resultados representados na Figura 3 Indicam que a cadela leve não se torna reticulada com o péptldo K16 (Passo 1). A Imuno-mancha com um anticorpo especifico da GPIIb, PMI-1, em digestos pardais com qulmotripslna,localizou o sitio de retlculação do K16 na metade do terminal amino da cadela pesada da GPIIb (Passo 2)., Daterminou-se que o fragmento de 40 kDa derivado da digestão com CNBr do ΘΡIIb-K16 se Iniciava no terminal NH2 da GPIIb e prevê-se que termine no resíduo de metlonlna 314 (Passo 3). A digestão com qulmotripslna do ΘΡIIb:K16 produziu um fragmento de 7 kDa que se Inicia no resíduo 294 (Passo 4). Determinou-se que o fragmento derivado da SV8 de 9 kDa do GPIIh:K16 se Iniciava no resíduo 254, (Passo 5). Consequentemente, o sitio de retlculação do K16 é constituído por um trecho de 21 aminoácldos na cadela pesada da GPIIb, dos resíduos 294 a 314. Esta região está enquadrada e indicada pela seta no passo 1,

Figura 7. 0 Painel A mostra a dependência da ligação do 125i-^^brinogénio da concentração de anticorpo anti-p1 (B12). 0 polipéptido p1 (circulo negro) e a GPIIb-IIIa (triângulo) foram imobilizados sobre placas de micrõtitulação. Os resultados

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -10- mostram "inibição selectiva da ligação do f1br1nogén1o pelos anticorpos ant1-p1. 0 Painel B mostra a Inibição selectiva da ligação do ^® I-f1br1nogén1 o a plaquetas em presença de anticorpos ant1-p1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A - Definições

Resíduo de Amlnoácldo: Prefere-se que os amlnoácldos aqui descritos se encontrem na forma Isomérlca "L". Contudo, qualquer resíduo de L-amlnoáddo pode ser substituído por resíduos na forma Isomérlca "D", desde que o pollpéptldo conserve a propriedade funcional desejada. NH2 refere-se ao grupo amlno livre presente no terminal amlno dum pollpéptldo. COOH refere-se ao grupo carboxllo livre presente no terminal carboxl do pollpéptldo. Em harmonia com a nomenclatura padrão para os pollpéptldos, J ,________BI o 1 ._______Chem, , 243:3557-59 (1969), as abre viaturas para os resíduos de amlnoácldo são tal como representadas na seguinte Tabela de Correspondência:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

SÍMBOLO AMINOÁCIDO 1-Letra 3-Letras Y Tyr tlroslna e >> *— <D glIcina p Phe fenllalanlna M Met metionlna A Ala alani na S Ser ser1na I Ile Isoleucina L Leu leuclna T Thr treonlna V Vai vai1na P Pro prollna

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -11- K Lys 1 isina H His histidlna Q 61 n glutamina E 61 u ácido glutâmico W Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cistelna

Deverá notar-se que todas as sequências de resíduos de amoniácido estão aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita se encontra na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxi- Além disso, deverá notar-se que um traço no inicio ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoécido indica uma ligação peptldica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoacido, ou a um grupo NH2 do terminal amino ou a um grupo COOH do terminal carboxi. e Péptido: Polipéptido e péptido são termos aqui utilizados de forma permutável para designar uma série linear de não mais do que cerca de 100 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptldicas entre os grupos alfa-amino e carboxi de resíduos adjacentes.

Nucleósido e Nucleótico: Uma unidade monomérica de ADN ou ARN constituída por uma porção . açúcar (pentose), um fosfato, e uma base heteroclclica azotada. A base está ligada à porção q. açúcar por meio do carbono glicosldico (carbono Γ da pentose), e essa combinação de base e açúcar é um nucleósido. Quando o nucleósido contém um grupo fosfato ligado à posição 3' ou 5' da pentose é designado como um nucleótido.

Par de_ bases (pb): Uma associação, ligada por hidrogénio, da adenina (A) com timina (T) , ou de citosina (C) com guanina (Θ)

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 ”12“ numa molécula de ADN de cadela dupla.

Receptor: Receptor © proteína receptora são termos aqui utilizados para indicar uma molécula protelnica biologicamente activa que se liga especificamente a (ou com) outras moléculas, designadas como ligandos, para formar um complexo proteico de receptor-ligando.

Ligando: Ligando refere~se a uma molécula que contém uma porção estrutural que está ligada por uma interacção especifica com uma proteína receptora particular. Um ligando e um receptor representativos são o fibrinogénio e a glicoproteina plaquetária ΘΡIIb-II Ia.

B· POLIPÉPTIDOS

Um polipéptido de acordo com o presente invento possui pelo menos cerca de 10, e não ma is do que cerca de 100, preferivelmente não ma is do que cerca de 40, e ma is preferivelmente não mais do que cerca de 25 a 30, resíduos de aminoãcido. Além disso, um polipéptido sujeito é caracterizado como possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido homóloga a, isto é, derivada da região funcional similar àquela porção da região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb entre os resíduos 290”320, tal como representado na Figura 1, ‘Homólogo à região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb destina-se, tal como aqui utilizado, a definir polipéptidos possuindo sequências derivadas da região de ligação ao ligando de uma subunidade alfa de integrina identificada na Tabela I, tal como a região entre os resíduos 290 a 320 na GPIIb, ou a sequência homóloga encontrada na região de ligação ao ligando da subunidade alfa de uma integrina, incluindo o receptor da vitronectina (VnR), VLA-2, VLA-4, VLA-5, LFA-1 e Mac-1. Tal como apresentado na Tabela 1, todas as sequências de aminoácidos da região de ligação ao 1igando ,identificada,de uma subunidade alfa de integrina possuem mais de 45% de similaridade de sequência (homologia) com a sequência de GPIIb homóloga.

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Numa concretização» um pollpéptldo sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de GPIIfo representada na Figura 1 que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -TDVNGDGRHDL-, sendo o referido pollpéptldo capaz de inibir a interacção entre a GPIIb e o seu ligando nativo» tal como o fibrinogénio. '"Um ligando nat1vo\ tal como utilizado no contexto de uma integrina, refere-se à proteína natural à qual a integrina se liga em processos interactivos celulares normais» isto é, o ligando respectivo. No caso da GPIIb-IIIa, por exemplo, um ligando nativo é o fibrinogénio; para o receptor de vitronectina o ligando nativo é a vitronectina; e para o receptor de fibronectlna o ligando nativo é a fibronectina.

Noutra concretização, um pollpéptldo sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de VnR que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -TDINGDDYÂDV-, sendo o referido pollpéptldo capaz de inibir a interacção entre o VnR e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm o VnR nas suas superfícies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de VnR encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1. ( segue Tabala 1]

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J 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 0) 03 Ό Ή 03 O V c H (03•μ 3 C σ ο\4 ο\4 c\4 ο\4 ο\4 ο\4 ο\4 03 03 -Q \0 CM ω ο LQ LO Ό Μ Η η (Μ CNÍ η η CM (Μ 0) 03 <£ —1 lli CQ «a:Ι Ο) 03 V 03 εοc\4 Ο εο υ •H £ 3 Ώ 03 μ ν£3 3 σ 03 Ή 0) 03 L /—s /""s Λι /—\ Ό ο\4 6\4 ®\4 ο\* ο\4 ο\4 ο\4 (Λ Η 03 Ο r" (ΝΙ ω Ή ω ω CM <0 μ V V L0 LÍ3 •tf 00 •tf tf· to !_ 03 (3 r* C ν»> y-/ -μ 03 Ο 0 3 Ό >03 «0 Ο * •Η •Η Ο •π 1 03 03 03 σ> 03 •μ £ 03 0) rH & Η X) «\4 μ 03

H CL CD 03 V 03 03Ό ο χ3 Η η 0 •Η 1 U •(Ο 0 Ό Γ“*1 0 ϋ C 'Π e £ £ 03 C (0 |> Η (Ο 03 ε 0) •Η 4" (0 •Η Η 0 (0 V de Η 0 03 (0 i.t— (0 σ; X Ζ ω Σ > > > W >- Li. >- σ μ IL >- > 0 τ· 0 0 μ μ Γ Σ μ μ X X 103 η (0 3 1(0 CL α 0. CL ο. α α. α. Ο Ό ϋ <ε <£ <£ <ε «a: <£ <ε (δ Ή 03 0 0 0 0 0 0 0 0 03 03 03 > Η > > > Η Η Η Ή 03 ·Γ*1 μ L· μ μ μ μ μ μ Η L Η I 1 μ μ I μ > > 03 μ > > I μ μ μ μ 03 03 Ω Ω Ω Ω Ω LU Ω Ω Ό Ό Ό X <Ε μ· ω Ω Η Η π 03 >- Η Li. μ LU ω ω 0 (0 0 0 Ω μ> 0 0 0 0 0 «0 Ή 1(0 ο Ω Ω Ω Ω Ω ζ Ω •Η ϋ •Η 0 0 «Ε 0 0 ω Η 0) C 03 ζ Ζ Ω Ζ Ζ Ω Ω Ω 03 (03 03 > Η > μ > > > > □£ 3 L Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω σ 1- 1— > > Η > > > 03 (0 > « C0 <ϊ <£ 0 ω ω ω Ό <3l CE Ο ο <£ Ο ο ο •Η L 0 Λ Μ tf· U3 Η rH .95 03 Η 1 I 1 1 1 Ο μ Η 03 <Ζ <ζ <χ 0 LO £ μ. £ μ μ μ ϋ. (0 τΗ Η 0 > > > > μ Σ 0.

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -15 ^ A sequência de resíduos de aminoácido da região de ligação ao ligando da GPIIb foi determinada no Exemplo 1D por reticulação com o polipéptido K16 como sendo a região de ligação ao ligando para ligação ao fibrinogénio e corresponde aos resíduos 294-314 da 8PIIb representada na Figura 1, As sequências representadas para as outras subunidades alfa de integrina foram obtidas a partir das referências seguintes, com a integrina correspondente registada entre parêntesis a seguir à referência: [Suzuki e c o 1 a b . , . J..........Bi o.I,.........Chem. , 252:140 8 0- 85, 1987 (VnR) ; Takada e c o 1 a b . , J..........C e 1 J_B 1 o] _..., 109:397-407, 1989 (VLA-2); Takada e colab., EMBQ J., 8:1361-68, 1989 (VLA-4); Argraves e colab., J.

Cell........Biol., 1 05 : 1 183-90, 1987 (VLA-5); Larson e colab., J. Cell

Biol., 108:703-12, 1989 (LFA-1); Corbi e colab., J. Biol. Chem., 263: 12403-1 1, 1988 (Mac-1); e Corbi e colab., EMBQ.......J,„, 6:4023-28, 1987 (p150,95) ; essas referências são aqui incorporadas por referência.

Noutra concretização, um polipéptido sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de VLA-2 que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -VDVDKDTITDV-, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interacçio entre VLA-2 e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm VLA-2 nas suas superfícies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de VLA-2 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1.

Noutra concretização, um polipéptido sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de VLA-4 que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula: -VDLNAD6FSDL”, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interação entre VLA-4 e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm VLA-4 nas suas superfícies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de VLA-4 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1.

Noutra concretização, um polipéptido sujeito possui uma 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

16- sequência que corresponde è sequência de VLA-5 que inclui uma sequência de residuos de aminoàcido representada pela fórmula: -TDVNGOeLDDL-, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interseção entre VLA-5 e o seu ligando nativo» e de inibir a adesão de células que contêm VLA-5 nas suas superficies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de VLA-5 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1 .

Noutra concretização, um polipéptido sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de LFA-1 que inclui uma sequência de residuos de aminoàcido representada pela fórmula: -VDVDGDGETEL-, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interaeção entre LFA-1 e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm LFA-1 nas suas superficies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de LFA-1 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1.

Noutra concretização, um polipéptido sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de Mac-1 que inclui uma sequência de residuos de aminoàcido representada pela fórmula: -VDVDSNGSTDL-, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interacçio entre Mac-1 e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm Mac-1 nas suas superficies celulares, A sequência completa da subunidade alfa de Mac-1 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1.

Noutra concretizaçio, um polipéptido sujeito possui uma sequência que corresponde à sequência de P150,95 que inclui uma sequência de residuo de aminoàcido ’ representada pela fórmula: -VDVDTOGSTDL-, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a interseção· entre P150,95 e o seu ligando nativo, e de inibir a adesão de células que contêm P15Q,95 nas suas superficies celulares. A sequência completa da subunidade alfa de P150,95 encontra-se descrita no artigo citado na nota de rodapé da Tabela 1.

Uma concretização preferida que é ilustrativa das

71 924 SCR.Q353P SCRF 192.1 -17- concretizaçoes anteriores para polipéptidos que correspondem às suas integrinas respectivas, é um polipéptido que possui uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde, e é preferivelmente idêntica a, uma fórmula representada na Tabela 2. TABELÁ 2 Ί

Designaçãoda Fórmula Sequência de Residuos de Aminoácido

p1 TDVN3D8RHDL p2 AVTDVNIGDGRHDLLVGAPLYM p3 AATDINGDDYADLFIGAPLFM p4 CSVDVDKDTÍTDVLLVGAPMYM p5 CAVDLNAD6FSDLLV6APMQS p6 AATDVNGDGLDDLLVGAPLltí p7 C6VDVDGD6ETELLLI6APLFY p8 CSVDVDSNGSTDLVLIGAPHYY p9 CSVDVDTDGSTDLVLIGAPHYY 1p1 e p2 possuem sequências que correspondem exatamente às sequências de resíduos de aminoácido representadas na Figura 1 para a 6PI Ib, dos resíduos 296 a 306, e dos resíduos 294 a 314, respectivamente. p3 a p9 possuem sequências que correspondem exactamente às sequências de resíduos de aminoácido representadas na Tabela 1 para a região de ligação ao ligando da subunidade alfa das Integrinas, VriR, VLA--2, VLA-4, VL.A-5, LFA-1, Mac-1 e P150,95, respectivamente.

Em concretizações preferidas, um polipéptido sujeito á ainda caracterizado pela sua capacidade de inibir competitivamente a adesão celular mediada pelas integrinas, tal como a agregação das plaquetas, a adesão de fibroblastos a uma matriz, e similares. Isto é, um polipéptido sujeito preferido é capaz de inibir competitivamente a ligação da integrina a um ligando nativo, isto é, um ligando ao qual a integrina, da qual o polipéptido derivou, 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

18-se liga in vivo. t

Onde o polipéptido sujeito contém uma sequência de residuos de aminoácido da região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb entre os residuos 290 e 320, o polipéptido possui a capacidade de inibir a adesão plaquetSria, isto é, de actuar como um agente anti-trombótico. Polipéptidos inibitórios da adesão plaquetária par ti cu 1 armente preferidos são os polipéptidos p1 e p2 anteriormente descritos, cujas propriedades de inibição da adesão são apresentadas no Exemplo 3.,

Em concretizações preferidas, um polipéptido sujeito é adicionalmente caracterizado pela sua capacidade, quando utilizado num inóculo, de induzir a produção de um anticorpo policlonal ou de um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento.

Os residuos de aminoãcido presentes num polipéptido sujeito, além de uma sequência correspondente a uma fórmula anteriormente descrita, podem ser quaisquer residuos que não afectem materialmente as caracterfstlcas básicas e novas de um polipéptido como são aqui discutidas. Os referidos residuos adicionais são geralment© adicionados a um ou a ambos os terminais de um péptido enumerado, e. podem incluir repetições e repetições parciais de urna sequência peptidica enumerada ou residuos contiguos da sequência proteica da subunidade alfa de integrina.

Um polipéptido sujeito possui uma sequência de residuos de aminoácido que corresponde a uma porção da região de ligação ao ligando de uma sequência da subunidade alfa de integrina. Assim, um polipéptido de acordo com o presente invento não necessita ser idêntico è sequência de residuos de aminoácido da porção de ligação ao ligando de uma subunidade alfa de integrina, desde que seja capaz de exibir pelo menos uma das caracteristicas preferidas anteriores de um polipéptido sujeito. Consequentemente, um polipéptido sujeito pode ser submetido a várias alterações, tais como inserções, delecções e

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 -19- substltuições, quer conservadoras quer não-conservadoras, onde as referidas alterações proporcionam certas vantagens na sua ut111 zaçio.

Substituições conservadoras são aquelas onde um resíduo de amlnoácldo é substituído por outro resíduo biologlcamente semelhante. Exemplos de substituições conservadoras Incluem a substituição de um resíduo hldrofóblco, tal como a Isoleuclna, a vallna, a leuclna ou a metlonlna, por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como entre a arglnlna e a Usina, entre os ácidos glutimlco e aspártico, ou entre a glutamina e a asparaglna, e similares. 0 termo "substituição conservadora" também Inclui a utilização de um amlnoácldo substituído no lugar de um amlnoácldo de origem não substituído desde que tal pollpéptldo também apresente a actlvldade de Inóculo ou ligação requerida.

Quando um pollpéptldo de acordo.com o presente Invento possui uma sequência que não é Idêntica à sequência de uma subunldade alfa de Integrlna porque foram efectuadas uma ou mals substituições conservadoras ou não-conservadoras, geralmente são substituídos não mals do que cerca de 20%, e mals geralmente são substituídos não mals do que 10% dos resíduos de amlnoácldo. Existe uma excepção onde resíduos adicionais foram adicionados a qualquer dos terminais com o fim de proporcionar um "llgador" através do qual os pollpéptldos de acordo com este Invento podem ser convenientemente afixados a um marcador, ou matriz sólida, ou portador antlgénlco. Os marcadores, matrizes sólidas e portadores que podem ser utilizados com os pollpéptldos de acordo com este Invento são aqui descritos em seguida.

Os llgadores de resíduos de amlnoácldo são geralmente, pelo menos, um resíduo, e podem ser 40 ou mals resíduos, mals frequentemente 1 a 10 resíduos. Resíduos de amlnoácldos típicos utilizados para ligação são a tlroslna, a clstelna, a Usina, o ácido glutêmlco e o ácido aspártico, e similares. Um llgador representativo é um trlpéptldo Cys-Gly-Gly- (CGG-) fixado ao

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -20- terminal amino de um polipéptido sujeito pelo resíduo de g11clna do terminal carboxi do ligador, tal como apresentado no Exemplo 2. Além disso, uma sequência polipeptidica de acordo com este invento pode diferir da sequência natural pela sequência a ser modificada por acilaçao do MH2 terminal, por ex., acetilação, ou amidação do ácido tioglicólico, carboxilamidação terminal, por ex., amónia, meti lamina, etc.

Quando acoplado a um portador por meio de um ligador para formar o que é conhecido na arte como um conjugado de portadoí— -hapteno, um polipéptido sujeito é. capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com a subunidade alfa de integrina à qual corresponde a sequência de resíduos de aminoácido do polipéptido. Considerando o principio bem estabelecido da reaetividade cruzada imunológica; o presente invento, por consequência, abrange variantes antigenicamente relacionadas de um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um polipéptido possuindo uma fórmula apresentada na Tabela 2. Uma "variante aritigenicamente relacionada" é um polipéptido que imunorreage com um anticorpo induzido por um polipéptido de acordo com a fórmula apresentada na Tabela 2.

Um polipéptido sujeito pode ser sintetizado por quaisquer técnicas que são conhecidas dos especialistas na arte dos polipéptidos. Um excelente sumário das muitas técnicas disponíveis pode ser encontrado em J,M. Stewart e J.D. Yong, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, e J. Meienhofer, "Hormonal Proteins e Peptides", Vol. 2, pég. 46, Academic Press (New York), 1983 para a síntese peptldica de fase sólida, e em E.. Schroder e K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 par® a síntese em solução cléssica.

Uma concretização relacionada abrange uma composição para promoção da fixação (adesão) de células a um substrato. Baseado na capacidade de um polipéptido sujeito para competir com uma integrina na ligação ao ligando nativo da integrina, o

71 924 SCR0353P SCRF 192/1 “21 polipéptido sujeito fornece um meio para ligação ao ligando e» consequentemente, pode ser utilizado para promover a actividade de fixação de células quando o polipéptido é imobilizado sobre um substrato.

Uma composição contendo um polipéptido sujeito é utilizada para tratar um substrato e, desse modo, imobilizar o polipéptido contido na composição sobre o substrato. 0 substrato pode ser qualquer superfície sobre a qual a actividade de promoção da adesão celular é desejada, e inclui recipientes para cultura celular, dispositivos médicos, um dispositivo protético, uma fibra de resina sintética, um enxerto vascular ou de vaso sanguíneo, um dispositivo percutâneo, orgãos artificiais, e similares. Â superfície pode ser constituída por vidro, uma resina sintética, nitrocelulose, poliéster, agarose, colagéneo, ou um polissacárido de cadeia longa. A imobilização dos polipéptidos sobre o substrato pode ser efectuada por uma variedade de meios e depende, inter alia, do substrato e do mecanismo de imobilização desejados. Os processos para o acoplamento ou imobilização do polipéptido são bem conhecidos na arte e, tipicamente, envolvem ligações covalentes entre um grupo amino ou tio! no polipéptido e um grupo reactivo presente no substrato.

Por exemplo, para processos de imobilização do polipéptido ver Aurameas e colab., Scand J. Immunol ., Vol. 8 Supl. 7:7--23 (1978); Pat. dos EUA Nos. 4 493 795, 4 578 079 e 4 671 950; K11 pstein e colab., J...........Inf.§.£,1.:........Pis · , 147:318-326 (1983) e Liu e colab. , §J_oche_m, 80:890 (1979). Para exernplos da utilização de polipéptidos promotores da adesão celular ver Pat. dos EUA NS 4 578 079.

C. INóCULOS

Noutra concretização, um polipéptido de acordo com este invento, preferivelmente um - . :-péptido correspondendo. a uma fórmula apresentada na Tabela 2 ou a uma sua variante 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

-22-antlgenlcamente relacionada, é utilizado numa composição com um diluente aquoso farmaceuticamente aceitável para formar um Inóculo que, quando administrado numa quantidade eficaz, é capaz de Induzir anticorpos que Imunorreagem com uma subunldade alfa de Integrlna ã qual a sequência de resíduos de amlnoâcldo do pollpéptldo corresponde. Os anticorpos assim Induzidos são capazes de Inibir a Interacção Integrlna--1 Igando, A palavra "Inóculo" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um pollpéptldo de acordo com este Invento como um Ingrediente actlvo utilizado para a preparação de anticorpos contra uma subunldade alfa de Integrlna.

Quando um pollpéptldo é utilizado para Induzir anticorpos deverá compreender-se que o pollpéptldo pode ser utilizado só, ou ligado a um portador como um conjugado, ou como um polímero pdipéptldlco, mas para facilidade de expressão, as várias concretizações dos pollpéptidos de acordo com este Invento são colectlvamente aqui designadas pelo termo "pollpéptldo", e suas várias formas gramaticais.

Como já notado, podem ser adicionados um ou mals resíduos de amlnoâcldo adicionais aos terminais amlno ou carboxl do pollpéptldo para auxiliar na ligação do pollpéptldo ao portador. Verificou -se que os resíduos de cistelna adicionados aos terminais amlno ou carboxl do pollpéptldo são partlcularmente úteis na formação de conjugados por melo de ligações dlssulfeto. Contudo, também podem ser utilizados outros processos bem conhecidos na arte para a preparação de conjugados. Processos de ligação adicionafe Πustratlvos Incluem a utilização de produtos da reacção de adição de Mlchael, dl-aldeldos tais como o glutaraldeldo, Kllpsteln e colab,, Jr..........Infect........D1s, , 14_7 , 318-326 (1983), e similares, ou a utilização de tecnologia da carbodl-Imlda tal como na utilização de uma carbodllmlda solúvel em água para formar ligações amlda ao portador. Para uma revisão do acoplamento ou conjugação proteica através de grupos funcionais

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -23- activados ver Aurameas e co 1 ab , , Scand .............J ,............Immunol . , Vol . 8, supl. 7:7-23 (1978) .

Portadores úteis são bem conhecidos na arte, e geralmente são, eles próprios, proteinas. Exemplos de tais portadores são a hemocianina de lapa (gen . Fissurella) (KLH ) , edesti na , tireoglobulina, albuminais tais como a albumina sérica bovina (BSA) ou a albumina sérica humana (HSA), glóbulos vermelhos tais como ©ritrócitos de carneiro (SRBC), toxóide do tétano, toxóide da cólera, assim como poliaminoãcidos tais como poli-(D-lisina; D-ácido glutâmicc), e similares. A escolha do portador é mais dependente do uso último do inóculo, e é baseada em critérios não par ti cu 1 armente compreendi dos no presente invento. Por exemplo, deve ser seleccionado um portador que não produza uma reação desagradável no animal particular a ser inoculado. 0 presente inóculo contém uma quantidade imunogénica e eficaz de um polipéptido de acordo com este invento, tipicamente como um conjugado ligado a um portador. A quantidade eficaz de polipéptido ou proteina por dose unitária depende, entre outras coisas, da espécie do animal inoculado, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, tal como é bem sabido na arte. Os inóculos contêm, tipicamente, concentrações de polipéptidos ou proteina de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), preferivelmente de cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose, 0 termo "dose unitária", no que concerne aos inóculos de acordo com o presente invento, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas corno dosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para produzir o efeito imunogénico desejado, em associação com o diluente requerido, isto é, protador ou veiculo. As especificações para a nova dose unitária de um inóculo de acordo com este invento são ditadas por e estão directamente dependentes (a) das caracterfsticas únicas do material activo e do efeito

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -24- imunológico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na arte da composição do referido material activo para uso imunológico em animais, tal como aqui descrito em detalhe, sendo estas caracterfsticas do presente invento.

Os inóculos são tipicamente preparados a partir do conjugado pol ipeptidico sólido seco, por dispersão do conjugado polipeptidico num diluente ou veiculo fisiologicamente tolerável (aceitável), tal como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa. Tais diluentes são bem conhecidos na arte e são discutidos, por exemplo, em Remington's Pharmeceutical__Sciences, 16^ Ed., Mack

Publishing Company, Easton, PA (1980) nas páginas 1465-1467. Os inóculos também podem incluir um adjuvante como parte do diluente- Adjuvantes tais como o adjuvante completo de Freund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFÂ) e o alúmen são materiais bem conhecidos na arte, e estão comercialmente disponiveis a partir de diversas fontes.

D. ANTICORPOS ANTI-PéPTIPO......POLICLONAIS.....E......MQNOCLONAIS

Um anticorpo de acordo com o presente invento imunorreage com um epitopo de uma subunidade alfa de integrina presente num dominio de epitopo definido por uma sequência de residuos de aminoácido correspondente àquela do polipéptido sujeito. Em concretizações preferidas, o epitopo reconhecido pelo anticorpo é um que pode ser formado (imitado imunologicamente) por um polipéptido sujeito tal como evidenciado pela capacidade do polipéptido para inibir competitivamente a ligação do anticorpo à subunidade alfa. A capacidade de um anticorpo sujeito para reconhecer uma porção de um dominio de epitopo definido por uma sequência de residuos de aminoácido correspondendo àquela de um polipéptido sujeito pode ser determinada por processos bem conhecidos na arte. 0 termo "anticorpo nas suas várias formas gramaticais é

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -25- aqul utilizado para designar moléculas de ImunoglobulIna e porções de moléculas de ImunoglobulIna 1muno!oglcamente actlvas, Isto é, moléculas que contêm um local de combinação do anticorpo ou paratopo. Exemplos de moléculas de anticorpo são moléculas de Imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancial-mente intactas, e aquelas porções de uma molécula de Imunoglobulina que contêm o paratopo, Incluindo aquelas porções conhecidas na arte como Fab, Fab1, F(ab'>2 e F(v).

Um "local de combinação do anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída pelas regiões variáveis e hipervariéveis das cadelas pesadas e leves que ligam especifIcamente (Imunorreagem com) o antlgénlo. 0 termo "Imunorreacção" nas suas várias fromas significa ligação entre uma molécula contendo uma determinante antlgénlca e uma molécula contendo um local de combinação do anticorpo, tal como uma molécula de anticorpo Inteira ou uma porção da mesma, "Determinante antlgénlca" refere-se à porção estrutural precisa do antlgénlo que é Imunologlcamente ligada a um local de combinação do anticorpo. 0 termo também é utilizado de forma Intercambiável com "epltopo".

1 * ANTICORPOS POLICLONAIS

Um anticorpo pollclonal sujeito é adlclonalmente caracterizado como não Imunorreaglndo com qualquer subunldade beta de Integrlna ou com um pol1pépt1do antlgénlco possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido idêntica a sequências na metade do terminal carboxi de uma subunldade alfa de integrina à qual corresponde a sequência de resíduos de aminoácido do polipéptido sujeito. Assim, por exemplo, um anticorpo pollclonal sujeito não imunorreage com um polipéptido cuja sequência é apresentada na Tabela 3. 71 .924 SCR0353P SCRF 192.1

26 TABELA 3 polipéptidos derivados da metade do terminal carboxi de uma subunidade alfa de integrina

Integrina Localização da Sequência de Aminoácidos Sequência dos Residuos de Aminoécido ΘΡ11 b 784-799 YELHNNGPGTVNGLHL VnR 810-825 YELRNNGPSSFSKAML VLA-2 946-960 LKVTT6SVPVSMATV VLÂ-4 775-791 TFHVINT8NSMAPNVSV VLA-5 830-845 YELINQGPSSISQGVL LFA-1 928-943 YQVRIQPSIHDHVIPT MaC-1 940-954 YQVSNLGQRSLPISL P150,95 936-950 YQVNNLGQRDLPVSI 1 As sequências de residuos de aminoécido e os números de posição dos residuos contidos nos polipéptidos registados são adoptados das referências citadas na nota de rodapé da Tabela 1.

Um anticorpo policlonal preferido de acordo com o presente invento imunorreage com um polipéptido sujeito, preferivelmente um polipéptido correspondendo na sequência de residuos de aminoécido a uma fórmula apresentada na Tabela 2.

Um anticorpo policlonal preferido é caracterizado por possuir a capacidade para imunorreagir com uma sufounidade alfa de integrina e, desse modo, inibir a capacidade da integrina para se ligar especificamente ao seu ligando por uma interacção com uma proteina contendo o ligando. Assim, um anticorpo policlonal sujeito é útil para inibir e, desse modo, modular, quer in vivo quer in vitro, a adesão de células que contêni a integrina com a qual imunorreage o anticorpo.

Numa concretização, um anticorpo policlonal preferido é

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -27” caracterlzado por possuir a capacidade para imunorreagir com a GPIIb e Inibir a capacidade da GPIIb para se ligar especlfieamente ao fIbrlnlgénlo.

Assim, um anticorpo pollclonal preferido, que Imunorreage com um pollpéptldo sujeito cuja sequência é derivada da região de ligação ao flbrlnogénlo da GPIIb, possui a capacidade para Inibir os acontecimentos mediados pelo complexo de 1Igando-recepfor flbr1nogénio-GPIlb-IIIa, tais como a adesão plaquetárla, a agregação plaquetárla e a formação de trombos.

Um anticorpo pollclonal de acordo com o presente Invento é tipicamente produzido por Imunização de um mamífero com um Inóculo do presente Invento, de preferência um Inóculo contendo um péptldo correspondendo a uma fórmula apresentada na Tabela 2 e Induzindo, desse modo, no mamífero moléculas de anticorpo possuindo a ImunoespeclfIddade pol1pept1d1ca apropriada. As moléculas de anticorpo são, então, recolhidas do mamífero e Isoladas até ao grau desejado por técnicas bem conhecidas, tais corno, por exemplo, por cromatografla de ImunoafInldade utilizando o pollpéptldo Imunlzante na fase sólida, 0 anticorpo pollclonal assim produzido pode ser utilizado, Inter alia, em sistemas e processos diagnósticos de acordo com o presente invento para distinguir células nucleadas ou plaquetas activadas e não activa-das, e em métodos terapêuticos com o fim de modular a adesão celular, tal como a inibição da adesão plaquetárla.

2. ANTICORPOS MQNOCLQNAIS

Um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento é caracterlzado por imunorreagir com um epitopo formado pela região de ligação ao ligando de uma subunidade alfa de integrina que é homóloga aos resíduos 290-320 da GPIIb, Preferivelmente, um anticorpo monoclonal sujeito é ainda caracterlzado por imunorreagir com um pollpéptldo sujeito, preferivelmente um polipéptido correspondendo a uma fórmula apresentada na Tabela 2.

Um anticorpo monoclonal preferido também é caracterlzado por

-28

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 possuir a capacidade de Inibir a ligação especifica de uma Integrlna ao seu ligando, tal como é descrito acima para os anticorpos pollclonals. Um anticorpo monoclonal preferido que Imunorreage com um pollpéptldo sujeito derivado da região de ligação ao flbrlnogénlo da GPIIb, tal como os pollpéptldos p1 ou p2é adie 1 ona 1 mente caracterlzado por possuir a aptidão de Inibir a capacidade da GPIIb para se ligar especlfIcamente ao flbrlnogénlo, e Inibir a adesão plaquetárla.

Assim, numa concretização, é abrangido um anticorpo monoclonal que compreende moléculas de anticorpo que Imunorreagem com a) GPIIb, e b) um pollpéptldo correspondendo à fórmula: AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM

Uma concretização relacionada abrange um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo monoclonal que Imunorreagem com a) um pollpéptldo possuindo uma sequência que corresponde à fórmula: TDVNGDGRHDL, AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM, AATDINGDDDYADLFIGAPLFM, CSVDVDKDTITDVLLVGAPMYM, CAVDLNADGFSDLLVGAPMQS, AATDVNGDGLDDLLVGAPLLM, CGVDVDGDGETELLLIGAPLFY, CSVDVDSNGSTDLVLIGAPHYY, ou CSVOVDTDGSTDLVLIGAPHYY; e b) a subunldade alfa de uma Integrlna à qual corresponde a sequência de resíduos de amlnoácldo do referido pollpéptldo, A frase "anticorpo monoclonal" nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que apenas contêm uma espécie de local de combinação do anticorpo capaz de Imunorreaglr com um antlgénlo particular. Assim, uma composição de anticorpo monoclonal exibe, tipicamente, uma única afinidade de ligação para qualquer antlgénlo com o qual

monoclonal pode, 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -29- imunorreaja. Uma composição de anticorpo portanto, conter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de locais de combinação do anticorpo, cada um imuno--espedfico para um antigénio diferente, por ex., um anticorpo monoclonal bl-especifico.

Um anticorpo monoclonal é tipicamente composto por anticorpos produzidos por clones de uma única célula denominados um hibridoma, que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada pela fusão de uma célula produtora de anticorpo e de uma linha celular de mleloma ou outra que se auto-perpetue. Tais anticorpos foram descritos, em primeiro lugar, por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975), cuja descrição é incorporada por referência.

3- PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL 0 presente invento abrange um processo de formação de um anticorpo monoclonal que (a) imunorreage com (a) um polipéptido sujeito, e .(b) a subunidade alfa de integrina à qual corresponde a sequência de resíduos de aminoácido. 0 processo compreende os passos de: (a) Imunização de um animal com uma subunidade alfa de integrina ou um polipéptido sujeito. Isto é tipicamente realizado pela administração de uma quantidade imunologicamente eficaz, isto é, uma quantidade suficiente para produzir uma resposta imunológica, do imunogénio a um mamífero imunologicamente competente. Preferivelmente, o mamífero é um roedor, tal como um coelho, uma ratazana ou um ratinho. 0 mamífero é então /mantido durante um período de tempo suficiente para que o mamífero produza células secretoras de moléculas de anticorpo que imunorreajam com o imunogénio. (b) De seguida é preparada uma suspensão de células produtoras de anticorpo removidas do animal imunizado. Isto é tipicamente realizado por remoção do baço do mamífero e separação mecânica das células esplénicas individuais num meio 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 "30- fisiologicamente tolerável utilizando processos arte.

J (c) As células produtoras de anticorpo tratadas com um agente transformador capaz de produzir uma linha de células transformada ("imortalizada"). Os agentes transformadores, e a sua utilização para produzir linhas de células imortalizadas, são bem conhecidos na arte, e incluem virus de ADN, tais como virus de Epstein Bar (EBV), virus Simio 40 (SV40), virus Polioma, e similares; virus de ARN, tais como virus da Leucemia Murina de Moloney (Mo-MuLV), virus do Sarcoma de Rous, e similares; células de mieloma, tais como P3X63" -Ag8.6S3, Sp2/0-Ag14, e similares.

Em concretizações preferidas, o tratamento com o agente transformador resulta na produção de um hibridoma por fusão das células esplénicas,em suspensão,com células de mieloma de ratinho de uma linha de células apropriada, pela utilização de um promotor de fusão adequado. A proporção preferida é de cerca de 5 células esplénicas por célula de mieloma numa suspensão contendo cerca de 10® esplenócitos.

J

bem conhecidos na em suspensão sao A linha de células utilizada deve, preferivelmente, ser do tipo denominado "resistente à droga", de modo que as células de mieloma não utilizadas não sobrevivam num meio selectivo, enquanto os hibridos sobreviverão. A classe mais comum é a linha de células resistente à 8-ozaguanina, a qual é desprovida do enzima hipoxantina guanina fosfo-ribos11 transferase e, por conseguinte, não será sustentada por meio de HAT (hipoxantina, aminopterina, e timidina). Também é geralmente preferido que a linha de células de mieloma utilizada seja do tipo denominado "rião secretor", visto que não produz, ela própria, qualquer anticorpo, embora possam ser utilizados tipos secretores. Em certos casos, contudo, podem ser preferidas linhas de mieloma secretoras. Enquanto o promotor de fusão preferido é o polietUeno glicol possuindo um peso molecular médio de cerca de 1 000 a cerca de 4 000 (comercialmente disponivel como PEG 1 000,

-31 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 etc.) podem ser empregues outros promotores de fusão conhecidos na arte. (d) As células transformadas são então cTonadas, preferivelmente até à monoclonalidade. A clonagem é preferivelmente executada num meio de cultura de tecidos que não sustente células não-transformadas. Quando as células transformadas são hibridomas, isto é tipicamente executado por diluição e cultura em recipientes separados, da mistura de células esplénicas não utilizadas, células de mieloma não utilizadas, e células fundidas (hibridomas) num meio selectivo, o qual não sustentará as células de mieloma não utilizadas durante um periodo de tempo suficiente para permitir a morte das células não utilizadas (cerca de uma semana). A diluição pode ser dum tipo limitante, na qual o volume de diluente é estatisticamente calculado para isolar um certo número de células (por sx. , 1-4) em cada recipiente separado (por ex., cada cavidade de uma placa de microtitulação). 0 meio é um (por ex., meio de HAT) que não sustentará a linha de células de mieloma não utilizada resistente à droga (por ex., resistente à 8-azaguanina), (e) Q meio de cultura de tecidos dos transformantes clonados é avaliado quanto â presença de moléculas de anticorpo segregadas que imunorreagem com o imunogénio e o seu polipéptido sujeito ou subunidade alfa de integrina correspondente. (f) Uma vez que um transformante desejado tenha sido identificado no passo (e), é seleccionado e cultivado num meio de cultura de tecidos adequado durante um periodo de tempo apropriado, seguido pela recuperação do anticorpo desejado a partir do sobrenadante da cultura. Q meio adequado e o periodo de tempo de.cultura apropriado são conhecidos ou são prontamente determinados.

Para produzir uma concentração muito maior de anticorpo monoclonal ligeiramente menos puro, o hibridoma desejado pode ser injectado em ratinhos, preferivelmente ratinhos singénicos ou semi-singénicos . 0 hibridoma causará a formação de tumores

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -32- produtores de anticorpo após um tempo de incubação adequado, o que resultará numa elevada concentração do anticorpo desejado (cerca de 5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e exsudado peritoneal (ascite) do ratinho hospedeiro.

Os meios dteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na arte e comercialmente disponíveis, e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos endógamos, e similares. Um meio sintético ilustrativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco [DMEM; Dulbecco e colab., Viro!. 8:396 (1959)], suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 mm de glutamina e 20% de soro de vitelo fetal. Uma estirpe de ratinho endógamo ilustrativo é a Balb/c.

Um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento também pode ser adicionalmente purificado por processos de cromatografia de imunoafinidade bem conhecidos, pela utilização na fase sólida de um polipéptido sujeito com o qual o anticorpo imunorreage.

Um anticorpo monoclonal produzido pelo processo anterior pode ser utilizado, por exemplo, em modalidades diagnósticas e terapêuticas onde é desejada a formação de um produto imunorreaccional de uma subunidade alfa de integrina. Produtos reaccionais ilustrativos incluem um produto imunorreaccional contendo GPIIb.

E, líIBRIDOMAS.....E_PR0ÇESS0OÍ......PREPARAÇÃO

Hibridomas de acordo com o presente invento são aqueles caracterizados por possuir a capacidade para produzir um anticorpo monoclonal sujeito.

Um hibridoma preferido de acordo com o presente invento é caracterizado por produzir moléculas de anticorpos que também imunorreagem com uma cita-adesina, preferivelmente a GPIIb.

Processos para produção de hibridomas que produzem, por ex., segregam, moléculas de anticorpo possuindo uma imuno-especifici-dade desejada, isto é, possuindo a capacidade para imunorreagir com uma proteína particular, e/ou um polipéptido, são bem

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 Ο <5 "**Ό 3 é a tecnologia de Natl, Acad. Sei, conhecidos na arte.. Particularmente aplicável hibridoma descrita por Niman e colab,, Proc, USA, 80:4949-4953 (1983), e por Galfre e colab., Meth...........Enzymol , 73:3-46 (1981), cujas descrições são aqui incorporadas por referência. Um processo ilustrativo par® produção de um anticorpo monoclonal foi descrito na descrição anterior.

F. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

Um polipéptido sujeito pode ser utilizado para modular a adesão in vivo de células expressando a subunidade alfa de integrina à qual corresponde o polipéptido.

Por exemplo, um polipéptido sujeito correspondendo à formula p1 ou p2, ou a ambas, pode ser utilizado numa composição farmaceuticamente aceitável que, quando administrada a um sujeito humano numa quantidade eficaz, é capaz de inibir a agregação das plaquetas. Acredita-se que essa inibição resulte numa taxa diminuída de formação de trombos. Assim, a administração in vivo de um polipéptido sujeito pode ser utilizada para modular qualquer resposta fisiológica iniciada pela adesão, tal como a coagulação e algumas respostas inflamatórias.

Noutra concretização as funções de adesão celular normais de uma célula portadora de uma integrina na sua superfície podem ser inibidas ou moduladas pela administração intravenosa de uma quantidade eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável, compreendendo um anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com este invento que imunorreage com a subunidade alfa da integrina na superfície da célula a ser inibida.

Numa concretização preferida, a agregação das plaquetas pode ser inibida pela administração intravenosa de uma quantidade-eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um anticorpo policlonal sujeito que imunorreage com um polipéptido correspondendo a uma porção da região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb, tál como um polipéptido de acordo com a fórmula p1 ou p2. 71 924

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Um processo preferido de modulação da adesão plaquetãria abrange a administração ma quantidade inibitória da agregação plaquetária de um anticorpo monoclonal sujeito que imunorreage com a região de ligação ao fibrinogénio (residuos 290-320) da GPÍIb. Mais preferivelmente, o anticorpo monoclonal utilizado num método terapêutico de inibição da agregação plaquetária é ainda caracterizado por imunorreagir com um polipéptido correspondendo à fórmula p1 ou p2.

Na medida em que os anticorpos policlonais ou monoclonais possam ser utilizados terapeuticamente para modular os acontecimentos mediados pela adesão celular, o presente invento também abrange a utilização de um polipéptido sujeito para neutralizar o efeito modulador dos anticorpos administrados terapeuticamente, por ex., como um antidoto para o anticorpo anti-poli-pépti do.

Numa forma de exercicio desta concretização, um reagente terapêutico contendo anticorpo anti-trombótico é primeiro administrado a um doente para modular a adesão celular, a agregação plaquetária ou a formação de trombos. Em seguida, após o inicio de uma complicação de sangramento, ou quando se torna desejável neutralizar os efeitos anti-trombóticos do anticorpo administrado, é administrada uma quantidade de um polipéptido sujeito que é eficaz para imunorreagir com o anticorpo administrado e, desse modo, neutralizar o efeito modulador do anticorpo, A escolha do polipéptido a ser administrado como um antidoto depende do anticorpo a ser neutralizado, e necessita que o polipéptido administrado possua a capacidade para imunorreagir com o anticorpo administrado- ^

As composições contendo a molécula de anticorpo ou o polipéptido administradas tomam a forma de soluções ou suspensões; contudo, os polipéptidos também podem tomar a forma de comprimidos, pilulas, cápsulas, formulações de libertação sustida., ... ou pós. Em qualquer caso, as composições contendo o

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 pollpéptldo contêm tipicamente cerca de 0,1 μΜ a cerca de 1,0 M d® pollpéptldo como Ingrediente actlvo, preferivelmente cerca de 1,0. μΜ a cerca de 10 milimolar (mM) , enquanto que as composições contendo a molécula de anticorpo contêm tipicamente cerca de 10 pg/ml a cerca de 20 mg/ml de anticorpo como Ingrediente activo, preferivelmente cerca de 1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml. A preparação de uma composição terapêutica que contém pollpéptldos ou moléculas dè anticorpo como ingredientes activos é bem compreendida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções liquidas quer como suspensões; contudo, também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em liquido antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é, muitas vezes, misturado com excipientes, os quais são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo, tal como são bem conhecidos. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol , e similares, e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampões do pH, os quais aumentam a eficácia do ingrediente activo.

Um pollpéptldo ou anticorpo pode ser formulado na composição terapêutica como formas de sal farmaceuticamente aceitável neutralizado. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da molécula de anticorpo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico e fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético, tartárico, mandélico, e similares. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimeti1amina, 2-etilamino - etanol, histidina, procalna, e similares.

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As composições terapêuticas contendo o polipéptido ou o anticorpo são convencionalrnente administradas intravenosamente, tal como, por exemplo, por injecção de uma dose unitária. 0 termo "dose unitária" quando utilizado em relação a uma composição terapêutica de acordo com o presente invento refere~se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para humanos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido, isto é, portador ou veiculo.

As composições são administradas duma forma compativel com a formulação da dosagem, e numa quantidade terapêuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sujeito para utilizar o ingrediente activo, e do grau desejado de inibição da ligação do ligando ao receptor. As quantidades precisas de ingrediente activo necessárias para. serem administradas dependem do critério do clinico, e são caracteristicas de cada indivíduo. Contudo, gamas de dosagem adequadas situam-se na ordem de um a vários miligramas de ingrediente activo por indivíduo por dia, e dependem da via de administração. Os regimes adequados para a administração inicial e as injecções de reforço também são variáveis, mas são exemplificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas, com intervalos de uma ou mais horas, por uma injscção ou outra administração subsequente, AI ternativamente, é abrangida a. infusão intravenosa continua suficiente para ' manter concentrações terapeuticamente eficazes no sangue. Para um polipéptido sujeito, concentrações sanguíneas terapeuticamente eficazes, situam-se na gama de cerca de 1,0 μΜ a cerca de 10 mM, preferivelmente de cerca de 50 μΜ a cerca de 1,0 mM. Concentrações sanguíneas terapeuticamente eficazes de moléculas de anticorpo de acordo com o presente invento situam-se na gama de cerca de 0,1 μΜ a cerca de 10 μΜ, preferivelmente 1,0 μΜ.

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β* SISTEMAS DIAGNÓSTICOS

Um sistema diagnóstico sob a forma de conjunto de acordo com o presente invento inclui, numa quantidade suficiente para, pelo menos, um ensaio, um polipéptido, um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento como um reagente embalado separadamente. As instruções para a utilização do reagente embalado também estão tipicamente incluídas.

As "Instruções para a utilização" incluem tipicamente uma expressão tangível descrevendo a concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do processo de ensaio tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a serem misturadas, período de tempo de manutenção para as misturas de reagente/amostra, temperatura, condições de tamponamento, e similares.

Numa concretização, um sistema diagnóstico para análise quanto á presença d© plaquetas activadas numa amostra de fluido vascular contendo plaquetas, tal como sangue ou plasma, compreende uma embalagem contendo um anticorpo policlonal sujeito que imunorreage com um polipéptido correspondendo è fórmula p1 ou p2. Noutra concretização, um sistema diagnóstico para análise quanto à presença de plaquetas activadas numa amostra de fuido vascular contendo plaquetas compreende uma embalagem contendo um anticorpo monoclonal sujeito que imunorreage com um epitopo formado pela região de ligação ao fibrinogénio (resíduos 290-320) da GPIIb, e preferivelmente também imunorreage com um polipéptido correspondendo à fórmula p1 ou p2. Um sistema diagnóstico também pode incluir um polipéptido sujeito onde o processo de ensaio a ser executado pelo sistema de diagnóstico utiliza um formato de imunorreacção competitiva. Mais preferidos são os conjuntos onde as moléculas de anticorpo do anticorpo policlonal ou monoclonal estão ligadas a um marcador.

Assim, em concretizações preferidas, um sistema diagnóstico de acordo com o presente invento ainda inclui um marcador ou meio indicador capaz de assinalar a formação de um complexo contendo as moléculas de anticorpo de um anticorpo policlonal ou

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -38- monoclonal de acordo com o presente Invento. A palavra "complexo" tal como aqui utilizada refere-se ao produto de uma reacção’ de ligação especifica, tal como uma reacção anticorpo-antigén1 o ou receptor-11gando. Complexos Ilustrativos são os produtos imunorreaccionais.

Tal como aqui utilizados, os termos "marcador" e "meio indicador" nas suas várias formas gramaticais referem-se a moléculas e átomos únicos que estio quer directa quer indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Marcadores ou meios indicadores "in vivo são aqueles úteis dentro do organismo de um sujeito humano, e incluem ^ ^ In, ^Tc, ®^6a, ^®®Re, e ^^1.

Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado a,ou incorporado, numa molécula de anticorpo, polipéptido ou proteína expressa, que faça parte de uma composição de anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com o presente invento, ou utilizado separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser utilizados sós ou em conj*unto com reagentes adicionais. Tais marcadores são, eles próprios, bem conhecidos na química de diagnóstico clinico e constituem uma parte deste invento apenas n® medida em que são utilizados com sistemas e/ou processos proteicos, quanto ao mais, novos. A ligação de marcadores, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas pela incorporação metabólica de aminoácidos contendo um radioisótopo fornecidos como um componente do meio de cultura. Ver, por exemplo, Qalfre e colab., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981), As técnicas de acoplamento ou conjugação proteica através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, e colab., Scand.________J._____Immunol . , Vol . 8 Supl . 7:7-23 ¢1978), Rodwell e colab., Biotech., 3:889-894 ¢1984), e Pat. dos E.U.A. nS 4 493 795. 0 sistema diagnóstico também pode incluir, preferivelmente

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 -39-numa embalagem separada, um agente de ligação especifico. Um "agente de ligação especifico" é uma entidade molecular capaz de ligar selectivamente uma espécie reagente de acordo com o presente invento, mas que não é, ela própria, um produto de expressão proteica, polipéptido, ou molécula de anticorpo de acordo com o presente invento. Agentes de ligação específicos ilustrativos são moléculas de anticorpo, proteínas do complemento, ou fragmentos das mesmas, proteína A, e similares. Preferivelmente, o agente de ligação especifico pode ligar-se à molécula de anticorpo ou polipéptido de acordo com este invento quando está presente como parte de um complexo.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação especifico está marcado. Contudo, quando o sistema diagnóstico inclui um agente de ligação especifico que não está marcado, o agente é tipicamente utilizado como um reagente ou meio amplificador. Nestas concretizações, o agente de ligação específico marcado é capaz de se ligar especificamente ao meio amplificador quando o meio amplificador está ligado a um complexo contendo a espécie reagente.

Os conjuntos diagnósticos de acordo com o presente invento podem ser utilizados num formato de "ELISA" para detectar a presença ou a quantidade de plaquetas ligadas ao fibrinogénio numa amostra de fluido corporal, tal como soro, plasma ou urina. "ELISA" refere-se a um ensaio imunossorção com enzima ligado que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado de enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar ou quantificar a quantidade de um antigénio ou anticorpo presente na amostra. Pode encontrar-se uma descrição da técnica do "ELISA" no Capítulo 22 da 4ã Edição de Basic and Clinicai Immunology por Sites, D.P., e colab., publicado por Lange Hedical publications de Los Altos, CA em 1982, e nas Patentes dos EJJ.A. N2 3 654 090; N2 3 850 752; e N2 4 016 043, os quais são todos aqui incorporados por referência. a molécula de

Assim, em concretizações preferidas,

40- 71 924 SCR0353P SCRP 192.1 anticorpo, polipéptido ou proteína expressa de acordo com o presente invento pode ser afixada a uma matriz sólida para formar um suporte sólido que é embalado separadamente nos sistemas diagnósticos sujeitos. 0 reagente é tipicamente afixado è matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, embora outros modos de afixação, bem conhecidos pelos especialistas na arte, possam ser uti11zados.

Matrizes sólidas Citeis são bem conhecidas na arte. Tais materiais incluem dextrano reticulado, disponivel sob a marca registada SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, MJ); agarose; pérolas de polistireno de cerca de 1 micron a cerca de 5 milfmetros de diâmetro, disponfveis de Abbott Laboratories de North Chicago, IL;bandas. baseadas em poli ( c1oreto* de. viniloj polistireno, poliacri1amida reticulada, nitroceiulose ou nylon, tais como folhas, tiras ou blocos.ou tubos, placas ou as cavidades de uma placa de microtitu 1 ação, tais como aqueles feitos de polistireno ou poli(cloreto de vinil©). A espécie . reagente, agente de ligação específico marcado ou reagente amplificador de qualquer sistema diagnóstico aqui descrito podem ser fornecidos em solução, como uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex., sob a forma liofilizada. Onde o meio indicador é um enzina, o substrato do enzima também pode ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Também podem ser incluídos um suporte sólido, tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita, e um ou mais tampões, como elementos embalados separadamente neste sistema de ensaio diagnóstico.

As embalagens aqui discutidas em relação aos sistemas diagnósticos são aquelas habitualmente utilizadas nos sistemas diagnósticos. Tais embalagens incluem garrafas e frascos de vidro ou plástico (por ex., polietileno, polipropi1eno e policarbonato), invólucros de plástico ou laminados de folha plástica, e similares.

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Η. PROCESSOS DE ENSAIO O presente invento abrange qualquer processo que resulte na detecção d© uma subunidade alfa de integrina, e particularmente da 6PIIb, por produção de um complexo contendo uma molécula de anticorpo contida num anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento. Os especialistas na arte compreenderão que existem numerosos processos quimicos de diagnóstico clinico bem conhecidos que podem ser utilizados para formar esses complexos. Podem ser empregues vários protocolos de ensaio heterogéneos e homogéneos, quer competitivos quer não-competitivos, para detecção da presença de uma subunidade alfa de integrina numa amostra corporal. Assim, enquanto processos de ensaio ilustrativos são aqui descritos, o invento não está limitado desse modo.

Por exemplo, são misturadas uma amostra de sangue [.conservada pela heparina (não coagulada) e moléculas de anticorpo marcadas com ^5 j, A mistura imunorreacional assim formada é mantida sob condições de ensaio imunológicõv- durante um periodo de tempo suficiente para que qualquer plaqueta activada imunorreaja com os anticorpos marcados e forme um produto imunorreaccional marcado. Os produtos imunorreaccionais marcados são então separados dos anticorpos marcados não reagidos, tipicamente por centrifugação suficiente para sedimentar todas as plaquetas presentes na amostra. A quantidade de produto imunorreaccional marcado formado é então analisada.

As condições de ensaio imunológic-o. c são aquelas que mantêm a actividade imunológica das moléculas de anticorpo contidas num anticorpo policlonal ou monoclonal de acordo com este invento e as supostas moléculas de integrina analisadas. Essas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4oC a cerca de 45°C, preferivelmente de cerca de 37°C, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, preferivelmente de cerca de 7, e uma força lónica variando desde aquela da água destilada até aquela de cerca de um molar de cloreto de sódio, preferivelmente

42- 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 aproxlmadamente aquela da solução salina fisiológica. Os processos para optimizar tais condições são bem conhecidos na arte.

I· SEGMENTOS DE AON

Em organismos vivos, a sequência de residuos de aminoácido de uma proteina ou polipéptidoBatá directamente relacionada, por meio do código genéticqÇDm-.a sequência de ácido desoxirribonucleico (ADN) do gene estrutural que codifica a proteina. Assim, um gene estrutural pode ser definido em termos da sequência de residuos de aminoácido, isto é, proteina ou pol ipéptidof .qus codifica.

Uma caracteristica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância. Isto é, para a maior parte dos aminoácidos utilizados para produzir as proteinas, mais do que um tripleto de nucleótidos de codificação (codão) pode codificar ou designar um resíduo de aminoácido particular. Consequentemente, um certo número de sequências de nucleótidos diferentes podem codificar uma sequência de residuos de aminoácido particular, Tais sequências de nucleótidos são consideradas funcionalmente equivalentes dado que elas podem resultar na produção da mesma sequência de residuos de aminoácido em todos os organismos. Ocasionalmente, uma variante metilada duma purina ou pirimidina pode ser incorporada numa dada sequência de nucleótidos. Contudo, tais metilações não afetam, de maneira alguma, a relação de codificação.

Um segmento de ADN de acordo com o presente invento compreende não mais do que cerca de 2 000 pares de bases nucleotidicas e inclui um gene estrutural que codifica um polipéptido sujeito contendo uma sequência de residuos de aminoácido de uma subunidade alfa de integrina homóloga à sequência de GPIIb localizada entre os residuos 290-320, tal como representado na Figura 1.

Um segmento de ADN preferido de acordo com o presente

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -43- invento inclui uma sequência de ADN que codifica uma sequência de residuos de aminoácido correspondendo a, © preferivelmente idêntica, à sequência representada por um polipéptido possuindo uma fórmula apresentada na Tabela 2. Preferivelmente, a sequência de ADN está presente como uma série linear e ininterrupta de codões, onde cada codão codifica um residuo de aminoácido encontrado nas sequências de residuos de aminoácido anteriormente descritas, isto é, a sequência de ADN não contém in troes

Assim, um segmento de ADN preferido c o n s t i t u i d o essencialmente pela sequência de nucleótidos representada na Figura 1, desde cerca da base 980 até cerca da base 1012, constitui uma concretização do presente invento.

Um segmento de ADN de acordo com o presente invento pode ser facilmente sintetizado por técnicas qutmicas, por exemplo, o método do fosfotriéster de Matteucci e colab., J. Am.. Chem. Soe., 103:3185 (1981). Evidentemente, por sintese qutmica da sequência de codificação, qualquer modificação desejada pode ser feita simplesmente por substituição daquelas bases codificando a sequência de residuos de aminoácido nativa pelas bases apropriadas. Contudo, são preferidas as moléculas de ADN incluindo sequências exactamente homólogas àquelas representadas na Figura 1 .

As moléculas de ADN de acordo com o presente invento possuem tipicamente terminais coesivos, isto é, porções de cadeia simples "salientes" que -se estendem para além da porção de cadeia dupla da molécula. É preferida a presença de terminais coesivos nas moléculas de ADN de acordo com o presente invento.,

Também estão abrangidos pelo presente invento os equivalentes de ácido ribonucleico (ARN) dos segmentos de ADN anteriormente descritos.

J- MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE

Uma molécula de ADN recombinante de acordo com o presente

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 —44~ invento pode ser produzida por ligação operativa de um vector a um segmento de ADN de acordo com o presente invento,, preferivelmente um segmento de ADN codificando um polipéptido sujeito correspondendo a uma fórmula apresentada na Tabela 2.

Tal como aqui utilizado, o termo "vector" refere-se a uma molécula de ADN capaz de replicação autónoma numa célula e à qual um outro segmento de ADN pode ser operativamente ligado de modo a ocasionar a replicação do segmento fixado. Os vectores capazes de dirigirem a expressão de genes codificando proteínas possuindo sequências de resíduos de aminoácido relacionadas com a GPIIb são aqui designadas como "vectores de expressão". Assim, uma molécula de ADN recombinante (ADNr) é uma molécula de ADN híbrida compreendendo pelo menos duas sequências de nucleótidos que normalmente não são encontradas em conjunto na natureza. A escolha do vector ao qual um segmento de ADN de acordo com o presente/ esrfci °operativamente ligado depende directamente, tal como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas, por ex., expressão proteica, e da célula hospedeira a ser transformada, estas sendo limitações inerentes na arte de construção de moléculas de ADN recombinantss. Contudo, um vector abrangido pelo presente invento é, pelo menos, capaz de dirigir a replicação, e preferivelmente também a expressão, do gene que codifica um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido relacionada com uma subunidade alfa d® integrina incluida nos segmentos de ADN aos quais está operativamente 1igada.

Em concretizações preferidas, um vector abrangido pelo presente invento inclui um replicão procariota, isto é, uma sequência de ADN possuindo a capacidade para dirigir a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante extracro-mossomicamente numa célula hospedeira procariota, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com o mesmo. Os referidos replicões são bem conhecidos na arte.. Além disso, essas concretizações que incluem um replicão procariota também

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -45- incluem ura gene cuja expressão confere resistência à droga a um hospedeiro bacteriano transformado com o mesmo. Os genes de resistência à droga bacterianos típicos são aqueles que conferem resistência è ampicilina ou tetraciclina.

Esses vectores que incluem um replicio procariota também podem incluir um promotor procariota capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) do gene que codifica uma sequência de resíduos de aminoácido relacionada com a ΘΡIIb numa célula hospedeira bacteriana, tal como E.Col1, transformada com o mesmo. IJm promotor é um elemento de controlo da expressão formado por uma sequência de AON que permite a ligação da ARN polimerase e que a transcrição ocorra. As sequências de promotor compatíveis com os hospedeiros bacterianos são tipicamente fornecidas em vectores plasmldicos contendo sítios de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN de acordo com o presente invento. Exemplos dos referidos plasmidios vectores são pUC8, pUC9, p8R322 e pBR329 disponíveis de Bio-Rad Laboratories, (Richemond, CA), e pPL e pKK223 disponíveis de Pharmacia, Piscataway, MJ.

Também podem ser utilizados vectores de expressão compatíveis com células eucariotas, prefer1velmente aqueles compatíveis com células de vertebrados, para formar as moléculas de ADN recombinante de acordo com o presente invento. Os vectores de expressão de células eucariotas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis a partir de diversas fontes comerciais. Tipicamente, os referidos vectores são fornecidos contendo sítios de restrição convenientes para a inserção do segmento de ADN desejado. Exemplos dos referidos vectores são pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) e pTDT1 (ATCC, #31255).

Em concretizações preferidas, os vectores de expressão de células eucariotas utilizados na construção das moléculas de ADN recombinante de acordo com o presente invento incluem um marcador de selecção que é eficaz numa célula eucariota, preferivelmente

um marcador de selecção de resistência à droga. Um marcador de resistência à droga preferido é o gene cuja expressão resulta na resistência á neomicina, isto é, o gene da neomicina--fosfotransferase (neo). Southern e colab., J.Mol.Appl. Genet., 1:327-341 (1982).

Também é abrangida a utilização de vetores de expressão retrovirais para formar os ADNr de acordo com o presente invento. Tal como aqui utilizado, o termo "yector de expressão retroviral" refere-se a uma molécula de ADN que inclui uma sequência promotora derivada da região de repetição terminal longa (LTR) de um genoma de retrovirus.

Em concretizações preferidas, o vector de expressão é tipicamente um vector de expressão retroviral, que é preferivelmente incompetente para a replicação em células eucariotas. A construção e utilização de vectores retrovirais foi descrita por Sorge e colab., Mol.______Cel 1._____Biol, , 4:1730-37 (1984).

Foi desenvolvida uma variedade de processos para ligar operativamente o ADN a vectores por meio de terminais coesivos complementares. Por exemplo, podem ser adicionados trechos . de homopolimeros complementares ao segmento de ADN a ser inserido e ao ADN do vector. 0 vector e o segmento de ADN são então unidos por pontes de hidrogénio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de ADN recombinante.

Os ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição fornecem um processo alternativo de união do segmento de ADN. a vectores. Um segmento de ADN possuindo terminais coesivos é tratado com ADN. polimerase de bacteriófago T4 ou ADN, polimerase I de E.Co1i, enzimas que renovem os terminais de cadeia simples 3' salientes com as suas actividades éxonuc1eotidicas 3'-5', e preenchem as extremidades 3' reentrantes com as suas actividades de polimerização. A combinação destas actividades produz, consequentemente, segmentos de ADN de extremidades rombas. Os segmentos de extremidades^rsmbas f f

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -47- de moléculas de de catalisar a são então incubados com um grande excesso molar ligador em presença de um enzima que é capaz ligação das moléculas de AON de extremidades iromhaar· . tal como a ADN ligersede bacteriófago T4. Assim, os produtos da reacção são segmentos de AON portadores de sequências ligadoras poliméricas nas suas extremidades. Estes segmentos de ADN são, de seguida, clivados com o enzima de restrição apropriado e ligados a um vector de expressão que foi clivado com um enzima que produz terminais compatíveis com aqueles do segmento de ADN.

Os ligadores sintéticos contendo uma variedade de sítios de restrição de endonuclease estão comercial mente disponíveis a partir de um certo ndmero de fontes, Incluindo International Biotechnologies, Inc., New Haven, CN.

Também estio abrangidos pelo presente invento os equivalentes de ARN das moléculas de ADN recombinante anteriot— mente descritas.

K.. CÉLULAS......TRANSFORMADAS......E CULTURAS 0 presente invento também se refere a uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ADN recombinante de acordo com o presente invento. A célula hospedeira pode ser quer procariota quer eucariota. As células baeterianas são células hospedeiras procariotas preferidas, © tipicamente são uma estirpe de E.coli tal como, por exemplo, a estirpe DH5 de E.coli )disponfve1 a partir de Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD. As células hospedeiras eucariotas preferidas incluem células de levedura e de mamifero, preferivelmente células de vertebrados, tais como aquelas de uma linha de células fibroblásticas humanas, de macaco, de ratazana ou de ratinho. As células hospedeiras eucariotas preferidas incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO) disponíveis a partir da ATCC como CCL61 e células de embrião de ratinho Suiço ΝΪΗ/3Τ3 disponíveis a partir da ATCC como CRL 1658. A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 molécula de AON recombinante de acordo com o presente invento é executada por processos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector utilizado. Em relação è transformação de células hospedeiras procariotas ver, por exemplo, Cohen e colab., Proc.. Matl . Acad. Sei. USA, 69:21 10 (1972); e Maniatis e colab,,

Molecular........Cloning, A. Laboratorv Ma.naal, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982), Em relação à transformação de células de vertebrados com vectores retrovirais contendo ADNr ver, por exemplo, Sorge e colab,, Mol. Cel1. Biol., 4:1730-37 (1984); Sraham e colab., Virol., 52:456 (1973); e Wigler e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:1373-76 (1979).

As células transformadas com sucesso, isto é, células que contêm uma molécula de ADN recombinante de acordo com o presente invento, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução de um ADNr de acordo com o presente invento podem ser clonadas para produzir colónias monoclonais. As células dessas colónias podem ser recolhidas, lisadas, e o seu conteúdo em ADN examinado quanto à presença do ADNr utilizando um processo tal como aquele descrito por Southern, J .. Μ o 3.1 o1.., 98:503 (1975) ou Berent e colab.,

Biotech., 3:208 (1985).

Além do ensaio directo quanto à presença do ADNr, a transformação bem sucedida pode ser confirmada por processos imunológicos bem conhecidos quando o ADNr é capaz de dirigir a expressão de um polipáptido sujeito. Por exemplo, as células transformadas com sucesso com um ADNr sujeito contendo um vector de expressão produzem um polipéptido exibindo uma antigenicidade caracteristica. Amostras de um cultura contendo células suspeitas de estarem transformadas são recolhidas e analisadas quanto a um polipéptido sujeito, utilizando anticorpos específicos para esse antigénio polipeptfdico, tais como aqueles produzidos por um hibridoma de acordo com o presente invento.

Assim, além das próprias células hospedeiras transformadas, o presente invento também abrange uma cultura dessas células,

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -49 preferivelmente uma cultura monoclonal (clonalmente homogénea), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, num meio nutriente. Preferivelmente, a cultura também contém uma proteína exibindo antigenicidade de uma subunidade beta de integrina.

Os meios nutrientes úteis para a cultura das células hospedeiras transformadas são bem conhecidos na arte e podem ser obtidos a partir de diversas fontes comerciais. Em concretizações onde as células hospedeiras são de mamífero, é preferivelmente utilizado um meio "isento de soro".

L. PROCESSOS......PARA......A.....PRODUÇÃO DE UM......POLIPÉPTIDO......SUJEITO

Um outro aspecto do presente invento refere-se a um processo para a produção de um polipéptido sujeito útil para dar origem a anticorpos, os quais podem ser utilizados nos processos e sistemas diagnósticos de acordo com o presente invento. 0 presente invento impõe a iniciação de uma cultura compreendendo um meio nutriente contendo células hospedeiras transformadas com uma molécula de ADN recombinante de acordo com o presente invento que é capaz de expressar um gene que codifica um polipéptido sujeito, preferivelmente um polipéptido correspondendo a uma fórmula apresentada na Tabela 2. A cultura é mantida durante um período de tempo suficiente para que as células transformadas expressem o polipéptido sujeito. 0 polipéptido expresso é então recuperado da cultura.

Os processos para a recuperação de um polipéptido expresso a partir de uma cultura sio bem conhecidos na arte, e incluem o fraccionamento da porção da cultura contendo o polipéptido utilizando técnicas bioquímicas bem conhecidas. Por exemplo, os processos de filtração em gel, cromatografia em gel, ultra-filtração, electroforese, permuta iónica, cromatografia de afinidade, e similares, tal como são conhecidos para os fraccionamento® proteicos, podem ser utilizados para isolar as proteínas expressas encontradas na cultura. · Além disso, processos imunoquímicof, tais como a 1 muno-afinidade,

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -50- imunoabsorçáo, e similares, podem ser executados utilizando processos bem conhecidos.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não a limitar, o presente invento. 1· Identif1 cação.......de........uma Região de Ligação ao Ligando numa

Integrina A reticulação química foi amplamente utilizada para estudar as interacções de ligandos contendo RGD com a GPIIb-IIIa. B e η n e f t e c o 1 a b , , J _Biol ._________Chem. , 257:8049 (1982), Ma is recentemente, as abordagens de reticulação foram utilizadas para examinar a interacção de péptidos RGD pequenos de seis a catorze aminoácidos com a GPIIb-IIIa como um meio de caracterização da topografia do sitio de reconhecimento de RGD. Santero e colab., Ce]1, 48:867 (1987) e D'Souza e colab,, J. Biol, Chem., 263:3943 (1988). Estes estudos mostraram que a activação plaquetária com um agonista, um acontecimento necessário para a ligação de proteínas adesivas, tais como o fibrinogénio e a fibronectina, è GPIIb-IIIa, aumenta de forma marcada e 'selectiva a reticulação dos péptidos com RGD ã GPIIa, a subunidade beta da integrina GPIIb-IIIa. 0 presente estudo define um sitio distinto dentro da GPIIb com o qual um pequeno péptido derivado do fibrinogénio pode ser reticulado quimicamente. Acredita-se que esse sitio defina um sitio funcional geral para a ligação do ligando à subunidade alfa de integrina, e é aqui designado como a região de ligação ao ligando na subunidade alfa de integrina. A sequência de resíduos de aminoácido desta região está relativamente conservada entre os membros da família das integrinas (Tabela 1) indicando que ela desempenha um papel critico na função desta família .·. de receptores de adesão. A. Preparação do Péptido de Fibrinogénio 0 péptido utilizado neste estudo, designado K16 e derivado

71 924 SCRQ353P SCRF 192.-1 cia cadeia gama do fibrinogénio, possui a sequência de resíduos cie aminoácido KYGGHHLGGAKQA6DV. Este péptido foi planeado para conter um resíduo de lisina (K) para facilitar a reticulaçao, e urn resíduo de tirosina (Y) para fornecer um sítio para radio-iodação. 0 K16 foi preparado por síntese em fase sólida num sintetizador peptídico de modelo 430 de Applied Biosystems (Foster City, CA), utilizando resinas de peptidil-glicina-mono--oxigenase α-amidante e t-Boc aminoácidos adquiridos de Applied Biosystems, 0 péptido foi analisado quanto à homogeneidade por cromatografia líquida de elevado rendimento utilizando uma coluna C18|,x Bondapak com um gradiente linear de 0-60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%, e verificou-se ser >85% homogéneo. A composição de aminoácidos do péptido foi determinada após um período de cerca de 24 horas,estando os hidrolisados em HC1 6 N, e os resultados foram consistentes com os rendimentos teóricos. Antes da utilização, os péptidos foram dissolvidos em solução salina tarnponada com fosfato (PBS) , e o pH foi ajustado para 7,2. Os outros polipéptidos aqui descritos também foram preparados pelo processo anterior, 0 K16 foi radioiodado por um processo de lactoperoxidase- glucose-oxidase modificado (ver Lam © colab., J............Biol ............Chem., 262:947-950 (1987)). Resumidamente, glucose (40 ^ig em 80 μΐ de fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,4), Na^^I isento de portador (15 miliCurie) e reagente de Erizymohead (BioRad, Richmond, CA), foram adicionados a 10 mg dos péptidos K1S, e a reacção foi levada a cabo de acordo com as instruções do fabricante de Enzymobead.. Em seguida, o péptido iodado foi separado dos outros reagentes por filtração em gel numa coluna Bio-Gel P-2. As condições para s radio-iodaçSo foram s e1e c c io n a d a s para minimizar a heterogeneidade do ligando e, utilizando este protocolo, >80% do péptido iodado encontra-se na forma monoiodotirosinada, A concentração do péptido marcado foi determinada por absorvãncia a 280 nm, utilizando coeficientes de extinção derivados das composições de aminoácidos. A actividade específica do péptido foi de cerca de 5-8 mCi/mg.

71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 “52- B. Preparaçao d e JP1 acjuetas e Reticulação Qutmica do Pépti- do K16 com. Sítios Distintos na GPIIb,

As plaquetas foram isoladas a partir de sangue humano fresco recolhido para ác1 do/c1trato/dextrose por centrifugação diferencial seguida por filtração em gel em Sepharose 2B em tampão de Tyrode isento de iões divalentes, pH 7,3, contendo 0,1% de albumina sérica bovina.. Ver, Marguerie e colab, , Jn...........Biol ,

Chem., 225:154-161 (1980). A ligação das plaquetas ao K16 seguiu os protocolos pre-viamente descritos para medição das interacções plaquetárias com proteinas adesivas e com este e outros péptidos. Ver, Ginsberg e colab., J_.........Biol . Chem. , 260:3931-3936 (1985); Lam e colab., Fed.

Proc. Fed, Am.._________Soe,..........Exp.......Biol, , 44:1126 (1985); e Marguerie e colab., acima. Resumidamente; as plaquetas foram suspensas a 4 x 10^/ml em tampão de albumina de Tyrode isento de iões divalentes, A não ser se especificado de outro modo, foi adicionado Ca* até uma concentração final de 1 mH. 0 estimulo plaquetário utilizado foi 0,5 unidades/ml de alfa-trombina. Em ensaios nos quais o fibrinogénio e a trombina estavam presentes, foi adicionada D--feni1 alam'1-L-prolil-arginina cetona 30 nM (Calbiochem, La Jolla, CA) à suspensão plaquetária 5 minutos após a adição da trombina ·© 5 minutos antes da adição do fibrinogénio. 0 péptido radiomarcado foi então adicionado a 6 x 108 células/ml de plaquetas estimuladas ou não estimuladas numa concentração de 30 μΜ, a a ligação prosseguiu durante 45 rnin a 22°C. 0 agente reticulante seleccionado foi então adicionado. 0 agente reticulante utilizado neste estudo, o suberato de bis(sulfossuc-

O cinimidilo) (BS^) , adquirido de Pierce Chemical Co., foi dissolvido em PBS imediatamente antes da utilização, e misturado com as plaquetas até uma concentração final de 0,2 mM, As reacções de reticulação foram concluidas após 10 min a 22°C pela adição de Tris 10 mM, pH 7,0. 0 ligando à célula foi recuperado por centrifugação através de sacarose a 20%, e as células foram extratdas em PBS contendo

-53

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 1% de Monidet P40 e N-etilmaleimida 10 mM (Sigma). As proteinas extraidas foram precipitadas com ácido tricloroacético a 10%, e a pelota obtida após centrifugação foi lavada três vezes com etanol a 85% frio. As amostras reticuladas foram analisadas por el ectroforese (SDS-PA6E) em geles de lâminas verticais de poliacrilamida no sistema tampão de Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970), Para a redução da ligação dissulfeto, as amostras foram tratadas com 2-mercaptoetanol a 5%. Os geles foram secos, e os auto-radiogramas foram ' rev-elãdos com filmes Kodak X-Omat AR. Os pesos moleculares foram calculados com base na mobilidade electroforética relativamente aos padrões obtidos de Diversified Biotech (HA). C .. Processos de Imuno-Mancha

As amostras reticuladas foram imunoprecipitadas utilizando um anticorpo monoclonal designado PMI-1, o qual reconhece a cadeia pesada de GPIÍb. Loftus e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7114 (1987), Os precipitados de ácido lavados, obtidos a partir das amostras reticuladas como anteriormente descrito, foram dissolvidos em 250 μΐ de tampão de imunoprecipitação (IPB), o qual continha NaCl 0,15 M, EDTA 0,01 M, benzamidina-HCl 10 mM, inibidor da tripsina do feijão de soja (10 pg/ml), fluoreto de fenilmetano-sulfoni1 o 0,2 mM, Triton X-100 a 1% (v/v), 0,05% de Tween 20, 0,02% de NaN^, e Trasylol (5 unidades/ml) em Tris-HCl 0,02 M, pH 7,4., verificou-E3 que o IPB dissociava o complexo de GPIIb-IIIa. As amostras foram pré-clarificadas pela adição de 15 μΐ de soro de coelho normal inactivado pelo calor, seguido por reagente de protefna A (Pansorbin, Behring Diagnostics). Os lisados clarificados foram então suplementados com 1% de albumina sérica bovina e 150 μΐ de IPB contendo 10 μΐ do anticorpo monoclonal anterior. As amostras foram incubadas durante toda a noite a 4°C e, em seguida, foi adicionado Pansorbin. Após 1 h a 22°C, as amostras foram centrifugadas, e os imunoprecipitados recuperados foram lavados três vezes por centrifugação em IPB. Os precipitados foram solubi1izados pelo calor durante 3 minutos a 100°C em tampão de amostra de Laemmli e, em seguida, submetidos

54 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 a SDS-PAGE como anteriormente descrito. Para imuno-mancha, as amostras proteicas foram resolvidas em SDS-PAGE como indicado acima. Após a electroforese, as .proteinas resolvidas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivini1ideno (PVDF). Os transferidos foram sondados com o anticorpo monoclonal anti-GP11 b , PMI-1 , ou com um anti-soro de coelho suscitado por um péptido possuindo uma sequência correspondendo às cadeias pesada ou leve da GPIIb. Loftus e colab, J...........Blol .

Chern..... 263s 1 1 025 — 28 (1988). Os anticorpos ligados foram detectados utilizando IgG anti-ratinho ou anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano picante (Bio-Rad) e 4-cloro-1-naftol como substrato. Ί o c A Figura 2A representa um auto-radi ograma de 1 ^° I —)< 1 6 reticulado com plaquetas estimuladas com trombina de acordo com os processos anteriores. A radioactividade migrou como uma banda principal única com uma mobilidade electroforética idêntica à GPIIb. A radioactividade minima foi detectada na posição da 6P11 Ia - Um excesso de 50 vezes de K16 não marcado aboliu a reticulação do péptido radiomarcado com as células (painel A, faixa d® direita), fornecendo uma indicação inicial da especificidade. Foi 'j/.erifiçada. . que a banda radioactiva principal era GPIIb autêntico, pela sua imunoprecipitação com um anticorpo monoclonal para a GPIIb (Figura 2B) . Shadle e colab, J. Cel1. Biol., 99:2056-60 (1984). Este anticorpo, PMI-1, imuno-precip i tou a banda de radioactividade principal dentro do extracto plaquetério, enquanto numerosos anticorpos de controlo, incluindo um monoclonal da mesma subclasse para outra proteina plaquetério, foram incapazes de imunoprecipitar a banda radioactiva. No decurso de numerosas experiências de reticulação, verifica-se que quantidades variáveis de material radioactivo se acumulavam no cimo dos geles. A experiência de imunoprecipitação representada na Figura 2B indica que pelo menos uma porção da radioactividade de elevado peso molecular continha o antigénio de GPIIb, A activação das plaquetas afectou de forma marcante a

71 924 SCRG353P SCRF 192.1 ~55~ ADP, PMA e com a GPIIb, reticulação do *^®I~K16 com a GPIIb (Figura 2C) . trombina todos eles aumentaram a reticulação do K16 relativamente àquele observado com plaquetas não estimuladas. 0 incremento mais pronunciado da retlculação do K16 foi observado com a trombina como:: estimulo plaquetário. Relativamente às plaquetas não-estimuladas, a estimulação com a trombina aumentou a reticulação do K16 com a GPIIb em 12 vezes (4 experiências). 0 aumento da reticulação foi devido a um aumento na ligação do K16 às células estimuladas, assim como a um aumento na eficiência da reacção de reticulação, A reticulação incrementada- do péptido com a GPIIb em plaquetas estimuladas também foi observado com dois reagentes de reticulação adicionais, 3,3'-ditiOí-bis-(propio-nato de su 1 f ossucci n i mi d'i 1 o) e ditio^bis- (propionat© de suceinimidilo).

Com os dados anteriores fornecendo um indicio claro quanto à reticulação especifica do péptido K16 com um sitio pertinente, a localização do sitio dentro da subunidade de GPIIb foi determinada pelos processos seguintes. 0 passo inicial foi efectuado para determinar se o ^®I-K16 se associou com a cadeia pesada ou leve da GPIIb, 0 ”*^®I-K16 foi reticulado com as plaquetas estimuladas com trombina. As bandas radioactivas dos complexos de GPIIb:K16 foram excisadas dos geles processados sob condições não redutoras, extraidas, e reprocessadas em geles sob condições redutoras. As amostras foram então transferidas do gel para uma membrana de PVDF, e sondadas por imunomancha com os anticorpos ou submetidas a auto-radiografia. Foram utilizados dois anticorpos anti-péptido anteriormente descritos para a imuno-mancha: anticorpos desenvolvidos pela sequência peptidica de 17 aminoácidos localizada no terminal carboxi da cadeia pesada de GPIIb (anti~V43), e anticorpos desenvolvidos pela sequência peptidica de 13 aminoácidos localizado no terminal amino da cadeia leve de GPIIb (anti~V41). Loftus e colab., J_...........Biol .

Chem., 263:11025-28 (1988), As imunomanchas desenvolvidas com estes dois anticorpos (Figura 3) indicaram claramente que, após a reticulação com o Kl6, a GPIIb ainda podia ser reduzida nos seus

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -56- constituintes d© cadeia pesada e leve. 0 auto-radiograma da amostra indicou que toda a radioactividad© detectável migrava na posição da cadeia pesada. Quando as regiões dos geles contendo as cadeias leve e pesada foram excisadas do gel e contadas, <2% da radioactividad© encontrava-se na posição da cadeia leve e 98% na posição da cadeia pesada. Quando o extracto de GPIIb:K16 foi processado num segundo gel, mas sob condições não-redutoras, a intensidade da banda de radioactividad© foi semelhante àquela observada na cadeia pesada de GPIIb sob condições redutoras (ver Figura 3), fornecendo um controlo para a recuperação da radioactividade no segundo gel. Quando o segundo gel apresentava uma concentração de acrilamida mais baixa (7,5%), foram claramente discerniveis as diferenças de migração, sob condições redutoras (Rf = 0,32) e não-redutoras (Rf =* 0,28), da cadeia pesada de GPIIb marcada e da GPIIb Intacta, respectivamente. D ♦ Fragmentação da GPIIb para________Identificar o Sitio de

Ligação ao Ligando

Para localizar o sitio de reticulação do K16 dentro da cadeia pesada da GPIIb, foi empregue uma abordagem por mapeamento imunoquimico utilizando o anticorpo monoclonal especifico de sitio, PMI-1. Este anticorpo reconhece os dez aminoácidos extremos do terminal carboxi da cadeia pesada de GPIIb. Loftus e colab., Proc..........Natl ........Acad..........Sei ..........USA, 84:7114-18 (1987). 0 complexo de cadeia pesada de GPIIb:K16 foi extraido a partir de geles processados sob condições redutoras de acordo com o Exemplo 1C, e submetido a proteólise de curta duração com quimotripsina. Cerca de 10 Lg do complexo de cadeia pesada de GP11b : K16 extraido foram digeridos com 5 μ-g de alfa quimotripsina durante 10 minutos a 22°C. 0 material digerido foi então submetido a ei ectroforese e a imuno-mancha utilizando PMI-1 (Figura 4) de acordo com os processos do Exemplo 1C. Dentro da digestão parcial, o PMI—1 imunorreagiu com um fragmento principal migrando a 60 kDa assim como com dois fragmentos de menor peso molecular a 32 © 20 kDa (Figura 4, faixa 2). Foi preparado um auto-radiograma da membrana de transferência, também de acordo

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 com o Exemplo 1C, e indicou que o fragmento de 60 kDa imunorreagindo com o PMI-1 não era radioactivo (Figura 4, faixa 4) . Em vez disso, foram deteeiados três fragmentos de menor peso molecular, e estes não alinham com qualquer dos fragmentos positivos para o PMI-1. Estes resultados indicaram que a região de 60 kDa da GPIIb, prolongando-se em direcção ao terminal amino a partir do terminal carboxi extremo da cadeia pesada não contém o sitio de reticulação do K16. Inversamente estes dados sugerem que o sitio de reticulação deve localizar-se na metade do terminal amino da cadeia pesada de GPIIb.

Para localizar adicionalmente o sitio de reticulação do K16, o complexo de GPIIb:K16, isolado a partir de geles de SDS-PAGE, foi submetido a clivagem com brometo de cianogénio (CMBr). Após \ re-electroforese e transferência de gel, foi consistentemente observado um fragmento radioactivo principal de 40 kDa (Figura 5) . 0 fragmento radioactivo foi extraído a partir do gel de SDS-PAGE, e submetido a análise da sequência do terminal NH2 num sequenciador de fase gasosa Modelo 475 A de Applied Biosystem, Os resultados do sequenciamento do fragmento de 40 kDa mostraram que -foi obtida uma sequência não ambígua durante 14 ciclos.· Esta sequência (Figura 5) corresponde precisamente à sequência do terminal amino da cadeia pesada da GPIIb. Análises semelhantes foram efeciuadas em duas preparações adicionais do fragmento de CNBr radioactivo e, em cada caso, foi obtida uma sequência correspondendo ao terminal amino da GPIIb. Foram efectuadas experiências de controlo, as quais indicaram que a GPIIb não era sensível à clivagem com ácido fórmico sob as condições utilizadas na reacção do CNBr, restringindo os sítios de clivagem do CNBr aos resíduos de metionilo da proteína. Os três primeiros resíduos de metionilo estão localizados nas posições 285, 314 e 489 da GPIIb. Ver a Figura 1 para os números das posições dos resíduos de aminoácido aqui utilizados. A clivagem com 0 CNBr em qualquer um dos dois primeiros sítios produziria um fragmento dentro da gama de 30-40 kDa (como existem dois sítios de glicosação ligados a Asn potenciais dentro desta região, o peso 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

58 molecular preciso não pode ser calculado), compatível com o fragmento observado de 40 kDa, A clivagem com o CNBr no terceiro resíduo de metionilo produziria, por outro lado, um fragmento de λ54 kDa, Consequentemente, o sitio de reticulação do K16 parece estar confinado a uma região distinta dentro dos primeiros 314 resíduos de aminoécido da GPIIb. Ocasionalmente foi observado um dupleto radioactivo no digesto de CNBr, com a banda mais elevada apresentando um peso molecular estimado de 54 kDa. Esta segunda banda é visível no digesto de CNBr na Figura 5, A sequência do terminal amino desta banda superior também foi determinada e correspondia às sequências do terminal amino da GPIIb em cada uma das 10 posições determinadas. Este fragmento, consequentemente, deve surgir da clivagem com o CNBr no resíduo metionilo na posição 489, Em conjunto, a radioactividade dentro destes dois fragmentos responde por 88% da radioactividade aplicada ao gel representada na Figura 5.

Uma digestão limite do complexo de cadeia pesada da 6PIIb:K16 com cromotripsina produziu um fragmento radioactivo único de 7 kDa (Figura 5). Recuperou-se £.90% da reactivi-dade do complexo de ΘΡ11b:K16nesta banda de 7 kDa. Os seis resíduos do terminal amino desta banda foram determinados e correspondiam à sequência da GPIIb iniciando-se a partir do resíduo 294. A anélise da sequência de três preparações separadas do fragmento de 7 kDa produziu pelo menos a sequência de três resíduos AVT, uma sequência de aminoácidos singular aos resíduos 294-296 da GPIIb. Um fragmento de 7 kDa iniciando-se no resíduo 294 deveria conter aproximadamente .60 aminoácidos e terminar na vizinhança do resíduo 350.

Para corroborar esta localização, foi utilizado o SV8 para digerir o complexo de cadeia pesada de ΘΡIIb:K16. 0 padrão peptidico deste digesto era extremamente complexo; consequentemente, ele foi primeiro submetido a HPLC numa coluna 04. As fracções radioactivas foram reunidas, submetidas a electroforese num gel de gradiente de 10 a 20%, e transferidas para uma membrana de PVDF. A auto-radiografia do transferido revelou uma

-59- 71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 banda larga na região de 8-9 kDa (Figura 5) com 95% da radioactividade aplicada ao gel migrando nesta posição. 0 sequenoiamento dos aminoácidos desta banda produziu duas sequências discerniveis, Uma sequência correspondia à sequência do terminal ΝΗ£ do SV8 e era presumivelmente derivada de um fragmento proteolftico do enzima o qual co-migrava com a banda radioactiva. A segunda sequência obtida pôde ser lida durante 16 ciclos, e forneceu sinais interpretáveis em 13 das 16 posições. Esta sequência correspondia àquela da GPIIb prolongando-se a partir do resfduo 253. Um fragmento de 9 kDa iniciando-se no residuo 253 conteria aproximadamehte 80 aminoácidos e também terminaria na vizinhança do residuo 350.

Um sumário dos dados de localização do sitio de reticulação do í< 16 está esquematicamente ilustrado na Figura 6. 0 passo 1 restringiu o sitio de reticulação à região da cadeia pesada da GPIIb. 0 passo 2 indicou que o sitio se localizava na metade do terminal amino da cadeia pesada de GPIIb, baseado na ausência do epitopo de PMI-1 no fragmento de quimotripsina de 60 kDa·. 0 passo 3 limitou adicional mente o sitio ao terço do terminal amino da subunidade, baseado na presença do péptido reticulado num fragmento de CNBr de 40 kDa iniciando-se no residuo 1 da ΘΡ11b. Os residuos de mefio.fii3o nas posições 285 ou 314 são os dois sitios alternativos para o terminal carboxi do fragmento de 40 kDa. 0 passo 4 confinou o sitio dè reticulação a um fragmento de quimotripsina de 7 kDa prolongando-se a partir do residuo 294. Este resultado determina que o fragmento derivado do CNBr radioactivo deve terminar no 314 em vez do 285, e localiza o sitio de reticulação do K16 dentro dum trecho de 21 aminoácidos. 0 passo 5 determina que o sitio de reticulação se localiza dentro do fragmento de SV8 de 9 kDa iniciando-se no residuo 253. Prevê-se que este fragmento termine na vizinhança do residuo 350. Como a região 294-314 está contida dentro do fragmento de SV8, o passo 5 fornece uma evidência que corrobora a localização do sitio de reticulação de K16 deduzida a partir do passo 4. Â sequência do trecho de 21 aminoáeidof da GPIIb contendo o

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 >60· qus sítio de reticulação da cadela gama/está indicada na Tabela 1, possui a mesma sequência de residuos de aminoácido que o polipéptido p1, e representa uma porção da região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb. A sequência do sitio de reticulação de cadeia gama na GPIIb foi favoravelmente alinhada com as sequências determinadas para outras suburtidades alfa de integrinas humanas, e esse alinhamento está representado na Tabela 1. É evidente uma elevada conservação da estrutura primária, A identidade da sequência desta região da GPIIb varia desde 48% para a subunidade alfa de Mac-1 até 81% para a subunidade alfa de VL.A-5, o receptor da fibronectina. A identidade global da GPIIb completa para estas outras subunidades alfa varia de 22 a 38%, A referida conservação selectiva de estrutura favorece um papel para esta região na função de receptor. Devido a esta conservação, esta região na subunidade alfa de integrinas humanas é considerada como sendo "homóloga" à região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb e, consequentemente, a região é aqui designada como a região de ligação ao ligando da subunidade alfa de integrina.

Na medida em que foi identificada a região de ligação ao ligando por reticulação química com fragmentos proteolíticos, acredita-se que os limites precisos do sitio de ligação ao ligando podem variar por tanto quanto cerca de 5 a 15 resíduos de aminoácido. Consequentemente, o sítio, por conveniência, será aqui designado como uma região de ligação ao ligando na subunidade alfa de integrina, e na GP11b ~11 Ia essa região abarca os resíduos desde cerca d® posição 290 até cerca da posição 320, 2. Sí n tese de Polipéptid os

Os polipéptidos representados na Tabela 2, due correspondem à região de ligação ao ligando identificada na subunidade alfa de integrina, foram sintetizados utilizando a técnica de fase sólida clássica descrita por Merrifield, Ady_. Enzymol . , 32 : 22 1 -96 (1969), tal como adaptada para utilização com um sintetizador peptídico automatizado, modelo 430 (Applied Biosystems, Foster

71 .924 SCRQ353P SCRF 192.1

City, CA).. Se os polipéptidos se destinam a ser utilizados em imunizações para preparar anticorpos policlonais ou monoclonais, os polipéptidos são sintetizados com um tripéptido de Cys-Gly-Gly (CGG) adicional (não representado na Tabela 2), como um ligador fixado entre o terminal amino de cada polipéptido e a glicina do terminal carboxi do tripéptido, para permitir o acoplamento do tiol do polipéptido a uma proteina portadora. As resinas-.·, -polipéptido preparadas foram clivadas com fluoreto de hidrogénio, extrafdas e analisadas quanto à pureza por cromatografia liquida de elevado rendimento (HPLC), utilizando uma coluna C18 de fase invertida fabricada por Waters Associates, Milford, MA. Os polipéptidos p3-p9 e os polipéptidos representados na Tabela 3, também são preparados pelo processo anterior, 3. Inibiçio da Ag regaçáo......Plaguetária.......por Polipéptidos

Sessenta mililitros (ml) de sangue humano total foram recolhidos em 5 ml de ACD (ácido citrico 0,065 M, citrato de sódio 0,085 M, dextrose a 2%) contendo hirudina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a uma concentração final de 0,06 unidades por mililitro (U/ml), e centrifugados durante 15 minutos a 120 x g. 0 sobrenadante resultante, designado plasma rico em plaquetas (PRP), foi recuperado.

Duzentos μ 1 do plasma rico em plaquetas (PRP) foram misturados com 190 μΐ de tampão de Tyrode contendo BSA e dextrose (cada uma a 1 mg/ml), Ca^+ 1 mM, fibrinogénio 300 mM, e o polipéptido p1 preparado no Exemplo 2 e adicionado em quantidades variáveis como indicado na Tabela 4. 0 péptido de controlo utilizado é formado pelos residuos 461-471 da GPIIb, e é representativo dos 30 péptidos de GPIIb-IIIa testados. Foram então misturados dez μΐ de ADP (80 μΜ em tampão de Tyrode) para estimular a agregação plaquetária. A mistura foi mantida a 37°C enquanto foram monitorizadas as alterações na transmissão da luz da mistura ao longo do tempo, utilizando um Dual Sample Aggregation Meter (Model QP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO), 0 medidor da agregação foi calibrado utilizando uma solução

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 ~62" contendo 200 μ.1 de PRP e 200 μΐ de Tampão de Tyrode para estabelecer uma linha de base baixa da transmissão da luz a 5% para as agregações de controlo e a 10% para as agregações em presença do polipéptido, 0 limite superior de 100% de transmissão da luz uniformemente estabelecido utilizando uma mistura de 100 ml de PRP e 300 μΐ de tampão de Tyrode.

Os resultados obtidos quando da medição da inibição da agregação plaquetária pelo polipéptido p1 são apresentados na Tabela 4, e são expressos como uma percentagem da transmissão da luz (100%) obtida na ausência de polipéptido quando medida cerca de 3 a 4 minutos após o AQP ter sido misturado. Os resultados na Tabela 4 mostram que o polipéptido p1 produziu uma inibição da agregação plaquetária dependente da dose.

Foram obtidos resultados semelhantes quando as plaquetas O,. foram agregadas numa solução contendo Ca 1 mM e fibrinogénio 300 nM. Adicionalmente, p1 1 mH produziu a inibição parcial (cerca de 40%) da agregação em presença de um agonista forte, tal como a trombina (60 miliunidades /ml) e o colagénio (5 pg/ml). TABELA 4

Inibição da Agregação Plaquetária pelos Polipéptidos

Designação do Concentração do Percentagem de

Polipéptido Polipéptido Transmissão controlo 1 mM 100 nenhum 0 piM 100 p1 5,0 iuM 86 p1 50,0 jjM 67 p I 125,0 uM 48 P 1 1,25 mM 10

Quando o polipéptido p2 foi testado no ensaio de agregação anterior exibiu, um grau de inibição da agregação plaquetária

63 71 924 SCRQ353P SCRF 192.1 mensurável mas ma is baixo. 0 pol ipéptido p2 foi cerca de 80% menos eficaz do que o pol ipéptido p1 na inibição da agregação plaquetária.

Assim, os resultados indicam as dosagens eficazes úteis para inibir a agregação plaquetária e os processos envolvendo a agregação plaquetária, tal como a formação de trombos, quando da utilização de polipéptidos de acordo com o presente invento que são derivados da região de ligação ao fibrinogénio da GPIIb, 4. Preparação......de......Anti-soro......Policlonal

Os polipéptidos sintéticos preparados no Exemplo 2 são, primeiro, acoplados a hemocianina de lapa (género ........Fissurella) (KLH) através do residuo de tio! presente no residuo de cisteina do ligador para formar os conjugados de polipéptido~KLH. Ratinhos Balb/c são então imunizados com 100 microgramas.. .^g) de conjugado, primeiro intraperitonea1 mente (IP) em adjuvante completo de Freund, e os reforços são administrados subcutânea e/ou intraperitonealmente em adjuvante incompleto de Freund.

Após três ou mais reforços, o anti-soro é recolhido a partir dos ratinhos responsivos, 0 anti-soro recolhido contém moléculas de anticorpo policlonal que imunorreagem com os polipéptidos imuriizantes, e são adequadas para utilização nos processos aqui descritos, 5. Inibição da Ligação do Fibrinogénio A actividade inibitória do polipéptido p1 sobre a ligação das plaquetas ao fibrinogénio foi examinada com 1 2 5 j __ -fibrinogénio, 0 ^^I-fihrinogénio (60 nM) foi adicionado ás plaquetas } lavadas, estimuladas com ADP (10 μΜ) . A ligação do polipéptido p1, um variante num aminoácido de p1 (TDVNGEGRHDL--p 1 ' ) , e um péptido de controlo, ao ^ ^ I-f i br i nogén io foi determinada nas concentrações finais de 1,0, 0,5, e 0,05 mM, a 22° C. 0 fibrinogénio radiomarcado ligado foi quantificado e expresso como uma percentagem do fibrinogénio ligado na ausência de polipéptido. Os dados apresentados na Tabela 5 foram obtidos

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -64- quando o I-fibrlnogénio foi pré-incubado com p1 durante 30 minutos antes da adição das plaquetas estimuladas com ADP, sendo a ligação medida 10 minutos mais tarde. Os resultados demonstram claramente a capacidade da sequência de residuos de p1 para inibir a ligação ao fibrinogénio. TABELA 5

Inibição da Ligação ao ^^I-Fibrinogénio

Polipéptido Concentração % de Inibição pi 1,0 mM 70 p 1 ' 1,0 mM 27 controlo 1,0 mM 2 p1 0,5 mM 52 p 1 ' 0,5 mM 18 controlo 0,5 mH 2 p1 0,05 mM 2 pi' 0,05 mM 2 controlo 0,05 mM 2 Os péptidos de 530-544. controlo são: GPIIb 24-33, 363-374, 430-439, e 6. Ligação do Fibrinogénio a Poli péptidos Imobi1izados Os polipéptidos p1 , p 1 ' , e controlos foram imobilizados sobre placas de microtitulação Immulon-2 de 96 cavidades (Dynatech Laboratories, VA). Os péptidos foram adicionados às placas, e mantidos a 4°C durante 24 horas, após as quais as placas foram lavadas com Hepes-tampão de Tyrode (pH 7,4) contendo Tween-20. As placas foram pós~revast1das com 3% de BSA durante 1 hora a 37°C e, de seguida, novamente lavadas. Permitiu-se que o 125I-fibrinogénio (50 μΐ a 50 nM) se ligasse às cavidades revestidas com o péptido, durante 24 horas a 22°C, as quais foram, em seguida, amplamente lavadas e contadas quanto à radioactividade ligada. 0 fibrinogénio marcado pôde ser exibido

71 924 SCR0353P SCRF 192.1 -65 pelo fibrinogérrío não marcado, desse modo, indicando. . ' a ligação saturável. s

Numa experiência adicional, a especificidade da ligação do fibrinogénio ao polipéptido p1 imobilizado foi' adicionalmente sondada pela exposição simultânea de fibrinogénio não marcado, albumina sérica bovina (BSA) e t i r eog 1 ob-ulina com 1 2 5 j „ (50nli) -fibrinogénio# ao p1 imobilizado. Os resultados são apresentados na Tabela 6. TABELA 6

Ligação do ^^Ι-Fibrinogénio aos Péptidos Imobilizados

Polipéptido Ligando não 125i-Fibrinogénio

Imobilizado Marcado (cpmxIO®) p 1 - 53 p1 1 - 17 Controlo - 5 p 1 - 28 p 1 Fibrinogénio 0,2μΜ 18 P1 II 0,4μΜ 15 p1 M 0,8μΜ 9 p1 fl 1,2 μ Μ 7 p1 (t 1,6μΜ 6 p1 BSA 1 ,2μΜ 25 p 1 BSA 1,5μΜ 24 p 1 Tireoglobulina 1,2μΜ 23 P1 II 1,5μΜ 22 Assim, o fibrinogénio 1iga-se muito mais ao p1 imobilizado (10~ Ί2 vezes) do que aos péptidos de controlo, e a ligação é especifi ca para o fibrinogénio.

-66 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 7 . Inibição_____da Ligação do__Fibrinogénio ao Poli pé p ido________g 1

Imobi1izado A inibição da ligação do fibrinogénio ao p1 imobilizado foi adicionalmente caracterizada com os resultados apresentados na Tabela 7. Assim, a albumina e a tireoglobulina mostraram inibição minima da ligação do 1ibririogénio relativamente ao fibrinogénio de ligação especifica. A dependência do catião da ligação foi determinada em presença de EDTA (5 mM) . Dois péptidos da cadeia gama de fibrinogénio (HHL.G8AKQA6DV e KY6GHHLGGAHQA6DV) inibiram a interacção do fibrinogénio com o p1 imobilizado. De igual modo, um anticorpo monoclonal (4A5) para a região da cadeia gama (Matsueda, G.R., e colab., FASES J. 2::6480 (1988)) bloqueou a interacção. Âdicionalmente, péptidos contendo RGD (RGDS e YVTAGR6DSPASSK) inibiram a ligação do fibrinogénio. Estas observações são consistentes com a hipõtese de gue os péptidos da cadeia gama de RGD interagem com os mesmos sities na GPIIb-IIIa. TABELA 7

Interacção do

Inibidor 125i„pibrinogénio com o Péptido p1 Imobilizado Concentração % de Inibição da ligação do (μΜ) 1^5í-fibrinogénio ao p1

Nenhum 0 Fibrinogénio 2 82 ± 1,2 Albumina 2 12 ± 4 Tireoglobulina 2 14 ± 4 EDTA 5 000 90 ± 8 HHLG6AKQA6DV 200 57 «Ã 11 KYGGHHLGGAKQAGDV 200 54 & 12 RGDS 200 52 ± 15 GRGESP 200 16 ± 7 YVTAGRGDSPASSK 200 61 ± 16 4A5 Mab 10 75 ± 8 Mab de Controlo 10 15 ± 4 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

67 8. Os An11 corgos.....Anti-p 1.......Inibem a Ligação.....do Flbrlnogénio

Os anticorpos para a GPIIb-IIIa foram produzidos por imunização de coelhos com GPIIb-IIIa- 0 soro de coelho foi passado sobre uma coluna de afinidade (2 mg de péptido/ml de Sepharose 4B) apresentando polipéptido p1 imobilizado, e o anticorpo ligado foi elutdo com ácido (pH 2,5) a partir da coluna. Os anticorpos anti-p1 isolados reagiram com o p1 numa diluição de 1/1 000, mas não foi observada qualquer reacção com outros péptidos da GPIIb-IIIa numa diluição de 1/10,

Tal como representado na Figura 7A, os anticorpos anti~p1 (B12) isolados exibem uma inibição dependente da concentração da ligação do 1251-fibrlnogénio (50 nM) ao p1 (circulo negro) e à GPIIb-IIIa (triângulo) imobilizados sobre placas de microtitulação durante 24 h a 22°C. 0 anticorpo de controlo era para os resíduos 1-13 da GPIIb, o qual foi purificado utilizando o processo empregue para os anticorpos anti~p1. As placas anti-,p1 foram preparadas como acima, e as placas anti-GPIIb-IIIa foram preparadas por revesti mento das cavidades de microtitulação com GPIIb-IIIa a 10 pg/ml, purificada por cromatografia de afinidade em KYGRGDS (Pytela, R,, e colab., Science, 231:1559-62 (1986)), A Figura 7B mostra o efeito de anticorpos anti-p1 (B12) sobre a ligação do 1 ^ ^ I-f i br i nogén 1 o às p 1 aquetasJQ 1 ^ ® I --fibrlnogénio (60 nM). foi incubado com plaquetas humanas ,lavadas, estimuladas com ADR (10®/ml) e anticorpos, durante 30 minutos a 22°C. Os anticorpos de controlo eram para outras regiões da GPIIb-IIIa. Os anticorpos para o polipéptido p1, consequentemente, inibiram especificamente a ligação do fibrlnogénio às plaquetas.. A especificação anterior, incluindo as concretizações e os exemplos específicos, destinares a ser ilustrativa do presente invento e não deve ser considerada como limitativa. Podem ser efectuadas numerosas outras variações e modificações sem se afastarem do verdadeiro espirito e âmbito do presente invento.

Claims (9)

1. 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

   ~68~ REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de preparação de um péptido caracterizado por ter um comprimento de não mais de 30 residuos de aminoácido possuindo uma sequência que corresponde a uma sequência de GPIIb que inclui uma sequência de residuos de aminoácido representada pela fórmula TDVN6D6RHDL, AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM, AATDINGDDYADLFIGAPLEM, CSVDVDKDTITDVLLVGAPMYM, CAVDLNADGFSDLLVGAPMQS, AATDVNGDGLDDLLVGAPLLM, CGVDVDGDGETELLLIGAPLFY, CSVDVDSNGSTDLVLIGAPHYY, ou CSVDVDTDGSTDLVLIGAPHYY, sendo o referido polipéptido capaz de inibir a agregação plaquetária,
2. 2 - Processo de preparação de um polipéptido caracterizado por ter uma sequência de residuos de aminoácido com a fórmula: TDVN6DGRHDL, AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM, AATDINGDDYADLFIGAPLFM, CSVDVDKDTITDVLLVGAPMYM, CAVDLNADGFSDLLVGAPMQS, AATDVNGDGLDDLLVGAPLLM, CGVDVDGDGETELLLIGAPLFY, CSVDVDSNGSTDLVLI6APHYY, ou CSVDVDTDGSTDLVLIGAPHYY.
3. 3 - Processo de preparação de um segmento de nucleótidos caracter izado por compreender não mais do que cerca de 2 000 pares de bases nucleotidicas uncluindo uma sequência definindo um gene estrutural que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 2. 71 924 SCR0353P SCRF 192.1

   »69
4. 4 - Processo de preparação de uma composição de anticorpo policlonal caracterizado por compreender a associação de moléculas de anticorpo que Imunorreagem com um pollpéptldo de acordo com a reivindicação 2, mas que não Imunorreagem com uma subunldade beta de uma Integrlna ou com um pollpéptldo cuja sequência de resíduos de amlnoácldo consiste essencialmente numa sequência que corresponde à sequência representada pela fórmula: YELHNNGPGTVNGLHL, YELRNNGPSSFSKAML, LKVTTGSVPVSMATV, TFHVINTGNSMAPNVSV, YELINQGPSSISQGVL, YQVRIQPSIHDHVIPT, YQVSNLGQRSLPISL , ou YQVNNLGQRDLPVSI. com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
5. 5 ~ Processo de preparação de um anticorpo monoclonal caracterizado por imunorreagir com (a) GPIIb e (b) um pollpéptldo representado pela fórmula: AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM.
6. 6 ” Processo de preparação de um anticorpo monoclonal caracterizado por imunorreagir com (a) um pollpéptldo de acordo com a reivindicação 2 e (b) a subunidade alfa de uma integrlna à qual corresponde a sequência de resíduos de aminoácido do referido pollpéptldo.
7. 7 - Processo de preparação de uma composição que promove a adesão de células a um substrato quando a referida composição é imobilizada sobre o substrato, caracterizado por compreender a associação de um pollpéptldo possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido de acordo com a fórmula TDVNGDGRHDL, AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM, AÂTDINGDDYADLFIGAPLFM, “70“ 71 924 SCR0353P SCRF 192.1 CSVDVDKDTITDVLLVGAPMYM, CAVDLNADGFSDLLVGAPMQS, ' AATDVNGDGLDDLLVGAPLLM, CGVDVDGQGETELLLIGAPLFY, CSVDVDSNGSTDLVLIGAPHYY, ou CSVDVDTDGSTDLVLIGAPHYY, possuindo o referido polipéptido a capacidade de promover a adesão celular quando imobilizado num substrato, com veiculos e excipi^ntes,
8. 8 - Processo de preparação de uma composição que promove a w adesão de células a um substrato quando imobilizada sobre o substrato, caracterizado por compreender a associação de um polipéptido com um comprimento de não mais de 30 residuos de aminoácido possuindo uma sequência que corresponde à sequência de GPIIb da reivindicação 1, que inclui uma sequência de residuos de aminoácido representada pela fórmula: "TDVNGDGRHDL- possuindo o referido polipéptido a capacidade de promover a adesão celular quando imobilizado num substrato com veículos ou excipientes.
9. 9 - Processo de preparação de.um anticorpo caracterizado por imunorreagir com um ©pitopo formado por um domfnio de epitopo de GPIIb definido pelos residuos de aminoácido 290-320, inclusivé, ^ da referida GPIIb, mas que não imunorreage com GPU Ia ou com um polipéptido cuja sequência de residuos de aminoácido consiste essencialmente numa sequência que corresponde à sequência representada pela fórmula: YELHNMGPGTVNGLHL. Lisboa, DEZ. 1990 Por SCRIPPS CLINIC AMD RESEARCH FOUNDATION